Allgemeine Virologie SS 2018 Virusdiagnostik - lehre.fli.de · Gliederung der Vorlesung 1....

Virusdiagnostik

Allgemeine Virologie – SS 2018

Rainer G. Ulrich

Friedrich-Loeffler-Institut

Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger

D-17493 Greifswald - Insel Riems

[email protected]

Allgemeine Virologie – SS 2018

11. 04. 18 Meilensteine der Virologie J. Stech

18. 04. 18 Klassifikation und Taxonomie von Viren R. Ulrich

25. 04. 18 Virusdiagnostik R. Ulrich

02. 05. 18 Virusaufnahme und Replikation T. Mettenleiter

09. 05. 18 Epidemiologie R. Ulrich

16. 05. 18 Ultrastruktur von Viren J. Stech

23. 05. 18 Projektwoche

30. 05. 18 Pathogenese und Virus-Zell-Interaktionen T. Mettenleiter

06. 06. 18 Genetik und Evolution der Viren S. Finke

13. 06. 18 Immunantwort und Impfstoffe S. Finke

20. 06. 18 keine Vorlesung

27. 06. 18 Tumorviren, Transformation und Tumorbildung S. Finke

04. 07. 18 Viren als Werkzeuge T. Hoenen

11. 07. 18 Chemotherapie und Zytokine S. Finke

18. 07. 18 Führung FLI Insel Riems T. Mettenleiter

Klausur: 03.08.2018 (Nachklausur: 30.10.2018)

Zusammenfassung

Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des

Nachweisverfahren/s.

Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten

Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und

immunologischen Reaktionen des Wirtes.

Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der

Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virus-

spezifischer cytopathogener Effekte (CPE).

Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und

Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest,

Hybridisierung, PCR/RT-PCR).

ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und

Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von

Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virus-

spezifischer Antikörper.

Gliederung der Vorlesung

1. Diagnostische Fragestellungen

2. Überblick über diagnostische Verfahren

3. Direkter Nachweis von replikationsfähigem

Erreger

4. Nachweis von Virusbestandteilen

5. Nachweis von immunologischen Reaktionen

des Wirtes

1. Diagnostische Fragestellungen I

- Erregeridentifikation bei einer Infektion

- Frische Infektion?

- Akute (selbstlimitierende) Infektion oder chronische Infektion/Reaktivierung?

- Therapiebeginn/Therapieverlauf

- Resistenz gegen antivirale Substanzen

- Unterscheidung von infizierten und immunisierten Tieren

(DIVA, Markervakzine)

- qualitative/quantitative Bestimmung (Titer): Messung einer schützenden

Immunität nach Immunisierung, bei Möglichkeit einer perinatalen Über-

tragung oder zur Bestimmung des Impfstatus nach Nadelstichverletzung

- Ätiologie neuer Erkrankungen

- Epidemiologische Untersuchungen (Prävalenz, molekularepidemiologischer

Nachweis des ätiologischen Agens)

1. Diagnostische Fragestellungen II





Erreger



des Wirtes


• Direkter Nachweis des replikationsfähigen Erregers

• Direkter Nachweis von Virusbestandteilen

– Antigennachweis

– Nukleinsäurenachweis

• Indirekter Nachweis von immunologischen

Reaktionen des Wirtes

– Antikörper

– Zelluläre Immunantwort

• messbares Auftreten einer spezifischen Immunantwort 2-3

Wochen nach Infektion.

Diagnostisch verwertbar ist die humorale Immunantwort.

• direkter Virusnachweis

zeitlich nur limitiert

möglich.

Bei fortgeschrittenem

Krankheitsstadium ist das

primär ursächliche Virus

häufig nicht mehr

nachweisbar.

2. Diagnostische Marker im Infektionsverlauf I

2. Diagnostische Marker im Infektionsverlauf II

HIV





Erreger



des Wirtes

• Virusanzucht:

• Zellkultur

• embryoniertes Hühnerei

• Versuchstier

• Morphologische Sichtbarmachung:

• Mikroskopie

• Elektronenmikroskopie

3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger

Kuhpockenvirusinfektion, Chorioallantoismembran

Virusanzucht in Zellkultur

• dient dem Infektiositätsnachweis

• nicht bei allen Viren möglich

• langsame, aber hochsensitive Methode

• Voraussetzung: Virusvermehrung führt zu

charakteristischen Veränderungen in der Zellkultur

(cytopathogener Effekt, CPE)

