Die Photorezeptor-Bandsynapse der Säuger-Retina ... · Abbildung 26: Vergleich der Anatomie und...
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Die Photorezeptor-Bandsynapse der Säuger-Retina: Untersuchungen zur Entwicklung, Struktur und Funktion einer komplexen chemischen Synapse Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Hanna Regus-Leidig aus Kassel
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Die Photorezeptor-Bandsynapse der Säuger-Retina:
Untersuchungen zur Entwicklung, Struktur und
Funktion einer komplexen chemischen Synapse
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Hanna Regus-Leidig
aus Kassel
ii
Als Dissertation genehmigt
von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Juli 2008
Vorsitzender der
Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Johann Helmut Brandstätter
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Jan Kremers
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
iii
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Chemische Synapsen 1
1.1.1 Aufbau und Funktion 1
1.1.2 Der Vesikelzyklus 2
1.1.3 Die aktive Zone chemischer Synapsen 3
1.2 Die Retina 6
1.2.1 Bandsynapsen der Säuger-Retina 8
1.2.2 Der molekulare Aufbau des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 9
1.2.2.1 Complexine an der Photorezeptor-Bandsynapse 10
1.3 Synaptogenese 11
1.4 Zielsetzung 13
2 ERGEBNISSE 14
2.1 Die postnatale Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der
wildtypischen Mausretina 14
2.1.1 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression von Bassoon während der
postnatalen Entwicklung der Retina 14
2.1.1.1 Lokalisation der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 16
2.1.2 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression weiterer CAZ-Proteine während der
postnatalen Entwicklung der Retina 18
2.1.3 STED-Analyse der Transport-Aggregate 19
2.1.4 Ultrastrukturelle Charakterisierung der Transport-Aggregate 20
2.1.5 Kolokalisationsstudien mit Antikörpern gegen Bassoon, Piccolo und RIBEYE 23
2.1.5.1 Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon und Piccolo mit Axiovison 4.6 23
2.1.5.2 Manuelle Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE anhand
von Tripelfärbungen 25
2.1.6 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 28
2.1.7 Die postnatale Expression von Proteinen des arciform density / Plasmamembran-
Kompartiments 31
2.1.7.1 Der Transport von in vivo-markierten Munc13-2-Proteinen 34
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
iv
2.2 Die postnatale Entwicklung des präsynaptischen Bandes in Photorezeptoren der Bassoon-
mutanten Mausretina 36
2.2.1 Western Blot-Analyse der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen in der
Bassoon-mutanten Retina im Vergleich zum Wildtyp 37
2.2.2 Immunzytochemische Untersuchung von RIBEYE, Piccolo und RIM1 während der
postnatalen Entwicklung in der Bassoon-mutanten Retina 39
2.2.2.1 Kolokalisationstudie von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten Retina
zum Zeitpunkt P6 41
2.2.3 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-Bandes in
der Bassoon-mutanten Mausretina 43
2.3 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 46
2.3.1 Funktionsanalyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 46
2.3.2 Immunzytochemische Analyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 47
2.3.3 Analyse der Bandsynapsen-Struktur in Photorezeptoren der Complexin 3 und 4 Einzel- und
DKO-Retina 48
2.4 RNA Interferenz: Etablierung einer Methode zur funktionellen Untersuchung von
Proteinen des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 51
2.4.1 Die organotypische Explantkultivierung von Mausretina 52
2.4.2 Lentiviraler Gentransfer in die organotypische Retinakultur 55
2.4.3 Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren der ex vivo Retina 57
2.4.3.1 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD im
heterologen System 57
2.4.3.2 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in
Photorezeptoren der ex vivo Retina 58
3 DISKUSSION 60
3.1 Die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 61
3.1.1 Proteine des Bandsynaspen-Komplexes werden während der Photorezeptor-Synaptogenese
auf zwei unterschiedliche Arten transportiert 62
3.1.2 Precursor spheres: Die Transport-Aggregate von Zytomatrix-Proteinen des
präsynaptischen Bandes 63
3.1.3 Die Reifung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 65
3.1.4 Die Rolle von Bassoon in der Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes 66
3.1.5 Die Entwicklung der aktiven Zone: Vergleich zwischen der Photorezeptor-Bandsynapse
und der konventionellen chemischen Synapse 69
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
v
3.2 Die Proteinausstattung der Photorezeptor-Bandsynapse ist an die tonische
Transmitterausschüttung angepasst 70
3.2.1 Complexine 3 und 4: Zwei spezifische Complexin-Isoformen an der Photorezeptor-
Bandsynapse 71
3.2.1.1 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse 72
3.2.1.2 Auswirkungen der Complexin 3 und 4-Deletion auf die Stabilität des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes 73
3.3 Funktionelle Eingriffe in die Photorezeptor-Bandsynapse 75
3.3.1 Das Potential viraler Transfektion von Photorezeptoren 75
3.3.2 RNA Interferenz von Komponenten des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der ex
vivo Retina 76
4 MATERIAL UND METHODEN 79
4.1 Versuchstiere 79
4.2 Genotypisierung der Bassoon-mutanten Mäuse 79
4.2.1 Polymerase-Kettenreaktion 80
4.3 Präparation der Retina 80
4.4 Lichtmikroskopie 81
4.4.1 Fixierung und Herstellung von Gefrierschnitten für die Fluoreszenzmikroskopie 81
4.4.2 Immunzytochemische Färbungen 81
4.4.3 Wholemount-Färbung der Retina 82
4.4.4 Lichtmikroskopische Analyse 82
4.4.5 Bestimmung und Quantifizierung der Kolokalisation von Proteinen 82
4.4.6 STED-Mikroskopie 83
4.5 Elektronenmikroskopie 83
4.5.1 Fixierung für gute Gewebeerhaltung 83
4.5.2 Immunoelektronenmikroskopie: Preembedding 84
4.5.3 Elektronenmikroskopische Analyse 84
4.6 Western-Blot Analysen 85
4.6.1 Herstellung von Retina-Homogenaten 85
4.6.2 Proteinmengenbestimmung 85
4.6.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden
Bedingungen nach dem TrisAcetat-System 85
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
vi
4.6.4 Western Blot-Transfer und Analyse 86
4.7 Organotypische Explant-Kultivierung der Mäuseretina 87
4.8 Transfektion der organotypischen Retinakultur 87
4.8.1 Kultivierung von HEK 293T-Zellen 87
4.8.2 Generierung der Lentiviren 88
4.8.3 Durchführung der lentiviralen Transfektion von organotypischen Retinakulturen 88
4.9 RNA Interferenz 89
4.9.1 Auswahl geeigneter shRNA-Sequenzen 89
4.9.2 Konstruktion des Transfervektors FUGW H1 mit shRNA-Inserts 89
4.9.2.1 Restriktionsverdau von DNA 90
4.9.2.2 Ligation und Transformation von Bakterien 91
4.9.2.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien 91
4.9.3 Analyse der Knockdown-Effizienz der shRNA-Konstrukte 91
4.10 Vektoren und Inserts 92
4.11 Lösungen und Medien 93
4.12 Chemikalien 95
4.13 Geräte und Hilfsmittel 98
4.14 Primärantikörper 100
4.15 Sekundärantikörper 101
5 ZUSAMMENFASSUNG 102
6 SUMMARY 104
7 LITERATURVERZEICHNIS 106
8 DANKSAGUNG 116
9 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 117
10 PUBLIKATIONEN 118
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
vii
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Proteinen der aktiven Zone 4
Abbildung 2: Morphologische Variabilität aktiver Zonen in unterschiedlichen chemischen
Synapsentypen 5
Abbildung 3: Toluidinblau-gefärbter Vertikalschnitt durch die Säuger-Retina und schematische
Darstellung der Schichtung 7
Abbildung 4: Die Bandsynapsen der Säugerretina 8
Abbildung 5: Kompartimentierung von Proteinen am Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex 10
Abbildung 6: Elektronendichte Vesikel in den Axonen sich entwickelnder Neurone in 3 Tage alten
dissoziierten Hippocampus-Kulturen 12
Abbildung 7: Verteilungsmuster von Bassoon während der postnatalen Entwicklung der
wildtypischen Retina 15
Abbildung 8: Verteilung der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren 17
Abbildung 9: Expressionsmuster von Piccolo, RIBEYE und RIM1 während der frühen postnatalen
Entwicklung der Retina 19
Abbildung 10: STED-Analyse der Bassoon-Aggregate in Photorezeptoren zum Zeitpunkt P2 20
Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Analyse der Transport-Aggregate in Photorezeptoren zum
Zeitpunkt P4 21
Abbildung 12: 3D-Rekonstruktion von precursor spheres in differenzierenden Photorezeptor-
Terminalien zum Zeitpunkt P4 22
Abbildung 13: Kolokalisation von Piccolo und Bassoon in der NBL zum Zeitpunkt P2 24
Abbildung 14: Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE an den Tagen P2 und P4 in der
NBL der wildtypischen Mausretina 26
Abbildung 15: Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE in precursor
spheres der sich differenzierenden Photorezeptoren 27
Abbildung 16: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der wildtypischen Retina 29
Abbildung 17: Verteilungsmuster von Munc13 während der postnatalen Entwicklung in der
wildtypischen Retina 32
Abbildung 18: Verteilungsmuster von CAST1, RIM2 und der Ca2+-Kanal α1-Untereinheit während
der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina 33
Abbildung 19: Transport von Munc13-2 während der Photorezeptor-Synaptogenese 35
Abbildung 20: Vergleich der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen der aktiven Zone
zwischen wildtypischer und Bassoon-mutanter Mausretina 37
Abbildung 21: Verteilungsmuster von RIBEYE während der postnatalen Entwicklung in der
Bassoon-mutanten Retina 40
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
viii
Abbildung 22: Verteilungsmuster von Piccolo in der NBL der Bassoon-mutanten Mausretina 41
Abbildung 23: Kolokalisation von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten OPL zum
Zeitpunkt P6 42
Abbildung 24: Lokalisation von Piccolo-Aggregaten in Photorezeptoren der Bassoon-mutanten
Retina zum Zeitpunkt P6 43
Abbildung 25: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in
der Bassoon-mutanten Retina 45
Abbildung 26: Vergleich der Anatomie und neuronalen Morphologie zwischen wildtypischer und
Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina 48
Abbildung 27: Degenerierte Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexe in der Complexin 3/4 DKO-
Retina 50
Abbildung 28: Die entwicklungsabhängige Expression von Bassoon in der ex vivo Retina 53
Abbildung 29: Präsynaptische Bänder in Photorezeptor-Terminalien der ex vivo Retina 54
Abbildung 30: Lentiviraler Gentransfer in die ex vivo Retina 56
Abbildung 31: Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in HEK293-
Zellen 58
Abbildung 32: Beispiele für einen erfolgten Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren
der ex vivo Retina 59
Abbildung 33: Wichtige Schritte in der Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes 66
Abbildung 34: Schematische Darstellung des Vektors FUGW H1 mit multiple cloning site 90
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Vektoren und Inserts 92
Tabelle 2: Verwendete Lösungen und Medien 93
Tabelle 3: Verwendete Chemikalien 95
Tabelle 4: Verwendete Geräte und Hilfsmittel 98
Tabelle 5: Verwendete Primärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 100
Tabelle 6: Verwendete Sekundärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen 101
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
ix
Abkürzungsverzeichnis
3D dreidimensional
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
Aq. bidest. Aqua bidestillata
ATP Adenosintriphosphat
Bc Bipolarzelle [englisch: bipolar cell]
BSA bovines Serumalbumin
BZ Bipolarzelle
Ca2+ Calzium
CAST1 englisch: CAZ associated structural protein 1
CAZ englisch: cytomatrix at the active zone
Cplx Complexin
CtBP2 englisch: C-terminal binding protein 2
DAB 3,3’-Diaminobenzidin
DIC Differentieller Interferenzkontrast
DKO Doppel-Knockout
DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium
DNA Desoxyribonukleinsäure [englisch: -acid]
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
DTT 1,4-Dithiothreitol
E18 Embryonaler Tag 18
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure [englisch: - acetic acid]
eGFP englisch: enhanced green fluorescent protein
ERG Elektroretinogramm
GCL Ganglienzellschicht [englisch: ganglion cell layer]
GFP grün fluoreszierendes Protein [englisch: green fluorescent protein]
Hc Horizontalzelle [englisch: horicontal cell]
HEK-Zellen menschliche embryonale Nierenzellen [englisch: human embryonic kidney cells]
HZ Horizontalzelle
INL innere nukleäre Schicht [englisch: inner nuclear layer]
IPL innere plexiforme Schicht [englisch: inner plexiform layer]
kDa Kilo-Dalton
KIF3A englisch: Kinesin family member 3A
KO englisch: Knockout
Verzeichnisse ___________________________________________________________________________
x
mg Milligramm
ml Milliliter
mRNA englisch: messenger RNA
MT Mutante
n Anzahl der Stichproben
NBL Neuroblastenschicht [englisch: neuroblast layer]
ng Nanogramm
nm Nanometer
NGS normales Ziegenserum [englisch: normal goat serum]
ONL äußere nukleare Schicht [englisch: outer nuclear layer]
p Signifikanzgrad
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PB Phosphatpuffer [englisch: phospate buffer]
PBS phospatgepufferte Salzlösung [englisch: phosphate buffered saline]
PCR Polymerasekettenreaktion [englisch: polymerase chain reaction]
PFA Paraformaldehyd
pH Säuregrad [lateinisch: potentia hydrogenii]
PSD Postsynaptische Dichte [englisch: postsynaptic density]
PTV Piccolo-Bassoon Transport Vesikel [englisch: Piccolo-Bassoon transport vesicle]
PVDF Polyvinylidenfluorid
RIM englisch: Rab3 interacting molecule
RNA Ribonukleinsäure [englisch: ribonucleic acid]
RNAi RNA Interferenz [englisch: RNA interference]
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat [englisch: sodium dodecyl sulfate]
shRNA englisch: small hairpin RNA
siRNA englisch: short interfering RNA
SNAP-25 englisch: synaptosomal associated protein of 25 kDa
SNARE englisch: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors
STED englisch: stimulated emission depletion
TBE Trizma-Borsäure-EDTA-Puffer
TBS trisgepufferte Salzlösung [englisch: Tris buffered saline]
TBST trisgepufferte Salzlösung mit Tween 20 [englisch: Tris buffered saline Tween]
V Volt
VGlUT1 vesikulärer Glutamattransporter 1
WT Wildtyp
Einleitung ___________________________________________________________________________
1
1 Einleitung
Informationen aus der Umwelt nimmt der Mensch über seine Sinne auf. Die Informationen
werden in Sekundenbruchteilen im Gehirn verarbeitet und steuern so unsere Aufmerksamkeit
und unser Verhalten. Das Gehirn ist ein komplexes Netzwerk aus über 100 Milliarden
einzelner Nervenzellen. Um zu verstehen, wie Nervenzellen miteinander kommunizieren und
in Systemen zusammenarbeiten - vor allem auch als Basis zum Verständnis neuronaler
Erkrankungen - ist Grundlagenforschung über den Aufbau und die Funktion von Nervenzellen
von größter Relevanz. Eine besondere Bedeutung nimmt hierbei die Schnittstelle zwischen
den Nervenzellen ein, die Synapse.
Neben Aufbau, Funktion und den molekularen Interaktionen von Proteinen an der Synapse ist
der Zusammenbau während der Entwicklung, der zu einer funktionstüchtigen Synapse führt,
von erheblichem Interesse. Nur wenn die Abfolge der einzelnen Schritte, Interaktionen und
Schlüsselprozesse während der Synaptogenese verstanden sind, können bei Störungen der
adulten Synapse Rückschlüsse auf fehl gelaufene Prozesse gezogen werden.
1.1 Chemische Synapsen
1.1.1 Aufbau und Funktion
Die Kommunikationsschnittstelle zwischen zwei Nervenzellen ist die Synapse (von griechisch
syn "zusammen" und haptein "anfassen, anknüpfen“). Eine Synapse setzt sich aus einem Teil
des informationsweitergebenden Neurons (Präsynapse) und einem Teil des
informationsaufnehmenden Neurons (Postsynapse) zusammen. Grundsätzlich unterscheidet
man zwei Arten von Synapsen, über welche Informationen auf unterschiedliche Weise
übermittelt wird. Bei der einfachsten Synapsenart, der elektrischen Synapse, stehen zwei
Nervenzellen über Proteinkanäle (Connexone) in direktem zytoplasmatischen Kontakt. Die
Einheit der aufeinander stoßenden Kanäle wird im englischen gap junction genannt. Eine
elektrische Kopplung ermöglicht den freien Ionenfluss von einer Zelle zur anderen, so dass
Potentialänderungen ohne zeitliche Verzögerung weitergegeben werden können.
