Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der … · T-Lymphozyten erkennen Antigene...

Aus der

Klinik für Kinder- und Jugendmedizin

im St. Josef-Hospital

- Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. E. H. Hamelmann

Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis

erkrankten Kindern und Jugendlichen

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Caroline Doris Schmitz

aus Emsbüren

2008

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr

Referent: Prof. Dr. med. U. Schauer

Koreferent: Prof. Dr. med. W. Görke

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Mai 2009

Abstract

Schmitz

Caroline Doris

Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und

an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen

Problem: Regulatorische T-Zellen stellen eine Subpopulation von T-Lymphozyten dar. Sie zeichnen sich

durch die Oberflächenproteine CD4 und CD25 aus, exprimieren CD25 hoch und entwickeln sich teilweise

FOXP3-abhängig. FOXP3 ist als Transkriptionsfaktor von zentraler Bedeutung in der Entwicklung FOXP3

positiver regulatorischer T-Zellen. Regulatorische T-Zellen werden anhand ihrer Oberflächenproteine

CD45RA und CD45RO, welche sie vor bzw. nach Antigenkontakt exprimieren, in naive-like und memory-

like regulatorische T-Zellen unterschieden. Sie spielen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung der

Immunhomöostase und sind mit ihrer Funktion Effektorzellen zu unterdrücken an verschiedenen

Krankheitsbildern wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen oder Transplantatabstoßungen

beteiligt. Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis ist bisher

wenig erforscht.

In der vorliegenden Pilotstudie wird im Sinne der Grundlagenforschung erstmalig vergleichend die

absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden

und an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht.

Methode: Mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen wurden in 5 ml heparinisiertem Vollblut von

gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden die Zellzahlen regulatorischer T-Zellen

bestimmt.

Ergebnisse: Patienten mit atopischer Dermatitis wiesen höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen auf als

gesunde Probanden. Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren konnten deutlich höhere Zellzahlen

bei Patienten mit atopischer Dermatitis beobachtet werden.

Die Anzahl naive-like regulatorischer T-Zellen verringerte sich in beiden Probandengruppen mit

zunehmendem Alter statistisch signifikant. Umgekehrt stieg gleichzeitig die Anzahl der memory-like

regulatorischen T-Zellen beider Probandengruppen.

Diskussion: Als mögliche Ursache der höheren Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit

atopischer Dermatitis wird eine geringere Funktion der Zellen und die daraus resultierende

kompensatorische Erhöhung der Zellzahl diskutiert.

Die deutlich höheren Zellzahlen in den ersten vier Lebensjahren werden als Reaktion auf eine hohe

entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter gesehen.

Als Grund des signifikanten Abfalls naive-like regulatorischer T-Zellen wird die stagnierende

Ausschleusung naiver Zellen aus dem Thymus abhängig von der Thymusinvolution erörtert. Für die

Aufrechterhaltung eines suffizienten Pools regulatorischer T-Zellen im Alter nach der Thymusinvolution

wird die periphere Expansion und die daraus resultierende Zunahme der memory-like regulatorischen T-

Zellen diskutiert.

Die vorliegende Studie leistet einen wichtigen Beitrag auf dem Gebiet der immunologischen

Grundlagenforschung, indem sie basierend auf ihren Erkenntnissen zu absoluten Zellzahlen

regulatorischer T-Zellen und deren Veränderungen neue Fragen für die weitere Erforschung der Funktion

und der Bedeutung regulatorischer T-Zellen bei Gesunden und im Krankheitsbild der atopischen

Dermatitis aufwirft.

1

INHALTSVERZEICHNIS

Abkürzungsverzeichnis................................................................................... 3

Abbildungsverzeichnis.................................................................................... 5

1 Einleitung ............................................................................................. 7

1.1 T-Lymphozyten...................................................................................... 7

1.2 CD4+ T-Zellen........................................................................................ 9

1.3 Regulatorische T-Zellen ...................................................................... 10

1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3 ................................................................ 16

1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen.......................................................... 18

1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen ............................... 19

2 Fragestellung..................................................................................... 21

3 Probanden, Material und Methoden................................................. 22

3.1 Probanden........................................................................................... 22

3.2 Materialien........................................................................................... 23

3.2.1 Labormaterialien und Geräte .................................................. 23

3.2.2 Reagenzien............................................................................. 24

3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper ........................................... 25

3.3 Methoden ............................................................................................ 25

3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes........................................ 25

3.3.2 Isolation der PBMC................................................................. 26

3.3.3 Anfärbung der PBMC.............................................................. 27

3.3.4 Durchflusszytometrie .............................................................. 31

3.3.5 Statistische Auswertung.......................................................... 39

2

4 Ergebnisse ......................................................................................... 40

4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit

atopischer Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als

Gesunde.............................................................................................. 41

4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-

Zellen: Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like

regulatorischen T-Zellen...................................................................... 43

4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer

Dermatitis erkrankter Kinder................................................................ 45

4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten............. 45

4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen ................... 48

5 Diskussion ......................................................................................... 51

5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten

mit atopischer Dermatitis: geringere Funktion -

kompensatorische Erhöhung der Zellzahl?! ........................................ 51

5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von

memory-like regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und

periphere Expansion............................................................................ 54

5.3 Ausblick ............................................................................................... 57

6 Literaturverzeichnis .......................................................................... 60

7 Anhang ............................................................................................... 67

3

Abkürzungsverzeichnis

+ positiv

- negativ

AD atopische Dermatitis

Ag Antigen

aTregs adaptive regulatorische T-Zellen (= iTregs)

BD Becton Dickinson

Cat.-No. Katalognummer

CD cluster of differentiation (Oberflächenmerkmale)

DNA Desoxyribonukleinsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

Emmax Emissionsmaximum

Exmax Exzitationsmaximum

FACS fluorescence activated cell sorter

FCS fötales Kälberserum

FH forkhead-domain

FITC Fluorescein Isothiocyanat

FOXP forkhead box protein

FSC forward scatter

g Erdschwerebeschleunigung

Ig Immunglobulin

IFN Interferon

IL Interleukin

IPEX kompexes Krankheitsbild: Immundysregulation,

Polyendokrinopathie, Enteropathie, x-chromosomal vererbt

iTregs induzierte regulatorische T-Zellen (= aTregs)

Jr Junior

LZ Leucin Zipper

M1 Marker1

M2 Marker2

MHC major histocompatibility complex

mRNA messenger ribonucleic acid

4

nm Nanometer

nTregs natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen

p Signifikanzniveau

PBMC peripher blood mononuclear cells

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PE Phycoerythrin

PerCP Peridinin Chlorophyll

R1 Region1

R2 Region2

R3 Region3

RAST Radio-Allergen-Sorbent-Test

RPMI Roswell Park Memorial Institute (Zellkulturmedium)

SSC side scatter

SCORAD severity scoring of atopic dermatitis

TCR t cell receptor

Teff T-Effektorzelle

TGF transforming growth factor

TH T-Helferzelle

TNF tumor necrosis factor

Tr/ Tregs T regulatorische Zellen

ZNfinger Zinkfinger

5

Abbildungsverzeichnis

Seite

Abbildung 1 Schematische Darstellung der Entwicklung, des

Phänotyps und der Effektorfunktionen von

regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen

14

Abbildung 2 Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins 17

Abbildung 3 Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient 26

Abbildung 4 Zellzählung mittels Neubauerkammer 27

Abbildung 5 FOXP3 Antigen-Antikörperbindung 29

Abbildung 6 Immunfluoreszenz 30

Abbildung 7 Schematische Darstellung des Durchflusszytometers 32

Abbildung 8 Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung 33

Abbildung 9 Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut 35

Abbildung 10 Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von

Lymphozyten

36

Abbildung 11 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten

in Bezug auf Region1 (Abbildung 10)

37

Abbildung 12 Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf

Region2 (Abbildung 11)

37

Abbildung 13 Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten

in Bezug auf Region1 (Abbildung 10)

38

Abbildung 14 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf


38

Abbildung 15 Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf


39

Abbildung 16 Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen

(CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+

naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like)

regulatorischer T-Zellen

42

Abbildung 17 Vergleich der altersabhängigen Veränderung der

Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen

44


Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten

46

6

Abbildung 19 Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten,

mononukleären Zellen und Lymphozyten

47


Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen

49

Abbildung 21 Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+,

CD4+CD45RA+ (naiven) und CD4+CD45RA- (Memory) T-

Helferzellen

50

7

1 Einleitung

1.1 T-Lymphozyten

T-Lymphozyten oder kurz T-Zellen sind eine für die Immunabwehr wichtige

Gruppe von Leukozyten. Sie sind in der Lage, spezifische Antigene zu

erkennen, gezielt zelluläre Abwehrmechanismen einzusetzen und

Antikörperbildung zu induzieren.

T-Lymphozyten erkennen Antigene ausschließlich in Form von Oligopeptiden,

die ihnen auf MHC-Molekülen von speziellen antigenpräsentierenden Zellen

(dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) präsentiert werden.

Dieses Phänomen wird als MHC-Restriktion bezeichnet. Die Antigen-MHC-

Komplexe werden von T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) erkannt, welche auf den

Oberflächen von T-Lymphozyten zu finden sind.

Ein T-Zell-Antigenrezeptor ist an den Proteinkomplex CD3 gebunden. CD3 ist

für die intrazelluläre Signaltransduktion nach Stimulation des T-Zell-Rezeptors

verantwortlich. Die Signaltransduktion führt zur differenzierten Gentranskription,

die für die Proliferation, Differenzierung, Ausbildung der Effektorfunktionen und

das Überleben von T-Zellen notwendig ist.

Für eine effektive Antigenerkennung und Antigenreaktion sind verschiedenste

Korezeptoren von enormer Bedeutung. Sie verbessern und stabilisieren den

Kontakt zwischen T-Zelle und antigenpräsentierender Zelle bzw. Zielzelle.

Außerdem sind sie an der Regulierung der Signaltransduktion über

kostimulierende oder hemmende Signale beteilgt.

Zwei dieser Korezeptoren dienen gleichzeitig als Oberflächenmarker für T-

Helferzellen: CD4 und CD45.

CD4 interagiert mit MHC-Klasse-II-Molekülen und stabilisiert den Kontakt

zwischen T-Zelle und Zielzelle. Außerdem ist CD4 durch Bindung einer

Thyrosinkinase an der Signaltransduktion beteiligt.

CD45 besitzt eine katalytische Funktion als Thyrosinphosphatase und trägt

daher eine zentrale Rolle in der Bereitstellung notwendiger Kinasen für die

Signaltransduktion. Ohne funktionales CD45 können T-Lymphozyten nicht über

ihren Antigenrezeptor stimuliert werden.

8

T-Zellen entwickeln sich aus lymphatischen Vorläuferzellen, die wie alle

Blutzellenvorläufer im Knochenmark aus einer pluripotenten hämatopoetischen

Stammzelle entstehen. Einige dieser lymphatischen Vorläuferzellen wandern

zum Thymus. Dort werden sie als Thymozyten bezeichnet.

Der Thymus als primär lymphatisches Organ wird als Ort der zentralen T-Zell-

Entwicklung bezeichnet (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002).

Der Thymus wächst rapide während der Embryonalphase und in der Kindheit

und erreicht seine absolut maximale Größe in der Pubertät. Danach stagniert

sein Wachstum und er involiert fortschreitend bis in das hohe Alter. Die

Involution ist gekennzeichnet durch ein vermindertes Gewicht des Thymus, eine

lymphoide Atrophie und einen Ersatz durch Fettstrukturen (Simpson J.G. et al.,

1975).

Im Thymus reifen Thymozyten durch verschiedene Stimuli von

hämatopoetischen und epithelialen Stromazellen zu naiven T-Zellen aus.

Die Reifung der Thymozyten erfolgt in verschiedenen Stadien. Das erste

Stadium zeichnet sich durch die fehlende CD4 und CD8 Expression und den

Mangel eines vollständigen T-Zell-Antigenrezeptors auf Thymozyten aus. Die

Thymozyten werden hier als doppelt-negativ bezeichnet.

In der zweiten Reifungsphase zeichnen sich die Thymozyten durch eine

Expression von CD4 und CD8 aus. Sie werden nun als doppelt-positive

Thymozyten bezeichnet.

Aus den doppelt-positiven Thymozyten entwickeln sich schließlich im dritten

Stadium die reifen, einfach positiven, naiven CD4+CD8- oder CD4-CD8+ T-

Lymphozyten. Diese naiven T-Zellen verlassen den Thymus und wandern über

Blut oder Lymphgefäße in das periphere lymphatische Gewebe.

Im Thymus unterliegen die reifenden T-Zellen einem Prozess der als positive

oder negative Selektion bezeichnet wird. Dieser Prozess stellt sicher, dass reife

T-Zellen Fremd-Antigene ausschließlich im Kontext mit eigenen MHC-

Molekülen erkennen und dass eine Immunantwort gegen Selbst-Antigene

ausbleibt. Diese Selektion findet auf der zweiten Entwicklungsstufe der

Thymozyten statt.

9

Thymische Selektion kann nicht in jedem Fall gewährleisten, dass autoreaktive

T-Zellen daran gehindert werden, als reife, funktionelle Zellen den Thymus zu

verlassen. Dieses Phänomen ist erklärbar durch die Antigen-Vielfalt des

Körpers und die gleichzeitige Insuffizienz des Thymus, alle körpereigenen

Antigene zu exprimieren.