3. Nachweis von replikationsfähigem Erreger

• Primäre Zellkultur – keine oder wenige Passagen

• Sekundäre Zellkultur

– Zellen eines einheitlichen Typs – bis zu 50 Passagen z.B. embryonale Lungenzellen

• Permanente Zelllinien

– Tumorgewebe oder transformiert

3. Zellkulturtechniken

Auswahl (potentiell) suszeptibler Zellen für die Virusanzucht

3. Zellkulturen für die Virusanzucht

Wirtszellen Abkürzung Geeignet zur Vermehrung

folgender Viren

Primäre Affennierenzellen PRMK Pockenviren, Mumpsvirus,

Masernvirus, Rhinoviren,

Influenzaviren

Primäre Hühnerfibroblasten PCEC Tollwutvirus, FSME-Virus

Affennierenzellen Vero Pockenviren, Marburg-Virus,

Ebola-Virus, Rötelnvirus,

Polioviren, Coxsackie-B-Viren,

ECHO-Viren

Hundenierenzellen MDCK Influenzaviren

Humane diploide Fibroblasten HDCS HSV, VZV, HCMV,

Rhinoviren, Rabiesvirus

Humane Tumorzellen HEp2, HeLa Adenoviren, Parainfluenzaviren,

Mumpsvirus, RSV, Polioviren,

Coxsackie-B-Viren, Rötelnvirus,

Coronaviren

Moskitozellen Alphaviren, Dengueviren

Cytoplasmatische Einschlusskörperchen

Syncytienbildung Proliferativer CPE

z.B. Respiratorisches Syncytial-Virus z.B. Paramyxoviren, Orthomyxoviren

z.B. Pockenviren

3. Cytopathogene Effekte (CPE)

Diffuser cytolytischer CPE

mit Abkugelung

z.B. Enteroviren

3. Plaque- und Focustest zur Quantifizierung

Vacciniavirus/AGMK-Zellen MoMSV/3T3-Mausfibroblasten

Viren <250nm, keine lichtmikroskopische Darstellung

Ausnahme: Pockenviren, Mimiviren

Elektronenmikroskopie

• mindestens 106 Partikel/ml erforderlich

• sehr hoher apparativer Aufwand

• die Morphologie allein kann meistens nur die Virusfamilie

definieren, nicht aber Subfamilien oder Virusspezies

• schnelles Ergebnis

• „Open view“-Methode: Entdeckung neuer Erreger

• Anwendung: Stuhldiagnostik

3. Direkter Erregernachweis

3. Elektronenmikroskopie und

Immunelektronenmikroskopie

Elektronenmikroskopie (Kotprobe):

Rotaviruspartikel

Immunelektronenmikroskopie (Kotprobe):

Caliciviruspartikel





Erreger



des Wirtes

- Nachweis viraler Antigene:

- (direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie

- capture-Enzymimmunoassay (EIA)

- Hämagglutinationstest

- Nachweis von viraler Nukleinsäure:

- Polymerasekettenreaktion

(konventionelle und Echtzeit- (real-time) PCR/RT-PCR)

- Hybridisierung

(Chip/Array-Technologie)


- Sandwich-Enzymimmunoassay (EIA)

direkte Verfahren: Verwendung von spezifischen Antikörpern, die

enzymmarkiert vorliegen

indirekte Verfahren: Verwendung eines Sekundärantikörpers, welcher

enzymmarkiert vorliegt

- (Direkter) Immunfluoreszenztest, Immunhistochemie

Markierung mit Peroxidase, Alkalischer Phosphatase oder

Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. FITC)

- Hämagglutinationstest

4.1. Nachweis viraler Antigene

Sandwich-ELISA

4.1. Antigennachweis mittels ELISA

4.1. Immunfluoreszenztest (IFT) und

Immunhistochemie (IHC)

Tollwutvirus-Antigennachweis in

Gehirnprobe eines Hundes.

Tollwutvirus-Antigennachweis im

Gehirn-Paraffinschnitt eines Hundes.