Anders als bei dieser Synapsenart bedienen sich chemische Synapsen einer komplexeren
Vorgehensweise. Prä- und Postsynapse sind durch einen etwa 25 nm breiten Spalt, den
sogenannten synaptischen Spalt, voneinander getrennt. Erreicht eine Potentialänderung die
Einleitung ___________________________________________________________________________
2
synaptische Endigung des präsynaptischen Neurons, öffnen sich spannungsgesteuerte
Calzium (Ca2+)-Kanäle und extrazelluläres Ca2+ strömt in die Zelle. Dies führt zu einer
Konformationsänderung Ca2+-bindender Proteine, die letztendlich die Fusion von
Transmittervesikeln mit der Zellmembran einleiten, so dass die Transmittermoleküle
ausgeschüttet werden können. Der Transmitter gelangt durch Diffusion zur Postsynapse, wo
er je nach Transmitterart von spezifischen Rezeptoren gebunden wird. Die Postsynapse ist auf
ultrastruktureller Ebene als elektronendichter Bereich zu erkennen (PSD, englisch:
postsynaptic density). Die PSD stellt eine Proteinmatrix aus verschiedenen Proteinen dar, in
der Rezeptoren und Ionenkanäle verankert sind. Je nach Art der Rezeptoren initiiert die
Bindung von Transmittermolekülen die direkte (ionotrope) oder indirekte (metabotrope)
Öffnung oder Schließung von Ionenkanälen. Dadurch ändern sich die Ionenkonzentrationen
im postsynaptischen Neuron und dieses wird entweder erregt oder gehemmt.
Die chemische Signalübertragung ist gerichtet, da nur die Präsynapse Transmitter
synthetisieren und ausschütten kann, und nur die Postsynapse die spezifischen Rezeptoren zur
Aufnahme besitzt. Ein weiterer Vorteil der chemischen Synapse gegenüber der elektrischen
Synapse ist, dass die Menge des ausgeschütteten Transmitters moduliert werden kann und
somit graduelle Erregungsunterschiede übermittelbar sind. Zudem kann durch metabotrope
Rezeptoren das Signal um ein Vielfaches verstärkt und die Antwort auf einen Transmitter
variiert werden. Nachteilig bei der chemischen Signalübertragung ist die zeitliche
Verzögerung, die durch die Umwandlung des elektrischen in ein chemisches Signal entsteht.
Daher sind chemische Synapsen dort nicht geeignet, wo eine sehr schnelle
Erregungsweiterleitung erforderlich ist.
1.1.2 Der Vesikelzyklus
Die schnelle Freisetzung von Transmittermolekülen über die Fusionierung synaptischer
Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran erfordert das stetige Vorhandensein einer
ausreichenden Menge an transmittergefüllten Vesikeln. Darüber hinaus muss dem
allmählichen Anwachsen der Membranfläche aufgrund der Fusion von Vesikeln
entgegengewirkt werden. Aus diesen Gründen unterliegen die Vesikel einem ständigen
Zyklus der Rückgewinnung von Membranmaterial an der Präsynapse mit anschließender
Transmitterneubeladung im Zytoplasma. Ein Vesikelzyklus dauert im Normalfall etwa 60
Sekunden, von denen die Transmitterbeladung der Vesikel die meiste Zeit in Anspruch
nimmt. Synaptische Vesikel werden über ATP-abhängigen (aktiven) Transport und
Einleitung ___________________________________________________________________________
3
spezialisierte Transporter mit ihrem spezifischen Transmitter gefüllt. Anschließend wandern
die Vesikel – vermutlich über Diffusion – an die aktive Zone und werden dort gedockt
(englisch: docking). Es findet ein Reifungsprozess statt, der sie fusionskompetent macht
(englisch: priming). An diesem Prozess sind die so genannten SNARE (englisch: soluble N-
ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors)-Proteine beteiligt, wie zum
Beispiel VAMP (Synaptobrevin), Syntaxin, SNAP-25 und Munc18a, die alle essentiell für die
Ca2+-vermittelte Exocytose sind. Strömt nun Ca2+ über spannungsgesteuerte Kanäle in die
Zelle, entlassen die gereiften Vesikel ihre Transmitterladung in den synaptischen Spalt. Zur
schnellen Rückgewinnung der leeren Vesikel gibt es aktuell zwei Hypothesen, bei denen die
Vesikel entweder direkt an der aktiven Zone verbleiben und dort erneut mit Transmittern
beladen („kiss-and-stay“), oder einem schnellen lokalen Rückgewinnungsprozess („kiss-and-
run“) zugeführt werden (Südhof, 2004; Rizzoli und Jahn, 2007). In einem langsameren
Prozess werden leere Vesikel mit einer Clathrin-Hülle überzogen. Nach dem Abkapseln von
der Membran verlieren sie ihre Clathrin-Hülle wieder und wandern ins Innere des Terminals
wo sie mit Endosomen fusionieren und einem Protein-Sortierungsprozess unterzogen werden.
Anschließend entstehen durch Knospung neue Vesikel, die dem Vesikelzyklus wieder
zugeführt werden.
1.1.3 Die aktive Zone chemischer Synapsen
Die aktive Zone der Präsynapse ist definiert als der Ort, an dem die Transmittervesikel mit der
Zellmembran fusionieren (Landis et al., 1988, Burns und Augustine, 1995). Der
Reifungsprozess und das räumlich begrenzte Fusionieren von Transmittervesikeln an der
präsynaptischen Plasmamembran ist ein komplexer Vorgang, der das korrekte und effiziente
Zusammenspiel vieler beteiligter Proteine erfordert. Aus diesem Grund besitzt die aktive
Zone chemischer Synapsen ein Netzwerk aus Zytomatrix-Proteinen, die den Vesikelzyklus
räumlich und zeitlich organisieren. Dieses Netzwerk erscheint in konventionellen chemischen
Synapsen auf ultrastruktureller Ebene als schwach elektronendichtes Band knapp über der
Plasmamembran. Es erstreckt sich etwa 50 nm weit in das Zytoplasma und wird als
„Präsynaptisches Netz“ (englisch: presynaptic grid) oder „Zytomatrix an der aktiven Zone“
(CAZ, englisch: cytomatrix at the active zone) bezeichnet (Dresbach et al., 2001, Garner et
al., 2000; Schoch und Gundelfinger, 2006). Die Präsynapse adulter chemischer Synapsen
setzt sich aus einer Reihe an Multidomänen-Proteinfamilien zusammen, die am Aufbau der
CAZ beteiligt sind: Munc13-Proteine (Brose et al., 1995), RIMs (Wang et al., 1997, 2000),
CAST-Proteine (Ohtsuka et al., 2002; Wang et al., 2002), Bassoon/Piccolo (Cases-Langhoff
Einleitung ___________________________________________________________________________
4
et al., 1996; tom Dieck et al., 1998; Wang et al., 1999; Fenster et al., 2000) und CtBP1/BARS
(tom Dieck et al., 2005) (Abbildung 1). Diese Proteine interagieren direkt oder indirekt über
diverse Proteinbindedomänen und bilden so ein Gerüst für vielfältige Interaktionen mit
anderen regulatorischen Proteinen der aktiven Zone.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Proteinen der aktiven Zone
Die aktive Zone besteht aus einem komplexen Netzwerk an Proteinen, das die Transmitterausschüttung räumlich und zeitlich organisiert. Gelb hinterlegte Proteine sind Teil der CAZ konventioneller chemischer Synapsen. Die wichtigsten Abkürzungen: SV = synaptisches Vesikel; CtBP = C-terminal binding protein; CAST = CAZ associated structural protein; RIM = Rab3 interacting molecule (verändert nach Schoch und Gundelfinger, 2006).
Alle beschriebenen Proteinfamilien besitzen zudem eine oder mehrere
Phosphorylierungsstellen, deren Phosphorylierung oder Dephosphorylierung in veränderten
funktionalen Eigenschaften resultieren kann (Lonart et al., 2003; Sun et al., 2003; Collins et
al., 2005).
Aktive Zonen chemischer Synapsen haben den gleichen Grundbauplan (Abbildung 2). Sie
bestehen aus an der Plasmamembran verankerten und assoziierten Proteinen (grün) und einer
darüberliegenden Zytomatrix (blau), an der Transmittervesikel gebunden sind (gelb). Intra-
und interspezifische Abweichungen in der Struktur und der Zusammensetzung spiegeln
lediglich Anpassungen an die jeweiligen kinetischen Anforderungen der
CAST
Einleitung ___________________________________________________________________________
5
Transmitterausschüttung wider (Zhai und Bellen, 2004). So übermitteln konventionelle
chemische Synapsen des Zentralnervensystems phasische Signale - also nur am Anfang eines
Reizes (Abbildung 2A).
Abbildung 2: Morphologische Variabilität aktiver Zonen in unterschiedlichen chemischen Synapsentypen
Der grundlegende Aufbau aktiver Zonen in unterschiedlichen chemischen Synapsentypen ist vergleichbar. Aktive Zonen bestehen aus an der Plasmamembran verankerten und assoziierten Proteinen (grün), einem darüberliegenden dichten Netzwerk an Proteinen (blau) und damit assoziierten Transmittervesikeln (gelb). Unterschiede in der Struktur sind auf die angepasste Funktion der jeweiligen Synapsentypen zurückzuführen. A: Hippocampus-Synapse, Säugetiere; B: Haarsinneszell-Synapse, Säugetiere; C: Photorezeptor-Synapse, Säugetiere; D: Photorezeptor-Synapse, Drosophila (verändert nach Zhai und Bellen, 2004).
Im Unterschied dazu exprimieren einige sensorische Neurone, wie beispielsweise Haarzellen
der Cochlea (Abbildung 2B) und Photorezeptoren und Bipolarzellen der Retina (Abbildung
2C) spezialisierte Bandsynapsen, die an eine tonische (kontinuierliche)
Transmitterausschüttung angepasst sind (Fuchs et al., 2003, Dowling, 1987). Diese können
graduierte Signale durch Modulation der Transmitter-Exozytoserate in Anpassung an die
Reizstärke weiterleiten. Bandsynapsen sind für diese Funktion mit einem speziellen Organell,
dem präsynaptischen Band, ausgestattet. Das Band ist ein Zellorganell, das im
Elektronenmikroskop als eine an der aktiven Zone verankerte, elektronendichte band- bis
kugelförmige Struktur erkennbar ist, die sich etwa 100-400 nm weit ins Zytoplasma erstreckt
(tom Dieck und Brandstätter, 2006; Moser et al., 2006). Es ist stets von einer einreihigen
Schicht von Transmittervesikeln umgeben, die über 5 nm dicke und 40 nm lange Filamente
mit dem Band verbunden sind (Rao-Mirotznik et al., 1995; Sterling und Matthews, 2005).
Nach neuesten Erkenntnissen wird vermutet, dass das Band als Plattform für das Priming der
gebundenen Transmittervesikel dient, so dass Bandsynapsen im Gegensatz zu
konventionellen chemischen Synapsen einen größeren release pool besitzen. In den letzten
Jahren kamen vor allem zwei Hypothesen auf, die den Mechanismus einer kontinuierlichen
Transmitterfreisetzung an Bandsynapsen erklären könnten: Bei der Fließbandhypothese wird
davon ausgegangen, dass die Filamente, über welche die Vesikel mit dem Band verbunden
sind, als Motor dienen, der die geprimten Vesikel aktiv zur Plasmamembran transportiert
Einleitung ___________________________________________________________________________
6
(Muresan et al., 1999). Beim Konzept der compound fusion wird davon ausgegangen, dass
während einer tonischen Transmitterausschüttung alle geprimten Vesikel am Band
miteinander und schließlich mit den gedockten Vesikeln an der Plasmamembran fusionieren
(Parsons und Sterling, 2003). Beide Hypothesen haben jedoch ihre Schwachstellen und
können die Frage nach dem Mechanismus der Kontinuität bislang nicht zufrieden stellend
klären.
1.2 Die Retina
In der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung der aktiven Zone der Photorezeptor-
Bandsynapse der Retina untersucht, die eine der komplexesten Spezialisierungen der aktiven
Zone chemischer Synapsen darstellt. Abgesehen von dem Kenntnisgewinn über die Protein-
Zusammensetzung und die Funktion chemischer Synapsen im Allgemeinen ist
Grundlagenforschung über die Entwicklung dieser sensorischen Synapse von größter
Bedeutung. Der Sehsinn nimmt beim Menschen die wichtigste Stellung innerhalb der Sinne
ein. Die Vielschichtigkeit der derzeit bekannten Genefekte, die Sehbehinderungen bis hin zur
Erblindung hervorrufen können, lässt deutlich werden, wie wichtig das Verständnis der
zugrunde liegenden molekularen Prozesse bei der Entstehung eines funktionstüchtigen
retinalen Systems ist (Li, 2001; Pacione et al., 2003; Hartong et al., 2006).
Die Retina ist ein etwa 200 µm dickes Gewebe, das ontogenetisch als Ausstülpung des
Diencephalons entsteht und somit Teil des Gehirns ist. Sie besteht aus verschiedenen
Zellklassen, die klar strukturiert in 5 Schichten angeordnet und untereinander vertikal und
horizontal verschaltet sind. Abbildung 3 zeigt einen Toluidinblau-gefärbten Vertikalschnitt
durch die Mausretina. Die äußerste Schicht ist die zum Pigmentepithel hin gerichtete,
lichtabsorbierende Photorezeptorschicht. Das Pigmentepithel umschließt die äußeren
Segmente der Photorezeptoren, während die Zellkörper der Photorezeptoren die äußere
Körnerschicht (ONL, englisch: outer nuclear layer) bilden. In der Retina findet man zwei
unterschiedliche Photorezeptortypen: die empfindlichen Stäbchen mit einem einheitlichen
Sehpigment (Rhodopsin) für das skotopische Sehen in der Dämmerung und bei wenig Licht
und die Zapfen mit verschiedenen Sehpigmenten für das photopische Sehen am Tag. Bei den
Vertebraten gibt es je nach Tierart zwei bis drei Zapfentypen, die sich leicht in der
Zusammensetzung ihres Opsins unterscheiden und damit die Grundlage des Farbensehens
bilden.
Einleitung ___________________________________________________________________________
7
Die Photorezeption erfolgt in den Außensegmenten der Stäbchen und Zapfen, wo sich die
Sehpigmente in dicht gepackten und übereinander gestapelten Membranscheibchen befinden.
Durch die Absorption von Photonen wird eine biochemische Signaltransduktionskaskade in
Gang gesetzt und der Lichtreiz in ein elektrisches Signal umgewandelt (Hofmann et al, 2001).
Diesen Vorgang nennt man Phototransduktion (Müller und Kaupp, 1998). Dabei wird das
Lichtsignal in der Zelle über ein second-messenger-System um ein Vielfaches verstärkt. Die
Photorezeptoren sind bei Dunkelheit depolarisiert und schütten Glutamat aus (Dunkelstrom),
bei Belichtung werden sie hyperpolarisiert und verringern je nach Reizstärke ihre
Transmitterausschüttung graduell. Sie geben ihre Erregung an Interneurone der inneren
Körnerschicht (INL, englisch: inner nuclear layer), die vertikal weiterleitenden Bipolarzellen,
weiter. In dieser Schicht befinden sich auch die Zellkörper der Müllerzellen – Gliazellen, die
die retinalen Neurone mit Nährstoffen versorgen, Struktur- und Stützfunktion haben und auch
an der Modulation der synaptischen Übertragung beteiligt sind (Newman und Reichenbach,
1996). Die Bipolarzellen bilden vertikale Verschaltungen mit den Dendriten der
Ganglienzellen in der inneren plexiformen Schicht (IPL, englisch: inner plexiform layer). Die
Zellkörper der Ganglienzellen liegen in der Ganglienzellschicht (GCL, englisch: ganglion cell
layer) und die Axone der Ganglienzellen verlassen den Augapfel als Sehnerv gebündelt an
einer Stelle, die als blinder Fleck bezeichnet wird.
Abbildung 3: Toluidinblau-gefärbter Vertikalschnitt durch die Säuger-Retina und schematische Darstellung der Schichtung PE = Pigmentepithel OS = äußere Segmente der Photo-rezeptoren (englisch: outer segments) IS = innere Segmente der Photorezeptoren (englisch: inner segments) ONL = äußere Körnerschicht (englisch: outer nuclear layer) OPL = äußere plexiforme Schicht (englisch: outer plexiform layer) INL = innere Körnerschicht (englisch: inner nuclear layer) IPL = innere plexiforme Schicht (englisch: inner plexiform layer) GCL = Ganglienzellschicht (englisch: ganglion cell layer) NFL = Nervenfaserschicht (englisch: nerve fiber layer) Gelber Pfeil: Richtung des Lichteinfalls (verändert nach Euler, 1996)
Einleitung ___________________________________________________________________________
8
Neben der vertikalen existiert auch eine horizontale Erregungsweiterleitung durch die Retina,
die durch zwei unterschiedliche Zellklassen ermöglicht wird. Die Horizontalzellen bilden
laterale inhibitorische Querverbindungen auf Ebene der Photorezeptor-Bipolarsynapsen in der
äußeren plexiformen Schicht (OPL, englisch: outer plexiform layer). Die Amakrinzellen sind
für die lateralen inhibitorischen Verschaltungen in der IPL zuständig.
1.2.1 Bandsynapsen der Säuger-Retina
Die unterschiedlichen Neuronenklassen der Retina bilden unterschiedliche chemische
Synapsentypen aus. Konventionelle chemische Synapsen sind die Synapsen der
Horizontalzellen, und der Amakrinzellen. An ihnen werden hauptsächlich die inhibitorischen
Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure (GABA) und Glyzin freigesetzt. Die Photorezeptoren
und Bipolarzellen besitzen Bandsynapsen, deren Transmitter Glutamat ist (Abbildung 4).
