ThrombozytenfunktionPrognosemarker bei Sepsis

der Roche Diagnostics Deutschland GmbHDiagnostik im Dialog

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Chronische NiereninsuffizienzMehr Klarheit mit Cystatin C

KnochenmarktransplantationRolle der Immungenetik

Liquor- diagnostikAnforderungen und Fallstricke

Physiologie der CSFDer Liquor ist ein Filtrat des Blutes – der erwachsene Organismus produziert im Ple-xus choroideus, einem baumartig vernetz-ten Adersystem in den Gehirnventrikeln, etwa 600 ml täglich. Von dort fließt die CSF letztlich in den kortikalen und lumbalen Subarachnoidalraum. Das Gesamtliquorvo-lumen beträgt 150 ml, somit wird die gebil-dete Flüssigkeit auch kontinuierlich drai-niert. Die Abgabe in das venöse Blut erfolgt über die sog. Arachnoidalzotten sowie im Bereich der spinalen Nervenwurzeln.

Physiologischerweise enthält der Liquor cerebrospinalis nur wenige Zellen (0–4 Zellen/µl) und eine niedrige Gesamteiweiß-konzentration (ca. 0,2  % des Blutes). Der fließende Liquor ist molekularen Austausch-prozessen (Diffusion) ausgesetzt. Während des Flusswegs steigt z. B. die Konzentration der aus dem Blut stammenden Proteine im lumbalen Liquor auf das 2–2,5fache des Ven-trikelliquors an. Kleine Proteine diffundie-ren leichter vom Serum in den Liquor als höhermolekulare, deshalb ist deren relative Konzentration (Liquor/Serum) größer. Aus

dem Gehirn stammende Proteine nehmen in ihrer Konzentration vom Ventrikel zum lumbalen Liquor ab. Glucose wird aktiv transportiert, der Liquor/Serum-Quotient beträgt normalerweise 0,7 – das ist aller-dings abhängig vom Blutzuckerspiegel.

Besondere DiagnostikZu diagnostischen Zwecken gewinnt man Liquor in der Regel durch Punktion des Spi-nalkanals im Lumbalbereich. Aufgrund der stetigen CSF-Produktion ist die Abnahme von 10 ml bereits nach 24 Minuten ausge-glichen. Nicht nur die Probengewinnung, auch weitere Aspekte machen die Liquordi-agnostik besonders anspruchsvoll:O Bedingt durch die Physiologie bzw.

Pathophysiologie des Liquors müssen etliche Laborparameter gleichzeitig im Liquor und im Serum bestimmt und dann im Kontext zueinander beurteilt werden. Ein isolierter Liquorwert hat keine ausreichende Aussagekraft.

O Die der Liquordiagnostik zugrunde liegenden, klinischen Fragestellungen sind äußerst komplex. Präzise Aussagen erfordern daher den Einsatz eines aus-

Die Analyse der Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor, CSF) ist ein wesentlicher Teil der neurologischen und psychiatrischen Diag-nostik, stellt aber sowohl das durchführende Labor als auch den befundenden Laborme-diziner vor Herausforderungen. Die folgen-den Ausführungen beschreiben grundlegende Parameter und Regeln der Liquoranalytik sowie mögliche Fallstricke. Für therapeuti-sche Entscheidungen ist letztendlich ein inte-grierter Gesamtbefund erforderlich, der die Ergebniskomplexität aus den durchgeführten Messungen in eindeutige Handlungsempfeh-lungen übersetzt.

Die Liquordiagnostik liefert:O den Nachweis oder Ausschluss eines

entzündlichen Erreger- oder autoimmu-nologisch bedingten Prozesses

O Hinweise auf neoplastische Erkrankung der Meningen (Hirn- und Rückenmarks-haut) und des ZNS

O den Nachweis CT- und MRT-negativer Subarachnoidalblutungen sowie älterer Blutungen

O Hilfestellung bei der diagnostischen Ein-ordnung neurodegenerativer Prozesse.

