Post on 13-Aug-2019
Plus strand RNA viruses and their host interactions
Birke A. Tews
Merkmale von Plusstrang-RNA-
Viren
Life cycle of plus strand RNA viruses
1. Entry
2. Uncoating
3. Translation and
polyprotein
processing
4. RNA replication
5. Assembly
6. Release
Merkmale von Plusstrang RNA-Viren
Einzelsträngiges RNA-Genom, das direkt als mRNA fungieren kann.
-> das virale Genom ist bereits infektiös (Abgrenzung Retrovirus)
5‘ Ende:
Cap -> Flaviviren, Coronaviren
VPg -> Caliciviren, Picornaviren
Unmodifiziert -> Pestiviren, Hepaciviren
3‘ Ende
Poly-A -> Coronaviren
Unmodifizierte Enden -> Pestiviren, Flaviviren, Hepaciviren
Subgenomische RNAs
Ja: -> Coronaviren, Caliciviren, Ateriviren, Astroviren, Togaviren
Nein: -> Flaviviren, Picornaviren
Picornaviridae – kleine RNA-Viren
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
- Nicht-umhüllt
- 7-9kb
- 5‘ Vpg & 3‘ poly-A-tail
- IRES
- Ein Polyprotein
Order: Picornavirales
Family: Picornaviridae
Genus: Aphthovirus
Species: Foot-and-mouth disease virus
Genus: Enterovirus
Species: human enterovirus C (polio)
Coronaviruses – die größten RNA-Viren
- umhüllt
- 27-32kb
- 5‘ Cap & 3‘ poly-A tail
- Zwei Polyproteine (ribosomal frameshift)
- Subgenomische RNAs für (Struktur-)Proteine
Order: Nidovirales
Family: Coronaviridae
Subfamily: Coronavirinae
Genus: Alphacoronavirus
Species: Human coronavirus 229E
Genus: Betacoronavirus
Species: Severe acute respiratory
Syndrome-related coronavirus
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Flaviviridae
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
- Umhüllt
- 10-12kb
- Ein Polyprotein
- Flaviviruses:
- 5‘cap & 3‘ loop
- Hepaciviruses, Pestiviruses
- Naktes, strukturiertes 5‘ &
strukturiertes 3‘ Ende
- IRES
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Flavivirus -> Species: Yellow fever virus
Genus: Hepacivirus -> Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)
Genus: Pestivirus -> Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)
Caliciviridae
- Nicht-umhüllt
- 7-8kb
- 5‘ VPg & 3‘ poly-A-tail
- Subgenomische RNA
Order: Unassigned
Family: Caliciviridae
Genus: Norovirus
Species: Norwalk virus
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Revers-genetische Systeme
Revers-genetische Systeme
„einfacher“ als für Negativstrang RNA-Viren.
Einbringen viraler RNA in die Zelle reicht theoretisch aus, um infektiöse
Viren zu bilden.
Klassischer Ansatz:
Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor
In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen
Einbringen der RNA in Zielzellen
Revers-genetische Systeme
Klassischer Ansatz:
Klonierung der kompletten cDNA hinter einen Promotor
In vitro Herstellung der genomischen RNA durch T7 oder SP6-Polymerasen
- Für Viren mit VPg oder Cap muss dieses in der Reaktion mit eingefügt
werden
- Für Viren mit Poly-A-Schwanz muss dieser vom Plasmid kodiert sein,
oder durch Poly-A-tailing angefügt werden
- Für Viren mit „nackten“ Enden ist meist das definierte Ende wichtig.
Revers-genetische Systeme
Genom hat häufig ausgeprägte Sekundärstrukturen -> toxisch/instabil in
Bakterien
-> cDNA auf mehrere Plasmide aufgeteilt.
Die einzelnen Sequenzen werden vor der in vitro Transkription zu einem
DNA-Molekül zusammengefügt.
Revers-genetische Systeme
In vivo Herstellung der „genomischen“ RNA durch transfizierte Zellen
- Durch Wahl eines RNA-Polymerase II Promotors wird die RNA mit
einem Cap modifiziert (gut für Viren mit einem VPg oder Cap-Genom)
- Ein Poly-A-Schwanz kann durch entsprechende Signale und die
zellulären Enzyme dafür angehängt werden.
