Aus dem Veterinärwissenschaftlichen Department

der Tierärztlichen Fakultät

der Ludwig-Maximilians-Universität München

Arbeit angefertigt unter der Leitung von

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. vet. Thomas Göbel

Charakterisierung von Hühner CRTAM

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde der

Tierärztlichen Fakultät

der Ludwig-Maximilians-Universität München

von Maria Zechmann

aus Hutthurm

München 2014

Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät

der Ludwig-Maximilians-Universität München

Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun

Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Göbel

Korreferent: Univ.-Prof. Dr. Dr. Michael Erhard

Univ.-Prof. Dr. Rolf Mansfeld

Univ.-Prof. Dr. Rüdiger Korbel

Univ.-Prof. Dr. Kaspar Matiasek

Tag der Promotion: 08. Februar 2014

In Liebe und Dankbarkeit meinen Eltern gewidmet

Inhaltsverzeichnis IV

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG ............................................................................................ 1

2. ZIELSETZUNG ......................................................................................... 3

3. LITERATURÜBERSICHT ...................................................................... 4

3.1 Nectine und Nectin-ähnliche Proteine..........................................................4

3.1.1 Nectine .........................................................................................................4

3.1.2 Necls .............................................................................................................5

3.1.3 Funktionen ....................................................................................................6

3.1.4 Bindung und Bindungspartner .....................................................................9

3.2 Ig-ähnliche Rezeptoren die an Nectine und Necls binden .........................10

3.2.1 CD96 ..........................................................................................................10

3.2.2 CD226 ........................................................................................................11

3.2.3 TIGIT .........................................................................................................12

3.2.4 CRTAM ......................................................................................................14

3.3 CRTAM beim Huhn ...................................................................................16

4. PUBLIKATION ....................................................................................... 18

5. DISKUSSION ........................................................................................... 53

6. ZUSAMMENFASSUNG ......................................................................... 59

7. SUMMARY............................................................................................... 61

8. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................ 62

9. DANKSAGUNG ....................................................................................... 71

1. Abkürzungsverzeichnis 1

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

APC antigen presenting cell

CADM cell adhesion molecule

CAM cell adhesion molecule

CASK calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase

CEA carcinoembryonic antigen

CRTAM class I restricted T cell associated molecule

cTADS chicken thymic activation and developmental sequence

CTLA4 cytotoxic T-lymphocyte antigen 4

DAL1 differentially expressed in adenocarcinoma of the lung

DAP-12 DNAX activation protein of 12 kDa

DC dendritic cell

DNAM1 DNAX accessory molecule 1

FcεRIγ γ-subunit of the high-affinity IgE receptor

HIV1 Humanes Immundefizienz-Virus 1

HSV Herpes simplex Virus

IEL intestinale intraepitheliale Lymphozyten

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IGSF immunoglobulin superfamily member

IL Interleukin

ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif

ITIM immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif

JAM junctional cell adhesion molecule

LFA-1 lymphocyte function-associated antigen 1

MAGUK membrane-associated guanylate kinase

MPP3 membrane palmitoylated protein 3

Muc-18 Mucin-18

MUPP1 multiple PDZ domain protein 1

MV Masernvirus

NCAM neural cell adhesion molecule

Necl Nectin-like

NKT-Zelle Natürliche Killer-T-Zelle

NK-Zelle Natürliche Killerzelle

Pals2 protein associated with Lin-7 2

Par-3 partitioning defective 3 homologue

PATJ Pals-1 associated tight junction protein

PDZ postsynaptic density 95/discs large/zona occludens-1

1. Abkürzungsverzeichnis 2

PICK1 protein interacting with protein kinase C alpha 1

PRR poliovirus receptorlrelated protein

PTA1 platelet and T cell activation antigen 1

PV Poliovirus

PVR poliovirus receptor

PVRL 2 poliovirus receptor-related 2

SHIP src-homology 2-containing inositolpolyphosphat-5'-phosphatase

SHP src homology phosphatase

SYNCAM synaptic cell adhesion molecule

Tactile T cell activation, increased late expression

TAGE4 tumor associated glycoprotein E4

TCR T cell receptor

Tctex-1 T-complex-associated-testis-expressed 1

TIGIT T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains

TLiSA1 T lineage-specific activation antigen 1

TSLC tumor suppressor in lung cancer

TSLL tumor suppressor in lung cancer like

VSTM3 V-set and transmembrane domain-containing protein 3

WUCAM Washington University cell adhesion molecule

1. Einleitung 1

1. EINLEITUNG

Das Immunsystem hat sich dahingehend entwickelt, starke Immunantworten

gegen Pathogene auslösen zu können, ohne eine überschießende Immunreaktion

und somit Autoimmunität zu erzeugen. Ermöglicht wird dies durch ein

Zusammenspiel von stimulatorischen und inhibitorischen Rezeptoren in

Kombination mit kostimulatorisch wirkenden Rezeptoren, welche zur Regulation

des Immunsystems und zur Feinabstimmung immunologischer Abläufe beitragen.

Leukozyten weisen eine Vielzahl solcher aktivierender und hemmender

Signalwege auf, welche miteinander interagieren, um das homöostatische

Gleichgewicht aufrecht zu erhalten und die zelluläre Antwort auf diverse Stimuli

zu modulieren. Die ihnen vorgeschalteten Rezeptoren zeichnen sich dabei durch

ganz charakteristische Merkmale aus.

Hemmende Rezeptoren besitzen einen langen zytoplasmatischen Anteil mit einem

charakteristischen immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM), eine

sechs Aminosäuren lange Sequenz, zusammengesetzt aus (I/V/L/S)-X-Y-X-X-

(L/V), wobei X irgendeine Aminosäure kennzeichnet [1]. Dieses wird nach

Ligandenbindung Tyrosin-phosphoryliert. Dabei wird eine Kaskade ausgelöst, in

der unter anderem Tyrosin-Phosphatasen, wie z.B. src homology phosphatase 1

und 2 (SHP-1 und SHP-2) sowie src-homology 2-containing

inositolpolyphosphat-5'-phosphatase (SHIP) rekrutiert werden [2]. Diese

inhibitorischen Rezeptoren sind auf der Zelloberfläche vorwiegend in

Kombination mit aktivierenden Gegenspielern exprimiert. Deren

zytoplasmatische Enden sind meist kurz und zeigen kein ITIM-Motiv. Sie

besitzen jedoch in ihrer transmembranen Region eine positiv geladene

Aminosäure, welche die Bindung von Adaptormolekülen wie z.B. γ-subunit of the

high-affinity IgE receptor (FcεRIγ), CD3δ oder DNAX activation protein of 12

kDa (DAP-12) vermitteln [3]. Diese Adaptormoleküle weisen ein

immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) auf, welches nach

Ligandenbindung an den Tyrosinresten phosohoryliert wird und somit Signale

übermittelt [4].

Die Rezeptoren können anhand ihrer extrazellulären Struktur unterschiedlichen

Gruppen zugeteilt werden. Ein oder mehrere Immunglobulin (Ig)-ähnliche

Domänen kennzeichnen Mitglieder der Ig-Superfamilie, wohingegen den C-Typ

Lectinen eine extrazelluläre Lectinstruktur zu eigen ist.

1. Einleitung 2

Während der letzten Jahre wurden große Bemühungen angestellt, dieses

Zusammenspiel immunmodulatorischer Signalwege zu charakterisieren und vor

allem die Feinabstimmung der Signale durch kostimulatorische Rezeptoren zu

untersuchen. Interessanterweise nehmen oft mehrere Rezeptor-Ligandenpaare

Einfluss auf denselben kostimulatorischen Weg, so z.B. CD28 und cytotoxic T-

lymphocyte antigen 4 (CTLA4), welche an B7.1 (CD80) und B7.2 (CD86) binden,

wobei CD28 positive und CTLA4 negative Signale vermittelt [5]. Seit einiger Zeit

ist ein neues Paar von Rezeptoren in der Diskussion, welches unter Umständen

auf ähnliche Weise wirken könnte: T cell immunoreceptor with Ig and ITIM

domains (TIGIT) als hemmender und CD226 als potentiell aktivierender

Rezeptor, welche beide um den Liganden CD155 konkurrieren [6]. Diese

Rezeptoren gehören zusammen mit CD96 und class I restricted T cell associated

molecule (CRTAM) zu einer Gruppe von Ig-Superfamilie-Molekülen, die nicht

nur immunmodulatorische Eigenschaften aufweist, sondern auch Zelladhäsion

vermittelt. Ihnen ist außerdem gemeinsam, dass sie an Familienmitglieder der

Nectin- und Nectin-like (Necl) Protein Familie binden, welche neben den

Cadherinen zu den cell adhesion molecules (CAMs) zählen und eine

Schlüsselrolle in verschiedensten biologischen Prozessen wie Zellpolarität,

Zellproliferation, Zellmigration, Zelldifferenzierung und Zelladhäsion spielen.

Auch sind sie beim Menschen in diverse pathologische Prozesse involviert, so

dienen einige Mitglieder beispielsweise als Virusrezeptoren oder sind in

Tumorgeschehen verwickelt [7, 8].

Auch im Hühnergenom können die Gene für CRTAM, CD96 und CD226

gefunden werden, wobei im Huhn die Funktionen dieser Rezeptoren im

Speziellen und die Mechanismen der Immunmodulation im Allgemeinen

weitgehend unerforscht sind.

2. Zielsetzung 3

2. ZIELSETZUNG

Ziel dieser Arbeit war es den Immunrezeptor CRTAM beim Huhn zu

charakterisieren, um zum einen mögliche Oberflächenmarker für die spezifische

zytotoxische T-Zell-Antwort zu erhalten und so genauere Einblicke in die

adaptive Immunantwort beim Huhn zu erlangen. Zum anderen sollte die

Charakterisierung dieses Markers im Zusammenspiel mit der künftigen

Charakterisierung der weiteren Rezeptoren seiner Familie dazu beitragen,

immunmodulatorische Vorgänge im Huhn nachzuvollziehen.

Ein erster Schritt in diese Richtung wurde mit der Generierung eines

monoklonalen Antikörpers gegen die extrazelluläre Struktur von CRTAM

erreicht. Dazu war es zuerst notwendig, den Rezeptor im Hühnergenom zu

identifizieren, ihn zu klonieren und auf verschiedenen Zelllinien zu exprimieren.

Nachfolgend konnte mithilfe dieser stabilen Zelllinien, durch Immunisierung

einer Maus, ein CRTAM-spezifischer monoklonaler Antikörper hergestellt und

die Gewebeverteilung dieses Rezeptors im Huhn untersucht werden.

Weiterhin sollte der Bindungspartner dieses Rezeptors charakterisieren werden,

der bei Mensch und Maus das Nectin-like Protein 2 (Necl-2) darstellt [9-11].

Sequenzvergleiche von CRTAM zwischen Mensch und Huhn zeigten hohe

Aminosäuren-Sequenz-Ähnlichkeit auf. So lag die Vermutung nahe, dass auch

das Hühner Necl-2 ein Bindungspartner für Hühner CRTAM sein könnte.

Durch Klonierung und Expression dieses Liganden auf einer Zelllinie und

nachfolgend durchgeführten Rezeptor-Liganden-Bindungsversuchen sollte diese

Annahme bestätigt werden.

3. Literaturübersicht 4

3. LITERATURÜBERSICHT

3.1 Nectine und Nectin-ähnliche Proteine

Nectine und Necls sind Mitglieder der Ig-Superfamilie von Proteinen. Sie

vermitteln Ca2+

-unabhängige Zell-Zell-Adhäsionen durch sowohl homophile als

auch heterophile trans-Interaktionen, das heißt zwischen gleichen

Familienmitgliedern, bzw. auch unterschiedlichen Familienmitgliedern oder

Mitgliedern anderer Familien. In ihrem Aufbau besitzen Nectine und Necls große

Ähnlichkeiten. So ist ihnen eine extrazelluläre Region mit drei Ig-ähnlichen

Domänen, ein Transmembransegment und ein zytoplasmatischer Teil mit

verschiedenen konservierten Motiven gemeinsam. Ein großer Unterschied besteht

jedoch darin, dass Nectine im Gegensatz zu Necls intrazellulär Afadin binden

können [12, 13].

3.1.1 Nectine

Nectine sind zusammen mit den Cadherinen wichtige CAMs und in Verbindung

mit ihnen oder unabhängig von ihnen an der Bildung von Zell-Zell-Adhäsionen

beteiligt [14]. Nectine wurden ursprünglich als Rezeptoren für α-Herpesviren

isoliert und als poliovirus receptor-related protein 1 und 2 (PRR1 und PRR2)

bezeichnet [15, 16]. Diese erste Gruppe umfasst vier Mitglieder, Nectin 1 bis

Nectin 4, und jedes Familienmitglied weist zwei bis drei Splicevarianten auf [12,

13]. Sie enthalten alle, bis auf Nectin 1β, Nectin 3γ und Nectin 4, das konservierte

Motiv E/A-X-Y-V an ihrem C-terminus, wobei X irgendeine Aminosäure

repräsentiert. Dieses dient als Bindungsmotiv für die postsynaptic density 95/discs

large/zona occludens-1 (PDZ)-Domäne von Afadin, welches die zwei

Splicevarianten l-Afadin für large und s-Afadin für small besitzt [17]. L-Afadin,

die längere Splicevariante, stellt das Nectin- und F-Aktin-Bindungsprotein dar

und bindet Nectine an das Aktin-Zytoskelett [17, 18]. Obwohl Nectin 4 dieses

Motiv fehlt, kann es Afadin am C-Terminus binden [19]. Eine Sonderstellung

nimmt Nectin 1γ ein, welchem die Transmembranregion fehlt und es daher als

lösliches Protein auftritt [20].

