„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären ...

Aus dem Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. Rolf Müller des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären Neuroblastomen“

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der gesamten Medizin

dem Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Kornelius Tobias Kerl, geboren in Delmenhorst

Marburg 2007.

Angenommen vom Fachbereich Humanmedizin der Philipps-Universität Marburg am: 06.06.2008 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs für Medizin Dekan: Prof. Dr. Rothmund Referent: Prof. Dr. Eilers 1.Korreferent: Prof. Dr. Grzeschik 2.Korreferent: Prof. Dr. Lührmann

3

1 Einleitung

1.1 Das Neuroblastom.................................................................................................8

1.1.1 Histologie...............................................................................................8

1.1.2 Diagnostik ..............................................................................................9

1.1.3 Inzidenz und Stadieneinteilung............................................................10

1.1.4 Prognose...............................................................................................11

1.1.5 Genetik.................................................................................................11

1.1.6 Therapie ...............................................................................................13

1.2 Die E2F-Familie...........................................................................................14

1.2.1 Die E2F-Transkriptionsfaktoren ..........................................................14

1.2.2 Der RB/E2F-Kontrollpunkt .................................................................16

1.2.3 E2F1 in Neuroblastomen .....................................................................17

1.3 Das Polycombgen BMI1 ..............................................................................18

1.3.1 Polycombproteine ................................................................................18

1.3.2 Polycomb Proteine und “Zellgedächtnis”............................................21

1.3.3 Repressionsmechanismen durch PcG-Komplexe ...............................22

1.3.4 INK4a/ARF..........................................................................................23

1.3.5 BMI1 ist als Onkogen, verantwortlich für die Selbsterneuerung von

Stammzellen........................................................................................................24

1.3.6 Bmi1 und Neuroblastome ....................................................................26

1.4 Ziele und Fragestellungen............................................................................26

2 Material ...............................................................................................................29

2.1 Chemikalien und Reagenzien ......................................................................29

2.2 Lösungen......................................................................................................30

2.3 Puffer............................................................................................................31

2.4 Enzyme ........................................................................................................34

2.5 Proteaseinhibitoren ......................................................................................35

2.6 Proteasominhibitoren ...................................................................................35

2.7 Bakterienstämme..........................................................................................36

2.8 Eukaryontische Zelllinien ............................................................................36

2.9 Kultivierungsmedien....................................................................................37

2.9.1 Bakterienmedium.................................................................................37

2.9.2 Zellkulturmedium ................................................................................38

Inhaltsverzeichnis

4

2.10 Antibiotika ...................................................................................................39

2.11 Antikörper ....................................................................................................39

2.11.1 Primärantikörper ..................................................................................39

2.11.2 Sekundärantikörper ..............................................................................40

2.12 Synthetische Oligonukleotide ......................................................................40

2.12.1 Primer zur Klonierung von cDNA in Plasmid-DNA...........................40

2.12.2 Primer für in vitro-Mutagenese............................................................41

2.12.3 RNA-Oligonukleotide für RNA-Interferenz Experimente ..................41

2.12.4 RNA-Oligonukleotide für RT-PCRs im Echt-Zeit-Gerät ....................42

2.13 Vektoren.......................................................................................................43

2.13.1 Grundvektoren .....................................................................................43

2.13.2 RNAi-Plasmid......................................................................................44

2.13.3 Reporterplasmide .................................................................................44

2.13.4 Expressionsvektor ................................................................................45

2.14 Kitsysteme....................................................................................................45

2.15 Verbrauchsmaterialien .................................................................................46

2.16 Geräte...........................................................................................................46

3 Methoden ............................................................................................................47

3.1 Zellbiologische Methoden ...........................................................................47

3.1.1 Allgemeine Bedingungen für die Kultivierung von Säugerzellen.......47

3.1.2 Passagieren von Zellen ........................................................................47

3.1.3 Zählen von Zellen mit Hilfe von Zählkammern ..................................48

3.1.4 Einfrieren von eukaryontischen Zellen................................................48

3.1.5 Auftauen von eukaryontischen Zellen .................................................49

3.1.6 Transiente Transfektion von Säugerzellen durch

Calciumphosphatpräzipitation für Expressionsstudien.......................................49

3.1.7 Calciumphosphat-Methode für die transiente Transfektion von

Säugerzellen für Reporterstudien........................................................................50

3.1.8 Selektion von antibiotikaresistenten Zellen .........................................50

3.1.9 Induktion von eukaryontischen Zellen.................................................51

3.1.10 Stabile Transfektion von Säugerzellen durch

Calciumphosphatmethode...................................................................................52

3.1.11 Infektion von Säugerzellen mit Virusüberstand ..................................53

5

3.1.12 Durchführung eines Koloniebildungsversuch mit stabil transfizierten

siRNA-BMI Klonen............................................................................................54

3.1.13 Anfärben von fixierten eukaryonten Zellen durch Giemsa-Färbung für

Koloniebildungsversuche....................................................................................54

3.1.14 Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)................................................55

3.2 Molekularbiologische Methoden .................................................................56

3.2.1 Kultivierung von Bakterien..................................................................56

3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien nach

Boiling-Prep-Methode 56

3.2.3 Minipräparation von BAC-Kulturen (bacterial artficial

chromosome).......................................................................................................57

3.2.4 Maxipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien .............................57

3.2.5 Photometrische Bestimmung Nukleinsäure-Konzentration...............58

3.2.6 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit

Restriktionsendonukleasen für analytische Zwecke ...........................................58

3.2.7 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit

Restriktionsendonukleasen für Klonierungszwecke ...........................................58

3.2.8 Agarose-Geleletrophorese von DNA...................................................59

3.2.9 Kovalente Verknüpfung von DNA-Fragmenten (Ligation) ................59

3.2.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien durch Hitzeschock ..60

3.2.11 Verschmelzen von zwei Oligonukleotideinzelsträngen durch

Verknüpfung durch kovalente Bindungen ..........................................................60

3.2.12 Dephosphorylierung von Vektorfragmenten .......................................61

3.2.13 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten ............................................61

3.2.14 Klonierungsstrategien ..........................................................................61

3.2.15 Sequenzierungen ..................................................................................62

3.2.16 Generierung von BMI-Punktmutanten mittels in vitro-Mutagenese ...63

3.3 Biochemische Methoden..............................................................................64

3.3.1 Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen ................................64

3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford ........................64

3.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteine..........................65

3.3.4 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen mittels Western-Blot 65

3.3.5 Detektion von Proteinen auf PVDF-Membranen durch

Chemolumineszenz .............................................................................................66

6

3.3.6 Bewertungskriterien für Western-Blots ...............................................66

3.3.7 Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität ...........................................67

3.3.8 Bestimmung der Luciferaseaktivität ....................................................67

3.3.9 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Trizol .......68

3.3.10 cDNA –Amplifikation durch reverse Transkription aus RNA ............68

3.3.11 PCR mit spezifischen Primern .............................................................69

3.3.12 RT-PCR mit spezifischen Primern im Echt-Zeit-Gerät .......................69

4 Ergebnisse ...........................................................................................................70

4.1 Experimentelles System: Neuroblastomzelllinien, die ein E2F1-ER-

Fusionsprotein exprimieren .....................................................................................70

4.2 BMI1 ist Zielgen von E2F1..........................................................................70

4.2.1 E2F1 induziert Bmi1 auch auf Proteinebene .......................................70

4.2.2 BMI1 ist ein direktes Zielgen von E2F1 ..............................................71

4.2.3 Die Induktion von Bmi1 durch E2F erfolgt durch eine E2F-

Bindungsstelle im Bmi1-Promotor .....................................................................73

4.3 BMI1 ist kein Regulator des MYCN-Gens in IMR 32-Zellen bei transienter

Transfektion .............................................................................................................75

4.4 Untersuchung der Rolle von BMI1 in der Antwort auf E2F1 in

Neuroblastomen .......................................................................................................76

4.4.1 Hemmung der BMI1-Expression durch RNAi-Interferenz..................76

4.4.2 Folgen der Hemmung von BMI1 in Neuroblastomzellen ....................78

4.4.3 Reduktion der BMI1 Menge durch RNA-Interferenz in stabilen

Zellklonen ...........................................................................................................80

4.4.4 Induzierbare Hemmung der BMI1 Expression ....................................81

4.4.5 Funktionelle Inaktivierung von Bmi1 durch Expression eines

dominant-negativen Allels ..................................................................................84

4.4.6 Die Expression von dnBmi1 in 1A3-Zellen hat keinen Einfluss auf die

Induktion von S-Phase und Apoptose.................................................................86

4.5 HTERT ist kein Zielgen von BMI1 in Neuroblastomzellen .........................88

4.5.1 Die Dereprimierung von Rb führt nicht zur Induktion von E2F1 bzw.

Bmi1 in MEFs.....................................................................................................89

5 Diskussion...........................................................................................................91

5.1 E2F1 induziert Bmi1 durch Bindung an die E2F1 Bindungsstelle im BMI1-

Promotor ..................................................................................................................91

7

5.2 Bedeutung von Bmi1 in der Tumorgenese ..................................................91

6 Literaturliste ........................................................................................................97

7 Abbildungsverzeichnis......................................................................................119

8 Abkürzungsverzeichnis.....................................................................................121

9 Verzeichnis der akademischen Lehrer ..............................................................124

10 Tabellarischer Lebenslauf .................................................................................125

11 Danksagung.......................................................................................................127

12 Ehrenwörtliche Erklärung .................................................................................128

8

Einleitung

1.1 DAS NEUROBLASTOM

Das Neuroblastom ist der dritthäufigste maligne Tumor in der Pädiatrie. Es macht 9%

aller bösartigen Tumore des Kindesalters aus und ist für etwa 15% aller Todesfälle

durch Krebserkrankungen in diesem Alter verantwortlich (Kaatsch und Zambon,

2006). Es handelt sich um einen embryonalen Tumor, ausgehend vom

postganglionären sympathischen Nervensystem mit häufiger Lokalisation im Bereich

der Nebenniere und dem sympathischen Grenzstrang (Brodeur und Castleberry,

1997).

Sowohl klinisch, als auch molekularbiologisch weist das Neuroblastom eine

ausgeprägte Heterogenität auf. Der Krankheitsverlauf hängt wesentlich vom Stadium

der Erkrankung und vom Alter der Patienten zum Zeitpunkt der Diagnosestellung ab.

Das durchschnittliche Alter bei Diagnosestellung beträgt zwei Jahre. Im Allgemeinen

zeigen Kinder, bei denen die Erkrankung im ersten Lebensjahr diagnostiziert wird,

lokalisierte Tumorstadien, die durch Operation und minimale adjuvante Therapie

geheilt werden können (Brodeur und Castleberry, 1997). Im Gegensatz hierzu sind die

Tumore älterer Kinder häufig bereits bei Diagnosestellung metastasiert. Diese Kinder

sterben trotz intensiver multimodaler Therapie an einer raschen Tumorprogression

(Maris und Matthay, 1999).

1.1.1 Histologie

Die meisten Neuroblastome weisen sehr undifferenzierte Zellen auf. Der Grad der

Differenzierung kann in einem Tumor stark variieren. Entsprechend werden Tumore,

die sowohl aus undifferenzierten Zellen, als auch aus reifen Ganglionzellen bestehen

von solchen, die undifferenzierte und nur partiell differenzierte Neuroblasten

enthalten und Tumoren, die lediglich unreife, nicht differenzierte Zellen enthalten,

unterschieden (Hughes und Palmer, 1974; Shimada, 1982). Liegen reife neben

unreifen Zellen vor, spricht man von Ganglioneuroblastomen. Bei völliger Ausreifung

heißen die Tumore Ganglioneurome (Peuchmaur, 2004).

9

Undifferenzierte Neuroblastome zeigen kleine, basophile Zellen, die sich zu

Pseudorosetten zusammenlagern. Elektronenmikroskopisch lassen sich

katecholaminhaltige Granula nachweisen. Durch spezifische immunhistochemische

Färbungen kann der Nachweis für die Neuronenspezifische Enolase (NSE) erbracht

werden (Triche und Chandra, 1985). Die Tumore enthalten darüber hinaus einen

Anteil an Schwann-Zellen. Diese Zellen werden als Teil des Ausreifungsprozesses

verstanden (Brodeur und Hedborg, 1993; Ambros, 1996).

1.1.2 Diagnostik

Klinisch fallen die Patienten durch eine Anämie, Oberbauchschmerzen, Erbrechen,

Obstipationen, Diarrhö, Knochenschmerzen, Fieber oder andere unspezifische

Symptome auf. Dabei hängt die Symptomatik sehr stark von der Lokalisation des

Tumors ab (Brodeur, 2003). Nach der deutschen Neuroblastomstudie (NB2004) ist

folgende Diagnostik initial bei Verdacht auf ein Neuroblastom durchzuführen:

Labordiagnostisch sind folgende Parameter zu bestimmen:

Großes Blutbild, Elektrolyte, Leberwerte, Nierenwerte, Gerinnung.

Zusätzlich werden tumorassoziierte Marker bestimmt:

-LDH und Ferritin (erhöht)

-Neuronenspezifische Enolase im Serum (erhöht)

-Katecholaminmetabolite im Urin (Vanillinmandelsäure und

Homovanilinmandelsäure).

Eine bildgebende Diagnostik zur Bestimmung der Tumorausdehnung erfolgt durch:

-Ultraschall des Abdomens und des Lymphknotenstatus

-Kernspintomographie des Abdomens, des Kopfes, des Spinalkanals und des

Thorax

-Knochenszintigraphie

Darüber hinaus besteht durch die Metjodbenzylguanidin (MIBG)-Aufnahme ein

szintigraphischer Nachweis. Bei dieser Methode wird MIBG in neurosekretorischen

Granula chromaffiner Zellen angereichert. Die Diagnose Neuroblastom wird vor

allem histologisch gesichert.

10

1.1.3 Inzidenz und Stadieneinteilung

Die nach Alter standardisierte Inzidenz des Neuroblastoms in Deutschland betrug,

basierend auf Ergebnissen aus den Jahren 1989 bis 1998, 1,2 Fälle per 100.000

Kinder. Das Geschlechterverhältnis war mit 1:1,1 für Mädchen:Jungen annähernd

gleich (Kaatsch und Spix, 1999).

Das Neuroblastom wird in fünf Stadien eingeteilt (NB 2004).

Die wichtigsten Kriterien dieser Einteilung sind:

-der Ausdehnungsgrad des Tumors

-das Metastasierungsmuster und

-die Möglichkeit zum operativen Eingriff:

Stadium I: lokalisierter Tumor mit makroskopischer kompletter Resektion (mit oder

ohne mikroskopisch residualer Resterkrankung; im repräsentativen ipsilateralen

Lymphknoten lässt sich mikroskopisch kein Tumor nachweisen).

Stadium IIa: lokalisierter Tumor mit makroskopischer inkompletter Resektion, mit

mikroskopisch negativem repräsentativem ipsilateralen Lymphknotenbefund

Stadium IIb: lokalisierter Tumor mit inkompletter makroskopischer Resektion, mit

positiven ipsilateralen und negativen kontralateralen Lymphknoten

Stadium III: nicht resektabler unilateraler Tumor, der die Mittellinie überschreitet; mit

oder ohne regionalen Lymphknotenmetastasen

Stadium IV: Primärtumor mit Metastasierung in nicht regionale Lymphknoten, in

Knochen, Knochenmark, Leber, Haut oder andere Organe (Ausnahme: 4S)

Stadium IV S: Dieses Stadium nimmt eine Sonderstellung ein. Diese Patienten weisen

nach ursprünglicher Definition mehrere Fernmetastasen bei lokalisiertem

Primärtumor auf. Die Metastasen treten vor allem in der Haut, der Leber und dem

Knochenmark auf. Definitionsgemäß sind die Patienten bei Diagnosestellung unter

einem Jahr alt.

11

1.1.4 Prognose

In der deutschen Neuroblastomstudie (NB 97) wurden 2151 Patienten nicht selektiv

untersucht. Es ergab sich in dieser Studie eine 10-Jahresüberlebensrate von 61%. Die

wesentlichen Determinanten für die Überlebenszeit sind der Zeitpunkt der

Diagnosestellung und die Amplifikation des MYCN-Gens (Berthold und Zischnag,

1997), welches sich bei etwa 25% der Patienten nachweisen lässt (Brodeur, 1994).

Das Stadium bei Diagnosestellung spielt eine sehr große Rolle für die Überlebenszeit

der Patienten. Kinder im Alter von unter einem Jahr zum Zeitpunkt der

Diagnosestellung, haben selbst bei ausgedehnten Tumorstadien eine deutlich

günstigere Prognose als ältere Kinder (Beckwith und Perrin, 1963; Brodeur, 1994).

Nach der deutschen Neuroblastomstudie (NB`97) bedeutet dies für die einzelnen

Stadien folgendes: Die 5-Jahres-Überlebenswahrscheinlichkeit beträgt für Stadium I

99%, Stadium II 93%, Stadium III 78%, Stadium IV 31% (NB 97).

1.1.5 Genetik

Für eine Untergruppe von Patienten mit Neuroblastomen ist eine familiäre

Prädisposition beschrieben worden, welche autosomal-dominant vererbt wird. Diese

Patienten erkranken im Durchschnitt 9 Monate früher als das

Gesamtpatientenkollektiv (Bordeaut und Delattre, 2005).

Es wurden bisher zahlreiche chromosomale Veränderungen in Neuroblastomen

untersucht. In den Chromosomen 1,-11 und -14 kommt es z.B. zu einem Verlust von

genetischem Material, während für das Chromosom 17 ein Zugewinn im Bereich von

17q charakteristisch ist (Gilbert und Weisband, 1984). CGH-Analysen (comparative

genomic hybridization) konnten in 50-75% aller untersuchten Neuroblastomproben

einen Zugewinn an genetischem Material in 17q21 nachweisen (Brinkschmidt und

Terpe, 1997; Plantaz und Feuerstein, 1997). Für Patienten mit familiärer Häufung von

Neuroblastomen wurde das Chromosom 16p12-13 als Ort der Mutation identifiziert.

Die Veränderungen im Bereich des Chromosoms 1 sind besonders häufig (bis zu 36%

aller Neuroblastome). Dabei handelt es sich um einen monoallelischen Verlust von

genetischem Material im Bereich des kurzen Arms vom Chromosom 1 (Brodeur und

12

Goldstein, 1977). Die Deletion auf Chromosom 1p geht mit einer schlechten Prognose

einher (Maris, 1995 und 2000). Die Konsensus-Verlustregion befindet sich im

Bereich 1p36.2-36.3, wobei kurze interstitielle Deletionen von größeren, terminalen

Deletionen, die generell mit einer Amplifikation von MYCN und entsprechend

schlechterer Prognose assoziiert sind, unterschieden werden (Christiansen und

Lampert,1992; Takeda und Taneko, 1994; White und Beltinger, 1995). Es wird

vermutet, dass im Bereich dieser Verlustregion von Chromosom 1p mehrere

potentielle Tumorsuppressorgene liegen (Schleiermacher und Delattre, 1994; Caron

und Hoeve, 1993; Takeda und Taneko, 1994). Durch den Transfer eines intakten

Chromosoms 1 in eine Neuroblastomzelllinie, die eine Deletion im Bereich des

Chromosoms 1p aufwies, konnte gezeigt werden, dass nach dem Transfer,

Differenzierungsprozesse und Apoptose induziert werden (Bader und Stanbridge,

1991). CHD5 wurde als ein Gen dieser Region identifiziert (Thompson und Brodeur,

2003). Die Mitglieder der CHD-Familie spielen eine große Rolle bei der

posttranslationellen Chromatinmodifikation (CHD: Chromodomain, helicase, DNA-

binding) (Woodage, 1997; Thompson und Brodeur, 2003).

In einem Kollektiv von 295 Neuroblastomen konnte festgestellt werden, dass ein

Verlust von genetischem Material im Bereich des langen Arms des Chromosoms 11

in 44% der Fälle vorlag (Guo und Maris, 1999). Die Konsensusverlustregion lag im

Bereich 11q23. In der Gruppe von Patienten ohne Amplifikation von MYCN ist der

LOH (loss of heterzygosity) des Chromosoms 11q mit einer signifikanten Reduktion

der Überlebenswahrscheinlichkeit assoziiert (Guo und Maris, 1999).

Das Chromosom 14 weist in Neuroblastomen ebenfalls häufig Deletionen auf. Diese

betreffen vor allen den langen Arm des Chromosoms 14 und korrelieren signifikant

mit einem LOH des Chromosoms 11q und invers mit der Amplifikation von MYCN

(Thompson und White, 2001).

Myc ist ein basisches Helix-loop-helix/leucine-zipper-Protein. Es wirkt als

Transkriptionsfaktor und kann in drei Teile unterteilt werden (Brough, 1995):

C-terminal befindet sich das b/HLH/LZ-Motiv. Dieses vermittelt die DNA-Bindung.

N-Terminal befinden sich zwei hoch konservierte Strukturen, die Myc-Box I und die

Myc-Box II, welche im Wesentlichen für die biologische Funktion von Myc

verantwortlich sind (Schwab, 1985; Li, 1994; Brough, 1995; Mac Gregor, 1996).

Grundsätzlich sind drei sehr eng miteinander verwandte Mycs zu unterscheiden: C-

Myc, N-Myc, L-Myc (Schwab, 1985; Schwab, 1988; Zimmermann, 1990).

13

Veränderungen des Expressionslevels von Myc sind die häufigste Ursache von

maligner Entartung von Tumoren. N-Myc ist in die Karzinogenese zahlreicher

Tumore involviert. In Neuroblastomen ist das Expressionslevel von N-Myc

entscheidend, um prognostische Aussagen treffen zu können (Schwab, 1995).

Die Funktionen von Myc sind sehr weitreichend: Blockade der Zelldifferenzierung,

Induktion von Apoptose, maligne Transformation von Zellen und Immortalisierung

(Schwab, 1988).

Ein wesentliches Problem bei der Therapie von Neuroblastomen ist die erworbene

und primäre Resistenz gegenüber Zytostatika. Isolierte Neuroblastomzelllinien aus

Tumorrezidiven weisen dabei wesentlich häufiger eine Resistenz gegenüber

Zytostatika auf, als entsprechende Tumore aus Kontrollzelllinien (Kuroda und

Sawada, 1991; Keshelava und Reynolds, 1997). In diesen Rezidiven konnte eine

Überexpression von MDR1 (multidrug resistance gene 1) nachgewiesen werden. In

einem Patientenkollektiv konnte gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen

Expression von MDR-Genen und dem Überleben der Patienten besteht (Norris und

Haber, 1996).

1.1.6 Therapie

Für therapeutische Maßnahmen werden die Neuroblastompatienten in mehrere

Gruppen eingeteilt (NB 2004). Bei dieser Einteilung werden das Tumorstadium, die

klinische Symptomatik und die Amplifikation von MYCN berücksichtigt.

Die erste Gruppe bilden Beobachtungspatienten im Säuglingsalter:

hierzu zählen Säuglinge mit MYCN-negativen Neuroblastomen und Stadium 1 oder

Stadium 4S ohne bedrohliche Symptome, sowie Stadium 2 und 3 ohne Deletion von

Chromosom 1p und einem Alter unter 2 Jahren.

Diese Patienten werden nach der Operation, bzw. Gewebeentnahme sechs bis zwölf

Monate beobachtet. Besteht der Tumor auch noch nach dieser Zeit, wird ein weiteres

operatives Vorgehen angestrebt. Nimmt der Tumor erneut an Größe zu, wird eine

einwöchige Chemotherapie mit Doxorubicin, Vincristin und Cyclophoshamid

durchgeführt (N4-Block). Diese muss bis zum Verschwinden des Tumors wiederholt

14

werden. Bei Übergang des Tumors in Stadium 4 wird der Patient der

Hochrisikogruppe zugeordnet.

Die zweite Gruppe (mittleres Risiko) umfasst Patienten im Stadium 2 und 3, die

MYCN nicht amplifiziert haben, aber eine 1p-Deletion aufweisen; oder Patienten im

Stadium 4 unter einem Jahr ohne MYCN-Amplifikation.

Nach der Operation wird eine Chemotherapie mit 10 Blöcken (3xN5: Cisplatin,

Etoposid, Vindesin; 3xN6: Vindesin, Darcabazin, Ifosfamid, Doxorubicin; 4xN7:

Cyclophophamid) durchgeführt.

Die dritte Gruppe (hohes Risko) besteht aus allen Patienten mit MYCN-Amplifikation

und Patienten im Stadium 4, die über einem Jahr alt sind (unabhängig von MYCN).

Diese Patienten erhalten nach einer primären operativen Tumorreduktion zunächst

2xN8 (Topotecan, Cyclophosphamid und Etoposid), gefolgt von 3xN5-Blöcken und

3xN6-Blöcken. Die zweite Operation und gegebenenfalls eine Bestrahlung werden

zwischengeschaltet. Bei Ansprechen des Tumors wird eine Hochdosischemotherapie

und eine autologe Stammzelltransplantation durchgeführt.

1.2 DIE E2F-FAMILIE

1.2.1 Die E2F-Transkriptionsfaktoren

E2F wurde als zellulärer Transkriptionsfaktor des E2-Adenoviruspromotors

identifiziert (Kovesdi und Nevins, 1986). Fast 5% aller Gene werden durch Mitglieder

der E2F-Familie reguliert. Eine große Anzahl hiervon übernimmt Funktionen bei der

Zellzyklusproliferation oder direkt bei der DNA-Synthese. Hierzu gehören unter

anderem die DNA-Polymeraseα (Pearson und Wang, 1991), die

Dihydrofolatreduktase (Blake, 1989), CDC25A (Vigo und Helin, 1999), die G1-

Cykline A und E (Schulze, 1995; Ohtani, 1995; Geng, 1996) sowie E2F-1 und -2

selbst (Hsiao und Farnham, 1994; Sears und Nevins, 1997).

