Berichte des Forschungszentrums Jülich

Berichte des Forschungszentrums Jülich

3546

Funktionelle und stmkturelie Eigenschaftendes ®- itochondrialen Phos . - hatcarriers ausSaccharo- ces cerevisiae

Andreas 5chroers

Berichte des Forschungszentrums Jülich ; 3546ISSN 0944-2952

Institut für Biotechnologie Jü1-3546

D61 (Diss. Universität Düsseldorf)

Zu beziehen durch : Forschungszentrum Jülich GmbH - ZentralbibliothekD-52425 Jülich - Bundesrep ublik Deutschland

02461161-6102 - Telefax : 02461161-6103 - e-mail : zb-publikation@fz-juelich .de

Abstract

S tru cture l and functional properties of the mitochondria! phosphate carrier fromSaccharomyces cerevisiae

Uptake of inorganic phosphate into mitochondria is essential for energy metabolism . The

import of phosphate into the mitochondrial matrix is mediated by the phosphate carrier (PIC),

a 32 kDa protein which catalyzes the electroneutral import of phosphate (H 2PO4) compen-

sated by the antiport of a hydroxyl ion . We have expressed wild type and mutant PIC from

yeast mitochondria in Escherichia coil inclusion bodies . PIC was solubilized from inclusion

bodies, purified and reconstituted into proteoliposomes in a functionally active form.

The mitochondrial phosphate carrier (PIC) belongs to the mitochondrial carrier family

(MCP) . Members of this family comprise six transmembrane segments and have been

shown to exist as dimers in the solubilized state. Beneath the strictly coupled transport-

functions of the PIC there is an uncoupled transport mode which can be observed after mo-

dification of the carrier with HgCl 2. After the analysis of mutants in which the three cysteines

of the wt-PIC were exchanged with serine, the modification of the cystein residue in position

28 turned out to be the trigger for uncoupling . By the introduction of amino acids different in

size and in charge in position of cystein 28 a positive charge was found to be responsible for

the induction of the uncoupled efflux mode.

In order to investigate a functional necessity of the dimerization and the molecular me-

chanism of coupling, we have developed a method to isolate tagged proteins as monomers,

to construct defined dimers from these monomers, and to isolate specific dimeric forms . By

functional analysis of heterodimers consisting of functionally different monomers the follo-

wing conclusions can be drawn : (i) Dimerization is essential for functionality, (ii) formed

dimers are stable, (iii) there is functional crosstalk between the subunits of the dimer. (iv)

modification (mutation) of one monomer is sufficient for uncoupling . Furthermore the functio-

nal analysis of heterodimers with different amino acids in position 28 provided evidence for

one single pathway within the functional active dimer.

9

Inhaltsverzeichnis

Seite

1 Einleitung

1 .1 Funktion von Mitochondrien - Stofftransport durch mitochondriale Carrier 51 .2 Die Strukturfamilie der mitochondrialen Carrier 71 .3 Kinetische Eigenschaften des mitochondrialen Phosphatcarriers 91 .4 Uniportinduktion - Entkopplung auf molekularer Ebene 101 .5 Die funktionelle Einheit der mitochondrialen Carrier 121 .6 Zielsetzung der durchgeführten Studien 13

2 Material und Methoden 14

2.1 Material 142 .2 Allgemeine Präparationen 15

2.2 .1 Präparation des PIC aus Rinderherzmitochondrien 15

2.2 .2 Präparation der Phosphatcarriers aus inclusion bodies 162.2.3 Rekonstitution des Phosphatcarriers 16

2.3 Analytische Methoden 17

2.3 .1 Bestimmung der Transportaktivität 172 .3 .1 .1 Vortauschtechnik 172.3 .1 .2 Rücktauschtechnik 19

2.3 .1 .3 Quecksilberinduzierter Uniport (Efflux) 192 .3 .1 .4 Bestimmung des aktiven lnnenvolumens 20

2.3.2 Proteinbestimmungen 20

2.3 .3 Polyacrylamidgelelektrophorese 21

2.3.4 Western-Blot-Analyse

2 .4 Spezielle Methoden 21

2.4 .1 Einstellung/Bestimmung der externen Osmolalität 21

2.4 .2 Chemische Modifizierung des PIC 22

2.5 Molekularbiologische Arbeiten 22

2.5 .1 Nährmedien und Kuitrvierungsbedingungen fur E. coif 22

2.5.2 Isolierung von DNA 22

2.5.3 Restriktion und Modifikation von DNA 23

2.5.4 Transformation von E. col/ 23

2 .5 .5 Generieren der tags durch PCR 23

2 .5 .6 Ortspezifische Mutagenese 24

2.5 .6.1 DNA-Seguenzierung 25

2.6 Dialyse 26

2.7 Chromatographische Methoden 26

2

3 Ergebnisse 27

3.1 Charakterisierung der Cysteinmutanten des PIC 27

3.1 .1 Wirkung von Inhibitoren 28

3.1 .2 Eine alternative Inhibitionsmethode 23

3.1 .3 Die physiologischen Transporteigenschaften der Cysteinmutanten 30

3.1 .4 Untersuchungen zur Effluxinduzierbarkeit 32

3 .1 .5 Einflüsse von Substratanaloga 33

3.2 Konstruktion und Analyse von Punktmutanten mit verschiedenen AS an Position von

Cystein 28 35

3 .2 .1 Allgemeine Eigenschaften der Mutanten 35

3.2.2 Efflux unphysiologischer Substrate 36

3.3 Lysin-scanning Mutagenese 38

3.3.1 Abhängigkeit des Pi7OH --Antiports von einem pH-Gradienten : 40

3.4 Konstruktion von Heterodimeren 43

3.4.1 Dialyse 44

3.4 .2 SLS-Gelelektrophorese 46

3.4 .3 Chromatographie Isolierung eines Heterodimers 48

3.4 .4 Entwicklung einer alternativen lsolierungsprozedur 51

3.4 .5 Heterodimerer PIC - Gezielte Inaktivierung von Monomeren 52

3.4 .5 .1 Inhibition des PICsc durch NEM 52

3.4.5.2 Konstruktion eines halbseitig inaktivierten Dimers 54

3.4.6 Dynamik des Monomer-Dinier Gleichgewichts 57

3.4.7 Analyse spezieller Heterodimere 58

4 Diskussion 60

4.1 Analyse von PlCsc -Mutanten 60

4 .1 .1 Grundlegende funktionelle Eigenschaften 60

4 .1 .2 Funktionsänderung durch chemische Modifizierung der Cysteinreste 61

4.1 .3 Zugänglichkeit der Cysteinreste 62

4.1 .4 Molekulare Voraussetzungen zur Kopplung von Substratgradienten 63

4.1 .5 Spekulationen zu Kopplung und Transportmechanismus 3

4 .1 .6 Protonenentkoppelter Phosphattransport 64

4.1 .7 Ursachen und mögliche physiologische Relevanz des Uniports 65

4.2 Das Dinier als funktionelle Einheit 65

4.2.1 Die „Minimalausstattung" für sekundäre Transporter 65

4.2.2 Experimentelle Hinweise auf eine funktionelle Dimerisierung 66

4.2.3 Das halbseitig inaktivierte Heterodimer 67

4.2 .4 Existiert ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Mono- und Dimeren? 68

4.2 .5 Verschiedene Konformationen und Aggregationszusände des PIC 68

3

4.2.6 Entkopplung durch ein modifiziertes Monomer 69

4.2.7 Hinweise auf die Existenz eines einzigen Translokationsweges pro Dimer 69

5 Zusammenfassung 72

6 Literaturverzeichnis 74

4

Abkürzungsverzeichnis

AAC

ATPIADP-CarrierAGC

Aspartat-Glutamat-CarrierAP

AntiportC12E8

OctaethylenglykolmonododecyletherC5 En

OligoethylenglykolmonopentanetherCAC

Carnitin-CarrierCIC

Citrat-Carriercmc

Kritische mizellare KonzentrationDIC

Dicarboxylat-Carrierext .

externEYPC

Phosphatidyicholin aus TruthahneigelbGLC

Glutamat-CarrierHEPES

HydroxyethylpropansulfonsäureHTP

Flydroxylapatitint .

internIPTG

Isopropyl-thio-ga!aktopyranosidMersalyl

MersalylsäureOGC

Oxoglutarat-CarrierORC

Ornithin-CarrierpCMBS

p-ChlormercuribenzoisulfonsäureapH

pH-Differenz (Protonengradient)Pr

anorganisches PhosphatPIC

Phosphat-CarrierPIC BHMPIC aus RinderherzPlCsc

PIG aus Saccharomyces cerevisiaePIPES

Piperazin-N,N"-bis(2-ethan)sulfonsäurePLP

Pyridoxal-5"-PhosphatPYC

Pyruvat-CarrierS

SubstratSLS

Natrium-N-LauroylsarkosinatTricine

N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyllglycinUCP

Uncoupling proteinUP

UniportV

Volumenv, v

GeschwindigkeitVMax

Maximale GeschwindigkeitWT(-PIC)

wild-Typ (unmutierter Phosphatcarrier)beliebige Aminosäure

Einleitung 5

~

Einleitung

1 .1

Funktion von Mitochondrien Stofftransport durch mitochondriale Carrier

Mitochondrien sind energiewandelnde Organellen eukaryontischer Zellen . Die wich-

tigste Funktion dieser Organellen ist die Bereitstellung von Adenosintriphosphat (ATP), wel-

ches in der mitochondrialen Matrix synthetisiert wird . Die Synthese von ATP aus ADP und

anorganischem Phosphat ist der letzte Schritt der sogenannten oxidative Phosphorylierung,

bei der Elektronen von Reduktionsäquivalenten schrittweise durch die Komplexe der At-

mungskette auf Sauerstoff übertragen werden . Der Fluß der Elektronen zum Sauerstoff ist

an den vektoriellen Transport von Protonen über die innere mitochondriale Membran gekop-

pelt, wodurch ein elektrochemisches Potential aufgebaut wird . Der Rückstrom der Protonen

durch den Fa-Teil der ATP-Synthese ist mit der ATP-Synthese am F,-Teil des Enzyms ge-

koppelt . Diese Zusammenhänge wurden erstmals von Mitchell als „chemiosmotische Hypo-

these" publiziert (Mitchell, 1966, 1976) . Desweiteren finden in der mitochondrialen Matrix

verschiedene katabole Reaktionen, wie z .B . der Tricarbonsäurezyklus, Teile des Harnstoff-

zyklus und die ¢3-Oxidation der Fettsäuren und zum Teil auch anabole Reaktionen wie Teil-

schritte der Glukoneogenese statt.

Der Aufbau des eingangs erwähnten elektrochemischen Potentials setzt eine Perme-

abilitätsbarriere voraus . Die äußere mitochondriale Membran ist aufgrund der vorhandenen

Porine in hohem Maße permeabel für die meisten Metabolite mit einer Größe von bis zu 10

kDA (Benz, 1985, Manella et al ., 1992, 1996 ; Sorgato und Moran, 1993) . Der Stofftransport

Ober die innere mitochondriale Membran, welche die erforderliche Permeabilitätsbarriere

darstellt, wird von einer Reihe spezifischer Carrierproteine katalysiert (La Noue und School-

werth, 1979, 1984, Krämer und Palmieri, 1989, 1992) . Hierdurch wird die Versorgung der

Matrix 1 1 II. IVIGit NletabLAUIIen wie e z.B . 1 P

RA- d-+ und Fettsäuren (als Bcmitochondrialen

olitI.yru tlClvatd, 17i C31QI.

(als nyfla~llcar_-M inDiese ' flehl~,trarf TSr .. .reteine katalysie ren zLimdeist den Al stal srh ve rschie-

dener

f 111.111) ! gewährleistet.

~m~

o.

maw . ' as .

. .

.Substrategegeneinander bzw . koppeln den Transport von Substraten an den über der

Membran anliegenden Protonengradienten.

Mit einem Anteil von 13 % am gesamten in der Membran vorhandenen Protein

(Klingenberg, 1981) ist der ADPIATP-Carrier (AAC) der am häufigsten vorkommende Carri-

er . Er katalysiert den Austausch von ADP gegen ATP und ist hierdurch direkt am Energie-

transfer beteiligt . Der Phosphatcarrier (PIC) importiert das für die Phosphorylierungsreaktion

benötigte anorganische Phosphats . Der AspartatlGlutamat-Carrier (AGC) ist zusammen mit

dem Ketoglutarat-Carrier (OGC) Bestandteil des sogenannten AspartatlMalat-Shuttles

• (Harold, 1986), durch den der Import von Reduktionsäquivalenten realisiert wird . Neben den

für die elementaren Funktionen der Mitochondrien absolut essentiellen Carriern, die in allen

Gewebetypen exprimiert werden, gibt es einige Carrier, die nur in bestimmten Geweben ex-

primiert werden, wie z .B. den Ornithincarrier (ORC) der hauptsächlich in Leber und Niere

6 Einleitung

exprimiert wird (Krämer und Palmieri, 1992) . Darüberhinaus gibt es teilweise eine gewebe-

spezifische Expression bestimmter Isoformen von mitochondrialen Carriern als Anpassung

an spezielle energetische Bedürfnisse, wie z .B im Palle des Phosphatcarriers (Dolce et aL,

1996) . Es sind bisher 15 mitochondriale Carrier in intakten Mitochondrien und z .T. in rekon-

stituierten Systemen untersucht worden . Diese sind bis auf den Glutamincarrier, einen Carri-

er für verzweigtkettige Ketocarbonsäuren (Hutson und Hall, 1993), einen SuccinatlFumarat-

Antiporter (Palmieri et al., 1997b) und einen OrnithinlH ¢ -Antiporter (Palmieri et aL, 1997a) in

Tabelle 1 aufgelistet . Aufgrund theoretischer Betrachtungen muß es außerdem auch noch

eine ganze Reihe Carrier für den Import von Cofaktoren und ähnlichen, nicht in den IMiito-

chondrien synthetisierten Substrate geben . Hierzu gibt es erste Untersuchungen an Trans-

portsystemen für Thiarninpyrophosphat und Coenzym A (Tahiliani et al., 1992).

Tabelle 1 : Die wichtigsten Carrier der inneren Mitochondrienrnembran . Die angegebene Zitate stellen jeweils nureine ungewertete Auswahl der verfügbaren Literatur dar .

Carrier : Transportfunktion Efflux- Primärstruktur heterologe Literatur(Abkürzung) Cytosol / Matrix induktion ÜberexpressionADP/ATP- ADP3--> möglich + + Aquila etaL, 1982(MC) ATP4 Klingenberg, 1990

:- i i.Klin

-~2nbar~ , 1992 .-Phosphat-

P€->

möglich

+ +

Aquila et al., 1987(PIC) <-- OH`/h9 ' --)

Runswick et a!., 1987en und Krämer, 1993 : i StapP--.-~

Aspartat-

Glutamat lH `-~ möglich

_

_

Dierks und Kramer, 1990a/bGlutamat-

F

Asoariat

€ Stappen et a!., 1992(AGC) Herick und Krämer, 1995. .. ... . . . . . .. . . ... . . ..... . . . . ...... . . . .... . . . ..... . .. . . . .... . . . ...... . . . ..... . . .. . . .... . . . .... . . . ... . . . . . .... . . . . .... . .. . . . . . ... . . . . . . . .. . . . . . . .. . . . . ..... . . .. . . ... . . . . ...... . . . . ... .... . . .. . . . . .... ... .. .. . . . . .... . . . ... . . . . .. .. . . . . . . ..Oxoglutaratl

Ketoglutaratz"- möglich

+

Runswick et al., 1990Malat-

a

tUtalat2-i(OGC) i -Pyruvat-

Pyruvaf ~

_

Bolll et a1.,1989(PYC)

~ O1-17H`4 e :

Dicarboxylat-

Ma€ai2 a

p

+

Kakhniashvili et a1., 1997(DiC)

~ Pi

Palmieri er al., 1997

. . .. . .. .. . . . .. . ... . ... .. .. :Citrat

H-Citraf

möglich

+ +

Kaplan et a!., 1993(C€C)

<- Nialat2

Xu et a!., 1995lacobazzi et al., 1997 ; '^ ; -'---

Carnitin-

Acy~arnitin~ möglich

+ _

Indiveri eta, 1992a1b(CAC)

<- Carnitin

Indivar€ et al., 1997a

: s : vQmithin-

Omithin ¢-.

_

_

'• Irtdiveri etal., 1992a(ORC)

~ Gitrullin°

Indiveri et a!., 1997b

Glutamat-

Glutamat ->(GLC)

F OH7Hf-

möglich

+

Lin et aL, 1980Aquila eta!., 1985Klin•enber• . 1990

Einleitung 7

1 .2

Die Strukturfamilie der mitochondrialen Carrier

Tabelle 1 gibt einen Überblick über die wichtigsten mitochondrialen Carrier . Nicht

aufgeführt sind die eingangs erwähnten Carrier für Cofaktoren, der Glutamincarrier und ein

Carrier für verzweigtkettige Ketocarbonsäuren . Derzeit sind für neun Carrier die Primär-

strukturen bekannt (Tabelle 1) . Dabei wurden in einigen Fällen Carrier aus verschiedenen

Organismen und auch verschiedenen Geweben sequenziert . Man kennt mittlerweile die Se-

quenzen von über 140 putativen mitochondrialen Carriern, denen aber nur teilweise die ent-

sprechenden Funktionen zugeordnet werden können . Allein durch die Sequenzierung des

Hefegenorns konnten 35 Gene als putative mitochondriale Carrier identifiziert werden, sie-

ben davon mit bereits bekannter Funktion, weiche alle der mitochondrialen Carrierfamilie

(MCF) zugeordnet werden können (Nelson, 1996 ; El Moualij et aL, 1997).

Die Zuordnung erfolgt sowohl unter strukturellen als auch funktionellen Gesichts-

punkten . Die strukturellen Informationen beschränken sich aufgrund fehlender 3D-Struktur-

daten auf aus Hydrophathieplots abgeleitete putative Sekundärstrukturen . So weisen alle

mitochondrialen Carrier ein gemeinsames Motiv von sechs transmeribranen Helices auf,

welche alternierend hydrophobe und amphiphatische Eigenschaften besitzen (Aquila et

1987 ; Walker, 1992 ; Palmieri et aL, 1993a) und durch hydrophile Loops miteinander verbun-

den sind . Für die sich hieraus ergebende sogenannte tripartite Struktur von drei Abschnitten

mit je ca. 100 Aminosäuren konnte mit Hilfe von sogenannten diagon-plots gezeigt werden

(Saraste und Walker 1982), daß die Abschnitte untereinander eine relativ hohe Ähnlichkeit

aufweisen. Eine evolutionäre Erklärung für die Struktur der mitochondrialen Carrier geht von

der Existenz eines gemeisamen Urgens aus, welches für 2 transmembrane Bereiche co-

dierte (Klingenberg, 1989 ; 1990), und dessen Trimerisierung zeitgleich mit dem Auftreten

der ersten Eukaryonten vor 1,5 Millionen Jahren vermutet wird (Kuan und Saier, 1993).

Neben diesen strukturellen Betrachtungen können die mitochondrialen Carrier auch

aufgrund ihrer funktionellen Eigenschaften in die MCF eigeordnet werden . Dazu gehören

Gemeinsamkeiten bezüglich der Transportmechanismen (Abschnitt 1 .3) . Ebenso zeigen sie

in vielerlei Hinsicht Ähnlichkeiten im Verhalten gegenüber Inhibitoren, Detergentien und den

zur Aufreinigung verwendeten Adsorbentien (Krämer und Palmieri, 1992).

Der PI i~1spha tl.af rler istD

h

ist

M ie Prim är ¢ ru~aik¢~a~.i r des Phos-

phatcarriers

typisches ~v~i tgIii~d~e derd r MCF.CF D

via. ~ ~ ii ~ ci~~ .~~

phatcarriers aus ;inderherzmitocondrien wurde sowohl durch Proteinsequenzierung (Aquila

et aL, 1982), als auch durch DNA-Sequenzierung aufgeklärt (Runswick et aL, 1987) Sie zeigt

die typische tripartite Struktur mit sechs transmembranen Helices (Abbildung 1) der rnito-

chondrialen Carrierfamilie (Aquila et a1., 1985, Kuan und Saier, 1993) . Weiterhin konnten

beim PIC sowohl N- als auch C-Terminus auf der cytosolischen Seite der Membran nachge-

wiesen werden, was in Einklang mit dem angenommenen Modell steht (Capobianco et al .,

1991) .

S Enleitunq

Bei einem Vergleich der transmembranen Bereiche des PIC sind einige konservierte

Bereiche zu erkennen, so z .B . drei Praline am Ende der Helices 1, 3 und 5, drei Glycine am

Anfang der Helices 2, 4 und 6 und darüberhinaus jeweils zwei Reste nach den Prolinen ne-

gativ geladene Aminosäuren . Im Gegensatz zu den transmembranen Bereichen, sind die

Aminosäuresequenzen der Loops relativ variabel . Man vermutet hier die für die Substrater-

kennung und das gating wichtigen Bereiche (Walker, 1992 ; Kuan und Safer, 1993) . Im PIC

wurde außerdem ein sich wiederholendes Strukturmotiv innerhalb der ersten und dritten He-

lix gefunden (Phelps et a!., 1991): X-Pro-X-(AsplGlu)-X-X-(LyslArg)-X-(ArglLys)-X . in der

fünften Helix fehlt dieses Strukturmotiv. Die interne Homologie des dritten Teils ist insgesamt

geringer, als die der ersten beiden Teile . Darüberhinaus besitzt der PIC einen relativ hohen

Anteil polarer Aminosäuren (39 %) und unter physiologischen Bedingungen eine hohe An-

zahl (ca . zehn) positiver Ladungen . Der Phosphatcarrier kann außerdem wie alle Mitglieder

der MCF einer „Superfamilie" von sekundären Transportern zugeordnet werden (Saier und

Reizer, 1991), von denen die meisten als grundlegendes Strukturmotiv 12 (± 2) transmem-

brane Helices aufweisen (Henderson, 1990 ; Maloney, 1990 ; Marger und Saier, 1993 ; Gos-

witz und Brooker, 1995) . Aufgrund dieser strukturellen Analogien und aus mechanistischen

Gründen (Krämer und Palmieri, 1989, 1992) wird allgemein angenommen, daß mitochon-

driale Carrier als Dimere aktiv sind (s . Abschnitt 1 .5)

2Trans-membrandomä~e 4 5

Abbildung 1 : Primärstruktur in Form der putativen aus Hydropathieplots abgeleiteten Sekundärstruktur desPICsc . B : Mögliche Anordnung von zwei PIC-Monomeren zu einerm Dimer mit zwei Transokationswegen, wie esaufgrund mechanistischer Befunde gefordert wird .

Einleitung 9. s

1 .3

Kinetische Eigenschaften des mitochondrialen Phosphatcarriers

Die Modelle für Transportkatalyse von mitochondrialen Carriern sind ausschließlich

aufgrund energetischer und kinetischer Untersuchungen erstellt worden, da bis heute keine

dreidimensionale Struktur für sekundäre Transportproteine bekannt ist . Für die Carrier wird

ein sogenannter single binding center gated pore mechanism diskutiert (Abbildung 2), bei

dem ein Kanal mit einem Bindungszentrum existiert, dessen Zugänglichkeit durch gates ge-

regelt wird . Das Öffnen und Schließen der gates wird wiederum durch Effektoren wie z .B.

die Substrate beeinflußt.

Abbildung 2 : Single binding center gated pore Mechanismus des PIC (modifiziert nach Klingenberg, 1992) Dar-gestellt ist das postulierte Dinier mit zwei getrennten Translokationswegen . Die anionischen Substrate S- und Tgelangen durch geöffnete gates von gegenüberliegenden Seiten an die Bindungszentren . Durch die Wechselwir-kungen mit diesen verschieben sich Ladungen im Protein : der temäre Komplex wird gebildet und unterzieht sicheinem weiteren Konformationswechsel . Hierduch werden die gates zur jeweils anderen Seite geöffnet . DerTransport ist prinzipiell in beide Richtungen möglich und wird durch die Triebkraft der Substratgradienten ge-steuert .

