Bestimmung von Chloramphenicol in Honig mit...
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Bestimmung von Chloramphenicol in Honig mit automatisierter Festphasenextraktion und HLPC-MS/MS-Detektion H. R. Wollseifen, Düren/D, T. Kretschmer, Düren/D Dr. H. R. Wollseifen, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Neumann-Neander-Str. 6–8, 52355 Düren/D Einleitung: Chloramphenicol ist ein Breitbandantibiotikum gegen grampositive und gramnegative Erreger. Es weist ein ungünstiges Nebenwirkungsprofil auf, so dass es heute nur noch als Reservean- tibiotikum angewendet wird [1]. Zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit hat die EU für viele Rückstände in tierischen Produkten Höchstgrenzen festgesetzt. Die Bestimmungsver- fahren erfordern eine leistungsfähige Festphasenextraktion, um Rückstände im Spurenbereich sicher detektieren und quantifizieren zu können. Nachfolgend wird ein empfindliches Bestimmungsverfahren mit einer automatisierten Festpha- senextraktion vorgestellt und mit manueller Aufarbeitung verglichen. Die Festphasenextraktion wurde mit einem SPE-Roboter, FREESTYLE TM SPE Modul, der LC Tech GmbH entwickelt. Als Festphase wurde entsprechend dem Methodenvorschlag der amtlichen Lebensmittelüberwa- chung CHROMABOND ® HLB eingesetzt [2]. Für die Anschlussanalytik wurde ein HPLC-MS/MS Verfahren entwickelt. Die flüssigchromatographische Bestimmung erfolgte auf einer Biphenyl- phase, NUCLEODUR ® π², die aufgrund von zusätzlichen π-Wechselwirkungen mit aromati- schen Analyten eine hohe Retention für Chloramphenicol aufweist. Zur Absicherung der Mes- sergebnisse wurde Chloramphenicol-d₅ als interner Standard eingesetzt. Chloramphenicol Abb. 1: Molekülformel Chloramphenicol Automatisierte Festphasenextraktion Säule: CHROMABOND ® HLB, 3 mL, 200 mg, (REF 730924) Probenvorbereitung: 5 g Honig in ein Zentrifugenröhrchen (50 mL) einwiegen, 4 mL Was- ser hinzufügen und kräftig 0,5 min schütteln, 1 mL Standardlösung (c = 5 ng/mL Chloramphenicol und Chloramphenicol-d₅) hinzufü- gen und 0,5 min kräftig schütteln, 15 mL Ethylacetat hinzufügen und 0,5 min kräftig schütteln, bei 3000 U/min für 10 min zentrifugieren, 12 mL Überstand abnehmen und unter Stickstoffstrom bei 40 °C ein- dampfen, Rückstand in 10 mL Wasser wieder aufnehmen. L C T e c h F r e e S t y l e - R e p o r t o n M e t h o d s : S P E D a t e : 2 6 . 0 6 . 2 0 1 7 T i m e : 1 3 : 1 1 : 0 2 N a m e : C A P - M 0 2 - H o n e y _ A g i l e n t . s p e S P E C o l u m n : L C T e c h _ 3 m l . c o l E x t e n s i o n c a n n u l a : y e s P r o c e s s i n g s p e e d s e l e c t i o n : S t a n d a r d ( o r g a n i c s o l v e n t s ) R i n s i n g i n t e n s i t y : E x t e n d e d r i n s i n g c y c l e w o . E x t r a C l e a n i n g a f t e r L o a d U s e p r e s s u r e l i m i t a t i o n f u n c t i o n d u r i n g l o a d i n g a n d w a s h i n g : n o S t e p : C o n d i t i o n i n g _ M e O H B a s i c t y p e : C o n d i t i o n i n g S t e p : - I D : 7 9 5 V o l u m e : 3 m l S u c t i o n S p e e d : 2 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 1 m l / m i n P o r t : 1 m e t h a n o l R e p e t i t i o n s : 0 W a i t i n g T i m e a f t e r D o s a g e : 1 0 s e