Die Universität Hohenheim

Die Mikrobiota im Verdauungstrakt landwirtschaftlicher Nutztiere –ein wichtiger Organismus zur Stoffumsetzung im Tier

Jana SeifertUniversität Hohenheim, Institut für NutztierwissenschaftenJunior-Stiftungsprofessur ‘Feed-Gut Microbiota Interaction’

Hans-Eisenmann-Zentrum, Weihenstephan 17.06.2015

Übersicht

- Was verstehen wir unter ‚Mikrobiota‘?

- Methoden zur Untersuchung der Mikrobiota

- Veränderung der Mikrobiota im Lebenszyklus (Schwein, Wiederkäuer)

- Unterschiede entlang des Gastrointestinal Traktes

- Funktionen der Bakterien:

Polysaccharid Abbau durch die Bakterien des Pansens

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Definitionen

Die Gesamtheit aller nicht-menschlichen (tierischen) DNA (Mikrobiom) bzw. allen nicht-menschlichen (tierischen) Lebens (Mikrobiota / Mikroflora) am menschlichen (tierischen) Körper.

Was und wo?• Bakterien, Archaeen, Viren/Phagen,

Hefen/Pilze, Protisten, Würmer, Parasiten etc...• am ganzen Körper: wo man auch sucht, findet

man Mikroorganismen...

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Genom vs. Mikrobiom

Komplexität

1014 Bakterien

10 x mehr mikrobielleZellen

1-2 kg mikrobielleBiomasse (Mensch)

Stammbaum der bedeutendsten mikrobiellen Taxa im humanen Gastrointestinal Trakt und ihrer relativen Anteile (De Vos & de Vos 2012)

Phylogenie der Bakterien im Verdauungstrakt

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Mikrobiota des Verdauungstraktes

Lumen Mukosa

MIKROBIOTA

Epithelium

Futter‐reste

Kurzkettige Fettsäuren

Vitamine

Immunomoduline

Metabolite

Vorteile für den Wirt- Aktivierung des

Immunsystems- Nährstoffaufnahme- Detoxifizierung- Vitamine- Unterstützung der

Darmmotilität

- UnterdrückungpathogenerSpezies

MetabolischesInventar der Mikrobiota

Aktive Phyla und exprimierte Proteine

PhylogenetischeStruktur und

mögliche Funktionen

DNA Protein

Metagenomics

Sequenzdatenbank

Metaboliten

Proteinfunktion

Wer ist da? Wer ist aktiv? Was wird gemacht?

RNA

Meta-proteomics Meta-

metabolomics

Meta-transcriptomics

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Nukleinsäure ExtraktionVerschiedene Protokolle:

Lyse der Zellen (mechanisch, chemisch)DNA/RNA Aufreinigung

In Mikrobiota Forschung des Nutztieres gibt es kein einheitliches Protokoll!Vergleichbarkeit der Ergebnisse !?

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16S rRNA –universelles Gen für phylogenetische Analysen

- Ribosome sind in allen Zellen, Proteinsynthese

- 16S rRNA ist eine Untereinheit der bakteriellen Ribosomen

- In mikrobieller Ökologie: Nutzung der variablen Regionen zum Nachweis der phylogenetischen Diversität

Welche variable Region ist für die Untersuchung der Mikrobiota geeignet?

Yarza et al. Nat. Rev. Microbiol 2014

V1

V2

V3

V4

V5

V6V7

V8

V9

Entwicklung der MikrobiotaDie Zusammensetzung der Mikrobiota variiert mit der Zeit (dynamisch)‘Klimax’ Gemeinschaft, welche relativ stabil ist

Beeinflussung der mikrobiellen Sukzession durch:- Geburt (Mikrobiota im Vaginaltrakt, Speichel; Mikrobiota der Umwelt)- Ernährung (Muttermilch, Pro- und Präbiotika etc.)- Umwelt (Hygiene im Stall, Weidehaltung)- Medizinische Behandlung (Antibiotika)

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Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Hauptphyla der Bakterien im Pansen: Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria(13 weitere Phyla)

Große Variation der Anteile im zeitlichenVerlauf!