Die Triebkraft des Transports besteht im elektrochemischen Potential eines

Substratgradienten . Beim Phosphatcarrier handelt es sich dabei uni den Protonengradienten

über der inneren mitochondrialen Membran . Dieser wird dazu genutzt, anorganisches Phos-

phat (Pi") in der mitochondrialen Matrix zu akkumulieren . Der dabei stattfindende Transport

von einem Proton und einem Molekül Pi - der meist als Pi"IH*-Symport beschrieben wird, ist

elektroneutral . Er ist somit nur von beiden Substratgradienten (Protonen- und Phosphatgra-

dient) abhängig, nicht jedoch vom Membranpotantial . Darüberhinaus katalysiert der PIC

auch noch einen homologen Austausch von Phosphat (Pi -/PF-Antiport), eine Eigenschaft die

ebenfalls typisch für alle mitochondrialen Carrier und die meisten sekundären Carrier ist

(Abbildung 3).

Aufgrund von kinetischen Bisubstratanalysen wurde ein simultaner Reaktionsmecha-

nismus postuliert, bei dem zwei Substratmoleküle in zufälliger Reihenfolge (random ordered)

an den Carrier binden (Bildung eines ternären Komplexes) und so den eigentlichen Translo-

kationsvorgang einleiten (Stappen und Krämer, 1993) . Deswegen wurde für den, an den

Protonengradienten gekoppelten Pi --Nettotransport in Analogie zum Pi-/PF-Antiport ein Pi -

/OHI--Antiport und kein Pi"/H +-Symport postuliert.

10 Einleitunq

Desweiteren können sowohl der PIC BHM als auch der PICsc durch Behandlung mit

Quecksilber(Il)chlorid dahingehend modifiziert werden, daß ein weiterer Transportmodus,

der sogenannten Efflux- oder Uniportmodus beobachtet werden kann (Stappen, 1994).

Abbildung 3 : Transportmodi des PICC . Dargestellt sind die beiden physio :oischen Transportmodi, der Pi -101- -Antiport (1),der Pi fPi --Antiport (2), sowie der durch HgC12 induzierte urphysiologische Uniport- (Efflux-) Modus

(3)-

1 .4

Uniportinduktion - Entkopplung auf molekularer Ebene

Durch die Behandlung von mitochondrialen Carriern mit cysteinspezifischen, queck-

silberhaltigen Reagentien kann die Funktionsweise der Carrier von einem strikt gekoppelten

Antiport in einen entkoppelten Uniport (Efflux) (Abbildung 3) geändert werden . Der Vorgang

ist reversibel, d .h . durch Zugabe von DTT kann der ursprüngliche Zustand wiederhergestellt

werden. Das Phänomen ist far verschiedene mitochondriale Carrier beschrieben worden, so

Einleitung 11

z.B. für den AspartatlGlutamat-Carrier, den Nukleotidcarrier (Dierks et aL, 1990a; Dierks et

at., 1990b), den Carnitincarrier (Indiveri et al., 1991, 1992a), sowie für den Phosphatcarrier

aus Rinderherz- (Stappen und Krämer, 1993) und Hefemitochondrien (Stappen, 1994) . An-

hand des AspartatlGiutamat-Carriers (AGC), dessen Primärstruktur bis heute nicht bekannt

ist, konnte gezeigt werden, daß für die Inhibition und die anschließende Induktion des Uni-

port zwei verschiedene Cysteine (Cys a und Cys b) verantwortlich sind (Dierks et aL, 1990,

Stappen et aL, 1992) . Durch diese Modifikationen werden die Eigenschaften der internen

Substratbindungsstelle dahingehend verändert, daß sowohl die Substrataffinität als auch die

Substratspezifität des Carriers drastisch reduziert werden . Der Carrier weist einen stark er-

hdhten internen Km-Wert für Aspartat auf (> 200 mM statt 3 mM) und transloziert eine Viel-

zahl von Substraten wie z .B. Malat, Chlorid und Succinat. Ahnliches konnte far den PIC BHM

gezeigt werden . Dieser transportiert nach Uniportinduktion ebenfalls nichtphysiologische

Substrate wie Sulfat, Chlorid, Ketoglutarat u .ä., wobei der Km-Wert für internes Phosphat von

11,2 rnM auf einen geschätzten Wert von > 6 M steigt (Stappen, 1994) . Diese veränderten

Eigenschaften der Carrier sprechen für einen kanalvermittelten Transport . Es gibt jedoch

Hinweise darauf, daß auch nach Uniportinduktion weiterhin einige, für carriervermittelten

Transport typische, Eigenschaften erhalten bleiben . Zu diesen gehört die spezifische Inhibi-

tion des Uniports durch extern zugesetztes Substrat (Transinhibition), die sowohl beim AGC,

als auch beim PIC beobachtet werden konnte . Hieraus kann geschlossen werden, daß die

Spezifität der externen Bindungsstelle trotz Uniportinduktion erhalten bleibt . Außerdem wur-

de durch Experimente mit dem AGC festgestellt, daß die Aktivierungsenergien des Antiports

und des Uniports identisch sind (Herick und Krämer, 1995).

Diese ambivalenten Eigenschaften geben Anlaß zu Spekulationen über einen bei

Carrierproteinen vorhandenen intrinsischen Kanal, dessen Zugänglichkeit durch gates regu-

liert wird . Der hieraus gefolgerte gated pore mechanism (Klingenberg, 1981, 1992), der die

Kopplung der einwärts und auswärts gerichteten Flüsse gewährleistet, wird durch die Modifi-

kation von Aminosäuren in bestimmten Bereichen des Proteins außer Kraft gesetzt . Durch

die Modifikation von bestimmten Cysteinresten wird die Funktionsweise der gates dahinge-

hend verändert, daß die strikte Kopplung zwischen der Bindung der Substrate und dem Off-

nen der gates nicht mehr gegeben ist .

Neben einer evolutionären Deutung des intrinsischen Kanals, welche davon ausgeht,

daß sich Transportproteine aus einfachen Poren entwickelt haben (Maloney, 1989), gibt es

Überlegungen die die mitochondrialen Carrier mit der permeability transition in Verbindung

bringen. Der bei der Apoptose auftretende Zusammenbruch der Permeabilitätsbarriere, für

den bis heute kein vermittelndes Protein eindeutig identifiziert werden konnte, konnte durch

carrierspezifische inhibitoren beeinflußt werden, was als Hinweis auf eine Beteiligung der

Carrier gewertet wurde . Als physiologischer Effektor für die Entkopplungsphänomene sind

12 Einleitung

u .a . Cat+ und reaktive Sauerstoffverbindungen in der Diskussion (Bernardi und Petronilli,

1996, Skulachev, 1996 ; Petit et aL, 1996).

1 .5

Die funktionelle Einheit der mitochondrialen Carrier

Mit einer molekularen Masse von 32 kDa und sechs tr ansmernbranen Helices ist der

Phosphatcarrier ein typischer Vertreter der Strukturfamilie der rnitochondrialen Carrier

(Aquila et al., 1985; Kuan et aL, 1995) . Es gibt verschiedene Hinweise darauf, daß mito-

chondriale Carrier nicht in ihrer monomeren Form, sondern als Dimere aktiv sind . Einer der

überzeugensten Hinweise auf eine Dimerisierung war die beobachtete Bindungsstöchiome-

trie von einem Molekül Carboxyatractylat einem hochspezifischen Inhibitor des Nukleotidcar-

riers (AAC) an zwei monomere Untereinheiten des MC. (Riccio et al., 1975) Eine noch ge-

ringere Bindungsstdchiometrie wurde für die Bindung der Substrate ADP und ATP gefunden.

Diese Untersuchungen mit fluoreszierenden Nukieotid-Analoga lassen den Schluß zu, daß

es sich bei der funktionellen Einheit um ein Tetramer handelt (Dupont et al., 1982) . Deswei-

teren konnte durch Crosslinking und analytische Ultrazentrifugation (Hackenberg und Klin-

genberg, 1980 ; Lin et al., 1980) gezeigt werden, daß die Carrier nach Solubilisierung mit

Hilfe von nichtionischen Detergentien in einer duneren Form vorliegen . Kürzlich konnte auch

gezeigt werden, daß die Bildung einer intermolekularen Disulfidbrücke beim ADPIATP-

Carrier (Majima et al., 1995) möglich ist.

Bei Studien an intakten Pinderherzmitochondrien stellte sich heraus, daß weniger als

ein Molekül des irreversiblen Inhibitors N-Ethyl-maleimid (NEM) pro Monomer PIC nötig ist,

um den Phosphattransport zu inhibieren (Wohlrab et al ., 1993) . Analysen des PICsc im re-

konstituierten System haben gezeigt, daß vermutlich die Bildung einer Disulfidbrücke zwi-

schen den Cysteinen an Position 28 zweier Mononiere den Phosphattransport inhibieren

kann (Phelps und Wohlrab, 1993).

Neben diesen experimentellen Befunden gibt es einen generellen Konsens bezüglich

der Minimalausstattung eines sekundären Carrierproteins, welcher besagt, daß etwa 12 (i- 2)

transmembrane Helices nötig sind, um Transport bzw . Kopplung zu bewerkstelligen

(Henderson, 1990 ; Maloney, 1990; Marger und Seder, 1993) . Darüberhinaus gibt es theoreti-

sche Betrachtungen welche ein Homodimer als funktionelle Einheit postulieren (Klingenberg,

1981) . Für bakterielle sekundäre Transportsysteme, welche in den meisten Fällen 12 trans-

membrane Helices aufweisen, konnte hingegen gezeigt werden, daß diese in der monome-

ren Form aktiv sind (Sahin-Toth et al., 1994) . Andere Transporter aus höheren Eukaryonten,

die Zucker-Uniporter (GLUT-Familie) und die Na ¢-gekoppelten Symporter (SGLT-Familie)

sind sowohl als Mono-, als auch als Oligomere aktiv . Die Interaktionen der Monomere wur-

den hier als regulatorisches Phänomen gedeutet (Herbert und Carruthers, 1991 ; Bell et al.,

1993; Zolotta et al., 1995) .

Einleitung13

1 .6

Zielsetzung der durchgeführten Studien

Die mitochondrialen Carrier sind in der Lage zwei Stoffflüsse miteinander zu koppeln.

Die hierfür notwendigen funktionellen und strukturellen Voraussetzungen sollten durch zwei

verschiedene experimentelle Ansätze aufgeklärt werden.

Die Behandlung des PlCsc mit verschiedenen quecksilberhaltigen SH-modifizieren-

den Agentien führt zu verschiedenen Funktionsänderungen . Durch Behandlung des PICsc

mit Mersalylsäure oder pCMBS wird eine Inhibition der physiologischen Transportmodi er-

zielt . Die Zugabe von HgCl 2 ändert die Funktion des Carriers von einem streng gekoppelten

Antiport in einen entkoppelten, unspezifischen Uniport (Efflux) . Hierbei wird die Kopplung der

Stoffflüsse aufgehoben bzw . umgangen. Die zur (Ent-)Kopplung der Flüsse notwendigen

strukturellen Veränderungen sollten auf molekularer Ebene charakterisiert werden . Nach

Klonierung des für den PICsc kodierenden Gens mit den nachfolgenden Möglichkeiten zur

Überexpression und ortspezifische Mutagenese, ergab sich ein experimenteller Zugang zu

den molekularen Ursachen der Funktionsänderungen . Durch Untersuchungen an verschie-

denen Cysteinmutanten sollten die möglichen Angriffstellen für verschiedene SH-

Modifizierungsagentien lokalisiert werden . Nach der Etablierung der Isolierung und Rekon-

stitution des rekombinanten Proteins bestand der erste Schritt in der Analyse der Cystein-

mutanten in Bezug auf ihre physiologischen Transporteigenschaften, dem eine detaillierte

Analyse der Wirkungsweise verschiedener SH-Modifizierungsagentien folgen sollte.

Der zweite Ansatz, die Mechanismen der Transportkatalyse auf struktureller Basis

weiter aufzuklären, war die Konstruktion und Analyse von Heterodimeren . Ausgangspunkt

für die Experimente war der Befund, daß mitochondriale Carrier in nichtionischen Detergen-

tien als Dinner, in SLS jedoch als Monomer vorliegen. Um die Anzahl der Monomere irrt

transportaktiven Komplex zu bestimmen, wurde folgender Weg beschritten : Es sollten Hete-

rodimere aus Monomeren unterschiedlicher Funktion konstruiert und charakterisiert werden.

Eines der onomere soll te durch chemisch Mnoiftz~~ ye ~~ierung inaktiviert--

- e

~ o~

~a-`--durch

_

_ o _~v_werden, während c°.5

andere normale Aktivität besitzen sollte . Eine weitere Voraussetzung far die Konstruktion

von Heterodimeren ist die Möglichkeit zur Unterscheidung der Monomere auf molekularer

Ebene . Es wurden zwei verschiedene tags an das Gen des PIC anfusionie . Hierdurch sollte

sowohl eine Aufreinigung der entsprechende Konstrukte, als auch eine Identifizierung durch

entsprechende Antikörper möglich sein . Der nächste Schritt war die Bildung von Dimeren

aus den verschiedenen Monomeren und die Isolierung eines definierten Dimers aus einer

Reihe entstehender Dimere. Schließlich sollten die isolierten Konstrukte stabil sein und eine

gut meßbare Aktivität aufweisen .

14 Material und Methoden


2.1

Material

Radioaktive Substanzen:

[32P] Phosphat, [ 33 P] Phosphat, [35S] Sulfat, Amersham Buchler (Braunschweig).

Modifizierungsreagenzien and 1nhibitoren:

pCMBS, N-ethyl-maieimide, Mersalyisäure, Sigma (Deisenhofen) ; PLP, Merck (Darmstadt);HgCI2, Henkel (Düsseldorf).

Dete~gentien:C12E8 , N-Lauroylsarcosinat, Na-Salz, Fluke (Deisenhofen) ; Triton X-100, Triton X-114,

SDS, Sigma (Deisenhofen).

Lipide:

Phosphatidylcholin aus Truthahneigelb Kit-E, Cardiolipin (Na-Salz), Sigma (Deisenhofen).

Puffer:

CAPS, HEPES, MES, PIPES, Tricine, Sigma (Deisenhofen) ; lmidazol, Merck (Darmstadt).

lonenaustauscher und Chromatographi_ematerialien:

Amberlite XAD -2, DOWEX 2-X10, Phosphonoameisensäureester, Fluke ; Sephadex G-50,

G-75, BioBeads SM-2, BioRad (München) ; Ni-NTA-Agarose Qiagen (Hilden), Anti-FLAG-

Affinity Agarose, Eastman Kodak (New Haven)

sonstige Chemikalien:

Acrylamid, Ammoniumperoxidisulfat, DTE, DTT, N,N'-Methyien-bisacrylamid, Mercaptoetha-

not, Sigma (Deisenhofen);Rinderserum Albumin (Fraktion V), Boehringer (Mannheim) ; Mole-

kulargewichtstandard-Proteine (low range), Pharmacia (Freiburg) ; Ultima Gold Szintillations-

Cocktail, Camberra Packard (Frankfurt) ; vorgoffrbte Molekulargewichtstandard-Proteinre,

BioRad (München) ; TEMED, Serve ; Glutardialdehyd, Natriumdithionit, Saccharose, Silberni-

trat, Merck (Darmstadt) ; Nicht aufgeführte Chemikalien waren von p. a . Qualität.

Antikörper:

Anti FLAG M2 Antikörper, Eastman Kodak (New Haven), Ni-NTA Konjugat, Qiagen (Hilden) .

Material und Methoden 15

Stämme und Plasmide:

E. col/

Genotyp Verwendung, Referenz

supE44 LVaCU169 (phi801aeZdM15) hsdR17

Klonierungen,

recAl endAl gyrA96 thi-1 relA1 mcr'

Grant et aL, 1990

F' traD361ae d (lacZ)M15proA¢B'/el4OWcrA) Klonierungen,

d(lac-proAD) thi gyrA96 (Nai r) endAl

Yanish-Perron et al., 1985

hsdR97W MK}) re/Al supE44

F" ompi [Ion] hsdSB (re, ms )

Expression,

Shadier et al., 1990

DH5amcr

JM109

BL21(DE3)

Plasmide IEigenschaften Verwendung, Referenz

Expression

Murakami et al., 1993

Klonierungen

Norrander et al., 1983

Das Plasmid, welches das das mir?-Gen trägt, das für den mitochondrialen Phos-

phatcarrier der Hefe Saccharomyces cerevisiae kodiert, (Murakami et al ., 1993; Wohlrab

und Briggs, 1994), wurde freundlicherweise von D . Pain (New York) zur Verfügung gestellt

(Abbildung 4). Bei dem Plasmid handelt es sich um ein pET3a-Derivat . Alle Klonierungsar-

beiten wurden in den E.coli Stämmen DH5amcr und Jnri109 durchgeführt . Zur Expression

wurden die entsprechenden Plasmide in den E . coli Stamm BL21 (DE3) transformiert.

22

Allgemeine Präparationen

2.2 .1

Präparation des PIC aus Rinderherzmitochondrien

Die Präparation der Rinderherz-Mitochondrien aus frischen Rinderherzen erfolgte

nach einer Vorschrift von Smith (1967). Nach der Zentrifugation wurde die Mitochondrien-

fraktion in 250 mM Saccharose, 50 pM EDTA, 10 rnM Tris-HCI pH 7,4 suspendiert, direkt in

flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt . Der Proteingehalt lag bei ca . 50

mglml .

Der Phosphatcarrier wurde nach einer Vorschrift von Genchi et al. (1988) aufgerei-

nigt. Diese Vorschrift basiert auf dem von Bisaccia et al . (1984) publizierten Verfahren der

Aufreinigung des Phosphatcarriers über Hydroxyapatitsäulen in Gegenwart von Cardiolipin.

Nach dem raschen Auftauen der Mitochondrien (je 20 mg Protein) wurden diese zweimal mit

pNYHM131 mini (PIC),bla

pUC18

hla


20 mM KCI, 20 mM KPi (pH 6,5) und 2 mM EGIA gewaschen . Anschließend erfolgte die

Solubilisierung des Phosphatcarriers in Gegenwart von 2,5 % Triton X-114, 4 mglml Cardio-

lipin, 20 mM KCI, 20 mM KPi (pH 6,5) und 2 mM EGTA (Endvolumen 0,7 ml) . Anschließend

wurde das Solubilisat auf eine Hydroxyapatitsäule aufgetragen (0,4 g HTP bei Auftrag von

0,6 ml Solubilisat) und mit dem zur Solubilisierung verwendeten Puffer eluiert . Es wurden

zwei Fraktionen zu je 0,5 ml gesammelt, wobei die zweite direkt zur Rekonstitution einge-

setzt wurde.

2 .2 .2

Preparation der Phosphatcarriers aus inclusion bodies

Die Anzucht der E.coll-Zellen erfolgte nach einer Vorschrift von Wohlrab und Briggs

(1994). Für die Expression wurden 500 ml 2 x YT-Medium (50 mg/1 Carbenicillin) mit 3 ml ei-

ner UN-Kultur des Stamm BL2I(DE) pNYFIM131 angeimpft (s . Abschn 2 .5.1) und unter star-

kem Schütteln bei 37°C bis zu einer CD600 von etwa 0,6 herangezogen (ca . 3 h) . Durch Zu-

gabe von 1 mM IPTG und weiteren 50 mg/I Carbenicillin wurde die Expression des Phos-

phatcarriers induziert . Nach weiteren 3 h wurden die Zellen abzentrifugiert (30 min, 15000 g,

4°C) und bei -20°C gelagert . Die folgenden Schritte der Aufarbeitung wurden bei 0 bis 4°C

durchgeführt. Die Zellen aus 125 ml Medium mit dem expremierten PIC wurde in 10 ml TE-

Puffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDi A, 1 mM D T T, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt) suspendiert

und mit Hilfe einer French press (Aminco, große Zelle, 16000 psi) aufgeschlossen und

10 min zentrifugiert (12000 g, 4°C) . Das Präzipitat wurde in 10 ml TE-Puffer homogenisiert

und 5 min zentrifugiert (1100 g, 4°C) . Der Überstand mit den inclusion bodies wurde aliquo-

tiert und 3 min zentrifugiert (12000 g, 4°C) . Die Lagerung der inclusion bodies erfolgte an-

schließend bei -20°C . Die Aufarbeitung der inclusion bodies lehnte sich an eine Vorschrift für

den Ketogfutaratcarrier von Fiermonte et al . (1993) an . Das Präzipitat wurde zweimal mit 1

% C12E8 gewaschen und 2,5 min (12000 g, 4°C) zentrifugiert . Der Oberstand wurde verwor-

fen und das Präzipitat in 500 pl TE-Puffer mit 1,67 % N-Lauroylsarcosinat solubilisert . An-

schließend wurde 1 ml Wasser zugegeben und 2,5 min zentrifugiert (12000 g, 4°C) . Die re-

sultierende Proteinlösung enthielt 2 bis 4 mglml Protein.

2 .2 .3

Rekonstitution des Phosphatcarriers

Die Rekonstitution des Phosphatcarriers aus Rinderherzmitochondrien erfolgte unter

Anwendung der erstmals für den AspartatlGlutamat-Carrier (Krämer & Leberger 1986) eta-

blierten sogenannten Amberlitemethode . Diese wurde von R . Stappen für den PICBHM opti-

miert. Hierbei wurden 12 mg Phospholipidlml in Kombination mit einem Deter-

gens/Phospholipid-Verhältnis von 1,6 - 1,8 mg/mg verwendet . Das DetergenslAmberlite-


Verhältnis wurde auf 20 mg/g eingestellt . Die Abreicherung des Detergens war nach 12 bis

14 Säulenpassagen zu beobachten (Steppen und Krämer, 1993).

Grundvoraussetzung für die detaillierte kinetische Analyse des rekombinanten PICsc,war die Etablierung eines Meßsystems zur optimalen Erfassung der kinetischen Daten . Zur

Rekonstitution des PIC wurde die bereits für den P!C aus Rinderherzmitochondrien eta-

blierte Amberlitemethode verwendet . Hierbei wurde von den bereits bekannten optimalen

Rekonstitutionsdaten ausgegangen . Die Phospholipidmenge im Rekonstitutionsansatz wur-

de konstant gehalten (16 mg/ml), während die Detergensrnenge und die Proteinmenge vari-

iert wurden. Es zeigte sich, daß bei einem Detergens/Phospholipid-Verhältnis von 0,62

mg/mg und einem ProteiniPhospholiipid-Verhältnis von 2-3 pg/mg eine maximale, auf die

Proteinmenge bezogene Aktivität und ein maximales aktives Innenvolumen von 1,5 - 2 pl/ml

beobachtet werden konnte . Für die Analyse der Mutanten war es allerdings von Vorteil, mit

höheren Proteinkonzentrationen zu arbeiten, da hierdurch das Signal-Rausch-Verhältnis er-

heblich verbessert werden konnte . Die meisten Experimente wurden mit einem Prote-

in/Phospholipid-Verhältnis von 7 pg/mg durchgeführt . Desweiteren wurde ein Deter-

gens/Amberlite (Bio-beads)- Verhältnis von 12 mg/g eingesetzt, um das Detergens während

der Rekonstitution abzureichern . Für die Transportmessungen wurde der pH durch 50 mM

PIPES pH 6,5 eingestellt und als Substrat waren 30 rnM Phosphat anwesend.

2 .3

Analytische Methoden

2.3 .1

Bestimmung der Transportaktivität

Die Transportaktivitäten der in Liposomen rekonstituierten Carrier wurden auf bio-

chemischen Wege durch Bestimmung der Veränderung des Verteilungskoeffizienten

(innen/außen) von radioaktiv markierten Substraten ermittelt . Prinzipiell standen zwei Mög-

lichkeiten zur Verfügung : Der Import von radioaktiv markiertem Substrat (Vortausch) und der

Export von radioaktiv markiertem Substrat (Rücktausch) (Dierks et al ., 1988).