15

Inzwischen sind acht Mitglieder der E2F-Familie bekannt (Review durch Rowland

und Bernards, 2006). Die verschiedenen Mitglieder der E2F-Familie wirken sowohl

als Transkriptionsaktivatoren als auch als Repressoren der Transkription (Dimova und

Dyson, 2005; Tsantoulis und Gorgoulis, 2005). Fünf Mitglieder der E2F-Familie

(E2F1-E2F5) interagieren mit den Proteine der Rb-Familie (pRB, p107 und p130)

(Weinberg, 1995; Paggi und Giordani, 2001; Hitchens und Robbins, 2003; Dimova

und Dyson, 2005; Tsantoulis und Gorgoulis, 2005). Durch Bindung dieser fünf E2Fs

an „Pocket Proteine“, unterdrücken sie die Transkription von Zielgenen. Diese E2F-

Komplexe bilden dann mit Histondeazetylasen (HDACs), chromatinverändernden

Proteinen, wie BRG-1 und Histonmethyltransferasen, wie SUV39H1, Komplexe

(Attwool, 2004). Durch Dissoziation von E2F1-E2F5 von den Pocket Proteinen wird

hingegen Transkription und damit die Expression von Zielgenen ausgelöst. Dabei

formen diese E2Fs Komplexe mit Histonacetyltransferasen wie p300, CBP, P/CAF

und Tip60 (Attwooll, 2004; Cobrinki, 2005).

Um an die DNA zu binden, bilden E2F1-E2F6 Heterodimere mit den

„Dimerisationspartner Proteinen (Dp1 und Dp2)“, während E2F7 und E2F8 auch

ohne Assoziation mit Dp1 und Dp2 an DNA binden können (Di Stefano und Helin,

2003; Logan und La Thangue, 2004). E2Fs enthalten sowohl Aktivator- als auch

Repressordomänen, wobei E2F1-E2F3 meist als Aktivatoren und E2F4-E2F6 meist

als Repressoren klassifiziert werden. Diese Unterschiede zwischen den beiden E2F-

Hauptgruppen spiegelt sich auch in der Struktur wieder: E2F4 und E2F5 sind primär,

wenn sie an Pocket Proteine gebunden sind, im Nukleus lokalisiert und funktionieren

so als „Repressionskomplex“, während sie sich in ungebundener Form außerhalb des

Nukleus befinden (Attwool, 2004; Frolov und Dyson, 2004).

Eine dominant-negative Mutante (Wu, 1996) und eine siRNA gegen Dp1 (Maehara,

2005), bewirken einen G1-Zellzyklusarrest durch den fehlenden DNA-

Bindungspartner für E2F. Dominant-negative Mutanten gegen E2F1 (Gonzalo, 2005,

Maehara, 2005) und E2F2 (Bargou, 1996) (mit fehlendem carboxyterminalem Ende)

zeigen keinen Zellzyklusarrest, sondern ganz im Gegenteil eine Stimulation der

Zellzyklusproliferation, die sich selbst gegenüber einer p19-Stimulation refraktär

zeigt (Rowland, 2002). Dieser offensichtliche Gegensatz wird folgendermaßen

erklärt: Können E2F1-E2F6 durch das Fehlen von Dp nicht an die DNA binden, so

überwiegt die Repression der Zellproliferation durch die atypisch bindenden (ohne

Dp1) E2F7 und E2F8. Dominant negativ-wirkende Mutanten von E2F besetzen

16

hingegen die E2F-Bindungsstellen und schützen diese so gegen Einflüsse repressiv

wirkender E2Fs (Rowland und Bernards, 2006).

1.2.2 Der RB/E2F-Kontrollpunkt

Bisher konnte nur ein kleiner Teil der genetischen Defekte, die zur Entstehung von

Neuroblastomen beitragen, identifiziert werden. So konnte bei einer Reihe von

Genen, die in vielen anderen Tumoren Mutationen aufweisen, in Neuroblastomen

keine Mutation nachgewiesen werden. Es gibt allerdings Hinweise, dass auch in

Neuroblastomen eine funktionelle Inaktivierung zumindest einiger dieser Gene

vorliegt. Diese weisen allerdings im Vergleich zu anderen Tumorarten andere

Mechanismen der Deregulation auf.

Viele Tumorarten zeigen Mutationen im RB-Gen (Retinoblastom) oder Genen

desselben Kontrollnetzwerkes (CDK2, CDK4, CCNE1)(Braden und Knudsen, 2006).

Das Retinoblastom-Protein ist Mitglied einer nach ihrer Struktur benannten Gruppe

von Proteinen, den „Pocket-Proteinen“. Zu dieser Gruppe gehören auch die Proteine

pRb1/105, p107 und pRb2/p130 (Gallo und Giordano 2005). pRB inhibiert das

Zellwachstum und die Zellproliferation (Balciunaite und Scime, 2005). Das

Retinoblastom-Protein ist eines der am Besten charakterisierten Tumorsupressoren.

Es weist vor allem im Retinoblastom, aber auch in vielen anderen malignen Tumoren,

wie z.B. dem Osteosarkom, dem kleinzelligen Bronchialkarzinom, dem

Prostatakarzinom sehr häufig Mutationen auf (Puri und McCance, 2005).

Ein Mechanismus der transkriptionellen Kontrolle der Cyclin-Untereinheiten ist

neben der Phosphorylierung und Dephosphorylierung, die Aktivierung einer weiteren

Gruppe regulatorischer Proteine, den zyklinabhängigen Kinaseinhibitoren (cyclin

dependend kinase inhibitors-CKI) (Peter und Herskowitz, 1994). Durch Binden der

CKIs an Cdk-Proteine oder Cyclin-Untereinheiten wird eine Inhibition der

Kinaseaktivität erreicht. Dadurch wird eine Phosphorylierung von Rb verhindert

(Peter und Herskowitz, 1994). In Säugerzellen sind zwei verschiedene CKI-Familien

bekannt, die beide die Zellzyklusprogression in der G1-Phase inhibieren: die Kip/Cip-

sowie die Ink4-Familie. Die Kip/Cip-Familie besteht aus den Proteinen p21Waf-1/Cip1,

17

p27Kip1 und p57Kip2. p21 spielt sowohl in dem DNA-Reparaturmechanismus der Zelle

als Zielgen von p53, als auch in der terminalen Differenzierung eine wichtige Rolle

(El-Deiry, 1993; Parker und Elledge, 1995).

Die zweite Familie zellzyklusinhibitorisch wirkender Proteine besteht aus den

Proteinen p14/p15INK4b, p16INK4a, p18INK4c und p19INK4d. Die Ink4-Proteine inhibieren

Cdk-4 und Cdk-6 durch Bindung an die Cdk-Untereinheit. Die Ink4-CKIs regulieren

also im Wesentlichen die Phosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins (Ortega und

Barbacid, 2002). Hypophosphoryliertes pRb1/p105 assoziiert mit E2F-1, E2F-2 und

E2F-3 und wirkt als transkriptioneller Ko-Repressor, der die Expression von E2F-

regulierten Genen inhibiert (Claudio, 2002; Trimarchi und Lees, 2002; Leone, 2000).

Die Phosphorylierung von pRb führt zur Dissoziation des pRb von E2F und in der

Folge zur Aktivierung E2F-regulierter Gene, die den Eintritt der Zellen in die S-Phase

des Zellzyklus bewirken (Muller, 2001; Young, 2003; Attwooll, 2004). Neben der

Inhibierung der E2F-abhängigen Expression wirkt der Rb/E2F-Komplex in

Kombination mit den HDAC (histone deacetylating complexes) selbst als aktiver

Repressor der Transkription. Diese wichtige Funktion als Kontrollpunkt bei der

Zellproliferation wird auch bei der Betrachtung Rb-defizienter Mäuse deutlich. Diese

weisen nämlich im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen einen höheren Anteil von Zellen in

der S-Phase auf. Rb wird auch in Verbindung mit chromatinverändernder Enzyme zur

Kontrolle der Expression von Genen gebracht (La Sala, 2003; Macaluso, 2003, 2005,

2006, Gunawardena, 2004, Parakati und DiMario, 2005). pRb2/p130 und p107 binden

an die repressiv auf die Transkription wirkenden E2Fs (E2F4 und E2F5) (Hijmans,

1995; 1998; Claudio, 2002; Farkas, 2002). E2F7 und E2F8 werden nicht in

Verbindung mit Pocket-Proteinen gebracht (Trimarchi und Lees, 2002; Aslanian,

2004; Ginsberg, 2004).

1.2.3 E2F1 in Neuroblastomen

E2F ist bei der Regulation der Transkription von MYCN in Neuroblastomen beteiligt

(Strieder und Lutz, 2003). Die Aktivität von E2F-1 steht unter der Kontrolle des Rb-

Weges, der in sehr vielen malignen menschlichen Tumoren dereguliert ist. In-vivo-

Analysen haben gezeigt, dass der MYCN-Promotor zwei überlappende E2F-

18

Bindungsstellen aufweist (La Thangue, 2002; Santoni-Rugui und Lukas, 2002).

Weitere Zielgene vom deregulierten E2F in Neuroblastomzellen wurden durch die

stabile Überexpression von E2F1-ER-Fusionsprotein in SK-N-SH-EP-Zellen

gefunden (Kramps, 2004). Die große Vielfalt an Aufgaben, die von Mitgliedern der

E2F-Familie erfüllt wird, wirft auch sehr viele Fragen auf:

1.) Welches der vielen hundert Zielgene ist verantwortlich für welche der zahlreichen

biologischen Funktionen?

2.) Liegen all diese Zielgene in aktiver Form vor, wenn die entsprechenden E2F-

Mitglieder aktiviert sind; oder ist das Vorliegen der entsprechenden Zielgene an

physiologische Regulationsmechanismen geknüpft?

Die Untersuchung eines dieser E2F-Zielgene, BMI1 und seine Rolle für die Funktion

von E2F1 im Neuroblastom war das Thema meiner Arbeit.

1.3 DAS POLYCOMBGEN BMI1

1.3.1 Polycombproteine

In den letzten Jahren ist durch viele Arbeiten klar geworden, dass entscheidende

Schritte zur Regulation von Genen auf Chromatinebene vollzogen werden. Eine sehr

wichtige Gruppe von Proteinen, die auf Chromatinebene Einfluss nimmt, sind die

Polycomb-Proteine. Die Polycomb-Proteine wurden in Drosophila, als Repressoren

der Homeotic Gene entdeckt. In menschlichen Zellen sind sie an der Regulation der

Homeobox (HOX) Gene beteiligt (Merel und van Lohuizen, 2004).

Es gibt im Wesentlichen zwei verschiedene Polycomb-Komplexe, die 2-5 MDa groß

sind und jeweils mit verschiedenen Korepressoren assoziieren (Jacobs und van

Lohuizen, 2002). In humanen Zellen gibt es offensichtlich einen dritten Komplex

(PRC3) (Kuzmichev und Reinberg, 2004).

Der erste Polycomb-Komplex („initiating complex“; PcGi; PRC 2) besteht unter

anderem aus EeD (embryonic ectoderm development), Enx1/EzH2 und Enx2/EzH1.

Der Kern des zweiten Komplexes („maintenance complex“; PcGm; welcher in

Drosophila auch Polycomb Repressive Complex 1 genannt wird) enthält die Proteine

19

Psc (posterior sex combs), Ph (polyhomeotic), Pc (Polycomb) und Ring (Francis und

Kingston, 2001; Satijn und Otte, 2001). In menschlichen Zellen liegt der

entsprechende „humane Polycomb Repressive Complex“ (hPRC) vor, der im

Wesentlichen die gleichen Proteine, aber auch das Ring-Finger-Protein Bmi (auch

Mel18, Mph1, M33 Mpc2) enthält. Dieses ist als das menschlich homologe Protein zu

Psc anzusehen (Satijn und Otte, 2001).

Die zwei Komplexe haben bei der Kontrolle der HOX-Gene eine redundante Funktion

(van der Lugt und Berns, 1994). HOX-Gene spielen u.a. bei der Differenzierung von

Stammzellen (HOXa5, HOXa9, HOXa10, HOXb3, HOXb4 und HOXb6) (Owens und

Hawley, 2002) und der neuronalen Differenzierung eine wichtige Rolle (Guthrie,

2004). Bei der Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen verhalten sich die

beiden Komplexe allerdings antagonistisch; der Eed/Ezh Komplex inhibiert, während

der Bmi-enthaltende Komplex die Proliferation der hämatopoetischen Stammzellen

stimuliert (Franke und Paro, 1992; Alkema und van Lohuizen, 1997; Gunster und

Otte, 1997). Natürlich ist die Vorstellung von nur zwei verschiedenen Polycomb-

Komplexen eine starke Vereinfachung und trifft in einigen Punkten den Sachverhalt

nur ungenau. Die verschiedenen Polycomb-Proteine werden während der

Differenzierung sehr unterschiedlich exprimiert. Diese Eigenschaft lässt sich am

Besten im Knochenmark feststellen. BMI1-, MEL18-, MPH1/RAE28- und M33-

mutierte Mäuse weisen alle sehr weitreichende Defekte im hämatopoetischen System

auf (Reduktion der T-Lymphozytenzahl, Defekte in der Entwicklung von B-

Lymphozyten, vermindertes Ansprechen auf Zytokine v.a. IL-7, u.s.w.) (van der Lugt

und Berns, 1994; Akasaka und Koseki, 1997, 2001; Core und Djabali, 1997;

Takihara, 1997). Im Knochenmark zeigen undifferenzierte Vorläuferzellen die

stärkste Expression von Bmi1 (und MPH1/RAE28) (Ohta und Takihara, 2002; Park

und Clarke, 2003). Während der Differenzierung nimmt die Expression von Bmi1

stark ab. Diese Eigenschaft unterscheidet Bmi1 von den anderen Polycomb-Proteinen

(z.B. M33, Mel18, Hph1, Enx/Ezh2), deren Expression in hämatopoetischen

Vorläuferzellen sehr schwach oder nicht nachweisbar ist und während der

Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen zunimmt (Raaphorst und Meijer,

2001). Diese Beobachtung lässt vermuten, dass die Zusammensetzung der Polycomb-

Komplexe von den unterschiedlichen physiologischen Bedingungen abhängt. Diese

Schlussfolgerung wird durch andere Beobachtungen unterstützt:

20

In Drosophila konnte gezeigt werden, dass die Zusammensetzung der Komplexe

abhängig von den unterschiedlichen Zielgenen ist. Dieses Bild wird dadurch

kompliziert, dass die eng miteinander verwandten PcG-Gruppen-Proteine Bmi1 und

Mel18 dosisabhängig miteinander kooperieren (Jacobs und van Lohuizen, 2002).

Der Verlust von Bmi1 verursacht neurologische Defekte, die bei Mel18-knock-out

Mäusen nicht beobachtet werden können (van der Lugt, 1994). Die neurologischen

Fehlbildungen bei Bmi-defizienten Mäusen liegen v.a. im Kleinhirn und im

Hippocampus (Molofsky und Morrison, 2003). In Lymphozyten verhält sich BMI1

durch Kollaboration mit CMYC als Onkogen, währenddessen MEL18

Tumorsuppressorfunktion hat (Kanno und Taniguchi, 1995). In Lymphozyten hat die

Überexpression von MEL18 wachstumsunterdrückende Wirkung (Akasaka, 1996;

1997). Diese z.T. entgegengesetzten Effekte von Bmi1 und Mel18 auf die

Zellproliferation sind umso erstaunlicher, wenn man weiß, dass 75% der

Aminosäuren beider Proteine identisch sind, und sie sich nur in der Ring-Finger-

Domäne unterscheiden (Alkema und Berns, 1997; Cohen, 1996; Jacobs und van

Lohuizen, 1999).

Abb.1 (modifiziert nach Jacobs und van Lohuizen; 2002)

Regulation der Proliferation hämatopoetischer Stammzellen. Polycomb Komplexe mit einem hohen Anteil an Bmi1-Protein

regulieren die Zellproliferation positiv, indem sie Ink4a reprimieren.

INK4a/ARF

Rb P53

BMI

BMI

BMI

Mel18

BMI BMI

Myc

ARF

P53

PcG

Cyclin

CDK

21

1.3.2 Polycomb Proteine und “Zellgedächtnis”

Der menschliche Körper besteht aus mehr als 200 unterschiedlichen Zelltypen. Diese

verschiedenen Zelltypen reagieren, obwohl sie alle das gleiche Genom enthalten, auf

intra- oder extrazelluläre Signale sehr unterschiedlich. Diese Zellidentität wird durch

epigenetische Ereignisse, wie Methylierung der DNA und posttranslationelle

Modifizierung der Histone, kontrolliert (Fisher, 2002; Jaenisch und Bird, 2003; Hsieh

und Gage 2004; Valk-Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Die Gene der Polycomb-

Gruppe und der Thrithorax-Gruppe sind Teil dieses „Zellgedächtnisses”, welches die

Zellen vor Änderungen der Zellidentität schützt. Die Transkriptionsaktivität von

Genen, die als Ergebnis von regulatorischen Ereignissen in den einzelnen Zellen für

eine bestimmte Zeit anzusehen ist, kann über viele Runden Mitose aufrecht erhalten

werden. Das biochemische Korrelat dieser Konservierung sind epigenetische

Markierungen auf der DNA, die während der Mitose erhalten bleiben oder im

Anschluss an die Mitose wieder aufgebaut werden (Muyrers-Chen und Paro, 2001;

Orlando, 2003). Verantwortlich dafür, ob ein Gen im aktivierten oder reprimierten

Zustand vorliegt, sind regulatorische Sequenzen, so genannte „Polycomb Response

Elemente“ (PREs), „Maintenance Elemente“, oder „Zellgedächtnis-Module“ (CMMs)

(Brock und van Lohuizen, 2001; Lyko und Paro, 1999). In Drosophila bestehen

solche Module aus mehreren hundert Basenpaaren. An die „Maintenance Elemente“

binden einerseits Polycomb-Proteine (PcGs), die den reprimierten Zustand durch die

Blockade der RNA-Synthese konservieren, und zum anderen die antagonistisch

wirkenden Trithorax-Proteine, die den aktiven Zustand stabilisieren (Breiling und

Orlando, 2001; Poux und Pirrotta, 2002).

Die Regulation durch Polycomb-Proteine ist aber keineswegs irreversibel, sondern

wird sehr dynamisch durch Aktivatoren und Repressoren beeinflusst (Orlando, 2003).

Es wird vermutet, dass die Regulation der Polymerase II und die Synthese von nicht-

kodierender RNA erheblichen Anteil am komplexen Zellgedächtnis hat (Francis und

Woodstock, 2004). In humanen Zellen sind die PRC1-Mitglieder nicht nur an

Euchromatinregionen lokalisiert, sondern akkumulieren auch am perizentrischen

Heterochromatin (Saurin und Freemont, 1998; Voncken und van Lohuizen, 1999).

Die Pcg-Proteine bevorzugen dabei v.a. die 1q12-Region und die mit der 1q12-

Region verwandten Sequenz auf Chromosom 9, 15, 16. Die Assoziation zu den

hochrepititiven Regionen lässt eine spezielle Zielstruktur der Pcg-Proteine in diesen

22

Sequenzen vermuten (Hernandez-Munos und van Lohuizen, 2005). Die genaue

Funktion dieser Pcg-Assoziation ist zurzeit noch nicht abschließend geklärt. Es ist

aber bekannt, dass perizentrisches Heterochromatin bei der Genstabilisierung und

beim transkriptionellen Abschalten von Genen eine Rolle spielt (Peters und Jenuwein,

2001; Taddei und Almouzni, 2001).

1.3.3 Repressionsmechanismen durch PcG-Komplexe

Viele Trx-Proteine, die als molekulare Antagonisten der Pcg-Proteine anzusehen sind,

kodieren für eine ATPase-abhängige Untereinheit der Swi/Snf-Protein-Familie

(Mahmoudi und Verrijzer, 2001). PRC1 und PSC können Swi/Snf-abhängige

Nukleosomen reprimieren; dieses zeigt die antagonistische biochemische Aktivität zu

den Polycomb-Proteinen. Es gibt Hinweise, dass trxG-Komplexe Verbindungen zu

histonverändernden Enzymen eingehen, wie z.B. der Histondeacetylase p300

(Yokoyama und Cleary, 2004) und Cbp (Petruk und Mazo, 2001). Viele

Polycombgruppenproteine interagieren mit Koregulatoren, die die Transkription

durch Deazetylierung von Lysinen am N-terminalen Ende der Histone H3 und H4,

bzw. durch Hinzufügen von Methylgruppen, reprimieren (Cao und Zhang, 2002;

Zermin, 2002; Kuzmichev, 2002; Müller und Simon, 2002; Sewalt, 1998). Das

menschliche Eed interagiert mit HDAC1 und 2 (histone deacetylases 1/2) und

reprimiert auf diesem Weg die entsprechenden Zielgene (van der Vlag und Otte,

1999).

In-vitro kann sowohl Prc1, als auch Psc Swi/Snf-abhängige Nukleosomen

reprimieren. Dies bedeutet, dass der nukleosomale Kern oder die DNA weniger die

primären Ziele der PcG- und trxG-Komplexe sind, als die Histonketten. Während der

Esc-E(z)-Komplex in Fliegen und der entsprechende Eed-Ezh2-Komplex in

menschlichen Zellen die H3-K27-Methytransferase aktivieren (Beisel und Sauer,

2002; Cao und Zhang, 2002; Czermin und Pirotta, 2002; Kuzmichev und Reinberg,

2002; Milne, 2002; Muller, 2002; Nakamura, 2002), wurde für den Prc1-Komplex

eine Aktivierung der H2A-K119-Ubiquitin-E3-Ligase nachgewiesen (Wang, 2004).

Beim längerfristigen Abschalten von Genen kooperieren die beiden PcG-Komplexe

über folgende Verbindung miteinander: Die ESC-E(Z)-abhängige H3-K27-

23

Methylierung schafft eine Bindungsstelle für die Rekrutierung des PRC1-Komplexes

(Fischle, 2003; Min, 2003). Es gibt zwei Beweise dafür, dass PcG-Komplexe mit

Zielpromotoren der E2F Proteine und der E2F-Bindungsdomäne assoziieren:

1.) E2F6, eines der repressiven Mitglieder der E2F-Familie gehört zum gleichen PcG-

Komplex wie Bmi1 (Ogawa, 2002; Trimarchi, 2001)

2.) Die Polycomb-Proteine Hpc2 und Ring 1 bilden einen Komplex mit E2F-1, Rb

und CtBP, welcher einen G2/M-Zellzyklusarrest durch Repression von Cyclin A und

Cdc2 verursacht (Dahiya und Dean, 2001).

1.3.4 INK4a/ARF

INK4a/ARF ist ein Tumorsuppressor, welcher Zielgen von BMI1 in

Mausembryofibroblasten ist (siehe auch Abb.1) (Jacobs und van Lohuizen, 1999).

INK4a/ARF kodiert für zwei Gene (Verwendung eines unterschiedlichen Leserasters),

die beide als Tumorsuppressor wirken: P16 und P19. P16 verhindert die Inaktivierung

des Tumorsuppressors RB durch Hemmung des Cyclin D-Cdk4/6-Kinasen-

Komplexes. Hypophosphoryliertes pRb beeinflusst E2F-Transkriptionsfaktoren und

reprimiert die E2F-Zielgene (Sherr, 2001). p19/Arf bindet an Mdm2 und verhindert

die Degradation und Inaktivierung des Tumorsuppressors p53 (Sherr, 2001). Sowohl

p16, als auch p19 unterdrücken die Zellproliferation und sind Teil eines Systems,

welches unregulierte mitogene Stimuli unterdrückt (Sherr, 2001). Die Aktivierung

wird z.B. beim Erreichen hoher Zellteilungsraten ausgelöst. Wenn primäre Zellen den

Expressionsstimuli von Ras oder c-Myc ausgesetzt werden, werden p16 und p19

induziert und bewirken so einen Wachstumsarrest oder induzieren Apoptose (Sherr,

2001). In anderen Gewebetypen, wie z.B. neuronalen und hämatopoetischen

Stammzellen führt das Fehlen von Bmi1 ebenfalls zur Überexpression von p16/Ink4a

und p19/Arf (Molofsky und Morisson, 2003; Park und Clarke, 2003). Die erhöhte

Expression von p16/Ink4a oder p19/Arf in hämatopoetischen Stammzellen führt zum

Wachstumsarrest oder dem p53-abhängigen Zelltod (Park, 2003).

Bmi-defiziente Mäuse weisen mehrere Erscheinungsbilder auf: normale Körpergröße

mit milden skeletalen Veränderungen, Zeichen hämatopoetischer Fehlbildungen und

neuronaler Anormalitäten (van der Lugt, 1994). Die Deletion von Ink4a oder Arf in

24

Bmi-/- Mäusen führt zum Wiedereintreten der, durch das Fehlen von Bmi1

blockierten Erneuerung von neuronalen Stammzellen (Molofsky und Pardee, 2005).

