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Arbeiten in der Zellkultur Dr. Tanja Musiol analytica 2016 – Forum Biotech, 11. Mai 2016

Arbeiten in der Zellkultur

Ein erster Überblick:

> Kultivierung eukaryotischer Zellen

> Kontaminationsarten, –quellen und deren Nachweis

> Vermeidung von Kontaminationen

> Desinfektion und Antibiotika

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Eppendorf AG | Analytica Forum Biotech | Arbeiten in der Zellkultur | Dr. Tanja Musiol | 11. Mai 2016







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Was braucht die Zelle in vitro?

Gefäße Umgebungsbedingungen

Medium

Kultivierung eukaryotischer Zellen

5 Eppendorf AG | Analytica Forum Biotech | Arbeiten in der Zellkultur | Dr. Tanja Musiol | 11. Mai 2016

Zellkulturmedien

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Inhaltsstoffe

> Salze

> Hauptsächlich NaCl

> Aminosäuren

> Medien mit stabilem L-Glutamin empfehlenswert oder L-Glutamin frisch zusetzen

> Zucker

> Glucose als Energielieferant

> Vitamine

> Unter anderem wichtig als Co-Faktoren für Enzyme


Zellkulturmedien

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Zusätze

> Serum

> Meistens wird fötales Rinderserum (FBS, fetal bovine serum) verwendet

> Enthält Wachstumsfaktoren, Spurenelemente, Hormone, Salze, Proteine

> Am wenigsten definierte Komponente in Zellkulturmedien

> Aktivität unterliegt starken Chargenschwankungen

> Phenolrot

> pH Indikator (in den meisten Flüssigmedien enthalten)

> Optimaler pH Wert (7,2-7,4)

> Antibiotika

??




Medium



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Auf die Oberfläche kommt es an...

Suspensionszellen

Adhärente Zellen

Unbehandelte Oberfläche (non-treated)

Zellkulturbehandelte Oberfläche (TC-treated)



unpolar + hydrophob

> Zellen können nicht auf der Oberfläche anheften Unbehandeltes Polystyrol

TC Behandlung

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TC-behandeltes Polystyrol

Anreicherung der Oberfläche mit polaren Gruppen


polar + hydrophil

> Zellen haften (hauptsächlich über im Serum enthaltene Proteine) an der Oberfläche


Die Klassiker

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Wenig Verdunstung; geringes Kontaminationsrisiko

Kein direkter Zugang zu den Zellen


Kostengünstig; direkter Zugang zur Wachstumsfläche

Höheres Kontaminationsrisiko; Handhabung im Stapel

Hoher Probendurchsatz, Automatisiertes Pipettieren

Höheres Kontaminationsrisiko, Plattenpositionseffekte (Edge Effect)




Medium



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Konstante Temperatur durch Beheizung der Innenkammer

Luftfeuchtigkeit über Wasserwanne

pH Balance des Mediums durch CO2

Evtl Sauerstoff : mit Versorgung durch N2 or O2


CO2 Inkubatoren


N2

O2

CO2







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Kontaminationsarten

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Kontaminationsarten, -quellen und deren Nachweis

Mikrobielle Kontaminationen

> Pilze, Hefen

> Bakterien

> Mykoplasmen

Eukaryotische Kontaminationen

> Kreuzkontaminationen mit anderen Zelllinien


Kontaminationsquellen

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Indirekte Quellen

> Labor und Laborausstattung

> Laborpersonal

Direkte Quellen

> Reagenzien

> Zelllinien und Primärzellen



Mikroskopischer Nachweis

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✔ > Bakterien

> Pilze

> Hefen

> Mykoplasmen

> Eukaryotische Zellen

✘



Detektion von Mykoplasmen

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Methode Sensitivität Spezifität Vorteile Nachteile

Mikrobiol. Kultur Hoch Hoch Empfohlen durch europäisches Arzneimittelbuch. Führt zu einem eindeutigen Ergebnis.

Mikrobiologisches Labor notwendig. Relativ langwierig. Potentielle Quelle für Kreuzkontaminationen. Manche Stämme sind nicht kultivierbar.

