Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik

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Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik

der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

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INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades

der Medizinischen Fakultät

der Albert-Ludwigs-Universität

Freiburg im Breisgau

Vorgelegt 2002 von Herrn Stephan Meckel

geboren in Karlsruhe

II

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher

1. Gutachter: Prof. Dr. med. Dr. h.c. H.E. Blum

2. Gutachter: Prof. Dr. sc. nat. H. Pircher

Jahr der Promotion: 2002

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Meinen Eltern

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1.4.1 Funktionen des X-Proteins ___________________________________________ 9

1.4.2 Immunologische Charakterisierung des X-Proteins _______________________ 12

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1.5.1 Allgemeines Prinzip _______________________________________________ 13

1.5.2 Modulation und Verstärkung der Effizienz ______________________________ 15

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1.6.1 Das Vakzinia-Expressionssystem _____________________________________ 19

1.6.2 Immunologischer Einsatz rekombinanter Vakzinia-Viren __________________ 22

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2.1.1 Das adw-Expressionsplasmid pRc/CMV-X _____________________________ 24

2.1.2 Klonierung des Vakzinia Shuttle–Plasmids pSc11-X ______________________ 24

2.1.3 Klonierung des Expressionsplasmids pcDNA3-X_________________________ 27

2.1.4 Transformation kompetenter E.coli-Bakterien ___________________________ 27

2.1.5 Mini- und Maxi-Präparation der Plasmid DNA __________________________ 29

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2.2.1 Zellen___________________________________________________________ 30

2.2.2 Liposomaler Gen-Transfer___________________________________________ 31

2.2.3 Calcium-Phosphat Transfektion ______________________________________ 32

2.2.4 Bestimmung der Transfektionseffizienz mit dem Luziferase-Assay___________ 32

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2.3.1 Lyse der transfizierten Zellen ________________________________________ 33

2.3.2 SDS-PAGE ______________________________________________________ 34

2.3.3 Immunoblot ______________________________________________________ 34

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2.4.1 Allgemeines zum Vakzinia-Virus _____________________________________ 35

2.4.2 Sicherheitsmaßnahmen im Umgang mit Vakzinia-Viren ___________________ 37

2.4.3 Herstellung von Vakzinia-Virussuspensionen im kleinen und großen Maßstab __ 38

2.4.4 Titrierung von Vakzinia-Virussuspensionen im Plaquetest__________________ 40

2.4.5 Homologe Rekombination und Selektion rekombinanter Vakzinia-Viren ______ 44

2.4.6 Charakterisierung rekombinanter Vakzinia-Viren und ihrer Genprodukte ______ 49

2.4.7 UV-Inaktivierung der Replikation rekombinanter Vakzinia-Viren____________ 51

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2.5.1 DNA-Immunisierung_______________________________________________ 52

2.5.2 Gewinnung des Serums, Präparation der Milz und Erstellung einer Einzel-

Zellsuspension __________________________________________________________ 53

2.5.3 ELISA zum Nachweis von HBx-spezifischen Antikörpern _________________ 54

2.5.4 In vitro Proliferationsanalyse von T-Zellen______________________________ 55

2.5.5 In vitro Stimulation und Nachweis von zytotoxischen T-Zellen (CTLs) _______ 56

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3.1.1 Konstruktion des Expressionsplasmids pcD/3-X-ayw______________________ 59

3.1.2 Klonierung des Vakzinia Transferplasmids______________________________ 61

3.1.3 Präparation der Plasmid-DNA________________________________________ 63

3.1.4 Optimierung der Transfektionseffizienz mit dem Reportergen Luziferase ______ 64

3.1.5 Expression von HBx-adw und HBx-ayw________________________________ 66

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3.2.1 Rekombination und Selektion der Virusklone____________________________ 70

3.2.2 Präparationen rekombinanter Virusklone _______________________________ 70

3.2.3 Charakterisierung rekombinanter Vakzinia-Viren und ihrer Genprodukte ______ 71

3.2.4 UV-Inaktivierung rekombinanter Vakzinia-Viren_________________________ 76

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3.3.1 Anti-HBx Antikörper nach DNA-Immunisierung_________________________ 79

3.3.2 Die T-Zellproliferationsantwort nach DNA-Immunisierung_________________ 82

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3.3.3 Zytotoxische T-Zellaktivität _________________________________________ 86

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4.1.1 HBx als Zielantigen der spezifischen Immuntherapie______________________ 93

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4.4.1 HBx-spezifische Antikörperproduktion________________________________ 100

4.4.2 T-Zellproliferationsantworten _______________________________________ 102

4.4.3 CTL-Antworten __________________________________________________ 105

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Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist der Prototyp der Familie der Hepadnaviren. Es handelt

sich um kleine umhüllte DNA-Viren, die primär die Leber infizieren. Hierzu werden

auch das Woodchuck-Hepatitis-Virus (WHV), das Ground-Squirrel-Hepatitis-Virus

(GSHV), das Enten-Hepatitis-B-Virus (DHBV) und das Reiher-Hepatitis-B-Virus

(HHBV) gezählt.

Die infektiösen Viruspartikel haben elektronenmikrospisch eine sphärische Gestalt mit

einem Durchmesser von 42 nm und werden auch nach ihrem Entdecker als Dane-Partikel

benannt. Die Konzentration zirkulierender Dane-Partikel im Serum HBV-infizierter

Patienten variiert zwischen 103 und 109 Viruspartikel/ml. Die Virushülle besteht aus

verschiedenen HBV-Hüllproteinen, welche ein ikosaedrisches Kapsid mit einem

Durchmesser von 22 bis 25 nm umgeben. Dieses besteht aus 240 Einheiten des HBcAg

(Hepatitis-B-Virus Core-Antigen) und enthält das Virus-Genom. Im Serum infizierter

Patienten werden außerdem noch 22 nm große, nicht infektiöse sphärische und

fadenförmige Partikel gefunden, welche überwiegend aus dem kleinen HBV-Hüllprotein

(HBsAg) bestehen, jedoch keine virale DNA enthalten. Diese Partikel kommen während

einer Infektion in Konzentrationen von 106 bis 1014/ml Serum vor und sind sehr

immunogen, weshalb sie zur Entwicklung einer HBV-Vakzine genutzt werden konnten

(261).

Das je nach Subtyp 3100 bis 3300 Basenpaare lange Genom besteht aus nur partiell

doppelsträngiger DNA. Der vollständige Minusstrang wird im Replikationsverlauf in

mRNA transkribiert und enthält 4 offene Leserahmen, welche in verschiedenen

Leserastern liegen und sich teilweise überlappen. Von diesen kodiert jeweils einer für die

verschiedenen Formen des HBsAg (kleines, mittleres und großes Hüllprotein), für die

Nukleokapsidantigene (HBcAg und sezerniertes HBeAg), für die DNA-Polymerase (P-

2

Protein) sowie für das X-Protein (siehe Abb. 1). In vivo hat man bisher 4 verschiedene

mRNAs gefunden: die 3.3 kb große prägenomische RNA dient zur Translation der

Polymerase, des Core-Antigens sowie des HBeAg. Das große Hüllprotein (präS1-

HBsAg) wird von der 2.4-kb-RNA synthetisiert, das mittlere (präS2) und das kleine

Hüllprotein von der heterogenen 2.1-kb-RNA. Das X-Antigen wird durch eine 0,8 kb

große mRNA kodiert. Bei der viralen Replikation dient die 3.3-kb mRNA gleichzeitig als

prägenomisches RNA-Intermediat, welches mit dem Polymerase-Protein über das ε-

Signal interagieren kann. Die Polymerase besitzt eine Reverse-Transkriptase-Aktivität,

die ein kurzes Stück genomischer DNA synthetisiert, um dann mit dem RNA-Transkript

zu hybridisieren. Dieses fungiert dann als Primer zur Synthese des gesamten

genomischen DNA-Stranges (296). Mit Hilfe der RNase-H-Aktivität der Polymerase

wird der Abbau der RNA am RNA/DNA-Hybrid vollzogen und schließlich zuletzt der

komplementäre DNA-Strang synthetisiert. Das X-Protein scheint für die Infektiosität von

HBV in vivo, nicht jedoch für den Replikationszyklus essentiell zu sein (19, 32, 186,

198).

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Das HBV wird parenteral übertragen. Dabei ist der Mensch das einzige Reservoir für die

Erreger, wobei eine experimentelle Übertragung auf den Schimpansen möglich ist. Eine

Infektion mit dem Virus führt zu einer akuten Hepatitis, welche in 5-10% chronisch

verläuft. Die Infektion des Neugeborenen durch eine chronisch infizierte Mutter kann

pränatal, aber vor allem perinatal, selten auch über die Muttermilch erfolgen und führt in

90% zu einer chronischen Verlaufsform. Dieser Infektionsmodus spielt eine wesentliche

Rolle in Hochendemiegebieten wie Ostasien, Zentral- und Westafrika mit einer

Durchseuchung der Bevölkerung von 20-80%. Die akute Verlaufsform hat eine

Inkubationszeit von 2-6 Monaten und verläuft in bis zu 65% asymptomatisch. Die

symptomatische Form geht mit Ikterus, Hepatomegalie evtl. auch Fieber und

Krankheitsgefühl einher und dauert in der Regel 2-3 Wochen. Die chronische HBV-

Infektion wird histopathologisch abhängig vom Entzündungsgrad und Ausprägung einer

Leberfibrose/-zirrhose in unterschiedliche Schweregrade unterteilt. Mit der Dauer einer

chronischen Infektion und Ausbildung einer Leberzirrhose steigt das Risiko, ein

hepatozelluläres Karzinom (HCC) zu entwickeln. Weltweit rechnet man insgesamt mit

ca. 350 Millionen chronisch infizierten Personen und etwa 250 000 sterben pro Jahr am

HCC. Neben der kontinuierlichen Hepatozytenregeneration und der genetischen

Instabilität scheint auch die Integration des HBV-Genoms an zufälliger Stelle in die

chromosomale DNA des Hepatozyten eine Rolle bei der Entstehung des HCC zu spielen

(202).

Zur serologischen Diagnose einer akuten HBV-Infektion bestimmt man das HBsAg. Eine

Ausheilung wird durch durch den Verlust von HBsAg und das Auftreten von anti-HBs

und anti-HBe Antikörpern angezeigt. Eine chronische Verlaufsform zeigt sich durch die

Persistenz von HBsAg über einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten. Zur Bestimmung

der Höhe der viralen Replikation wird die virale DNA-Menge im Serum mittels

quantitativer Polymerasekettenreaktion gemessen. Der Durchseuchungsgrad einer

Bevölkerung lässt sich am besten mittels anti-HBc Antikörper ermitteln, da diese sowohl

nach einer akuten als auch bei einer chronischen Infektion lebenslang persistieren (siehe

Abb. 2).

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��(�� (entnommen aus Modrow S, Falke D, Molekulare Virologie (186)).

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In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, daß das HBV nicht direkt zytopathisch

für die infizierten Hepatozyten ist (46). Untersuchungen zur Pathogenese der Hepatitis B

im humanen System und im Tiermodell erbrachten eindeutige Hinweise, daß die

Hepatitis durch zelluläre HBV-Antigen-spezifische und Antigen-unspezifische

Immunreaktionen initiiert wird (29,107). Bei der Viruselimination sind sowohl zelluläre

als auch humorale Immunmechanismen beteiligt. Es konnte gezeigt werden, daß neben

der Virus-spezifischen, T-Zell vermittelten Lyse infizierter Zellen auch inflammatorische

Zytokine, welche von aktivierten Antigen-spezifischen und -unspezifischen

lymphomononukleären Zellen sezerniert werden, eine wichtige Rolle spielen. Letztere

können direkt und auf nicht-zytopathischem Wege eine Inhibition der Virusreplikation

und der viralen Genexpression induzieren (5, 47).

5

Bei einem selbstlimitierenden Verlauf einer akuten Hepatitis B beobachtet man eine

besonders starke, multispezifische und polyklonale T-Zellantwort gegen verschiedene

HBV-Antigene. Im Falle einer chronischen HBV-Infektion gelingt die vollständige

Viruselimination nicht und es findet sich eine bedeutend schwächere und antigenetisch

stärker restringierte Immunantwort im Blut der Patienten. Es konnten zahlreiche MHC-

Klasse-I und -Klasse-II restringierte T-Zell-Epitope im Bereich der HBV-

Strukturproteine identifiziert werden, wobei die CD4+ T-Helferzellantworten vor allem

gegen das Core-Antigen gerichtet sind, während die HBV-Hüllproteine, das Core-

Antigen und das Polymerase-Antigen häufig Ziel einer CD8+ zytotoxischen T-

Zellantwort (CTL) sind (47). Auch nach Ablauf einer selbstlimitierenden akuten

Hepatitis können Spuren der HBV-DNA im Serum in sehr niedrigen Konzentrationen

mittels PCR trotz kompletter klinischer und serologischer Ausheilung über Jahrzehnte

nachweisbar bleiben. Diese „low-level“-Persistenz der viralen DNA tritt in Kombination

mit nachweisbaren HBV-spezifischen CTL-Antworten auf. Dies könnte darauf

hinweisen, daß die HBV-DNA transkriptionell aktiv ist und somit wenige virale Partikel

bzw. Antigene lebenslang produziert werden, welche eine protektive CTL-Antwort

ständig unterhalten (175, 221).

Im transgenen Mausmodell wurden weitere Untersuchungen zu HBV-spezifischen

zytotoxischen T-Zellen und den Mechanismen der nicht-zytopathischen Immunantwort

durchgeführt. Transgene Mäuse, welche das HBV-Hüllprotein in ihren Hepatozyten

exprimieren, entwickelten nach dem intravenösen, adoptiven Transfer von CD8+ MHC-

Klasse-I restringierten, HBsAg-spezifischen CTL-Klonen eine akute Hepatitis (5, 106,

190, 301). Es wurden typische Zeichen der Apoptose mit der Bildung von azidophilen

Councilman Bodies, welche charakterischerweise auch bei einer humanen, akuten viralen

Hepatitis auftreten, beobachtet. Bei diesem Prozess des CTL-induzierten Killings

infizierter Hepatozyten werden simultan Fas-vermittelte und Perforin abhängige

Apoptose-Wege aktiviert (196).

Die CTL-induzierte Apoptose betrifft jedoch insgesamt nur 5% aller Hepatozyten und es

kommt konsekutiv durch das Einwandern weiterer Entzündungszellen zu einer

nekroinflammatorischen Reaktion mit dem klinischen Bild des Ikterus. Hierbei spielt

auch die Antigen-unspezifische Zerstörung von Hepatozyten mittels Interferon-γ (IFN-γ)

und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) Sekretion durch aktivierte Leber-Makrophagen

6

und T-Zellen eine wichtige Rolle (4). Neben dem Killing von Hepatozyten kommt es

vermittelt durch die CTLs zu einer nicht-letalen Suppression der viralen Replikation und

Expression in allen Hepatozyten (104, 106). Dieser nicht-zytopathische Prozess ist

Zytokin vermittelt und kann durch spezifische anti-IFN-γ und anti-TNF-α Antikörper

blockiert werden.

Außerdem wurde untersucht, daß ein solcher Prozess auch durch den Transfer von

HBsAg-spezifischen MHC-Klasse-II restringierten T-Zellklonen in transgene Mäuse

initiiert werden kann. Ein weiterer starker Inhibitor der HBV-Replikation in der Leber ist

Interleukin-12 (IL-12), welches über die Induktion von IFN-γ wirksam wird (40). Die

beiden Zytokine IFN-γ und IL-2 wirken über die Aktivierung von Lebermakrophagen,

welche das antiviral wirksame TNF-α sezernieren (99, 105). Dieses hemmt konsekutiv

die Expression von HBV-Proteinen durch eine posttranskriptionelle Degradation der

HBV-RNA in der infizierten Zelle.

Eine ungeklärte Frage bleibt jedoch weiterhin der genaue Mechanismus der HBV-

Persistenz bei einer chronischen HBV-Infektion. Der immunologische Toleranz-Effekt

ist wahrscheinlich entscheidend für die fehlende antivirale Immunantwort und Persistenz

der neonatalen HBV-Infektion nach einer Mutter-zu-Kind-Transmission des Virus. Es

wurde wiederholt gezeigt, daß die CTL-Antwort chronisch infizierter Patienten sehr

schwach im Vergleich zu einer akuten, selbstlimitierenden HBV-Infektion ist (185, 207,

220).

Es gibt mehrere Hypothese, die eine virale Persistenz und Suppression der zellulären

Immunität erklären können:

♦ Induktion einer peripheren immunologischen Toleranz.

♦ Erschöpfung der T-Zellantwort durch eine sehr hohe Viruslast und Antigenämie.

♦ CTL-Inaktivierung durch Antigenpräsentation ohne den Kontext kostimulatorischer

Signale in der Leber.

♦ Inhibition der Antigenpräsentation durch virale Mechanismen.

♦ „Down“- Regulation der viralen Gen-Expression.

♦ HBV-Infektion extrahepatischer, peripherer immunologischer Organe (253).

7

♦ Umgekehrte Expression des Fas-Liganden in der infizierten Leberzelle und

Destruktion der CTLs über den Fas Ligand–Fas Rezeptor-Mechanismus (93, 102).

♦ Eine verminderte Zytokinproduktion vom TH1-Subtyp oder das Vorliegen einer

TH0/TH2 Polarisierung könnte die komplette Virus-Elimination verhindern.

Um diese Hypothesen belegen zu können, bedarf es weiterer, intensiver

immunologischer Untersuchungen in Hepadnavirus Tiermodellen und im humanen

System.

Eine Selektion von CTL-Escape-Mutanten kann im Rahmen einer chronischen HBV-

Infektion auftreten. Sie spielt jedoch wahrscheinlich keine so bedeutende Rolle für die

Viruspersistenz wie z.B. bei der HIV-Infektion (7, 27, 28, 130). Die Mutanten werden

charakteristischerweise durch eine starke und besonders restringierte Immunantwort

selektioniert – bei der chronischen HBV-Infektion kein häufig anzutreffender Zustand

(siehe oben). Außerdem entstehen sie meist sekundär auf dem Boden einer bereits

persistierenden HBV-Infektion. Inwieweit solche Mutanten als primäre Ursache für die

HBV-Persistenz in Frage kommen, ist bisher ungeklärt.

Die CD4+ MHC-Klasse-II restringierte T-Zellhilfe ist ein wichtiger Faktor für die Stärke,

Spezifität und Polarisierung der CTL-Antwort während einer akuten und auch

chronischen HBV-Infektion. Eine Assoziation bestimmter MHC-Klasse-II Allelen

(DRB1*1302) mit einem protektiven Effekt gegen die chronische HBV-Infektion konnte

in Fall-Kontroll-Studien nachgewiesen werden (268).

Die Differenzierung von CD4+ T-Zellen in TH1- (inflammatorische) und TH2-

Effektorzellen entscheidet, ob eine humorale oder zelluläre Immunantwort vorherrschend

sein wird (231). TH1-Zellen zeichnen sich durch Sekretion großer Mengen der Zytokine

IL-2, IFN-γ, TNF-α, TNF-β, Granulozyten-Makrophagen-Colony Stimulating Factor

(GM-CSF) und IL-3 aus und sind wichtig für die Initiation einer Antigen-spezifischen,

zellulären Immunantwort. Weiterhin erkennen TH1-Zellen Peptide im Kontext mit

MHC-Klasse-II Molekülen auf der Oberfläche von professionellen Antigen-

präsentierenden Zellen (APCs), wie dendritischen Zellen, Makrophagen und aktivierten

B-Zellen (184, 187). Weitere wichtige Funktionen der TH1-Zellen sind die Rekrutierung

von Makrophagen an den Infektionsort durch eine IL-3- und GM-CSF-vermittelte

8

Stimulation der Produktion im Knochenmark sowie die Aktivierung der Makrophagen

über die Zytokine IFN-γ und TNF-α (254).

Die klassischen T-Helferzellen vom TH2-Typ werden zumeist durch extrazelluläre

Erreger, wie die meisten Bakterien, aktiviert (206). Mit einem Zytokinprofil zur B-Zell

Stimulation sezernieren sie insbesondere IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10. Durch die

Produktion von Antikörpern gegen virale Oberflächenantigene durch aktivierte B-Zellen

können auch die Viruspartikel in der Blutbahn gebunden werden. Somit kann initial

Schutz gegen eine Infektion erzeugt und ein sekundäres Fortschreiten der Viren von

Zelle zu Zelle verhindert werden.

Patienten mit einer akuten, selbstlimitierenden HBV-Infektion zeigen vorwiegend ein

TH1-spezifisches Zytokinmuster. Dagegen produzieren die intrahepatischen T-

Helferzellen von chronisch infizierten Patienten ein variables Muster mit einzelnen TH1-

und TH2-Klonen und Kombinationen von Zytokinen (TH0) (15, 123, 128, 129). Dieses

Phänomen könnte eine Erklärung für die Insuffizienz der Immunantwort bei chronisch

infizierten Patienten darstellen.

In ersten experimentellen Ansätzen einer HBV-Immuntherapie konnte gezeigt werden,

daß sowohl rekombinantes HBsAg nach i.m. Administration als auch DNA-

Immunisierung mit verschiedenen Formen der HBV-Hüllantigene in Mäusen und

Primaten eine potente T-Zellantwort erzeugen können (41, 64, 94, 126, 145, 170, 238).

Insbesondere mit der Methode der DNA-Immunisierung ließen sich im murinen System

besonders starke humorale und zelluläre Immunantworten gegen Epitope der Hüll- und

HBV-Core-Antigene induzieren. Mit der adjuvanten Gabe von Zytokin kodierenden

Plasmiden wie IL-2, GM-CSF, IL-12 und IFN-γ konnten stärkere CTL-Antworten

induziert und eine Differenzierung in TH1- und TH2-Subtypen durch Koimmunisierung

der entsprechenden Zytokin-Plasmide gezeigt werden (49, 96, 300). Durch die

Konstruktion von Polytop-Minigen-Plasmiden, welche mehrere humane HLA

restringierte Epitope der HBV-Polymerase-, Hüll- und Core-Antigene kodieren, konnte

die Entwicklung und Optimierung von Epitop-spezifischen DNA-Vakzinen in HLA-

transgenen Mäusen getestet werden (124, 158). Zum jetzigen Zeitpunkt werden bereits

die ersten klinischen Studien der Phase I zur therapeutischen DNA-Immunisierung

chronischer HBV-infizierter Patienten durchgeführt (262).

9

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Der kleinste ORF des HBV-Genoms wurde erstmalig von Galibert et al (92) beschrieben

und kodiert für das lösliche, intrazelluläre X-Protein mit einer Länge von 145 bis 154

Aminosäuren (17 kD). Seine Rolle bei der HBV-Replikation und Pathogenese der

Hepatitis-B-Infektion ist bis dato unklar, zumal bisher kein Protein der vorhergesagten

Größe in infizierten Zellen oder Viruspartikeln sicher in vivo nachweisbar war. Ursache

dafür ist wahrscheinlich die sehr schnelle Degradation des Proteins bzw. eine sehr

schwache intrazelluläre Expression unterhalb der experimentellen Nachweisgrenze. In

vitro Transfektionsstudien mit heterologen Promotoren konnten ein 17 kD großes Protein

nachweisen, welches sich immunhistochemisch in humanen Lebergewebe primär im

Zytoplasma, in einigen Zellen jedoch ausschließlich im Nukleus lokalisieren läßt (61, 92,

247, 318). Es besteht eine Homologie von 80% zwischen den 4 unterschiedlichen HBV-

Subtypen, darüber hinaus eine 71 bzw. 31%ige Homologie zu WHV und GSHV.

Hochkonservierte Sequenzen befinden sich im Bereich des Amino- und Karboxy-

Terminus des ORF. Im Gegensatz dazu enthält das DHBV und das HHBV keinen X-

ORF. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, daß das X-Protein nicht essentiell für die

Replikation von HBV in vitro zu sein scheint (32, 310). Allerdings ist es im Woodchuck-

Modell notwendig für eine erfolgreiche Infektion und Etablierung einer chronischen

Hepatitis (43, 321).

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Das X-Protein in seiner Rolle als Transaktivator zur Transkription zahlreicher viraler und

zellulärer Gene ist schon seit längerem bekannt. Es aktiviert in vitro und in vivo u.a. die

Promotor/Enhancer Elemente der HBV-Core und –Surface Gene (55, 223, 229) sowie

heterologe Promotoren, wie den SV-40 early-Promotor, den Rous-Sarcoma-Virus (RSV)

Promotor (251), den Herpes-Simplex-Virus Thymidine-Kinase Promotor (316), das

Long-Terminal-Repeat (LTR) des humanen T-lymphotrophen Virus (HTLV-1), HIV-

Promotoren (278) und den β-Interferon Promotor (277). Ausserdem konnte gezeigt

werden, daß das X-Protein die Aktivität der RNA-Polymerasen II und III über die

Transkriptionsfaktoren NF-κB und AP-1 und AP-2 steigern kann und als Ko-Aktivator

10

über Protein-Protein Interaktionen u.a. mit den Aktivator-Molekülen CREB (cAMP

responsive element binding protein), ATF-2 (activating transcription factor-2) und TBP

(TATA-binding protein) zu wirken scheint (8, 165, 214, 245, 278). Ob alle diese in vitro

Interaktionen auch unter in vivo Bedingungen, bei sehr geringer Expression des X-

Antigens, relevant sind, ist allerdings eher unwahrscheinlich.

Unklarheit besteht weiterhin über die Rolle des X-Proteins bei der Karzinogenese des

HCC trotz zahlreicher Erkenntnisse über seine pleiotropen Transaktivator-Funktionen

und zellulären Ziel-Moleküle (78). Sequenzen des X-ORF werden häufig an zufälliger

Stelle chromosomal integriert in HCC-Zellen gefunden und oft kann eine gesteigerte

Expression von HBx im Vergleich zu den übrigen HBV-Antigenen beobachtet werden

(69, 169, 203, 205, 256, 291). Häufig kommt es dabei zur Fusion von Teilen des X-ORF

mit zellulären, kodierenden Sequenzen bei intakter Transaktivator-Funktion des X-

Proteins (305). Die Selektion HBxAg-positiver Hepatozyten ist möglicherweise ein erster

Schritt bei der Multi-Step Karzinogenese des HCC. In Transfektionsstudien und in HBx-

transgenen Mäusen konnte bereits eine transformierende Aktivität des X-Proteins

nachgewiesen werden (119, 135, 141). Andere Arbeitsgruppen konnten diese Ergebnisse

aber nicht bestätigen (151, 222). Weitere Schritte sind die Alteration von Signal-

Transduktionsmolekülen durch HBx wie NF-κB, den ras- und raf-abhängigen

Proteinkinasen (MAP) und der Proteinkinase C (PKC), mit nachfolgender Störung der

Wachstumsregulation und Resistenz der Zellen gegen Apoptose-Stimuli durch Zytokine

bzw. einem immunologischen „Escape“ der Zellen (21, 22, 133, 161, 199, 245, 294).

Insbesondere aktiviertes NF-kB ist ein sehr potenter Inhibitor der TNF-α induzierten

Apoptose und könnte den infizierten und mutierten Leberzellen während der chronischen

Infektion einen Selektionsvorteil verschaffen (20).

Eine wichtige Rolle könnte auch die Inaktivierung des Tumor-Suppressor-Gens p53

durch eine Komplex-Bildung mit HBx spielen (77, 273, 279, 293). p53 besitzt eine

zentrale Bedeutung bei der Reparatur von DNA-Schäden und Verhinderung

unkontrollierter Zellproliferation und Tumortransformation durch Induktion der

Apoptose in der geschädigten Zelle; daher sind Alterationen der Aktivität des Proteins

oder Mutationen dieses Gens assoziiert mit zahlreichen Tumorformen (70, 120, 280, 287,

317). In neueren Studien konnte aber auch gezeigt werden, daß eine HBx-Expression mit

der Induktion von Apoptose assoziiert sein kann (45, 255).

11

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Die Veränderungen der Gen-Expressionsmuster können zur Resistenz gegen Apoptose-Stimuli z.B. durch

Zytokine führen. Der Selektionsvorteil HBxAg-positiver Zellen führt über weitere Schritte im Sinne einer

Multi-Step Karzinogenese durch die Akkumulation von Mutationen zur HCC-Transformation der Zelle.

Modifiziert nach MA Feitelson und LX Duan (78).

Es ist allerdings klar, daß das X-Protein kein akut transformierendes Onkogen sein kann,

da durchschnittlich 30-60 Jahre bei einer chronischen HBV-Infektion bis zum Auftreten

eines HCC vergehen. Vielmehr scheint es unterschiedliche Schritte im Rahmen einer

Multi-Step Karzinogenese zu modulieren, deren Bedeutung in vivo Gegenstand der

weiteren Forschung ist (78).

12

Neuere Untersuchungen zeigen eine Assoziation von HBx mit der 19S- und auch mit der

20S- Untereinheit des Proteasom-Komplexes der Zelle (121, 122, 250, 319). Das X-

Protein scheint sowohl als Substrat als auch als Inhibitor des 26S-Proteasom-Komplexes

zu wirken, ausserdem ist diese Interaktion möglicherweise essentiell für dessen

Transaktivator-Funktionen. Der Proteasom-Komplex greift als zentrale Schaltstelle der

Degradation Ubiquitin gekoppelter Proteine in zahlreiche zelluläre Prozesse wie u.a. die

Signal-Transduktion, die Kontrolle des Zellzyklus, Stress-Antworten der Zelle,

Aktivierung der Transkription, DNA-Reparatur, Apoptose und Antigenpräsentation ein

(60, 118). Eine Hemmung der Degradation viraler Proteine im Proteasom könnte u.a. zur

Suppression der viralen Antigenpräsentation in Assoziation mit MHC-Klasse-I

Molekülen führen und so den immunologischen „Escape“ der Virus-infizierten Zelle

fördern (226). Für diese Hypothese fehlen aber noch eindeutige experimentelle in vivo

Daten.