4

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LiquordiagnostikPD Dr. rer. nat. Dr. med. Manfred Uhr, Max-Planck-Institut für Psychiatrie, München

Medizin | Liquordiagnostik | Diagnostik im Dialog • Ausgabe 43 • 04/2014

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Diagnostik im Dialog • Ausgabe 43 • 04/2014 | Liquordiagnostik | Medizin

AkuitätsparameterDie Zellzahl und die Blut-Liquor-Schran-kenfunktion, mit dem Albuminquotienten als Marker (s.u.), sind Akuitätsparameter. Sie geben Hinweis auf einen noch laufenden Krankheitsprozess.

Zell- und Erythrozytenzahlen im Liquor müssen in der Fuchs-Rosenthal-Zählkam-mer manuell exakt bestimmt werden. Das liquorzytologische Präparat wird häufig in seiner Aussagekraft und diagnostischen Bedeutung unterschätzt. Möglichst alle

Liquorzellen sollten durch geeignete Ver-fahren gesammelt, gefärbt und schließlich durch einen Experten der Liquorzytologie beurteilt werden. Neben der spezifischen Anzeige einer Blutung (Nachweis von Ery-throphagen, Hämosiderophagen) weisen Aktivierungsmuster, z. B. von Lymphozyten (Plasmazellen), Monozyten und Granulo-zyten (Abb. 1), auf chronische und akute ZNS-Prozesse hin. Achtung: Blutbeimen-gungen im Liquor können zu gravierenden Fehlinterpretationen der Proteinanalytik führen! Zur Korrektur einer artifiziellen Blutbeimengung ist die genaue Erythrozy-tenzahl erforderlich.

Die Blut-Liquor-Schrankenfunktion ist ein funktioneller und kein morphologischer Begriff. Sie ergibt sich aus der molekülgrö-ßenabhängigen Diffusion und dem Liquor-fluss. Als Maß der Schrankenfunktion eignet sich der Albuminquotient QAlb (Liquor/Serum), denn Albumin ist ein ausschließlich in der Leber produziertes Protein, das im Liquor nur nach Passage der Blut-/Liquor-Schranke auftreten kann. QAlb gibt über einen altersabhängigen Referenzbereich quantitativ

reichend umfangreichen diagnostischen Portfolios. Die Gesamtbeurteilung hat unter Berücksichtigung aller Einzel-messungen und unter Erstellung eines integrierten Gesamtbefunds (s. unten) zu erfolgen.

O Für die Liquordiagnostik gelten beson-ders hohe Qualitätsansprüche, z. B. hin-sichtlich Präanalytik, Testsensitivitäten und exakt einzuhaltenden Beurteilungs-kriterien für die Befundung.

Zum Grundprogramm der Liquordiagnostik gehören:O das Laktat im Liquor als Hinweis einer

bakteriellen Entzündung im ZNS. Gegenüber der ebenfalls gängigen Glu-cosemessung im Liquor hat Laktat den diagnostischen Vorteil, dass seine CSF-Konzentration unabhängig von der im Serum ist.

O Gesamteiweiß im Liquor, als erster Test auf Störungen der Blut-Hirnschranken-funktion

O Zell- und Erythrozytenzahl (s. u.)O Liquor/Serum-Quotient für Albumin,

IgG, IgA und IgM (s. u.)

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Laborparameter müssen gleichzeitig im Liquor und im Serum

bestimmt werden.

Liquorzytologie

Abb. 1: Differenzialzellbild im Liquor mit Lym-phozyten (A), aktivierten Lymphozyten (B) und Plasmazellen (C)

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Für die exaktere Beurteilung lassen sich im Diagramm mehrere Bereiche charakteri-sieren, wie in Abb. 2 am Beispiel von IgG dargestellt:1 Entspricht dem Referenzbereich (Nor-

malbefund). Es lassen sich keine intra- thekale Immunglobulinproduktion und keine Schrankenfunktionsstörung nach-weisen.