Jami et al. ISME J. 2013

Tag 1 Dominanz von Streptococcus (Firmicutes)

Wechsel der Zusammensetzunginnerhalb der Phylaz.B. Bacteroidetes: Bacteroides (Tag 1-3) zu Prevotella (ältere Tiere)

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Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Umstellung der Mikrobiota auf anaerobe Verhältnisse

Tag 1

Tag 3

12Jami et al. ISME J. 2013

Entwicklung der Mikrobiota – Wiederkäuer (Kuh)Gezielter quantitativer Nachweis

13Jami et al. ISME J. 2013

Kim et al. Vet. Microbiol. 2015

Entwicklung der Mikrobiota - Schwein

Veränderung während und nach der Absetzphase (Futterumstellung, Stress, and. physiologische Faktoren)

4 Wo.: Bacteroides (Nutzung von Mono- und Oligosacchariden), Blautia, Dorea, Escherichia, Eubacterium

6 Wo: Prevotella (Nutzung von Hemicellulosen, Xylan), Clostridium

Hauptphyla der Bakterien im Schwein: Firmicutes, Bacteroidetes (ca. 90%)

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Lokalisation der Mikrobiota – Schwein

Looft et al. ISME J. 2014

Unterschiede der Zusammensetzung der Mikrobiota-> entlang des Gastrointestinal Traktes-> zwischen Lumen und Mukosaschicht

Aufgrund unterschiedlicher Nährstoffangebote, physikochemischer Bedingungen(pH, O2, Darmbewegung)

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Lokalisation der Mikrobiota – Schwein

Verdauung und Absorption:- Proteine- Fette- Kohlenhydrate

Umsetzung bisher noch nicht verdauterund absorbierter Nährstoffe:- Fermentierbare Kohlenhydrate- Proteine

Analyse von Kotproben spiegeln nur sehr begrenzt die intestinalen Vorgänge ab!

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Funktionen der Mikrobiota – Einblicke in den GIT

Praecaecale VerdaulichkeitKanülen am terminalen Ileum zur Bestimmungder praecaecalen Aminosäureverdaulichkeit von Futtermitteln

Analyse von Kotproben spiegeln nur sehr begrenzt die intestinalen Vorgänge ab!

Praecaecale Verdaulichkeit im Pansen und DuodenumEffizienz der ruminalen Fermentation der Rohnährstoffe

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Funktionen der Mikrobiota – Pansen

BedingungenPANSEN

• kontinuierliche Futteraufnahme• 38-40°C• dunkel• anaerob (-250-450 mV)• konstante Pufferung (pH 5,5-7,0)• Abtransport von Metaboliten (Absorption,

Eruktation, Passage)• Zerlegung, Zerkleinerung und Mischung

des Futters

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Flint et al. 2008McCann et al 2014

Funktionen der Mikrobiota – PansenMikrobiota

Bacteroidetes (Prevotella)Firmicutes, Archaeen

Funktionelle Nischen

FibriolytischProteolytischLipolytischAmylolytisch

Enzyme‚Carbohydrateactive enzymes(CAZy)‘

FutterAbbau

CH4 und CO2

SCFAEssigsäure, Propionsäure, Buttersäure

NH3Harnstoff

mikrobielles Protein FettsäurenPassagerate

Leber

Harnstoff NH3

Emissionen

Muskulatur / FettgewebeMilchproduktion Aminosäuren

FettsäurenZucker

Dünn-darm

Unverdautes Material

Amino- und Fettsäuren

PANSEN

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http://www.rmgnetwork.org.nz/hungate1000.html

http://www.ruminomics.eu/

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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Leahy et al. Animal 2013

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Genomsequenzierungen von Bakterien im Pansen

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Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008

Polysaccharid-abbauende BakterienX: Xylan; S: Stärke; C: Zellulose

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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Funktionen der Mikrobiota – PansenAbbau pflanzlicher Zellen:

1. Abbau der Hemizellulose und Pektine

2. Abbau von Zellulose

Zellulolytische Bakterien besitzen extrazelluläre Enzyme (Cellulosome) zum Abbau von Polysacchariden.

‘Carbohydrate active enzymes‘ (CAZY): z.B Glykosyl-Hydrolasen (GH; 96 Enzymfamilien).

In zellulolytischen Bakterien vorwiegend GH44, GH45 und GH48 (Endoglucanasen mit verschiedenen Substratspezifitäten):

•(Lachno)clostridium cellobioparum•Eubacterium cellulosolvens•Fibrobacter succinogenes•Ruminococcus albus•Ruminococcus flavefaciens

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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Ruminococcus flavefaciensStruktur des Cellulosome’s

- strukturelle Proteine ScaA, ScaB, ScaC und ScaE bilden ein Gerüst; Zusammenhalt durch verschiedene Interaktionsmoleküle (‘dockerin–cohesion’); Bindungsstellen für katalytische Enzyme

- Oligosaccharide werden durch Membran-assozierteTransportproteine aufgenommen

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008

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Fibrolytische Bakterien

Butyrivibrio proteoclasticus, Prevotella ruminicola, Prevotella bryantiisind xylanolytische Bakterien - > Abbau der Hemizellulose Fraktion