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Nachweisbare Antikörper gegen das X-Protein finden sich bei HBV-infizierten Personen

in 7-54% (115, 132, 174, 189). Es besteht keine Korrelation zwischen anti-HBx Titern

und einer chronischen HBV-Infektion bzw. dem Vorliegen eines HCC. Ein bestimmter

Prozentsatz HBV-infizierter Patienten produziert überhaupt kein anti-HBx, ein Indiz für

eine sehr schwache Immunogenität des Proteins und /oder eine hohe quantitative und

qualitative Heterogenität der humoralen Immunantworten. Peptid-spezifische ELISA-

Untersuchungen zur Bestimmung der Epitop-Feinspezifität chronisch infizierter

Patienten zeigten eine kurze immundominante Region im Bereich des Karboxy-Terminus

des X-Proteins (252). Weiterhin konnten bisher HLA-Klasse-II restringierte T-

Zellantworten gegen das X-Protein bei akut und teilweise auch bei chronisch infizierten

Patienten nachgewiesen werden, wobei mit Peptiden mehrere T-Zell-Epitope, ebenfalls

hauptsächlich im Bereich des Karboxy-Terminus liegend, charakterisiert werden konnten

(127). Im Vergleich mit den immunogenen Core- und Hüll-Antigenen fallen die T-

Zellantworten aber weitaus schwächer aus.

In einer neueren Studie konnten HLA-A2.1 restringierte CD8+ T-Zell-Epitope des X-

Proteins mit synthetischen Peptiden bei chronisch HBV-Infizierten nachgewiesen

13

werden. Die Ergebnisse dieser Studie sollten aber noch durch weitere Experimente,

welche insbesondere eine endogene Prozessierung des HBxAg durch die Targetzelle

nachweisen können, bestätigt werden (51).

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Die DNA-Immunisierung, auch bekannt als genetische oder Polynukleotid-

Immunisierung, ist eine effiziente Methode zur spezifischen Aktivierung des

Immunsystems. Obwohl schon zu Beginn der 90er Jahre bekannt war, daß die Injektion

von nackter Plasmid-DNA in eine Maus zur Expression des auf dem Plasmid kodierten

Genes in vivo führt (303), konnte erst 1992/1993 in ersten Studien die Bedeutung dieses

Ansatzes für die Entwicklung von Vakzinen und Immuntherapeutika gezeigt werden (89,

264, 281, 289). Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Applikation von gereinigter,

nackter Plasmid-DNA, welche aus einem nicht-replikationsfähigen Expressions-Vektor

mit den Antigen-kodierenden Sequenzen und entsprechenden regulatorischen Elementen

besteht, in den Empfänger-Organismus. Dort wird die DNA von den Wirtszellen

aufgenommen und das Antigen exprimiert. Das endogen produzierte Protein kann so

zytosolisch prozessiert und adäquat auf der Zelloberfläche präsentiert werden, um eine

spezifische Immunantwort des Empfängers zu induzieren. Auf diesem Wege der

endogenen Synthese von Antigenen durch die Wirtszelle wird eine Infektion durch ein

virales Pathogen imitiert. Durch die Präsentation von Peptidfragmenten des Antigens im

Kontext von MHC-Klasse-I Molekülen kommt es zur Aktivierung von spezifischen

CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs) über den T-Zellrezeptor. Je nach Proteintyp

werden die produzierten Antigene auch von der transfizierten Zelle sezerniert und

können extrazellulär das Priming einer humoralen und CD4+ T-Zell Immunantwort

induzieren. Die freigelassenen Proteine können aber auch von Antigen-präsentierenden

Zellen (APC) aufgenommen und über MHC-Klasse-II und –Klasse-I restringierte

Antigenpräsentation eine T-Helferzell- und CTL-Antwort (Cross-Priming) generieren.

Die DNA-Immunisierung bietet die gleichen immunologischen Vorteile wie die

Immunisierung mit lebenden, attenuierten Vektoren, jedoch ist die applizierte Plasmid-

14

DNA nicht replikationsfähig und das Risiko einer unkontrollierten Ausbreitung des

Vektors in immundefizienten Wirtsorganismen oder einer Übertragung auf weitere

Personen vergleichsweise minimal.

Tang et al. (264) konnten zum ersten Mal zeigen, daß die Mäuse, denen mit einer Gene-

Gun Plasmid-DNA injiziert worden war, eine Antikörperantwort gegen das kodierte

Protein entwickelten. Bald entdeckte man auch, daß durch diese Technik der

Immunisierung breite zelluläre und humorale Immunantworten gegen verschiedene virale

Antigene, wie z.B. Proteine des Influenza-Virus (89, 281), des HIV-1 (289) und des

HBV (64), induziert werden konnten.

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�� 3�� ! Modifiziert nach M. Geißler.

Seitdem wurden in zahlreichen Infektions- und Tiermodellen DNA-Vakzine gegen

weitere virale, bakterielle und auch Protozoon-Erreger, wie HIV-2 (312), das Herpes-

Simplex (34, 167), Rabies (307), HCV (74, 95), Tuberkulose (159, 265, 266), Malaria-

15

Sporozoiten (188), Mykoplasmen (18), Leishmanien (308), Zytomegalieviren (100),

Toxoplasmen (6), Rotaviren (114) und zuletzt auch Ebola (309) und Listeriose (81)

untersucht. Der Vorteil dieser Immunisierungstechnik gegenüber der herkömmlichen

Immunisierung mit rekombinanten Antigenen ist die Induktion einer zytotoxischen,

CD8+ T-Zell- und inflammatorischen T-Helferzellantwort, welche für die Eradizierung

verschiedenster viraler Erreger unerlässlich ist; teilweise ist es sogar möglich, eine

partielle oder komplette Protektion gegen die Pathogene im Tiermodell zu

demonstrieren.

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Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, die durch eine DNA-Vakzine induzierten

Immunantworten quantitativ und qualitativ in ihrer Effizienz zu modulieren. In der Regel

sind multiple Applikationen notwendig, um maximale Immunantworten zu induzieren.

Es gibt jedoch noch keine verläßlichen Daten, wie ein optimales Immunisierungs-

Protokoll (DNA-Menge, Zahl und Frequenz der Einzeldosen) aussehen soll. Eine

mögliche Optimierungsstrategie ist die Wahl größerer zeitlicher Abstände zwischen den

DNA-Einzeldosen (88, 152).

Antigen-spezifische Immunantworten konnten nach intravenöser, intramuskulärer,

intranasaler, intraepidermaler, intradermaler, intravaginaler und neuerdings auch

intrasplenischer und intrahepatischer Applikation von DNA gezeigt werden (11, 98, 290,

304). In den meisten Studien wurden die Plasmide allerdings intradermal oder

intramuskulär injiziert (56, 65, 285). Zur epidermalen Applikation der DNA wird häufig

die Genkanone (Gene Gun) eingesetzt. Bei dieser Methode werden Gold-Mikropartikel

mit Plasmiden beladen und durch Beschleunigung in die Haut injiziert. Auf diese Weise

werden die Zellen der Epidermis (u.a. Langerhans-Zellen) direkt durch die Mikropartikel

transfiziert. Im Vergleich zur Nadelinjektion ist die Genkanone deutlich effizienter, da

man gleiche Antikörper- und CTL-Antworten mit 100- bis 5000-fach geringerer DNA-

Menge erzielen kann (80, 209). Trotz dieser Unterschiede in der Effizienz sind die

induzierten Immunantworten weder von längerer Dauer noch konnte man eine bessere

Protektion gegen Pathogene in vivo erreichen. Im Gegenteil, während nach

intramuskulärer DNA-Injektion überwiegend TH1-Antworten mit einem hohen IgG2a :

16

IgG1 Verhältnis, IFN-γ Produktion und geringer IL-4 Produktion induziert werden,

überwiegen nach Immunisierung mit der Genkanone TH2-Antworten mit vorherrschend

IgG1 Antikörpern, weniger IFN-γ und mehr IL-4 Produktion (80, 87, 210). Wird die

DNA intradermal mittels Nadel injiziert, so können beide TH1- und TH2-Profile

generiert werden (210, 219).

Neuere Ansätze der Applikation wie die Beladung von synthetischen Mikrosphären mit

Plasmid-DNA (14, 36, 113), der Einsatz selbst-replizierender RNA-Vakzine oder

artifizieller, bakterieller Chromosomen (BAC-VAC) als replizierende Vakzine eröffnen

erfolgsversprechende Perspektiven zur Entwicklung hochimmunogener DNA-und RNA-

Impfstoffe (72, 153, 257, 314). Die Stärke und Qualität der induzierten Immunantworten

muß noch in weiteren Studien mit diesen neuen Methoden genauer charakterisiert

werden.

Zytokine sind essentielle Moleküle für die Regulation und Koordination der zellulären

und humoralen Immunantwort. Bereits 1993 konnte gezeigt werden, daß durch die

Injektion von Zytokin-Plasmiden in den Muskel die Immunantwort auf ein

rekombinantes Protein durch die charakteristische Aktivität des Zytokins in vivo

verstärkt wurde (218). Durch eine Ko-Immunisierung mit Zytokin kodierenden

Plasmiden können die durch ein Antigenplasmid induzierten Immunantworten nicht nur

verstärkt, sondern auch in Richtung einer TH1- oder TH2-Antwort gelenkt werden. So

stimuliert beispielsweise die adjuvante Injektion eines IL-2 Plasmids eine TH1-

polarisierte humorale und zelluläre Immunität gegen ein Antigen (48, 95).

Das Zytokin GM-CSF fördert die Produktion von Granulozyten und Makrophagen,

sowie die Reifung und Aktivierung von APCs und dendritischen Zellen (116).

Intramuskulär verabreicht kann die Koexpression von GM-CSF sowohl die humorale wie

die zelluläre Immunantwort gegen Plasmid kodierte Antigene verstärken (95, 125, 248,

306).

IL-12 ist der Prototyp eines TH1-Zytokins mit einer sehr potenten Induktion der CTL-

und NK-Aktivität sowie einer erhöhten IFN-γ Produktion (272). Die Ko-Immunisierung

mit einem IL-12 Plasmid auf intranasalem oder intramuskulärem Wege kann eine

17

Induktion der zellulären Immunität vom TH1-Typ gegen verschiedene Antigene deutlich

steigern, vor allem mit einer verstärkten CTL-Antwort und T-Zellproliferation bei

gleichzeitig verminderter Antikörperproduktion (49, 125, 136, 249, 275, 276). Ein

weiteres TH1-Zytokin, das IL-18, scheint dagegen nur zu einer moderaten Steigerung der

CTL-Aktivität, aber deutlicher Erhöhung der Antikörpertiter und T-Helferzellantwort zu

führen (137).

Auch der Zeitpunkt der Ko-Administration von Zytokin-Plasmiden scheint sich auf die

Effizienz der Immunantworten auszuwirken. Sudien mit GM-CSF und einem

Fusionsprotein aus IL-2 und dem Fc-Teil eines murinen Antikörpers zeigten bei Injektion

vor oder mit der Gabe des Antigenplasmids eine schwächere bzw. eher TH2-dominante

Immunantwort, während die Gabe 3 bis 5 Tage nach DNA-Immunisierung zu einer

potenten CTL-Antwort bzw. TH1-dominanten Zytokinproduktion führte (17, 147).

Das Prinzip der Zytokin-Koimmunisierung wurde in dieser Arbeit angewandt, um

Immunantworten gegen das HBxAg zu verstärken.

Durch die Verwendung nicht-methylierter, palindromischer DNA-Sequenzen, welche

CpG-Oligodinukleotide (CpG-ODN) enthalten, können unabhängig von einem Antigen

Monozyten, NK-Zellen und B-Zellen aktiviert werden und als immunstimulatorisches

Adjuvans zur Induktion einer Immunreaktion vom TH1-Subtyp bei der DNA-

Immunisierung eingesetzt werden (143, 144, 297).

Die Wahl unterschiedlicher Carrier bei der initialen Immunisierung und den

nachfolgenden Booster-Immunisierungen bietet sich als weitere Methode zur

Optimierung und effektiven Steigerung von Antigen-spezifischen Immunantworten an.

Benutzt man zwei Carrier-Systeme, welche keine immunologische Kreuzreaktivität

besitzen, wie beispielsweise Plasmid-DNA und rekombinantes Protein oder Plasmid-

DNA und rekombinante Vakzinia-Viren, so kann man in vielen Fällen sehr effiziente

Immunantworten induzieren (225). In einem Malaria-Modell konnte durch ein

heterologes Protokoll mit Plasmid-Priming und rekombinanten Vakzinia-Viren als

Boost-Impfstoff eine komplette Protektion gegen Plasmodium berghei erreicht werden

(242, 244).

18

�6 �$2!-7 1(1)$ �(28 1 (*� +$1

Dem englischen Landarzt Edward Jenner gelang im Jahre 1776 zum ersten Mal die

erfolgreiche Vakzinierung eines 8jährigen Jungen gegen die Pocken (Variola) mit dem

Kuhpockenvirus. Dieses Impfverfahren wurde später durch die Verwendung des

engverwandten Vakzinia-Virus, welches aus dem Pferd isoliert worden war und eine

mildere Impfreaktion zeigte, abgelöst. Wie schon damals von Jenner prophezeit, wurde

dank dieser Vakzine der letzte Fall einer Pocken-Infektion im Jahre 1977 beschrieben

und 1980 erklärte die WHO offiziell die Eradizierung dieser Infektionskrankheit.

Das Vakzinia-Virus ist ein 300-400 nm großes Viruspartikel aus der Familie der

Poxviren, dessen Hülle aus Lipoprotein-haltigen Membranen die komplexe

Nukleokapsidstruktur umschließt. Dieses beherbergt wiederum das ca. 200.000

Basenpaare große, virale Genom aus linearer, doppelsträngiger DNA. Zahlreiche Virus

kodierte Enzyme, u.a. eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, ein Transkriptionsfaktor

und Capping-Enzyme, liegen verpackt innerhalb des Kapsides vor und können nach dem

Eintritt in die Wirtszelle mRNA-Transkripte mit typischen eukaryontischen

Eigenschaften synthetisieren. Initial werden nur die sogenannten „early“ Gene

transkribiert, welche das Wachstum der benachbarten Zellen stimulieren, die Replikation

des viralen Genoms und die Transkription der „intermediate“ Gene und „late“ Gene

steuern. Nach der Synthese der „late“ Struktur-Gene kommt es zum Assembly der

viralen Partikel, welche dann durch den Golgi-Apparat transportiert und über die

Plasmamembran aus der Zelle geschleust werden. Jede der drei Gen-Klassen besitzt

spezifsche Promotorsequenzen, die von viralen Proteinen erkannt werden und bilden die

Basis für den programmierten, Kaskaden-artigen Ablauf der viralen Genregulation (193).

In den frühen 80er Jahren wurden die Methoden zur Herstellung rekombinanter

Vakzinia-Viren maßgeblich in der Arbeitsgruppe von Bernard Moss entwickelt (302).

Die meisten Strategien zur Fremdgen-Insertion funktionieren nach dem Prinzip der

homologen Rekombination (siehe unten).

19

�//! ,! �� .��>�� (modifiziert nach Current Protocols in Molecular

Biology (9)).

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Die gentechnische Rekombination von Vakzinia-Viren bietet eine hervorragende

Möglichkeit zur Expression von Fremdgenen in eukaryontischen Zellen. Wegen des sehr

vielfältigen Wirt-Spektrums im Bereich eukaryontischer Zellen und permissiver

Versuchstiere und einer durchschnittlich sehr starken Expression durch die viralen

Promotoren ist das System für zahlreiche Anwendungen geeignet: Analyse von Protein-

Protein Interaktionen, Epitop-Charakterisierung monoklonaler Antikörper, Zellfusion,

Expression von Ionenkanälen sowie funktionelles Screening von cDNA-Bibliotheken

(193).

Bei der Rekombination werden zumeist nicht-essentielle Gene des viralen Genoms wie

z.B. die Thymidinkinase (TK) durch die Insertion des Fremdgens deletiert, wobei Gene

bis zu einer Größe von 25.000 Basenpaaren im viralen Genom toleriert werden (173). Da

20

das Vakzinia-Virus im Zytoplasma der Wirtszelle repliziert und einen eigenen

Transkriptions-Apparat verwendet, müssen kontinuierliche ORFs und virale Promotoren

zur Fremdgenexpression eingesetzt werden. Der Expressionszeitpunkt im viralen

Replikationszyklus und die Stärke der Expression können durch die Wahl eines „early“,

„intermediate“ oder „late“ Promotors bestimmt werden. Ein häufig verwendeter

Promotor ist der kombinierte „early/ late“ Promotor, mit dem sich eine sehr starke

Expression erreichen lässt (52, 204).

Zur Herstellung eines rekombinanten Vakzinia-Virus verwendet man ein Plasmid als

Transfervektor (shuttle vector) mit einer Expressionskassette, bestehend aus dem

entsprechenden Vakzinia Promotor und einer Klonierungsstelle (multiple cloning site)

zur Insertion des Fremdgens. Diese wird von homologen Sequenzen genomischer

Vakzinia-DNA am 5´-und am 3´-Ende flankiert, welche den Ort der Integration im

viralen Genom determinieren (42, 75, 163). Die Rekombination findet mit einer

Wahrscheinlichkeit von 0.1% als doppeltes Cross-Over zwischen den homologen

Sequenzen der infizierten viralen und der transfizierten Plasmid-DNA in der Wirtszelle

statt (Abb. 6, Plasmid-Karte siehe Kap. 2.4.5).

Bei der Selektion rekombinanter Klone können unterschiedliche Methoden angewendet

werden. Wurde die Fremdgen-Sequenz in den viralen TK-Lokus inseriert, so können die

Rekombinanten über ihren TK-negativen Phänotyp in TK-defizienten Zellen selektioniert

werden (163). Alternativ können über den Transfervektor Antibiotikumresistenz-Gene

oder Reporter-Gene ko-inseriert werden, die ein Farb-Screening wie z.B. durch ß-

Galaktosidase (lacZ Gen) oder β-Glukuronidase Synthese ermöglichen (39, 42, 75). Eine

neuere Methode funktioniert über die Komplementierung eines Defektes in der

extrazellulären Virusproduktion, so daß alle Plaques rekombinante Viren enthalten (31).

Auch eine direkte in vitro Ligation des Fremdgenes in das Vakzinia-Genom konnte

erfolgreich durchgeführt werden (235).

21

�//! -! �� .��/�� 7�� (�� &�� :��! Das

Fremdgen wird von den Vakzinia-DNA-Sequenzen TKL und TKR flankiert. Das Fremdgen steht unter der

Kontrolle des Vakzinia „early/late“-Promotors p7.5. Das ko-inserierte Selektionsgen lazZ wird durch den

Vakzinia-„late“-Promotor p11 kontrolliert. Modifiziert nach (9).

Eine weitere Modifikation ist der Einsatz der hocheffizienten RNA-Polymerase des

Bakteriophagen T7 zur Expression von Fremdgenen in Vakzinia-Virus Vektoren.

Entweder wird die T7-RNA-Polymerase und das Fremdgen unter der Kontrolle eines T7-

Promotors über getrennte Vektoren ko-infiziert und exprimiert oder beide Proteine

werden über ein induzierbares System im gleichen Vakzinia-Virus synthetisiert (86,

295).

Ein erhöhtes Maß an Sicherheit im Umgang mit den Vakzinia-Viren und der Verzicht auf

potenzielle Impfrisiken (siehe Kap. 2.4.2) konnte durch die Entwicklung neuer

22

attenuierter, replikations-inkompetenter Vakzinia-Stämme erreicht werden; so ist unter

anderem das modifizierte Vakzinia-Virus Ankara (MVA) durch eine mehr als 500-fache

Passage in Hühnerembryonen-Zellen entstanden. MVA ist ein hocheffizienter und

immunogener Expressionsvektor, mit dem unter S1-Sicherheitsstandard gearbeitet

werden darf (117, 242).

!-!# ��7�� $�� /��

Zur Produktion monoklonaler Antikörper oder zur Immunisierung von Versuchstieren

können rekombinante Vakzinia-Viren äquivalent zu gereinigtem, rekombinanten Protein

mit sehr hoher Effizienz eingesetzt werden (193). Daneben werden Vakziniavektoren

aber vor allem zur Induktion von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten in vivo, sowie zur

Generierung von Antigen-präsentierenden Targetzellen in vitro genutzt. Die

intrazelluläre Expression eines Antigens durch das Virus erlaubt eine „natürliche“

Prozessierung und Präsentation von Peptidfragmenten desselben im Kontext von MHC-

Klasse-I Molekülen auf der Oberfläche der infizierten Zelle. Zur Determinierung der

Targetzellen werden autologe oder MHC-syngene Zellen mit den rekombinanten

Vakzinia-Viren infiziert, welche das gewünschte Antigen unter der Kontrolle eines

„early“ oder „early/late“ Promotors exprimieren (271). Die Targetzellen können mit51Chromium markiert werden und in einem Chrom-Release-Assay mit

Effektorlymphozyten von immunisierten Versuchstieren oder humanen T-Lymphozyten

verwendet werden (24, 288). Mit dem Epstein-Barr-Virus immortalisierte B-Zellen

dienen u.a. als autologe Targetzellen zur Untersuchung humaner CTLs.

Mit der Immunisierung von Versuchstieren, von der Maus bis zum Schimpansen, können

rekombinante Vakzinia-Viren, welche eines oder mehrere Gene von RNA- oder DNA-

Viren exprimieren, eine partielle oder sogar komplette Protektion gegen die

entsprechende Infektion erzeugen (192). Der protektive Effekt stützt sich in den meisten

Fällen auf neutralisierende Antikörper gegen Hüllproteine der Erreger sowie auf die

Induktion einer potenten CTL-Antwort gegen die infizierten Zellen (146, 191). Auch bei

der Herstellung von prophylaktischen und therapeutischen Vakzinen gegen

experimentelle Tumoren im Tiermodell konnten rekombinanten Vakzinia-Viren

23

zusammen mit Zytokinen (IL-2 und IL-12) und kostimulatorischen Molekülen (B7-1 und

B7-2) erfolgreich eingesetzt werden (217, 230).

In der Veterinärmedizin zeigten erste erfolgversprechende Freiland-Immunisierungen mit

Fallen, welche mit einem rekombinaten Vakzinia-Virus zur Expression eines Rabies-

Virus Glykoproteins ausgestattet waren, eine protektive Immunität und verminderte

Inzidenz der Tollwut bei Wildtieren (37). In humanen, klinischen Studien der Phase I mit

HIV-1 Hüllproteinen und Glykoproteinen konnten allerdings bisher nur niedrig-potente

humorale und zelluläre Immunantworten mit dem Vakziniavektor-System induziert

werden (57, 58). Eine Optimierung könnte eventuell durch die adjuvante Administration

von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-2, IL-12, IFN-γ oder eine Booster-Strategie

in Kombination mit der DNA-Immunisierung (s.o.) erreicht werden (193, 242).

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1. Es soll ein rekombinantes Vakzinia-Virus zur Expression des X-Proteins vom

adw-Subtyp hergestellt werden.

2. Zur Analyse von CTL-Antworten gegen das HBxAg soll mit dem Vakzinia-

Virus Expressionssystem die Präsentation des HBxAgs in syngenen Stimulator-

und Zielzellen etabliert werden, da eine HBx stabil-exprimierende Zellinie nicht

zur Verfügung stand bzw. nicht konstruiert werden konnte

3. Die Immunantworten gegen das X-Protein sollen im murinen System mittels

DNA-Immunisierung auf humoraler und zellulärer Ebene charakterisiert

werden. Das Ziel ist die Testung einer potenziellen DNA-Vakzine gegen das

HBxAg zur Immuntherapie der chronischen HBV-Infektion im Tiermodell.

24

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#! ! �� $2�� .7?��

Dieser Vektor wurde uns freundlicherweise von Dr. M. Melegari, Molecular Hepatology

Laboratory, MGH, Boston überlassen (172). Hierbei wurde die kodierende Sequenz des

X-ORF aus dem HBV-Überlängenkonstrukt adwR9 (32) in das Plasmid pGEM-7

subkloniert. Anschließend wurde es über die Restriktionsstellen NcoI, welche sich direkt

vor dem Startcodon des X-ORF befindet, sowie NsiI (schneidet ca +200 Basenpaare

unterhalb des X-ORF-Stopcodons) in die HindIII-Klonierungsstelle des

Expressionsvektors pRcCMV-2 (#V750-20, Invitrogen, Carlsbad CA) ligiert. Der offene

Leserahmen des HBV X-Proteins vom Subtyp adw2 wird durch einen CMV-Promotor

kontrolliert. Der Vektor enthält ein Ampicillinresistenz-Gen zur Vermehrung in E.coli-

Bakterien.

#! !# '�� ;��@&�� ;7 ��

Die für das X-Protein kodierende Sequenz vom adw-2 Subtyp wurde aus dem Plasmid

pRc/CMV-X durch gezielte Mutagenese mittels PCR zur Subklonierung in den Vakzinia-

Virus Shuttle-Vektor pSc11 vorbereitet. Über den sense-Primer AGG-27 wurde vor dem

Startcodon ATG eine EcoRV-Restriktionsstelle eingeführt. Ebenso wurde eine EcoRV-

Schnittstelle hinter dem Stopcodon des X-ORF durch den antisense-Primer GTC-27

eingefügt. Die PCR des 555-Basenpaare-langen X-ORF-Fragments wurde mit dem

Expand High Fidelity PCR-System (Boehringer, Mannheim, #1732641) durchgeführt.

In diesem System wird ein Enzym-Mix, bestehend aus der Taq-Polymerase und der Pwo

25

DNA-Polymerase (16), verwendet. Letztere enthält eine 3´-5´-Exonukleaseaktivität,

durch die eine dreimal niedrigere Mutationsrate der PCR erzielt wird.

�//! 1! ;�� '�� $2�� .7?�� (nach M. Melegari).

Die Primer wurden von der Firma Birsner + Grob (BIG Biotech GmbH, Freiburg) nach

Vorgaben synthetisch hergestellt und als gefriergetrocknetes Pellet angeliefert. Nach

Resuspension in dH2O wurden jeweils 100 pmol pro Primer eingesetzt.

Sequenz der Primer:

EcoRV X-ORF Startcodon

AGG-27 X-sense: AGG GAT ATC CAA GCT CAT GGC TGC TAG

GTC-27 X-antisense: GTC GAT ATC CAT GCC CCA AAG CCA CCC

EcoRV

26

Reaktionsansatz:

Template pRc/CMV-X 600 ng ≅��

AGG-27 sense-Primer 100 pmol ≅��

GTC-27 antisense-Primer 100 pmol ≅��

dNTP-Mix (2mM) 0.2 mM ≅��

Polymerase Mix 2.6 U ≅��

PCR-Puffer (10x) 1x ≅��

DH2O ��

Gesamt ��

Die PCR wurde in einem Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt:

� Initial 3 min 94°C

� 20 Zyklen von je

� 30 s 94°C Denaturierung

� 30 s 55°C Annealing

� 45 s 72°C Extension

� Terminal 7 min 72°C

Nach gelelektrophoretischer Analyse eines Aliquots wurde das PCR-Produkt mit einem

PCR-Aufreinigungs Kit (QIAGEN, Hilden) zur weiteren Klonierung isoliert.

Das PCR-Produkt wurde nach einem Restriktionsverdau mit EcoRV am 5´- und 3´-Ende

und elektrophoretischer Analyse der Fragmente aus dem Agarosegel extrahiert und

aufgereinigt (QIAquick Gel Extraktion Kit, QIAGEN, Hilden). Es folgte die Ligation mit

dem am SmaI–Monolinker linearisierten und mittels Kälber-Alkalische Phosphatase

(CIAP, New England Biolabs (NEB)) dephosphorylierten Vakzinia Shuttle-Vektor

pSc11 (42). Die positiven Klone des neu generierten Konstruktes pSc11-X-adw wurden

mit entsprechenden Restriktionsenzymen zur Kontrolle der Orientierung des inserierten

27

X-ORF in Bezug auf den Vakzinia „early-late“ Promotor p7.5 untersucht. Das Plasmid

enthält eine Ampicillinresistenz zur Vermehrung in E.coli-Bakterien.

#! !) '�� $2�� 7��)��

Um den Einfluß des HBV-Subtyps auf die Immunogenität des X-Antigens zu

untersuchen, wurde ein weiterer DNA-Expressionsvektor kloniert. Der HBx-ORF vom

Subtyp ayw wurde aus dem HBV-Überlängenkonstrukt pCH-9/3091 (von Prof. M.

Nassal, Abteilung Medizin II, Uniklinik Freiburg freundlicherweise zur Verfügung

gestellt) mit den Enzymen NcoI (Schnittstelle liegt direkt innerhalb des Startcodons ATG

des X-ORF) und SmaI (Schnittstelle liegt +153 bp hinter dem X-ORF Stopcodon)

ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment (Gibco BRL,

Eggenstein) an der NcoI-Schnittstelle in ein „blunt-end“ umgewandelt und aufgereinigt.

Danach wurde es in das mit EcoRV linearisierte und mit CIAP vorbehandelte

Expressionsplasmid pcDNA3.1(+) (#V790-20, Invitrogen, Carlsbad CA) ligiert. Der

Vektor pcDNA3.1(+) ist bis auf die MCS identisch mit pRc/CMV-2, was wichtig für

vergleichende Studien mit pRc/CMV-X-adw und pcDNA3-X-ayw war. Die gewonnenen

und aufgereinigten Klone der transformierten E.coli wurden mittels geeignetem

Restriktionsverdau auf eine korrekte Orientierung der inserierten Sequenz überprüft. Das

so entstandene Expressionskonstrukt wurde pcD/3-X genannt.