Zur Aufrechterhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz, die die Fähigkeit des

Körpers beschreibt, peripher autoreaktives Verhalten zu unterdrücken, sind

verschiedene Mechanismen bekannt. Als wahrscheinlich wichtigster Bestandteil

der peripheren T-Zell-Toleranz ist hier die Aktivität der regulatorischen T-Zellen

zu nennen (Holländer G.A. et al., 2006; Janeway C.A. et al., 2002).

1.2 CD4+ T-Zellen

CD4+ T-Zellen, auch T-Helferzellen genannt, stellen eine Subpopulation der T-

Lymphozyten dar und tragen den CD4-Korezeptor an ihrer Oberfläche. Sie

werden, wie in 1.1 beschrieben, im Thymus aus Thymozyten differenziert und

wandern als naive CD4+ T-Zellen in die Peripherie. Dort werden sie zu T-

Effektorzellen aktiviert oder differenzieren zu CD4+ Gedächtniszellen, den

Memory T-Zellen.

Diese Aktivierung der CD4+ T-Zellen erfolgt über Antigenkontakt. Antigene

werden von antigenpräsentierenden Zellen auf MHC-II-Molekülen dargeboten.

Durch Bindung des MHC-II/ Antigen-Komplexes an den TCR wird die CD4+ T-

Zelle aktiviert, setzt Zytokine frei und beginnt zu proliferieren.

Anhand des sezernierten Zytokinmusters können die aktivierten CD4+ T-Zellen,

die T-Effektorzellen, in zwei Subpopulationen unterteilt werden. Die Zellen vom

Subtyp TH1, auch TH1-Effektorzellen genannt, sezernieren typischerweise

IFNχ, IL-2 und TNFβ. Die TH2-Zellen, auch TH2-Effektorzellen genannt,

sezernieren die Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und TGFβ.

10

TH1-Zellen steuern durch ihre Zytokinausschüttung die Immunantwort in eine

zellulär betonte Richtung, die sich unter anderem in einer

Aktivierung von Makrophagen äußert. TH2-Zellen steuern die Immunantwort in

eine humoral betonte Richtung. Sie aktivieren durch ihr Zytokinmuster B-Zellen

und veranlassen eine Antikörperproduktion.

Etwa 5% aller naiven CD4+ T-Zellen differenzieren zu Memory T-Zellen. Die

phänotypische Unterscheidung von naiven CD4+ T-Zellen und Memory T-Zellen

wird durch die Isoformen des Oberflächenproteins CD45 ermöglicht. Naive

CD4+ T-Zellen exprimieren die Isoform CD45RA, Memory T-Zellen hingegen die

Isoform CD45RO, die einer Spleißvariante des CD45RA entspricht.

Memory T-Zellen steuern im Gegensatz zu den T-Effektorzellen die

Immunantwort nicht in eine spezifische Richtung. Sie können sowohl

dendritische Zellen als auch B-Zellen aktivieren und die entsprechenden

Signale zur Antikörperproduktion bereitstellen. Memory T-Zellen besitzen

zudem die Fähigkeit, auch nach Jahren bei erneutem Kontakt mit dem gleichen

Antigen eine schnelle und effiziente Immunantwort zu vermitteln (Holländer

G.A. et al., 2006).

1.3 Regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen, auch T-Regulatorzellen oder Tregs genannt, stellen

eine Subpopulation der CD4+ T-Zellen dar. Sie wurden 1995 erstmalig von

Sakaguchi et al. beschrieben.

So genannte Suppressor-Zellen, denen regulatorische Funktionen

zugesprochen wurden, wurden schon 1971 von Gershon und Kondo identifiziert

(Gershon R.K. et Kondo K., 1971).

Wegen widerspüchlicher Forschungsergebnisse verschwand jedoch das

Konzept der T-Zell-Suppression in den 1980ern.

Sakaguchi et al. erregten als Erste wieder das Interesse an den nun so

genannten regulatorischen T-Zellen durch Entdeckung einer Population von

CD4+ Zellen, die CD25 (alpha-Kette des IL-2-Rezeptors) hoch exprimierte und

in einem Mausmodell Autoimmunität verhinderte (Sakaguchi S. et al., 1995).

11

Heute weiß man, dass regulatorische T-Zellen bei Menschen in der Lage sind,

zerstörende immunologische Abwehrreaktionen zu kontrollieren und

Immunantworten gegen ungeeignete Ziele wie Selbst-Antigene oder nicht-

schädliche externe Antigene zu verhindern. Ihre Funktion ist wesentlicher

Bestandteil der periperen Toleranz (Bacchetta R. et al., 2007).

Es sind verschiedene Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen

beschrieben, die koexistieren und zur Immunsuppression beitragen (vgl.

Abbildung 2, S. 19).

Zu unterscheiden sind natürlich vorkommende CD4+CD25high regulatorische T-

Zellen, peripher induzierte CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, zum Beispiel

Tr1 und TH3 Zellen, sowie CD4+CD25high regulatorische T-Zellen, die sich in

der Peripherie durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entwickeln (Beyer M.

et Schultze L., 2006).

Die natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen werden auch

als nTregs bezeichnet. Sie entwickeln sich im Thymus und sind daher von

denjenigen CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen abzugrenzen, welche in der

Peripherie induziert werden. Die peripher induzierten CD4+CD25+

regulatorischen T-Zellen werden auch als adaptive oder induzierte

regulatorische T-Zellen (aTregs/ iTregs) bezeichnet (Bacchetta R. et al., 2007;

Casares N. et al., 2007).

aTregs werden in verschiedene Zelltypen unterschieden: die IL-10

produzierenden Typ 1 regulatorischen T-Zellen (Tr1), deren suppressive

Funktion bei Allergien, Autoimmunität und allogener Transplantation gut belegt

ist (Bacchetta R. et al., 2007), sowie die TH3-Zellen, die die Aktivität

konventioneller T-Zellen in einer TGF-β abhängigen Art unterdrücken (Buckner

J.H. et al., 2004) und nach oralem Antigenkontakt oder durch Stimulation von

CD4+CD25- T-Zellen in Anwesenheit von TGF-β induziert werden (Valmori D. et

al., 2005).

12

aTregs entwickeln sich unter dem Einfluss von vermutlich unreifen

dendritischen Zellen und/ oder der Anwesenheit von IL-10 und TGF-β, aber

auch unter Anwesenheit immunsuppressiver Medikamente wie

Glukokortikoiden und Vitamin D3 (Verhagen J. et al., 2006). Sie entwickeln sich

Foxp3 unabhängig (Vieira P.L. et al., 2004).

Foxp3-abhängig entwickeln sich die nTregs (Hori S. et al., 2003) und die

peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs, die

den nTregs sehr ähnlich sind (Bacchetta R. et al., 2007).

nTregs, die im Thymus entstehen, unterdrücken die Proliferation von CD4+ und

CD8+ T-Effektorzellen, sowie die IL-2 mRNA-Transkription und die damit

verbundene IL-2 Produktion, welche als Wachstumsfaktor für die autokrine

Proliferation von T-Zellen fungiert. Sie supprimieren hauptsächlich via Zell-Zell-

Kontakt (Bacchetta R. et al., 2007). Der genaue Mechanismus der Suppression

ist jedoch bisher noch nicht bekannt.

nTregs unterdrücken nicht nur T-Zellen, wie die aTregs, sondern auch natural

killer cells, die Reifung von dendritischen Zellen und die Antikörperproduktion

der B-Zellen (Bacchetta R. et al., 2007).

Die peripher durch Konversion von CD4+CD25- T-Zellen entstehenden Tregs

sind eine von Akbar et al. beschriebene Population von regulatorischen T-

Zellen. Sie ähneln phänotypisch den nTregs und sind vermutlich diejenigen

Zellen, die nach der Thymusinvolution den Pool der nTregs aufrecht erhalten.

Das Modell für die periphere Entstehung von diesen Tregs im Menschen lautet:

Naive T-Zellen werden durch die Begegnung mit einem Antigen oder einer

antigenpräsentierenden Zelle geprimed. Sie verlieren daraufhin ihren

Oberflächenmarker CD45RA und exprimieren CD45RO. Erneuter

Antigenkontakt führt zur Differenzierung der nun aktivierten Zellen zu einer hoch

differenzierten Population, den CD4+CD45RO+ Memory T-Zellen. Diese hoch

differenzierten Zellen neigen zu Apoptose und produzieren insuffiziente Levels

von IL-2 für die autokrine Proliferation. Sie sind daher leicht in das Stadium der

Anergie zu überführen. Mit der Überführung erlangen sie ihre suppressive

Aktivität und werden als regulatorische T-Zellen bezeichnet.

13

Dieses Modell schließt die Koexistenz anderer Populationen von thymisch

produzierten oder cytokin-abhängigen Populationen regulatorischer T-Zellen

nicht aus (Akbar A.N. et al., 2003).

Abschließend lässt sich festhalten, dass in der aktuellen Literatur zu den

Subpopulationen der regulatorischen T-Zellen keine klare schematische

Darstellung der Populationen vorliegt. Abbildung 1 zeigt ein selbsterstelltes

Schema aus Informationen zu regulatorischen T-Zellen der angegeben Quellen.

14

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Entwicklung, des Phänotyps und der Effektorfunktionen von regulatorischen T-Zellen und T-Effektorzellen. (Akbar, 2003;

Banham, 2006; Buckner, 2004; Chatenoud, 2006; Holländer, 2006; Shevach, 2004; Toda, 2006;

Vieira, 2004)

CD4+

CD4+

CD25high

FOXP3+

CD45RA+

TH1, TH2(Teff)

CD4+

CD25-

FOXP3-

Thymus

CD4+

CD25-

FOXP3-

Th3

Tr1

CD4+

CD25high

FOXP3+

CD45RO+

aTregs / iTregs

CD4+

CD25-

FOXP3-

CD4+

CD25high

FOXP3+

CD45RA+

Antigen-

stimulation

CD4+

CD25high

FOXP3+

CD45RO+

CD4+

CD25high

FOXP3-

CD45RO+

CD4+

CD25+

FOXP3-

CD45RO+

CD4+

CD25high

FOXP3-

CD45RO+

nTregs

TH1: IFNχ, IL-2, TNFβ

TH2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, TGFβ

IL-10high

TGF-βhigh

In vivo:

Zell-Zell Kontakt

Cytokinunabhängig

?

Z

I

E

L

Z

E

L

L

E

N

Antigen-

stimulation

naive-like nTreg

Antigen-

stimulation

memory-like nTreg

Naive CD4+

T-Zelle

Memory T-Zelle

15

Regulatorische T-Zellen können nach ihrem Entwicklungsstand in zwei

verschiedene Zelltypen unterschieden werden.

Der eine Typ regulatorischer T-Zellen ist charakterisiert durch die Expression

von CD45RAhigh und CD45ROlow. CD45RA gilt, wie bei den T-Helferzellen, als

Marker für naive Zellen. Zugehörige zu diesem Typ Zellen werden als naive-like

regulatorische T-Zellen bezeichnet.

Der andere Typ regulatorischer Zellen ist durch die Marker CD45ROhigh und

CD45RAlow charakterisiert. CD45RO gilt als Memory-Zell-Marker. Daher werden

Zugehörige zu diesem Typ Zellen als memory-like regulatorische T-Zellen

bezeichnet (Banham A.H. et al., 2006).

Zusammenfassend ist zu sagen, dass regulatorische T-Zellen CD4 und CD25

als Oberflächenproteine exprimieren, über Zell-Zell Kontakt und

Zytokinausschüttung Zielzellen unterdrücken und damit die Immunhomöostase

aufrecht erhalten. Außerdem sind sie anerg (inaktiv), besitzen eine geringe

Proliferationskapazität und neigen zu Apoptose (Akbar A.N. et al., 2003).

CD25 ist jedoch als Marker für regulatorische T-Zellen nicht spezifisch. CD25

wird außer auf regulatorischen T-Zellen auf aktivierten T-Effektorzellen, den

TH1- und TH2-Zellen exprimiert. Er kann daher nicht direkt genutzt werden, um

regulatorische T-Zellen von aktivierten T-Effektorzellen zu unterscheiden.

Um die regulatorischen T-Zellen mit einer nur geringen Kontamination von T-

Effektorzellen bestimmen zu können, bedarf es der Analyse der CD4+CD25high

Population. Diese Population besitzt regulatorische Aktivität und exprimiert

CD25 auf einem hohen Niveau.

Als signifikantester Marker für die regulatorischen T-Zellen gilt jedoch FOXP3,

ein Transkriptionsfaktor, der für die Entwicklung der regulatorischen T-Zellen

von zentraler Bedeutung ist (Banham A.H. et al., 2006).

16

1.4 Transkriptionsfaktor FOXP3

Das „Forkhead box Protein“ FOXP3 ist Mitglied der P Subfamilie der Fox-

Transkriptionsfaktoren (Lopes J.E. et al., 2006).

Die Familie der Fox-Transkriptionsfaktoren wurde 1990 erstmalig von Weigel

und Jäckle beschrieben (Weigel D. et Jäckle H., 1990) und besteht heute aus

mindestens 43 Mitgliedern, welche in zwei Klassen unterteilt werden. Klasse 1

besteht aus den Subfamilien A-G, I-L und Q, Klasse 2 wird von den Familien H

und M-P gebildet. FOXP3 gehört demnach zur Klasse 2 dieser Familien

transkriptionaler Regulatoren (Katoh M. et al., 2004).