2 Reine Schrankenfunktionsstörung ohne lokale IgG-Synthese (z. B. bei Guillain-Barré-Syndrom oder engem Spinalkanal)

3 Reine IgG-Synthese im ZNS ohne Schrankenfunktionsstörung (z. B. bei Multipler Sklerose)

4 Schrankenfunktionsstörung mit zusätz-licher IgG-Synthese im ZNS (z. B. bei Neuroborreliose)

5 Unplausibler Bereich; hier angesiedelte Ergebnisse sind auf Fehler bei der Blut-entnahme bzw. Analytik zurückzuführen.

Die senkrechte rote Linie im Diagramm kennzeichnet den jeweils gültigen, altersab-hängigen Referenzwert von QAlb (Alter des Patienten/15+4). Die Prozentlinien geben an, welcher Anteil des Immunglobulins im Liquor aus dem ZNS stammt.

Für die akkurate Abklärung einer Schran-kenfunktionsstörung bzw. intrathekalen Immunglobulinsynthese sind folgende Aspekte wichtig:

O Die Liquorkonzentration von IgA ist 800-mal und für IgM 3000-mal niedriger als im Serum. 50 % aller Liquorproben haben eine IgA-Konzentration von < 4 mg/l und eine IgM-Konzentration von < 0,3 mg/l. Um Fehler bei der Quotien-tenbestimmung zu minimieren, werden Liquor und entsprechend verdünntes Serum im gleichen Konzentrations-bereich und in einer Serie gemessen. Deshalb benötigen die verwendeten Methoden (insbesondere für IgA und IgM) auch im unteren Messbereich eine sehr hohe Sensitivität und Präzision.

O Um die analytische Genauigkeit der einge-setzten Methoden realistisch abzubilden, ist ferner darauf zu achten, dass auch die Kontrollen in klinisch relevanten niedri-gen Konzentrationsbereichen liegen.

O Im Gegensatz zum Reiber-Schema sind lineare Auswerteverfahren wie der IgG-Index insbesondere bei Schrankenfunk-tionsstörungen zu ungenau und folglich nicht mehr anzuwenden.

Oligoklonale BandenNeben den auf Statistik beruhenden quan-titativen Methoden steht mit der isoelektri-schen Fokussierung (IEF) auch ein beson-ders empfindlicher qualitativer Nachweis für die intrathekale Immunglobulinsyn-these zur Verfügung: IgG-Antikörper aus Liquor und Serum werden parallel aufge-trennt und stellen sich als wenige (Oligo-) Banden aus unterschiedlichen Zellklonen dar. Gleiche Bandenmuster aus beiden Kompartimenten charakterisieren die Dif-fusion der Antikörper vom Blut in den Liquor. Oligoklonale Banden, die nur im Liquor auftreten, kennzeichnen eine Anti-körperbildung im ZNS bei akuten und chronisch-entzündlichen Erkrankungen des zentralen Nervensystems.

Abb. 3 zeigt beispielhaft IEF-Ergebnisse:O Patient A mit Normalbefund. Es sind

keine oligoklonalen Banden in Liquor und Serum abzugrenzen. Die verwischte Spur ist lediglich Folge von vielen tau-send unterschiedlichen Antikörpern.

O Bei Patient B sind oligoklonale Banden

Auskunft über Schrankenstörungen. Auch in pathologischen Fällen bestimmt die Flussge-schwindigkeit des Liquors die Proteinkonzen-tration in der CSF mit.

QuotientendiagrammEin Quotientendiagramm soll die Frage beantworten, ob ein Patient eine intrathe-kale Immunglobulinsynthese hat, was für einen entzündlichen ZNS-Prozess spricht. Zu berücksichtigen ist dabei, wie viel des jeweiligen Immunglobulins allein durch passive Diffusion maximal in den Liquor-raum gelangt sein kann. Ist die tatsächliche Konzentration höher, geht man von einer intrathekalen Bildung aus. Die Analyse ist quantitativ. Bezugspunkt für den Immun-globulin CSF/Serum-Quotienten ist QAlb.