Einige Familienmitglieder können verschiedene zytoplasmatische Proteine

zusätzlich zu Afadin binden, z.B. das Zellpolaritätsprotein partitioning defective 3

homologue (Par-3) [21], protein interacting with protein kinase C alpha 1

(PICK1) [22], multiple PDZ domain protein 1 (MUPP1) [23], Pals-1 associated

3. Literaturübersicht 5

tight junction protein (PATJ) [23], membrane palmitoylated protein 3 (MPP3)

[24], Zyxin [25] und Willin [26].

3.1.2 Necls

Nectin-ähnliche Proteine sind ubiquitär vorkommende Moleküle mit sehr breit

gefächerten Funktionen [27]. Diese Gruppe umfasst fünf Moleküle, Necl-1 bis

Necl-5, und grenzt sich von den Nectinen dahingehend ab, dass ihre Mitglieder

Afadin nicht binden können [13]. Sie interagieren jedoch mit Gerüstproteinen, wie

z.B. mit den Mitgliedern der membrane-associated guanylate kinase (MAGUK)

Familie MPP3 [28], protein associated with Lin-7 2 (Pals2) [29] und

calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase (CASK) [30], sowie

Band4.1-Familienmitgliedern, z.B. das Protein differentially expressed in

adenocarcinoma of the lung (Dal1) [31], oder mit T-complex-associated-testis-

expressed 1 (Tctex-1), einer Untereinheit des Dynein-Motorkomplexes [32]. Auch

treten sie in Wechselwirkung mit Nectinen und können so an der Zelladhäsion

teilhaben. So ist beispielsweise Necl-5 durch heterophile trans-Interaktion mit

Nectin 3 an der Bildung von Adherens Junctions beteiligt [33]. In Abbildung 1

sind die strukturellen Unterschiede der Nectine und Necls schematisch dargestellt.

3. Literaturübersicht 6

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Nectine und Necls mit jeweils drei

Ig-Domänen, welche durch Disulfidbrücken (S-S) stabilisiert sind. Nectine (oben)

besitzen ein PDZ-bindendes Motiv, welches mit der PDZ-Domäne von Afadin

interagieren kann, wohingegen das PDZ-Motiv der Necls (unten) eine andere

Aminosäurensequenz aufweist und eine Interaktion mit dem PDZ-Motiv von Afadin nicht

möglich ist. Vielmehr assoziieren sie mit Mitgliedern der MAGUK Familie. Necls weisen

zusätzlich ein 4.1-Bindungsmotiv auf, durch welches sie mit Mitgliedern der 4.1-Familie

von Proteinen interagieren. TM stellt die Transmembrandomäne dar. Abbildung

modifiziert nach Fuchs et al.[8]

3.1.3 Funktionen

Nectine regulieren die Formation von verschiedensten Zell-Zell-Verbindungen,

wie z.B. Adherens Junctions zwischen benachbarten epithelialen Zellen und

Fibroblasten [13, 14], Sertolizell-Spermatid-Verbindungen im Hoden [34-36],

Puncta Adherentia Junctions im Nervensystem [37] und Zellverbindungen im

Ziliarkörper [38]. Neben den Aufgaben bei der Zelladhäsion regulieren Nectine

und Necls eine Reihe wichtiger zellulärer Funktionen, bei denen im Folgenden

einige herausgegriffen werden sollen.

Nectine und Necls sind beteiligt an der Zellproliferation und Zellbewegung [39,

40], sowie Zelldifferenzierung [41]. Sie sind auch involviert in den Aufbau von

apikal-basaler Polarität an Zell-Zell-Adhäsionsstellen [42, 43] und die Formation

von Tight Junctions in Epithelzellen [44, 45]. Des Weiteren sind sie wichtig für

das Zellüberleben und weisen einen anti-apoptotischen Effekt auf [46]. Im

Nervensystem mediieren einige Vertreter axo-gliale Interaktionen, Schwannzell-

Differenzierung und Myelinisierung [30, 47, 48].

Einige Mitglieder fungieren als Eintrittspforte für virale Erreger, so stellen Nectin

3. Literaturübersicht 7

1α und Nectin 2α Rezeptoren für Herpesviren dar [15, 16], Nectin 4 interagiert

mit dem Masernvirus [49] und Necl-5 vermittelt Interaktion mit Polioviren [50].

Viele Tumorzellen exprimieren erhöhtes Level von Nectinen und Necls, wodurch

diese Proteine einen Vorteil für Wachstum, Verteilung und Metastasierung von

Tumorzellen darstellen könnten [51, 52].

Zusammenfassend sind die Mitglieder der Nectin und Necl-Familie mit

Interaktionspartnern und Funktionen in der Tabelle 1 eingetragen.

3. Literaturübersicht 8

Mitglied Interaktion mit Funktionen

Nectin 1

PRR1, PVRL1,

CD111

Nectin 1, Nectin 3,

Nectin 4, Necl-1.

CD96, HSV

Zelladhäsion

Zelldifferenzierung

Rezeptor für Herpes simplex Virus

(HSV)

Nectin 2

PRR2, PVRL2,

CD112

Nectin 2, Nectin 3,

CD226, TIGIT,

HSV

Zelladhäsion

Rezeptor für HSV

Nectin 3

PRR3, PVRL3,

CD113

Nectin 1, Nectin 2,

Nectin 3, Necl-1,

Necl-2, Necl-5

Zelladhäsion

Zellbewegung

anti-apoptotischer Effekt

Nectin 4

PRR4, PVRL4

Nectin 1, Nectin 4,

MV

Zelladhäsion

Marker für Brustkarzinom

Rezeptor für Masernvirus (MV)

Necl-1

CADM3, TSLL1,

IGSF4B,

synCAM3

Nectin 1, Nectin 3,

Necl-1, Necl-2,

Necl-3, Necl-4

Zelladhäsion im Nervengewebe

mediiert axo-gliale Interaktion,

Schwannzelldifferenzierung und

Myelinisierung

Necl-2

CADM1, IGSF4,

TSLC1, sgIGSF,

synCAM1

Nectin 3, Necl-1,

Necl-2, CRTAM

Zelladhäsion

lokalisiert in der basolateralen

Membran von Epithelzellen

Tumorsuppressor

Mediator der Tumorüberwachung

Necl-3

CADM2,

IGSF4D,

synCAM2

Necl-1 Funktion noch unbekannt

Necl-4

CADM4, TSLL2,

IGSF4C,

synCAM4

Necl-1 Zelladhäsion im Nervengewebe

mediiert axo-gliale Interaktion,

Schwannzelldifferenzierung und

Myelinisierung

möglicherweise in Tumorsuppression

involviert

Necl-5

PVR, CD155,

TAGE4

Nectin 3, TIGIT,

CD226, CD96, PV

Rezeptor für Poliovirus (PV)

Überexpression in vielen Karzinomen

erhöht Zellbewegung und

Zellproliferation

Tabelle. 1: Mitglieder der Nectin und Necl-Familie mit alternativen Bezeichnungen,

Interaktionspartnern und Funktionen. TAGE4: tumor associated glycoprotein E4, TSLL:

tumor suppressor in lung cancer like, IGSF: immunoglobulin superfamily; Tabelle

modifiziert nach Takai et al. [27]

3. Literaturübersicht 9

3.1.4 Bindung und Bindungspartner

Zwei Nectin und Necl-Moleküle auf der Oberfläche derselben Zelle formen zuerst

cis-Homodimere, welche dann seitliche Cluster bilden [53, 54]. Diese können

dann in trans mit den Clustern auf der entgegengesetzten Zellseite interagieren.

Dabei scheint die V-Domäne für die Formation von cis- und trans-Dimeren

verantwortlich zu sein [53]. Auf diese Weise können die Familienmitglieder

sowohl homophil mit dem gleichen Mitglied, als auch heterophil mit anderen

Familienmitgliedern interagieren, wobei letztere Interaktionen stärkere Bindungen

hervorrufen [54]. Zusätzlich können sie aber auch trans-Verbindungen mit

Molekülen außerhalb der Nectin und Necl-Familie eingehen [7, 8]. Dabei stellen

trans-Interaktionen außerhalb der Nectin und Necl-Familie solche mit anderen

Ig-ähnlichen Transmembranproteinen dar, wie z.B. den nachfolgend

beschriebenen Molekülen T cell activation, increased late expression (Tactile,

CD96) [55], DNAX accessory molecule 1 (DNAM1, CD226) [56], TIGIT [57]

und CRTAM [9-11] (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Interaktionspartner von Nectinen und Necls.

Die rotierenden Pfeile zeigen an, dass der jeweilige Vertreter homophile Interaktionen

eingehen kann, der durchgestrichene rotierende Pfeil, dass nur heterophile Interaktionen

möglich sind. Abbildung modifiziert nach Rikitake et al. [58]

3. Literaturübersicht 10

3.2 Ig-ähnliche Rezeptoren die an Nectine und Necls binden

Eine Gruppe von Rezeptoren, die in den letzten Jahren intensiv studiert wurde,

zählt ebenfalls zur Ig-Superfamilie und beinhaltet Bindungspartner der vorher

beschriebenen Nectine und Necls. Ihnen allen ist gemeinsam, dass sie sowohl auf

CD8 positiven T-Zellen als auch auf Natürlichen Killer (NK)-Zellen exprimiert

werden und an der Vermittlung von Effektorfunktionen dieser Zelltypen beteiligt

sind [7, 8]. Zu dieser Gruppe zählen CD96, TIGIT, CD226 und CRTAM, auf

welche nachfolgend näher eingegangen werden soll.

3.2.1 CD96

Ursprünglich wurde CD96 als T-Zell-spezifischer Rezeptor identifiziert, und

erhielt die Bezeichnung Tactile für T cell activation, increased late expression

[59]. Dieses Molekül ist beim Menschen auf Chromosom 3 und bei der Maus auf

Chromosom 16 kodiert und besitzt als Mitglied der Ig-Superfamilie drei

Ig-Domänen [59]. Dem zytoplasmatischen Teil fehlen typische Motive für das

downstream signalling [59], aber er enthält ein ITIM-Motiv [55]. CD96 zeigt

Sequenzähnlichkeiten mit CD226 [60], Drosophila amalgam, dem Melanom-

Antigen Mucin-18 (MUC-18), Mitglieder der carcinoembryonic antigen (CEA)

Familie, Necl-5 und dem neural cell adhesion molecule (NCAM) [59].

Beim Menschen ist die Expression weitgehend beschränkt auf NK-Zellen,

T-Zellen und einige B-Zellen. Während die Expression auf naiven T-Zellen und

NK-Zellen gering ist, wird sie nach Zellaktivierung jedoch stark hochreguliert

[59].

Die Rolle von CD96 im Immungeschehen ist noch nicht geklärt. Aufgrund der

ITIM-Sequenz könnte dieser Rezeptor eine inhibitorische Funktion besitzen. Es

wurde jedoch gezeigt, dass CD96 die Bindung von NK-Zellen an Necl-5

exprimierende Zielzellen fördert und die Zytotoxizität von aktivierten NK-Zellen

stimuliert. Dieser Effekt war allerdings weniger effizient als bei anderen

Rezeptoren wie z.B. bei CD226 [55]. Andere Berichte haben heruasgestellt, dass

CD96 ein wichtiger Marker für akute Myeloische Leukämie ist und dass

Mutationen in diesem Rezeptor eine Form des Opitz Trigonocephalie Syndroms

bedingen [61, 62]. Eine neuere Studie weist auf die Funktion von CD96 während

der Humanen Immundefizienz-Virus 1 (HIV1) Infektion hin. Dabei scheint die

Abnahme der CD96 Expression auf CD8 positiven Zellen den Verlauf der HIV1

Pathogenese zu beeinflussen und könnte darauf hindeuten, dass CD96

3. Literaturübersicht 11

möglicherweise das Fortschreiten einer HIV1 Erkrankung beeinträchtigt [63]. Bei

der Maus ist Nectin 1 als zusätzlicher Ligand für diesen Rezeptor bekannt [64].

3.2.2 CD226

Ein weiteres Mitglied der Ig-Superfamilie von Rezeptoren, welches an Vertreter

der Nectin und Necl-Familie bindet, ist CD226, ein transmembranöses

Glykoprotein mit zwei extrazellulären Ig-Domänen [60, 65]. Das Gen ist

lokalisiert auf dem humanen und murinen Chromosom 18q22.3 [60, 65].

Ursprünglich wurde dieses Molekül als T lineage-specific activation antigen 1

(TLiSA1) beschrieben, ein Marker involviert in die Differenzierung von CD8

positiven T-Zellen [66]. Später wurde ihm zusätzlich eine Rolle in der

Aktivierung von Blutplättchen zugesprochen und es wurde in PTA1 für platelet

and T cell activation antigen 1 umbenannt [67]. Nachfolgend wurde die

Bezeichnung DNAX accessory molecule 1 (DNAM-1) vorgeschlagen, da CD226

als ein signaltransduzierendes Adhäsionsmolekül und ein Rezeptor, involviert in

die CD8 positive T-Zell und NK-Zell mediierte Zytotoxizität, charakterisiert

wurde. [60].

Dieses Molekül wird auf einem Großteil der NK-Zellen, auf T-Zellen, auf einem

Teil der B-Zellen und auf Monozyten in Mensch und Maus exprimiert [60, 68].

