Cytotoxizität gadoliniumhaltiger Kontrastmittel auf renale ... · die Zellen außerdem mit...

Aus dem

Lehrstuhl für Diagostische Radiologie

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med Michael Uder

Cytotoxizität gadoliniumhaltiger Kontrastmittel auf renale

Tubuluszellen in vitro:

Vergleich eines nichtionischen iodhaltigen

Röntgenkontrastmittels mit gadoliniumhaltigen

Kontrastmitteln

bei gleichen molaren Konzentrationen und Konzentrationen

gleicher Röntgendichte

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Sonja Reichert geb. Kohlbacher

aus

Saarbrücken

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung ______________________________________________ 6

Abstract_______________________________________________________ 8 1. Einleitung__________________________________________________ 10

1.1 Kontrastmittel-induzierte Nephropathie ___________________________ 10 1.2 Einteilung und Anwendung der Kontrastmittel_____________________ 11 1.3 Fragestellung _________________________________________________ 20

2. Materialien und Methoden ____________________________________ 21 2.1 Materialien ___________________________________________________ 21 2.2 Methodik _____________________________________________________ 26

3. Ergebnisse _________________________________________________ 34 3.1 Visueller Vergleich der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger Kontrastmittel ___________________________________________________ 34 3.2 Vergleich der Cytotoxizität bei gleicher Röntgendichte ______________ 35 3.3 Vergleich gadoliniumhaltiger und iodhaltiger Kontrastmittel bei äquimolaren Konzentrationen ______________________________________ 37 3.4 Trypanblau-Test_______________________________________________ 44 3.5 ELISA zur Detektion von Apoptose und Nekrose____________________ 46

4. Diskussion _________________________________________________ 50 4.1 Klinische Relevanz der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ______ 50 4.2 Pathogenese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ___________ 52 4.3 Prophylaxe der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie ____________ 53 4.4 Verwendung von Gadoliniumchelaten_____________________________ 54 4.5 Vergleich der Kontrastmittel in vivo ______________________________ 56 4.6 Vergleich der Kontrastmittel in vitro _____________________________ 59 4.7 Kontrastmittelkonzentrationen und Inkubationszeiten ______________ 70 4.8 Zellkultur als in vitro-Modell ____________________________________ 73 4.9 Limitationen der Untersuchungen________________________________ 74 4.10 Resümee und Schlussfolgerung__________________________________ 75

Literaturverzeichnis ____________________________________________ 77

Abkürzungsverzeichnis ________________________________________ 105 Vorveröffentlichungen_________________________________________ 106

Danksagung _________________________________________________ 107

Zusammenfassung

6

Zusammenfassung Hintergrund und Ziele

Die in der Radiologie für diagnostische und interventionelle Röntgenverfahren

eingesetzten iodhaltigen Kontrastmittel können zu schwerwiegenden

Beeinträchtigungen der Nierenfunktion, der kontrastmittelinduzierten

Nephropathie führen, die oft mit hohen Mortalitätsraten einhergeht. Dagegen

gelten die gadoliniumhaltigen MRT-Kontrastmittel als sehr gut

nierenverträglich. Daher wird zurzeit diskutiert, inwiefern der Einsatz

gadoliniumhaltiger Kontrastmittel für CT und Angiographie eine Alternative

zur Verwendung von herkömmlichen iodhaltigen Kontrastmitteln darstellen

könnte.

Methoden

Um die cytotoxischen Effekte eines iodhaltigen Kontrastmittels mit

verschiedenen gadoliniumhaltigen Kontrastmitteln vergleichen zu können,

führten wir Experimente an Kulturen renaler Tubuluszellen (LLC-PK1) durch.

Dazu wurden LLC-PK1-Zellen mit dem Iod-Kontrastmittel Iomeprol und den

Gadolinium-Kontrastmitteln Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin,

Gadoteratmeglumin und Gadodiamid bei gleichen molaren Konzentrationen

und Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte entsprechen für 24

Stunden inkubiert. Um die Rolle der Osmolalität bewerten zu können, wurden

die Zellen außerdem mit Mannitol-Lösungen entsprechender Osmolalität

inkubiert. Die Cytotoxizität wurde durch einen MTT-Konversionstest, einen

Trypanblau-Exklusionstest und einen ELISA zur Detektion von Apoptose und

Nekrose bewertet.

Ergebnisse und Beobachtungen

Bei äquimolaren Konzentrationen zeigten Gadopentetat und Gadobenat eine

signifikant höhere Inhibition der MTT-Konversion als Gadoterat, Gadodiamid

und Iomeprol (p < 0,001). Wie durch den Trypanblau-Test gezeigt werden

konnte, waren nach Inkubation mit Gadopentetat signifikant mehr Zellen

Zusammenfassung

7

abgestorben als nach Inkubation mit Iomeprol (p < 0,001). Gadopentetat und

Gadobenat induzierten signifikant mehr Apoptose und Nekrose als die übrigen

Kontrastmittel (p < 0,001). Bei Konzentrationen gleicher Röntgendichte war

die Inhibition der MTT-Reduktion nach Inkubation mit Iomeprol bei allen

Konzentrationen signifikant geringer als bei allen getesteten Gadolinium-

Kontrastmitteln (p < 0,001). Somit führten alle getesteten gadoliniumhaltigen

Kontrastmittel bei Konzentrationen gleicher Röntgendichte zu stärkeren

cytotoxischen Effekten als das iodhaltige Kontrastmittel. Die ionischen

hochosmolalen Gadoliniumchelate führten zu stärkeren Zellschädigungen als

die nichtionischen Gadolinium-Kontrastmittel mit niedriger Osmolalität.

Praktische Schlussfolgerungen

Unsere Exprimente lassen darauf schließen, dass die gadoliniumhaltigen

Kontrastmittel bei Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte

entsprechen, in vitro ein höheres nephrotoxisches Potential aufweisen, als die

auf Iod basierenden Kontrastmittel. Möglicherweise ist es bei Angiographien

sinnvoller, statt der Gadoliniumchelate zur Nephroprotektion verdünnte

Lösungen der herkömmlichen Iod-Kontrastmittel zu verwenden, die die gleiche

oder sogar bessere Bildqualität bieten. Bevor die Verwendung von

Gadoliniumpräparaten für Röntgenuntersuchungen empfohlen werden kann,

sollten daher größere klinische Studien durchgeführt werden, die die

Nephrotoxizität der Iod-Kontrastmittel und Gadolinium-Kontrastmittel in

Konzentrationen vergleichen, die die gleiche Röntgendichte aufweisen und

damit auch zu vergleichbarer Bildqualität führen.

Abstract

8

Abstract Cytotoxicity of gadolinium-based MRI contrast agents on renal tubular

cells in vitro: comparison of a nonionic iodinated radiographic contrast

medium and gadolinium-based MRI contrast agents at equi-attenuating

and equimolar concentrations.

Goals of this study

The iodine based contrast media used in diagnostic and interventional radioloy

can lead to severe impairment of renal function known as contrast media-

induced nephropathy, which often involves high mortality rates. In contrast,

gadolinium-based MRI contrast agents are known to have very good renal

tolerance. Therefore, the use of gadolinium-based contrast media for CT and

angiography as a possible alternative to the use of conventional iodinated

contrast agents is under discussion.

Materials and methods

To compare the cytotoxic effects of an iodine-based contrast media with

several gadolinium-based agents we conducted some experiments using

cultured renal tubule cells (LLC-PK1). Cells were incubated with the iodinated

contrast agent iomeprol, the gadolinium chelates gadoptentetate dimeglumine,

gadobenate dimeglumine, gadoterate meglumine, or gadodiamide at equimolar

and equi-attenuating doses for 24 hours. To assess the role of osmolality cells

were also incubated with corresponding mannitol solutions. Cytotoxicity was

assesed using the MTT test, a trypan blue exclusion test, and an ELISA to

detect apoptosis and necrosis.

Results

At equimolar concentrations gadopentetate and gadobenate showed a

significantly higher inhibition of MTT conversion than gadoterate, gadidiamide

and iomeprol (p < 0,001). As we could demonstrate using the trypan blue test,

Abstract

9

after incubation with gadopentetate significantly more cells were dead than

after incubation with iomeprol (p < 0,001). Gadopentetate and gadobenate

induced significantly more apoptosis and necrosis than the other contrast media

(p < 0,001).

At equi-attenuating concentrations inhibition of MTT reduction after

incubation with iomeprol was significantly lower than after incubation with all

gadolinium-based contrast agents tested (p < 0,001).

In summary, all gadolinium-based contrast media led to stronger cytotoxic

effects than the iodinated contrast agent. Ionic gadolinium chelates of high

osmolality involved stronger cell damage than nonionic gadolinium contrast

agents with low osmolality.

Conclusion:

Our experiments suggest, that gadolinium-based contrast agents at equi-

attenuating concentrations possess a higher nephrotoxic potential than

iodinated contrast agents in vitro. For reasons of nephroprotection maybe it is

more reasonable to use dilute solutions of conventional iodinated contrast

agents in angiography which provide equal or even better image quality instead

of using gadolinium chelates. Before the use of gadolinium-based contrast

agents for X-ray radiography can be recommended, there should be more

clinical studies to compare nephrotoxicity of iodinated and gadolinium-based

contrast agents in equi-attenuating concentrations which provide equal image

quality.

Einleitung

10

1. Einleitung

1.1 Kontrastmittel-induzierte Nephropathie

Die interventionelle und diagnostische Radiologie umfasst einige

Untersuchungen und Eingriffe, die unter Einsatz von iodhaltigen

Kontrastmitteln durchgeführt werden, wie beispielsweise die Digitale

Subtraktionsangiographie (DSA), Urographie und computertomographische

Untersuchungen. Obwohl die Verabreichung dieser Kontrastmittel in der

Mehrzahl der Fälle gut vertragen wird, steigt mit zunehmender Anwendung

von Verfahren unter Kontrastmittelgabe im klinischen Alltag (KATZBERG,

2006) und zunehmendem Alter und Morbidität der Patienten (TOMS, 2001)

auch die zu erwartende Anzahl von Komplikationen dieser Verfahren. Eine der

wichtigsten Komplikationen nach intravaskulärer Anwendung von

Kontrastmitteln ist die Kontrastmittel-induzierte Nephropathie (KIN), die die

dritthäufigste Ursache für im Krankenhaus erworbenes akutes Nierenversagen

darstellt (BERG, 2000; NASH, 2002; BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003).

Diese ist definiert als eine Verschlechterung der Nierenfunktion in Folge der

Kontrastmittelgabe, mit Erhöhung des Kreatinin-Wertes im Serum um mehr als

25 % oder 44 µmol/l (0,5 mg/dl) innerhalb von drei Tagen, wenn eine andere

Ätiologie ausgeschlossen werden kann (MORCOS, 1998; ASPELIN, 2003). In

der Mehrzahl der Fälle zeigt sich ein benigner Verlauf mit Wiederherstellung

der Nierenfunktion innerhalb von 10 bis 14 Tagen (BAKER, 2003). In einigen

Fällen, vor allem bei Patienten mit Risikofaktoren, kommt es jedoch zur

transienten oder sogar zur dauerhaften Dialysepflichtigkeit (McCULLOUGH,

1997; GRUBERG, 2000; RIHAL, 2002). Dabei ist die KIN mit einer hohen

Mortalität und einer geringen Langzeitüberlebensrate verknüpft, vor allem

wenn die Nephropathie die Dialysepflichtigkeit des Patienten nach sich zieht

(LEVY, 1996; McCULLOUGH, 1997; GRUBERG, 2000; FREEMAN, 2002;

RIHAL, 2002; MARENZI, 2004; DANGAS, 2005).

Einleitung

11

Die Inzidenz eines akuten Nierenversagens nach Kontrastmittelgabe wird in

der Allgemeinbevölkerung mit weniger als 2 % angegeben (ASPELIN, 2003;

BERG, 2000; NIKOLSKY, 2003), jedoch steigt sie bei Zugehörigkeit zu einer

der Risikogruppen deutlich an (MANSKE, 1990; RUDNICK, 1995;

McCULLOUGH, 1997; NIKOLSKY, 2003). Zu den Risikofaktoren zählen

hierbei vor allem eine vorbestehende renale Insuffizienz und zusätzlicher

Diabetes mellitus sowie hohes Alter, hohe Dosen des verwendeten

Kontrastmittels, Dehydratation, Herzinsuffizienz und vorhergehende KIN

(RUDNICK, 1995; MORCOS, 1999).

Für Patienten mit vorbestehender Nierenfunktionseinschränkung finden sich in

der Literatur Angaben der Inzidenz zwischen 12 und 27 % (MORCOS, 1998).

Eine Studie bei Patienten mit diabetischer Nephropathie zeigt sogar eine

Inzidenz von 50 % (MANSKE, 1990).

Die Pathomechanismen, welche zur Ausprägung der KIN führen, sind

momentan noch nicht zur Genüge aufgeklärt. Hämodynamische

Veränderungen des renalen Blutflusses, insbesondere medulläre Ischämie und

Hypoxie, eventuell unter Beteiligung vasoaktiver Substanzen wie Adenosin

und Endotheloin, direkte cytotoxische Effekte möglicherweise mit Beteiligung

freier Radikale, Apoptose- und Nekroseauslösung und ein Anstieg des

intratubulären hydrostatischen Druckes, ausgelöst durch die osmotische

Diurese aufgrund der KM-Gabe oder der hohen Viskosität der Kontrastmittel,

werden dafür verantwortlich gemacht (MORCOS, 1998; HEYMAN, 1998;

UEDA, 1998; HIZOH, 1998; RUDNICK, 2003; HAUESSLER, 2004; IDEE,

2004; PERSSON, 2005; SEELIGER, 2007).

1.2 Einteilung und Anwendung der Kontrastmittel

Der Einsatz von Kontrastmitteln (KM) in der Radiologie dient der Verstärkung

von Kontrasten und damit zur Verbesserung der Qualität von bildgebenden

Verfahren. Die auftreffenden Röntgenstrahlen werden durch die Kontrastmittel

abgeschwächt und es resultiert ein stärkerer Kontrast zum KM-freien Gewebe,

welches die Röntgenstrahlung passieren lässt. Der Absorption der

auftreffenden Röntgenstrahlung dienen bei den Röntgen-Kontrastmitteln die

Einleitung

12

enthaltenen Iodatome, die mit ihrer hohen Ordnungszahl die Röntgenstrahlung

stärker abschwächen als die Atome im Weichteil- und Fettgewebe, deren

durchschnittliche Ordnungszahlen deutlich geringer sind. Die Grundstruktur

aller iodhaltigen Kontrastmittel ist der triiodierte Benzolring, der in den

Positionen 2, 4 und 6 mit Iod substituiert ist.

Die im klinischen Alltag gebräuchlichen iodhaltigen Röntgen-Kontrastmittel

können in vier Gruppen eingeteilt werden. Man unterscheidet ionisch

monomere, ionisch dimere, nichtionisch monomere und nichtionisch dimere

iodhaltige Kontrastmittel (ALMEN, 1990). Die Begriffe monomer und dimer

leiten sich dabei von der Anzahl der Benzolringe pro Kontrastmittelmolekül

ab. Ionische Kontrastmittel weisen eine hohe Wasserlöslichkeit aufgrund ihrer

ionischen Struktur auf. Im Gegensatz dazu muss bei nichtionischen KM eine

adäquate Wasserlöslichkeit durch Einführen einer genügend hohen Zahl von

Hydroxylgruppen geschaffen werden (ALMEN, 1990). Abb. 1-4 zeigen die

Grundstrukturen der verschiedenen Gruppen der Röntgen-Kontrastmittel, Abb.

5 zeigt die Struktur des in dieser Studie verwendeten nichtionischen Monomers

Iomeprol.

M+

I

R

ICOO-

RI

Abb. 1: Grundstruktur ionisch monomerer Iod-Kontrastmittel

Einleitung

13

M+

R

I

R I

R

IR

I

I R

I

COO-

Abb .2: Grundstruktur ionisch dimerer Iod-Kontrastmittel

I I

RI

R

NHO R

Abb. 3: Grundstruktur nichtionisch monomerer Iod-Kontrastmittel

ONH

R

I

I

R

IRR

IO

NHR

I R

I

Abb. 4: Grundstruktur nichtionisch dimerer Iod-Kontrastmittel

Einleitung

14

I

I I

NCH3

OOH

O NHOH

OH

O

OHOH

Abb. 5: Strukturformel Iomeprol (Imeron)

Die ionischen Kontrastmittel liegen als Salze vor, die in wässriger Lösung in

das iodhaltige Anion und das zugehörige Kation, je nach Kontrastmittel

beispielsweise Na+ oder Methylglucosamin (Meglumin), dissoziieren. Dadurch

liegt die Osmolalität der Lösung deutlich über der von nichtionischen KM.

Man teilt KM daher auch anhand ihrer Osmolalität ein in hochosmolale

(ionisch monomere) KM mit einer Osmolalität von zwischen 1500 und 1790

mosm/kg H2O in einer Lösung von 300 mg I/ml bei 37 ºC (Ioxitalamat),

niedrigosmolale (ionisch dimere oder nichtionisch monomere) KM mit etwa

520-720 mosm/kg H2O (Ioxaglat, Iomeprol) und isoosmolale (nichtionisch

dimere) KM mit circa 290-320 mosm/kg H2O (Iotrolan, Iodixanol). Tabelle 1

zeigt die Einteilung der iodhaltigen Kontrastmittel und die jeweiligen

Osmolalitäten.

Einleitung

15

KM-Klasse

Kontrastmittel

Osmolalität (mosm/kg H2O, 37ºC) bei 300mg

I/ml Ionische Monomere

Amidotrizoat, Ioxitalamat

1500-1790

Ionische Dimere

Ioxaglat

560

Nichtionische Monomere

Iomeprol, Iohexol, Iopamidol, Ioversol, Iopromid

521-720

Nichtionische Dimere

Iotrolan, Iodixanol

290-320

Tabelle 1: Klasseneinteilung iodhaltiger Kontrastmittel mit Angabe von Kontrastmitteln der jeweiligen Klasse und der Osmolalität.