Zur Beantwortung der diagnostischen Fra-gestellung wird der CSF/Serum-Quotient des Patienten (QIgG, QIgA und QIgM ) auf der y-Achse eines sog. Reiber-Schemas (Abb. 2) gegen den zugehörigen QAlb (x-Achse) auf-getragen. Der jeweils empirisch ermittelte spezifische Zusammenhang zwischen QAlb einerseits und QIgG, QIgA bzw. QIgM anderer-seits beschreibt eine hyperbolische Funktion. Die Grenzlinie Qlim (fette schwarze Linie in Abb. 2) differenziert allgemein eine Diffu-sion (unterhalb der Linie) von einer intrat-hekalen Produktion (oberhalb der Linie).

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Nachweisverfahren für intrathekale Immunglobulinsynthese

Abb. 2: Quotientendiagramm für IgG (Erläuterung s. Text)

150100

50

20

10

5

2

1

0,5

2 5 10 20 50 100

QIg

G x

10-3

QAlbumin x 10-3

80% 60% 40%

1

23

4

5

Abb. 3: Oligoklonale Banden im Serum und Liquor (Erläuterung s. Text)

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Diagnostik im Dialog • Ausgabe 43 • 04/2014 | Liquordiagnostik | Medizin

Korrespondenzadresse

PD Dr. rer. nat. Dr. med. Manfred Uhr Leiter der Neurologischen Ambulanz Leiter der Funktionsbereiche Neurophysiologie und klinischen Chemie Max-Planck-Institut für Psychiatrie München Kraepelinstr. 2-10 80804 München uhr@mpipsykl.mpg.de

im Serum und im Liquor in identischer Weise nachweisbar. Dies spricht dafür, dass die Banden aus dem Serum stam-men (periphere Entzündung) und nicht aus einer intrathekalen Bildung.

O Im Fall C treten oligoklonale Banden im Liquor zusätzlich neben Banden im Serum auf. In beiden Kompartimenten wurden IgG-Antikörper gebildet, neben einer peripheren liegt auch eine ZNS-Entzündung vor.

O Fall D ist typisch für Patienten mit Mul-tipler Sklerose. Nur der Liquor weißt oligoklonale Banden auf. Diese Banden und dementsprechend die Immunglobu-line wurden intrathekal produziert. Dies spricht für einen entzündlichen ZNS-Prozess.

Eine weitere Methode zum Nachweis intra- thekal gebildeter Immunglobuline ist die Bestimmung des Antikörperindex (AI): Bei Gesunden ist der Konzentrationsquotient CSF/Serum spezifischer IgG-Antikörper (Qspez) (z .B. gegen Masern) identisch mit dem Gesamt-IgG-Quotienten (QIgG), denn bei passiver Diffusion existiert kein Unter-schied zwischen spezifischen und anderen Antikörpern. Basierend auf dieser physio-logischen Tatsache gibt der Vergleich dieser Quotienten Auskunft über eine lokale IgG-

Synthese. Bei einer intrathekalen Immun-globulinsynthese werden die Quotienten der spezifischen Antikörper auf die theoretisch errechneten Quotienten der passiven Diffu-sion (Qlim) bezogen. Allerdings ist der AI nur ein relatives Maß für die intrathekale Menge spezifischer Antikörper. Bei Ver-laufskontrollen ist somit zu beachten, dass ansteigende AI-Werte keine Akuität der Erkrankung anzeigen, sondern auch auf das Absinken der Serumtiter zurückzuführen sein können.