2.3 .1 .1

Vortauschtechnik

Mit der Vortauschtechnik wurde die Aufnahme von radioaktiv markiertem Substrat in

die Proteoliposomen gemessen (Krämer, 1984) . Um das unvorteilhafte Volumenverhältnis

innen/außen durch geeignete Substratgradienten zu kompensieren (s . u .) und um außen ei-

ne von der inneren abweichende Substratkonzentration einzustellen, wurde das externe Me-

dium durch eine Gelfiltration ausgetauscht . Dazu wurde das externe Substrat von den Lipo-

somen durch Größenausschlußchromatographie (Gelfiltration an Sephadex G-75; Säulen-


durchmesser: 7 mm, Volumen : 6 ml; Auftragsvolumen : 400 bis 600 pl ; Elutionsvolumen : 600

bis 900 pi) abgetrennt . Der Phosphatcarrier wurde vor Auftrag auf die Sephadex G-75-Säule

durch 0,3 mM Mersalyl reversibel inhibiert, um einen Export des internen Substrats zu ver-

hindern. Durch Zugabe von 10 mM DTE im Startpuffer wurde diese Inhibition revertiert (s .u .).

Die Säulen wurden in Wasch- und Elutionspuffer äquilibriert . Dieser enthielt neben dem ge-

wünschten externen Puffer mit dem entsprechenden pH-Wert noch Saccharose um isoos-

molale Bedingungen einzustellen . Die Messung der Transportaktivität wurde durch Zugabe

von 5-10 mM 33P-markiertem Phosphat (ca . 0,8 kBq) zusammen mit 10 mM DTE gestartet.

Der Austausch von unmarkiertem internen gegen markiertes externes Substrat wurde nach

bestimmten Zeiten durch Zugabe von Pyridoxalphosphat (PLP) in einer Endkonzentration

von 40 mM gestoppt (Inhibitor--Stopp-Methode, Dierks et al ., 1988; Stappen und Krämer,

1993). Zur Kontrolle der Wirkung von PLP wurden Startwerte durch gleichzeitige Zugabe

von PLP und markiertem Substrat gemessen . Nach einer Meßzeit von 6-8 Minuten wurde

externes (radioaktives) Substrat, das nicht in die Proteoliposomen aufgenommen worden

war, durch Anionenaustausch-Chromatographie Ober Dowex 2-X10-Säulen (Acetatform pH 8

bis 9) entfernt . Pro Säule wurden 130 pl Proteoliposomen des jeweiligen Ansatzes aufgetra-

gen und mit 1,2 ml isoosmolaler Saccharoselösung direkt in Szintillationsröhrchen eluiert.

Um Wechselwirkung der Proteoliposomen mit dem Anionenaustauscher zu verhindern, wur-

de jede Säule zuvor mit 4 mg Phospholipid und 2 mg Rinderserum-Albumin in 40 mM Ace-

tatpuffer pH 8 konditioniert . Die Transportaktivität wurden mit Hilfe eines Computerpro-

gramms berechnet (Enzfitter, Biosoft), das den zeitlichen Verlauf der Isotopenäquilibrierue ng

(Exponentialfunktion) einem Prozeß erster Ordnung angleicht . Die apparente Trans-

portaktivität [dpm/min] wurde durch Multiplikation der Geschwindigkeitskonstanten k [min- 1 ]

und dem Endwert der Kinetik [dpm] bestimmt . Unter Berücksichtigung der spezifischen Ra-

dioaktivität [dpm/nmol] und des Probenvolumens [ml] konnte die Volumenaktivität

[nmol/minlml] bestimmt werden . Diese konnte nach Bestimmung der Proteinkonzentration in

die spezifische Transportaktiviät [mmoilminlgp.otein] umgerechnet werden. Alternativ wurde

eine zweite Möglichkeit der Vortauschtechnik entwickelt, bei der phosphatfreie Proteolipo-

somen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, in externes Medium injiziert wurden,

welches 10 mM markiertes Phosphat enthielt. In diesen Experimenten wurden jeweils 50 p1

Liposomen zum Starten der Kinetik mit 200 pl externem Medium vermischt, anschließend

wurde der Transportvorgang durch Zugabe von 20 mM PLP gestoppt . Es wurden 200 pl des

resultierenden Reaktionsansatzes auf die Dowex-Säulen aufgetragen. Eine ausführlichere

Beschreibung dieser Meßmethode erfolgt in Abschnitt 3 .5 .2 .


2.3 .1 .2

Rücktauschtechnik

Mit der Rücktauschtechnik wurde der Export von radioaktiv markiertem Substrat aus

den Proteoliposornen gemessen . Dazu war es erforderlich, die Proteoliposomen zunächst

mit markiertem Substrat in der Vortauschtechnik zu beladen (0,5 pM externes Substrat, ca.

1 kBglml, 10 min, 25°C) . Anschließend wurden die Fraktionen mit 0,3 mM Mersalylsaure in-

hibiert, und das externe Substrat durch Größenausschlußchromatographie entfernt . Der

Start der Kinetik erfolgte durch Zugabe von 10 mM DU. In den Fällen, in denen konstitutiv

effluxinduzierte PIC-Mutanten untersucht wurden, erfolgte der Start der Kinetik durch einen

Temperatursprung von 0-4°C auf 22-25°C . Zum Beenden der Transportreaktion wurde, wie

in den Vortauschexperimenten beschrieben, PLP zugegeben.

Die Transportaktivität der Rücktausch-Experimente wurde ebenfalls mit Hilfe von

Enzfit berechnet . Die Meßpunkte werden dabei folgenden Gleichungen angepaßt (Dierks

und Krämer, 1988).

Zur Berechnung von Rücktauschkinetiken muß der Startwert (dpma) und der Endwert

(dpmoo) der Isotopenäquilibrierung bekannt sein . Der prozentuale Rquilibrierungsgrad a ei-

ner Kinetik zum Zeitpunkt t ergiebt sich aus:

(GI . 1)

a = 100 m (dpril o - dpm t ) ! (dpm o - dpm,o)

Wenn die Menge des externen Substrats die des internen um ein Vielfaches übersteigt

(Sexye$ » S,nVin), kann die Zeitabhängigkeit der prozentualen Isotopenäquilibrierung wie

folgt beschrieben werden:

(GI . 2)

a100 °(1 -et )

Aus den so erhaltenen Werte für die apparente Geschwindigkeitskonstante erster Ordung

k[miri ' j ergibt sich der zeitliche Verlauf der lsotopenäguilibrierung, da innerhalb eines ein-

zelnen Experiments mit identischen Proteoiiposomen die apparenten Geschwindigkeitskon-

stanten direkt miteinander vergleichbar sind (Dierks und Krämer, 1988) . Durch Multiplikation

der apparenten Geschwindigkeitskonstante k mit dem aktiven Innenvolumen V ;n und der in-

ternen Substratkonzentration Sen wird die Austauschaktivität v' [pM/min) ergibt sich:

(GI . 3)

v '= k Vm ° Sin

2.3 .1 .3

Quecksilberinduzierter Uniport (Efflux)

Der Uniport (Efflux) des PIC wurde durch Zugabe von HgCI2 (üblicherweise 1 mM) in-

duziert . Wurde der Uniport physiologischer Substrate untersucht, wurden die Proteoliposo-


men wie in der Rücktauschtechnik mit Substrat vorbeladen . Dagegen mußten die Proteolipo-

somen schon in Gegenwart radioaktiv markierter Substrate rekonstituiert werden, wenn der

Efflux unphysiofogischer Substrate betrachtet werden sollte . Als Stopreagenz wurde 40 mM

PLP zusammen mit 10 mM DTE eingesetzt . Externe anionische Substrate wurden wie be-

schrieben (s.o.) mit Anionenaustauscher Dowex 2-X10 (Acetatform) abgetrennt . Die Be-rechnung der Transportaktivität erfolgte entsprechend unter Berücksichtigung des radioakti-

ven Isotopenäquilibrierungsgrades . Die Messung erfolgte über 12 Minuten (Zeitpunkte : 0, 1,2, 4, 8, 12 min).

2 .3 .1 .4

Bestimmung des aktiven Innenvolumens

Das aktive Ennenvolumen einer Proteoliposomenfraktion wurde durch Aquilibrierung

der Proteoliposomen mit radioaktiv markiertem Substrat bestimmt . Bei gleicher interner und

externer Substratkonzentration kann der Anteil des durch den Antiporter ohne treibende

Kraft in die Liposomen transportierten, radioaktiv markierten Substrats mit folgender Glei-

chung berechnet werden (Krämer und Heberger, 1986):

(GI . 4)

dpm ;nt/dpmext = (Sint Vint) / (Seat Vex)

Da das externe Volumen das interne um Größenordnungen übertrifft, kann Ve,~ zu 100 %

bzw. zu 1000 pl/ml gesetzt werden . Mit Seit = Sint gilt:

(GI . 5)

Vint [Ipf/mi] = 1000 • dprnint/dpmext

2.3.2

Proteinbestimmungen

Je nach Bedarf wurden verschiedene Proteinbestimmungen angewendet . In Abwe-

senheit von reduzierenden Thiolverbindungen wurde der Pierce detergent compatible pro-

tein assay' der Fa. BioRad benutzt . Alternativ wurde eine modifizierte Methode nach Lowry

verwendet . Um störende Einflöße durch hohe Salzkonzentrationen, DTE und Detergentien

zu vermeiden, wurde das Protein zunächst mit 0,015 % Desoxycholat und 7,2 % Trichfores-

sigsäure präzipitiert und anschließend mit Diethylether gewaschen (Peterson, 1977). Das

präzipitierte Protein wurde in 10 % SDS solubilisiert, indem es etwa 0,5 bis 1 h bei 60°C ge-

schüttelt wurde .


2.3.3

Polyacrylamidgefelektrophorese

SDS-Polyacrylamidgele wurden nach einer Vorschrift von Schägger und von Jagow

(1987) mit einem Vertikal-Gel-System (Renner) hergestellt . Das Gel bestand aus einem

Trenngel (10 % Acrylamid) und einem Sammelgel (4 % Acrylamid) . Die Elektrophorese wur-

de üblicherweise ON mit 12,5 mA pro Gel durchgeführt . Nach der Gelelektrophorese wurden

die Gele mit Coomassie Brilliant Blue 0,05 % in 25 % lsopropanol, 10 % Essigsäure gefärbt.

Abweichend hiervon wurden sogenannte native Gele hergestellt, die anstelle von

Harnstoff Glycerin enthielten (s . Kap . 4 .4)

2.3.4

Western-Blot-Analyse

Zur immunologischen Detektion durch Western-Blotting wurden die Proteine nach

Auftrennung im SDS-Gel durch efektrophoretisehes Blotting auf PVDF-Membranen

(Millipore) Obertragen (Towbin et al ., 1979) . Der Nachweis des spezifisch gebundenen Anti-

körper erfolgte durch einen zweiten, an alkalische Phosphatase gekoppelten Antiköper, der

gegen Immunglobulin aus Kaninchen gerichtet war (Hensel et al ., 1990). Nach 15-minütiger

Aquilibrierung in Blotpuffer (0,01 M CAPS/NaOH pH 11, 10 % Methanol) wurde das Gel zum

Transfer in den Semi-Dry-Blotter (Pharmacia) gelegt (Ausubel et al ., 1989) . Der Transfer

erfolgte über 1 bis 2 h bei 0,8 mA/cm 2. Die PVDF-Membran wurde 1 h in Blockpuffer (50 mM

Tris/HCI pH 7,4, 0,9 % NaCl, 5 % Milchpulver) bei RT geschüttelt, anschließend zwei mal mit

Waschpuffer (50 mM Tris/H CI pH 7,4, 0,9 % NaCl) 15 min gewaschen und anschließend mit

dem spezfischen Antikörper in einer Konzentration von 1 :250 bis 1 :30000 in Waschpuffer bei

4°C ON oder bei RT über 2 bis 4 h inkubiert . Danach wurde die Membran drei mal mit

Waschpuffer gewaschen (je 15 min) und mit dem zweiten an alkalische Phosphatase konju-

gierten Antikörper bei RT 1 bis 2 h geschüttelt . Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer

(ie 15 min) wurde die Färbereaktion durchgeführt . Unmittelbar vor Gebrauch wurden 10 ml

Puffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCI 2 , 100 mM Tris/I-ICI pH 9,5) mit je 66 pl NBT-Lösung (0,5 g

Nitroblau-Tertazolium in 10 ml 70 % Dimethylformamid) und BICP-Lösung (0,25 g Bro-

mochforo-indolylphosphat in 10 ml 50 % Dimethylformamid) gemischt und zur Membran ge-

geben. Die Reaktion wurde nach etwa 10 min durch in 20 mM PBS gelöstes EDTA gestoppt.

2.4

Spezielle Methoden

2.4.1

EinstellunglBestimmung der externen Osmolalität

Die Osmolalitäten [osm/kg] wurden mittels eines kryoskopischen Osmometers

(Osmomat 030, Gonotec) bestimmt . Die Einstellung der Osmolarität der jeweiligen externen


Puffer erfolgte durch Zugabe entsprechender Mengen von 1 M Saccharoselösungen zu dem

jeweils verwendeten externen Puffer.

2.4.2

Chemische Modifizierung des PIC

Die für die Aufnahme einer Kinetik notwendige reversible Inaktivierung wurde durch

Behandlung der Proteoliposomen mit Mersalylsäure (0,3 mM) oder pCMBS (0,3 mM) er-

reicht . Beide Agentien wurden in H 20 bzw. verd. NaOH gelöst, und als gefrorene Stammlö-

sungen verwendet . Diese Inaktivierung konnte durch Zugabe von 10 mM DU aufgehoben

werden. Die irreversible Inaktivierung des Proteins erfolgte durch Behandlung des in SLS

soiubilisierten PIC durch frisch angesetztes NEM (Endkonzentration 2 mM) . Überschüssiges

NEM wurde anschließend durch Zugabe von 10 mM DU reduziert.

2.5

Molekularbiologische Arbeiten

2.5 .1

Nährmedien und Kultivierungsbedingungen für E. coll

Für die Kultivierung und Plasmidisolierung wurde LB-Vollmedium (Sambrook et al ., 1989) 10

g NaCl, 10 g Trypton, 5 g Hefe-Extrakt, ad 1 1 Aqua dest .) verwendet, für die Expression

wurden die Zellen in 2xYT-Medium (Sambrook et al ., 1989) (5 g NaCl, 15 g Trypton, 10 g

Hefe-Extrakt, ad 1 i Aqua dest .) kultiviert . Für die Herstellung von Agarplatten wurde LB-

Medium mit 15 gll Agar autoklaviert . Die Bestimmung des Zellwachstums erfolgte photome-

trisch (Novaspec 2, Pharmacia) bei einer Wellenlänge von 600 nm (0D600) . Für alle Klonie-

rungsschritte wurden ausschließlich die Stämme DH5arcr und JM109 eingesetzt . Für die

Mutagenese wurden die entsprechenden Fragmente in pUC18 kloniert . Die Expression der

Konstrukte (pNYHM131 -Derivate) erfolgte aussschließlich in dem Stamm BL21 (DE3)sm ~.

2.5.2

Isolierung von DNA

Die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coil wurde nach einer modifizierten Methode von

Birnboim & Doly (1979) durchgeführt . Plasrnide wurden in einem Maßstab von 2-4 ml Über-

nacht-Kultur mit dem GFX® micro Plasmid Prep Kit (Pharmacia, Freiburg) nach den Anga-

ben des Herstellers präpariert.


2.5.3

Restriktion und Modifikation von DNA

Alle Techniken zur Restriktion, Präzipitation, Klenow- oder alkalischer Phosphatase-

behandlung wurden nach Sambrook et at . (1989) durchgeführt . Ligationen wurden mit dem

`ready to go ligation kit' (Pharmacia, Freiburg) 45 min bei 16°C durchgeführt . Die gelelektro-

phoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte in 0,8 oder 1 %igen Tris-Acetat-

EDTA-(TAE) Agarosegelen (Sambrook at al ., 1989). Zur Isolierung von DNA-Fragmenten

aus Agarosegelen wurde das `QiaEx-kit' der Firma Qiagen (Hilden) nach Angaben des Her-

stellers verwendet.

2 .5 .4

Transformation von E. tali

Als Standard-Methode für die Transformation von E . coli wurde die Methode von

Chung et at . (1989) verwendet . Die Zellen wurden bei einer OD600 von 0,4 geerntet und in

1/10 des Ausgangsvolumens TSS-Puffer (LB-Medium, mit 10 % Polyethylenglykol 8000, 5 %

DMSO, 50 mM MgSO 4) resuspendiert . Nach Zugabe der Plasmid-DNA wurden die Zellen 30

min auf Eis und anschließend 60 min bei 37°C irrkubiert . Alternativ wurden kompetente Zel-

len, die nach einer Vorschrift von Inoue et al., 1990 präpariert worden waren zur Transfor-

mation verwendet.

2.5 .5

Generieren der tags durch PCR

Die PCR-Reaktion wurde im Thermal-Cycler 480 (Perkin-Elmer, Norwalk, USA)

durchgeführt . Die Reaktionsansätze wurden nach Zugabe der Taq-Polymerase mit Mineralöl

überschichtet um einen Volumenverlust durch Verdampfen zu vermeiden . Die Annealing-

Temperatur und die Zeit der Kettenverlängerung wurden je nach eingesetztem Primer und

Größe des zu amplifizierenden Fragments variiert. Eingesetzt wurden folgende Konzentra-

tionen und Mengen : Primer 1, 1 pM; Primer 2, 1 pM; Matrizen-DNA, ca . 0,1 pM ; dNTP Mix,

100 pM ; Taq 10x-Puffer (+ Mg 2`), 10 pl ; H2O ad 100 pi ; Taq-Polymerase, I Unit.

Der verwendete Taq 10x-Puffer bestand aus 100 mM Tris-HCI, pH 8,3, 15 mM MgCI2 , 0,5M

KCI, 1 mglml Gelatine . Die für die Einführung der tags verwendeten Primer sind in Tabelle 2

aufgeführt. Die arrtplifizierten Fragmente wurden anschließend unter Verwendung der Re-

striktionsenzyme Kpnl/BamHl in pUC18 kloniert und sequenziert . Anschließend erfolgte die

Rückklonierung in pNYHM131 .


Abbildung 4 : Plasmid pNYHM131 mitdem für den PIC kodierenden Gen.Für die Einführung der tags wurdendie Schnittstellen BamHl und Kpn!verwendet . Für die Mutagenese anCystein 28 und der 1 . Helix wurde dievon den Schnittstellen Ndel und Ncolbegrenzte Kassette in pUC18 kloniert.

Tabelle 2: Primer für tags . Die Antisense-Primer entsprechen dem C-Terminus des PIC, dem entsprechendentag (fett) und besitzen außerdem eine BamHl-Schnittstelle (unterstrichen) . Der Primer TagS entspricht Base 666-

680 des PIC -Gens auf dem Plasrnid pNYHM131.

Tag Sense

Primer

His -Tag AS 5'- GGA TCC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ACC ACC

ACC ACC AAT TIC -3'

Flag -Tag AS 5'-GGA TCC CTA CTT GTC ATC GTC GTC CTT GTA GTC ATG

ACC ACC ACC ACC -3'

Ta ' S S 5'-GAC TGC TGG l l

GGC -3'

2.5 .6

Ortspezifische Mutagenese

Für alle K!onierungsschitte wurden des Plasmid pUC18 verwendet . Hierzu wurden die

entsprechenden Fragmente aus dem Expressionsvektor pNYHM131 in pUC18 umkloniert.

Die Mutagenese des Cysteins an Position 28 wurde unter Verwendung des QuikChangeTM

Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Heidelberg) durchgeführt . Hierzu wurden kom-

plementäre Primer (21-27mere) benutzt, welche in der Mitte das auszutauschende Codon

besaßen (Tabelle 3) . Es wurde eine PCR mit den entsprechenden Primern, dem Plasmid

pUC18 und Pfu-Polymerase durchgeführt, bei der das ganze Plasmid amplifiziert wurde.

Nach Durchführung der PCR wurden die eingesetzten DNA-Templates durch eine zuge-

setzte DNAse (Dpnl, Zielsequenz: 5'-GmsATC-3') verdaut, wodurch sich die Wahrscheinlich-


keif einer anschließenden Transformation mit einem Plasmid ohne Mutation erheblich ver-

ringert . Hierzu wurde Plasmid DNA aus dem Stamm E coil JMi109 isoliert.

Nach Isolierung des Plasmids wurde ein Ndell/Vcol Fragment in pUC18 umkloniert

und zur Mutagenese verwendet .Nach Verifizierung der eingeführten Mutation wurden die

entsprechenden Fragmente in pNYHMl131 zurückkloniert.

Tabelle 3: Primer fur Mutagenese . Die Codons, die ausgetauscht wurden, sind fett dargestellt

Mutation Sense Primer

G 24 K S

5'- C GCC CTA GCC AAA GCC ATA GGG TG -3'

AS

5'- CA CCC TAT GGC M GGC TAG GGC G -3'

1 26 K S

5'- A GCC GGC GCC AAA GGG TGC GGG -3'

AS

5'- CCC GCA CCC TT T GGC GCC GGC T -3'

C 28 1r' S

5' - GC GCC ATA GGG GT C GGG T CAS ACT CA -3 '

AS

5'- TG ACT CGA CCC GAC CCC TAT GGC GC -3'

C28K S

5' .- GC c-CC ATA GGG ° GGGGTOGACTCA-3'

AS

5'- TG AGT CGA CCC CU T CCC TAT GGC GC -3'

C 28 E S

5'- GC GCC ATA GGG GAG GGG TCG ACT CA -3'

AS

5'- TG AGT CGA CCC C'TC CCC TAT GGC GC -3'

028 VV S

5°- GC GCC ATA GGG TGC GGG TOG ACT CA -3'

AS

5'- TG AGT CGA CCC CCA CCC TAT GGC GC -3'

S 30 K S

5'- C GGG TGC GGG AAA ACT CAC TCC AG -3'

AS

5'- CT GGA GTG AGT TTT CCC GCA CCC T -3'

H 32 K S

5'- C GGG TCG ACT AAA TCC AGT ATG GTC -3'

AS

5'- GAC CAT ACT GGA TTT AGT CGA CCC -3'

S 34 K S

5'- G ACT CAC TCC AAA ATG GTC CCG ATC -3'

AS

5'- GAT CGG GAG CAT TTT GGA GTG AGT C -3'

V 36 K S

5'- CAC TCC AGT ATG AAA CCG ATC GAT GTC -3'

AS

5'- GAG ATC GAT CGG TTT CAT ACT GGA GTG -3'

1 38 K S

5'- GT ATG GTC CCG AAA GAT GTC GTT AAG -3'

AS

5'-CU AAG GAG A T C TTT O GG GAC CAT -3'

2.5.6 .1

►DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung der isolierten DNA-Fragmente nach der Kettenabbruchmethode

von Sanger et al . (1977) wurde nicht-radioaktiv mittels 'Automated Laser Fluoreszenz'

durchgeführt (A .L.F., Pharmacia LKB, Freiburg) . Die Sequenzierreaktionen wurden mit dem

`AutoRead m Sequencing Kit' (Pharmacia, Freiburg) nach dem `fast protocol' des Herstellers

durchgeführt . Alternativ wurden Sequenzierungen auf einem ABI PRISM Th" 310 Genetic Ana-

lyzer (Perkin Elmer) durchgeführt . Die Sequenzierreaktion hierzu wurde auf einem Ther-


mocycler Gene Amp° PCR System 9700 (Perkin Elmer) durchgeführt . Das entsprechende

Konstrukt in pUC18 wurde mit dem Universal-Primer (Pharmacia) und dem BigDye Termi-

nator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer, Applied Biosystems) unter Verwendung folgender

Mengen sequenziert : Primer 5 pmol, Plasmid 1 pg, Ready Reaction Mix 6 pl, H2O ad 20 pl.

2.6

Dialyse

Um das anionische Detergens Sodium-Lauroylsarcosinat gegen andere nicht-

ionische Detergentien auszutauschen wurde das zuvor solubilisierte Protein dialysiert . Hierzu

wurde das Solubilisat mit dem entsprechenden zusätzlichen Detergens versetzt, in einen

Dialyseschlauch überführt und vier Ma! für 12-16 h bei 4°C gegen einen tausendfachen

Überschuß an Puffer dialysiert . Die Einzelheiten und Resultate der Dialyse sind im Ergebni-

steil ausführlich dargestellt.