In den letzten Jahren ist gezeigt worden, dass computertomographische

Untersuchungen und Angiographien auch mit einer weiteren Gruppe von

Kontrastmitteln, den Gadoliniumchelaten, möglich sind (PENA, 1999;

SPINOSA, 2000; LE BLANCHE, 2001; GUPTA, 2002; RIEGER, 2002;

SPINOSA, 2002; KALINOWSKI, 2003; KIM, 2003; BAE, 2004; STRUNK,

2004; REMY-JARDIN, 2005). Dabei handelt es sich um eine Gruppe von KM,

die ursprünglich zur Kontrastgebung in der Magnetresonanztomographie

entwickelt wurden. Sie enthalten anstelle von Iodatomen das Lanthanoid

Gadolinium. Der Aufbau dieser KM beruht auf einem anderen Prinzip als der

der iodhaltigen: die Gadolinium-Atome sind nicht kovalent gebunden, sondern

sind Teil eines Chelat-Komplexes. Daher folgt auch deren Einteilung anderen

Kriterien. Man unterscheidet je nach Struktur des Chelat-Komplexes zwischen

linearen und zyklischen KM und wie bei den Iod-Kontrastmitteln zwischen

ionischen und nichtionischen KM (REIMER, 2004). Daraus folgen ebenfalls

unterschiedliche Osmolalitäten und die Einteilung in hoch- und

niedrigosmolale KM. Die Abbildungen 6-9 zeigen die Strukturformeln der in

dieser Arbeit verwendeten Gadolinium-Kontrastmittel. Tabelle 2 zeigt eine

Aufstellung aller in dieser Arbeit verwendeten KM unter Angabe der

Wirkstoffbezeichnung, des Handelsnamens, der Molekülstruktur und der

Osmolalität.

Einleitung

16

N

N

N

O-

Gd3+

O-

O

O

O-

O

O-O

O-

O

CH3

CH2CCCCCH2OH

NH2+

H OHOH HH OHH OH

2-

2

Abb. 6: Strukturformel Gadopentetatdimeglumin (Magnevist)

O

N

N

N

O-

Gd3+

O-

O

O

O-

O

O-O

O-

O

CH3

CH2CCCCCH2OH

NH2+

H OHOH HH OHH OH

2

2-

Abb. 7: Strukturformel Gadobenatdimeglumin (Multihance)

Einleitung

17

N N

N N

Gd 3+

O--O

O O

-O O-

OO

CH3

CH2CCCCCH2OH

NH2+

H OHOH HH OHH OH

-

+

Abb. 8: Strukturformel Gadoteratmeglumin (Dotarem)

Gd 3+

N

-O

NN

O

O-O

O

NHH3C

O

NHCH3

O-

O

Abb. 9: Strukturformel Gadodiamid (Omniscan)

Einleitung

18

Bezeichnung

Handelsname

Molekulare Struktur

Iod-konzentration

[mg I/ml]

KM-konzentration

[mM]

Osmolalität [mosm/kg

H2O]

Iomeprol-300

Imeron 300 Nichtionisch,

monomer

300

788

521

Iomeprol-190

-- Nichtionisch,

monomer

190

500

301

Iomeprol-150

Imeron 150 Nichtionisch,

monomer

150

394

350

Gadopentetat-dimeglumin (Gd-DTPA)

Magnevist

Linear, ionisch

--

500

1960

Gadobenat-dimeglumin

(GdBOPTA)2- Multihance Linear,

ionisch

--

500

1970

Gadoterat-meglumin

(Gd-DOTA) Dotarem Zyklisch,

ionisch

--

500

1350

Gadodiamid (Gd-DTPA-

BMA) Omniscan Linear,

nichtionisch

--

500

780

Tabelle 2: Aufstellung der verwendeten Kontrastmittel unter Angabe von Bezeichnung, Handelsname, Molekülstruktur, Iodkonzentration, Molarität und Osmolalität.

Die Gadolinium-Kontrastmittel gelten als sicher in Bezug auf nephrotoxische

Nebenwirkungen in den bei Kernspin-Untersuchungen verwendeten

Konzentrationen von bis zu 0,3 mmol/kg Körpergewicht (NIENDORF, 1991;

TOMBACH, 2001; THOMSEN, 2004). Eine Zulassung dieser Präparate für

die Anwendung in der Computertomographie und Angiographie liegt

allerdings nicht vor. Gadoliniumhaltige KM erreichen bei intravasaler

Anwendung in den oben genannten Dosen auch nicht den gleichen Röntgen-

Kontrast, der mit üblichen Dosierungen iodhaltiger Kontrastmittel erzielt

werden kann. Folglich sind auch Bildqualität und diagnostische

Aussagefähigkeit bei Verwendung von Gadolinium-KM denen bei

Einleitung

19

Verwendung von Iod-KM unterlegen (STRUNK, 2004). Es ist zudem berichtet

worden, dass bei Einsatz von Gd-KM in höherer Dosierung ebenfalls eine

nephrotoxische Wirkung auftreten kann (ROSIOREANU, 2004; THOMSEN,

2004). In den letzten Jahren zeigt sich darüber hinaus eine neuartige Entität, die

mit der Applikation von Gadolinium-Kontrastmitteln in Zusammenhang

gebracht wird: die nephrogene systemische Fibrose. Es handelt sich hierbei um

eine Erkrankung, die sich hauptsächlich an der Haut in Form von Fibrosierung

der Haut an den Extremitäten manifestiert, die jedoch auch auf Muskulatur und

andere Organe übergreifen und tödlich enden kann (BRIDGES, 2009;

GOULLE, 2009; TEN DAM 2009). Da es zudem tierexperimentelle Hinweise

darauf gibt, dass die allgemeine Toxizität der Gadolinium-KM bei

Konzentrationen, die die gleiche Röntgenabsorption ergeben wie iodhaltige

KM, 6- bis 25-mal höher ist als die iodierter KM, bleibt die Verwendung von

Gd-KM für computertomographische Untersuchungen und Angiographie

weiterhin umstritten (WEINMANN, 1990; MORCOS, 1999; NYMAN, 2002).

Messungen der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger

Kontrastmittel in vitro zeigen, dass die 0,5 molaren Gadoliniumchelate bei den

für die digitale Subtraktionsangiographie üblichen 70-80 kV in etwa die

gleiche Abschwächung von Röntgenstrahlung zeigen wie Iod-KM mit 60-80

mg I/ml. Bei einer 80 kg schweren Person würde man bei einer Dosierung von

0,3 mmol/kg KG maximal etwa 50 ml Gadolinium-KM geben dürfen. Dies

würde in etwa dem Volumen von 50 ml eines auf 60-80 mg I/ml verdünnten

Iod-KM oder 10-13 ml des unverdünnten Iod-KM entsprechen (NYMAN,

2002).

Da für viele Anwendungen der interventionellen Radiologie wesentlich größere

Volumina benötigt werden, würde hier nur der off-label use, also die

Anwendung außerhalb der Zulassung, von sehr großen Mengen der

Gadolinium-KM in Frage kommen. In der Tat wurde bereits über den Einsatz

auch sehr großer Volumina von bis zu 440 ml von Gadolinium-Kontrastmitteln

für Röntgenuntersuchungen berichtet (GEMMETE, 2001; THOMSEN, 2002;

STRUNK, 2004).

Insgesamt bleibt die Verwendung der Gd-Kontrastmittel weiterhin ein strittiges

Thema: Während einige Autoren darin Vorteile für Patienten mit

Einleitung

20

Risikofaktoren für die Entwicklung einer KIN sehen (WAGNER, 2001;

GUPTA, 2002; RIEGER, 2002; SPINOSA, 2002; FURUICHI, 2004; REMY-

JARDIN, 2005; KALINOWSKI, 2007), gibt es gleichsam auch Autoren, die

aufgrund von tierexperimentellen Studien, klinischen Untersuchungen und

Fallberichten die Meinung vertreten, dass Gadolinium-KM nicht für die

Anwendung außerhalb von Kernspin-Untersuchungen geeignet sind

(GEMERY, 1998; ELMSTAHL, 2004; ERLEY, 2004).

1.3 Fragestellung

Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob die Gadolinium-Kontrastmittel

weniger toxisch auf renale Tubuluszellen wirken als iodhaltige Kontrastmittel.

Dazu wurden die Kontrastmittel bei gleichen molaren Konzentrationen und bei

Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte entsprechen, verglichen. Die

Untersuchung der Kontrastmittel bei gleicher molarer Konzentration zielte

dabei darauf ab, die Cytotoxizität der Kontrastmittelmoleküle vergleichen zu

können. Die Untersuchungen der Kontrastmittel bei Konzentrationen, die in

der Bildgebung gleiche Röntgendichte ergeben würden, sollte vor allem zur

Klärung der klinischen Fragestellung beitragen, ob der Gebrauch der

Gadolinium-Kontrastmittel eine sinnvolle Alternative zur Verwendung

iodhaltiger Kontrastmittel bei Patienten mit Kontraindikationen gegen

iodhaltige KM darstellen könnte.

Zudem sollte untersucht werden, ob der cytotoxische Effekt von

Kontrastmitteln allein durch die Osmolalität der Kontrastmittel zu erklären ist

und in wieweit die Auslösung von Nekrose und Apoptose für die

Nierenzellschädigung durch die verschiedenen Kontrastmittel von Bedeutung

ist.

Material und Methoden

21

2. Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien MTT-Testreagenz Sigma,Taufkirchen, Deutschland Medium 199 EARLE (1x) Biochrom, Berlin, + 2,2 g NaHCO3 mit Phenolrot Deutschland Trypsin/EDTA-Lösung Biochrom, Berlin, 0,05 % / 0,02 % in PBS Deutschland L-Glutamin (200 mM) Biochrom, Berlin,

Deutschland

Penicillin/Streptomycin Biochrom Berlin, (1000 U/ 10000 µg/ml) Deutschland Fetal bovine serum (FBS) GIBCO Invitrogen

Karlsruhe, Deutschland

Trypanblau MERCK, Darmstadt, Deutschland Fluka Chemika, Buchs, Deutschland Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg, Deutschland Essigsäure Roth, Karlsruhe,

Deutschland Dimethylformamid (DMF) AppliChem, Darmstadt, Deutschland


22

2.1.2 Medien, Puffer und Lösungen Kulturmedium 500 ml Medium 199 Biochrom, Berlin, Deutschland + 5 ml L-Glutamin Biochrom, Berlin, Deutschland + 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, Deutschland + 50 ml FBS Invitrogen,

Karlsruhe, Deutschland

Testmedium 500 ml Medium 199 Biochrom, Berlin,

Deutschland + 5 ml Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin,

Deutschland

Lyse-Puffer für MTT-Test 20,0 % SDS (Natriumdodecylsulfat) Serva, Heidelberg,

Deutschland 33,3 % DMF (Dimethylformamid) AppliChem, Darmstadt, Deutschland 2 % Essigsäure Roth, Karlsruhe, Deutschland pH eingestellt auf 4,7 PBS (phosphate buffer saline) Na2HPO4 8,3 mmol/l NaH2PO4 0,16 mmol/l Linaris, NaCl 185 mmol/l Bettingen am Main, Deutschland


23

Mannitol-Lösungen: Mannit-520 47,7 g D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland 1,192 g Hepes Roth, Karlsruhe,

Deutschland 500 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Mannit-1860 84,72 g D-Mannitol Serva, Heidelberg,

Deutschland 0,593 g Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland 250 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Mannit-780 35,5 g D-Mannitol Serva, Heidelberg, Deutschland 0,593 g Hepes Roth, Karlsruhe, Deutschland 250 ml Aqua dest. pH eingestellt auf 7,4 Trypanblau-Lösung 0,5 g Trypanblau MERCK,

Darmstadt, Deutschland

0,9 g NaCl Fluka Chemika, Buchs, Deutschland 100 ml Aqua dest. MTT-Lösung (7,5 mg/ml) 750 mg MTT-Reagenz [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid] 100 ml PBS


24

2.1.4 Kontrastmittel Iomeprol-300 Imeron 300

ALTANA Pharma, Konstanz, Deutschland

Iomeprol-150 Imeron 150

ALTANA Pharma, Konstanz, Deutschland

Gadopentetatdimeglumin Magnevist Schering AG

Berlin, Deutschland Gadobenatdimeglumin Multihance ALTANA Pharma

Konstanz, Deutschland

Gadoteratmeglumin Dotarem Guerbet Roissy, Frankreich Gadodiamid Omniscan

GE Healthcare Braunschweig, Deutschland

2.1.5 Test-Set Cell Death Detection ELISAPLUS Roche Applied

Science

Mannheim, Deutschland


25

2.1.6 Zellkulturzubehör Kulturflaschen 75 cm2 CELLSTAR, mit Filterkappe Frickenhausen, Deutschland 96-Well-Mikrotiterplatten CELLSTAR, steril Frickenhausen, Deutschland 6-Well-Platten CELLSTAR,

Frickenhausen, Deutschland

2.1.7 Geräte ELISA-Reader Dynatech MR 5000, Dynatech.

Alexandria, CA, USA

2.1.8 Zellen LLC-PK1-Zellen American Type

Culture Collection ATCC, Rockville

MD, USA


26

2.2 Methodik

2.2.1 Zellkultur Für die Versuche wurden LLC-PK1–Zellen verwendet, die schon

verschiedentlich als in vitro-Modell zur Untersuchung der Nephrotoxizität

verschiedener Substanzen (FALAHATPISHEH, 2001; DOMINGUEZ, 2002)

Verwendung gefunden haben. Die Verwendung dieser Zelllinie gilt als

etabliertes Verfahren zur Aufklärung von Pathomechanismen renaler

Schädigungen unter Ausschluss störender äußerer Faktoren (wie beispielsweise

hämodynamische Veränderungen) (IDEE, 1996).

Die LLC-PK1-Zelllinie wurde erstmals 1958 aus den Nieren eines Hampshire-

Schweines kultiviert und ist durch die Ausbildung dreidimensionaler so

genannter Dome-Strukturen, d.h. flüssigkeitsgefüllte kuppelartig aufgewölbte

Areale innerhalb der Zellschicht, die bei Erreichen der Konfluenz zu

beobachten sind, charakterisiert (HULL, 1976). Die Zellen zeigen typische

Eigenschaften proximaler Tubuluszellen (MULLIN, 1980) und sind im

Gegensatz zu anderen renalen Zelllinien weitestgehend homogen (IDEE,

1996).

Die Zellen wurden in Kulturflaschen mit Filter in modifiziertem Medium 199

kultiviert. Dem Medium wurden 2 mM L-Glutamin, 10 % fetales Kälberserum

(FBS), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zugesetzt. Die

Temperatur wurde bei hoher Luftfeuchtigkeit und einem Anteil von 5 % CO2

konstant auf 37 ºC gehalten. Alle 72 Stunden wurde das Medium erneuert, um

optimales Wachstum der Zellen zu gewährleisten. Nach sieben Tagen war die

Konfluenz des Zellrasens erreicht und die Zellen wurden nach Absaugen des

Mediums gesplittet. Dazu wurden die Zellen zweimal mit 37 ºC warmer PBS-

Pufferlösung gewaschen, um eventuelle Interaktionen von

Mediumbestandteilen mit dem Trypsin auszuschließen. Um den Zellrasen

aufzulösen wurden die Zellen für 2-5 Minuten mit Trypsin/EDTA-Lösung

inkubiert bis die Zellen begannen sich abzukugeln. Anschließend wurde die

Lösung abgesaugt und die Zellen nochmals für 20-30 Minuten in den


27

Brutschrank gestellt. Nach dieser Zeit konnten die nun komplett abgerundeten

Zellen durch Klopfen von der Wand gelöst und in Medium überführt werden.

Ein Teil der Zellen wurde für die Versuchsdurchführung verwendet, der andere

wurde weiter kultiviert. Dieser Vorgang konnte bis zu einer Passagenzahl von

13-15 wiederholt werden.

2.2.2 Visueller Vergleich der Röntgendichte von Gadolinium-Kontrastmitteln und dem iodhaltigen Kontrastmittel Iomeprol Um die Kontrastmittelkonzentrationen bestimmen zu können, die sich in ihrer

Röntgendichte entsprechen, wurden verschiedenen Verdünnungen des Iod-KM

Iomeprol mit 50, 75, 150, 190 und 300 mg I/ml und die Gadolinium-

Kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin,

Gadoteratmeglumin und Gadodiamid mit 0,5 mol/l in Spritzen gefüllt und

diese anschließend bei etwa 70 kV durchleuchtet. Um die Wirkungen des

menschlichen Körpers zu imitieren wurden die Spritzen dabei von einer 20 cm

hohen Wasserschicht bedeckt. Anschließend wurden die Bilder beurteilt und

die Kontrastmittelkonzentrationen bestimmt, die in etwa zur gleichen

Röntgendichte geführt hatten.

2.2.3 Testlösungen

Zum Vergleich der Effekte von iodhaltigen Kontrastmitteln gegenüber

gadoliniumhaltigen Kontrastmitteln wurden Verdünnungen der Kontrastmittel

Iomeprol-300 (Imeron 300), Iomeprol-150 (Imeron 150),

Gadopentetatdimeglumin (Magnevist), Gadobenatdimeglumin (Multihance),

Gadoteratmeglumin (Dotarem) und Gadodiamid (Omniscan) verwendet. Zur

Kontrolle des Osmolalitätseffektes wurden zusätzlich entsprechend

konzentrierte Mannitol-Lösungen verwendet. Eine Mannitol-Lösung von 780

mosm/kg H2O entspricht der Osmolalität von Omniscan und eine Lösung von

520 mosm/kg H2O diente der Kontrolle des osmolalen Effektes von Iomeprol-

300. Zur Kontrolle des Osmolalitätseffektes von Magnevist wurde eine Lösung

von 1860 mosm/kg H2O verwendet, obwohl die Osmolalität dieses

Kontrastmittels bei 1960 mosm/kg H2O liegt. Eine entsprechend hoch


28

konzentrierte Mannitol-Lösung konnte allerdings wegen der Übersättigung der

Lösung nicht verwendet werden.