- Für Viren mit exakten Genomenden kann hier durch die Klonierung
eines Ribozyms das exakte 3‘ Ende generiert werden.
Interaktion mit dem Wirt:
essentielle Wirtsfaktoren
Life cycle of plus strand RNA viruses
1. Entry ->
Receptors/proteases
2. Uncoating -> pH-shift,
endocytotic pathways,
enzymes
3. Translation and
polyprotein processing
-> ribosome, initiation
factors, elongation
factors, proteases,
chaperones
4. RNA replication
5. Assembly
6. Release/Maturation ->
proteases
Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
Poliovirus: CD155
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch
Affen)
Order: Picornavirales
Family: Picornaviridae
Genus: Aphthovirus
Species: Foot-and-mouth disease virus
Genus: Enterovirus
Species: human enterovirus C (polio)
Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
Poliovirus: CD155
Anfällige Spezies: Mensch (experimentell auch
Affen)
Rezeptor identifiziert durch Expression von cDNA aus
suszeptiblen Zellen in nicht suszeptiblen Zellen
Aus empfänglich gewordenen Zellklonen cDNA isoliert, kloniert und
sequenziert
In transgenen Mäusen exprimiert bekommen diese empfänglich.
Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…
Order: Nidovirales
Family: Coronaviridae
Subfamily: Coronavirinae
Genus: Betacoronavirus
Species: Middle eastern respiratory
syndrome-related coronavirus
Rezeptoren: Ein Virus – ein Rezeptor
Rezeptoren können Speziesspezifitäten bedingen
MERS-Coronavirus: Dipeptidyl peptidase 4
(DPP4, CD26)
Anfällige Spezies: Cameliden, Fledermäuse,
Menschen…
Gefunden über Bindung an rekombinanten S1-Fc-Protein und
identifiziert durch Massenspektrometrie
Löslicher Rezeptor kann Infektion hemmen
Expression kann Zellen empfänglich machen
Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion. Wirtsfaktor TMPRSS2
Alexandra C. Walls et al. PNAS 2017;114:42:11157-11162
Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion
Earnest et al, Plos Pathogens 2017
ZellkulturMaus
Eintritt ist mehr als nur Rezeptoren
MERS (und andere Coronaviren) brauchen Proteasen für die Aktivierung
der Membranfusion
Hepatitis C: ein Virus – viele Rezeptoren
Source: ViralZone:www.expasy.org/viralzone, SIB Swiss Institute of Bioinformatics
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Hepacivirus
Species: Hepacivirus C (Hepatitis C virus)
1 2 3
Hepatitis C is a viral infection, which is
chronic in 80% of the cases (1) and can lead
to cirrhosis (2) and hepatocellular
carcinoma (3)
Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren
Hepatitis C Virus
Anfällige Species: Mensch (experimentell Schimpansen)
- „Attachment factors“: LDL-R & Glykosaminoglykane
- Rezeptoren: SR-BI & CD81
- Notwendige Eintrittsfaktoren: Claudin-1 & Occludin
Model by Sophana Ung
Rezeptoren: Ein Virus – viele Rezeptoren
Hepatitis C Virus
Anfällige Species: Mensch (experimentell Schimpansen)
- Nur die humane Isoform möglich: CD81 & OCLN
- SR-BI hochexprimiert in Leberzellen
- Weitere nicht-essentielle Faktoren fördern die Aufnahme
Model by Sophana Ung
Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine
Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?
Exkurs: miRNA
Winter et al. Nature Cell Biology, 2009
Nicht alle Wirtsfaktoren sind Proteine
Lebertropismus bei Hepatitis C Infektionen – bedingt durch miRNA?
- HCV hat zwei Bindestellen für miR-122 im 5‘ Ende des Genoms
- miR-122 ist hochkonzentriert in der Leber und reguliert Lipid- und
Cholesterolstoffwechselfunktionen und wirkt als Tumorsuppressor
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
HCV ist miR-122 abhängig
Mutierte Bindungsstellen
Details der Interaktion
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
Details der Interaktion
Erica S. Machlin et al. PNAS 2011;108:8:3193-3198
Welche Funktion erfüllt die Bindung?