#! !* =��(�� $!7��

Die Transformation von kompetenten Bakterien dient der effektiven Vermehrung von

Plasmid DNA in E.coli-Bakterien. In dieser Arbeit wurden ausschließlich INVαF´One

Shot Zellen (#C2020-03, Invitrogen, Carlsbad CA) zur Plasmid-Vermehrung

eingesetzt. Diese Zellen besitzen eine besonders hohe Transformationseffizienz. Die

Transformation von 1-10 µl Ligationsprodukt (5-50 ng DNA) erfolgte nach dem

mitgelieferten Protokoll. Anschließend wurden 50-100 µl der transformierten

Bakteriensuspension auf Ampicillin-haltige Agarplatten (15 g / l Bactoagar in LB-

Medium, 50 µg / ml Ampicillin) ausgestrichen und bei 37°C im Brutschrank über Nacht

28

inkubiert. Die Selektion der positiven Klone im Ampicillin-haltigem Agar erfolgte über

das Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin, welches von den transformierten

Vektoren koexprimiert wird. Die ausgebildeten Kolonien wurden unter sterilen

Bedingungen zur weiteren Vermehrung in Mini-Präp-Kulturen und Analyse in

Polystyrolröhrchen mit LB-Medium überführt.

�//! +! ;�� (A� �� '�� B�>�C�$2�� 7�?)��!

29

#! !, �� 2��&�� &��

Zur Erzeugung größerer Mengen an Plasmid DNA müssen E.coli-Flüssigkulturen

angelegt werden. Die Bakterien werden nach Transformation oder aus bereits angelegten

Glycerol-Stocks in LB-Medium (10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g Yeastextrakt pro

Liter dH2O) unter Zugabe des Selektionsantibiotikums Ampicillin (100 µg / ml) bei 37°C

in einem Rotationsinkubator (250 U / min) über Nacht kultiviert. Zur Analyse wurden 5

ml LB-Kulturen (Mini-Präp) in Polystyrolröhrchen angelegt und die vermehrte Plasmid-

DNA nach der Methode der alkalischen Lyse isoliert (30). Die bei 4°C abzentrifugierten

Bakterienpellets wurden mit dem Spin Miniprep Kit (#27104, QIAGEN, Hilden)

alkalisch lysiert und die Plasmid-DNA nach Adsorption an eine mit Silika-Matrix

beschichtete Säule mit dH2O oder TE-Puffer (pH 8.5) eluiert.

Zur anschließenden DNA-Immunisierung wurde die DNA der Expressionsplasmide in

großen Mengen aus mehreren 500 ml LB-Übernachtkulturen extrahiert. Die DNA wurde

mit dem QIAGEN Plasmid Mega bzw. Giga Kit (#12181 und #12191, QIAGEN, Hilden)

aus den Bakterien isoliert und nach der Isopropanol-/Ethanolpräzipitation in einem

Volumen von 400-600 µl 0.15 M Tris-Cl (pH 8.5) gelöst. Nach gelelektrophoretischer

Analyse und spektrophotometrischer Konzentrations- und Reinheitsbestimmung wurde

die Plasmid-DNA bei –20°C bis zu ihrer weiteren Verwendung tiefgefroren. Es wurden

Konzentrationen von 4-8 µg / µl und Plasmid-Mengen von 2-4 mg / 500ml

Bakterienkultur erzielt. Bei einem Überwiegen der „supercoiled“ Form (>90 %) in der

gelelektrophoretischen Analyse wurde auf den folgenden Schritt der CsCl-Gradienten

Reinigung der Plasmid-DNA verzichtet. Aus den bei -80°C angelegten Glycerol-Stocks

(Bakteriensuspension in 20 % Glycerol) der positiven Klone konnten die Plasmide später

jederzeit wieder amplifiziert werden.

30

&��7�� >�D

� Konzentrationsbestimmung

� C = 50 µg / ml x VF x OD260 (doppelsträngige DNA)

� C = 20 µg / ml x VF x OD260 (einzelsträngige DNA)

� Reinheitsanalyse

� Ratio OD280 : OD260 > 1.8

�� 9'+$&& !1&&),% $1 1 : )+!

#!#! 8��

Bei den Transfektions- und Expressionsstudien in dieser Arbeit wurde mit folgenden

Zellinien gearbeitet:

:�0 8��% �=�� ! �.E� *,-

Murine fetale Myoblasten, welche aus der Muskulatur der hinteren Maus-Extremität

gewonnen wurden. Die Zellen lassen sich mit sehr niedriger Effizienz (ca. 1-5%)

transfizieren. Im Rahmen der HBx-Transfektionsstudien dienen sie als in vitro Modell

für die intramuskuläre DNA-Applikation bei der genetischen Immunisierung von

Mäusen. Medium: DMEM-10 (Gibco BRL, Eggenstein) mit 10%igem fetalem

Kälberserum (FCS), Zusatz von Penicillin / Streptomycin (Gibco BRL, Eggenstein) und

nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, GIBCO BRL, Eggenstein) (50).

�F��1 8��

Es handelt sich hierbei um eine humane Hepatomzellinie (freundlicherweise zur

Verfügung gestellt von Dr. M. Geißler, Universitätsklinikum Freiburg, (195)) welche für

die HBx-Transfektionsstudien zum Nachweis einer Expression des X-Proteins in

Lebergewebe verwendet wurde. Kultiviert wurden diese Zellen in DMEM-10 +

Pen/Strep und NEAA.

31

&0 , 8��% �=�� ! =��-*

Murine Mastozytomzellen vom Haplotyp H-2d, d. h. syngen zur Balb/c Maus (216). Die

Transfektion dieser Zellinie wurde zur Expression des X-Proteins in potenziellen

Targetzellen für die Zytotoxizitätsassays durchgeführt. Versuch der Etablierung einer

stabilen Zellinie, welches das X-Protein exprimiert. Medium : DMEM-10 + Pen

/Strep/NEAA.

$E* 8��% �=�� ! =��)+

Murine T-Zell Lymphomlinie, welche mittels 9,10-dimethyl-1,2-Benzanthracene in einer

C57BL/6 Maus induziert wurde (Haplotyp H-2b). Auch mit dieser Zellinie wurde

versucht, eine syngene Targetzellinie, welche das X-Protein stabil exprimiert, für die

Charakterisierung der CTL-Aktivität in C57BL/6 Mäusen zu erzeugen. Medium DMEM-

10 + Pen./Step./NEAA (215).

#!#!# E�� :��=��(��

Zur Charakterisierung der Expression des X-Proteins wurden G-8, P815 und EL4 Zellen

mit den Plasmiden pRc/CMV-X (adw2) und pcDNA3-X (ayw) nach der Methode des

Liposomen vermittelten Gentransfers transfiziert (79). Die kritischen Parameter dieses

hocheffizienten Transfektionssytems sind das Liposom–DNA Verhältnis, die absolute

DNA-Menge und die Inkubationszeit, welche in dieser Arbeit für die G-8 Zellen, die nur

schlecht transfizierbar sind, mittels des Enzyms Luziferase als Reportergen-Assay

optimiert wurden (s.u.). Die Transfektion erfolgte mit dem LipofectAMINE Reagenz

(Gibco BRL, Eggenstein, #18324-012) in Serum-freien Medium Opti-MEM (Gibco

BRL, Eggenstein, #31985). Die Zellen wurden am Vortag auf eine 6-Well-Platte

umgesetzt, so daß sie zum Zeitpunkt der Transfektion gerade die optimale Konfluenz von

ca. 70% erreicht hatten. Pro Transfektionsansatz wurden 4 µg Plasmid-DNA mit dem

Liposom-Komplex in dem optimierten Liposom-DNA Verhältnis von 5:1 sorgfältig

durchmischt und ca. 35 min. bei Raumtemperatur in Opti-MEM Medium inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen in jeweils 2 ml Opti-MEM Medium überführt und

vorsichtig mit dem Liposomen-DNA Komplexen beträufelt, um den gesamten

Monolayer damit abzudecken. Nach 2 h Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit

32

MEM (GIBCO BRL, Eggenstein) gewaschen und mit frischen, Serum-haltigem Medium

versorgt. Die Lyse der Zellen zur Proteinextraktion erfolgte nach 12- bis 72-stündiger

Inkubation im 37°C CO2-Begasungsbrutschrank.

#!#!) ��7��&�� =��(��

Die transiente Transfektion von HUH-7 Zellen wurde nach der Methode der

Calciumphosphatpräzipitation durchgeführt (101). Es wurden 4 µg der gereinigten

Plasmid DNA mit einer 1 M CaCl2-Lösung (Endkonzentration 0.125 M) und sterilem

dH2O in einem Endvolumen von 75 µl vorgegeben. Diese Lösung wurde mit 75 µl

2xBBS-Puffer sorgfältig durchmischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Zellen waren am Vortag auf eine Six-Well-Platte umgesetzt worden. Die

Transfektionslösung wurde nun vorsichtig tropfenweise auf das Medium der Zellen

gegeben und für ca. 15 h bis 24 h im Brutschrank bei 35°C und 2% CO2 darauf belassen.

Anschließend wurden die Zellen zweimal mit MEM gewaschen und mit frischem

Medium bei 37°C und 5% CO2 für weitere 24h bis 48h inkubiert. Zur Beurteilung der

Transfektionseffizienz wurden die Zellen mit dem Plasmid pEGFP-N1 (CLONTECH

Labs Inc., Palo Alto, CA, #6085-1) kotransfiziert, so daß nach 24-48h die Stärke des

grün fluoreszierenden EGFP-Signals mit dem Fluoreszenz-Mikroskop beurteilt werden

konnte.

#!#!* �� =��(��((�� E��(��>

Zur Optimierung der Transfektionsbedingungen von G-8 Zellen und CV-1 Zellen mit

dem liposomalen System (siehe Kap. 2.2.2) wurde die Luziferaseaktivität (68) als Marker

für die Transfektionseffizienz in den lysierten Zellen bestimmt. Bei der Transfektion des

Reportergen-Plasmids pCMV-Luc+ wurden das Liposom-DNA-Verhältnis (1:5 bis 1:20)

und die Inkubationszeit der Zellen mit dem DNA/Liposomen-Komplexen (2 h, 4 h und 6

h) variiert. Die Zellen wurden nach 24 h mit jeweils 500 µl Lysepuffer (25 mM

Glyzylglyzin, pH 7.8, 4 mM EGTA, 15 mM MgSO4, 15 mM KH2PO4, 1 mM DTT und

1% Triton X-100) pro well für 20 min. auf Eis lysiert. Direkt vor Beginn der Messung

33

wurden jeweils 20 µl des Zellysats in Duplikate mit 300 µl des Analyse-Puffers (25 mM

Glyzylglyzin, pH 7.8, 4 mM EGTA, 15 mM MgSO4, 15 mM KH2PO4, 1 mM DTT und 1

mM ATP) in Luminometerröhrchen vermischt. Die Luziferaseaktivität wurde für 10 s in

einem Luminometer (Lumat LB 9705, Fa EG&G Berthold) nach automatischer Injektion

von jeweils 100 µl Luziferinlösung (250 mM D-Luciferin (Sigma, Taufkirchen, #L-

9504), 25 mM Glyzylglyzin, pH 7.8, 10 mM DTT) in relativen Light-Units (RLA)

gemessen. Hierbei kommt es zu einer schnellen, ATP-abhängigen Oxidation des

Substrates Luziferin, begleitet von einer Lichtemission, welche proportional zur Menge

des Enzyms Luziferase ausfällt. Als Positivkontrolle diente ein Lysat mit sehr hohen

Light-Units aus einer früheren Messung, die Negativkontrolle wurde mit Mock-DNA

transfizierten Zellen ermittelt.

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$9'+$&& !1

#!)! E>� �� (�� 8��

Da die potenziellen intrazellulären Zielstrukturen, mit denen das X-Protein interagiert,

noch nicht genau bekannt sind, wurden verschiedene Lysepuffer mit unterschiedlichem

Salz- und Detergentiengehalt zur optimalen Extraktion des Proteins getestet. Die

zentrifugierten Zellpellets wurden mit RIPA-Puffer (0.15 M NaCl, 1% NP-40, 50 mM

Tris, 0.5% DOC und 1% SDS), mit Core-Lysepuffer (0.15 M NaCl, 1% NP-40) sowie

mit dem 1x SDS-Gelladepuffer [50 mM Tris -Cl pH 6.8, 10% Glycerol, 2% SDS, 100

mM DTT, 5% 2-ME (2-Merkaptoethanol), 0.1% Bromphenol-Blau] für jeweils 8-10 min.

bei 4°C lysiert und anschließend bei –80°C sofort tiefgefroren.

34

#!)!# ;�;�&�:$

Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE (149) werden die aufzutrennenden Proteine in

Anwesenheit von SDS (Natriumdodecylsulfat) von einer einheitlichen negativen Ladung

umgeben. Die Auftrennung erfolgt bei der Polyacrylamid Gelelektrophorese mit

konstanter Porengröße auschließlich entsprechend der Molmasse der Proteine. Zunächst

wurden die Lysate in 1x SDS-Gelladepuffer (siehe Kap. 2.3.1) 10 Minuten bei 100°C

denaturiert und anschließend in einem 5%igen Sammelgel fokussiert und dann im

12%igem Trenngel (Running-Gel) aufgetrennt. Die Lösung der Gele wurde nach

Maniatis „Molecular Cloning“ (233) angerichtet, die Polymerisation des Acrylamids

(#A-3574, Sigma, Taufkirchen) wurde durch Zugabe von APS und TEMED (#T-7024,

Sigma, Taufkirchen) induziert, dann wurde die Lösung schnell zwischen zwei

Glasplatten gegossen und mit dH2O überschichtet. Das Sammelgel wurde auf das

Trenngel gegossen und ein Kamm eingesetzt. Nach vollständiger Polymerisation wurden

die denaturierten Proteinproben auf das Sammelgel geladen und in einer mit Laufpuffer

(250 mM Glycin, pH 8.3, 25 mM Tris-Base, 0.1% SDS) gefüllten Elektrophoresekammer

(BIORAD, München) für 90 min. mit einer Spannung von 140 mV aufgetrennt. Als

Größenstandard wurde der Protein-Molekulargewichtsmarker Low Standard (2.85 –43

kD, GIBCO BRL, Eggenstein, #16040-016) verwendet.

#!)!) ��/��

Beim Western-Blotting werden die elektrophoretisch separierten Proteine auf einer

Membran mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen (270). Zunächst wurden die mit

der SDS-PAGE aufgetrennten Proteine durch einen Transfer vom Gel auf eine

Nitrozellulose-Membran (Immobilon-P Transfer Membrane, Millipore, Bedford MA,

#IPVH 09120) übertragen. Das Gel wurde hierzu luftblasenfrei auf die Membran plaziert

und zwischen zwei Whatman 3MM-Papieren in einer Transferapparatur (BIORAD,

München) eingespannt. Bei einer Spannung von 100 mV, mit der Membran der Anode

zugewandt, wurden die Proteine im Transferpuffer (48 mM Tris-Base, 39 mM Glycin pH

8.3, 0.037% SDS, 20% Methanol) für 1 h auf der Membran immobilisiert. Um die freien

Proteinbindungsstellen der Membran abzusättigen, wurde die Membran anschließend

35

über Nacht bei 4°C in einem Blockierungspuffer [3% fettfreies Milchpulver, 1% bovines

Serumalbumin (BSA) in PBS] auf einer Schwenkvorrichtung inkubiert. Die Inkubation

mit dem monoklonalen Maus-Antikörper gegen das HBV-X-Protein α-X36 (dieser

Antikörper wurde uns freundlicherweise von Prof. J. Wands, Brown University,

Providence, RI, USA überlassen) erfolgte in einer Verdünnung von 1:500 in

Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem

Schwenken. Nach dreimaligem Waschen mit PBS / 0,02% Tween (BIORAD,

München) für jeweils 10 Minuten wurde die Membran mit dem Meerrettich-Peroxidase

konjugierten 2. Antikörper anti-Mouse Ig (#NXA931, Amersham, Freiburg) in einer

Verdünnung von 1:3000 wiederum für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der

Bindungsnachweis der Antikörper erfolgte nach erneutem dreimaligem Waschen mit

PBS / 0,02% Tween mit dem ECL-Chemolumineszenzsystem (Amersham, Freiburg,

#RPN-2106). Hierzu wurde die Membran für eine Minute in der Substratlösung

geschwenkt und zur Autoradiographie in einer Dunkelkammer auf einen Kodak-BMR-

Röntgenfilm mit verschiedenen Belichtungszeiten (10 s bis 1 h) plaziert.

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#!*! � ��

In der vorliegenden Arbeit wurden Vakzinia-Viren vom WR-(Western Reserve) Stamm

verwendet. Diese wurden uns freundlicherweise von Dr. J. Hausmann (Abteilung

Virologie am Institut für Mikrobiologie und Hygiene, Universität Freiburg) überlassen.

Die Versuchsprotokolle wurden in Anlehnung an Standardmethoden modifiziert (9, 163).

36

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��2��

�� % �(��7�� > ��> 7��% �=�� ! ��E�14

Diese Zellinie wurde 1964 zur Untersuchung der malignen in vitro Transformation mit

dem Rous Sarkom-Virus etabliert (139). Die Zellen wachsen adhärent mit typischer

Fibroblasten-artiger Morphologie im Monolayer und eigenen sich in besonderem Masse

zum Studium des zytopathischen Effektes (CPE), welcher durch die Infektion mit dem

Vakzinia-Virus hervorgerufen wird. Sie wurden zur Stock-Amplifikation der Viren, für

die homologe Rekombination, für den Protein-Expressionsnachweis und zur Plaquetest-

Titerbestimmung eingesetzt. Medium: DMEM-5 (Gibco BRL, Eggenstein) mit 5%igem

fetalem Kälberserum (FCS), Zusatz von Penicillin/Streptomycin (Gibco BRL,

Eggenstein) und nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, GIBCO BRL, Eggenstein).

�='� *) �% =�>�� B='�C �� 7��% �=�� !

�.E�0)4)!

Adhärent im Monolayer, Fibroblasten-artig wachsende Zellen, bei denen eine Deletion

des Thymidinkinase (TK) Gens vorliegt. Sie werden in einem Selektionsmedium unter

Zusatz von 5´-Bromodesoxyuridin (BrdU) kultiviert. Dieses Zytostatikum wird durch das

intakte Enzym TK phosphoryliert und in die DNA eingebaut, was zum Abbruch der

Replikation und schließlich zum Zelltod führt. Daher eignet sich diese Zellinie besonders

zur Selektion rekombinanter Vakzinia-Viren, welche keinen intakten TK-Lokus mehr

besitzen und so ungehindert in diesen Zellen in Anwesenheit von BrdU replizieren und

Plaques ausbilden können. Vakzinia-Viren vom Wildtyp mit intakter TK werden jedoch

bei der Replikation gehemmt. Medium: DMEM-10 (Gibco BRL, Eggenstein) mit

10%igem fetalem Kälberserum (FCS), Zusatz von Penicillin / Streptomycin (Gibco BRL,

Eggenstein), nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA, GIBCO BRL, Eggenstein) und 50

µg / ml 5´-BrdU.

37

#!*!# ;�7��G�� F��

Alle Arbeiten mit Vakzinia-Viren unterliegen nach dem Anhang III der Gentechnik-

Sicherheits- Verordnung (GenTSV) Sicherheitsmaßnahmen der Stufe 2 (S2). Daher muß

offenes Arbeiten mit den Vakzinia-Viren ausschließlich unter einer Laminar-Flow Bank

(Hood) durchgeführt werden. Dabei kommen nur sterile Wegwerf-Plastik-Pipetten und –

gefäße sowie kein gläsernes Material/Gerät, insbesondere keine Pasteurpipetten zur

Anwendung. Eine Aerosolbildung muß bei Pipettierarbeiten unter allen Umständen

vermieden werden. Alle anfallenden flüssigen Abfälle werden unter Zusatz von 3%igem

Buraton inaktiviert und anschließend sofort autoklaviert. Feststoffabfälle müssen

innerhalb der Sicherheitswerkbank in Polyamid-Beuteln doppelt verschlossen, in speziell

dafür gekennzeichneten Behältern gesammelt und ebenfalls sofort nach Abschluß der

Arbeiten autoklaviert werden. Als besondere Maßnahme gegen eine akzidentielle

Exposition werden die Hände und Unterarme des Experimentators durch den Gebrauch

von zwei Lagen Handschuhen und Schutzkitteln mit verlängerten Armbündchen

geschützt. Eine Exposition der Augen soll durch das Tragen einer Schutzbrille vermieden

werden, da eine Infektion des Auges (Keratitis) eine sehr ernsthafte Komplikation des

Vakzinia-Virus darstellt. Eine Impfung zur Prophylaxe bei ungeimpften

Wissenschaftlern wird in einer Stellungnahme des ZKBS (19.6790-10-14, Mai 1997,

Seiten 80-82) sehr kontrovers diskutiert. Bei einer Abwägung von Risiko und Nutzen

einer Impfung wird hier auf die seltenen, aber gelegentlich sehr gravierenden

Impfkomplikationen hingewiesen. Im Gegensatz dazu ist die Wahrscheinlichkeit einer

akzidentiellen Infektion unter S2-Schutzmaßnahmen als sehr gering anzusehen. Ein

Impfstoff kann derzeit nur über die „Centers of Disease Control“ (CDC, Atlanta, USA)

bezogen werden. Personen mit schweren dermatologischen Erkrankungen (Ekzemen),

sowie Schwangere und Immunsupprimierte dürfen nicht mit Vakzinia-Viren arbeiten.

Ungeimpfte Personen dürfen nicht mit Vakzinia-Virus infizierten Versuchstieren arbeiten

sowie nicht an „Large-Scale“ Virusproduktionen (Impfstoffproduktion) beteiligt sein.

Bei Kontaminationen der Arbeitsfläche bzw. Geräten/ Materialien muß eine

Inaktivierung mit 3%igem Buraton durchgeführt werden, und die Hood bzw. das Gerät

nachfolgend mit UV-Licht bestraht werden.

38

#!*!) �� 3�� G��

��G��/

#!*!)! ��(�� (��

Bei allen Infektionsexperimenten muß auf eine exakte Konzentration der

Virussuspension, sowie auf eine angemessene Dosierung des Inokulums in bezug auf die

Zahl der infizierten Zellen geachtet werden. Die Konzentration einer Virussuspension

wird in pfu/ml angegeben, wobei pfu für „plaque forming unit“ steht. Diese Einheit ist

ein Maß für die absolute Menge an infektiösen Viruspartikeln in einer titrierten

Virussuspension. Dagegen bezeichnet die „Multiplicity of infection“ (MOI) das

Verhältnis zwischen der Anzahl infektiöser Viruspartikel und der Zahl der infizierten

Zellen. Die Zellzahlen werden mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und man

rechnet bei einer Infektion eines konfluenten Monolayers unter Standardbedingungen mit

Durchschnittswerten je nach Größe der entsprechenden Kulturschalen. Nach mehreren

Auszählungen wurde bei einer konfluenten 5cm∅-Petrischale mit CV-1 Zellen von einer

Zellzahl von 1 x 106 ausgegangen. Die Fläche einer 5cm∅-Schale beträgt ca. 20 cm2

(genau 19,63 cm2), so daß zur Umrechnung auf die Fläche einer 75cm2- Flasche der

Faktor 3,75, einer 6-Well-Platte der Faktor 0.5 bzw. einer 150 cm2-Flasche der Faktor 7.5

eingesetzt werden kann.

Zur Virusvermehrung wurden 80-90% konfluente CV-1 Zellen im Monolayer infiziert.

Die Infektion erfolgte mit einer MOI von 0.2 (0.05-0.5 Variationsbreite), d.h. bei einem

Titer des Wildtyp-Virus WR-Stammes von 107 pfu / ml wurden 20 µl der

Virussuspension pro 5cm∅-Schale (106 Zellen), bzw. 75 µl pro 75cm2-Flasche

eingesetzt. Das Inokulum sollte ein Volumen von ca 0,04 ml / cm2 haben, also 800 µl auf

eine 5cm∅-Schale bzw. 3 ml auf eine 75cm2-Flasche. Es wurde durch Verdünnung des

entsprechenden Volumens der Virussuspension in DMEM-0 hergestellt. Die Infektion

wurde in Serum-freiem Medium (DMEM-0, Gibco BRL, Eggenstein) durchgeführt, da

Serumproteine Viruspartikel binden und so inaktivieren können. Nach guter

Durchmischung des Inokulums wurde das Kulturmedium von den Zellen abgenommen,

die Zellen einmal mit MEM gewaschen und schließlich mit dem Inokulum für 1 h bei

37°C im Begasungsbrutschrank (5% CO2) inkubiert. Während der Inkubation wurden die

39

Zellen alle 10-15 Minuten kurzzeitig geschwenkt, um eine optimale Verteilung des

Inokulums auf dem Zellrasen zu gewährleisten. Nach der Abnahme des Inokulums

wurden die Zellen mit dem Erhaltungsmedium DMEM-5 bei 37°C im CO2-Inkubator

inkubiert. Eine optimale Virusausbeute wurde je nach MOI nach ca. 56 h (24-72 h)

erreicht. Zur Kontrolle wurden die Zellen täglich auf sichtbare Zeichen des

zytopathischen Effektes (CPE) untersucht und entsprechend die Inkubationszeit

individuell angepaßt (siehe Abb. 11-14).

#!*!)!# �� 3�� (�� 8��

Nach Ablauf der Inkubation wurden die infizierten Zellen mit einem sterilen Zellschaber

abgelöst und im Kulturmedium in sterile 15 ml oder 50 ml Polypropylen-Röhrchen

überführt. Nach 5-minütiger Abzentrifugation bei 1200 rpm und 4°C wurde der

Überstand verworfen und die Zellen in 0.25-0.5 ml DMEM-0 pro 5cm∅-Schale bzw. 1-

1.5 ml pro 75cm2-Flasche resuspendiert. Da 80-90% der Viren Zell-assoziert sind,

wurden sie durch 3 Zyklen Frieren und Tauen aus den Zellen herausgelöst. Dies geschah

durch abwechselndes Überführen der Röhrchen mit der Virus-/Zellsuspension von einem

Ethanol-Trockeneisbad in ein 37°C -Wasserbad. Anschließend wurden sie noch zur

weiteren Ablösung der Viren vom Zelldebris für 3-5 Minuten in einem Ultraschall-

Wasserbad behandelt. Da sich die Viruspartikel nun in Suspension befanden, wurde der

zelluläre Debris bei 1000 rpm für 2 Minuten abzentrifugiert und der Viren-haltige

Überstand bei -20°C bzw. –80°C tiefgefroren.

#!*!)!) �� 3�� 2��&��

Die Herstellung von Mini-Stocks erfolgte durch die Infektion einer 5cm∅-Schale 80%

konfluenter CV-1 Zellen (siehe Abb. 10) mit einem Inokulum, welches aus einem

aufgearbeiteten Plaque oder Virussuspensionen mit sehr niedrigem Titer hergestellt

wurde. Nach 48-96 h Inkubationsdauer (maximaler CPE) bei 37°C im CO2 Brutschrank

wurden die Viruspartikel isoliert (siehe 2.4.1.3). Da der Titer der gewonnenen

Virussuspension unter Umständen noch sehr niedrig war, wurde als Zwischenschritt mit

der Hälfte der aufgearbeiteten Virussuspension eine 75cm2-Flasche infiziert, und die

40

Viren wurden nach 48–96 h in 1-1.5 ml Suspension aufgearbeitet. Hierbei ließen sich

Titer zwischen 1 x 105 und 5 x 106 pfu/ml erreichen. Mit 50-200 µl dieser

Virussuspension wurden 10-15 75cm2-Flaschen CV-1 Zellen zur Herstellung eines Maxi-

Stocks infiziert. Die Zellen wurden bei maximalem CPE (48-72h) aufgearbeitet und die

Viruspartikel in 1-1.2 ml pro 75cm2-Flasche aufgenommen. Die Titer einer solchen

Präparation lagen zwischen 1 x 107 und 5 x 108 pfu / ml (siehe Abb. 13, 14).

#!*!* =�� 3�� &��6��

Eine Bestimmung des Titers einer Virus-haltigen Suspension mit dem Plaquetest sollte

immer mit dem selben Zelltyp durchgeführt, der auch anschließend für weitere

Infektionen zur Anwendung kommt, da die Effizienz der Infektion und auch die

Eigenschaften der Zytopathie je nach Zelltyp unterschiedlich ausfallen können. In der

vorliegenden Arbeit wurden die Viren in CV-1 Zellen bzw. teilweise auch in MC57G

Zellen (Fibroblasten) titriert.

#!*!*! �� &��6� ��7� '��3��(��/��

Mit dieser relativ einfach durchführbaren Methode wurden alle Wildtyp WR Vakzinia-

Virus Stocks, bzw. Stocks von rekombinanten Vakzinia-Viren, deren Reinheit zuvor im

doppelten Agarose-Overlay (s.u.) sicher dargestellt wurde, titriert. Dies ist eine wichtige

Voraussetzung, da mit der Kristallviolett-Anfärbung nicht zwischen Plaques

rekombinanter Klone bzw. nicht-rekombinanter, d.h. Wildtyp Klone unterschieden

werden kann.

Zunächst wurde eine Verdünnungsreihe in 10er Potenzschritten der Virussuspension

angerichtet. Pro 15 ml Polystyrol-Röhrchen wurden 1 ml DMEM-0 vorgegeben und in

das erste Röhrchen 110 µl der Virussuspension eingefüllt. Nach sorgfältigem

Durchmischen (Vortexen) wurden 110 µl davon in das nächste Röhrchen übertragen.

Dieser Schritt wurde solange wiederholt, bis eine Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-9

erstellt war.

41

�//! 4! �� 8�� 7��

��(�� >��! Die

Zellen sind morphologisch intakt.