Zur Herstellung der Verdünnungen, die sich in der Röntgendichte entsprechen

sollten, wurde von folgendem Sachverhalt ausgegangen: Eine Lösung eines

Iod-KM mit 75 mg I/ml würde bei den in der Angiographie üblichen 70 – 80

kV etwa die gleiche Röntgendichte aufweisen wie die 0,5 M Gadolinium-KM

(NYMAN 2002). Es wurden daher die auf Iod basierenden KM bei einer

Konzentration von 75 mg I/ml im Medium mit 0,5 M Gadoliniumverbindungen

im Medium in verschiedenen Verdünnungen verglichen. Das entspricht

Verdünnungen von Iomeprol-300 von 1:8, 1:16 und 1:32 und Verdünnungen

von Iomeprol-150 von 1:4, 1:8 und 1:16 vs. Verdünnungen von Gd-KM von

1:2, 1:4 und 1:8. Die zugehörigen Mannitol-Lösungen wurden entsprechend

verdünnt.

Da eine Lösung des iodhaltigen Kontrastmittel Iomeprol mit 300 mg I/ml einer

788 mM Lösung entspricht, wurde Iomeprol-300 mit destilliertem Wasser im

Verhältnis 1:1,58 verdünnt, so dass man eine Lösung von 500 mM (Iomeprol-

190) erhielt. So war es möglich das iodhaltige Kontrastmittel mit den

Gadolinium-Kontrastmitteln bei gleicher molarer Konzentration zu

vergleichen.

Die Lösung von Iomeprol-190 sowie die Gadolinium- und Mannitol-Lösungen

wurden jeweils im Verhältnis von 1:2, 1:4, 1:8 und 1:16 mit serumfreiem

Medium verdünnt. Dies entsprach KM-Konzentrationen von 250, 125, 62,5

und 31,25 mM.


29

2.2.4 MTT-Test

Der MTT-Test stellt ein etabliertes Verfahren zur Testung der Cytotoxizität

verschiedenster Substanzen in der Zellkultur dar und wurde bereits für

verschiedenste Untersuchungen eingesetzt (TOUTAIN, 1992; ANDERSEN,

1998; KREISBERG, 1988; WANG, 1998; AHLENSTIEL, 2003;

THAMILSELVAN, 2002; BALACHANDRAN, 2005; HANIGAN, 2005;

NAKANISHI, 2005; TOLSON, 2005).

Der MTT-Test misst die Aktivität der zellulären Dehydrogenasen lebender

Zellen unabhängig davon, ob sie momentan DNA synthetisieren oder nicht und

gilt als Test für die Lebensfähigkeit der Zelle. MTT ist eine heterozyklische

organische Verbindung, die zur Gruppe der Tetrazoliumsalze gehört. Das

schwach gelbe MTT wird über noch nicht komplett aufgeklärte Mechanismen

in die Zelle aufgenommen, wo sein Tetrazoliumring durch die Dehydrogenasen

aktiver Mitochondrien oder durch andere zelluläre Dehydrogenasen

aufgebrochen wird und wodurch das alkohollösliche dunkelblaue Formazan

entsteht. Anschließend werden die Zellen mittels des Detergens SDS lysiert

und das Formazan freigesetzt. Die Intensität der entstandenen Formazan-

Lösung kann dann photometrisch bestimmt werden (MOSMANN 1983, LIU

1997).

In unseren Experimenten verwendeten wir die Methode nach MOSMANN, der

diesen Cytotoxizitäts-Test 1983 erstmals etabliert hat, in modifizierter Form:

Die trypsinierten Zellen wurden in Medium 199 mit FBS aufgenommen und

anschließend in sterile 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden in einer

Dichte von 30.000-40.000/well ausgesät. Dazu wurden in jede Vertiefung 100

µl der Zellsuspension gegeben. Die Zellen wurden anschließend für 24 Stunden

inkubiert, so dass die Zellen adherieren und durch Teilung einen konfluenten

Zellrasen mit Domes bilden konnten.

Nach der Inkubation wurde das Medium abgesaugt und in jede Vertiefung 200

µl der jeweiligen Kontrastmittellösung bzw. Medium ohne Wachstumsfaktoren


30

(Kontrolle) gegeben. Die Zellen wurden mit den Testsubstanzen wiederum für

24 Stunden inkubiert.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das MTT-Testreagenz hinzu gegeben

und die Zellen damit 2 Stunden inkubiert, um die Aufnahme des gelben MTT

und die Umwandlung in das blaue Reaktionsprodukt zu ermöglichen. Danach

wurde der Überstand abgegossen und die Zellen mit der SDS/DMF-Essigsäure

lysiert und somit das entstandene Formazan freigesetzt. Die Mikrotiterplatten

wurden anschließend für einige Minuten in den Brutschrank gestellt und

daraufhin für 10-15 Minuten geschüttelt, bis die Zellen vollständig aufgelöst

waren und eine klare Lösung entstand. Die Konzentration des Farbstoffes

wurde mittels eines ELISA-Readers (Dynatech MR 5000) bei einer

Wellenlänge von 570 nm bezüglich einer Referenzlänge von 630 nm

gemessen.

2.2.5 Zeitkinetik der Zellschädigung

Zur Beurteilung der Zeitabhängigkeit der Zellschädigung durch Gadolinium-

Kontrastmittel verwendeten wir exemplarisch Gadopentetatdimeglumin

(Magnevist). Die Zellen wurden mit Konzentrationen von 62,5 und 250 mM

des Kontrastmittels über 2, 8, 24 und 48 Stunden inkubiert. Nach Ablauf der

Inkubationszeit wurde der MTT-Test wie oben beschrieben durchgeführt.

2.2.6 Trypanblau-Test Der Trypanblau-Test beruht auf der Tatsache, dass bei lebenden Zellen der

verwendete Farbstoff nicht ins Zellinnere gelangen kann und sie daher

ungefärbt bleiben, während der Farbstoff bei avitalen Zellen eindringen kann,

so dass tote Zellen sich mit dem betreffenden Farbstoff anfärben.

Für diesen Test wurden die Zellen in 6-Well-Platten in einer Dichte von

100.000 Zellen/ml bzw. 200.000 Zellen/Well ausgesät, die sicherstellen sollte,

dass nach 24 Stunden Inkubation ein subkonfluenter Zellrasen entstand. Eine

Konfluenz sollte nicht erreicht werden, da in diesem Zustand bereits mit dem

Absterben von Zellen zu rechnen ist.


31

Die Zellen wurden ausgesät und 24 Stunden in Kulturmedium inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen für 24 Stunden mit Medium ohne FBS bzw.

Verdünnungen von Imeron-190 und Magnevist (jeweils 1:2 und 1:4) behandelt.

Der Überstand wurde nach Ablauf der Inkubationszeit abgenommen und

zentrifugiert. Das Pellet wurde in je 900 µl PBS aufgenommen. Der Zellrasen

des dazugehörigen Wells wurde zweimal mit PBS gewaschen und

anschließend für eine Minute mit Trypsin überschichtet. Anschließend wurde

das Trypsin abgesaugt und sobald alle Zellen abgelöst waren, wurden sie zu

den Zellen des Überstandes gegeben. Danach wurden 100 µl der 0,5 %igen

Trypanblau-Lösung hinzugegeben, so dass insgesamt eine 0,05 %ige Farbstoff-

lösung resultierte, die auch in früheren Studien schon Verwendung gefunden

hat (SCHICK, 1999).

Anschließend wurden 10 µl der Lösung nach gründlicher Durchmischung in

eine Zählkammer eingefüllt und die gefärbten und ungefärbten Zellen sofort

unter dem Mikroskop ausgezählt. Aus den erhaltenen Zellzahlen wurde dann

der prozentuale Anteil der abgetöteten blauen Zellen an der Gesamtzellzahl

errechnet.

2.2.7 ELISA-Test zur Detektion von Nekrose und Apoptose

Nach dem Nachweis der Zellschädigung von Tubuluszellen durch iodhaltige

und gadoliniumhaltige Kontrastmittel in den vorhergehenden Versuchen sollte

als nächstes die Frage geklärt werden, inwiefern die Schädigung in der

Auslösung von Nekrose und Apoptose eine Erklärung findet.

Dazu wurde ein enzymgekoppelter Immuntest (ELISA, enzyme-linked

immuno sorbent assay) durchgeführt, dem ein so genanntes Sandwich-Prinzip

zugrunde liegt. Der Test ist in der Lage histongebundene DNA-Fragmente

durch Bindung von Antikörpern und eine anschließenden Farbreaktion

nachzuweisen.

An eine mit Streptavidin beschichtete Platte binden dabei spezielle Antikörper,

die auch spezifisch sind für den Histonanteil der Nucleosomen. Somit kommt

es zum „Einfangen“ der Nucleosomen an der Platte. An den DNA-Teil der

Nucleosomen bindet ein weiterer Antikörper, der außerdem ABTS [2,2 -́

Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure), Diammoniumsalz] binden


32

kann. Wird ABTS gebunden, so kommt es zu einer enzymatischen

Farbreaktion deren Reaktionsprodukt man photometrisch bestimmen kann.

Mit dem Test kann man die zwei bekannten Arten des Zelltodes differenzieren,

indem einerseits der Zellkulturüberstand mit DNA-Fragmenten bereits

nekrotischer Zellen mit permeabler Membran analysiert werden kann

(Nachweis von Nekrose) und indem ein Lysat der Zellen untersucht wird,

deren Membran primär noch intakt ist (Apoptose).

Zunächst wurden die Zellen in einer Dichte von etwa 30.000-40.000/Well in

eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit Kulturmedium eingesät und für etwa 24

Stunden proliferieren lassen. Dann wurden die Zellen mit Testmedium und den

verschiedenen Kontrastmittel- und Mannitol-Verdünnungen, wie sie auch im

MTT-Test verwendet wurden, überschichtet. Beispielhaft wurde hier eine

Verdünnung von 1:4 gewählt.

Nach dem Ablauf der Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Platten bei

1300 Umdrehungen/Minute für 7 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurde

der Zellkulturüberstand abgenommen und bis zur Weiterverarbeitung bei 4 ºC

gelagert.

Die zurückgebliebenen Zellen wurden daraufhin mit 200 µl Lysepuffer für 30

min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Platten

nochmals zentrifugiert und das Lysat vorsichtig abgenommen.

Nun wurden jeweils 20 µl einer Positivkontrolle, bestehend aus DNA-Histon

Komplexen, des Zellkulturüberstandes, des Zelllysates und des

Inkubationspuffers (als Background-Kontrolle) in die Vertiefungen einer mit

Streptavidin beschichteten Platte überführt. Dazu wurden je 80 µl eines

Immunreagenz gegeben. Dieses bestand aus Anti-Histon-Biotin, einem

monoklonalen Maus-Antikörper, der einerseits an das Streptavidin und

andererseits an den Histonanteil der Nucleosomen binden kann, aus Anti-

DNA-POD (anti-DNA-Maus-Antikörper konjugiert mit Peroxidase) als

weiteren Antikörper für die Bindung der DNA-Komponente und die

Farbreaktion mit ABTS als Substrat für die Peroxidase sowie aus einem

Inkubationspuffer. Die Mikrotiterplatten wurden dann bei Raumtemperatur 2

Stunden unter Schütteln inkubiert. Somit wurde eine gründliche


33

Durchmischung der Komponenten gewährleistet und die Bindung der

Antikörper sichergestellt.

Der Überstand wurde nach 2 Stunden verworfen und die Platte anschließend 3-

4mal mit 300 µl Inkubationspuffer/Well gewaschen, um überschüssige, d.h.

nicht gebundene Antikörper zu entfernen und damit eine unspezifische

Enzymreaktion auszuschließen. Nach dem Trockenklopfen der Platte wurden

100 µl ABTS-Lösung/Well zugegeben und damit eine enzymatische

Farbreaktion ausgelöst. Nach etwa 3-5 Minuten wurde die Extinktion bei einer

Wellenlänge von 405 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 492 nm

gemessen.

Von den erhaltenen Werten wurde der Background-Wert jeweils subtrahiert

und ein Anreicherungsfaktor durch Division der gemittelten Extinktion der

geschädigten Zellen durch die Extinktion der Kontrollzellen, berechnet.

2.2.8 Statistische Analyse

Die Ergebnisse der Versuche werden als Mittelwert Standardfehler des

Mittelwertes (S.E.M.) angegeben. Die Anzahl toter Zellen im Trypanblau-Test

werden als Prozentsatz der Gesamtzellzahl angegeben. Die Daten des MTT-

Tests werden als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen angegeben.

Die Daten des ELISA-Tests wurden als prozentuale Differenzen zur Kontrolle

angegeben. Um die Effekte der verschiedenen Kontrastmittel untereinander

und mit den Effekten der Mannitol-Lösungen und den unbehandelten

Kontrollzellen zu vergleichen, wurden die Daten einer Varianzanalyse mittels

Einweg-ANOVA und eines nachfolgenden Tukey-post-hoc-Tests analysiert.

Zusätzlich wurde ein Zweiwege-ANOVA-Test durchgeführt, um die

Signifikanz der Interaktionen zu bewerten. Ein p-Wert < 0,05 wurde als

signifikant angesehen. Mit Ausnahme des Zweiwege-ANOVA-Tests wurde für

alle statistischen Analysen wurde das Programm Prism 3.03 (2002 Graph Pad

Software, San Diego, CA) verwendet. Für den Zweiwege-ANOVA-Test wurde

das Programm SPSS 11.5.1 für Windows verwendet (2002, SPSS Inc.,

Chicago).

Ergebnisse

34

3. Ergebnisse

3.1 Visueller Vergleich der Röntgendichte iodhaltiger und gadoliniumhaltiger Kontrastmittel Um die verschiedenen Kontrastmittel bei Konzentrationen gleicher

Röntgendichte untersuchen zu können, wurden zunächst Vorversuche

durchgeführt, um die Röntgendichte der Kontrastmittel visuell zu vergleichen.

Das iodhaltige Kontrastmittel führte in der Konzentration von 75 mg I/ml in

etwa zu einer ähnlich starken Abschwächung der Röntgenstrahlung wie die

unverdünnten 0,5 molaren Gadolinium-Kontrastmittel.

Abb. 10: Vergleich der Röntgendichte von Gadolinium-Kontrastmitteln und Iomeprol. Die Spritzen sind mit Iomeprol der Konzentrationen 50, 75, 150, 190 und 300 mg I/ml (erste Reihe) und den 0,5molaren Gadolinium-Kontrastmitteln Gadodiamid (1), Gadoteratmeglumin (2), Gadobenatdimeglumin (3) und Gadopentetatdimeglumin (4) (zweite Reihe) gefüllt. Bei Durchleuchtung mit 70 kV und unter Verwendung von 20 cm Wasser zur Imitation des menschlichen Körpers zeigen die Gadoliniumchelate eine ähnliche Röntgendichte wie eine Iomeprol-Lösung mit 75 mg I/ml.

Ergebnisse

35

3.2 Vergleich der Cytotoxizität bei gleicher Röntgendichte Getestet wurden Kontrastmittelkonzentrationen, die jeweils der Röntgendichte

eines Iod-Kontrastmittels bei 9,375 mg I/ml, 18,75 mg I/ml und 37,5 mg I/ml

entsprechen. Bei einer Konzentration von 9,375 mg I/ml induzierten Iomeprol-

300 und Iomeprol-150 (Im 300 vs. Im 150 p > 0,05) eine signifikant geringere

Schädigung als die gadoliniumhaltigen Kontrastmittel Gadopentetat,

Gadobenat, Gadoterat und Gadodiamid (jeweils p < 0,001 vs. Iomeprol). Dabei

war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden hochosmolalen Gd-

KM festzustellen (p > 0,05), ebenso zwischen Gadoteratmeglumin und

Gadodiamid (p > 0,05). Bei einer Konzentration, die 18,75 mg I/ml entspricht,

wirkte ebenfalls Iomeprol am wenigsten hemmend auf die Konversion des

MTT. Es zeigten sich die gleichen signifikanten Unterschiede zwischen den

Kontrastmitteln wie in der niedrigeren Konzentration: Alle Gadolinium-KM

unterschieden sich in ihrem cytotoxischen Effekt signifikant von Iomeprol

(jeweils p < 0,001 vs. Iomeprol). Bei der höchsten getesteten Konzentration

von 37,5 mg I/ml induzierten die beiden hochosmolalen Gadolinium-

Kontrastmittel Magnevist und Multihance die stärkste Konversionshemmung,

wobei sie sich untereinander in ihrem Effekt nicht signifikant unterschieden (p

> 0,05). Davon abzugrenzen ist die etwas geringere Schädigung durch

Gadoteratmeglumin (Dotarem) und die deutlich geringeren Schädigungen

durch Gadodiamid und Iomeprol (jeweils p < 0,001 vs. Gadoterat und

Gadobenat). Wie auch aus Abb. 11 ersichtlich, unterschieden sich bei dieser

Konzentration aber im Gegensatz zu den vorigen die Gd-KM Gadoterat und

Gadodiamid deutlich voneinander (p < 0,001), so dass die Schädigung des

nichtionischen KM Gadodiamid sich in ihrem Verlauf etwa parallel der

Schädigung durch Iomeprol zeigte, während der Effekt von

Gadoteratmeglumin in hohen Konzentrationen im Bereich der Schädigung

durch die hochosmolalen Gadolinium-Kontrastmittel lag. Tabelle 3 zeigt die

Ergebnisse des MTT-Test als Mittelwerte S.E.M.

Ergebnisse

36

0 10 20 30 400

50

100

Iomeprol-300Iomeprol-150

GadopentetatGadobenatGadoteratGadodiamid

Konzentration [mM Gd]0 67 133 200 267

Konzentration [mg I/ml]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 11: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol, Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin, Gadoterat und Gadodiamid anhand der Messung der MTT-Konversion bei Konzentrationen, die gleicher Röntgendichte entsprechen. Iomeprol-300 und Iomeprol-150 induzieren bei allen Konzentrationen eine geringere Schädigung als die Gadolinium-Kontrastmittel (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n ~ 140 für Iomeprol-300, n ~ 150 für Iomeprol-150, n ~ 300 für die Gadoliniumchelate.

