ändert standard-histologischen Methoden zugeführt werden.

Die KLSM liefert horizontale hautober-flächen-parallele Schnittbilder mit einer fast histologischen Auflösung um 1 µm und einer Fläche von 500 x 500 µm; Einzelzellen und Zellkerne sind also abgrenzbar. Die einzelnen Bilder können zu Mosaiken von bis zu 8 x 8 mm Größe durch laterales Scannen zusammen-gesetzt werden. Durch Verschiebung des Fo-kus kann eine Eindringtiefe der dargestellten Schichtebene bis in die obere Dermis erzielt werden (max. bis etwa 250 µm).

Topographie der normalen Haut in der KLSM

Die Aufnahme der Bilder ist einfach und kann mit etwas Übung effizient gestaltet wer-den. Die Interpretation der konfokalen Auf-nahmen erfordert allerdings eine besondere Ausbildung und Erfahrung. Neben der um-fangreichen Fachliteratur stehen für den Er-werb von Kenntnissen zur KLSM zahlreiche Lehrbücher und Atlanten zur Verfügung [2, 3]. Bis heute sind mehr als 380 Publikationen zur KLSM erschienen. Für die Anwender wurden modular aufgebaute Trainingsprogramme entwickelt. Für das Verfahren der KLSM wurde inzwischen eine deutsche S1-Leitlinie (AWMF-Register Nr. 013/076) erstellt und publiziert [4].

Bei der KLSM zeigt sich aufgrund der hori-zontalen Ansicht zuerst das Stratum corneum. Im konfokalen Bild werden hier die polygo-nalen kernlosen Korneozyten als kohäsiver, stark reflektierender Zellverband mit der für die Haut typischen Felderung und Fältelung, die als dunkle Linien erscheinen, sichtbar. Darunter wird das Stratum granulosum mit dunklen, oval-rundlichen Zellkern-Strukturen,

In den letzten Jahren haben gänzlich neue Technologien das diagnostische Spektrum der dermatologischen Onkologie maßgeb-lich erweitert. Hierzu zählen die konfokale Laserscanmikroskopie (KLSM), die optische Kohärenztomographie (OCT), die elektri-sche Impe danzspektroskopie (EIS) und die Multi spektral analyse. Alle Verfahren teilen dieselben Vorzüge: Sie sind nicht-invasiv, für den Patienten schmerzfrei, direkt anwendbar und liefern Daten und Befunde in Echtzeit. Zu den Stärken der bilddiagnostischen in-vi-vo Verfahren zählen zum einen die Schnellig-keit der Untersuchung und die Genauigkeit bei der Feststellung eines benignen oder ma-lignen Muttermals, zum anderen ist die Ver-meidung von unnötigen Gewebeentnahmen von hohem Stellen wert für den Patienten. Die diagnostischen Ver fahren eigenen sich auch zur Verlaufs beobachtung z.B. im Rah-men von Therapie maßnahmen.

Konfokale Laserscan­mikroskopie (KLSM)

Durch die KLSM lassen sich Schichten der Epidermis bis zur oberen Dermis in zellulärer Auflösung Ebene für Ebene horizontal ab-bilden. Das Gewebe wird mit einem Infrarot-laser abgetastet. Die konfokale Anordnung der Optik ermöglicht ein scharfes Bild der Fokus ebene ohne störende Effekte der darü-ber liegenden Schichten. Für die Bildgebung werden die unterschiedlichen Reflektions-eigenschaften des Gewebes genutzt. Die In-tensität der Reflektion ist dabei umso stärker je größer der Brechungsindex der Zellstruk-turen ist. Beispielsweise erscheint Melanin mit einem Brechungsindex von 1,7 hell im konfokalen Bild, während Keratin (Bre-chungsindex = 1,5) dunkler erscheint [1]. Unter suchte Hautareale können, falls not-wendig, zu einem späteren Zeitpunkt unver-

Aus der Dermatologie

Moderne Diagnoseverfahren in der Dermato­Onkologie

die von einem schmalen körnigen Ring hellen Zytoplasmas umgeben sind, dargestellt. Darauf-folgend ist das Stratum spinosum mit polygo-nalen, etwas kleineren Zellen abgrenzbar. Die Zellanordnung erscheint wabenartig mit einem dunklen Zellkern und einer hellen Zell membran. An einigen Stellen sind die ersten pigmentier-ten Basalzellen der Papillenschicht erkennbar. Die Zellanordnung erinnert an das Muster ei-nes Kopfsteinpflasters.