Keine Anzeichen des zyto-

pathischen Effektes (CPE).

�//! ! $�� &��6�

�� >��! Ver-

größerung eines einzelnen Plaques

innerhalb konfluenter CV-1 Zellen.

Die Plaque-Formation ist Ausdruck

des zytopathischen Effektes (CPE)

durch Infektion benachbarter Zellen

ausgehend von einem viralen

Partikel (Plaque forming unit =

PFU). Dieses Bild entsteht ca. 24 h

bis 48 h post infectionem.

�// #! '��(�� 3��

&��6�!Nach weiterer Progredienz

der Infektion kommt es zur

Konfluenz einzelner viraler Plaques

innerhalb des Monolayers.

42

�//! )! �� 8�� /�

�� >��7�� $((��!

Vergrößertes Bild konfluierender

Plaques und zahlreicher „blasiger“

Zellen als morphologisches

Korrelat für den massiven CPE.

Dieses Bild entsteht ca. 72 h bis 96

h nach Infektion mit sehr hoher

MOI. Optimaler Zeitpunkt zur

Viruspräparation.

�// *! =�� &$! Das

Resultat der kompletten Infektion

eines CV-1 Monolayers mit sehr

hoher MOI besteht aus ballonierten,

zytopathischen Zellen und

verklumptem Zell-Debris ca. 96 h

post infectionem.

43

Mit jeweils 1 ml der letzten sechs Verdünnungsschritte (10-3 bis 10-9) wurde je eine

konfluente 5cm∅-Schale der entsprechenden Zellinie, wie in Kap. 2.4.3.1 beschrieben,

infiziert und nach 48h Inkubationsdauer im 37��2-Inkubator erfolgte die Auszählung

der Plaques. Hierzu wurden die Zellen zweimalig mit PBS gewaschen und anschließend

mit jeweils 1 ml einer Kristallviolett-Lösung (0.2 % Kristallviolett (Sigma, Taufkirchen,

#C-3886) in 20 % Ethanol oder in 4 % Paraformaldehyd) überschichtet. Nach 5 bis 10

minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Farblösung abgenommen und der

dünne Farbfilm auf dem Zellrasen an der Raumluft getrocknet. Anschließend zählte man

die im violetten Zellrasen farblos erscheinenden Plaques für jede Verdünnungsstufe aus.

Der Farbstoff wird nur von vitalen Zellen aufgenommen; die Plaques erscheinen farblos,

da es durch den CPE der Viren zur Lyse der infizierten Zellen gekommen ist. Dabei gilt

es zu beachten, daß nur Primärplaques gezählt werden, da es bei einer zu langen

Inkubationsdauer zur Formation von kleineren Sekundärplaques kommen kann. Das

Verhältnis der gezählten Plaques sollte zwischen jedem Verdünnungsschritt ungefähr

dem Faktor 10 entsprechen, damit von einer korrekten Titrierung ausgegangen werden

kann.

Der Wert des Titers T = Anzahl der ausgezählten Plaques

Verdünnungsfaktor der entsprechenden Verdünnungsstufe pfuml

Die Titrierung ist besonders exakt, wenn die vorletzte Verdünnungstufe, auf der Plaques

erkennbar sind, ausgewertet wird.

#!*!*!# �� /�� &��6� �� 93��>

Konfluente 5cm∅-Schalen der entsprechenden Zellinie wurden mit einer

Verdünnungsreihe der Virussuspension, wie in Kap. 2.4.4.1 beschrieben, infiziert. Nach

der Abnahme des Inokulums wurden die Zellen mit jeweils 5 ml des Agarose-

Plaquemediums (Anfertigung, siehe Tabelle unten) überschichtet und für eine Dauer von

48 h im 37��2 -Brutschrank inkubiert. Dann wurde auf die untere eine zweite Schicht

aus je 3 ml Agarose-Plaquemedium, welche das Chromogen X-Gal (400 µl/ml) enthält,

gegeben. Durch die Aktivität des lacZ-Gens, welches für das Enzym Beta-Galaktosidase

44

kodiert, wurde das Substrat X-Gal in den infizierten Zellen in einen blauen Farbstoff

umgewandelt. So kommt es zur Blau-Anfärbung der rekombinanten Plaques innerhalb

der erstarrten Agarose nach weiterer Inkubationzeit von 24 h und die Plaques konnten

nun, wie in Kap. 2.4.4.1 beschrieben, ausgezählt werden. Liegt eine Verunreinigung der

Virussuspension mit nicht-rekombinanten Viren vor, finden sich lichtmikroskopisch

nicht angefärbte Plaques innerhalb des Zellrasens.

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Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Shuttle-Plasmid pSc11 besitzt zwei

Möglichkeiten zur Selektionierung der rekombinanten Klone (42). Die BrdU-Selektion

über das durch Insertion zerstörte TK-Gen (flankierende TKR -und TKL -Sequenzen) wird

durch das ko-inserierte lacZ-Gen unter der Kontrolle des starken Vakzinia „late“

Promotors p11 (25) in gegenläufiger Orientierung zur Fremdgenkassette ergänzt. Das

Zytostatikum BrdU kann seine letale Wirkung auf die TK-defizienten HuTK-143B Zellen

durch Phosphorylierung mit dem Enzym Thymidinkinase nur dann entfalten, wenn diese

mit nicht-rekombinanten Virusklonen infiziert wurden, welche eine intakte TK besitzen.

Das inserierte Fremdgen wird unter die Kontrolle des compound „early/late“ Promotors

p7.5 (52) gestellt. Da allerdings auch Spontanmutationen im TK-Locus des Wildtyp

Vakzinia-Virus mit einer Häufigkeit von 1:10000 auftreten, können die resultierenden

Plaques von den blau-gefärbten, rekombinanten Plaques nach Zugabe von X-Gal (5-

Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-beta-D-Galactopyranosid) zum Selektions-Agarose-Overlay

unterschieden werden. Die Spontanmutanten vermögen zwar unter dem Selektionsdruck

des applizierten BrdU zu replizieren, bilden aber farblose Plaques aus, da sie keine Beta-

Galaktosidase exprimieren können. Die Selektion der rekombinanten Klone erfolgte in

mehreren Runden der sequentiellen Plaque-Aufreinigung im doppelten Agarose-Overlay

(9, 164).

45

�� 3�� 93��> �� =�� ? ;�� 3�� ! ��

2.5 % LMP-Agarose in dH2O

(Seaplaque Agarose FMC Bioproducts,Rockland ME, #50112)

2x MEM high Glucose

(GIBCO BRL, Eggenstein, #21935) Medium

10 % FCS

2x Penicillin/Streptomycin

2.5 % LMP-Agarose durch Aufkochen (TS = 65°C) verflüssigen

2x MEM und Agarose bei 42°C in Wasserbad halten

Zu gleichen Teilen Agarose und 2x MEM mischen

Endkonzentration: 1x MEM–5, 1.25 % LMP Agarose

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! 93��> ��;��?=��

#! 93��> �� 78 @:��;�� :��

Zusatz von Bromdesoxyuridin(BrdU, Sigma, Taufkirchen,

#B-5002)

1/200 des Endvolumens von200x Stock in dH2O (10

mg/ml) zugeben

Endkonzentration 50 µg/ml

Kein Zusatz

Zusatz von X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-beta-D-

Galactopyranosid)

(PEQLAB #37-2610)

100x Stock in DMSO (40 mg/ml) 1/100 des Endvolumens

zugeben

Endkonzentration 400 µg/ml

Zellen werden mit jeweils 5ml pro 5cm∅-Schale

überschichtet

Zellen werden mit jeweils 5ml pro 5cm∅-Schale

überschichtet

1. Overlay wird mit jeweils 3ml pro 5cm∅-Schale

überschichtet

Agarose-Overlay für ca. 10-15 Minuten beiRaumtemperatur erstarren lassen

Inkubation der Zellen in 37��2 Brutschrank

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46

#!*!,! ��(�� =��(�� .��/��

Die Infektion wurde in zu ca. 85% konfluenten 5cmØ-Schalen mit CV-1 Zellen

durchgeführt. Die Zellen wurden nach einmaligem Waschen mit MEM mit dem Wildtyp

WR Vakzinia-Virus mit einer MOI von 0,02 für 2h unter Schwenken im 37ºC CO2-

Inkubator infiziert (siehe Kap. 2.4.3.1). Nach Abnahme des Inokulums erfolgte die

liposomale Transfektion der Zellen mit dem Vakzinia Shuttle-Vektor pSc11-X bzw. dem

pSc11 Leervektor in einem DNA:Liposom Verhältnis von 1:5. Dieses Verhältnis war in

einer Effizienzanalyse der Transfektion von CV-1 Zellen mit dem Luziferase–Assay

bestimmt worden (siehe Kap. 2.2.4). Jeweils 8 µg der Plasmide pSc11-X und pSc11

wurden mit 40 µl LipofectAMINETM-Reagenz (Gibco BRL, Eggenstein) in insgesamt

600 µl des Serum-freien OptiMEM Medium (Gibco BRL, Eggenstein) gut durchmischt

und 35 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (siehe Kap 2.2.2). Die Infektion und die

Transfektion wurden zeitlich so abgestimmt, daß nach dem Ablauf beider Inkubationen

direkt mit der Transfektion der zuvor mit dem Virus inokulierten Zellen begonnen

werden konnte. Das Inokulum wurde abgenommen und 2.4 ml OptiMEM Medium pro

5cmØ-Schale auf die Zellen gegeben. Anschließend wurden diese mit dem DNA-

Liposom Komplex vorsichtig überträufelt. Nach sorgfältigem Schwenken erfolgte eine

Inkubation von 2 h im 37ºC CO2-Brutschrank. Danach wurde das Medium gewechselt

und die Zellen in DMEM-5 für 48–64 h bis zum maximalen, mikroskopisch sichtbaren

CPE weiter inkubiert. Die Aufarbeitung der Zellen geschah, wie in Kapitel 2.4.3.2

beschrieben, unter Aufnahme der Viren in jeweils 0.5 ml DMEM-0 pro 5cmØ-Schale.

Die gewonnene Virussuspension enthält zu diesem Zeitpunkt ein Gemisch aus

rekombinanten und Wildtyp Vakzinia-Viren in einem sehr hohen Verhältnis zugunsten

der Wildtyp Viren. Diese kann entweder bei –80°C tiefgefroren werden oder sofort zur

weiteren Plaque-Aufreinigung eingesetzt werden.

47

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#!*!,!# ;�� F �� 93��>��(��

Die erste Runde der Selektion wurde mit BrdU in HuTK- 143B Zellen durchgeführt, um

die noch in großer Anzahl vorhandenen TK+ Wildtyp Viren zu eliminieren. Die konfluent

gewachsenen Zellen wurden in 5cmØ-Schalen mit einer Verdünnungseihe von 100 bis

105 (siehe Kap. 2.4.4.1) der gewonnen Virussuspension für 1 h infiziert. Nach Abnahme

des Inokulums wurden die Zellen mit jeweils 5 ml des ersten Agarose-Overlays, welcher

den Selektionsmarker BrdU (50 µg / ml) enthält, überschichtet. Die Anfertigung der

Agarose-Overlays erfolgte wie in Abb. 15 beschrieben. Nach Ablauf der Inkubationszeit

von 48 h im 37ºC CO2-Brutschrank wurde über den ersten Agarose-Overlay eine zweite

Lage Agarose/Medium geschichtet, welche das chromogene Substrat der Beta-

Galaktosidase X-Gal (400 µg / ml) enthielt. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation zeigte

sich makroskopisch eine Blaufärbung der entstandenen Plaques rekombinanter Viren

innerhalb der Agarose. Die blauen, rekombinanten Plaques wurden mit Hilfe einer 500 µl

Filterpipettenspitze aus der Agarose durch langsames Aspirieren der Zellen abgesaugt

48

und in jeweils 0.5 ml DMEM-0 aufgenommen. Ein blaugefärbtes Plaque besteht aus

Zellen, welche ausgehend von einem einzelnen viralen Klon eine Population

rekombinanter Viruspartikel enthält. Die Suspension sollte kleine Klümpchen der

blaugefärbten Agarose enthalten. Es sollten ca. 5-10 Plaques aus möglichst niedrigen

Verdünnungsstufen mit der Methode des dreimaligen Tauens / Frierens (siehe Kap.

2.4.3.2) aufgearbeitet werden. Dabei gilt es zu beachten, daß sich die Plaques

lichtmikroskopisch gut von eventuell in nächster Nähe vorhandenen farblosen Plaques

abgrenzen lassen, um eine Verunreinigung der gewonnenen Suspension mit Wildtyp

Viren möglichst gering zu halten.

#!*!,!) ;�� 7� �6�� &��6�� :��

Die aus den infizierten HuTK- 143B Zellen mit der initialen BrdU-Selektion

vorgereinigten rekombinanten Viren mußten in weiteren 3-4 Selektionsschritten von

Kontaminationen mit dem Wildtyp Virus aufgereinigt werden. Erst dann konnte eine

weitere Vermehrung der Klone in Mini- und Maxi-Stocks und eine Analyse des

inserierten Gens erfolgen. In den nachfolgenden Selektionsrunden wurden konfluente

5cmØ-Schalen CV-1 Zellen mit einer Verdünnungsreihe (100 bis 10-2) der

aufgeschlossenen Viren aus Kap. 2.4.5.2. infiziert und mit jeweils 5 ml Agarose /

Medium ohne Zusatz (siehe Abb. 15) für 48 Stunden inkubiert. Der zweite

Agarose/Medium-Overlay enthielt wiederum X-Gal und die nach weiteren 24 Stunden

Inkubation im 37ºC CO2-Brutschrank entstandenen blauen Plaques wurden erneut

abgesaugt und aufgearbeitet (siehe Kap. 2.4.5.2). Pro Runde wurden 2-3 Plaqueklone aus

der vorherigen eingesetzt, die übrigen Klone können bei –80°C tiefgefroren gelagert

werden. Zeigten sich in einer der weiteren Selektionsrunden keine farblosen Plaques

mehr im CV-1-Monolayer, sondern eine reine Population rekombinanter, blaugefärbter

Plaques, so wurde die Selektion an diesem Punkt beendet. Anschließend wurden Mini-

sowie später auch Maxi-Stocks aus den rekombinanten Klonen der aufgearbeiteten

Plaques hergestellt (siehe Kap. 2.4.3.3). Die rekombinanten Viren wurden rVV-X-adw

und rVV-pSc11 genannt.

49

#!*!-� �� /�� :��

#!*!-! &�.��>� �� <�� .�� ;��7�

Mit den hergestellten Stocks der rekombinanten Vakzinia Klone rVV-X-adw, rVV-

pSc11 sowie mit Wildtyp Vakzinia-Virus als Negativkontrolle wurden konfluente 5cmØ-

Schalen CV-1 Zellen unter Standard-Bedingungen (siehe Kap. 2.4.3.1) infiziert. Nach

einer Inkubation von 72 h im 37ºC CO2-Brutschrank wurden die Zellen bei maximalem

CPE von den Petrischalen abgekratzt und die DNA mittles Proteinase-K Verdauung mit

dem QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, #39304) aus den Zellen extrahiert. Nach

Elution wurden die gewonnenen DNA-Proben gelelektrophoretisch analysiert und ihre

Konzentration bestimmt. Jeweils 400 ng der DNA-Proben wurden zur PCR-Analyse

eingesetzt (Protokoll siehe Kap. 2.1.2). Die PCR wurde mit folgendem Programm

durchgeführt: 25 Zyklen à 30 s Denaturieren bei 94°C, 30 s Annealing bei 57°C sowie 5

min. (wegen Fragmentgrößen > 34 kb) Elongation bei 68°C. Die PCR-Produkte wurden

anschließend in einem 0.8% Agarosegel analysiert.

Die beiden Primer wurden innerhalb der flankierenden Regionen des Thymidinkinase-

Lokus (TKR und TKL) des Vakzinia Genoms so gewählt, daß durch Insertion des

Fremdgenes in den TK-Lokus PCR-Produkte der rekombinanten Klone mit

unterschiedlicher Länge entstehen können.

&�� =�>��D

Sense TK83 – Primer TGG-24 : =:: �=� :=� ��: �=: �=: �� =�=

Antisense TK1100 – Primer CGG-24 : �:: === �=� =�� :� �� =�

��7�� :�IG�� &�.�&��D

Negativkontrolle Wildtyp Vakzinia-Virus: !4 1 �/ (Position 83–Position 1100)

(mit intaktem TK-Lokus)

Rekombinantes rVV-pSc11: *!,)# �/ (Position 83–Position 4615)

Rekombinantes rVV-X-adw: ,!41+ �/ (Position 83–Position 5159)

50

Gleichzeitig konnte mittels der Agarosegel-Analyse der PCR-Produkte die Reinheit der

Virus-Stocks überprüft werden. Sollten die Stocks der rekombinanten Klone nach der

Selektion mit Spuren des Wildtyp Vakzinia-Virus kontaminiert sein, so würde dies in

zwei unterschiedlichen PCR-Produkten entsprechender Größe resultieren. Diese können

dann anhand ihrer Länge als Banden des rekombinanten Klones und des Wildtyp Virus

in der gelelektrophoretischen Auftrennung dargestellt werden.

'��7��D

Da schon geringste DNA-Mengen zur Kontamination dieser Nachweis-PCR ausreichen,

mußten besondere Schutzmaßnahmen eingehalten werden:

♦ Die Aufarbeitung der DNA und Durchführung der PCR erfolgte räumlich getrennt

von der Klonierung der Plasmide bzw. Herstellung der rekombinanten Viren.

♦ Es werden neue Aliquots von Puffern, Primern, dNTPs und H2O eingesetzt.

♦ Die Template-DNA wird dem PCR-Mastermix im allerletzten Schritt zugefügt.

♦ Aerosolbildung beim Pipettieren wird strengstens vermieden und die verwendeten

Pipetten werden zuvor mit UV-Licht behandelt, um etwaige DNA-Spuren an der

Pipette zu inaktivieren.

♦ Es werden nur Pipettenspitzen mit Filtereinsatz verwendet.

♦ Um eine mögliche Kontamination der eingesetzten Materialien ausschließen zu

können, wird eine spezielle Negativkontrolle mit H2O an Stelle der Template-DNA

eingesetzt.

#!*!-!# ��7�� :��2�� /�� 5��

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Die HBxAg-Expression durch die Vakzinia-Klone rVV-X-adw und rVV-X-ayw

(freundlicherweise durch Prof. F.V. Chisari, La Jolla, CA, USA überlassen) wurde

zunächst in CV-1 Zellen überprüft. Unter Standardbedingungen wird jeweils eine

konfluente 75cm2 Flasche mit einem Virusklon infiziert (siehe Kap. 2.4.3.1) und die

Zellen bei maximalem CPE nach 72-96 h vom Boden der Flasche abgekratzt und mit 500

µl RIPA-Puffer (s.o.) für 20 Minuten bei 4°C lysiert. Die Zellysate werden unter Zugabe

51

des 6x β-Mercaptoethanol-haltigen Probenpuffers für 10 Minuten bei 100°C im

Wasserbad denaturiert und anschließend auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen. Das

exprimierte X-Protein wurde im Western-Blot (siehe Kap. 2.3) mit dem monoklonalen

Antikörper α-X36 in einer Verdünnung von 1:500 nachgewiesen. Als Negativkontrollen

wurden Zellen mit dem rVV-pSc11 oder Wildtyp Virus infiziert.

Um eine Expression des X-Proteins auch in den Targetzellen für die späteren

Zytotoxizitätsassays nachzuweisen, wurden die adhärent wachsenden Mäuse-

Fibroblasten MC57G (H-2b syngen) und Balb/c-3T3 sowie D2 (beide H-2d syngen) und

die in Suspension kultivierten lymphoiden Zellinien P815 (H-2d syngen ) sowie EL4 (H-

2b syngen ) mit einer MOI von 5-20 pfu / Zelle infiziert. Nach Inkubation wurden die

Zellen bei maximalem CPE mit RIPA-Puffer lysiert und die Lysate im Western-Blot wie

oben beschrieben analysiert.

#!*!1 F��3�� .�� /��

Das Ziel der UV-Inaktivierung rekombinanter Vakzinia-Viren ist die Suppression der

viralen Replikation bei intakter Expression des inserierten Fremdgens in der infizierten

Zelle. Dies ist eine notwendige Voraussetzung zum Einsatz der Viren bei der in vitro

Stimulation muriner Lymphozytenkulturen. Hierbei muß gewährleistet sein, daß keine

viralen Partikel aus lysierten Stimulatorzellen freigesetzt werden und anschließend die

empfindlichen CD8+ T-Lymphozyten durch eine zytopathische Infektion zerstören (10,

76, 134, 313). Um die optimale Bestrahlungsenergie zu ermitteln, wurde eine Titration

der UV-Bestrahlung mit dem UV- Crosslinker-Gerät (BIORAD, München)

durchgeführt.

#!*!1! =�� F�� 3��

Zur UV-Bestrahlung wurde das entsprechende Volumen der Virus-Stammlösung in ca.

800–1000 µl DMEM-0 aufgenommen und so auf dem Boden einer 5cm∅-Schale verteilt,

daß die Virussuspension als dünner Film gerade die gesamte Fläche der Schale bedeckte.

Anschließend wurden in einer Bestrahlungsserie mit Energiestufen von 0 mJ bis 1000 mJ

52

in Schritten zu 100 mJ jeweils gleiche Mengen der Virussuspension im UV-Crosslinker

inaktiviert. Parallel wurden nun CV-1 Zellen in konfluenten 5cm∅-Schalen mit dem UV-

inaktivierten Virus mit einer MOI von 4 zur Kontrolle der Proteinexpression sowie mit

einer niedrigen MOI (0.25) zur Kontrolle der viralen Replikation unter

Standardbedingungen (siehe Kap. 2.4.3) infiziert. Zum Nachweis einer intakten

Proteinexpression nach UV-Bestrahlung wurden die CV-1 Zellen nach 24 h mit RIPA-

Puffer lysiert und im Western-Blot analysiert (siehe Kapitel 2.3). Die virale Replikation

in Form einer sichtbaren Plaque-Bildung wurde durch tägliche mikroskopische

Beobachtung der infizierten CV-1 Zellen bis zum Tag 10 nach der Infektion überprüft.

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Es wurden Balb/c- und C57BL/6- Mäuse im Alter von 6-12 Wochen eingesetzt, welche

im Tierstall des Neurozentrums der Universitätsklinik Freiburg gehalten wurden.

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Die intramuskuläre Injektion der Plasmid-DNA erfolgte in den rechten oder linken M.

tibialis anterior der Mäuse. Fünf Tage vor Applikation der Expressionsplasmide wurden

je 100 µl einer 0,25%igen Lösung des Lokalanästhetikums Bupivacain (Carbostesin,

Astra GmbH, Wedel) in verschiedene Abschnitte des Muskels injiziert. Diese

Vorinjektion erzeugt eine Nekrose, Inflammation und sukzessive Regeneration des

Muskels, wodurch immunkompetente Zellen wie z.B. Antigen-präsentierende Zellen

(APCs) samt ihres immunmodulatorischen Zytokinrepertoirs in den Muskel einwandern.

In diesem immunologisch hochaktiven Milieu sind dann bei der eigentlichen DNA-

Injektion besonders zahlreiche APCs und aktivierte Effektorzellen erreichbar (63). Fünf

Tage nach der Bupivacain-Gabe wurde die Plasmid-DNA, gelöst in 100 µl einer 0.9%

53

NaCl Lösung, in 4-5 Bereiche desselben Muskels mit einer 27G Nadel injiziert. Je nach

Studiengruppe wurden dabei pro Maus 100-150 µg Plasmid-DNA, bei Zytokin-

Koimmunisierung zusätzlich 25-50 µg des entsprechenden Interleukin-

Expressionsplasmids, eingesetzt. Bei einigen Gruppen wurden ein- oder zweimalige

Booster-Immunisierungen in 2-wöchentlichen Abständen durchgeführt (nach M.

Geißler).

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8��

Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse in einer abgeschlossenen

Kammer mit Isofluran (Forene, Abbott, Wiesbaden, #B506) anästhesiert und

anschließend ca 0,8 ml bis 1 ml Blut durch retrobulbäre Punktion gewonnen. Nach

erfolgter Blutentnahme wurden sie mit Isofluran getötet und sofort in ein 70% Ethanol-

Bad überführt.

Nach 4-6 stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Blutproben zur

Abtrennung der Seren von den korpuskulären Blutbestandteilen zweimal in einer 4°C-

Tischzentrifuge bei 10 000 U / min. für jeweils 10 Minuten zentrifugiert und die

Überstände in sterilen Eppendorf-Cups bei –20°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Die Mäuse wurden über einen Haut-Längsschnitt und einen Peritonealschnitt längs zur

Milzachse unter sterilen Bedingungen splenektomiert. Mit einem Glasmörser wurden

unter Zugabe von jeweils 10 ml IMDM-10 aus den Milzen Einzel-Zellsuspensionen

erstellt und diese zur Separation von Hilus-Fett- und Bindegewebsbestandteilen über ein

steriles Nylon-Siebgewebe mit einer Maschenweite von 200 µm (Polyamid-Siebgewebe,

Fa Reichelt Chemietechnik, Heidelberg) filtriert. Nach 5-minütiger Abzentrifugation bei

1200 rpm wurden die Zellen mit jeweils 2,5 ml des kurz vor Gebrauch hergestellten

Erythrozyten-Lysepuffers (0.83% NH4Cl / 0,17 M Tris pH 7,5 im Verhältnis 10:1) für 10

min. im 37°C CO2-Begasungsbrutschrank inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit

MEM wurden die separierten Leukozyten bei 1200 rpm abzentrifugiert, in jeweils 6 ml

IMDM-10 / 5 x 10-5 M 2-ME (2-Merkaptoethanol) aufgenommen und die

54

Konzentrationen der Lymphozyten in der Neubauer-Zählkammer mit Trypanblaufärbung

(0.02 %) zur Vitalitätsanalyse bestimmt. Pro Maus kann man mit einer Ausbeute von ca

1 x 108 Splenozyten rechnen. Zur weiteren Verwendung in den unten beschriebenen

immunologischen Assays wurde die Konzentration der Einzel-Zellsuspensionen auf 4 x

106 Lymphozyten / ml eingestellt.

#!,!) $E�;� �� 7�� 3�� 2��(�7�� I��

Die Quantifizierung von spezifischen Antikörpern gegen das X-Protein in den Seren

genetisch immunisierter Balb/c und C57BL/6 Mäuse wurde nach dem Prinzip des ELISA

(Enzymimmunoassay) durchgeführt. Das rekombinante HBx zur Bindung der Antikörper

wurde uns freundlicherweise von Dr. S. Urban, Zentrum für Molekulare Biologie,

Universität Heidelberg überlassen (283). Dieses Protein wurde im Baculovirus-System

als 6-His-Tag-Fusionsprotein synthetisiert und in einem Na-Phosphat-Puffer bei pH 5.5

gelöst. Zunächst wurden in einer 96-well „Pro Bind“ Mikrotiterplatte jeweils 1,1 µg

rekombinantes Protein in 50 µl Puffer pro well über Nacht bei 4°C immobilisiert. Diese

Proteinkonzentration hatte sich nach Pilotexperimenten als optimal erwiesen. Nach

zweimaligem Waschen mit PBS 0.02 % Tween wurden die freien Bindungsstellen der

Platten mit 3 % BSA (#A-9647, Sigma, Taufkirchen) in PBS für 2 Stunden abgesättigt.

Anschließend wurden die Seren in verschiedenen Verdünnungsstufen (1:20 bis 1:500 in

PBS/3 % BSA) als Duplikate einpipettiert und für 2 Stunden bei Raumtemperatur

inkubiert. Als Positivkontrolle wurde der monoklonale anti-HBx-Antikörper α-X36

(siehe Kap. 2.3) in einer Verdünnung von 1:2000 eingesetzt. Nach drei weiteren

Waschschritten wurden die Platten mit dem Meerretich-Peroxidase konjugierten anti-

Maus IgG Antikörper (Amersham, 1:1000 in PBS verdünnt) in jeweils 50 µl für eine

Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Substratreaktion erfolgte nach 5maligem

Waschen durch Zugabe von jeweils 50 µl der o-Phenyldiamin • 2 HCl (OPD) –Lösung

(#7181E, Abbott, Wiesbaden). Nach Eintritt der Farbentwicklung wurde die Reaktion

mit 1 N Schwefelsäure (100 µl pro well) gestoppt und die Absorptionswerte bei 492 nm

in einem ELISA-Reader bestimmt. Von den errechneten Mittelwerten der Duplikate

wurde die Hintergrundaktivität (Substratreaktion ohne Serum und Antikörper)

subtrahiert.

55

#!,!* �� 3�� &��(��>� 3�� =�8��

Das Prinzip des T-Zellproliferationsassays basiert auf dem Einbau eines leicht messbaren

Markers der DNA –Syntheseleistung der Lymphozyten nach Zugabe eines

unspezifischen (u.a. PMA, PHA, Con A, anti-CD3) oder spezifischen (rekombinantes

Protein oder Peptid) T-Zellstimulus (54, 108, 110). Nach dem in vivo Priming mit

Plasmid-DNA wurden die murinen T-Zellen in der vorliegenden Arbeit mit

rekombinantem X-Protein vom ayw-Subtyp (siehe Kap. 2.5.2) in unterschiedlichen

Konzentrationen in vitro stimuliert. Dabei fungieren MHC-Klasse-II tragende Zellen, u.a.

dendritische Zellen, welche einen Teil der Milz Einzel-Zellsuspension (siehe Kap. 2.5.1)

ausmachen, als Antigen-präsentierende Zellen (APCs) zur Induktion der T-

Zellproliferation. Zur Markierung werden Thymidin-Analoga wie das radioaktive 3H-

Thymidin oder das Bromodesoxyuridin (BrdU) verwendet (212). In dieser Arbeit wurde

mit dem Cell Proliferation ELISA (Boehringer, Mannheim, #1647229) ein BrdU-Assay

zur Proliferationsanalyse eingesetzt.