Ergebnisse

37

37,5 mg I/ml 18,75 mg I/ml 9,375 mg I/ml

Iomeprol- 300 66 1,4 74 1,5 82 1,5

Iomeprol- 150 64 1,5 74 1,4 81 1,3

Mannit-520 84 1,1 90 0,8 95 0,8

62,5 mmol/l 31,25 mmol/l 15,625 mmol/l

Mannit-1860 3 0,2 51 1 81 0,9

Gadopentetat 2 0,1 48 1 63 0,8

Gadobenat 1,3 0,2 50 0,9 64 0,7

Gadoterat 9 0,4 60 0,9 71 0,8

Gadodiamid 47 1,2 56 0,9 70 0,8

Mannit-780 56 0,7 75 0,9 86 0,7

Tabelle 3: Ergebnisse des MTT-Konversionstests bei gleicher Röntgendichte in Konzentrationen, die 37,5 mg I/ ml, 18,75 mg I/ml bzw. 9,375 mg I/ml entsprechen, für die Gadoliniumchelate entsprechend 62,5 mmol/l, 31,25 mmol/l bzw. 15,625 mmo/l. Die Werte sind als % der Kontrolle S.E.M. angegeben. n=140 für Iomeprol- 300, n= 150 für Iomeprol-150, n~300 für die Gadoliniumchelate.

3.3 Vergleich gadoliniumhaltiger und iodhaltiger Kontrastmittel bei äquimolaren Konzentrationen

3.3.1 MTT-Test zur Beurteilung der Cytotoxizität der Kontrastmittel

Alle gadoliniumhaltigen Kontrastmittel zeigten bei unseren Experimenten eine

dosisabhängige Inhibition der MTT-Konversion, ebenso wie das auf Iod

basierende Kontrastmittel Iomeprol (Abb. 11).

Bei einer Konzentration von 31,25 mM induzierten alle getesteten

Kontrastmittel eine signifikante Inhibition der MTT-Konversion in Vergleich

zur Kontrolle, wobei allerdings zwischen den einzelnen Kontrastmitteln keine

signifikanten Unterschiede festzustellen waren (p > 0,05).

Ergebnisse

38

Bei der zweifachen Konzentration der Kontrastmittel (62,5 mM) verursachten

die hochosmolalen Gadolinium-KM Gadopentetat- und Gadobenatdimeglumin

eine signifikant höhere Konversionshemmung als die niederosmolalen

Gadolinium-KM Gadoteratmeglumin und Gadodiamid und als das iodhaltige

KM Iomeprol (jeweils p < 0,001). Bei dieser Konzentration konnte jeweils kein

signifikanter Unterschied festgestellt werden zwischen den beiden

hochosmolalen Gd-KM Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin

sowie zwischen dem iodhaltigen KM Iomeprol und den Gadolinium-KM

Gadoteratmeglumin und Gadodiamid (p > 0,05).

Auch bei der Konzentration von 125 mM konnte ein stärkerer Effekt von

Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin im Vergleich zu

Gadoteratmeglumin, Gadodiamid und Iomeprol nachgewiesen werden (p <

0,001). Auch hier konnte jeweils kein signifikanter Unterschied zwischen

Gadopentetat und Gadobenat gefunden werden (p > 0,05). Bei 250 mM konnte

aber im Gegensatz zu den geringeren Konzentrationen erstmals eine

Signifikanz zwischen Iomeprol und den gadoliniumhaltigen KM Gadoterat (p

< 0,001) und Gadodiamid (p < 0,01) und eine Signifikanz zwischen Gadoterat

und Gadodiamid nachgewiesen werden (p < 0,001). Im Gegensatz dazu zeigte

sich bei den Konzentrationen von 31,25 bis 125 mM kein signifikanter

Unterschied zwischen Gadodiamid und Iomeprol (p > 0,05). Bei einer

Konzentration von 250 mM jedoch war der Effekt von Gadodiamid etwas

geringer als der von Iomeprol (p < 0,05).

Bis zu einer Konzentration von 125 mM waren die Effekte von

Gadoteratmeglumin und Iomeprol nicht signifikant unterschiedlich. Bei einer

Konzentration von 250 mM hingegen erreichte die Toxizität von

Gadoteratmeglumin fast das Niveau der hochosmolalen Gadolinium-

kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin und

übertraf somit weit die toxischen Effekte der nichtionischen KM Gadodiamid

und Iomeprol (p < 0,001).

Zwischen Konzentration und Art des Kontrastmittels konnte im two-way-

ANOVA (p < 0,0001) eine signifikante Interaktion festgestellt werden. Diese

Interaktion ist auch deutlich aus Abb. 11 zu erkennen, da hier ein nicht

Ergebnisse

39

paralleler Verlauf der Dosis-Wirkungs-Kurven der beiden Kontrastmittel-

gruppen zu sehen ist. Während die Dosis-Wirkungs-Kurven der nichtionischen

niedrigosmolalen KM Iomeprol und Gadodiamid einen asymptotischen Verlauf

zeigen, erkennt man im Verlauf der Kurven für Magnevist

(Gadopentetatdimeglumin), Multihance (Gadobenatdimeglumin) und Dotarem

(Gadoteratmeglumin) eine starke Zunahme der Konversionshemmung ab einer

Konzentration von 125 mM.

0 50 100 150 200 2500

50

100

Iomeprol-190

GadopentetateGadobenateGadoterate

Gadodiamide

Kontrastmittelkonzentration [mM]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 12: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit äquimolaren Konzentrationen von Iomeprol-190, Gadopentetat, Gadobenat, Gadoterat und Gadodiamid anhand der Messung der MTT-Konversion. Statistisch signifikante Unterschiede zeigten: Gadopentetat und Gadobenat ab einer Konzentration von 31,25 mM gegenüber allen anderen Substanzen (p < 0,001), Gadodiamid gegenüber Iomeprol-190 bei 250 mM (p < 0,05) und Gadoterat gegenüber Iomeprol und Gadodiamid bei 250 mM (p < 0,001). Die Daten werden angegeben in Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.) als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. n 126 für Iomeprol und n 277 für die Gadoliniumchelate.

Ergebnisse

40

250 mmol/l

125 mmol/l

62,5 mmol/l

31,25 mmol/l

Iomeprol 190 43 1,7 57 1,4 69 1,3 78 2

Mannit 330 71 1,6 79 1 87 1,3 95 0,5

Gadopentetat 2 0,1 48 1 63 0,8 76 1,7

Mannit 1860 3 0,2 51 1 81 0,9 84 0,9

Gadobenat 1,3 0,2 50 0,9 64 0,7 78 1,5

Gadoterat 8,5 0,4 60 0,8 71 0,8 78 1,5

Gadodiamid 47 1,2 56 0,9 70 0,8 78 + 1,5

Mannit 780 56 0,7 75 0,9 86 0,7 91 0,7

Tabelle 4: Vergleich der cytotoxischen Effekte der aufgeführten Kontrastmittel und Mannitollösungen nach 24stündiger Inkubationsdauer anhand des MTT-Tests. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz der unbehandelten Kontrollzellen. Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 120.

3.3.2 Zeitkinetik der Zellschädigung Die Zeitabhängigkeit der Zellschädigung wurde exemplarisch anhand von

Gadopentetatdimeglumin (Magnevist) getestet. Innerhalb der ersten zwei

Stunden nach Inkubationsbeginnn konnte bereits der größte Anteil der

Schädigung als Beeinträchtigung der MTT-Konversion registriert werden (p <

0,001). Nach weiteren sechs Stunden war in der Konzentration von 62,5 mM

eine geringfügig stärkere Zellschädigung nachweisbar (p > 0,05), während aber

bei einer Konzentration von 250 mM eine weitere deutliche Zunahme der

Konversionshemmung gezeigt werden konnte (p < 0,001). Nach 24 Stunden

war bei beiden Kontrastmittel-Konzentrationen kaum noch eine Veränderung

des Effektes festzustellen. Bei einer Inkubationsdauer von 48 Stunden konnte

kein signifikanter Unterschied in der Zellschädigung bei beiden

Konzentrationen gegenüber der Schädigung nach 24 Stunden festgestellt

werden (p > 0,05). Somit scheint der größte Teil der Schädigung bereits in den

ersten Stunden der Exposition einzutreten und das Maximum nach 24 Stunden

erreicht zu sein.

Ergebnisse

41

0 10 20 30 40 500

50

100

150

62.5 mM250 mM

Inkubationszeit [h]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 13: Konzentrations- und Zeitabhängigkeit der cytotoxischen Effekte von Gadopentetatdimeglumin auf LLC-PK1–Zellen verglichen anhand der MTT-Konversionshemmung. Die Zellen wurden für 2, 8, 24 und 48 Stunden mit 62,5 und 250 mM Gadopentetat inkubiert. Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 60. 2 Stunden 8 Stunden 24 Stunden 48 Stunden

250 mmol/l 28 1,2 3,8 0,3 1,8 0,3 1,2 0,2

62,5 mmol/l 71 1,5 68 1,2 59 1,8 57 1,8

Tabelle 5: Zeitabhängigkeit der Zellschädigung nach Inkubation der Zellen mit Gadopentetatdimeglumin in Konzentrationen von 250 und 62,5 mmol/l und anschließendem MTT-Test. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen. Angegeben sind jeweils Mittelwert und Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n 60.

Ergebnisse

42

3.3.3 Vergleich der Kontrastmittelcytotoxizität mit Osmolalitätseffekten Bei allen zum Vergleich getesteten Mannitol-Lösungen zeigte sich wie bei den

getesteten Kontrastmitteln eine dosisabhängige Toxizität, die jedoch in fast

allen Fällen signifikant geringer war als die Toxizität des damit verglichenen

Kontrastmittels (p < 0,001, siehe Abbildungen 4, 5, 6 sowie Tabelle 4). Im

Gegensatz dazu zeigten Gadopentetatdimeglumin und Gadobenatdimeglumin

nur bei Konzentrationen von 31,25 und 62,5 mM einen stärkeren Effekt als die

entsprechenden Mannitol-Lösungen (p < 0,001 bei beiden Konzentrationen).

Bei den Konzentrationen von 125 und 250 mM hingegen war keine

signifikante Abweichung zwischen der toxischen Wirkung der ionischen Gd-

KM und der Mannitol-Lösung zu erkennen (p > 0,05 bei beiden

Konzentrationen).

0 100 200 3000

50

100

150

Mannitol-330Iomeprol-190

Konzentration [mM]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 14: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und der korrespondierenden Mannitol-Lösung anhand des MTT-Konversionstests. Statistische Signifikanz zeigten: Iomeprol-190 und Mannit-330 bei allen getesteten Konzentrationen (p < 0,001, n 126). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).

Ergebnisse

43

0 100 200 3000

50

100

150

GadodiamidMannitol-780

Konzentration [mM]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 15: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Gadodiamid und der korrespondierenden Mannitol-Lösung anhand des MTT-Konversionstests. Statistische Signifikanz zeigten: Gadodiamid und Mannit-780 bei allen getesteten Konzentrationen (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).

Ergebnisse

44

0 100 200 3000

50

100

150

Gadopentetat

Mannitol-1860Gadobenat

Konzentration [mM]

MTT

[% d

er K

ontr

olle

]

Abb. 16: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK1–Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Gadopentetatdimeglumin, Gadobenatdimeglumin und der korrespondierenden Mannit-Lösung (Mannit-1860) anhand des MTT-Konversionstests. Statistisch signifikante Unterschiede ergaben sich bei Konzentrationen von 31,25 und 62,5 mM (p < 0,001, n 277 für die Gadoliniumchelate und n 245 für Mannit-1860). Die Daten sind angegeben als Prozentsatz der ungeschädigten Kontrollzellen und zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.).

3.4 Trypanblau-Test

Mittels des Trypanblau-Tests konnte nachgewiesen werden, dass die

Inkubation der LLC-PK1–Zellen mit Gadopentetatdimeglumin zum Tod der

Zellen führt. Bei einer Konzentration des KM von 125 mM und 24stündiger

Inkubation kam es bei 57 6 % der Zellen zum Zelltod, bei einer

Konzentration von 250 mM kam es zum Absterben aller Zellen (p < 0,001 vs.

Kontrolle).

Im Gegensatz dazu führte die Inkubation der Zellen mit dem iodhaltigen

Kontrastmittel Iomeprol zu einer geringen Anzahl toter Zellen bei einer

Konzentration von 125 mM (p < 0,001 vs. Gadopentetat, p > 0,05 vs.

Kontrolle). Bei höherer Konzentrierung kam es unter Iomeprol zu einem

moderaten Anstieg der Anzahl toter Zellen an der Gesamtzellzahl (p < 0,001

vs. Kontrolle). Die Auslösung des Zelltodes war aber auch in dieser hohen

Ergebnisse

45

Konzentration noch deutlich geringer als die durch das Gadoliniumchelat

induzierte (p < 0,001).

Kontrollzellen Iomeprol-190 Gadopentetat

250 mmol/l 12 0,7 26 4* 100 0*

125 mmol/l 12 0,7 19 4 57 6*

Tabelle 6: Vergleich der Kontrastmittel Iomeprol-190 und Gadopentetatdimeglumin bezüglich der Auslösung des Zelltodes anhand des Trypanblau-Exklusionstests in den Konzentrationen von 250 und 125 mmol/l. Die Werte sind angegeben als Prozentsatz toter Zellen an der Gesamtzellzahl und zeigen jeweils den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwertes (S.E.M.). n = 9. * bedeutet Sinifikanz zu den unbehandelten Kontrollzellen.

Kontro

lle12

5 mM Io

meprol

-190

125 m

M Gad

open

tetat

250 m

M Iomep

rol-19

0

250 m

M Gad

open

tetat

0

50

100

*

*

*

+

+

Tote

Zel

len

[% d

erG

esam

tzel

lzah

l]

Abb. 17: Vergleich der Anzahl toter Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadopentetat bei Konzentrationen von 125 und 250 mM. Statistisch signifikante Unterschiede zeigten Gadopentetat zur Kontrolle (Inkubation mit serumfreiem Medium) bei beiden Konzentrationen (p < 0,001), Iomeprol-190 zur Kontrolle bei 250 mM (p < 0,001), und Gadopentetat zu Iomeprol bei beiden Konzentrationen (p < 0,001). Die Daten sind wiedergegeben als Prozentsatz toter Zellen an der Gesamtzellzahl und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichung der Mittelwerte, n = 9. * bedeutet

Ergebnisse

46

signifikante Unterschiede zur Kontrolle, + bedeutet signifikante Unterschiede zwischen den Kontrastmitteln.

3.5 ELISA zur Detektion von Apoptose und Nekrose

Wie mittels eines ELISA für die Detektion von histongebundenen DNA-

Fragmenten im Zellkulturüberstand (Nekrose) und der cytoplasmatischen

Fraktion des Zelllysates (Apoptose) festgestellt wurde, führt bei einer KM-

Konzentration von 125 mM die Inkubation mit Gadopentetatdimeglumin und

Gadobenatdimeglumin zu einem stark signifikanten Anstieg von Nekrose und

Apoptose (Nekrose und Apoptose jeweils p < 0,001 vs. Kontrolle für

Gadopentetat und Gadobenat). Dabei konnte zwischen diesen beiden KM kein

Unterschied in der Auslösung von Apoptose und Nekrose gefunden werden (p

> 0,05).

Gadoterat, Gadodiamid und Iomeprol-190 führten nicht zu einem signifikanten

Anstieg der Nekrose gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen (jeweils p >

0,05 vs. Kontrolle).

Gadodiamid und Iomeprol verursachten ebenfalls keinen signifikanten Anstieg

der Apoptose gegenüber der Kontrolle (jeweils p > 0,05 vs. Kontrolle). Im

Gegensatz dazu verursachte Gadoterat einen leichten signifikanten Anstieg der

Apoptose verglichen mit der Apoptose bei unbehandelten Zellen (p < 0,01 vs.

Kontrolle). Zwischen den drei Kontrastmitteln Gadoterat, Gadodiamid und

Iomeprol-190 konnte weder für die Induktion der Nekrose noch für die

Induktion der Apoptose ein signifikanter Unterschied festgestellt werden.

Insgesamt riefen die beiden hochosmolalen Gadolinium-KM bei äquimolaren

Konzentrationen signifikant mehr Nekrose und Apoptose hervor als die beiden

Gd-Kontrastmittel Gadoterat und Gadodiamid sowie das iodhaltige

Kontrastmittel (jeweils p < 0,001 für Nekrose und Apoptose).

Ergebnisse

47

Gadop

entet

atGad

oben

at

Gadote

ratGad

odiam

idIom

eprol

-190

0

50

100

150+

ns

ns

* *

Nek

rose

[% D

iffer

enz

zur

Kont

rolle

]

Abb. 18: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadolinium-KM bei 125 mM anhand eines ELISA für die Detektion von Nekrose. Gadopentetat und Gadobenat induzierten einen signifikanten Anstieg von Nekrose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadopentetat und Gadobenat induzierten signifikant mehr Nekrose als die beiden anderen Gadoliniumchelate und das iodhaltige Kontrastmittel (p < 0,001). Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zur Kontrolle und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte. n = 22. * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle, + bedeutet Signifikanz zwischen den Kontrastmitteln, ns bedeutet nicht signifikant.

Ergebnisse

48

Nekrose Apoptose

Gadopentetat +124 9* +34 1*

Gadobenat +95 12* +35 3*

Gadoterat +17 7 +13 3*

Gadodiamid -6 7 +4 3

Iomeprol-190 +3 9 +5 2

Tabelle 7: Vergleich von Nekrose und Apoptose nach 24stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und verschiedenen Gadoliniumchelaten durch einen ELISA. Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zu den unbehandelten Kontrollzellen. Aufgeführt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte (S.E.M.) n = 22; * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle.

Ergebnisse

49

Gadop

entet

atGad

oben

at

Gadote

ratGad

odiam

idIom

eprol

-190

0

10

20

30

40 ns

ns

+

* *

*

Apop

tose

[% D

iffer

enz

zu

r Kon

trolle

]

Abb. 19: Vergleich der cytotoxischen Effekte auf LLC-PK-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Iomeprol-190 und Gadolinium-KM bei 125 mM anhand eines ELISA für die Detektion von Apoptose. Gadopentetat und Gadobenat induzierten einen signifikanten Anstieg von Apoptose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadoterat führte nur zu einem geringen Anstieg der Apoptose (p < 0,01 vs. Kontrolle). Gadopentetat und Gadobenat induzierten signifikant mehr Apoptose als die beiden anderen Gadoliniumchelate und das iodhaltige Kontrastmittel. (p < 0,001 ). Die Daten sind angegeben als Differenz der Prozentwerte zur Kontrolle und zeigen die Mittelwerte und die Standardabweichungen der Mittelwerte. n = 22. * bedeutet Signifikanz zur Kontrolle, + bedeutet Signifikanz zwischen den Kontrastmitteln, ns bedeutet nicht signifikant.