Die Regulation des Wachstums von Stammzellen ist allerdings nicht nur vom

Ink4a/Arf abhängig; so ist das Erscheinungsbild von Ink4a/Arf-defizienten Mäusen

relativ normal. Es wird eine multifaktorielle Beeinflussung vermutet: P21/Cip1 und

P18/Ink4c kontrollieren ebenfalls den Zellzyklus (Cheng und Scadden, 2000;

Miyazawa, 2000). Mel18 und Cbx7 regulieren in bestimmten Zelltypen Ink4a/Arf

(Gil und Beach, 2004); so ist Ink4a/Arf in Mel18-/- Mausembryofibroblasten

hochreguliert (Jacobs und van Lohuizen, 1999). Andere Polycomb-Proteine, wie z.B.

Eed in mutierten Mäusen und Ezh2-defiziente Fibroblasten beeinflussen Ink4a/Arf

nicht (Lessard, 1999; Bracken, 2003).

1.3.5 BMI1 ist als Onkogen, verantwortlich für die Selbsterneuerung von

Stammzellen

Bmi-1 ist sowohl für die Proliferation und die Selbsterneuerung von erwachsenen

hämatopoetischen und neuronalen Stammzellen (Lessard und Sauvageau, 2003; Park

und Clarke, 2003; Molofsky und Morrison, 2003; Iwama, 2004; Leung, 2004; Zencak,

2005), als auch für die Proliferation von Tumorstammzellen notwendig (Valk-

Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Bmi-defiziente Mäuse weisen zahlreiche

neurologische Defekte auf (siehe oben): v.a. in der Proliferation der Zellen der

subventrikulären Zone (Molofski, 2003), des Kleinhirns (Bmi wird für die

Entwicklung der Vorläuferzellen benötigt; Leung, 2004), aber auch des peripheren

Nervensystems (Molofsky, 2003). Diese Funktion von Bmi1 wird ebenfalls durch

Fähigkeit den INK4a-Genort zu reprimieren ausgeübt. Die Deletion von INK4a oder

ARF führt in Bmi-/-Mäusen zum Wiedereintreten der Erneuerung von neuronalen

Stammzellen (Molofsky, 2005).

In der Stammzellbiologie unterscheidet sich Bmi1 in einem wesentlichen Punkt von

anderen Polycomb-Proteinen: Die Expression von Bmi1 im Knochenmark ist in

undifferenzierten Vorläuferzellen sehr hoch und sinkt mit jedem Grad höherer

Differenzierung, während die Expression aller anderen Polycomb-Proteine während

der Differenzierung zunimmt (Lessard, 1998).

25

Die Identifizierung von BMI1 als Onkogen erfolgte in B- und T-Zell-Lymphomen

(Haupt und Adams, 1991; van Lohuizen, 1991). Es gibt wesentliche Hinweise dafür,

dass Bmi an der Entstehung von Tumoren beteiligt ist:

1.) Bmi1 kooperiert mit c-Myc in Lymphomen von doppelt-transgenetischen Mäusen

(Haupt und Adam, 1991; van Lohuizen und Berns, 1991; Jacobs, 1999). Bmi1

reguliert dabei Ink4a/Arf negativ, wodurch P16 und P19 aktiviert werden. P16 hemmt

die Zellzyklusprogression durch die Regulation von Cyclin D-abhängigen Kinasen

und verhindert die Phosphorylierung des Tumorsuppressors Rb (Serrano und Lowe,

1993). P19/Arf verhindert die Degradation und Inaktivierung des Tumorsuppressors

p53 durch die Bindung an Mdm2.

2.) Die Überexpression von Bmi1 blockiert die Seneszenz und immortalisiert

Mausembryofibroblasten (allerdings nicht menschliche Fibroblasten). Bmi-/-Mäuse

weisen sowohl in der Hämatopoese, als auch in der neurologischen Entwicklung

verschiedene Defekte auf. In Kombination mit aktiviertem H-Ras führt dieses zu einer

neoplastischen Transformation (Jacobs, 1999). Diese onkogenetische Funktion hängt

ebenfalls von der Fähigkeit von Bmi1 ab, Ink4a zu reprimieren; so zeigte sich in Bmi-

/-, Ink4a-/- Mausembryofibroblasten, die die beschriebenen Defekte aufwiesen, ein

erfolgreicher Rettungsversuch mit Ink4a/Arf (Jacobs, 1999).

3.) Bmi1 wurde in bestimmten Mantelzelllymphomen (9 von 36; 25%) hoch

amplifiziert gefunden (Bea, 2001). Allerdings kann in solchen Mantelzelllymphomen,

welche Bmi1 überexprimiert haben, weder ein Unterschied im Ink4a/Arf-Level, noch

im p16-Level, im Vergleich zu Lymphomen, die Bmi1 nicht überexprimieren,

gefunden werden (Bea, 2001). Bmi1 ist außerdem in einigen Linien des nicht-

kleinzelligen Bronchial-Karzinoms (58% aller NSCLC) (Hentz, unveröffentlichte

Ergebnisse, Ref. Vonlanthen), des Kolonkarzinoms, des Multiplen Myeloms und des

Medulloblastoms überexprimiert zu finden (Molofsky und Morisson, 2003; Kim,

2004; Bea, 2001; Vonlanthen, 2001; De Vos, 2002). Die Überexpression von Bmi1

kann in diesen Tumoren allerdings nicht mit der Tumorcharakteristik oder der

Prognose in Verbindung gebracht werden.

26

1.3.6 Bmi1 und Neuroblastome

In den letzten Jahren gibt es immer mehr Hinweise, dass Bmi-1 zelltypspezifische

Effekte hervorruft. Bmi-1 wird durch Repression von Arf für die Verhinderung von

Seneszenz in Fibroblasten verantwortlich gemacht (Itahana und Dimri, 2003). Es gibt

einige Hinweise, dass Bmi-1 auch bei der Entstehung von Neuroblastomen beteiligt

ist:

1.) Bei der Analyse von Genexpressionsprofilen von 94 Primärtumoren zeigte

sich in jedem dieser Neuroblastome eine starke Überexpression von BMI-1

(Berwanger und Eilers, 2002)

2.) Interessant ist auch die Rolle der HOX-Gene, denen eine große Bedeutung bei

der Entstehung einiger Tumore zugesprochen wird. Es gibt eine Verbindung

zwischen HOX-Genen und BMI1 bei der Entstehung von Tumorzellen im

Knochenmark (Antonchuk, 2002; Thorsteinsdottir, 2002). Es ist bis heute aber

unklar, welche Rolle HOX-Gene in Neuroblastomen tatsächlich spielen.

3.) In Lymphomen ist die Kooperation zwischen BMI1 und CMYC bekannt:

BMI1 kann hier die Induktion der ARF-Gene durch CMYC unterdrücken und

somit Apoptose verhindern (Bea und Campo, 2001; Jacobs und van Lohuizen,

1999). Eine wichtige Rolle nimmt das zu c-Myc in Neuroblastomen homologe

N-Myc ein, welches genau wie Bmi1 durch E2F kontrolliert wird. Bei

Überexpression von E2F1 könnte sowohl MYCN, als auch BMI1 dereguliert

werden, was bei einer möglichen Kooperation dieser beiden Gene eine fatale

Wirkung auf die Proliferation der Tumorzellen hätte.

1.4. ZIELE UND FRAGESTELLUNGEN

Das Neuroblastom ist der häufigste solide Tumor im Kindesalter (Kap. 1.1.1). Die

Prognose ist sehr unterschiedlich (Kap. 1.1.4) und hängt u.a. vom Stadium der

Erkrankung bei Diagnosestellung, vom Erkrankungsalter und auch wesentlich von der

Expression bestimmter Gene (z.B. MYCN) und bestimmten Mutationen ab (z.B. 1p36)

(Kap. 1.1.5). N-Myc wird in Neuroblastomen durch E2F1 reguliert. Überexpression

27

von E2F-1 führt zur Induktion von S-Phase und Apoptose (Kap. 1.2.1 und 1.2.3).

Durch Arbeiten im eigenen Labor wurde gezeigt, dass das Polycomb-Protein und

Onkogen BMI1 (Kap. 1.3) in menschlichen Neuroblastomen, aber auch in

Rattenfibroblasten auf RNA-Ebene durch E2F1 reguliert wird. Diese Beobachtungen

werfen einige Fragen auf:

1.) Lässt sich die Überexpression von BMI1 durch E2F1-Stimulus, die auf RNA-

Ebene beobachtet werden konnte, auch auf Protein-Ebene zeigen?

2.) Ist BMI1 direktes oder indirektes Zielgen von E2F1?

3.) Wird BMI1 über eine vermeintliche E2F-1-Konsensusbindungsstelle im

proximalen Bmi1-Promotor reguliert?

4.) Welche Aufgaben erfüllt BMI1 in Neuroblastomzellen?

Zwei Modelle sind denkbar:

Modell 1

Modell 2

Abb.2: Induziert Bmi-1 nach E2F-1 Stimulation S-Phase und Apoptose?

Modell 1) E2F-1 induziert Apoptose und S-Phase unabhängig von der Stimulation von Bmi-1. Bmi-1 erfüllt in der Zelle andere

Aufgaben.

Modell 2) E2F-1 induziert Bmi-1; dadurch wird Apoptose, S-Phase und weitere Programme in den Zellen ausgelöst

Es gibt viele Gene, die von E2F1 gehemmt werden, aber in Anwesenheit von

Cycloheximid nicht von E2F1 reprimiert werden. Diese Beobachtung spricht dafür,

dass hier ein indirekter Weg der Repression vorliegt. Ein möglicher Kandidat, der

Apoptose

S-Phase

BMI-1

E2F-1

???

E2F-1

Apoptose

S-Phase BMI-1

???

28

diese Aufgaben erfüllen könnte, wäre Bmi1. In beiden Modellen wird Bmi1 durch

E2F1 reguliert. Im ersten Model wird die Induktion von Apoptose und S-Phasen nur

von E2F1 und nicht von Bmi1 beeinflusst. Bmi1 erfüllt dabei andere Aufgaben als S-

Phase- und Apoptoseinduktion. Bmi1 wird auch im zweiten Model durch E2F1

reguliert. Hier induziert Bmi1, die E2F1-zugeschriebenen Programme, nämlich die

Induktion von S-Phase und Apoptose.

29

2 Material

2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN

Die Reagenzien und Chemikalien, die im höchsten Reinheitsgrad von den Firmen

Merck (Darmstadt), Applichem (Heidelberg) und Sigma-Aldrich (München) bezogen

wurden, werden in alphabetischer Reihenfolge aufgelistet. Materialien, die von

anderen Firmen geliefert wurden, sind mit den entsprechenden Firmennamen in der

Materialliste versehen. In dieser Auflistung werden Standardchemikalien wie z.B.

Ethanol, Glycin oder Natriumchlorid nicht berücksichtigt.

Produkt Firma

Agarose, für Analysezwecke Sekam

Agarose, für präparative Zwecke Invitrogen

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma

Adenosin-5’-triphosphat (ATP) Fluka

Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V Applichem

Desoxynukleotidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Sigma

D-Luciferin Applichem

DNA-Längenstandard „1 kb-DNA-ladder“ Invitrogen

Ethidiumbromid Roth

L-Glutamin Bio Whittaker

Magermilchpulver Merck

Ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) Sigma

Propidiumiodid

Proteinlängenstandard „Bench Mark Prestained Protein Ladder“

Invitrogen

Protein-Molekulargewichtmarker “Low Range Rainbowmarker

RPN 755”

Amersham

Protein-Molekulargewichtmarker “Full Range Rainbowmarker

RPN 800”

Amersham

N, N, N, N-tetramethylendiamin (TEMED) Gibco

Trypsin, gebrauchsfertige 1x Trypsin-EDTA-Lösung Invitrogen

30

2.2 LÖSUNGEN

Als Lösungsmittel wurde, soweit es nicht anders erwähnt wird, Aqua dest. verwendet.

Lösungen Menge Einheit Inhaltsstoffe

30 % (w/v) Acrylamid Acrylamid Stammlösung

0,8 % (w/v) N, N’-Methylen-Bisacrylamid

Ammoniumperoxodisulfat-

Lösung (APS)

10 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat

Magermilchpulver Blocklösung

5 % (w/v)

in TBST

4,75 % (v/v) Ethanol

10 % (v/v) ortho-Phosphorsäure

Bradford-Reagenz 0,01 % (w/v) Commassie Brilliant Blue G-250

filtriert und lichtgeschützt

gelagert

BSA Referenz-Stocklösung 1 mg/mL BSA

in jeweiligen Lysepuffer

3,7 % (w/v) Paraformaldehyd

in PBS, pH 7,4

Fixierlösung Jeweils frisch angesetzt oder bei -

20°C als 20 %ige Stammlösung

gelagert

β-Gal-Substratlösung 4 mg/mL ONPG

Glycin Glycin-Waschlösung

0,1 M

In PBS, pH 7,4

Giemsa-Färbelösung Sigma

5 % (v/v) FCS

0,1 % (v/v) NP-40

in PBS, pH 7,4 Inkubationslösung

Jeweils frisch angesetzt

31

0,2 MM D-Luciferin Luciferase-Substratmix

25 MM Gly-Gly pH7,8

NP40-Lyselösung 0,1 % (v/v) NP-40

16 Ml HCl

0,5 ml Triton X-100

2M HCL/0,5% Triton X-100

(für zweidimensionale FACS-

Analyse) 83,5 ml H20

3,814 G Na2BO4O7 0,1M Na2B4O7*10H2O


Analyse)

ad 100 ml H2O

1 G BSA

0,5 Ml Tween

5,58 g NaCitrat

PBS/0,5% Tween 20 + 1%

BSA


Analyse) ad 100 ml PBS

0,5 ml NP40 PBS/0,1 NP 40 (für

eindimensionale FACS-

Analyse)

500 ml PBS

2.3 PUFFER

Als Lösungsmittel für die Puffer wurde ebenfalls, wenn es nicht anders erwähnt wird,

Aqua dest. verwendet.

Puffer Menge Einheit Inhaltsstoffe

40 % (w/v) Saccharose

0,2 % (w/v) Bromphenolblau

0,2 % (w/v) Xylencyanol DNA-Probenpuffer

10 mM EDTA

60 mM Na2HPO4SO

10 mM KCL2-Mercaptoethanol

50 mM 2-Mercaptoethanol

ß-Galactosidase

Reaktionspuffer

1 mM MgSO

32

50 mM Hepes-KOH

1,5 mM Na2HPO4

280 mM NaCl

2x HBS-Puffer

pH 7,05

100 mM KHPO4

1 mM DTT KPI-Puffer

pH7,8

25 mM Tris-HCl pH 8,3

0,2 mM Glycin Laufpuffer

0,1 % (w/v) SDS

2 mM ATP pH 7,0

10 mM MgSO4 Luciferase-Reaktionspuffer

25 mM Gly-Gly pH 7,8

93,2 mM Na2HPO4 Natriumphosphatpuffer

6,8 mM NaH2PO4

137 mM NaCl

8,2 mM Na2HPO4

2,7 mM KCl 1x PBS

1,5 mM KH2PO4

15 mM Tris-Puffer, pH 8

10 mM EDTA P1-Puffer für BAC-Prep

100 Mg/ml RNAse A

0,2 M NaOH P2-Puffer für BAC-Prep

1 % SDS

P3-Puffer für BAC-Prep 3 M KOAc, pH 5,5

0,5 M Tris-HCl pH 6,8 4x Sammelgelpuffer

0,4 % (w/v) SDS

4,8 ml 4x Trenngelpuffer

0,6 G SDS

0,426 G Dithiotreithol

3,5 ml Glycerol

3x SDS-Probenpuffer

Spatelspitze Bromphenol-blau

33

Ad 10 ml mit Aqua dest.

40 mM Tris-Acetat

1 mM EDTA 1x TAE

pH 8,0

50 mM Tris-HCl

150 mM NaCl TBS

pH 7,4

TBS TBST

0,2 % (v/v) Tween-20

10 mM Tris-HCl

100 mM NaCl TE-Puffer pH 8,0

1 mM EDTA

250 mM NaCl

0,1 % Nonidet P-40

50 mM HEPES (pH 7,0)

5 mM EDTA

0,5 mM Dithiothreitol

ELB Lysepuffer (Satjin)

1 mM Phenylmethylsulfonyl, Fluoride,

Proteaseinhibitoren

192 mM Glycin

25 mM Tris-Base

10 % (v/v) Methanol

Transferpuffer für

Semidryblot

pH 8,3

192 mM Glycin

25 mM Tris-Base

10 % (v/v) Methanol Transferpuffer für Tankblot

0,03 % (v/v) SDS

1,5 M Tris-HCl pH 8,8

0,4 % (w/v) SDS 4x Trenngelpuffer

8 mM EDTA

34

2.4 ENZYME

Die unterschiedlichen Enzyme und die zugehörigen Restriktionspuffer wurden von

den Firmen New England Biolabs, Stratagene und Invitrogen bezogen. Weitere

Enzyme und ihre Bezugsquellen sind nachfolgend aufgeführt:

Enzym Hersteller

BamH I Stratagene

Bgl II Stratagene

EcoR I Stratagene

Hind III Stratagene

NheR I Stratagene

Nhe Stratagene

NOT I Stratagene

Sac I Stratagene

Xba Stratagene

Xho I Stratagene

Dpn I Stratagene

Pfu Turbo Polymerase Stratagene

Pwo Polymerase Hybaid-AGS

Shrimp alkaline phosphatase New England Biolabs

T4 DNA-Ligase New England Biolabs

T4PNK (Kinasierung) New England Biolabs

35

2.5 PROTEASEINHIBITOREN

Alle Proteaseinhibitoren wurden 1:1000 eingesetzt.

Proteaseinhibitoren Stammkonzentration Hersteller

Aprotinin 5 mg/mL in PBS pH 7,4 Roche Biochemica

Dithiothreitol 1 M in Aqua dest. Merck

Leupeptin 5 mg/mL in Aqua dest. Roche Biochemica

N-Ethylmaleimid (NEM) 1 M in Ethanol Sigma

Pepstatin A 1 mg/mL in Methanol Roche Biochemica

Phenylmethylsulfonyl-

Fluorid (PMSF)

0,2 M in Ethanol Sigma

2.6 PROTEASOMINHIBITOREN

Proteasominhibitoren Stammkonzentration Hersteller

N-acetyl-L-leucinyl-L-

leucinyl-L-norleucinal (ALLN)

20 mM in DMSO Sigma

MG 132 20 mM in DMSO Calbiochem

36

2.7 BAKTERIENSTÄMME

In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Bakterienstämme (Escherichia coli)

verwendet:

Stamm Bezeichnung

XL1-Blue E.coli, recA, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1,

F’[pro AB laclq Z∆lacM15, Tn10 (tetr)]

DH5α E.coli, Fα80dlacZ∆M15, ∆(lacZYAaegF)U169, deoR, recA1,

endA1, hsdR17 (rKi,mK

+), phoA, supE44, α-

thi-1, gyrA96, relA1

Der Stamm DH5α wurde für Klonierungszwecke und der Stamm XL-1 Blue für

Retransformationen verwendet.

2.8 EUKARYONTISCHE ZELLLINIEN

Alle verwendeten Zellen waren menschlichen Ursprungs.

Ziellinie Herkunft

SK-N-SH-EP Neuroblastomzelllinie, die N-Myc nicht exprimiert

1A3 SHEP-Zellen mit E2F-ER-Fusionsprotein

TOR-Zellen 1A3-Zellen, die zusätzlich zum E2F-1-ER-Fusionsprotein

eine TET-abhängige siRNA gegen BMI-1 enthalten

HeLa Zervixkarzinomzelllinie

PhoenixECO Embryonale Nierenzellinie; humane Verpackungszellinie

für rekombinante, ekotrope Retroviren (Grignani et al.,

1998)

37

Erläuterung zu 1A3-Zellen:

Dieses Zellsystem beruht auf der Grundlage der Zelllinie SK-N-SH-EP. In diesen

Zellen wird das Fusionsprotein E2F-1-ER, bestehend aus dem E2F-1 und der

Ligandenbindedomäne des Östrogenrezeptors, konstitutiv exprimiert. Dieses

Fusionsprotein kann durch die Zugabe des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen

zum Zellkulturmedium reversibel aktiviert werden.

2.9 KULTIVIERUNGSMEDIEN

2.9.1 Bakterienmedium

Bakterienmedium Menge Einheit Inhaltsstoffe

10 g/l Bactorypton (Peptontrypton)

5 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

3 g/l Glucose

LB-Medium

pH 7,0 mit NaOH eingestellt

LB-Medium LB-Agar

1,5 % (w/v) Bacto-Agar

20 G Bactorypton (Peptontrypton)

5 G Hefeextrakt

10 mM NaCl

2,5 mM KCl

10 mM MgCl2

SOB-Medium

10 mM MgSO4

SOB-Medium SOC-Medium

20 mM Glucose

38

2.9.2 Zellkulturmedium

Medien für die Zellkultur wurden von der Firma BioWhittaker (RPMI) (Verviers,

Belgien) und DMEM-Medium von der Firma Invitrogen geliefert. Fetales Kalbserum

(FCS) wurde von der Firma GIBCO bezogen, 1x Trypsin/EDTA Lösung hingegen

von der Firma Invitrogen. Vor der Verwendung wurde FCS-Medium 30min bei 56°C

im Wasserbad deaktiviert. Diese Hitzeinaktivierung dient der Vermeidung möglicher

Komplementreaktionen im Serum.

Zellkulturmedium für: Menge Einheit Inhaltsstoffe

500 mL DMEM (mit Phenolrot)

50 mL FCS

5 mL L-Glutamine (200 mM) IMR-32-Zellen

5 Ml Penicillin (10.000 U/mL)/

Streptomycin (10 mg/mL)

500 Ml DMEM

50 Ml Serum Supreme

5 Ml L-Glutamin Phönix-Zellen

5 Ml Penicillin (10.000 U/ml)

Streptomycin (10mg/ml)

500 Ml RPMI

50 Ml FCS SHEP, 1A3-Zellen, TOR-

Zellen, HELA-Zellen 5 Ml Penicillin (10.000 U/ml)

Streptomycin

DMEM ohne FCS

20 % (v/v) FCS Zell-Einfriermedium

10 % (v/v) DMSO

39

2.10 ANTIBIOTIKA

Antibiotikum Verwendung Endkonzentration Hersteller

Ampicillin Bakterienmedium 100 µg/mL Sigma

Chloramphenicol Bakterienmedium 34 µg/mL Sigma

Hygromycin Selektionsmedium 100 µg/mL Calbiochem

Kanamycin Bakterienmedium 100 µg/mL Gibco

Neomycin (G418) Zellkulturmedium 200 µg/mL Calbiochem

Penicillin Zellkulturmedium 100 U/mL BioWhittaker

Puromycin Selektionsmedium 1µg/mL Invivo Gen

Streptomycin Zellkulturmedium 100 µg/mL BioWhittaker

Zeocin Selektionsmedium 100 µg/mL Calbiochem

2.11 ANTIKÖRPER

2.11.1 Primärantikörper

Antigen Name Ursprung Bezugsquelle

Bmi-1 Maus, monklonal Upstate biotechnology

Bmi-1 K333 Kaninchen, polyklonal Otte

Cdk2 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz

E2F1 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz

E2F2 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz

HA MMS-1011 Maus, monoklonal Babco

HPC 2 M9 Maus, monoklonal Otte

P16/INK 4a 183 Maus, monoklonal Phar Mingen

P16/INK 4a 174 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz

P16/INK 4a 196 Kaninchen, polyklonal D.Parry USA

P19 204 Maus, monoklonal Abcam

P27 C-19 Kaninchen, polyklonal Santa Cruz

40

RING I M24 Maus, monoklonal Otte

RING I K320 Kaninchen, polyklonal Otte

Anti-BrdU Maus, monoklonal Becton Dickinson

2.11.2 Sekundärantikörper

Antikörper mit

Modifikation

Ursprung Verwendung

anti-Kaninchen-HRP Affinitätsgereinigter Antikörper

(Amersham), Esel-anti-Kaninchen

Immunglobulin

Western-Blot

anti-Maus-HRP Affinitätsgereinigter Antikörper

(Amersham), Schaf-anti-Kaninchen

Immunglobulin

Western-Blot

2.12 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE

2.12.1 Primer zur Klonierung von cDNA in Plasmid-DNA

Die Synthese, der zu Klonierungszwecken benötigten Primern wurde von der Firma

MWG-Biotech in Ebersberg durchgeführt und als Lyophilisat versendet. Dieses

wurde in Aqua dest. aufgenommen, so dass eine Endkonzentration von 100pmol/µl

bestand. Die Primer wurden in dieser Konzentration aliquotiert.

Name Sequenz (5’→→→→3’)

BMI5sacII AAT CCC CGC GGT CGC GCC GGGC TGC TCT TTC

BMI3cloning GGA CGA TAG TCA CAT GTA TTA GCA

Delta

RFBMI5new

CCG GAT CCA GAA ATG CAT TTC TTC TTG ACC AGA ACA

GAT TG

41

2.12.2 Primer für in vitro-Mutagenese

Die nachfolgend aufgeführten Oligonukleotide wurden als Primer zur in vitro-

Mutagenese der potentiellen E2F-Bindungsstelle im Bmi-1-Promoter verwendet.


