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Proteinbiochemie

Grundproblematik

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Ein isoliertes Protein – Was nun?Bsp His-Tag

Bsp GST-Tag

Biuret

• Cu2+ bildet mit Proteinbackbone einen Komplex

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Biuret• Detektion: Komplex ist blau gefärbt. Absorptionsmaximum bei 545 nm. • Vorteil: Menge an Komplex ist direkt proportional zu Menge an Protein.• Nachteil: Der Komplex absorbiert nur schwach, d.h. es sind grössere Mengen

Protein nötig (50-300 microgramm)

Lowry• O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall: Protein

Mesurement With the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265 – 275

• Ein Biuret Verstärker: Im Alkalischen bildet sich auch Cu1+ - das Cu2+ im Biuretkomplex kann durch Proteinseitenketten zu Cu1+

reduziert werden.

• Das Cu+ reduziert Mo(VI) Komplexe (Folin-Cicolteu Reagenz) zu Mo(IV) => stark blau!

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Lowry

• Da es sich um eine gekoppelte Detektion handelt, können verschiedene Stoffe stark interagieren. Siehe Gegenüberstellung BCA-Lowry

• Vorteil: Sensitivität ca. Faktor 10 erhöht !

Smith et al. BCA / Pierce

• Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985 Oct;150:76-85.

• Ein Biuret Verstärker: Im Alkalischen bildet sich auch Cu1+ - das Cu2+ im Biuretkomplex kann durch Proteinseitenketten zu Cu1+

reduziert werden.

• Das Cu+ wird von BCA komplexiert.

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Smith et al. BCA / Pierce

Smith et al. BCA / Pierce

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Smith et al. BCA / Pierce

Smith et al. BCA / Pierce

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Smith et al. BCA / Pierce

• Da es sich um eine gekoppelte Detektion handelt, können verschiedene Stoffe stark interagieren.

• Cu2+ zu Cu+ Reduktion hängt von Aminosäurezusammensetzung ab.

• Vorteil: Sensitivität ca Faktor 10-20 erhöht ! • Schnell• Stabil

Bradford

• Basiert auf Interaktion von Coomassie Brilliant Blue G250 mit Proteinen bei niedrigem pH.

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Fluoreszenzbasierter Assay

You, W.W., et al. (1997) Anal. Biochem. 244:277-282. http://www.biotek.com/resources/tech_res_detail.php?id=37

Fluoreszenz basierter Assay

You, W.W., et al. (1997) Anal. Biochem. 244:277-282. http://www.biotek.com/resources/tech_res_detail.php?id=37

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Über Absorption bei 280 nm

• Faustregel: 1 mg/ml Proteingemisch ca. Absorption bei 280 nm von 1.

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Über Absorption bei 280 nm

• Faustregel: 1 mg/ml Proteingemisch ca. Absorption bei 280 nm von 1.

• Isoliertes Protein mit bekannter Sequenz:Errechnen des Extinktionskoeffizienten.

Winpep

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Winpep

Winpep

http://n.ethz.ch/student/lhennig/winpep.html

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Expasy / http://www.expasy.org/

Expasy