Die Schreibweise in Großbuchstaben definiert FOXP3 als einen humanen

Transkriptionsfaktor. Per Nomenklatur definiert die Schreibweise Foxp3 den

Transkriptionsfaktor in Mäusen, die Schreibweise FoxP3 den

Transkriptionsfaktor in allen anderen Spezies (Carlsson P. et al., 2002).

Die Fox-Transkriptionsfaktoren sind charakterisiert durch eine invariante, d.h.

stabile winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne (Lopes J.E. et al., 2006).

Diese besteht aus ca. 100 Aminosäuren (Kaestner K.H. et al., 2000).

Das FOXP3-Protein besteht aus insgesamt 431 Aminosäuren. Strukturell ist es

aus der C-terminalen winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne, einem

mittig liegenden C2H2 Zink Finger und einem ebenfalls mittig liegenden Leucin

Zipper aufgebaut. Der N-Terminus ist reich an Prolin, jedoch bisher nicht

funktionell definiert (Lopes J.E. et al., 2006).

Das FOXP3-Protein ist kodiert aus 11 Exons. Bei Menschen, im Gegensatz zu

Mäusen, ist eine zweite kürzere Isoform des FOXP3-Proteins bekannt, in

welcher das Exon 2 fehlt. Im Moment ist jedoch die Funktion dieser zwei

Unterformen nicht bekannt (Bacchetta R. et al., 2007).

17

Abbildung 2: Strukturelle Darstellung des FOXP3-Proteins (Lopes, 2006) mit C-terminaler Forkhead-Domain, mittig liegendem Zink Finger (ZN finger) und Leucin Zipper (LZ) und

alternativ gesplicetem Exon 2.

Die winged helix/ forkhead DNA-bindungs Domäne des FOXP3-

Transkriptionsfaktors kann an den IL-2 Promotor binden und die IL-2-mRNA

Transkription unterdrücken. Zusätzlich besitzt der N-Terminus des Proteins

essentielle Stellen für die Repressoraktivität. FOXP3 gilt allgemein als

Repressor, der die Bildung von IL-2, welches als Wachstumsfaktor für die

autokrine Proliferation von T-Zellen fungiert, unterdrückt.

Neben der DNA-bindungs Domäne, die außerdem wichtig für die

Kernlokalisation von FOXP3 ist, kodiert das Protein Zink Finger und Leucin

Zipper Domänen, die Homodimerisation und Heterodimerisation mit anderen

forkhead-Familienmitgliedern oder anderen DNA-bindenden Kofaktoren

erlauben (Bacchetta R. et al., 2007).

Bei einer Gen-Sequenzanalyse bildete sich das FOXP3 Gen auf dem

Chromosom Xp11.23 ab (Zavattari P. et al., 2004).

Ist das FOXP3-Protein durch Genmutationen in der kodierenden Region

verändert, kommt es klinisch zum seltenen, verherenden Krankheitsbild IPEX.

Das Krankheitsbild IPEX wurde vor mehr als 20 Jahren zum ersten Mal

beschrieben. IPEX steht als Abkürzung für ein Syndrom, das einem x-

chromosomal-rezessiven Erbgang unterliegt und sich in Immundysregulation,

Polyendokrinopathie und Enteropathie äußert. Es ist assoziiert mit einem

autoimmunen Diabetes, Hypothyreoidismus, autoimmuner hämolytischer

Anämie, wiederkehrenden Infektionen, membranöser Nephropathie, einem

Hyper-IgE und atopischer Dermatitis. Das Krankheitsbild geht meist mit einem

frühen Tod der männlichen hemizygoten Träger um den 24. Lebensmonat

einher. Todesursachen sind Sepsis und massive Gedeihstörung (Owen C.J. et

al., 2003; Torgerson T.R. et al., 2007).

Das FOXP3 Gen mutiert bei IPEX im Intervall 17-20-cM auf Chromosom Xp

11.23-Xq13.3 (Bennett C.L. et al., 2001).

18

1.5 FOXP3+ regulatorische T-Zellen

Die Entdeckung von Foxp3 als einem spezifischen Marker für natürlich

vorkommende regulatorische T-Zellen (Hori S. et al., 2003) hat zu einer

regelrechten Explosion der Forschung auf dem Gebiet der regulatorischen T-

Zellen geführt.

FOXP3 fungiert als Hauptregulator in der Entwicklung und Funktion von

natürlich vorkommenden CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und ist damit ein

Schlüssel für die Aufrechterhaltung der normalen Immunhomöostase.

Der Funktionsverlust von FOXP3 führt zu einem Mangel an regulatorischen T-

Zellen und resultiert in dem letalen Krankheitsbild IPEX. Die Überexpression

dieses Modulators führt zu schwerer Immundefizienz (Ochs H.D. et al., 2005).

Bei verschiedenen Krankheiten wurden Änderungen in der Anzahl und Funktion

von FOXP3 positiven regulatorischen T-Zellen gefunden.

Patienten mit Tumoren zum Beispiel zeigen lokal einen relativen Überfluss an

FOXP3 positiven Zellen, welche die Möglichkeit des Körpers inhibieren, die

Bildung von tumorösen Zellen zu unterdrücken (Beyer M. et Schultze J.L.,

2006).

Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie dem systemischen Lupus

erythematodes hingegen besitzen eine relative Dysfunktion von FOXP3

positiven Zellen (Alvarado-Sánchez B. et al., 2006).

In Tierstudien führte die Induktion oder Zugabe von Foxp3 positiven T-Zellen zu

einer merklichen Reduktion der Schwere von Erkrankungen wie Diabetes,

Multipler Sklerose, Asthma, inflammatorischen Darmerkrankungen, Thyreoiditis

und renalen Krankheiten (Suri-Payer E. et al., 2006).

Um jedoch regulatorische Zellen für humane Immuntherapien, die zum Beispiel

zur Heilung von Autoimmunerkrankungen, zur Verhinderung von

Transplantatabstoßungen oder zur Tumorzellinhibition beitragen, nutzen zu

können, ist es wichtig die Biologie der regulatorischen T-Zellen genau zu

verstehen (Banham A.H. et al., 2006). Dies ist Gegenstand der aktuellen

Forschung.

19

1.6 Atopische Dermatitis und regulatorische T-Zellen

Die atopische Dermatitis, auch atopisches Ekzem genannt, ist eine chronisch

rezidivierende, inflammatorische Hautkrankheit.

Die Diagnose der atopischen Dermatitis basiert auf folgender klinischer

Konstellation: Pruritus, faziale und extensorseitige rote, schuppende, manchmal

auch nässende Ekzeme bei Kindern, flexorseitige Ekzeme derselben

Morpholgie bei Erwachsenen und Chronizität der Dermatitis, die unter anderem

zur Lichenifikation führen kann.

Der klinische Phänotyp der atopischen Dermatitis ist als ein Produkt der

Interaktion zwischen prädisponierenden Genen, Umweltreizen, kutaner

Hyperreagibilität aufgrund einer defekten Hautbarrierefunktion und

immunologischen Antworten zu sehen.

Die atopische Dermatitis ist typischerweise eine Erkrankung des Säuglings- und

Kindesalters. Sie kann bis zur Pubertät ausheilen aber auch bis in das

Erwachsenenalter persistieren. Verschiedene Beobachtungen deuten darauf

hin, dass die atopische Dermatitis die kutane Manifestation einer systemischen

Erkrankung ist. Sie ist die initiale Erkrankung, die mit Nahrungsmittelallergien,

allergischer Rhinitis und Asthma bronchiale assoziiert sein kann. All diese

Erkrankungen gehören zum atopischen Formenkreis und sind charakterisiert

durch erhöhte Serum-IgE Spiegel (Leung D.Y. et al., 2004; Sitzmann F.C.,

2002; Koletzko B. et al., 1999).

Zur Beurteilung des Schweregrades der Erkrankung kann der SCORAD-Score

angewandt werden. SCORAD dient zur Klassifizierung des Schweregrades

einer atopischen Dermatitis. Als Einstufungskriterien gelten: Alter des Patienten,

dermale Ausbreitung der atopischen Dermatitis anhand der 9-er Regel (Gesicht,

Hände, Torso,...), Intensität (Erythem, Ödem/ Papulation, Exkoriation,

Lichenifikation, trockene/ nässende/ verkrustete Stellen) und subjektive

Beschwerdezeichen (Pruritus, Insomnie) (Oranje A.P. et al., 2007).

Auf histologischer Ebene kann eine dermale mononukleäre Infiltration der

Hautläsion der atopischen Dermatitis beobachtet werden.

20

Während der initialen Inflammationsphase wandern T-Effektorzellen in die

Dermis der Läsion ein und sezernieren IFN-χ. IFN-χ induziert die Apoptose von

Keratinozyten, was wahrscheinlich zu der charakteristischen ekzematösen

Hautveränderung der Patienten mit atopischer Dermatitis führt. Als Antwort auf

INF-χ regulieren die Keratinozyten die Produktion der durch INF-χ induzierten

Zytokine hoch. Dies fördert die Infiltration weiterer T-Zellen in die Epidermis und

erhöht damit die Schwere der Inflammation und der Keratinozyten-Apoptose

(Verhagen J. et al., 2006).

Die Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen

Dermatitis ist bisher wenig erforscht.

Bei Patienten mit atopischer Dermatitis konnten FOXP3 positive regulatorische

T-Zellen nicht in inflammatorischen Hautläsionen nachgewiesen werden.

Allerdings waren Tr1 Zellen, als eine Gruppe der peripher induzierten

regulatorischen T-Zellen nachweisbar. Die Abwesenheit der FOXP3+

regulatorischen T-Zellen deutete auf eine dysregulierte Kontrolle der

Inflammation hin (Verhagen J. et al., 2006).

Dass FOXP3 positive regulatorische T-Zellen eine zentrale Rolle in der

Regulation immunologischer Erkrankungen spielen, ist spätestens seit der

Beobachtung des Krankheitsbildes IPEX klar. IPEX Patienten besitzen aufgrund

eines Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine nTregs und leiden darausfolgend

an einer schweren Immundefizienz, die unter anderem von einer atopischen

Dermatitis begleitet wird (Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006).

Die genaue Rolle regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen

Dermatitis sowie die potentielle Einsetzbarkeit regulatorischer T-Zellen in der

Immuntherapie, welche möglicherweise zu einer Heilung der atopischen

Dermatitis beitragen könnte, wird weiterhin nachhaltig Gegenstand der

Forschung bleiben.

21

2 Fragestellung

Regulatorische T-Zellen wurden zuerst 1995 beschrieben. Seither sind die

regulatorischen T-Zellen zu einem zentralen Punkt der immunologischen

Forschung geworden.

Die vorliegende Studie beschäftigt sich mit der Erforschung der absoluten

Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an atopischer Dermatitis

erkrankten Kindern und Jugendlichen. Außerdem umfasst sie die Analyse der

altersabhängigen Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen beider

Probandengruppen.

Hierbei stellen sich folgende Fragen:

• Gibt es hinsichtlich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen

Unterschiede zwischen der gesunden Kontollgruppe und der Gruppe von

Patienten mit einer atopischen Dermatitis? Wie wären diese zu werten?

• Ändern sich mit dem Alter die Zellzahlen verschiedener Subpopulationen

regulatorischer T-Zellen in beiden Probandengruppen? In welchem

Zusammenhang wären diese Veränderungen zu sehen?

22

3 Probanden, Material und Methoden

In diesem Kapitel werden zunächst die Auswahlkriterien für die teilnehmenden

gesunden und an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden dargestellt. Es

folgt eine Auflistung der verwandten Materialien. Daraufhin werden die

angewandten Verfahren zur Markierung der Oberflächenantigene CD4 CD25

und CD45 sowie des intrazellulären Markers FOXP3 und die

durchflusszytometrische Analyse der Zellpopulationen beschrieben. Das Kapitel

schließt mit der Darstellung der verwandten statistischen Analyseverfahren der

experimentellen Daten.

3.1 Probanden

Insgesamt nahmen 54 Probanden an der klinischen Pilotstudie teil. Die

Probanden befanden sich im Alter von 0 bis 18 Jahren. 37 Probanden gehörten

der gesunden Kontrollgruppe an; 31 männlichen, 6 weiblichen Geschlechts; 32

deutscher, 5 anderer Herkunft. 17 Probanden waren der Gruppe an atopischer

Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zuzuordnen; 11 männlichen, 6

weiblichen Geschlechts; 13 deutscher, 4 anderer Herkunft.

Als Kriterien für die Gruppe der gesunden Kinder und Jugendlichen galten:

• Kein Leiden an einer akuten oder chronischen Krankheit

• Insbesondere kein Leiden an atopischer Dermatitis, Asthma oder

Allergien

• Keine Einnahme immunsupprimierender oder immunmodulierender

Medikamente

Als Kriterien für die Gruppe der an atopischer Dermatitis erkrankten Kinder und

Jugendlichen galten:

• Leiden an atopischer Dermatitis klassifiziert nach dem SCORAD-Score

• Erhöhtes Gesamt-IgE

• Positive RAST-Ergebnisse

23

Untersucht wurden 5 ml heparinisierten Vollbluts von gesunden und an

atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen. Die Teilnahme an

der klinischen Querschnittsstudie beschränkte sich auf die einmalige Abnahme

von 5 ml Blut. Die Ethikkommission der Ruhr-Universität Bochum und die Eltern

der Kinder erklärten ihre Zustimmung.