CD226 bindet zwei verschiedene Zelloberflächenliganden, poliovirus receptor

(PVR, Necl-5, CD115) und poliovirus receptor-related 2 (PVRL 2, Nectin 2) [56,

69]. Die Interaktion von CD226 auf CD8 positiven T-Zellen oder NK-Zellen und

ihren Liganden auf Zielzellen induziert zellvermittelte Zytotoxizität in vivo und in

vitro [69, 70].

Nach Rezeptorbindung wird das Serin329

von CD226 durch die Protein-Kinase C

phosphoryliert, was einen wichtigen Schritt für die Zellsignalweiterleitung und die

Zelladhäsion darstellt [65]. Die Initialisierung der Zytotoxizität durch

Kreuzvernetzung von CD226 ist abhängig von einer funktionellen Interaktion mit

dem lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1) [71]. LFA-1 assoziiert mit

CD226 auf NK-Zellen und aktivierten T-Zellen, wobei die Serin-

Phosphorylierung von CD226 eine wichtige Rolle spielt. Des Weiteren führt die

Kreuzvernetzung dieser beiden Moleküle zu einer Tyrosin-Phosphorylierung von

CD226 durch die Protein Kinase Fyn, welche durch LFA-1 aktiviert wird. CD226

ist somit involviert in die LFA-1 mediierten intrazellulären Signalwege zur

Auslösung von T-Zell-Differenzierung und T-Zell-Proliferation [71, 72]. Der

3. Literaturübersicht 12

zytoplasmatische Anteil von CD226 enthält Bindungsmotive für Mitglieder der

4.1 Familie von Proteinen und für Mitglieder der MAGUK Familie. Diese

Proteine binden den CD226 Rezeptor an das Aktin-Zytoskelett und fördern

womöglich das Clustering von CD226 mit LFA-1 [73]. Bei Monozyten und

eventuell auch anderen Immunzellen spielt CD226 eine Rolle bei

transendothelialer Migration, wobei es durch die Interaktion mit Necl-5, welches

unter anderem an den endothelialen Zellverbindungen exprimiert wird, die

Migration durch diese Zellverbindungen während des Diapedeseschrittes

erleichtert [74]. Auch ist CD226 an der CD4 T-Helferzell-Differenzierung

beteiligt [72, 75]. Eine wichtige Funktion von CD226 ist außerdem die Erhöhung

der zytotoxischen Effektorfunktionen von CD8 Zellen und NK-Zellen gegen

Tumoren und virusinfizierte Zellen [76, 77]. Dieses Molekül ist an der NK-Zell

mediierten Tumorüberwachung beteiligt. NK-Zellen benötigen CD226 für die

Elimination von Tumorzellen, da diese durch die niedrige Expression von

Liganden für andere aktivierende NK-Zell-Rezeptoren weniger anfällig für

Zytotoxizität sind [78]. Auch agiert CD226 als kostimulatorisches Molekül zur

Aktivierung von CD8 positiven T-Zellen und NK-Zellen durch

nichtprofessionelle Antigenpräsentierende Zellen (APC für antigen presenting

cell) und Tumoren mit niedriger Immunogenität [78].

Diese Funktionen heben die wichtige Rolle von CD226 beim Vermitteln einer

CD8 T-Zell- und NK-Zell-Antwort hervor, wo Tumoren und/oder virusinfizierte

Zellen andere wichtige kostimulatorische Moleküle, z.B. Mitglieder der B7

Familie, herunterreguliert haben [7].

Die klinische Relevanz von CD226 wurde anhand einer Reihe von Studien

aufgezeigt. Beispielsweise wurde dargelegt, dass CD226 zusammen mit dem

T-Zell-Rezeptor (TCR für T cell receptor) in die Erkennung und Elimination von

„Akuter Myeloischer Leukämie Blasten“ durch Vγ9Vδ2 T-Zellen beteiligt ist

[79]. Vγ9Vδ2 T-Zellen sind mit einem Anteil von 1-10 % im Menschen die

Hauptgruppe von zirkulierenden γδ T-Zellen. Sie können phosphorylierte nicht-

Peptidantigene, welche auf Zellen exprimiert werden, die eine neoplastische

Transformation durchmachen, erkennen und diese Zellen dann abtöten [80, 81].

3.2.3 TIGIT

TIGIT ist die Kurzbezeichnung für T cell immunoreceptor with Ig and ITIM

domains und, wie der Name schon andeutet, ein weiteres Mitglied der

3. Literaturübersicht 13

Ig-Superfamilie [82]. Auch WUCAM, für Washington University cell adhesion

molecule [83] und V-set and transmembrane domain-containing protein 3

(VSTM3) [84] sind gängige Bezeichnungen für dieses Transmembranprotein.

Strukturell setzt sich TIGIT aus einer extrazellulären variablen Ig-ähnlichen

Domäne, einer Typ-I Transmembranregion und einem kurzen zytoplasmatischen

Anteil mit zwei Tyrosinen, von denen eines zu einem ITIM gehört, zusammen

[82, 83].

Die Expression beschränkt sich auf NK-Zellen und T-Zellen und bei letzteren

hauptsächlich auf T-Gedächtniszellen, Follikulären T-Helferzellen und

Regulatorischen T-Zellen und wird nach T-Zell-Aktivierung transient

hochreguliert [82-84].

Bis jetzt sind zwei Bindungspartner bekannt, Necl-5 und Nectin 2, welche auf

Dendritischen Zellen (DC für dendritic cell) exprimiert werden [57, 82]. TIGIT

stellt ein Protein dar, dessen Genstruktur der von anderen Mitgliedern der CD28

Familie entspricht und kann daher der CD28 Familie zugeordnet werden [84].

Mitglieder der B7-CD28 Familie von Proteinen spielen eine wichtige Rolle in der

Regulation von T-Zell-Funktionen [85], so anscheinend auch TIGIT, da gezeigt

werden konnte, dass lösliches TIGIT die T-Zell-Antwort in vivo und in vitro

abschwächt [84]. Zudem wurde nachgewiesen, das TIGIT Knockout-Mäuse sehr

anfällig für Autoimmungeschehen sind, was schlussfolgern lässt, dass TIGIT ein

wichtiger Regulator der T-Zell-Antwort ist [84]. Dabei kann TIGIT die

T-Zell-Antwort nicht nur indirekt über die Bindung von Necl-5 auf DCs steuern,

wodurch es zu einem Abfall der Interleukin (IL)-12 und einem Anstieg der IL-10

Produktion durch DCs kommt [82]. Es kann vielmehr auch direkt, ohne die Hilfe

von APCs, die T-Zell-Antwort hemmen, indem es die TCR gesteuerten

Aktivierungssignale abschwächt [6, 84], was zu einer verminderten Aktivierung,

IL-2 Produktion und TCR mediierten Proliferation führt [6]. Des Weiteren kann

TIGIT die T-Zell-Aktivierung noch auf einem weiteren Weg direkt hemmen,

indem es mit CD226 um denselben Liganden Necl-5 konkurriert [6].

Auf Seiten der NK-Zellen ist bekannt, dass TIGIT, sowohl bei Mensch als auch

bei Maus, die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität direkt durch das ITIM hemmt

[57, 86]. Im Mausmodell wurde gezeigt, dass die Interferon (IFN)-γ Sekretion

nach TIGIT-Blockierung erhöht und die TIGIT-vermittelte Inhibition dominant ist

gegenüber den Signalen von Necl-5 bindenden kostimulatorischen Rezeptoren

wie CD226 [86].

3. Literaturübersicht 14

3.2.4 CRTAM

Dieses Molekül wurde erstmals 2000 in einer Studie identifiziert, in welcher Gene

charakterisiert werden sollten, die vorwiegend in Natürlichen Killer-T-Zellen

(NKT-Zellen) exprimiert sind. Wegen seinem restringierten Expressionsmuster in

NKT-Zellen und CD8 positiven T-Zellen erhielt das Molekül die Bezeichnung

CRTAM für class I restricted T cell associated molecule [87].

Beim Menschen wird CRTAM auf aktivierten CD8 positiven T Zellen, NK-Zellen

und einer kleinen Untergruppe von CD4 positiven T Zellen exprimiert [10, 87].

Als weiteres Mitglied der Ig-Superfamilie besitzt es zwei extrazelluläre

Ig-ähnliche Domänen, die membrandistale vom variablen Typ und die

membranproximale Domäne vom konstanten Typ [87].

Die Signalwege von CRTAM sind noch weitgehend unbekannt. So findet sich

intrazytoplasmatisch kein Afadin-Bindungsmotiv vergleichbar zu dem der

Nectine, oder ein Band4.1 Bindungsmotiv wie bei CD226, aber auch keine ITIM-

Sequenzen wie bei CD96 und TIGIT. Jedoch weist CRTAM ein Carboxyl–

terminales PDZ-Bindungsmotiv auf, welchem es möglich ist, mit der PDZ-

Domäne von anderen Proteinen zu interagieren [9].

Das CRTAM Gen befindet sich beim Menschen auf Chromosom 11 (11q24.1),

bei der Maus auf Chromosom 9 und besteht bei beiden aus 10 Exons.

Bis jetzt wurde nur ein Ligand bei Mensch und Maus beschrieben, Nectin-like

Protein 2 (Necl-2), auch bekannt als cell adhesion molecule 1 (CADM1),

immunoglobulin superfamily member 4 (IGSF4), synaptic cell adhesion molecule

1 (SYNCAM) und tumor suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) [9-11]. Dabei

verursacht die Bindung von CRTAM auf aktivierten NK-Zellen und Necl-2 auf

der Oberfläche von Tumorzellen erhöhte NK-Zell-Zytotoxizität gegen sonst nur

schwach immunogene Ziele [10]. Da Necl-2 unter anderem eine Rolle bei der

Metastasierung von verschiedenen Tumorformen zugesprochen wird [51, 52],

scheint die Wichtigkeit von CRTAM bei der Tumorüberwachung hochrelevant zu

sein [7]. Auf CD8 positiven T-Zellen führt die Kreuzvernetzung von TCR und

CRTAM in vitro zur erhöhten IFN-γ Ausschüttung [10]. In einer anderen Studie

wurde gezeigt, dass Necl-2 auf APCs die Sekretion von IL-22 durch CD8 positive

Zellen fördert [11], eines T-Zell-Mediators, welcher direkt die nichtspezifische

Immunität in Geweben beeinflusst [88]. Auch führt eine Interaktion von CRTAM

positiven CD8 T-Zellen mit Necl-2 auf DCs der T-Zell-Zone im Lymphknoten

zur Retention von CD8 positiven T-Zellen in einer späten Phase der Aktivierung

3. Literaturübersicht 15

noch vor Beginn der Proliferation, was möglicherweise eine effektive

Entwicklung von zytotoxischen T-Zellen in dieser Lokalisation bedingt [89]. Auf

aktivierten CD4 positiven T-Zellen unterstützt CRTAM durch Interaktion mit

dem Zellpolaritätsprotein Scrib die Adhäsion und Ausbildung einer späten Phase

der Zellpolarität. Die Aufrechterhaltung dieser Zellpolarität führt zur Produktion

von IFN-γ und IL-22 und könnte daher die TH1 und TH17 Antwort beeinflussen

[90].

Erst kürzlich wurde in einer Studie die Rolle der CRTAM Expression auf

aktivierten Vγ9Vδ2 T-Zellen nach TCR-Bindung herausgearbeitet. Obwohl die

Bindung von Necl-2 an CRTAM auf diesen Zellen weder Zytotoxizität noch

IFN-γ Ausschüttung bedingt, führte die Interaktion von CRTAM mit

Necl-2-exprimierenden Tumorzellen zur Herunterregulierung von CRTAM und

zum Zelltod der Vγ9Vδ2 T-Zellen. Diese Ergebnisse zeigen die Beteiligung von

CRTAM am Überleben der aktivierten Vγ9Vδ2 T-Zellen auf und geben Hinweise

darauf, dass Necl-2 auf Tumorzellen einen neuen Angriffspunkt der

Antitumortherapie darstellen könnte [91].

Neben diesen wichtigen Funktionen im Immungeschehen beteiligt sich CRTAM

durch seine Expression auf Epithelzellen an der Ausbildung von Zell-Zell-

Interaktionen und stellt daher ein bedeutendes Molekül in der epithelialen

Zelladhäsion dar [92]. Wegen seiner Expression in Purkinje-Neuronen des

Kleinhirns wird diskutiert, ob CRTAM durch Bindung an Necl-2 im Gehirn zu

neuronalen Interaktionen beiträgt [93].

In Abbildung 3 sind die strukturellen Merkmale von CRTAM und seinen

Gruppenmitgliedern schematisch dargestellt.

3. Literaturübersicht 16

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Ig-Superfamilienmitglieder, die an Nectine

und Necls binden. Die Anzahl der Ig-Domänen der jeweiligen Vertreter, welche durch

Disulfidbrücken (S-S) stabilisiert sind, ist eingezeichnet. CD96 und TIGIT besitzen ein

ITIM-Motiv, TIGIT noch ein zusätzliches Tyrosin (Y), in ihrem zytoplasmatischen Anteil

und wirken dadurch potentiell hemmend. CRTAM besitzt ein PDZ-bindendes Motiv und

CD226 zusätzlich dazu ein 4.1-Bindungsmotiv. Abbildung modifiziert nach Fuchs et al.