Die Photorezeptor-Bandsynapse der Retina eignet sich besonders gut zur Untersuchung dieses
spezialisierten Synapsentyps, denn die präsynaptischen Bänder der Photorezeptoren sind im
Gegensatz zu denen der Bipolarzellen relativ groß (bis zu 1 µm). Innerhalb der beiden
Photorezeptortypen, der Stäbchen und der Zapfen, gibt es jedoch Unterschiede in der Größe
und Anzahl der exprimierten Bänder. So besitzt ein typisches Säugetier-Stäbchen in der Regel
nur ein einzelnes synaptisches Band, das lichtmikroskopisch sichelförmig erscheint
(Abbildung 4C) und etwa 130 synaptische Vesikel gebunden hat. Zapfen-Terminalien
Abbildung 4: Die Bandsynapsen der Säugerretina A: Toluidinblaufärbung eines Vertikalschnittes durch die Mausretina. B: Immunzytochemische Färbung der präsynaptischen Bänder (Färbung gegen RIBEYE/CtBP2): a: Stäbchen, b: Zapfen, c: Bipolarzelle. Die Zellkörper in der INL und GCL sind ebenfalls immunreaktiv für CtBP2. C, D, E: Ultrastrukturelle Dar-stellung der präsynaptischen Bänder von Stäbchen (C), Zapfen (D) und Bipolarzellen (E) mit Ver-größerungen der immunzyto-chemisch markierten Bänder aus B. Größenbalken A: 20 µm. (verändert nach tom Dieck und Brandstätter, 2006)
Einleitung ___________________________________________________________________________
9
hingegen besitzen zwischen 20 und 50 etwas kleinere Bänder, wobei die Anzahl zur
Peripherie der Retina hin ansteigt (Haverkamp et al., 2000; tom Dieck und Brandstätter, 2006;
Abbildung 4D). Obwohl die Bänder eines Zapfen-Terminals unterschiedlich groß sein
können, ergibt sich im Schnitt eine Gesamtgröße von etwa 10 µm. An dieser Gesamtfläche
sind etwa 600 Vesikel gebunden, also etwa fünfmal so viele wie in Stäbchen (Sterling, 2004).
Die Größe und Anzahl der Bänder korreliert mit der Informationsrate, welche die
Photorezeptorzelle übermitteln muss. Zapfen sind bei Tageslicht über einen weiten
dynamischen Bereich an die Übermittlung fein graduierter Signale angepaßt. Die
Hauptaufgabe von Stäbchen hingegen ist es, unter skotopischen Bedingungen ein binäres
Signal weitergeben zu können (0 oder 1 Photon), was somit keiner feineren graduierten
Auftrennung bedarf (Rao-Mirotznik et al., 1995; de Ruyter van Stevenick und Laughlin,
1996).
1.2.2 Der molekulare Aufbau des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
Die molekulare Zusammensetzung der aktiven Zone von konventionellen chemischen
Synapsen und Bandsynapsen ähnelt sich. Unterschiede in der Proteinausstattung können auf
die unterschiedlichen Funktionsanforderungen an die beiden Synapsentypen zurückgeführt
werden. Proteine, die ausschließlich an Bandsynapsen vorkommen, sind RIBEYE - eine
Isoform des Transkriptionsfaktors CtBP2 (englisch: C-terminal binding protein 2; Schmitz et
al., 2000) und KIF3A, eine Untereinheit der Kinesin-Motorproteinfamilie (Muresan et al.,
1999). RIBEYE ist das erste identifizierte spezifische Protein der Bandsynapse und man
nimmt an, dass es den Hauptteil am Aufbau der synaptischen Bänder ausmacht. Die Funktion
von KIF3A am synaptischen Band ist bislang noch unbekannt. Das Vorkommen einer
Motorprotein-Untereinheit unterstützt die Hypothese, dass das synaptische Band wie ein
Förderband dafür sorgen könnte, dass jederzeit ausreichend synaptische Vesikel zur
Transmitterfreisetzung an die aktive Zone transportiert werden. Kinesine benötigen für ihren
Transport jedoch Mikrotubuli, die bislang nicht am Band gezeigt werden konnten. Darüber
hinaus wurde gezeigt, dass die Transmitterausschüttung ATP-unabhängig ist und somit eine
Beteiligung von Motorproteinen wie Kinesin ausschließt (Heidelberger et al., 2002). Auch
konnten bislang keine weiteren Untereinheiten des trimeren Kinesin-Komplexes an der
Bandsynapse nachgewiesen werden, die für die Motorfunktion nötig wären. Aus den
genannten Gründen muss in Betracht gezogen werden, dass eine Immunfärbung von KIF3A
am Band lediglich eine Kreuzreaktion mit einem konservierten Epitop eines noch
unbekannten Proteins darstellt (Sterling und Matthews, 2005).
Einleitung ___________________________________________________________________________
10
Die Proteine der aktiven Zone am Bandsynapsen-Komplex der Photorezeptoren bilden zwei
räumlich und vermutlich auch funktionell getrennte Kompartimente (Abbildung 5): Ein
Kompartiment, das das synaptische Band umfasst und ein Kompartiment, das den Bereich der
arciform density und der darunter liegenden Plasmamembran bildet (tom Dieck et al., 2005).
Das Kompartiment des synaptischen Bandes beinhaltet RIBEYE, CtBP1, KIF3A, Piccolo und
RIM1, das Kompartiment der arciform density / Plasmamembran beinhaltet RIM2, Munc13,
CAST1, sowie eine Ca2+-Kanal-Untereinheit α1. Bassoon ist am Übergang der beiden
Bereiche lokalisiert und verbindet die beiden Kompartimente miteinander. Diese Funktion
von Bassoon sowie der schlüssige Beweis, dass das synaptische Band an der
Transmitterfreisetzung beteiligt ist, wurde in der Arbeit von Dick et al. (2003) geliefert.
Untersuchungen von Mäuseretinae, denen ein funktionstüchtiges Bassoon-Protein fehlt,
zeigten, dass Bassoon eine essentielle Rolle in der Verankerung der synpatischen Bänder an
der Plasmamembran von Photorezeptoren spielt. Fehlt Bassoon, so schwimmen die
synaptischen Bänder als „ribbon fields“ frei im Zytoplasma der Photorezeptor-Terminalien
und die Erregungsübertragung auf die nachgeschalteten Bipolarzellen ist beeinträchtigt (Dick
et al., 2003).
1.2.2.1 Complexine an der Photorezeptor-Bandsynapse
Die Bildung und Aufrechterhaltung des SNARE-Komplexes in chemischen Synapsen wird
durch eine Vielzahl an Proteingruppen kontrolliert (Wojzik und Brose, 2007). Die
Complexin-Proteinfamilie zählt zu den wichtigsten Vertretern der SNARE-Komplex-
Abbildung 5: Kompartimen-tierung von Proteinen am Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex Das präsynaptische Band setzt sich aus den Proteinen RIBEYE, CtBP1, KIF3A, Piccolo und RIM1 zusammen. Den Bereich der arciform density / Plasmamembran bilden RIM2, Munc13, CAST1 sowie eine Ca2+-Kanal-Untereinheit α1. Bassoon ist am Übergang dieser beiden Bereiche lokalisiert und scheint ein essentielles Bindeglied zwischen den Kompartimenten zu sein. (verändert nach tom Dieck et al., 2005)
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Einleitung ___________________________________________________________________________
11
Stabilisatoren (Brose, 2008). Das Maus-Genom besitzt vier Complexin-Gene (Complexin 1-
4), von denen die ersten drei im Gehirn exprimiert werden. Complexin 3 wird jedoch nur in
sehr geringen Konzentrationen exprimiert und trägt nicht signifikant zur synaptischen
Übertragung bei (Xue et al., 2008).
In der Säugerretina werden alle vier Complexin-Isoformen exprimiert, zwei davon –
Complexin 3 und 4 – spezifisch an den Photorezeptor-Bandsynapsen (Reim et al., 2005). Von
Reim und Kollegen (2005) wurde postuliert, dass diese Spezifität eine wichtige Rolle in der
graduierten Freisetzung von Glutamat an Photorezeptor-Bandsynapsen spielen könnte. Die
genaue Funktion der beiden Proteine ist jedoch noch unverstanden.
1.3 Synaptogenese
Die Bildung chemischer Synapsen (= Synaptogenese) beginnt bereits im embryonalen
Organismus und zieht sich bis weit nach der Geburt. Die Synaptogenese lässt sich in vier
Phasen einteilen: (1) Phase des ersten Kontaktes, während dessen ein Nervenzell-Fortsatz
(Axon oder Dendrit) ein potentielles Ziel erkennt, (2) Induktion der Differenzierung von Prä-
und Postsynapse, (3) Akkumulation von Vesikeln und Proteinen an der prä- und
postsynaptischen Membran und (4) strukturelle und funktionelle Reifung. Die Phasen 1-3
können sich innerhalb von 1-2 Stunden vollziehen (Dailey et al., 1996; Ahmari et al., 2000;
Jontes et al., 2000; Vardinon-Friedman et al., 2000). Die Synaptogenese erfordert die
Zusammenarbeit vieler Proteine und Signalkaskaden, wobei eine Reihe von hierarchischen
Interaktionen zwischen sezernierten und Zelloberflächen-Proteinen nötig zu sein scheint. Zur
Zell-Zell-Erkennung werden beispielsweise Zelladhäsionsmoleküle wie Cadherine,
Protocadherine und Neurexin-Neuroligin-Komplexe benötigt, die darüber hinaus vermutlich
Signale zur Bildung prä- und postsynaptischer Spezialisierungen liefern (Shapiro und
Colman, 1999; Scheiffele et al., 2000; Takai et al., 2003). Die Signalgebung während der
Synaptogenese scheint bidirektional zu laufen, dennoch geht der postsynaptischen
Differenzierung oft die präsynaptische Differenzierung voraus (Vardinon-Friedman et al.,
2000).
Eine zentrale Frage in der Synapsenentwicklung ist die nach dem Transportmechanismus von
prä- und postsynaptischen Proteinen zum Zielort (Axon-Terminal oder Dendrit). Die
Tatsache, dass funktionelle Synapsen innerhalb weniger Stunden gebildet werden können,
ließ vermuten, dass das Vorhandensein eines gewissen Repertoires an synaptischen Proteinen
für die schnelle Bildung einer funktionellen Synapse notwendig ist. Übereinstimmend mit
dieser Hypothese wurden in sich neu entwickelnden Hippocampus-Synapsen elektronendichte
Einleitung ___________________________________________________________________________
12
Vesikel mit einem Durchmesser von 80 nm gefunden (Zhai et al., 2001; Abbildung 6). Diese
Vesikel sind sehr beweglich und beinhalten ein Set an Molekülen, die an der aktiven Zone
adulter konventioneller Synapsen lokalisiert sind. Bislang sind dies Piccolo, Bassoon, RIM
und Proteine des Exocytose-Apparates: Syntaxin, SNAP-25 und ein spannungsgesteuerter N-
Typ Ca2+-Kanal (Zhai et al., 2001; Othsuka et al., 2002; Shapira et al., 2003). Diese Vesikel
stellen höchstwahrscheinlich die Transportform von präsynaptischen Proteinen dar, deren
Fusion mit der Plasmamembran in der schnellen Neubildung einer aktiven Zone resultieren
kann (Zhai et al., 2001; Shapira et al., 2003). Die Entdeckung von Piccolo und Bassoon als
eine der ersten CAZ-Proteine, die auf solchen Transportvesikeln während der Synaptogenese
detektierbar sind, führte zu der Bezeichnung Piccolo-Bassoon-Transport Vesikel (englisch:
Piccolo-Bassoon transport vesicles, PTVs). Bei der Beladung der PTVs scheint die
Sortierung der CAZ-Proteine über Golgi-Membranen eine wichtige Funktion zu spielen (Zhai
et al., 2001; Dresbach et al., 2006; Abbildung 6C).
Im Gegensatz zu den „vorgefertigten“ PTVs der präsynaptischen aktiven Zone ist der
Transport und Zusammenbau der PSD an Postsynapsen vermutlich sequenzieller Natur. Laut
aktuellen Studien vollzieht sich die Bildung der PSD durch eine graduelle Rekrutierung von
Molekülen aus einem diffusen Pool von Proteinen oder der sequenziellen Fusionierung von
einer Vielzahl an Vesikeln, die jeweils nur wenige Moleküle tragen (Mammen et al., 1997;
Okabe et al., 1999; Setou et al., 2000; Bresler et al., 2004).
Abbildung 6: Elektronendichte Vesikel in den Axonen sich entwickelnder Neurone in 3 Tage alten dissoziierten Hippocampus-Kulturen. A: Elektronenmikroskopische Auf-nahme mehrerer 80 nm großer elektronendichter Vesikel (PTVs) an Mikrotubuli in Axonen (Pfeile). B: Elektronendichte Vesikel können auch in der Nähe des Golgi-Apparats beobachtet werden. Größenbalken A und B: 0,1 µm. (verändert nach Zhai et al., 2001)
Einleitung ___________________________________________________________________________
13
1.4 Zielsetzung
Die Hypothese der PTVs zur schnellen Neubildung aktiver Zonen chemischer Synapsen
erklärt noch nicht bis ins Detail die Bildung einer funktionstüchtigen Synapse. So wurden
bislang nur ein Teil aller benötigten Moleküle auf den PTVs gefunden. Durch welchen
Mechanismus weitere Proteine der aktiven Zone zur Membran rekrutiert werden, ist noch
ungeklärt. Die Hypothese der PTVs muß daher an anderen Modellsynapsen validiert und
verfeinert werden. Die Photorezeptor-Bandsynapse eignet sich aufgrund der bereits
lichtmikroskopisch erkennbaren Kompartimentierung besonders gut zur Untersuchung des
Zusammenbaus der aktiven Zone während der Synaptogenese. Im Rahmen der vorliegenden
Arbeit sollte daher die Abfolge in der Expression der verschiedenen Synapsenproteine
untersucht werden, sowie ihre Interaktionen an der aktiven Zone und die
Transportmechanismen, über die die Proteine an die Synapse gelangen. Zudem sollte
aufgrund der herausragenden Stellung des CAZ-Proteins Bassoon als eines der ersten
detektierbaren Proteine während der Synaptogenese konventioneller chemischer Synapsen die
Funktion von Bassoon während der Photorezeptor-Entwicklung anhand der Bassoon-
mutanten Maus untersucht werden.
Ein weiterer Vorteil der Photorezeptor-Bandsynapsen ist aufgrund ihrer Größe und der
übersichtlichen Anordnung der Photorezeptor-Terminalien in der äußeren plexiformen
Schicht das Potential für funktionelle Eingriffe. Daher sollte im Rahmen dieser Doktorarbeit
eine Methode zur Transfektion von Photorezeptoren mit siRNAs etabliert werden. Durch den
Knockdown eines oder mehrer essentieller Proteine der aktiven Zone während der
Entwicklung sollte es möglich sein, Informationen bezüglich der Funktion eines Proteins bei
der Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes zu gewinnen ohne dabei auf
die Generierung von transgenen Mäusen angewiesen zu sein.
Darüber hinaus standen Knockout-Mäuse zur Verfügung, denen bestimmte Isoformen eines
weiteren präsynaptischen Proteins - Complexin 3 und 4 - fehlen. Die Auswirkungen der
Deletion dieser Proteine auf die Struktur und Funktion der Photorezeptor-Bandsynapsen
sollten in Einzel- und Doppel-Knockout-Retinae untersucht werden.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
14
2 Ergebnisse
2.1 Die postnatale Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in
der wildtypischen Mausretina
Die Entwicklung der Photorezeptoren und die Ausbildung der synaptischen Kontakte finden
in der Mausretina innerhalb der ersten zwei postnatalen Wochen statt (Olney, 1968; Blanks et
al., 1974). Daher wurde die Analyse der Expression und des Transportes von Proteinen der
Photorezeptor-Bandsynapse auf den Zeitraum von P0 (postnataler Tag 0 = Tag der Geburt)
bis P14 beschränkt.
2.1.1 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression von Bassoon während der
postnatalen Entwicklung der Retina
Die wichtige Rolle von Bassoon zeigt sich nicht nur in seiner Funktion als essentielles
Ankerprotein im adulten Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex. Bassoon ist außerdem eines
der ersten CAZ-Proteine, das während der Synaptogenese konventioneller chemischer
Synpasen auf PTVs zu detektieren ist. Zeitgleich mit der Lokalisation von Bassoon an
zukünftigen Präsynapsen wird die Rekrutierung von synaptischen Vesikeln beobachtet. Somit
spielt Bassoon vermutlich eine tragende Rolle bei der Bildung aktiver Zonen (Zhai et al.,
2000; Zhai et al., 2001). Für die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
stellte sich daher zunächst die Frage, ab welchem Zeitpunkt in der Entwicklung der Retina
Bassoon zum ersten Mal in differenzierenden Photorezeptorzellen detektiert werden kann.
Hierfür wurden vertikale Retinaschnitte der Entwicklungsstadien P0, P2, P4, P6, P8, P10, P12
und P14 mit einem Antikörper gegen Bassoon markiert (Abbildung 7). Jedem
Entwicklungsstadium ist zur Verdeutlichung der retinalen Schichten eine differentielle
Interferenzkontrast (DIC)-Aufnahme gegenübergestellt.