Etwas tiefergehend, in der dermo-epiderma-len Junktionszone, bilden die Basalzellen helle Ringe um die dunklen Papillen. Hier kann im Idealfall der Blutfluss in den oberflächlichen Kapillargefäßen aufgenommen werden. Die Basalzellen selbst erscheinen im konfokalen Bild sehr hell, da sie eine Kappe aus Melanin tragen. Je nach Melaningehalt der unter-schiedlichen Hauttypen nach Fitzpatrick kann die Reflexionsstärke variieren. Unter-halb der Junktionszone, im Stratum papillare, zeigen sich die retikulären Bündel des ober-flächlich-dermalen Bindegewebes. Die festen Bindegewebsfasern des Stratum reticulare, be-stehend aus kontrastgebendem Kollagen und Elastin, heben sich vor allem in der Gesichts-haut gut vom umliegenden Gewebe ab. Die Beschaffenheit des Bindegewebes in der obe-ren Dermis gibt im konfokalen Bild Auf-schluss über altersabhängige Unterschiede und Lichtschädigungen.

Breites Anwendungsspektrum der KLSM in der Dermato­Onkologie

Die KLSM kann zur Differenzierung zwi-schen Nävuszellnävi und malignen Melano-men sowie für die Diagnostik von epithelialen Tumoren (Basalzellkarzinome, aktinische Ke-ratosen, spinozelluläre Karzinome) eingesetzt werden. Dabei können die oberflächennahen Anteile eines Hauttumors ohne Operation di-rekt am Patienten mit fast histologischer Auf-lösung dargestellt werden.

Von besonderem Interesse ist die Einschät-zung von melanozytären Läsionen hinsicht-lich ihrer Dignität. Dies ermöglicht eine Me-lanom-Früherkennung und eine Vermeidung unnötiger Exzisionen. Die KLSM erreicht bei der Melanom-Diagnose eine Spezifität von 91,9 bis 97,3 % und einer Sensitivität von 69,3 bis 72,3 % [5, 6]. Die Spezifität basiert auf bildmorphologischen Charakteristika in Verbindung mit einem validierten Diagnose-Algorithmus nach Pellacani et al [5, 6, 7].

Die KLSM ist auch bei nicht-melanozytären Hautveränderungen, wie beispielsweise Basal-zellkarzinomen oder aktinischen Keratosen, in der Primärdignostik sowie Verlaufsbeob-achtung einsetzbar. Für die Diagnostik des Basalzellkarzinoms mittels KLSM ergab sich eine Spezifität von 95,7 % bis 100 % und eine Sensitivität von 82,9 % bis 88,5 % [8, 9].

Abb. 1: Topographie der Haut in der KLSM (Quelle: Mavig)

Abb. 2: Darstellung eines Basalzell­karzinom in der KLSM: Noduläre Nester mit Palisadenstellung (Quelle: Dr. Martina Ulrich, Charité Berlin)

Die KLSM lässt sich auch ex vivo zur Dia-gnostik und Schnittrandkontrolle an frisch chirurgisch entferntem, unfixiertem Gewebe ähnlich der mikrographisch-kontrollierten Chirurgie einsetzen. Gegenstand aktueller Forschung ist auch die Möglichkeit der Fluo-reszenzdiagnostik mittels konfokaler Laser-mikroskopie in und ex vivo, die dank der neuen multi-wave Lasergeräte mit drei ver-schiedenen Wellenlängen vielversprechend erscheint.

Optische Kohärenztomographie (OCT)