[8]

3.3 CRTAM beim Huhn

Beim Huhn wurde CRTAM erstmals im Jahr 2000 beschrieben und als neues

Mitglied der Ig-Superfamilie charakterisiert [94]. Wegen seiner schnellen und

gewebe-spezifischen Expression in aktivierten Thymozyten, Milzlymphozyten

und in embryonalen Thymozyten führte man die Bezeichnung cTADS für chicken

thymic activation and developmental sequence ein.

Die Sequenz zeigt ein Protein von 439 Aminosäuren Länge an. Es ist gegliedert in

einen extrazellulären Bereich mit zwei Ig-ähnlichen Domänen, eine Typ-I

Transmembranregion und eine kurze zytoplasmatische Domäne. cTADS mRNA

konnte nicht in unaktivierten Thymus-, Milz- oder Bursazellen gefunden werden,

jedoch in Milz- und Thymuszellen nach Zellaktivierung und zusätzlich in

embryonalen Thymozyten [94].

3. Literaturübersicht 17

Die Expression von cTADS in embryonalem Thymus war dabei beschränkt auf

drei ausgeprägte Peaks zu Zeitpunkten, welche mit der klonalen Expansion von

TCR-1, -2 und -3 exprimierenden Zellen einhergehen. Daraus wurde

geschlussfolgert, dass cTADS in allen drei Untergruppen von Hühner-

Thymozyten exprimiert sein könnte und es möglicherweise in die Prozess der

klonalen T-Zell-Expansion involviert ist [94].

4. Publikation 18

4 PUBLIKATION

Chicken CRTAM binds nectin-like 2 ligand and is upregulated on

CD8+ αβ and γδ T lymphocytes with different kinetics

Maria Zechmanna, Sven Reese

b, Thomas W. Göbel

a*

aInstitute for Animal Physiology, Department of Veterinary Sciences, University

of Munich, Munich, Germany; bInstitute for Anatomy, Histology and

Embryology, Department of Veterinary Sciences, University of Munich, Munich,

Germany

* Corresponding author: Tel.: +49 89 2180 3827; fax: +49 89 2180 2552;

E-mail address: goebel@lmu.de (T.W. Göbel).

4. Publikation 19

Abstract

During a search for immunomodulatory receptors in the chicken genome, we

identified a previously cloned chicken sequence as CRTAM homologue by its

overall identity and several conserved sequence features. For further

characterization, we generated a CRTAM specific mab. No staining was

detectable in freshly isolated cell preparations from thymus, bursa, caecal tonsils,

spleen, blood and intestine. Activation of splenocytes with recombinant IL-2

increased rapid CRTAM expression within a 2 h period on about 30% of the cells.

These CRTAM+ cells were identified as CD8

+ γδ T lymphocytes. In contrast,

CRTAM expression could not be stimulated on PBL with IL-2, even within a 48 h

stimulation period. As a second means of activation, T cell receptor (TCR)

crosslinking using an anti-αβ-TCR induced CRTAM on both PBL and

splenocytes. While CRTAM expression was again rapidly upregulated on

splenocytes within 2 h, it took 48 h to reach maximum levels of CRTAM

expression in PBL. Strikingly, albeit the stimulation of splenocytes was performed

with anti-αβ-TCR, CRTAM expression after 2 h was mainly restricted to CD8+

γδ T lymphocytes, however, the longer anti-TCR stimulation of peripheral blood

lymphocytes (PBL) resulted in CRTAM expression on αβ T lymphocytes. In

order to characterize the potential ligand we cloned and expressed chicken Necl-2,

a member of the nectin and nectin-like family which is highly homologous to its

mammalian counterpart. Three independent assays including a reporter assay,

staining with a CRTAM-Ig fusion protein and a cell conjugate assay confirmed

the interaction of CRTAM with Necl-2 which could also be blocked by a soluble

CRTAM-Ig fusion protein or a CRTAM specific mab. These results suggest that

chicken CRTAM represents an early activation antigen on CD8+ T cells which

binds to Necl-2 and is upregulated with distinct kinetics on αβ versus

γδ T lymphocytes.

4. Publikation 20

Introduction

CD8+ T cells and natural killer (NK) cells display a number of receptors that are

important in the recognition of target cells. One group of receptors expressed by

both cell types belongs to the immunoglobulin superfamily (IgSF) and includes

CD226 (DNAM-1), TIGIT (WUCAM), CD96, and CRTAM (CD355) [1,2].

These receptors bind to members of the nectin and nectin-like family, which are

IgSF members, too and mediate Ca2+

independent homophilic and heterophilic

adhesion. They are also important for adhesion between neighboring epithelial

cells.

CRTAM was initially identified in a study devised to characterize upregulated

genes in NK-T cells and received its name as “class I-restricted T cell-associated

molecule” to denote its restricted expression pattern on CD8+ T cells. It has been

further characterized as an important activation marker for both CD8+ T cells and

NK-T cells [3]. In man, CRTAM expression is observed on activated CD8+

T cells, as well as on natural killer (NK) cells and a small subset of CD4+

T cells

[3,4]. As a type I transmembrane protein CRTAM is composed of an amino-

terminal Ig-like domain of the variable type (V-type), and a membrane proximal

Ig-like domain of the constant type 1 (C1-type). Its intracytoplasmic domain

contains a carboxyl–terminal class I PSD-95/Disc-large/ZO-1 (PDZ)-binding

motif, capable of interacting with PDZ domain.

The CRTAM gene is located on human chromosome 11 (11q24.1), whereas the

mouse counterpart is located on chromosome 9 (9 21.79 cM), both consisting of

10 exons. Several groups have identified Necl-2 (CADM1, IGSF4, SYNCAM,

TSLC1, synCAM1) as a ligand of both murine and human CRTAM [4-7].

Engagement of CRTAM promotes cytotoxic effects of NK cells towards Necl-2

expressing tumor cells. Coligation of TCR and CRTAM on CD8 positive T cells

causes interferon-γ (IFN-γ) secretion in vitro [4].

Recently, a study highlighted the role of CRTAM expression on Vγ9Vδ2 T cells

after TCR triggering. Although this T cell subpopulation exerted neither

cytotoxicity nor cytokine secretion, an interaction of CRTAM on these cells with

Necl-2 bearing tumor cells induced CRTAM down regulation and cell death of the

Vγ9Vδ2 T cells, thus revealing the CRTAM involvement in the survival of

activated Vγ9Vδ2 T cells [8].

Aside from the presence on cells of the immune system and its immunological

functions, CRTAM is also involved in cell-cell adhesion due to its expression in

4. Publikation 21

epithelial cells [7] and has a role in the transcytosis of neural stem cells across

brain vascular endothelial cells [9].

In 2000, a novel chicken receptor was characterized as member of the IgSF [10].

Since mRNA could only be detected in mitogen-treated thymic and splenic cells

as well as in embryonic cells at developmental time points known for T cell clonal

expansion it was designated as cTADS (chicken thymic activation and

developmental sequence).

The characterization of IgSF families in the chicken with immunomodulatory

capacity has been instrumental to gain novel insights into the phylogeny, tissue

distribution and function of various IgSF immune receptors [11-13]. Therefore,

during an attempt to find additional families, sequence analyses revealed that

cTADS is the chicken CRTAM homologue. We now demonstrate using a novel

CRTAM specific mab that avian CRTAM expression is restricted to activated

CD8+

T cells. Although absent from resting cells, stimulation with IL-2 or anti-

αVβ1-TCR leads to a rapid CRTAM upregulation on CD8+ γδ T cells and at later

time points on αβ T cells. Furthermore, we were able to characterize Necl-2 as a

ligand for chicken CRTAM. These results point to an important function of

CRTAM especially on γδ T cells, a close interaction of αβ and γδ T cells during

activation and they finally provide evidence for the high phylogenetic

conservation of the adhesion receptor family on lymphocytes that binds to nectins.

4. Publikation 22

Materials and Methods

Ethics Statement

All of the experimental procedures were in accordance with institutional, state and

federal guidelines on animal welfare. The animal experiments were approved by

the committee for the Care and Use of Laboratory animals of the Government of

Upper Bavaria, Germany (permit number: 55.2-1-54-2531.6-12.09) and all efforts

were made to minimize animal suffering during work.

Animals

Fertilized eggs of chicken line M11, provided by S. Weigend, Federal

Agricultural Research Center, Mariensee, Germany, were hatched at the Institute

for Animal Physiology, University of Munich. The birds were raised under

conventional conditions and used for experiments at the age of 8-16 weeks. Balb/c

mice were purchased from Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, Germany).

Cloning procedures and sequence analysis

The chicken thymic activation and developmental sequence (cTADS) was

originally described in a previous study [10] and will be named CRTAM

throughout the paper. For the generation of the constructs, PCR primers for

amplification were designed based on the CRTAM and Necl-2 sequence

(CRTAM: accession no. NM_001030347.1, Necl-2: accession number

XM_417901.3; Table 1). The primers were flanked by sequences recognizing

residues of the respective cloning vectors to allow cloning with overlapping ends

using the Gibson Assembly™ Master Mix. (New England Biolabs, Ipswich,

USA). As templates for CRTAM and Necl-2 amplification, cDNA derived from a

chicken thymic cell line (T1-6G5) and chicken brain was used, respectively.

After purification with Wizard®SV Gel and PCR Clean-up system (Promega,

Mannheim, Germany), the PCR products were linked to a modified

pcDNA3.1/V5-His Topo Vector (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) containing a

N-terminal FLAG epitope tag, the transmembrane domain of chicken CD8α and

the cytoplasmic domain of murine CD3δ [14,15] using the Gibson Assembly™

Master Mix. In order to generate a soluble CRTAM-Ig fusion protein the primers

were generated to amplify the CRTAM extracellular region with overlapping

sequences to a vector containing the human Ig signal peptide and the CH2, CH3

domain of human IgG1 [16] using the Gibson Assembly. All constructs were

4. Publikation 23

verified by sequencing (GATC, Konstanz, Germany). The Lasergene software

package was used for sequence analyses and Mega5 [17] for the construction of

the phylogenetic tree.

Cell lines, transfection and expression

The chicken CRTAM-FLAG and Necl-2-FLAG constructs were used to establish

stable HEK 293 cells and the CRTAM-FLAG was also used to generate a stable

BWZ.36 cell line. The human embryonic kidney (HEK) 293 cell line [18] was

stably transfected using the Metafectene liposomal transfection reagent according

to the manufacturer`s protocol (Biontex, Planegg, Germany) for both CRTAM

and Necl-2. After 24 h of incubation (37°C, 5% CO2) the transfected cells were

seeded in a 96-well flat bottom plate and cultured with medium containing

0.8 mg/ml G418 (Biochrom AG, Berlin, Germany) for 2 weeks.

The mouse thymocyte cell line BWZ.36 [19] was stably transfected by

electroporation (3x106 cells, 200V with 950 µF capacitance) with the CRTAM-

FLAG expression construct.

Transfected cells were plated in a 96-well flat bottom plate and selected in

medium containing 0.8 mg/ml G418 (Biochrom AG, Berlin, Germany) for

10 days at 37°C.

Grown single colonies were analyzed by flow cytometry (FACS CantoII, BD,

Heidelberg, Germany) for surface expression of the FLAG epitope.

Expression of chicken CRTAM-Ig fusion protein and ELISA

The CRTAM-Ig fusion construct was stably transfected into HEK 293 cells using

the Metafectene liposomal transfection reagent according to the manufacturer`s

protocol (Biontex, Planegg, Germany). After 24 h of incubation (37°C, 5% CO2)

the transfected cells were seeded in a 96-well flat bottom plate and cultured with

medium containing 0.8 mg/ml G418 (Biochrom AG, Berlin, Germany) for

2 weeks. The culture supernatants were analyzed for CRTAM-huIg secretion by

sandwich ELISA as described [20]. Soluble CRTAM was then affinity-purified on

protein G-coupled Sepharose using standard procedures.

Generation of a monoclonal antibody

For mab generation, Balb/c mice were immunized three times in 3 weeks intervals

with 1x107

of the stably CRTAM-FLAG transfected 293 cells. The mab were

4. Publikation 24

produced according to standard methods with the SP2/O myeloma cell line.

Hybridoma supernatants were tested by flow cytometry on either CRTAM-FLAG

transfected or untransfected BWZ.36 cells as described before [21]. For further

characterization of chicken CRTAM, we selected mab 8A10 (IgM).

Cell preparation

Single cell suspensions of bursa, ceacal tonsils, spleen and thymus were prepared

by passing the organs through a stainless steel mesh. Lymphocytes were obtained

from the cell suspensions by density centrifugation on Ficoll-Hypaque (Biochrom,

Berlin, Germany). Peripheral blood lymphocytes (PBL) were isolated by slow-

speed centrifugation [22]. Intestinal intraepithelial lymphocytes (IEL) from the

duodenal loop were prepared as described before [23].

Activation of cells and cell culture

Activated lymphocytes isolated from blood, spleen, thymus and caecal tonsils as

well as IEL were generated by cultivation 1x107

cells/ml in a 24-well plate with

either a 1:1000 dilution of recombinant IL-2 produced in our laboratory [24] or

with plate-bound anti-TCR-2 (SouthernBiotech, Birmingham, USA) at a

concentration of 10 µg/ml for different time periods. The cells were cultured with

RPMI 1640 medium supplemented with 8% FCS, 2% chicken serum and 1%

penicillin/streptomycin at 41°C and analyzed by flow cytometry.