Am Tag P0 besteht die Retina zum größten Teil aus einer noch undifferenzierten
Zellpopulation, der Neuroblasten-Schicht (NBL, englisch: neuroblast layer). Aus dieser
entwickeln sich im Laufe der postnatalen Retinogenese die verschiedenen retinalen
Neuronenklassen. Lediglich die Differenzierung der GCL und der IPL beginnt pränatal. Diese
Schichten sind am Tag der Geburt bereits rudimentär zu erkennen und schwach immunreaktiv
für Bassoon. Zu den Zeitpunkten P0 und P2 lassen sich zusätzlich punktförmige
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
15
Abbildung 7: Verteilungsmuster von Bassoon während der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina in den ersten zwei postnatalen Wochen gefärbt für Bassoon kombiniert mit DIC-Aufnahmen der entsprechenden Stadien. Bassoon tritt erstmals am Tag P0 als punktierte Färbung in der NBL auf, nimmt am Tag P2 an Intensität zu und konzentriert sich ab dem Tag P4 im sich entwickelnden Band der OPL. Die OPL wandert im Lauf der nächsten vier Tage (bis P8) zur Mitte der Retina hin und kondensiert immer deutlicher zu einem dünnen Band. Die IPL ist bereits ab dem Tag der Geburt diffus für Bassoon gefärbt. Bis zum Tag P14 nehmen die Intensität der Bassoon-Färbung und die Dicke der IPL zu. Etwa ab dem Tag P12 zeigt die Markierung in der IPL fünf Banden mit starker Bassoon-Immunreaktivität, die von vier Banden schwächerer Bassoon-Färbung getrennt werden. Dies entspricht der Färbung im adulten Entwicklungsstadium und ist zum Großteil auf die Markierung konventioneller chemischer Synapsen zurückzuführen. NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer Größenbalken: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
16
Markierungen in der äußeren NBL detektieren. Diese punktierte Färbung kondensiert am Tag
P4 zu einem dünnen Band in der sich entwickelnden OPL. Zum Zeitpunkt P6 ist die
punktierte Markierung ausschließlich auf die OPL beschränkt und die ONL ist frei von
Bassoon-Färbung. Bis zum Tag P14 nimmt die Intensität der Färbung in der OPL stetig zu.
Die sichelförmige Markierung, welche für die präsynaptischen Bänder der adulten
Photorezeptor-Terminalien charakteristisch ist, ist jedoch auch am Tag P14 noch selten zu
erkennen. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die Synaptogenese mit diesem Tag
noch nicht vollständig abgeschlossen ist (Dick et al., 2003).
Die starke Färbung der IPL mit dem Antikörper gegen Bassoon ist auf die Markierung von
konventionellen Synapsen zurückzuführen, da der verwendete Antikörper gegen Bassoon das
Protein an den Bipolarzell-Bandsynapsen nicht markiert (Brandstätter et al., 1999; Dick et al.,
2001).
Immunzytochemische Färbungen von Bassoon an vertikalen Gefrierschnitten embryonaler
Mäuseretina zeigten darüber hinaus, dass eine Immunreaktion gegen Bassoon bereits zwei
Tage vor der Geburt (E18, embryonaler Tag 18; der früheste untersuchte Zeitpunkt) zu
beobachten ist (ohne Abbildung).
Wie in konventionellen chemischen Synapsen kann also auch in der Retina Bassoon sehr früh
in der Synapsen-Entwicklung detektiert werden.
2.1.1.1 Lokalisation der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren
Es stellte sich nun die Frage nach der Verteilung der Bassoon-Aggregate innerhalb der sich
differenzierenden Photorezeptorzellen. Viele Proteine, die für adulte Photorezeptoren als
Marker einsetzbar sind, werden von den noch undifferenzierten Photorezeptoren erst zu einem
relativ späten Zeitpunkt in der Entwicklung exprimiert. Bei der immunzytochemischen
Analyse der Expressionsmuster einiger Vesikelproteine im frühen Stadium der Retina fiel
jedoch auf, dass viele dieser Proteine - wie zum Beispiel der vesikuläre Glutamat-Transporter
1 (VGLUT1) - zum Zeitpunkt P0 und P2 in auswachsenden Photorezeptor-Axonen stark
angereichert sind. So ließen sich in Doppelfärbungen von VGLUT1 und Bassoon in der
jungen Retina die Lokalisation und die Anzahl der Bassoon-Aggregate innerhalb der sich
differenzierenden Photorezeptorzelle bestimmen.
Abbildung 8 zeigt vertikale Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina doppelgefärbt
für VGLUT1 (magenta) und Bassoon (grün) an den Tagen P0 und P4. Die Färbungen zeigen,
dass zum Zeitpunkt P0 bereits mehrere Bassoon-Aggregate entlang eines auswachsenden
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
17
axonalen Fortsatzes verteilt sind (Abbildung 8A). Diese Aggregate stellen vermutlich
Transport-Aggregate dar und erreichen das Terminal um den Tag P4, wo sie schließlich
akkumulieren (Abbildung 8B). Die VGLUT1-positiven Photorezeptor-Axone zu den
Zeitpunkten P0 und P4 entsprechen mit hoher Wahrscheinlichkeit differenzierenden Zapfen,
da die Differenzierung von Zapfen derjenigen von Stäbchen vorausgeht (Marquardt und
Gruss, 2002; Sherry et al., 2003; Wässle et al., 2006). Darüber hinaus beinhalten die
VGLUT1-positiven Axone im Durchschnitt 7-8 immunzytochemisch detektierbare Bassoon-
Aggregate (P0: n = 53; P4: n = 50), die zur Bildung individueller Bänder führen könnten
(Abbildung 8C und D). Bassoon-Markierung außerhalb der VGLUT1-positiven Axone läßt
sich den etwas später entwickelnden Stäbchen zuordnen.
Abbildung 8: Verteilung der Bassoon-Aggregate in differenzierenden Photorezeptoren A, B: Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina doppelgefärbt für VGLUT1 (magenta) und Bassoon (grün) zu den Entwicklungsstadien P0 (A) und P4 (B). VGLUT1-positive Axone gehören vermutlich zu Zapfen-Photorezeptoren. Am Tag der Geburt befinden sich mehrere Bassoon-Aggregate entlang eines wachsenden Axons (A). Zum Zeitpunkt P4 akkumulieren die meisten Aggegate bereits in den zukünftigen Terminalien (B). C, D: Quantifizierung der Bassoon-Aggregate pro Photorezeptor-Axon am Tag P0 (C), bzw. Photorezeptor-Terminal am Tag P4 (D). Am Tag der Geburt beinhaltet ein Photorezeptor-Axon im Durchschnitt 8 Bassoon-Aggregate, zum Zeitpunkt P4 durchschnittlich 7. NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; VGLUT1: vesikulärer Glutamat-Transporter 1 Größenbalken A und B: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
18
2.1.2 Immunzytochemische Untersuchungen zur Expression weiterer CAZ-Proteine
während der postnatalen Entwicklung der Retina
Für die detailliertere Analyse der Zusammensetzung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes wurden Färbungen der jungen Retina mit Antikörpern gegen weitere Proteine der
adulten Bandsynapse durchgeführt. Hierbei stellte sich heraus, dass neben Bassoon auch
Piccolo, RIBEYE und RIM1 zu den früh detektierbaren Proteinen gehören (Immundetektion
ab P0). Interessanterweise sind diese Proteine alle am Bandkompartiment des adulten
Bandsynapsen-Komplexes lokalisiert (tom Dieck et al., 2005). Neben der frühen Detektion in
der Retina ist diesen Proteinen auch die punktierte Färbung in der äußeren Hälfte der NBL
gemein.
Abbildung 9 zeigt vertikale Gefrierschnitte der Retina zu den Zeitpunkten P2, P4 und P6
gefärbt für Piccolo, RIBEYE und RIM1. Unter Einbeziehung der Bassoon-Färbung
(Abbildung 7) fällt auf, dass die Anzahl und die Intensität der immunreaktiven Punkte
zwischen den einzelnen Proteinen dieser früh detektierbaren Gruppe stark divergieren. Die
stärkste und häufigste punktförmige Markierung zeigen Antikörper gegen Bassoon und
Piccolo. Mit den Antikörpern gegen RIBEYE und RIM1 sind nur vereinzelte, schwächere
Markierungen zu erkennen, die im Fall von RIM1 erst bei hoher Vergrößerung deutlich
werden. Am Tag P2 sind die Anzahl und die Intensität der immunreaktiven Punkte in der
äußeren NBL für alle vier synaptischen Proteine am größten. Wie bei Bassoon wandern die
immunreaktiven Punkte in den nächsten Tagen weiter zur Mitte der Retina, wo sie schließlich,
beginnend am Tag P4, auf Höhe der späteren OPL kondensieren. Am Tag P6 befinden sich
die immunreaktiven Markierungen aller vier Proteine in der OPL und die ONL ist frei von
Färbung.
Die Ergebnisse zeigen, dass Komponenten des präsynaptischen Bandes in den sich
differenzierenden Photorezeptoren der Retina früh in der Entwicklung als Protein-Aggregate
detektierbar sind. Diese werden zum zukünftigen Terminal transportiert und könnten daher
den PTVs konventioneller chemischer Synapsen entsprechen. Die lichtmikroskopischen
Daten ließen allerdings vermuten, dass die Protein-Aggregate in Photorezeptoren größer als
die während der Synaptogenese konventioneller chemischer Snyapsen beschriebenen 80 nm
großen PTVs sind. Da die räumliche Auflösung konventioneller Lichtmikroskopie begrenzt
ist, wurden zur Validierung dieser Beobachtung STED (englisch: stimulated emission
depletion)- und elektronenmikroskopische Analysen der Transport-Aggregate durchgeführt.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
19
2.1.3 STED-Analyse der Transport-Aggregate
Mit dem STED-Verfahren lassen sich Strukturen lichtmikroskopisch mit einer Auflösung
abbilden, die weit unterhalb der physikalisch definierten Grenze für sichtbares Licht liegt
(Hell et al., 1994; Klar et al., 2000; Klar et al., 2001). Die maximale laterale Auflösung
herkömmlicher Laserscanning-Mikroskope liegt bei etwa 200 nm. Mit der STED-Technologie
lassen sich Strukturen mit einer Größe von bis zu 30 nm auflösen. Das Prinzip des STED-
Verfahrens setzt jedoch ein optimales Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Färbung voraus.
Daher eigneten sich für die STED-Analysen der Transport-Aggregate vor allem die
Färbungen von Bassoon mit dem Kaninchen-Antikörper sap7f.
Abbildung 10 zeigt eine repräsentative konfokale Laserscanning-Aufnahme einiger Bassoon-
Aggregate zum Zeitpunkt P2 (A) und die dazugehörige STED-Aufnahme derselben
Aggregate (B). Im konfokalen Bild sind vier etwa gleich große rundliche Strukturen zu
erkennen. Mit der erhöhten Auflösung der STED-Aufnahme wird jedoch deutlich, dass eine
solche Struktur zumeist aus zwei kleineren, punktförmigen Aggregaten besteht (Abbildung
10, Pfeilköpfe). Diese scheinen in der herkömmlichen Lichtmikroskopie
Abbildung 9: Expressionsmuster von Piccolo, RIBEYE und RIM1 während der frühen postnatalen Entwicklung der Retina Konfokale Laserscanning-Auf-nahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina gefärbt für Piccolo, RIBEYE und RIM1 zu den Stadien P2, P4 und P6. Wie Bassoon sind auch Piccolo, RIBEYE und RIM1 bereits früh in der Entwicklung der Retina detektierbar. In der NBL zeigen sich die Markierungen der drei Proteine als immunfluoreszierende Punkte, die bis zum Tag P6 zur zukünftigen OPL wandern. NBL: neuroblast layer; OPL: outer plexiform layer Größenbalken: 20 µm
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
20
Abbildung 10: STED-Analyse der Bassoon-Aggregate in Photorezeptoren zum Zeitpunkt P2 A, B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen eines vertikalen Gefrierschnitts durch die NBL der wildtypischen Mausretina gefärbt für Bassoon zum Zeitpunkt P2. Abbildung A entstand mit einem herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskop, Abbildung B zeigt denselben Bereich der Retina, der mit einem STED-Mikroskop aufgenommen wurde. Es ist deutlich zu sehen, dass eine Struktur in (A) in Wirklichkeit zwei kleineren Protein-Aggregaten entspricht (B, Pfeilköpfe). Größenbalken B: 0,2 µm
aufgrund der geringeren Auflösung miteinander zu „verschmelzen“. Die kleineren Aggregate
im STED-Bild haben einen Durchmesser von 129 nm ± 20 nm (n = 15) und sind somit
deutlich größer als die PTVs in konventionellen chemischen Synapsen.
Auch mit hochauflösender STED-Mikroskopie kann jedoch nicht geklärt werden, ob die in
der Photorezeptor-Entwicklung gefundenen Komplexe vesikulärer Natur sind. Deshalb wurde
eine elektronenmikroskopische Analyse der Transport-Aggregate durchgeführt.
2.1.4 Ultrastrukturelle Charakterisierung der Transport-Aggregate
Die Ultrastruktur der Transport-Aggregate wurde mit konventioneller und Immuno-
Elektronenmikroskopie analysiert. Aufgrund der schlechten Gewebeerhaltung der jungen
Retina erfolgte die Analyse erst zum Zeitpunkt P4. Zu diesem Zeitpunkt sind in der
Lichtmikroskopie punktförmige Markierungen detektierbar, die beginnen in einem dünnen
synpatischen Band zu kondensieren.
Mit dem Elektronenmikroskop lassen sich am Tag P4 in den differenzierenden Photorezeptor-
Axonen und -Terminalien runde bis ovale elektronendichte Strukturen beobachten. Diese sind
von einer Vesikelreihe umgeben, jedoch selbst nicht von einer Membran umhüllt (Abbildung
11A). Solche elektronendichten Strukturen wurden bereits vor über 30 Jahren beschrieben
und als mögliche Vorläufer für präsynaptische Bänder diskutiert (Olney, 1968; Blanks et al.,
1974). Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden in der vorliegenden Arbeit
„preembedding“-Markierungen verschiedener Photorezeptor-Bandsynapsen-Proteine
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
21
Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Analyse der Transport-Aggregate in Photorezeptoren zum Zeitpunkt P4 A: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Photorezeptor-Axons mit einer Vorläufer-Struktur des präsynaptischen Bandes (weißer Kasten) in der wildtypischen Mausretina zum Zeitpunkt P4. Die runde, elektronendichte Struktur ist von einer Vesikelreihe umgeben. B, C, D, E: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von preembedding-markierten Transport-Aggregaten in Photorezeptor-Terminalien zum Zeitpunkt P4. Antikörper gegen RIBEYE (B), Piccolo (C) und Bassoon (D) markieren die Vorläufer-Strukturen, gegen Munc13 hingegen nicht (E). Größenbalken A: 1 µm; B-E: 0,2 µm
zum Zeitpunkt P4 für die Elektronenmikroskopie durchgeführt. In der Tat konnten die runden
und ovalen elektronendichten Strukturen mit Antikörpern gegen Band- und Bandassoziierte
Proteinen wie RIBEYE, Piccolo und Bassoon markiert werden (Abbildung 11B, C, D).
Antikörper gegen Proteine des arciform density / Plasmamembran-Kompartimentes, wie zum
Beispiel MUNC13 und CAST1, zeigten hingegen keine Markierung dieser Strukturen
(Abbildung 11 E).
Die meisten Terminalien zukünftiger Photorezeptoren beinhalten ein bis zwei Transport-
Aggregate und sind daher vermutlich entstehenden Stäbchen zuzuordnen. Gelegentlich
wurden auch Terminalien mit mehreren Transport-Aggregaten gefunden. Diese stellen
vermutlich differenzierende Zapfen-Terminalien dar.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
22
Obwohl die Transport-Aggregate in einzelnen ultradünnen Schnitten rund bis oval erschienen,
blieb die genaue dreidimensionale Morphologie der Komplexe unklar. Daher wurden mit
Hilfe von ultradünnen Serienschnitten zum Zeitpunkt P4 dreidimensionale (3D)
Rekonstruktionen von Photorezeptor-Terminalien angefertigt, von denen 3 repräsentative
Bilder in Abbildung 12 dargestellt sind. Von 15 rekonstruierten Protein-Aggregaten in sieben
sich entwickelnden Photorezeptor-Terminalien zeigten 11 eine sphärische Morphologie.
Daher kann davon ausgegangen werden, dass die frühesten Komplexe sphärisch sind.
Aufgrund dieser Tatsache gaben wir den Vorläufer-Strukturen des präsynaptischen Bandes
den englischen Terminus „precursor spheres“. Der anhand der elektronenmikroskopischen
Aufnahmen ermittelte Durchmesser der precursor spheres beträgt 129 nm ± 36 nm
(Standardabweichung; n = 143, gemessen von P4 bis P10) und stimmt mit den Daten der
STED-Analyse überein. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass es sich bei den
lichtmikroskopisch und den elektronenmikroskopisch beobachtbaren Aggregaten um die
gleichen Strukturen handelt.