BMIE2Fmut5 GCA GGG CGG CGC GTG GCT AGC TGT GGA GAA ATG TCT

C

BMIE2Fmut3 GAG ACA TTT CTC CAC AGC TAG CCA AGA GCC GCC CTG

C

2.12.3 RNA-Oligonukleotide für RNA-Interferenz Experimente

RNA-Oligonukleotide wurden von der Firma MWG in Ebersberg synthetisiert, als

Lyophilisat erhalten und in Aqua dest. in einer Konzentration von 100 pmol/µl

aufgenommen. Folgende Oligonukleotide wurden für RNA-Interferenz Versuche

verwendet:


BMIsi56for GAT CCC CAG GAT TAT TAT ACA CTA ATT TCA

AGA GAA TTTA GTG TAT AAT AAT CCT TTT TTG

GAA A

BMIsi56rev AGC TTT TCC AAA AAA GGA TTA TTA TAC ACT

AAT TCT CTT GAA ATT AGT GTA TAA TAA TCC

TGG G

SiRbmi1fw GAT CCC CAA TGG ACA TAC CTA ATA CTT TCA

AGA GAA GTA TTA GGT ATG TCC ATT TTT TTG

GAA A

42

SiRbmi2rev AGC TTT TCC AAA AAA ATG GAC ATA CCT AAT

ACT TCT CTT GAA AGT ATT AGG TAT GTC CAT

TGG G

SiRbmi3fw GAT CCC CAG TGA CTC TGG GAG TGA CAT TCA

AGA GAT GTC ACT CCC AGA GTC ACT TTT TTG

GAA A

SiRbmi4rev AGC TTT TCC AAA AAA GTG ACT CTG GGA GTG

ACA TCT CTT GAA TGT CAC TCC CAG AGT CAC

TGG G

SiRbmi1fwTOR GAT CCC AAT GGA CAT ACC TAA TAC TTT CAA

GAG AAG TAT TAG GTA TGT CCA TTT TTT TGG

AAA

SiRbmi2revTOR AGC TTT TCC AAA AAA ATG GAC ATA CCT AAT

ACT TCT CTT GAA AGT ATT AGG TAT GTC CAT

TGG

BMIsi56forTOR GAT CCC AGG ATT ATT ATA CAC TAA TTT CAA

GAG AAT TAG TGT ATA ATA ATC CTT TTT TGG

AAA

BMIsi56revTOR AGC TTT TCC AAA AAA GGA TTA TTA TAC ACT

AAT TCT CTT GAA ATT AGT GTA TAA TAA TCC

TGG

2.12.4 RNA-Oligonukleotide für RT-PCRs im Echt-Zeit-Gerät

Die Primer für die RT-PCR im Echtzeitgerät (Real-Time-Cycler) wurden ebenfalls

von der Firma MWG synthetisiert.

Folgende Primer wurden für quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät benutzt:

43

Name Sequenz (5`-3`)

ARF5milan CCC TCG TGC TGA TGC TAC TG

ARF3milan ACC TGG TCT TCT AGG AAG CGG

hTertfor GAC TCG ACA CCG TGT CAC CTA CGT

hTertrev TGA CAG GGC TGC TGG TGT CTG CTC TC

HOX3.5for TCC GGC TGC AGA GTG AAG G

HOX3.5rev CTG CGG CGA GTG AGG TAG C

MouseBMI3 TCT TCT CCT CAT CTG CAA CTT CTC

MouseBMI5 AAT TAG TCC CAG GGC TTT TCA A

HBMI RT32 CTT CAT CTG CAA CCT CTC CTC TAT

HBMI RT52 AAT TAG TTC CAG GGC TTT TCA A

Casp3new fw CTG AGC CAT GGT GAA GAA GGA AT

Casp3new rev CAT GGC ACA AAG CGA CTG GAT

2.13 VEKTOREN

2.13.1 Grundvektoren

Vektor Vektoreigenschaften Herkunft

pBluescript KS+ prokaryontischer Vektor zur Klonierung von

DNA-Fragmenten

Stratagene

GenBank#

X5232

pcDNA3 Eukaryontischer Expressionsvektor mit CMV

(Cytomegalievirus)-Promotor und T7-Promoter

Invitrogen

pcDNA3.1 (-) Eukaryontischer Expressionsvektor mit reverser

Orientierung der „multiple cloning site“

Invitrogen

pUHD10.1 Eukaryontischer Expressionsvektor mit CMV

(Cytomegalievirus)-Promotor

pBABE-puro Vektoren für die Herstellung rekombinanter

Retroviren im BOSC/Phoenix-System mit

zusätzlichen Resistenzgenen gegen Puromycin

Morgenstern und

Land, 1990

44

pGl3 basic Vektor mit dem Luciferase-Reportergen ohne

eukaryontischem Promoter

Promega

2.13.2 RNAi-Plasmid


pSUPER Vektor für die Expression von „small interfering

RNAs“ siRNA in Säugerzellen mit Polymerase-

III H1-RNA und T7-Promotor; basierend auf

dem pBlueScript-KS-Vektor

Brummelkamp,

2002

pTER Vektor für die Expression von „small interfering

RNAs“ (siRNA) in Säugerzellen mit

Polymerase-III H1-RNA und T7-Promoter,

TET-On-System; basierend auf dem

pBluescript-KS-Vektor

2.13.3 Reporterplasmide

Vektor Vektoreigenschaft Herkunft

pcDNA4TOLuc Vektor mit dem Luciferase-Reportergen in

eukaryontischen Zellen, zur Überprüfung von

dem TET-On-System (pcDNA6.1 in 1A3-

Zellen)

pGL3-BMI-1

Vektor

Vektor mit dem Luciferase-Reportergen mit

SV40 Promoter und Sac I und Xho I kloniertem

BMI-1-Gen mit E2F-1 Bindungsdomäne

Promega,

Mannheim

pcDNA3 MYC-

Vektor

PcDNA3 Vektor mit humaner c-MYC cDNA.

Die cDNA stammt aus dem Bluescript KS MYC

45

2.13.4 Expressionsvektor


pcDNA3.1(-)

EGFP

Eukaryontischer Expressionsvektor für das

enhanced green fluorescent protein (EGFP).

NheI/AflII Fragment aus pd2EGFP-N1

(Clontech) in NheI/AflII Schnittstellen von

pcDNA3.1(-).

Clontech

2.14 KITSYSTEME

Bezeichnung Quelle

DNA-Aufreinigung „PCR purification Kit“ Qiagen

DNA-Isolierung “Plasmid Maxi Kit, Qiagen-tip 500“ Qiagen

DNA-Isolierung „Gel Extraction Kit“ Qiagen

DNA-Isolierung „QIAamp DNA Mini Kit“ Qiagen

In vitro Mutagenese “Quick Change site directed mutagenesis”

“Rapid-Ligation-Kit”

Stratagene

Qiagen

Western-Blot Detektion „ECL Western-Blotting Detection System“ Amersham

Western-Blot Detektion „ECL+ Western-Blotting Detection System“ Amersham

46

2.15 VERBRAUCHSMATERIALIEN

Zellkulturmaterialien aus Plastik, sowie andere Einwegartikel für die Zellkultur

wurden über die Firma Nunc und Greiner bezogen.

Produkt Produktbezeichnung Hersteller

Blotting Membran Immobilon-P, PVDF Transfer Membran Millipore

Film ECL Hyperfilm Amersham

2.16 GERÄTE

Gerät Hersteller

Begasungsbrutschränke „BBD 6220“ Heraeus

Kamera CF 1/8 FMC CCD Kappa

Kühlzentrifuge „Centrifuge 5417R“ Eppendorf

Luminometer Lumat LB 9507 Berthold

Mikroskop „DMIRB“ Leica

Minigelanlage

RT-PCR-real-time-cycler

Biorad

Semidryblot Apparatur Trans-blot SD Biorad

Spektrophotometer Pharmacia

Steril-Arbeitsbank „HeraSafe“ Heraeus

Tankblotapparatur Trans-blot Biorad

Thermocycler „Primus“ MWG-Biotech

Tischzentrifuge „Biofuge pico“ Heraeus

Ultraschallgerät „Digital Sonifier W-250D“ Branson

UV-Handlampe (6 Watt Lampe, UVP) Kobe

Zellhomogenisator „Ultra Turrax“ IKA-Analysentechnik

Zentrifuge „Sorvall RC-5B“ Du Pont

47

3 Methoden

3.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN

3.1.1 Allgemeine Bedingungen für die Kultivierung von Säugerzellen

Die Versuche in der Zellkultur wurden unter sterilen Versuchsbedingungen

durchgeführt. Dies beinhaltet die Benutzung von Sterilwerkbänken mit laminarem

Luftstrom, von sterilen Polystyrol-Zellkulturschalen (6cm, 10cm, 15cm) und anderen

Zellkulturmaterialien aus Plastik, wie z.B. autoklavierten Pipetten, sowie das

Verwenden von sterilen Zellkulturlösungen. Inkubationbedingungen der Zellen im

Brutschrank waren 37° C, 96% relative Luftfeuchte und 5% CO2-Gehalt.

3.1.2 Passagieren von Zellen

Zellen auf konfluenten Zellschalen wurden durch Kontaktinhibition in ihrer

Teilungsaktivität gehemmt und gerieten so in einen Wachstumsarrest. Dieser

Wachstumsarrest konnte durch rechtzeitiges Passagieren der Zellen verhindert

werden. Dazu wurde das Medium auf den Zellen abgenommen und durch einmaliges

Waschen mit PBS vollständig entfernt. Anschließend erfolgte das Lösen der Zellen

von den Zellkulturschalen durch Zugabe von 1-3ml (je nach Größe der Schalen)

Trypsin-EDTA-Lösung und 1-4minütiger Inkubation im 37°C-Brutschrank. Die

abgelösten Zellen wurden mit Zellkulturmedium resuspendiert und ein bestimmter

Anteil dieser Suspension (1:5 bei IMR32-Zellen bis 1:10 1A3-Zellen) auf eine zuvor

mit frischem Zellkulturmedium versehende Zellkulturschale neu ausplattiert.

48

3.1.3 Zählen von Zellen mit Hilfe von Zählkammern

Die genaue Bestimmung der Ausgangszellzahl war für zahlreiche Versuche von

elementarer Bedeutung. Die Zellzahl wurde mit Hilfe von Neubauer-Zählkammern

bestimmt. Die trypsinisierten Zellen wurden in einem bestimmten Volumen

Zellkulturmedium aufgenommen, mit Trypanblaulösung angefärbt und anschließend

auf die Mikrotiterplatte der Neubauer-Zählkammer gegeben.

Durch die Anfärbung mit Trypanblau konnten abgestorbene von vitalen Zellen

unterschieden werden. Es wurden alle Zellen in einem bestimmten quadratischen Feld

der Zählkammer gezählt und durch die Berechnung der Zelldichte in der Suspension

die Zellzahl bestimmt. Die Zelldichte ließ sich mit der folgenden Formel berechnen:

Zellzahl/Quadrat x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml

3.1.4 Einfrieren von eukaryontischen Zellen

Um Zelllinien über lange Zeiträume (bis zu mehreren Jahren) lagern zu können,

wurden die Zellen in flüssigen Stickstoff eingefroren. Dazu wurden Zellen, die sich

im exponentiellen Wachstum befanden, durch die oben beschriebene Trypsinisierung

von der Zellkulturschale abgelöst, in einem großen Volumen PBS resuspendiert und

im 15ml Falcon-Tube bei 1200 Upm für fünf Minuten abzentrifugiert. Der Überstand

wurde abgesaugt und das Zellpellet in einem Einfriermedium, bestehend aus 1ml

DMEM mit 25% (v/v) FCS und 10% (v/v) DMSO resuspendiert. Die Suspension

wurde in ein vorgekühltes Kryoröhrchen überführt. Diese Kryoröhrchen wurden

anschließend für 24h bei –80°C eingefroren, bevor sie dann zur endgültigen Lagerung

in flüssigen Stickstoff überführt wurden.

49

3.1.5 Auftauen von eukaryontischen Zellen

Der Prozess des Auftauens sollte möglichst zügig durchgeführt werden, um die

Exposition der Zellen mit dem im warmen Zustand zellschädigenden Einfriermedium

zu verkürzen und damit mögliche Zellschädigungen zu vermeiden. Die im flüssigen

Stickstoff eingefrorenen Zellen wurden bei 37°C im Wasserbad aufgetaut, mit einem

großen Volumen (z.B.: 10ml) vorgewärmten Zellkulturmedium versetzt und dann bei

1200 Upm für fünf Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das

Zellpellet wurde in 10ml Zellkulturmedium resuspendiert. Diese 10ml

Zellkulturmedium wurden in eine Zellkulturschale gegeben. Die Zellen waren nach 4-

8h adhärend und wurden nach Ablauf dieser Zeit unter dem Mikroskop auf Zelldichte

und Morphologie untersucht.

3.1.6 Transiente Transfektion von Säugerzellen durch

Calciumphosphatpräzipitation für Expressionsstudien

24h vor Beginn der Transfektion wurden je 5x10 5 Zellen auf 10cm-Schalen bzw. je

2x105 Zellen auf 6cm-Schalen ausplattiert. 4h vor der Transfektion wurde das

Medium abgesaugt und die Zellen mit frischem DMEM-Zellkulturmedium versetzt.

Die zu transfizierende DNA (Gesamtmenge 15µg für 6cm Schalen und 30µg für 10cm

Schalen) wurde in 450µl Aqua dest. (bei Transfektionen auf einer 6cm Schale; bei

Transfektionen auf 10cm Schalen sind alle angegebenen Mengen zu verdoppeln)

gelöst und mit weiteren 150µl 2,5M CaCl vermischt. Zu dieser Lösung wurde unter

ständigem Zuführen von Luftblasen über eine Pasteurpipette 500µl 2x HBS langsam

hinzutitriert. Diese Lösung wurde 2min bei Raumtemperatur zur Präzipitatbildung

inkubiert und anschließend gleichmäßig auf den ausplattierten Zellen verteilt. Nach

einer Inkubation von ca. 12h im Brutschrank wurden die Zellen von den nicht in die

Zellen aufgenommenen DNA-Präzipitaten durch 2maliges Waschen mit PBS

gereinigt. Die Transfektionseffizienz konnte nach weiteren 24h unter der UV-Lampe

durch ko-transfiziertes GFP-Plasmid kontrolliert werden. Zu diesem Zeitpunkt war

die Expression von den entsprechenden Proteinen der transfizierten Plasmiden am

50

Größten, so dass die Zellen zu diesem Zeitpunkt für die entsprechenden Analysen

geerntet wurden.

3.1.7 Calciumphosphat-Methode für die transiente Transfektion von

Säugerzellen für Reporterstudien

Die transiente Transfektion wurde, wie im Punkt „Transiente Transfektion von

Säugerzellen durch Calciumpräzipitation für Expressionsstudien“ beschrieben,

durchgeführt. Dabei wurden jeweils Triplikate verwendet. Es wurden 200.000 Hela-

Zellen bzw. 500.000 SHEP-Zellen (auch 1A3-Zellen) ausplattiert. Als interner

Transfektionsstandard wurde zusätzlich zum CMV-GFP-Vektor 1µg β-Galactosidase

Expressionsvektor kotransfiziert.

3.1.8 Selektion von antibiotikaresistenten Zellen

Um transfizierte Zellen auf einer Zellkulturschale gegenüber den nicht durch die

Transfektion getroffenen Zellen anzureichern, wurden 2-5µg eines

Expressionsvektors, der für ein Puromycin-Resistenzgen, Hygromycin-Resistenzgen

oder Zeocin-Resistenzgen kodiert, kotransfiziert. 36-48h Stunden nach

Transfektionsende wurden die Zellen in Selektionsmedium mit einer Puromycin-

Endkonzentration von 1µg/ml überführt. Die Selektion mit Hygromycin erfolgte bei

einer Konzentration 100µg/ml, während die Selektion mit Zeocin bei 150µg/ml

durchgeführt wurde. Das Selektionsmedium wurde bis zum Erreichen, der zur Ernte

der Zellen nötigen Konfluenz, alle drei Tage gewechselt. Die Vollständigkeit der

abgelaufenen Selektion wurde überprüft, indem alle Zellen einer Kontrollplatte, auf

der entsprechende Zellen ohne kotransfizierten Selektionsmarker, aber den gleichen

Selektionsbedingungen, wie auf der Versuchsplatte, durch die Selektion gestorben

waren.

51

1A3-Zellen enthalten das stabil transfizierte E2F-1-ER-Fusionsprotein, welches mit

einem G418-Resistenzplasmid kotransfiziert wurde. Um die Stabilität der

Transfektion des E2F-1-ER-Fusionsprotein in den 1A3-Zellen zu gewährleisten,

musste ein konstanter Selektionsdruck von 10µl/ml G418 aufrechterhalten werden.

Die Konzentration für ein bestimmtes Antibiotikum war von Zelllinie zu Zelllinie

unterschiedlich, so dass vor der Selektion mit einem für die Zelllinie neuem

Antibiotikum, die spezifische Konzentration getestet werden musste. Dazu wurden

mehrere Zellkulturschalen in 20%iger Konfluenz mit dem entsprechenden

Resistenzplasmid transfiziert und anschließend mit dem Antibiotikum in

verschiedenen Konzentrationen selektioniert. Außerdem wurden parallel Zellen ohne

transient transfiziertes Resistenzplasmid mit denselben Konzentrationen des

Antibiotikums selektioniert. Es wurde die Konzentration des Antibiotikums für die

weiteren Versuche ausgewählt, bei der gerade noch alle Zellen auf der

untransfizierten Schale gestorben sind, während bei dieser Konzentration die Zellen

auf der Schale mit transfiziertem Selektionsmarker überlebten.

3.1.9 Induktion von eukaryontischen Zellen

Für die Versuche wurden verschiedene induzierbare Zellsysteme verwendet. Die

Induktion erfolgte durch Zugabe des entsprechend gelösten Stoffes zum

Zellkulturmedium. 1A3-Zellen sind modifizierte SK-N-SH-EP-Zellen, die ein E2F-1-

ER-Fusionsprotein enthalten, welches durch 4-Hydroxytamoxifen induziert werden

kann. Diese Induktion erfolgte mit 1µg/ml Hydroxytamoxifen (4OHT). Außerdem

wurden mehrere Zellsysteme mit tetracyclinabhängiger Induktion verwendet; hier

betrug die Induktionskonzentration 10µg/ml.

Durch Cycloheximid kann die Proteinbiosynthese in Zellen unterdrückt werden: für

die entsprechenden Experimente wurde eine Konzentration von 4µg/ml benutzt.

52

3.1.10 Stabile Transfektion von Säugerzellen durch Calciumphosphatmethode

Die Transfektion wurde nach dem entsprechenden Protokoll für die „transiente

Transfektion nach Calciumphosphatmethode“ durchgeführt. Für die stabile

Transfektion wurde entweder ein Vektor mit enthaltenem Resistenzmarker verwendet

oder ein Resistenzplasmid kotransfiziert. 36-48h nach einer erfolgreichen

Transfektion wurde dem kotransfizierten Resistenzmarker entsprechend, mit der

Selektion begonnen. Für die einzelnen stabilen Transfektionen wurden folgende

Resistenzmarker verwendet:

Stabile Transfektion des ekotropen Rezeptors in Shep-Zellen für die retrovirale

Infektion: Zeocin bzw. Hygromycin.

Stabile Transfektion der siRNA in 1A3 Zellen: Puromycin.

Stabile Transfektion des TET-Repressors in 1A3-Zellen: Puromycin.

Stabile Transfektion des TET-abhängigen Reporterplasmids zur Testung der TOR-

Zellen, sowie des TET-abhängigen siRNA-Plasmids (pcDNA 4/TO): Hyromycin,

bzw. Zeocin.

Als Selektionskonzentrationen wurde Puromycin 1µg/ml, Hygromycin 100µg/ml oder

Zeocin 100µg/ml eingesetzt. Das Medium wurde alle drei Tage gewechselt, wobei

der Selektionsdruck stets aufrechterhalten wurde. Die Selektion wurde solange

durchgeführt, bis nur noch solche Zellen auf der Zellkulturschale erhalten waren, die

das entsprechende Resistenzplasmid enthielten (nach 5 Tagen bei

Puromycinselektion, bis zu 18 Tagen bei Hyromycin- bzw. Zeocinselektion). Nach

weiteren 10 Tagen waren die verbliebenen Zellen zu 2-4mm großen Kolonien

hochgewachsen. Die zuvor im Gegenlicht markierten Klone, wurden nun mit Hilfe

von sterilen Klonierungsringen unter Abdichtung durch Vaseline von den

Zellkulturschalen trypsinisiert und in 1cm Zellschalen überführt. Unter weiterhin

bestehendem Selektionsdruck wurden die Zellen bis zur Konfluenz der Schalen in

Kultur gehalten, um sie dann auf 6cm-Schalen später auf 10cm-Schalen

auszuplattieren. Die expandierten Zellen wurden nun für weiterführende Experimente

verwendet.

53

3.1.11 Infektion von Säugerzellen mit Virusüberstand

Das ∆-Ring-Finger-Plasmid wurde uns mit freundlicher Unterstützung vom Labor van

Lohuisen zur Verfügung gestellt. Hierbei handelte es sich um ein retrovirales Plasmid.

Im Western-Blot war das dominant-negative Allel nach retroviraler Infektion durch

den Bmi-1-Antikörper nachweisbar (van Lohuizen). Um 1A3-Zellen retroviral

infizieren zu können, brauchten die Zellen einen ekotropen Rezeptor. Dieser war

nötig, weil in unserem Labor (S1-Sicherheitsstandard) keine humanpathogenen Viren

benutzt werden durften. Die retrovirale Infektion (mit dem dominant negativen Allel)

verlief in drei wesentlichen Schritten:

1.) Zunächst wurde ein ekotroper Rezeptor transient oder stabil (ekotroper Rezeptor

für die retrovirale Infektion von 1A3-Zellen mit dem dominant-negativen Allel gegen

Bmi-1) in die entsprechenden Zellen transfiziert und dem Selektionsmarker

entsprechend selektioniert (Hygromycin oder Zeocin bei dominant negativen Allel).

2.) Herstellen des retroviralen Überstandes:

Dazu wurden am ersten Tag 5.000.000 Phönixzellen auf einer 10cm-Schale

ausplattiert. 24h später erfolgte die Transfektion der entsprechenden Plasmide nach

Calciumphosphatmethode. Für die retrovirale Infektion des dominant-negativen Allels

gegen das Bmi-1 wurden durch entsprechende Transfektion virale Überstände der

folgenden Plasmide hergestellt:

a) GFP

b) pbabe puro

c) Wildtyp Bmi-1

d) ∆-Ring-Finger Mutante

24h nach Transfektionsbeginn wurden die Phönixzellen mit PBS gewaschen und 7ml

(anstatt den sonstigen 10ml) auf die entsprechenden Zellkulturschalen gegeben. 48h

nach Transfektionsbeginn wurde der Überstand (7ml) als erster viraler Überstand

steril filtriert und als solcher für Infektionen benutzt oder bei –80°C eingefroren.

Außerdem wurde erneut 7ml frisches Zellkulturmedium auf die Zellen gegeben. Nach

weiteren 24h wurde der zweite virale Überstand entsprechend abgenommen und

ebenfalls steril filtriert.

54

3.) Infektion der Säugerzellen durch Virusüberstand

Jeweils 3ml Virusüberstand wurde auf die Säugerzellen (hier: 1A3-Zellen), die den

ekotropen Rezeptor transient oder stabil enthielten, gegeben. Nach 24h wurde das

Medium abgesaugt und die Zellen mit PBS gewaschen. 48h nach Infektion wurde mit

der Selektion gegen das Resistenzplasmid, welches auf den Plasmiden der Infektion

enthalten waren (beim dominant-negativen Allel: Puromycin) begonnen. Nach drei

Tagen Selektion mit Puromycin wurden die Zellen für weiterführende Experimente

geerntet.

3.1.12 Durchführung eines Koloniebildungsversuch mit stabil transfizierten

siRNA-BMI Klonen

Um Unterschiede in der Wachstumsgeschwindigkeit zwischen Zellen mit stabil

transfizierter siRNA gegen BMI-1 und nicht transfizierten Zellen sichtbar zu machen

wurden Koloniebildungsversuche durchgeführt. Dafür wurde zunächst die siRNA

(1/2, 3/4 oder 5/6) bzw. der Leervektor stabil in 1A3-Zellen transfiziert

(Selektiosmarker: Puromycin). Die sich in unterschiedlicher Geschwindigkeit

teilenden Zellen wurden nach 8 Tagen exponentiellen Wachstums durch eine Giemsa-

Färbung makroskopisch sichtbar gemacht.

3.1.13 Anfärben von fixierten eukaryonten Zellen durch Giemsa-Färbung für

Koloniebildungsversuche

Mit der Giemsa-Färbung konnten zuvor auf der Zellkulturschale fixierte Zellen

angefärbt und damit Unterschiede in der Anzahl und Größe von Zellkolonien

verschiedener Zellpopulationen makroskopisch sichtbar gemacht werden. Die zuvor

in Form eines Koloniebildungsversuchs wachsenden Zellen wurden nach 8 Tagen

exponentieller Teilung fixiert. Dazu wurde das Zellkulturmedium von den

Zellkulturplatten abgesaugt. Durch die Zugabe von 5ml Ethanol (abs.) für 10min auf

die Platten wurden die Zellen fixiert. Das Ethanol wurde dann abgesaugt und je 5ml

55

der gebrauchsfertigen Giemsalösung 1:20 mit Wasser verdünnt auf die

Zellkulturschalen gegeben. Diese Lösung wurde für 45min auf den Zellkulturschalen

gelassen. Anschließend wurde die Giemsalösung abgesaugt und die Zellkulturschale

mit Wasser gewaschen. Die Platten wurden umgedreht an der Luft getrocknet.