Antibodies and immunofluorescence analysis

Single-cell staining was performed with the 8A10 mab, followed by a goat-anti-

mouse IgM-allophycocyanin (APC) conjugate (SouthernBiotech, Birmingham,

USA), or with anti-FLAG M2 mab (Sigma-Aldrich, Munich, Germany), followed

by a goat-anti-mouse IgG1 APC (SouthernBiotech, Birmingham, USA) or

R phycoerythrin (R-PE) conjugate (SouthernBiotech, Birmingham, USA),

respectively. The staining with the CRTAM-huIg fusion protein was followed by

a goat-anti-human IgG R-PE conjugate (SouthernBiotech, Birmingham, USA).

For double immunofluorescence analysis, the cells were first incubated with a

mixture of primary mab, followed by incubation with an APC-conjugated goat-

anti-mouse IgM antibody in combination with goat-anti-mouse IgG1 R-PE

conjugate (SouthernBiotech, Birmingham, USA). Additional mab used for

staining were specific for chicken CD3 (CT3, mouse IgG1) [25], chicken CD4

4. Publikation 25

and CD8 (CT4, mouse IgG1; CT8 mouse, IgG1 [26], Bu-1 (AV20, mouse IgG1)

specific for B lymphocytes [27], CD25 (IgG1), the α-chain of the IL-2-receptor,

chicken TCR-1 (mouse IgG1) to discriminate the γδ T cells (γδ-TCR [28]), and

TCR-2 and TCR-3 to distinguish different subsets of αβ T cells (αVβ1-TCR [29];

αVβ2-TCR [30], both mouse IgG1). For each staining, appropriate isotype

matched controls were used.

Dead cells were discriminated by staining with Fixable Viability Dye eFluor®

780 (affymetrix eBioscience, Frankfurt, Germany) or 7-amino-actinomycin D

(7 AAD, Sigma-Aldrich, Munich, Germany; 25µg/µl) and the living cell

population was analyzed by flow cytometry (FACS Canto II, Beckton Dickinson,

USA) using the BD FACS DIVA 6.1.3 software.

BWZ.36 reporter assay and ELISA

The BWZ.36 cells are stably transfected with a ß-galactosidase reporter cassette

under the control of the IL-2 promotor containing three NFAT repeats. A

construct was generated encoding the extracellular CRTAM domains fused to the

CD8 transmembrane domain and the CD3δ cytoplasmatic domain, which was

used to establish a stable BWZ.36 clone. Upon CRTAM ligation the ITAM of the

CD3δ cytoplasmatic domain is phosphorylated and activates the NFAT promotor.

As a consequence ß-galactosidase is induced and can be detected by adding

chlorophenolred-ß-D-galactopyranosid (CPRG). ß-galactosidase has the ability to

cleave CPRG into galactose and chlorophenolred, leading to a color change that

can be detected and quantified by optical density reading at 575 nm. 24-well cell

culture dishes were coated with anti-FLAG mab 10μg/ml at 4°C over night for a

positive control or were left uncoated. Each cell line was plated at a total amount

of 1.5 x 105 cells in the dishes and was incubated for 24 h at 37°C. For our

binding study, we co-cultivated stably CRTAM-FLAG transfected BWZ.36

reporter cells with the stably Necl-2-FLAG transfected HEK 293 cells. As

positive controls, we incubated the CRTAM-FLAG transfected BWZ.36 in the

anti-FLAG mab coated wells. As a mock-control, we co-cultivated the stably

expressing BWZ.36 reporter cells with a HEK 293 cell line expressing a Necl-2

unrelated molecule to exclude unspecific binding. To verify the specificity of

chicken CRTAM to chicken Necl-2 we co-cultivated the Necl-2-FLAG

transfected HEK 293 cells with the CRTAM-huIg fusion protein, both pure and in

a concentration of 1:10 for 20 minutes to block specific binding sites before

4. Publikation 26

adding the CRTAM-FLAG transfected BWZ.36 cells. After incubation time the

cells were lysed and the β-galactosidase activity was measured by using

130µl/well CPRG (Roche, Mannheim, Germany) and quantified by optical

density reading at 575 nm 18 h after incubation.

Statistical analysis

The data of the BWZ.36 reporter assays is presented as mean value (mean) and

standard deviation (SD) and a dependent t-test was employed to assess differences

using the IBM SPSS program version 21.0 based on a significance level of 5 %.

Furthermore an adjustment for multiple testing was done using the Bonferroni-

Holm correction for multiple comparisons. Finally, values of p < 0.01667 were

considered significant.

Conjugate Assay

Untransfected BWZ.36, mock transfected BWZ.36 and BWZ.36-CRTAM cells

were labeled with PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit for 2 minutes

(Sigma-Aldrich, Munich, Germany), whereas 293-Necl-2 cells were labeled with

Vybrant® DiD cell-labeling solution (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) for

5 minutes using standard procedures. After the cells were washed three times,

labeled 293-Necl-2 cells (2,5 × 105) were mixed with either labeled BWZ.36-

CRTAM cells, mock-transfected BWZ.36 cells or untransfected BWZ.36 cells

(2,5 × 105), spun down and incubated at 37°C for 2 h. The conjugates were

washed once and gently resuspended before flow cytometric analysis. For

blocking experiments CRTAM transfected BWZ.36 cells or mock-transfected

BWZ.36 cells were preincubated with 8A10 mab for 20 min at room temperature.

4. Publikation 27

Results

Identification of chicken CRTAM

In an attempt to identify novel Ig-like receptors with immunomodulatory potential

we found a previously cloned gene designated cTADS. The gene is located on a

12.5 kb region of chromosome 24 and is encoded by 12 exons. CRTAM

sequences can also be found in other avian species (turkey: Chromosome 26:

3,303,411-3,315,820; 12 exons and an incomplete version in zebra finch:

chromosome 24:3450462-3458344:1). As depicted in Fig.1A, cTADS shares

significant homology with mammalian CRTAM. It contains two Ig domains in its

extracellular region, the first represents a V-type and the second a C-type

Ig domain. The linking region between the Ig and transmembrane region is

extended with more than 50 additional amino acids present in the chicken and

corresponding turkey sequence (Fig. 1A). Analysis of the genomic structure

revealed the presence of two additional exons in the avian CRTAM genes,

responsible for the extended linking region. The cytoplasmic domain is of equal

length and contains a C-terminal PDZ-binding motif (Fig. 1A).

We next constructed a phylogenetic tree with the receptors known to bind to

Nectins or Nectin-like proteins. As expected, the homologues of human and

mouse CD96, TIGIT and CD226 form closely related pairs. The CRTAM

receptors form a distantly related clade, but clearly the chicken CRTAM clusters

together with its respective mammalian homologues (Fig. 1B). In conclusion, we

have identified the chicken cTADS sequence as CRTAM homologue.

Generation of a chicken CRTAM specific mab that does not react with

resting cells

In order to produce a CRTAM specific mab we generated two cell lines with a

N-terminal FLAG-tagged CRTAM version that displayed both extracellular

Ig domains fused to the chicken CD8 transmembrane and murine CD3δ

cytoplasmic domains. Following immunization, mab supernatants were evaluated

by their binding properties to the stably transfected cell lines in comparison to the

positive control FLAG staining and the untransfected controls (Fig. 2A). One mab

designated 8A10, which resembles an IgM isotype, was selected for the further

studies.

For analyzing the tissue distribution of chicken CRTAM we initially stained cell

preparations obtained from thymus, bursa, blood, spleen, caecal tonsils and

4. Publikation 28

intestine with the 8A10 mab, however, we failed to detect CRTAM expression on

the cell surface of these freshly isolated cells (Fig. 2B). This indicated that the

mab is able to specifically recognize CRTAM on transfected cells, but it either did

not stain the antigen on native cells or the molecule was not present on these cells.

CRTAM is transiently expressed on activated cells

Since CRTAM is a receptor known to be upregulated upon activation, we next

evaluated if activation of chicken splenocytes would lead to CRTAM expression.

Initial experiments were performed with the lectin Concanvalin A, phorbol-

myristate-acetate in combination with Ca-ionophore (PMA/Ca-ionophore),

recombinant IL-2 and TCR crosslinking (data not shown). While all of the

reagents stimulated CRTAM expression, we focused on the latter two reagents

due to their superior stimulation of CRTAM.

IL-2 treatment was able to induce splenocyte activation as judged by increasing

CD25 expression (Fig. 3A, middle panels). IL-2 also induced a rapid CRTAM

upregulation reaching maximum levels as early as 2 h following stimulation and

declining constantly thereafter (Fig. 3A upper panels). Identical treatment of PBL,

however, did not induce detectable CRTAM expression (Fig. 3B upper panels)

although IL-2 caused cellular activation as judged by the increased CD25

expression during the 48 h stimulation period (Fig. 3B, middle panels). When

several dilutions of IL-2 were tested (in the range of 1:10 to 1:1000), none of

these concentrations were able to induce CRTAM expression (data not shown).

Anti-TCR-2 stimulation of splenocytes also induced CRTAM expression after 2 h

rapidly declining at later timepoints (Fig. 3A, lower panels). In contrast to the

IL-2 stimulation of PBL, that failed to induce detectable CRTAM expression,

anti-TCR-2 treatment of PBL resulted in CRTAM expression visible after 6 h and

increasing to reach maximum levels at 48 h (Fig. 3B, lower panels).

These results indicate that CRTAM resembles an early activation marker and

poses the question what cellular subsets are upregulating CRTAM following

activation.

CRTAM is restricted to CD8 positive T cells with distinct kinetics on αβ

versus γδ T cells

To determine the cell types that express CRTAM we performed a series of double

stainings using stimulated splenocytes and PBL. Following short term IL-2

4. Publikation 29

stimulation of splenocytes, CRTAM was detectable on CD3+ T lymphocytes.

CRTAM was undetectable on CD4+ T cells, in contrast it was present on a subset

of CD8+ T cells (Fig. 4). By analyzing the distinct T cell subsets as characterized

by their TCR usage, it became evident, that CRTAM was upregulated on a γδ

T cell subpopulation, whereas most αβ T cells did not express CRTAM (Fig. 4).

We consistently observed a correlation of TCR and CRTAM expression with

those cells expressing high levels of CRTAM also displayed high amounts of

TCR on their surface as judged by the fluorescence intensities (Fig. 4).

When similar immunofluorescence analyses were performed with splenocytes

activated for 2 h with anti-αVβ1-TCR (TCR-2 mab), CRTAM expression was

again mainly expressed by a γδ T cell subset (Fig. 5A). This was surprising since

the TCR stimulation was directed against αβ T cells. Only after 24 h to 48 h

stimulation where CRTAM expression already decreased, its expression could

also be detected on αβ T cells (Fig. 5B). Since we have observed different kinetics

of anti-TCR stimulation between splenocytes and PBL, we also analyzed the 48 h

time point of stimulated PBL. In that case, CRTAM expression was virtually

absent from γδ T cells, but a subset of αβ T cells co-expressed CRTAM (Fig. 5C).

These cells were also CD8+. The reexpression of CRTAM following TCR-2

stimulation of splenocytes visible in the time period between 24 h and 48 h (Fig.

3A; increase of 8 to 13%) is due to the simultaneous decrease of CRTAM on

γδ T cells and its increase on αβ T cells.

In conclusion, depending on the type of stimulation and the cellular source,

CRTAM is upregulated on either CD8+

γδ or αβ T cells, with the interesting

observation that stimulation of the αβ-TCR in splenocytes leads to rapid CRTAM

upregulation on γδ T cells

Identification of the chicken nectin-like 2 molecule

To further explore the chicken CRTAM molecule we wanted to test whether it

binds to the same ligand as in mammals, which is the nectin-like 2 protein

(Necl-2) [5]. For this purpose, the chicken Necl-2 homologue was identified in the

genome database by homology searches and cloned by PCR. Chicken Necl-2 is

encoded by 12 exons on chromosome 24: 4,664,469-4,732,605 and shares about

80 % identity to the corresponding human receptor (Fig. 6). Interestingly, as has

been observed for the CRTAM gene, there are two additional exons present in the

4. Publikation 30

chicken that code for an extended connecting peptide close to the transmembrane

region that is absent from the human sequence (Fig. 6).

As the human counterpart, the intracellular tail of chicken Necl-2 contains a type I

PDZ-binding motif (PDZ) characterized by the conserved sequence X/Tyr/Phe/Ile

[31] that in humans is able to bind the PDZ motif of members of the MAGUK

family, like Pals2 [32], CASK [33] and Dlg3 (MPP3) [34]. Furthermore it also

contains a binding motif for band 4.1 family proteins and thereby in humans it is

known to recruit the tumor suppressor DAL-1, that connects Necl-2 to the

cytoskeleton [35].

Chicken CRTAM binds to Necl-2

In order to study the potential interaction of CRTAM and Necl-2 we performed

three independent assays. First we generated a soluble CRTAM protein by fusing

the two CRTAM Ig domains to the human CH2, CH3 Ig domains. We tested the

specific binding of the CRTAM-huIg fusion protein on a HEK 293 cell line stably

transfected with the extracellular N-terminal FLAG-tagged domain of Necl-2 and

on untransfected HEK 293 cells, respectively (Fig. 7A). Necl-2 was readily

detected by anti-FLAG staining on the transfected HEK 293 cells (Fig. 7A, upper

panel; MFI of 6885 as compared to MFI of 227 in the control). Next we stained

the cells with the CRTAM-huIg fusion protein. As can be observed from Fig. 7A,

the fusion protein stained the Necl-2 transfected cells, whereas an irrelevant

fusion protein that also contained the human CH2, CH3 Ig domains did not react

with the Necl-2 transfected cells (Fig. 7A, lower panel; MFI of 1423 as compared

to MFI of 225 in the control). In a next step, we verified the binding capacitiy of

chicken CRTAM and chicken Necl-2 employing the CRTAM transfected

BWZ.36 cell line in a reporter assay. Since the CRTAM was epitope tagged, anti-

FLAG stimulation served as a positive control and resulted in a strong induction

of the intracellular NFAT promotor and ß-galactosidase activity (Fig. 7B). The

BWZ.36-CRTAM transfectants were either incubated with HEK 293 cells

expressing an irrelevant receptor as a negative control or with the Necl-2

expressing HEK 293 cells. The Necl-2 expressing cells induced significant higher

amounts of ß-galactosidase activity as compared to the control (Fig. 7B). This

interaction could be blocked by the addition of the soluble CRTAM-Ig fusion

protein.