Abbildung 12: 3D-Rekonstruktion von precursor spheres in differenzierenden Photorezeptor-Terminalien zum Zeitpunkt P4 Die frühesten Vorläuferstrukturen des präsynaptischen Bandes in differenzierenden Photorezeptor-Terminalien sind sphärisch. A, B: Dreidimensionale Darstellung von rekonstruierten Stäbchen-Terminalien mit ein bis zwei Transport-Aggregaten anhand von ultradünnen Serienschnitten C: Dreidimensionale Darstellung eines anhand von ultradünnen Serienschnitten rekonstruierten potentiellen Zapfen-Terminals mit vier Transport-Aggregaten. grau: Photorezeptor-Terminal rot: precursor spheres gelb: Transmittervesikel grün: postsynaptisches Element Größenbalken A-C: 0,2 µm
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
23
2.1.5 Kolokalisationsstudien mit Antikörpern gegen Bassoon, Piccolo und RIBEYE
Während der Photorezeptor-Synaptogenese der Mausretina werden Proteine des
Bandkompartimentes - RIBEYE, Piccolo, RIM1 - sowie das Verbindungsmolekül zwischen
Bandkompartiment und arciform density - Bassoon - als precursor spheres zu den
zukünftigen Photorezeptor-Terminalien transportiert. Lichtmikroskopisch zeigen diese
Proteine ein vergleichbares Expressionsmuster (frühe punktierte Färbung). Dieses Ergebnis
ließ vermuten, dass die genannten Proteine - vergleichbar mit den PTVs in konventionellen
chemischen Synapsen - in den Photorezeptoren der Retina in einem gemeinsamen Transport-
Komplex zu den zukünftigen Synapsen in den Terminalien transportiert werden. Daher
wurden Kolokalisationsstudien mit Mehrfachfärbungen gegen RIBEYE, Piccolo und Bassoon
an vertikalen Gefrierschnitten in frühen Entwicklungsstadien der Mausretina durchgeführt
und quantitativ ausgewertet. Für die Analyse wurde ein Computerprogramm mit einer
manuellen Methode verglichen.
2.1.5.1 Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon und Piccolo mit Axiovison 4.6
Das Kolokalisationsmodul von Axiovision 4.6 ist dazu konzipiert, in Fluoreszenz-Aufnahmen
die Lichtintensitäten eines Pixels in zwei Farbkanälen miteinander zu vergleichen. Die
graphische Darstellung erfolgt in einem Streudiagramm, dessen x-Achse die Pixelverteilung
entsprechend der Intensität des einen Farbkanals und die y-Achse die des zweiten Farbkanals
anzeigt. Jeder auftretenden Intensität ist zudem eine farblich kodierte Häufigkeit (englisch:
frequency) zugeteilt. Ein Punkt, der sich genau auf oder nahe einer der beiden Achsen
befindet, entspricht einem Pixel in der Fluoreszenzaufnahme, der nicht oder nur sehr schwach
mit der anderen Kanalfarbe überlagert ist.
Das Streudiagramm lässt sich in Quadranten unterteilen: der vierte Quadrant beinhaltet die
Mehrzahl an Pixel, die sehr schwach sowohl in der einen als auch in der anderen Farbe
fluoreszieren. Dieser Bereich gilt als unspezifisch gefärbter Hintergrund und wird deshalb aus
der Auswertung ausgeschlossen. Aus dem Ausschluß der unspezifischen Färbungen ergeben
sich automatisch Quadranten eins, zwei und drei. Quadranten eins und zwei beinhalten
einzeln gefärbte Pixel mit entsprechender Intensität. In Quadrant drei sind letztlich diejenigen
Pixel enthalten, die Kolokalisation aufweisen. Die Grenzen der einzelnen Quadranten können
manuell verschoben werden, wobei der Schwellenwert jeweils anhand der Original-Aufnahme
überprüft werden muss, in der die kolokalisierten Pixel in einer Falschfarbe angezeigt werden
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
24
können. Das bedeutet, dass die auswertende Person mit Hilfe der originalen Fluoreszenz-
Aufnahme subjektiv die Grenze zwischen Kolokalisation und Einzelmarkierung ziehen muss.
Abbildung 13 zeigt die Auswertung der Kolokalisation für einen vertikalen Gefrierschnitt der
Mausretina zum Zeitpunkt P2 doppelmarkiert für Bassoon (mit dem Sekundär-Antikörper
Alexa 488, in der Abbildung GFP) und Piccolo (mit dem Sekundär-Antikörper Alexa 594, in
der Abbildung Cy3). Die Darstellung bezieht sich auf einen ausgewählten Bereich der NBL.
Es fällt auf, dass ein hoher Anteil an Hintergrundfärbung existiert (Quadrant 4). Wird diese
außer Acht gelassen, so verbleibt ein Prozentsatz von aufgerundeten 49% der Kolokalisation
von Bassoon und Piccolo aus der Gesamtheit der fluoreszierenden Pixel. Die beiden Proteine
werden also zu einem großen Teil in gemeinsamen Komplexen transportiert, jedoch nicht alle
Aggregate setzen sich aus beiden Proteinen zusammen. 42% des Bassoon-Proteins und 22%
des Piccolo-Proteins scheinen einzeln transportiert zu werden.
Ein großer Nachteil des Computerprogramms ist, dass es nur einzelne Pixel miteinander
vergleichen kann. Dadurch entsteht als Ergebnis eine Anzahl an kolokalisierten Pixeln oder
eine Kolokalisations-„Fläche“. Pixel, die im Gewebe sehr dicht beieinander liegen und
deshalb ebenfalls als kolokalisiert gewertet werden müssten, kann das Programm nicht als
solche detektieren. Dies ist insbesondere bei Proteinen von Bedeutung, die in einem Komplex
vorliegen, jedoch in diesem nicht homogen verteilt sind. Entscheidend ist jedoch, dass das
Programm die Kolokalisation der nicht ganz ausgegrenzten Hintergrundfärbung
Scatter Quadrant Anzahl Pixel Fläche (µm²)
Bassoon (GFP) 6052 63,436
Piccolo (Cy3) 4872 51,067
Kolokalisation 3486 36,539
Hintergrund 1429110 14979,73 Kolokalisation Bassoon + Piccolo: 49% Abbildung 13: Kolokalisation von Piccolo und Bassoon in der NBL zum Zeitpunkt P2 Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon und Piccolo anhand von Doppelfärbungen vertikaler Gefrierschnitte am Tag P2 mit dem Kolokalisationsmodul von Axiovision 4.6. Ausgewertet ist ein ausgewählter Bereich der NBL.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
25
miteinbezieht. Daher liegt vermutlich der Prozentsatz an Kolokalisation von Bassoon und
Piccolo in Wirklichkeit niedriger.
Aus den genannten Gründen wurde auf eine manuelle Methode der Quantifizierung
zurückgegriffen. Hierfür wurde die punktförmige Markierung der Proteine per Hand auf Folie
übertragen und durch exaktes Übereinanderlegen beider Kanäle mit der jeweiligen Färbung
des anderen Proteins verglichen. Diese Methode erlaubt es dem Betrachter, auch nah
aneinandergrenzende oder nur teilweise überlappende Fluoreszenzpunkte als kolokalisiert zu
werten.
2.1.5.2 Manuelle Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und
RIBEYE anhand von Tripelfärbungen
Eine Kolokalisationsbestimmung anhand von Doppelfärbungen lässt mehrere Arten der
Interpretation zu. So lassen sich beispielsweise keine Aussagen darüber treffen, ob in einer
Doppelfärbung einzeln auftretende Protein-Aggregate eventuell mit einem dritten Protein
komplexiert vorliegen. Für eine möglichst genaue Analyse der Transport-Komplexe wurden
daher Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE für die Stadien P2, P4 und P6
durchgeführt.
.
Abbildungen 14A und B zeigen repräsentative Ausschnitte der NBL zu den Zeitpunkten P2
und P4 tripelgefärbt für Bassoon (blau), Piccolo (grün) und RIBEYE (rot). In der
Überlagerung der drei Kanäle sind einzeln markierte Aggregate, doppelmarkierte Aggregate
und Aggregate zu sehen, in denen alle drei Proteine lokalisiert sind (weiße Färbung).
Abbildung 15 zeigt die Auswertung der Quantifizierung (P2: n = 1420; P4: n = 1575; P6: n =
2540). Von den ausgezählten immunfluoreszierenden Aggregaten zum Zeitpunkt P2 sind etwa
20% der Aggregate mit Antikörpern gegen alle drei Proteine tripelmarkiert. Der Prozentsatz
an Aggregaten, die lediglich zwei der drei Proteine beinhalten, schwankt zwischen 1%
(Bassoon/RIBEYE) und 25% (Bassoon/Piccolo). Piccolo und Bassoon treten am häufigsten
einzeln auf (23 bzw. 21%), RIBEYE dagegen nur zu 6%.
Von P2 zu P6 erhöht sich der Prozentsatz an tripelgefärbten Aggregaten um etwa das
Doppelte auf 38%. Im Gegenzug dazu verringert sich die Anzahl an einzeln auftretenden
Protein-Aggregaten (Piccolo 18%, Bassoon 11% und RIBEYE lediglich 1%). Die Anzahl der
doppelmarkierten precursor spheres ändert sich dagegen kaum von P2 zu P6.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
26
Abbildung 14: Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE an den Tagen P2 und P4 in der NBL der wildtypischen Mausretina A, B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die NBL der wildtypischen Mausretina tripelgefärbt für Bassoon (blau) und Piccolo (grün) und RIBEYE (rot) zu den Entwicklungsstadien P2 (A) und P4 (B). Nicht alle precursor spheres beinhalten alle drei Proteine. In der Überlagerung der drei Kanäle sind einzeln markierte Aggregate, doppelmarkierte Aggregate, sowie Aggregate zu sehen, in denen alle drei Proteine enthalten sind (weiße Färbung). Am Tag P4 akkumulieren die precursor spheres in den zukünftigen Photorezeptor-Terminalien, der zukünftigen OPL. Auch zu diesem Zeitpunkt liegen noch nicht alle drei Proteine in einem gemeinsamen Komplex vor. NBL: neuroblast layer Größenbalken A: 10 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
27
Abbildung 15: Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE in precursor spheres der sich differenzierenden Photorezeptoren Manuelle Quantifizierung der Kolokalisation von Bassoon, Piccolo und RIBEYE anhand von Tripelfärbungen der NBL und OPL der wildtypischen Mausretina zu den Zeitpunkten P2, P4 und P6. Der Prozentsatz an Komplexen, die alle drei Proteine beinhalten, steigt von P2 zu P6 um fast das Doppelte von 20% auf 38%. Einzeln vorkommende Proteine werden dagegen seltener. Die Anzahl an doppelmarkierten precursor spheres ändert sich kaum von P2 zu P6.
Die Tripelfärbungen zeigen, dass es weniger einzeln transportierte Proteine zu geben scheint,
als die mit dem Computerprogramm ausgewerteten Doppelfärbungen vermuten ließen. So
sind es nach der manuellen Auswertung der Tripelfärbungen lediglich 21% statt 42% der
Bassoon-Aggregate am Tag P2.
Offensichtlich wird der Zusammenbau der präsynaptischen Bänder während der
Photorezeptor-Synaptogenese nicht über einheitliche Transport-Komplexe vollzogen.
Vielmehr scheinen zu Beginn der Expression von Band-Proteinen einzelne Aggregate jedes
Proteins exprimiert zu werden, die teilweise erst bei der Ankunft im Terminal aggregieren,
sich zu einem großen Teil aber bereits auf dem Weg zum Terminal zusammenschließen.
Einige precursor spheres werden also bereits als vorgefertigte „Proteinpakete“ des
präsynaptischen Bandes transportiert.
.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
28
2.1.6 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes
Mäuse öffnen zwischen P12 und P14 ihre Augen. Zu diesem Zeitpunkt sollte daher der
präsynaptische Apparat der Photorezeptoren bereits funktionstüchtig sein. Nach der licht- und
elektronenmikroskopischen Charakterisierung der precursor spheres stellte sich als nächstes
die Frage, wie die weitere Ausbildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
vollzogen wird. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurde eine detaillierte
ultrastrukturelle Entwicklungsstudie durchgeführt.
Zunächst wurde in Ultradünnschnitten der Retina zwischen P4 und P14 in Photorezeptor-
Terminalien nach Strukturen in der Bandentwicklung gesucht, die Übergangsformen von den
precursor spheres zu stabförmigen Bändern darstellen könnten. Hierbei wurde gezielt auf
Stadien geachtet, in denen zwei oder mehrere precursor spheres miteinander fusionieren oder
in denen andere Formveränderungen der precursor spheres zu erkennen sind. Als solche
erwarteten wir früh in der Photorezeptor-Synaptogenese vermehrt auftretendes
keulenförmiges („club shaped“) Bandmaterial zu detektieren, das auf eine Streckung der
precursor spheres schließen ließe. Solche keulenförmigen Bandformen wurden beim Vorgang
des Abschnürens von Bandmaterial während der Lichtperiode des Tag / Nacht-Zyklus in
Albinomäusen des Mausstammes BALB/c beschrieben (Adly et al., 1999; Spiwoks-Becker et
al., 2004). Keulenfömiges Bandmaterial konnten wir jedoch während der Entwicklung des
Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes nur äußerst selten nachweisen (ohne Abbildung).
Zur detaillierteren Untersuchung der Bandentwicklung wurde daher eine quantitative Studie
durchgeführt, in der Bandmaterial-Strukturen zu den Zeitpunkten P4, P6, P10, P14, P35 und
>1 Jahr gezählt und analysiert wurden (n = 500 / Stadium). Repräsentative Bilder des
Photorezeptor-Bandmaterials zu den entsprechenden Altersstufen der Mausretina sind in
Abbildung 16A dargestellt. Wie bereits erwähnt finden sich in Zapfen-Terminalien häufig
mehrere precursor spheres, die in „ribbon fields“ angeordnet sind, wie sie in der Bassoon-
mutanten Mausretina beobachtet wurden (Dick et al., 2003). „Ribbon fields“ aus precursor
spheres konnten vor allem in den Stadien P4 und P6 detektiert werden.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
29
Abbildung 16: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in der wildtypischen Retina A: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Photorezeptor-Terminalien in der wildtypischen Mausretina zu den Zeitpunkten P4, P6, P10, P14, P35 und >1Jahr. Die Terminalien an den Tagen P4 und P6 sind vermutlich Zapfen-Terminalien. B: Quantifizierung der Photorezeptor-Bandmaterial-Formen unterteilt in die Kategorien precursor spheres (Kugel), unreif (frei; Quadrat) und reif (verankert; Dreieck) zu den Zeitpunkten P4, P6, P10, P14, P35 und >1Jahr. An den Tagen P4 und P6 dominieren precursor spheres. Bis P14 nimmt die Anzahl der precursor spheres ab und gleichzeitig steigt der Prozentsatz an verankerten Bändern. Um den Tag 35 ist der niedrigste Prozentsatz an precursor spheres zu verzeichnen. Dieser steigt jedoch in Photorezeptoren von >1 Jahr alten Mäusen wieder leicht an. Unreife Bänder erreichen ihre höchste Häufigkeit um den Tag P10. C: Tabellarische Darstellung der Quantifizierung des Photorezeptor-Bandmaterials aus (B), Angaben in % ± Standardabweichung (n = 2 Tiere). HZ: Horizontalzelle; BZ: Bipolarzelle Größenbalken A: 0,2 µm.
HZ
HZ
HZ HZ HZ
HZ
HZ
HZ
BZ
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
30
Ausgehend von den am häufigsten beobachteten Formen des Bandmaterials wurde eine
Klassifizierung in drei Kategorien vorgenommen: 1) precursor spheres, 2) unreife Bänder
(stabförmig und frei schwimmend) und 3) reife, verankerte Bänder (Bänder an der arciform
density / Plasmamembran, die mit mindestens zwei postsynaptischen Elementen assoziiert
sind).
Zu den frühen Zeitpunkten P4 und P6 dominieren precursor spheres in den sich
entwickelnden Photorezeptor-Terminalien (62% bzw. 54%, Abbildung 16B und C). Unreife
Bänder (30% / 32%) und verankerte Bänder (8% / 14%) sind an den Tagen P4 und P6 noch
selten. Von P4 zu P14 sinkt die Zahl der precursor spheres drastisch (7%), während der
Prozentsatz an verankerten Bändern stark zunimmt (73%). Der größte Anstieg im Prozentsatz
der verankerten Bänder konnte zwischen P10 und P14, dem Zeitpunkt der Augenöffnung,
verzeichnet werden. Obwohl die meisten Bandsynapsen zu diesem Zeitpunkt bereits gebildet
und funktionstüchtig sind, setzt sich die Bildung und Reifung der Bandsynapsen noch bis zur
fünften postnatalen Woche fort. Um den Tag P35 erreichen precursor spheres (1%) und
verankerte Bänder (91%) ihre adulte Häufigkeit. Bei Mäusen mit einem Alter von über einem
Jahr findet man wieder eine leichte Zunahme an precursor spheres in Photorezeptor-
Terminalien (Abbildung 16A, Pfeilkopf).
In Übereinstimmung mit der Zunahme an verankerten Bändern konnte eine Abnahme in der
Häufigkeit der unreifen Bänder mit einem Höhepunkt am Tag P10 (42%) beobachtet werden.