Die Optische Kohärenztomographie ist ein Bildgebungsverfahren, das seit mehr als 10 Jahren als Standardmethode in der Ophthal-mologie eingesetzt wird und nach techni-schen Weiterentwicklungen nun seit einigen Jahren auch für die Diagnostik in der der-matologischen Praxis zur Verfügung steht. Die OCT zeigt vertikale Schnittbilder von

einigen Millimetern Länge, die eine Auf-lösung von < 10 µm und, abhängig vom Ge-webe, eine Detektionstiefe bis zu 2 mm bie-ten, so dass hiermit inzwischen Veränderun-gen bis in die mittlere Dermis dargestellt werden können [10, 11]. Eine Weiterent-wicklung, die High-Definition optische Kohärenztomografie, ermöglicht zusätzlich eine horizontale (en-face) Bildgebung und in allen Dimensionen eine Auflösung von 3 µm bei einer Untersuchungszeit von weni-gen Minuten. Die OCT hat damit in der Bildqualität und Auflösung in den letzten Jahren einen weiten Sprung nach vorne ge-macht und erlaubt nun eine gute und schnelle Möglichkeit für die Sofortdia-gnostik von epithelialen Tumoren wie dem Basalzellkarzinom [12, 13]. Hierdurch kön-nen Biopsien vermieden werden und im Vor feld operativer Behandlungsmaßnahmen die Ausdehnung und Eindringtiefe von oberflächlichen Hauttumoren nicht- invasiv bestimmt werden. Insbesondere können Tumor grenzen zur Vermeidung von Nach-

Abb. 3: Darstellung einer Lentigo maligna in der KLSM (Quelle: Dr. Martina Ulrich, Charité Berlin)

Fallbeispiel 1:

Die Abbildung 3 zeigt den Einsatz der KLSM bei einer Patientin mit einer Lentigo maligna im Gesicht. 3 (a) zeigt das Foto einer unklaren Pigmentläsion unterhalb des rechten Auges. 3 (b) Auffällig in der Vergrößerung mit dem Dermatoskop ist das dunkler pigmentierte Areal im Zen-trum. 3 (c-e) In der Diagnostik mittels KLSM erlaubt die Übersichtsaufnahme die Beurteilung der Gesamtarchitektur (c). In der größeren Vergrößerung (d, 1x1 mm) können dann Gewebs-strukturen und Zellverbände beurteilt werden. Die Möglichkeit, einzelne atypische Pigment-zellen zu detektieren (e, rote Pfeile zeigen einzelne atypische Zellen), erlaubt dann die sofortige Diagnosestellung und somit unverzügliche Einleitung von Therapiemaßnahmen.

exzisionen und Lokalrezidiven präoperativ dargestellt werden. Außerdem stellt die op-tische Kohärenztomografie eine gute nicht-invasive Option zur Dokumentation von Therapieverläufen dar, wie bei der topischen Behandlung von aktinischen Keratosen und

Basalzellkarzinomen [14]. Die Technik kann allerdings auch bei nicht-onkolo-gischen Erkrankungen wie z.B. zum Nach-weis von Parasiten (Skabiesmilben) und Pilzstrukturen (Onychomykose) genutzt werden.

Abb. 4: Darstellung einer unbehandelten aktinische Keratose mittels KLSM.

Abb. 5: Regelrechte Honigwaben­Struktur mit homogenem Bild kleiner, polygonaler Keratinozyten nach einer 3 monatigen The­rapie mit Diclofenac in Hyaluronsäure Gel.

Fallbeispiel 2:Bei einem 61-jährigen Patienten bestehen seit längerer Zeit schuppende Rötungen im Be-reich der Stirnregion. Die betroffenen Stellen sind auf Berührungsreize leicht schmerzhaft und werden klinisch als aktinische Keratosen diagnostiziert. In der KLSM ist eine atypische Honigwabenstruktur mit z.T. großen polygonalen Zellen erkennbar (Abb. 4). Es wurde eine Flächentherapie der betroffenen Stirnregion mit Diclofenac in Hyaluronsäure Gel 2 x täglich eingeleitet. Nach 3 Monaten zeigte sich klinisch eine vollständige Abheilung und in der KLSM eine regelrechte Honigwabenstruktur mit kleinen, polygonalen Keratinozyten (Abb. 5)

Abb. 6: Vertikale Schnittbilder der oberen Haut mittels OCT (Vivosight®, Michelson Diagnostics)

Abb. 7: Ovoide Tumornester eines Basalzellkarzinoms in der OCT [Quelle: Dr. Orit Markowitz, New York]

Fallbeispiel 3: Bei der dermatologischen Untersuchung einer 61-jährigen Patientin fällt eine hautfarbene Papel an der Nase auf, die laut Angaben der Patientin bereits seit Jahren bestünde. Der klini-sche und dermatoskopische Befund sprechen eher für eine gutartige fibröse Nasenpapel. Eine Probebiopsie lehnt die Patientin aus kosmetischen Gründen ab. Die zusätzlich durchgeführ-te optische Kohärenztomografie zeigt ovoide Tumornester, die für das Vorliegen eines Basal-zellkarzinoms sprechen. Eine bioptische Sicherung wird durchgeführt und die histologische Begutachtung bestätigt die Diagnose eines nodulären Basalzellkarzinoms.