2 .7

Chromatographische Methoden

Die Ni-NTA-Affinitätschromatographie wurde auf einem GradiFrac System der Firma

Pharmacia durchgeführt . Zur Isolierung entsprechender Proteinkonstrukte Ober Interaktion

des eingeführten Histidin-Tags mit Ni e+ wurde 5 ml Ni-NTA-Agarose in Econosäulen (200mm

x 5 mm) der Fa . Biorad verwendet . Die Isolierung der Proteine erfolgte nach der Vorschrift

des Herstellers unter nicht-denaturierenden Bedingungen . Hierzu wurde die Säule in Puffer

A (300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO 4 , pH 8,0) äquilibriert . Vor der ersten Affinitätschromato-

graphie an Ni-NTA-Agarose wurden die dialysierten Proben zentrifugiert, um präzipitiertes

Protein zu entfernen . Die Probe wurde auf die equilibirierte Ni-NTA-Agarose Säule aufgetra-

gen. Nach Auftrag des Proteins auf die Säule wurde mit drei Säulenvolumina Puffer B

(Puffer A mit 10 % Glycerin) gewaschen . Die Elution wurde mit einem !midazolgradienten (0-

500 mM) durchgeführt . Bei einer Imidazolkonzentration von etwa 250 mM erfolgte die Elution

des an die Säule gebundenen Proteins . Nach der Elution wurden die entsprechenden Frak-

tionen mit Centrikon-Röhrchen der Fa . Amicon (Ausschlußgrenze 30 kDa) aufkonzentriert

U

mit - ulem [ :•i- die Chromatographie an der Anti-FLAG t A tii EELaLoi lu I IEL

SLt die

uU

it5t . ..4g Zivs' benötigten P ,

U er

umgepuffert . Alle bei der Chromatographie verwendeten Puffer enthielten 0,1 % C12E8 um

eine Präzipitation des Proteins zu verhindern . Die Chromatographie mit der Anti-FLAG Affi-

nitätsagarose wurde in den vom Hersteller zur Verfügung gestellten Säulen nach der mitge-

lieferten Vorschrift durchgeführt . Hierbei wurde die entsprechende Proteinlösung fünf Mal

über die zuvor mit TBS-Puffer (50 mM Tris/HCI, 150 mM NaCl, pH 7.4, 0 .1% C12E 8 .) equli-

brierte Säule gegeben. Danach wurde mit TBS gewaschen und anschließend mit FLAG-

Peptid in TBS (73pg/ml) eluiert. Nach der Elution wurden die Proteinlösungen wieder mit

Gentriton Röhrchen -Aussch!ußgrenze 30 kDa- aufkonzentriert .

Analyse des rekombinanten PIC 27

3 Ergebnisse

3.1

Charakterisierung der Cysteinmutanten des PIC

Die zur molekularen Aufklärung der induzierbaren Effluxfunktion des PlCsc unter-

suchten Cysteinmutanten wurden in der Arbeitsgruppe von H . Wohlrab (Boston) kloniert und

freundlicherweise für die Untersuchungen zur Verfügung gestellt . Der PlCs besitzt 3 Cy-

steinreste (Abbildung 5), welche einzeln bzw . in verschiedenen Kombinationen gegen Serin

ausgetauscht wurden . Es wurden folgende Mutanten generiert und analysiert : Cys28Ser,

Cys134Ser, Cys300Ser, CysI341300Ser, Cys2811341300Ser.

Neben der Bestimmung der kinetischen Parameter wie V,na, und Km sollten die Mu-

tanten insbesondere im Hinblick auf die durch Modifizierung mit SH-modifizierende Agentien

induzierten funktionellen Veränderungen untersucht werden.

Cytopiasma

C

II

1H

IV

V

VI

MatrixAbbildung 5 : Putative Transmernbrantopologie des PICsc abgeleitet aus Hydropathieplots . Die drei Cysteinrestesind durch Pfeile gekennzeichnet . Der Bereich der Phospholipidmembran ist dunkel unterlegt eingezeichnet .

28 Analyse des rekombinanten PIC

3.1 .1

Wirkung von Inhibitoren

Um die grundlegenden kinetischen Parameter der Cysteinmutanten zu bestimmen,

mußten sowohl Vor- als auch Rücktauschexperimente durchgeführt werden . Für die Durch-

führung der Rücktauschexperimente ist eine Größenausschlußchromatographie notwendig.

Hierdurch kann das externe Medium ausgetauscht werden . Sowohl für die Messung des Pi -

/OH -Antiports als auch des Uniports muß das extern vorliegende, markierte Phosphat ab-

getrennt werden. Voraussetzung hierfür ist die Inhibition des PIC, da sonst das Substrat

während und nach der Chromatographie durch die Pi -/O -Antiporttaktivität des PlC expor-

tiert wird . Daher wurde zuvor die Wirkung aller Modifizierungsagentien auf den WT-PIC und

die Mutanten untersucht . Da die erforderliche reversible Inhibition des Carriers auf der Modi-

fizierung von Cysteinresten beruht, war bereits vor Beginn der Experimente klar, daß bei ei-

nigen Mutanten Probleme mit dieser Inhibition auftreten würden . Es wurden Experimente mit

allen Cysteinmutanten durchgeführt, in denen der Pi /r i'-Antiport in Gegenwart verschiede-

ner Inhibitoren gemessen wurde.

Tabelle 4: Wirkung der eingesetzten Modifizierungsagentien auf den wt-PIC und die verschiedenen Cysteinmu-tanten . Dargestellt ist jeweils die prozentuale Restaktivität im Pi7Pr -Antiportmodus bezogen auf das unmodifi-zierte Protein . Die Zugaben erfolgten in der angegebenen Reihenfolge . Der pH-Wert betrug 6,8 . Die Inkubations-zeiten und Konzentrationen für die eingesetzten Agentien waren : PLP (20 mM), 5 min ; Mersalyl (0,3 mM), 15min ; pCMBS (0,3 mM), 15 min ; DTT (5mM), Start der Kinetik ; HgCI2 (1 mM), Start der Kinetik.

Carrier Zugabe von Restaktivität [%]

1 . 2 . 3.

wt-PIC iviers . < 3

wt-PIC pCMBS 5

Wt-PIC Mers . DTT 102

wt-PIC PLP < 3

wt-PIC Mars . D- I"'T' PLP < 3

C28S pCMBS 6

C28S Mers . 6

C28S HgCI2 29

C134S pCMBS 45

C134S Mers . 36

C300S pCMBS 7

C300S Mers . < 5

C134S1C300S Mers . 89

C28SIC134SIC300S Mers . 76

Im Falle des WT-PIC wurde außerdem die Reaktivierung durch DTT und die, für das Ab-

stoppen bei Aufnahme einer Kinetik notwendige, abschließende Inaktivierung durch PLP ex-


emplarisch gemessen. Hierbei zeigte sich, daß die Mutanten, bei denen das Cystein 134

gegen Serin ausgetauscht worden war, nur schlecht durch Mersalylsäure und pCMBS inhi-

biert werden konnten (Tabelle 4) . Der Austausch von Cystein 28 und Cystein 300 gegen Se-

rie allein hatte keinen Einfluß auf die Inhibierbarkeit des Carriers . Die Doppelmutante

Cys134Ser/Cys300Ser weist gegenüber der Einfachmutante C134S jedoch eine noch gerin-

gere Sensitivität gegenüber Mersalylsäure auf, was einen additive Effekt durch die Modifika-

tion des Cystein 300 anzeigt . Den größte Anteil an der Inhibition des Phosphattransportes

durch Behandlung mit Mersalylsäure hat jedoch das Cystein 134.

3.1 .2

Eine alternative lnhibitionsmethode

Aufgrund der schlechten Inhibition durch pCMBS und Mersalylsäure wurde für die

entsprechenden Mutanten eine alternative Meßmethode entwickelt . Während der Grdßen-

aussohlußchrornatographie wurde ein pH-Gradient angelegt, der den Export von Phosphat

verhindern sollte . Dieser pH-Gradient war dem bei Abtrennung des äußeren Substates ent-

stehenden Phosphat-Gradienten entgegengesetzt . Hierzu wurden Kontrollexperimente

durchgeführt, in denen die Wirksamkeit der beiden lnhibitionsmethoden an wt-PIC kontrol-

liert und verglichen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt und belegen die

Wirksamkeit der pH-Gradienten-Methode . Bei der Rekonstitution wird ein pH-Wert von 6,8

eingestellt um eine optimale Transportaktivität zu erhalten . Bei der nachfolgenden Größen-

ausschlußchromatographie wird normalerweise durch die Inhibition des PIC mit Mersalylsäu-

re verhindert, daß das interne Substrat ([ 33P]Phosphat-markiert) durch die Pr-Netto-

Transportaktivität des PlC exportiert wird . Bei den Mutanten in denen Cystein 134 durch Se-

rie ausgetauscht wurde, wurde in diesen Fällen der pH-Wert des bei der Größenausschluß-

chromatographie verwendeten Puffers auf 5,3 gesenkt . Hierdurch konnte der Export von

Substrat erfolgreich inhibiert werden . Anschließend konnte der Pl -Netto-Transport durch

Anheben des pH-Wertes auf 6 .8 gemessen werden . Die Induktion des Efflux erfolgte durch

Zugabe von 1 mM HgCI 2 .

Tabelle 5: Vergleich der reversiblen inhibition des PI --Nette-Transports durch Mersalylsäure reit der pH-

Gradienten Methode anhand des WT-PIC . Angegeben ist die Geschwindigkeitskonstante 1 . Ordnung [min1J fürzwei Transportmodi des PIC.

Experiment Mersalyl 0,3 mM Inverser pH-Gradient

Kontrollea <0,01 0,06

PrIOH"-Antiport 0,73 0,60

HgCl2 induzierter Efflux 0,56 0,41

a Kontrolle bedeuted entweder ohne Ent€emen des Mersalyis durch Zugabe von DU, bzw . ohne pH-Shift von 5,2

auf 6,8.


3.1 .3

Die physiologischen Transporteigenschaften der Cysteinmutanten

Bevor mit der eigentlichen Zielsetzung der durchgeführten Studien, der Untersuchung

des Eff€uxmodus begonnen werden konnte, mußten zunächst die grundlegenden kinetischen

Parameter wie Km- und Vmm Werte der physiologischen Transportfunktionen bestimmt wer-

den. Zur Bestimmung der internen Km- Werte wurde interne Phosphatkonzentration zwi-

schen 0,1-30 mM variiert, während die externe auf 30 mM eingestellt wurde . Zur Messung

der externen Km -Werte wurde entsprechend umgekehrt vorgegangen . Die ermittelten Km-

Werte sind in Tabelle 6 aufgelistet . In

Abbildung 7 sind exemplarisch die Eadie-Hofstee Plots für die internen und externen

KM-Werte von WT-PIC und der Mutante Cys28Ser dargestellt.

Tabelle 6 : KM-Werte der Phosphatcarrier aus Rinderherz-und Hefemitochondrien bzw . E.coli inclusion bodies fürPhosphat an der internen bzw . externen Bindungsstelle . Die Experimente wurden bei pH 6,5 (PICsHM) und 6,8(PlCsc) durchgeführt.

Herkunft des Carriers Carrier Ext . Km-Wert [mM] int . ,M-Wert [mkt]

Rinderherz (PICBHM )`

S. cerevisiae

wt-PIC

wt-PiC

1,8 ± 0,1

2,Oa

9,4 ± 0,5

S. cerevisiae Wt-PIC 1,18 ± 0,1 b 8,9 ± 0,7

inclusion bodies C28S 1,35 ± 0,2 8,1 ± 1,7

C134S 1,45 ± 0,2

C300S 1,45 ± 0,3

C134SIC300S 6,9 ± 0,5

C28S/C134SIC300S 10,0 ± 0,8

a PiIOH -Antiport Modus, gemessen als Phosphat Netto-Aufnahme, Guerin et a!. (1990)Dieser Wert wurde von Wohlrab und Briggs (1994) zu 1,3 mM bestimmt (Pi"7OH --Antiport, gemessen als Phos-

phat Netto-Aufnahmeaus Stappen und Krämer, 1993

Die Bestimmung der K,;,-Werte zeigt sich keine außergewöhnlichen Abweichungen von den

Werten des wi-PiC . Die Bestimmung der Vm Werte für die physiologischen Transportmodi

zeigte, daß alle Mutanten aktiv sind, und daß das Verhältnis der beiden Modi (Pi7PI -Antiport

und PI--Netto-Transport) in etwa dem des wt-PIC entsprach (Abbildung 6).


Carrier

Abbildung 6 : Bestimmung der Vmax -Werte für WT-PIC und alle Cysteinmutanten . Pi7Pi -Antiport (schwarze Bal-ken), gemessen im Vortausch mit int. und ext . 30mM Phosphat, PiIOH--Antiport (graue Balken) gemessen imRücktausch mit 30 mM int . Phosphat . Alle Werte sind auf den PiiPi -Ant iiport des WT-PIC (100 %) bezogen.

Abbildung 7 : Eadie-Hofstee Plot für Pi-/Pi -Antiport des PIC . Gezeigt sind die Daten für den wt-PIC () und dieMutante C28S (®) . A : Variation der externen Phosphatkonzentration zur Bestimmung des externen K M-Wertes.B : Variation der internen Phosphatkonzentration zur Bestimmung der internen K M-Werte. Die KM-Werte wurdenbestimmt zu 1,12 mM (WT-PIC 1 . ,), 8,9 mM (WT-PIC,,,t), 1,7 rnMi (Cys288erEM.) und 8,1 . mM (Cys28SeW

12a-

110 -

100 -

90-

80 -

70 -

B

4 8 t0


3.1 .4E

Untersuchungen zur Effluxinduzierbarkeit

Zur Untersuchung der Effluxinduktion wurden die entsprechenden Proteoliposomen

mit 30 mM t33P]Phosphat vorbeladen, inhibiert und das externe Substrat durch Größenaus-

schlußchromatographie abgetrennt . Zum Start der Kinetik wurden die Proteoliposomen mit 1

mM HgCI2 behandelt . Der Stop erfolgte durch Zugabe von PLP in Kombination mit DTT . Die

Efflux-Aktivitäten sind in Abb 3 .3.4 im Vergleich zu den Pi /Pi"-Antiport Aktivitäten dargestellt.

im Gegensatz zu den physiologischen Transportaktivitäten, die in alien Mutanten erhalten

geblieben waren, zeigte sich bei einigen Mutanten kein meßbarer Efflux . Ein Vergieich der

Mutanten Cys28Ser und Cys134Ser mit dem WT-PIC verdeutlicht die Unterschiede in Bezug

auf die Induzierbarkeit der Effluxfunktion . Während die Aktivität in den drei Transportmodi

bei Cys134Ser in etwa dem WT-PIC entspricht, kann bei alien Mutanten, in denen das Cy-

stein 28 gegen Serin ausgetauscht worden war, auch durch höhere Konzentrationen an

HgCI2 kein Efflux mehr induziert werden . (Abbildung 8) . Hierdurch kann die Induktion des Ef-

flux eindeutig mit der Modifizierung des Cysteins 28 in direkten Zusammenhang gebracht

werden .

CarrierC28S

Abbildung 8 : Geschwindigkeitskonstanten k des Efl :luxmodus (schraffierte Balken) im Vergleich mit dem Pi7Pi°-Antiportmodus (schwarze Balken) . Pi7Pi --Antiport gemessen im Vortausch mit int . und ext . 30 mM Phosphat, Ef-

flux gemessen im Rücktausch mit 30 mM int . Phosphat .


3 .1 .5

Einflüsse von Substratanaloga

Für eine detailliertere mechanistische Untersuchung der Effluxfunktion in Bezug auf

die transportierten Substrate, eine Beteiligung der Substratbindungssteilen und mögliche

Trans-Effekte, wurden neben Phosphat verschiedene nichtphysiologische Substrate einge-

setzt . Bislang war die Tatsache, daß externes Phosphat den Efflux von internem Phosphat

blockiert, der einzige Hinweis dafür, daß trotz der Entkopplung eine Interaktion zwischen der

externen Bindungsstelle und den auch beim Efflux stattfindenden Konformationsänderungen

des Proteins stattfindet . Hieraus wurde gefolgert, daß der Translokationsweg für das Phos-

phat in beiden Transportmodi identisch ist, und daß sich durch die Modifizierung kein alter-

nativer Weg innnerhalb des Proteins ergibt (Stappen und Krämer 1993) . Als unphysiologi-

sche Substrate wurden sowohl Sulfat, als auch ein Phosphatanalogon, der Phosphonoamei-

sensäureester (PFA) eingesetzt . PFA ist als Inhibitor des Phosphattransporters aus der Nie-

re bekannt (Kempson 1988) . Hier bindet er vermutlich an die Substratbindungsstelle, wird

0

Erl-• . .

ig

e

50 -- r

0

2

4

8

8

iß

12

Zeit [min]

Abbildung 9 : Inhibition des HgCI 2 induzierten Efflux von Phosphat (~) durch 5 mM Phosphat (V), 5 mM PFA (A),5 mM Sulfat (0) . Intern 30 mM Phosphat, pH 6,8.

aber nicht oder nur schlecht transportiert . PFA sollte mit Phosphat und dem, nur im Ef-

fluxmodus transportierten Sulfat verglichen werden . Da PFA nicht radioaktiv markiert verfüg-

bar war, konnten die Transport-, bzw . Bindungsstudien nur indirekt durchgeführt werden . Es

wurden Versuche durchgeführt, bei denen der Einfluß externer Anionen (Phosphat, PFA,


Sulfat) auf die Geschwindigkeit alter drei Transportmodi gemessen wurde . Proteoliposomen

wurden mit [ 33PlPhosphat vorbeladen . Nach Inhibition mit Mersalylsäure wurde sowohl der

Pi -/OH'-Antiport (Zugabe von Die') als auch der Effluxmodus (Zugabe von HgCI 2) induziert.

Extern wurden jeweils 5 mM Phosphat, Sulfat bzw . Phosphonoameisensäure (PFA) zugege-

ben. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 7 zusammengefaßt . Der Pr-/OH --Antiport wird durch

Phosphat und PFA, nicht aber Sulfat beschleunigt . Die Auswirkungen auf den Efflux von

Phosphat sind genau umgekehrt. Phosphat und PFA wirken inhibierend, während Sulfat,

welches kein Substrat des Phosphatcarriers ist keinen Einfluß auf den Efflux von Phosphat

hat (Abbildung 9) . Der Zusatz von externem PFA beim Pi -IPi--Antiport wirkt ebenfalls inhibie-

rend . Die Inhibition des Pi -/Pi -Antiports durch PPA wurde noch detaillierter untersucht und es

konnte gezeigt werden, daß PFA den homologen Phosphataustausch hemmt (K, : 0,75 mM,

Abbildung 10).Tabelle 7 : Einfluß von extern zugesetzten Anionen auf die Transportaktivität des PICsc . Angegeben ist dieTransportaktivität in % bezogen auf die Aktivität des jeweiligen Modus ohne Zusätze.

Transportmodus

Zugabe

Phosphat

von:

5 mM Sulfat 5 mM PFA 5 mM

Pi7PF-Antiport

a n.b . 50

Pi-IOK-Antiport

150 96 160

induzierter Efflux

32 105 48

'in diesem Fall sind extern 30 mM Phosphat zugegen

0,5 -

-0,4

Abbildung 10 : t.ineweaver-Burk-Plot : Abhängigkeit der Geschwindigkeit des PiIPi --Antiports von der Konzentrati-on des externen Phosphats (ohne Inhibitor W, mit 5mM PFA extern o).

Analyse des rekombinanten PIC 35,

3.2

Konstruktion und Analyse von Punktmutanten mit verschiedenen AS an Position

von Cystein 28

Nachdem festgestellt worden war, daß die Modifizierung von Cystein 28 für die In-

duktion des Effluxmodus verantwortlich ist, wurden Mutanten generiert, in denen das für die

Induktion des Effluxmodus essentielle Cystein an Position 28, gegen verschiedene andere

Aminosäuren ausgetauscht wurde . Es wurden sowohl geladene (Lysin, Glutaminsäure), als

auch ungeladene Aminosäuren verschiedener Größe (Valin, Tryptophan) eingeführt Hier-

durch sollte geklärt werden, ob die Induktion der Effluxfunktion auf die Einführung einer La-

dung, oder auf eine einfache sterische Veränderung der entsprechenden Proteindomäne zu-

rückzuführen ist.

3.2 .1

Allgemeine Eigenschaften der Mutanten

Alle generierten Mutanten zeigten gut meßbare Aktivitäten im Pi7Pi'-Antiport Modus

die durch Behandlung mit Mersalylsäure (0,3 mM) auf weniger als 2 % der ursprünglichen

Transportaktivität reduziert werden konnte . Die Pi/Pi -Antiportaktivitäten der Mutanten

Cys28Glu und Cys28Trp waren jedoch ziemlich gering. Die Rücktauschexperimente zur Be-

stimmung der Pi/OH --Antiport und Efflux Aktivitäten wurden in einer leicht variierten Ver-

suchsanordnung bestimmt, da die Vermutung bestand, daß sich die Eigenschaften der PIC-

Mutanten bezüglich des unidirektionalen Phosphattransports geändert haben könnten . Die

Proteoliposornen wurden nach der üblichen Markierung des internen Substratpools mit Mer-

salyl inhibiert. Anschließend wurde die Gelfiltration bei 4°C durchgeführt, statt wie sonst üb-

lich bei Raumtemperatur . Der Start der Kinetik erfolgte durch Zugabe von DTT (Pi -/OH -

-Antiport), DU + Phosphat (Pi-/PF-Antiport) oder isoosmolare Saccharose (Kontrolle) und

gleichzeitigem 'Anheben der Temperatur auf RT. Die Ergebnisse sind in Abbildung 11 darge-

stellt . Bei den Ri sktauNC,versuchen balgte sich, lost `as nn.ei ite Cys28Lys iri. Gegensatz

zu alien anderen Mutanten trotz der Inhibition durch Mersalylsäure, Phosphat aus den Pro-

teoliposomen exportierte . Die übrigen Mutanten zeigten dieses Verhalten nicht, d .h . sie lie-

ßen sich durch Mer salyl vollständig inhibieren und der Export von Phosphat konnte erst

durch DTT wieder induziert werden (Pi/OH Antiport) . Der Vergleich zwischen dem HgCl 2 -

induzierten Efflux beim wt-PIC und der Mutante Cys28Lys legt den Schluß nahe, daß der Ef-

flux durch eine positive Ladung an Position 28 induziert wird . In der Mutante Cys28Lys ist

der Efflux quasi konstitutiv . Außerdem fällt auf, daß der Pi-IPi--Antiport bei der Mutante

Cys28Lys erheblich langsamer ist, als der Pi /OH Antiport, was dem Phänomen der

Transinhibition beim HgCI 2 modifizierten WT-PIC entsprechen würde. Da zu vermuten ist,

daß die Induktion der Effluxfunktion durch Modifizierung des Cysteins 28 ausschließlich un-

physiologischer Natur ist, d .h. das Cystein 28 zufällig in einer, für die Kopplung kritischen

Region liegt, lag die Frage nah, ob der Effekt auch durch Einführen einer positiven Ladung


in der unmittelbaren Umgebung des Cysteins 28 induziert werden kann . Die sich hieraus er-

gebende Fragestellung wird in Abschnitt 3 .3 ausführlich behandelt.

C28E

C28WWt C28KC28V

Carrier

Abbildung 91 : Rücktauschversuche zur Messung der Effluxeigenschaften der Cystein 28 Mutanten . Alle Aktivitä-ten sind in % dargestellt, bezogen auf die Aktivität des Pr/Pr-Antiports durch den WT-PIC . Schwarze Balken : Pi-/Pi--Antiport internes Phosphat 30 mM, externes Phosphat 10 mM, pH intern und extern 6,8 ; graue Balken Pr/OH --Antiport, internes Phosphat 30 mM, pH int . 6,8, pH ext . 8,0, schraffierte Balken, Export von Label nach Zu-gabe von 300pM Mersalyl (konstitutiver Efflux)

3.2.2

Efflux unphysioiogischer Substrate

Für den PIC BHM und den PICsc aus intakten Mitochondrien konnte nach der Induktion

der Effluxfunktion auch der Efflux diverser unphysiologischer Substrate beobachtet werden.