3.1.14 Durchflußzytometrie (FACS-Analyse)

Durch die Durchflußzytometrie konnten in Zellkulturexperimenten Effekte auf den

Zellzyklus durch prozentuale Quantifizierung der Zellen, die sich in den

verschiedenen Phasen des Zellzyklus befanden, aufgezeigt werden. Zur Fixierung, der

zu untersuchenden Zellen wurden diese durch Trypsinisierung von den

Zellkulturschalen gelöst und in PBS-Puffer aufgenommen. Die Zellen wurden durch

zweiminütiges Zentrifugieren bei 1200 Upm pelletiert. Das Pellet wurde in 0.5ml PBS

aufgenommen und mit 4,5ml EtOH (absolut) versetzt. Dieser Ansatz wurde über

Nacht bei –20°C inkubiert. Zur Vorbereitung auf die FACS-Analyse wurden die

Zellen 5min bei 1500Upm erneut pelletiert und anschließend in 2ml PBS/0,1% NP40

resuspendiert. Diese Suspension wurde erneut 5min bei 1500 Upm zentrifugiert. Die

in 0,5ml PBS aufgenommenen Zellen wurden mit 15µl Propidiumjodid (ab jetzt im

Dunkeln gearbeitet) und 10µl RNAse A (25mg/ml) versetzt und eine Stunde bei

Raumtemperatur inkubiert.

56

3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN

3.2.1 Kultivierung von Bakterien

Für Klonierungszwecke, Retransformationen und bakterielle Expressionen wurde der

E.coli-Sicherheitsstamm DH5α verwendet. Diese Bakterien amplifizieren die

entsprechend transfizierte Plasmid-DNA. Für Maxipräparationen wurden 300ml LB-

Medium versetzt mit 100µg/ml Ampicilin mit Bakterien oder einer Einzellkolonie von

Bakterien versetzt. Für Minpräparationen wurde analog ein 3ml-Ansatz verwendet.

Die entsprechenden Ansätze wurden bei 37°C 16h im Schüttelinkubator kultiviert.

3.2.2 Minipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien nach Boiling-Prep-

Methode

Die 3ml Übernachkultur, der sich in der exponentiellen Wachstumsphase befindenden

Bakterien wurde für 3min bei 12000Upm bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der

Überstand wurde abgesaugt, das Zellpellet mit 110 µL STETL-Puffer (STET-Puffer

plus 1:100 Lysozym) resuspendiert und dann für 5min bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde die Suspension 45sec bei 95°C aufgekocht. Nach dem

Aufkochen wurden die Proben bei 4°C und 12000Upm abzentrifugiert. Das

schleimige Sekret wurde mit einem sterilen Zahnstocher entfernt. Der restliche Teil

der Probe wurde mit 110µl Isopropanol versetzt, invertiert und dann erneut 15min bei

12000 Upm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Das erneute

Zellpellet wurde mit 0,5ml 70%igen Ethanol gewaschen. Um die Zellen wieder zu

Pelletieren wurde erneut 5min bei 12000Upm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand

wurde abgekippt und die Eppendorf-Tubes wurden zum Trocknen der Pellets verkehrt

herum auf ein trockenes Tuch gestellt. Die getrockneten Zellpellets wurden in 20-30µl

TE-Puffer resuspendiert.

57

3.2.3 Minipräparation von BAC-Kulturen (bacterial artficial chromosome)

1,5ml Übernachtkultur wurden in einem Eppendorftube 10min bei 3000Upm

abzentrifugiert, der Überstand anschließend verworfen und das Pellet in 0,3ml P1-

Puffer resuspendiert. Es wurden 0,3ml P2-Puffer hinzugefügt, gut geschüttelt und die

Proben 5min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden 0,3ml

P3-Puffer langsam hinzugefügt und nochmals gut geschüttelt. Die Proben wurden nun

5min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Proben 10min bei 4°C und 10000Upm

zentrifugiert. Der Überstand wurde in neue Eppendorftubes gegeben und je 0,8ml

Isopropanol hinzugefügt. Zum Durchmischen der Proben wurden diese invertiert und

dann 5min auf Eis inkubiert. Durch erneutes Zentrifugieren bei 12000Upm (4°C) für

15min wurde die Nukleinsäure pelletiert. Die Pellets wurden mit 0,5ml Ethanol

gewaschen, erneut abzentrifugiert und an der Luft getrocknet. Die Resuspension

erfolgte in TE Puffer. Ein Kontrollverdau mit NOT I, bei dem die Promotorregionen

aus dem CYPAC2 Vektor geschnitten wurde, war möglich.

3.2.4 Maxipräparation von Plasmid-DNA aus Bakterien

Diese Methode dient zur Gewinnung größerer Mengen Plasmid-DNA. Bei dieser

Methode handelt es sich um ein säulenchromatographisches Verfahren. In unserem

Labor wurde diese Methode mit dem „Maxi-Prep-Kid“ der Firma Genomed anhand

des entsprechenden Handbuchs von 1994 durchgeführt. Die gewonnene DNA wurde

in 200-400µl TE-Puffer gelöst, durch photometrische Methoden die Konzentration

bestimmt und durch anschließende Verdünnung mit TE-Puffer auf eine

Endkonzentration von 1mg/ml eingestellt.

58

3.2.5 Photometrische Bestimmung Nukleinsäure-Konzentration

Die Quantifizierung der Nukleinsäuremenge einer Probe erfolgte durch die

photometrische Bestimmung (bei 260nm) der Optischen Dichte (OD) der Probe an

Nukleinsäure. Dabei ließ sich hieraus die Konzentration der Probe wie folgt

berechnen: C (µg/ml) = OD bei 260 nm x 50 x Verdünnungsfaktor.

Der Reinheitsgehalt konnte durch Bildung des Quotienten OD 260nm/OD280nm

bestimmt werden. Dabei spricht ein Wert zwischen 1,8 und 2,0 für eine relativ

proteinfreie Probe.

3.2.6 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen

für analytische Zwecke

1µg des zu untersuchenden DNA-Plasmids wurde in einem Gesamtvolumen von 10µl

und unter den vorgegebenen Pufferbedingungen des Herstellers mit 1U des

entsprechenden Restriktionsenzyms inkubiert. Inkubationslänge und Temperatur

waren dabei vom jeweiligen Restriktionsenzym abhängig. Die verdauten Proben

wurden anschließend mit Hilfe von Gelelektrophorese analysiert.

3.2.7 Sequenzspezifische Hydrolyse von DNA mit Restriktionsendonukleasen

für Klonierungszwecke

Dieses Verfahren erfolgte entsprechend Punkt „Sequenzspezifische Hydrolyse von

DNA mit Restriktionsnukleasen für analytische Zwecke“. Allerdings wurden nur

400ng aufgereinigte DNA eingesetzt. Wurden thermostabile Restriktionsenzyme

verwendet, so mussten diese durch 20minütiges Erhitzen der Probe bei 75°C

inaktiviert werden. Der komplette Ansatz wurde durch Gelelektrophorese auf einem

präparativen Gel aufgetrennt. Die entsprechende Bande wurde aus dem Agarosegel

geschnitten und mit Hilfe „des QIAquick Gel Extraction“ Kit der Firma Qiagen

aufgereinigt.

59

3.2.8 Agarose-Geleletrophorese von DNA

Um verschiedene Größen an DNA-Fragmenten aufzutrennen, wurden Agarosegele

benutzt. Durch das Mitführen eines DNA-Längenstandards konnte die Größe der

einzelnen Fragmente bestimmt werden. Die Agarosekonzentration wurde je nach

erwarteter Fragmentgröße zwischen 0,5-2%ig gewählt. Die Agarose wurde mit

1µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die Proben wurden 5:1 mit DNA-Probenpuffer

gemischt und auf das Gel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanten 90

Volt für mindestens eine Stunde bei Auftrennung für präparative Zwecke und 120

Volt für eine Stunde bei analytischen Gelen. Die DNA-Fragmente wurden durch UV-

Licht durch Fluoreszenz von Ethidiumbromid, welches ein interkalierender Farbstoff

ist, sichtbar gemacht. Für präparative Zwecke wurden die entsprechenden DNA-

Banden mit einen Skalpell ausgeschnitten und mit Hilfe des „QIAquick Gel

Extraction“ Kit der Firma Qiagen aufgereinigt. Die DNA wurde in 30µL TE-Puffer

eluiert.

3.2.9 Kovalente Verknüpfung von DNA-Fragmenten (Ligation)

Der zuvor durch Restriktionsverdau linearisierte Vektor (10-100ng) und die zu

inserierende cDNA (10fache Menge) wurden unter den Pufferbedingungen des

Herstellers mit Hilfe von einer Einheit (1U) T4-DNA-Ligase kovalent verknüpft.

Dazu wurde der Reaktionsansatz 16h bei Raumtemperatur inkubiert und ein Aliquot

in kompetente Bakterien transformiert. Eine Positivkontrolle (linearisierter Vektor)

und Hintergrundskontrollen (Ansatz ohne Ligase, Ansatz ohne Insert) wurden stets

mitgeführt. Für Ligationsansätze, die bei dem ersten Versuch keine Kolonien

hervorbrachten, wurde beim zweiten Ligationsversuch das „DNA Rapid Ligation“ Kit

der Firma Roche verwendet. Dadurch konnte die Ligationseffizienz erhöht werden.

60

3.2.10 Transformation von Plasmid-DNA in Bakterien durch Hitzeschock

Um DNA-Plasmide in kompetente E.coli Bakterien zu transformieren, wurden die

Bakterien zunächst auf Eis aufgetaut, um 100µl der Bakteriensuspension anschließend

mit 100-500ng Plasmid-DNA für 30min in einem 1,5ml Eppendorf-Tube auf Eis zu

inkubieren. Die Suspension wurde dann für 90sec im 42°C Wasserbad erhitzt. Durch

diesen Hitzeschock wurde die Permeabilität der Bakterien transient erhöht, so dass die

Plasmid-DNA besser in die Zellen aufgenommen werden konnte. Der Ansatz wurde

nochmals zwei Minuten auf Eis inkubiert und anschließend mit 500µl LB-Medium

versetzt. Diese Probe wurde nun 45min bei 37°C geschüttelt (Schüttelfrequenz 650

Upm). Die inkubierten Kulturen wurden anschließend 2min bei 1500Upm

abzentrifugiert, mit 100µl LB Medium versetzt und auf ampicillinhaltige

Agaroseplatten mit Hilfe eines Drygalski-Spatels ausplattiert oder direkt für das

Animpfen einer Übernachtkultur benutzt.

In der Regel wurde Ampicilin als Selektionsmedium verwendet. Bei der Anzucht der

Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) wurde Chloramphenicol in einer

Konzentration von 1:1700 verwendet.

3.2.11 Verschmelzen von zwei Oligonukleotideinzelsträngen durch Verknüpfung

durch kovalente Bindungen

Als Gesamtmenge wurde hierfür ein 200µl Ansatz gewählt. Dieser setzte sich aus den

folgenden Komponenten zusammen: je 40µl von beiden Oligonukleotiden (je

20pmol), 50µl 1molarer Tris-Puffer (pH:7,5) und 40µl 25 molare Mgl2. Die restlichen

30µl wurden mit Aqua. dest. aufgefüllt. Diese Probe wurde 3min in einem kochendem

Wasserbad erhitzt und anschließend im sich langsam abkühlenden Wasser über Nacht

inkubiert.

61

3.2.12 Dephosphorylierung von Vektorfragmenten

Vektoren wurden, wenn sie zuvor nur mit einem Restriktionsenzym geschnitten

worden waren, anschließend dephosphoryliert. Damit wurde bei der folgenden

Ligation eine Religation der beiden Vektorenden verhindert. Die Dephosphorylierung

erfolgte mit der Shrimp-Alkaline-Phophatase der Firma Roche unter den

vorgegebenen Pufferbedingungen für 5h bei 37°C.

3.2.13 Phosphorylierung von DNA-Fragmenten

Um eine Ligation von Oligonukleotiden mit einem dephosphorylierten Vektor zu

ermöglichen, mussten die Oligonukleotide phosphoryliert werden. Dazu wurden 2µl

Oligonukleotide in einem 10µl Gesamtansatz mit 1µl T4 PNK und 1µl 1mM ATP

unter den vorgegebenen Pufferbedingungen 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend

wurde die T4PNK durch 10minütiges Erhitzen auf 70°C hitzeinaktiviert.

3.2.14 Klonierungsstrategien

3.2.14.1 Klonierung des BMI-Fragments mit E2F-Bindungsstelle in den pGl3luc-

Vektor

Schritt 1: Klonierung des BMI-Fragments aus BAC in den Bluescript-Vektor

Dazu wurde sowohl der Bluescript-Vektor, als auch das Bacterial artificial

chromosome mit der Restriktionsenzym NOT1 verdaut. Durch Aufreinigung über das

Agarosegel konnte die linearisierte Form des Bluescript-Vektors und das gewünschte

0,6 kB Fragment des BAC isoliert werden. Um bei der anschließenden Ligation, die

Religation der beiden Enden des geschnittenen Bluescript-Vektors zu verhindern,

wurde der Vektor dephosphoryliert. Für die Dephosphorylierung wurde die Shrimp-

Alkaline-Phosphatase der Firma Roche unter den vorgegebenen Pufferbedingungen

durch 5stündige Inkubation bei 37°C verwendet. Das 0,6 kB große BAC-Fragment

62

wurde mit der T4PNK kinasiert. Die Ligation erfolgte mit dem „Rapid Ligation“ Kit.

Zur Ligationskontrolle wurde das entsprechende Plasmid mit dem Restriktionsenzym

PVU1 verdaut. Die Klone, die das BMI-Fragment in der richtigen Orientierung

enthielten, wiesen nach Auftrennung über ein Agarosegel, folgendes Bandenmuster

auf: 1.Bande 1040 Basen, 2.Bande 460 Basen, 3.Bande 210 Basen

Schritt 2: BMI-NOT1-Fragement aus dem Bluescript-Vektor in den pGl3-luc-basic-

Vektor

Dazu wurde der Bluescript-Vektor, der das BMI-NOT1-Frament enthielt, sowie der

pGL3-basic-Ausgangsvektor mit den Restriktionsenzymen Xho1 und Sac1

geschnitten. Dadurch erhielten wir nach gelelektrophoretischer Auftrennung einen

4,4kB großen pGL3-Vektor und ein 670B großes BMI-Fragment. Diese beiden

Fragmente wurden erneut ligiert.

3.2.14.2 Klonierung der siRNA gegen BMI-1 in den pSuper-Vektor bzw. siRNA

gegen BMI-1 in den pTER-Vektor für das tetracyclinabhängige System

Der pSuper Vektor bzw. pTER-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen Bgl II und

Hind III geschnitten. Die Oligonukleotide konnten direkt mit dem verdauten und

aufgereinigten Vektor ligiert werden.

3.2.15 Sequenzierungen

Die Sequenzierungen wurden von der Firma SEQLab in Göttingen durchgeführt.

Dazu wurden generell die Standardprimer der Firma SEQLab benutzt. Für die

Sequenzierung der siRNA in den pTER-Vektor wurde der BGH-Primer (s. Methoden)

benutzt.

63

3.2.16 Generierung von BMI-Punktmutanten mittels in vitro-Mutagenese

Zur Einführung einer Punktmutation in die E2F-1-Bindungsstelle im BMI-1-Gen

wurde das „QuickChange site-directed mutagenesis“ Kit der Firma Stratagene

verwendet. Ausgehend von dem pGL3-Klonierungsvektor wurden zur spezifischen

Mutation bestimmter Nukleotide zwei zueinander komplementäre Primer (siehe

Material) hergestellt. Diese Primer generierten die gewünschte Punkmutation:

Austausch von TGGC gegen GCTA. Durch diesen Basenaustausch wurde eine

zusätzliche Restriktionsschnittstelle für das Restriktionsenzym NHE eingeführt.

Durch eine PCR mit einer DNA-Polymerase mit 3´-5´Exonukleaseaktivität wurde das

komplette Plasmid amplifiziert. Um die Plasmid-DNA der Matrize zu beseitigen,

wurde das PCR-Produkt eine Stunde mit dem Dpn I, einer Restriktionsendonuklease,

die methylierte DNA schneidet, verdaut. Anschließend wurde ein Aliquot direkt in

DH5α-Bakterien transformiert und auf Agarplatten ausplattiert. Aus Einzelkolonien

einer Agarplatte wurden Übernachtkulturen angeimpft und durch Minipräparation

Plasmid-DNA isoliert. Der Erfolg der Mutagenese wurde mit Hilfe eines

Restriktionsverdaus mit dem NHE-Restriktionsenzyms überprüft. Im Promotor, der

durch Mutation verändert wurde, entstand eine neue Schnittstelle für das

Restriktionsenzym NHE, so dass in der folgenden Auftrennung durch

Gelelektrophorese anstatt einer 780kB großen Bande zwei Banden entstanden (460

kB und 320kB). Die entsprechenden erfolgreich veränderten Plasmide wurden zur

Sequenzierung an die Firma SEQLab nach Göttingen geschickt.

64

3.3 BIOCHEMISCHE METHODEN

3.3.1 Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen

Die Herstellung von Proteinlysaten aus Säugerzellen für die Analyse im Western Blot

oder für Reporterstudien erfolgte mittels mehrmaligen Schockgefrierens in flüssigem

Stickstoff und jeweiligem Auftauen im Wasserbad (freeze and thaw-Methode). Dazu

wurden die entsprechenden Zellen auf den Zellkulturschalen mit PBS gewaschen, mit

einem Zellkulturschaber von der Platte gekratzt, in 1ml PBS aufgenommen und in

1,5ml-Falcons überführt. Durch Abzentrifugieren bei 4°C und 1200 UpM wurden die

Zellen pelletiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 200-300µl KPI-Puffer

plus 1:1000 Proteininhibitoren resuspendiert. Durch anschließend dreimaliges

Schockgefrieren im flüssigen Stickstoff und jeweiligem Wiederauftauen im 37°C

Wasserbad (2min pro Schritt) wurden die Zellwände aufgebrochen. Im folgenden

Zentrifugationsschritt für 15min bei 4°C und 12000Upm wurden die Proteine von

dem Zelldetritus (der erneut ein Pellet im Eppendorf-Tube bildete) getrennt. Der

Überstand mit den darin enthaltenen Proteinen wurde in ein neues Eppendorf-Tube

überführt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte nach der Methode nach Bradford.

3.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Zunächst wurde eine Proteinstandardkurve erstellt. Dazu wurde eine BSA-

Verdünnungsreihe (1-10µg/ml im jeweiligen Lysepuffer mit 100µl 150mM NaCl-

Lösung und 1ml Bradford-Lösung versetzt) benutzt. Die jeweiligen Proben wurden

fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Absorption der Proben bei 595nm

wurde durch Abgleich mit einer Leerprobe, bestehend aus 1µl KPI-Puffer, 100µl

NaCl und 1ml Bradford-Reagenz, photometrisch bestimmt. Zur Messung der

Absorption der Proteinproben wurde analog vorgegangen. Die

Konzentrationsbestimmung der Proben erfolgte anhand der BSA-Standard-Kurve.

65

3.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteine

Um Proteinlysate aufzutrennen wurde eine SDS-Gelelektrophorese unter

denaturierenden Bedingungen verwendet. Die Matrix bildeten Gele aus Acrylamid,

die aus niedrigprozentigen Sammelgelen und 7,5-15%igen Trenngelen bestanden. Die

Konzentration des Trenngels wurde je nach gewünschtem Auftrennungsgrad gewählt.

Das Trenngel wurde in Anlehnung an Laemmli (Laemmli, 1970) gegossen (3,83-5, ml

Acrylamidlösung; 3,75ml Trenngelpuffer; 150µl 10 % SDS auf 15ml mit Aqua dest.

aufgefüllt, 12µL TEMED und 150µL 10%iges APS wurden als letztes hinzugefügt, da

hierdurch die Polymerisierung des Gels initialisiert wurde). Das Trenngel wurde

sofort nach dem Gießen mit Isopropanol überschichtet. Nach erfolgter Polymerisation

wurde das Isopropanol abgegossen und das Trenngel mit Hilfe eines Whatman-

Papiers von Isopropanolresten befreit. Das Trenngel wurde nun vom Sammelgel

überschichtet (650µL Acrylamidlösung; 1,2ml Sammelgelpuffer; 50µl 10 % SDS; auf

5ml mit Aqua. dest. aufgefüllt; auch hier wurde die Polymerisation durch Zugabe von

150µL 10% APS und 5µL TEMED gestartet). Sofort nach dem Giessen des

Sammelgels (vor Beginn der Polymerisation) wurden Geltaschen durch das

Verwenden eines geeigneten Kammes gesteckt.

Die Denaturierung der Proteine erfolgte nach Zugabe eines SDS-Ladepuffers durch

5minütiges Erhitzen im 95°C warmen Heizblock. Anschließend wurden die Proteine

auf das im SDS-Puffer stehendem Gel aufgetragen und durch das Anlegen einer

gleichmäßigen Spannung (80 Volt im Sammelgel, 120 Volt im Trenngel) aufgetrennt.

Es erfolgte nun der Transfer auf eine PVDF-Membran.

3.3.4 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membranen mittels Western-Blot

Die durch SDS-Page aufgetrennten Proteine wurden bei diesem Schritt auf eine

Polyvinylidenfluor-Membran transferiert. Die entsprechenden Membranen wurden

zunächst äquilibriert. Dazu wurden diese Membranen 5min in Ethanol, 2min in

Wasser und 1min im Blotpuffer inkubiert. Der Transfer der Proteine erfolgte durch

das Tankblotverfahren bei konstanter Spannung von 100V für 1 Stunde. Dabei wurde

eine Tankblotapparatur der Firma Biorad verwendet.

66

3.3.5 Detektion von Proteinen auf PVDF-Membranen durch

Chemolumineszenz

Nachdem die Proteine durch SDS-Page aufgetrennt und durch Nitrocellulose

immobilisiert worden waren, waren die Protein nun zugänglich für eine Detektion

durch Antikörper. Zunächst wurden die PVDF-Membranen mit den transferierten

Proteinen 2h bei Raumtemperatur in einer Blocklösung inkubiert. Dadurch wurde die

Bindungskapazität für unspezifische Antikörper verringert. Anschließend erfolgte

eine ebenfalls 2stündige Inkubation der Membran mit dem Primärantikörper bei

Raumtemperatur. Die Membran wurde dreimal (bei Bmi-1-Antikörper fünfmal) für

jeweils 10min mit TBST-Puffer gewaschen. Die Inkubation mit dem

peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper erfolgte in einer 1:3000-Verdünnung in

Blocklösung bei Raumtemperatur für 2h. Auch der Sekundärantikörper wurde durch

fünfmaliges Inkubieren für je 10min von der Membran gewaschen. Die Detektion der

Proteine erfolgte mittels ECL um überexpremierte Proteine zu detektieren (selber

gemischt: Lösung A: 100µl Luminol-Stammlösung; 44,4µl p-Cumar-Säure; 1ml 1M

Tris-HCL pH 8,5 auf 10ml mit Aqua dest.; Lösung B: 6,12µl 30%ige H2O2, 1ml 1M

Tris-HCL pH 8,5 auf 10ml mit H2O auffüllen) bzw. ECLplus (ECLplus Western-

Blotting Detection System, Amersham) um endogene Proteine nachzuweisen.

3.3.6 Bewertungskriterien für Western-Blots

Die Schwärzung des Films ist in gewissen Grenzen der Menge an gebundenen

Antikörper und damit der Menge an nachzuweisendem Protein proportional. Die

Höhe der nachzuweisenden Proteine wurde dabei in Relation zu der Signalstärke des

jeweils als Ladekontrolle parallel bestimmten CDK2-Signales beurteilt.

67

3.3.7 Bestimmung der ββββ-Galactosidaseaktivität

Die Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität wurde im Rahmen von Reporter-Assays

durchgeführt, um eine interne Kontrolle der Transfektionseffizienz der Zellen zu

bekommen. Dadurch konnte die Reporteraktivität normalisiert werden. Der jeweils in

die Zellen kotransfizierte β-Galactosidase-Expressionsvektor setzte dabei ein

chromogenes Substrat um. Dazu wurden 50µL des Zelllysats zu 750µL

Reaktionspuffer und 100µl Substratlösung gegeben, in einer Halbmikroliter-

Einmalküvette gemischt und bei 37°C inkubiert. Die Inkubation erfolgte so lange, bis

ein gelblicher Farbumschlag sichtbar wurde. Dieser Farbumschlag erfolgte durch die

Umsetzung des chromogenen Substrats ONPG zum gelben o-Nitrophenol durch die

β-Galactosidase. Dieses Spaltprodukt entsteht in proportionaler Menge zur β-

Galactosidaseaktivität. Durch Konzentrationsmessung des entstandenen Produkts

durch Absorptionsbestimmung bei 420nm konnte auf die Aktivität der β-

Galactosidase geschlossen werden.

3.3.8 Bestimmung der Luciferaseaktivität

Die Interaktion von Transkriptionsfaktoren an einem bestimmten Promotor wurde

durch Bestimmung der Luciferaseaktivität sichtbar gemacht. Dazu wurden die

entsprechenden Zellen zunächst auf einer 6cm-Schale ausplattiert und anschließend

transient transfiziert. 36h nach der Transfektion wurden die Zellen mit kaltem PBS

gewaschen, durch Abkratzen geerntet und in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt. Es

wurden Proteinlysate hergestellt. Zur Bestimmung der Luciferaseaktivität wurden

50µl des Proteinlysats mit 350µl Reaktionspuffer versetzt und die Lichtemission in

einem Luminometer (Lumat LB 9507, Berthold) nach automatischer Zugabe von

150µl Substratmix durch die Einspritzpumpe des Luminometers gemessen.