c . W a i t i n g T i m e a f t e r S t e p : 5 s e c . D i s p e n s e : i n t o W a s t e S t e p : C o n d i t i o n i n g _ W a t e r B a s i c t y p e : C o n d i t i o n i n g S t e p : - I D : 7 9 6 V o l u m e : 5 m l S u c t i o n S p e e d : 2 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 1 m l / m i n P o r t : 8 w a t e r R e p e t i t i o n s : 0 W a i t i n g T i m e a f t e r D o s a g e : 1 0 s e c . W a i t i n g T i m e a f t e r S t e p : 5 s e c . D i s p e n s e : i n t o W a s t e S t e p : L o a d B a s i c t y p e : L o a d - T r a n s f e r S a m p l e - A l i q u o t o v e r s a m p l e l o o p S t e p : - I D : 7 9 7 V o l u m e : 9 m l S u c t i o n S p e e d : 1 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 3 m l / m i n V i a l T y p e : T y p e 1 @ 1 6 W a i t i n g T i m e a f t e r D o s a g e : 0 s e c . W a i t i n g T i m e a f t e r S t e p : 1 5 0 s e c . D i s p e n s e : i n t o W a s t e w i t h o u t r i n s i n g o f v i a l S t e p : W a s h i n g _ _ w a t e r B a s i c t y p e : W a s h i n g S t e p : - I D : 7 9 8 V o l u m e : 5 m l S u c t i o n S p e e d : 1 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 3 m l / m i n P o r t : 8 w a t e r R e p e t i t i o n s : 1 W a i t i n g T i m e a f t e r D o s a g e : 0 s e c . W a i t i n g T i m e a f t e r S t e p : 0 s e c . D i s p e n s e : i n t o W a s t e S t e p : D r y i n g _ N i t r o g e n B a s i c t y p e : D r y i n g - D r y i n g b y d e f i n e d a i r v o l u m e S t e p : - I D : 7 9 9 A i r v o l u m e : 1 0 0 m l S u c t i o n S p e e d : 1 0 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 1 0 0 m l / m i n D i s p e n s e : i n t o W a s t e S t e p : E l u t i n g _ E E - M e O H _ 8 : 2 B a s i c t y p e : E l u t i n g S t e p : - I D : 8 0 0 V o l u m e : 5 m l S u c t i o n S p e e d : 1 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 3 m l / m i n P o r t : 1 1 M e O H - E E 8 : 2 R e p e t i t i o n s : 0 W a i t i n g T i m e a f t e r D o s a g e : 0 s e c . W a i t i n g T i m e a f t e r S t e p : 0 s e c . D i s p e n s e : i n t o v i a l s N u m b e r o f v i a l s : 1 V i a l T y p e : T y p e 1 @ 1 6 S t e p : D r y i n g _ a f t e r _ E l u t i o n B a s i c t y p e : D r y i n g - D r y i n g b y d e f i n e d a i r v o l u m e S t e p : - I D : 8 0 1 A i r v o l u m e : 2 0 m l S u c t i o n S p e e d : 1 0 0 m l / m i n D i s p e n s i n g S p e e d : 1 0 m l / m i n D i s p e n s e : s t a y o n a c t u a l p o s i t i o n Abb. 2: Methodenreport für die automatisierte SPE von Chloramphenicol in Honig mit dem FREESTYLE TM SPE Modul. Eluententausch: Eluat unter Stickstoffstrom bei 40 °C eindampfen und in 1 mL Wasser/Acetonitril (95:5, v/v) wieder lösen. Manuell ausgeführte Festphasenextraktion Säule: CHROMABOND ® HLB, 3 mL, 200 mg, (REF 730924) Probenvorbereitung: siehe automatisierte Festphasenextraktion Konditionieren: 1 x 3 mL Methanol, 1 x 5 mL Wasser Probenaufgabe: 9 mL Probenlösung mit geringem Vakuum (Fluss 3 mL/min) Waschen: 10 mL Wasser (Fluss 3 mL/min) Trocknen: 5 min mit Vakuum Elution: 5 mL Ethylacetat/Methanol (80:20, v/v) Eluententausch: siehe automatisierte Festphasenextraktion Anschlussanalytik: HPLC-MS / MS Chromatographische Bedingungen: HPLC-Säule: EC 150/2 NUCLEODUR ® π², 5 μm, (REF 760624.20) Eluent A: Wasser Eluent B: Acetonitril Gradient: 5–95 % B in 7,5 min, 95 % B für 1 min halten, 95–5 % B in 1 min, 5 % B für 5 min halten Fluss: 0,3 mL/min Temperatur: 35 °C Injektionsvolumen: 5 μL MS-Bedingungen: API 5500, ion source ESI, negative ionization mode, scan type MRM Curtain gas 35 psig, ion spray voltage -4500 V, temperature 450 °C, nebulizer gas 45 psig, turbo gas 45 psig, CAD medium MRM transitions Analyt [M-H]- Q1 (Quantifier) Q2 (Qualifier) Chloramphenicol 320,9 152,0 256,0 Chloramphenicol-d₅ 325,9 156,6 261,8 Tabelle 1: MRM transitions für Chloramphenicol und für Chloramphenicol-d₅. Kalibrationsgeraden 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 1.00e5 9.00e4 8.00e4 7.00e4 6.00e4 5.00e4 4.00e4 3.00e4 2.00e4 1.00e4 0.0 Time [min] Intensity [cps] Max 27e5 cps. [min] 0 20 40 60 80 100 120 140 25000000 20000000 15000000 10000000 5000000 0 Konzentration [ng/mL] Intensität [cps] CAP Q1 CAP Q2 R² = 0,9958 R² = 0,9962 Abbildung 3: Chromatogramm einer dotierten Honigprobe, 1 µg/kg. Abbildung 4: Kalibrationsgeraden von Chloramphenicol, Kon- zentrationsbereich 0,5–100 ng/mL. Wiederfindungsraten Chloramphenicol Chloramphenicol (interner Standard berücksichtigt) Chloramphenicol-d5 Automatisierte SPE 86,8 ± 4.4 (n = 4) 90,8 ± 4.6 (n = 4) 95,6 ± 4,5 (n = 4) Manuelle SPE 74,6 ± 2,7 (n = 3) 92,9 ± 3,4 (n = 3) 80,3 ± 4,7 (n = 3) Tabelle 2: Vergleich der Wiederfindungsraten bei automatisierter und manueller Festphasenextraktion. Ergebnisse und Diskussion Die Ergebnisse zeigen, dass eine Festphasenextraktion für Chloramphenicol mit CHROMABOND ® HLB aus der Matrix Honig zu sehr guten Wiederfindungen führt. Die in Tabelle 2 aufgeführten Wiederfindungsraten zeigen, dass durch eine Automatisierung mit Hilfe des SPE-Roboters, FREESTYLE TM SPE Modul, höhere Wiederfindungsraten von bis zu 90 % bei sehr guter Repro- duzierbarkeit (< 5 %) erreicht werden. Eine Korrektur durch internen Standard ist insbesondere bei der manuellen Probenvorbereitung zielführend. Die Abbildung 3 zeigt ein Chromatogramm eines dotierten Probenextraktes. Da Matrixinterferenzen deutlich vom Signal des Analyten ab- getrennt sind, ist eine eindeutige Identifizierung und Quantifizierung möglich. Die flüssigchro- matographische Methode könnte aufgrund der guten Retention von Chloramphenicol durch eine kleinere Partikelgröße oder eine kürzere Säule beschleunigt werden. Die Methodik weist eine sehr gute Linearität auf. Es muss berücksichtigt werden, dass ab Konzentrationen von 50 ng / mL Chloramphenicol erste Sättigungseffekte bei der massenspektrometrischen Detek- tion auftreten. Insgesamt konnte ein Bestimmungsverfahren entwickelt werden, bei dem insbe- sondere die Automatisierung der Festphasenextraktion zu sehr guten Ergebnissen führte. Literatur [1] Side-effects of Chloramphenicol and Aureomycin, Br Med J. 1951, 384–2, 388–392. [2] Verordnung (EG) Nr. 470/2009, [3] Bestimmung von Antibiotika-Rückständen in Honig L40.00–17. Dank Die MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG dankt der LC Tech GmbH für die Kooperation und die Bereitstellung des SPE-Roboters (FREESTYLE TM SPE Modul).
