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Aufgabe II: Untersuchungen am isolierten Herzen (Straub- und Langendorff-Präparation)

Versuchsteil A Untersuchung ionaler und humoraler Effekte am isolierten Froschherz (Straubherz-Präparation) 1. Aufgabenstellung In diesem Versuchsteil sollen folgende Effekte am isolierten Froschherzen mit Hilfe eines Straub-Präparates untersucht werden:

1. Entzug von Ca2+-Ionen 2. Applikation eiskalter Ringerlösung 3. Applikation von Adrenalin 4. Erhöhung der extrazellulären K+-Konzentration 5. Applikation eines Betablockers (selektiver β1-Rezeptorenblocker) und eines Calciumantagonisten

(Ca2+-Kanalblocker Verapamil) 6. Aufzeichnung eines Einthoven-EKGs

2. Die Straubherz-Präparation Die Präparation des Froschherzens wird vor dem Praktikum durch Mitarbeiter des Institutes vorgenommen. Um Ihnen eine Vorstellung vom Ablauf zu geben, folgt eine kurze Beschreibung der Präparationsschritte. Man verwendet für diesen Versuch den Krallenfrosch Xenopus laevis. Das Froschherz ist etwas anders aufgebaut als das Herz eines Säugers. Es besitzt zwei komplett getrennte Vorhöfe, aber nur einen Ventrikel. Der linke Vorhof empfängt oxygeniertes Blut aus der Lunge, der rechte venöses Blut aus dem Körperkreislauf. Obwohl der Ventrikel ungeteilt ist, werden sauerstoffreiches und sauerstoff-armes Blut nur teilweise durchmischt. Sauerstoffreicheres Blut wird in die Körperarterien geleitet; sauerstoffärmeres Blut gelangt in die Lungen und die Haut, wo das Blut wieder mit Sauerstoff angereichert wird. Zur Präparation wird der Truncus arteriosus mit einem Faden abgebunden. An der V. cava posterior wird mit einer Schere möglichst herzfern ein kleiner Schnitt angebracht. Eine vorher mit Ringerlösung gefüllte Straubkanüle wird an der Schnittstelle eingeführt und so weit vorgeschoben, bis sich die Spitze der Kanüle im Ventrikel befindet. Das vom Herzen in die Straubkanüle gedrückte Blut wird sorgfältig abgesaugt und durch Ringerlösung ersetzt. Mit einem Faden wird die Kanüle möglichst herzfern an der Vene fixiert, damit der Sinus venosus, der primäre Schrittmacher, nicht abgebunden wird. Nun wird das Herz zusammen mit der Straubkanüle aus dem Frosch durch Abtrennen der noch bestehenden Verbindungen herausgenommen. Für die Messungen wird die Kanüle an einem Stativ befestigt. Der mittlere Flüssigkeitspegel in der Kanüle soll bei etwa 20 mm konstant gehalten werden, damit im Herzen immer der gleiche Druck herrscht. Achten Sie während der Messungen darauf, dass keine Luftblasen in das Herz gelangen! Die Ventrikelspitze wird mittels einer elastischen Klemme mit einem am Stativ befestigten mechanischen Wegeaufnehmer verbunden, der wiederum an einen Messrechner angeschlossen ist. Der Zugfaden wird

nach Storch & Welsch, 1993

vorsichtig gespannt. Die mit der Systole verbundene Verkürzung des Herzens erzeugt so ein zeitabhängiges Signal, das so genannte Herz-Mechanogramm. 3. Durchführung und Auswertung Das Herz-Mechanogramm wird mit Hilfe einer speziellen Software erfasst und graphisch dargestellt. Machen Sie sich zunächst mit dem Programm vertraut. Ein Student pro Gruppe sollte die Bedienung des Programms übernehmen, während die anderen für die Applikation der Substanzen verantwortlich sind. Applikation der Lösungen: Das Herz muss während des gesamten Versuches feucht gehalten werden, indem es ständig mit Ringerlösung versorgt wird. Dabei ist darauf zu achten, dass die Kanüle ständig mit einem konstanten Flüssigkeitslevel gefüllt ist. Außerdem sollte das Herz auch von außen mit Hilfe einer Pipette ab und zu mit Ringerlösung umspült werden. Dabei sollte es jedoch nicht mechanisch gereizt werden. Achten Sie darauf, dass das Herz beim Tauschen der Lösungen keine Luft zieht. Ersetzen Sie die Testlösung jeweils wieder durch Ringerlösung, sobald sich die Herzfrequenz und die Amplitude nicht mehr verändern. Zwischen den Applikationen der Testlösungen ist darauf zu achten, dass der Ausgangszustand nahezu wieder hergestellt wird.