68

3.3.9 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen mit Hilfe von Trizol

Die durch Isolierung aus eukaryotischen Zellen gewonnene RNA wurde in einem

weiteren Schritt zur cDNA-Synthese verwendet. Die Isolierung der RNA erfolgte mit

Hilfe des Trizol-Reagenz der Firma Invitrogen nach dem entsprechend mitgelieferten

Protokoll. Dazu wurde die Zellen durch Abschaben von der Zellkulturplatte geerntet,

in ein Eppendorftube überführt, abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das

Zellpellet mit 1ml Trizol-Reagenz vermischt. Um eine vollständige Dissoziation der

Nukleoproteine von der Nukleinsäure zu gewährleisten, wurden die homogenisierten

Proben 5min bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend 0,2ml Trizol/mlChloroform

hinzugefügt und die Proben vorsichtig 15sec per Hand geschüttelt. Durch

Zentrifugieren bei 12000Upm für 5min bei 4°C wurde die Lösung in eine untere

wässrige rote Phenol-Chloroform-Phase und eine obere farblose wässerige Phase

getrennt. Die RNA befand sich in der wässerigen Phase. Diese Phase wurde in ein

neues Eppendorftube überführt und die RNA durch hinzufügen von 0,5ml

Isopropanol präzipitiert. Die Proben wurden für 10min bei Raumtemperatur inkubiert

und anschließend bei 4°C und 12000Upm 10min zentrifugiert. Durch diesen

Zentrifugationsschritt wurde die RNA pelletiert. Der Überstand wurde verworfen und

das Pellet mit 1ml 75%igem Ethanol gewaschen und erneut 5min scharf

abzentrifugiert. Die RNA-Pellets wurden an der Luft getrocknet und in einem kleinen

Volumen (15-30µl) TE-Puffer aufgenommen.

3.3.10 cDNA –Amplifikation durch reverse Transkription aus RNA

In ein autoklaviertes 0,2ml PCR-Gefäß wurde in folgender Reihenfolge diese

Agenzien pipettiert: 0,5µl RNAsin, 1,5µl Oligo (dT) und 250ng RNA. Diese Probe

wurde auf 13µl mit H2O aufgefüllt. Im PCR-Cycler wurden die Proben für 10min bei

70°C inkubiert und anschließend 12µl eines Mastermixes bestehend aus 5µl 5xFirst-

Strand-Buffer, 2,5µL DTT, 1,5µl BSA, je 0,5 µl dNTP, 0,25µl RNAsin sowie 1µl

Super-Script hinzugefügt. Daraufhin wurde im PCR-Cycler 10min bei 25°C, 55min

bei 42°C und 15min bei 70°C inkubiert.

69

3.3.11 PCR mit spezifischen Primern

Bei der PCR wurde aus einem cDNA-Einzelstrang durch enzymatische Anlagerung

von freien Desoxynukleosidtriphosphaten ein DNA-Doppelstrang synthetisiert. Die

Primer, die eine Länge von etwa 20 Nukleotiden umfassten, benötigten ein freies

3OH-Ende. Der Reaktionsansatz bestand aus 2µl der synthetisierten cDNA, 5µl

Reaktionspuffer, je 1µl dNTPs, 0,1µl Polymerase, 0,9µl Taq-Verdünnungspuffer. Der

Reaktionsansatz wurde durch H2O auf ein Gesamtvolumen von 50µl aufgefüllt, gut

durchmischt und nach den angegebenen Bedingungen im PCR-Cycler inkubiert.

Thermoprotokoll:

1Zyklus: 95°C für 30 Sekunden

12-18 Zyklen: 95°C für 30 Sekunden; 55°C für 1 Minute; 68°C für 2 Minuten/kb

Plasmid.

3.3.12 RT-PCR mit spezifischen Primern im Echt-Zeit-Gerät

Diese molekularbiologische Methode folgt den Prinzipien der unter Punkt 3.3.11.

beschriebenen Technik. Die Besonderheit dieser Methode besteht darin, dass sie

durch Interkalierung von Cypergreen in die DNA eine Messung der proportional zur

DNA-Amplifikation verlaufenden PCR-Reaktion über eine UV-Lampe und dadurch

eine Quantifizierung der Reaktionsprodukte ermöglicht. Die Amplifikationskurven

der einzelnen Proben kann in Echtzeit über einen Bildschirm abgelesen werden. Der

Reaktionsansatz besteht für eine Probe aus: 18µl H2O; 2,5µl Puffer; 1µl dNTPs;

1,75µl Mg; 0,5µl je Primer (10pmol/ml); 0,75µl SYBR; 0,125µl Polymerase.

70

4 Ergebnisse

4.1 EXPERIMENTELLES SYSTEM: NEUROBLASTOMZELL-

LINIEN, DIE EIN E2F1-ER-FUSIONSPROTEIN EXPRIMIEREN

Grundlage der meisten Experimente war ein Zellklon der humanen

Neuroblastomzelllinie SK-N-SH-EP (1A3-Zellen), der konstitutiv ein E2F1-ER-

Fusionsprotein exprimiert (Kramps, 2004). Dieses Fusionsprotein kann durch Zugabe

des Östrogenderivats 4-Hydroxytamoxifen (4OHT) zum Zellkulturmedium reversibel

aktiviert werden. 1A3-Zellen reagieren auf Stimulation mit 4OHT durch

Überexpression von E2F1-Zielgenen (z.B. CCNE1) (Kramps, 2004). Zudem weisen

12h-16h nach 4OHT-Stimulus geerntete 1A3-Zellen einen höheren Anteil an Zellen in

der S-Phase (E2F induziert den Übergang der Zellen in die S-Phase) gegenüber den

nicht induzierten Zellen auf. Die S-Phasen-Induktion wird 24h nach 4-OHT-Stimulus

von einem weiteren Effekt überlagert: Die stimulierten Zellen weisen gegenüber der

Kontrolle einen größeren Anteil an apoptotischen Zellen auf.

4.2 BMI1 IST ZIELGEN VON E2F1

4.2.1 E2F1 induziert Bmi1 auch auf Proteinebene

Frühere Arbeiten in der Arbeitsgruppe hatten gezeigt, dass das BMI1-Gen in

Neuroblastomen auf RNA-Ebene durch E2F1 induziert wird und das E2F1 in vivo an

den Promotor des endogenen BMI1-Gens bindet (Nowak, 2006). Um zu überprüfen,

ob E2F1 auch die Proteinmenge von Bmi1 erhöht, habe ich mit Hilfe eines Western-

Blot das Bmi-Protein in Lysaten von 1A3-Zellen nachgewiesen:

71

Der Western-Blot zeigt das Bmi1 auch auf Proteinebene von E2F1 induziert wird.

4.2.2 BMI1 ist ein direktes Zielgen von E2F1

Cycloheximid blockiert die Proteinbiosynthese in Zellen. Diese Eigenschaft des

Cycloheximids macht man sich (im ER-System) zu nutze, um direkte Effekte von

einem Gen auf ein Zielgen, von indirekten zu unterscheiden. Cycloheximid wurde

verwendet, um nachzuweisen, ob die Induktion von BMI1 durch E2F1 auf direktem

oder indirektem Weg zustande kommt.

Mögliche Modelle:

Modell 1

Abb. 4: Modelle: Ist die Induktion von Bmi1 durch E2F1 ein direkter oder ein indirekter Effekt?

Abb. 4a: Modell 1 zeigt das Induktionsschema für einen direkten Effekt von E2F1 auf Bmi1. In diesem Fall wäre nach Induktion

durch E2F1 eine hohe BMI-RNA-Expression und ein durch Cycloheximid blockiertes und damit niedriges Bmi-Protein-Level zu

erwarten.

Abb.3: Western-Blot: Bmi1 nach E2F1

Induktion

AK gegen Bmi1 (54kDa) und CDK2 (22kDa)

mit zwei jeweils von einander unabhängigen

Versuchen (K1 und K2, (je 30µg

Proteinlysat)) nach 16stündiger Induktion mit

4OHT (K1,4OHT und K2,4OHT) und den

jeweiligen Kontrollen ohne Zugabe von

4OHT (K1minus4OHT und K2minus4OHT).

4OH E2F-ER

BMI

Protein RNA

Proteinsynthese blockiert durch Cycloheximid

BMI

CDK

K1 K1 K2 K2 minus plus minus plus 4OHT 4OHT 4OHT 4OHT

72

Abb. 4b: Modell 2 zeigt die Induktionskaskade zwischen E2F1 und BMI1 unter Zwischenschalten eines weiteren Gens

(Aktivator von BMI1) und somit eines indirekten Effekts von E2F1 auf BMI. In diesem Fall würden wir sowohl ein niedriges

Bmi-Protein, als auch ein niedriges BMI-RNA Level erwarten.

Würde der Induktionsweg indirekt ablaufen, entweder über ein oder mehrere

dazwischen geschaltete Gene, dann würde dieser Weg auf Höhe der Proteinsynthese

des zwischengeschalteten Proteins, durch die proteinbiosyntheseblockierende

Wirkung des Cycloheximids unterbrochen werden. In diesem Fall könnte keine

Induktion von BMI1 auf RNA-Ebene beobachtet werden. Um zu zeigen, dass der

Effekt von E2F1 auf BMI1 direkt war, wurde aus unterschiedlich behandelten Zellen

RNA isoliert und eine RT-PCR im Echtzeitgerät durchgeführt.

a) CyclinE b) BMI1 c) BMI1

Abb.5: RT-PCR: Induziert E2F1 BMI1 direkt oder indirekt?

A.) CyclinE (Induktionskontrolle) 1.) ohne Zugabe 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX

B.) BMI1-RNA Level in CT-Werten unter den vier verschieden Induktionsbedingungen:

1.) ohne Zugabe (no drug) 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX

C.) BMI1-RNA Level als X-fache-Aktivierung: 1.) ohne Zugabe 2.) plus 4OHT 3.) plus CHX 4.) plus 4OHT, plus CHX

Proteinsynthese blockiert durch Cycloheximid

4OHT E2F-ER

BMI

Protein RNA RNA Protein

Aktivator d.

BMI1-

Transkription

Induktionkontrolle / CYCLIN E

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

no drug 4OHT CHX 4OHT,

CHX

21

22

23

24

25

26

27


CHX

CT-W

erte

0

1

2

3

4

5

6


CHX

X-fache Aktivierung

X

F

A

C

H

I

N

D

U

K

T

I

O

N

X

F

A

C

H

I

N

D

U

K

T

I

O

N

∆

C

T

-

W

E

R

T

E

73

Als Kontrolle, ob die Induktion durch 4OHT effektiv war, wurde die CyclinE-

Expression durch quantitative RT-PCR untersucht. CyclinE wurde als ein bekanntes

Zielgen von E2F1, in diesem Versuchsansatz induziert. Durch quantitative RT-PCR

konnte gezeigt werden, dass eine Induktion von BMI1 auf RNA-Ebene durch die

alleinige Zugabe von 4OHT (zweiter Fall), aber auch bei Zugabe von 4OHT plus

Cycloheximid (vierter Fall) zu beobachten ist. Die Induktion von BMI1 durch E2F1

erfolgt demnach direkt.

4.2.3 Die Induktion von Bmi1 durch E2F erfolgt durch eine E2F-Bindungsstelle

im Bmi1-Promotor

Der Promotor des humanen BMI-Gens enthält eine Sequenz, die möglicherweise eine

E2F1-Bindungsstelle darstellt:

Abb.6: Der Promotor des BMI1-Gens enthält eine potentielle E2F1 Bindungsstelle (5´-TGTGGCGC-´). Diese Bindungsstelle

wird hoch konserviert auch im Mauspromotor gefunden. Die „E2F consensus site“ hat die Sequenz: TTTSSCGC (Weimann und

Farnham).

Um zu überprüfen, ob diese Sequenz notwendig für die Aktivierung des Bmi1-

Promotors durch E2F1 ist, wurde der Bmi1-Promotor mit der E2F1-Bindungsstelle in

den pGL3-basic-Vektor kloniert (siehe Methoden 3.13.1). Die Sequenzen von Bmi1

mussten aus einem „Bacterial artifcial chromosome“ durch Restriktionsverdau

entnommen werden. Eine Klonierung auf Basis eines PCR-Produkts war nicht

möglich, vermutlich weil der proximale Promotor des BMI1-Gens extrem CG-haltig

ist.

E2F1 induzierte im Reporter-Assay sehr stark Bmi1. Um zu zeigen, dass die

Induktion von Bmi1, die im Reporter-Assay zu beobachten war, von der Bindung des

E2F1 an die bekannte Bindungsstelle des Bmi-Promotors abhängt, wurde die E2F1-

Bindungsstelle im Promotor von Bmi1 durch den Austausch von vier benachbarten

-319 -144 -52 -19 268 458

Sp Sp Sp E2F1 exon1

74

Basen zerstört. Dabei wurde die potentielle E2F1-Bindungsstelle im Bmi1-Promotor

so verändert, dass eine neue Schnittstelle für das Restriktionsenzym NHE (Nhe I)

entstand (Austausch von TGGC gegen GCTA). Die Mutagenese erfolgte im pGL3-

Bmi-Wt-Vektor. Der Erfolg der Mutagenese wurde mit Hilfe eines Kontrollverdaus

mit den Restriktionsenzymen Nhe/Xho und durch Sequenzierung überprüft (siehe

Material und Methoden 3.2.16). Der anschließend durchgeführte Reporter-Assay

zeigte folgendes Ergebnis:

In diesem Experiment aktivierte transfiziertes E2F1 das Reportergen etwa 10fach und

E2F3 etwa 3fach (Abb.7). Im Gegensatz dazu erhöhten weder E2F1 noch E2F3 die

Aktivität des mutierten Reporterkonstrukts. Demnach ist die E2F-Bindungsstelle im

proximalen Promotor des BMI-Gens verantwortlich für die Aktivierung durch E2F.

Abb 7.:Luciferase-Assay in Shep-Zellen: Ist die E2F1-Bindungsstelle im BMI1-Promotor verantwortlich für die Induktion von

Bmi1 nach E2F1 Stimulus?

Die Transfektion erfolgte nach folgendem Schema (jeweils Triplikate):

1.) 6µg pGL3-BMI, 12µg CMV-Leervektor, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal

2.) 6µg pGL3-BMI, 6µg E2F1, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal



5.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 12µg CMV-Leerwert, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal

6.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 6µg E2F1, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal

7.) 6µg pGL3-BMI mit mutierter E2F1-Bindungsstelle, 6µg E2F2, 6µg DP1, 3µg CMV eGFP, 3µg β-Gal

Lu cife rase/B ra dfo rd

0

2

4

6

8

10

12

LeerwertBMI

BMIE2F1

BMIE2F2

BMIE2F3

MutaLeeerwert

MutaE2F1

MutaE2F2

MutaE2F3

x

-

f

a

c

h

-

a

k

t

i

v

75

4.3 BMI1 IST KEIN REGULATOR DES MYCN-GENS IN IMR 32-

ZELLEN BEI TRANSIENTER TRANSFEKTION

Die Untersuchung der Promotoren von CMYC und MYCN hat überraschende

Parallelen in der transkriptionellen Regulation beider Gene enthüllt (Strieder, 2003).

Die Regulation des MYC-Gens durch PcG-Proteine, die in mehreren Zellsystemen

nachgewiesen wurde (Guo und Dimri, 2006), könnte eine weitere Gemeinsamkeit

darstellen. Analog der Situation in Lymphozyten, könnte durch die Expression von

Bmi1 die funktionellen Eigenschaften des PcG-Komplexes verändert werden, mit der

Folge, dass N-Myc nicht mehr reprimiert wird. Es ist bekannt, dass E2F1 N-Myc in

Neuroblastomzellen induzieren kann (Strieder, 2003). Da außerdem bekannt ist, dass

E2F1 Bmi1 induziert, habe ich überprüft, ob die Überexpression von N-Myc durch

E2F1 ein Effekt ist, der durch Bmi1 verursacht wird. In diesem Fall müsste bei

alleiniger Überexpression von Bmi1 die N-Myc-Expression ansteigen. Dazu wurde im

Anschluss an eine transiente Transfektion von N-Myc in IMR-32-Zellen ein

Luciferase-Assay durchgeführt.

Die Luciferaseaktivität ist bei Kotransfektion des Leervektors erwartungsgemäß

niedrig (Abb. 8; Probe 1). Die dritte Probe mit kotransfizierten E2F3 wurde als

Positivkontrolle mitgeführt, da bekannt ist, dass E2F3 N-Myc induziert. Die Aktivität

des N-Myc Promotors wird durch Bmi1 nicht induziert (niedrige Luciferasewert in

der zweiten Probe; vergleichbar mit dem Leerwert). Das bedeutet, dass zumindest bei

transienter Transfektion Bmi1 nicht die N-Myc-Expression steigern kann.

0

50000

100000

150000

200000

250000

Leerwert (pcDNA3) BMI-1 E2F

Luciferaseaktivität

Abb.8: Lucifersase-Assay: Ist N-Myc in

Neuroblastomzellen durch Bmi1 induzierbar? Transiente Transfektion mit folgendem

Transfektionschema in IMR32-Zellen

1.) 4µg N-Myc-luc; 3µg pcDNA3; 1,5µg LacZ; 1,5µg

CMVeGFP (Vergleichswert;Leerwert)

2.) 4µg N-Myc-luc; 3µg CMV BMI-1; 1,5 µg LacZ;

1,5µg CMVeGFP

3.) 4µg N-Myc-luc; 1,5µg CMV-E2F3 plus 1,5µg DP1;

1,5µg CMVeGFP (Positivkontrolle, denn es ist bekannt,

dass E2F3 N-Myc induziert

76

4.4 UNTERSUCHUNG DER ROLLE VON BMI1 IN DER ANTWORT

AUF E2F1 IN NEUROBLASTOMEN

Die aussagekräftigsten Ergebnisse zur Funktion eines Gens liefern experimentelle

Ansätze, bei denen das Gen funktionell inaktiviert wird. Das Ziel dieser

Versuchansätze war, durch Aktivierung von E2F1 bei gleichzeitiger Hemmung von

Bmi1, die Bedeutung von Bmi1 für die E2F1 Funktion zu untersuchen (siehe

Einleitung Abb.2, Model 1 versus Model 2). Ich habe zwei verschiedene Ansätze zum

Ausschalten des BMI1-Gens benutzt:

Zum einen wurde die BMI1-Expression durch RNA-Interferenz, RNAi, gehemmt

(siehe Kapitel 4.4.1-4.4.4).

Zum anderen wurde ein dominant negatives Allel zur funktionellen Hemmung von

Bmi1 verwendet (siehe Kapitel 4.4.5).

4.4.1 Hemmung der BMI1-Expression durch RNAi-Interferenz

Im ersten Schritt wurde ein sogenannter siRNA-Vektor basierend auf dem pSuper-

Plasmid hergestellt. Der Vektor kodiert für eine kurze RNA, die „short hairpin RNA“

(shRNA), die unter der transkriptionellen Kontrolle eines starken viralen Promotors

steht. Diese RNA faltet zu einem Doppelstrang zurück, der in einen Proteinkomplex

integriert wird. Dieser Komplex zerstört spezifisch diejenigen mRNA-Moleküle,

deren Sequenz mit der siRNA im Komplex übereinstimmt (Leung und Whittaker,

2005; Lenz, 2006). Weil nicht alle Bereiche eines mRNA-Moleküls in gleicher Weise

für RNAi geeignet sind und nur unsichere Kriterien definiert werden können, die eine

Vorhersage über die Eignung einer bestimmten Sequenz als Ziel der RNAi

ermöglichen, habe ich drei verschiedene shRNAs gegen BMI1 konstruiert, die

verschiedene Zielsequenzen innerhalb des BMI1-mRNA-Moleküls erkennen.

Die drei shRNAs gegen BMI1 wurden zunächst durch eine transiente Transfektion

getestet, um zu zeigen, dass die jeweiligen siRNAs überhaupt einen Effekt auf das

Expressionslevel von BMI1 haben. Dazu wurden die drei verschiedenen siRNAs in

verschieden Ansätzen in IMR32-Zellen transient transfiziert.

77

Die Höhe der Expression des BMIs bzw. die Repression durch die verschiedenen

siRNAs wurde auf RNA-Ebene durch RT-PCR im Echtzeit-Gerät geprüft.

0

1

2

3

4

5

6

7

siRNA1/2 siRNA3/4 siRNA5/6

Je höher die ∆-CT-Werte sind, desto effektiver ist die Reduktion von BMI1 durch die

entsprechende siRNA. SiRNA1/2 (∆-CT-Wert:5,2) und siRNA5/6 (∆-CT-Wert:4,8)

weisen sehr hohe ∆-CT-Werte auf (Abb.9) und können deshalb anhand dieses

transienten Versuches als gut funktionierende siRNAs bezeichnet werden.

Aufgrund der Ergebnisse der transienten Transfektion der drei verschiedenen siRNAs

gegen BMI1 in IMR32-Zellen konnte angenommen werden, dass die drei siRNAs

BMI1 in den Zellen reprimieren können. Für die „loss-of-function-Versuche“ müssen

aber exakt reproduzierbare Versuchsbedingungen vorliegen. Deshalb wurde die

siRNA stabil in 1A3-Zellen transfiziert.

Abb.9: RT-PCR im Echtzeitgerät: Austestung der siRNA gegen

BMI1 im transienten Versuchsansatz.

Y-Achse: ∆-CT-Werte des BMIs;

Der ∆-CT-Wert steht für eine Differenz zwischen zwei CT-Werten;

in diesem Fall für die Differenz der BMI-RNA-Werte von Zellen

mit kotransfiziertem Leervektor und Zellen, die nach transienter

Transfektion ein siRNA-Konstrukt enthalten. RNA-Lysat aus

IMR-32-Zellen (BMI1 exprimierende Neuroblastomzelllinie), die

nach dem folgenden Transfektionsschema transfiziert wurden:

1.) 24µg pGl3-Vektor mit siRNA1/2, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP

2.) 24µg pGL3-Vektor mit siRNA3/4, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP


4.) 24µg pGL3-Leervektor, 3µg Puromyinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP

Die Zellen wurden 48h nach Transfektionsbeginn für 72h mit 0,8µg/ml Puromycin vollständig selektioniert.

Die BMI-Werte wurden zweifach abgeglichen:

1.) Der Abgleich mit den S14 –Werte erfolgte (wie bei jeder quantitativen RT-PCR), um sicherzustellen, dass man

von gleichen cDNA-Mengen bei der RT-PCR ausgeht;

2.) Durch Quantifizierung des BMIs auf RNA-Ebene in den mit dem Leervektor transfizierten Zellen konnte das

Ausgangslevel des BMIs bestimmt werden. Durch den Vergleich dieses „Normallevels“ mit dem Level des BMIs in

den siRNA-Zellen kann die Effektivität der einzelnen siRNAs festgestellt und miteinander verglichen werden.

∆

-

C

T

-

W

E

R

T

78

4.4.2 Folgen der Hemmung von BMI1 in Neuroblastomzellen

Nach stabiler Transfektion der drei siRNAs in 1A3-Zellen zeigte sich unter Selektion

mit 0,8mg/ml Puromycin folgendes:

1.) Alle 4 Platten (siRNA1/2; siRNA3/4; siRNA 5/6; Kontrollplatte mit pSuper-

Leervektor) hatten eine gleich gute Transfektionseffizienz (durch

kotransfiziertes GFP sichtbar gemacht).

2.) Alle 4 Platten waren nach drei Tagen Selektion mit 0,8 mg/ml Puromycin

vollständig selektioniert.

3.) Nach einigen Tagen stellte sich bereits heraus, dass die Einzelklone auf der

Kontrollplatte, aber auch die Klone mit transfizierter siRNA1/2 und mit

siRNA3/4 wesentlich schneller wieder wuchsen, als die Klone, die mit

siRNA5/6 transfiziert worden waren.

4.) 18 Tage nach Transfektionsbeginn wurde ein Koloniebildungsversuch

gemacht und es stellte sich folgende Situation auf den Zellkulturschalen dar:

Abb.10: Koloniebildungsversuch in 1A3-Zellen 20 Tage nach stabiler Transfektion verschiedener siRNAs gegen Bmi1

(Selektion mit 0,8mg/ml Puromycin). Transfektionsschema:

1.) 24µg pGl3-Vektor mit siRNA1/2, 3µg Puromycinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP



4.) 24µg pGL3-Leervektor, 3µg Puromyinresistenzmarker, 3µg CMVeGFP

Der Koloniebildungsversuch zeigte, dass sich zwei der siRNA-Platten (siRNA1/2 und

siRNA3/4) von der Wachstumsgeschwindigkeit und der Zellkoloniedichte nach 18

Tagen nicht von der Kontrollplatte (Leervektor transfiziert) unterschieden. Auf der

Zellkulturschale mit transfizierter siRNA5/6 konnten wesentlich weniger

Einzelzellkulturen erkannt werden. Außerdem zeigte sich auf der Zellkulturplatte der

pSuper siRNA 5/6 siRNA 1/2 siRNA 3/4

79

siRNA5/6-Klone, dass die wenigen Zellen sich morphologisch veränderten. Die

Zellen bildeten längliche Zellkörper mit langen Zellausläufern aus.