4. Publikation 31

The statistical analysis revealed significant differences (p<0,01667) between all

groups except the negative control compared to BWZ-CRTAM + 293-Necl-2

receptor ligand pair blocked by CRTAM-huIg and BWZ-CRTAM + 293-Necl-2

receptor ligand pair to BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair blocked

by 1:10 diluted CRTAM-huIg. As measure of the variability we calculated subject

coefficients of variation, which all were < 10% indicative of a good

reproducibility. The calculation of the minimum distance in between the value of

the negative control and the value of the BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor

ligand pair is based on the largest statistical variation. As a result we can assign,

that the value of the BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair has to

exceed the value of the negative control more than 20% to ensure that the ligand

binds to the receptor with a certainty of 95%. In this assay the value of BWZ-

CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair exceeds more than 30% compared to

the value of the mock-transfected negative control.

In a further experiment we coincubated labeled BWZ.36-CRTAM, or control

BWZ.36 cells with 293-Necl-2 cells for 2 h at 37°C and measured the formation

of conjugates by flow cytometry (Fig. 7C) We observed abundant conjugate

formation between BWZ.36-CRTAM and 293-Necl-2 cells (Fig. 7C, middle

panel) but not between untransfected BWZ.36 (Fig. 7C, upper panel) or mock

transfected BWZ.36 (data not shown) and 293 Necl-2 cells. Preincubation of

BWZ.36-CRTAM cells with 8A10 mab almost completely blocked the conjugate

formation (Fig. 7C, lower panel), whereas preincuabtion of mock transfected

BWZ.36 cells with the 8A10 mab did not show any effect (data not shown).

In conclusion, three independent assays have proved the CRTAM - Necl-2

interaction.

4. Publikation 32

Discussion

The chicken cTADS gene was initially identified in 2000 as a novel Ig-like

molecule with similarity to several proteins mediating adhesion that is upregulated

on activated thymocytes and splenocytes [10]. The mammalian CRTAM gene was

identified in 2000, too, thus a direct assignment of CRTAM and cTADS was most

likely precluded due to the simultaneous submission [3]. In 2004, a study initiated

to establish a link between innate immunity in the urochordate Ciona intestinalis

and adaptive immunity receptors of the IgSF family pointed out the relationship of

mammalian CRTAM and cTADS [36]. It is of interest that CRTAM homologues

seem to have distantly related homologues not only in non-mammalian vertebrates

but even in Drosophila, where the BEAT family shares similar structural features

such as an identical domain organization [36]. In Ciona intestinalis, an ancestral

gene cluster represented on chromosomes 4 and 10 founded four paralogous

regions by two whole genome duplications [37]. Comparative studies have

identified the chicken chromosomes 1, 4, 24 and 31 as these paralogous regions

and indeed several important IgSF families have been located to these

chromosomes, such as the CD200 family on chromosome 1, the chicken leucocyte

receptor cluster (LRC) on chromosome 31, and CRTAM on chromosome 24

[12,16,38].

It is interesting to note that both chicken Necl-2 and CRTAM have a difference in

their genomic organization. There are two additional exons coding for residues

located between the membrane proximal Ig domains and the transmembrane

domains. It is not evident, why this region has been condensed in the mammalian

molecules and what the functional significance of an extended membrane

proximal region is. In a recent report, a novel computational method was used to

demonstrate the close relationship of CRTAM and the nectin-like family with the

conclusion that both receptors belong to the nectin-like family [39]. The finding

that both genes share the additional exons in galliformes is supporting this notion.

A further unifying theme for CRTAM and other nectins is their expression on

leukocytes and on cells of the nervous system such as Purkinje cells in the

cerebellum [40]. The analysis of CRTAM expression in the brain goes beyond the

scope of this report, but will be examined in future studies. Altogether, CRTAM is

a well conserved molecule that serves several functions in the immune and

nervous system.

In order to further explore chicken CRTAM on leukocytes we have generated a

4. Publikation 33

specific mab. Our inability to detect CRTAM on freshly isolated cells corresponds

well with mammalian data on CRTAM expression. Several activation agents such

as mitogens, TCR crosslinking and IL-2 rapidly upregulated chicken CRTAM.

One intriguing aspect is the fast CRTAM upregulation within 2 h of IL-2 or TCR

stimulation of splenocytes. This is in good agreement with the data reported on

the mRNA expression of cTADS [10]. Since mRNA is detectable very early after

cellular activation, it is likely to resemble de novo protein biosynthesis of

CRTAM rather than surface expression of preformed receptor proteins stored

intracellularly as reported for other molecules such as CD300a [41].

Interestingly, this early CRTAM upregulation on splenocytes by IL-2 was mainly

detectable on a γδ T cell subset. IL-2 stimulation of PBL failed to induce

CRTAM, although the cytokine was able to activate cells as judged by the

increase of CD25 expression. In contrast, TCR crosslinking did induce CRTAM

expression on PBL, but at later time points with a maximum after 48 h of

stimulation and mainly on αβ T cells.

Taken together, there are two pronounced differences in CRTAM upregulation

between γδ and αβ T cells: firstly, a rapid upregulation on γδ T cells upon

stimulation and a delayed CRTAM expression on αβ T cells reaching a maximum

within 48 h and secondly an inability of blood derived γδ T cells to express

CRTAM in contrast to splenic γδ T cells. Splenic and blood derived γδ T cells

also differ in their expression of various other molecules, such that blood

γδ T cells lack CD6 and display only low levels of CD5 [42-44]. Thus, while

blood γδ T cells seem to be refractory to activation, a splenic γδ T cell subset can

be readily activated and CRTAM serves as an early activation antigen on these

cells. In this regard it is interesting that another rich source of γδ T cells is the IEL

population, however, we were not able to detect CRTAM on resting or activated

IEL. This underscores that IEL harbors yet another γδ T cell subset, that is also

defined by its unique expression of CD8αα homodimers instead of CD8αβ

heterodimers [45].

Mammalian CRTAM is also detectable on NK cells. In the adult chicken, NK cell

frequencies are either low or undetectable in several tissues such as PBL or

spleen, but the intestinal epithelium harbors a high frequency of NK cells [46,47].

This IEL population did not express CRTAM whether on the resting cell

population, nor were we able to increase CRTAM expression upon stimulation of

IEL with either IL-2, TCR-2 crosslinking, or PMA/Ca-ionophore (data not

4. Publikation 34

shown).

A further interesting result of our study is the early upregulation of CRTAM on

γδ T cells following stimulation of αβ T cells with TCR crosslinking. We can

exclude a direct stimulation, since multiple studies have demonstrated that the

TCR-2 mab is specifically recognizing αVβ1 T cells. For instance, staining with

the TCR-1 and TCR-2 mab detects non-overlapping T cell subsets [48] and

immunoprecipitation with these mab also shows distinct biochemical features

[49]. Therefore it could be speculated, that stimulation of αβ T cells leads to either

a cognate or non-cognate interaction of αβ and γδ T cells that induces CRTAM on

γδ T cells. IL-2 secreted by αβ T cells may well be involved in this process, since

IL-2 by itself causes CRTAM expression on γδ T cells. This observation is in line

with earlier reports showing that γδ T cells in the chicken require either αβ T cells

or exogenous cytokines as growth promoting factors [50]. Since assays for the

detection of chicken IL-2 are not available, we performed an IL-2 specific PCR on

either resting or TCR-2 stimulated splenocytes. In this experiment a strong

upregulation of IL-2 mRNA is observed (Fig. S1, Text S1). The mechanism of

CRTAM induction on γδ T cells following TCR-2 crosslinking needs to be

studied in greater detail in future experiments. This will also include an analysis

of CD25 expression on resting chicken T cells, which has so far not been

performed comprehensively.

We have also been able to confirm Necl-2 as ligand for CRTAM. In mammals,

Necl-2 is expressed on the basolateral membrane of epithelial cells and on certain

tumor cells [2,7]. The interaction of CRTAM and Necl-2 leads to IFN-γ secretion

and T cell stimulation as well as secretion of IL-22 [2]. It will be of importance to

clarify if similar reactions can be induced in the chicken. Likewise, the recent

observation that CRTAM engagement on Vγ9Vδ2 T cells triggers cell death of

γδ T cells could indicate that the upregulation of CRTAM on splenic γδ T cells in

the chicken is a sign of terminal differentiation that may finally result in apoptosis

if CRTAM binds to Necl-2 [8].

In conclusion, this characterization of chicken CRTAM expression revealed that

CRTAM belongs to a highly conserved receptor family interacting with nectins

and that it resembles an activation antigen differentially regulated on splenic

versus blood αβ and γδ T cells.

4. Publikation 35

Acknowledgments

We would like to thank B. Sperling, B. Schaerer and M. Kohn for expert technical

assistance and PD Dr. S. Härtle for continuous support during cytometric

analyses.

4. Publikation 36

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4. Publikation 41

Figure 1. Identification of chicken CRTAM.

(A) Ig domains (IgV, IgC1), connecting peptides (CP) and cytoplasmic domains

(CY) as well as PDZ-binding motifs (framed) are indicated. The positions of the

signal peptides (SP) and the transmembrane domains (TM) are marked by a bar

above the sequence. The conserved cysteine residues are marked by asterisks.

Exons are numbered according to the genomic structure of the chicken sequence.

The alignment was performed separately for the different exons with ClustalW.

Identical residues are boxed. (B) In order to delineate the phylogenetic

relationships of the chicken and mammalian receptors indicated a neighbor-

joining phylogenetic tree was generated using the MEGA5 software. Accession

numbers: chicken (gg) CRTAM: NP_001025518.1, turkey (tu) CRTAM:

ENSMGAG00000001951, human (hu) CRTAM: NP_062550.2, mouse (mu)

CRTAM: NP_062338.3, human CD226: NP_006557.2, mouse CD226:

NP_848802.2, human CD96: NP_937839.1, mouse CD96: NP_115854.2, human

TIGIT: NP_115854.2, mouse TIGIT: NP_001139797.1.

Figure 2. Generation of a chicken CRTAM specific mab.

(A) Untransfected and CRTAM-FLAG transfected HEK 293 (upper panel) and

BWZ.36 cells (lower panel) were stained with either anti-FLAG or 8A10 mab and

analyzed by flow cytometry. (B) Freshly isolated cells of indicated tissues were

stained with 8A10 mab. One of three independent experiments is shown.

Figure 3. CRTAM expression upon activation.

Either splenocytes (A) or PBL (B) were stimulated with IL-2 (upper and middle

panels) or plate bound anti-TCR-2 (lower panels) for the indicated time periods

followed by immuofluorescence analysis using 8A10 mab and anti-CD25 mab

(middle panels). The markers were set according to isotype matched negative

controls and the percentage of positive cells is indicated.

Figure 4. IL-2 stimulation leads to CRTAM upregulation on CD8 positive

γδ T cells.

Splenocytes were stimulated with recombinant IL-2 for 2 h. Different cell subsets

were analyzed by staining with CRTAM specific mab 8A10 in combination with

mab specific for CD3, CD4, CD8, Bu1, γδ-TCR, αVβ1-TCR and αVβ2-TCR as

4. Publikation 42

indicated. The markers were set according to the isotype matched negative

controls. The percentage of positive cells is indicated.

Figure 5. CRTAM expression is induced on splenic γδ T cells and blood

αβ T cells at different time points following TCR-2 stimulation.

Splenocytes (A, B) and PBL (C) were stimulated with plate bound anti-TCR-2 for

2 h (A) and 48 h (B, C) followed by analysis with mab specific for TCR-γδ or

TCR-αVβ1 in combination with 8A10 mab. The markers were set according to the

isotype matched negative controls and the percentage of positive cells is indicated.

One of three independent experiments is shown.

Figure 6. Sequence alignment of chicken (gg) and human (hu) Necl-2.

Ig-Domains (Ig1, Ig2, Ig-like), connecting peptide (CP) and cytoplasmic domains

(CY) as well as 4.1 (shaded) and PDZ-binding motifs (framed) are indicated.

Identical decoration was used as in Fig. 1. Accession numbers: chicken

XP_417901, human NP_055148.

Figure 7. Chicken CRTAM binds to Necl-2.