Zur Stimulation der T-Zellen wurden Triplikate von jeweils 200 µl der Milz Einzel-

Zellsuspension in IMDM-10 in einer Endkonzentration von 5x105 Effektorzellen pro

well auf 96-well Mikrotiterplatten (Round bottom) mit dem HBx-Antigen in

Konzentrationen von 0.1 µg / ml, 1 µg / ml und 10 µg / ml für 48 h inkubiert. Das

Medium enthielt zusätzlich 2-Merkaptoethanol in einer Konzentration von 5 x 10-5 M.

Nach dem Ablauf von 48 h wurden die Zellen mit BrdU in einer Endkonzentration von

100 µM für weitere 12 h markiert. Anschließend wurden die Zellen 10 min. bei 1000

U/min abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Platten abgetrocknet. Nach

einem Fixations/Denaturierungsschritt von 30 min. erfolgte eine 90-minütige Inkubation

mit dem anti-BrdU-POD Fab-Fragment, welches hierbei an das in die zelluläre DNA

inkorporierte BrdU gebunden wurde. Nach mehreren Waschgängen wurde die

eingeleitete Substratreaktion (Tetramethylbenzidine) mit 1 M H2SO4 abgestoppt und die

Extinktionen bei 450 nm quantitativ in einem ELISA-Reader ausgewertet. Es wurden

Mittelwerte der Triplikate berechnet und die Hintergrund-Aktivität (gemessene BrdU-

Bindung an Medium ohne Zellen) von den Extinktionswerten subtrahiert. Um die

spezifische Proliferation zu erfassen, wurden die Differenz-Werte durch Substraktion der

gemessenen Aktivität in Abwesenheit des Antigens gebildet (∆OD).

56

#!,!, �� 3�� ;�� 7�� 3�� >��2�7�� =�8�� B�=EC

Mit der DNA-Immunisierung lassen sich Antigen-spezifische CTL-Precursorzellen in

vivo induzieren. Zur Messung einer spezifischen CD8+ zytotoxischen T-Zellantwort

(CTL) der in vivo sensibilisierten murinen Effektorzellen müssen die Precursorzellklone

in vitro expandiert werden. Dies gelingt durch eine Präsentation der prozessierten

Fremdantigene im Kontext von syngenen MHC-Klasse-I Komplexen auf den

Stimulatorzellen. Zu diesem Zweck wurden in Anlehnung an Lefkovits (Hrsg.)

„Immunology Methods Manual“ (10) Milzzellen einer nicht-immunisierten Balb/c- bzw.

C57BL/6- Maus vom identischen Haplotyp (H-2d bzw. H-2b) mit HBx-rekombinanten

Vakzinia-Viren infiziert. Um eine mögliche Proliferation der infizierten Stimulatorzellen

zu supprimieren, werden diese anschließend bestrahlt und schließlich mit den

Effektorzellen in einem fixen Effektor : Stimulator Verhältnis (E:S Ratio) für 5-6 Tage

inkubiert. Zur Quantifizierung der CTL-Aktivität nach erfolgter in vitro Stimulation wird

ein 51Chrom-Release-Assay durchgeführt (38). Zunächst werden syngene Targetzellinien

mit rekombinanten Vakzinia-Viren infiziert, um eine Expression und nachfolgende

Präsentation des HBx-Antigens zu erreichen, und anschließend mit 51Cr markiert.

Während der Inkubation mit den spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten werden

bestimmte Peptidstrukturen der Antigene über die Interaktion der T-Zellrezeptoren mit

MHC-Klasse-I Molekülen erkannt und durch die Lyse der Targetzellen wird 51Cr in den

zellfreien Überstand freigesetzt. Durch eine Analyse der Überstände im Gammacounter

kann die korrigierte prozentuale Lyse berechnet werden.

#!,!,! �� 3�� ;�� =E �� (�� ;��>��

Zur Stimulation wurden 4 x 107 Effektorzellen einer Maus in einem E:S Verhältnis von 4

: 1 mit den Stimulatorzellen 6 Tage lang inkubiert. Hierzu wurden 1 x 107 syngene

Splenozyten pro Ansatz gepoolt, um dann in einem 15 ml Falcon-Röhrchen zur Infektion

in einem möglichst geringen Volumen von 1 - 2 ml DMEM-0 resuspendiert zu werden.

Die Infektion erfolgte mit einer MOI von 5 für 120 min. auf einer automatischen Roll-

Vorrichtung im 37°C CO2-Begasungsbrutschrank. Die rekombinanten Vakziniaviren

waren zuvor mit 300 mJ UV-Licht inaktiviert worden (siehe Kap. 2.4.7). Nach der

Infektion wurden die Splenozyten zweimal mit jeweils 5 ml MEM gewaschen und

57

anschließend mit 20 Gy (2000 rad) bestrahlt. Die Konzentration der Zellen wurde durch

entsprechende Zugabe von IMDM-10 + 5 x 10-5 M 2-ME (2-Merkaptoethanol) auf 1 x

106 / ml eingestellt und zur Stimulation auf 24-Well-Platten übertragen. Es wurden

jeweils 1 ml (1 x 106 Zellen) der infizierten Stimulatorzellen und 1 ml der Effektoren (4 x

106 Zellen) pro well gemischt und insgesamt 10 wells pro Effektor-Maus angesetzt. Nach

24 Stunden wurden den Ansätzen 10 Units/ml rekombinantes, murines Interleukin-2

(mIL-2 #1271164, Boehringer, Mannheim) zugesetzt.

#!,!,!# �� =E��3�� .��>

Als Targetzellinien wurden die syngenen Fibroblasten MC57G für den Haplotyp H-2b

und Balb/3T3 für den Haplotyp H-2d mit rekombinanten Vakzinia-Viren infiziert. Die

Infektion der Targetzellen mit den Vakzinia-Viren rVV-X-ayw bzw. rVV-X-adw sowie

als Negativkontrolle rVV-X-pSc11 erfolgte mit einer MOI von 8 für 150 min. unter

ständigem Schwenken im 37°C-CO2-Inkubator. Anschließend wurden die Zellen

gewaschen, trypsiniert und in jeweils 150 µl IMDM-10 in einem 15 ml Falcon-Tube

aufgenommen. Diese Zellsuspension wurde unter Zugabe von 51Cr mit einer Aktivität

von 5 mCi / ml (Amersham, Freiburg, #CJS1-5mCi) bei einer Endaktivität von 0,4 mCi

für 90 min. markiert. Dabei wurde die Labeling-Suspension auf einer automatischen

Rollvorrichtung im CO2-Begasungsbrutschrank bei 37°C ständig durchmischt. Nach drei

Waschschritten mit MEM wurden die Zellen gezählt und auf eine Konzentration von 1 x

105 / ml eingestellt. Zur Inkubation mit den Effektorzellen wurden diese aus den

Stimulationsansätzen zusammengeführt, gezählt und auf eine Konzentration von 1 x 107 /

ml eingestellt. Die Effektoren wurden nun in Triplikaten in verschiedenen

Effektor:Target (E:T Ratio) Verhältnissen (100:1, 20:1, 5:1) sowohl mit den HBx-

spezifischen Targetzellen als auch mit den unspezifischen rVV-pSc11 infizierten

Targetzellen in einer 96-Well „round-bottom“ Platte inkubiert. Wenn die Ausbeute der

stimulierten Lymphozyten zu gering ausfallen war, wurden niedrigere E:T Verhältnisse

gewählt. Zur Bestimmung der spontanen 51Cr-Freisetzung wurden nur Targetzellen mit

IMDM-10 Medium eingesetzt, für die Maximalfreisetzung wurden die Targetzellen mit 5

%igem Triton X-100 (#T8787, Sigma, Taufkirchen) lysiert.

58

&��7��D

100 : 1 20 : 1 Spontan Maximal

Effektorzellen (1x107 /ml) 100 µl 20µl - -

Targetzellen (1x 105 / ml) 100 µl 100µl 100µl 100µl

IMDM-10 - 80µl 100µl -

5% Triton X-100 - - - 100µl

Die pipettierten Ansätze wurden bei 1200 rpm kurz „anzentrifugiert“ und anschließend

für eine Dauer von 6 Stunden im 37°C CO2-Begasungsbrutschrank inkubiert. Nach

erneuter Zentrifugation für 4 min. wurden jeweils 100 µl des Überstandes im Gamma-

Counter analysiert. Es wurden Mittelwerte der Triplikate bestimmt und die spezifische

Lyse der zytotoxischen T-Zellen folgendermaßen berechnet:

Spezifische 51Cr-Freisetzung = Effektor-Freisetzung - spontane Freisetzung

Maximale Freisetzung - spontane Freisetzung

59

��

4�� $+&)$"",1# ,1% �0(+(2)$+ & $+,1# %$+ /"(&- %*�$2)!+$1

)! ! '�� $2�� 7�?)��>�

Das X-Protein der beiden HBV Subtypen ayw und adw unterscheidet sich innerhalb

seiner Antigenstruktur in 9 von 154 Aminosäuren, dies entspricht einer 82,9 %igen

Homologie der Primärstruktur des Proteins. Zur immunologischen Charakterisierung des

X-Proteins in vivo werden daher Konstrukte beider Virus-Subtypen untersucht. Da das

Plasmid pRc/CMV-X (adw) schon vorlag, sollte das Expressionsplasmid pcD/3-X (ayw)

kloniert werden. Der X-ORF wurde aus dem HBV-ayw Überlängenkonstrukt pCH-

9/3091 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. M. Nassal,

Universitätsklinik Freiburg) gewonnen. Ein 617 bp großes Fragment mit dem X-ORF-

Insert wurde durch Restriktionsverdau mit den Enzymen NcoI und SmaI ausgeschnitten.

Der 5´-Basenüberhang an der NcoI-Schnittstelle des Fragmentes wurde mit dem Klenow-

Enzym durch Einbau zusätzlicher Nukleotide in ein „blunt-end“ umgewandelt.

Anschließend wurde der Zielvektor pcDNA/3 mit EcoRV linearisiert, mit dem Enzym

Alkalische Phosphatase (CIAP) dephosphorylisiert und das Insert durch eine „blunt-end“

Ligation eingeführt.

�//! 1! ��>��7�� :�� '��!

1% Agarosegel. Spur 1: 617 bp X-ORF Insert

mit NcoI und SmaI verdaut, nach Klenow

Reaktion. Spur 2: Zielvektor pcDNA3.1 mit

EcoRV verdaut (5446 bp).

60

Der Nachweis des X-ORF Inserts im Zielvektor pcD/3 erfolgte durch eine DNA-Analyse

der E.coli-Klone, welche mit dem Ligationsprodukt transformiert worden waren, mit der

Mini-Prep Methode. Da das Insert über „blunt“ Schnittstellen in den Vektor ligiert

worden war, mußte auch die korrekte Orientierung des X-ORF in dem positiven pcD/3-X

Klon 1 durch einen geeigneten Restriktionsverdau überprüft werden (siehe Abb. 19). Das

Enzym AvaI schneidet einmal innerhalb des Vektor-Backbones und einmal in der Nähe

�//! 0! ��>� �� 7�?)�

'��! 1% Agarosegel mit

aufgereinigten Plasmidklonen

aus E.coli. Spur 1: Maxi-Prep-

DNA des Vektors pcD/3 (5446

bp) als Negativ-kontrolle, Spur

2: religierter Vektor pcD/3 als

Negativ-kontrolle, Spur 3:

positiver Klon 1 pc/D3-X (6065

bp), Spuren 4-7: negative

Klone.

�//! +! .��3�� 3��

&��! 1% Agarosegel. Spur 1: pcD/3-X

Klon 1 verdaut mit AvaI. Fragmente von 4397 bp,

1119 bp und 549 bp beweisen die korrekte

Insertion des X-ORF. Spur 2: pc/D3-X Klon 1

(6065 bp) linearisiert mit pvuI. Spur 3: pcD/3-X

Klon 1 zirkulär ungeschnitten.

61

des 5´-Endes innerhalb des Inserts. Je nach Orientierung des Inserts resultieren ein

Fragment fixer Größe von 1119 bp und zwei Fragmente unterschiedlicher Größe von

4397 bp und 549 bp bei richtiger Insertion bzw. 4830 bp und 116 bp bei falscher

Insertion.

)! !# '�� =��(��

Die Herstellung eines HBx rekombinanten Vakzinia-Virus vom adw-Subtyp erforderte

zunächst die Insertion des X-ORF in das Vakzinia Shuttleplasmid pSc11. In einer PCR

wurde der X-ORF aus dem Plasmid pRc/CMV-X amplifiziert. Da der Shuttle-Vektor nur

einen SmaI-Monolinker als Klonierungsstelle besitzt, mußten mittels PCR-Mutagenese

die „blunt“ Restriktionsstellen EcoRV vor dem Start- und hinter dem Stop-Kodon in die

Sequenz eingeführt werden.

Das 555 bp große PCR-Produkt (siehe Abb. 20) wurde aufgereinigt und mit EcoRV

verdaut. Der Zielvektor pSc11 wurde mit SmaI linearisiert und vor der „blunt-end“

Ligation mit CIAP dephosphorylisiert, um die spontane Religation des Vektors zu

begrenzen (siehe Abb. 21).

�//! #4! &�. �� 9.< B��C!

1% Agarosegel. Spur 1: PCR-

Negativkontrolle. Spur 2: PCR-

Produkt von 555 bp enthält X-ORF

und PCR-Template pRc/CMV-X.

62

Da es bei der „blunt-end“ Ligation zwei Möglichkeiten der Orientierung des Inserts gibt,

wurden die positiven Klone des Plasmids pSc11-X (siehe Abb. 22) mit dem Restriktions-

enzym AatII verdaut. Nur die korrekte Orientierung des X-ORF liefert 3 spezifische

Fragmente mit einer Länge von 5424 bp, 1947 bp und 1055 bp (siehe Abb. 23).

�//! ##! ��&��

�� &�� '��. 1%

Agarosegel. Spur 1: Positiv-

kontrolle Vektor pSc11, Spuren

2, 3, 5-8: positive Klone pSc11-

X (8426 bp), Spur 4: doppelte

Insertion (8969 bp), Spur 9:

negativer Klon.

�//! # ! ��>� �� (��

�� ! 1% Agarosegel.

Spur 1: PCR-Fragment EcoRV verdaut

(544 bp). Spur 2: pSc11 Transfervektor

mit SmaI linearisiert (7883 bp).

63

Es wurden schließlich 3 positive Plasmid-DNA Klone mit korrekter Orientierung des X-

ORF weitergeführt und zur Herstellung von rekombinanten Vakzinia-Viren amplifiziert.

)! !) &�� &��

Es wurden insgesamt jeweils ca. 15 mg der Plasmide pcD/3-X (ayw) und pRc/CMV-X

(adw) und 2 mg des Plasmids pSc11-X (adw) präpariert. Als Maß für die Reinheit der

Präparation wurde der Quotient aus der spektrophotometrischen Absorption bei 260 nm

und bei 280 nm gebildet. Werte > 1,8 werden als kontaminationsfrei angesehen. Die

hergestellten Präparationen wiesen einen Quotienten zwischen 1.870 und 1.917 auf, was

auf die Gegenwart reiner Plasmid-DNA hinwies. Weiterhin sollte der Anteil

geschlossener zirkulärer DNA in den Präparationen sehr hoch sein, da nur diese für

effiziente Transfektionen in vitro und in vivo geeignet ist. Bakterielle genomische DNA

darf überhaupt nicht nachzuweisen sein, der Anteil relaxierter zirkulärer DNA sollte

nicht größer als 10% sein und der Anteil der geschlossen zirkulären DNA („supercoiled“)

mindestens 90% sein. Bei einzelnen Präparationen wurde der Reinheitsgrad bzw. der

Anteil geschlossen zirkulärer DNA durch anschließende CsCl-Gradienten-Aufreinigung

zusätzlich erhöht.

�//! #)! .��>� ��

9��! 1% Agarosegel.

Plasmid-DNA wurde mit AatII

geschnitten. Spuren 1, 4, 6: negative

Klone von pSc11-X mit einem 5424 bp

Fragment und einem Doppel-Fragment

bei 1508 bp und 1494 bp. Spuren 2, 3,

5: positive Klone pSc11-X mit den

Fragmentlängen 5424 bp, 1947 bp und

1055 bp.

64

)! !* 9�� =��(��((�� .�� E��(��

Die murine Myoblasten-Zellinie G-8 zeigt eine sehr niedrige Transfektionseffizienz mit

der CaPO4-Methode. Mit der Methode des liposomalen Gentransfers lassen sich

hocheffiziente Transfektionen mit zahlreichen Zellinien durchführen. Es gibt jedoch

einige Parameter bei dieser Methode, welche individuell an die jeweiligen Bedingungen

der einzelnen Zellinien angepasst werden müssen. Im Falle der G-8 Zellen wurden die

Parameter DNA:Liposom Verhältnis im Transfektionsansatz und Inkubationszeit der

DNA-Liposom Komplexe während der Transfektion untersucht. Auch die liposomale

Transfektion von CV-1 Zellen mit dem Transferplasmid sollte für die Vakzinia-Virus

Rekombination optimiert werden.

G-8 Zellen wurden in 6-Well-Schalen mit jeweils 1 µg des Plasmids pCMV-Luc+

transfiziert. Dabei wurde in verschiedenen Ansätzen das DNA:Liposom Verhältnis

zwischen 1:5 und 1:12,5 und die Inkubationszeit mit den DNA-Liposom-Komplexen von

2 h, 4 h oder 6 h variiert. Die Luziferaseaktivität als Maß für die Transfektionseffizienz

wurde in den einzelnen Zellysaten 24 h später mit dem Luminometer wie in Kap. 2.2.4

beschrieben, bestimmt und ist in Abb. 25 dargestellt. Die höchste Transfektionseffizienz

wurde mit einem DNA:Liposom Verhältnis von 1:5 und einer kurzen Inkubationszeit von

2 h beobachtet. Gleichwohl zeigt dasselbe DNA:Lipsom Verhältnis auch bei längerer

Inkubation eine effiziente Transfektion, welche jedoch mit zunehmender Dauer

�//! #*! ��2��&��

�� &��! 1%

Agarosegel. Der Anteil an

„supercoiled“ DNA beträgt mehr

als 95%. Spur 1, 2: pcD/3-X (ayw)

Maxi-Präparationen. Spur 3, 4:

pRc/CMV-X (adw) Maxi-

Präparationen.

65

wahrscheinlich als Folge der Zell-Toxizität der Liposomen abnimmt. Daher wurde bei

den weiteren HBx-Expressionsstudien in G-8 Zellen jeweils ein Verhältnis von 1:5 mit

einer Inkubationszeit von 2 h gewählt.

Analog wurden CV-1 Zellen mit DNA:Liposom Verhältnissen von 1:5, 1:10 und 1:15

transfiziert und analysiert. Auch hier zeigte sich noch deutlicher, daß die höchste

Effizienz mit einem Verhältnis von 1:5 erzielt werden kann.

0

2

4

6

8

��

2 h 4 h 6 h

��

�� !"��##��

1 : 5

1 : 7,5

1 : 10

1 : 12,5

DNA : LiposomVerhältnis

�//! #,! �� E��(��3�� G (A� �� =��(��((��

�� :��(�� :�0 8��! Die Abhängigkeit der Transfektions-

effizienz vom DNA:Liposom Verhältnis und der Inkubationszeit wurde durch Transfektion

mit dem Reportergen pCMV-Luc+ (1 µg) und anschließende Messung der

Luziferaseaktivität in relativen Lichteinheiten (RLU) im Zellysat der einzelnen

Transfektionsansätze gezeigt.

66

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

��

��

��

��$�

�%��&'

�

��

1 : 5 1 : 10 1 : 15

��(��)��*��+%#��

�� !&��##��

)! !, $2�� 3�� 2�� 2��>�

Die Expression des X-Proteins wurde in der humanen Hepatomzellinie HUH-7 sowie in

der murinen Muskelzellinie G-8 als in vitro Modell für die i.m. Plasmid-DNA

Applikation bei der DNA-Immunsierung überprüft. Bei allen Immunoblotanalysen wurde

der monoklonale Antikörper α-X36 (freundlicherweise von Prof. J. Wands, Brown

University, Providence, RI, USA überlassen) eingesetzt. Das Plasmid pRc/CMV-X

(freundlicherweise von Dr. M. Melegari, Molecular Hepatology Unit, MGH, Boston

überlassen), welches das X-Protein vom adw-Subtyp exprimiert, wurde unter

Standardbedingungen nach der Ca-Phosphat Methode in HUH-7 Zellen transfiziert. Die

G-8 Zellinie wurde liposomal transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden mit

unterschiedlichen Lysepuffern lysiert.

Das X-Protein läßt sich aus beiden Zellinien und mit unterschiedlichen

Transfektionsbedingungen nur mit den stark Detergenzien-haltigen Lysepuffern RIPA

und 1x konzentriertem Western-Blot Ladepuffer oberhalb der Nachweisgrenze des

Immunoblots extrahieren. Dagegen konnte es in den Lysaten des schwachen Core-

Lysepuffers nicht nachgewiesen werden (siehe Abb. 27).

�//! #-! $��(�G ��

E�� ( ��

=��(��((��

8��! Transfektionsansätze mit

unterschiedlichen DNA:Liposom

Verhältnissen. Messung der

Luziferaseaktivität in relativen

Lichteinheiten (RLU).

67

Die Charakterisierung der zeitabhängigen Expression des X-Proteins wurde in beiden

Zellinien nach transienter Transfektion mit dem Plasmid pRc/CMV-X durchgeführt

(siehe Abb. 28). Der Beginn der Expression in HUH-7 Zellen, welche mit der CaPO4-

Methode transfiziert worden waren, konnte nach 36 h nachgewiesen werden. Ein

Maximum zeigte sich nach 60 h mit durchgängig starker Expression bis 72 h nach der

Transfektion. In G-8 Zellen war die Expression vom ersten Zeitpunkt bei 20 h nach

Transfektion bis 60 h nach Transfektion kontinuierlich stark.

�//! #1! ��7�� 2 B��C $2�� F��1 �� :�0 8��

��7��7�� E>��((��. Transiente Transfektion (CaPO4-Methode) von HUH-7

Zellen mit pRc/CMV-X (Spur 3-5). Negativkontrolle: untransfizierte HUH-7 Zellen (Spur

1+2). G-8 Zellen liposomal unter optimierten Bedingungen transfiziert (Spur 6-9). Die

Proteinextraktion erfolgte 24h nach Transfektion mit Lysepuffern RIPA, Core-Lysepuffer

(Core) und einem 1x konz. Westernblot-Ladepuffer (Loading). Immunoblot-Analyse der

Proteinextrakte mit einem monoklonalen anti-X Antikörper.

68

Die Expression des X-Proteins vom ayw-Subtyp wurde mit dem subklonierten

Expressionsplasmid pcD/3-X getestet. Hierzu wurden zwei positive Klone des klonierten

Vektors in G-8 Zellen mit dem lipsomalen System unter optimierten Bedingungen

transfiziert. Beide Plasmidklone zeigen funktionierende Synthese des X-Proteins nach 24

h (siehe Abb. 29).

Ebenso wurde die Expression von pcD/3-X in HUH-7 Zellen sowie die zeitabhängige

Expression in beiden Zellinien mit dem Immunoblot-Verfahren getestet (Bilder nicht

gezeigt). Dabei konnten vergleichbare Resultate zu den Expressionsstudien mit dem

Plasmid pRc/CMV-X erzielt werden.

�//! #0! 8��/��

$2�� 3�� 2 B��C �� F��

1 �� :�0 8��!

�C HUH-7 Zellen mit pRc/CMV-X

nach der Ca-PO4-Methode transient

transfiziert. Nach 20 h bis 72 h wurden

Proteinextrakte gewonnen und im

Immunoblot mit einem monoklonalen,

HBx-spezifischen Antikörper getestet.

�C G-8 Zellen wurden liposomal mit

pRc/CMV-X transfiziert und nach 20 h

bis 60 h geerntet. Die Proteinextrakte

wurden im Immunoblot mit einem

monoklonalen, HBx-spezifischen Anti-

körper getestet.

69

4�� $+&)$"",1# +$2!-7 1(1)$+ �(28 1 (*� +$1

Als immunologisches Werkzeug zur Charakterisierung von CTL-Antworten gegen HBx

vom ayw-Subtyp sollte ein Vakzinia-Virus, welches das X-Antigen exprimiert,

rekombiniert werden. Die Spezifität einer gegen Epitope des X-Antigens gerichteten

CTL-Antwort kann nur nachgewiesen werden, wenn alle unspezifischen, gegen

Vakzinia-Epitope gerichteten CTLs in einer geeigneten Kontrolle gemessen werden

können. Zu diesem Zweck wurde ein zweites rekombinantes Vakzinia-Virus mit dem

Transfervektor pSc11 ohne Insertion eines Fremdgens hergestellt. Dieses rekombinante

Virus produziert bei ähnlicher Virulenz sämtliche Vakzinia-Epitope und die infizierte

Wirtszelle kann diese der MHC-Klasse-I Präsententation zuführen. So lassen sich bei

Messungen von CTL-Antworten im Chrom-Release-Assay unspezifische CTL-

Aktivitäten quantifizieren.

�//! #+! $2�� &�� 3�� >��

;/�>� �� :�0 8��! Die G-8 Zellen wurden

liposomal unter optimierten Bedingungen mit zwei

Klonen des Plasmids pcD/3-X transfiziert und nach

24 h geerntet. Die extrahierten Proteine wurden im

Immunoblot mit einem monoklonalen, HBx-

spezifischen Antikörper getestet. Spur 1 und 2 zeigen

die Expression von HBx durch jeden der beiden

Plasmidklone. Spur 3 zeigt die Negativkontrolle mit

pcD/3 transfizierten Zellen.

70

)!#! � .��/�� ;��

Die beiden rekombinanten Vakzinia-Viren rVV-X-ayw und rVV-pSc11 wurden nach der

Methode der homologen Rekombinantion und anschließenden Plaque-Selektion im

doppelten Agarose-Overlay hergestellt. Zunächst wurden CV-1 Zellen mit dem Wildtyp

Vakzinia-Virus bei einer MOI von 0,02 infiziert und direkt im Anschluß mit den

Plasmiden pSc11-X sowie pSc11 mit dem liposomalen Gentransfer unter optimierten

Bedingungen (siehe Kap 2.2.4) transfiziert. Die Zellen wurden nach 2 und 3 Tagen

geerntet und in eine Virussuspension aufgearbeitet. Die rekombinanten Virusklone

wurden in 3 Runden Plaque-Selektion auf TK- 143B Zellen im doppelten Agarose-

Overlay Verfahren aufgereinigt. Die Selektion TK-negativer Klone erfolgte durch das

Zytostatikum Bromo-Desoxyuridine, zusätzlich konnten die positiven Klone durch blaue

Anfärbung der Plaques mit dem Enzym Beta-Galaktosidase optisch sichtbar gemacht

werden. Pro Runde wurden 10 rekombinante Plaques aufgearbeitet. Die folgenden

Infektionen wurden mit Virussuspensionen aus 3 bis 8 dieser Plaques unverdünnt und in

einer 1:10 Verdünnung durchgeführt (siehe Abb. 30). Den Abschluß der Plaque-

Reinigung bildeten 2 Runden einfacher Beta-Galaktosidase Selektion der Klone in CV-1

Zellen. Aus der letzten Runde wurden jeweils 2 Klone von rVV-X-ayw und rVV-pSc-11

amplifiziert und anschließend charakterisiert.

)!#!# &�� /��

Es wurden Präparationen positiver Klone der rekombinanten Vakzinia-Viren rVV-X-

ayw, rVV-X-adw (Dieses Virus wurde uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt von

Prof. F.V. Chisari, Scripps Institute, La Jolla, CA, USA), rVV-pSc11 und des Wildtyp

Vakzinia-Virus WR (Western Reserve Stamm) hergestellt. Solche Präparationen müssen

besonders hohe Titer aufweisen, damit sie zur Antigenexpression in eukaryontischen

Zellen sowie zur Generierung von immunologischen Zielzellen eingesetzt werden

können. Diese Zellen werden mit Multiplizitäten im Bereich von MOI 5 bis MOI 20 bei

einem sehr kleinen Inokulum infiziert, so daß Titer zwischen 107 pfu/ml und 109 pfu/ml

erforderlich sind. Die Titrierung der Präparationen rekombinanter Viren nach

erfolgreicher Selektion wurde zunächst im doppelten Agarose-Overlay Verfahren mit

dem Chromogen X-Gal durchgeführt (siehe Abb. 31). Somit konnte durch

71

lichtmikroskopische Bestimmung des Verhältnisses blauer zu farbloser Plaques der

Reinheitsgrad der Präparationen ermittelt werden. Dieser lag bei den selektionierten

Klonen von rVV-pSc-11 und rVV-X-ayw >99 %. Im nachfolgenden wurden die Titer

reiner Präparationen der rekombinanten Viren und des Wildtyp Vakzinia-Virus mit dem

Kristallviolett-Plaquetest ermittelt (siehe Abb. 32).

)!#!)� �� /�� :��

Die Insertion des Fremdgens rekombinanter Vakzinia-Viren und die Reinheit der

Präparationen konnte mit Hilfe einer analytischen PCR der präparierten Vakzinia-DNA

untersucht werden. Hierzu wurden CV-1 Zellen mit Präparationen der rekombinanten

Vakzinia-Klone und des Wildtyp Virus infiziert und eine DNA-Extraktion der Virus

infizierten Zellen durchgeführt. Diese DNA-Proben wurden in einer PCR mit Primern,

welche im viralen Genom in der Region des Thymidinkinase-Gens binden, analysiert.