Abb. 8: Aktinische Keratose mit fokal verbreiterter Epidermis bei erhaltener dermo­epidermaler Junktionszone (VivoSight® ­ Michelson Diagnostics Lt.)

Abb. 9: OCT Darstellung (VivoSight® ­ Michelson Diagnostics Lt.) der vollständigen Abheilung einer aktinischen Keratose nach 3­monatiger Behandlung mit Diclofenac in Hyaluronsäure Gel.

Fallbeispiel 4:Bei einer 48-jährigen Frau bestehen mehrere bis zu 1 cm große, wenig schuppende, symp-tomlose, scharf begrenzte Rötungen im Wangenbereich. Klinische Diagnose: Aktinische Ke-ratosen (Carcinoma spinocellulare in situ). In der OCT stellt sich die Läsion als umschriebe-ne Verdickung der Epidermis mit erhaltener Basalmembran dar (Abb. 8). Nach Einleitung einer Lokaltherapie mit Diclofenac in Hyaluronsäure Gel über 3 Monaten konnte die kom-plette Abheilung aller Läsionen mittels OCT bestätigt werden (Abb. 9).

Elektrische Impedanz­spektroskopie (EIS)

Die Elektrische Impedanzspektroskopie ist eine patentierte Technologie, die im Laufe von 20 Jahren am Karolinska Institut in Stockholm entwickelt wurde. Durch die Möglichkeit der Erfassung und Analyse präzi-ser Daten von atypischen Läsionen stellt EIS einen technologischen Durchbruch bei der nicht visuellen Erkennung maligner Melano-me dar [15].

Erkennen struktureller Veränderungen mit EIS

Bei unterschiedlichen medizinischen Bedin-gungen weist das Hautgewebe unterschied-liche elektrische Eigenschaften auf. Normales Gewebe hat im Gegensatz zu atypischem Gewebe beispielsweise eine andere Zellgröße, Form, Ausrichtung, Kompaktheit und Struk-tur der Zellmembranen. Alle diese Verände-rungen wirken sich auf die Fähigkeit der Zelle aus, Elektrizität zu leiten und zu speichern, eine messbare Eigenschaft, die als elektrische Impedanz bezeichnet wird.

Die Haut wird harmlosen elektrischen Signa-len durch eine Hautläsion ausgesetzt. EIS kann dann diese Veränderungen analysieren und beispielsweise ein malignes Melanom feststellen. Mithilfe eines innovativen Elektro-densystems werden mehr Informationen von Spektren verschiedener Tiefe bereitgestellt, so

dass Veränderungen erkannt werden können, die auf Anomalitäten in der Zellstruktur, Aus-richtung, Größe, molekularen Zusammen-setzung und Integrität der Zellmembrane hinweisen.

EIS misst den Gesamtwiderstand im Gewebe bei Wechselströmen unterschiedlicher Fre-quenzen. Dabei wird zwischen zwei Elektro-den an der Sondenspitze ein nicht wahrnehm-bares wechselndes Potenzial angelegt. Um die Läsion sowohl in der Breite als auch in der Tiefe abzudecken, wird die Messung bei 35 Frequenzen und vier Tiefeneinstellungen in insgesamt 10 Permutationen auf der gesamten Läsion vorgenommen.

Einsatz der EIS in der Dermato­Onkologie

Verschiedene Frequenzen können zur Mes-sung verschiedener Zelleigenschaften einge-setzt werden. Im Allgemeinen werden EIS-Messungen bei niedrigen Frequenzen von der extrazellulären Umgebung beeinflusst, Mes-sungen bei höheren Frequenzen hingegen von der intra- und extrazellulären Umgebung. Die von EIS-System eingesetzten Frequenzen (1 kHz – 2,5 MHz) beziehen sich auf die kli-nisch relevanten Eigenschaften wie Zusam-mensetzung der intra- und extrazellulären Umgebung, Zellform und -größe sowie Zusammensetzung der Zellmembran, die al-lesamt den von Histopathologen für die Dia-gnose von Hautkrebs verwendeten Eigen-schaften ähnlich sind.