Diskussion

50

4. Diskussion

4.1 Klinische Relevanz der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie

Die Zahl der jährlich durchgeführten diagnostischen Untersuchungen und

interventionellen Verfahren unter intravasaler Applikation von Kontrastmitteln

nimmt immer weiter zu (TOMS, 2001). Insgesamt werden inzwischen weltweit

jährlich mehr als 60 Millionen Kontrastmittel-Dosen verwendet (BERG, 2000),

allein in den USA werden jährlich bis zu einer Million Kontrastmittel-

Untersuchungen durchgeführt (McCULLOUGH, 2003). Ebenso steigen Alter

und damit auch Komorbidität der behandelten Patienten (TOMS, 2001). Dies

hat zur Folge, dass auch die Inzidenz der Nebenwirkungen durch die

applizierten Kontrastmittel zunimmt. Neben Übelkeit und Erbrechen,

allergischen Reaktionen und hyperthyreotischen Krisen (VAN DER MOLEN,

2004) kann es auch zur Kontrastmittel-induzierten Nephropathie kommen, die

eine der wichtigsten Komplikationen der intravasalen Kontrastmittelgabe

darstellt. Dabei kommt es innerhalb von 72 Stunden nach

Kontrastmittelapplikation zu einem Anstieg des Serum-Kreatininwertes um

mehr als 25 % oder mehr als 0,5 mg/dl (MORCOS, 1998), wobei eine andere

Ätiologie ausgeschlossen worden sein muss. Insgesamt liegt die KIN an dritter

Stelle der Ursachen für im Krankenhaus erworbenes akutes Nierenversagen

(BERG, 2000; NASH, 2002; BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003).

Bei Patienten ohne Risikofaktoren tritt dieses Ereignis mit einer sehr geringen

Inzidenz zwischen 1,2 und 1,6 % in der Gesamtbevölkerung auf (NIKOLSKY,

2003). Hat ein Patient allerdings einen oder mehrere Risikofaktoren für die

KIN, so steigt sein Risiko deutlich an (WAYBILL, 2001). Als

prädisponierende Faktoren, die zur Entstehung einer KIN beitragen können,

zählen dabei besonders die Einschränkung der Nierenfunktion und die

Kombination aus Niereninsuffizienz und Diabetes mellitus, aber auch die

Einnahme von nichtsteroidalen Antiphlogistika oder Aminoglykosiden, hohes

Alter, Volumenmangel und kardiovaskuläre Vorerkrankungen (MORCOS

Diskussion

51

1998, McCULLOUGH 2003). So fand RIHAL 2002 eine Gesamtinzidenz der

KIN im Patientenkollektiv von 3,3 % wohingegen die Inzidenz bei Patienten

mit erhöhtem Serumkreatinin (> 2,0 mg/dl) einem Risiko von 22,4 %

ausgesetzt waren eine KIN zu entwickeln. Patienten mit erhöhtem

Kreatininwert und zusätzlichem Diabetes mellitus hatten sogar ein Risiko von

30,6 % eine KIN zu entwickeln (RIHAL, 2002). McCULLOUGH berichtet in

ähnlicher Weise von einer Inzidenz der KIN bei Patienten mit schwerer renaler

Funktionsstörung im Herzkatheterlabor von 13 % bei Nichtdiabetikern und 20

% bei Patienten mit zusätzlichem Diabetes mellitus (McCULLOUGH, 2003).

Eine Studie von 1990 zeigte sogar eine Inzidenz der KIN von 50 % bei

Patienten mit diabetischer Nephropathie, die einer koronaren Angiographie

unterzogen wurden (MANSKE, 1990).

In den meisten Studien zum Thema der Inzidenz der KIN wird die Dialyserate

aufgrund der KIN zwischen 0,4 und 2 % angegeben (LEVY, 1996;

McCULLOUGH, 1997; GRUBERG, 2000). Wenn die Dialysepflichtigkeit

eintritt, so sind schlechte Überlebensraten der Patienten die Folge. So spricht

McCULLOUGH von einer Krankenhaus-Mortalitätsrate von 36 % bei

Auftreten einer dialysepflichtigen KIN und einer Zweijahres-Mortalitätsrate

von 80 % (McCULLOUGH, 2003). Auch andere Studien zeigen ähnlich hohe

Mortalitätsraten. So fand GRUBERG eine kumulative Einjahresüberlebensrate

von dialysepflichtigen Patienten, die bei 45,2 % lag. Für Patienten mit

Kontrastmittel-Nephropathie, die nicht dialysiert werden mussten, zeigte sich

hier ebenfalls eine schlechte Überlebensrate von 35,4 % (GRUBERG, 2000).

Ähnliche Ergebnisse finden sich auch in anderen Veröffentlichungen (LEVY,

1996; RIHAL, 2002). Bei Intensivpatienten ermittelte man bereits

Mortalitätsraten von bis zu 76 % (DOUMA, 1997). Die höhere Mortalitätsrate

ist aber zum Großteil nicht auf ein Nierenversagen zurückzuführen, sondern

die Patienten, die eine KIN entwickeln, haben ein höheres Risiko an nicht

renalen Komplikationen wie z.B. Myokardinfarkt, Schlaganfall, Koma,

Lungenembolie oder gastrointestinalen Blutungen zu versterben. Die

schlechten Langzeitüberlebensraten hängen dabei nicht von der Höhe des

Anstiegs des Serum-Kreatinin-Wertes ab, sondern es zeigen sich bereits hohe

Mortalitätsraten bei verhältnismäßig geringem Anstieg des Kreatinin-Wertes

Diskussion

52

von etwa 0,5 mg/dl (McCOULLOUGH, 2003). Doch auch wenn es nicht zu

lebensbedrohlichen Zuständen kommt, so ist die Rate der Komplikationen

während des Krankenhausaufenthaltes erhöht und die Dauer des Aufenthaltes

verlängert, was die KIN zu einem klinisch durchaus relevanten Kranheitsbild

macht (DANGAS, 2005).

4.2 Pathogenese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie

Aufgrund der klinischen Relevanz der KIN wird bereits seit Jahren an der

Erforschung der Pathomechanismen der Erkrankung gearbeitet, allerdings sind

diese noch immer nur unzureichend geklärt. Als eine Hauptursache der KIN

wird die Hypoxie der renalen Medulla angeschuldigt, die durch mehrere

Faktoren ausgelöst werden könnte: Die Kontrastmittel führen eventuell zur

Ausschüttung vasoaktiver Substanzen wie zum Beispiel Endothelin und

Vasopressin und reduzieren dadurch den renalen Blutfluss. Gleichzeitig könnte

eine Erhöhung der Blutviskosität (SOLOMON, 2005; SEELIGER, 2007) und

dadurch eine verschlechterte Sauerstoffversorgung des Gewebes eine Rolle

spielen. Des Weiteren wird ein höherer Sauerstoffverbrauch im distalen

Tubulus und ein erhöhter hydrostatischer Druck in den Tubuli durch

osmotische Diurese und hohe Viskosität der KM als möglicher

Pathomechanismus diskutiert (McCULLOUGH, 2003; IDEE, 2004). Jedoch

lassen neuere Ergebnisse einer kontrollierten Patientenstudie an über 300

Patienten zur fehlenden prophylaktischen Wirkung des Vasodilatators

Fenoldopam und andere klinische Untersuchungen mit verschiedenen

vasodilatatorischen Substanzen darauf schließen, dass die hämodynamischen

Veränderungen nicht die wesentliche Rolle in der Entstehung der KIN beim

Menschen spielen (HALL, 1992; CHERTOW, 1996; KUMIK, 1998;

ABIZAID, 1999; WANG, 2000; STONE, 2003; KATZBERG, 2005).

Neben der medullären Hypoxie wird als wichtiger Pathomechanismus die

direkte Tubuluszellschädigung verstanden (MORCOS, 1999; RUDNICK,

2003). Bereits frühe Studien haben cytotoxische Effekte der Kontrastmittel

zeigen können (TALNER, 1968; HUMES, 1987). HUMES berichtete

beispielsweise, dass Kontrastmittel an isolierten proximalen Tubuluszellen von

Diskussion

53

Kaninchen einen subletalen Schaden verursachten, der sich durch

Erniedrigung der mitochondrialen Respiration, Kaliumaustritt aus den Zellen

und einen veränderten Calciumstoffwechsel der Zellen bemerkbar machte

(HUMES, 1987).

4.3 Prophylaxe der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie

Aufgrund der klinischen Relevanz der durch Kontrastmittel induzierten

Nephropathie und der schlechten Langzeitprognose wurden immer neue

Ansätze zur Prävention dieser Erkrankung entwickelt. Ein Ansatz der zu

vielversprechenden Ergebnissen führte, war die Verwendung von

nichtionischen niedrig- oder isoosmolalen Kontrastmitteln (COX, 2004;

MORCOS, 2005). Die Überlegenheit von Kontrastmitteln niedriger

Osmolalität gegenüber KM mit hoher Osmolalität ist inzwischen anerkannt, da

sie durch mehrere Studien wiederholt belegt wurde (MORCOS, 1999;

RUDNICK, 1995; MOORE, 1992). Ob die Verwendung isoosmolaler

Kontrastmittel einen zusätzlichen Nutzen bringt, wird in der Literatur

kontrovers diskutiert. So zeigte ASPELIN die Überlegenheit isoosmolaler KM

(ASPELIN, 2003), während andere Studien keinen Vorteil bei der Verwendung

isoosmolaler Kontrastmittel aufzeigen konnten (KOLEHMAINEN, 2003). Des

Weiteren wurde die Verabreichung von Mannitol-Lösungen, Furosemid,

Natriumbicarbonat, ANP (atriales natriuretisches Peptid), Endothelin-

Antagonisten, Adenosin-Rezeptorantagonisten, Prostaglandin E-1, Calcium-

Kanal-Blockern, Fenoldopam, Dopamin in geringen Dosen, und

Antioxidantien wie N-Acetylcystein auf deren prophylaktische Wirkung hin

untersucht (LEPOR, 2003; MORCOS, 2004; MERTEN, 2004; PANNU, 2004;

SHAH, 2004). Vor allem zur Verwendung von N-Acetylcystein (ACC) wurden

in den letzten Jahren zahlreiche Studien durchgeführt (BAKER, 2003;

MAEDER, 2004; SHAH, 2004; LEPOR, 2003; MORCOS, 2003; MINER,

2004; MORCOS, 2005; NALLAMOTHU, 2004). Eine große Metaanalyse

kommt dabei zu dem Schluss, dass ACC die Inzidenz des Kreatininanstiegs

nach Kontrastmittelgabe senken kann, dass dies aber nur von grenzwertiger

Signifikanz ist und in verschieden Subgruppen nicht zu beobachten war

Diskussion

54

(PANNU, 2004). Hinzu kommt, dass ACC möglicherweise nur eine

pseudoprotektive Wirkung besitzt, da ACC in der Lage ist den

Serumkreatininspiegel zu senken ohne die glomeruläre Filtrationsrate zu

beeinflussen (HOFFMANN, 2004).

Weitere Ansätze waren die prophylaktische Hämodialyse, Hämofiltration und

die Verwendung niedrigerer Kontrastmittel-Dosen (HUBER, 2002;

MARENZI, 2004; MORCOS, 2005). Die prophylaktische Hämodialyse zeigte

dabei keinen Vorteil für die Patienten in Hinsicht auf das Risiko eine KIN zu

entwickeln (MORCOS, 2005). Die prophylaktische Hämofiltration dagegen

zeigte in einer klinischen Studie einen positiven Einfluss auf die Prognose von

Patienten mit schwerwiegendem chronischem Nierenversagen (MARENZI,

2004). Der Nutzen dieses Verfahrens muss aber noch in weiteren Studien

bestätigt werden.

Die einzige Strategie zur Prävention der Kontrastmittelinduzierten

Nephropathie, deren Nutzen auf hohem Evidenzniveau derzeit gesichert ist, ist

die Hydrierung der Patienten vor der Kontrastmittelgabe (MÖCKEL, 2002).

4.4 Verwendung von Gadoliniumchelaten

Ein weiterer Vorschlag, der gemacht wurde, um die KIN zu vermeiden, ist die

Verwendung einer anderen Substanzgruppe, nämlich der Gadolinium-KM statt

der gebräuchlichen auf Iod basierenden Kontrastmittel (STRUNK, 2004;

MORCOS, 2005). Diese Gruppe von Kontrastmitteln findet nämlich schon

lange Zeit bei Untersuchungen im Magnetresonanztomographen Verwendung

und gilt dort als sicher in Bezug auf renale Komplikationen (NIENDORF,

1991; KIRCHIN, 2003; THOMSEN 2004).

Gadolinium-Kontrastmittel sind ursprünglich Kontrastmittel, die für die

Magnetresonanztomographie (MRT) entwickelt wurden. Ihre Kontrastwirkung

im MRT beruht auf der paramagnetischen Wirkung des Gadoliniumions. Die

Kontrastmittel führen zu einer katalytischen Verkürzung der Relaxationszeit

von Protonen und verstärken dadurch den Kontrast zum umgebenden Gewebe

(RAYMOND, 2005). Dieser Effekt ist auf die ungepaarten Elektronen

Diskussion

55

zurückzuführen, von denen Gd(III) jeweils sieben besitzt. Die ungepaarten

Elektronen weisen einen parallelen Spin auf, der sich zu einem

Nettoelektronenspin addiert (Paramagnetismus). Das magnetische Moment der

Elektronen führt zu einem starken magnetischen Wechselfeld und stimuliert

die Relaxation der benachbarten Protonen (REIMER, 2004; RAYMOND,

2005). Die Kontrastgebung bei konventionellen Röntgenverfahren hingegen

beruht auf vollkommen anderen Mechanismen. Dort wird die auftreffende

Röntgenstrahlung von den Kontrastmittelmolekülen absorbiert, was in der

Kontrastverstärkung gegenüber dem umliegenden KM-freien Gewebe

resultiert.

Es gibt mehrere Studien, die belegen, dass auch Gadolinium-KM grundsätzlich

für Untersuchungen im Computertomographen und für angiographische

Untersuchungen geeignet sind (KAUFMAN, 1999; LE BLANCHE, 2001;

GUPTA, 2002; KALINOWSKI, 2003; BAE, 2004). So testete BAE

beispielsweise Gadolinium-KM bei einer Dosis von 0,3 mmol/kg KG bei

Schweinen auf die Verwendbarkeit für computertomographische Angiographie

und kam zu dem Ergebnis, dass diese klinisch durchaus für entsprechende

Untersuchungen genutzt werden können (BAE, 2004). Auch KALINOWSKI

kommt in einer Studie an zehn Schweinen unter Verwendung von 1-molarem

Gadobutrol zu dem Schluss, dass das Gadoliniumchelat für

computertomographische Untersuchungen geeignet erscheint. Allerdings

verwendet er in seiner Studie eine deutlich höhere Konzentration von 2

mmol/kg KG (KALINOWSKI, 2003). Gadoteratmeglumin wurde bei

Kaninchen eingesetzt um renale Arterienstenosen zu beurteilen. Auch in dieser

Studie wurden Gadolinium-KM als Alternative zu iodhaltigen KM gesehen,

ebenso wie bei der Computertomographie eines Hundes unter Verwendung von

Gadopentetatdimeglumin (LE BLANCHE, 2001, GUPTA, 2002). Allerdings

wurde bei keiner dieser Studien die Wirkung auf die Nierenfunktion beurteilt,

sondern lediglich die Kontrasteigenschaften der Gadoliniumchelate.

Unterstützt werden diese tierexperimentellen Studien von Fallberichten und

Studien über die Verwendung von Gadoliniumchelaten außerhalb der

Kernspin-Tomographie an Patienten mit Kontraindikationen gegen Iod-

Kontrastmittel, die die Machbarkeit von CT und Angiographie mit

Diskussion

56

Gadolinium-KM zeigen (HATRICK, 1997; SPINOSA, 1998; HAMMER,

1999; KAUFMAN, 1999; PENA, 1999; ALBRECHT, 2000; ERLY, 2000;

NUSSBAUM, 2000; TOWNSEND, 2000; AMAR, 2001; WAGNER, 2001;

BUDOFF, 2002; DINKEL, 2002; GUPTA, 2002; RIEGER, 2002). RIEGER

berichtet beispielsweise von der Durchführung diagnostischer und inter-

ventioneller Angiographien an 29 Patienten mit Nierenfunktionseinschränkung

und beobachtete dabei eine adäquate diagnostische Darstellung der relevanten

Strukturen (RIEGER, 2002). PENA führte an einem Patienten eine

computertomographische Untersuchung unter Verwendung von

Gadopentetatdimeglumin durch, die eine koronale zweidimensionale

Rekonstruktion der Aorta ermöglichte (PENA, 1999).

4.5 Vergleich der Kontrastmittel in vivo Es gibt jedoch auch Berichte über nephrotoxische Eigenschaften der

Gadoliniumpräparate in Mensch und Tier.

Eine tierexperimentelle Studie an Ratten mit einer Cisplatin-induzierten

Nephropathie zeigte 24 Stunden nach Injektion hoher Dosen von Diatrizoat,

Iohexol, Gadopentetat oder Gadodiamid eine Dysfunktion der Nieren bei allen

vier Kontrastmitteln, wobei Gadodiamid die geringsten Funktionsstörungen

auslöste und Diatrizoat die ausgeprägtesten (THOMSEN, 1995). ELMSTAHL

untersuchte 2004 die Wirkung der Kontrastmittel Gadopentetat, Gadodiamid

und Iohexol in äquimolaren Konzentrationen und Konzentrationen mit sich

entsprechenden Röntgendichten an Schweinen mit renaler Ischämie. Dabei

zeigte sich, dass die Gadolinium-Kontrastmittel sowohl in den äquimolaren als

auch in den Konzentrationen gleicher Röntgendichte stärkere nephrotoxische

Effekte zeigten als das nichtionisch monomere Kontrastmittel Iohexol

(ELMSTAHL, 2004). Auch in einer 2008 veröffentlichten tierexperimentellen

Studie an Schweinen mit renaler Ischämie zeigten die verwendeten iodhaltigen

Kontrastmittel Iodixanol und Iopromid einen deutlichen Vorteil bezüglich

Röntgendichte und Nephrotoxizität in der Arteriographie gegenüber dem

Gadolinium-Kontrastmitteln Gadobutrol und Gadodiamid bei einem injizierten

Volumen von 3 ml/kg KG (ELMSTAHL, 2008).