Interessanterweise scheint die Entwicklung der präsynaptischen Bänder mit ihrer
Verankerung an der Plasmamembran noch nicht abgeschlossen zu sein. Dies konnte mit einer
quantitativen Analyse der Länge verankerter Bänder gezeigt werden. Die Messdaten sprechen
dafür, dass die Bänder nach der Verankerung bis zur Augenöffnung noch signifikant an Größe
zunehmen. So wachsen die verankerten Bänder von 260 nm ± 21,4 nm (s.e.m.; n = 20) zum
Zeitpunkt P4 auf eine durchschnittliche Länge von 405 nm ± 14,2 nm (s.e.m.; n = 100) zum
Zeitpunkt P14.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
31
2.1.7 Die postnatale Expression von Proteinen des arciform density / Plasmamembran-
Kompartiments
Die bisher vorgestellten Daten zeigen, dass die CAZ-Komponenten Bassoon, Piccolo,
RIBEYE und vermutlich auch RIM1 während der Entwicklung des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes teilweise in „vorgefertigten“ Vorläuferstrukturen des
präynaptischen Bandes – den precursor spheres – zum zukünftigen Photorezeptor-Terminal
transportiert werden. Immunzytochemisch sind diese CAZ-Proteine ab dem Tag der Geburt
als punktierte Färbung in der NBL detektierbar und wurden deshalb in die Kategorie der
„früh detektierbaren“ Proteine eingestuft.
Eine detaillierte immunzytochemische Analyse der Expression von Komponenten des
arciform density / Plasmamembran-Kompartiments - Munc13, RIM2, CAST1 und die Ca2+-
Kanal-Untereinheit α1 - an vertikalen Gefrierschnitten der Mausretina zeigte ein
abweichendes zeitliches und räumliches Expressionsmuster.
Abbildung 17 zeigt beispielhaft die Expression von Munc13 detektiert mit einem pan-
Munc13-Antikörper in der Retina von P0 bis P14. In den Entwicklungsstadien P0 und P2 ist
die NBL noch frei von Immunfärbung, die IPL hingegen ist bereits vergleichsweise stark für
Munc13 gefärbt. Eine spezifische Markierung in der NBL ist erst ab dem
Entwicklungsstadium P4 mit der beginnenden Formation der OPL zu verzeichnen. Die
Färbung ist auf Höhe der sich entwickelnden OPL als schwach immunreaktives, diffuses
Band zu erkennen. An den darauf folgenden Tagen wandert auch die diffuse Markierung mit
der sich entwickelnden OPL zur Mitte der Retina - entsprechend der Immunfärbung der früh
detektierbaren Proteine Bassoon, Piccolo, RIBEYE und RIM1. Die Munc13-Färbung der
OPL behält jedoch bis zum Tag P14 ihren diffusen Charakter.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
32
Abbildung 17: Verteilungsmuster von Munc13 während der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina in den ersten zwei postnatalen Wochen gefärbt für Munc13. An den Tagen P0 und P2 ist noch keine Färbung in der NBL zu detektieren. Erst ab P4 erscheint auf Höhe der entstehenden OPL ein schwach diffus gefärbtes Band. Die Intensität dieser Färbung in der OPL erhöht sich nur leicht bis zum Tag P14. Auch bleibt die Färbung größtenteils diffus. Die IPL erscheint bereits ab dem Tag der Geburt vergleichsweise stark gefärbt und diese Färbung wird über den Zeitraum der Entwicklungsreihe zusehends strukturierter. Die größeren, stark fluoreszierenden Strukturen in der OPL und IPL ab dem Tag P8 sind Blutgefäße, die mit dem Sekundär-Antikörper mitgefärbt werden (Pfeilköpfe). NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer Größenbalken: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
33
Abbildung 18: Verteilungsmuster von CAST1, RIM2 und der Ca2+-Kanal α1-Untereinheit während der postnatalen Entwicklung in der wildtypischen Retina Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina an den Tagen P2, P4 und P6 gefärbt für die arciform density-Proteine CAST1, RIM2 und der Ca2+-Kanal α1 Untereinheit. Alle drei Proteine können erst am Tag P4 als schwach immunreaktives Band der entstehenden OPL detektiert werden. Zu keinem Zeitpunkt in der Entwicklung werden Transport-Strukturen in der NBL sichtbar. Dies spricht für eine diffuse Verteilung der arciform density-Proteine bis zur Aggregation an der Synapse. NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer Größenbalken: 20 µm.
Abbildung 18 zeigt das mit Munc13 vergleichbare Expressionsmuster von CAST1, RIM2 und
der Ca2+-Kanal-Untereinheit α1 in vertikalen Retinaschnitten zu den Zeitpunkten P0, P2, P4
und P6. Aufgrund der späteren Immundetektion der Komponenten des arciform density /
Plasmamembran-Kompartiments wurden diese in die Kategorie der „spät detektierbaren“
Proteine eingestuft.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
34
2.1.7.1 Der Transport von in vivo-markierten Munc13-2-Proteinen
Eine fehlende Immunfärbung bedeutet nicht zwangsläufig, dass ein bestimmtes Protein nicht
exprimiert wird. Vielmehr ist es denkbar, dass die Art und Weise wie ein Protein in der Zelle
vorliegt - beispielsweise diffus oder aggregiert – oder wie zugängig das Epitop für den
Antikörper ist, die Qualität der Markierung beeinflussen kann. Deshalb wurde hier bewusst
der Begriff „detektierbar“ gewählt. Um jedoch auszuschließen, dass eine nicht detektierbare
Färbung auf eine der oben genannten Ursachen zurückzuführen ist, konnte im Fall von
Munc13 zusätzlich auf transgene Mauslinien zurückgegriffen werden. Die Mäuse dieser
Linien exprimieren jeweils eine der bislang drei identifizierten Munc13-Proteine als
Fusionsprotein mit GFP (grün fluoreszierendes Protein, englisch: green fluorescent protein)
oder GFP-Derivaten und zeigen normale Synapsen-Morpholgie und Transmission (Kalla et
al., 2006). Obwohl die Munc13-Proteine in der Retina zu schwach exprimiert werden, um
über die direkte Fluoreszenz des GFP-Moleküls visualisiert zu werden, ist es dennoch
möglich, diese mit einer indirekten Immunfärbung des GFP-Anteils sichtbar zu machen
(Cooper et al., in Vorbereitung).
Von den bereits drei identifizierten Munc13-Proteinen ist Munc13-2 dasjenige, welches in
Photorezeptoren exprimiert und an deren Bandsynapsen lokalisiert ist (Cooper et al., in
Vorbereitung). In Tripelfärbungen mit Antikörpern gegen Bassoon, Piccolo und GFP an
vertikalen Retinaschnitten der transgenen Munc13-2-Maus sollte überprüft werden, ob
Munc13-2 tatsächlich nicht in Komplexen mit Proteinen des Bandkompartiments oder
Bassoon zu den zukünftigen Photorezeptor-Terminalien transportiert wird.
Eine solche Tripelfärbung zu den Zeitpunkten P2 und P4 ist in Abbildung 19 dargestellt.
Bassoon (blau) und Piccolo (rot) zeigen auch hier wieder eine punktierte Immunfluoreszenz
in der NBL zu beiden Zeitpunkten. Munc13-2 (grün) hingegen konnte auch in der transgenen
Maus am Tag P2 zumeist gar nicht oder nur diffus markiert werden. In dem vergrößerten
Ausschnitt der NBL wird jedoch deutlich, dass auch sehr vereinzelt schwach markierte
Munc13-2-Aggregate in der NBL nachweisbar sind. Treten diese auf, sind sie immer mit
Proteinen des Bandkompartiments kolokalisiert (weiße Färbung in der Überlagerung). Zum
Zeitpunkt P6 werden in der transgenen Mausretina mehrere punktförmige Munc13-2-
Markierungen in der OPL erkennbar, die mit Bassoon und Piccolo kolokalisieren. Diese
befinden sich zu diesem Zeitpunkt bereits in den zukünftigen Terminalien der
Photorezeptoren und stellen keine Transporteinheiten mehr dar. Daher kann davon
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
35
ausgegangen werden, dass der Großteil der Munc13-2-Proteine am Tag P2 noch diffus im
Zytoplasma vorliegt und erst bei der Ankunft der precursor spheres im Photorezeptor-
Terminal mit diesen aggregieren.
Abbildung 19: Transport von Munc13-2 während der Photorezeptor-Synaptogenese A, B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrier-schnitte durch die NBL und OPL einer Mausretina mit in vivo-markierten Munc13-2-Proteinen am Tag P2 (A) und P6 (B). Die Schnitte sind tripelgefärbt für Bassoon (blau), Piccolo (rot) und den GFP-Anteil des Munc13-2-Fusions-proteins (grün). Am Tag P2 zeigen Antikörper gegen Bassoon und Piccolo mehrere kolokalisierte Transport-Aggregate. Munc13-2 hingegen ist hauptsächlich diffus markiert. Vereinzelte, schwächer gefärbte Munc13-2-Aggregate sind immer mit Bassoon und Piccolo kolokalisiert (überlagerte Aus-schnittsvergrößerung). Am Tag P6 können in der OPL der in vivo-markierten Mausretina be-reits mehrere aggregierte Munc13-2-Markierungen detektiert werden, die auch zu diesem Zeitpunkt mit Bassoon und Piccolo kolokalisieren. Die in den Kästen gezeigten Bereiche der NBL sind in den unteren Bildern in höherer Vergrößerung dargestellt. NBL: neuroblast layer Größenbalken A: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
36
2.2 Die postnatale Entwicklung des präsynaptischen Bandes in Photorezeptoren
der Bassoon-mutanten Mausretina
Die bislang vorgestellten Daten zur Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
wurden in wildtypischen Mäusen des Stammes C57Bl6 gewonnen. Mit der Bassoon-mutanten
Maus stand mir eine transgene Maus zur Verfügung, der ein elementares CAZ-Protein des
Bandsynapsen-Komplexes fehlt. In Photorezeptoren der adulten Bassoon-mutanten Retina
sind die präsynaptischen Bänder nicht an der Plasmamembran verankert, sondern schwimmen
frei im Zytoplasma (Dick et al., 2003). Zur Klärung der Frage, ob die beobachteten freien
Bänder eine Folge der Degeneration einer zuvor intakten Synapse oder aber auf eine
Entwicklungsstörung zurückzuführen sind, führten Dick et al. (2003) eine ultrastrukturelle
Studie durch, in der sie die Anzahl der frei schwimmenden und verankerten Bänder in den
Photorezeptoren Bassoon-mutanter Retinae an den Tagen P10, P14, P35 und im adulten Tier
bestimmten. Aus der Tatsache, dass zu keiner Zeit eine nennenswerte Anzahl an verankerten
Bändern gefunden wurde, wurde auf eine Störung in der Bildung der Bandsynapse
geschlossen (Dick et al., 2003).
Mit Hilfe der gleichen Mauslinie sollte nun in der vorliegenden Arbeit der Frage
nachgegangen werden, wie das Fehlen von Bassoon die Expression und den Transport der
precursor spheres und damit die Entwicklung der Photorezeptor-Bandsynapse in der frühen
postnatalen Synaptogenese beeinflusst. Für diese Untersuchungen wurde zunächst eine
vergleichende Western Blot-Entwicklungsstudie von Proteinen der aktiven Zone zwischen
wildtypischer und Bassoon-mutanter Retina durchgeführt. Die anschließende
immunzytochemische Analyse wurde auf die „früh detektierbaren“ Proteine des
Bandkompartiments beschränkt, die im Wildtyp als precursor spheres transportiert werden
(RIBEYE, Piccolo und RIM1). Des Weiteren wurde auch für die Bassoon-mutante Retina
eine quantitative ultrastrukturelle Entwicklungsstudie durchgeführt.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
37
2.2.1 Western Blot-Analyse der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen in
der Bassoon-mutanten Retina im Vergleich zum Wildtyp
Für die vergleichende proteinbiochemische Analyse der wildtypischen und der Bassoon-
mutanten Retina während der Entwicklung wurden Retinahomogenate beider Mausstämme zu
den Zeitpunkten P0, P2, P4, P6, P8, P10, P14 und adult angefertigt. Je 25 µg der
wildtypischen und Bassoon-mutanten Proben wurden nebeneinander gelelektrophoretisch
aufgetrennt und auf eine Membran transferiert. Auf diese Weise konnten die relativen
Proteinkonzentrationen für Komponenten der aktiven Zone zwischen Wildtyp und Mutante
direkt miteinander verglichen werden. Abbildung 20 zeigt die Western Blot-Färbungen für
CAST1, Munc13, RIBEYE und Piccolo.
Abbildung 20: Vergleich der entwicklungsabhängigen Expression von Proteinen der aktiven Zone zwischen wildtypischer und Bassoon-mutanter Mausretina Die Markierung von CAST1 erfolgte mit dem CAST1-Antikörper, Munc13 wurde mit einem panMunc13-Antikörper gefärbt, RIBEYE mit dem Antikörper gegen CtBP2 und die Färbung von Piccolo erfolgte mit dem Piccolo44a-Antikörper (siehe 4.14). Die Proteine CAST1 und Munc13 sind sowohl in der wildtypischen als auch in der Bassoon-mutanten Retina als schwache Banden bereits am Tag der Geburt zu detektieren. Der Expressionsgrad steigt mit zunehmendem Alter. Die Proteinkonzentrationen zwischen den beiden Mausstämmen sind vergleichbar. RIBEYE ist in der Retina beider Mausstämme ab dem Tag P6 als Doppelbande markiert. In der wildtypischen Retina ist die schwere Isoform von RIBEYE in jedem Stadium stärker exprimiert als die leichte Isoform. In der Bassoon-mutanten Retina scheinen beide Isoformen bis P14 in etwa gleich stark exprimiert zu werden. Insgesamt ist die Proteinkonzentration von RIBEYE bis P14 in der Bassoon-mutanten Retina niedriger als im Wildtyp, im adulten Alter gleichen sich die Proteinkonzentrationen jedoch an. Piccolo ist erst ab dem Tag P8 in der Retina beider Mausstämme als schwach markierte Doppelbande zu detektieren. Ab P14 ist ein deutlicher Unterschied in der Proteinkonzentration zwischen Wildtyp (höhere Konzentration) und Bassoon-Mutante (niedrigere Konzentration) zu verzeichnen, der bis ins adulte Alter bestehen bleibt. WT: Wildtyp; MT: Mutante; kDa: Kilo-Dalton
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
38
CAST1 und Munc13 lassen sich sowohl in der wildtypischen Retina als auch in der Bassoon-
mutanten Retina bereits am Tag der Geburt detektieren. Bei beiden Mausstämmen ist in den
Retinahomogenaten eine vergleichbare Menge an Proteinen vorhanden und die Bandenstärken
nehmen mit fortschreitendem Differenzierungsgrad der retinalen Neuronenklassen stetig zu.
In ihrer Expression verändert sind RIBEYE und Piccolo, die beide im Bandkompartiment der
adulten Photorezeptor-Bandsynapse vorliegen und in der frühen postnatalen Retina als
precursor spheres zum Photorezeptor-Terminal transportiert werden. Beide Proteine
exprimieren in der Retina zwei Isoformen, die in der Western-Blot-Analyse in je zwei
immunreaktiven Banden ab dem Stadium P6 / P8 detektiert werden. Die
Proteinkonzentrationen sowohl von RIBEYE als auch von Piccolo sind während der
Retinogenese in der Bassoon-mutanten Mausretina deutlich geringer als im Wildtyp. Dies
bleibt bei Piccolo bis ins adulte Alter der Bassoon-mutanten Maus der Fall, während sich die
Konzentrationen von RIBEYE zwischen den beiden Mausstämmen im adulten Alter
angleichen.
An dieser Stelle soll erwähnt werden, dass die Proteine RIBEYE und Piccolo
immzytochemisch bereits ab dem Tag der Geburt detektiert, in Western Blot-Analysen jedoch
erst später sichtbar gemacht werden können. Offensichtlich liegt die Expressionsstärke der
Proteine bis zum Zeitpunkt P4 / P6 unterhalb der Detektionsgrenze für Western Blot-
Analysen von Retinahomogenaten. Zudem ist gerade Piccolo mit einem hohen
Molekulargewicht von über 500 kDa gelelektrophoretisch schlecht auftrennbar.
Die Ergebnisse lassen vermuten, dass das Fehlen eines funktionstüchtigen Bassoon-Proteins
keine Auswirkung auf die Expression der untersuchten Proteine des arciform density /
Plasmamembran-Kompartiments (CAST1 und MUNC13) hat. Auf die Expressionsstärke von
Proteinen des Bandkompartiments scheint das Fehlen von Bassoon-Protein jedoch bereits im
frühen Alter der Retina einen Einfluß zu haben. Im Folgenden sollte immunzytochemisch
untersucht werden, wie sich dies im Gewebe widerspiegelt.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
39
2.2.2 Immunzytochemische Untersuchung von RIBEYE, Piccolo und RIM1 während
der postnatalen Entwicklung in der Bassoon-mutanten Retina
Für die immunzytochemische Untersuchung der entwicklungsabhängigen Expression von
RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten Retina wurden wie für die Western-
Blot-Analyse die Entwicklungsstadien P0, P2, P4, P6, P8, P10, P12 und P14 untersucht.
Abbildung 21 zeigt exemplarisch die Färbung von RIBEYE an vertikalen Gefrierschnitten der
Bassoon-mutanten Retina. Im Vergleich zu den Markierungen im Wildtyp fallen drei Punkte
besonders auf:
1) RIBEYE lässt sich in frühen postnatalen Stadien (P0-P4) in der NBL nicht als
punktförmige Aggregate detektieren. Der früheste Zeitpunkt einer spezifischen Markierung ist
P6. In diesem Stadium färbt der Antikörper gegen RIBEYE vereinzelte, punktförmige
Aggregate in der sich bereits entwickelnden OPL. Das Verteilungsmuster der einzelnen
Punkte in der OPL läßt vermuten, dass es sich hierbei um Bandmaterial in sich entwickelnden
Zapfen-Terminalien handelt.