Direkte DNA- Färbung

Niedrig Niedrig (unspezifische DNA Färbungen)

Empfohlen durch europäisches Arzneimittelbuch. Schnell und preiswert.

Interpretierung des Ergebnisses kann schwierig und subjektiv sein.

Indirekte DNA- Färbung (Indikatorzellen)

Hoch Niedrig (unspezifische DNA Färbungen)

Einfacher zu interpretieren als die direkte DNA-Färbung, da die Kontaminanten amplifiziert werden.

Indirekte Methode, daher langsamer und langwieriger als die direkte DNA-Färbung

PCR Hoch Mittel (detektiert nicht alle Stämme)

Schnell und sehr sensitiv. Gute Kits von verschiedenen Herstellern auf dem Markt.

Falsch positive Ergebnisse möglich durch Übertrag von kontaminierten Proben und Positivkontrollen.

ELISA

Mittel (hoch mit ampli-fiziertem ELISA)

Mittel (detektiert nicht alle Stämme)

Schnell und einfach. Gut einsetzbar für große Anzahl von Proben.

Amplifizierte ELISA haben zusätzliche Schritte und sind langsamer. ELISA Reader notwendig

Biochemische Detektion

Mittel Hoch Sehr schnell. Gut für kleine Probenanzahl

Luminometer notwendig

Quelle: Modifiziert nach Geraghty et al., 2014 Br J Cancer doi: 10.1038/bjc.2014.166



Eukaryotische Kontaminationen

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> Kreuzkontaminierung einer Zelllinie mit einer anderen Zelllinie

> Tritt durch Fehler beim hantieren mit Zellen auf

> Schätzungen besagen, dass 15-30% aller Zelllinien weltweit entweder kreuzkontaminiert oder falsch identifiziert sind

> Aktuell sind ca. 500 kreuzkontaminierte Zelllinien dokumentiert

> ICLAC: International cell line authentication committee



STR Analyse

Short tandem repeats: Der genetische Fingerabdruck

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Analyse der PCR und Vergleich mit STR

Datenbank

Zelllinie Zellpellet PCR Isolierte DNA

Für mehr Informationen zu STR Analyse, Kreuzkontaminationen und falsch identifizierten Zelllinien (inklusive aktueller Liste betroffener Zelllinien): www.iclac.org









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Das Zellkulturlabor

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Vermeidung von Kontaminationen

> Nur Zugang für eingewiesene/geschulte Personen

> Kein Durchgangsverkehr

> Wenn möglich, separates Belüftungssystem (S2 Labor)

> Reinigungsbereich (Waschbecken)

> Oberflächen und Boden sollten leicht zu reinigen sein

> Türen und Fenster unbedingt geschlossen halten

> Equipment (Inkubator, BSC, Wasserbad, Pipetten, etc.) regelmäßig und gründlich reinigen

> Reinigungsplan/ Reinigungsvorschrift etablieren


Arbeiten an der Sicherheitswerkbank

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> Hände/Handschuhe desinfizieren

> Vor Arbeitsbeginn die Oberfläche in der Werkbank desinfizieren

> Arbeitsplatz sinnvoll einrichten

> Keine unnötigen Gegenstände

> Alle Gegenstände vor dem Einbringen oberflächendesinfizieren

> Sprühdesinfektion vermeiden

Arbeitsplatz vorbereiten




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Während der Arbeit

> In der Mitte der Werkbank arbeiten.

> Luftströmung an den Ansaugschlitzen nicht blockieren

> Nicht über offenen Flaschen, Schalen oder Platten hantieren

> Keine offenen Flammen (Bunsenbrenner)

> Schnelle, hektische Bewegungen in und vor der Werkbank vermeiden

> Nach der Arbeit Oberflächen im Innenraum der Werkbank desinfizieren



Reagenzien

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Reagenz/Medium mit Zellen testen 7 Tage kultivieren

(ohne Antibiotika!)

Zellen und potentielle Kontaminanten haben

sich vermehrt Mikroskopische Kontrolle

> Alle Aliquots (z.B. FBS, Trypsin) korrekt beschriften, inkl. Lotnummer

> Eingangskontrolle für riskante Reagenzien und frisch angesetzte Medien


Zelllinien und Primärzellen

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> Zelllinien von verlässlichen Quellen beziehen

> Zellbanken (z.B. ECACC, ATCC)

> Quarantäne für Zellen während der Testung

> Bakterien, Pilze, Hefen (in Kultur)

> Mykoplasmen (z.B. PCR)

> Kreuzkontaminationen mit anderen Zelllinien (STR Analyse)

> Nie zwei Zelllinien gleichzeitig in der Sicherheitswerkbank

> Arbeitsplatz in der Werkbank zwischendurch desinfizieren

> Zelllinien und Primärzellen getrennt voneinander kultivieren








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Desinfektion

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Desinfektion mit 70% Ethanol

> Wirkt nicht gegen Sporen

> Wirkt nicht gegen Pilze


Desinfektion und Antibiotika

Desinfektionsmittel

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Desinfektionsmittel Klasse

Vorteile Nachteile Auswirkung auf andere Materialien

Alkohole Kurze Kontaktzeit für effektive Wirkung. Preiswert und einfach vorzubereiten. Geringe Toxizität

Entflammbar. Nicht effektiv gegen Sporen und Pilze. Geringe Durchdringung von organischem Material.

Wirkt nicht korrosiv auf Metalle, aber kann Platik und Gummi schädigen

Hypochloride

Effektiv gegen die meisten Mikroorganismen. Geringe Toxizität. Kombinierbar mit Detergenzien.

Toxisch. Begrenzt aktiv gegen Pilze. Schnelle Inaktivierung durch organisches Material. Inaktivierung durch anionische Detergenzien. Lösungen zerfallen schnell und sollten regelmäßig erneuert werden

Wirkt korrosiv auf Metalle und Gummi. Färbt/bleicht Stoffe und Oberflächen

Phenole Effektiv gegen die meisten Mikroorganismen. Starke Anti-fungizide Wirkung

Toxisch, haut-reizend. Nicht effektiv gegen manche Viren. Inaktivierung durch anionische Detergenzien , hartes Wasser and Salze. Strenger Geruch.

Wirkt leich korrosiv auf Metalle. Kann Plastik beschädigen.

Quartäre Ammonium-verbindungen

Effektiv gegen die meisten Mikroorganismen. Geringe Toxizität

Nicht effektiv gegen Sporen und manche Viren. Lange Kontaktzeit notwendig für effektive Wirkung. Inaktivierung durch anionische Detergenzien. Reduzierte Aktivität bei hartem Wasser und Salzen.

Minimal Korrosiv. Kann Oberflächen färben.

Persauerstoff-verbindungen

Effektiv gegen die meisten Bakterien, Viren und Pilze. Eingeschränkt aktiv gegen Sporen

Haut-reizend. Lösungen zerfallen und sollten alle paar Tage erneuert werden

Korrosiv, aber geringer als Hypochloride

Quelle: Modifiziert nach Geraghty et al., 2014 Br J Cancer doi: 10.1038/bjc.2014.166


Antibiotika

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Antibiotika sind keine Allzweckwaffe

> Resistenzbildung durch Unterdosierung

> Schleichende Kontaminationen, die schwer unter dem Mikroskop zu erkennen sind

> Vernachlässigung der sterilen Arbeitstechnik

> Zytotoxische Effekte

> Nicht-standardisierte Verwendung kann zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen führen



Antibiotika

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Sinnvolle Verwendung von Antibiotika?

> Kurzzeitiger Einsatz von Antibiotika beim Ansetzen von Primärkulturen

> Kurzzeitiger Einsatz von Antibiotika bei unwiederbringlichen Zelllinien

> Achtung: Antibiotika sind bei 37°C nur begrenzt haltbar (3-5 Tage)!

Es sollte soweit wie möglich auf den Einsatz von Antibiotika in der Zellkultur verzichtet werden!!!



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