(A) The chicken Necl-2-FLAG transfected HEK 293 cells were stained with either

an isotype matched control or anti-FLAG mab (upper panel). The CRTAM-huIg

fusion protein was tested on the same cell line (right histogram, lower panel) and

compared to a control staining of the Necl-2-FLAG transfected cells with an

irrelevant huIg fusion protein (left histogram, lower panel). Mean fluorescence

intensity (MFI) is indicated. (B) A reporter assay as described in the methods

section was initiated to analyze the binding of CRTAM and Necl-2. Mean ± SD of

twelve independent assays is shown. Lower case letters denote significant

differences (p<0.01667) of each denoted group compared with following groups:

(a) anti-FLAG positive control (p<0,001), BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor

ligand pair (p<0,001) and BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair

blocked with 1:10 diluted CRTAM-huIg (p<0,001), (b) all other treatment groups,

(c) BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair blocked with undiluted

CRTAM-huIg (p<0,001), (d) BWZ-CRTAM + 293-Necl-2 receptor ligand pair

blocked with 1:10 diluted CRTAM-huIg (p < 0,001). (C) For conjugate assays,

BWZ.36 cells and CRTAM transfected BWZ.36 cells were labeled with PKH67,

4. Publikation 43

whereas 293-Necl-2 cells were labeled with Vybrant® DiD. 293-Necl-2

transfectants only formed conjugates with CRTAM transfected (middle panel) but

not with untransfected BWZ.36 cells (upper panel). Preincubation of the CRTAM

transfected BWZ.36 cells with 8A10 mab prior to coincubation with 293-Necl-2

cells almost completely reduced conjugate formation (lower panel). Percentage of

conjugates is indicated. One of three independent experiments is shown.

4. Publikation 44

Table 1 Oligonucleotides used for cloning

Number Sequence O Specificity

1718 GGACGATGACGATAAGGAAttcgaaaccataactgta S CRTAM

1719 CTGTGCTGGATATCTGCAatccttctccttcttac AS CRTAM

1740 GGACGATGACGATAAGggccagaacttgataacag S Necl-2

1741 TGGATATCTGCAGAATTcgtccacgctccttattg AS Necl-2

1756 AAGCTGGTGCCACGCGaaaccataactgtacagg S CRTAM-Ig

1757 GGCATGTGTGAGTTTTGtccttctccttcttactc AS CRTAM-Ig

O: orientation indicated as S (sense) and AS (antisense); Capital letters denote

regions overlapping with vectors and lower case letters those regions specific for

the gene indicated.

4. Publikation 45

Figure 1A

Figure 1B

4. Publikation 46

Figure 2A

Figure 2B

4. Publikation 47

Figure 3A

4. Publikation 48

Figure 3B

4. Publikation 49

Figure 4

Figure 5

4. Publikation 50

Figure 6

Figure 7A

4. Publikation 51

Figure 7B

Figure 7C

5. Publikation 52

Supplementary Figure 1

Supplementary Text 1

Supplementary Materials and Methods

Cell preparation

For PCR analysis freshly isolated splenocytes were prepared by passing the organ

through a stainless steel mesh. Lymphocytes were obtained from the cell

suspension by density centrifugation on Ficoll-Hypaque (Biochrom, Berlin,

Germany).

mRNA preparation and cDNA synthesis

Total RNA was isolated from unstimulated splenocytes or splenocytes stimulated

with TCR-2 mab for 2 hours using the Trizol method (Peqlab, Erlangen,

Germany). For removal of genomic DNA, the Rapid Out DNA Removal Kit was

applied (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany). Finally, cDNA was amplified using

the ThermoScriptTM

RT-PCR System for First-Strand cDNA Synthesis

(Invitrogen, Karlsruhe, Germany).

PCR analysis

A PCR was performed using the GoTaq® DNA Polymerase (Promega, Madison,

USA). The primers utilized for amplification were as follows:

ß-actin, sense primer (5´- TACCACAATGTACCCTGGC-3´) and anti-sense

primer (5´- CTCGTCTTGTTTTATGCGC-3´);

IL-2, sense primer (5´- ACCAACTGAGACCCAGGAGT-3´) and anti-sense

primer (5´- CCGGTGTGATTTAGACCCGT-3´).

5. Diskussion 53

5. DISKUSSION

Die kritische Rolle der Kostimulation bei der Regulation des Immunsystems hat

vor allem in den letzten Jahren den Antrieb dazu gegeben, kostimulatorische

Signalwege zur Feinabstimmung von T-Zell-Antworten zu erforschen. Dabei ist

man auf das TIGIT/CD226 Netzwerk gestoßen, welches analog dem gut

charakterisierten CD28/CTLA4-Weg zur T-Zell-Aktivierung oder zur Anergie der

T-Zellen beizutragen scheint und dem eine wichtige Rolle bei der Regulation von

humanen Autoimmunerkrankungen zugesprochen wird [6]. Diese beiden

Moleküle gehören zu einer Gruppe von Proteinen, deren Gemeinsamkeit unter

anderem darin besteht, dass sie an Familienmitglieder der Nectine und Necls

binden [7, 8]. Obwohl TIGIT im Hühnergenom noch nicht aufgefunden wurde,

könnte durch das Vorhandensein der anderen Mitglieder dieser wichtigen Gruppe

von Rezeptoren, nämlich CRTAM und CD226, das System zur Regulation von

T-Zell-Antworten auch im Huhn konserviert sein.

Während das Hühner cTADS im Jahr 2000 als ein neues Mitglied der

Ig-Superfamilie mit Ähnlichkeiten zu verschiedenen Zelladhäsionsmolekülen

beschrieben wurde [94], identifizierte man etwa zur selben Zeit beim Säuger das

CRTAM Gen. Daher war die Herstellung einer Verbindung dieser beiden

Moleküle durch die annähernd gleichzeitige Veröffentlichung erschwert [87].

Jedoch fallen schon beim Vergleich der Aminosäuresequenzen ähnliche

Strukturmerkmale dieser beiden Proteine auf. 2004 arbeitete dann eine Studie die

Beziehung vom Säuger CRTAM und dem Hühner cTADS heraus [95]. Diese

Studie zielte darauf ab, eine Verbindung zwischen dem angeborenen

Immunsystems des Urchordate Ciona intestinalis und den Rezeptoren des

adaptiven Immunsystems der Ig-Superfamilie herzustellen. Interessanterweise

scheint CRTAM neben den weit entfernten Homologen in Nicht-Säuger

Vertebraten auch Homologe in Drosophila zu haben. Dort teilt die BEAT Familie,

eine Multigenfamilie, welche Proteine der Ig-Superfamilie kodiert, ähnliche

strukturelle Merkmale, so z.B. eine identische Organisation der Domänen [95]. In

Ciona intestinalis begründet ein Gencluster, welches auf den Chromosomen 4 und

10 repräsentiert ist, vier paraloge Regionen durch zwei komplette

Genomduplikationen [96]. Vergleichende Studien haben gezeigt, dass im

Hühnergenom die Chromosomen 1, 4, 24 und 31 diese paralogen Regionen

darstellen und tatsächlich sind mehrere wichtige Gruppen der Ig-Superfamilie auf

5. Diskussion 54

diesen Chromosomen lokalisiert, wie die CD200 Familie auf Chromosom 1, das

Hühner Leukozytenrezeptorcluster auf Chromosom 31, sowie CRTAM und Necl-

2 auf Chromosom 24 [97-99].

Bereits 2010 erwähnte die Arbeitsgruppe um Garay die Sequenzähnlichkeit von

CRTAM und Necl-2, vor allem bezüglich der ersten Ig-ähnlichen Domäne.

Außerdem arbeitete sie heraus, dass CRTAM eher den Necls als den junctional

cell adhesion molecules (JAMs) gleicht [92]. Auch teilt CRTAM mit den Necls

charakteristische Züge bezüglich der Proteinsequenz und ist phylogenetisch näher

verwandt zu ihnen [100]. Im Hühner CRTAM und Necl-2 finden sich die gleichen

charakteristischen Aminosäurenstrukturen wie beim Säuger, bei welchem sie für

homo- und heterotypische Bindungen verantwortlich sind (Abbildung 4). Es wäre

also durchaus denkbar, dass beim Huhn dieselben Aminosäuren wie beim Säuger

an der Ligandenbindung beteiligt sind, was jedoch zukünftig noch durch gezielte

Punktmutationsstudien verifiziert werden muss.

Abbildung 4: Sequenz-Alignement der ersten Ig-ähnlichen Domäne von Hühner (gg)

und humanem (hu) CRTAM sowie Necl-2. Die charakteristischen Rezeptor-Liganden-

Bindungsstellen, welche die hauptsächlichen Kontakte in der Homo- und

Heterodimerbildung repräsentieren, sind blau eingezeichnet. Dabei stellen F39 und Y84

bei huCRTAM und Y83 und P47/L48 bei huNecl-2 sehr wichtige Bindungsstellen dar.

Beim Huhn sind diese wichtigen Aminosäuren ebenfalls vorhanden, was dafür sprechen

könnte, dass beim Huhn dieselben Aminosäurenstrukturen wie beim Menschen für die

Ligandenbindung verantwortlich sein könnten. Abbildung modifiziert nach Zhang et al.

[100]

In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde eine neue Methode verwendet, um

die enge Verbindung von CRTAM und der Nectin-Familie zu demonstrieren. Man

kam zu dem Ergebnis, dass beide Rezeptoren zu der Nectin-like Familie gehören

[101]. Die Erkenntnis, dass beide Gene zusätzliche Exons in Hühnervögeln teilen,

unterstützt dieses Resultat. Ein herausragendes Merkmal von Necl-2 und CRTAM

ist nämlich eine Besonderheit in ihrer genomischen Organisation im Vergleich zu

anderen Mitgliedern der Ig-Superfamilie. Beide enthalten zwei zusätzliche Exons,

5. Diskussion 55

welche für Reste kodieren, die sich zwischen den membranproximalen und den

transmembranen Domänen befinden. Jedoch bleibt zu klären, warum diese Region

in den Säugermolekülen nicht vorhanden ist und was die funktionelle Relevanz

einer erweiterten membranproximalen Region darstellt.

Ein weiteres charakteristisches Merkmal von CRTAM und anderen Nectinen ist

ihre Expression auf Leukozyten, auf Zellen des Nervensystems, wie z.B. Purkinje

Zellen im Kleinhirn [93] und auf Epithelzellen [92]. Die Analyse der CRTAM

Expression im Gehirn geht über die Zielsetzung dieser Arbeit hinaus, wird aber in

zukünftigen Studien untersucht. Zusammenfassend ist zu sagen, dass CRTAM ein

gut konserviertes Molekül darstellt, welches verschiedene Funktionen im

Immunsystem und Nervensystem erfüllt.

Um einen näheren Einblick in die Gewebeexpression von CRTAM im

Allgemeinen und die Expression auf Leukozyten im Besonderen zu erhalten,

wurde ein monoklonaler Antikörper generiert. Dabei konnte auf frisch isolierten

Zellen von mehreren Geweben keine CRTAM Oberflächenexpression

nachgewiesen werden, was gut mit den Säugerdaten der CRTAM Expression

korreliert. Daraufhin wurden mehrere Aktivierungsmethoden sowohl an Milz- als

auch Blutzellen getestet. Ein faszinierender Aspekt dabei war die unterschiedliche

und transiente Expression von CRTAM auf aktivierten Zellen. Während das

Molekül in der Milz bereits zwei Stunden nach Stimulation mit TCR-2 und IL-2

exprimiert wird, zeigt sich die Expression im Blut erst nach 24 bis 48 Stunden und

nur bei Stimulation mit TCR-2.

Die rasche CRTAM Hochregulation auf Milzzellen zwei Stunden nach IL-2 oder

TCR-2 Stimulation stimmt mit Daten überein, die über die mRNA-Expression

von cTADS veröffentlicht wurden [94]. Da CRTAM mRNA sehr früh nach

zellulärer Aktivierung nachweisbar ist, spricht das eher für eine de novo

Proteinbiosynthese von CRTAM als für eine Oberflächenexpression von

präformierten, intrazellulär gelagerten Rezeptorproteinen, wie es z.B. für

Moleküle wie CD300a bekannt ist [102].

Diese frühe Hochregulation auf Milzzellen durch IL-2 war hauptsächlich auf

γδ T-Zellen nachweisbar. Bei Blutzellen ergab sich hingegen ein ganz anderes

Expressionsmuster. Nach IL-2 Stimulation von PBL konnte CRTAM nicht auf der

Zelloberfläche nachgewiesen werden, obwohl durch Detektion der α-Kette des

IL-2 Rezeptors (CD25) aufgezeigt werden konnte, dass die Stimulation von PBL

durch IL-2 im Allgemeinen funktioniert hat.

5. Diskussion 56

Im Gegensatz dazu wurde nach TCR-2 Kreuzvernetzung CRTAM auf PBL

exprimiert, aber zu späteren Zeitpunkten mit einem Maximum nach 48 Stunden

Stimulation und hauptsächlich auf αVβ1 T-Zellen. Somit ergeben sich für Milz-

und Blutzellen zwei völlig verschiedene Expressionsmuster von CRTAM. Milz

und Blut γδ T-Zellen unterscheiden sich auch in ihrer Expression von anderen

Molekülen, so fehlen z.B. Blut γδ T-Zellen die CD6 Expression und sie zeigen

nur geringe Level von CD5 auf der Oberfläche [103-105]. Während Blut

γδ T-Zellen also widerstandsfähig gegen Aktivierung zu sein scheinen, kann eine

Untergruppe von Milz γδ T-Zellen ohne Umstände aktiviert werden.

Wegen der frühen Expression auf vor allem CD8 positiven γδ T-Zellen stellt

CRTAM einen frühen und transienten Aktivierungsmarker für die zytotoxische

T-Zellantwort dar. Das transiente Erscheinen von CRTAM auf der Zelloberfläche

könnte eine Vermeidungsstrategie darstellen, da so hauptsächlich spezifische

Interaktionen zwischen CRTAM und Necl-2 forciert werden und nichtspezifische

unnötige Adhäsionen und somit ungerichtete Immunreaktionen minimiert werden

[9].