Die Untersuchungen der Mutanten an Position 28 sollten durch Effluxmessungen mit dem

unphysiologischen Substrat Sulfat ergänzt werden . Hierzu wurden die Proteine wie üblich

rekonstituiert, mit dem Unterschied, daß die radioaktive Markierung (50mM [ 35S]Sulfat) be-

reits vor der Abreicherung des Detergens, d .h . vor der Bildung der Proteoliposomen hinzu-

gefügt wurde, da Sulfat nicht carriervermittelt in die Liposomen transportiert werden kann .


C28V

C28K

C28E

Carrier

C28Wwt wt mod.

Abbildung 12 : Efflux von [ S]Sulfat. Die entsprechenden Carrier wurden in Gegenwart von 50 mM [ 35 S]Sulfat re-konstituiert . Anschließend wurden die Kinetiken wie im Text beschrieben aufgenommen . wt mod . steht fairHgCI2-modifizierten WT-PIC . Alle Transportaktivitäten sind auf die Aktivität des WT-PIG vermittelten Efflux bezo-gen.

Nach der Rekonstitution wurde die externe Markierung durch eine Crößenausschlußchro-

matographie bei 4°C abgetrennt und die Kinetik durch Anheben der Temperatur auf Raum-

temperatur gestartet . Die Ergebnisse sind in Abbildung 12 dargestellt. Als Referenz diente

der durch HgCl2 modifizierte WT P!C . Außer bei der Referenz konnte nur bei der Mutante

C28K ein Efflux von f 35S3Sulfat gemessen werden. Dies wurde als Beleg für die molekulare

Ähnlichkeit von HgCl2-modifiziertem Cysteinrest und dem Lysinrest bei der Effluxinduktion

gewertet, d .h . die molekulare Ursache für den Efflux ist eine positive Ladung in Position von

Cystein 28 .


3.3

Lysin-scanning Mutagenese

Die durch Einbringen der positiven Ladung in Position 28 induzierbare Entkopplung

des Transports sollte bezüglich der Positionierung der positiven Ladung innerhalb der, den

experimentellen Befunden nach für die Kopplung interessanten Bereich der ersten Helix

weiter charakterisiert werden . Dies sollte durch Einführen von positiven Ladungen an ver-

schiedenen Positionen innerhalb der 1 . Helix realisiert werden . Es wurden an verschiedenen

Positionen, die sowohl oberhalb als auch unterhalb des Cysteins 28 liegen (Abbildung 13),

Lysin-Punktmutationen erzeugt (Gly24, 11e26, His32, Ser34, Va136, Iie38), Die Positionen

dieser neu eingeführten Lysinreste befinden sich teilweise auf der selben, teilweise auf der

entgegengesetzten Seite der Position des Cysteins 28 (Abbildung 13)

G Iy29

A

B

Abbildung 13 : A: Helical-Wheel-Plot eines Abschnitts der 1 . Helix des PIC . 3 : Transmembrantopologie der I . He-lix . Die Positionen an den Lysinreste eingeführt wurden, sind jeweils hervorgehoben.

Die Aminosäuren innerhalb der ersten Helix, welche durch Lysin ersetzt wurden, sind

in Abbildung 13 in Aufsicht (A : Helical-Wheel-Plot) als auch in einer Seitenansicht der 1 . He-

lix gezeigt . Mit diesen Mutanten wurden dieselben modifizierten Rücktauschexperimente

durchgeführt wie zuvor mit den Cys28X Mutanten . Die gemessenen Effluxaktivit6ten sind in

Analysedesrekombinanten PIC 39

Abbildung 14 zusammen mit den gemessenen Werten für den Pi7PF-Antiport und den

P! -/OH --Antiport dargestellt Die Pi -/OH --Antiport Funktion wurde zusätzlich detaillierter analy-

siert . Die Ergebnisse werden in Abschnitt 3 .3 .1 behandelt. lm Vergleich zum WT-P!C ist die

Aktivität einiger Mutanten, wie zum Beispiel der Mutante Gly24Lys äußerst gering . Das für

den WT-PIC typische Verhältnis der Aktivitäten von Pi7PI -Antiport und Pi7OH"-Antiport ist

jedoch erhalten geblieben . Die insgesamt geringen Transportaktivitäten könne sowohl auf

eine veringerte Membraninsertionsrate der entsprechenden Mutanten, z . B. aufgrund von

Faltungsproblemen, als auch direkt auf die Transporteigenschaften des Proteins zurückzu-

führen sein.

140

120

100

80

60

40

20

Abbildung 14 : Rücktauschversuche zur Messung der Effluxeigenschaften der Mutanten der Lysin-scanning- Mu-

tagenese. Schwarze Balken : P1 IPr -Antiport Internes Phosphat 30 mM, externes Phosphat 10 mM, pH intern undextern 6,8 ; raue Balken Pi7OH"-Antiport, internes Phosphat 30 mM, pH int . 6,8, pH ext . 8,0, schraffierte Balken,Export von [Pj Phosphat nach Zugabe von 0,3 mM Mersalyl (konstitutiver Efflux).

Auffällig ist jedoch, daß auch bei der Mutante, bei der das als transportessentiell be-

kannte Histidin 32 (Phelps et al., 1996) gegen Lysin ausgetauscht wurde, beide physiologi-

schen Transportmodi zu beobachten sind . Ein konstitutiver Efflux kann ausschließlich bei der

schon bekannten Mutante Cys28Lys und bei der Mutante His32Lys gemessen werden . Das

letztere Ergebnis ist insofern erstaunlich, da ein Histidinrest unter Umständen ebenso wie

Lysin eine positive Ladung aufweist .


3.3.1

Abhängigkeit des Pi -/OH--Antiports von einem pH-Gradienten

Um das Entkopplungsphänornen des Efflux aus einer anderen experimentellen Richtung zu

charakterisieren, wurden Versuche gemacht, an allen Lysinmutanten der 1 . Helix den Pi -/OH"

-Antiport in Abhängigkeit von einem Protonengradienten zu messen . Hierzu wurden spezielle

Vortauschexperimente durchgeführt, bei denen herkömmliche Proteollposomen verwendet

wurden, die jedoch ohne Phosphat hergestellt wurden . Hierdurch konnte der Phosphat-

Netto-Transport (PI -/OH --Austausch) im Vortausch gemessen werden . Zum Starten der Ki-

netik wurden 50 pl Proteoliposornen mit 200 pl einer externen Lösung vermischt, die 10 mM[ 33P]Phosphat enthielt . Der pH-Wert der Liposomenfraktion also auch des internen Volu-

mens betrug 8,0 (50mM HEPES), der der externen Lösung betrug vor dem Mischen 5,2 (50

mM PIPES) und nach dem Mischen etwa 5,4 was somit dem externen pH-Wert wärend der

Messung entsprach . In den Experimenten in denen kein Protonengradient aufgebaut wurde,

betrug der interne und externe pH-Wert 7,5 . Die Kinetik wurde wie üblich durch Zugabe von

40 mM PLP gestopt. Anschließend wurden 200 pl des Transportansatzes auf die in üblicher

Weise präparierten Dowexsäulen aufgetragen und eluiert.

WT-PIC, der in Anwesenheit eines Protonengradienten eine normale Aufnahmeakti-

vität aufwies, zeigte in Abwesenheit des Protonengradienten eine weitaus geringere Aktivi-

tät. Interessanterweise war die Initialgeschwindigkeit in beiden Fällen gleich hoch, der

Transport kam aber ohne pH-Gradienten nach ca . 30 s zum Erliegen (Abbildung 15) . Wenn

man unter den Bedingungen von gleichem pH intern und extern, davon ausgeht, daß au-

schließlich eine Eguilibirierung des internen und externen Phosphatpools stattfindet, so wird

bei Vorhandensein eines pH-Gradienten dieser dazu genutzt, einen internen P1-Pool mit ei-

ner Konzentration > 10 mM zu akkumulieren . Die Transportaktivität der anderen Mutanten

war, wie bereits erwähnt, in einigen Fällen äußerst gering . Bei zwei der Mutanten (Cys28Lys,

His28Lys) konnte jedoch interessanterweise ein Phosphattransport gemessen werden, der

unabhängig von einem pH-Gradienten war . Die Phosphataufnahme erfolgte unter beiden

Bedngungen etwa wie beim WT-PIC in Abwesenheit eines Protonengradienten (Abbildung

16). Die Phosphataufnahmeaktivitäten der Mutanten sind in Abbildung 17 im Vergleich dar-

gestellt .


600 -

500

400 -

.o..Q -- . . .o 0 . .---- . . . . . . 0200

100

20

40

60

80

100

120

Zeit [s]

Abbildung 15 : Aufnahme von Pr durch WT-PIC in Liposomen, intern 0 mM PF, extern 10 mM P1, mit ( ) und oh-ne (O) pH-Gradienten A pH 2,6.

250 -0

--•o- . .- .---

o . .

200

150 -

100

i-t

20

40

60

80

100

120

Zeit [s]

Abbildung 16 : Aufnahme von Pl durch Mutante His32Lys in Liposomen, intern 0 mM Pr, extern 10 mM Pr, mit() und ohne (O) pH-Gradienten A pH 2,6 .


E

C28K H32K S34K V36K

138K

Carrier

126Kwt-PIC G24K

Abbildung 17 : Die Phosphataufnahmeaktivität der verschiedenen Mutanten der Lysin-scanning-Mutagenese inAbhängigkeit von einem Protonengradienten . Graue Balken zeigen die Phosphatautnahme in Anwesenheit, diegestreiften Balken in Abwesenheit eines Protonengradienten .

Konstruktion von Heterodimeren 43

3.4

Konstruktion von Heterodimeren

Erste Hinweise auf eine Assoziation von Monomeren als Voraussetzung für die

Funktionalität ergab sich aus anfänglichen Rekonstitutionsexperimenten, bei denen die zur

Rekonstitution optimale Proteinmenge bestimmt werden sollte . Zum einen zeigte sich hier,

daß der in SLS solubilisierte PIC nicht direkt, d .h. unter ausschließlicher Verwendung von

SLS rekonstituiert werden kann . Außerdem hatte sich gezeigt, daß bei Rekonstitution kleiner

Proteinmengen keinerlei Aktivität gemessen werden konnte . Bei den Arbeiten mit dem aus

Rinderherzmitochondrien isolierten PIC (Stappen und Krämer, 1993) hingegen führten be-

reits kleine Mengen an Protein zu deutlich meßbaren Transportaktivitäten (Abb . 4 .2) . Im Be-

reich kleiner Proteinmengen ergab sich hier ein linearer Zusammenhang zwischen der, dem

Rekonstitutionsansatz zugesetzten Proteinmenge und der gemessenen Transportaktivität.

In den Experimenten mit dem in SLS solubilisierten PIC aus E.coli inclusion bodies

ergab sich ein sigmoider Zusammenhang zwischen zugesetzter Proteinmenge und gemes-

sener Aktivität . Bis zu einem ProteinlLipid-Verhältnis von etwa lieg 1 mg ist keine meßbare

Aktivität vorhanden . Hier muß man davon ausgehen, daß pro Liposom nur ein Monomer re-

konstituiert wurde, welches für sich allein nicht funktionell aktiv ist . Die Ergebnisse der ver-

schiedenen Rekonstitutionsexperimente sind in Abbildung 4 .2 zusammen dargestellt . Um si-

cherzustellen, daß bei der Rekonstitution der kleinen Proteinmengen das Protein nicht durch

Adsorption an die Wände der verwendeten Reaktionsgefäße aus der Rekonstitutionsansatz

entfernt wird, wurde ein Dotblot mit den rekonstituierten Froteoliposonien durchgeführt, der

ebenfalls in Abbildung 18 zu sehen ist . Es wurden steigende Mengen His-PIC rekonstituiert.

Anschließend wurden von allen Proben 4 pl auf die Blotmembran aufgetragen . Der Nach-

weis des rekonstituierten Proteins erfolgte mit Ni-NTA-Konjugat wie unter Material und Me-

thoden beschrieben . Auch bei Rekonstitution kleiner Proteinmengen ist eine signifikante

Menge Protein in den rekonstituierten Fraktionen zu finden .

44 Konstruktion von Heterodimeren

_A--

E

Protein 1 Lipid [pg I mg]

Abbildung 18 : Aktivität des PIC in Abhängigkeit von dem zur Rekonstitution eingesetzten ProteinlPhospholipid-Verhältnis . Rekonstituiert wurden : (E) PICsc aus SLS, (A) PICsc nach Dialyse in C12E8, (o)PICSRM aus intaktenMitochondrien in Triton X-114 (Daten aus Stappen 1994) . Dotbiot : Aufgetragen wurden 4 pi, Punke entsprechenin steigender Konzentrationfallender Konzentration : 0 ; 0,1 ; 0,25 ; 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 3,0 [pglmg(Lipid)].

3.4.1

Dialyse

Die Grundvoraussetzung für die Konstruktion von Heterodimeren ist das Vorhanden-

sein von Protein in monomerem Zustand, welches unter definierten Bedin gungen in die di-

mere Form überführt werden kann. Bei der Analyse des rekombinanten PlC mittels Po-

lyacrylamid-Gelelektrophorese hatte sich gezeigt, das das rekombinante Protein in dem zur

Solubilisierung verwendeten Detergens SLS genau dasselbe Laufverhalten aufweist, wie in

SDS. Der PlC erscheint sowohl in SLS als auch in SDS bei einem apparenten Molekularge-

wicht von 32 kDa, was dem Molekulargewicht des monomeren PIC entspricht . Da iekannt

war, daß mitochondriale Carrier nach Isolierung aus intakten Mitochondrien mit Hilfe von

nichtionischen Detergentien wie C12E8 oder Triton X-114 als Dimer vorliegen, sollte versucht

werden, das anionische Detergens SLS gegen ein nichtionisches auszutauschen, was durch

Dialyse realisiert wurde . Hierzu wurde das aus den inclusion bodies in SLS solubilisierte

Protein (s . Material und Methoden) mit zusätzlichem Detergens versetzt und dialysiert . Ein

Gegensatz zu den nichtionischen Detergentien, die verwendet wurden, besitzt SLS eine re-

lativ hohe cmc von 13,7 mM (C12E8 cmc 0,11 mM) und läßt sich durch Dialyse gut entfernen.

Eine Aussage über die nach der Dialyse vorhandene Menge an SLS zu machen, ist relativ


schwierig, da man hierzu Experimente mit radioaktiv markiertem SLS hätte durchführen

müssen. Die Resultate der nachfolgenden Chromatographieschritte lassen jedoch den

Schluß zu, daß nur eine relativ geringe Menge SLS nach der Dialyse vorhanden war, da sich

in Vorversuchen gezeigt hatte, daß bereits relativ geringe Mengen an SLS (i .A. anionische

Detergentien) die Affinitätschromatographie an Ni-NTA-Sephadex empfindlich stören . Es

wurden verschiedene nichtionische Detergentien getestet, um das SLS bei der Solubilisie-

rung des Proteins zu ersetzen . Die Ergebnisse in Bezug auf die Ausbeute und die Aktivität

des nach der Dialyse gewonnenen Proteins sind in Tabelle 8 dargestellt.

Tabelle 8 : Ausbeute an Protein nach der Dialyse und Phosphattransportaktivitat nach Rekonstitution des PIC ausverschiedenen Detergentien . PIC wurde in SLS solubilisiert und in Gegenwart verschiedener Detergentien dialy-siert . Die Ausbeute bezieht sich auf die Proteinkonzentration zu Begin der Dialyse . Die Transportaktivität wurdeals homologer Pi7PF-Austausch in Vortauschexperimenten gemessen.

Detergens Aubeute Transportaktivität

Dime! /min mg Prot .]

TX-114 60-115 144 ±18

TX-100 45±8 108±21

CSE, 12±5 36±8

C 12 E 8 82 ± 10 180 ± 25

C 72 E8 + 2% EYPC 95 ± 6 182 ± 18

Dodecylmaitosid 74 ± 12 54 ± 16

Es zeigte sich, daß C12E8 am besten geeignet war, große Mengen Protein mit guter

Aktivität zu erhalten . Eine weitere Verbesserung der Ausbeuten konnte durch Zugabe von 2

% der ebenfalls zur Rekonstitution verwendeten Phospholipide zu den dialysierten Proben

erzieltb werden.

ikonnte hierdurch nur gdes

jedoch nochinochwEDiea P'~nilYn kti vi tLal

eriln Iglfld lyfsügin ~, die¢di e-;I.¢ .~v~.a.sc~.A Isbeute d

~

einma l von 82 % auf 95 % gesteigert werden.

Die Zusammensetzung der bei der Dialyse verwendeten Puffer ist in Tabelle 9 auf-

geführt . Die Zielsetzung bei der Zusammenstellung der Puffer war in erster Linie, eine Ag-

gregation des Proteins zu verhindern. Hierzu wurde 5 m M DU zugesetzt, urn eine Oxidation

von Cysteinen und somit eine u .U . stattfindende unkontrollierte Sulfidbrockenbildung zu

vermeiden. Außerdem wurde Glycerin zugesetzt, um hydrophoben Wechselwirkungen, die

ebenfalls zur Aggregation führen können zu reduzieren . Der pH-Wert wurde mit Ausnahme

des letzten Puffers so gewählt, daß er in dem Bereich lag, in dem der PIC BHM seine höchste

Aktivität aufweist (Stappen und Krämer, 1993). LiCI als Salzbestandteil des ersten Puffers

wurde wegen der milden chaotrophen Eigenschaften des Lia-Ions ausgewählt . Die Überle-

gung war, daß der aus den inclusion bodies solubilisierte monomere und vermutlich denatu-

rierte PIC durch die Zugabe eines chaotropen Reagens leichter aus energetisch ungünsti-

gen Konformationen in die native Form zurückgefaltet werden kann . Die folgenden Puffer


enthielten im weiteren KCl als Salz, wobei hier die Konzentration in Puffer 3 auf 200 mM ge-

senkt wurde. Der letzte Puffer entsprach in seiner Zusammensetzung dem bei der Chroma-

tographie an Ni-NTA-Agarose verwendeten Equilibrierungspuffer . Hierbei mußte auf die Zu-

sätze OTT und NaN 3 verzichtet werden, die beide nicht mit der bei dem folgenden Chroma-

tographieschritt verwendeten Ni-NTA-Agarose kompatibel sind (Reduktion des Ni e+ ).

Tabelle 9 : Zusammensetzung der bei der Dialyse verwendeten Puffer . Angegeben ist jeweils das Salz, der zuge-setzte Puffer und der eingestellte pH-Wert . Alle Puffer wurden vor der Dialyse frisch angesetzt und entgast . DTTwurde jeweils (Puffer 1-3) nach dem Entgasen zugesetzt.

Puffer Salz

Puffer

0,06 % NaN 3 10 %Glycerin 5mM DTT

1

LICI 400 mM PIPES 20 miVi, pH 6,5

+

+

+

2

KCl 400 mM PIPES 20 mM, pH 6,5

+

+

+

3

KCl 200 mM PIPES 20 mM, pH 6,5

+

+

+

4

NaCl 300 mM Na2HP04 50 mM, pH 8,5

+

-

3 .4 .2

SLS-Gelelektrophorese

Um Unterschiede zwischen dem dialysierten und dem SLS-solubilisierten Protein zu

zeigen, wurde eine spezielle Gelelektrophorese durchgeführt . Hierbei wurde das anionische

Detergens SLS verwendet . Außerdem wurde der in den SDS-Polyacrylamid-Gelen verwen-

dete Harnstoff durch Glycerin ersetzt . Die Proben wurden mit Probenpuffer, der bis auf den

Austausch von SDS gegen SLS und die Abwesenheit von iviercaptoethanol identisch mit

dem für die SDS-PAGE verwendeten ist, versetzt, bei 37°C für 10 min geschüttelt und auf

das Gel aufgetragen . In Abbildung 19 ist ein SLS-Gel im Vergleich zu einem herkömmlichen

SLS-Gel dargestellt . Für beide Gele wurden identische Proben verwendet und wie oben,

bzw. unter Material und Methoden beschrieben, aufgearbeitet.

Die erste Probe enthielt das dialysierte Protein (in C 12Es), die zweite SLS-

solubilisiertes Protein mit dem Zusatz von C12E8 und die dritte enthielt ausschließlich SLS-

solubilisiertes Protein . Während der einfache Zusatz von C12E8 keine Veränderung im Lauf-

verhalten des PIC bewirkt, wird nach der Dialyse d .h . dem Austausch von SLS gegen C12Es

ein signifikant höheres Molekulargewicht beobachtet . Das apparente Molekulargewicht (ca.

42 kDa) entspricht jedoch nicht dem, weiches man für ein PIC-Dinier annehmen würde (ca

62 kDa). Wenn man das dialysierte Protein im SDS-Gel mit den beiden anderen Proben

vergleicht, so sieht man in alien drei Fällen ein apparentes Molekulargewicht von 32 kDa.

Das bedeuted das das in C12E8 solubilisierte, dialysierte Protein in Gegenwart von SLS über

einen längeren Zeitraum stabil ist, während der Zusatz von SDS wieder zur Monomerisie-

rung des PIC führt .


Awy

3 4 5

94 kDa

67 kDa

43 kDa

30 kDa

20 .1 kDa

1

‘B

1 2 3 4

Abbildung 19 : Gelelektrophorese des PIC in verschiedenen Stadien der Aggregation . A: Nicht denaturierendeBedingungen in SLS (12 % Gel mit 10 % Glycerin, 0,1 % SLS, Coomassie gefärbt) . B Denaturierendes SDS-Ger(12 % SDS PAGE, Coomassie gefärbt) : Spur 1 und 5 Standard ; Spur 2 : PIC in C12E8 nach Dialyse; Spur 3 : PICin SLS mit Zusatz von C 12 Ea; Spur 4 : PIC in SLS . Die Markerproteine wurden in dem jeweiligen, für das Gel ver-wendete Detergens solubilisiert.


3 .4.3

Chromatographie - Isolierung eines Heterodimers

Um die Bildung von Heterodimeren zu charakterisieren, müssen sowohl die Mononie-

re, als auch die entstehenden Dimere experimentell unterscheidbar sein . Hierzu wurden zwei

verschiedenen tags an den C-Terminus des PlCsc fusioniert . (Abbildung 20) . Der erste ver-

wendete tag ist der His-tag der aus 6 Histidinresten besteht, eine hohe Affinität zu Ni e{-Ionen

besitzt und eine Aufreinigung Ober Ni-NTA-Agarose ermöglicht . Der zweite verwendete tag

ist der sog . FLAGS-tag. Hierbei handelt es sich um ein Oktapeptid, das eine Aufreinigung

über an Sepharose gekoppelte Antikörper ermöglicht .

His-Tog

Abbildung 20 : PIC mit beiden zur Aufreinigung an den C-Terminus fusionierten tags. Histag : 5 zusätzliche Histi-dine ergeben mit dem C-terminalen His3l 1 die 6 erforderlichen Histidine . FLAG-Tag: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-000H.

Die Expression erfolgte wie unter Abschnitt 2 .2 .2 beschrieben . Beide getagten Carri-

er zeigten jeweils für sich rekonstitutiert eine dem WT-PIC vergleichbare Transportaktivität

(Tabelle 1 n).

Tabelle 10 : Transportaktivitäten der getagten WT-PIC Konstrukte . FLAG-PIC und His-PIC,im Vergleich zum ungetagten WT-PIC . Zusätzlich angegeben sind die Aktivitäten nachBehandlung des Carriers mit 2 mM NEM irrt SLS-so€ubilisieten Zustand.

Carrier Transportaktivität nach Zugabe von

[p sol 1 min mg] 2 mM NEM

Wt-PIC 124 3

His-PIC 110 C 1

FLAG-PIC 95 n.d .

