Plasmidisolierung, Restriktions-analyse und Gelelektrophorese

Katja Behling

Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die sich auf

Grund eines eigenen Replikationsursprungs autonom vermehren können

Vorkommen: in Bakterien und niedrigen Eukaryonten

(T7) Promotor

MCS (multiple cloning site)

Ampicillin Resistenz

origin Plasmid

Ge

n

Aufbau eines VEKTORS

Funktion von Plasmiden unter den normalen Wachstumsbedingungen

entbehrlich R-Plasmide: Selektionsvorteil (Resistenzen) F-Plasmide: Konjugation zwischen zwei

Bakterienzellen

als Vektoren: wichtiges Werkzeug für die Molekularbiologie zur Vervielfältigung oder Expression von Genen

Plasmidisolierung Methode 1: Aufschluss durch alkalische Lyse

pelletierte E.coli-Zellen Resuspendierung der Zellen in einem EDTA-

haltigem Puffer alkalische Lyse mittels SDS und NaOH SDS löst als Detergenz die Phospholipide und

Proteinkomponenten,NaOH denaturiert chromosomale DNA, Plasmid-DNA und Proteine

Neutralisation durch KAc-Puffer Zelltrümmer, denaturierte DNA präzipitieren durch

Zentrifugation Aufreinigung des Plasmids aus dem plasmidhaltigen

Überstand mittels einer Säule (Glasfasersäule)

Plasmidisolierung Methode 2: Aufschluss durch Lysozym (1)

pelletierte E.coli-Zellen: Homogenisierung in STETL-Puffer SS: : Sucrose – osmolytische Aufbruch der

Zellmembran, nach LysozymbehandlungTT: : Triton X-100 - Auflösung der ZellmembranEE: EDTA – Komplexierung von Mg2+ und Ca2+, die zum einen die Zellwand stabilisieren und zum anderen für die Enzymaktivität nötig sindTT:: Tris/HCl (pH 8) – PufferungLL:: Lysozym – Spaltung des Murein

Plasmidisolierung Methode 2: Aufschluss durch Lysozym (2)

Zentrifugation Abtrennung der Zelltrümmer Fällung mit Isopropanol Pelletierung von DNA

und Proteinen Phenol-Chloroform-Extraktion Trennung von

DNA und Proteinen Fällung der DNA mit Ammoniumacetat und Ethanol (NH4

+ CH3COO-) verhindert die Co-präzipitation von freien Nukleotiden

Restriktion von DNA

Restriktion ist das Schneiden von DNA-Molekülen mit Enzymen

Endonukleasen• Abbau von „Innen“

Exonukleasen• Abbau von den Enden

z. B. DNase I, II, Nuklease S1

z. B. Exonuklease I-VI, Lambda-Exonukl., T7 Exonuklease

DNasenDNasenDeoxyribonukleasenDeoxyribonukleasen

Nomenklatur von Restriktionsenzymen

Nomenklatur (Smith & Nathans, 1973)

1. Name des Enzyms ist eine Abkürzung- Ableitung vom Wirtsorganismus- drei Buchstaben kursiv

Bsp.: Escherichia coli = Eco2. Anzahl von Restriktions-und

Modifikationssystemen, durch römische Zahlgekennzeichnet.

- Bsp.: Hind I, Hind II, Hind III etc. (Haemophilus influenza, Serotyp: Rd)

Bsp: Escherichia coli EcoRl

5`-GAA TT C3`-C TT AAG

Eco RI G CTTAA

AATTC G

GAA TT CC TT AAG Palindrom

Eco RI5`-GAA TT C3`-C TT AAG

G CTTAA

AATTC G

„sticky ends“(klebrige Enden)(kohäsive Enden)

Sma I(Serratia marcescens)

5`-CCC GGG3`-GGG CCC

CCC GGGGGG CCC

glatte Enden(stumpfe Enden)

Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen

• Erkennung und Schneiden nach Tetra-. Penta-, Hexa-, oder Heptanukleotidsequenzen

Trennung von Stoffgemischen: Elektrophorese

Wanderung elektrisch geladener Teilchen durch einen

als Trägermaterial dienenden Stoff in einem elektrischen Feld

als Trägermaterial dienen Gele (Polyacrylamid, Agarose) die elektrophoretische Bewegung hängt von folgenden

Faktoren ab:

• Gesamtladung des Moleküls• Größe und Gestalt des Moleküls• Porengröße des Gels• pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke des Puffers• angelegte Spannung

Gelelektrophorese von Nukleinsäuren

zur Analytik und Reinigung von DNA oder RNA unter nativen Bedingungen: Agarose-Gele:

Polymer aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose Bildung eines komplexen Netzwerkes (molekulares Sieb)

Herstellung der Gellösung

1. Agarose wird durch Aufkochen in Pufferlösung gelöst

2. Zugabe von Ethidiumbromid3. Ausgießen der Lösung auf eine horizontale

Apparatur, Kamm setzen4. bei Abkühlung erstarrt die Masse zu einem festen

Gel

Agarosegelelektrophorese I

Agarosegelelektrophorese II

Ethidiumbromid (EtBr)

• interkaliert in die DNA• Bestrahlung mit UV orange Fluoreszenz

Gelelektrophorese von Plasmid-DNA

Klonierung

Praktikum

Plasmid- isolierung

Methode 1 Methode 2

Restriktionsverdau

Gelektrophorese