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Bestimmung von Chloramphenicol in Honig mit automatisierter Festphasenextraktion und HLPC-MS/MS-DetektionH. R. Wollseifen, Düren/D, T. Kretschmer, Düren/DDr. H. R. Wollseifen, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Neumann-Neander-Str. 6–8, 52355 Düren/D
Einleitung:
Chloramphenicol ist ein Breitbandantibiotikum gegen grampositive und gramnegative Erreger. Es weist ein ungünstiges Nebenwirkungsprofil auf, so dass es heute nur noch als Reservean-tibiotikum angewendet wird [1]. Zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit hat die EU für viele Rückstände in tierischen Produkten Höchstgrenzen festgesetzt. Die Bestimmungsver-fahren erfordern eine leistungsfähige Festphasenextraktion, um Rückstände im Spurenbereich sicher detektieren und quantifizieren zu können. Nachfolgend wird ein empfindliches Bestimmungsverfahren mit einer automatisierten Festpha-senextraktion vorgestellt und mit manueller Aufarbeitung verglichen. Die Festphasenextraktion wurde mit einem SPE-Roboter, FREESTYLETM SPE Modul, der LC Tech GmbH entwickelt. Als Festphase wurde entsprechend dem Methodenvorschlag der amtlichen Lebensmittelüberwa-chung CHROMABOND® HLB eingesetzt [2]. Für die Anschlussanalytik wurde ein HPLC-MS/MS Verfahren entwickelt. Die flüssigchromatographische Bestimmung erfolgte auf einer Biphenyl-phase, NUCLEODUR® π², die aufgrund von zusätzlichen π-Wechselwirkungen mit aromati-schen Analyten eine hohe Retention für Chloramphenicol aufweist. Zur Absicherung der Mes-sergebnisse wurde Chloramphenicol-d₅ als interner Standard eingesetzt.Chloramphenicol
Abb. 1: Molekülformel Chloramphenicol
Automatisierte Festphasenextraktion
Säule: CHROMABOND® HLB, 3 mL, 200 mg, (REF 730924) Probenvorbereitung: 5 g Honig in ein Zentrifugenröhrchen (50 mL) einwiegen, 4 mL Was-
ser hinzufügen und kräftig 0,5 min schütteln, 1 mL Standardlösung (c = 5 ng/mL Chloramphenicol und Chloramphenicol-d₅) hinzufü-gen und 0,5 min kräftig schütteln, 15 mL Ethylacetat hinzufügen und 0,5 min kräftig schütteln, bei 3000 U/min für 10 min zentrifugieren, 12 mL Überstand abnehmen und unter Stickstoffstrom bei 40 °C ein-dampfen, Rückstand in 10 mL Wasser wieder aufnehmen.