Diskussion

57

Klinische Fallberichte und Studien widersprechen sich in der Aussage, ob

Gadolinium-Kontrastmittel bei Röntgen-Untersuchungen in Patienten mit

Kontraindikationen gegen Iod-Kontrastmittel einen Vorteil bieten. Eine Studie

von RIEGER impliziert, dass Gadopentetatdimeglumin eine sichere Alternative

für Angiographie und interventionelle Verfahren bei Patienten mit schwerer

vorbestehender Nierenschädigung ist. In dieser Untersuchung wurden 32

diagnostische und interventionelle angiographische Verfahren an Patienten mit

schwerer renaler Insuffizienz, von denen 59 % an zusätzlichem Diabetes

mellitus litten, durchgeführt. Dabei wurde Gadopentetatdimeglumin in einer

Konzentration von durchschnittlich 0,34 mmol/kg KG allein oder in

Kombination mit CO2 verwendet und führte in allen Fällen zu einer

ausreichenden Röntgendichte. Dabei erlitt einer der 29 Patienten ein akutes

Nierenversagen nach der Kontrastmittelanwendung, wobei jedoch andere

Ursachen nicht sicher ausgeschlossen werden konnten. Gadopentetat-

dimeglumin wird daher von Rieger als weniger nephrotoxisch beurteilt als

iodhaltige Kontrastmittel (RIEGER, 2002).

In einer ähnlichen Studie wurden die Verwendung eines nichtionischen Iod-

Kontrastmittels in Kombination mit CO2, CO2 als alleiniges Kontrastmittel und

Gadodiamid in einer Konzentration von bis zu 0,3 mmol/kg KG für die

Angiographie der unteren Extremität auf ihre Nephrotoxizität hin untersucht.

Dabei wurden insgesamt 42 Angiographien an insgesamt 40 Patienten mit

chronischer renaler Insuffizienz, von denen 63 % an Diabetes mellitus erkrankt

waren, beobachtet. 15 Prozeduren wurden mit dem Iod-KM durchgeführt, 7

mit Kohlenstoffdioxid und 20 mit Gadodiamid. Es zeigte sich ein signifikanter

Unterschied in der Inzidenz der KIN zwischen der Gruppe, die das iodhaltige

KM erhielt (40 %) und der Gruppe, die das Gadolinium-KM erhielt (5 %). Die

Kontrastmittel wurden jedoch in verschiedenen Dosierungen verwendet, was

die Beurteilbarkeit des nephrotoxischen Potentials deutlich einschränkt.

Errechnet man für beide Gruppen die durchschnittlich verabreichte Dosis, so

kommt man zu dem Ergebnis, dass das nichtionische Iod-KM deutlich höher

dosiert wurde als das Gadolinium-KM: Die Patienten erhielten durchschnittlich

0,43 mmol des nichtionischen KM/kg KG, aber nur 0,29 mmol/kg KG

Gadodiamid (SPINOSA, 2000). Allerdings gibt es auch klinische Studien und

Diskussion

58

Fallberichte, die zeigen, dass auch die auf Gadolinium basierenden KM zu

akutem Nierenversagen führen können (SCHENKER, 2001; SAM, 2003;

ERLEY, 2004). Dafür spricht eine Studie an 260 Patienten, von denen sich 218

einer Magnetresonanz-Angiographie und 42 einer digitalen

Subtraktionsangiographie mit Gadopentetatdimeglumin als einzigem

Kontrastmittel in einer Dosierung von 0,25 – 0,42 mmol/kg KG unterzogen.

Bei 195 der Patienten bestand vor der Prozedur bereits eine chronische

Niereninsuffizienz (Kreatinin-Clearance < 80 ml/min/1,73 m2). In dieser

Patientengruppe kam es bei sieben Patienten zu einem akuten Nierenversagen

nach der Angiographie. Dies entspricht einer Inzidenz von 3,5 %. Das akute

Nierenversagen nach KM-Gabe trat dabei bei Kontrastmittel-Konzentrationen

zwischen 0,27 und 0,42 mmol/kg KG auf. Bei drei Patienten wurde aufgrund

des akuten Nierenversagens vorübergehende Hämodialyse notwendig, einer der

Patienten musste sich einer Langzeitdialyse unterziehen (SAM, 2003).

Eine neuere randomisierte klinische Studie zeigte, dass die Gabe des

Gadolinium-Kontrastmittels Gadobutrol bei Patienten mit stark eingeschränkter

Nierenfunktion (Serumkreatinin 3,2 1,3 mg/dl, GFR 31 16 ml/min/1,73 m2)

ebenso wie das Iod-KM Iohexol in einer GFR-Reduktion resultiert. Insgesamt

wurden 21 Patienten in zwei Gruppen randomisiert und erhielten während einer

digitalen Subtraktionsangiographie entweder Gadobutrol oder Iohexol. In der

Gadobutrol-Gruppe wurde eine signifikante GFR-Reduktion von 10,6 13,8

ml/min/1,73 m2 beobachtet, in der Iohexol-Gruppe betrug die signifikante

GFR-Reduktion nur 8,7 8,8 ml/min/1,73 m2. Dieser Unterschied in der GFR-

Reduktion durch die beiden Kontrastmittel war allerdings ebenso wie die

Inzidenz des akuten Nierenversagens in den beiden Gruppen (50 % bei

Gadobutrol und 45 % bei Iohexol) nicht statistisch signifikant, da nach der

Untersuchung von 21 Patienten die Studie vorzeitig abgebrochen wurde,

nachdem eine Untersuchung von NYMAN mögliche toxische Effekte von

Gadobutrol gezeigt hatte (NYMAN 2002) und nahezu alle bis dahin

untersuchten Patienten mit einer GFR-Reduktion auf die Applikation von

Gadobutrol reagierten (ERLEY, 2004).

Diskussion

59

4.6 Vergleich der Kontrastmittel in vitro

4.6.1 MTT-Test

Der MTT-Test ist ein etabliertes Testverfahren, das bei vielen Fragestellungen

zur Beurteilung von Lebensfähigkeit, Aktivierungszustand und Proliferation

von Zellen und vor allem der Cytotoxizität verschiedenster Substanzen

Anwendung findet (KREISBERG, 1988; AHLENSTIEHL, 2003; ZHANG,

2003; NAKANISHI, 2005). Auch für die Quantifizierung der Effekte von

Kontrastmitteln wurde der MTT-Test bereits mehrfach angewendet. So zeigen

einige Studien die Reduktion der MTT-Konversion durch iodhaltige

Kontrastmittel an Tubulus-Zellkulturen (DASCALU, 1994; HARDIEK, 2001;

ZAGER, 2003; HEINRICH, 2005).

Auch in unseren Experimenten konnte die Cytotoxizität der verschiedenen

Kontrastmittel gut anhand der Reduktion der MTT-Konversion nachvollzogen

werden. Sämtliche Kontrastmittel zeigten eine Konversionsinhibition, die mit

der Dosis der jeweiligen Kontrastmittel zunahm. Diese Dosisabhängigkeit

zeigte sich auch in anderen Studien zur Kontrastmittelwirkung an Zellkulturen:

HARDIEK zeigte bei Untersuchungen anhand des MTT-Tests eine deutliche

Dosisabhängkeit der MTT-Konversionshemmung durch Iopamidol, Iomeprol,

Iodixanol, Ioxaglat und Diatrizoat in Konzentrationen von 25, 50, 75 und 100

mg I/ml (HARDIEK, 2001). Eine Dosisabhängigkeit der Konversions-

hemmung konnte auch für die Kontrastmittel Ioxitalamat, Ioversol, Iodixanol

und Iotrolan bei Konzentrationen von 18,75 bis 150 mg I/ml beobachtet

werden (HEINRICH, 2005) sowie in einer weiteren Studie für Iomeprol und

Iodixanol in Konzentrationen von 4,77 und 75 mg I/mL (HEINRICH, 2007).

In unserer Arbeit wurde eine Evaluierung der Zeitkinetik der Zellschädigung

durch die Kontrastmittel Iomeprol und Gadopentetatdimeglumin ebenfalls

anhand des MTT-Tests durchgeführt. Hier zeigte sich der Großteil der

Schädigung bereits zwei Stunden nach Inkubation mit den Kontrastmitteln,

nach acht Stunden war keine weitere signifikante Zunahme der Zellschädigung

mehr nachweisbar. Auch HARDIEK evaluierte die Zeitabhängigkeit der

Zellschädigung durch Iopamidol mit Hilfe des MTT-Tests, konnte dabei aber

Diskussion

60

keine eindeutige Zeitabhängigkeit der Schädigung nachweisen. In den

Konzentrationen von 25, 50, 75 und 100 mg I/ml war nach vier Stunden

Inkubation eine maximale Zellschädigung erreicht, die im weiteren Verlauf

gleich blieb oder sich leicht reduzierte (HARDIEK, 2001). Auch in einer in

vitro Studie an humanen Nieren-Adenocarcinom-Zellen wurde mittels des

MTT-Tests eine deutliche Zellschädigung bereits nach vier Stunden

Inkubationszeit nachgewiesen. Dieser Effekt wurde in allen getesteten

Iodkonzentrationen (8, 20, 60 mg I/ml) beobachtet und war für die getesteten

ionischen Kontrastmittel (Diatrizoat, Amidotrizoat, Ioxaglat) signifikant stärker

als für die nichtionischen KM (Iopamidol, Iotrolan, Iopromid). Nach 24

Stunden zeigte sich auch hier keine eindeutige Zunahme der Schädigung, so

dass auch hier keine klare Zeitabhängigkeit gezeigt werden konnte

(DASCALU, 1994). In einer in vitro Studie mittels MTT-Test an LLC-PK1-

Zellen von HEINRICH konnte allerdings eine Zeitabhängigkeit der

Konversionshemmung durch Iomeprol und Iodixanol festgestellt werden. Auch

hier zeigte sich, dass sich ein Großteil der Zellschädigung bereits früh

innerhalb von 8 Stunden auftrat und eine weitere Inkubation nur zu geringer

oder keiner weiteren Zunahme der Konversionshemmung mehr führte

(HEINRICH, 2007).

Zum cytotoxischen Potential gadoliniumhaltiger Kontrastmittel liegen derzeit

noch keine Studien unter Zuhilfenahme des MTT-Tests vor, jedoch verwendet

YANO einen Test, der ebenfalls auf der Reduktion eines Tetrazoliumsalzes zu

einem Formazan beruht und allgemein als Alternative zum MTT-Test

angesehen wird. In dieser Studie wurden die Effekte von Gadopentetat und

Gadoteridol nach 30minütiger KM-Inkubation und anschließender 24stündiger

Inkubation in serumfreiem Medium mittels des WST-8-Tests beurteilt. Es

zeigte sich bei beiden Kontrastmitteln eine signifikante Hemmung der WST-8-

Reduktion (YANO, 2003).

Es gibt nun aber mehrere Möglichkeiten, die beobachtete

Konversionshemmung zu deuten. Der Mechanismus der MTT-Aufnahme in

die Zelle ist nicht komplett geklärt. Die Aufnahme des Tetrazoliums in die

Zelle erfolgt wahrscheinlich durch Endozytose, wobei allerdings auch ein

Diskussion

61

proteinvermittelter Transport ins Zellinnere nicht komplett ausgeschlossen

werden kann (LIU, 1997). In der Zelle wird das gelbe Tetrazolium durch

mitochondriale oder andere zelluläre Dehydrogenasen zu dem blauen

Formazan reduziert.

Die Konversion von MTT in das blaue Formazan kann daher für die Messung

verschiedenster Endpunkte verwendet werden. Zunächst könnte die

verminderte MTT-Konversion durch das Absterben von Zellen erklärt werden.

Dagegen sprechen im Falle von niedrigosmolalen, nichtionischen KM aber in

vitro Studien, die zeigen, dass die Reduzierung des Tetrazoliums zu Formazan

durch nichtionsche KM nicht auf den Zelltod zurückgeführt werden kann

(HARDIEK, 2001). Auch unsere Testergebnisse zum Zelltod durch

nichtionische Kontrastmittel sprechen dagegen, dass der Hauptgrund für die

geringere MTT-Konversion in den behandelten Zellkulturen im Absterben der

Zellen liegt. Zum zweiten könnte eine Reduktion der Proliferationsrate der

behandelten Zellen gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen für die

Ergebnisse des MTT-Tests zumindest teilweise verantwortlich sein. Dafür

sprechen die Untersuchungsergebnisse von HARDIEK, die eine geringe

dosisabhängige Proliferationshemmung durch Iopamidol zeigen konnten.

Allerdings konnte die verminderte MTT-Reduktion nicht vollständig durch

diese Proliferationshemmung erklärt werden (HARDIEK, 2001). Weiterhin

könnte eine Beeinflussung mitochondrialer und anderer zellulärer

Dehydrogenasen die verminderte Entstehung des Formazans in den mit

Kontrastmittel behandelten Zellen verursachen (HARDIEK, 2001). In der

Literatur finden sich Hinweise auf die Beeinflussung der Mitochondrien durch

Kontrastmittel: Anhand von in vitro Experimenten an LLC-PK1-Zellen konnte

eine verminderte MTT-Reduktion gezeigt werden, die auf die Beeinflussung

mitochondrialer Dehydrogenasen zurück zu führen sein könnte und zusätzlich

eine Erhöhung der Adenosin-Konzentration als Ausdruck einer Imbalance

zwischen ATP-Produktion und ATP-Utilisation (HARDIEK, 2001). Auch

ZAGER beschreibt die Beeinflussung der Mitochondrien durch Kontrastmittel.

Er fand nach Untersuchungen anhand von Kulturen proximaler Tubuluszellen

nach Schädigung durch das iodhaltige Kontrastmittel Ioversol, dass

Kontrastmittel zur Destabilisierung der Plasmamembran und möglicherweise

Diskussion

62

auch der mitochondrialen Membranen führen können, so dass es in der Folge

zum Verlust wichtiger Plasmamembranproteine wie der Na+/K+-ATPase und

auch mitochondrialer Proteine wie Cytochrom c kommen kann. Der Übertritt

von Cytochrom c, das normalerweise an der inneren Mitochondrienmembran

lokalisiert ist, ins Cytoplasma kann über die Aktivierung von Caspasen

schließlich zum Tod der Zelle führen (ZAGER, 2003; ZAGER, 2004).

Des Weiteren könnten theoretisch die Kontrastmittel auch die Aufnahme des

MTT in die Zellen durch Endozytose oder proteinvermittelten Transport

hemmen und dadurch zu einer verminderten Reduktion des MTT führen. Ein

derartiger Effekt von Kontrastmitteln wurde bisher allerdings noch nicht

beschrieben.

4.6.2 Trypanblau-Test zum Nachweis des Zelltodes

Um bewerten zu können, ob die im MTT-Test beobachtete

Konversionshemmung nach Behandlung der Zellen mit verschiedenen

Kontrastmitteln auf den Untergang von Zellen zurückzuführen ist, führten wir

einen Trypanblau-Exklusions-Test beispielhaft mit einem iodhaltigen

(Iomeprol-190) und einem gadoliniumhaltigen Kontrastmittel (Magnevist,

Gadopentetatdimeglumin) durch.

In unseren Experimenten unter Verwendung des Trypanblau-Exklusions-Tests

konnte eine signifikante Reduktion der Anzahl lebender Zellen durch das

hochosmolale Kontrastmittel Gadopentetatdimeglumin in Konzentrationen von

125 mM und 250 mM festgestellt werden, wohingegen nach Inkubation mit

dem monomeren Iod-Kontrastmittel Iomeprol nur eine geringe Anzahl toter

Zellen nachgewiesen werden konnte und dieser Effekt auch nur in der hohen

Konzentration von 250 mM zu sehen war.

Diese Ergebnisse decken sich gut mit den Resultaten des MTT-Tests und auch

mit bisherigen Untersuchungen anderer Autoren, die den Trypanblau-Test

angewendet haben, um Kontrastmittel-Cytotoxizität untersuchen (HALLER,

1997; WANG, 1998; SCHICK, 1999; ANDERSEN, 1994; HARDIEK, 2001).

Diskussion

63

Dabei zeigt sich meist, dass die nichtionisch monomeren und somit

niedrigosmolalen Iod-KM weniger oft oder gar nicht zum Absterben der Zellen

führten als die ionischen und somit hochosmolalen Kontrastmittel (WANG,

1998). WANG beurteilte anhand der Trypanblau-Färbung die cytotoxischen

Effekte der Kontrastmittel Diatrizoat, Ioxaglat, Iopromid und Iotrolan auf die

Zellen menschlicher Gefäßmuskulatur. Nach 60-minütiger Inkubation der

Zellen mit den Kontrastmittellösungen fand sich keine Beeinträchtigung der

Lebensfähigkeit der Zellen durch die nichtionisch monomeren Kontrastmittel

Iopromid und Iotrolan, bei den ionischen KM Diatrizoat und Ioxaglat wurde

eine signifikante Reduktion lebender Zellen festgestellt (WANG, 1998). Auch

HARDIEK fand keinerlei Hinweise auf eine Beeinträchtigung der

Lebensfähigkeit von LLC-PK1-Zellen nach Inkubation mit dem nichtionischen

Kontrastmittel Iopamidol (HARDIEK, 2001).