Konzentration [mmol/l] NaCl NaH2PO4 MgSO4 CaCl2 KCl NaHCO3 Glucose

Frosch-Ringerlösung 100 1 1,6 1,6 4 20 5,5

Ca2+-freie Frosch-Ringerlösung 100 1 1,6 0 4 20 5,5

K+-reiche Frosch-Ringerlösung 79 2 1,6 1,6 25 30 5,5

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Verwenden Sie die in der Tabelle aufgelisteten Lösungen und gehen Sie wie folgt vor! Welche Effekte beobachten Sie und wie erklären Sie diese? 1. Austausch der Ringerlösung durch Ca2+-freie Ringerlösung. 2. Austausch der Ringerlösung durch eiskalte Ringer-Lösung. Was würden Sie beim menschlichen Herzen beobachten? 3. Zugabe von Adrenalin zur Ringerlösung (wenige Tropfen der bereitgestellten 10–5 M Lösung). 4. Austausch der Ringerlösung durch K+-reiche Ringerlösung

(Erhöhung der Kaliumkonzentration von 4 mM auf 25 mM). 5. Die jeweils letzte Gruppe kann den Effekt eines Betablockers und eines Ca2+-Kanalblockers testen. Gehen Sie dabei wie folgt vor: - Zugabe von ca. 5-10 Tropfen Adrenalin (10–5 M), positiv inotropen und chronotropen Effekt abwarten - Zugabe von 20-30 µl des β1-Rezeptorenblockers "Beloc i.v." (Wirkstoff Metoprololtartrat),

Effekt beobachten - Zugabe von 10 µl des verdünnten Ca2+-Kanalblockers "Verahexal" (Wirkstoff Verapamil), Effekt

abwarten - Zugabe von 10 µl "Verahexal" (unverdünnt), Effekt beobachten (Hinweis: die Substanz lässt sich nicht

auswaschen). 6. Aufzeichnung eines Einthoven-EKGs Dafür wird ein Frosch-Herz in eine Schale mit Ringerlösung gelegt. Die Ableitelektroden tauchen so in die Ringerlösung ein, dass sie das Einthoven-Dreieck bilden. Die Papier-Vorschubgeschwindigkeit wird mit Hilfe der Tasten [50] und [x 0,1] auf 5 mm/s eingestellt. Positionieren Sie das Froschherz zunächst passend zum Steiltyp (ca. 90°) und zeichnen drei Herzaktionen mit dem EKG-Schreiber auf. Drehen Sie anschließend das Herz passend zum Linkstyp und Rechtstyp und zeichnen jeweils wieder drei Herzaktionen auf. Wie ändern sich die R-Zacken in Ableitung I, II und III? Geben Sie anschließend ca. 1 ml Adrenalinlösung auf das Herz und beobachten Sie das EKG.

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Versuchsteil B Computersimulation zur Wirkung physiologischer und pharmakologischer Substanzen am isolierten Rattenherz (Langendorff-Präparat) 1. Einführung Dieser Versuchsteil wird als Simulation mit Hilfe der Software SimHeart durchgeführt. SimHeart ist ein realitätsnahes Programm, das keine gemessenen Versuchsergebnisse verwendet, sondern die Herzaktion nach einem mathematischen Algorithmus berechnet. Es besteht somit die Möglichkeit, auch ohne Präparation eines Tieres einige der klassischen Versuche am Langendorff-Herzen im virtuellen Labor durchzuführen. 2. Aufgabenstellung A) Schauen Sie sich zuerst das Video über die Präparation eines Langendorff-Herzens an! B) Untersuchen Sie die Wirkung von

1. Adrenalin 2. Acetylcholin 3. Atropin (Parasympatholytikum) 4. Propranolol (nichtselektiver β-Rezeptorenblocker) 5. Verapamil (Ca2+-Kanalblocker) 6. Strophanthin (Herzglykosid)