4.1. Hämagglutinationstest

Influenzavirus

• Erreger können direkt ohne vorherige Virusanzucht und

Vermehrung nachgewiesen werden

• empfindlicher als der Nachweis eines viralen Antigens

4.2. Nachweis viraler Nukleinsäuren

• Nukleinsäurenachweis ohne Vervielfältigung der Nukleinsäure

Hybridisierung (Southern Blot - DNA, Northern Blot - RNA, in situ-

Hybridisierung, Chip/Array-Technologie)

• Nukleinsäurenachweis mit Vervielfältigung der Nukleinsäure

Polymerasekettenreaktion (konventionelle und Echtzeit-PCR/RT-PCR)

4.2. Southern Blot zum Virus-DNA-Nachweis

4.2. In situ-Hybridisierung (ISH)

• Methode zur selektiven in vitro-Vermehrung definierter DNA-

Abschnitte unter Verwendung einer thermostabilen DNA-

Polymerase I (Direktnachweis kleinster Mengen von DNA)

• Sequenz des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts muss

bekannt sein (Auswahl der Primer)

Zyklische Wiederholung

von 3 Schritten:

1. Denaturierung der DNA in

Einzelstränge

2. Anlagerung von synthetischen

Polymeren (Oligonukleotiden)

3. Synthese komplementärer

DNA-Stränge

4.2. Polymerasekettenreaktion

Konventionelle PCR/RT-PCR

• Pan-PCR/RT-PCR

• nested/semi-nested PCR/RT-PCR

• Kompetitive (semiquantitative) PCR/RT-PCR

• Random-priming, Klonierung, Sequenzierung

(Abgleich gegen Datenbanken)

Quantitative Echtzeit-PCR (-RT-PCR)

4.2. PCR-Technologie

• Quantitative Bestimmung der HBV-DNA oder HCV-

RNA als Verlaufsparameter der antiviralen

Therapie.

• Feststellung der Viruslast (viral load) zur Therapie-

überwachung bei einer HIV-Infektion oder bei

Verdacht auf eine perinatale Übertragung.

• Verdacht auf eine Herpesvirusinfektion (HSV-PCR

oder VZV-PCR).

• Molekularepidemiologische Untersuchungen.

4.2. Indikationen für den Einsatz der PCR

• Längenscreening in der Gelelektrophorese und Anfärbung der PCR-

Produkte

• Hybridisierung mit einer Gensonde (Southern Blot; ELISA)

• Sequenzspezifische Amplifikatspaltung durch Restriktionsenzyme

(Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus, RFLP)

• nested/seminested PCR (RT-PCR)

• Nukleinsäuresequenzierung

4.2. Spezifitätsnachweis

4.2. Produktdetektion mittels Echtzeit-PCR

Detektion von Fluoreszenzsignalen, die mit der Amplifikatbildung im direkten Zusammenhang stehen

Verwendung von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden (Spezifitätsnachweis) oder Doppelstrang-DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. SYBR Green I)

•Quantifizierung mittels Software-gestützter Berechnung eines Fluoreszenzschwellenwertes Threshold

•Zyklus, bei dem der berechnete Fluoreszenzschwellenwert gekreuzt wird Threshold Cycle (TC)

•Schwellenwert wird umso eher erreicht, je mehr Zielsequenzen sich in der zu untersuchenden Probe befinden

4.2. Real-time PCR: 5´-Exonuklease-Assay

TaqMan-Sonden

4.2. Real-time PCR: absolute Quantifizierung

Well Name Dye Well Type Ct (dRn) Final Call (dRn) Quantity (copies)

#_00 FAM Unknown 20,21 + 7,94E+05

#_03 FAM Unknown 27,03 + 6,73E+03

DI9 FAM Standard 16,46 + 1,00E+07




NTC FAM NTC No Ct - No CtStandards

Unbekannte Probe

NTC

4.2. Vorteile der Echtzeit (real-time)-PCR

Extrem sensitiv - Amplifikation sehr kleiner Fragmente

Spezifitätsgewinn - Detektion über Sonden

Sehr schnell - gleichzeitige Amplifikation und Detektion

Deutlich verminderte Kreuzkontaminationen - kein Öffnen der PCR-Reaktionsgefäße nach der Amplifikation notwendig

Sehr gut automatisierbar - Hochdurchsatzverfahren

Quantifizierung möglich - Viruslastbestimmung

4.2. Prinzip von DNA-Mikroarrays

Glas-Objektträger mit Mikroarray:

Messpunkte (Spots) mit individuellen

DNA-Oligomeren bekannter Sequenz

DNA-Chip auf Oligonukleotid-Basis

4.2. DNA-Chip-Technologie

Streptavidin ++++++++

Bio.