Erhöhte Translation
Stabilität gegenüber XRN1/2
Wirtsfaktoren zur Persistenzetablierung - Pestiviren
Order: Unassigned
Family: Flaviviridae
Genus: Pestivirus
Species: Pestivirus A (Bovine viral diarrhea virus)
Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)
BVDV
• Two biotypes: non-cytopathic (ncp), cytopathic (cp)
– Distinguished by their effect in cell culture
– Relevance for host infection?
Pathogenesis: BVD / Mucosal Disease
• Infection
– often clinically inapparent
– fever
– diarrhea
– mucosal lesions
– death
• Infection in pregnant cows
– ncp viruses infecting between 40 and 120 of
gestation lead to infection of the fetus and
birth of persistently infected animals (PI)
• PI animals:
– Have no adaptive immune response
– Have high viral titer in the blood
– Act as virus reservoirs
• Superinfection with a cp virus of PI animals
leads to development of mucosal disease.
What is the difference between cp and ncp isolates
• Difference between cp and ncp is the presence of
cleaved NS3 in infected cells.
Fig: M. Jörn (Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015)
Regulation of NS2-3 cleavage
• Ncp viruses do produce NS3 at
early time points
• Cp viruses produce NS3 at
every stage of infection
• NS2 is an autoprotease
responsible for the cleavage
• Conclusion: production of NS3
is tightly regulated in ncp
viruses
• What is the molecular basis for
the tight regulation and for the
constitutive cleavage in cp
viruses
T. Lackner et al. J. Virol. 2004;78:10765-10775
Molecular basis – genomes of cp viruses
cp viruses contain cellular sequences leading to NS2-NS3 cleavage
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
Molecular basis – genomes of cp viruses
exception
usual
Complete cleavage of NS2-3 -> no infectious virus
Insertion of IRES or ubiquitin between NS2 and NS3 -> no infectious virus
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
Ubiquitin related
proteins -> cleavage
by cellular proteases
Molecular basis – genomes of cp viruses
Some cp viruses have another insertion
- 90aa of a 699aa J-domain protein (Jiv = J-domain protein interacting
with viral protein, or DNAJ-C14)
- Jiv is a cellular chaperone belonging to the Hsp40 family
- The 90aa sequence have no protease activity
Tautz, Tews & Meyers: The Molecular Biology of Pestiviruses, Adv Virus Res 2015
NS2 ist eine Autoprotease
- Sequenzvergleich mit HCV
- Mutageneseanalyse mit Mutationen im putativen aktiven Zentrum
- Keine Spaltung -> kein Virus
Lackner et al. Temporal Modulation of an Autoprotease Is Crucial for Replication and Pathogenicity of an RNA Virus, J Virol 2004
Jiv/Jiv90 erlaubt die Spaltung
- NS2 ist eine Autoprotease
- Jiv90 ein essentieller Kofaktor
Rinck et al. A Cellular J-Domain Protein Modulates Polyprotein Processing and Cytopathogenicity of a Pestivirus, J Virol 2001
Effekt der Spaltung auf Virus-RNA-Level
Cytopathogene Viren generieren mehr
genomische RNA
Das führt nicht zu mehr infektiösem Virus
Lackner et al. Temporal Modulation of an Autoprotease Is Crucial for Replication and Pathogenicity of an RNA Virus, J Virol 2004
Die Spaltung in der Infektion
NS3 wird für die Replikation benötigt
NS2-3 wird für den Partikelbau benötigt
Adaptierung an NS2/NS3 alleine
Chimäre aus ncp7 und Ossloss
Je ein Aminosäureaustausch in NS2 und NS3 nötig
Sowohl NS2-3 als auch NS3 bilden einen Komplex mit NS4A
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
NS4A interagiert unterschiedlich mit NS3 und NS2-3
Einfluss auf Interaktion mit NS4A
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
Kompakte Interaktion
NS3/NS4A -> RNA
Replikation
Depletion von Jiv in der
Infektion -> keine Spaltung
NS2-3
Veränderte Interaktion
NS2-3/NS4A ->
Partikelzusammenbau
Zeitliche Regulierung der
Infektion
Jiv Depletion reguliert Replikation und Zusammenbau
Dubrau et al. Plos Pathogens 2017
Warum die zeitliche Regulierung?
Ncp Virus IFN-Antwort unterdrückt -> Foetus
überlebt
Cp Virus IFN-Antwort vorhanden -> Abort
RNA
Npro/Erns
RNA
Npro/Erns