Beobachten Sie dabei die Wirkung auf die Herzfrequenz sowie auf die Druckamplitude! 3. Durchführung Machen Sie sich zunächst mit dem virtuellen Schreiber vertraut. Testen Sie eventuell einige Einstellungen für „Resolution“ in mV/Div (Div = Kästchen) und „Speed“ in cm/s (1 Kästchen ist 1 cm breit), um eine optimale Registrierung zu erhalten. Die Nährlösung (Perfusat) fließt aus einem Vorratsbehälter durch einen mit Carbogen durchperlten Zwischenbehälter. Das Perfusat hat eine konstante Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min. Dem Perfusat können Pharmakalösungen mit einer variablen Fließgeschwindigkeit beigemischt werden. Das Gemisch wird über eine Kanüle in die Aorta geleitet und gelangt von dort über die Herzkranzgefäße in das Herzmuskelgewebe. Dadurch wird auch außerhalb des Organismus die Grundversorgung des Herzmuskels mit Nährstoffen und Sauerstoff gewährleistet, während gleichzeitig die Wirkung von Pharmaka untersucht werden kann. In der linken Herzkammer befindet sich ein Ballonkatheter, der über eine Flüssigkeitssäule mit dem Transducer verbunden ist. Dieser wandelt die Druckänderungen infolge der Herzkontraktionen in elektrische Signale um und gibt diese über das rote Kabel an den Verstärker weiter.

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Applizieren von Substanzen: Das Herz wird ständig mit einer physiologischen Lösung (Krebslösung) mit einer Flussrate von 10 ml/min (= 10.000 µl/min) umspült. Bei der Applikation von Substanzen wird ein zusätzlicher Flüssigkeitsstrom in diese Krebslösung geführt. Bei der Festlegung der Konzentration muss beachtet werden, dass die eingestellten Konzentrationen durch die ständig fließende Krebslösung noch einmal verdünnt werden. Beispiel: Stellen Sie eine Konzentration von 10-4 M mit einer Flussrate von 10 µl/min ein, so erfolgt eine Verdünnung durch die Krebslösung um den Faktor 1000, da diese Krebslösung konstant mit 10.000 µl/min fließt. Die endgültige Konzentration der Substanz am Herzen ist also nicht 10-4 M sondern 10-7 M. Stellen Sie dagegen eine Flussrate von 100 µl/min ein, so ist der Verdünnungsfaktor nur 100. Die endgültige Konzentration beträgt also 10-6 M. Die Zufuhr der Substanzen erfolgt mit Hilfe des Perfusors. Es können 2 unterschiedliche Wirkstoffe gleichzeitig appliziert werden.

1. Reagenzglasständer mit gewünschtem Wirkstoff auswählen (aktuelle Wirkstoff-bezeichnung auf Reagenzglasständer anklicken und neue im Dropdown-Menü auswählen)

2. Bei gedrückter Maustaste wird das Reagenzglas mit der gewünschten Konzentration aus dem Reagenzglasständer in einen der beiden Perfusorschächte überführt.

3. Am Zählwerk den gewünschten Stromfluss in µl/min einstellen. Durch die rote Leuchtdiode unterhalb des Zählwerkes wird signalisiert, dass der eingestellte Wert nur im Zählwerk eingegeben, aber noch nicht vom Perfusor übernommen ist.

4. Pfeiltaste neben der roten Diode drücken. Die Diode wird grün. Der Wert wird vom Perfusor übernommen und erscheint im Display der Stromflusstaste.

5. Zur Applikation der Substanz wird die Stromflusstaste gedrückt. 6. Durch Drücken der Stop-Taste wird die Applikation beendet. 7. Hinweis: Vor dem Zurückstellen eines Reagenzglases muss der zugehörige Reagenzglas-

ständer ausgewählt werden. Achten Sie darauf, dass zwischen den einzelnen Teilversuchen ausreichend lange Kontrolllösung (Krebslösung) appliziert wird, um das Herz von Substanzresten zu befreien und somit den Ausgangszustand wiederherzustellen. Beim parallelen Zugeben von zwei Substanzen müssen zeitgleich beide Perfusoren angeschaltet sein. Wertebestimmung: Die Auswertung der Druckamplitude und der Frequenz wird sofort nach Stabilisierung des Effektes durchgeführt. Dazu werden die Kästchen ausgezählt und anhand der eingestellten Auflösung bzw. Schreibergeschwindigkeit in mV bzw. Schläge/min umgerechnet. Stellen Sie „Resolution“ und „Speed“ so ein, dass die Aufzeichnungen möglichst gut auswertbar sind. Bei der Amplituden-auswertung ist zusätzlich zu beachten, dass der Verstärker an seinem Ausgang 1 mV pro 2 mmHg liefert. Das heißt, die errechneten Amplituden in mV müssen anschließend durch Multiplikation mit dem Faktor 2 in mmHg umgerechnet werden. Sollte die Kurve aus dem Bild laufen, kann die Nulllinie durch Verschiebung des Schreibers korrigiert werden.