Das jeweilige PCR-Produkt konnte durch die Berechnung der Länge der

Insertionssequenz bzw. der Wildtyp Sequenz vorhergesagt werden (siehe Abb. 33).

Die untersuchten Virusklone der rekombinanten Viren zeigten das jeweilige Insert mit

der entsprechenden Länge. Außerdem wiesen die Präparationen einen sehr hohen

Reinheitsgrad auf. Verunreinigungen der Präparationen rekombinanter Viren mit

Wildtyp Viruspartikeln können mit dieser PCR sehr sensitiv aufgespürt werden. In keiner

der DNA-Präparationen ließ sich jedoch eine zusätzliche Bande des Wildtyp Genoms mit

einer Länge von 1,017 kb nachweisen (siehe Abb. 34)

72

��7�� 2.5 x108 pfu / ml

��7��>� 5 x 107 pfu / ml

��7��;7� 4 x 107 pfu /ml

��7�5= 5 x 107 pfu / ml

�//! )4! ;�� /��

�� ! Doppelter

Agararose-Overlay mit dem

Substrat X-Gal führt 72 h nach

Infektion zur selektiven Blau-

Färbung der rekombinanten

Virusklone. Die Plaques

werden in der 1:10 Ver-

dünnung (rechts) einzeln abge-

saugt und aufgearbeitet.

�//! ) ! =�� /��

�� ! Die

Original-Suspension wird in 1:10

Verdünnungs-stufen zur Infektion

eingesetzt und im Agarose-Overlay

Verfahren mit X-Gal angefärbt. Die

Zahl der rekombinanten Plaques wird

in der vorletzten Verdünngsstufe

(rechts oben) ausgezählt und daraus

der Virustiter ermittelt.

�//! )#! =��.��

��2��&��! Die Höhe

der Titer wurde mit dem

Kristallviolett-Plaquetest bestimmt.

73

Die Expression des X-Antigens durch die rekombinanten Vakzinia-Viren rVV-X-adw

und rVV-X-ayw wurde in Lysaten infizierter CV-1 Zellen nachgewiesen. Die Zellen

wurden mit unterschiedlichen Multiplizitäten zwischen MOI 5 und MOI 20 infiziert. Die

Zellysate wurden im Immunblot mit einem monoklonalen Antikörper gegen das X-

Protein getestet.

�//! ))! :�IG� ��

&�.�&�� /��

��>� ��/��

��!

�� &�.�&��

WT Vakzinia-Virus 1.017 kb

rVV-pSc11 4.532 kb

rVV-X-adw 5.079 kb

�//! )*! &�.�&�� 3��

�� 3��7��

��! 1% Agarose-

gel. Spur 1: DNA nicht-infizierter

Zellen, Spur 2: PCR-Produkt mit

WT-VV infizierter Zellen, Spur 3:

PCR-Produkt des rekombinanten

VV-pSc11, Spur 4 und Spur 5:

irrelevante PCR-Produkte, Spur 6:

PCR-Produkt des rekombinanten

VV-X-adw. Die Längen

entsprechen dem jeweiligen Insert.

74

Der Western-Blot in Abb. 35 zeigt, daß beide Klone des neu-synthetisierten Vakzinia-

Virus rVV-X-adw ein intaktes X-Protein in der infizierten Zelle synthetisieren können.

Ebenso ist die Expression von HBx Subtyp ayw mit dem rekombinanten Vakzinia-Virus

rVV X-ayw in CV-1 Zellen möglich (Abb. 36). Die Expressionskinetik zeigt, daß eine

Antigenexpression auch schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt nach der Infektion (8 h)

schwach nachgewiesen werden kann, was eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz

der Vakzinia-Viren zur Herstellung von Zielzellen im Zytotoxizitätsassay war. Eine

erhöhte MOI bei der Infektion scheint keine verstärkte Expression zu bewirken (siehe

Abb. 36). Als Positivkontrolle wurden G-8 Zellen mit dem getesteten Plasmid pcD/3-X

transfiziert, in der Negativkontrolle wurden CV-1 Zellen mit dem Wildtyp Vakzinia-

Virus infiziert.

�//! ),! $2��

��/��

��! Proteine aus CV-1

Zellen im Immunoblot mit HBx-

spezifischem Antikörper. Analyse

90h nach Infektion mit Klonen

rekombinanter Vakzinia-Viren.

Spur 1 und 2: Beide Klone von

rVV-pSc-11 exprimieren kein X-

Protein; Spur 3 und 4: Klon 1 und 2

des rekombinanten Virus rVV-X-

adw sind positiv; Spur 5:

Positivkontrolle HUH-7 Zellen mit

Plasmid pRc/CMV-X transfiziert.

75

Die Antigenexpression wurde weiterhin in verschiedenen syngenen Targetzellinien,

welche in CTL-Assays verwendet werden sollten, untersucht. Die beiden

Fibroblastenlinien MC57G (H-2b) und D2 (H-2d) zeigen eine starke Expression des X-

Proteins nach Infektion mit dem rekombinanten Vakzinia-Virus vom ayw-Subtyp bei

einer MOI von 10. Die Untersuchung der zeitabhängigen Expression konnte schon 9 h

nach Infektion eine deutliche Expression im Immunoblot nachgewiesen werden (siehe

Abb. 37). Diese Resultate sprechen für den Einsatz dieser Zellinien zusammen mit dem

Vakzinia-System zur CTL-Analyse muriner Lymphozyten.

Dagegen ließ sich in den für den CTL-Assay bewährten lymphoiden Zellinien P815 (H-

2d) und EL4 (H-2b) in wiederholten Experimenten mit MOIs zwischen 1 und 20 keine

funktionstüchtige Expression des X-Proteins durch rekombinante Vakzinia-Viren

nachweisen (Resultate nicht gezeigt).

�//! )-! 8��/�� $2�� /�� >�!

Immunoblot-Analyse von CV-1 Zellen mit HBx-spezifischem Antikörper. Spur 1:

Positivkontrolle G-8 Zellen transfiziert mit Plasmid pcD/3-X. Spur 2: Negativkontrolle CV-1

Lysat infiziert mit WT Vakzinia-Virus. Spur 3 und 4: CV-1 Lysate 8 h nach Infektion mit

rVV X-ayw mit MOI 10 (3) und MOI 20(4). Spur 5 und 6: CV-1 Lysate 22 h nach Infektion

mit rVV X-ayw mit MOI 10 (5) und MOI 20 (6).

76

)!#!*� F��3�� /��

Die rekombinanten Vakzinia-Viren sollten u.a. bei der in vitro Stimulation muriner T-

Lymphozytenkulturen eingesetzt werden. Dabei wurden infizierte syngene Splenozyten

als Stimulatorzellen verwendet. Innerhalb der 5- bis 6-tägigen Ko-Kultur-Phase besteht

jedoch das Risiko, daß replikationsfähige virale Partikel aus den Stimulatorzellen

freigesetzt werden und in der Folge zytopathisch auf die empfindlichen Lymphozyten

einwirken.

�//! )1! 8��/�� $2�� &�� =�� ,1: �� #!

Immunoblot aus Zellysaten von MC57G und D2 Zellen mit HBx-spezifischem Antikörper. Spur 1

und 2: HBx-Expression in D2 9 h bzw. 22 h nach Infektion mit rVV-X-ayw. Spur 3:

Negativkontrolle D2-Zellen mit Wildtyp VV infiziert. Spur 4-6: HBx-Expression in MC57G Zellen

6 h, 9 h und 22 h nach Infektion mit rVV-X-ayw. Spur 7: Negativkontrolle MC57G mit Wildtyp VV

infiziert. Spur 8: Positivkontrolle G-8 Zellen mit Plasmid pcD/3-X (ayw) transfiziert.

77

Aus diesem Grunde sollte die selektive Inaktivierung der viralen Replikation durch eine

minimale UV-Dosis getestet werden. Die optimale UV-Dosis wurde wie oben erwähnt

(siehe Kap. 2.4.7) durch Bestrahlung der Virussuspension von rVV-X-ayw mit

ansteigenden Energiedosen in einem UV-Cross-Linker (BIORAD) ermittelt. Parallel

wurde anschließend die Expression des X-Antigens in CV-1 Zellen und Replikation der

inaktivierten Viren durch lichtmikroskopische Untersuchung der Morphologie des CV-1

Monolayers untersucht. Die CV-1 Zellen wurden 24 h nach der Infektion mit RIPA-

Puffer lysiert und im Immunoblot mit dem monoklonalen, X-spezifischen Antikörper α-

X36 analysiert. Als Positivkontrolle wurde ein Lysat von CV-1 Zellen, welche mit dem

unbestrahlten rVV-X-ayw infiziert worden waren, eingesetzt. Mit Wildtyp Vakzinia-

Virus infizierte CV-1 Zellen wurden als Negativkontrolle getestet.

Wie in Abb. 38 zu sehen ist, fand schon bei der minimalen Inaktivierungs-Dosis von 300

mJ UV-Licht keine intakte virale Replikation der Viren mehr statt. Wurde die Dosis noch

weiter erhöht, liessen sich entsprechend keine Zeichen der Replikation bis zum Tag 10

nach Infektion nachweisen. In der Immunoblot-Analyse ist bei der Minimal-Dosis von

300 mJ eine im Vergleich zur Positivkontrolle schwächere, aber nachweisbare

Expression des X-Antigens vorhanden. Bei höheren Dosen konnte schließlich auch keine

Expression mehr gezeigt werden. In der Folge sollten die rekombinanten Vakzinia-Viren

daher mit einer Dosis von 300 mJ zum Einsatz bei der Lymphozytenstimulation bestrahlt

werden. Damit sollte die Expression des X-Antigens zur optimalen Präsentation auf der

Stimulatorzelle gewährleistet bleiben. Die virale Replikation wird bei dieser Dosis

jedoch wie beabsichtigt vollständig verhindert.

78

�//! )0! F��3��

��/��

��>�!

�C Immunoblot mit dem HBx-

spezifischen Antikörper α-X36.

Spuren 1-6: Lysate aus mit rVV-

X-ayw infizierten CV-1 Zellen.

Die Viren waren zuvor mit

Intensitäten zwischen 300 mJ und

1000 mJ im UV-Cross-Linker

bestrahlt worden. Spur 7: Positiv-

kontrolle mit unbestrahlten Viren.

Spur 8: Negativkontrolle mit

Wildtyp Vakzinia-Viren.

�C Analyse der Replikation UV-bestrahlter Vakzinia-Viren in CV-1 Zellen. Die im

konfluenten Monolayer infizierten Zellen wurden einmal pro Tag bis Tag 10 nach Infektion

lichtmikroskopisch auf Veränderungen der Morphologie und Plaque-Formation als Folgen

des zytopathischen Effektes replizierender Vakzinia-Viren untersucht.

79

4�4 �1 : :! �+#$71 &&$

)!)! ��2 ��I�� 7� ��

Balb/c (H-2d) und C57BL/6 (H-2b) Mäuse wurden in unterschiedlichen Gruppen mit den

HBx-Expressionsplasmiden pcD/3-X vom ayw-Subtyp und pRc/CMV-X vom adw-

Subtyp mit bzw. ohne adjuvante Applikation der Zytokine IL-12 und IL-18 durch die

Zytokin-Expressionsvektoren pApIL-12p70 (freundlicherweise von Dr. V Zurawski,

Apollon, Malvern, PA, USA zur Verfügung gestellt) und pCI-sIL-18 (freundlicherweise

von Prof. Dr. J Reimann, Ulm zur Verfügung gestellt) immunisiert (siehe Kap 2.5.1).

Dabei wurden jeweils 100 µg DNA des X-Antigen-exprimierenden Plasmids und 50 µg

der Zytokin-Plasmide bzw. des „Leervektors“ pAp021 (Apollon, Malvern PA) pro Maus

intramuskulär injiziert. In der Kontrollgruppe wurden die Mäuse mit dem Plasmid

pcDNA3 immunisiert. Jede Gruppe erhielt 4 Wochen nach der ersten Immunisierung

eine Booster-Immunisierung nach dem gleichen Schema. Die Seren der Mäuse wurden

14 – 21 Tage nach der Booster-Gabe entnommen. In einer Verdünnung von 1 : 20

wurden sie dann auf HBx-spezifische Antikörper mit der ELISA-Methode getestet (siehe

Kap 2.5.3).

Die Balb/c Mäuse, welche mit beiden Subtypen des X-Antigens und adjuvanten

Zytokinen immunisiert wurden, zeigten eine deutliche Antikörperproduktion mit sehr

hohen Serokonversionsraten. Die Gruppen, die mit dem ayw-Plasmid pcD/3-X + pApIL-

12p70 sowie pcD/3-X + pCI-sIL18 und mit dem adw-Plasmid pRc/CMV-X + pCI-sIL-18

immunisiert wurden, zeigten eine Serokonversionsrate von 100 %. Dagegen konnte man

bei den mit X-Antigenplasmid alleine immunisierten Gruppen nur sehr schwache

Antikörperbildung und keine einheitliche Serokonversion beobachten. Das ayw-Plasmid

pcD/3-X induzierte überhaupt keine signifikanten Antikörper, und das adw-Plasmid

Gruppe pRc/CMV-X erzeugte nur teilweise schwache Antikörperantworten (60%

Serokonversionsrate).

80

Bei C57BL/6 Mäusen konnte allgemein nur eine sehr schwache Antikörperproduktion

beobachtet werden. In der Gruppe, welche mit dem ayw-Antigenplasmid pcD/3-X

immunisiert wurde, lag die Rate der Serokonversion bei 60%. Ebenso zeigte die Gruppe

mit dem adw-Plasmid pRc/CMV-X und dem Zytokin IL-18 eine 60%ige Serokonversion

bei überwiegend schwacher Antikörperproduktion. Ansonsten zeigten alle anderen

Gruppen keine signifikante Antikörperbildung, mit der Ausnahme einer einzelnen sehr

hohen anti-X Antwort in der Gruppe, welche mit dem adw-Plasmid pRc/CMV-X +

pApIL-12p70 immunisiert wurden. Insgesamt zeigt sich in diesen Gruppen ein sehr

uneinheitliches Bild, ohne eine eindeutige Aussage über eine tendenzielle Wirkung der

adjuvanten Zytokine. In den Gruppen der Kontrollmäuse wurden keine signifikanten

anti-X Antikörper nachgewiesen.

��!��,��#�-.��%��

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

pcD/3-X pcD/3-X +IL-12

pcD/3-X +IL-18

pRc/CMV-X

pRc/CMV-X + IL-12

pcD/3 AK X36

��

��

Cut-off 0,95

�//! )+! ��2 ��I�� ;�� /?7 ��! Mäuse-Seren in 5

Gruppen mit spezifischer Immunisierung. 1: 5 Mäuse mit pcD/3-X (ayw). 2: 3 Mäuse mit pcD/3-X

(ayw) + pApIL-12p70. 3: 5 Mäuse mit pcD/3-X (ayw) + pCI-sIL-18. 4: 5 Mäuse mit pRc/CMV-X

(adw). 5: 2 Mäuse mit pRc/CMV-X (adw) + pApIL-12p70. 6: Kontrollgruppe (2 Mäuse) mit

„Leervektor“ pcDNA3 immunisiert. 7: monoklonales Antiserum (α-X36) als Positivkontrolle.

81

In einem anderen Versuch wurden die anti-HBx Antikörpertiter bei verschiedenen

Verdünnungsstufen der Mäuse-Seren im Bereich von 1:20 bis 1:500 untersucht. Balb/c

und C57BL/6 Mäuse wurden zweimal mit jeweils 100 µg des Plasmids pRc/CMV-X

bzw. pcD/3-X i.m. immunisiert. Die Seren wurden 3 Wochen nach der letzten

Immunisierung entnommen. Jeweils eine Balb/c und eine C57BL/6 Maus wurde

einmalig mit rekombinantem X-Protein vom ayw-Subtyp ohne Freund-Adjuvans

subkutan immunsiert. Diese Mäuse zeigen im Vergleich mit den Plasmid-immunisierten

Mäusen keine signifikanten Antikörpertiter und können als Non-Responder unter diesen

Bedingungen angesehen werden. Bei den Plasmid-immunisierten Mäusen sind mit

beiden Subtypvektoren HBx-spezifische Antikörper bis zu einer Serumverdünnung von

1:100 signifikant nachweisbar, was auf niedrige Antikörpertiter hinweist (siehe Abb. 41).

��!��,��/0��-1��%��

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4

pcD/3-X pcD/3-X +IL-12

pcD/3-X +IL-18

pRc/CMV-X

pRc/CMV-X + IL-12

pRcCMV-X + IL-18

pcD/3 AK X36

��

��

�23'

��*

Cut-off 0,95

�//! *4! ��2 ��I�� ;�� ,1�E?- ��! Mäuse-Seren

in 6 Gruppen mit spezifischer Immunisierung. 1: 5 Mäuse mit pcD/3-X (ayw). 2: 3 Mäuse mit

pcD/3-X (ayw) + pApIL-12p70. 3: 5 Mäuse mit pcD/3-X (ayw) + pCI-sIL-18. 4: 5 Mäuse mit

pRc/CMV-X (adw). 5: 3 Mäuse mit pRc/CMV-X (adw) + pApIL-12p70. 6: 5 Mäuse mit

pRc/CMV-X (adw) + pCI-sIL-18. 7: Kontrollgruppe (4 Mäuse) mit „Leervektor“ pcDNA3. 8:

monoklonales Antiserum (α-X36) als Positivkontrolle.

82

)!)!#� �� =�8��(�� 7� ��

Die in vitro T-Zellproliferation der in vivo mit den HBx vom adw -und ayw-Subtyp

sensibilisierten Effektorzellen wurde durch Stimulation mit rekombinantem X-Protein

vom ayw-Subtyp erreicht. Als Maß für die spezifische T-Zellproliferationsantwort wurde

die BrdU-Inkorporation in einem quantitativem ELISA (∆OD bei 450 nm) nach 48 h

Inkubation mit dem X-Antigen ausgewertet.

Zunächst wurde die Proliferationsaktivität nach DNA-Immunisierung mit HBx-

Plasmiden und einmaliger Immunisierung mit rekombinantem X-Protein vom ayw-

Subtyp ohne Freund-Adjuvans verglichen. Sowohl bei der Balb/c wie auch bei der

C57BL/6 Maus zeigte sich kein signifikanter Anstieg der Proliferationsantworten. In

��!4��%��!��

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

1 :20 1 : 40 1 : 100 1 : 500

��

��

pcD/3-X C57BL/6 Maus 1

pcD3/-X Balb/c Maus 2

pRc/CMV-X C57BL/6 Maus 3

pRc/CMV-X Balb/c Maus 4

rHBx C57BL/6 Maus 5

rHBx Balb/c Maus 6

pc anti-X Serum 1:100

Cut-Off

Cut-Off

�//! * ! �� 2��(�7�� I�� 7��7�� A��(��!

Insgesamt 4 C57BL/6 und Balb/c Mäuse wurden mit den Plasmiden pRc/CMV-X (adw) und

pcD/3-X(ayw) zweimal im Abstand von 14 Tagen immunisiert. Jeweils eine Balb/c und eine

C57BL/6 Maus wurde mit 5 µg rHBx(ayw) subkutan ohne Freund-Adjuvans immunisiert. Der

anti-HBxAg-spezifische ELISA wurde 3 Wochen nach der letzten Immunisierung durchgeführt.

83

dieser kleinen Gruppe wurden jeweils nur schwache Proliferationsantworten bei den mit

dem adw-Expressionsvektor pRc/CMV-X immunisierten Mäusen nachgewiesen, wobei

die C57BL/6 Maus einen deutlichen Anstieg bei erhöhter Konzentration des X-Antigens

zeigt (siehe Abb. 42).

In einer weiteren Gruppe wurden die T-Zellproliferationsantworten in C57BL/6 Mäusen

nach dreimaliger i.m. Immunisierung mit den HBx-Expressionsplasmiden beider

Subtypen im Abstand von jeweils 5 Wochen untersucht (siehe Abb. 43). Auch hier

zeigen sich überwiegend sehr schwache T-Zellantworten, wobei bei einer Maus, welche

mit dem ayw-Subtyp immunisiert wurde, ein starker Anstieg der Proliferationsaktivität

gemessen wurde.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

�� ∆

��

pcD/3-XBalb/c

pRcCMV-XBalb/c

rHBx Balb/c pcD/3-XC57BL/6

pRc/CMV-XC57BL/6

rHBxC57BL/6

5#��*�6��6��%��

�!��##)��#� ��

1 10

rHBx (µg / ml)

�//! *#! =�8��(�� 7� *0 � ;�� 2 (c = 1 µg/ml bzw. 10 µg/ml).

2 Balb/c und 2 C57BL/6 Mäuse wurden mit jeweils 100 µg der Plasmide pRc/CMV-X (adw)

und pcD/3-X (ayw) zweimal i.m. immunisiert (6 d nach Bupivacain-Injektion). Zur Kontrolle

wurde jeweils eine Balb/c und C57BL/6 Maus mit 5 µg rekombinantem X-Protein (ayw-

Subtyp) ohne Freund-Adjuvans immunisiert. Die Stimulation der Lymphozyten wurde 3

Wochen nach der Booster-Immunisierung mit 5x105 Zellen pro Effektor angesetzt.

84

In einem weiteren Versuch wurden zwei größere Kohorten bestehend aus Balb/c bzw.

C57BL/6 Mäusen mit HBx-Expressionsplasmiden beider Subtypen und teilweise auch

adjuvant mit Expressionsvektoren der Zytokine IL-12 und IL-18 zweimal im Abstand

von 14 Tagen intramuskulär immunisiert (Schema siehe Kap. 3.3.1). 3 Wochen nach der

Booster-Applikation wurden die Proliferationsaktivitäten nach in vitro Stimulation mit

rekombinantem X-Antigen untersucht. In der Gruppe der Balb/c Mäuse, welche mit dem

ayw-Plasmid pcD/3-X immunisiert worden waren, zeigten sich bei der Mehrzahl der

Mäuse deutliche Proliferationsantworten (siehe Abb. 44). Die adjuvant-applizierten

Zytokin-Plasmide von IL-12 und IL-18 scheinen allerdings keinen signifikant positiven

Effekt auf die T-Zellproliferationsaktivität auszuüben. Weiterhin zeigten mit

„Leervektor“ vakzinierte Mäuse keine spezifische Proliferationsaktivität.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

�� ∆

��

pcD/3-X pcD/3-X pRc/CMV-X pRc/CMV-X mock

��

�!��##)��#� ��/0��-1��%��

1 10

rHBx (µg / ml)

�//! *)! =�8��(�� ,1�E?- ��! Es wurden jeweils 2 Mäuse mit 100 µg der

Plasmide pRc/CMV-X bzw. pcD/3-X 5 bis 6 d nach Bupivacain-Gabe (0,25%) immunisert.

Die Mäuse erhielten insgesamt 3 DNA-Immunisierungen im Abstand von je 5 Wochen. 14

Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Lymphozyten mit rHBx (ayw) für 48 h mit 5

x 105 Zellen pro Ansatz stimuliert.

85

Diese Ergebnisse liessen sich mit dem adw-Plasmid pRc/CMV-X nicht reproduzieren.

Auch in der Gruppe der C57BL/6 Mäuse kam es zu keiner signifikanten HBx-

spezifischen T-Zellproliferationsantwort (Ergebnisse sind nicht abgebildet).

Insgesamt induziert das X-Antigen überwiegend schwache T-Zellproliferations-

antworten. Dabei scheint die Induktion von T-Zellproliferationsantworten gegen das X-

Antigen erfolgreicher in Balb/c Mäusen zu sein, was gut mit den anti-HBx

Antikörpertitern korreliert. Außerdem scheint das ayw-Protein beim Vergleich der

Subtypen auf der Ebene der T-Zellantworten Epitope mit stärkerer Immunogenität zu

besitzen.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

��6

!��

�)��

�� ∆

��

�2/'

��*

pcD/3-X pcD/3-X + IL-12 pcD/3-X + IL-18 mock

5#��*�6�

�!��##)��#� ��#�-.��%��

1 10

rHBx (µg / ml)

3/5 = Anzahl der Responder-Mäuse

2/35/5

2/2

�//! **! =�8��(�� /?7 ��. 3 Gruppen mit spezifischer Immunisierung: Gruppe

1 mit pcD/3-X (ayw); Gruppe 2 mit pcD/3-X (ayw) + pApIL-12p70; Gruppe 3 mit pcD/3-X (ayw)

+ pCI-sIL-18 sowie 1 Kontrollgruppe (2 Mäuse) mit „Leervektor“ pcDNA/3. Die

Proliferationsaktivität von 5 x 105 Zellen pro Effektor wurde nach 48 h Stimulation mit rHBx (c =

1 µg/ml bzw. 10 µg/ml) gemessen; dargestellt sind die Mittelwerte von Respondertieren.

86

)!)!)� 8>��2�7�� =�8��3��

Nach der DNA-Immunisierung wurden die in vivo aktivierten CTLs durch eine 5- bis 6-

Tage dauernde in vitro Stimulation mit syngenen Splenozyten als Stimulatorzellen

expandiert. Da es bisher nicht gelungen war, eine syngene Targetzellinie mit stabiler

Expression des X-Proteins herzustellen, wurde dieses transient mit rekombinanten

Vakzinia-Viren in den permissiven Targetzellinien exprimiert. Hierzu wurden diese mit

den UV-inaktivierten Vakzinia-Viren rVV-X-adw und rVV-X-ayw infiziert und in einem

Effektor:Stimulator Verhältnis von 4:1 mit den Effektorlymphozyten eingesetzt.

Anschließend wurden die Effektorzellen in einem 6 Stunden 51Cr-Release-Assay auf

zytotoxische Aktivität hin untersucht. Die Lyse der syngenen Targetzellen MC57G (H-

2b) und Balb/3T3 (H-2d), welche mit rekombinanten Vakzinia-Viren infiziert wurden,

wurde mittels 51Cr-Freisetzung im Gamma-Counter gemessen. Es wurden

Effektor:Target (E:T) Verhältnisse von 100:1, 50:1 und 20:1 verwendet. Als Kontrolle

für die unspezifische Lyse wurden Targetzellen mit dem Vakzinia-Virus rVV-pSc11

infiziert.

In einem großen Versuch wurden zwei Kohorten mit unterschiedlichen Gruppen aus

C57BL/6 und Balb/c Mäusen mit den Vektoren pRc/CMV-X und pcD/3-X sowie

adjuvanten Zytokin-Expressionsvektoren für IL-12 und IL-18 vakziniert (Schema der

Immunisierung siehe Kap. 3.3.1). Die Mäuse erhielten insgesamt zwei i.m.

Immunsierungen nach einer Bupivacain-Vorabinjektion (0,25%). Im Chrom-Release-

Assay ließ sich weder bei den Balb/c- noch bei C57BL/6 Mäusen eine spezifische CTL-

Aktivität gegen die Targetzellen nachweisen, welche mit den HBx-rekombinanten

Vakzinia-Viren rVV-X-adw bzw. rVV-X-ayw infiziert worden waren (Daten sind nicht

gezeigt).

Eine weitere Gruppe C57BL/6 Mäuse wurde mit dem adw-Plasmid pRc/CMV-X und den

Expressionsplasmiden der Zytokine IL-12 und GM-CSF (siehe Kap. 3.3.1) intramuskulär

mit Bupivacain (0,25%) ko-immunisiert. 10 Tage nach der Vakzinierung wurde die

Stimulation der Milz-Effektorzellen angesetzt. Im Chrom-Release gegen Vakzinia-Virus

infizierte MC57G Targetzellen zeigte sich wieder keine spezifische CTL-Aktivität (siehe

Abb. 45).

87

Schließlich wurde auch der Versuch einer multiplen Booster-Immunisierung zur

Induktion von HBx-spezifischen CTLs unternommen. Eine Gruppe aus C57BL/6

Mäusen wurde mit den Plasmiden pRc/CMV-X (adw) und pcD/3-X (ayw) dreimal im 5-

wöchigen Abstand nach Bupivacain-Gabe intramuskulär vakziniert. 14 Tage nach der

letzten Boosterung wurden die Splenozyten zur Stimulation entnommen. Die CTL-

Aktivität wurde mit E:T Verhältnissen von 50:1 und 20:1 im Chrom-Release bestimmt

(siehe Abb. 46). Auch in diesem Versuch wurden keine spezifischen CTL-Antworten

gemessen.

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

18%

��

Maus 1 Maus 2 Maus 3 Maus 4 Maus 5 mock

��

��!��7��/0��-1��%��

100 : 1 - rVV-X-adw

20 : 1 - rVV-X-adw

100: 1- rVV-pSc11

20 : 1 - rVV-pSc11

E:T Ratio + Targetzellen

�//! *,! �=E��3�� ,1�E?- �� $D= �� 3�� 44D �� #4D !

5 Mäuse wurden mit dem Plasmid pRc/CMV-X und den Zytokinen IL-12 und GM-CSF

einmal i.m. immunisiert. Eine Kontrollmaus wurde mit dem „Leervektor“ pRc/CMV2

immunisiert. Zur Messung der spezifischen CTL-Antwort wurden MC57G Targetzellen mit

dem Vakzinia-Virus rVV-X-adw infiziert. Die unspezifische Aktivität wurde durch die Lyse

rVV-pSc11-infizierter Targetzellen erfasst.

88

0%

2%

4%

6%

8%

10%

12%

14%

16%

��

pcD/3-X Maus 1 pcD/3-X Maus 2 pRc/CMV-X Maus 3 pRc/CMV-X Maus 4

��

��!��7��/0��-1��%��

50 : 1 rVV-X (ayw /adw )

20 : 1 rVV-X (ayw /adw )

50 : 1 rVV-pSc11

20: 1 rVV-pSc11

E:T Ratio + Targetzellen

�//! *-! �=E�� (�� 2��(�7�� B��

�>�?��C �� (�7�� B��;7 C ��,1: =��! Effektorzellen aus

C57BL/6 Mäusen wurden nach dreimaliger DNA-Immunisierung mit den HBx-

Expressionsplasmiden pcD/3-X und pRc/CMV-X im Chrom-Release-Assay analysiert.