Unter zusätzlicher Betrachtung der Testung der drei siRNAs im transienten Assay,

konnte angenommen werden, dass die siRNA5/6 sehr effektiv BMI1 reprimiert. In der

zuvor durchgeführten RT-PCR und transienten Transfektion zur Testung der siRNAs

konnte aber auch für die siRNA1/2 eine starke Reduktion von BMI1 gezeigt werden,

während im Koloniebildungsversuch der siRNA1/2-Klone kein Unterschied in der

Zellmorphologie oder in der Wachstumsgeschwindigkeit im Vergleich zur

Kontrollplatte beobachtet werden konnte. Deshalb wurden alle funktionellen

Analysen der siRNA-Klone nur mit stabil transfizierter siRNA durchgeführt. Nimmt

man also an, dass stabil transfizierte siRNA1/2 und siRNA3/4 nicht die erwünschte

Wirkung erzielen konnte, siRNA5/6 aber im Gegensatz dazu BMI1 supprimieren

konnte, könnte der beobachtete Wachstumsarrest aus verschiedenen Gründen

verursacht werden. Dies könnte bedeuten, dass durch die Suppression von BMI1

(siRNA5/6) die Zellen apoptotisch bzw. seneszent werden oder das Potential der

neuronalen Stammzelle zur Selbsterneuerung verlieren und Ausdifferenzieren (Cui,

2006). Das würde erklären, warum auf der Platte „siRNA5/6“ im Vergleich zur

Kontrollplatte (pSuper) und den anderen beiden siRNA-Platten (siRNA1/2 und

siRNA3/4) viel weniger Klone zu sehen waren.

Es ist allerdings auch bekannt, dass shRNAs so genannte „off-target Effekte“

hervorrufen können. „Off-target Effekte“ sind unspezifische Antworten der Zelle

(z.B. auch Induktion von Apoptose) nach Einbringen von siRNAs in die Zelle. Diese

Effekte können u.a. durch Induktion einer p53-Antwort oder durch

Interferonstimulation erklärt werden (Pebernard und Iggo, 2004; Fedorov und

Khorova, 2006).

Um zu klären, ob der beobachtete Wachstumsarrest der Neuroblastomzellen bei

BMI1-Reduktion durch Änderung des Zellzyklusprofils zustande kommt, wurde eine

Durchflußzytometrie mit Bmi1-reprimierten Zellen durchgeführt (siehe Kapitel 4.4.6).

80

4.4.3 Reduktion der BMI1 Menge durch RNA-Interferenz in stabilen

Zellklonen

Nach stabiler Transfektion der siRNA1/2 und siRNA5/6 in 1A3-Zellen wurde die

Höhe der Expression von Bmi1 in den jeweiligen siRNA-Klonen mit Hilfe von

Western-Blots überprüft. Es sollte die Höhe der Expression von Bmi1 in den

Ausgangszellen analysiert werden. Dazu wurden von den Zellkulturplatten

Einzelklone gepickt, um dann die jeweiligen Einzellklone hochzuziehen und im

Western-Blot zu analysieren. Als Vergleichswert für die Höhe der Bmi1-Expression,

bzw. für die Reduktion durch die siRNA, wurden Einzelklone mit transfiziertem

pSuper-Leervektor analysiert. Der Unterschied der Höhe der Expression von Bmi1

zwischen den pSuper-Klonen und den siRNA-Klonen, sollte sich durch die Wirkung

der jeweiligen siRNA ergeben.

Abb.11: Western-Blot von 1A3-Zellen: Lässt sich Bmi1 durch stabil transfizierte siRNA reduzieren?

Zellklone: pSuper- und siRNA-Klonen (Antikörper: Bmi1 und Cdk2)

Der Nachweis von Cdk (ca 22kDa) zeigt, dass gleiche Proteinmengen auf das Gel geladen wurden. Die pSuper-Klone (pS, K1-

K3) enthalten den pSuper-Vektor als stabil transfizierten Leervektor und sind zum Vergleich der Bmi-Expression (ca 54kDa) mit

den siRNA-Klonen (diese Zellen enthalten entweder stabil transfizierte siRNA1/2 oder siRNA 5/6) notwendig.

Es ließ sich in den Western-Blots beobachten, dass Unterschiede in der Stärke der

Expression von Bmi1 auftraten. PSuper-K1 und siRNA5/6-K1 enthielten im

Vergleich zu den Klonen pSuperK3 und siRNA5/6K2 viel Bmi1. Die Bmi1-

Expression war bei einigen siRNA-Klonen reduziert (siRNA5/6K2). Es musste aber

auch festgestellt werden, dass die Leervektoren (pSuper) eine sehr unterschiedliche

Menge Bmi1 enthielten (vergleiche pSuperK1 mit pSuperK3). Es konnte somit nicht

eindeutig gesagt werden, dass die Reduktion von Bmi1 beim siRNA5/6 K2 aufgrund

der Wirkung der siRNA zustande kam. Diese Schwankungen der Bmi1-Expression

könnte auch durch individuelle Unterschiede in den verschiedenen Zellen oder durch

methodische Schwierigkeiten aufgetreten sein.

pS pS pS si1/2 si1/2 si1/2 si5/6 si5/6

K1 K2 K3 K1 K2 K3 K1 K2

BMI

CDK

81

Außerdem ließ sich die niedrige Expression von Bmi1 bei den siRNA-Klonen, soweit

es zu einem bestimmten Zeitpunkt vorlag, wenige Wochen später nicht mehr im

Western-Blot reproduzieren.

Erklärungsversuche:

Ist die Bmi1-Proteinmenge tatsächlich in einigen Klonen durch die siRNA

herunterreguliert, so führt das vermutlich zum Wachstumsarrest. Zellen aus einigen

„Bmi-knock-out-Klonen“ könnten die siRNA aus verschiedenen Gründen verlieren

und hätten damit einen erheblichen Wachstumsvorteil gegenüber den restlichen

Zellen dieses Klons. Der „Bmi-knock-out-Klon“ würde von revertierten Zellen

überwachsen werden und würde nach wenigen Passagen in der Zellkultur wieder eine

völlig normale Bmi1-Expression aufweisen. Dieser mögliche Erklärungsversuch

wurde durch eine Beobachtung an einigen siRNA5/6 Klonen gestützt, die ein

besonders langsames Wachstum aufwiesen. Diese Zellen wiesen im Vergleich zu den

pSuper-transfizierten Zellen morphologische Veränderungen auf. V.a. konnte

beobachtet werden, wie die Zellen axonale Fortsätze im Sinne einer

Ausdifferenzierung bildeten. An diesen Klonen konnte man regelrecht beobachten,

wie die sehr langsam wachsenden Zellen (fast im Wachstumsarrest) von einem Punkt

der Zellkulturschale, von sehr schnell wachsenden Zellen verdrängt wurden. Nach

wenigen Tagen zeigte sich eine schnelle Wachstumsgeschwindigkeit des Gesamtklons

(„Bmi-knock-out- Zellen“ von revertierten Zellen überwachsen?). Aufgrund dieser

Beobachtungen und den sich daraus ergebenen Problemen wurde eine neue Strategie

zum Herunterregulieren von BMI1 durch siRNA verfolgt:

4.4.4 Induzierbare Hemmung der BMI1 Expression

Um die negative Selektion von Zellen mit reduzierter Bmi1-Expression zu

verhindern, wurden Zellklone hergestellt, bei denen die Expression der siRNA gegen

BMI1 reversibel durch die Zugabe von Tetrazyklin zum Zellkulturmedium reguliert

werden konnte (TET-on-System).

82

Abb.12:

Model: Induzierbare RNA-Interferenz von BMI1. (modifiziert nach: Brummelkamp und Agami, 2002)

TOR-Zellen sind ein Derivat der humanen Neuroblastom-Zelllinie SK-N-SH-EP, die das 4OHT-abhängige E2F1-ER-

Fusionsprotein sowie den Tet-Repressor von E.coli konstitutiv exprimiert. Die siRNA steht unter Kontrolle des TET-Repressors.

Durch tetrazyklinabhängige Induktion löst sich der TET-Repressor vom TET-O-Promotor und somit kommt es zur Expression

der siRNA.

Um Zellen zu erhalten, die eine siRNA tetrazyklinabhängig exprimieren, müssen zwei

Plasmide stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Das eine Plasmid ist der

Tet-Repressor, der den TET-O-Promotor blockiert. Das zweite Plasmid ist die siRNA,

die unter Kontrolle des TET-O-Promotors steht. Das Plasmid, das für den TET-

Repressor kodiert, kann an unterschiedlichen Stellen in das Genom der Zelle integriert

werden. Es ergeben sich daraus verschiedene Aktivitäten des Repressors. Um

Einzelklone zu identifizieren, die eine gute TET-Regulation zeigen, wurde ein

Luciferase-Plasmid transient in die Klone transfiziert, welches ebenso wie die siRNA

vom TET-Repressor abhängig ist. Theoretisch gibt es für jeden Einzelklon je vier

Möglichkeiten die siRNA zu exprimieren, erkennbar an der Luciferaseaktivität: Ein

guter Klon wäre einer, der ohne Induktion durch Tetrazyclin eine niedrige

Luciferaseaktivität aufweist, jedoch durch die Tetrazyclin-Induktion, eine möglichst

hohe Luciferaseaktivität aufzeigt.

pcDNA

4/TO

Nukleus

Endogenes

BMI1

TET O siRN

A P

Tet-R

E2F1-

ER-

Fusions-

Pr.

Prote

in

Kom

pl.

Tet-R

TET

4oht

TOR-Zelle

83

Die folgende Abbildung eines Reporter-Assays zeigt verschiedene Einzelklone, die

das TET-Repressor-Plasmid stabil transfiziert und zum Austesten ihrer

Repressorqualität transient ein Reporterplasmid enthalten.

Abb.13: Luciferase-Assays: Austestung der TET-Repressor-Klone Gezeigt ist hier eine Auswahl an Klonen (TOR5, 7, 13, 23, 24), jeweils links ohne TET-Induktion (m=minus TET) rechts

daneben jeweils nach 18h TET-Induktion (p=plus TET)

Während z.B. Klon 5 eine hohe Repessoraktivität bereits vor Zugabe von TET zeigte

und auf die Zugabe von TET kaum reagierte, wies Klon 7 eine sehr geringe Aktivität

in Abwesenheit von TET auf und wurde durch die Zugabe von TET etwa 150fach

induziert. Nach den oben genannten Kriterien sind die Klone 7; 13; 24; 27; 37 (einige

dieser Klone sind oben nicht abgebildet) gut für die stabile Transfektion von siRNA

geeignet. Die Klone TOR7 und TOR27 wurden für weitere Arbeiten ausgewählt.

In die Klone TOR7 und TOR27 wurde zusätzlich zum TET-Repressor die siRNA5/6

im pTER-Vektor stabil transfiziert.

Abb.14: Western-Blot: Bmi-1 (ca. 54kDa) lässt sich im TET-on-System runterregulieren.

Auswahl von Klonen, die aus TOR7-Zellen hervorgegangen sind und zusätzlich die siRNA5/6 TET-induzierbar enthalten.

Jeweils links (minus Tet) sind die Klone ohne TET-Induktion zu finden, rechts daneben (plus Tet) sind jeweils die Klone nach

24stündiger TET-Induktion zu finden.

K1 K1+ K2- K2+ K3- K3+ K4- K4+ K5- K5+ minus plus minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet

BMI1

CDK

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

1 6 0

1 8 0

2 0 0

Luciferaseaktivität

R e i h e 1

T5 T5 T7 T7 T13 T13 T23 T23 T24 T24 minus plus minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet

84

Klon3 weist ohne TET-Induktion eine hohe Bmi1-Expression auf und erfährt nach

Induktion mit TET eine wesentliche Reduktion des Bmi1-Werts. Dieser Klon ist ein

möglicher Kandidat für die funktionelle Analyse von Zellen mit reduzierter Bmi1-

Expression.

4.4.5 Funktionelle Inaktivierung von Bmi1 durch Expression eines dominant-

negativen Allels

Ein Protein wird dann als dominant-negativ bezeichnet, wenn es zum einen unfähig

ist die Funktionen des Ausgangsproteins zu erfüllen und zusätzlich das endogene

Protein funktionell inhibiert. Dadurch kann ebenfalls ein „loss of function“ in den

Zellen erreicht werden. Für das Bmi-1 wurde in der Literatur ein dominant-negatives

Allel beschrieben, das ein aminoterminalverkürztes Protein kodiert, dem die Ring-

Finger Domäne (RF) fehlt (Itahana und Dimri, 2002). Um das dnBmi in 1A3-Zellen

zu exprimieren, wurde in diesen Zellen zuerst der ekotrope Rezeptor exprimiert.

Anschließend wurden diese Zellen mit einem Retrovirus infiziert, der das delta RF

Allel trägt. Das endogene Bmi1 ließ sich durch Western-Blots zwar nachweisen; das

dominant-negative Allel war aber nicht detektierbar.

Mögliche Gründe hierfür sind:

1.) Der Antikörper konnte das dominant negative Allel doch nicht nachweisen

(inzwischen ausgeschlossen).

2.) Die retrovirale Infektion war zu ineffizient, so dass sie unter der

Nachweisgrenze des Western-Blots lag; wobei auch hierfür wieder zwei

Gründe in Frage kämen:

-die stabile Transfektion mit dem ekotropen Rezeptor war ungenügend

(GFP-Kontrolle zeigte etwa 50%-Transfektionserfolg).

-der retrovirale Überstand und damit die Infektion war nicht optimal

Um die Effizienz in diesem System zu erhöhen, wurde die Strategie geändert:

Ich habe auch für das dominant-negative Allel das TET-on-System verwendet. Durch

das Umklonieren des dominant-negativen Allels vom Bmi1-Ausgangsprotein und die

Verwendung eines induzierbaren Systems sollten drei mögliche Fehler- bzw.

Schwachstellen des stabilen Systems umgangen bzw. ausgeschaltet werden:

85

1.) Durch das Zurückgreifen bei der Klonierung auf das Bmi-∆-RF-

Ausgangsplasmid konnte sichergestellt werden, dass das von dem

verwendeten Antikörper detektierbare Bmi1 kloniert wurde.

2.) Durch das TET-Systems konnte eine Induzierbarkeit der Expression der ∆-

Ring-Finger-Mutante und damit eine erleichterte Detektierbarkeit im Western-

Blot erreicht werden.

3.) Der Zeitpunkt der Expression des Systems konnte von mir gewählt werden.

Dadurch konnten Wachstumsnachteile durch den Verlust von Bmi1 auf kurze

Zeiträume reduziert werden.

Für das induzierbare TET-System mit ∆-Ring-Finger Mutante konnten die gleichen

TET-Klone, wie für die TET-induzierbare-siRNA verwendet werden; also die Klone

TOR7 und TOR27. Das ∆-Ring-Finger Protein wurde ebenfalls stabil in die

jeweiligen Klone transfiziert (die Klonierung der ∆-Ring-Finger-Mutante wurde von

Daniel Fehr im eigenen Labor durchgeführt).

Im Western-Blot lässt sich zum einem das endogene Bmi1 (ca. 54kDa) nachweisen.

Auf der anderen Seite ist auch die ∆-Ring-Finger Mutante (36kDa), der etwa ein

Drittel der Aminosäuren des gesamten Bmi1-Proteins fehlt, durch den Bmi-

Antikörper nachweisbar. Im Western-Blot fällt auf, dass einige der TET-induzierten

Klone auf Höhe der ∆-Ring-Finger Mutante (ungefähr 36kDa) eine Doppelbande

aufweisen (z.B. Klon2), während bei anderen Klonen auf dieser Höhe lediglich eine

Einzelbande vorzufinden ist (z.B. Klon12). Die Ursache für das Auftreten dieser

Doppelbande ist unbekannt.

BMI-1

BMI-∆RF

CDK

K1 K1 K2 K2 K12 K12 K13 K13 minus plus minus plus minus plus minus plus Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet Tet

Abb.15: Western-Blot: Lässt sich die ∆-RF-

Mutante im TET-induzierbaren System

nachweisen?

Antikörper gegen Bmi-1 (ca 54kDa)- und

Cdk(22kDa). Auswahl einiger Klone: Die

verwendeten Klone enthalten als TOR7-

Zellen sowohl das TET-ON-System, als

auch die TET-induzierbare Bmi-∆-RING-

Mutante (36kDa). Im Western-Blot sind

verschiedene ∆-Ring-Finger Klone

nebeneinander aufgetragen.

Links befinden sich jeweils die nicht-induzierten Klone (minus), während die jeweils rechten Klone 16 h mit TET induziert

wurden (plus TET).

86

4.4.6 Die Expression von dnBmi1 in 1A3-Zellen hat keinen Einfluss auf die

Induktion von S-Phase und Apoptose

Um die ∆-RF-Klone funktionell zu analysieren, wurde eine FACS-Analyse von zwei

Klonen (einer mit Doppelbande bei 36kDa, Klon2; der andere mit einer Einzelbande

an dieser Stelle, Klon12) durchgeführt.

Abb. 16: FACS-Analyse des TET-induzierbaren ∆RF-Klon2.

Vier verschiedene Induktionsbedingungen:

1.) ohne Induktion

2.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen

3.) nach 12stündiger Induktion mit Cycloheximid

4.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen und 12stündiger Induktion mit Cycloheximid

1. 2.

3. 4.

87

Abb. 17: FACS-Analyse des TET-induzierbaren ∆-RF-Klon12. Vier verschiedene Induktionsbedingungen:

1.) ohne Induktion

2.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen

3.) nach 12stündiger Induktion mit Cycloheximid

4.) nach 18stündiger Induktion mit 4-Hydroxytamoxifen und 12stündiger Induktion mit Cycloheximid

In den FACS-Analysen der zwei Klone lässt sich folgendes erkennen:

1.) E2F-1 induziert in den Zellen (plus 4OHT) Apoptose. Außerdem befindet sich in

den E2F-1 induzierten Zellen ein größerer Anteil in der S-Phase, als in der nicht-

induzierten Population.

2.) Durch die alleinige Zugabe von TET zu den Zellen und der damit verbundenen

Aktivierung des dominant-negativen Allels gegen BMI1, ist weder eine Induktion

von Apoptose, noch eine Induktion der S-Phase zu beobachten.

3.) Durch Induktion der Zellen mit 4OHT und TET, ergibt sich das gleiche Bild, wie

im ersten Fall (Induktion nur mit 4OHT). Es befinden sich mehr Zellen in der S-

Phase und begehen Apoptose, als in den nicht induzierten Populationen

Demnach ist Bmi1 weder an der Induktion der S-Phase, noch der Apoptose beteiligt.

1. 2.

3. 4.

88

4.5 HTERT IST KEIN ZIELGEN VON BMI1 IN

NEUROBLASTOMZELLEN

Nach einer gewissen Anzahl von Zellteilungen geht fast jede Zelle in Seneszenz über

oder begeht Apoptose. Dieser Schritt ist einer der kritischen Schritte im Übergang

einer Körperzelle in eine Tumorzelle (Hahn, 1999; Greider, 1999; Elenbass, 2001).

Einer der wichtigsten Ursachen für den Übergang einer Zelle in Seneszenz ist die von

Zellteilung zu Zellteilung voranschreitende Verkürzung der Telomere (Harley, 1990;

Allsop, 1992; Nugent, 1998), als Konsequenz der DNA-Replikation. In Stammzellen

wird hingegen die Länge der Telomere durch das Enzym Telomerase stabilisiert. Eine

aktivierte Telomerase findet man auch in vielen Tumorzellen (Kim, 1994; Shay,

1997; Shay, 2001), während die Telomerase in menschlichen Körperzellen reprimiert

vorliegt. Das Enzym besteht aus zwei Anteilen: zum einem aus einem Ribonuklein-

Protein-Komplex; zum anderen aus einer katalytischen Untereinheit (hTert) mit einem

reverse Transkriptase-Motiv. Die RNA-Komponente wird in den meisten Zellen

exprimiert. hTERT kommt im Gegensatz dazu nur in sehr wenigen Zellen vor (Kim,

1994; Shay, 1998). In Zellen, in denen hTERT exprimiert wird, werden die Telomere

auch nach mehreren Zellteilungen noch in der ursprünglichen Länge vorgefunden.

Nach neueren Vorstellungen wird hTERT aber nicht generell in menschlichen

Körperzellen reprimiert, sondern wird vielmehr zellzyklusabhängig reguliert.

In einigen Brustkrebszelllinien wird Bmi1 überexprimiert vorgefunden; Bmi1

verlängert die Überlebenszeit von Brustepithelzellen (MECs) und Bmi1 induziert die

Aktivität von Telomerase in MECs (Dimri, 2002). In humanen Fibroblasten konnte

keine Induktion der Telomerase durch Bmi1 nachgewiesen werden. Die Induktion der

Telomerase durch Bmi1 scheint ein zelltypabhängiger Mechanismus zu sein (Dimri,

2002).

Um den Einfluss von Bmi1 auf hTERT in Neuroblastomen zu untersuchen, wurde

die Expression von hTERT nach Stimulation der 1A3-Zellen mit 4-OHT (Induktion

von Bmi1) durch Echtzeitgerät-PCR dargestellt. Würde Bmi1 hTERT induzieren, so

würde ich in der Induktionskinetik in der Echtzeit-PCR absinkende CT-Werte

erwarten.

89

Das Expressionslevel von hTERT sinkt durch längere Induktionszeiten der Zellen mit

4OHT und damit der Induktion von E2F1 und BMI1. Die Expression von Bmi1 führt

im transienten Versuchsansatz in Neuroblastomzellen nicht zu einer Induktion von

hTERT.

4.5.1 Die Dereprimierung von Rb führt nicht zur Induktion von E2F1 bzw.

Bmi1 in MEFs

Die Regulation von pRb erfolgt vor allem über seinen Phosphorylierungsstatus;

Hypophosphoryliertes pRb assoziiert mit E2F1, E2F2 und E2F3 und wirkt als

transkriptioneller Ko-Repressor, der die Expression von E2F-regulierten Genen

inhibiert. Die Phosphorylierung von pRb führt zur Dissoziation des pRb von E2F und

in der Folge zur Aktivierung E2F-regulierter Gene, die den Eintritt der Zellen in die

S-Phase des Zellzyklus bewirken (Leone, 2000; Claudio, 2002; Trimarchi und Lees,

2002). Ein Mechanismus, der zur Inaktivierung des pRb in Neuroblastomen führt,

stellt eine direkte Verbindung zwischen N-Myc und dem pRB/E2F- Kontrollpunkt

her. Nach diesem Modell aktiviert N-Myc direkt die Expression via ID2 (Lasorella

und Iavarone, 2002). Das entsprechende ID2-Protein bindet an pRb und sequestriert

dieses in inaktiven Komplexen. Dadurch geht die negative Kontrolle von Rb auf E2F

verloren (Lasorella und Iavarone, 2002 und 2005).

Da RB E2F1 in vielen Zellen reprimiert, und wir durch unsere eigenen Arbeiten

wissen, dass E2F1 BMI1 induziert, würden wir in Rb-/- MEFs erwarten, dass BMI1

als E2F1 Zielgen dereprimiert wird. Um diesen Zusammenhang darzustellen, wurde

BMI1 in RB-/- im Vergleich zu RB+/+ MEFs (RNA mit freundlicher Unterstützung

Abb.18: Quantitative RT-PCR im

Echtzeitgerät: HTERT-Kinetik nach

Bmi1 Induktion.

Auf der y-Achse sind die CT-Werte

aufgetragen. Alle Werte sind auf die

entsprechenden s-14-Werte

normalisiert. Die Induktion der Zellen

wurde mit 1µg/ml 4-Hydroxytamoxifen

für die auf der X-Achse angegebenen

Zeiten durchgeführt (0h,1h,4h,8h,12h,).

h T E R T K in e t ik

0

0 ,5

1

1 ,5

2

2 ,5

3

3 ,5

4

0 h 1 h 4 h 8 h 1 2 h

delta CT-W

ert

ç

90

der Arbeitsgruppe Gaubartz; eigenes Labor, zur Verfügung gestellt) durch

quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät untersucht:

Der RT-PCR kann entnommen werden, dass sich das BMI1-Level in RB-knock-out

MEFs sich nicht wesentlich vom BMI1-Level in RB+/+MEFs unterscheidet. Eine

mögliche Erklärung hierfür wäre, dass die Dereprimierung von RB in MEFs nicht zur

Induktion von E2F1 und damit von BMI1 führt. Um abschließend die Frage zu klären

wären MEFs nötig, die auch defizient für andere Pocketproteine sind, welche

teilweise redundant mit Rb sind.

Abb.19: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät zur

Untersuchung der Expression von BMI-1 in RB-knock-

out MEFs. Die ct-Werte (keine ∆-ct Werte) wurden auf

die entsprechenden s14-Werte normiert.

B M I i n R B - k n o c k - o u t M E F s

2 0

2 1

2 2

2 3

2 4

2 5

2 6

2 7

2 8

2 9

3 0

R B M E F s R B - / - M E F S

CT-W

erteBMI-1

R e ih e 1

91

5 Diskussion

5.1 E2F1 INDUZIERT BMI1 DURCH BINDUNG AN DIE E2F1

BINDUNGSSTELLE IM BMI1-PROMOTOR

Bmi1 spielt in der Embryonalentwicklung, in Stammzellen und bei der Entstehung

von Tumoren eine wichtige Rolle. Es ist deshalb umso erstaunlicher, dass über die

Regulation von Bmi1 in Neuroblastomen bisher sehr wenig bekannt ist. In dieser

Arbeit habe ich zunächst die Regulation von Bmi1 durch E2F1 untersucht. Durch

Vorarbeiten von Verena Strieder und Christoph Kramps war bekannt, dass BMI1 auf

DNA-Ebene Zielgen von E2F1 ist. Mit den 1A3-Zellen stand ein Zellsystem zur

Verfügung, in dem zu jedem beliebigen Zeitpunkt E2F1 überexprimiert werden

konnte. Durch einen Western-Blot mit Zelllysaten aus 1A3-Zellen mit bzw. ohne 4-

Hydroxytamoxifen-Induktion konnte ich zeigen, dass E2F1 Bmi1 auf Proteinebene

induziert. Durch Blockierung der Proteinbiosynthese durch Cycloheximid konnte ich

in 1A3-Zellen mit einen Western-Blot und einen Luciferaseassay nachweisen, dass

E2F1 Bmi1 auf direktem Weg stimuliert.

Um zu untersuchen, ob die E2F1 Bindungsstelle im Bmi1-Promotor verantwortlich

für die Überexpression von Bmi1 nach E2F1-Stimulus ist, habe ich die E2F1-

Bindungsstelle im Bmi1-Promotor punktmutiert. Das Ergebnis dieser Reporterstudien

ist, dass die E2F-Bindungsstelle im Bmi1-Promotor verantwortlich für die Induktion

von Bmi1 nach E2F1 Stimulus ist. Die Überexpression von E2F1 in

Neuroblastomzellen führt zur Induktion von Bmi1 (Nowak, 2006).

5.2 BEDEUTUNG VON BMI1 IN DER TUMORGENESE

BMI1 scheint kein klassisches E2F1 Zielgen zu sein, denn BMI1 wird in vielen

Tumoren nicht zellzyklusabhängig beeinflusst.

Die Induktion von BMI1 durch E2F1 ist an die Deregulation von E2F geknüpft, so

wie es auch bei anderen E2F-Zielgenen (z.B. ARF) beobachtet wird (Aslanian, 2004).

92

Überexprimiertes Bmi1 kann in einer Vielzahl von Tumoren gefunden werden

(Molofsky, 2003; Kim, 2004; Bea, 2001; Vonlanthen, 2001; De Vos, 2002). In

doppel-transgenen Mäusen mit Lymphomen kann eine Kooperation zwischen Bmi1

und Myc gezeigt werden. Bmi1 reprimiert hier die durch Myc-induzierte Apoptose

(Jacobs, 1999). In Neuroblastomen induziert N-Myc durch verschiedene Stimuli die

Apoptose (Lutz, 1998; Fulda, 1999). In Analogie zu der Rolle in Lymphomen wäre

auch in Neuroblastomen eine durch Bmi1 blockierte N-Myc-induzierte Apoptose,

vorstellbar. So wäre die Deregulierung von E2F1 im Hinblick auf seine beiden

direkten Zielgene BMI1 und MYCN in doppelter Hinsicht fatal. Bei der Aktivierung

würden sich zwei positiv verstärkende Aktivierungsschleifen bilden: Zum einem

induziert E2F1 nicht nur MYCN, sondern MYCN ist auch in der Lage E2F1 zu

aktivieren (Leone, 2001; Beier, 2000). Zweitens: BMI1 reprimiert INK4a und

induziert auf diesem Weg die Phosphorylierung vom Retinoblastoma-Protein und die

Aktivierung von E2F (Jacobs, 1999). Im Gegensatz zum PRC2-Komplex (zweiter

Polycomb-Komplex), in dem mehrere Untereinheiten durch E2F1 induzierbar sind,

scheint Bmi1 der einzige Teil des PRC1-Komplexes zu sein (erstes Polycomb-

Komplex), der durch E2F1 reguliert wird. Weder Mel18, noch Hpc2 oder Ring1

werden durch E2F induziert.

Das Verhältnis von Bmi1 zu Hpc2 hat wesentliche Auswirkung auf die biochemische

und biologische Funktion des Komplexes (Dahiya, 2001). Nach diesem Model würde

ein Bmi1-dominanter Komplex Ink4a reprimieren, während das Überwiegen von

Hpc2 im Komplex zum Zellarrest durch Repression von E2F-Zielgenen führen würde.

Nach diesem Model würde also die selektive Induktion von Bmi1 durch E2F1 in

diesem Komplex zu einer Proliferation der Zellen führen.

Bmi1 ist sowohl für die Proliferation und die Selbsterneuerung von erwachsenen

hämatopoetischen und neuronalen Stammzellen (Lessard und Sauvageau, 2003; Park

und Clarke, 2003; Molofsky und Morrison, 2003; Iwama, 2004; Leung, 2004; Zencak,

2005), als auch für die Proliferation von Tumorstammzellen notwendig (Valk-

Lingbeek und van Lohuizen, 2004). Die Deletion von Ink4a oder Arf in Bmi-/-

Mäusen führt zum Wiedereintreten der, durch das Fehlen von Bmi1 blockierten

Erneuerung von neuronalen Stammzellen (Molofsky und Pardee, 2005).

Welche Aufgabe hat die Induktion von Bmi1 durch E2F1 in Neuroblastomen auf die

Zellzyklusregulation?

Um diese Frage beantworten zu können, habe ich zwei Versuchsansätze gewählt.

93

Zum einen habe ich die Reprimierung von BMI1 durch siRNA erreicht. Zunächst

wurde die siRNA stabil in 1A3-Zellen transfiziert. Dieser Ansatz war aufgrund von

einem Wachstumsarrest der Zellen für die weitere funktionelle Analyse von Bmi1

nicht geeignet. Weiterhin konnte ich beobachten, dass in den Zellen, in denen Bmi1

reprimiert vorlag, auch morphologische Veränderungen auftraten. Diese Zellen

zeigten eine Verschmälerung der Zellkörper, sowie eine Ausbildung von axonalen

Ausläufern. Aufgrund des Wachstumsarrests und der damit verbundenen Probleme

für die weitere funktionelle Analyse der Klone, habe ich die siRNA gegen BMI1

tetrazyklininduzierbar in die 1A3-Zellen eingebracht. Im anschließend durchgeführten

Western-Blot konnte eine deutliche Reduktion der Expression von Bmi1 in siRNA-

Klonen im Vergleich zu nicht-induzierten Klonen, beobachtet werden.

Der zweite Ansatz zur Repression von Bmi1 ergab sich durch ein dominant-negatives

Allel gegen Bmi1. Auch in diesem System wiesen die Zellen nach stabiler retroviraler

Infektion mit dem dominant-negativen Allel einen Wachstumsarrest auf, so dass auch

dieses Zellsystem, TET-induzierbar dargestellt wurde. Zwei unterschiedliche

dominant-negative Bmi1-Klone habe ich in der Durchflußzytometrie unter jeweils

vier verschiedenen Induktionsbedingungen analysiert (1. keine Induktion; 2.

Induktion mit 4OHT; 3. Induktion mit TET; 4. Induktion mit 4OHT und TET). Die

Durchflußzytometrie zeigte, dass die Zellen, in denen E2F1 durch 4OHT induziert

wurde, sowohl vermehrt S-Phase, als auch vermehrt Apoptose aufwiesen. In Zellen,

in denen Bmi1 reprimiert vorlag, zeigten die Zellen weder eine Veränderung des

Anteils der Zellen in S-Phase, noch der Zellen, die Apoptose begingen. In den Zellen,

in denen sowohl E2F1 überexprimiert, als auch Bmi1 reprimiert vorlagen, konnten

lediglich die Effekte auf das Zellzyklusprofil beobachtet werden, die auch bei

alleiniger Induktion von E2F1 gesehen werden konnten: Induktion von S-Phase und

Apoptose. Die Repression von Bmi1 hat nach den Ergebnissen der FACS-Analyse

also weder einen Einfluss auf die S-Phase noch auf die Apoptose.

Cui und Mitarbeiter (2006) stellen in Neuroblastomzellen (BE(2)-C-Zellen) bei

Repression von Bmi1 ebenfalls einen Wachstumsarrest fest. Diese Arbeitsgruppe

sieht, genau wie auch in meinen Experimenten gezeigt, keinen Einfluss der Bmi1-

Reprimierung auf das Zellzyklusprofil. Den beobachteten Wachstumarrest wird

durch den Verlust des Potentials der neurologischen Stammzelle zur Selbsterneuerung

begründet (Cui, 2006). In diesem Potential der Stammzelle zur Selbsterneuerung wird

94

ein wesentlicher Grund der Neuroblastomzelle zur malignen Entartung gesehen (Cui,

2006).

Die in der Einleitung diskutierten Modelle zum Einfluss von E2F1 reguliertem Bmi1

auf die Induktion von S-Phase und Apoptose sind also wie folgt zu beurteilen:

Abb.20: Modell 1: Funktion von Bmi1 im Zellzyklus

E2F1 induziert Bmi1. Bmi1 hat aber weder Einfluss auf die Induktion von S-Phase noch auf die Induktion der Apoptose. Die

genaue Funktion von Bmi1 in der Zellzyklusregulation bleibt zunächst weiterhin offen.

Das zweite Modell zeigt einerseits die nachgewiesene Induktion von S-Phase und

Apoptose durch E2F1, aber auch, dass Bmi1 keinen Einfluss auf diese Effekte hat.

Die Aufgaben die Bmi1 im Zellzyklus hat, bleiben damit zunächst ungeklärt.

Abb. 21: Modell 2: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus

E2F1 induziert Apoptose und S-Phase. E2F1 induziert Bmi. Bmi1 scheint aber an der Vermittlung von Apoptose und S-Phase-

Induktion durch E2F1 keinen Anteil zu haben.

Sowohl Model 1 (Abb. 20), als auch Model 2 (Abb.21) zeigen, dass E2F1 Bmi1

induziert. E2F1 induziert dabei sowohl S-Phase, als auch Apoptose. Die Ergebnisse

meiner Arbeit geben einen Hinweis, dass die Reprimierung von Bmi1 zum

Wachstumsarrest führt und offensichtlich keinen Einfluss auf das Zellzyklusprofil, im

speziellen nicht auf S-Phase und Apoptose, hat. Eine mögliche Erklärung des

E2F1

Apoptose

S-Phase Bmi1

??? Potential zur Selbsterneuerung d.

Stammzelle???

Apoptose

S-Phase

Bmi1

E2F1

???Potential zur

Selbsterneuerung d.

Stammzelle???

95

beobachteten Wachstumsarrests bei Bmi1-Reprimierung wäre ein Verlust des

Potentials der Neuroblastomzellen zur Selbsterneuerung (Cui, 2006).

Sowohl das siRNA- als auch das ∆-Ring-Finger-System wiesen allerdings ein

Problem auf: Bei der Austestung der siRNA-Klone im Western-Blot konnte zwar

gezeigt werden, dass nach der Induktion durch Tetracyclin die Bmi1-Proteinmenge in

den entsprechenden Zellen im Vergleich zu den nicht induzierten Zellen drastisch

absank, es musste aber auch festgestellt werden, dass eine Restaktivität an Bmi1

blieb. Da es nicht bekannt ist, welche Menge an Bmi1 in der Zelle notwendig ist, um

die entsprechenden Zielgene von Bmi1 zu induzieren, kann die Frage nicht

abschließend geklärt werden, ob die Reprimierung von Bmi1 doch Auswirkungen auf

den Zellzyklus hat.

Ein ähnliches Problem stellte sich auch in den ∆-Ring-Finger Klonen dar; auch in

diesem System ließ sich eine Überexpression der ∆-RF-Mutante nach

4Hydroxytamoxifen-Stimulus beobachten. Es ließ sich durch den Bmi1 Western-Blot

nur zeigen, dass das dominant negative Allel, in unserem Fall die Bmi1-∆-RF-

Mutante, exprimiert wurde. Es konnte aber nicht nachgewiesen werden, dass die

Funktion vom endogenen Bmi1 reprimiert wurde. Die Wirkung der ∆-RF-Mutante

zeigte sich erst auf der Stufe der Zielgene, in unserem Fall der Bmi1-Zielgene. Es ist

bekannt, dass Bmi1 p16 reprimiert. Würde die ∆-RF-Mutante eine reprimierende

Wirkung auf die Bmi1-Zielgene, wie z.B. p16 haben, dann müsste p16 in den

Tetrazyclin induzierten (Bmi-reprimierten) Zellen dereprimiert vorliegen.

Die Wirkung der ∆-RF-Mutante auf die Zielgene wurde im eigenen Labor anhand

eines p16-Western-Blot mit Zelllysaten von induzierten bzw. nicht induzierten ∆-RF-

Klonen dargestellt. Wie erwartet zeigte sich in den Tetrazyclin-induzierten Zellen

eine Derepression von p16 (Daten aus eigenem Labor). Durch diesen p16-Western-

Blot konnte gezeigt werden, dass die Expression der ∆-RF-Mutante in den

entsprechenden Klonen ausreichte, um Zielgene von Bmi1 zu beeinflussen. Ob eine

vollständige Derepression von p16 erreicht wurde, konnte durch den Western-Blot

nicht gesagt werden. Es kann also auch in diesem Fall nicht sicher gesagt werden, ob

die ∆-RF-Mutante die Wirkung des endogene Bmi1 auf die Zielgene so effektiv

reduzieren kann, dass das endogene Bmi1 faktisch „ausgeschaltet“ wird.

Trotz dieser Unsicherheit bekamen wir zumindest durch diese Versuche einen

Hinweis, dass Bmi1 zwar wahrscheinlich keinen Einfluss auf den Zellzyklus, vor

96

allen nicht auf die Induktion von Apoptose oder S-Phase hat. Durch die gezeigten

Ergebnisse und den oben genannten Verbindungen zu anderen Onkogenen, steht

Bmi1 weiterhin im Verdacht, das Potential zur Selbsterneuerung der neurogenen

Stammzelle aufrechtzuerhalten und damit einen wesentlichen Anteil an der

Entstehung von Neuroblastomen zu haben.

Zur genaueren Untersuchung der Wirkung von Bmi1 wird es nötig sein, mittels eines

cDNA-Microarrays die Genexpressionsänderung zu identifizieren, die aus der

Inaktivierung von Bmi1 resultieren. Dabei werden vier verschiedene

Induktionsbedingungen der Zellen im Microarray untersucht:

1.) nicht induzierte Zellen

2.) Zellen mit überexpremierten E2F1

3.) Zellen mit reprimierten Bmi1

4.) Zellen mit überexpremiertem E2F1 und reprimiertem Bmi1

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7 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 (modifiziert nach Jacobs und van Lohuizen; 2002): Regulation der

Proliferation hämatopoetischer Stammzellen (Seite 14)

Abbildung 2: Induziert Bmi-1 nach E2F-1 Stimulation S-Phase und Apoptose? (Seite

21)

Abbildung 3: Western-Blot: Bmi-1 nach E2F-1 Induktion (Seite 64)

Abbildung 4: Modelle: Ist die Induktion von Bmi-1 durch E2F-1 ein direkter oder ein

indirekter Effekt? (Seite 66/67)

Abbildung 5: RT-PCR: Induziert E2F-1 BMI-1 direkt oder indirekt? (Seite 68)

Abbildung 6: Der Promotor des BMI-1-Gens enthält eine E2F-1 Bindungsstelle

(Seite 68)

Abbildung 7: Luciferase-Assay in Shep-Zellen: Ist die E2F-1-Bindungsstelle im

BMI-1-Promotor verantwortlich für die Induktion von Bmi-1 nach E2F-1 Stimulus?

(Seite 69)

Abbildung 8: Lucifersase-Assay: Ist N-Myc in Neuroblstomzellen durch Bmi-1

induzierbar? (Seite 70)

Abbildung 9: RT-PCR im Echtzeitgerät: Austestung der siRNA gegen Bmi-1 im

transienten Versuchsansatz (Seite 72)

Abbildung 10: Koloniebildungsversuch in 1A3-Zellen 20 Tage nach stabiler

Transfektion verschiedener siRNAs gegen BMI-1 (Seite 73)

Abbildung 11: Western-Blot von 1A3-Zellen: Lässt sich Bmi-1 durch stabil

transfizierte siRNA reduzieren? (Seite 75)

Abbildung 12: Model: Induzierbare RNA-Interferenz von BMI-1. (modifiziert nach:

Brummelkamp und Agami, 2002). (Seite 77)

Abbildung 13: Luciferase-Assays: Austestung der TET-Repressor-Klone (Seite 78)

Abbildung 14: Western-Blot: Bmi-1 (ca. 54kDa) lässt sich im TET-on-System

runterregulieren (Seite 78)

Abbildung 15: Western-Blot: Lässt sich die –RF-Mutante im TET-induzierbaren

System nachweisen? (Seite 80)

Abbildung 16: FACS-Analyse des TET-induzierbaren siRNA5/6 Klon2 (Seite 81)

Abbildung 17: FACS-Analyse des TET-induzierbaren siRNA5/6 Klon12 (Seite 82)

120

Abbildung 18: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät: HTERT-Kinetik nach Bmi-1

Induktion (Seite 84)

Abbildung 19: Quantitative RT-PCR im Echtzeitgerät zur Untersuchung der

Expression von BMI-1 in RB-knock-out MEFs (Seite 85)

Abbildung 20: Modell 1: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus (Seite 88)

Abbildung 21: Modell 2: Funktion von Bmi-1 im Zellzyklus (Seite 88)

121

8 Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Ak, α Antikörper

ALLN N-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal

APS Ammoniumperoxodisulfat

ATP Adenosin-5’-triphosphat

BAC bacterial artficial chromosome

BrdU 5-Bromo-2-Desoxyuridin

BSA bovine serum albumin

CDK cyclin dependent kinase

CGH comparative genomic hybridization

Chx Cycloheximid

CMM cellular memory moduls

CMV Cytomegalievirus

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytosintriphosphat

dGTP Desoxyguanidintriphosphat

DNA Desoxyribo Nucleic Acid

dTTP Desoxythymidintriphosphat

DP Dimerisationspartner Proteinen

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGFP enhanced green fluorescent protein

EtOH abs. Ethanol absolut

FACS Fluorescence activated cell sorting

122

FCS Fetales calvserum

HDAC Histondeazetylasen

HOX Homeobox

hPRC humane Polycomb Repressive Complex

IL Interleukin

In Input

IP Immunpräzipitation

kDa KiloDalton

LDH Lactatdehydrogenase

LUC Luciferase

MEF mouse embyonic fibroblast

MIBG Metjodbenzylguanidin

min Minuten

mRNA messanger Ribo Nucleic Acid

mut Mutante

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

NB2004 Neuroblastom2004 (aktuelle deutsche Neuroblastomstudie)

NME N-Ethylmaleimid

NSCLC non small-cell lung cancer

NSE Neuronenspezifische Enolase

OD Optischen Dichte

4-OHT 4-Hydroxytamoxifen

ONPG Ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

Pc Polycomb

PcG Polycomb group

123

PcGm Polycomb group maintenance complex

PcGi Polycomb group initiating complex

PCR polychainreaction

Ph polyhomeotic

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PRE Polycomb Response Elemente

PSC posterior sex combs

PVDF Polyvinylidenfluorid

Rb Retinoblastom

RF Ring finger

RNA ribo nucleic acid

RT-PCR real-time polychain reaction

shRNA short hairpin RNA

siRNA small interfering RNA

TEMED tetramethylendiamin

TET Tetrazyklin

Trk Tyrosinkinase

Trx Thrithorax

UV ultaviollet

WB Western-Blot

Wt Wildtyp

124

9 Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrer in Marburg waren folgende Damen und Herren, denen

ich danke:

Dr. J. Adamkiewicz Dr. Jackowski-Dohrmann Prof. Dr. Dr. H.

Remschmidt

Prof. Dr. med. R. Arnold Prof. Dr. H. Junclas Prof. Dr. H. Renz

Prof. Dr. G. Aumüller Prof. Dr. H. F. Kern Prof. Dr. G. Richter

Dr. H. Barth Dr. H.-S. Kim-Berger Prof. Dr. H. Schäfer

Prof. Dr. P.J. Barth

Prof. Dr. G. Klaus Prof. Dr. H. Schmidt

Prof. Dr. Dr. H.D. Basler Prof. Dr. H.D. Klenk PD Dr. Schnabel

Prof. Dr. E. Baum Prof. Dr. J. Koolman T. Schneyer

PD. Dr. H. Becker Prof. Dr. J.C. Krieg Prof. Dr. J. Seitz

Dr. E. Bergmann Prof. Dr. P. Kroll Prof. Dr. B. Steiniger

Prof. Dr. H. Christiansen Prof. Dr. R.E. Lang Dr. S. Stiller

Prof. Dr. F. Czubayko PD Dr. A. Leonhardt Dr. H.W. Vohland

Prof. Dr. M. Eilers Prof. Dr. R. F. Maier Prof. Dr. K. Voigt

Dr. B. Feuser Prof. Dr. B. Maisch Prof. Dr. S. Waldegger

PD Dr. Gerdes Dr. Dr. K. Mandrek Prof. Dr. E. Weihe

Prof. Dr. A. Geus Prof. Dr. R. Moll Prof. Dr. J.A. Werner

Prof. Dr. L. Gotzen Prof. Dr. Dr. U. Mueller Prof. Dr. H. Wulf

Prof. Dr. P. Griss Prof. Dr. R. Mutters Dr. M. Zemlin

Prof. Dr. R. Happle Prof. Dr. B. Neumüller

Prof. Dr. R. Hofmann Prof. Dr. W.H. Oertel

125

10 Tabellarischer Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Kornelius Tobias Kerl

Anschrift: Coerdestr. 52

48147 Münster

Geburtsdatum: 02.01.1979

Geburtsort: Delmenhorst

Schulbildung:

1985 – 1989: Grundschule am grünen Kamp in Delmenhorst

1989 - 1991: Orientierungsstufe Süd in Delmenhorst

1991-1998: Gymnasium an der Max-Planck-Straße

Schulabschluss: Allgemeine Hochschulreife mit der Note 2.4

Hochschulstudium:

Fachrichtung: Humanmedizin

Universität: Philipps-Universität Marburg

Zeitraum: 08/2000-04/2006

Physikum: 03/2002; Note „gut“ (2.0)

1.Staatsexamen: 03/2003; Note „gut“ (2.0)

2.Staatsexamen: 03/2005; Note „gut“ (1.66)

3.Staatsexamen: 06/2006; Note „gut“ (2.0) [Gesamtnote „gut“ (1,8)]

Thema der Doktor-

arbeit:

„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären

Neuroblastomen“

am Institut für Molekularbiologie und Tumorforschung in

Marburg

126

Praktische Tätigkeiten:

07.1998-08.1999 Zivildienst als Rettungssanitäter beim Malteser Hilfsdienst

Delmenhorst

09.1999-11.1999 Pflegepraktikum in der Orthopädischen Klinik Stenum

08.2001-09.2001 Famulatur in der Inneren Medizin am Diakonie Krankenhaus

Werda

03.2002-04.2002 Famulatur in der Chirurgie am Kaiser-Franz-Josef

Krankenhaus Wien

04.2002-05.2002 Famulatur in der Schwerpunktpraxis für Diabetes, Praxis Dr.

Eidenmüller, Marburg

08.2003-09.2003 Famulatur in der Kinderheilkunde in der Prof.-Hess-

Kinderklinik, Bremen

09.2003-07.2004 Doktorarbeit am Institut für Molekularbiologie und

Tumorforschung in Marburg bei Prof. Dr. Martin Eilers;

Thema: „BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären

Neuroblastomen“

04.2005-08.2005 1.Tertial des Praktischen Jahres: Kinderheilkunde in der

Universitätskinderklinik Marburg

08.2005-12.2005 2. Tertial des Praktischen Jahres: Chirurgie im King-Edward

Hospital in Durban (Südafrika)

12.2005-03.2006 3. Tertial des Praktischen Jahres: Innere Medizin im Salem-

Spital in Bern (Schweiz)

Seit 01.08.2006 Assistenzarzt der Pädiatrie am Universitätsklinikum Münster

127

11 Danksagung

Danken möchte ich allen, die an der wissenschaftlichen Verwirklichung dieser Arbeit

beteiligt waren.

Ganz besonderer Dank gilt:

Martin Eilers, Werner Lutz, Daniel Fehr, Sven Gallinat, Jens-Peter Reese, Sovana

Adhikary, Kathrin Killmer, Kathrin Nowak, Michael Wanzel, Holger Christiansen,

Bernd Berwanger, Eckhard Bergmann.

Weiterhin möchte ich all denen danken, die mich weniger wissenschaftlich, als auf

vielen anderen Wegen immer unterstützt haben:

Renate Kerl-Haevke, Wolf-Dieter Kerl, Katharina Kerl, Kristoff Kerl, Daniela Deppe,

Philipp Engel und Vianca Pillay.

128

12 Ehrenwörtliche Erklärung

„ Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Medizin Marburg zur

Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel „BMI-1 ist ein direktes Zielgen

von E2F-1 in primären Neuroblastomen“ im Institut für Molekularbiologie und

Tumorforschung unter der Leitung von Prof. Dr. Rolf Müller mit Unterstützung von

Prof. Dr. Martin Eilers und PD Dr. Werner Lutz ohne sonstige Hilfe selbst

durchgeführt und bei der Abfassung der Arbeit keine anderen als die in der

Dissertation aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe. Ich habe bisher an keinem in- oder

ausländischen Medizinischen Fachbereich ein Gesuch um Zulassung zur Promotion

eingereicht, noch die vorliegende oder eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.

Vorliegende Arbeit wurde in folgenden Publikationsorganen:

„Nucleic Acids Research, March 2006; Nowak, K.; Kerl, K.; Fehr, D.; Kramps, C.;

Gessner, C.; Killmer, K.; Samans, B.; Berwanger, B.; Christiansen, H.; Lutz, W.;

mit dem Titel „BMI1 is a target gene of E2F-1 and is strongly expressed in primary

neuroblastomas.“ veröffentlicht.

„BMI-1 ist ein direktes Zielgen von E2F-1 in primären ...

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