HALLER verwendete den Trypanblau-Test zur Beurteilung der Toxizität der

Kontrastmittel nach Inkubation der LLC-PK1-Zellen mit Ioxaglat und

Iopamidol und anschließender Trypsinierung der Zellen. Dabei stellte sich eine

Reduktion der Zahl lebender Zellen heraus, die bei dem hochosmolalen

Kontrastmittel Diatrizoat deutlich ausgeprägter war, als bei dem nichtionisch

monomeren Kontrastmittel Iopamidol (HALLER, 1997). Auch in den

Versuchen von SCHICK an MDCK-Zellen führte das ionische monomere KM

Diatrizoat zu einem signifikanten Anstieg toter Zellen im Trypanblau-Test,

während die verwendeten nichtionischen KM Iohexol und Iodixanol, aber auch

das dimere ionische KM Ioxaglat nicht zu einer reduzierten Lebensfähigkeit

der Zellen führten (SCHICK, 1999). ANDERSEN verwendete zur

Untersuchung der zellulären Schädigungsmechanismen durch Kontrastmittel

den Trypanblau-Test sowohl bei LLC-PK1- als auch MDCK-Zellen. Dabei

zeigte das hochosmolale Kontrastmittel Metrizoat bei beiden Zelltypen eine

signifikante Erhöhung der Zellmortalität (73% tote Zellen bei den LLC-PK1-

Zellen, 56 % bei den MDCK-Zellen), wohingegen die Kontrastmittel niederer

Osmolalität Ioxaglat und Iohexol nur geringe Auswirkungen auf die

Lebensfähigkeit der Zellen hatten (ANDERSEN, 1994).

Zur Auslösung des Zelltodes durch Gadolinium-KM existieren derzeit keine

anderen Studien unter Verwendung der Trypanblau-Methode.

Diskussion

64

4.6.3 Rolle von Apoptose und Nekrose Ein wichtiger Mechanismus bei der Entstehung der KIN soll die direkte

cytotoxische Schädigung der Nierenzellen sein, wozu auch die Auslösung des

Zelltodes gehört (HIZOH, 1998; MORCOS, 1998; PEER, 2003; RUDNICK,

2003). Wie durch die Verwendung des Trypanblau-Tests deutlich wurde,

kommt es bei Inkubation renaler Tubuluszellen mit hochosmolalen

Kontrastmitteln zum Absterben von Zellen. Der Zelltod kann nun aber durch

zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen: durch Apoptose oder Nekrose.

Die Nekrose ist assoziiert mit raschem metabolischem Kollaps der Zelle, der

zur Zellschwellung inklusive Schwellung der cytoplasmatischen Organellen,

Verlust der Plasmamembranintegrität und letztendlich zur Zellruptur führt

(BONFOCO, 1995). Dadurch kommt es zum Austritt von cytoplasmatischen

Bestandteilen, die zu inflammatorischen Reaktionen im umliegenden Gewebe

führen können. (LIEBERTHAL, 1996; ALENZI, 2003).

Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der Apoptose um einen

energieverbrauchenden, gengesteuerten Zellprozess, der zum „Suizid“ der

Zelle führt. Dabei unterscheiden sich die beiden Prozesse durch die

morphologischen Charakteristika und die biochemischen Vorgänge

grundlegend voneinander. Die Apoptose ist charakterisiert durch

Zellschrumpfung, nukleare Kondensation und DNA-Fragmentation in

nucleosomale Einheiten durch Spaltung der Linker-DNA zwischen den

Nucleosomen, die zur Bildung von mono- und oligonucleosomalen DNA-

Fragmenten führt. Diese werden als Hauptmerkmal der Apoptose bezeichnet

(ARENDS, 1990; SCHWARTZMAN, 1993; ALENZI, 2003). Anschließend

kommt es zur Karyolyse, dann zur Auflösung der Zelle in mehrere Apoptose-

Körperchen. Darunter versteht man Plamamembranvesikel mit kondensiertem

Chromatin und morphologisch intakten Organellen, wobei es im Gegensatz zur

Nekrose nicht zum Austritt cytoplasmatischen Materials kommt

(LIEBERTHAL, 1996; NAGATA, 2000; ALENZI, 2003).

Diskussion

65

Die Beteiligung beider Vorgänge an der Entstehung der KIN ist seit einiger

Zeit ein kontrovers diskutiertes Thema, zu welchem entgegengesetzte

Studienergebnisse vorliegen. Daher war ein weiterer Schritt unserer

Untersuchungen die Klärung der Frage, ob Nekrose und Apoptose durch die in

unserer Studie verwendeten Iod- und Gadolinium-Kontrastmittel ausgelöst

werden können.

Um die beiden Arten des Zelltodes, die durch die KM ausgelöst werden

könnten - Apoptose und Nekrose - unterscheiden zu können, führten wir einen

ELISA durch, der histongebundenen DNA-Komplexe aus der

cytoplasmatischen Fraktion der Zellen nach apoptotischem Zelluntergang und

DNA-Fragmente nach Austritt aus nekrotischen Zellen nachweisen konnte. Die

hochosmolalen Gadoliniumchelate Magnevist (Gadoliniumpentetatdi-

meglumin) und Multihance (Gadobenatdimeglumin) induzierten dabei

verglichen mit der Kontrolle aus unbehandelten Zellen in serumfreiem Medium

signifikant mehr Apoptose und auch Nekrose, wohingegen Gadoterat nur

wenig Apoptose auszulösen vermochte und die übrigen Kontrastmittel

Gadodiamid und Iomeprol weder zu Apoptose noch zu Nekrose führten.

Auch in früheren Studien wurde der Frage nachgegangen, inwiefern die auf Iod

basierenden Kontrastmittel zur Apoptoseauslösung führen. HIZOH wies

anhand von MDCK-Zellen, die für 2-8 Stunden mit dem ionischen monomeren

Kontrastmittel Diatrizoat in Konzentrationen von 10, 20 und 30 % inkubiert

worden waren, eine DNA-Fragmentation als Zeichen einer Apoptose nach

(HIZOH, 1998; HIZOH, 2002). Die Aussage, dass ionische Iod-Kontrastmittel

apoptotischen Zelltod auslösen können, wird von Untersuchungen von PEER

unterstützt, bei denen renale Mesangiumzellen, Tubuluszellen, Epithelzellen,

endotheliale Zellen und hepatische Zellen verwendet wurden. Dabei wurden

die verschiedene Zelltypen mit Ioxaglat (ionisch dimer), Ioxitalamat (ionisch

monomer), Iopromid und Iomeprol (beide nichtionisch monomer) für 24

Stunden in Konzentrationen von 0,1 %, 1 % und 10 % inkubiert. Die ionischen

Kontrastmittel führten dabei bei allen Konzentrationen zur Auslösung von

Apoptose, ebenso wie das nichtionische KM Iopromid. Iomeprol führte bei

Konzentrationen 1 % zum apoptotischen Zelltod (PEER, 2003).

Diskussion

66

Die Auslösung von Apoptose durch nichtionische Kontrastmittel wird in der

Literatur unterschiedlich beurteilt. Während in der Studie von PEER Iomeprol

und Iopromid zu Apoptose führen, konnte HARDIEK keinen Anhalt für den

programmierten Zelltod nach 24stündiger Inkubation von LLC-PK1-Zellen mit

dem nichtionischen KM Iopamidol finden (HARDIEK, 2001). YANO zeigte in

mehreren Studien, dass das nichtionische iodhaltige Kontrastmittel Ioversol

nach vorübergehender 30minütiger KM-Exposition und anschließender

24stündiger Inkubation in serumfreiem Medium zur Auslösung des

programmierten Zelltodes führt (YANO, 2003; YANO, 2004). Auch

ROMANO konnte 2008 zeigen, dass sowohl Iodixanol (IOCM) als auch

Iobitridol LOCM) in Kulturen von Humanen embryonalen Nierenzellen

(HEK293), LLC-PK1-Zellen und in Hundenierenzellkulturen (MDCK) eine

dosisabhängige Apoptose auslösen können (ROMANO, 2008)

Die unterschiedlichen Ergebnisse der genannten Untersuchungen lassen sich

wohl auf die Verwendung unterschiedlicher Kontrastmittel, Konzentrationen,

Inkubationszeiten und verschiedene Nachweismethoden für Apoptose

zurückführen.

Zur Rolle der Apoptose bei Gadolinium-Kontrastmitteln liegen derzeit noch

keine Studien vor.

4.6.4 Rolle der Osmolalität

Ein wichtiges Kriterium für die Entstehung der Kontrastmittel-induzierten

Nephropathie ist anscheinend die Osmolalität der Kontrastmittel. So zeigten

verschiedene klinische Untersuchungen einen deutlichen Unterschied in der

Toxizität der Kontrastmittel abhängig von der jeweiligen Osmolalität. In einer

großen Metaanalyse zeigte BARRETT eine deutlich höhere Inzidenz der KIN

bei Patienten mit Risikofaktoren, wenn diese ein Iod-KM mit hoher

Osmolalität (Iothalamat, Diatrizoat) erhielten, als wenn sie ein KM mit

niedriger Osmolalität erhielten (Iohexol, Iopamidol). Die niedrigosmolalen KM

induzierten bei 1,9 % der Patienten mit renaler Insuffizienz eine KIN, bei

Patienten mit Niereninsuffizienz und zusätzlichem Diabetes mellitus in 3,8 %.

Bei Verwendung der hochosmomolalen Kontrastmittel zeigte sich bei den

Diskussion

67

Patienten mit Nierenfunktionseinschränkung eine Inzidenz der KIN von 12,5 %

und bei Patienten, die zusätzlich dazu noch an Diabetes mellitus litten, eine

Inzidenz von 25 % (BARRETT, 1993). Eine weitere Studie, die ebenfalls die

Kontrastmittel Iohexol und Diatrizoat verglich, zeigt sehr ähnliche Ergebnisse:

Iohexol führte bei Patienten mit Niereninsuffizienz allein zu einer Inzidenz der

KIN von 4,1 %, bei Patienten mit zusätzlichem Diabetes mellitus von 7,4 %.

Diatrizoat zeigte bei Patienten mit renaler Insuffizienz eine Inzidenz der

Kontrastmittel-Nephropathie von 11,8 %, während Patienten mit beiden

Risikofaktoren einem Risiko von 27 % ausgesetzt waren eine Einschränkung

der Nierenfunktion nach Kontrastmittelgabe zu erleiden (RUDNICK, 1995).

Klinische Studien zur Verwendung von Kontrastmitteln mit noch geringerer

Osmolalität, den so genannten isoosmolalen Kontrastmitteln (Iotrolan,

Iodixanol), zeigen gegensätzliche Ergebnisse. Während einige Autoren einen

Vorteil in der Verwendung isoosmolaler KM sehen (CHALMERS, 1999;

ASPELIN, 2003), sprechen andere Untersuchungen nicht klar für die

Überlegenheit dieser KM-Gruppe (DERAY, 1996; SHARMA, 2005).

Neben klinischen Studien sprechen auch tierexperimentelle Studien für ein

besseres Risikoprofil niedrigosmolaler Kontrastmittel. ELMSTAHL

beobachtete bei seinen Untersuchungen an Schweinen mit vorgeschädigten

Nieren, dass die nephrotoxischen Effekte der gadolinium- und iodhaltigen

Kontrastmittel sich proportional zu ihren Osmolalitäten verhielten. Es wurde

geschlussfolgert, dass die Nierenschädigung im Tiermodell eine Folge der

Hyperosmolalität sein könnte (ELMSTAHL, 2002).

Damit korrelieren auch Ergebnisse von in vitro Studien, die die Toxizität von

hoch- und niedrigosmolalen Kontrastmitteln anhand von Zellkulturen

vergleichen. So zeigte sich bei einem Vergleich des hochosmolalen KM

Ioxitalamat mit dem niedrigosmolalen Iomeprol-300 eine deutlich stärkere

MTT-Konversionshemmung bei dem hochosmolalen KM. Bei einem Vergleich

der Kontrastmitteleffekte mit entsprechenden Mannitol-Lösungen als

Osmolalitätskontrolle wurde aber deutlich, dass zusätzlich zur Osmolalität

noch eine Chemotoxizität der Kontrastmittelmoleküle vorliegt (HEINRICH,

2005). DASCALU verglich die Auswirkungen der Inkubation mit ionischen

und nichtionischen Iod-Kontrastmitteln auf humane endotheliale und renale

Diskussion

68

Zellen und zeigte, dass die ionischen Kontrastmittel zu einer stärkeren

Hemmung der MTT-Konversion führten als die nichtionischen Kontrastmittel

(DASCALU, 1994). Auch in unseren Untersuchungen konnten wir eine

Abhängigkeit der Toxizität von der Osmolalität der Testlösungen feststellen.

So zeigten die hochosmolalen Gadolinium-KM (Magnevist: 1960 mosm/kg;

Multihance: 1970 mosm/kg) eine signifikant höhere Konversionshemmung als

das niedrigosmolale Iod-KM Iomeprol (521 mosm/kg) und die Gadolinium-

KM Gadodiamid und Gadoterat. Auch unsere Ergebnisse weisen darauf hin,

dass die Cytotoxizität nicht allein Folge der Osmolalität ist, sondern zusätzlich

andere Faktoren an der Schädigung beteiligt sein müssen. Dafür sprechen die

Ergebnisse beim Vergleich der Kontrastmitteleffekte mit Mannitol-Lösungen

gleicher Osmolalität, bei denen eine höhere Toxizität der Kontrastmittel

gegenüber den Mannitol-Lösungen nachgewiesen werden konnte.

Gadopentetat und Gadobenat zeigten in den geringeren Konzentrationen

jeweils stärkere Schädigungen der Zellen als die korrespondierenden Mannitol-

Lösungen. In der Konzentration von 250 mM allerdings war dieser Effekt nicht

mehr nachweisbar. Es scheint also bei den hochosmolalen Kontrastmitteln in

hohen Konzentrationen die Osmolalität der vorherrschende Schädigungs-

mechanismus zu sein, während in geringen Dosen auch andere Mechanismen

bei der Zellschädigung eine Rolle spielen.

Auch HARDIEK zeigte, dass zwar ein Teil der Zellschädigung durch die

Osmolalität erklärt werden konnte, aber zusätzlich noch ein chemotoxischer

Effekt der Kontrastmittelmoleküle vorliegen muss (HARDIEK, 2001). Damit

decken sich auch bisherige in vitro Studien zur Rolle der Osmolalität, die

ebenfalls eine wesentliche Bedeutung in der Entstehung der KIN der

Osmolalität zuordnen, gleichzeitig aber einen zusätzlichen chemotoxischen

Effekt beschreiben (WANG, 1998; ZHANG, 2000).

4.6.5 Rolle der Toxizität des Gadoliniums Ein möglicher Grund für die toxischen Effekte der Gadoliniumchelate in

unseren Experimenten könnte die Freisetzung freier Gd3+-Ionen während der

Inkubationszeit sein. Freies Gadolinium stellt eine hochtoxische Substanz dar,

Diskussion

69

weil Gadoliniumionen in freier Form beispielsweise calciumantagonistisch

wirken, sich in Leber und Milz anreichern und zu Interaktionen mit

Blutgerinnung und Hämatopoese führen (REIMER, 2004). Gadolinium muss

daher durch starke organische Chelatoren gebunden werden. Diese können

linear oder zyklisch aufgebaut sein, zusätzlich unterscheidet man ionische und

nichtionische Kontrastmittelmoleküle (RAYMOND, 2005; REIMER, 2004).

Die Gadoliniumchelate zeigen im Vergleich mit freien Gadoliniumionen eine

deutlich geringere Toxizität, so zeigte Gadodiamid in Experimenten in vitro an

menschlichen neutrophilen Granulozyten keine Schädigung, während freies

Gadolinium zu reduzierter Überlebensfähigkeit der Zellen führte (BEHRA-

MIELLET, 1996).

Gadoliniumionen können aber in vivo durch Transmetallisation im Austausch

gegen Kupfer(II)-, Zink(II)- oder Calcium(II)-Ionen aus den Chelatkomplexen

herausgelöst werden (CACHERIS, 1990), so dass Gadoliniumionen freigesetzt

werden. Es gibt klinische Hinweise darauf, dass es bei Anwendung von

Gadodiamid zum Austausch des Gd3+-Ions gegen andere Ionen im Körper

kommen kann (KIRCHIN, 2003). Andererseits wurden bis zu sieben Tage nach

Anwendung von Gadodiamid kein Metabolismus und keine Transmetallisation

bei Patienten mit schwerwiegender Niereninsuffizienz nachgewiesen

(NORMANN, 2000). Für andere Gadoliniumchelate liegen diesbezüglich keine

Hinweise vor, da deren höhere Thermostabilität einen Ionenaustausch zu

verhindern scheinen (KIRCHIN, 2003).

Gegen die Freisetzung freier Gadoliniumionen als Mechanismus der

Zellschädigung in unseren Experimenten sprechen zwei Gründe: Gadodiamid,

das einzige Kontrastmittel für das die Transmetallisation beschrieben wurde,

zeigte in unseren Experimenten die geringste Toxizität verglichen mit den

weiteren getesteten Gadoliniumchelaten. Dagegen spricht ebenfalls der

zeitliche Verlauf der MTT-Konversionshemmung, da der größte Teil des

Effektes bereits nach zwei Stunden erreicht war.

Diskussion

70

4.7 Kontrastmittelkonzentrationen und Inkubationszeiten

Wichtig für die Beurteilung, inwiefern Gadolinium-KM tatsächlich eine

Alternative für Patienten mit Kontraindikationen gegen iodhaltige KM

darstellen, ist die notwendige Dosierung der jeweiligen KM für den

entsprechende Anwendungszweck und die Wirkungen der Kontrastmittel bei

diesen Konzentrationen.

In der Angiographie werden üblicherweise iodhaltige Kontrastmittel mit einer

Konzentration von 300 bis 370 mg I/ml eingesetzt. Für koronare Interventionen

werden von diesen Lösungen Volumina von etwa 240 bis 380 ml verwendet

(McCULLOUGH, 1997; MARENZI, 2004; DANGAS, 2005). Geht man

beispielsweise von einem Volumen von 250 ml eines KM mit 300 mg I/ml aus

und davon, dass dieses Volumen des Kontrastmittels sich im extrazellulären

Volumen ausbreitet, das etwa 20 % des Körpergewichtes ausmacht, so erwartet

man eine Serumkonzentration von etwa 5,4 mg I/ml bei einem 70 kg schweren

Patienten. Dies entspricht bei dem 788 mM Kontrastmittel Iomeprol 197 mmol

oder einer Dosierung von 2,8 mmol/kg KG. Die klinisch verwendeten Dosen

an Iod-Kontrastmittel erreichen nach Injektion eine Serumkonzentration von

maximal 10 bis 20 mg I/ml (HARDIEK, 2001; HALLER, 2004).