Zur Dimerisierung wurden die unter Abschnitt 4 .4 beschriebenen Dialyseschritte

durchgeführt . HisTag-PIC (His-PIC) und FLAGTag-PIC (FLAG-PIC) wurden in SLS solubili-

siert, zu gleichen Teilen gemischt und dialysiert . Nach der Dialyse und erfolgten Dimerisie-


rung können theoretisch folgende Carrierspezies zugegen sein: Zum einen die beiden Ho-

modimere [FLAG-PIC]2 und [His-PIC] 2 und zum anderen das gewünschte Heterodimer [His-

P1C/FL AG-PIC] . Bei einer, der Statistik folgenden Dimerisierung sollten hierbei je 25 % Ho-

modimer und 50 % Heterodimer entstehen . Diese der Dimerisierung zugrundeliegenden An-

nahmen wurden durch entsprechende Experimente verifiziert (Abschnitt 3 .2 .5 .2) Darüber-

hinaus sind wahrscheinlich auch noch Anteile an falsch gefaltetem, nicht dimerisiertem Pro-

tein [FLAG-PIC] und [His-PIC] vorhanden. Die Isolierung des Heterodimers erfordert die auf-

einanderfolgende Anwendung der zwei, den tags entsprechenden Chronatographiemateria-

lien. Die Isolierung ist schematisch in Abbildung 21 dargestellt.

1 . Solubilisierung in SLS

FLAG His

2. ivi SChen der donor sere

3. Austausch von SLS gegen nichtionisches Detergensdurch Dialyse (Dimerisierung)

4.Ni-NTA-Chromatographie (Affinität zu 6His-Tag)

5a. Durchfluß

5b. Eluat

His

6. Anti-FLAG-Affinitätschromatographie

7a. Durchfluß

7b. Eluat

Abbildung 21 : Schema der Isolierung eines Heterodimers . PIC-Konstrukte mit zwei verschiedenen tags (His-tagund FLAG-tag) wurden exprimiert und in SLS als Monomere solubilisiert . Die Monomere wurden gemischt, undzum Austausch des SLS gegen C12 E8 dialysiert, was zu einer Dimerisierung führte . Das resultierende Gemischaus Monomeren, Homo- und Heterodimeren wurde auf eine Ni-NTA-Agarose Säule aufgetragen . Hierdurchkonnten die Konstrukte die einen His-Tag aufwiesen isoliert werden . Durch den zweiten Chromatographieschrittmit der Anti-FLAG-Säule können so die entstandenenHeterodimere isoliert werden .


Bei beiden folgenden Chromatographieschritten wurde streng nach den Angaben des

jeweiligen Herstellers des Säulenmaterials vorgegangen (Abschnitt 2 .7) . In Abbildung 22 ist

eine Kinetik dargestellt, die nach Rekonstitution des in dieser Weise gewonnenen Kon-

struktes aufgenommen wurde . An dem Konstrukt konnten beide fags durch Western-Blotting

nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht gezeigt) Durch die zwei aufeinandefolgenden

Chror, atographieschritte waren die Ausbeuten an aktivem Protein jedoch gering (Tabelle

11). Eine funktionelle Charakterisierung war mit diesen Mengen nicht möglich . Die Methode

mußte also im Hinblick auf eine Steigerung der Ausbeuten modifiziert werden.

140-

60 --

40 -

20

2 4

Zeit [min]

Abbildung 22 : Kinetik des Pi -/PiAntiports durch [His-PIC/FLAG-PIC] Heterodirner. P hosphatkorkzentration internund extern 30 mini, pH 6,8 .

86


3.4.4

Entwicklung einer alternativen lsolierungsprozedur

Durch die aufeinanderfolgende Applikation der zwei Affinitätssäulen war es prinzipiell

möglich, Heterodimere zu isolieren . Die Ausbeuten waren jedoch gering, sodaß diese Me-

thode nicht geeignet war, die isolierten Heterodimere funktionell zu charakterisieren . Um den

zweiten Chromatographieschritt zu umgehen, wurde eine Methode entwickelt, die es ermög-

lichte, das entsprechende Heterodimer auch mit einem Chromatographieschritt anzurei-

chern. Hierzu wurden die entsprechenden lVlonomere nicht, wie sonst üblich im Verhältnis

1 :1, sondern im Verhältnis 1 :7 miteinander gemischt . Unter der Voraussetzung, daß sich alle

Dimere mit der gleichen Wahrscheinlichkeit bilden, was durch Kontrollexperimente verifiziert

wurde (Abschnitt 4 .7), ergab sich die unten erläuterte theoretische Verteilung an dimerem

Protein .

Die zu mischenden Monomere sind mit A bzw. B bezeichnet . Die Anzahl der Teilchen

wird mit n bzw. m bezeichnet. Die Gesamtmenge ergibt sich aus m + n = N . Die Bildungs-

wahrscheinlichkeiten für die entsprechenden Diniere ergeben sich wie folgt:

P (AA) = m(m-1) I N(N-1)

P(AB) = 2mn 1 N(N-1)

P(BB) = n(n-1) 1 N(N-1)

Aufgrund der hohen Teilchenzahlen n und m können mit c(A) = m/N die Wahrschein-

lichkeiten direkt berechnet werden, die in diesem Fall identisch mit den relativen Häufigkei-

ten sind:

P(AA) = c(A)2

P(AB) = 2c(A)(1-c(A))

P(BB) _ c(B) 2

Pür das Verhältnis 1 :7 ergibt sich also c(A) = 118 und somit ergeben sich für die entstehen-

den Diniere folgende Näuflgkeiten:

Formel Anteil vor Affinitätssäule nach Affinitätssäule

P(AA)=c(A)2= (118) 2 1164 1,5% 7%

P(AB) =.2c(A) (1-c(A)) 14164 22 % 93 %

P(BB) = (1-c(A))2 . 49164 76,5 %

100% 100%


Gibt man dieses Proteingemisch Ober eine Af#initätssäule, die eine Affinität zu dem

Protein A aufweist, isoliert man nur die Dimere AB und AA . Der Anteil des erwünschten He-

terodimers AB am Gesamtprotein, welches mit Hilfe der Säule isoliert wird beträgt demzufol-

ge etwa 93 % . Die Aktivität des Homodimers AA (7 %) kann bei den meisten kinetischen

Messungen vernachlässigt werden . Die Ausbeuten an Protein konnten durch die 1 :7-

Methode deutlich gesteigert werden . In Tabelle 11 sind die Ausbeuten und Aktivitäten der

entsprechenden Fraktionen nach den verschiedenen Chromatographieschritten aufgelistet.

Tabelle 11 : Ausbeuten und Aktivitäten verschiedener Konstrukte

Zeitpunkt : Zustand Methode Carrier Aktivität Proteinmenge

nach Detergens Konstrukt [pmol/min mgt

[mg]

Solubilisierung S! S lfl1T-PIC 124 4,5 ± e,5

Solubilisierung SLS His-PIC 11 V

Solubilisierung SLS FLAG-PlC 95

Dialyse C12 E$ WT-PIC a 180 3,8 ±

0,4

Dialyse C 12 E 8 1 :1 HT ¢ FT a 168

Ni-NTA-Säule C 12 Es 1 :1 [HT/FT], [HT/HT] b 152 0,5 ± 0,1

Ni-NTA-Säule C 12 E 8 1 :7 [HT/FT], [HTIHT] b 153

Anti-FLAG-Säule C12E8 1 :1 [HT/FT] 185 0 .08 ± 0,02

a:dimerisiert, bzw . verschiedene Dimereb:Verhältnis von Hetero zu Homodimer ist abhängig von angewandter Methode (1 :1 ; 117) siehe Abschnitt 4.6

3 .4 .5

Heterodimerer PIC - Gezielte Inaktivierung von Monomeren

3 .4 .5 .1

Inhibition des PICsc durch NEM

Voraussetzung für die Konstruktion von Heterodimeren, in denen nur ein Monomer

aktiv ist, ist die irreversible Inhibition eines Monomers und die anschließende Dimerisierung

mit einem unmodifizierten Monomer. Zur Inaktivierung wurde N-Ethylmaleirnid (NEM) ver-

wendet, welches Cysteine irreversibel modifiziert . Freies NEM kann anschließend durch Zu-

gabe von DTT inaktiviert werden . Der Phosphatcarrier konnte hierdurch vollständig inhibiert

werden, was eigentlich im Widerspruch zu älteren Beobachtungen stand . Es wurden daher

Experimente durchgeführt, welche die inhibitorische Wirkung von NEM auf den PlCsc im re-

konstituierten System genauer zeigen sollten . Dazu wurde wt-PIC und die Mutante C28V

sowohl vor, d .h. in SLS solubilisiert, als auch nach der Rekonstitution mit verschiedenen


Konzentrationen an NEM behandelt . Anschließend wurden die Aktivitäten der jeweiligen

Fraktionen bestimmt . Die Ergebnisse sind in Abbildung 23 dargestellt . Die inhibitorische Wir-

kung auf den bereits rekonstituierten PIC K spiegeln die am nativen PICsc beobachteten

Verhältnisse wider. Die halbmaximale Inhibition wird im Falle des WT-PIC bei einer ge-

schätzten Konzentration von ca 3 mM erreicht, im Falle der Mutante C28V sind hierzu noch

höhere Konzentrationen nötig . Im solubilisierten Zustand ist die Empfindlichkeit beider Carri-

er um ein Vielfaches höher, was höchstwahrscheinlich auf den monomeren und wahrschein-

lich teilweise entfalteten Zustand des Proteins zurückzuführen ist (Albildung 24) . NEM ist

somit für die Inaktivierung des monomeren PIC geeignet.

140

aE 120

E 10o

80

G

1,0

60

40

20

i

r

E

0,0

0,5 1,5

2,0

1=di r . ,,E's

Abbildung 23 : Aktivität des WT-PIC ( I) und der Mutante C28V (o) in Abhängigkeit von der, nach der Rekonsti-tution zugesetztem Menge NEM . Die Transportaktivitäten wurden als Pi/PF-Antiport mit 30 mM Phosphat int . undext . bestimmt .


Zeit [min]

Abbildung 24 : Kinetik des PiIPT-Antiports durch His-PIC, nach Behandlung mit 2 mM NEM (o) und unmodifiziert(a), Phosphat intern und extern 30 mM.

3.4 .5 .2

Konstruktion eines halbseitig inaktivierten ®invers

Die Tatsache, daß es in vitro zur spontanen Bildung von ®irreren aus monomer vor-

liegendem Protein kommt, ist natürlich bestenfalls ein Hinweis auf die funktionelle Notwen-

digkeit einer Dimerisierung . lrr Grunde ist hierduch keine weitergehende Aussage möglich

als durch den experimentellen Befund, daß in vivo dimere Carrier aus intakten Mitochondrien

isoliert werden (Hackenberg und Klingenberg, 1980 ; Lin et a!., 1930). Der experimentelle

Ansatz, ein Heterodimer zu konstruieren, bei dem eines der Monomere inaktiviert worden

war, eröffnete die Möglichkeit zwischen, der funktionell notwendigen und der, z .B. durch

einfache Affinitäten und räumliche Nähe erfolgten Dimerisierung, zu differenzieren . Zur Kon-

struktion eines halbseitig inaktivierten Diners wurde der in SLS solubilisierte His-PlC mit

NEM behandelt und nach dem Abreagieren des NEM durch Zugabe eines Überschusses an

an- mit der siebenfachen Menge des unbehandelten 1=L G-PlC gemischt . Die gemischten

Proteinfraktionen wurden wie oben beschrieben dialysiert . Als Kontrolle wurde außerdem

eine Mischung aus nicht inaktivierten Monomeren, und eine Mischung bei der beide Mono-

mere zuvor inaktiviert wurden, durchgeführt . Anschließend wurden die entsprechenden Kon-

strukte, wie in Abschnitt 2 .7 beschrieben, chromatographisch isoliert .


Zeit [min]

Abbildung 25 : Kinetik des PI IPI -Antiports durch verschiedene nach der in Abschnitt 3 .4 .4 beschriebenen Metho-de isolierten Konstrukte (1 Teil His-PIC, 7 Teile FLAG-PIC) : unmodifiziertes Homodimer [His-PIC]2 (o), unmodifi-ziertes Heterodimer [His-PIC/FLAG-PIC]

halbseitig durch NEM inaktiviertes Heterodimer [His-PIC(NEM)IFLAG-PIC] (A), vollständig durch NEM inaktiviertes Heterodimer [His-PIC(NEM)IFLAG-PIC(NEM)]

(v) .

In Abbildung 25 sind die Kinetiken der in dieser Art und Weise gewonnenen Konstrukte dar-

gestellt . Das unmodifizierte Konstrukt zeigt eine Phosphattransportaktivität von 153

[prnollmin mg], gemessen als Pi -IPr-Antiport, während des Konstrukt aus zwei modifizierten

Monomeren ebenso wie rekonstituierte NEM-behandelte Monomere, fast vollständig inaktiv

ist . Interessanterweise ist das halbseitig inaktivierte Konstrukt ebenfalls inaktiv, was den

Schluß zuläßt, daß zwei intakte Untereinheiten, die miteinander interagieren, nötig sind, um

Phosphattransport zu katalysieren . Es gab prinzipiell zwei Argumente gegen diese Interpre-

tation . Der eine Einwand wäre, daß der PIC zwar dimerisiert, jedoch als Monomer aktiv ist,

und nur durch eine Art Transeffekt des NEM-inaktivierten Monomers die Aktivität des ande-

ren, aktiven Monmers unterdrückt wird . Das zweite Argument wäre eine Inaktivierung aller

Monomere durch verschlepptes NEM. Beide Argumente konnten durch ein Experiment in

dem eine Mixtur aus gleichen Teilen NEM-inaktiviertem monomerem His-PIC und unbehan-

deltem monomerem FLAG-PIC rekonstituiert wurde, ausgeschlossen werden . Die gemesse-

ne Aktivität dieser Mischung zeigt deutlich, daß die Homodimere aus FLAG-PIC die sich bei

diesem Experiment gebildet haben, trotz der Anwesenheit von NEM-inaktivierter His-PiC ak-


tiv sind (Tabelle 12). Diese Mischung zeigte sogar eine geringfügig größere Aktivität, als

man für eine Dimerisierung der eigesetzten Monomere annehmen würde.

Es mußte außerdem gezeigt werden, daß die Bildung von Heterodimeren mit dersel-

ben Wahrscheinlichkeit geschieht wie die der Homodimere . Hierzu wurde ein Rekonstituti-

onsexperiment mit SLS-solubilisiertem Protein durchgeführt . NEM-inaktivierter His-PIC und

aktiver FLAG-PIC wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und rekonstituiert . Es

wurden jeweils die Aktivitäten der rekonstituierten Proteinmischung bestimmt . Die Eckdaten

des Versuchs waren aus bereits durchgeführten Versuchen bekannt. Die Rekonstitution, bei

der ausschließlich inaktiviertes Protein eingesetzt wurde, sollte keine Aktivität, die unbehan-

delte die volle Aktivität aufweisen . in dem Bereich zwischen beiden Mischungen sollte bei

Rekonstitution eines, in rnonornerer Form aktiven Carriers die Aktivität linear zunehmen . Im

Fall eines Dinners wäre eine, einer quadratischen Gleichung zugrundeliegende Kurve zu er-

warten, welche bei einer vorliegenden Präferenz zur Homodimerbildung mehr oder weniger

von der Idealform abweichen würde . In Abbildung 26 sieht man, daß der Verlauf der Aktivität

ziemlich gut mit dem für das Dimer angenommenen übereinstimmt, was wieder für die funk-

tionelle Notwendigkeit der Dimerisierung spricht . Außerdem entspricht der Verlauf dem

Idealverlauf der Kurve, d .h. alle Dimere bilden sich mit der gleichen Wahrscheinlichkeit.

3

1

€

~

20

40

60

SO

% unmodifiziertes Protein

Abbildung 26 : Aktivität verschiedener Mischungen aus NEM-inaktivierten und unmodifiziertem Carrier . WTPIC(NEM)TWT-PiC (i) ; offene Kreise: His-PiC(NEM)/PLAG-PIC(O) . Die gestricheite Linie gibt den hyphotheti-sehen Verlauf für Monomere, die durchgezogene für Dimere als aktive Einheiten an . Die Aktivität wurde als Vo-lumenaktivität bestimmt . Die Gesamtproteinmenge im Ansatz belief sich auf 7pglmg Lipid .


Durch diesen experimentellen Ansatz konnte gezeigt werden, daß die Bildung der

Dimere aus verschiedenen Monomeren gleichberechtigt erfolgt, und somit die statistischen

Voraussetzungen für die Durchführung der 1 :7 Methode erfüllt sind . Außerdem konnte durch

diesen Versuch erneut demonstriert werden, daß die dimere Form des PIC die aktive Einheit

darstellt.

Tabelle 12 : Aktivitäten der verschiedenen teilweise NEM-behandelten PIC-Konstrukte . Die Konstrukte befindensich in verschiedenen Detergentien und somit entweder in der monomeren (SLS) oder dinieren (C12E8) Form.Die aufgelisteten Dimere wurden mit Hilfe der 1 :7-Methode isoliert . Die Transportaktivität wurde als Pi7Pi--Antiport gemessen.

PIC-Konstrukt Detergens Aktivität [ImolImin mg]

NEM nach

Rekonst.

ohne NEM NEM vor

Rekonst.

[PIC] SLS+C 12 E 8 124 ± 13 3 120 ± 17

[ H is-PIC] SLS+ C12 Ea 110 ± 16 < 1

[PIC] 2 C 1 2Es 130 ± 25

[His-PIC/FLAG-PIC] C12Es 153 ± 24

[His-PIC(NEM) /FLAG-PIC] C12E8 < 1

[His-PIC(NEM)IFLAG-PiC(NEM)] C 12 E 8 < 1

[His-PIC(NEM)] + [FLAG-PIC] Ci2E8 69 ±15

3.4.6

Dynamik des Monomer-Dimer Gleichgewichts

Für die nachfolgenden Experimente mußte sichergestellt werden, daß das Monomer-

Dimer Gleichgewicht keine große Dynamik aufweist . Um zu überprüfen, ob die Heterodimere

die für nachfolgende Experimente essentielle zeitliche Stabilität aufwiesen, wurden Experi -

mente durchgeführt, in denen die Aktivität der unter 3 .4.5 vorgestellten Konstrukte über ei-

nen bestimmten Zeitraum überprüft wurden. Hierdurch sollte nicht nur gewährleistet werden,

daß die Aktivität über einen bestimmten Zeitraum erhalten blieb, sondern insbesondere, daß

keine Reorganisation der Monomers nach der Rekonstitution stattfand . Im Prinzip war die

erfolgreiche Aufreinigung der Konstrukte bereits ein Hinweis darauf, daß die Dimere in der

solubiiisierten Form stabil waren.

Das vollständig unmodifizierte Konstrukt wurde im Vergleich mit dem halbseitig inak-

tivierten Dinier aufgereinigt, rekonstituiert und nach verschiedenen Zeiten (Abbildung 27) auf

Aktivität hin überprüft . Die Aktivität des unmodifizierten Heterodimers nahm über den erfaß-

ten Zeitraum geringfügig ab, wärend im selben Zeitraum bei dem halbseitig inaktivierten

Heterodimer keine Aktivität zu beobachten war . Man konnte also davon ausgehen, daß die

58Konstruktionvon Heterodimeren

Konstrukte über den für Experimente nötigen Zeitraum stabil waren und keine Reorganisati-

on stattfand.

0 . 1

0

5

'10

15

20

25

Zeit [hi

Abbildung 27 : Zeitliche Abhängigkeit der Aktivitäten der Konstrukte nach Rekonstitution zur Bestimmung derStabilität in der Membran . Die Transportaktivität wurde als Pi7PF-Antiport bestimmt . [His-PICII = LAG-PIC]-Dimerunmodifiziert ( ), [His-PIC(NEM)IFLAG-PIC] (A)_

A 7

A nsIcvcn d .-.m:'snE .asr '„,°ssfit:a rnr$imer=, ~ ~ . . .d . ..

Durch die entwickelte Methode der Konstruktion von Heterodimeren ergab sich eine

Reihe von Anwendungsmöglichkeiten . Die in Abschnitt 3 .2 beschriebenen, gewonnenen Er-

kenntnisse bezüglich der Uniportinduktion sollten . mit der Möglichkeit zur Konstruktion von

Heterodimeren kombiniert werden, um die molekularen Voraussetzungen für den Uniport

weiter einzugrenzen . Hierfür kamen eine Reihe von Konstrukten in Betracht, die in Tabelle

13 aufgelistet sind . Es wurden Heterodimere mit unterschiedlichen Arninosäureresten in Po-

sition 28 konstruiert . Hierdurch sollte eine Antwort auf die Frage nach der „Minimal-

ausstattung" des Carriers für die Uniportinduktion gefunden werden . Darüberhinaus wurden

die Kombinationen der Aminosäurereste so gewählt, daß u .U. eine Aussage über eine räum-

liche Interaktion der Aminosäurereste untereinander, bzw . mit dem translozierten Substrat

möglich werden würde . Hierdurch wären dann wiederum strukturelle Aussagen über den


über den Aufbau des Translokationsweges mit einer möglichen Beteiligung der Helices 1

denkbar. Zur Konstruktion der Heterodimere sollten in der, für die Induktion der Effluxinduk-

tion interessanten Position 28 nur in einem Monomer die entsprechende Aminosäure (Cys

HgCI2 ,Lys) vorhanden sein . Das andere Monomer sollte in diesem Fall eine in Bezug auf

den Efflux neutrale Aminosäure in Position 28 aufweisen. Darüberhinaus wurde ein

Cys28Lys-Monomer mit einem NEM inhibierten wt-Monomer kombiniert, um Aussagen über

eine potentielle räumliche Interaktion der beiden Aminosäuren an Position 28 machen zu

können . Die Kombination aus einer positiv und einer negativ geladenen Aminosäure in den

Positionen 28 sollte einen weiteren Zugang zu dem Aspekt einer möglichen räumlichen In-

teraktion liefern.

Die Heterodimere wurden sowohl im Hinblick auf Aktivität in beiden physiologischen

Transportmodi als auch auf das Vorhandensein oder die lnduzierbarkeit der Effluxfunktion

hin untersucht . Es konnten ausschließlich bei den Heterodimeren [Cys!Val] und [Lys/Val]

Aktivitäten in beiden physiologischen Transportmodi gemessen werden . Die Heterodimere

[Lys/Cys-NEM] und [Lys/Glu] wiesen keine Aktivität auf. Desweiteren konnte bei dem Hete-

rodimer [CysNal] in Analogie zum WT-PIC durch Behandlung mit HgCl 2 der Uniportmodus

induziert werden. Bei dem Heterodimer [LysNal] war ebenso wie der bei der Doppelmutante

. [LyslLys] erstmalig gefundene konstitutive Efflux meßbar. Die beiden anderen Konstrukte

zeigten neben dem Fehlen von physiologischen Transportaktivitäten auch keinerlei Effluxak-

tivitäten. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 13 im Vergleich mit den Homo-

dimer-(Doppei-) Mutanten dargestellt.

Tabelle 13 : Eigenschaften der untersuchten Mutanten (Doppelmutanten) bzw. Heterodimer-Konstrukte . Monomer1 war jeweils im Fall der Heterodimere mit dem His-tag versehen . Efflux (HgCI 2) bezeichnet den Quecksilberin-duzierten Efflux. Efflux konst. steht für den bei einigen Konstrukten auftretenden permanenten Efflux. Zum Ver-gleich sind die in Abschnitt 4 .7.2 untersuchten teilweise inaktivierten Heterodimere noch einmal aufgeführt.

AS in Pos.28

CTransportmodi Aktivität [pmoi 1 min mg]

Monomer I Monomer 2 Pi"/Pr Pi"-petto Efflux (HgCl2) Efflux konst.

Cys Cys 180 ± 41 117 ± 25 ja wieviel

Val Val 133 ±32 1541: 51 nib 12 ± 15

Lys

. Lys 72±27 117±32 II . ; . 124?- 3V

Glu Glu 32±13 43±21 nib . < 1

Trp Trp 23±12 29±9 n .b . <1

Cys Val 143±23 70±12 120±28 <1

Lys Val 42 ± 14 79 ± 24 nib. 95 ±1 9

Lys Cys (NEB) <1 <1 <1 <1. ,ye Glu <1 <1 nib . <1

Cys Cys (NEM) <1 <1 1 <1

-Cys (ITEM) Cys (NEM) <1 <1 n.b . <1

60 Diskussion

4 Diskussion

4.1

Analyse von PlCsc -Mutanten

Durch Behandlung mit HgCI 2 kann die Funktion des mitochondrialen PIC von einem

streng gekoppelten Austausch in einen entkoppeltem Uniport verändert werden . Diese Ef-

fluxfunktion ist bei einigen mitochondrialen Carriern durch Behandlung mit Quecksilberagen-

tien induzierbar . Die Möglichkeit zur heterologen Expression des mitochondrialen PIC aus

Saccharomyces cerevisiae bot ideale Voraussetzungen, die Induktion der Effluxfunktion im

Detail zu untersuchen . Zum einen besitzt der PICsc nur 3 Cysteine, die für die durchgeführ-

ten Experimente in verschiedenen Kombinationen gegen Serin ausgetauscht wurden, zum

anderen kann man durch die heterologe Expression ausschließen, daß evtl . bei der Isolie-

rung aus Mitochondrien mitaufgereinigte andere Carrier oder Kanalproteine (Porine) der äu-

ßeren Membran die Vermittler des unspezifischen Efflux sind.