2) Die Dichte und Intensität der RIBEYE-markierten fluoreszierenden Aggregate in den
potentiellen Zapfen-Terminalien nimmt von P6 bis P14 in der Bassoon-mutanten Retina leicht
zu, bleibt aber deutlich schwächer als im Wildtyp. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen,
dass in den Photorezeptoren Bassoon-mutanter Retinae RIBEYE in einer wesentlich
geringeren Proteinkonzentration vorhanden ist, was die Western Blot-Analysen bereits
angedeutet haben. Neben diesen relativ stark fluoreszierenden RIBEYE-Aggregaten in der
OPL ist das stete Hinzukommen kleinerer, schwach markierter Aggregate auffällig. Diese
spiegeln vermutlich Bandmaterial in den sich später differenzierenden Stäbchen-Terminalien
wider.
3) Die RIBEYE-Aggregate in der OPL der Bassoon-mutanten Retina nehmen bis P14 und
darüber hinaus (Dick et al., 2003) nicht die typische Sichelform an, wie man sie in den
Terminalien der wildtypischen Stäbchen-Photorezeptoren findet, sondern bleiben
punktförmig.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
40
Abbildung 21: Verteilungsmuster von RIBEYE während der postnatalen Entwicklung in der Bassoon-mutanten Retina Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die Bassoon-mutante Mausretina in den ersten zwei postnatalen Wochen markiert mit einem Antikörper gegen CtBP2. Am Tag der Geburt ist noch keine spezifische RIBEYE-Markierung zu detektieren. Eine spezifische Färbung von RIBEYE wird zum ersten Mal am Tag P6 in der OPL beobachtet. Die Färbung ist punktförmig und weist eine sehr geringe Dichte auf. Die Intensität und Dichte der OPL-Färbung nimmt bis P14 zu, bleibt jedoch weiterhin punktförmig (Ausschnittsvergrößerung zum Zeitpunkt P14). Eine nennenswerte synaptische Markierung der IPL ist erst am Tag P14 zu detektieren. Die Kernfärbungen, die vor allem in der INL sichtbar werden, sind auf die Markierung des Transkriptionsfaktors CtBP2 zurückzuführen. NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer Größenbalken: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
41
Das zeitliche und räumliche Expressionsmuster von RIM1 ist mit der RIBEYE-Färbung
vergleichbar (ohne Abbildung). Piccolo hingegen kann auch in der Bassoon-mutanten Retina
zum frühen Zeitpunkt P2 als immunfluoreszierende Aggregate in der NBL markiert werden
(Abbildung 22). Im Vergleich zu der Piccolo-Färbung im Wildtyp ist in der NBL der
Bassoon-mutanten Retina sowohl die Anzahl als auch die Intensität der fluoreszierenden
Aggregate geringer.
2.2.2.1 Kolokalisationstudie von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten
Retina zum Zeitpunkt P6
Trotz des Fehlens von Bassoon sind auch in der Bassoon-mutanten Retina die Proteine
RIBEYE, Piccolo und RIM1 des Bandkompartiments in adulten Photorezeptor-Terminalien
kolokalisiert (tom Dieck et al., 2005). Die geringere oder auch teilweise fehlende
immunzytochemische Detektion von precursor spheres in der NBL der Bassoon-mutanten
Retina ließ die Frage aufkommen, ab welchem Stadium die Proteine des Bandkompartiments
erstmals in einem gemeinsamen Komplex vorliegen. Zur Klärung dieser Frage wurde die
Kolokalisation der Proteine am Tag P6 untersucht, da dies der früheste gemeinsame Zeitpunkt
einer spezifischen Färbung der drei Proteine RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der OPL ist.
Abbildung 23 zeigt eine Tripelfärbung von RIBEYE (rot), Piccolo (grün) und RIM1 (blau) in
der OPL der Bassoon-mutanten Retina zum Zeitpunkt P6. Die Überlagerung der drei Kanäle
zeigt eine deutliche Kolokalisation der drei Proteine vor allem in den größeren Aggregaten
der potentiellen Zapfen-Terminalien (weiße Färbung). Dies lässt vermuten, dass zwar die
Bildung der precursor spheres und die frühzeitige Aggregation der Proteine des
Abbildung 22: Verteilungsmuster von Piccolo in der NBL der Bassoon-mutanten Mausretina Konfokale Laserscanning-Auf-nahmen der NBL der wildtypischen und Bassoon-mutanten Mausretina zum Zeitpunkt P2 gefärbt mit einem Antikörper gegen Piccolo. Im Vergleich zum Wildtyp ist die Dichte und Intensität der punktförmigen Piccolofärbung in der Bassoon-mutanten NBL geringer. NBL: neuroblast layer WT: Wildtyp; MT: Mutante Größenbalken: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
42
Bandkompartiments beeinträchtigt ist, nicht jedoch der Transport der einzelnen Proteine zu
den Photorezeptor-Terminalien. Dieser scheint jedoch im Vergleich zur wildtypischen Retina,
in der precursor spheres bereits am Tag P4 in Photorezeptor-Terminalien zu finden sind, in
der Bassoon-mutanten Retina mit ein bis zwei Tagen Verzögerung vollzogen zu werden.
Abbildung 23: Kolokalisation von RIBEYE, Piccolo und RIM1 in der Bassoon-mutanten OPL zum Zeitpunkt P6 Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines vertikalen Gefrierschnitts durch die OPL der Bassoon-mutanten Mausretina zum Zeitpunkt P6 tripelgefärbt für RIBEYE (rot), Piccolo (grün) und RIM1 (blau). Die drei Proteine sind größtenteils in punktförmigen Aggregaten in der OPL kolokalisiert (weiße Färbung in der Überlagerung, Pfeilköpfe). Diese sind vermutlich in sich entwickelnden Zapfen-Terminalien lokalisiert. Neben den größeren punktförmigen Aggregaten sind mehrere kleine Aggregate zu erkennen, die vermutlich Stäbchen-Terminalien zuzuordnen sind. OPL: outer plexiform layer Größenbalken: 10 µm.
Um zu klären, ob es sich bei den stärker fluoreszierenden Aggregaten in der OPL tatsächlich
um Bandmaterial in sich entwickelnden Zapfen-Terminalien handelt, wurden vertikale
Gefrierschnitte der Mausretina zum Zeitpunkt P6 mit Antikörpern gegen Piccolo (magenta)
und Glycogenphosphorylase (grün) markiert (Abbildung 24). Glycogenphosphorylase wird in
der Retina hauptsächlich von Zapfen-Photorezeptoren exprimiert und eine Färbung mit einem
Antikörper gegen das Enzym färbt die gesamte Zelle einschließlich ihrer Axone und
Terminalien (Nihira et al., 1995). Deutlich sind punktförmige Piccolo-Aggregate in den
Zapfen-Terminalien zu erkennen (weiße Färbung in der Überlagerung). Vereinzelt lassen sich
jedoch auch wesentlich kleinere punktförmige Piccolo-Markierungen außerhalb der Zapfen-
Terminalien detektieren, die daher den Stäbchen-Bandsynapsen zuzuordnen sind (Abbildung
24, Pfeilköpfe in der Ausschnittsvergrößerung). Die relative Größe der punktförmigen
Färbung in den Zapfen-Terminalien lässt vermuten, dass es sich hierbei um Anhäufungen von
precursor spheres, beziehungsweise um Felder von mehreren Bändern = „ribbon fields“
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
43
(Dick et al., 2003) handelt, die mit konventioneller Fluoreszenzmikroskopie nicht als einzelne
Strukturen aufgelöst werden können.
Die Ergebnisse lassen vermuten, dass das Fehlen von Bassoon keine Auswirkungen auf den
Transport der Proteine RIBEYE, Piccolo und RIM1 per se hat. Immunzytochemisch konnten
precursor spheres während der Photorezeptor-Synaptogenese in der Bassoon-mutanten Retina
nur mit Antikörpern gegen Piccolo beobachtet werden. Diese waren zudem schwächer
fluoreszierend und scheinbar kleiner als im Wildtyp. Darüber hinaus scheint auch der zeitliche
Ablauf des Transports in der Bassoon-mutanten Retina verzögert zu sein. Wie sich das Fehlen
von Bassoon während der Photorezeptor-Synaptogenese auf ultrastruktureller Ebene auswirkt,
sollte in einer quantitativen elektronenmikroskopischen Analyse untersucht werden.
2.2.3 Elektronenmikroskopische Entwicklungsstudie zur Bildung des Photorezeptor-
Bandes in der Bassoon-mutanten Mausretina
Wie bei der quantitativen ultrastrukturellen Analyse im Wildtyp wurde auch in der Bassoon-
mutanten Mausretina zur Analyse der Bandmaterialformen eine Klassifizierung in die
folgenden drei Kategorien vorgenommen: 1) precursor spheres, 2) unreife Bänder (frei
schwimmend und stabförmig) und 3) verankerte Bänder (Bänder an der arciform density /
Plasmamembran, assoziiert mit mindestens zwei postsynaptischen Elementen).
Abbildung 24: Lokalisation von Piccolo-Aggregaten in Photo-rezeptoren der Bassoon-mutanten Retina zum Zeitpunkt P6 Konfokale Laserscanning-Auf-nahme eines vertikalen Gefrier-schnitts durch die Bassoon-mutante Mausretina zum Zeitpunkt P6 doppelgefärbt für Piccolo (magenta) und Glycogenphosphorylase (gün). Am Tag P6 befinden sich stark fluoreszierende Piccolo-Aggregate vor allem in Zapfen-Terminalien. Vereinzelt sind auch außerhalb der Zapfen-Terminalien kleinere, schwächer markierte Piccolo-Aggregate detektierbar, die vermutlich Stäbchen-Terminalien zuzuordnen sind (Pfeilköpfe). Der im Kasten gezeigte Bereich der OPL ist in den rechten Bildern in höherer Vergrößerung dargestellt. Größenbalken: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
44
Lichtmikroskopisch läßt sich in der Bassoon-mutanten Retina eine Kolokalisation von
RIBEYE, Piccolo und RIM1 ab dem Tag P6 als punktförmige Färbung in den Zapfen-
Terminalien detektieren. Obwohl die Stadien P4 und P6 in die ultrastrukturelle Analyse der
Bassoon-mutanten Retina mit einbezogen wurden, erfolgte eine Identifizierung von
elektronendichtem Bandmaterial erst zum Entwicklungszeitpunkt P10.
Abbildung 25A zeigt repräsentative Bilder des Bandmaterials in Zapfen-Terminalien zu den
entsprechenden Altersstadien der Retina. Auffällig sind hier die bereits erwähnten „ribbon-
fields“, die zu jedem Zeitpunkt in den Bassoon-mutanen Zapfen-Terminalien zu finden sind
(P10, P14, P35 und >1 Jahr). Diese entsprechen also in der Tat den lichtmikroskopisch
detektierbaren stärker fluoreszierenden Punkten in der OPL, die mit konventioneller
Laserscanning-Mikroskopie nicht höher aufgelöst werden können.
Am Tag P10 enthält die Bassoon-mutante Retina 39% precursor spheres (Abbildung 25B und
C). Dies sind 14% mehr als in der wildtypischen Retina zu diesem Zeitpunkt. Der Prozentsatz
an precursor spheres sinkt in den Photorezeptor-Terminalien der Bassoon-mutanten Retina
bis zum Tag der Augenöffnung (P14) auf 17%, steigt danach jedoch wieder drastisch an.
Bereits mit P35 macht der Anteil an precursor spheres 54% aus.
Überraschenderweise fiel bei der quantitativen Analyse der Bandmaterialformen im
Entwicklungsstadium P10 auf, dass entgegen der Erwartung ein relativ hoher Prozentsatz an
unreifen – also stabförmigen – Bandmaterial-Strukturen zu verzeichnen war (60%). Am Tag
P14 ist der größte Anteil an unreifen Bändern zu beobachten (82%). Unreife Bänder werden
jedoch offensichtlich nicht an der Plasmamembran verankert, da zu keinem der untersuchten
Zeitpunkte eine nennenswerte Anzahl an reifen, verankerten Bändern zu detektieren ist. Der
maximale Prozentanteil an verankerten Bändern findet sich am Tag P35 mit 2%. Dieser
Befund stimmt mit den lichtmikroskopischen Daten überein, dass präsynaptisches
Bandmaterial in der OPL der Bassoon-mutanten Mausretina punktförmig bleibt und nie die
typische Sichelform adulter, wildtypischer Bänder annimmt.
Diese Beobachtung unterstützt die Theorie von Dick et al. (2003) über die Aufgabe von
Bassoon an der Photorezeptor-Bandsynapse, die eine physikalische Verbindung des
präsynaptischen Bandes mit der aktiven Zone beinhaltet. Darüber hinaus stimmt sie mit der
Annahme überein, dass der Phänotyp der Bassoon-mutanten Retina die Folge einer
Entwicklungsstörung und nicht einer Degeneration der intakten Synapse ist (Dick et al.,
2003).
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
45
Abbildung 25: Ultrastrukturelle Entwicklungsstudie zur Bildung der Photorezeptor-Bandsynapse in der Bassoon-mutanten Retina A: Repräsentative elektronenmikroskopsiche Aufnahmen von Zapfen-Terminalien in der Basoon-mutanten Mausretina zu den Zeitpunkten P10, P14, P35 und >1Jahr. B: Quantifizierung der Photorezeptor-Bandmaterial-Formen unterteilt in die Kategorien precursor spheres (Kugel), unreif (frei; Quadrat) und reif (verankert; Dreieck) zu den Zeitpunkten P10, P14, P35 und >1Jahr. Am Tag P10 enthält die Bassoon-mutante Retina 39% precursor spheres und 60% unreife Bänder. Precursor spheres erreichen am Tag P14 ihren niedrigsten Prozentsatz mit 17%. Der Prozentsatz steigt danach jedoch wieder stark an. Am Tag P14 ist der größte Anteil an unreifen Bändern zu beobachten. Unreife Bänder werden jedoch offensichtlich nicht verankert, da zu keinem der untersuchten Zeitpunkte eine nennenswerte Anzahl an reifen, verankerten Bändern zu verzeichnen ist. C: Tabellarische Darstellung der Quantifizierung der Photorezeptor-Bandmaterial-Formen aus (B), Angaben in %. Größenbalken A: 0,2 µm.
Der Durchmesser der precursor spheres in der Bassoon-mutanten Mausretina beträgt 117 nm
± 27 nm (Standardabweichung; n = 113, gemessen bei P10 und P14). Diese sind somit im
Durchschnitt 12 nm kleiner als die precursor spheres in der wildtypischen Mausretina.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
46
2.3 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse
Photorezeptor-Bandsynapsen sind auf tonische Transmitterausschüttung spezialisiert. Bei
dieser funktionellen Anpassung spielt die Ausbildung des präsynaptischen Bandes in den
Photorezeptor-Terminalien eine zentrale Rolle. Das präsynaptische Band ist jedoch nicht das
einzige Charakteristikum, das Bandsynapsen von konventionellen chemischen Synapsen
unterscheidet. Von vielen präsynaptischen Proteinen, die ubiquitär am Aufbau chemischer
Synapsen beteiligt sind, werden an den Photorezeptor-Bandsynapsen spezifische Isoformen
exprimiert. Dies ist zum Beispiel bei den an der Regulation des SNARE-Komplexes
beteiligten Complexinen der Fall. Die spezifische Expression der Complexin-Isoformen 3 und
4 an den hochspezialisierten Photorezeptor-Bandsynapsen lässt vermuten, dass sie dort eine
wichtige, an die tonische Transmitterausschüttung angepasste, Funktion übernehmen. Zur
Untersuchung der Complexine 3 und 4 in der Retina wurden von Kerstin Reim (Max-Planck-
Institut für experimentelle Medizin, Göttingen) Complexin 3 und 4 Einzel-Knockout (KO)
und Complexin 3/4 Doppel-Knockout (DKO)-Mäuse generiert. In Kooperation mit Kerstin
Reim und Josef Ammermüller (Arbeitsgruppe Neurobiologie, Carl von Ossietzky Universität,
Oldenburg) wurde der funktionelle und morphologische retinale Phänotyp dieser Mäuse
analysiert.
2.3.1 Funktionsanalyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina
Die funktionellen Veränderungen in der Retina der Complexin 3 und 4 Einzel-KO und
Complexin 3/4 DKO-Mäuse wurde mit Elektroretinogrammen (ERGs) gemessen. Für die
Generierung eines ERGs wird die Retina im narkotisierten Tier mit kurzen Lichblitzen gereizt
und die gemessene Aktivität der Retina über die Zeit graphisch dargestellt. Somit kann das
ERG als licht-evoziertes Summenpotential aller retinalen Zellen, neuronal und nicht-neuronal,
verstanden werden. Das ERG besitzt mehrere „Wellen“, die den verschiedenen retinalen
Zellklassen zugeordnet werden können. Veränderungen in der Amplitude oder in der
zeitlichen Komponente einzelner Wellen können Aufschluß über mögliche neuronale
Übertragungsstörungen geben.
Im Vergleich zum Wildtyp zeigten die ERG-Messungen adulter Complexin 3-KO-Mäuse eine
unveränderte Amplitude, jedoch eine verlängerte Latenzzeit bis zum Maximum der b-Welle.