In den Nieren erreichen die Kontrastmittel allerdings durch die

physiologischen Konzentrierungsvorgänge deutlich höhere Konzentrationen,

die um das 50 bis 100fache über den Serumkonzentrationen liegen können

(BAKER, 2003; BRIGUORI, 2003). In einer tierexperimentellen Studie

wurden bei Kaninchen Urinkonzentrationen von 100 mg I/ml gemessen

(SPARATO, 1982). UEDA zeigte 1998 durch Mikropunktionstechnik, dass die

Iodkonzentration am proximalen Tubulus der Ratte 15 Minuten nach Injektion

verschiedener iodhaltiger Kontrastmittel zwischen 13,4 und 69,3 mg I/ml lag

(UEDA, 1998).

In unseren Experimenten verwendeten wir für den Vergleich der Kontrastmittel

bei gleicher Röntgendichte Konzentrationen zwischen 9,375 und 37,5 mg I/ml,

die also Konzentrationen der Kontrastmittel entsprechen, wie sie unter

physiologischen Bedingungen in der Niere auftreten können und die

Diskussion

71

gleichzeitig im Rahmen der Konzentrationen liegen, wie sie auch in

vorangegangenen Zellkulturstudien bereits verwendet wurden (ANDERSEN,

1994; HALLER, 1997; HIZOH, 1998; SCHICK, 1999; HARDIEK, 2001;

HIZOH, 2002; YANO, 2003). In einigen Studien wurden sogar

Konzentrationen von 100-150 mg I/ml untersucht (HIZOH, 1998; HARDIEK,

2001; YANO, 2003).

In einer 1997 veröffentlichten Studie von HALLER finden sich Kontrastmittel-

Konzentrationen von 37 mg I/ml und 74 mg I/ml, ähnlich wie sie auch in

unseren Experimenten zum Einsatz kamen (HALLER, 1997). HIZOH

verwendete in seinen Studien zur cytotoxischen Wirkungen iodhaltiger

Kontrastmittel beispielsweise Diatrizoat in Konzentrationen von 37 mg I/ml bis

111 mg I/ml (HIZOH, 1998; HIZOH, 2002). YANO testete die Wirkung des

Kontrastmittels Ioversol auf LLC-PK1-Zellen bei Konzentrationen von 25, 50,

100 und 150 mg I/ml (YANO, 2003). HARDIEK verwendete ebenfalls bei

LLC-PK1-Zellkulturen hohe Konzentrationen von 100 mg I/ml des

Kontrastmittels Iopamidol (HARDIEK, 2001).

Die oben erwähnten Kontrastmittel-Konzentrationen der Iod-Kontrastmittel

wie sie bei unseren Untersuchungen Verwendung fanden, entsprechen

Konzentrationen der Gadoliniumchelate von 62,5 bis 250 mmol/l, wenn die

Kontrastmittel sich in ihren Absorptionsvermögen für Röntgenstrahlen

entsprechen sollen. Diese hohen Konzentrationen von Gadoliniumchelaten

werden in der Niere natürlich nur dann erreicht, wenn sehr viel höhere Dosen

verabreicht werden, als diejenigen die für die Anwendung im Kernspin-

Tomographen üblich sind (0,3 mmol/kg KG). Die Röntgendichte einer 0,5

molaren Lösung eines Gadolinium-KM entspricht etwa der Röntgendichte von

60-80 mg I/ml, wie wir auch in unseren Versuchen bestätigen konnten. So

würden 50 ml eines Gadolinium-KM etwa 10-13 ml eines Iod-KM mit 300 mg

I/ml entsprechen (NYMAN, 2002). Die Mengen an Gadolinium-

Kontrastmittel, die notwendig sind, um aussagekräftige Angiogramme

außerhalb des MRT zu erreichen, liegen im Allgemeinen über den Dosierungen

von 0,3-0,4 mmol/ kg KG (ERLEY, 2004) und müssen insbesondere für

interventionelle Verfahren deutlich höher sein. Daher wurde die Verwendung

Diskussion

72

sehr viel größerer Mengen an Gadolinium-KM zwischen 80 und 440 ml als

Off-label-use bereits beschrieben (GEMMETE, 2001; THOMSEN, 2002;

ROSIOREANU, 2004; STRUNK, 2004). Dies entspricht einer Dosierung von

40-220 mmol oder 0,57-3,14 mmol/kg KG, also dem Vielfachen der üblichen

MRT-Dosis. Bei einem 70 kg schweren Patienten würden diese Dosierungen

zu einer Plasmakonzentration von etwa 3-16 mmol/l führen. Nimmt man

gleiche Konzentrierungsvorgänge wie oben an, so werden in der Niere

Konzentrationen der Gadoliniumchelate erreicht, wie sie in unserer Studie

Anwendung fanden.

Die Elimination von Kontrastmitteln bei Gesunden geschieht fast

ausschließlich durch glomeruläre Filtration (ROSATI, 1994). Da die

Elimination von Kontrastmitteln bei Patienten mit renaler Insuffizienz deutlich

eingeschränkt ist, verlängern sich die Halbwertzeiten der Kontrastmittel

erheblich und daher sind die Nierenepithelien über längere Zeit diesen

toxischen Substanzen ausgesetzt. Dies äußert sich auch in über mehrere Tage

bestehenden Nephrogrammen, wie sie LOVE beschrieben hat (LOVE, 1994).

So beträgt die Halbwertzeit des Gadoliniumchelates Gd-DTPA in Patienten mit

normaler Nierenfunktion etwa 1,5 Stunden, wohingegen die Halbwertzeit bei

Patienten mit chronischem Nierenversagen bis zu 30 Stunden erreichen kann

(PENA, 1999). Die Halbwertzeit von Gadodiamid beträgt bei Patienten mit

stark eingeschränkter Nierenfunktion bis zu 34 Stunden (JOFFE, 1998). Es

fanden sich in einer Studie Halbwertzeiten für das Gadoliniumchelat

Gadobutrol von 20,4 Stunden bei Patienten mit einer Kreatininclearance von

30 ml/min oder weniger, die nicht dialysepflichtig waren, verglichen mit einer

Halbwertzeit von 1,5 Stunden bei gesunden Patienten (TOMBACH, 2000).

Die Eliminationshalbwertzeit für Iopamidol wird in der Literatur bei Patienten

mit starker Einschränkung der Nierenfunktion mit bis zu 70 Stunden

angegeben (DONELLY, 1993). Auch bei anderen iodhaltigen KM liegen sehr

lange Halbwertzeiten vor. NOSSEN beschrieb eine Halbwertzeit von Iodixanol

von 23,0 Stunden und 27,2 Stunden für Iohexol bei Patienten mit schwerer

Nierenfunktionsschädigung (NOSSEN, 1995).

In unseren Experimenten war der größte Teil der MTT-Konversionshemmung

innerhalb der ersten beiden Stunden nachweisbar und nach 24-stündiger

Diskussion

73

Inkubation mit den Kontrastmitteln war ein nahezu maximaler Effekt zu

erkennen. Diese Inkubationszeit liegt noch unterhalb der

Eliminationshalbwertszeiten der Kontrastmittel wie sie in der Literatur für

Patienten mit renaler Insuffizienz beschrieben werden. Eine Inkubationszeit der

Zellen mit KM von 24 Stunden wurde auch in anderen Studien an renalen

Tubuluszellen verwendet (ANDERSEN, 1995; HARDIEK, 2001; PEER,

2003). Und auch noch längere Inkubationszeiten von bis zu drei Tagen sind

beschrieben (ZAGER, 2003).

Unser Versuchsaufbau richtete sich also sowohl was die Konzentrationen als

auch die Inkubationszeiten angeht, so weit wie möglich nach den

Gegebenheiten wie sie in klinischen Situationen bei Patienten mit

Niereninsuffizienz erwartet werden können.

4.8 Zellkultur als in vitro-Modell Die Zuhilfenahme von Zellkulturmodellen für die Aufklärung der Einflüsse

verschiedener Substanzen auf bestimmte Gewebe ist ein etabliertes Verfahren,

das für die unterschiedlichsten Fragestellungen zum Einsatz gekommen ist

(TOUTAIN, 1992; ANDERSEN, 1998; KREISBERG, 1988; WANG, 1998;

AHLENSTIEL, 2003; THAMILSELVAN, 2002; BALACHANDRAN, 2005;

HANIGAN, 2005; NAKANISHI, 2005; TOLSON, 2005).

Mehrere Autoren haben bereits Zellkulturen für ihre Untersuchungen zur

Kontrastmittelwirkung verwendet, um die Pathomechanismen der KIN weiter

aufzuklären und um mögliche prophylaktische Ansätze zu erproben

(ANDERSEN, 1994; HALLER, 1997; HIZOH, 1998; WANG, 1998;

HARDIEK, 2001; DOMINGUEZ, 2002; HIZOH, 2002; PEER, 2003; YANO,

2003; YANO, 2004). Einige in-vitro-Untersuchungen zur Kontrast-

mittelwirkung iodhaltiger Kontrastmittel, aber auch zur Wirkung von

Gadolinium-KM wurden ebenfalls anhand der von uns verwendeten LLC-PK1-

Zellen durchgeführt (HALLER, 1997; HARDIEK, 2001; YANO, 2003;

YANO, 2004; YANO, 2005; ROMANO, 2008)

Der wesentliche Vorteil der Zellkultur ist, dass die Wirkung der getesteten

Substanzen auf die Zellen unter Ausschluss äußerer Störfaktoren (wie z.B.

Diskussion

74

hämodynamische Veränderungen) evaluiert werden kann. Daher ist diese

Methode im besonderen Maße zur Aufklärung der tubulotoxischen Effekte der

KM geeignet (HALLER, 2004).

Die beiden am häufigsten verwendeten renalen Tubuluszelltypen sind MDCK-

Zellen, die aus Hundenieren gewonnen wurden und LLC-PK1-Zellen,

gewonnen aus den proximalen Tubuli des Schweins. Sie entsprechen in ihren

wesentlichen Eigenschaften nativen Nierenepithelzellen (RABITO, 1986;

GRAUNSTHALER, 1985).

Jedoch wurde eine starke Heterogenität der MDCK-Zellen beschrieben und

diese Zelllinie entspricht in ihren Eigenschaften nicht in dem Maße humanen

renalen Tubuluszellen wie LLC-PK1-Zellen, was die Aussagekraft von

Experimenten mit diesen Zellen einschränkt (GRAUNSTHALER, 1985; IDEE,

1996; TOUTAIN, 1995; HALLER, 2004). Für LLC-PK1-Zellen hingegen

liegen keine Berichte vor, die die Validität von Modellen mit diesen Zellen

einschränken könnten. Bisherige Studien mit LLC-PK1-Zellen zeigten, dass die

Schädigung der Zellen durch hochosmolale Kontrastmittel stärker ausgeprägt

ist, als die Schädigung durch niedrigosmolale Kontrastmittel (HARDIEK,

2001; HEINRICH, 2005). Diese Ergebnisse decken sich mit den vielfach

bestätigten Ergebnissen klinischer Untersuchungen (BARRETT, 1993;

RUDNICK, 1995). Diese Korrelation wird als Bestätigung der Validität eines

in-vitro- Modells für die KIN angesehen (IDEE, 1996).

4.9 Limitationen der Untersuchungen

Die verwendete Zellkulturmethode erlaubte uns eine objektive Beurteilung der

Kontrastmittelwirkung auf proximale Tubuluszellen unter standardisierten

Bedingungen. Diese Methode hat einerseits den Vorteil, dass Störfaktoren wie

z.B. hämodynamische Veränderungen weitgehend ausgeschlossen werden

können (HALLER, 2004), andererseits aber den Nachteil, dass sie der

multifaktoriellen Genese der Kontrastmittel-induzierten Nephropathie nicht

gerecht wird, sondern nur die direkte Cytotoxizität als möglichen

Teilmechanismus der KIN darstellen kann. Die KIN wird ja unter anderem

auch auf Beeinflussung der renalen Durchblutungssituation zurückgeführt, die

Diskussion

75

in diesem Modell natürlich nicht berücksichtigt wird (McCULLOUGH, 2003;

IDEE, 2004).

Zudem bleiben die Mechanismen, durch die Kontrastmittel die Zellen

schädigen weiterhin unklar. Die Osmolalität spielt zwar eine wichtige Rolle in

der Zellschädigung durch die Kontrastmittel, jedoch muss zusätzlich noch ein

chemotoxischer Effekt der Kontrastmittelmoleküle vorliegen. Dieser konnte

jedoch noch nicht endgültig aufgeklärt werden.

Eine weitere Limitation unserer Studie besteht darin, dass die verwendeten

Konzentrationen der Gadolinium-Chelate in einem hohen Bereich liegen, der

nur beim Off-label-use von Gadolinium-Kontrastmitteln in hohen

Konzentrationen wie beispielsweise der interventionellen Angiographie

erreicht wird.

4.10 Resümee und Schlussfolgerung

Der Einsatz von Gadoliniumchelaten als Alternative zu iodhaltigen

Kontrastmitteln bei Röntgenuntersuchungen zur Vermeidung der

kontrastmittelinduzierten Nephropathie wird derzeit kontrovers diskutiert.

Es liegen zwar mehrere Studien vor, die den Einsatz gadoliniumhaltiger

Kontrastmittel bei Röntgenuntersuchungen propagieren, jedoch berück-

sichtigen diese oftmals nicht die höhere Dosis bei Iod-Kontrastmitteln und die

schlechteren Kontrasteigenschaften bei Gadolinium-Kontrastmitteln und

beurteilen die toxischen Wirkungen der Kontrastmittel daher unter ungleichen

Bedingungen.

In dieser Studie versuchten wir daher die iodhaltigen und gadoliniumhaltigen

Kontrastmittel unter gleichen Bedingungen zu untersuchen, indem wir gleiche

molare Konzentrationen ebenso einsetzten wie Konzentrationen, die unter

Bestrahlung mit Röntgenstrahlen in der gleichen Röntgendichte resultieren

würden und somit die gleiche Bildqualität liefern würden.

Unsere Exprimente lassen darauf schließen, dass die gadoliniumhaltigen

Kontrastmittel bei Konzentrationen, die sich in ihrer Röntgendichte

entsprechen, in vitro ein höheres nephrotoxisches Potential aufweisen, als die

auf Iod basierenden Kontrastmittel. Möglicherweise ist es bei Angiographien

sinnvoller, statt der Gadoliniumchelate zur Nephroprotektion verdünnte

Diskussion

76

Lösungen der herkömmlichen Iod-Kontrastmittel zu verwenden, die die gleiche

oder sogar bessere Bildqualität bieten. Zudem sollte die Verwendung

gadoliniumhaltiger Kontrastmittel nicht unkritisch gesehen werden, da es auch

durch diese Kontrastmittelgruppe bereits zu schwerwiegenden Komplikationen

gekommen ist, die insbesondere auch die Risikogruppe von

niereninsuffizienten Patienten betraf. Seit 2001 wurden insgesamt über 200

Fälle der potentiell letalen nephrogenen systemischen Fibrose in

Zusammenhang mit der Applikation von Gadolinium-Kontrastmitteln

beschrieben (GOULLE 2009, TEN DAM 2009).

Bevor die Verwendung von Gadoliniumpräparaten für Röntgenuntersuchungen

empfohlen werden kann, sollten daher größere klinische Studien durchgeführt

werden, die die Nephrotoxizität der Iod-Kontrastmittel und Gadolinium-

Kontrastmittel in Konzentrationen vergleichen, die die gleiche Röntgendichte

aufweisen und damit auch zu vergleichbarer Bildqualität führen und es sollten

die Inzidenz und Pathogenese der nephrogenen systemischen Fibrose nach

Gadoliniumapplikation weiter untersucht werden.

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Abkürzungsverzeichnis

105

Abkürzungsverzeichnis ABTS [2,2´-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt] ACC Acetylcystein CT Computertomographie DMF Diethylformamid DNA Desoxyribonucleic acid, Desoxyribonucleinsäure DSA Digitale Subtraktionsangiographie EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay FBS Fetal bovine serum, fetales Kälberserum Gd Gadolinium KG Körpergewicht KIN Kontrastmittel-induzierte Nephropathie KM Kontrastmittel MRT Magnetresonanztomographie MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-

tetrazoliumbromid PBS Phosphate buffer saline POD Peroxidase SDS Natriumdodecylsulfat S.E.M. Standardabweichung des Mittelwertes

Vorveröffentlichungen

106

Vorveröffentlichungen

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Lebenslauf

107

Danksagung Herrn Professor Dr. Michael Uder möchte ich herzlich für die Überlasssung

des interessanten Dissertationsthemas danken.

Bei meinem Betreuer Dr. Marc C. Heinrich möchte ich mich ganz besonders

für Anregungen, konstruktive Kritik und Hilfestellungen bei der Erstellung

dieser Arbeit sowie die vielen Stunden, die er sich für meine Betreuung Zeit

genommen hat, bedanken.

Ich bin ebenfalls zu tiefstem Dank verpflichtet gegenüber Frau Martina

Wagner, Dr. Christof Ulrich und dem gesamten Team des nephrologischen

Labors, die mir die Durchführung der Laborarbeiten erst ermöglicht haben und

mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite standen. Dr. Martin Kuhlmann möchte

ich dafür danken, dass er meine Arbeit im nephrologischen Labor ermöglicht

hat.

Besonderer Dank gilt meinem Ehemann David, der mich mit viel Verständnis

und Geduld durch Höhen und Tiefen von Studium und Dissertation begleitet

hat.

Schließlich danke ich meinen Eltern, die mich während des Studiums und der

Erstellung dieser Arbeit jederzeit unterstützt haben.

Cytotoxizität gadoliniumhaltiger Kontrastmittel auf renale ... · die Zellen außerdem mit...

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