Ausgewählte biophysikalische Methoden zur Analyse von Pflanzen (II):

UV/VIS-Spektroskopie - von der Pigmentanalyse bis zur

Quantifizierung von mRNA

Chlorophyll

S0

S2

S1T1

h·ν

h·ν

intersystem crossing

absorption

absorptionfluorescence

intersystem crossingintersystem crossing

phosphoresscence

intersystem crossing EET

Voraussetzung der Messung von UV/VIS-Spektren: Lichtabsorption, Beispiel Chlorophyll

Pigmentbestimmung in Extrakten:moderne UV/VIS-spektroskopische Methode

Prinzip: UV/VIS-Spektren wurden bei Kalibration (publizierte Datenbank!) in mathematische Gleichungen überführt. Eine Summe dieser Gleichungen wird incl. automatischer Korrekturfaktoren für Basislininedrift, Wellenlängenungenauigkeit und Trübung an Extraktspektrum angepasst (“gefittet”).

Pflanzen werden vor der Messung gefriegetrocknet und dann mit 100% Aceton extrahiert.

Metallgehalt:Atomabsorptions-Spektroskopie (AAS)

Prinzip: Metallionen haben spezifisches Linien-Absorptionsspektrum im UV/VIS-Bereich.

Pflanzen werden vor der Messung mit Säure verdaut

Messung von in vivo / in situ-UV/VIS-Spektren (nicht bildgebend)

Warum in vivo / in situ?--> Direkte Korrelation mit physiologischen Parametern möglich--> keine Extraktionsartefakte--> Messung an einzelnen Zellen möglich--> Hohe Zeitauflösung bei Messung von Kinetiken

Nachteile gegenüber der Messung von Extrakten:--> viele überlappende Banden desselben Pigments durch Proteinbindung--> Banden sehr breit--> Extinktionskoeffizienten in vivo meist unbekannt --> meist keine absolute Quantifizierung

Beispiel 1 zur Anwendung von zeitaufgelösten in vivo-Fluoreszenzspektren:

Regulation der Photosynthese für die Stickstoff-Fixierung in Trichodesmium

Methoden der Analyse von in vivo-Spektren: Dekonvolution

Quelle: Lehrbuch (Lawlor, 1990, Thieme Verlag)

Beispiel 2 zur Anwendung von spektral aufgelösten in vivo-Fluoreszenzkinetiken: Änderungen der Fluoreszenzkinetik-

Parameter unter Schwermetallstress

Küpper H, Aravind P, Leitenmaier B, Trtilek M, Šetlík I (2007) New Phytol., 10.1111/j.1469-8137.2007.02139.x.

Beispiel zur Anwendung von in vivo-Absorptionsspektren:Bildung von Cu-Chl bei Kupferstress (und Pheo bei Ansäuerung)

Küpper H, Küpper F, Spiller M (1998) Photosynthesis Research 58, 125-33

Elodea canadensis

Ectocarpus siliculosus

Antithamnion plumula

Küpper H, Šetlík I, Spiller M, Küpper FC, Prášil O (2002) Journal of Phycology 38(3), 429-441

Bildgebende in vivo-VIS-Spektroskopie: moderne Methoden der Fluoreszenzmikroskopie

Methoden--> Trennung von Chromophoren über “linear unmixing”--> FRET--> Messung physiologischer Vorgänge über spez. Fluoreszenzfarbstoffe--> FRAP--> FCS--> QISH--> GFP etc.

Wichtige Voraussetzungen und Fakten--> Apertur vs. Lichtsammlung--> richtige Messung--> Überlapp und Trennung von Signalen

medium inlet medium

outletglass window (0.17 mm thick); sample is placed between this window and the layer of cellophan

o-rings (silicon rubber) layer of cellophan

Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskopsfür physiologische Messungen an lebenden Zellen:

Präparat unter physiologischen Bedingungen halten!

Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570

Entscheidend bei der Nutzung eines Mikroskopsfür physiologische Messungen an lebenden Zellen:

NICHT ZUVIEL LICHT! --> Lichtintensität bestimmen!

Lens Light fielddiameter

Measuringirradiance

Actinicirradiance

Saturatingirradiance

[mm] [µmol m-2 s-1] [µmol m-2 s-1] [µmol m-2 s-1] 6.3×/0.20 2.90 0.006 686 524 16×/0.40 1.06 0.026 2835 2167 25×/0.63 0.67 0.075 8295 6332 40×/0.95 0.38 0.200 22058 16904 63×/0.95 0.23 0.270 30311 23218100×/1.30 0.16 0.270 29441 22546

Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570

numerische Apertur NA = I * sinus q

I = Brechungsindex des Mediumsq = halber Öffnungswinkel des Objektivs

Apertur

Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer: Apertur bestimmt Effizienz der Lichtsammlung

Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer:

Korrekte Einstellung von Hintergrund und Verstärkung

Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer:

korrekte Eichung / Bestimmung der LinearitätP

ixel

gre

y va

lue

Irradiance [%]0.1 1 10

1

10

100Model: y = ax + b

Levenberg-Marquardt, statistical weighting

χ2 = 0.10176

a = 10.261 ± 0.157

b = -0.039 ± 0.069

Küpper H, Šetlík I, Trtilek M, Nedbal L (2000) Photosynthetica 38(4), 553-570

Wichtiger Faktor bei der Nutzung eines Mikroskops alsSpektrometer: Überlapp von Absorptions-/Emissions-Banden

Preliminary tests with GFP in young leaves of Arabidopsis thaliana

Fluorescence observed through GFP filterset

NON-transformed plant...