Integrierte BefundungDie oben ansatzweise beschriebenen Ver-fahren machen zwar nur einen Teil der Liquoranalytik aus, verdeutlichen aber ihre Grundregeln: Zytologie, Proteinanalytik, Immunologie, etc. ermöglichen nur im Kontext zueinander wertvolle diagnostische Aussagen. Um alle Informationen in der gegebenen Komplexität sinnvoll und für eine therapeutische Entscheidung verständlich darzustellen, sollte ein integrierter Gesamt-befund erstellt werden. Dazu gehörenO die Darstellung aller Liquordaten und

deren sinnvollen Ableitungen (z. B. Quo-tienten)

O die grafische Darstellung der Quotien-tendiagramme (Abb. 1) zur übersicht-lichen Erfassung der acht Messgrößen

IgG, IgM, IgA und Albumin, jeweils im Serum und Liquor und deren Plausibili-tätskontrolle

O spezielle Demenz- oder Destruktions-marker (z. B. NSE, S-100, Ferritin oder Autoantikörper)

O die abschließende Beurteilung. Sie muss Auskunft geben, ob es sich um einen Normalbefund, einen entzündlichen ZNS-Prozess, eine Schrankenfunktions-störung oder eine spezifische Antikör-persynthese im ZNS handelt.

Es sollte immer ein integrierter Gesamtbefund

unter Berücksichtigung von Zytologie, Proteinanalytik,

Immunologie, etc. erstellt werden.

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tration entstehende Trübung wird turbidi-metrisch bei 800/570 nm bestimmt.

Voraussetzung für eine valide Liquordiag- nostik ist u. a. die hohe Sensitivität der ver-wendeten Assays, da die Proteinkonzentra-tionen – und damit auch die der Immun- globuline – im Liquor sehr niedrig sind. Dies gilt insbesondere für IgM*.

Bei Tina-quant® Tests wird die analytische Sensitivität durch große Latexpartikel opti-miert, die mit hoch reaktiven monoklonalen Antikörpern beschichtet sind. Die Testprä-zisionen sind sehr hoch, die einzusetzenden Probenvolumina gering. Speziell beim Test Tina-quant® Immunglobulin M CSF kommt die patentierte DuREL Technologie (Dural-Radius Enhanced Latex) zum Einsatz: Neben den großen Latexpartikeln mit hoch-reakti-ven Antikörpern befinden sich auch kleinere Latexpartikel mit niedrig-reaktiven mono-klonalen Antikörpern im Reagenz. Das ist die Basis für die besonders hohe Sensitivi-tät dieses Tests und seinen sehr weiten und niedrigen Messbereich.

Übrigens: Der Einsatz verschieden großer Latexpartikel und damit die Kombination von sehr hoher Sensitivität und weitem pri-mären Messbereich ist nur bei der Turbidi-metrie möglich.

* s. a. Artikel „Liquordiagnostik“ in diesem Heft

kenfunktion und/oder einer intrathekalen Immunglobulinsynthese*.

Bei den homogenen ImmunoassaysO Tina-quant® Immunglobulin M CSF

und O Tina-quant® Immunglobulin A CSFagglutinieren während der Inkubations-phase die mit IgA- bzw. IgM-Antikörpern beschichteten Latexpartikel aus dem Rea-genz mit dem humanen IgA bzw. IgM aus der Liquor- bzw. Serumprobe. Die proporti-onal zur jeweiligen Immunglobulinkonzen-

Neue Tests für die Bestimmung von IgM und IgA in Liquor und Serum ergänzen ab sofort das vorhandene Roche Liquor-Portfolio bestehend aus Albumin, Immunglobulin G, Gesamt-Eiweiß, Glucose und Laktat.

Die Bestimmung von Albumin und der Immunglobuline G, M und A im Liquor und im Serum gehören zum Basisprogramm der Liquordiagnostik. Die einzelnen Mess-werte liefern über die von Prof. Reiber ent-wickelten Quotienten und deren grafische Darstellung wichtige Aussagen zur Schran-

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Messbereich 0,4–25 mg/L 0,1–15 mg/L

Präzision 1,8–4,3 % 1,7–4,7 %

Kalibrationsfrequenz 1 x pro Charge 1 x pro Charge

On-board Stabilität 12 Wochen 12 Wochen

Reagenzmanagement gebrauchsfertiges Reagenz gebrauchsfertiges Reagenz