LCTech FreeStyle - Report on Methods: SPE Date: 26.06.2017 Time: 13:11:02
Name: CAP-M02-Honey_Agilent.spe SPE Column: LCTech_3ml.col
Extension cannula: yes
Processing speed selection: Standard (organic solvents)
Rinsing intensity: Extended rinsing cycle wo. Extra Cleaning after Load
Use pressure limitation function during loading and washing: no
Step: Conditioning_MeOH Basic type: Conditioning Step: - ID: 795
Volume: 3 ml Suction Speed: 20 ml/min Dispensing Speed: 1 ml/min Port: 1 methanolRepetitions: 0Waiting Time after Dosage: 10 sec. Waiting Time after Step: 5 sec. Dispense: into Waste
Step: Conditioning_Water Basic type: Conditioning Step: - ID: 796
Volume: 5 ml Suction Speed: 20 ml/min Dispensing Speed: 1 ml/min Port: 8 waterRepetitions: 0Waiting Time after Dosage: 10 sec. Waiting Time after Step: 5 sec. Dispense: into Waste
Step: Load Basic type: Load - Transfer Sample-Aliquot over sample loop Step: - ID: 797
Volume: 9 ml Suction Speed: 10 ml/min Dispensing Speed: 3 ml/minVial Type: Type1@16 Waiting Time after Dosage: 0 sec. Waiting Time after Step: 150 sec.
Dispense: into Wastewithout rinsing of vial
Step: Washing__water Basic type: Washing Step: - ID: 798
Volume: 5 ml Suction Speed: 10 ml/min Dispensing Speed: 3 ml/min Port: 8 waterRepetitions: 1Waiting Time after Dosage: 0 sec. Waiting Time after Step: 0 sec.
Dispense: into Waste
Step: Drying_Nitrogen Basic type: Drying - Drying by defined air volume Step: - ID: 799
Air volume: 100 ml Suction Speed: 100 ml/min Dispensing Speed: 100 ml/min Dispense: into Waste
Step: Eluting_EE-MeOH_8:2 Basic type: Eluting Step: - ID: 800
Volume: 5 ml Suction Speed: 10 ml/min Dispensing Speed: 3 ml/min Port: 11 MeOH-EE 8:2Repetitions: 0Waiting Time after Dosage: 0 sec. Waiting Time after Step: 0 sec.
Dispense: into vials Number of vials: 1Vial Type: Type1@16
Step: Drying_after_Elution Basic type: Drying - Drying by defined air volume Step: - ID: 801
Air volume: 20 ml Suction Speed: 100 ml/min Dispensing Speed: 10 ml/min Dispense: stay on actual position
Abb. 2: Methodenreport für die automatisierte SPE von Chloramphenicol in Honig mit dem FREESTYLETM SPE Modul.
Eluententausch:
Eluat unter Stickstoffstrom bei 40 °C eindampfen und in 1 mL Wasser/Acetonitril (95:5, v/v) wieder lösen.
Manuell ausgeführte Festphasenextraktion
Säule: CHROMABOND® HLB, 3 mL, 200 mg, (REF 730924) Probenvorbereitung: siehe automatisierte Festphasenextraktion Konditionieren: 1 x 3 mL Methanol, 1 x 5 mL Wasser Probenaufgabe: 9 mL Probenlösung mit geringem Vakuum (Fluss 3 mL/min) Waschen: 10 mL Wasser (Fluss 3 mL/min) Trocknen: 5 min mit Vakuum Elution: 5 mL Ethylacetat/Methanol (80:20, v/v) Eluententausch: siehe automatisierte Festphasenextraktion
Anschlussanalytik: HPLC-MS / MS
Chromatographische Bedingungen:
HPLC-Säule: EC 150/2 NUCLEODUR® π², 5 μm, (REF 760624.20) Eluent A: Wasser Eluent B: Acetonitril Gradient: 5–95 % B in 7,5 min, 95 % B für 1 min halten, 95–5 % B in 1 min, 5 %
B für 5 min halten
Fluss: 0,3 mL/min Temperatur: 35 °C Injektionsvolumen: 5 μL
MS-Bedingungen:
API 5500, ion source ESI, negative ionization mode, scan type MRM Curtain gas 35 psig, ion spray voltage -4500 V, temperature 450 °C, nebulizer gas 45 psig, turbo gas 45 psig, CAD medium
MRM transitionsAnalyt [M-H]- Q1 (Quantifier) Q2 (Qualifier)Chloramphenicol 320,9 152,0 256,0Chloramphenicol-d₅ 325,9 156,6 261,8Tabelle 1: MRM transitions für Chloramphenicol und für Chloramphenicol-d₅.