Die Blutproben wurden im Rahmen einer geplanten Operation durch einen

standardmäßig gelegten venösen Zugang, im Rahmen einer erforderlichen

Blutabnahme zur Vaterschaftstestung oder im Rahmen einer geplanten

Allergietestung abgenommen.

Mitwirkende Abteilungen waren:

• die kinderchirugische Praxis Dr. med. M. Standke, Bochum-

Wattenscheid

• die anästhesiologische und unfallchirurgisch-orthopädische Abteilung

des St. Josef-Hospital Bochum

• die Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum

• die Praxis für Allgemeinmedizin Dr. med. J. Möllers, Rheine

• die Sprechstunde für Kinder mit atopischer Dermatitis von Herrn Prof. Dr.

med. U. Schauer in der Kinderklinik Bochum.

3.2 Materialien

3.2.1 Labormaterialien und Geräte

Labormaterialien

1,5 ml sicher verschließbares Röhrchen

1,8 ml Cryo Röhrchen

5 ml Polystyrene Round Bottom Tube

10 ml serologische Pipette, steril

15 ml konisches Röhrchen (Blue Max Jr.)

50 ml konisches Röhrchen (Blue Max)

Deckgläser optisch plan geschliffen

Pipettenspitzen (klein/ groß)

Eppendorf, Bestell-Nr. 0030 120.086

Nunc, Dänemark, Cat.-No. 363401

Falcon/ BD Europe, Cat.-No. 352052




Eppendorf

24

Geräte

Arbeitsbank Heraeus LaminAir, steril

Auflichtmikroskop

Automatische Pipette Express

Durchflusszytometer FACScanTM

Eppendorf Reference 20 Pipette (2-20 µl)

Gefriertruhe (–88°C)

Kühlschrank

Labsystems 4500 Finnpipette (200-1000 µl)

Stickstoffbehälter

Styroporbehälter

Vortexer (VF2)

Wasserbad

Zählkammer nach Neubauer

Zentrifuge (Omnifuge 2.0 RS)

Heraeus Instruments

Zeiss (West Germany)

Falcon/ BD, USA

BD

Eppendorf

Profiline, National Lab Gubtt

Liebherr

Thermo Scientific

Chronos Biosafe, Messer

Falcon

Janke und Kunkel IKA-Labortechnik

Köttermann

Heraeus sepatech

3.2.2 Reagenzien

Biocoll-Trennlösung (Dichte 1.077 g/ ml)

Einfriermedium (Freeze):

4,4 ml RPMI 1640

100 µl Penicillin/ Steptomycin (1%)

1 ml DMSO

4,5 ml FCS

FoxP3 Staining Buffer Set

• Fixation/ Permeabilization Diluent

• 10x Permeabilization Buffer

• Fixation/ Permeabilization Concentrate

Heparin-Natrium Braun 100.000 I.E.

PBS (Dulbecco), steril

PBS-0,1% NaAcid

Rattenserum

Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L6115

Cat.-No. 00-5523-00, NatuTec

• Cat.-No. 00-5223-56, NatuTec



Braun Melsungen AG, Melsungen

Cat.-No. 3212010

Biochrom AG, Berlin, Cat.-No. L1825

Sigma, USA, Cat.-No. R 9759

25

Türk´sche Lösung

Fluka Chemie GmbH, Schweiz,

Cat.-No. 93770

3.2.3 Antikörper und Kontrollantikörper

Antikörper

FITC anti-human CD25

FITC labeled anti-human CD45RA

PE anti-human CD25

PE-conjugated anti-human Foxp3

PerCP labeled anti-human CD4

BD-Pharmingen™

Cat.-No. 555431

BD-Pharmingen™

Cat.-No. 555488

BD-Pharmingen™

Cat.-No. 555432

eBioscience

Cat.-No. 12-4776-73

BD Biosciences, USA

Cat.-No. 345770

Kontrollantikörper

Mouse IgG2a PerCP

Mouse γ1 FITC

Mouse γ1 PE

PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control

BD Immuncytometry systems, USA

Cat.-No. 349054


Cat.-No. 345815


Cat.-No. 345816

eBioscience

Cat.-No. 12-4321-71

3.3 Methoden

3.3.1 Erstellung des Differentialblutbildes

Zu Beginn der durchgeführten Studie wurden 5 ml Vollblut von gesunden

Kindern sowie von Patienten mit atopischer Dermatitis der Kinderklinik Bochum

abgenommen und in 200 µl Heparin aufgenommen. Von jeder heparinisierten

Blutprobe wurden 500 µl für ein Differentialblutbild entnommen. Die Erstellung

26

des Differentialblutbildes erfolgte im Labor des St. Josef-Hospital Bochum. Das

Blutbild wurde verwandt, um prozentuale Zellwerte in absolute Zellzahlen

umzurechnen.

3.3.2 Isolation der PBMC

Für die Präparation der PBMC, der peripher blood mononuclear cells, wurde

das heparinisierte Blut im Verhältnis 1:3 mit PBS gemischt und anschließend in

einem 50 ml Falcon Röhrchen auf 15 ml Ficoll (Biocoll) geschichtet. Danach

erfolgte die Auftrennung der Zellen bei 660xg und Zimmertemperatur für 20

Minuten in der Zentrifuge ohne Aktivierung der Bremse.

Abbildung 3: Lymphozytenisolierung mittels Ficoll-Gradient. (Jacobs, 1996) Charakteristische Schichtung vor (links) und nach (rechts) Zentrifugation von auf Ficoll-Lösung

geschichtetem heparinisiertem Vollblut. Rechts: mittig liegende Interphase mit Lymphozyten und

Monozyten.

Der PBMC-Ring mit Lymphozyten und Monozyten wurde abpipettiert und

zweimalig in PBS bei 300xg und 200xg sowie Zimmertemperatur und unter

Aktivierung der Bremse in der Zentrifuge gewaschen.

Für die Zellzählung wurde das gewonnene Zellpelet in 5 ml PBS aufgenommen.

Eine 10 µl Probe wurde entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt.

Die angefärbten Zellen wurden nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer

Neubauer-Zählkammer gezählt. Dabei wurden alle neun Quadranten mit ihren

16 Feldern berücksichtigt.

27

Abbildung 4: Zellzählung mittels Neubauerkammer. (Jacobs, 1996) Die Kammer (links) enthält zwei Zählgitter, eines davon ist rechts vergrößert dargestellt.

Die isolierten PBMC wurden in 1 ml gekühltes Einfriermedium aufgenommen

und zunächst in Styroporbehältern in einer Tiefkühltruhe langsam auf –80°C

heruntergekühlt, um sie dann nach einigen Tagen in die mit flüssigem Stickstoff

befüllten Tanks zu überführen. Dort wurden die Proben bis zu den endgültigen

Messungen gelagert und gesammelt.

3.3.3 Anfärbung der PBMC

Zur Analyse der Zellsubpopulationen wurden die eingefrorenen Zellen in 40 ml

37°C warmem PBS aufgetaut und resuspendiert. Bei 300xg wurde diese

Zellsuspension 10 Minuten in der Zentrifuge gewaschen und anschließend

nochmals in kaltem PBS bei 200xg für 15 Minuten zentrifugiert. Das

gewaschene Zellpelet wurde in 1 ml PBS resuspendiert und hiervon wurde eine

10 µl Probe entnommen und in 90 µl Türk´scher Lösung gefärbt. Die Zellen

wurden erneut nach Aufschüttelung auf dem Vortexer in einer Neubauer-

Zählkammer ausgezählt. Die ermittelte Zellzahl diente zur Berechung des

Verdünnungsfaktors.

Anschließend wurden zwei Färbereihen durchgeführt.

28

3.3.3.1 Markierung von CD4, CD25 und FOXP3

Ziel der ersten Färbereihe war es, die Oberflächenmarker CD4 und CD25 und

den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3 fluoreszierend kenntlich zu

machen.

Dazu wurde die Probe zunächst mit PBS auf einen Wert von 1x106 Zellen/ 100

µl verdünnt. Von dieser geeichten Zellsuspension wurden zwei Proben à 100 µl

entnommen. Die Oberflächenmarker CD4 und CD25 wurden in beiden Proben

durch Zugabe von 20 µl PerCP labeled anti-human CD4 und 20 µl FITC anti-

human CD25 angefärbt.

Anschließend wurden die mit den fluoreszenzmarkierten Antikörpern

angereicherten Proben für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. In jede

Probe wurde 1 ml kühlschrankkaltes PBS hinzu gegeben und die Proben

wurden 5 Minuten bei 200xg gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes

wurde zu beiden Proben 1 ml nach Herstellerangabe erstellte Fix/ Perm

Solution gegeben. Diese diente der Perforierung der Zellmembran, sowie der

Nukleolenmembran, um eine Markierung des intranukleären Transkriptions-

faktors FOXP3 durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper zu ermöglichen.

Dann wurden die Proben 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank fixiert. Nach

darauf folgendem einmaligem Waschen mit 3 ml PBS bei 580xg wurde den

Proben der nach Herstellerangaben erstellte Permeabilisierungspuffer

hinzugefügt.

Nach 2-maligem Waschen der Proben mit Perm Puffer bei 200xg für 5 Minuten

wurden die Zellen durch Zugabe von 2 µl Rattenserum (2%) geblockt und

anschließend bei 4°C für 15 Minuten im Kühlschrank inkubiert. Diese

Blockierung diente zur Stabilisierung der Zellstruktur und verhinderte damit eine

unspezifische Bindung des FOXP3-Antikörpers.

Zu einer Probe wurden anschließend 20 µl des PE-conjugated anti-human

FoxP3 hinzugegeben. Zur anderen Probe wurden 20 µl des Kontrollantikörpers

PE-conjugated Rat IgG2a Isotype Control pipettiertet.

29

Abbildung 5: FOXP3 Antigen-Antikörperbindung. (Lopes, 2006) Bindung des FOXP3 spezifischen Antikörpers an den intranukleären Transkriptionsfaktor FOXP3. FOXP3

mit Exon 2, Zinkfinger (ZN finger), Leucin Zipper (LZ) und Forkhead-Domain (FH).

Darauf folgte die Inkubation der Proben für 30 Minuten bei 4°C im Kühlschrank.

Den Abschluss der Färbungen bildete das einmalige Waschen mit 2 ml Perm

Puffer.

Zusammenfassend wurde durch diese Färbereihe die Fluoreszenzmarkierung

der Oberflächenproteine CD4, CD25 und des intranukleären Proteins FOXP3

erreicht. Es konnte die Anzahl der CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen und der

CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen durchflusszytometrisch bestimmt

werden.

3.3.3.2 Markierung von CD4, CD25, CD45RA

Die zweite Messreihe diente der Färbung der Oberflächenmarker CD4, CD25

und CD45RA. Hieraus konnte die Anzahl CD4+ T-Zellen, der so genannten T-

Helferzellen, der CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- der so genannten naiven

und Memory T-Zellen, der CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA-,

der so genannten naive-like und memory-like regulatorischen T-Zellen

durchflusszytometrisch bestimmt werden.

30

Abbildung 6: Immunfluoreszenz. (Jacobs, 1996) Markierung von oberflächlichen Proteinen (CD4, CD25, CD45RA) mit direkt Fluoreszenzfarbstoff-

markierten Antikörpern.

Zur Färbung der letzt genannten Oberflächenproteine wurden zwei Proben à

100 µl aus der geeichten PBMC-Zellsuspension mit einem jeweiligen Inhalt von

105 Zellen entnommen.

Zu der ersten Probe wurden jeweils 5 µl des PerCP labeled anti-human CD4,

des FITC labeled anti-human CD45RA und des PE anti-human CD25

hinzugegeben. Die Kontrollprobe erhielt jeweils 5 µl der Kontrollantikörper

Mouse IgG2a PerCP, Mouse γ1 FITC und Mouse γ1 PE.

Die Proben wurden für 15 Minuten bei 4°C im Kühlschrank inkubiert und

anschließend mit 1 ml PBS-Acid bei 200xg für 5 Minuten in der Zentrifuge

gewaschen. Nach Abgießen des Überstandes wurden die Zellen in 200 µl PBS-

Acid resupendiert. Die Anwendung von PBS-Acid diente zur Stabilisierung der

Zellen.

Abschließend konnten die Proben durchflusszytometrisch gemessen werden.

Es wurde die Anzahl der CD4+, der CD4+CD45RA+, CD4+CD45RA-, der

CD4+CD25+CD45RA+ und der CD4+CD25+CD45RA- T-Zellen bestimmt.

Diese zwei Färbereihen wurden zur Erfassung der vier Parameter CD4, CD25,

CD45RA und FOXP3 in dem drei-kanaligen Durchflusszytometer des

Studienlabors durchgeführt.

31

3.3.4 Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie ist eine Methode zur Analyse von Einzelzellen in

Suspension auf der Grundlage von Fluoreszenz- und Streulichteigenschaften.

Verschiedene physikalische und chemische Zelleigenschaften werden simultan

auf der Einzelzellebene gemessen. Relative Zellgröße, Granularität sowie bis

zu 12 verschiedene Fluoreszenzfarben (je nach Geräteausstattung) können für

viele tausend Zellen umgehend ermittelt werden.

Der Zellsuspension werden Antikörper-Fluorochrom-Konjugate zugesetzt. Die

Antikörper sind gegen spezifische Antigene der Zellen gerichtet (s. Abbildung 6,

Seite 30). Dadurch können beispielsweise Subpopulationen von Zellen

unterschieden werden.

Monoklonale fluoreszenzmarkierte Antikörper sind mittlerweile in großer

Auswahl kommerziell erhältlich, sodass breite Anwendungsmöglichkeiten in der

Klinik als auch in der Grundlagenforschung bestehen.

Zur Analyse wird die in einem Reagenzröhrchen vorgegebene Zellsuspension

über eine Stahlkapillare durch Überdruck in die aus Quarzglas bestehende

Messküvette eingeführt. Beim Eintreten in die Messküvette werden die Zellen

stark beschleunigt, wodurch sich Aggregate auftrennen. Umgeben von

Trägerflüssigkeit erreichen die Zellen so den Analysepunkt, einen Argonlaser

mit 488nm Wellenlänge, aufgereiht wie an einer Perlenschnur. Dieses

Phänomen wird als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet.

32

Abbildung 7: Schematische Darstellung des Durchflusszytometers. (Jacobs, 1996) Druckluftabhängige Wanderung der Einzelzellsuspension über eine Stahlkapillare in die Messküvette.

Nach hydrodynamischer Fokussierung Laserbestrahlung und Analyse der Streueigenschaften und der

Fluoreszenz der Zellen.

Das Licht des Lasers wird durch die Zellen gestreut. Die Streuung des Lichtes

wird durch die Zellgröße, die Struktur der Zellmembran sowie den Zellkern und

die intrazellulären Bestandteile beeinflusst.

Beim Streulicht unterscheidet man den sogenannten forward scatter, das

Streulicht längs zum Anregungslichtstrahl, und den sogenannten side scatter,

das Streulicht im rechten Winkel zu dieser Achse. Der forward scatter ist dabei

in erster Linie ein Maß für die Zellgröße (kleine Zellen streuen weniger),

während der side scatter vor allem die intrazelluläre Granularität misst

(Granulozyten streuen mehr als Leukozyten).

33

Abbildung 8: Prinzip der Streulicht- und Fluoreszenzmessung. (Shapiro, 2003) Trifft der Laserstrahl auf eine Zelle, kommt es zu zelltypischen Streulichtphänomenen, durch die die Zelle

hinsichtlich Zellgröße, Granularität und Fluoreszenz charakterisiert werden kann. Das Vorwärtsstreulicht

gilt als Maß der Zellgröße, das Seitwärtsstreulicht gilt als Maß der Zellgranularität.

Die Messung der Fluoreszenz erfolgt entlang der Laserachse im 90°-Winkel.

Die fluoreszierenden Farbstoffe absorbieren Licht über einen weiten, für sie

charakteristischen Wellenlängenbereich. Dadurch werden Elektronen der

äußeren Schalen auf ein höheres Energieniveau gehoben. Mit dem Rücksprung

auf das ursprüngliche Niveau wird ein Photon abgegeben. Dieser

Strahlungsübergang wird als Fluoreszenz bezeichnet. Bei diesem Vorgang geht

Schwingungs-Rotations-Energie verloren. Daher hat das emittierte Licht eine

größere Wellenlänge (energieärmer) als das anregende Licht.

Unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe haben unterschiedliche Exzitations- und

Emissionsspektren. Die Emissionsspektren der Farbstoffe bestimmen

nachfolgend die Kombinierbarkeit der Fluorochrome. Sie sollten sich in ihren

Wellenlängenbereichen möglichst wenig überschneiden, um sie trennscharf

auswerten zu können. Durch Mehrfarbenfluoreszenz wird die Korrelation

mehrerer Zelleigenschaften ermöglicht. In Tabelle 1 sind verschiedene

Farbstoffe zusammen mit ihrem Exzitationsmaximum (der Wellenlänge, bei der

sie am besten angeregt werden) und Emissionsmaximum (der Wellenlänge, bei

der das meiste Licht emittiert wird) aufgeführt.

34

Tabelle 1: Exzitations- und Emissonsmaxima verschiedener Fluorochrome. (Shapiro,

2003)

Farbstoff Exmax (nm) Emmax (nm) Fluorescein Isothiocyanat (FITC) 495 520

Phycoerythrin (PE) 480, 545, 564 575

Peridinin Chlorophyll-a (PerCP) 490 675

Auf einem Monitor eines an das Durchflußzytometer angeschlossenen

Computers werden die Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften der Zellen

graphisch dargestellt.

Dot Plot Graphiken sowie Histogramme der Streulicht- und

Fluoreszenzeigenschaften der Zellen wurden in der vorliegenden Studie mittels

der CELLQuest Software erstellt.

Eine Dot Plot Graphik von Scattereigenschaften aller Zellen einer Vollblutprobe,

die auf der x-Achse die Zellgröße (forward scatter) und auf der y-Achse die

Zellgranularität (side scatter) repräsentiert verdeutlicht nachfolgend, dass sich

spezifische Zellpopulationen durch charakteristische Punktwolken darstellen

lassen.

35

Abbildung 9: Dot Plot der Streulichtsignale aus Vollblut. (Jacobs, 1996) Die x-Achse repräsentiert mit dem forward scatter (FSC) die Zellgröße, die y-Achse mit dem side scatter

(SSC) die Zellgranularität. Punktwolken stellen spezifische Zellpopulationen dar, die sich in ihren

Streulichteigenschaften ähneln.

Ein gating, d.h. die Eingrenzung einer Zellpopulation mit Hilfe des

Computerprogrammes ermöglicht die genauere Betrachtung einer einzelnen

Zellpopulation.

In der vorliegenden Studie wurde die Population von Lymphozyten genauer

untersucht. Dazu erfolgte ein gating jener Zellpopulation.

36

Abbildung 10: Dot Plot der Scattereigenschaften und Gating von Lymphozyten. Eingrenzung der Zellpopulation von Lymphozyten in die Region1 (R1) für die detailliertere Analyse von

Zelleigenschaften.

Neben der Streulichtdetektion erlaubte das zur Verfügung stehende FACScanTM

die Erfassung dreier Fluoreszenzfarbstoffe. Die Fluoreszenzintensität der Zellen

nach Antikörpermarkierung konnte mit Hilfe des Computerprogrammes

CELLQuest graphisch verdeutlicht werden. Die Autofluoreszenz und

unspezifische Bindung von fluoreszierenden Antikörpern, die durch

Negativkontrollen bestimmt werden konnte, ließ sich bei der Auswertung am

Computer diskriminieren.

Zweifarbenfluoreszenzen wurden in Dot Plot Graphiken, Einfarbenfluores-

zenzen in Histogrammen dargestellt.

Zunächst erfolgte die Messung der CD4+CD25+ Zellen aus der Population von

Lymphozyten. Anschließend wurde die Anzahl der CD4+CD25+FOXP3+ Zellen

aus der Population der CD4+CD25+ Zellen bestimmt.

37

Abbildung 11: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ CD25+ Lymphozyten, die als Population der

regulatorischen T-Zellen definiert ist. Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, FITC.

Abbildung 12: Histogramm FOXP3+ und FOXP3- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 11). Marker1 (M1) beschreibt die Population der FOXP3+ CD4+ CD25+ Lymphozyten, die der Population der

FOXP3+ regulatorischen T-Zellen entspricht. Fluoreszenzfarbstoff: PE.

38

Darauf folgend wurden die Populationen: CD4+CD45RA+ (naive) T-Zellen und

CD4+CD45RA- (Memory) T-Zellen analysiert. Abschließend erfolgte die

Detektion der CD4+CD25+CD45RA+ (naive-like) sowie der CD4+CD25+CD45RA-

(memory-like) regulatorischen T-Zellen aus der Lymphozytenpopulation.

Abbildung 13: Dot Plot der Fluoreszenzeigenschaften von Lymphozyten in Bezug auf Region1 (Abbildung 10). R2 (Region2) beschreibt die Population der CD4+ Lymphozyten, der T-Helferzellen, R3 (Region3)

beschreibt die Population der CD4+CD25+ Lymphozyten, der regulatorischen T-Zellen.

Fluoreszenzfarbstoffe: PerCP, PE.

Abbildung 14: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region2 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+, der naiven T-Zellen; Marker2 (M2) beschreibt

die Population der CD45RA- CD4+, der Memory T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC.

Links: Ergebnisse eines 8 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl naiver T-Zellen.

Rechts: Ergebnisse eines 8 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von Memory T-Zellen.

39

Abbildung 15: Histogramm CD45RA+ und CD45RA- Zellen in Bezug auf Region3 (Abbildung 13). Marker1 (M1) beschreibt die Population der CD45RA+ CD4+ CD25+, der naive-like regulatorischen T-

Zellen; Marker2 (M2) beschreibt die Population der CD45RA- CD4+ CD25+, der memory-like

regulatorischen T-Zellen. Fluoreszenzfarbstoff: FITC.

Links: Ergebnisse eines 6 Monate alten Kindes mit einer höheren Anzahl von naive-like regulatorischen T-

Zellen.

Rechts: Ergebnisse eines 14 Jahre alten Kindes mit einer höheren Anzahl von memory-like

regulatorischen T-Zellen.

3.3.5 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung der orientierenden Pilotstudie wurde mit Hilfe der

GraphPad PRISM Software vorgenommen.

Die Analyse der Daten erfolgte durch einfache lineare Regression. Der

Vergleich der Daten der Patienten- und Kontrollgruppe wurde mit Hilfe des t-

Tests durchgeführt.

Die Darstellung der Daten erfolgte in Scatterdiagrammen mit Hilfe von

Regressionsgeraden und Mittelwertlinien.

Für die Ergebnisse wurde ein Signifikanzniveau von p = 0,05 festgelegt.

p ≤ 0,05 gilt als schwach signifikantes, p ≤ 0,01 als signifikantes und p ≤ 0,001

als hoch signifikantes Ergebnis. p > 0,05 gilt als nicht signifikant.

40

4 Ergebnisse

Im Sinne einer vergleichenden Querschnittsstudie wurden absolute Zellzahlen

regulatorischer T-Zellen verschiedenaltriger gesunder und an atopischer

Dermatitis erkrankter Probanden durchflusszytometrisch bestimmt und

altersabhängige Veränderungen der Anzahl regulatorischer T-Zellen analysiert.

Hierbei wurden folgende Populationen regulatorischer T-Zellen berücksichtigt:

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen, CD4+CD25+FOXP3+ regulatorische T-

Zellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische T-

Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like

regulatorische T-Zellen.

Zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und Interpretation der absoluten

sowie altersabhängigen Anzahl regulatorischer T-Zellen wurden verschiedene

Leukozytensubpopulationen per Differentialblutbild und Durchflusszytometrie

bestimmt. Diese werden in 4.3 beschrieben.

41

4.1 Absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen: Probanden mit atopischer

Dermatitis weisen höhere Zellzahlen auf als Gesunde

Der Vergleich beider Probandengruppen ergab in jeder Subpopulation

regulatorischer T-Zellen eine höhere Anzahl Zellen bei den an atopischer

Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen.

Insbesondere in den ersten vier Lebensjahren wurde eine deutlich höhere

Zellzahl bei Probanden mit atopischer Dermatitis beobachtet (vgl. Abbildung 18,

Seite 49).

Besonders hervorzuheben ist der anzählige Unterschied in der Population der

CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen. Hier liegt die Anzahl

jener Zellen von Patienten mit atopischer Dermatitis mit einem

Signifikanzniveau von 0.0014 signifikant höher als die der gesunden

Kontrollgruppe.

Schwach signifikant mit einem Signifkanzniveau von 0.0207 stellt sich der

Unterschied in der Anzahl der CD4+CD25+CD45RA- memory-like

regulatorischen T-Zellen zwischen den Probandengruppen dar.

Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen beider

Probandengruppen wurde mit Hilfe des t-Tests durchgeführt. Waagerechte

Linien in nachfolgenden Diagrammen stellen den Mittelwert der Zellzahl jener

Probandengruppe dar.

42

Abbildung 16: Vergleich der absoluten Zellzahlen der Subpopulationen (CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+, CD4+CD25+CD45RA+ naive-like und CD4+CD25+CD45RA- memory-like) regulatorischer T-Zellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen

jeweils höhere Anzahlen regulatorischer T-Zellen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen

mit niedrigerem Zellzahlniveau.

43

4.2 Altersabhängige Veränderung der Anzahl regulatorischer T-Zellen:

Abnahme von naive-like, Zunahme von memory-like regulatorischen T-

Zellen

Die Subpopulationen regulatorischer T-Zellen Gesunder und an atopischer

Dermatitis erkrankter Patienten zeigen keinen signifikanten Unterschied in der

altersabhängigen Veränderung der Zellzahl.

Die nahezu gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen werden mit Hilfe von

Regressionsgeraden in nachfolgenden Scatterdiagrammen verdeutlicht.

Insbesondere im Altersintervall 0-10 Jahre sind verhältnismäßige

Übereinstimmungen zu entdecken.


Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorische T-Zellen weisen in

beiden Probandengruppen einen Abfall der Zellzahl im Laufe des Alters auf.

Statistisch signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0011 bei Gesunden

und von 0.0086 bei an atopischer Dermatitis erkrankten Probanden ist hierbei

der Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen.

CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorische T-Zellen unterliegen in beiden

Probandengruppen einem Anstieg (nicht signifikant) der Zellzahl im Laufe des

Alters.

44

AD

Kontrollen

Abbildung 17: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen regulatorischer T-Zellen. Verringerung der Anzahl von CD4+CD25+, CD4+CD25+FOXP3+ und CD4+CD25+CD45RA+ naive-like

regulatorischen T-Zellen; Zuwachs von CD4+CD25+CD45RA- memory-like regulatorischen T-Zellen in

beiden Probandengruppen (Links: Gruppe atopischer Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe).

Zusatzbeobachtung: In den ersten vier Lebensjahren weisen Patienten mit atopischer Dermatitis deutlich

höhere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf.

45

4.3 Leukozytensubpopulationen gesunder und an atopischer Dermatitis

erkrankter Kinder

Das vorliegende Kapitel beschreibt Ergebnisse von Leukozyten-

subpopulationen, die zur Berechnung, Einordnung, Vergleichbarkeit und

Interpretation der Ergebnisse regulatorischer T-Zellen genutzt wurden.

Die Ergebnisse der Leukozytensubpopulationen stimmen mit bestehenden

Normwerten überein (Plenert W. et Heine W., 1984; Comans-Bitter W.M. et al.,

1997; Shearer W.T. et al., 2003; Vitelli-Avelar D.M. et al., 2005; Schauer U. et

al., 1991; Sullivan K.E. et al., 2002).

4.3.1 Leukozyten, mononukleäre Zellen und Lymphozyten

In der gesunden Kontrollgruppe sowie in der Gruppe der Patienten mit

atopischer Dermatitis ist ein Abfall der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären

Zellen sowie von Lymphozyten im Laufe des Alters zu verzeichnen.

Statistisch hoch signifikant mit einem Signifikanzniveau < 0.0001 verringert sich

die Anzahl der mononukleären Zellen und der Lymphozyten altersabhängig in

der Gruppe der gesunden Probanden.

46

AD

Kontrollen

Abbildung 18: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der Leukozyten. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten in

beiden Probandengruppen. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontroll-

gruppe

47

Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der

Leukozyten, der mononukleären Zellen und der Lymphozyten minimal höhere

Zellzahlen (nicht signifikant) gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf.

Abbildung 19: Vergleich der absoluten Zellzahlen von Leukozyten, mononukleären Zellen und Lymphozyten. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen

jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem

Zellzahlniveau.

48

4.3.2 CD4+, CD4+CD45RA+ und CD4+CD45RA- Zellen

Im direkten Vergleich beider Probandengruppen ist ein Abfall der Zellzahl von

CD4+ T-Helferzellen und von CD4+CD45RA+ naiven T-Helferzellen in beiden

Probandengruppen zu verzeichnen.

Der Abfall der naiven T-Helferzellen stellt sich hierbei bei Gesunden mit einem

Signifikanzniveau von 0.0036 und bei an atopischer Dermatitis erkrankten

Probanden mit einem Signifikanzniveau von 0.0017 statistisch signifikant dar.

Die CD4+CD45RA- Memory T-Zellen folgen in der gesunden Kontollgruppe

signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0038 einer altersabhängigen

Zunahme der Zellzahl.

In der Gruppe der an atopischer Dermatitis leidenden Patienten ist ein Abfall

der Zellzahl zu beobachten. Dieser ist jedoch mit einem Signifikanzniveau von

0.3582 statistisch nicht signifikant.

49

AD

Kontrollen

Abbildung 20: Vergleich der altersabhängigen Veränderung der Zellzahlen von Subpopulationen der CD4+ T-Zellen. Altersabhängige Abnahme der Zellzahl von CD4+ T-Helferzellen und CD4+CD45RA+ naiven T-

Helferzellen. Zunahme der CD4+CD45RA- Memory T-Zellen bei Gesunden, Abnahme bei Patienten mit

atopischer Dermatitis. Links: Gruppe der atopischen Dermatitiker (AD), Rechts: gesunde Kontrollgruppe

50

Patienten mit atopischer Dermatitis weisen auch in der Population der CD4+,

der CD4+CD45RA+ (naiven) und der CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen

höhere Zellzahlen gegenüber der gesunden Kontrollgruppe auf. Statistisch

schwach signifikant mit einem Signifikanzniveau von 0.0274 stellt sich der

Unterschied in der Population der naiven T-Helferzellen dar.

Abbildung 21: Vergleich der absoluten Zellzahlen von CD4+, CD4+CD45RA+ (naiven) und CD4+CD45RA- (Memory) T-Helferzellen. Links: Zellzahlergebnisse der Probanden mit atopischer Dermatitis (AD). Atopische Dermatitiker weisen

jeweils höhere Zellzahlen auf. Rechts: Zellzahlergebnisse der gesunden Kontrollen mit niedrigerem

Zellzahlniveau.

51

5 Diskussion

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die absolute Anzahl regulatorischer T-

Zellen mit Hilfe durchflusszytometrischer Untersuchungen bei gesunden und an

atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen zu bestimmen und

die altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen in

beiden Probandengruppen vergleichend zu analysieren.

Dabei wurden folgende Populationen berücksichtigt:


Zellen, CD4+CD25+CD45RA+ Zellen, so genannte naive-like regulatorische T-

Zellen sowie CD4+CD25+CD45RA- Zellen, so genannte memory-like

regulatorische T-Zellen.

In Bezug auf die altersabhängigen Veränderungen wurde der Schwerpunkt

besonders auf die Populationen der naive-like und der memory-like

regulatorischen T-Zellen gelegt.

5.1 Höhere absolute Anzahl regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit

atopischer Dermatitis: geringere Funktion - kompensatorische Erhöhung

der Zellzahl?!

Der Vergleich der absoluten Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und

an atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen ergab in jedem

Fall eine höhere Zellzahl regulatorischer T-Zellen bei den an atopischer

Dermatitis erkrankten Probanden.

Für das Kindesalter werden mit der vorliegenden Studie erstmalig höhere

Zellzahlergebnisse regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit atopischer

Dermatitis veröffentlicht.

An Erwachsenen wurde die Anzahl CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen bei

Patienten mit atopischer Dermatitis erstmalig von Ou et al. im Jahr 2004

untersucht. Auch hier fand sich bei Patienten mit atopischer Dematitis im

52

Gegensatz zu den gesunden Kontrollen eine signifikant höhere Anzahl von

regulatorischen T-Zellen (Ou L.S. et al., 2004).

Die atopische Dermatitis als eine Erkrankung mit autoimmunen Reaktionen

würde jedoch primär niedrigere Zellzahlen regulatorischer T-Zellen erwarten

lassen, durch die es zu einer Störung der Immunhomöostase und damit zu

einem Ausbruch der atopischen Dermatitis kommt.

So wie bei Patienten mit dem Krankheitsbild IPEX, bei denen aufgrund eines

Mutationsdefektes im FOXP3 Gen keine natürlich vorkommenden

regulatorischen T-Zellen zu finden sind und die daraus folgend an einer

schweren Immundefizienz, begleitet von einer atopischen Dermatitis, leiden

(Ochs H.D. et al., 2005 ;Torgerson T.R. et al., 2007; Verhagen J. et al., 2006),

könnte bei Patienten mit einer atopischen Dermatits die atopische Dermatitis als

ein Ausdruck der gestörten Immunhomöostase verstanden werden.

Unsere Ergebnisse, die bei Patienten mit atopischer Dermatitis höhere

Anzahlen regulatorischer T-Zellen beschreiben, widersprechen der Erwartung

primär niedrigerer Zellzahlen.

Als ein Interpretationsansatz der höheren Zellzahlergebnisse kann die Funktion

der regulatorischen T-Zellen in Frage gestellt werden. Eine verminderte

Funktion regulatorischer T-Zellen könnte erstens zu einer kompensatorischen

Erhöhung der Zellzahl führen und würde zweitens eine Möglichkeit der

Entstehung bzw. des Ausbruchs einer atopischen Dermatitis bei Kindern und

Jugendlichen erklären.

Erstmalig 2008 konnten Smith et al. bei Kindern mit einer Hühnereiallergie, die

in 80% der Fälle von einer atopischen Dermatitis begleitet wurde, eine

verminderte Funktion von regulatorischen T-Zellen nachweisen. Der Nachweis

erfolgte durch die verminderte Unterdrückung von Zytokinantworten bei

Atopikern im Gegensatz zu Gesunden nach Kokultivierung von Effektorzellen

mit regulatorischen T-Zellen (Smith M. et al., 2008).

53

Mit diesem Beweis der verminderten Funktion regulatorischer T-Zellen bei

atopischen Dermatitikern stellt sich die Frage, wie diese Funktionsminderung

ausgeglichen werden kann, um insgesamt ein hohes Funktionsniveau der

Zellen zu erreichen. Eine Antwort könnte die kompensatorische Erhöhung der

Zellzahl sein.

Der oben beschriebene Zusammenhang zwischen höheren Zellzahlen und

verminderter Funktion regulatorischer T-Zellen kann auch noch anhand einer

anderen Beobachtung diskutiert werden:

Bei älteren Menschen (70.-90. Lebensjahr) wurden höhere Zellzahlen

regulatorischer T-Zellen beschrieben als bei jungen Menschen (20.-30.

Lebensjahr) (Gregg R. et al., 2005). Angenommen diese Zellen seien in ihrer

Funktion unbeeinträchtigt, so könnten regulatorische T-Zellen gemäß ihrer

normalen Funktion hoch effektiv autoimmune Prozesse unterdrücken und

immunologische Reaktionen kontrollieren. Hieraus wäre auf eine hoch effektive

Kontrolle prinzipiell immunologischer Reaktionen und damit auf eine

erfolgreiche Prävention von Autoimmunkrankheiten zu schließen.

Entgegen dieser Schlussfolgerung erkranken ältere Menschen jedoch häufiger

an Autoimmunkrankheiten, chronischen Infektionen und Tumoren (Dejaco C. et

al., 2006). Es ist daher anzunehmen, dass regulatorische T-Zellen auch bei

älteren Menschen weniger funktional sind. Die Funktionsminderung führt zu der

Notwendigkeit einer erhöhten Prävalenz von regulatorischen T-Zellen, d.h. zu

einer kompensatorischen Zellzahlerhöhung, um das immunologische System

auf einem entsprechendem Funktionsniveau aufrecht zu erhalten (Dejaco C. et

al., 2006).

Kombiniert aus den Beobachtungen von Smith et al. und Dejaco et al. kann

parallel in der vorliegenden Studie für Patienten mit einer atopischen Dermatitis

eine verminderte Funktion regulatorischer T-Zellen und eine daraus folgende

Zellzahlerhöhung angenommen werden. Die kompensatorische Hyperplasie der

Anzahl regulatorischer T-Zellen könnte als Ausdruck des Versuchs der

Aufrechterhaltung eines hohen Funktionsniveaus der immunologischen

Kontrolle bei Patienten mit atopischer Dermatitis verstanden werden.

54

Wie genau allerdings regulatorische T-Zellen an der immunologischen Kontrolle

der atopischen Dermatitis beteiligt sind, ist bisher noch nicht erforscht.

Bekannte Effektormechanismen, wie die Interleukin-10 Produktion, die TGF-β

Produktion und der Zell-Zell Kontakt (Bacchetta R. et al., 2007; Buckner J.H. et

al., 2004) sind von zunehmendem Interesse. Die Entdeckung, dass zum

Beispiel die IL-10 Produktion regulatorischer T-Zellen allergenspezifische

Effektorzellen unterdrückt (Verhagen J. et al., 2006), stellt nur den

Anfangspunkt der Quantifizierung regulatorischer Funktionen dar.

Eine weitere Aufklärung wird die Entwicklung von Immuntherapien ermöglichen.

5.2 Altersabhängige Abnahme von naive-like und Zunahme von memory-like

regulatorischen T-Zellen: Thymusinvolution und periphere Expansion

In der vorliegenden Studie wurde in den Populationen der CD4+CD25+

regulatorischen T-Zellen, der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen und

der CD4+CD25+CD45RA+ naive-like regulatorischen T-Zellen bei Gesunden

sowie bei Patienten mit atopischer Dermatitis ein altersabhängiger Abfall der

Zellzahl beobachtet. Insbesondere die Abnahme der Anzahl von naive-like

regulatorischen T-Zellen stellte sich hierbei als statistisch signifikant heraus.

Umgekehrt konnte in der Population der CD4+CD25+CD45RA- memory-like

regulatorischen T-Zellen in beiden Probandengruppen ein Anstieg der Zellzahl

im Laufe des Alters beobachtet werden.

Bei gesunden Erwachsenen wurde die altersabhängige Veränderung der

Anzahl naive-like und memory-like regulatorischer T-Zellen erstmals 2005 von

Seddiki et al. und Valmori et al. untersucht und prozentual beschrieben.

In ihren Studien nahm parallel zur Abnahme der CD4+ Zellen die Anzahl der

naive-like CD4+CD25+CD45RA+ regulatorischen T-Zellen statistisch signifikant

mit dem Alter ab (Seddiki N. et al., 2006; Valmori D. et al., 2005). Umgekehrt

nahm gleichzeitig die Anzahl der memory-like CD4+CD25+CD45RA-

regulatorischen T-Zellen zu (Valmori D. et al., 2005).

55

Erstmals für gesunde Kinder und Jugendliche konnten mit der vorliegenden

Studie Veränderungen der Zellzahlen naiver und memory-like regulatorischer T-

Zellen beschrieben werden. Diese Ergebnisse stimmen in der Beobachtung der

altersabhängigen Abnahme der Zellzahl naive-like regulatorischer T-Zellen und

der Zunahme memory-like regulatorischer T-Zellen mit den Studien von Seddiki

et al. und Valmori et al. überein. Die vorliegende Studie kann demnach mit ihren

Ergebnissen an die Studien von Seddki et al. und Valmori et al. anknüpfen, die

Studien um Ergebnisse altersabhängiger Zellzahlveränderungen naiver und

memory-like regulatorischer T-Zellen im Zeitraum der Geburt bis zum 18.

Lebensjahr ergänzen und darüberhinaus Auskunft über absolute Zellzahlen der

Subpopulationen regulatorischer T-Zellen geben. Sie kann zusammen mit den

Studien von Seddiki et al. und Valmori et al. als Ausgangspunkt für die

Erstellung von Normwerten für Subpopulationen regulatorischer T-Zellen

genutzt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Studie dienen unsere Ergebnisse der

altersabhängigen Veränderungen der Zellzahlen regulatorischer T-Zellen

gesunder Probanden als Vergleichsgrundlage für gewonnene Ergebnisse der

Patienten mit atopischer Dermatitis.

Die hier erstmalig beschriebenen altersabhängigen Veränderungen der Anzahl

naive-like und der memory-like regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit

atopischer Dermatitis verlaufen gerade in den ersten zehn Lebensjahren

identisch mit den Veränderungen der Zellzahlen in der gesunden

Kontrollgruppe, d.h. der Abnahme der naive-like und der Zunahme der memory-

like regulatorischen T-Zellen.

Diese gleichartigen Veränderungen der Zellzahlen verweisen auf einen

übergeordneten Zusammenhang, der für Gesunde sowie Patienten mit

atopischer Dermatitis gleichermaßen Ausschlag gebend zu sein scheint: die

Thymusinvolution und periphere Expansion.

56

Das Altern ist verbunden mit der progressiven Involution des Thymus. Diese

äußert sich in einem signifikanten Verlust der Fähigkeit des Thymus, neue T-

Zellen zu generieren und zu exportieren. Begleitend zur reduzierten Produktion

naiver nicht-regulatorischer T-Zellen ist anzunehmen, dass sich auch der

thymische Output an naiven regulatorischen T-Zellen verringert (Dejaco C. et

al., 2006; Gregg R. et al., 2005).

Der signifikante altersabhängige Abfall der naive-like regulatorischen T-Zellen

kann demnach in Beziehung zur Thymusinvolution gesetzt werden.

Um den thymischen Ausfall zu kompensieren, müssten frühzeitig alternative

Wege der Generierung regulatorischer T-Zellen zur Aufrechterhaltung eines

suffizienten Pools von regulatorischen T-Zellen initiiert werden (Dejaco C.,

2006).

Lange war nicht klar, wie der Pool regulatorischer T-Zellen mit der Tendenz der

Zellen zu Inaktivität, geringer Proliferationskapazität und zu Apoptose effizient

aufrechterhalten werden konnte.

Akbar et al. entwarfen erstmals ein Modell der peripheren Entstehung

regulatorischer T-Zellen. Die regulatorischen T-Zellen schienen sich demnach

in der Peripherie aus dem Memory T-Zell-Pool zu entwickeln (Akbar A.N. et al.,

2003). Dieses Modell konnte von Vukmanovic-Stejic et al. bestätigt werden. Es

konnte gezeigt werden, dass sich eine gewisse Anzahl von regulatorischen T-

Zellen, die phänotypisch mit den memory-like regulatorischen T-Zellen

übereinstimmt, aus schnell-teilenden, hochdifferenzierten Memory CD4+ T-

Zellen entwickelt (Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006).

Memory CD4+ T-Zellen weisen eine periphere Expansion der Zellzahl im Laufe

des Alters auf (Gregg R. et al., 2005). Da sich memory-like regulatorische T-

Zellen wie oben beschrieben aus Memory CD4+ T-Zellen entwickeln

(Vukmanovic-Stejic M. et al., 2006), ist auch im Pool der memory-like

regulatorischen T-Zellen eine Expansion und damit altersabhängigen Zunahme

der Zellzahl denkbar. Diese Theorie erklärt die Zunahme der memory-like

regulatorischen T-Zellen in der vorliegenden Studie.

57

Es kann daher angenommen werden, dass die memory-like regulatorischen T-

Zellen den suffizienten Pool regulatorischer T-Zellen im Alter nach der

Thymusinvolution und damit die periphere Immuntoleranz aufrechterhalten.

Memory-like regulatorische T-Zellen sind vermutlich, genau wie Memory T-

Zellen in der Lage, antigenspezifische Immunantworten gegen ein bekanntes

Antigen auch nach Jahren abzurufen und damit vor Autoimmunität und

immunologischen Fehlregulationen zu schützen.

5.3 Ausblick

In der vorliegenden Pilotstudie wurde im Sinne der Grundlagenforschung

erstmalig die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der Anzahl

regulatorischer T-Zellen vergleichend bei gesunden und an atopischer

Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen untersucht.

Für Patienten mit atopischer Dermatitis werden hier demnach erstmalig

Ergebnisse über die absolute Anzahl und die altersabhängige Veränderung der

absoluten Anzahl von regulatorischen T-Zellen im Kindes- und Jugendalter

veröffentlicht.

Diese Ergebnisse können, genau wie die erstmalig veröffentlichten Ergebnisse

der regulatorischen T-Zellen bei Gesunden, als grundlegende Vergleichsdaten

für nachfolgende Studien genutzt werden. Sie können zusammenfassend als

orientierende Richtwerte in der Erstellung von Normwerten für Subpopulationen

regulatorischer T-Zellen gelten.

Als eine wertvolle Zusatzbeobachtung stellte sich in der vorliegenden Studie die

deutlich höhere Anzahl regulatorischer T-Zellen von Patienten mit atopischer

Dermatitis in den ersten vier Lebensjahren heraus.

Als ein Interpretationsansatz dieser höheren Zellzahlen könnte eine reaktive

Hochregulierung der Anzahl regulatorischer T-Zellen bei hoher entzündlicher

Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten Lebensjahren gelten.

58

Diese Annahme stützt sich auf den durch Caramalho et al. erbrachten Beweis,

dass die Proliferation regulatorischer T-Zellen durch Exposition der Zellen mit

proinflammatorischen Bakterienprodukten hochreguliert wird. Durch Auslösung

des Entzündungsreizes durch Interleukin-2 und Lipopolysachariden kam es

hierbei außerdem zu einer 10fach erhöhten Supressoraktivität von

regulatorischen T-Zellen (Caramalho I. et al., 2003).

Parallel zu den Beobachtungen von Caramalho et al. kann in unserer Studie die

gesicherte hohe entzündliche Aktivität der atopischen Dermatitis in den ersten

zwei Lebensjahren (Turner J.D. et al., 2006) als auslösender Reiz für die

Proliferation regulatorischer T-Zellen verantwortlich gemacht werden.

Die hohe entzündliche Aktivität wird durch verstärkte Infiltration von T-

Effektorzellen in die Epidermis aufrecht erhalten und weiter gesteigert

(Verhagen J. et al., 2006), sodass angenommen werden, dass dieser

Entzündungsreiz, verglichen mit der Stimulation mit proinflammatorischen

Bakterienprodukten bei Caramalho et al., eine bis zu 10fach erhöhte

Supressoraktivität regulatorischer T-Zellen auslöst.

Hohe Anzahlen regulatorischer T-Zellen mit gesteigerter Suppressoraktivität

(Caramalho I. et al., 2003) könnten zu einer effektiven Unterdrückung von

Effektorzellen führen und damit die Inflammation eindämmen. Zusätzlich könnte

eine Toleranzentwicklung von Effektorzellen gegenüber regulatorischen T-

Zellen zu einer Abschwächung des Entzündungsreizes und einer vereinfachten

Eindämmung der Inflammation führen.

Die regulatorischen T-Zellen von Atopikern weisen zwar eine herabgesetzte

Aktivität auf, aber ihre erhöhte Anzahl könnte sich klinisch in einer deutlichen

Besserung der atopischen Dermatitis äußern. Diese Besserung der atopischen

Dermatitis, die auch als Selbstheilungstendenz bei primär hoher

Entzündungsaktivität im frühen Kindesalter beschrieben wird, ist aus klinischer

Erfahrung gut belegt.

59

Es stellt sich nun die Frage: Könnte demnach sogar eine stark erhöhte Zellzahl

regulatorischer T-Zellen im Säuglings- und Kleinkindesalter ein prognostisch

günstiges Zeichen für die Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis

darstellen und damit als klinischer Prognoseparameter angewandt werden? Die

Antwort auf diese Frage stellt zusammen mit der genaueren Erforschung der

Selbstheilungstendenz der atopischen Dermatitis im frühen Kindesalter eine

interessante Forschungsperspektive dar.

Durch genauere Untersuchungen von Hautläsionen, in denen zum Beispiel

höhere Anzahlen und erhöhte Suppressoraktivitäten regulatorischer T-Zellen

nachweisbar sein könnten, und durch gleichzeitige Beobachtung der klinischen

entzündlichen Aktivität der atopischen Dermatitis, könnte im Rahmen einer

Längsschnittstudie dieser These nachgegangen werden.

Bedeutsam wäre insgesamt die Identifikation von Interaktionsmechanismen

regulatorischer T-Zellen im Krankheitsbild der atopischen Dermatitis, um die

Pathogenese der atopischen Dermatitis immunologisch genauer definieren zu

können.

Die vorliegende Studie stellt mit der selbsterstellten zusammenfassenden

Übersicht regulatorischer T-Zellen (siehe Abbildung 1, Seite 14) und den

Ergebnissen der Zellzahlbeobachtungen einen Ausgangspunkt für die

Erforschung der Rolle der regulatorischen T-Zellen im Krankheitsbild der

atopischen Dermatitis dar.

60

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67

7 Anhang

Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum

Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger

Patienteninformation und Einwilligungserklärung zur Teilnahme an der

klinischen Studie

„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell

Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern

verschiedener Altersklassen“

Sehr geehrte Eltern!

Neurodermitis, Allergien, Infektanfälligkeit und rheumatische Erkrankungen im

Kindesalter stellen ein zunehmendes Problem dar. Die Universitäts-Kinderklinik

Bochum beschäftigt sich intensiv mit diesen Erkrankungen und erforscht ihre

Entstehungsweise. Grundlage ist die Kenntnis der normalen Reifung des

Immunsystems.

Sie können uns bei der weiteren Forschung helfen, indem Sie einwilligen, dass

Ihrem Kind im Rahmen der Einleitung der Narkose einer geplanten Operation,

im Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Vaterschaftstestung oder im

Rahmen einer geplanten Blutentnahme zur Allergietestung bei der

Neurodermitis zusätzlich 5 ml Blut für unsere Untersuchungen abgenommen

werden.

Die Teilnahme an dieser klinischen Studie ist freiwillig. Sie können die Teilnahme ablehnen, ohne dass Ihrem Kind hierdurch Nachteile in seiner medizinischen Betreuung entstehen. Klinische Studien sind notwendig, um verlässliche neue medizinische

Forschungsergebnisse zu gewinnen. Unverzichtbare Voraussetzung für die

Durchführung einer klinischen Studie ist jedoch, dass Sie Ihr Einverständnis zur

Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie schriftlich erklären. Bitte

68

lesen Sie den folgenden Text als Ergänzung zum Informationsgespräch

sorgfältig durch und zögern Sie nicht, Fragen zu stellen.

Bitte unterschreiben Sie die Einwilligungserklärung nur

- wenn Sie Art und Ablauf der klinischen Prüfung vollständig verstanden haben,

- wenn Sie bereit sind, der Teilnahme Ihres Kindes zuzustimmen und

- wenn Sie sich über Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Teilnehmers

an dieser klinischen Studie im Klaren sind.

1. Was ist der Zweck der klinischen Studie? Von der Zusammensetzung der weißen Blutkörperchen hängt die Art der

Immunantwort ab. Wir möchten untersuchen, wie die Zusammensetzung der

weißen Blutkörperchen vom Alter und von einer bestehenden Erkrankung wie

der Neurodermitis abhängt. Mit dieser klinischen Studie wird die Anzahl

bestimmter Arten weißer Blutkörperchen, den sog. T-Regulatorzellen, den T-

Memoryzellen und den B-Zell Subpopulationen, Ihres Kindes bestimmt.

Diese Arten weißer Blutkörperchen werden in einen Zusammenhang mit der

Entstehung von Neurodermitis, Allergien und allgemeiner Abwehrschwäche

gebracht.

In dieser klinischen Studie werden Bezugswerte für diese Arten weißer

Blutkörperchen erstellt. Dazu wird die Anzahl dieser Zellen im Blut gesunder

Kinder untersucht. Des Weiteren wird die Anzahl der Zellen im Blut einer

Vergleichsgruppe an Neurodermitis erkrankter Kinder untersucht. Diese

Ergebnisse werden mit denen von gesunden Kindern verglichen.