Streptavidin ++++++++

Bio.

Capture H1-16 HPAIV H5 und H7

Capture (Sonde) M N1-9

Reporter Alexa 555

Reporter Alexa 647

Hämagglutinin Neuraminidase, Matrixprotein

Amplikon PanHA

Amplikon PanNA, M

I. Identifizierung

II. Subtypisierung

III. Pathotypisierung

4.2. Diagnostisches DNA-Chip-System für AIV

A. Gall (FLI)





Erreger



des Wirtes

• Nachweis einer frischen Infektion (IgM-Ak, Titeranstieg IgG-Ak)

z.B. anti-HAV-IgM

• Nachweis einer stattgefundenen Infektion (IgG-Ak)

z.B. HIV, HCV, HBV, HDV

• Nachweis einer Immunität (IgG-Ak)

z.B. Poliovirus, FSMEV, anti-HBs (HBV)

• Nachweis einer Virusreaktivierung (IgM-Ak)

z.B. HSV, HCMV

5. Antikörpernachweis

ELISA/EIA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Herpesviren, Hepatitis B-Virus

iIFA indirekter Immunfluoreszenzassay Hantaviren

HHT Hämagglutinationshemmtest Rötelnvirus

IB Immunoblot, Western Blot, Lineassay

HIV, HCV, EBV, HEV

NT Neutralisationstest

Enteroviren, Hantaviren

5. Antikörper-Nachweisverfahren

5. Neutralisationstest

5. Hämagglutinationshemmtest (HHT)

5. Rötelnvirus-Hämagglutinationshemmtest

5. Antikörpernachweis mittels ELISA

- indirekter ELISA

- capture ELISA (µ, mAk)

- kompetitiver ELISA

5. ELISA zur qualitativen Bestimmung von

Virus-spezifischen Antikörpern

Quantifizierung von Antikörpern durch Endpunkttitration

5. Immunoblot: Western Blot-Test

HIV-Blot mit positiver Kontrolle

(1), negativer Kontrolle (2) und

3 Patientenseren (A,B,C)

Bestätigungstest

für HIV-Diagnostik

5. Diagnostische Bewertung

• Der Nachweis virusspezifischer Antikörper in einer klinischen Probe ist

nur ein indirekter Hinweis auf eine virale Infektion.

• Da Virus-spezifische IgG-Antikörper oftmals lebenslang persistieren, ist

ihr Nachweis in einer einzelnen Serumprobe kein ausreichender Beweis

für eine akut stattfindende Infektion.

• Nur der Nachweis von Virus-spezifischen IgM-Antikörpern und/oder die

Bestimmung der Titer Virus-spezifischer IgG-Antikörper in zwei

aufeinanderfolgenden Proben (mindestens 14 Tage Abstand) kann

Auskunft über den Zustand der Infektion geben (Titerunterschiede größer

oder gleich einem Faktor 4 sprechen für eine akute Infektion).

• Da bei vielen Virusinfektionen eine signifikante Antikörperbildung erst 8-12

Tage nach der Infektion einsetzt, ist bei negativem Befund unter

Umständen eine Verlaufsprobe erforderlich (Diagnostisches Fenster).

Zusammenfassung

Die diagnostische Fragestellung bestimmt die Auswahl der/des

Nachweisverfahren/s.

Die Virusdiagnostik beinhaltet Verfahren zum direkten

Erregernachweis, zum Nachweis von Virusbestandteilen und

immunologischen Reaktionen des Wirtes.

Der direkte Nachweis von replikationsfähigem Erreger basiert auf der

Anzucht des Virus auf suszeptiblen Zellen und dem Nachweis Virus-

spezifischer cytopathogener Effekte (CPE).

Der direkte Nachweis von Virusbestandteilen basiert auf der Antigen- und

Nukleinsäure-Detektion (ELISA, Immunfluoreszenztest, Hämagglutinationstest;

Hybridisierung, PCR/RT-PCR).

ELISA, Immunfluoreszenztest, Immunoblot-Test, Neutralisations- und

Hämagglutinationshemmtest dienen dem indirekten Nachweis von

Virusinfektionen mittels qualitativer und/oder quantitativer Analyse Virus-

spezifischer Antikörper.

• Gisela Flunker (Greifswald), Astrid Gall und Bernd

Hoffmann (Riems) für die Bereitstellung von Folien

Danksagung

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