Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen.

Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente


Guten Morgen


Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Tag 4

Auswertung von Bindungsexperimenten

Aufgabe 9: Bindungsgleichgewichte

Aufgabe 10: Identische, unabhängige Bindungsstellen

Aufgabe 11+12: Unabhängige Bindungsstellen

Aufgabe 13: Kooperative Bindung

Aufgabe 14: Auswertung von Bindungsdaten nach

verschiedenen Modellen


Binäre Bindungsgleichgewichten

BA

ABAss cc

c

k

kK

1

1

)c(c)c(c

c

cc

c

k

kK

ABB,gesABA,ges

AB

BA

ABAss

1

1

Modell

nach ausmultiplizieren und umstellen:

ABBAk

k

1

1

mit ci=cA,ges-cAB erhält man:

01

,,,,

2

gesBgesAAB

AssgesBgesAAB ccc

Kccc



Auswertung von binären Bindungsgleichgewichten

p q x² + px + q = 0

qpp

x ,

2

21 22

B,gesA,gesAssB,gesA,gesAssB,gesA,ges

AB cc/Kcc/Kcc

c

2

2

1

2

1

Es kann nur „-“ gelten

Warum?

01

,,,,

2

gesBgesAAB

AssgesBgesAAB ccc

Kccc


Binäre Bindungsgleichgewichte

Modell:

Ziel:

Signal = BL + fAB cAB


AB cc/Kcc/Kcc

c

2

2

1

2

1

ABBAk

k

1

1

)c c f(K c B,gesA,gesAssAB ,,


Auswertung von binären Bindungsgleichgewichten

Modell:

Lösung:

cA, ges [nM] 1,00E+00

Null 4,30E-03F(AB) 1,01E+00

KAss [M] 9,87E+07

0

cB,ges [nM] Signal, exp cAB,theo [nM] Signal,theo FQ

0 0 0,00 0,00 0

1,00E-01 1,01E-02 0,01 0,01 0

2,00E-01 1,94E-02 0,02 0,02 0

5,00E-01 4,69E-02 0,04 0,05 01,00E+00 9,18E-02 0,08 0,09 0

2,00E+00 1,69E-01 0,15 0,16 0

5,00E+00 3,31E-01 0,32 0,32 0

1,00E+01 4,89E-01 0,48 0,49 02,00E+01 6,54E-01 0,66 0,67 0

5,00E+01 8,49E-01 0,83 0,84 0

1,00E+02 9,20E-01 0,91 0,92 0

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 50 100

cB [nM]

Sig

nal

Signal, exp

Signal,theo

ABBAk

k

1

1


AB cc/Kcc/Kcc

c

2

2

1

2

1


Mehrere, identische Bindungsstellen

Beispiel:

Modell: A + nB ABn

k1

k-1

Protein bindet unspezifisch an DNA

Jedes Molekül A hat n Bindungsstellen.Effektive Konzentration der Bindungsstellen für B ist n×cA.



AB ccn/Kccn/Kccn

c

2

2

1

2

1

Mehrere, identische Bindungsstellen

Modell: A + nB ABn

k1

k-1

Modell:

A + B AB


AB cc/Kcc/Kcc

c

2

2

1

2

1


Grenzen von Modellen und Schlussfolgerungen

Niedrige Konzentration der konstanten Komponente (A)

A

A

AA

+BAB

A

AB

B

B

B

BB B

A

+BAB

A

ABB

B

B

B

BB B

B

BB

BB

A

+BAB

A

ABB

B

B

B

BB B

B

BB

BB

AB

BB

BB

)c(c)c(c

c

cc

c

k

kK

ABB,gesABA,ges

AB

BA

ABAss

1

1

wenn cA<<cB dann gilt cBcB,ges

B,gesABA,ges

ABAss c)c(c

cK

AssB,ges

AssB,ges

A,ges

AB

Kc

Kc

c

cΘ

1

Relative Sättigung ist unabhängig von cA.Stöchiometrie kann nicht bestimmt werden

Wir brauchen großen Überschuß von B um A zu sättigen. Stöchiometrie kann nicht bestimmt werden.


cA<<1/KAss

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0 1000 2000 3000 4000

cB/cA

Sig

nal

Kurvenformdefiniert KAss

KAss kann genau bestimmt werdenn ist nicht definiert

Niedrige Konzentration der konstanten Komponente (A)

Grenzen von Modellen und Schlußfolgerungen


Hohe Konzentration der konstanten Komponente (A)

A

A

AA

+BAB

A

ABA

+BAB

AB

ABAB

+BAB

AB

ABB

B

BB

AB

Stöchiometrische TitrationA, B und AB koexistieren nichtKAss kann nicht bestimmt werden

Grenzen von Modellen und Schlußfolgerungen


Grenzen von Modellen und Schlussfolgerungen

cA>>K Ass

0.00

2.00

4.00

6.00

8.00

10.00

12.00

0 2 4 6 8

cB/cA

Sig

na

l

KAss kann nicht bestimmt werdenn ist sehr genau messbar

Stoichiometrie bei Sättigung definiert n

Hohe Konzentration der konstanten Komponente (A)


Verschiedene Modelle vergleichen

Das Modell definiert die Beziehungen zwischen den Meßgrößen und den Variablen des Experiments, z.B. der Konzentration eines Komplexes AB in Abhängigkeit von der Zeit, sowie der Konzentrationen von A und B:

cAB = f(t, cA, cB)

Ein Modell ist immer als Arbeitshypothese zu betrachten, die angezweifelt werden muß, wenn keine gute Anpassung der Daten möglich ist. Will man ein Modell durch ein komplizierteres ersetzen, ist genau zu überprüfen, ob die Daten dies rechtfertigen.