Genomsequenzen zeigen Präferenzen für Abbau von Hemizellulose und

Pektin, und wenig für kristalliner Zellulose

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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Prevotella spp. – Genom-Vergleiche

Purushe et al. Microb. Ecol. 2010

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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P. ruminicola hat die genetische Kapazität Glykane des Wirtes zu nutzen, ähnlich wie Bacteroides thetaiotaomicron

Funktionen der Mikrobiota – PansenPrevotella spp. – Genom-Vergleiche

P. bryantii hat mehrpotentielle Fähigkeitenzum Pektin Abbau alsP. ruminicola:erhöhte Zahl an PektatLyasen, Poly-galacturonasen, PektinMethylesterasen und α-Rhamnosidasen

Purushe et al. Microb. Ecol. 2010

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Anza

hlan

Enz

ymen

Bacteroides thetaiotaomicron : nutzt ein breites Spektrum von Polysacchariden und hat einzigartige Gene für den Abbau von Stärke

Stärke Abbau Systeme:

SusC und SusD: Bindung der StärkeMoleküleSusG: begrenzte Hydrolyse von Stärke

Verstärkte Hydrolyse im Periplasma(SusA, Neopullulanase) und Aufnahmeüber die zytoplasmatische Membran

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008

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Polysaccharid-abbauende Pilze

Piromyces sp. E2: Xylose Isomerase, GH

Orpiomyces sp. CA1: - Verschiedene Enzyme: 357 GH, 24 PL, 92 CE - Mehrheit ist bakteriellen Ursprungs und wurde durch horizontalen

Gentransfer erworben: viele GH48 (Abbau kristalliner Zellulose) und GH6 (Cellobiohydrolasen)

-> dieses System fehlt bzw. ist kaum in Fibrobacter and Ruminococcusvorhanden

Kein System für den Abbau von Stärke und Pektin -> Pilze ausschließlich für Zellulose Abbau durch Multienzym Komplexe

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

30Interaktion und Symbiose zwischen Bakterien und Pilzen!

Verteilungen der Genfunktionen variiertzwischen den verschiedenen Studien!

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Deusch et al. Comp. Stru. Biotechnol. J. 201531

Interaktionen

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Flint et al. Nat. Rev. Microbiol. 2008

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MetabolischesInventar der Mikrobiota

Aktive Phyla und exprimierte Proteine

PhylogenetischeStruktur und

mögliche Funktionen

DNA Protein

Metagenomics

Sequenzdatenbank

Metaboliten

Proteinfunktion

Wer ist da? Wer ist aktiv? Was wird gemacht?

RNA

Meta-proteomics Meta-

metabolomics

Meta-transcriptomics

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Metaproteomics - Arbeitsschema

Proben-vorbereitung

ProteinExtraktion

In gel TrypsinVerdau

Peptid Elutionund Reinigung

LC-MS/MS AnalyseBioinformatische Datenanalyse

Pansenproben

Deusch & Seifert Proteomics (im Druck)

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

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Probenvorbereitung

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 35

Protein und Peptid Identifikationen

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 36

Pansenmaterial(Faser)HistodenzProtokoll

Pansenmaterial(Faser)KäsetuchProtokoll

Pansensaft

Phylogenetische Verteilung der ProteineFunktionen der Mikrobiota – Pansen

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Prevotellaceae sindhäufiger im Pansensaft zufinden

Fibrobacter succinogenes, Ruminococcaceae und Lachnospiraceae häufigerin fester Pansenprobe

VerstärkteHäufung von Methano-microbiaceae imPansensaft

Deusch & Seifert Proteomics (im Druck)

Verteilung der Glykosyl-Hydrolasen

Rot: Enzyme in allen Probenidentifiziert

Gelb: Enzyme in RS-H and RS-Cidentifiziert

Blau: Enzyme in RS-C and RF identifiziert

Grün: Enzyme identifiziert in RF

Proteine der GH-Familien vorwiegend von Prevotellaceae und Ruminococcaceae

Funktionen der Mikrobiota – Pansen

Deusch & Seifert Proteomics (im Druck) 38

Mikrobiota Forschung in der Zukunft

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Verständniss zur Interaktion -> innerhalb der Mikrobiota-> zwischen Mikrobiota und Wirt-> zwischen Mikrobiota undFutter

zur Unterstützung des Tierwohls, Ressourcenschonung (Futtermitteleinsatz), Klimaschutz

Identifizierung neuer Enzymfunktionen für biotechnologische Anwendungen

Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit!