Life  in  crowded  and  disordered  environments  

Lecture 18: Crowding Rädler/Lipfert  SS  2014  

Biophysics  of  Macromolecules    

8.  Juli.  2014  

Summary:  Life  at  low  Reynoldsnumbers  

G.  Taylor    

Bacteria  move  like  screw  drivers        

Bacteria  are  like  fish  in  thick  honey  

Re(bacteria)=10-­‐8  

The friction coefficient of rigid bodies

€

F = −γ⊥ ⋅ v

€

M = −γ r ⋅ω

From  Howard,  2001  

TranslaHon  

RotaHon  

Drive  through  anisotropy  of  fricEonal  force  

fricHon  Propulsive  force  

From  Sackmann  2010  

Bakterien  und  Spermien  schrauben  sich  durch  Wasser    

ps ζζ 2≈s

p

AchsezusenkrechtibungAchsezuparallelibung

ObjekteeStabförmig

ζ

ζ

ReRe

Taylor  Gleichung:   UqaKqaKqAv

2/1)()2/1)(

21

0

022

+−

=

K0  Bessel  FunkHonenKraP  ist  Effekt  zweiterOrdnung  From  Sackmann  2010  

Wie  effizient  ist  Diffusion  als  Transport  ?    

Die  Welt  kleiner  Péclet  Zahlen  ist  durch  Diffusion  homogenisiert  

Bakterium : v ≈ 1µm/s, d ≈ 1µm, D(Wasser) ≈ 1µm2/ms=10-9m2/s => Pe ≈ 10-3

€

Pe =Diffusionszeit

Driftzeit=vd

D

Experiment  :  Die  Diffusionsuhr  

Die  Péclet  Zahl  gibt  das  Verhältnis  von  KonvekHon  und  Diffusion  an.  

€

dc

dt= D

d2c

dx2

€

c(t) =N

4πDt( )3 2

e−x

24Dt

Diffusions-­‐  Gleichung  

€

σ 2(x) = 2Dt

v  

d  

1.6  mm  ≈  0.75h      (eine  Schulstunde)  2.5cm  ≈  7d      (eine  Woche)  12,8cm  ≈  27  Wochen      (ein  Schulhalbjahr)  

Das Paradox der DNA Replikation

Drehmoment

Mechanischer Reibungsverlust:

Umdrehungsfrequenz: ω=600s-1

€

M = 4π ωηR2L

€

Wfric = −Mω( ) ω 2π( ) = 8π 2 ωηR2L

≈ 2 ⋅10−17Jm−1( ) ⋅ L

L=6000bp

ATP Hydrolyse bringt 8,2 10-20J => L kann bis zu 2mm lang sein !

Kann die DNA Helicase gegen die Reibung ankommen ?

   Crowding - why is it important ?

Crowding  alters  Biochemical  Equilibria  

Crowding  alters  the  KineHcs  within  Cells  

§  Excluded  volume  forces  §  Binding  staHcHcs  

§  Slowing  of  diffusion  

Examples  of  dense    filament  architectures  

acHn  Axon  Nerve  cell  

Aligned  collagen  

Bundles  of  cellulose  

AcHn  filaments  

Collagen  matrix   Strands  o  

Sugar  Cell  wall  Of  gram  NegaHve  bacteria  

Mat  of  Collagen  and  proteoglycans  (Hssue  cells)  

AcHn  filaments  at  the  leading  edge  of  a  crawling  cell  

Das Ausschlußvolumen

•  Die einfache Betrachtung als random walk ergab für den End-zu-End-Abstand eines Polymerknäuels:

r2

= N ⋅ l2

•  Flory löste das Problem durch eine einfache heuristische Betrachtung: Wenn 2 Monomere überlappen, dann stoßen sie sich ab. Die Wahrscheinlichkeit, daß 2 Monomere am selben Ort liegen wächst mit dem Quadrat der Konzentration der Monomere.

W = vkBT ⋅c

m

2

Energiedichte: cm=

N

r2

3

W = vkBT ⋅

N2

r26

€

EAusschluß =W ⋅ r2

3

= vkBT ⋅N2

r2

3

Mittlerer End-zu-End-Abstand wird als Maß für den Radius des Polymers genommen

•  Problem: Das Polymer kann sich nicht selbst durchdringen. Deshalb müßte der mittlere quadratische End-zu-End-Abstand größer sein.

•  Die Ausschlußenergie treibt das Polymerknäuel auseinander. Diese Kraft muß jetzt durch die entropische Kraft ausgeglichen werden, die das Knäuel zusammentreibt.

EAusschluß = W ⋅ r23

= vkBT ⋅N2

r 23

FAusschluß =∂EAusschluß

∂ r2= −vkBT ⋅ 3 ⋅

N2

r 24

Fentr

≅3kT

N ⋅l2⋅ r

2

3kT

N ⋅ l2⋅ r

2− vk

BT ⋅3 ⋅

N2

r24 =!

0

1

l2⋅ r

25

= −v ⋅N3

r2∝ N

3

5 r2∝ N

0.5

im Gegensatz zu:

D:  Distance  

osmoHc  pressure  of  the  small  beads  

n:  parHcle  conc.  N/V  

Experiments  by  Yodth  et  al    see  als  Phillips  et  al  page  526  

DepleEon  forces  

Steric stabilisation depletion interaction

Entropic forces

Lajce  Model  of  Biochemical  Binding  Equilibrium  

Zsol (L,C) =Ω!

L!C!(Ω− L −C)!e−βLεL

Sol

e−βCεCSol

pbound =1

1+ (Ω− L −C L) ⋅eβΔεLSol

FracEon  bound  vs.  ligand  conc  

DissociaEon  constant  vs.  volume  fracEon    

Kd (ΦC )Kd (ΦC = 0)

= (1−ΦC )r

Crowding  reduces  the  dissociaHon  constant  Depending  on  size  raHo  crowder/ligand=r  

Colloidal  Glass  TransiHon  

from  Eric  Weeks  

Phase  diagram  of  monodisperse  hard-­‐spheres  as  a  funcHon  of  volume  fracHon,  φ.  

20  

How is diffusion affected by the presence of spheres ?

•  Vesicles occupy up to 30 % volume fraction Φ

•  Theory predicts an „effective“ viscosity of the medium due to hydrodynamic interactions

(Einstein Formula)

(Krieger Dougherty)

Relative viscosity of colloids vs volume fraction

polystyrene beads (Krieger 1972)

silica beads in cyclohexane (de Kruif 1986)

From  Jones:  soP  maler  

Shear thinning

supercooled

Confocal microscopy

glassy π =0.61

Tracer  diffusion   Self  diffusion  

Diffusion  of  proteins  in  crowded  protein  soluHon  

LeP:.  BSA  (fileld  cirlces),  ribonuclease  (filled  squares)  Right:  myoglobin  (white  circles),  hemoglobin  (black  circles)  

Minton  1993  (nach  R.  Philps)  

Die Kontrolle der Transkription in Eukaryontenzellen ist komplex:"

•  Eukaryontische RNA-Polymerasen benötigen "Allgemeine Transkriptionsfaktoren“"

•  Eine eukaryotische Gen-Kontrollregion besteht aus einer Promotor plus Regulator-DNA-Sequenzen"

•  Verstärker-Elemente regulieren Gene in Abstand"

Zeitskala der Suche nach der Bindungsstelle

€

D =kT6πηR

€

P(r,t) =14πtD

exp − r2

4Dt$

% &

'

( )

€

tdiffusion =d2

2D

Stokes Einstein Gleichung (z.B. DGFP=3-7µm2/s)

Wahrscheinlichkeitsverteilung

1µm

Typische Zeitskala dass ein Protein einen beliebigen Punkt in E.coli findet : tD ≈ 0.1s

Diffusion to an adsorbing disk

€

J = −D4πr2 dCdr

€

dCdt

=1r2D ddr

4πr2 dCdr

#

$ %

&

' (

€

C(r) =J

D4πr+ C(∞)

€

C(∞) = N V

€

C(ε) = 0

€

J = 4πεDNV

€

τ on =V

4πDεN≈ 20s N

Verweildauer der Transkriptionsfaktoren

€

1τ off

=1τ on

V ⋅ exp ΔG kT( ) = 4πDε M[ ] ⋅ exp ΔG kT( )

(mit τon=20s/N folgt, dass 1Molekül in 1µm3 einen Operator gerade halb besetzt)

für spezifische Bindungsstellen (Operator) mit 1M-1=1.6nm3 and ΔGspez=-12.6kcal/mol, ε=1 folgt

€

τ off ≈ 20s

für  unspezifische  Bindungsstellen  mit  ΔGuspez=-­‐10-­‐4  kcal/mol,  

€

τ off ≈10−4 s

Die Suche auf dem DNA Strang

€

τ =L2

2D1≈ 200.000s ≈ 2Tage

Unspezifische Bindung von TFs and DNA ist ein Problem, da die Suche auf nach der Bindungsstelle auf dem Strang länger dauert. Wenn die Verweildauer unendlich wäre, würde ein ein-dimensionaler random walk

dauern (L=1.5mm und D1≈D)

Die Suche auf der DNA wird durch „Sprünge“ auf benachbarte DNA Stränge beschleunigt

€

τ ≈l2

D1

$

% &

'

( ) ⋅Ll≈LlD1

Mit L=1.5mm, l=150nm folgt

€

τ ≈ 50s

Verstärker (Enhancer) „wirken auf Distanz“

W. Su et al PNAS (1990)

Schleifenbildung erhöht die Wechselwirkung

Van Hippel

Beispiel: NtrC (nitrogen regulatory Protein C)

a transcription factor that activates a variety of genes that are involved in nitrogen utilization by contacting simultaneously a binding site on the DNA and RNA polymerase complexed with the σ54 sigma factor at the promoter.

from enteric bacteria :

Distribution of DNA loops formed of NtrC and Pol

W. Su et al PNAS (1990)

J. Mol. Biol. (1997) 270, 125-138

Die F0 -F1 ATPase ist der kleinste Rotationsmotor der Welt"

D. Müller et al. ‘00"

Wie kann man die Antriebskraft Eines so kleinen Motors messen ?

Reibungskraft als Maß zur Messung molekularer Motoren

Der F0 Rotor ist ein „Schrittmotor“

Diskrete Sprünge in der Umdrehung