4 .1 .1

Grundlegende funktionelle Eigenschaften

Es hat sich gezeigt, daß der heterolog exprimierte PICsc dieselben kinetischen Ei-

genschaften aufweist, wie der direkt in Hefemitochondrien charakterisierte PICsc . Auch die

Eigenschaften des in Bezug auf seine kinetischen Eigenschaften in allen Transportmodi de-

tailliert charakterisierten PICBHM spiegeln sich in dem heterolog exprimierten Protein wieder.

So weist der PICsc dieselben KM-Werte auf, wie der in intakten Mitochondrien charakteri-

sierte PICsc und der im rekonstituierten System untersuchte PIC BHM . Das für die beiden phy-

siologischen Transportmodi typische Verhältnis der Aktivitäten konnte ebenfalls beobachtet

werden . In Analogie zum PIC BHM läßt sich beim PICsc durch Behandlung mit HgCI 2 ein dritter

Transportmodus, der Uniport- oder Effluxmodus induzieren . Es konnte gezeigt werden, daß

auch der PICsc im Effluxmodus ebenso wie der PIC BHM durch externes Phosphat gehemmt

wird, was die Ähnlichkeit der bei beiden Carriern beobachteten Entkopplungsphänomene

belegte. Diesbezüglich konnte außerdem gezeigt werden, daß PFA, ein kompetitiver Inhibi-

tor des Phosphattransports ebenfalls den Efflux-Modus inhibiert, was ein weiterer Hinweis

auf die Funktionalität der externen Bindungsstelle während des Efflux ist . Aufgrund der Tat-

sache, daß externes PFA, welches als kompetitiver Inhibitor des Pi"/Pi -Antiports fungiert,

den Pi -ICl--1 --Antiport beschleunigt, wurde gefolgert, daß PFA selber durch den PIC translo-

ziert wird (hier Pi-/PFA-Antiport) . Da PFA jedoch nicht markiert erhältlich ist, konnten seine

Eigenschaften als Substrat nur indirekt untersucht werden.

Es konnte bereits an vielen Transportproteinen gezeigt werden, daß Cysteinreste

nicht essentiell für die (physiologischen) Transportfunktionen sind (van Iwaarden et al.,

1991, 1992). Es gibt jedoch eine Reihe von Beispielen dafür, daß durch die Behandlung von

Proteinen mit cysteinspezifischen Modifizierungsagentien die Funktion der Proteine verän-

Diskussion 61

dent wird. Im einfachsten Fall äußert sich die Modifizierung in einer Reduktion der Aktivität.

Diese experimentellen Möglichkeiten wurden an einer Vielzahl von Proteinen benutzt, um

strukturell und funktionell relevante Bereiche der Proteine einzugrenzen und zu analysieren.

Hierfür wurde meist eine Kombination aus Cystein-scanning-Mutagenese mit anschließen-

den Inhibitionsstudien verwendet. Im vorliegenden Fall hatten verschiedene Modifizie-

rungsagentien unterschiedliche Auswirkungen auf die Funktion des Proteins . Durch die Be-

handlung des PIC mit relativ großen cysteinspezifischen Agentien wird eine Inhibition erzielt,

während die Verwendung von HgCl2 zur Induktion der dritten Transportfunktion führte.

Die vorliegenden experimentellen Befunde ermöglichen nun eine Zuordnung der ein-

zelnen Cysteine des PlCsc (Abbildung 5) zu den durch (unphysiologische) Behandlung mit

SH-Reagentien hervorgerufenen Funktionsänderungen wie Inhibition und Effluxinduktion.

Cystein 300 welches am C-Terminus lokalisiert ist, hat keinerlei funktionelle Relevanz in Be-

zug auf Inhibition oder Efflux. Allerdings wird durch die Einführung des Serinrestes in Positi-

on 300 die Transportaktivität um etwa 50 % vermindert . Eine ähnliche Verminderung der

Transportaktivität von Pi7Pr-Antiport und Pi /®H"-Antiport konnte bei alien Mutanten beob-

achtet werden. Das für den WT-PIC bekannte Verhältnis der Transportaktivitäten bei dem

der Pi7OH--Antiport etwa 70 % der Geschwindigkeit des Pi"/Pr-Antiports aufweist, blieb je-

doch in allen Mutanten etwa gewahrt, was auf einen unveränderten Transportmechanismus

schließen Iäßt. Die unterschiedlich hohen Aktivitäten der einzelnen Mutanten können sowohl

direkt auf die Aktivität des Proteins, als auch auf eine unterschiedliche Effizienz der Insertion

in die Membran der Proteoliposomen zurückzuführen sein . Die KM-Werte der Mutanten wei-

sen ebenfalls keine außergewöhnlichen Abweichungen von dem des WT-PIC auf . Der K,-

Wert der Dreifachmutante (C28,134,300S) ist in etwa fünfmal so hoch wie der des wt-PIC.

Demnach kann man noch nicht von einem drastisch veränderten Km-Wert sprechen wie er

sich z.B. durch strukturelle Veränderungen einer Substratbindungsstelle ergeben würde.

4.1 .2

Funktionsänderung durch chemische Modifizierung der Cysteinreste

Die Modifizierung von Cystein 134 ist führt zur Inhibition des Transports durch Mer-

salylsäure und pCMBS . Die Modifizierung des Cysteins 300 durch Mersalyl fuhrt zwar zu ei-

ner weiteren Reduktion der Transportaktivität, der Haupanteil der Inhibition wird jedoch

durch Modifizierung von Cysteinl34 erreicht . Bei den Mutanten Cys28Ser und Cys28,

134,300Ser konnte nach Behandlung mit HgCl2 kein Uniport gemessen werden . Die im

Brennpunkt stehende, reversible unphysiologische Entkopplung des Transports, d .h. die In-

duktion des Efflux durch Behandlung des PICsc mit HgCl 2 , konnte hierdurch eindeutig mit

der Modifizierung von Cystein 28 korreliert werden (Schroers et al., 1997) . Die hierbei auf-

tretenden kanalartigen Eigenschaften sind bereits bei einigen anderen mitochondrialen Car-

riern, wie . z .B. dem ADPIATP-Carrier (AAC) und dem AspartatlGlutamat-Carrier (AGC)

62 Diskussion

(Dierks et a!. 1990a; Dierks et a!. 1990b) und dem Carnitin-Carrier (CAC) (Indiveri et a!.

1991) beobachtet worden, konnten jedoch bislang nicht mit der Modifizierung bestimmter

Aminosäurereste korreliert werden . Die Modifizierung von Cystein 28 führt also erstens zu

einem Spezifitätverlust der internen Bindungsstelle, während die Spezifität der externen Bin-

dungsstelle erhalten bleibt, und zweitens zu einer Entkopplung des physiologischen Antiport-

Mechanismus. Diese Beobachtungen lassen den Schluß zu, daß durch die Modifizierung

des Cysteins 28 die, durch Interaktion des Proteins mit dem Substrat induzierten Konforma-

tionsänderung, (gating) beeinflußt wird, welche essentiell für einen geordneten Transport-

mechanismus ist . Allerdings ist anzunehmen, daß auch im Falle des efflux-induzierten PlCsc

weiterhin Konformationsänderungen während des Transportvorgangs stattfinden, was am

Beispiel des AGC gezeigt werden konnte. Eine Bestimmung der Aktivierungsenergie für die

physiologischen Transportmodi und den Effluxmodus führte zu dem Ergebnis, daß in allen

Transportmodi in etwa die gleiche Aktivierungsenergie für den Transport notwendig ist. Da-

her muß davon ausgegangen werden, daß, obwohl der Effluxmodus kanalartige Eigen-

schaften aufweist, weiterhin Konformationsänderungen des Proteins stattfinden . (Herick und

Krämer, 1995).

4.1 .3

Zugänglichkeit der Cysteinreste

Die Unterschiede in der Wirkungsweise und dem Wirkort der SH-modifiziernden

Quecksilberagentien sind sowohl auf die Zugänglichkeit, die chemische Umgebung und die

Reaktivität der jeweiligen Cysteine zurückzuführen, wobei die beiden erstgenannten Fakto-

ren mit der Größe und den chemischen Eigenschaften der jeweiligen SH-modifizierenden

Verbindung direkt korrelieren . lm Falle des PlCsc lassen die vorliegenden Ergebnissen den

Schluß zu, daß Cystein 134 und wahrscheinlich auch Cystein 300 fier relativ große hydro-

phile SH-modifizierende Agentien wie Mersalylsäure und pCMBS zugänglich sind . Die Posi-

ton des Cystein 28 ist dagegen nur für das kleine relativ unpolare HgC12 zugänglich

(kovalenter Charakter der Hg-Cl-Bindung) . Dies konnte dadurch gezeigt werden, daß die

Reaktion des HgCl 2 mit Cystein 28 nicht durch vorhergehende Behandlung des PlCsc mit

anderen großen Queeksiiberagentiei"I beeinträchtigt wird. Wenn man versucht, die Ergebnis-

se der Zugänglichkeit von Cystein 300 und Cystein 134 für große hydrophile Agentien mit

der putative Sekundärstruktur des PlCsc in Einklang zu bringen, ist die Zugänglichkeit im

Falle des Cystein 300 relativ offensichtlich, da es wahrscheinlich aufgrund seiner Positionie-

rung am C-Terminus zum Cytosol (externen Medium) exponiert ist . Bei Cystein 134 ist die

beobachtete Zugänglichkeit jedoch etwas überaschend, da es mehr oder weniger in der

Mitte der 3 . Helix, also vermutlich genau in der Membran liegt . Aufgrund der Ergebnisse muß

man annehmen, daß Cystein 134 in einer wässrigen Umgebung liegt, zu der außerdem ein

Zugang von der cytosolischen Seite des PlCsc besteht . Im Vergleich dazu besteht dieser

Diskussion 63

Zugang zu Cystein 28 welches in etwa auf der selben Höhe in der putativen 1 . Helix liegt,

nicht.

4 .9 .4E

Molekulare Voraussetzungen zur Kopplung von Substratgradienten

Die Analyse der Punktmutanten an Position 28 hat gezeigt, daß an dieser Position

sowohl kleine, ungeladene (Cys28Val) als auch positiv geladene Aminosäurereste

(Cys28Lys) toleriert werden . Die Einführung eines negativ geladenen (Cys28Glu) bzw . sehr

großen Restes (Cys28Trp) hingegen führt zu einem deutlichen Aktivitätsveriust . Durch die

an Position 28 eingeführten Mutationen konnte gezeigt werden, daß der Trigger für die In-

duktion des Efflux eine positive Ladung ist und nicht primär durch eine Veränderung der na-

tiven Konformation des Carriers durch die Mercaptidbildung mit HgCl 2 zustande kommt. Die

Substitution von positiv geladenen Aminosäuren durch Cysteinmerceptide ist auch bereits an

anderen sekundären Transportern wie dem Metall-Tetracyclin/H {-Symporter aus E. coil

(Someya und Yamaguchi, 1996) beschrieben worden . Der bei der Mutante Cys28Lys auf-

tretende Efflux ist quasi konstitutiv im Vergleich zu der reversiblen Modifikation des Cysteins

28 durch HgCl 2 . Der Effekt ist deshalb besonders interessant, da in dieser Region des Carri-

ers einige Aminosäuren zu finden sind, die essentiell für eine Kopplung des Phosphattrans-

ports an den Protonengradienten sind (Phelps et al. 1996) . Dies sind sowohl die beiden in

unmittelbarer Nachbarschaft des Cysteins 134 in der dritten Helix liegenden Glutarnatreste

126 und 137 weiche sich etwa auf der gleichen Höhe wie Cystein 28 befinden, als auch ins-

besondere das Histidin 32, welches sich nur eine Helixwindung weiter unter der Position des

Cysteins 28 befindet . Für diese 3 Aminosäurereste wurde bereits ein Charge-Relay Modell

far den Protonentransportvorgang postuliert, bei dem Histidin 32 vorübergehend protoniert

wird (Phelps et al. 1996).

4 .1 .5

Spekulationen zu Kopplung und Transportmechanismus

Das Einführen der positiven Ladung an anderen Positionen innerhalb der ersten He-

ix hat gezeigt, daß diese Regiontegion relativ kritischt tütfür dis physiologischen Transportfunktionen

ist, da einige der generierten Mutanten kaum noch Transportaktivität aufwiesen, was jedoch

auch auf eine lnsertionsdefizienz dieser Mutanten zurückzuführen sein könnte . Es konnten

jedoch bei der Mutante His32Lys dieselben Entkopplungseffekte gemessen werden wie bei

der Mutante Cys28Lys . Die gemessenen physiologischen Transportaktivitäten der Mutante

His32Lys sind außerdem deswegen bemerkenswert, weil der Austausch von Histidin 32 Ala-

nin die Aktivität des Carriers vollständig ausschaltet (Wohlrab et al ., 1996) . Andererseits ist

auch die Tatsache, daß der Austausch von Histidin 32 gegen Lysin dieselben entkoppelnden

Effekte hervorruft wie der Austausch von Cystein 28 gegen Lysin nicht einfach zu interpretie-

64 Diskussion

ren, da Histidin ebenso wie Lysin bei physiologischem pH-Wert eine positive Ladung auf-

weist . Der einzige Unterschied in Bezug auf die Ladung Ist durch die geringere Protonie-

rungswahrscheinlichkeit des Histidins gegeben . Da der pK-Wert eines (de-)protonierbaren

Aminosäurerestes innerhalb einer Proteinstruktur durch unpolare Arninosäuren in der Um-

gebung des entsprechenden Restes drastisch variiert werden kann, ist vorstellbar, daß der

Histidinrest im Grundzustand des Carriers unprotoniert vorliegt, und die reversible Protonie-

rung von Histidin 32 ein Teilschritt bei der Bildung des transportaktiven Komplexes ist . Wei-

tere Schritte bei der Bildung des Komplexes wären die anschließende Anlagerung von ex-

ternem Phosphat und vermutlich einem internen Hydroxylion . Anschließend würde das

Phosphat transloziert werden, wobei weiterhin unklar ist, ob bei der Translokation ein Proton

mit oder ein Hydroxylion gegen das Phosphat transportiert wird . Wahrscheinlich besteht eine

strukturelle Analogie zwischen dem protonierten Histidin und dem entweder in Position 28

oder Position 32 ein g eführten Lysinrest . Dies führt dazu, daß durch die Einführun g der posi-

tiven Ladung mechanistische Abläufe ermöglicht werden, die im normalen Transportmecha-

nismus „verboten" bzw höchst unwahrscheinlich sind . Nach Modifizierung des WT-PIC mit

HgCI2 bzw. nach Einführung einer positiven Ladung in Position 28 bzw . 32 wäre die für die

Bildung des transportaktiven Komplexes notwendige Ladung konstitutiv vorhanden und so-

mit keine Kopplung mehr zwischen Protonen- und Phosphattransport gegeben . In diesem

Zustand wäre in Abwesenheit von externem Phosphat die unspezifische Bindung von inter-

nem Phosphat oder anderen Anionen und deren Translokation in das externe Kompartiment

möglich.

4 .1 .6

Protonenentkoppelter Phosphattransport

Durch die Analyse der Mutanten bezüglich der Nettoaufnahme von Phosphat in Pro-

teoliposornen in Abhängigkeit von einem Protonengradienten ergab sich ein Bild, Welches

gut mit den konstitutiven Effluxphänomenen bei einigen Mutanten übereinstimmt . Die beim

WT-PIC zu beobachtende Abhängigkeit des Phosphatimportes in die Proteoliposomen war

bei den Mutanten Cys28Lys und His32Lys nicht gegeben . Während der WT-PIC in der Lage

ist, den Protonengradienten für eine Akkumulation von Phosphat zu nutzen, welche die ex-

terne Konzentration überschreitet, Ist bei den o .a . Mutanten die initialgeschwindigkeit und

die Menge an importierten Phosphat unabhängig von dem Vorhandensein eines Protonen-

gradienten . Die Interpretation dieser experimentellen Befunde ist relativ schwierig, da nicht

zwischen dem Zusammenbruch des Protonengradienten durch eine konstitutiv entkoppelte

Mutante und der prizipiellen Unfähigkeit einer Mutante beide Flüsse zu koppeln, unterschie-

den werden kann. Beide Ursachen würden zu ein und demselben Phänomen führen . Aller-

dings Ist in Anbetracht der Tatsache, daß die Membranen der rekonstituierten Proteoliposo-

men wahrscheinlich nicht absolut dicht für Protonen sind, erstaunlich, daß einerseits beim

Diskussion 65

WT-PIC eine Nutzung des Protonengradienten über einen Zeitraum von immerhin 2 Minuten

zu beobachten ist, gärend bei den Mutanten davon ausgegangen werden müßte, daß hier

der Gradient durch den Carrier in ca . 30 s abgebaut wird . Um diese Fragestellung weiter an-

zugehen, müßte man die Protonenflüsse, die über die Membran und durch die entsprechen-

den Carrier vermittelt werden, direkt messen. Die Zusammenhänge zwischen Kopplung und

der funktionellen Einheit des PIC sind bisher ungeklärt, konnten aber durch die in Abschnitt

4 beschriebenen Experimente näher analysiert werden.

4.1 .7

Ursachen und mögliche physiologische Relevanz des Uniports

Es gibt verschiedene experimentelle Hinweise darauf, daß die strukturellen Voraus-

setzungen für die Unterschiede zwischen den Transportmodi Antiport, Symport und Uniport

bzw. carrier- und kanalvermitteltem Transport sehr gering sind (Nikaido und Saier, 1992;

Krämer, 1994) . So konnte gezeigt werden, daß durch den Austausch einer einzigen Ami-

nosäure in der Lac Permease der Transport von einem gekoppelten zu einem angekoppel-

ten Mechanismus hin verändert wird . (Eelkema et al., 1991 ; King und Wilson, 1990 ; Kaback,

1992) . Außerdem gibt es in durch Untersuchungen von Transportproteinen mit elektrophy-

siologischen Methoden eine Reihe von Hinweisen auf kanalartige Eigenschaften, so z .B. bei

Neurotransmitter Transportern (Cammack und Schwartz, 1996 ; DeFelice und Blakely, 1996),

dem Chloroplasten Triosephosphat Carrier (Schwarz et al., 1994), bei mitochondrialen

Transportern wie z .B. dem ADP/ATP-Carrier (Tikhonova et al ., 1994; Brustovetsky und Klin-

genberg, 1996) und dem Phosphatcarrier (Herick et a! ., 1996) . Dieses Carrier-Kanal Kon-

zept ist besonders interessant in Bezug auf Vorgänge, die z .B . bei der Apoptose auftreten.

Hierbei werden Kanäle geöffnet, welche das Membranpotential zusammenbrechen lassen.

Außerdem wird in Zusammenhang mit diesem Vorgang die Freisetzung von Substanzen

diskutiert, welche den weiteren Verlauf der Apoptose initiieren (Skulachev, 1996 ; Zoratti und

Szabo, 1995; Bernardi und Petronilli, 1996)

4 .2

Das Dimer als funktionelle Einheit

4.2 .1

Die „Minimalausstattung" für sekundäre Transporter

Es ist bereits in vielen Untersuchungen an sekundären Transportern versucht wor-

den, die Frage nach dem Aufbau des transportaktiven Komplexes aufzuklären . Diese Frage-

stellung ist nicht nur prinzipiell, sondern insbesondere deshalb von großem Interesse, weil

es bis heute nicht gelungen ist, die dreidimensionale Struktur eines sekundären Transport-

proteins aufzuklären . Die mit Hilfe einer Vielzahl experimenteller Methoden an der Lactose

66 Diskussion

Permease aus E. coil am weitesten fortgeschrittene Strukturaufklärung und der daraus ab-

geleiteten Modelle (Kaback, 1997) erreicht nicht die durch Röntgenstrukturanalyse mögli-

chen Auflösungen . Die Fragestellung ist jedoch nicht allein struktureller Art . Es waren in er-

ster Linie mechanistische Aspekte, die durch den gewählten experimentellen Ansatz aufge-

klärt werden sollten und konnten.

Ausgangspunkt für die Überlegungen bezüglich der Cligomerisierung von sekundä-

ren Transportern war das Motiv von zwölf transmembranen Helices als Minimalkonsens fürsekundäre Transporter (Henderson, 1990 ; Maloney 1990; Marger und Saier, 1993) . Es wird

allgemein angenommen, daß sekundäre Transporter, die weniger als zwölf transmembrane

Helices aufweisen, ausschließlich in oligomerer Form aktiv sind . Beispiele hierfür sind bspw.

das ErnrE-Protein mit drei transmembranen Helices (Yerushalmi et aL, 1996) und die mito-

chondrialen Carrier (Kuan und Saier, 1993), für welche aufgrund verschiedener experimen-

teller Hinweise eine dimere Struktur angenommen wird . Hierzu gehören die, für den

ADP/ATP-Carrier (AAC) gefundene Bindungsstöchiometrien (Riccio et ei ., 1975), die hydro-

dynamische Messungen an isolierten Carriern (Lin et al., 1980; Hackenberg und Klingen-

berg, 1980) und Crosslinking-Experimente an solubilisiertem AAC (Majima et aL, 1995). Für

die Bindung von fluoreszierenden Nukleotidanaloga wurde sogar eine noch geringere

Stöchiometrie von einem Molekül Substrat auf 4 Untereinheiten AAC gefunden (Dupont et

aL, 1982) .

4.2 .2

Experimentelle Hinweise auf eine funktionelle Dimerisierung

Eine relativ einfache Methode zur Bestimmung der funktionellen Notwendigkeit einer

Oligornerisierung ist die Durchführung von Titrationsexperimenten mit den Monomeren des

entsprechenden Proteins . Solche Titrationsexperimente zur Bestimmung des transportakti-

ven Komplexes sind bereits mit einigen Transportproteinen wie der Lactose Permease aus

E. colt (Sahin-Toth, et al., 1994) und auch an dem aus intakten Mitochondrien mit Hilfe von

nichtionischen Detergentien isolierten PICBHM (Steppen und Krämer, 1993) durchgeführt

worden . Sie führten in alien Fällen zu einer linearen Abhängigkeit der Aktivität von der ein-

gesetzten Proteinmenge . Bei der Rekonstituti on des SLS-solubil i sierten PIC ergab sich je-

doch ein sigmoider Zusammenhang zwischen eingesetzter Proteinmenge und gemessener

Aktivität . Hieraus wurde geschlossen, daß die ersten, einzeln in Proteoliposomen rekonsti-

tuierten PIC-Monomere allein nicht aktiv sind . Die Rekonstitution von dialysiertem, dirneri-

siertem PIC führte wiederum zu einer linearen Beziehung zwischen beiden Größen . Die Un-

tersuchungen des dialysierten Proteins in verschiedenen Gelsystemen haben gezeigt, daß

die Bande des PIC im nativen Gel nach der Dialyse bei einem deutlich höheren apparenten

Molekulargewicht erscheint . Das apparente Molekulargewicht entspricht zwar nicht dem für

das Dinier erwartete Molekulargewicht, es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß

Diskussion 67

das teilweise denaturierte, in SLS solubilisierte Protein ein vollkommen anderes Laufverhal-

ten aufweist, als das, nach der Dialyse renaturierte und dimerisierte Protein . Solche drasti-

schen Unterschiede im Laufverhalten sind auch für andere Proteine wie das MtrA aus

Methanobacterium thermoautotrophicum beschrieben worden. Dieses Protein ist nur in An-

wesenheit seiner prosthetischen Gruppe korrekt gefaltet und weist ein um 25 % reduziertes

apparentes Molekulargewicht in der SDS-PAGE gegenüber dem entfalteten Protein auf

(Harms und Thauer 1996).