Kalibrationsgeraden
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0
1.00e5
9.00e4
8.00e4
7.00e4
6.00e4
5.00e4
4.00e4
3.00e4
2.00e4
1.00e4
0.0
Time [min]
Inte
nsity
[cps
]
Max 27e5 cps. [min]
0 20 40 60 80 100 120 140
25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0
Konzentration [ng/mL]
Inte
nsitä
t [cp
s]
CAP Q1
CAP Q2
R² = 0,9958
R² = 0,9962
Abbildung 3: Chromatogramm einer dotierten Honigprobe, 1 µg/kg.
Abbildung 4: Kalibrationsgeraden von Chloramphenicol, Kon-zentrationsbereich 0,5–100 ng/mL.
WiederfindungsratenChloramphenicol Chloramphenicol (interner
Standard berücksichtigt)Chloramphenicol-d5
Automatisierte SPE 86,8 ± 4.4 (n = 4) 90,8 ± 4.6 (n = 4) 95,6 ± 4,5 (n = 4)Manuelle SPE 74,6 ± 2,7 (n = 3) 92,9 ± 3,4 (n = 3) 80,3 ± 4,7 (n = 3)
Tabelle 2: Vergleich der Wiederfindungsraten bei automatisierter und manueller Festphasenextraktion.
Ergebnisse und Diskussion
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Festphasenextraktion für Chloramphenicol mit CHROMABOND® HLB aus der Matrix Honig zu sehr guten Wiederfindungen führt. Die in Tabelle 2 aufgeführten Wiederfindungsraten zeigen, dass durch eine Automatisierung mit Hilfe des SPE-Roboters, FREESTYLETM SPE Modul, höhere Wiederfindungsraten von bis zu 90 % bei sehr guter Repro-duzierbarkeit (< 5 %) erreicht werden. Eine Korrektur durch internen Standard ist insbesondere bei der manuellen Probenvorbereitung zielführend. Die Abbildung 3 zeigt ein Chromatogramm eines dotierten Probenextraktes. Da Matrixinterferenzen deutlich vom Signal des Analyten ab-getrennt sind, ist eine eindeutige Identifizierung und Quantifizierung möglich. Die flüssigchro-matographische Methode könnte aufgrund der guten Retention von Chloramphenicol durch eine kleinere Partikelgröße oder eine kürzere Säule beschleunigt werden. Die Methodik weist eine sehr gute Linearität auf. Es muss berücksichtigt werden, dass ab Konzentrationen von 50 ng / mL Chloramphenicol erste Sättigungseffekte bei der massenspektrometrischen Detek-tion auftreten. Insgesamt konnte ein Bestimmungsverfahren entwickelt werden, bei dem insbe-sondere die Automatisierung der Festphasenextraktion zu sehr guten Ergebnissen führte.
Literatur
[1] Side-effects of Chloramphenicol and Aureomycin, Br Med J. 1951, 384–2, 388–392. [2] Verordnung (EG) Nr. 470/2009, [3] Bestimmung von Antibiotika-Rückständen in Honig
L40.00–17.
Dank
Die MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG dankt der LC Tech GmbH für die Kooperation und die Bereitstellung des SPE-Roboters (FREESTYLETM SPE Modul).
![Menschen Präparate: Mundflora des - mgw.or.at · tetracycline, chloramphenicol, and trimethoprim -sulfamethoxazole.[1] Variable or pleomorphic in shape and similar to Actinomyces](https://static.fdokument.com/doc/165x107/5e0accf09a10763f5578a699/menschen-prparate-mundflora-des-mgworat-tetracycline-chloramphenicol-and.jpg)