4. Auswertung Tragen Sie die Werte in die Tabelle ein und erläutern Sie ihre Beobachtungen!

1. Welchen Einfluss hat Adrenalin auf Herzkraft und Frequenz (Inotropie, Chronotropie)? 2. Welchen Einfluss hat Acetylcholin auf Herzkraft und Frequenz? Beachten Sie den

Unterschied zwischen isoliertem Herz und physiologischer Situation im Organismus. 3. Welche Wirkung hat Atropin bei alleiniger Applikation und warum? Welche Wirkung

erwarten Sie bei alleiniger Applikation von Atropin in vivo? 4. Wie verändert sich die Acetylcholinwirkung bei gleichzeitiger Applikation von

Atropin? 5. Wie verändert Propranolol die Adrenalinwirkung? 6. Bei Überdosierung von Verapamil kann es zum Herzstillstand kommen. Wie ist dieser

zu erklären und was ist die eigentlich angestrebte therapeutische Wirkung dieses Ca2+-Kanalblockers?

7. Welchen Effekt hat das Herzglykosid g-Strophanthin?

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Wirkungsweise der pharmakologischen Substanzen:

Applizierte Substanz Konz. [mol/l]

Amplitude [mmHg]

Frequenz [Schläge/

min] Kontrolle --- + Adrenalin 10-07

10-06 Kontrolle --- + Acetylcholin

10-07 10-06

+ Adrenalin 10-06 Kontrolle --- + Atropin 10-06 + Acetylcholin 10-07

10-06 Kontrolle --- + Adrenalin 10-06 + Propranolol 10-06

10-05 Kontrolle --- + Adrenalin 10-06 + Verapamil 10-06

10-05 10-04

Kontrolle --- + g-Strophanthin

10-08 10-07

Kontrolle --- + Verapamil 10-07 + g-Strophanthin 10-08

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5. Theorie zur Wirkungsweise der Substanzen Adrenalin: Positiv inotroper Effekt: Adrenalin aus dem Nebennierenmark und Noradrenalin aus den Nervenendigungen des Sympathikus binden an β1-adrenerge-Rezeptoren des Arbeitsmyokards. Über eine G-Protein-Kaskade wird die Adenylatzyklase aktiviert, was zu einem Anstieg des intrazellulären cAMP führt. cAMP aktiviert die Proteinkinase A, die über eine Phosphorylierung des L-Typ-Ca2+-Kanals diesen aktiviert und somit einen vermehrten Ca2+-Einstrom bewirkt. Die erhöhte Ca2+-Konzentration bewirkt eine erhöhte Kontraktionskraft. Positiv chronotroper Effekt: Adrenalin und Noradrenalin binden beide an β1-Rezeptoren der Sinusknotenzellen. Es findet auch in diesen Zellen die oben beschriebene cAMP-Kaskade statt. Der erhöhte cAMP-Spiegel steigert direkt den Schrittmacherstrom If, der durch cAMP-gesteuerte unspezifische Kationenkanäle getragen wird. Parallel kommt es wie in den Myokardzellen auch hier zu einem gesteigerten Ca2+-Einstrom (Phosphorylierung durch Proteinkinase A). Die Aktivierung der Schrittmacherkanäle und der Ca2+-Kanäle führt zu einer schnelleren diastolischen Depolarisation und zu einem steileren Aufstrich des Aktionspotentials im Sinusknoten. Acetylcholin: Negativ inotroper Effekt: Der direkte Einfluss von Acetylcholin aus dem Parasympathikus ist auf die Strukturen des Vorhofes beschränkt. Im Vorhofmyokard bindet es an muskarinerge ACh-Rezeptoren. Dies bewirkt über ein inhibitorisches G-Protein die Hemmung der Adenylatzyklase, wodurch der cAMP-Spiegel der Zelle sinkt und die Phosphorylierung der Ca2+-Kanäle durch die Proteinkinase A verringert wird. Die Konsequenz ist ein verminderter Ca2+-Einstrom, was die verminderte Kontraktionskraft erklärt. Negativ chronotroper Effekt: Durch den hemmenden Einfluss auf die Adenylatzyklase in den Sinusknotenzellen hat Acetylcholin eine Verminderung des Schrittmacherstromes zur Folge. Depolarisationen werden dadurch verzögert. Gleichzeitig kommt es zu einer rezeptorgesteuerten Aktivierung eines Kaliumkanals, was über die βγ-Untereinheit des inhibitorischen G-Proteins vermittelt wird. Es kommt dadurch zu einem vermehrten Kaliumausstrom, was ebenfalls die Depolarisation verzögert.