89

��8 ��

�� --,1)0$+(' $ %$+ =0+!1 &=0$1 �$'() ) &*�*� +,& �13$2) !1

Diese Studie wurde vor dem Hintergrund der Entwicklung einer effizienten

Immuntherapie der chronischen HBV-Infektion (CHB) durchgeführt. Mit einem

Schwerpunkt im asiatischen Subkontinent sind weltweit mehr als 350 Millionen

Menschen chronisch mit HBV infiziert und durch schwerwiegende Komplikationen wie

akute Leber-Insuffizienz, Leberzirrhose und HCC bedroht. Leider hat sich der Pool von

HBV-Trägern, global gesehen, auch durch die Einführung prophylaktischer

Vakzinierungs-Programme in einigen Ländern mit hohem medizinischen Standard nicht

entscheidend verändert (53). Auch die augenblicklich verfügbaren antiviralen Therapien

mit Interferon und Lamivudine sind in ihrer Effizienz nicht zufriedenstellend und nur bei

einem Teil der chronisch infizierten Patienten mit Erfolg einsetzbar. Lamivudine kann

außerdem bei längerem therapeutischem Einsatz die Entstehung viraler Mutanten mit

geringerer Sensitivität für den Wirkstoff fördern (1, 201). Auf der Suche nach neuen,

effizienteren Therapien stehen insbesondere immuntherapeutische Ansätze im

Mittelpunkt, da die Chronizität durch eine insuffiziente Immunantwort gegen die

infizierten Hepatozyten hervorgerrufen wird. Die Entwicklung einer therapeutischen

Vakzine ist daher eine vielversprechende Strategie, um spezifische Immunantworten

gegen virale Partikel und Virus infizierte Zellen zu induzieren. Erste Resultate klinischer

Studien mit einer therapeutische Vakzinierung gegen HPV-Infektionen sind sehr

erfolgsversprechend (148).

Die Aktivität und die antigene Restriktion von CD4+ T-Helferzellen und CD8+

zytotoxischen T-Zellen sind wichtige Faktoren bei der Pathogenese der CHB. Es konnten

zahlreiche CTL-Epitope vor allem in den Hüllantigenen, dem Core-Antigen und der

viralen Polymerase charakterisiert werden (26, 185, 200, 208, 220). Im Verlaufe der

CHB sind die CTL-Antworten nach Isolation der CTLs aus peripherem Blut gegen alle

90

HBV-Proteine sehr schwach bzw. unterhalb der Nachweisgrenze (82), so daß man von

einer partiellen oder totalen Immuntoleranz gegen diese Antigene spricht. Diese „low-

level“ CTL-Aktivität ist nicht ausreichend, um das Virus vollständig zu eliminieren, ist

aber andererseits in der Lage, die Hepatitis zu unterhalten, da eine intrahepatische

Kompartimentalisierung der Effektorzellen besteht. Weiterhin scheint eine starke,

polyklonale, vorrangig gegen das Core- und HBe-Antigen gerichtete CD4+ T-

Helferzellantwort vom TH1-Subtyp zur Virus-Elimination erforderlich zu sein (128, 168,

274). Die komplette Kontrolle der Infektion gelingt sehr wahrscheinlich nur durch die

Induktion einer multispezifischen, polyklonalen humoralen und zellulären Immunantwort

gegen verschiedene HBV-Antigene. So ist das Risiko, eine CHB zu entwickeln, bei

immun-kompromittierten HBV-infizierten Patienten deutlich erhöht (176). Hinzu kommt

auch, daß HBV-Proteine selbst, hauptsächlich das HBeAg, die Polymerase,

wahrscheinlich jedoch auch das X-Antigen immunmodulatorische Funktionen ausüben

können und auch in extrahepatischen, lymphatischen Geweben wie u.a. in Mesenterial-

Lymphknoten, Milz, Niere und Testes nachweisbar sind (84, 299, 315). Andererseits

kann es im Verlaufe der CHB zur akuten Exazerbation der Erkrankung mit Aktivierung

der antiviralen, immunologischen Effektoren kommen. Dies kann dann zur

Viruseradikation mit Serokonversion zu anti-HBe und anti-HBs führen. Weiterhin ist

eine HBs-Serokonversion beim CHB-Patienten auch durch eine

Knochenmarkstransplantation von einem HBV-immunen Spender möglich (150). Diese

Beobachtungen lassen eine aktive Immuntherapie der CHB als einen vielversprechenden

Therapieansatz erscheinen. Theoretisch sollte eine therapeutische HBV-Vakzine eine

starke CD4+ zelluläre T-Helferzellantwort vom TH1-Subtyp und eine Stimulation der

CD8+ CTL-Aktivität induzieren, wobei die Immunantwort gegen Epitope eines oder

mehrerer HBV-Antigene gerichtet sein sollte.

Aufgrund der oben erwähnten Tatsachen und der Erkenntnis, daß die HBe- und HBs-

Serokonversion beide mit einer verbesserten Leber-Histologie, einer höheren

Überlebenswahrscheinlichkeit und einem erniedrigtem Risiko für die Entstehung eines

HCC assoziiert sind, wurden bisher vor allem therapeutische Vakzine, welche auf den

HBV-Hüllproteinen basieren sowie eine Core-CTL-Peptid Vakzine in klinischen Studien

evaluiert. Impfstoffe mit bereits nachgewiesener prophylaktischer Effizienz wie die

Protein-Vakzine Hepagene (MEDEVA Ltd., UK), welche aus den HBV-Hüllantigenen

HBsAg, Teilen des präS1-Antigens, dem präS2-Antigen und dem Adjuvans

91

Aluminiumhydroxid besteht, wurden ebenfalls als therapeutische Vakzine getestet. Es

konnten zwar starke TH1-gewichtete T-Zellantworten in Mäusen und Schimpansen

induziert werden, jedoch ließ sich in einer größeren humanen Phase-II-Studie in

Indonesien keine signifikante Effizienz dieser Vakzine nachweisen (213, 311). Zur Zeit

werden weitere HBV-Hüllprotein-Vakzine mit verschiedenen Adjuvanzien wie z.B. 3D-

MPL (Monophosphoryl Lipid A) oder QS21 (Quillaria Saponaria) in Phase-II-Studien

untersucht (154, 197, 284). Ein weiterer Ansatz ist die kombinierte Gabe von HBsAg und

anti-HBs Antikörpern, welche Komplexe bilden und dadurch humorale und zytotoxische

T-Zellantworten induzieren sollen (298). Darüber hinaus wurde eine Lipopeptid-Vakzine

bestehend aus einem HLA-A2.1 restringierten HBV-Core Peptid als CTL-Epitop und

einem adjuvanten Tetanus-Toxoid T-Helferzellepitop-Peptid untersucht, welches zwar

bei gesunden Individuen sehr starke CTL-Antworten induzieren konnte, jedoch bei CHB-

Patienten keinen therapeutischen Effekt zeigte (112, 286).

Eine neue, sehr effiziente Methode zur Induktion humoraler und zellulärer

Immunantworten stellt die auch in dieser Arbeit verwendete DNA-Immunisierung dar

(siehe Kap. 1.5). Vorteile dieser Methode sind die in vivo Synthese des kodierten

Antigens mit einem potenten Auto-Adjuvans durch CpG-Motive und ein

immunologisches Profil, welches in seiner Kinetik, Spezifität und den Isotypen einer

natürlichen Infektion sehr nahe kommt. Besonders hervorzuheben ist die starke T-

Zellaktivierung mit CTL- und TH1-gewichteten T-Helferzellantworten nach

intramuskulärer Applikation. Nachteilig sieht man das potenzielle Risiko der Plasmid-

Integration und Mutagenese und wahrscheinlich eine geringere Immunogenität der

Impfstoffe bei Primaten und Menschen im Vergleich zu Mäusen an.

In zahlreichen Studien wurde der Einsatz von Plasmiden, welche verschiedene HBV-

Hüllproteine kodieren, in verschiedenen Tiermodellen vor allem in Mäusen und auch in

Schimpansen untersucht (67, 94, 96, 97, 166). Hierbei ließen sich hohe anti-HBs

Antikörpertiter und starke zelluläre Immunantworten induzieren. In der ersten humanen

Studie der Phase I wurde ein HBsAg-kodierendes Plasmid mit der Gene-Gun-Methode

an gesunden Individuen untersucht. Mit einer relativ niedrigen Dosis von 0,25 µg

Plasmid-DNA ließen sich keine effizienten Antikörpertiter induzieren (262). Im

Mittelpunkt anderer präklinischer Studien stand das Core-Protein oder eine Kombination

von HBcAg und Hüllproteinen (94, 96, 145). Auch hier ließen sich im Mausmodell

92

starke Antikörperantworten und potente CTLs sowie eine TH1-Zytokinsekretion

induzieren. Außerdem besteht auch die Möglichkeit, durch Kombiantion mit Zytokin

kodierenden Plasmiden die T-Helferzellprofile selektiv in Richtung TH1 oder TH2 zu

modulieren (49, 241).

Darüber hinaus wurden auch alternative Delivery-Strategien wie der Einsatz retroviraler

oder adenoviraler Vektoren als immuntherapeutische Vakzine in Tiermodellen untersucht

(111, 228, 232). Vielversprechende Ergebnisse lieferte eine Studie, bei der HBV-

transgene Mäuse mit dendritischen Zellen vakziniert wurden. Es gelang hier eine

partielle Toleranzdurchbrechung mit schwacher Induktion von CTL-Antworten und

spezifischen Antikörpern (246). Ein attraktiver Ansatz wäre die Kombination einer

medikamentösen, antiviralen Therapie mit einer Immuntherapie, da sich eine Reduktion

der Viruslast vorteilhaft auf die Durchbrechung der Virus induzierten Immuntoleranz

auswirken kann (33). In einem Tierexperiment konnte bei WHV-infizierten Woodchucks

durch Vorbehandlung mit dem neu-entwickelten antiviralen Wirkstoff L-FMAU (1-(2-

fluoro-5-methyl-b-L-arabinofuranosyl) uracil) und nachfolgender Therapie mit einer

WHs-Antigen-Vakzine ein sehr breites Spektrum von T-Zellantworten gegen sämtliche

WHV-Antigene im Vergleich zur singulären Therapie mit der Antigen-Vakzine

nachgewiesen werden (59). Sollte sich ein ähnlicher Effekt auch bei einer Immuntherapie

von CHB-Patienten nachweisen lassen, wäre dies ein großer Schritt in Richtung der

Entwicklung einer therapeutischen HBV-Vakzine.

Allerdings scheint die Entwicklung einer beim Menschen therapeutisch effizienten

Vakzine sehr viel schwieriger als erwartet zu sein. Bisher konnte mit keiner der klinisch

getesteten Vakzine ein eindeutig positiver Therapie-Effekt bei der CHB nachgewiesen

werden. Gründe dafür sind wahrscheinlich weiterhin Unklarheiten über die ideale

Zusammensetzung einer solchen Vakzine und die große Variabilität virologischer,

klinischer und immunologischer Pathomechanismen der CHB. Auch ergeben sich

Schwierigkeiten, ein optimales Schema zur Administration sowie Therapie-Endpunkte

festzulegen, welche in der längerfristigen Perspektive klinische Relevanz besitzen. Über

die Art der Immunstimulation und die Antigenzusammensetzung einer solchen

therapeutischen Vakzine gibt noch keine allgemeine Übereinstimmung. Daß jedoch die

meisten der bisher getesteten Vakzine auf den Hüll-Antigenen basieren, ist auf die große

Erfahrung mit diesen Antigenen im Bereich prophylaktischer Vakzine und gute

93

Charakterisierung von Antigen-Epitopen auf B- und T-Zellebene (siehe oben)

zurückzuführen. Analog zur Serokonversion bei der natürlichen HBV-Infektion ist

wahrscheinlich auch eine starke CD4+ TH1- und CTL-Antwort für die Virus-Elimination

und Durchbrechung der immunologischen Toleranz bei der CHB erforderlich.

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Die Immunantworten gegen die beiden Nicht-Strukturantigene HBV-Polymerase und

HBxAg sind bisher noch nicht ausreichend charakterisiert und in ihrer Rolle als

Zielantigene für eine Immunstimulation untersucht worden. Es gibt jedoch einige

Hinweise, daß eine multispezifische, polyklonale Immunantwort mit einem sehr breiten

Antigen-Spektrum zur Toleranzdurchbrechung und Virus-Elimination bei der CHB

notwendig ist (siehe oben). Auch existieren Anhaltspunkte, daß eine

Kombinationstherapie aus antiviraler Therapie und Immuntherapie mit unterschiedlichen

Antigen-Zielstrukturen einer singulären Therapie überlegen sein könnte.

Aus diesen Gründen sollte in dieser Arbeit die Immunogenität des HBx-Antigens auf B-

Zell- und T-Zellebene in einem Tiermodell charakterisiert werden und der Einsatz dieses

Antigens als Zielstruktur einer therapeutischen Vakzine mit der Methode der DNA-

Immunisierung evaluiert werden. Die nachfolgenden Erkenntnisse stellen eine Basis für

die Untersuchung der Immunantworten gegen das X-Antigen im Hinblick auf eine

immuntherapeutische Strategie dar:

♦ In zahlreichen Arbeiten konnte die Expression von HBx im Lebergewebe bei

Patienten mit CHB, zirrhotischen Veränderungen und einem HCC nachgewiesen

werden. Dabei schwanken die quantitativen Angaben der Autoren sehr deutlich

zwischen einer 0 %igen bis über 80 %igen Expression von HBx in HBV-assoziierten

HCCs (109, 131, 291, 292, 318, 320). Um eventuelle Abweichungen aufgrund

unterschiedlicher Spezifitäten der zum Nachweis des X-Proteins in

immunhistologischen Untersuchungen eingesetzten Antikörper auszuschalten, wurde

die Expression in einer neueren Studie mit 11 verschiedenen monoklonalen und

polyklonalen Antiseren im Vergleich analysiert (256). Das Antigen konnte hier in

59% aller HCCs und 53% der zirrhotischen Veränderungen bei CHB mit sämtlichen

94

spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Darüber hinaus findet man DNA-

Sequenzen des X-ORF innerhalb integrierter HBV-Sequenzen im Genom von HCC-

Zellen (169, 282) sowie intakte RNA-Transkripte des X-ORF in HCCs (69, 205). Die

HBx-Expression bleibt während des Prozesses der Tumortransformation, vom Fokus

präneoplastisch veränderter Hepatozyten über den Nodulus bis zum manifesten HCC

erhalten, während die HBsAg-Expression deutlich herabreguliert wird (13, 256, 269).

Diese Ergebnisse deuten auf eine selektive Expression von HBx im CHB-Patienten

mit einem HCC hin. Sollte es gelingen, spezifische, humorale und zelluläre

Immunantworten gegen Epitope des X-Proteins zu induzieren bzw. zu verstärken, so

könnte auf diesem Wege die Elimination präneoplastischer oder bereits

transformierter Hepatozyten sehr effektiv erfolgen.

♦ Das onkogene Potential von HBx konnte in zahlreichen in vitro Studien mit

verschiedenen Zellinien und auch in HBx-transgenen Mäusen demonstriert werden,

wobei letzteres nicht reproduziert werden konnte (135, 142, 160, 234, 267).

Allerdings ist der genaue Mechanismus bzw. die Rolle von HBx bei der HCC-Genese

bisher unbekannt und es gibt unterschiedliche Hypothesen darüber, wie HBx durch

Interaktionen mit anderen Proteinen und seine pleiotrope transaktivatorische Aktivität

auf zahlreiche Gene entscheidenden Einfluß auf die Karzinogenese ausübt (siehe

Kap. 1.4, 78, 165). Außerdem scheinen die transaktivatorischen Funktionen des

Proteins auch für die HBV-Replikation und Expression und damit auch für die

Aufrechterhaltung einer chronischen HBV-Infektion wichtig zu sein; im Woodchuck-

Modell gelingt die chronische Infektion nur bei intaktem X-ORF (43, 55, 321).

Interessant erscheint weiterhin die Tatsache, daß die transaktivatorische Potenz des

X-Antigens in der genomisch integrierten Form beim HCC vollständig erhalten bleibt

(12, 305). Insbesondere durch Alteration von intrazellulären Signal-

Transduktionskaskaden und Interaktion mit Tumor-Suppressorproteinen wie p53

scheint HBx die unkontrollierte Proliferation HBxAg-positiver Zellen zu stimulieren

und die Resistenz der Zellen gegen Apoptosestimuli zytotoxischer Zytokine zu

fördern (siehe auch Kap 1.2). Ein besonders effektiver Schritt bei der Bekämpfung

der chronischen HBV-Infektion und Durchbrechung der Multi-Step Karzinogenese

des HCCs wäre daher die Elimination HBxAg-exprimierender Hepatozyten durch

gezielte, spezifische Immunstimulation.

95

♦ Über die immunologische Charakterisierung des X-Antigens gibt es bereits einige

aufschlussreiche Studien. Der erste Anhaltspunkt für eine in vivo Expression des X-

Proteins gelang durch den Nachweis von Antikörpern gegen HBx in den Seren HBV-

infizierter Patienten (132). Einige Autoren kommen zu dem Ergebnis, daß die

Induktion einer HBx-Antikörperantwort mit dem HCC assoziiert ist (189, 211).

Andere können nur eine niedrige Inzidenz der anti-X Antikörper beim HCC

nachweisen, dafür aber häufig sehr hohe Titer bei CHB-Patienten ohne HCC (73,

115, 155, 156, 174). In einer Untersuchung zur Epitop-Feinspezifität der B-

Zellantworten gegen HBx konnte eine immundominante Region in der Hälfte des

Karboxy-Terminus des Proteins lokalisiert werden, welche mindestens zwei stärkere

Epitope enthält. Auch hier wurden die höchsten Titer bei Patienten mit CHB

beobachtet, wobei alle Antikörperantworten gegen mehr als ein Epitop gerichtet

waren und insgesamt polyspezifische Antikörperantworten gegen zahlreiche Epitope

gemessen wurden (252) In den Seren akut infizierter Patienten und asymptomatischer

Träger fanden sich auch hier nur Antikörperantworten mit niedrigeren Titern und

weniger zahlreichen Epitopen. Auf welche Weise das hauptsächlich zytoplasmatisch

lokalisierte X-Protein mit seiner sehr kurzen Halbwertszeit von 20-30 Minuten dem

Immunsystem präsentiert wird, bleibt jedoch weiterhin unklar (61, 237). Da es bisher

keine Anhaltspunkte für eine Sekretion des Nicht-Strukturproteins gibt, bleibt noch

die Möglichkeit der Freisetzung aus nekrotischen Hepatozyten. Wegen der

multispezifischen Antikörperantworten mit Epitopen, welche nahezu die gesamte

Peptid-Sequenz abdecken, ist auch eine Prozessierung und anschliessenden Peptid-

Präsentation sehr wahrscheinlich. In einer einzigen Human-Studie mit akut und

chronisch HBV-Infizierten konnten bisher zelluläre Immunantworten vom CD4+ T-

Zelltyp gegen Epitope des X-Proteins nachgewiesen werden (127). Bei 100% der

akut infizierten sowie 35% der chronisch infizierten Patienten wurde eine spezifische

T-Zellproliferation beobachtet, die jedoch im Vergleich mit dem HBcAg deutlich

schwächer ausfiel. Auch konnten verschiedene Epitope, welche wiederum

hauptsächlich in der Hälfte des Karboxy-Terminus der X-Sequenz lokalisiert sind,

durch Stimulation der T-Zellen mit synthetischen Peptiden identifiziert werden. Eine

bedeutende Rolle bei der Elimination Virus infizierter Zellen wird im allgemeinen

den CD8+ zytotoxischen T-Zellen zugeschrieben. Eine einzelne Studie zeigt bisher

das Vorhandensein von 5 HLA-A2.1 restringierten CTL-Epitopen bei chronischen

HBV-Trägern. Es wurde allerdings nicht demonstriert, daß es sich bei diesen

96

Epitopen um intrazellulär prozessierte Peptide handelt (51). Zusammenfassend läßt

sich sagen, daß es sowohl humorale Antikörper- als auch T-Zellantworten gegen

verschiedene Epitope des X-Proteins im Verlaufe einer HBV-Infektion gibt. Es

konnte keine eindeutige Assoziation der Stärke und Spezifität der Immunantwort mit

akuten, chronischen Verlaufsformen bzw. dem HCC nachgewiesen werden, doch gibt

es Hinweise, daß sich häufiger höhere Antikörpertiter bei chronisch Infizierten

beobachten lassen, während die CD4+ T-Zellantworten prozentual häufiger bei einer

akuten HBV-Infektion gemessen werden können. Die Gründe dafür sind unklar, auch

ist bisher nicht eindeutig geklärt, warum die humoralen wie auch die zellulären

Immunantworten im Vergleich mit anderen Strukturantigenen des HBV deutlich

schwächer ausfallen. Die bisher gewonnenen Daten geben aber trotzdem Anlaß zur

Hoffnung, durch eine gezielte, effektive Stimulation spezifische Immunantworten

gegen HBx zu induzieren bzw. bei chronisch infizierten Patienten zu verstärken, um

eine Toleranz des Immunsystems gegenüber diesem Antigen bei der CHB

therapeutisch zu durchbrechen. Dazu bedarf es allerdings weiterhin einer

eingehenden Charakterisierung der HBx-spezifischen Immunantworten, insbesondere

der CTL-Antworten.

♦ In verschiedenen Untersuchungen wurde der 26S Proteasom-Komplex als wichtige

funktionelle Zielstruktur des X-Antigens innerhalb der Wirtszelle identifiziert (83,

121, 122, 250, 319). Interaktionen des X-Proteins mit den Molekülen PSMA7, einer

α-Untereinheit der 20S Proteasomkomponente, und PSMC1, einer ATPase-

Untereinheit der 19S regulatorischen Proteasomkomponente, konnten dabei in vitro

und in vivo demonstriert werden. HBx selbst ist in Ubiquitin-gebundener Form ein

Substrat des Proteasomkomplexes und wird mit einer sehr kurzen Halbwertszeit

hydrolysiert. Weiterhin scheint die intakte Proteasom-Funktion notwendig für die

transaktivatorische Potenz des X-Antigens auf zahlreiche Promotoren zu sein.

Besonders hervorzuheben ist die Erkenntnis, daß HBx alle 3 wichtigen Peptidase-

Aktivitäten des Proteasom-Komplexes zu hemmen vermag und so die

Degradationskapazität Ubiquitin-gekoppelter Proteine als natürliche Substrate des

26S Proteasomes entscheidend reduziert wird; im besonderen ist die chymotrypsin-

artige Aktivität betroffen, welche die wichtigste enzymatische Kapazität der

Proteindegradation innerhalb der Zelle darstellt. Der Proteasom-Komplex ist als

zentrale intrazelluläre Stelle verantwortlich für die nicht-lysosomale

97

Proteindegradation in eukaryontischen Zellen (60). Folglich wird so eine bedeutende

Funktion des Proteasoms bei der Bekämpfung viraler Infektionen in der Zelle negativ

beeinflußt, nämlich die aktive Degradation viraler Proteine sowie die Bereitstellung

von antigenen Peptiden zur Präsentation im Kontext von MHC-Komplexen auf der

Zelloberfläche (226, 243). Insbesondere durch die Induktion von IFN-γ im

Frühstadium einer viralen Infektion wird die zelluläre Synthese von

Proteasomuntereinheiten stimuliert, um schließlich die Peptid-Hydrolysefunktion des

Proteasom-Komplexes zu steigern (85, 90, 162). HBx könnte also auf diesem Wege

die Proteolyse aller HBV-Antigene reduzieren. In der Folge könnte es seine eigene

sowie die Antigenpräsentation aller HBV-Antigene hemmen. Diese Folgerungen

stellen eine mögliche Erklärung für die Beinträchtigung der immunologische

Erkennung HBV-infizierter Zellen dar. In der Konsequenz unterliegen Zellen mit

genomischer Integration des X-ORF und permanenter Expression des X-Proteins

wahrscheinlich einem immunologischen Escaping. Um hier einen Angriffspunkt zu

bieten, könnten diese Hepatozyten durch gezielte Immunstimulation gegen Epitope

des X-Antigens eliminiert werden und so ein Escape Virus-infizierter Zellen bzw.

Zellen mit integriertem HBV-Genom im Stadium der CHB wirkungsvoll bekämpft

werden.

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Tiermodelle zum experimentellen Studium immunologischer Mechanismen einer HBV-

Infektion sind nicht verfügbar, da HBV nur für Menschen und Schimpansen in vivo

infektiös ist, aber nicht unter in vitro Bedingungen. Artverwandte Hepadnaviren wie

DHBV und WHV lassen nur Untersuchungen an Outbred-Spezies wie der Ente und dem

Woodchuck zu, deren Immunsystem nicht ausreichend charakterisiert ist, und so keine

eindeutige Analyse der zellulären Immunantworten gegen HBV-Antigene erlauben.

Um die Induktion humoraler und zellulärer Immunantworten gegen HBx zu untersuchen

und zu testen, inwieweit das X-Proteins als Zielantigen einer therapeutischen Vakzine

zum Einsatz kommen kann, wurde das Prinzip der DNA-Immunisierung mit

Expressionsvektoren des X-Antigens in einem murinen Inbred-System gewählt. Mehrere

98

Studien zeigten, daß diese Methode sehr effektiv ist, um eine humorale und zelluläre

Immunantwort gegen Antigene verschiedener viraler Pathogene, einschließlich HBV, zu

induzieren (siehe Kap 1.3 und Kap. 4.1). Offenbar scheint die DNA-Immunisierung im

Vergleich mit alternativen Vakzine-Strategien wie exogenem rekombinantem Protein

oder rekombinanten Vakzinia-Viren nicht nur effizienter bei der Stimulation von T-

Zellantworten gegen Antigene mit schwacher Immunogenität zu sein, sondern auch ein

deutlich breiteres Spektrum potenziell immunogener Epitope bei Protein-Antigenen zu

präsentieren (238, 239).

Da es uns bisher nicht gelungen war, stabile Transfektanten mit dem X-Protein Antigen-

präsentierender Zellinien in Haplotyp-syngenen murinen Zellen zu erzeugen, wurden

rekombinante Vakzinia-Viren als Target-System für die immunologische

Charakterisierung der CTL-Antworten gewählt. Dieses System bietet eine sehr hohe

Transfektionseffizienz in eukaryontischen Zellinien und ist wegen der endogenen

Prozessierung der exprimierten Antigene hervorragend zur Antigenpräsentation im

Kontext von MHC-Molekülen geeignet (227, 193).

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Die erfolgreiche Klonierung des Expressionsplasmids pcD/3-X vom ayw-Subtyp und des

Vakzinia-Transfervektors für den X-ORF vom adw-Subtyp pSc11-X wurde durch

kommerzielle Sequenzierung beider Vektoren bestätigt. Dabei konnte für beide Vektoren

ein intakter ORF ohne Mutationen demonstriert werden. Ein weiterer, entscheidender

Faktor für die Effizienz von Zelltransfektionen in vitro und in vivo ist der Grad der

Plasmid-DNA Präparationen mit einer hohen Reinheit und einem hohen Anteil

geschlossen zirkulärer DNA (98 %) (66). Aus diesem Grunde wurden die Maxi-

Präparationen der Expressionsvektoren pcDNA/3-X und pRc/CMV-X nach erfolgter

Ethanol-/Isopropanolpräzipitation zum Teil einer weiteren Aufreinigung nach der

Methode der zweifachen Caesiumchlorid-Ultrazentrifugation unterzogen.

In mit den Expressionsplasmiden pRc/CMV-X und pcDNA/3-X transfizierten HUH-7

und G-8 Zellen konnte eine starke Expression des X-Proteins vom adw- und ayw-Subtyp

99

bis über 60 h nach Transfektion nachgewiesen werden. Die Selektion stabiler

Transfektanten der murinen, lymphoiden Zellinien P815 und EL4 mit den X-

Expressionsvektoren mittels Gentamycin-Selektion wurde dennoch trotz zahlreicher

Versuche nicht erreicht. Die Ursache ist sehr wahrscheinlich eine toxische Wirkung der

dauerhaft hohen Expression des Transaktivatorproteins HBx mit seinen pleiotropen

Wirkungen auf intrazelluläre Signal-Transduktionsmechanismen und nukleäre

Promotoraktivitäten der Zellen.

Die Herstellung der rekombinanten Vakzinia-Viren rVV-X-adw und rVV-pSc11 erfolgte

durch mehrfache sequentielle Plaque-Reinigung und kombinierte Selektion der Plaques

über das deletierte Thymidinkinase-Gen sowie das Chromogen X-Gal. Die hohe Reinheit

konzentrierter Maxi-Präparationen der rekombinanten Virusklone ist eine wichtige

Voraussetzung für die Infektion von eukaryontischen Zellinien zur Expression des

inserierten Gens. Es können nämlich nicht nur Verunreinigungen durch das

Selektionsverfahren per se, sondern auch Spontanmutanten im viralen Thymidinkinase-

Lokus mit einer veränderten Wachstumskinetik während der Selektion auftreten. Daher

wurden die rekombinanten Virusklone mit dem Plaque-Assay im CV-1-Monolayer und

ergänzend extrahierte virale DNA mit der PCR-Methode analysiert, welche mit hoher

Genauigkeit (99%) die Reinheit der Präparationen demonstrieren konnte (9, 163). Die

Synthese des X-Proteins durch die rekombinanten Vakzinia-Viren beider Subtypen

konnte mittels Infektionsstudien demonstriert werden. Zur Erzeugung von Targetzellen

muß das Antigen in MCH-Klasse-I exprimierenden Zelllinien endogen synthetisiert

werden. In den H-2d und H-2b restringierten, lymphoiden P815 bzw. EL4 Zellen konnte

nach Infektion mit den rekombinanten Vakzinia-Viren keine Expression des X-Proteins

nachgewiesen werden. Eine sehr hohe Synthese des X-Proteins wurde in den murinen

Fibroblasten MC57G (Haplotyp H-2b) und D2 (Haplotyp H-2d) mit den Vakzinia-Viren

schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt nach Infektion demonstriert. Dies ist

wahrscheinlich Ausdruck der Aktivität des „compound early/late“ Promotors, unter

dessen Kontrolle das X-Protein in den infizierten Zellen exprimiert wird. Die beiden

Fibroblastenlinien eignen sich sehr gut zur MHC-Klasse-I restringierten

Antigenpräsentation bei der Stimulation muriner T-Lymphozyten mit rekombinanten

Vakzinia-Viren (10).