Abb. 10: Unterschiedliche elektrische Eigenschaften von normalem und abnormalem Gewebe [Quelle: Scibase]

Mit Hilfe des erweiterten Algorithmus von Nevisense® lassen sich Läsionen anhand der Messdaten von der Läsion und von einer Refe-renz klassifizieren. Das Ergebnis stellt dann einen Wert dar, der dem Grad der festgestellten Atypie entspricht. Sowohl der Klassifikator, als auch die Analysemethode wurden in mehreren Iterationen mit Daten aus mehreren klinischen Studien entwickelt. Die größte Prospektiv-studie zur Früherkennung maligner Melanome hat ergeben, dass mit Nevisence® folgende Ergebnisse erreicht werden können: 97 % Sen-sitivität bei einer Spezifität von 34 % [16].

Multispektralanalyse

Bei der Multispektralanalyse von klinisch atypi-schen Hautläsionen handelt es sich um soft-waregesteuerte, medizintechnische Geräte, die Zugang zu optischen Bildmetriken gestatten. Das von der FDA freigegebene und mit der CE-Kennzeichnung versehene Computer-Visi-on-System MelaFind® kommuniziert mittels Spektralanalyse von Licht aus 10 unterschied-lichen Wellenlängen (430 nm – 950 nm) digi-tale Daten bis zu einer Hauttiefe von 2,5 mm.

Abb. 11: Pike­Elektrodensystem der EIS (Nevisense®; 45 Spikes x 5 Elektroden, d. h. insgesamt 225 Spikes auf einer quadra tischen Oberfläche von 5x5 mm Spike­Länge: 150 mm).[Quelle: Scibase]

Abb. 12: Multispektralanalyse von atypischen Pigmentläsionen zur Früherkennung von Melanomen [Quelle: MelaScience]

Die Auflösung beträgt 20 µm, was ca. 3 Melano-zyten entspricht. Die Daten werden anschlie-ßend von hochentwickelten proprietären Com-puteralgorithmen aufgearbeitet. In weniger als einer Minute bietet MelaFind® unterschied-liche Spektralbilder und Daten über den Grad der dreidimensionalen morphologischen Des-organisation einer Läsion. Unter Verwendung eines speziell entwickelten Algorithmus werden Asymmetrie-, Textur- sowie Struktureigen-schaften analysiert und bewertet. Der Grad der Disorganisation wird in einem Score-System im Range von -5,25 bis +9,00 dargestellt.

Computer­Bildgebungssystem zur Unterstützung der Melanom­Früherkennung

Das System wurde anhand einer umfangrei-chen proprietären Datenbank für pigmentierte Hautläsionen entwickelt, trainiert und getestet [17]. Insgesamt wurden mehr als 10.000 Haut-läsionen mit entsprechenden histologischen Befunden von mehr als 7.000 Patienten mit 600 Melanomen im In-Situ-Stadium oder sehr geringer Tumordicke analysiert. Das Diagnose-system soll dem Dermatologen in besonderer Weise bei der diagnostischen Abklärung von atypischen Pigmentläsionen und Frühformen von Melanomen unterstützen. Die Sensitivität und Spezifität von MelaFind® wurde im Rah-men einer großen randomisierten multizentri-schen Studie untersucht [18]. Als Ergebnis die-ser Studie betrug die Sensitivität des Verfah-rens für Melanom 98,3 % (Score ≥ 0) bei einer Spezifität von 10,8 %. Die mittlere Tumor-dicke der untersuchten Melanome betrug 0,365 mm und 45 % aller Melanome waren in situ. Somit bietet die Multispektralanalyse mit MelaFind® eine hohe Sensitivität zur Erken-nung von Melanomen im Frühstadium und übertrifft nach den Auswertungen der multi-zentrischen Studie die Sensitivität von derma-tologischen Experten.

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Verfasser

Prof. Dr. Uwe Reinhold Dermatologisches Zentrum Bonn Friedensplatz 53111 Bonn E-Mail: u.reinhold@derma-bonn.de

Dieser Artikel ist erschienen im Spektrum der Dermatologie 2/2013, initiiert von der Janssen-Cilag GmbH.