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Atropin: Atropin ist ein Alkaloid aus Nachtschattengewächsen, das beispielsweise in der Notfallmedizin (z. B. als Gegengift zu Muscarin) und in der Augenheilkunde eingesetzt wird. In hohen Dosen kann es zur Atemlähmung führen. Es wirkt parasympatholytisch, d. h. es vermindert die Wirkung von Acetylcholin, indem es die Bindungsstellen an muskarinergen Acetylcholin-Rezeptoren besetzt, ohne die Rezeptoren zu aktivieren. Propranolol: Dieses Medikament blockiert β-adrenergen-Rezeptoren (nichtselektiver Betablocker) und gehört somit zu den β-Sympatholytika. Da die Sympathikuswirkung am Herzen verringert wird, verringern sich Herzkraft und -frequenz. Dadurch sinkt das Herzminutenvolumen und mit ihm der arterielle Mitteldruck. Verapamil: Verapamil ist ein Ca2+-Kanalblocker und wird daher auch als Kalziumantatagonist bezeichnet. Bei therapeutischen Konzentrationen führt der geringere Ca2+-Einstrom zur Verringerung von Schlagkraft und Frequenz des Herzens und dadurch zur Senkung des arteriellen Mitteldrucks. Außerdem reduziert Verapamil den Tonus der glatten Muskulatur der Blutgefäße. Dadurch sinkt der periphere Widerstand und mit ihm der arterielle Mitteldruck. Strophantin (=Ouabain): Diese Substanz gehört zu den Herzglykosiden. Sie vermitteln ihre therapeutischen Effekte bei Herzinsuffizienz überwiegend durch die Kontraktionskraftsteigerung der Kardiomyozyten. Die Wirkung der Herzglykoside beruht hauptsächlich auf Hemmung der Na+/K+-ATPase. Diese Hemmung hat zur Folge, dass die beim Aktionspotenzial eingeströmten Na+-Ionen nicht mehr vollständig zurückgepumpt werden können und somit die intrazelluläre Na+-Konzentration steigt. Da der elektrochemische Na+-Gradient die Triebkraft für den Vorwärtsmodus (Na+ rein, Ca2+ raus) des Na+/Ca2+-Austauscher ist, wird in der Diastole weniger Ca2+ nach extrazellulär transportiert und stattdessen ins SR gepumpt. Somit kann in der nächsten Systole mehr Ca2+ aus dem SR freigesetzt werden und die Kontraktionskraft steigt. Herzglykoside haben eine geringe therapeutische Breite. Bei Überdosierung kommt es zu gefährlichen Elektrolyt- und Herzrhythmusstörungen. Die Herzinsuffizienz wird allerdings heutzutage in erster Linie nicht über eine Stärkung, sondern eine Entlastung des Herzens durch Blutdrucksenkung mit Betablockern, Hemmern des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems und Diuretika behandelt. Die klinisch verwendeten Herz-glykoside sind Digitoxin und Digoxin. 6. Schwerpunkte zur Vorbereitung auf das Praktikum - Ruhemembranpotential und Einwärtsgleichrichter-Kanäle (Kir-Kanäle) - Aktionspotentialformen und verantwortliche Ionenkanäle von Schrittmacherzellen und Zellen des

Arbeitsmyokards - spannungsabhängiger Na+-Kanal und seine drei Zustandsformen - absolute und relative Refraktärzeit - Erregungsbildungs- und -leitungssystem des Herzens - vegetative Innervation des Herzens und zugehörige Transmitter bzw. Rezeptoren - inotrope, chronotrope und dromotrope Effekte - elektromechanische Kopplung im Arbeitsmyokard - Ca2+-Transportprozesse der Myokardzelle - Rolle von Phospholamban bei einer sympathikotonen Stimulation des Herzmuskels: Wofür ist die

Aktivierung der SERCA von Bedeutung? - Frequenzinotropie - Wirkung von Hypokaliämie und Hyperkaliämie auf das Herz - Begriffe Antagonist und Agonist - Druck-Volumen-Diagramm des linken Ventrikels - Ruhedehnungskurve, Kontraktionsformen - isobare und isovolumetrische Maxima, Unterstützungskurve - Darstellung der 4 Herzphasen im Diagramm - Frank-Starling-Mechanismus und seine Bedeutung - Einfluss des Sympathikus - Ventrikelfunktionskurve - Koronardurchblutung, Koronarreserve - Energetik des Herzmuskels - EKG (Einthovendreieck und Lagetypen)

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