Diese Hinweise waren der Ausgangspunkt für die Dimerisierungsexperimente in de-

nen versucht werden sollte, strukturell und funktionell unterscheidbare Monornere zur Kon-

struktion von Heterodimeren zu verwenden . Die verschiedenen entstehenden Dimere sollten

anhand der molekularen tags identifiziert, isoliert und charakterisiert werden.

4.2.3

Das halbseitig inaktivierte Heterodimer

Die Ergebnisse der Untersuchungen haben gezeigt, daß PIC ausschließlich in der

dimeren Form aktiv ist . Monomerer PIC ist nach Insertion in den Lipid-Bilayer nicht aktiv . Ein

Heterodimer aus einem aktiven und einem inaktivierten Monomer ist ebenfalls nicht aktiv.

Die Rekonstitution einer Mischung aus aktiven und inaktiven Monoteeren führt jedoch zu gut

meßbaren Aktivitäten, wodurch ein inaktivierender Effekt durch modifiziertes Protein, bzw.

verschleppten Inhibitor ausgeschlossen werden kann (Schroers et a!., 1998).

Die Konstruktion, Isolierung und Rekonstitution von Heterodimeren aus aktiven Mo-

nomeren im Vergleich mit einem halbseitig inaktivierten Heterodimer aus einem aktiven und

einem inaktivierten Monomer haben gezeigt, daß ausschließlich Dimere aus zwei funktionell

aktiven Monoteeren aktiv sind . Zwischen beiden intakten Dimeren muß während des Trans-

portvorgangs eine konformative Wechselwirkung stattfinden, die wahrscheinlich essentiell

für die Kopplung ist . Die Analyse der Heterodimere hat gezeigt, daß für die Bildung eines

transportaktiven Komplexes zwei Monomere nötig sind, die auch jeweils als Homodimer ak-

tiv sind. Sobald eines der Monornere inaktiviert, d .h . mit NEM modifiziert wurde, ist kein akti-

ver Transport mehr meßbar. Dies kann als eindeutiger Hinweis auf das Dinner als minimale

funktionelleE tEonelEGlle Einheit gewertet ~ werden .

konnte zum ersten Mal geze igt werden, daßHierdurch

die bereits aufgrund einer Vielzahl von Experimenten mit anderen mitochondrialen Carriern

(Riccio et a!., 1975; Hackenberg und Klingenberg, 1980 ; Lin et a!., 1980) angenommene Di-

merisierung tatsächlich zwingende Voraussetzung für die Funktionalität des PIC und

höchstwahrscheinlich für die der mitochondrialen Carrier im allgemeinen ist.

Für die Tatsache, daß beide Monomere intakt sein müssen, um Transport zu kataly-

sieren, gibt es zwei Erklärungsmöglichkeiten . Die eine wäre, daß beide Monomere zu glei-

chen Teilen zu einem Transiokationsweg beitragen, der durch die Modifizierung eines Mo-

nomers für das Substrat nicht mehr passierbar ist . Die andere wäre eine Störung der Inter-

68 Diskussion

aktion beider Monomere, welche jeweils einen separaten Translokationsweg aufweisen und

zur Kopplung des Transports durch Konformationsänderungen mit dem anderen Monomer

interagieren . Letztere Interpretation paßt am besten zu dem aufgrund von kinetischen Mes-

sungen postulierten Modell mit zwei Substratbindungsstellen und hieraus geforderten zwei

Translokationswegen. Beide Möglichkeiten wurden durch die Untersuchungen an speziellen

Heterodimeren näher untersucht.

4.2.4

Existiert ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Mono- und Dimeren?

Da für die Konstruktion und die Analyse von Heterodimeren deren Stabilität von gro-

ßem Interesse ist, wurden zusätzliche Experimente zur Dynamik des Monomer-Dimer-

Gleichgewichtes durchgeführt, Durch die erfolgreiche Isolierungsprozedur der Heterodimere

konnte prinzipiell schon dernonstiert werden, daß die Heterodimerer über einen Zeitraum

von einigen Stunden in der solubilisierten Form stabil sind . Um die Stabilität nach Rekonsti-

tution in den Lipid-bilayer zu untersuchen, wurden unmodifiziertes Dimer und halbinaktivier-

tes Dimer rekonstituiert und in verschiedenen Zeitabständen auf Aktivität hin überprüft.

Durch die Stabilitätsexperimente konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß die Dimere

nicht nur in solubilisierter Form (in C12E8), d.h. während der Isolierungsprozedur, sondern

auch nach Insertion in die Lipidmernbran stabil sind und kein dynamisches Gleichgewicht

zwischen Monomeren und Dimeren besteht. Während eine Reorganisation von Mononieren

während der isoiierungsprozedur, bei der sich die Dimere isoliert voneinander in Deter-

gensmizellen befinden relativ schwer vorstellbar ist, wäre eine Reorganisation in der Lipid-

membran durchaus denkbar, da die Proteine in der Membran sehr mobil sind . Eine Mono-

merisierung und anschließende Neubildung von Dimeren findet jedoch nicht statt.

4.2.5

Verschiedene Konfornlationeri und Aggregationszusände des PIC

Die für die Inaktivierung einzelner Monomere mit dem aikylierenden Agens NEM

durchgeführten Voruntersuchungen erbrachten neue Erkenntnisse in Bezug auf die Konfor-

n'icaua :

Ofl des `i- :1 .,In untaer verschiedenen

So konnte g zig i~ V'erLaCi r

.den, ~seai

dBedingungen. ,per

PICsc, für den bisher eine hohe Unempfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor NEM beschrie-

ben wurde (Guerin et aL, 1990), unter bestimmten Bedingungen durch NEM inhibiert werden

kann. Die Inhibition des PIC BHM beruht auf der Modifikation des Cysteins 42, dessen Position

im PICK von einem Threonin (Thr43) eingenommen wird . Durch Austausch des Threonins

43 beim PICsc gegen ein Cystein konnte die Empfindlichkeit gegenüber NEM wieder herge-

stellt werden (Wohlrab und Briggs, 1994).

Aufgrund der in SLS wahrscheinlich in gewissem Umfang denaturierten Konformation

des PICsc, sind dort vermutlich die Cysteinreste für NEM zugänglich, sodaß der in SLS salu-

Diskussion 69

bilisierte PICsc vollständig durch Behandlung mit NEM inhibiert werden kann . Demgegen-

über weist der Carrier nach der Rekonstitution in eine künstliche Phospholipidmembran die-

selbe Unempfindlichkeit gegenüber NEM auf wie der PIC SC in intakten Mitochondrien . Zum

Vergleich wurde die Mutante Cys28Val zusammen mit dem WT-PIC untersucht . Es zeigte

sich, daß diese im Gegensatz zum WT-PiC eine geringfügig geringere Empfindlichkeit ge-

genüber NEM besitzt, was den Schluß zuläßt, daß ein großer Teil der inhibitorischen Wir-

kung durch Modifikation von Cystein 28 erzielt wird . Dieses Ergebnis befindet sich in Ein-

klang mit der inhibition durch Modifizierung des eingeführten Cysteins in Position 43, wenn

man davon ausgeht, daß Helix 1 einen Teil des Transiokationsweges darstellt. Die vollstän-

dige inhibition der Transportfunktionen durch ein NEM-modifiziertes Cystein 28 ist jedoch

bemerkenswert, da die Einführung eines Tryptophanrestes an derselben Position die Aktivi-

tät nicht vollständig inhibiert . Man muß jedoch beachten, daß im Gegensatz zu der Mutante

Cys28Trp beim ZIEM-behandelten WT-PlC wahrscheinlich alle drei Cysteine modifiziert sind.

Hierzu gehört auch das für die Inhibition durch Mersalylsäure verantwortliche Cysteini34.

4.2 .6

Entkopplung durch ein modifiziertes Monomer

Durch die Möglichkeit zur Konstruktion von Heterodimeren ergab sich ein weiterer

Zugang zur Frage nach der (Ent-)Kopplung durch die positive Ladung in Position 28 . Nach-

dem gezeigt worden war, daß für die physiologischen Transportfunktionen die Dimerisierung

eine zwingende Voraussetzung ist, sollte die Effluxfunktion an Heterodimeren untersucht

werden, welche nur in einer Position 28 eine positive Ladung aufweisen . Die Untersuchun-

gen der Effluxfunktion haben ergeben, daß nur eine positive Ladung pro Dimer notwendig

ist, um den Efflux zu induzieren. Für die Entkopplung des Transports ist also die Modifikation

eines einzelnen Monomers ausreichend. Wenn man für die Kopplung der Substratflüsse

konformative 'Wechselwirkungen zwischen beiden Monomeren postuliert, wird dieser durch

eine positive Ladung in Position 28 in einem der beiden Monomere unterbunden, bzw . ge-

stört . Die Lysin-seanning-Mutagenese in Helix 1, also der direkten Umgebung der Position

28 hat gezeigt, daß auch eine positive Ladung an Position 32, also fast genau eine Helix-

Windung we 1fit elGl- , denselben Effekt bewirkt.be. irkt . Diese Region des Proteins

~~ alsos scheint a lwso insge-

samt kritisch für die Kopplung zu sein.

4.2 .7

Hinweise auf die Existenz eines einzigen Transiokationsweges pro Dimer

Die beiden Konstrukte [LyslCys(NEM)] und [Lys/Glu] (Abschnitt 3 .4.7) die keinerlei

Aktivität in den physiologischen Transportmodi aufweisen, zeigen auch keine Effluxaktivitä-

ten. Da man davon ausgehen muß, daß bei der ursprünglichen Effluxinduktion im wt-PIC

(CyslCys) die anderen Cysteine (Position 134 und 300) durch die vorhergehende Behend-

70 Diskussion

lung mit Mersalylsäure (Inhibition) modifiziert sind und hier trotzdem durch Zugabe von

HgCI 2 Efflux induziert werden kann, bedeutet dies, daß nach Modifizierung des Cysteins 28

eines Monomers durch NEM der Efflux blockiert ist . Das wiederum !Kt den Schluß zu, daßdas modifizierte Cystein 28 den Weg, den das Substrat beim Efflux durch den PlC nimmt,

blockiert . Die komplette Inhibition jeglicher Transportaktivität in dem Konstrukt [Lys/Glu] gibt

Anlaß zu der Annahme, daß beide Aminosäurereste im Protein so dicht beieinanderiiegen,

daß die Bildung einer Salzbrücke möglich wird, welche entweder die für den Transport n6ti-

ge Flexibilität von Proteindomänen unterbindet, bzw . direkt im Transportweg liegt. Ersteres

wäre im Sinne der Modelle die aufgrund kinetischer Analysen von zwei getrennten Translo-

kationwegen ausgehen, die in den unterschiedlichen Monorneren liegen und deren Interakti-

on durch Konformationsänderungen des Proteins realisiert wird. Die Annahme einer Salz-

brücke, welche sich in einem, aus beiden Monomeren gebildeten Translokationsweg bildet,

ist jedoch einfacher vorstellbar und befindet sich im Einklang mit den experimentellen Be-

funden bezüglich einer angenommenen Cystinbrückenbildung zwischen den Cysteinen 28

(Phelps und Wohlrab, 1993) . Die beide letzten Punkte sind starke Argumente für einen ein-

zigen Translokationsweg innerhalb des Carrierdimers, weswegen das aufgrund kinetischer

Daten postulierte Modell mit zwei Translokationswegen in Frage gestellt werden muß . Ein

Modell, welches beiden experimentellen Befunden gerecht werden will, muß folglich einen

aus beiden Monorneren konstituierten Translokationsweg aufweisen, durch den beide

Substrate nach Bindung an den entsprechenden Bindungsstellen und der Protonierung von

Histidin 32 transioziert werden . Die Histidine 32 bzw . Cysteine 28 liegen innerhalb des intrin-

sischen Kanals und die Modifizierung von einem der beiden Cysteine 28 mit NEM führt zu

einer vollständigen sterischen Blockade des Transiokationsweges . Über den Verlust der

Substratspezifität der internen Bindungsstelle bei Uniportinduktion kann hier nur spekuliert

werden. Unter physiologischen Bedingungen weist die interne Bindungsstelle ausschließlich

eine geringere Substrataffinität als die externe Bindungsstelle auf . Wenn man annimmt, daß

die Protonierung von Histidin 32 ein Teilschritt des Translokationsvorgangs beim Import von

Phosphat ist, welcher u . U . auch Konformationsänderungen des Proteins verursacht, so ist

vorstellbar, daß durch die Einführung der konstitutiven Ladung mit der damit verbundenen

Vorwegnahme des Konformationswechsels die Substra terkennung beeinträchtigt wird . Au-

ßerdem wird wahrscheinlich durch die konstitutive positive Ladung der geordnete Antiport-

mechanismus dergestalt gestört, daß das Substrat auch ohne gleichzeitigen Transport des

Cosubstrates (OH - bzw. H ¢) transloziert werden kann . Die Tatsache, daß die Aktivität des

Carriers im Uniportmodus weiterhin durch externes Substrat beeinflußt werden kann, spricht

für die Intaktheit der externen Bindungsstelle und ist ein Beleg für die auch im Uniportmo-

dus stattfindenden konformativen Wechselwirkungen innerhalb des Proteins . Zusammen-

fassend läßt sich sagen, daß bei Uniportinduktion das gating nicht vollständig umgangen,

sondern gestört wird . Eine ganze Reihe Fragen nach strukturellen und funktionellen Zu-

Diskussion 71

sammenhängen bleibt weiterhin offen oder ergibt sich aus den vorliegenden experimentellen

Befunden . Hierzu gehört die Frage nach dem Aufbau des Translokationsweges und den für

die Wechselwirkung mit dem Substrat verantwortlichen Aminosäureresten . Die für große

SH-modifizierende Hg-Reagentien zugängliche Position des Cysteins 134, welche in einer

für den Transport kritischen Region liegt, wäre u .U . ein Ausganspunkt für weitergehende

Untersuchungen . Hierbei ist anzumerken, daß Cystein 134 wahrscheinlich nicht im eigentli-

chen Transportweg liegt, da nach Modifizierung von Cys 134 mit großen SH-Reagetien wei-

tehin Translokation von Phosphat im Uniportrnodus stattfinden kann . Um die Rolle von Cy-

stein 134 genauer zu untersuchen, würden sich Fluoreszenzexperimente anbieten, mit de-

nen man konformative Veränderungen und Protein-Substrat-Wechselwirkungen auch an an-

deren Positionen untersuchen könnte . Aussagen über eine putatve Tertiärstruktur bleiben

weiterhin äußerst spekulativ . Aufgrund der experimentellen kinetischen Befunde ist zu ve-

muteten, daß die räumliche Entfernung zwischen beiden Helices 1 des Homodimers relativ

gering ist . Dies müßte jedoch beispielsweise durch Messung von Fiuoreszenzlabel-

Interaktionen im Detail untersucht werden . Durch diesen experimentellen Ansatz wäre dann

auch eine Bestimmung der räumlichen Anordnung der anderen Helices möglich .

72 Zusammenfassuna

5 Zusammenfassung

Der mitochondriale Phosphatcarrier aus S . cerevisiae wurde in E. celi überexprimiert.Durch eine Kombination von Mutagenese, lnhibitionsstudien und weiteren biochemischenMethoden wurde versucht, zur Aufklärung der grundlegenden Fragen nach Transportkopp-lung und dem Aufbau des transportaktiven Komplexes beizutragen.

1. Folgende Transportmodi können beim PlCsc beobachtet werden: Ein gekoppelter homo-loger Pi /PI -Antiport, ein Pi"/OH- r-Antiport und nach Behandlung des Carriers mit HgCl2 einentkoppelter Uniport (Efflux) . Alle drei Transportmodi wurden anhand des rekombinantenPlCsc untersucht. Die kinetischen Daten entsprechen den bereits am PIC BHM ermittelten.Durch die Analyse von Cysteinmutanten, in denen die drei Cysteine des PlCsc einzeln und inverschiedenen Kombinationen gegen Serine ausgetauscht wurden, konnten die Angriffs-punkte von Mersalyl und pCMBS sowie HgCI 2 ermittelt werden, die als Inhibitoren bzw . In-duktionsagens für den Uniport fungieren . Keines der Cysteine entities sich hierbei als trans-portrelevant.

2. Die Cysteine 134 und 300 sind zugänglich für große hydrophile SH-modifizierende Agen-tien wie pCMBS und Mersalylsäure, wobei die Modifizierung von Cystein 134 die Inhibition

der beiden gekoppelten Austauschmodi verursacht . Cystein 28 ist im gefalteten Zustand desPIC nur für HgCI 2 zugänglich . Durch die Modifizierung von Cystein 28 wird der Uniportmodusinduziert.

3. Für eine genauere Bestimmung der molekularen Ursachen fier die Entkopplung wurdenverschiedene Punktmutanten an Position 28 konstruiert . Es wurden Aminosäuren verschie-dener Größe und Ladung eingeführt . Die kinetische Analyse der Mutanten hat gezeigt, daßdie Einführung einer positiven Ladung (Lysin) an Position 28 die Entkopplung verursacht.Durch eine Lysin-scanning-Mutagenese konnte weiter gezeigt werden, daß der Efflux auchdurch Einführung der positiven Ladung unterhalb von Position 28 in Position 32 auf der sel-ben Seite der ersten Helix induziert werden kann . Unter Umständen ist die PiotonieEung d .h.die Einführung der positiven Ladung an Histidin 32, welches bereits als Bestandteil eines

Charge-Relay-Medells diskutiert wurde, Teil des geordneten Transportmechanismus, wel-

cher durch die Einführung einer konstitutiven positiven Ladung in dieser Region gestört wird.

4. Durch einen Vergleich von Uniport und PiiO -Antiport in Bezug auf verschiedene externzugesetzte Anionen und kompetitiven Substratanaloga konnte gezeigt werden, daß die Spe-zifität der externen Bindungsstelle für Phosphat und das Phosphatanalogon PFA erhalten

bleibt.

5. Durch Solubilisierung des Proteins aus den inclusion bodies mit Hilfe von SLS, einemanionischen Detergens, kann PIC in monomerem Zustand isoliert werden . Die hierbei vorlie-gende Konformation des PIC stimmt nicht mit der nativen Konformation überein, was durcheine veränderte Zugänglichkeit von Cysteinresten demonstriert werden konnte . Aus diesem

Zusammenfassunq 73

Zustand kann PIC unter zusätzlicher Verwendung von nichtionischen Detergetien in aktiver

Form rekonstituiert werden.

6. Es besteht die allgemeine Annahme, daß rnitochondriale Carrier als Homodimere funktio-

nell aktiv sind. Der PlCsc konnte durch den Austausch des zur Solubilisierung verwendeten

Detergens SLS gegen C12E8 mittels Dialyse dimerisiert werden . Bei Verwendung von PIC-

Konstrukten mit N-terminal anfusionierten tags konnten durch Dimerisierung und anschlie-

ßende Affinitätschromatographie gezielt Dimere konstruiert und isoliert werden.

7. Für die Rekonstitution von SLS-solubilisiertem PIC ergab sich ein sigmoider Zusammen-

hang zwischen Aktivität und eingesetzter Proteinmenge . Im Gegensatz dazu führten Expe-

rimente mit dimerisiertem bzw. aus intakten Mitochondrien isolierten PIC zu einer linearen

Abhängigkeit . Dies kann als Argument für die notwendige Dimerisierung als Grundlage für

ein aktives Transportprotein gewertet werden.

9. Durch die Konstruktion von Heterodimeren aus funktionell unterschiedlichen Monomeren

konnte gezeigt werden, daß Dimere, die aus einem aktiven und einem durch chemische Mo-

difizierung mit NEM inaktivierten Monomer bestehen, nach Rekonstitution keine Aktivität

aufweisen . Im Vergleich hierzu führte die Rekonstitution einer Mischung aus aktiven und in-

aktiven Monomeren zu aktivem Transport . Hieraus wird geschlossen, daß Monomere für

sich allein nicht aktiv sind, und daß zwischen den Untereinheiten eines Dimers konformative

Wechselwirkungen stattfinden . Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die Dimere sowohl

im solubilisierten Zustand als auch nach Rekonstitution in den Bilayer stabil sind und keine

Reorganisation von Monomeren stattfindet.

9. Die Konstruktion von Heterodimeren mit unterschiedlichen Aminosäuren in der, für die

(Ent-) Kopplung wichtigen Position des Cysteins 28 gibt Anlaß zu der Annahme, daß für die

Induktion des Efflux nur in einem der beiden Monomers an Position 28 eine positive Ladung

vorhanden sein muß, damitit der Efflux induziert werden kann.

10. Die Modifizierung mit NEM an Position 28 in einem der beiden Monomere führt zu einer

Inhibition des durch die andere Position 28 induzierten Efflux, was auf eine direkte Interakti-

on beider Positionen schließen läßt . Dieser Befund wird durch die fehlende Aktivität eines

Heterodimers in welchem in den Positionen 28 eine positive und eine negative Aminosäure

vorhanden war, bestätigt . Eine denkbare Erklärung hierfür hierfür wäre eine Salzbrücke zwi-

schen beiden Positionen 28, die auch mit den experimentellen Befunden bezüglich einer an-

genommenen Cystinbrückenbildung zwischen den Cysteinen 28 in Einklang ist . Beide letz-

ten Punkte sprechen für einen einzigen Translokationsweg innerhalb des Carrierdimers .

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Die vorliegende Dissertation wurde am Institut für Biotechnologie 1 des Forschungszentrums

Jülich und am Institut für Biochemie der Universität zu Köln angefertigt . Ich danke Prof . DrH . Sahm für die freundliche Aufnahme im Institut und für sein fortwährendes Interesse an

meiner Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt Prof . Dr. R. Krämer für die Überlassung des Themas, für die Auf-

nahme in die Arbeitsgruppe, für die hervorragende Betreuung sowie für seine fortwährende

Diskussionsbereitschaft.

Bedanken möchte ich mich weiterhin bei Prof . Dr. H. Wohlrab und Mitarbeitern für die Be-

reitstellung der Phosphatcarriermutanten.

Ferner danke ich dem Sonderforschungsbereich 189 für die freundliche Aufnahme und Un-

terstützung, insbesondere Dr.! . Eggefing und Prof. Dr . H. Weiss, dem auch mein Dank für

die Übernahme des Korreferates gilt.

Darüberhinaus danke ich alien Mitgliedern und assoziierten Professoren des Graduierten-

kollegs „Molekulare Physiologie" der Universität Düsseldorf für anregende Seminare und die

nicht alltäglichen Vorlesungen.

Bei meinen Jülicher Laborkollegen Dr.Klaus Herick und Dr . Ruth Siewe möchte ich mich für

die vielen anregenden Gespräche während und nach der Arbeit und die exzellente musikali-

sche Untermalung im Labor bedanken.

Meinen Kölner Bürokollegen Francois Deuber, Birgit Haler und Dr. Michael Massow danke

ich für anregende Kritik und Diskussionen, Toleranz gegenüber einer Unmenge von Haustie-

ren, jede Menge Striezel und Antworten auf alle Fragen des täglichen Lebens.

Ein ganz spezieller Dank geht an Susanne Ruffert und Thomas Hermann für die überaus

angenehme Gesellschaft, für Pistenschokolade, Windschatten und sonstigen Hüttenzauber.

Ein Dankeschön geht an Dr- Andreas Burkovski und Marc Jaiwob1,' für die Hilfe Rund urnsGen.

Außerdem gilt mein Dank dem Rest der gesamten Arbeitsgruppe als da wären -KatharinaBenova, Marie- T heres Finken, Carola Förster, Eva Glees, Daniela Kruse, Jana Meier-Wagner, Dr. Susanne Morbach und Hendrik Rönsch- für das gute Arbeitsklima und die vie-

len kleinen Annehmlichkeiten.

Ein ganz spezielles Dankeschön gilt Timo Aspelmeier fair die überaus kompetente Unterstüt-

zung bei mathematischen Fragestellungen.

Nicht zuletzt möchte ich meinen Eltern, Martin und natürlich Christiane für Unterstützung,

Geduld und aufmunternde Worte danken .

Berichte des Forschungszentrums Jülich

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Transcript of Berichte des Forschungszentrums Jülich