All the signal was AUTOFLUORESCENCE

Epidermis

40 μm

Mesophyll

Nutzung überlappender Abs/Em-Banden für FluorescenceResonanceEnergyTransfer (FRET)

Voraussetzungen für FluorescenceResonanceEnergyTransfer(FRET)

Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (I): Kalibration

Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished

Transmission (Hellfeld, Phasenkontrast, ...):

Information über Struktur

FDA-Fluoreszenz:

Vitalitätstest

Rhod5N-Fluoreszenz:

Cadmium-Aufnahme

Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (II): Anwendungsbeispiele, bildgebend

Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished

Messung physiologischer Vorgänge über Fluoreszenzfarbstoffe (III): Anwendungsbeispiel quantitativer Daten

Rhod5N-Fluoreszenzkinetik: Cadmium-Aufnahme

Leitenmaier B, Küpper H, (2008) unpublished

Bildgebendes „holeburning“: FluorescenceRecoveryAfterPhotobleaching (FRAP)

FluorescenceCorrelation

Spectroscopy(FCS)

FluorescenceCorrelation

Spectroscopy (FCS) II

--> info about molecular concentration, brightness, diffusion,

and chemical kinetics

Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) III

Quantitative mRNA in situ hybridisation (QISH):overview of the method

cut out

max. 2x5 mm

vacuum infiltrate with alkaline fixation solution

extract pigments and dehydrate

extract hydrophobic compounds

digest proteins

hybridise with fluorescent

oligonucleotides

rehydrate

postfixate

quantify record images in CLSM extract and quench background

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

ZNT1 in young leaves of Thlaspi caerulescens Prayon:comparison of different QISH hybridisation probes

overlays of green autofluorescence and red fluorescence of ZNT1-probes

full-length antisense RNA probe fragmented (200 b) antisense RNA probe 34 b synthetic oligonucleotide

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

QISH vs. nicht-normiermte detektion: Effekte der Gewebe-Optik

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

Regulation der ZNT1 Transkription analysiert über QISH

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187

spon

gy m

esop

hyll

phloe

mbu

ndle

shea

thpa

lisad

e mes

ophy

ll

epide

rmal

metal s

torag

e cell

s

epide

rmal

subs

idiary

cells

epide

rmal

guard

cells

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

c(ZN

T1 m

RN

A) /

c(1

8s rR

NA

) 10 µM Zn2+ Thlaspi caerulescens 10 µM Zn2+ Thlaspi arvense 1 µM Zn2+ Thlaspi arvense

transform Agrobacterium with the constructs

transfrom plants by agrobacteriuminfection (floral dip with or without

vacuum infiltration)

select healthy (resistant) seedlings

prepare tissue pieces or whole mounts

germinate seeds of transformed plants on selective medium(e.g. agar containing Kanamycin)

select for YFP expression

quantify record images in CLSM

promoter

EYFP

Construct vectors for plant transformation

Qualitative Beobachtung der Transkription&Translation in vivoüber fluoreszierende Proteine

35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana:epidermis

Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence

Trichome base, epidermal cells and stoma Trichome

35S promoter in young leaves of Arabidopsis thaliana:mesophyll

Overlays of green autofluorescence, red (chlorophyll) autofluorescence and yellow YFP fluorescence

Clone with high YFP expression Clone with medium YFP expression

Comparison of our in situ hybridisation method

with promoter-GFP/YFP/DsRed/... constructs

In situ hybridisation

- Easy cellular quantification because whole cells are labelled

- No macroscopic (whole plant) quantification possible because of diffusion limits

- Low background fluorescence because chlorophyll, carotenoids, flavonoids and many further fluorescent

compounds are extracted

- No direct comparison of gene expression with physiology because samples are fixed (dead)

- Very fast: Ordering the fluorescently labelled oligonucleotides takes 1-2 weeks, the hybridisation

procedure itself takes 3 days

- All plants can be analysed ( Thlaspi work)

Fluorescent proteins

- Quantification on a cellular level difficult because only the narrow ring of cytoplasm is labelled

- Macroscopic (whole plant) observation and quantification easily possible with fluorescence measuring camera (so far only tested with GFP)

- High background fluorescence because all autofluorescent compounds are present in the samples

- Direct comparison of gene expression with physiological parameters (photosynthesis, electrophysiology) possible because samples are alive

- Very time-consuming because of the cloning, transformation and plant growth/selection steps;

- The plant has to be transformed ( Arabidopsis)

- The gene sequence has to be known - The promoter has to be cloned

Küpper H, Seib LO, Sivaguru M, Hoekenga OA, Kochian LV (2007) The Plant Journal 50(1), 159-187