Gültigkeitskriterien für Modelle

• Absolutbetrag der Abweichungen: Liegt die theoretische Kurve im Bereich der experimentellen Unsicherheiten jedes einzelnen Messpunktes?

könnte OK seinkann nicht sein !



• Verteilung der Abweichungen: zufällig oder systematisch ( Runs test)

könnte OK sein eher unwahrscheinlich



• Gibt es ein Alternativmodell und können die Daten damit besser angepaßt werden?

besseres ModellModell wechseln

kein besseres Modellaltes Modell weiterverwenden



Absolutbetrag der Abweichungen: Liegt die theoretische Kurve im Bereich der experimentellen Unsicherheiten jedes einzelnen Messpunkts?

Verteilung der Abweichungen: zufällig oder systematisch?

Gibt es ein Alternativmodell und können die Daten damit besser angepasst werden?

Ein gutes Modell sollte auch Daten erklären können, die bei der Formulierung des Modells noch nicht bekannt waren.


Das Prinzip der „Sparsamkeit“

Daten sollen mit möglichst wenig Variablen beschrieben werden.

Achtung: Jede kompliziertere Variante eines Modell, das die Daten beschreibt, beschreibt die Daten auch!

Experimentell kann ein ungeeignetes Modell widerlegt, aber nie die Gültigkeit eines geeigneten Modells bewiesen werden.

Insbesondere ist es schwierig zu erkennen, daß ein zu kompliziertes Modell gewählt wurde.



Auswertung von BindungsgleichgewichtenModell: A + B AB

BA

AB

1

1Ass cc

c

k

kK

mit: cA << cB, d.h. cB cB,ges.) ergibt sich:

BABgesA,

ABAss c)c(c

cK

cAB = KAss×cB,ges. ×cA,ges. - KAss×cB,ges. ×cAB

cAB (1+ KAss×cB,ges.) = KAss×cB,ges. ×cA,ges.

ges.B,Ass

ges.B,Ass

ges.A,

AB

cK1

cK

c

c

Relative Besetzung der Bindungsstelle (cAB/cA,ges.) ist unabhängig von cA,ges.

Stöchiometrie der Bindung kann nicht gemessen werden



2 Bindungsstellen

Modell:

A

AB

BA

BAB

K1

K4K2

K3

K1=K4, K2=K3 unabhängige Bindungsstellen

K1<<K3, K2<<K4 kooperative Bindung

A AB AB2

+B

-B

+B

-B



Unabhängige Bindungsstellen

ges.B,iAss,

ges.B,iAss,

ges.A,i cK1

cK

c

besetztisiteθ

Modell: A AB AB2 ... ABn

+B

-B

+B

-B

+B

-B

+B

-B

n

ii

A,ges

B,geb Θc

c

1

n

ii

A,ges

AB,geb

c

c

1

d.h. man misst die cB,geb in Abhängigkeit von cA,ges




Fall 1: Detektion von Bgebunden

(KAss,1 >> KAss,2)

c B,ges.

1+2

2

1

2

B,ges.c

1+2

1

• Abweichung der Kurvenform deutet auf 2 Bindungsstellen

• nur detektierbar, wenn sich KAss,1

und KAss,2 deutlich unterscheiden




0

0,5

1

cB,ges.

1 = 2

12

0

0,5

1

cB,ges.

• verzögerte Besetzung von AB2

• leicht sigmoidale Kurvenform

Fall 2: Detektion von AB2

(KAss,1 KAss,2)

1 = 2

12



Kooperative Bindung (Hill Modell)

Assn

B

Assn

B

ges.A,

AB

Kc1

Kc

c

cn

Modell: A + nB ABn

Vorraussetzung: cA << cB, d.h. cB cB,ges.

nBA

AB

1

1Ass

cc

c

k

kK

mit: KAss = Kin



Kooperative Bindung (Hill Modell)

cB,ges.

• stark sigmoidale Kurvenform

• verzögerte Besetzung bei kleinen cB,ges.

• steilerer Anstieg der Kurve bei mittleren cB,ges.



Mehrzähniger Ligand, lineares Makromolekül

N: Anzahl Elementarbindungsplätze des Makromoleküls (hier ca. 100)

L: Anzahl Elementarbindungsplätze benötigt pro Ligand (hier 14)

Lücke groß genug für weiteren Liganden

Lücke zu klein für weiteren Liganden

LN

Scheinbare Sättigung tritt zu früh ein !

1L

LigandBdgsstelleges.

Bdgsstellebesetzt

1)Θ(L1

LΘ1

k

)L-N(1

N

c

c

cΘ


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Auswertung von Bindungsexperimenten

Aufgabe 9: Bindungsgleichgewichte

Aufgabe 10: Identische, unabhängige Bindungsstellen

Aufgabe 11+12: Unabhängige Bindungsstellen

Aufgabe 13: Kooperative Bindung

Aufgabe 14: Auswertung von Bindungsdaten nach

verschiedenen Modellen

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