Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von

Proteinen

von Tim Grotjohann

VeranstalterLehrstuhl für GenetikUniversität Bielefeld

Inhaltsübersicht:

-Allgemeines zum Protein-Blot

-Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese

-Blottingmembranen

-Gel-Blot

1) Wet-Blot

2) Semi-Dry-Blot

3) Transferpuffer

-Dot-Blot

-Färbeverfahren für transferierte Proteine

Allgemeines zum Protein-Blot

-Definition: beim Protein-Bloting werden Proteine auf eine Membran übertragen und dort einer spezifischen Nachweisreaktion unterzogen

-DOT-Blot: Proteine werden direkt auf die Membran getüpfelt

-Gel-Blot: Übertragung von Proteinen, die zuvor in einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt wurden

-die Membran: sie dient als Trägermatrix für die Proteine, auf der diese immobilisiert sind und sich somit leichter handhaben lassen

-Western-/Immuno-Blotting: mittels einer spezifischen Antikörperreaktion lassen sich hiermit bestimmte Proteine identifizieren, die Molmassen dieser bestimmen oder auch die Spezifität eines Antikörpers bestimmen

-es gibt noch weitere Verfahren, bei denen die Fähigkeit von Proteine ausgenutzt wird, an andere Moleküle zu binden (North-Western-Blotting, South-Western-Blotting, Virus-Overlay,…)

Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese

-Proteinaufreinigung: durch Degradierung von Proteinen können weitere Banden auf dem Gel entstehen – so kann es beim Kochen der Probe in SDS- und alkanolaminhaltigem Probenauftragspuffer zur Fragmentierung von Proteinen kommen deswegen wird eine Erhitzung auf lediglich 60°C für ca. 10-30 Minuten empfohlen

-Gelelektrophorese: Je dünner das Gel, desto effizienter ist der Transfer – deshalb sollten Gele eine Dicke von 2mm möglichst nicht überschreiten

Blottingmembranen

-Nylon:

-hohe Proteinbindekapazität

-besonders für das Blotten von sauren Proteinen oder bei Chemoluminiszenznachweisen

-benötigt spezielle Blockingreagenzien (Casein und Polyvinylpyrrolidon)

-Polyvinylidenfluorid (PVDF):

-hohe Proteinbindekapazität (bis 600µg/cm²)

-gute Resistenz gegen organische Lösungsmittel

-gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis bei Chemolumineszenz-Detektionssystemen

Blottingmembranen

-Nitrocellulose (NC):

-Bindekapazität von 180µg/cm²

-kleine Porengröße von 0,025µm

-günstiger als PVDF

-beim Dot-Blot vorwiegend verwendet, da diese Membran eine hohe Saugfähigkeit hat

Gel-Blot

-Der Transfer muss direkt nach der Auftrennung der Proteine erfolgen

-Transfer-Methoden:

-Diffusions- und Vakuumtransfer finden eher bei der Arbeit mit nativen Gelen ihre Verwendung

-Als Standardverfahren hat sich der elektrophoretische Transfer durchgesetzt

im Folgenden werden exemplarisch die elektrophoretischen Verfahren „Wet-Blot“ uns „Semi-Dry-Blot“ vorgestellt

Gel-Blot

Wet-/Tank-Blot Semi-Dry-Blot

-Vorteile des Semi-Dry-Blots sind die höhere Transfergeschwindigkeit und die sehr viel geringere Menge an verwendetem Transferpuffer

-Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen

Membran Gel+ -

Filterpapier

Schwammtuch

Kunstoffgitter

1) Wet-Blot

Gel-Blot – 1)Wet-Blot

+

-

Membran

2) Semi-Dry-Blot

2kg

GelFilterpapier

3) Transferpuffer

-grundsätzlich gibt es mehrere Alternativen

-Er darf keine stark leitenden Salze enthalten, da diese zu hohen Strömen führen, was einen schlechten Transfer und eine Überhitzung der Apparatur zur Folge hat

-der Puffer muss keinen exakten pH-Wert aufweisen (alle Werte zwischen 7,3 und 11 sind akzeptabel)

-Er enthält 0- 20% Methanol, welches die Membran benetzt und so die Proteinbindung erleichtert, sowie die SDS-Bindungen lockert

Dot-Blot

-Hierbei wird auf die gelelektrophoretische Trennung verzichtet und die Proteine direkt auf die Membran getüpfelt

-Hauptanwendungsgebiete:-immunchemische Quantifizierung kleinster Proteinmengen-Detektion bestimmter Proteine aus einem Proteingemisch-Bestimmung von Nachweisgrenzen von Detektionssystemen-bei Verwendung von Proteinen mit sehr hoher/kleiner

Molmasse, oder solchen, die durch die Elektrophorese beschädigt würden, oder durch ihre hohe Ionenstärke die Trennung stören würden

-nur dann anwendbar, wenn monoklonale Antikörper oder Proben mit nur einem Protein verwendet werden

Färbeverfahren für transferierte Proteine

Die Effizienz eines Blotvorgangs lässt sich mit unspezifischen Proteinfärbemethoden bestimmen:

-Ponceau-S-Färbung:

-geeignet für NC und PVDF

-Nachweisgrenze bei 5-15ng Protein/mm²

-kolloidales Gold:

-geeignet für NC und PVDF

-Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm²

-benötigt abgesättigte Membran

-neigt zu irreversiblen Bindungen

-Fluorophore:

-geeignet für NC und PVDF

-Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm²

-benötigt aufwändige optische Ausrüstung

-Direktblau 71:

-geeignet für NC und PVDF

-Nachweisgrenze bei 0,5-1,5ng Protein/mm² (NC)

bzw. 1-3ng Protein/mm² (PVDF)

-hohe Kontrast

Färbeverfahren für transferierte Proteine