100

Die Suppression der viralen Replikation rekombinanter Vakzinia-Viren mittels UV-

Bestrahlung konnte entsprechend titriert werden, so daß die Expression des X-Antigens

in ausreichender Menge für die MHC restringierte Präsentation in den Targetzellen

erhalten bleibt. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für den Einsatz der Vakzinia-Viren

bei der in vitro Stimulation muriner Lymphozytenkulturen, um eine Kontamination der

empfindlichen T-Zellen zu vermeiden (10, 134, 313). Diese Ergebnisse belegen die

Herstellung und erfolgreiche Testung von zwei rekombinanten Vakzinia-Viren als

effektive Werkzeuge zur immunologischen Untersuchung und Charakterisierung der

beiden häufigsten Subtypen des Hepatitis-B X-Proteins.

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Die in vivo Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die von akut und chronisch mit HBV

infizierten Patienten gewonnenen Daten, daß sich das X-Protein auf B- und T-Zellebene

durch eine schwache Immunogenität auszeichnet. Mit der Methode der intramuskulären

DNA-Immunisierung lassen sich im murinen System abhängig vom genetischen

Haplotyp Antikörperantworten und zum Teil auch schwache T-Zellproliferationen

induzieren. Die Stimulation signifikanter CTL-Antworten gegen X-Epitope ist bei

Mäusen des Haplotyps H-2d sowie H-2b mit dieser Methode nicht gelungen.

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Die Antikörperproduktion wurde nach zweifacher intramuskulärer Plasmid-

Immunisierung untersucht. Die Daten zeigen signifikante Serokonversionsraten bei

zahlreichen Gruppen im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Der Haplotyp der Mäuse

scheint Einfluß auf die Antikörperbildung auszuüben, da es bei den Gruppen mit Balb/c

Mäusen insgesamt zu höheren Serokonversionsraten im Vergleich mit den C57BL/6

Mäusen kommt; ähnliches wurde auch schon nach Vakzinierung von Mäusen mit HBV-

Hüllprotein exprimierenden Plasmiden beobachtet (62, 64). Dieser Effekt wird besonders

deutlich bei den Gruppen, welche adjuvant mit den Zytokinvektoren IL-12 und IL-18

immunisiert wurden. Es wurde kein signifikanter Unterschied bezüglich der beiden

101

Antigensubtypen ayw und adw beobachtet. Jedoch scheinen die beiden adjuvant

applizierten Zytokine IL-12 und IL-18 zu einem positiven Effekt auf die Serokonversion

und Stärke der Antikörperproduktion bei den Balb/c Mäusen zu führen. Die Höhe der

Antikörpertiter nach intramuskulärer Immunisierung mit beiden Subtyp-Plasmiden ohne

adjuvante Zytokinplasmide wurde in einer sehr kleinen Gruppe von Mäusen untersucht.

Hier zeigen sich insgesamt niedrige Antikörpertiter mit signifikanter

Antikörperproduktion bis zu einer Verdünnung der Seren von 1:100. Eine

Vergleichsgruppe wurde einmalig mit rekombinantem X-Antigen ohne Freund´sches

Adjuvans subkutan immunisiert und zeigte darauf keine Antikörperantworten.

Niedrige Antikörpertiter und partielle Serokonversion sind Effekte, welche auch in

verschiedenen Humanstudien beobachtet wurden. Schek et al. berichten, daß ein

bestimmter Prozentsatz HBV-Infizierter keine Antikörperreaktion gegen HBx im

Verlaufe seiner Infektion entwickelt (236). In einer Untersuchung zur Epitop-

Feinspezifität der humoralen Immunantworten konnten zahlreiche Epitope und auch eine

immundominante Region innerhalb der Protein-Sequenz identifziert werden, jedoch

zeigten sich auch sehr heterogene Spezifitäten der Antikörper bei HBV-Patienten. Bei

asymptomatischen HBV-Trägern und akut infizierten Patienten wurden nur sehr niedrige

Titer und wenige Epitope charakterisiert (252). Ursachen für die qualitative und

quantitative Heterogenität der Antikörperantworten könnten die schwache in vivo

Expression von HBx mit seiner kurzen Halbwertszeit, sowie eine schwache

Immunogenität des Proteins aufgrund seiner geringen Größe von nur ca. 17 kD mit

relativ wenigen immunogenen Epitopen sein. HBx wird wahrscheinlich nicht von der

infizierten Zelle sezerniert, sondern ist vielmehr hauptsächlich im Zytosol der Zelle als

Transaktivatorprotein lokalisiert, ein kleiner Anteil scheint auch mit nukleären

Membranen des Zellkerns assoziert zu sein (23, 61, 71, 133, 140, 256).

Über die Mechanismen der Präsentation von HBx bei der Induktion einer humoralen

Immunantwort gibt es keine definitiven Erkenntnisse. Die in dieser Arbeit erzielten

Ergebnisse unterstreichen eine T-Helferzell-abhängige Induktion der humoralen

Immunantwort. Es konnte gezeigt werden, daß bei den Responder-Mäusen vom H-2d-

Haplotyp mit signifikanter Antikörperproduktion auch eine stärkere T-

Zellproliferationsantwort gegen das X-Antigen vom ayw-Subtyp beobachtet werden.

Eine Abhängigkeit der humoralen Immunantworten vom genetischen Haplotyp wurde

102

schon in Studien über humorale Antworten gegen HBV-Hüllproteine und das Core-

Antigen bei verschiedenen murinen „inbred“ Stämmen demonstriert (177, 179). Ebenso

scheint auch beim Menschen eine genetische Prädisposition im Bereich der HLA-Allele

zu existieren, welche bestimmend für die Ausprägung der Antikörperantworten nach

Gabe einer rekombinanten HBV-Vakzine sind (2). Offensichtlich scheint die spezifische

Erkennung eines einzelnen T-Zell-Epitops in Abhängigkeit vom genetischen Haplotyp

zur Aktivierung einer starken T-Helferzellfunktion ausreichend zu sein, welche zu einer

Antikörperproduktion gegen mehrere unterschiedliche B-Zell-Epitope desselben oder

eines anderen HBV-Antigens führen kann (180, 181).

In dieser Arbeit wurde der Effekt einer erhöhten Serokonversionsrate und moderaten

Steigerung der Antikörperproduktion bei den Balb/c Mäusen durch die adjuvante Gabe

von Expressionsplasmiden der TH1-Zytokine IL-12 und IL-18 beobachtet. Kim JJ et al.

fanden eine signifikant erhöhte Antikörperantwort im Zusammenhang mit einer Ko-

Administration des IL-18 Gens, welches sich ansonsten eher durch eine potente

Induktion von IFN-γ sowie der NK-Zellaktivität auszeichnet (138). Hingegen gibt es über

den Einsatz von IL-12-Plasmiden, dem Prototyp der TH1-Zytokine, unterschiedliche

Aussagen über adjuvante Effekte auf die Antikörperproduktion. Chow et al. konnte in

einer Untersuchung mit dem HBsAg eine erhöhte IgM und IgG Produktion mit einer

verstärkten Induktion der IgG2-Subklasse beobachten, was auf eine Aktivierung von

TH1-Zellen hinweist (49). Andere Studien mit viralen Antigenen zeigen demgegenüber

einen negativen Effekt der Ko-Immunisierung mit IL-12 auf spezifische

Antikörperantworten bei simultaner Aktivierung von CD4+ T-Zellantworten vom TH1-

Subtyp und Verstärkung der CTL-Antworten (136, 249).

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Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist die erfolgreiche Stimulation der T-

Zellproliferationsaktivität gegen HBx mittels DNA-Immunisierung im murinen System.

Nach zweimaliger intramuskulärer Immunisierung wurde in der Gruppe der Balb/c

Mäuse ein signifikanter Proliferationsanstieg beobachtet, wenn diese mit dem

rekombinanten X-Antigen vom ayw-Subtyp stimuliert wurden. Dies gelang jedoch nur

bei Mäusen, welche auch mit einem Plasmid vom ayw-Subtyp immunisiert worden

103

waren. In den adw-Gruppen zeigte sich keine signifikante Proliferationsaktivität nach

Stimulation mit dem ayw-Protein, so daß wahrscheinlich keine Kreuz-Reaktivität der

beiden Subtyp-Antigene auf T-Zellebene besteht. Allerdings reagierten in dieser Gruppe

zwischen 60 und 100 % der Balb/c Mäuse mit einer signifikanten Proliferationsantwort,

so daß auch hier Non-Responder vorlagen. Durch die adjuvante Applikation von IL-12-

und IL-18-Plasmiden scheint sich die Responder-Rate leicht zu erhöhen, auf die Stärke

der Proliferationsantworten wurde jedoch kein positiver Einfluß ermittelt.

Möglicherweise liegt diesen Beobachtungen der Effekt der Haplotyp-assozierten

Antigenrestriktion bei der Induktion von CD4+ T-Zellantworten über die MHC-Klasse-II

restringierte Präsentation des X-Antigens zu Grunde. Die Differenzierung der T-

Zellaktivität wurde nicht analysiert, jedoch könnte eine T-Helferzell vermittelte

Aktivierung HBx-spezifischer B-Zellen wahrscheinlich sein, da parallel zur

Proliferationsaktivität in der Gruppe der Balb/c Mäuse auch eine Induktion von

Antikörperantworten gemessen wurde.

Jung et al. berichten in der bis dato einzigen Studie über spezifische T-Zellantworten

vom CD4+ T-Zelltyp gegen HBx-Epitope bei akut und chronisch HBV-infizierten

Patienten. Ihnen gelang es, die T-Zellspezifität mit synthetischen Peptiden und

rekombinantem Antigen sowie durch die Etablierung von T-Zellklonen zu

charakterisieren. Die Stärke der Proliferationsaktivität fiel in dieser Untersuchung im

Vergleich mit dem hochimmunogenen Core-Antigen deutlich schwächer aus. Da keine

Differenzierung der CD4+ T-Zellantworten vorgenommen wurde, läßt sich auch in dieser

Arbeit nur über die Funktion der HBx-spezifischen T-Zellen in vivo spekulieren.

Allerdings scheinen sich einige der T-Zell Epitope mit bereits charakterisierten B-Zell

Epitopen zu überlappen, welche in einer immundominanten Region lokalisiert sind (127,

252). Untersuchungen zur B- und T-Zellfeinspezifität bei den HBV-Hüllproteinen mit

rekombinanten Vakzinen erbrachten aufschlußreiche Erkenntnisse über die Interaktion

von T-Helferzell- und B-Zellepitopen und die Abhängigkeit der T-Zellantworten vom

genetischen Haplotyp sowie vom Subtyp der viralen Antigene (178, 182, 183). So konnte

im murinen System u.a. gezeigt werden, daß die T-Zellerkennung von Epitopen des pre-

S2-Antigens je nach H-2 Haplotyp und adw bzw. ayw-Subtyp der Antigene variiert und

der Responder-Status der T-Zellen davon abhängig ist.

104

Bei der Untersuchung der Proliferationsaktivität weiterer Mäuse-Gruppen mit

modifizierten Immunisierungs-Schemata zeigten sich in der vorliegenden Arbeit nur bei

einzelnen Balb/c und C57BL/6 Mäusen überwiegend schwache Proliferationsantworten.

Zum Vergleich wurde eine kleine Gruppe (n=2) einmalig mit rekombinantem X-Protein

subkutan immunisiert. Es konnte keine signifikante Proliferationsaktivität bei diesen

Mäusen gemessen werden - ein weiterer Hinweis auf die schwache Immunogenität des

X-Proteins bzw. ein schlechtes Ansprechen auf eine singuläre Applikation.

Insgesamt gesehen ist dies die erste Untersuchung einer Induktion von zellulären

Immunantworten gegen HBx in einem murinen inbred-System. Die gemessenen

Resultate zeigen sehr schwache Antigen-spezifische T-Zellantworten nach mehrfacher

DNA-Vakzinierung im Vergleich mit den anderen HBV-Strukturproteinen. Eine

Abhängigkeit der T-Zellantworten vom genetischen Haplotyp und vom Virus-Subtyp

scheint wahrscheinlich zu sein. Darüber hinaus gibt es auch Hinweise auf die Interaktion

von T-Helferzellantworten auf die HBx-spezifische B-Zellaktivität. Um diese

Hypothesen zu bekräftigen, sind weitere Untersuchungen zur Epitop-Feinspezifität und

zum Zytokinexpressionsmuster der spezifischen T-Zelleffektoren erforderlich. Auch

bleibt noch die Klärung der schwachen Intensität der Immunantworten. Zum einen

könnte die in vivo Expression des X-Antigens nicht ausreichend für ein effektives

Priming sein, wobei in dieser Studie alle Expressionsvektoren bei der DNA-

Immunisierung mit starken CMV-Promotoren ausgestattet waren. Vorstellbar ist auch

eine eingeschränkte Immunogenität aufgrund der geringen Größe des X-Proteins mit

potenziell weniger Epitopen als z.B. beim Core-Antigen. Über die Zell-assoziierte

Antigenpräsentation von Epitopen des X-Proteins in HBV-infizierten Zellen gibt es

bisher auch keine Klarheit, so daß durch die zahlreichen intrazellulären Interaktionen und

Transaktivatorfunktionen des X-Proteins auch eine Inhibition von Funktionen der

Antigenpräsentation denkbar wären, wie z.B. der Prozessierung von Peptiden im

Proteasom-Komplex (s.o.).

105

*!*!) �=E��

Der Nachweis muriner, HBx-spezifischer zytotoxischer T-Zellantworten nach in vitro

Stimulation der Lymphozyten mit Vakzinia infizierten syngenen Splenozyten konnte im

Chrom-Release-Assay nicht gezeigt werden. Es wurden mehrere Versuche mit

unterschiedlichen Prime/Boost Strategien durchgeführt, zunächst erhielten die Mäuse

zweimal i.m. DNA-Immunisierungen nach Vorab-Injektion von 0,25 %igem Bupivacain.

Die Mäuse wurden je nach Kohorte auch mit IL-12 und IL-18 Expressionsplasmiden ko-

immunisiert. Eine weitere Gruppe wurde mit IL-12 und GM-CSF ko-immunisiert.

Schließlich wurde auch eine mehrfache Immunisierung mit 2-maliger Boosterung

getestet. Es wurden jeweils Mäuse beider Haplotypen H-2b und H-2d mit beiden

Antigensubtypen HBx-adw und HBx-ayw untersucht.

In keiner der untersuchten Kohorten zeigte sich eine HBx-spezifische CTL-Aktivität

gegen eines der Antigensubtypen. Allerdings konnten bei einzelnen Individuen

unspezifische Lyse-Aktivitäten mit dem Chrom-Release-Assay dargestellt werden,

welche wahrscheinlich auf eine NK-Zellaktivität (Natürliche Killerzellen) in der

untersuchten Lymphozyten-Population zurückzuführen sind. Dies ist ein deutlicher

Hinweis, daß der Cr-Release-Assay selbst fehlerfrei durchgeführt wurde. Auch wurden

entsprechend hohe Effektor:Target (E:T) Verhältnisse von bis zu 100:1 gewählt, welche

zum Nachweis schwacher spezifischer Aktivitäten notwendig sind.

Eine mögliche Erklärung für den fehlenden Nachweis spezifischer CTL-Aktivitäten in

dieser Arbeit ist der Einsatz des Vakzinia-Virussystems bei der Erzeugung von

spezifischen Stimulator- und Targetzellen zur in vitro Stimulation und Messung der

spezifischen Lyse durch die Effektorzellen. Auch unter Verwendung einer entsprechend

hohen Multiplizität zur Infektion der Stimulator- und Targetzellen kommt es

wahrscheinlich nicht zur Expression der Antigene in der Gesamtzahl der eingesetzten

Zellen, wie es bei einem stabilen Transfektanten der Fall ist. Trotz der sorgfältigen

Titration der UV-Inaktivierung zur Unterdrückung der Virusreplikation kann zudem

nicht 100%ig ausgeschlossen werden, daß während der 5-tägigen Stimulationsphase eine

Virus induzierte Zytotoxizität in der Zellkultur auftritt. Nimmt man diese Faktoren

zusammen mit der bereits oben diskutierten, schwachen Immunogenität des X-Antigens

(siehe Kap. 1.4., Kap. 4.1.1), so läßt sich daraus folgern, daß eventuell schwache CTL-

106

Antworten durch ein nicht optimal sensitives Detektionssystem nicht nachgewiesen

werden konnten. Insbesondere der Nachweis von humoralen und T-Helferzellantworten

gegen das HBx-Antigen in dieser Arbeit konnte demonstrieren, daß ein effizientes

Priming mit der Methode der DNA-Immunisierung zumindest auf der Ebene der B-

Zellen und CD4+ T-Zellen gegen HBx im murinen System möglich ist. Unterstützt wird

diese Hypothese durch den Nachweis von durchgängig sehr schwachen CTL-Antworten

gegen das murine AFP-Antigen in der Maus mit dem Vakzinia-Virussystem bei der

Stimulation der Effektorzellen und beim Einsatz als Targetzellen im 51Cr-Release-Assay

(103). Auch konnte bereits bei anderen HBV-Antigenen gezeigt werden, daß die

Methode der DNA-Immunisierung beim Priming von CTL-Antworten gegen schwach-

immunogene Anitgene im murinen System anderen Vakzine-Strategien durchaus

überlegen sein kann (238, 239). Die Haplotypen-spezifische MHC-Restriktion der HBx-

Epitope könnte ebenfalls ein Problem bei der Antigenerkennung bzw. dem Priming von

CTLs sein. Weitere Studien im Labor von Dr. Geißler mit spezifischen H-2 Konsensus-

Peptiden zur in vitro Stimulation der murinen Lymphozyten konnten aber ebenfalls keine

signifikanten H-2d oder H-2b restringierten CTL-Antworten nachweisen.

Eine weitere mögliche Erklärung für die schlechte Immunogenität von HBx auf der CTL-

Ebene liefert die jüngst bekannt gewordene Interaktion des X-Proteins mit dem

Proteasom-Komplex (Kap. 1.4.1, Kap. 4.1.1, 121, 122, 319). Durch eine Hemmung der

Peptidase-Funktionen des Komplexes könnte das X-Protein die Bereitstellung von

Antigenpeptiden zur Präsentation im Kontext von MHC-Komplexen auf der

Zelloberfläche verhindern. Für diese Hypothese spricht, daß es bisher nicht gelungen ist,

CTL-Antworten im humanen System auf dem Wege der endogenen Prozessierung des X-

Proteins nachzuweisen (51). Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte in vitro

Stimulation und die CTL-Assays funktionieren mit dem Vakzinia-Vektorsystem

ebenfalls auf dem Weg der endogenen Antigenprozessierung. Die postulierte Inhibition

der Peptidase-Aktivitäten des Proteasom-Komplexes könnte so als zentrale Schaltstelle

der Antigenprozessierung die MHC-Klasse-I restringierte Präsentation von

immunogenen Peptiden des X-Proteins ausschalten und damit die spezifische Erkennung

und konsekutive Lyse durch aktivierte zytotoxische T-Zellen verhindern. Zur Erhärtung

dieser Hypothese sind aber weitere Studien in in vivo Modellen notwendig.

107

Daher wäre es ein vielversprechender Ansatz, den kürzlich entdeckten, sogenannten

alternativen Weg der Antigenprozessierung und Peptidbeladung der MHC-Klasse-I

Moleküle („alternate pathway“) zur Präsentation des X-Antigens auszunutzen. Dabei

können Antigene gebunden an das zytoslische 70-kDa schwere Hitzeschockprotein

hsp73 direkt über eine Prozessierung im Post-Golgi-Kompartement auf MHC-Klasse-I

Moleküle geladen werden (224, 240). Auch exogen zugeführtes Antigen bzw.

Peptidfragmente eines Antigens können so der endogenen Prozessierung und MHC-

Klasse-I Präsentation zugeführt werden (258). Mit Hilfe von Fusionsproteinen, bestehend

aus Antigen bzw. immunogenen CTL-Epitopen eines Antigens und dem hsp70-

Hitzeschockprotein aus dem Mycobacterium tuberculosis, entweder in als Protein- oder

DNA-Vakzine bzw. mit anderen Delivery-Systemen appliziert kann die zelluläre, CD8+

Immunität deutlich gesteigert und eine bis zu 30-fache Potenzierung der MHC-Klasse-I

restringierten Präsentation erreicht werden (44, 157, 259, 260). Diese Strategie wird

augenblicklich im Labor von Dr. Geißler in Zusammenarbeit mit Prof. Reimann,

Universität Ulm verfolgt.

�� ,2,13)&'$+&'$2) :$1

Wie bereits oben dargelegt, ist die Induktion einer starken, CD8+ zytotoxischen T-

Zellantwort besonders wichtig für die Entwicklung einer erfolgversprechenden

Immuntherapie der chronischen Hepatitis-B-Virus Infektion. Die in dieser Arbeit

durchgeführten Untersuchungen konnten mit der Methode der DNA-Immunisierung im

Mausmodell keine signifikanten, spezifischen CTL-Antworten gegen das X-Antigen im51Chrom-Release-Assay nach in vitro Restimulation der murinen Lymphozyten

nachweisen. Da dies möglicherweise ein Problem der Sensitivität des Assays per se bzw.

des Vakzinia-Vektorsystems zur Infektion der Stimulator-/Targetzellen sein kann,

könnten sich hier neue, hoch-effiziente Methoden für zukünftige Versuche zur Messung

MHC-Klasse-I restringierter CD8+ T-Zellen anbieten. Solche Systeme können deutlich

sensitiver als der 51Cr-Release-Assay direkt ex vivo Antigen-spezifische CTLs bei sehr

niedrigen Prekursorzell-Zahlen ohne zusätzliche in vitro Restimulation bereits nach

einmaliger i.m. Applikation einer DNA-Vakzine nachweisen. Dazu gehört u.a. der

ELISPOT-Assay, welcher Epitop-spezifische, zytotoxische T-Zellen über die lokale

108

Produktion bestimmter Zytokine, u.a. IFN-γ, die durch einen Antikörper-gekoppelten

Substrat-Chromogen Komplex visualisiert werden, quantifizieren kann (171, 263).

Vergleichende Arbeiten zeigen, daß diese Assays etwa 10- bis 100-fach sensitiver im

Nachweis von CTLs als bisher eingesetzte Methoden sind, da solche nur die Fraktion der

CTLs messen, welche in vitro proliferieren können und wahrscheinlich nur den T-

Gedächtniszellen entsprechen (194).

Ein weiteres, erst kürzlich entwickeltes Verfahren zur quantitativen und funktionellen

Analyse MHC-Klasse-I restringierter T-Zellen ist das System der MHC-Peptid

Tetramere (3, 35, 91). Diese Technik basiert auf der Multimerisierung von MHC-Peptid

Komplexen, welche so eine erhöhte Gesamtavidität zu den T-Zellrezeptoren besitzen.

Diese werden zur Antigen-spezifischen Markierung von zytotoxischen T-Zellen über die

Interaktion MHC-Klasse-I Molekül und T-Zellrezeptor benutzt. Die markierten T-Zell-

Tetramere können schließlich in der Durchflußzytometrie identifiziert und quantifziert

werden und über zusätzliche Antikörpermarkierungen wahlweise phänotypisch und

funktionell (Oberflächenmarker, Zytokinrezeptoren etc) sowie in ihrer klonalen Spezifität

analysiert werden. Mit dieser sensitiven Methode liess sich u.a. zeigen, daß die Zahl

Antigen-spezifischer T-Zellen während einer akuten Infektion viel größer ist als bisher

angenommen wurde; sie umfaßt beispielsweise bei der LCMV-Infektion von Mäusen bis

zu 50% des gesamten Repertoires an CD8+ T-Zellen. Mit dieser Technik können so

elegant und sehr schnell Studien zur T-Zellimmunität an direkt ex vivo entnommenen

Lymphozyten durchgeführt werden. Voraussetzung ist allerdings die Kenntnis

immundominanter Epitope eines Antigens, da die Tetramere Epitop-spezifisch hergestellt

werden müssen. Daher wäre es zunächst sinnvoll, über die Konsensusanalyse bestimmter

Haplotypen solche immundominanten Regionen innerhalb der Peptidsequenz des X-

Proteins zu identifizieren. So könnten dann die T-Zellpopulationen nach Priming mit

einer HBx-Vakzine auf eine Peptid-spezifische T-Zellaktivität untersucht werden. Dies

liesse sich mit einem herkömmlichen 51Cr-Release-Assay nach Peptid-spezifischer in

vitro Stimulation bzw. mit dem ELISPOT-Assay durchführen. Zur Optimierung des T-

Zell Primings könnte man schließlich auch die Vakzine selbst modifizieren, u.a. mit den

oben beschriebenen hsp70-Fusionsvektoren oder mit einer starken, TH1-gewichteten

Induktion durch entsprechende Ko-Immunisierung (siehe Kap. 1.5.2).

109

� ��9��

In der vorliegenden Arbeit wurde die Immunogenität des Hepatitis-B X-Antigens im

murinen System mit der Methode der intramuskulären DNA-Vakzinierung im Hinblick

auf die Entwicklung einer effizienten Immuntherapie der chronischen HBV-Infektion

sowie des HBV-induzierten HCCs untersucht. Das X-Antigen spielt wahrscheinlich über

zahlreiche Interaktionen eine wichtige Rolle bei der Etablierung der chronischen HBV-

Infektion und der HCC-Genese. Im Serum HBV-infizierter Patienten wurden bereits

einzelne Epitope des X-Antigens auf humoraler und T-Helferzell-Ebene in verschiedenen

Studien charakterisiert. Neuerdings gibt es auch Hinweise für HBx-spezifische CTL-

Antworten im humanen System. Zunächst wurden HBx-Expressionsplasmide der beiden

häufigsten HBV-Subtypen ayw und adw kloniert und die entsprechenden Antigene in

eukaryontischen Zellen exprimiert. Um eine effiziente MHC-Klasse-I Präsentation des

X-Antigens zu erreichen, wurden HBx-spezifische Vakzinia-Viren mittels homologer

Rekombination hergestellt und selektioniert. Die Expression der rekombinanten

Vektoren wurde in murinen Haplotyp-syngenen Zellinien getestet. Weiterhin wurde die

optimale UV-Dosis zur Inaktivierung der Replikation rekombinanter Vakziniaviren

titriert. C57BL/6 und Balb/c Mäuse wurden mit den HBx-Expressionsvektoren sowie

adjuvant mit den Zytokin-Vektoren IL-12 und IL-18 immunisiert. Die Antikörper-

Analyse immunisierter Mäuse mit dem ELISA-Verfahren zeigte eine präferentielle

Induktion von HBx-spezifischen Antikörpern in Balb/c Mäusen mit leicht erhöhter

Serokonversionsrate bei Ko-Administration von IL-12- und IL-18. Bei Balb/c Mäusen

wurden überwiegend schwache T-Helferzellantworten nach Immunisierung mit dem

ayw-Subtyp beobachtet. Insgesamt konnte die gleichzeitige Induktion einer signifikanten

Antikörperantwort sowie einer T-Helferzellantwort bei Balb/c Mäusen mittels DNA-

Immunisierung demonstriert werden. Der Nachweis einer signifikanten CD8+

zytotoxischen T-Zellantwort gegen HBx-spezifische Epitope beider Subtypen ist weder

in Balb/c noch in C57BL/6 Mäusen mit der Methode der intramuskulären DNA-

Immunisierung gelungen. Mit der Herstellung rekombinanter Vakzinia-Viren und der

Klonierung von Expressionsvektoren der beiden X-Antigene liefert diese Arbeit wichtige

Grundlagen für zukünftige immunologische Studien mit dem X-Antigen.

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147

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In erster Linie möchte ich mich bei Herrn PD Dr. Geißler für die Überlassung des

Themas, seine intensive praktische und theoretische Betreuung meiner Arbeit und

kritische Korrektur bei der Abfassung der Dissertation bedanken.

Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Blum danke ich für die herausragenden

Arbeitsbedingungen in seiner Abteilung und seine Begutachtung der Dissertation.

Ebenfalls möchte ich Herrn Prof. Dr. Pircher für die Begutachtung meiner Arbeit danken.

Mein besonderer Dank gilt meinem Freund und Mitstreiter Christian Mauch sowie allen

Mitarbeitern aus dem Labor B3.

Allen übrigen Mitarbeitern der B-Labors in der Medizinischen Universitätsklinik,

Freiburg, namentlich Sabine Bleul, Frau Dr. Dörte Ortmann, Sabine McNally, Dr. zu

Putlitz, PD Dr. von Weizsäcker, Dr. Köck, PD Dr. Moradpour, Prof. Dr. Nassal, Dr.

Baumert danke ich herzlich für die Unterstützung bei meiner Arbeit.

Für die gute Kooperation und methodische Unterstützung bei der Arbeit mit

rekombinanten Vakzinia-Viren möchte ich mich bei Herrn Dr. Jürgen Haussmann,

Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Freiburg, bedanken.

Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik

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