2. Wie läuft die klinische Studie ab?

Diese klinische Studie wird ausgehend von der Kinderklinik Bochum in

Zusammenarbeit mit der kinderchirurgischen Praxis Dr. med. Standke, der

orthopädisch-unfallchirurgischen und anästhesiologischen Abteilung des St.

Josef-Hospital Bochum, sowie der Vaterschaftssprechstunde der Tagesklinik

und der Neurodermitissprechstunde von Herrn Prof. Dr. med. Schauer der

Kinderklinik Bochum durchgeführt. Es werden insgesamt ungefähr 70 Kinder

daran teilnehmen.

69

Im Rahmen dieser klinischen Studie werden Ihrem Kind vor der anstehenden

Operation oder vor der anstehenden Blutentnahme im Rahmen einer

Vaterschaftstestung oder einer Allergietestung bei der Neurodermitis zusätzlich

5 ml Blut abgenommen. Diese Abnahme erfolgt durch einen venösen Zugang,

der Ihrem Kind standardmäßig im Rahmen der Operationsvorbereitung oder im

Rahmen der geplanten Blutabnahme gelegt wird, was bedeutet, dass keine

zusätzliche Blutentnahme nötig wird.

Die Blutentnahme wird von Ihrem betreuenden Arzt durchgeführt, mit dem Sie

zusammen an der Studie teilnehmen. Nach allen Erfahrungen ist die

Blutentnahme von bis zu 10 ml für Ihr Kind ungefährlich und unbedenklich. Es

kann allerdings sein, dass ihr Kind die Blutentnahme als unangenehm, vielleicht

sogar schmerzhaft empfindet und sich deshalb etwas wehren wird. Wenn Ihr

betreuender Arzt den Eindruck hat, dass das geschehen könnte, wird bei der

Blutentnahme zunächst eine örtlich betäubende Creme aufgetragen, sodass die

Abnahme schmerzlos erfolgen kann. In sehr seltenen Fällen kann sich nach der

Blutentnahme ein kleines Hämatom, also ein Bluterguss bilden, der sich aber

ohne Zutun wieder zurückbilden wird.

Das abgenommene Blut wird laborchemisch untersucht und die Anzahl der

vorhandenen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen

wird bestimmt.

Die Teilnahme an dieser klinischen Studie beschränkt sich auf die einmalige

Abnahme von 5 ml Blut.

3. Worin liegt der Nutzen einer Teilnahme an der klinischen Studie?

Ein Nutzen besteht darin, dass Sie uns helfen, Bezugswerte und

Vergleichswerte für die Anzahl der T-Regulatorzellen, der T-Memoryzellen und

der B-Zell Subpopulationen zu erstellen. Diese Werte könnten in Zukunft zu

neuen wissenschaftlichen Erkenntnissen auf dem Gebiet der Immunologie

führen. Damit kann Kindern, die an Immundefektkrankheiten wie z.B.

Neurodermitis, Allergien, allgemeiner Abwehrschwäche leiden, zu neuen

Therapiemöglichkeiten verholfen werden.

70

Es ist nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser klinischen

Studie einen Nachteil haben wird.

Es ist auch nicht zu erwarten, dass Ihr Kind aus der Teilnahme an dieser

klinischen Studie einen direkten Nutzen haben wird.

4. Gibt es Risiken, Beschwerden und Begleiterscheinungen? Es bestehen keine zusätzlichen Risiken.

5. Zusätzliche Einnahme von Arzneimitteln?

Es sollten keine Arzneimittel eingenommen werden, die positiv oder negativ auf

die Stimulierung bzw. Unterdrückung des Immunsystems wirken.

6. In welcher Weise werden die im Rahmen dieser klinischen Prüfung gesammelten Daten verwendet?

Sofern gesetzlich nicht etwas anderes vorgesehen ist, haben nur die

Doktorandin, ihr Betreuer und deren Mitarbeiter Zugang zu den vertraulichen

Daten, in denen Sie und Ihr Kind namentlich genannt werden. Diese Personen

unterliegen der Schweigepflicht.

7. Entstehen für die Teilnehmer Kosten? Gibt es einen Kostenersatz oder eine Vergütung?

Durch die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie entstehen für Sie

keine zusätzlichen Kosten.

Für die Teilnahme Ihres Kindes an dieser klinischen Studie erhalten Sie keine

Vergütung.

71

8. Möglichkeit zur Diskussion weiterer Fragen

Für weitere Fragen im Zusammenhang mit dieser klinischen Studie stehen

Ihnen Ihre Doktorandin und ihr Betreuer gern zur Verfügung. Auch Fragen, die

Ihre Rechte als Erziehungsberechtigte/r des Patienten und Teilnehmer an

dieser klinischen Studie betreffen, werden Ihnen gerne beantwortet.

Name der Kontaktperson: Herr Prof. Dr. med. U. Schauer - 0234 / 509-2660

Name der Kontaktperson: Caroline Schmitz (Doktorandin) - 0176 / 21936426

......................................................................................................

(Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten)

......................................................................................................

(Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden)

72

Einverständniserklärung

Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................

Geburtsdatum: ............................. Blutabnahmeindikation: ...............................

Ich erkläre mich bereit, mein Kind an der klinischen Studie

„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern


teilnehmen zu lassen.

Ich bin von ........................................................................ ausführlich und

verständlich über die mit der klinischen Studie verbundene Blutentnahme,

mögliche Belastungen und Risiken, sowie über Wesen, Bedeutung und

Tragweite der klinischen Studie aufgeklärt worden. Aufgetretene Fragen wurden

mir verständlich und genügend beantwortet. Ich hatte ausreichend Zeit, mich zu

entscheiden. Ich habe zur Zeit keine weiteren Fragen mehr.

Ich behalte mir jedoch das Recht vor, die freiwillige Mitwirkung meines Kindes jederzeit zu beenden, ohne dass meinem Kind daraus Nachteile für die weitere medizinische Betreuung entstehen. Ich bin zugleich damit einverstanden, dass die im Rahmen dieser klinischen

Studie ermittelten Daten meines Kindes aufgezeichnet werden.

Beim Umgang mit den Daten werden die Bestimmungen des

Datenschutzgesetzes beachtet.

Eine Kopie dieser Patienteninformation und Einwilligungserklärung habe ich

erhalten. Das Original verbleibt beim Prüfarzt.

......................................................................................................

(Datum und Unterschrift des Patienten und der Erziehungsberechtigten)

......................................................................................................

(Datum, Name und Unterschrift des Aufklärenden)

73

Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Bochum

Universitätsklinik Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger

Patienteninformation und Einwilligungserklärung für Kinder zur Teilnahme an der klinischen Studie

„Bestimmung der Anzahl an T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell

Subpopulationen bei gesunden und an Neurodermitis erkrankten Kindern


Hallo!

Bevor Du Dich entschließt, bei dieser klinischen Studie mitzumachen, wird Dir

Dein Doktor genau erklären, warum diese Studie gemacht wird. Er wird Dir

erzählen, was mit Dir passieren wird und was die guten und die schlechten

Dinge an der Studie sind. Bitte sei nicht zu schüchtern, Deinem Doktor Fragen

zu stellen. Du kannst ihn alles fragen, was Du nicht verstehst und er wird es Dir

erklären.

Warum wird diese Studie gemacht?

Diese Studie wird gemacht, um zu sehen, wie viele weiße Blutkörperchen von

einer bestimmten Art in Deinem Blut sind. In Deinem Blut gibt es rote und weiße

Blutkörperchen. Uns interessieren die weißen Blutkörperchen. Einige von

denen heißen T-Regulatorzellen, T-Memoryzellen und B-Zell Subpopulationen

und nicht jedes Kind hat gleich viele von ihnen. Wir wollen untersuchen, ob Du

genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast, wie ein anderes Kind,

das eine Krankheit hat, die Neurodermitis heißt. Wenn Du Neurodermitis hast

schauen wir, ob Du genauso viele von diesen weißen Blutkörperchen hast wie

ein ganz gesundes Kind.

74

Was wird Dir während der Studie passieren?

Wenn Du einverstanden bist, nimmt der Doktor Dir ein bisschen Blut ab. Dazu

muss er Dich mit einer dünnen Nadel einmal kurz pieksen. Wenn Du möchtest,

kannst Du vorher ein Pflaster bekommen, dann spürst Du fast nichts von dem

Pieks. Ganz selten mal kannst Du einen kleinen blauen Fleck an der Stelle

bekommen, wo der Doktor das Blut abgenommen hat. Die Abnahme von bis zu

10 ml Blut ist ungefährlich für Dich.

Was sind die schlechten Dinge an der Studie?

Die Blutabnahme kann etwas weh tun, aber nur für eine kurze Zeit. Es kann

auch passieren, dass Du einen Bluterguss bekommst oder eine Schwellung, die

aber schnell wieder weg geht.

Was sind die guten Dinge an der Studie?

Gut ist, dass Du uns hilfst ein bisschen mehr über diese weißen Blutkörperchen

zu erfahren. Vielleicht kann dann einmal Kindern, die diese Krankheit

Neurodermitis haben, besser geholfen werden.

Kannst Du selber entscheiden, ob Du an der Studie teilnimmst?

Du musst nicht an der klinischen Studie teilnehmen, wenn Du das nicht

möchtest. Selbst wenn Du jetzt ja sagst, kannst Du immer auch nachdem die

Studie begonnen hat Deine Meinung ändern und aufhören. Niemand wird auf

Dich böse sein und Dein Doktor würde sich auch dann noch weiter um Dich

kümmern.

75

Einverständniserklärung

Name des Patienten in Druckbuchstaben: ............................................................

Geburtsdatum: ........................ Blutabnahmegrund: .............................................

Ich war anwesend, als .…………………………………. dieses Formular gelesen

hat oder vorgelesen bekam und seine / ihre mündliche Einwilligung gab.

......................................................................................................

(Datum, Name und Unterschrift des Kindes)

.............................................................................................................................

(Datum, Name und Unterschrift der Person, die das Aufklärungsgespräch

geführt hat)

Danksagung Mein Dank gilt...

... allen Patienten und gesunden Kindern, die an meiner Studie teilgenommen haben.

... im Besonderen meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. med. U. Schauer für die

Ermöglichung und Betreuung dieser Arbeit. Er stand mir jederzeit mit Rat, konstruktiver

Kritik und Geduld zur Seite.

... Frau Veronika Baumeister und Frau Angelika Michel für die Einführung in die

Laborarbeit und den erheblichen Beitrag zum Gelingen meiner Doktorarbeit.

... Herrn Dr. med. M. Standke, Frau Wahlkamp, Herrn Professor Dr. med. Schleberger

in Gedenken, Herrn Dr. med. J. Möllers und Mitwirkenden der Vaterschaftssprech-

stunde in der Tagesklinik der Kinderklinik Bochum für die Unterstützung bei der

Sammlung der Blutproben.

… meinen lieben Eltern, die mir das Studium der Humanmedizin ermöglicht haben.

… meiner Mama, die mir in jeder Hisicht den Rücken frei gehalten und die mich

besonders in der Endphase meiner Arbeit liebevoll aufgemuntert und stets motiviert

hat.

... meinem Papa und meiner Schwester Anne, die mit hohem Interesse vor allem

meinem Diskussionsteil gefolgt sind und mich - obwohl fachfremd - sowohl gedanklich

als auch tatkräftig durch geduldiges Zuhören und Korrekturen an meiner Arbeit

unterstützt haben.

... meinem lieben Freund Stephan, der mir jederzeit zur Seite stand, mich stets mit

wertvollen Ratschlägen unterstützt hat und mir immer wieder Kraft gegeben hat.

… meinen Freunden, die mir durch liebevolle Nachfragen und gegenseitige Motivation

halfen, das Ziel nicht aus dem Auge zu verlieren.

LEBENSLAUF

PERSÖNLICHE DATEN Name Caroline Doris Schmitz

Geburtsort Emsbüren

Familienstand ledig

Konfession römisch-katholisch

SCHULAUSBILDUNG 08/1988 – 06/1990 Keplerschule Korb, Grundschule

08/1990 – 06/1992 Gertrudenschule Rheine, Grundschule

08/1992 – 06/2001 Gymnasium Dionysianum Rheine

06/2001 Allgemeine Hochschulreife – Abitur

STUDIUM 10/2001 – 08/2003 Vorklinisches Studium der Humanmedizin

Ruhr-Universität Bochum

08/2003 Ärztliche Vorprüfung – Physikum

09/2003 – 08/2006 Klinisches Studium der Humanmedizin

Ruhr-Universität Bochum

08/2006 – 07/2007 Praktisches Jahr

1.Tertial: Chirurgie, Kalix sjukhus,

Lehrkrankenhaus der Universität Umeå,

Schweden

2.Tertial: Innere Medizin, St. Josef-Hospital,

Universitätsklinik der Ruhr-Universität

Bochum

3.Tertial: Pädiatrie, Klinik für Kinder- und

Jugendmedizin im St. Josef-Hospital,

Universitätsklinik der Ruhr-Universität

Bochum

05/2008 2. Ärztliche Prüfung

PROMOTION 06/2005 – 09/2008 „Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der

Anzahl regulatorischer T-Zellen bei gesunden und an

atopischer Dermatitis erkrankten Kindern und Jugendlichen“

Prof. Dr. med. Uwe Schauer

Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital,

Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum

Absolute Anzahl und altersabhängige Veränderung der … · T-Lymphozyten erkennen Antigene...

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