Aufgrund der hohen Expression von CRTAM auf γδ T-Zellen der Milz wurde

auch die intestinale intraepitheliale Lymphozytenpopulation (IEL), eine andere

reiche Quelle von γδ T-Zellen beim Huhn, auf CRTAM-Expression untersucht.

Dabei war es weder möglich, CRTAM auf unaktivierten noch auf aktivierten IEL

nachzuweisen. Diese Ergebnisse könnten darauf hinweisen, dass IEL wiederum

eine andere Untergruppe von γδ T-Zellen beherbergt. Es wurde schon

beschrieben, dass sich diese Population auch in der Expression eines weiteren

Moleküls von anderen γδ T-Zellen unterscheidet, sie exprimieren nämlich CD8αα

Homodimere anstelle von CD8αβ Heterodimeren [106].

Ein weiterer interessanter Aspekt ist die frühe Hochregulierung von CRTAM auf

γδ T-Zellen der Milz nach Stimulation der αβ T-Zellen durch TCR-2

Kreuzvernetzung. Der TCR-2 Antikörper erkennt spezifisch αVβ1 T-Zellen, daher

kann eine direkte Stimulation der γδ T-Zellen durch diesen Antikörper

ausgeschlossen werden [107, 108]. Eine mögliche Begründung dafür konnte sein,

dass die IL-2 Sekretion von den durch TCR-2 aktivierten αVβ1 T-Zellen in den

Prozess der Stimulation von γδ T-Zellen beteiligt ist, da schon IL-2 für sich

CRTAM Expression auf γδ T-Zellen induziert. Bereits in früheren Berichten

wurde gezeigt, dass γδ T-Zellen im Huhn entweder αβ T-Zellen oder exogene

Zytokine als Wachstumsfaktoren benötigen [109]. Zur vollständigen Abklärung

5. Diskussion 57

dieser Hypothese wäre es jedoch nötig, IL-2 durch einen spezifischen Assay

nachzuweisen. Da solch ein sensitives Nachweissystem beim Huhn leider noch

nicht verfügbar ist, wurde eine IL-2 spezifische PCR mit unstimulierten und zwei

Stunden TCR-2 stimulierten Milzlymphozyten durchgeführt. Dabei konnte in

diesem Experiment eine eindeutige Hochregulierung von IL-2 mRNA nach

TCR-2 Stimulation nachgewiesen werden.

Es war außerdem möglich, Necl-2 in drei voneinander unabhängigen Assays

eindeutig als Ligand für CRTAM zu bestätigen und diese Ergebnisse durch eine

detaillierte statistische Auswertung zu untermauern. Im Säuger ist Necl-2 auf der

basolateralen Membran von Epithelzellen und auf verschiedenen Tumorzellen

exprimiert [8, 92]. Die Interaktion von CRTAM und Necl-2 führt zur IFN-γ

Sekretion und T-Zell-Stimulation, als auch zur Sekretion von IL-22 [10, 11]. Ein

wichtiger Schritt zur Abklärung, ob ähnliche Reaktionen im Huhn vorhanden

sind, wäre die Etablierung eines Nachweisverfahrens für IFN-γ. Erste Versuche

der Stimulation von CRTAM positiven Zellen zur IFN-γ Sekretion und der

Nachweis dieses Zytokins blieben bis jetzt jedoch erfolglos.

Ein wichtiger Unterschied zum Säuger CRTAM besteht darin, dass beim Huhn

keine CRTAM-Expression auf NK-Zellen nachgewiesen werden konnte.

Im adulten Huhn sind die NK-Zell-Frequenzen entweder sehr niedrig, z.B. im

Blut, oder nicht nachweisbar, z.B. in der Milz. Jedoch beherbergten IEL eine

höhere Frequenz von NK-Zellen. Weder auf vom Blut stammenden, noch auf von

Dünndarm isolierten NK-Zellen konnte vor und nach Stimulation eine CRTAM

Expression nachgewiesen werden. Eine mögliche Erklärung dafür könnte aus der

Tatsache entstehen, dass die Lymphozyten-Subpopulationen vom Huhn im

Vergleich zu denen von Mensch und Maus anders zusammengesetzt sind. Hühner

besitzen eine viel höhere Rate von γδ T-Zellen (bis zu 50 % der Milz und Blut

Lymphozyten [110]), jedoch viel geringere Frequenzen an NK-Zellen. Dieses

könnte darauf hindeuten, dass γδ T-Zellen und NK-Zellen ähnliche Funktionen

haben und um die gleiche immunologische Nische konkurrieren [111].

Im Gegensatz zu den Daten von Ruble und Forster, welche unter anderem die

embryonale CRTAM-Expression auf mRNA-Ebene untersucht haben, konnte im

Rahmen dieser Arbeit keine CRTAM-Oberflächenexpression auf embryonalen

Thymuszellen festgestellt werden [94]. Somit konnte auch die These nicht

bestätigt werden, dass CRTAM für die embryonale T-Zell-Proliferation wichtig

sein könnte.

5. Diskussion 58

Durch die Charakterisierung des Oberflächenrezeptors CRTAM im Huhn war es

möglich, einen frühen Aktivierungsmarker für die spezifische T-Zell-Antwort im

Huhn zu generieren und somit tiefere Einblicke in die adaptive Immunantwort

beim Huhn zu erhalten. Auch ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, Necl-2 als

Bindungspartner für CRTAM im Huhn zu identifizieren. Zudem konnte ein erster

Schritt gemacht werden, um nähere Einblicke in immunmodulatorische Vorgänge

beim Huhn zu erlangen. Um dieses Ziel weiter zu verfolgen und ein eventuelles

Zusammenspiel von CRTAM mit anderen Rezeptoren seiner Familie zu klären,

werden zukünftig weitere Vertreter dieser Gruppe, wie zur Zeit der Rezeptor

CD226, charakterisiert.

6. Zusammenfassung 59

6. ZUSAMMENFASSUNG

Charakterisierung von Hühner CRTAM

Das cTADS Molekül wurde ursprünglich bereits 2000 als ein neues Mitglied der

Ig-Superfamilie identifiziert, welches möglicherweise in T-Zell-Aktivierung und

-Entwicklung involviert ist. Durch seine Sequenzähnlichkeiten und typischen

konservierten Sequenzstrukturen konnte dieses Molekül als CRTAM-Homolog

identifiziert werden.

Um das Expressionsmuster dieses Moleküls aufzuzeigen und insbesondere um

herauszustellen, ob CRTAM einen möglichen immunmodulatorisch wirkenden

Oberflächenrezeptor im Huhn darstellt, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein

spezifischer monoklonaler Antikörper generiert.

Während auf unaktivierten Zellen verschiedener Hühnergewebe und Blutzellen

keine CRTAM-Expression nachgewiesen werden konnte, war dieses Molekül

transient auf CD8 positiven T-Zellen von Blut, Thymus, Milz und Caecaltonsillen

nach Aktivierung mit rekombinanten IL-2, Concavalin A, TCR-Kreuzvernetzung

und Phorbol Myristate Acetat-Calcium-Ionophor nachweisbar.

Die Aktivierung von Milzzellen mit rekombinanten IL-2 führte zu einer raschen

und transienten CRTAM-Expression innerhalb zwei Stunden auf CD8 positiven

γδ T-Lymphozyten, wohingegen auf PBL keine CRTAM Expression stimuliert

werden konnte. Im Gegensatz dazu führte die TCR Kreuzvernetzung mit einem

anti- αVβ1 TCR Antikörper zu einer CRTAM-Expression auf sowohl PBL, als

auch auf Milzzellen, aber mit einer unterschiedlichen Kinetik und auf

verschiedenen T-Zell-Subpopulationen. Während die TCR-2 Stimulation von PBL

zu einer CRTAM-Expression auf αβ T-Zellen mit einem Maximum zwischen 24

und 48 Stunden Stimulation führte, zeigte die CRTAM Expression auf Milzzellen

zwei Stunden nach Stimulation ihr Maximum. Dabei war sie nach zwei Stunden

beschränkt auf CD8 positive γδ T-Lymphozyten und erst nach 24 bis 48 Stunden

auch auf αβ T-Zellen nachweisbar.

Um den potentiellen Liganden zu charakterisieren, wurden drei voneinander

unabhängige Assays generiert und somit konnte Necl-2, ein Mitglied der Nectin

und Necl-Familie von Zelladhäsionsmolekülen, als ein Ligand für Hühner

CRTAM identifiziert werden.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass CRTAM nur auf aktivierten CD8

positiven T-Lymphozyten exprimiert wird und Necl-2 den Bindungspartner für

6. Zusammenfassung 60

das Hühner CRTAM darstellt.

Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Hühner CRTAM einen Oberflächenmarker

auf aktivierten CD8 positiven T-Zellen im Huhn darstellt und dass die Interaktion

zwischen CRTAM und Necl-2 eine wichtige Rolle bei der Zelladhäsion und der

Interaktion von aktivierten zytotoxischen T-Zellen spielen könnte.

7. Summary 61

7. SUMMARY

Characterization of chicken CRTAM

The cTADS molecule was originally described as a new member of the

immunoglobulin superfamily potentially involved in T cell activation and

development. Due to sequence identity and typical conserved sequence features,

this molecule could be identified as a CRTAM homologue.

In order to delineate the expression pattern of this molecule and in particular its

potential as an immunomodulatory cell surface receptor, a monoclonal antibody

was generated.

Staining of various chicken tissues and blood cells revealed no reactivity. In

contrast, CRTAM surface expression was transiently detectable on CD8 positive

T cells isolated from blood, thymus, spleen and caecal tonsils following activation

with recombinant IL-2 as well as with Concanvalin A, TCR crosslinking with

anti-TCR2 and phorbol myristate acetate-calcium-ionophore treatment.

Activation of splenocytes with recombinant IL-2 led to a rapid and transient

CRTAM expression within 2 hours on CD8+ γδ T lymphocytes, whereas on PBL

no CRTAM expression was detectable. In contrast, TCR crosslinking using an

anti- αVβ1 TCR induced CRTAM expression on both PBL and splenocytes but

with different kinetics and on different subpopulations. The anti-TCR-2

stimulation of PBL resulted in a CRTAM expression on αβ T cells with an

optimum in between 24 to 48 hours of stimulation. However, the CRTAM

expression on splenocytes after 2 hours of stimulation was restricted to CD8+ γδ T

lymphocytes and only detectable on αβ T cells 24-48 h after stimulation.

In order to characterize the potential ligand, three independent assays were

generated and as a result chicken Necl-2, a family member of the Nectin and

Nectin-like cell adhesion molecules, could be identified as a ligand of chicken

CRTAM.

In summary, chicken CRTAM is only expressed on activated cytotoxic

lymphocytes and the Nectin-like protein 2 functions as a binding partner to

chicken CRTAM.

These results demonstrate that chicken CRTAM represents a surface marker for

activated CD8 positive T cells in chicken and that the CRTAM- Necl-2 interaction

could play an important role in cell adhesion and cytotoxic T cell function.

8. Literaturverzeichnis 62

8. LITERATURVERZEICHNIS

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IX. Danksagung 71

9. DANKSAGUNG

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Göbel, der es mir ermöglicht hat,

in seinem Labor und unter seiner Leitung diese Arbeit anfertigen zu dürfen. Seine

hervorragende fachliche Betreuung und seine konstruktiven Hilfestellungen waren

von unschätzbarem Wert für das Gelingen dieser Arbeit.

Bei Herrn Prof. Dr. Stangassinger bedanke ich mich ganz herzlich für den am

Institut zur Verfügung gestellten Arbeitsplatz und die guten Arbeitsbedingungen.

Besonderen Dank möchte ich auch Frau PD Dr. Birgit Viertlböck, Frau PD Dr.

Sonja Härtle und Herrn Prof. Dr. Kaspers für ihre stete Bereitschaft zur

Diskussion und ihre kritischen Beiträge aussprechen. Sie halfen mir dadurch,

mein Themengebiet aus einem anderen Blickwinkel zu betrachteten.

Beatrice Sperling, Marina Kohn, Beatrice Schaerer und Ingrid Riehl danke ich für

die gute Einarbeitung und die fortwährende Hilfestellung bei allen methodischen

Problemen.

Ich danke weiterhin allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppen Deeg und Kaspers für

die freundliche und hilfsbereite Zusammenarbeit.

Mein Dank gilt ferner meiner Arbeitsgruppe für das außergewöhnlich gute

Arbeitsklima und die kollegiale Zusammenarbeit im Labor.

Ganz besonders danken möchte ich meinen Mitstreitern, die in privaten und

fachlichen Fragen immer ein offenes Ohr und aufbauenden Zuspruch für mich

hatten.

Barbara Schreiner, Julia Schermuly und Christian Straub möchte ich für ihre

Freundschaft und die schöne gemeinsame Zeit danken.

Bei Fritz Meggendorfer und Thomas Hoschka bedanke ich mich für die

Betreuung der Tiere und die gute Zusammenarbeit im Tierstall.

Meiner Familie, besonders meinen Eltern, möchte ich für die fortwährende

seelische und finanzielle Unterstützung und die Ermöglichung meines Studiums

danken.

Ganz besonders möchte ich meinem Vater und meiner Mutter für ihre Wärme,

ihre Anteilnahme und ihre Rückendeckung danken, die es mir erst möglich

IX. Danksagung 72

machten, in manchen schwierigen Situationen auf meinem Weg zu bleiben.

Auch möchte ich meinen Geschwistern, meinen größten Vertrauten und ständigen

Wegbegleitern, für ihre Loyalität und ihre Anteilnahme danken.

Ich kann mich glücklich schätzen, eine so tolle Familie zu haben!