Da die b-Welle hauptsächlich die Aktivität der ON-Bipolarzellen widerspiegelt, deutet die
gemessene Veränderung darauf hin, dass in der Complexin 3-KO-Retina die Übertragung von
Photorezeptoren auf nachgeschaltete ON-Bipolarzellen beeinträchtigt ist (Reim et al., 2008;
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
47
eingereicht; ohne Abbildung). Die Veränderungen waren vor allem bei hohen
Lichtintensitäten zu beobachten, die das Zapfensystem reizen und somit in Einklang mit dem
Befund stehen, dass Complexin 3 vor allem an den Bandsynapsen der Zapfen exprimiert wird
(Reim et al., 2005). Die Deletion von Complexin 4 in den Einzel-KO-Mäusen bewirkt kaum
eine Veränderung in der Übertragung von den Photorezeptoren auf die ON-Bipolarzellen. Im
ERG konnte lediglich eine geringe Reduktion der b-Wellen-Amplitude verzeichnet werden,
jedoch nur bei sehr niedrigen Lichtintensitäten. Dies stimmt mit dem immunzytochemischen
Befund überein, nach dem Complexin 4 vorwiegend an den Bandsynapsen der Stäbchen zu
detektieren ist (Reim et al., 2005).
Das Fehlen beider Complexin-Isoformen in der DKO-Retina hingegen hat stärkere
Veränderungen in fast allen Komponenten des ERGs zur Folge. So war in der
doppeldefizienten Retina sowohl die Amplitude der b-Welle signifikant reduziert, als auch die
Latenzzeit bis zum Maximum der b-Welle bei allen Lichtintensitäten verlängert. Teilweise
sind diese Veränderungen nicht nur auf eine Addition der Effekte der beiden Deletionen
zurückzuführen. Vielmehr ist ein kooperativer Effekt der beiden Complexin-Isoformen
denkbar (Reim et al., 2008; eingereicht).
2.3.2 Immunzytochemische Analyse der Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina
Aufgrund der gestörten Übertragung von Photorezeptoren auf nachgeschaltete Bipolarzellen,
was vor allem in der Complexin 3/4 DKO-Retina deutlich wurde, waren morphologische
Veränderungen in der Photorezeptor-Synapsenstruktur zu vermuten. Im Rahmen dieser
Doktorarbeit wurde der retinale Phänotyp der Mäuse licht- und elektronenmikroskopisch
analysiert. Für eine erste Grundcharakterisierung der retinalen Anatomie von Complexin 3
und 4 Einzel- und DKO-Mäusen wurden vertikale Gefrierschnitte der KO-Retinae im
Vergleich zum Wildtyp mit verschiedenen retinalen Zellmarkern gefärbt.
Abbildung 26 zeigt differentielle Interferenzkontrast (DIC)-Aufnahmen der vier Genotypen
(Abbildung 26A), Doppelmarkierungen von Horizontalzellen (anti-Calbindin, grün) und
Amakrinzellen (anti-Calretinin, magenta; Abbildung 26B) sowie Zapfen-Photorezeptoren
(anti-Peanut Agglutinin, grün) und Stäbchen- und Zapfen-Bipolarzellen (anti-CaB5, magenta;
Abbildung 26C). Alle Färbungen zeigen, dass die allgemeine retinale Anatomie der Einzel-
KO und der DKO-Mäuse mit der wildtypischen Retina vergleichbar ist. Weder ist eine
Veränderung in der Gewebedicke zu erkennen, noch ist die Schichtung oder die Morphologie
der einzelnen neuronalen Zellklassen auffällig beeinträchtigt.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
48
2.3.3 Analyse der Bandsynapsen-Struktur in Photorezeptoren der Complexin 3 und 4
Einzel- und DKO-Retina
Der synaptische Phänotyp von Photorezeptoren adulter Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-
Retinae wurde zunächst anhand von immunzytochemischen Tripelfärbungen für drei Proteine
des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes – Bassoon, RIBEYE und Piccolo – untersucht.
Anhand dieser Färbungen konnte in der OPL der Einzel-KO-Retinae kein Unterschied im
Vergleich zur wildtypischen Retina gefunden werden (ohne Abbildung). In der OPL der
DKO-Retina jedoch zeigten sich auffällige Veränderungen: Insgesamt erschien die Struktur
der OPL ungeordneter als im Wildtyp (Abbildung 27A und B). Darüber hinaus zeigten
fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen mit hoher Vergrößerung in der OPL der DKO-Retina
deutlich punktförmige Ablösungen des Bandmaterials. Bassoon, das Ankerprotein zwischen
dem präsynaptischem Band und der Plasmamembran (grün), scheint von der Ablösung nicht
betroffen zu sein (Ausschnittsvergrößerung, Abbildung 27B).
Abbildung 26: Vergleich der Anatomie und neuronalen Morphologie zwischen wild-typischer und Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retina Die vier Genotypen zeigen vergleichbare neuronale Morpholgie. A: Differentielle Interferenzkontrast-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische (WT) und Complexin 3 und 4 Einzel- und DKO-Retinae. B, C: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte der Retinae aus (A) doppelgefärbt für verschiedene retinale Neuronen-klassen: Horizontalzellen (grün) und Amakrinzellen (magenta; B) sowie Zapfen-Photorezeptoren (grün) und Stäbchen- und Zapfen-Bipolarzellen (magenta; C). WT: Wildtyp; Cplx: Complexin; KO: Knockout; DKO: Doppel-Knockout; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer; PNA: peanut agglutinin; CaB5: calcium binding protein 5 Größenbalken A: 20 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
49
Für eine genauere Analyse der lichtmikroskopischen Befunde wurden Photorezeptor-
Terminalien der verschiedenen Mausstämme elektronenmikroskopisch untersucht. Bei der
Analyse der Complexin 3 und 4 Einzel-KO-Retinae zeigte auch die elektronen-
mikroskopische Untersuchung keine sichtbare Veränderung der Photorezeptor-Bandsynapsen-
Struktur. Die Untersuchung der Photorezeptor-Terminalien der DKO-Mäuse bestätigte den
lichtmikroskopischen Befund: In einigen Terminalien konnten einzelne bis mehrere runde,
elektronendichte Strukturen detektiert werden, die von einer Vesikelreihe umgeben sind und
somit Ähnlichkeiten mit den während der Photorezeptor-Synaptogenese auftretenden
precursor spheres aufweisen (Abbildung 27E).
Eine quantitative Analyse ergab, dass die beobachteten sphärischen Strukturen (= spheres) in
24% ± 6% (Standardabweichung, n = 343) der Photorezeptor-Terminalien der DKO-Mäuse
auftreten, in wildtypischen Mäusen des gleichen Alters jedoch nur in 1% ± 0% der
Photorezeptor-Terminalien (Standardabweichung, n = 290; Abbildung 27F). Dieser
signifikant erhöhte Prozentsatz an spheres (p < 0,02) in der DKO-Retina repräsentiert
möglicherweise Abbauprodukte des Bandsynapsen-Komplexes. Seltener fanden sich
keulenartige Bandmaterialformen, die für einen gerade einsetzenden degenerativen
Ablösungsprozeß von Bandmaterial sprächen (Abbildung 27D).
Lediglich 40% ± 13% (s.d., n = 343) der Photorezeptor-Terminalien in DKO-Retinae
enthalten intakte, verankerte Bänder (Abbildung 27C) im Gegensatz zu 59% ± 8%
(Standardabweichung, n = 290) in der wildtypischen Retina. Der Prozentsatz an Terminalien
ohne Bandmaterial ist vergleichbar zwischen wildtypischer Retina (40% ± 8%;
Standardabweichung, n = 290) und Complexin 3/4 DKO-Retina (36% ± 9%;
Standardabweichung, n = 343).
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
50
Abbildung 27: Degenerierte Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexe in der Complexin 3/4 DKO-Retina
A, B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen vertikaler Gerfierschnitte durch die OPL der adulten wildtypischen (WT, A) und Complexin 3/4 Doppel-Knockout (DKO)-Retina (B) tripelgefärbt für Bassoon (grün), RIBEYE (rot) und Piccolo (blau) mit Ausschnittsvergrößerungen der weiß umrandeten Bereiche der OPL. Die OPL der DKO-Retina erscheint ungeordneter als im Wildtyp. In der DKO-Retina sind viele punktförmige Markierungen von RIBEYE und Piccolo in der OPL zu erkennen. C, D, E: Repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen von Photorezeptor-Terminalien der DKO-Retina mit intakter Bandynapse (C), verankertem, keulenförmigen Bandmaterial (D) und frei schwimmendem sphärischen Bandmaterial (spheres) mit Ausschnittsvergrößerung der spheres (E). Die Pfeilköpfe markieren das Bandmaterial. F: Quantifizierung des Anteils an verankerten Bändern (anchored ribbons), spheres und leeren Terminalien (empty) in Photorezeptoren der wildtypischen (dunkelgraue Balken) und der Complexin 3/4 DKO-Retina (hellgraue Balken). In der DKO-Retina ist ein signifikant erhöhter Prozentsatz an spheres zu verzeichnen. WT: Wildtyp; Cplx: Complexin; DKO: Doppel-Knockout; OPL: outer plexiform layer; Hc: horizontal cell; Bc: bipolar cell Größenbalken B: 20 µm, C-E: 0,2 µm.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
51
2.4 RNA Interferenz: Etablierung einer Methode zur funktionellen Untersuchung
von Proteinen des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
Das Generieren von transgenen Mäusen, bei denen ein Gen mutiert oder ganz ausgeschaltet
ist, ist inzwischen zwar eine zuverlässige, jedoch nach wie vor sehr zeitaufwändige und
kostspielige Methode, um eine Funktionsanalyse von Proteinen durchzuführen. Ein weiterer
Nachteil dieser Technik ist die Ungewissheit über die Lebensfähigkeit der gentechnisch
veränderten Mäuse, denen ein eventuell überlebenswichtiges Gen fehlt. Viele Knockout-Tiere
sterben schon vor oder direkt nach der Geburt. Aus diesen Gründen ist es von größter
Bedeutung, schnellere und einfachere Wege zum Knockdown eines oder mehrerer Gene und
deren Genprodukten in definierten Zellpopulationen zu etablieren, bei denen nicht der
gesamte Organismus verändert wird, sondern lediglich das zu untersuchende Gewebe oder
sogar nur einzelne Zelltypen.
Ein möglicher Ansatz ist das Ausschalten von Genprodukten mittels RNA Interferenz (RNAi,
englisch: RNA interference). RNAi ist ein hoch konservierter Mechanismus in eukaryotischen
Zellen, der sich vermutlich zur Abwehr viraler messenger RNA (mRNA) gebildet hat, jedoch
ebenso zur Degradierung anderer mRNA genutzt werden kann (Fire et al., 1998; Waterhouse
et al., 2001). Durch den spezifischen Abbau der mRNA eines gewünschten Gens wird das
Protein nicht mehr oder nur in sehr geringen Konzentrationen gebildet und der Effekt dieses
Fehlens kann in der Zelle oder dem Organismus untersucht werden. Für diesen Ansatz wird
eine kurze, doppelsträngige RNA von 21 bis 23 Nukleotiden benötigt, die homolog zur
Zielsequenz der zu degradierenden mRNA ist (Elbashir et al., 2001). Diese sogenannte short
interfering RNA (siRNA) wird dann von einem Enzymkomplex der Zelle dazu verwendet, die
endogene mRNA der Zelle abzubauen (Hammond et al., 2000; Hutvágner et al., 2001). Für
eine längerfristige Unterdrückung von Genen hat sich die Methode der Vektor-vermittelten
Expression von shRNA (englisch: short hairpin RNA) bewährt. Diese shRNA wird
intrazellulär enzymatisch zur wirksamen siRNA prozessiert.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
52
2.4.1 Die organotypische Explantkultivierung von Mausretina
In der vorliegenden Arbeit sollte die RNAi-Methode zum Knockdown von CAZ-Proteinen in
Photorezeptoren während der Retinogenese an organotypischen Retinakulturen getestet und
etabliert werden. Es existieren zwei Arten der organotypischen Retina-Kultivierung, die beide
ihre Vor- und Nachteile haben: Bei der organotypischen „Roller“-Kultur wird die noch
undifferenzierte Retina am Tag der Geburt oder früher ohne Pigmentepithel mit der
Photorezeptorseite nach unten auf einen Nitrozellulosefilter gezogen. Dieser wird auf einem
Deckgläschen befestigt und in ein Plastikröhrchen mit Kulturmedium überführt. Das
Röhrchen wird in einen Rotor eingesetzt, der sich bei 37°C langsam dreht. Diese Methode der
Kultivierung erzielte insgesamt sehr gute Erfolge in Bezug auf die Entwicklung der retinalen
Schichten und die maximale Dauer der Kultivierung (eigene Vorarbeiten, ohne Abbildung). In
Verbindung mit einem Eingriff in das System - wie zum Beispiel durch verschiedene
Transfektionsmethoden zum Einbringen von DNA in die Zellen – ist die Roller-Kultur
allerdings nur noch bedingt geeignet.
Aufgrund der genannten technischen Schwierigkeiten wurde eine andere Art der Kultivierung
gewählt, die organotypische „Explant“-Kultivierung. Bei der organotypischen Explant-
kultivierung von retinalem Gewebe wird die noch undifferenzierte Retina ebenfalls auf einen
Nitrozellulosefilter gezogen. Dieser verbleibt jedoch stationär in der Vertiefung einer
Plastikschale. Für den Gasaustausch wird die Retina nicht völlig mit Kulturmedium bedeckt,
sondern lediglich befeuchtet. Bei dieser Art der Kultivierung kann das Gewebe maximal drei
Wochen gehalten werden, wobei mit dem Beginn der zweiten Woche ex vivo eine deutliche
Abnahme in der Gewebedicke auf ein verstärktes Absterben der Neuronen hinweist. TUNEL-
Experimente, bei denen eine Anfärbung von degradierter DNA als Anzeichen für Apoptose
gewertet wird, zeigen eine vermehrte Kernfärbung bereits ab dem siebten Tag ex vivo (Reidel
et al., 2006).
Es wurde zunächst getestet, ob die Entwicklung der ex vivo Retina mit der in vivo Retina
vergleichbar ist. Dazu wurden Kulturretinae, die mit E18 in Kultur genommen wurden, nach
5, 7 und 17 Tagen ex vivo fixiert und lichtmikroskopisch analysiert. Abbildung 28 zeigt
differentielle Interferenzkontrast (DIC)-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte der ex vivo
Retinae, sowie Färbungen mit einem Antikörper gegen Bassoon.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
53
Abbildung 28: Die entwicklungsabhängige Expression von Bassoon in der ex vivo Retina A, B, C: Konfokale Laserscanning-Aufnahmen vertikaler Gefrierschnitte durch die wildtypische Mausretina nach 5 Tagen ex vivo (A), 7 Tagen ex vivo (B) und 17 Tagen ex vivo (C) gefärbt für Bassoon. Die DIC-Aufnahmen zeigen die Schichten der Retina zu den entsprechenden Entwicklungsstadien. Nach 5 Tagen ex vivo ist die IPL markiert und es sind deutlich immunfluoreszierende Bassoon-Aggregate in der NBL zu sehen. 2 Tage später kondensieren die Bassoon-Aggregate bereits in der sich entwickelnden OPL und nach 17 Tagen ex vivo konzentriert sich die Färbung für Bassoon auf die beiden plexiformen Schichten, die IPL und die OPL. Die räumliche und zeitliche Expression von Bassoon in der ex vivo Retina ist mit der in vivo Retina vergleichbar. In der ex vivo Retina bleibt die Bassoon-Markierung in den Photorezeptor-Terminalien jedoch punktförmig, wie die Ausschnittsvergrößerung der OPL in (C) zeigt. NBL: neuroblast layer; IPL: inner plexform layer; GCL: ganglion cell layer; ONL: outer nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; INL: inner nuclear layer Größenbalken: 20 µm.
Nach 5 Tagen ex vivo - einem Zeitpunkt, der dem Tag P2 in vivo entsprechen würde - läßt
sich in der kultivierten Retina eine Vielzahl an precursor spheres in der äußeren NBL
detektieren (Abbildung 28A). Vergleichbar mit der in vivo Retina werden die precursor
spheres auch in der kultivierten Retina innerhalb der nächsten Tage in die zukünftigen
Photorezeptor-Terminalien transportiert. Die sich entwickelnde OPL ist nach 7 Tagen ex vivo
in der Kulturretina ebenso deutlich erkennbar wie zum entsprechenden Stadium P4 in vivo.
Nach 17 Tagen in Kultur zeigt die DIC-Aufnahme der ex vivo Retina die bereits erwähnte
deutliche Reduktion in der Gewebedicke (Abbildung 28C). Die Ausschnittsvergrößerung der
Bassoon-Färbung zu diesem Zeitpunkt in der OPL lässt erkennen, dass die Bassoon-
Aggregate nun vollständig in der OPL kondensiert sind. Zu dem vergleichbaren
Entwicklungszeitpunkt in vivo (P14) finden sich bereits vereinzelt sichelförmige Strukturen,
die Bassoon-Aggregate in den Photorezeptor-Terminalien der ex vivo Retina haben jedoch
noch alle eine punktförmige Erscheinung. Dies ändert sich auch bei einer Erhöhung der
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
54
Kultivierungsdauer nicht (ohne Abbildung). Der Grund für die unvollständige Entwicklung
der Photorezeptor-Bandsynapsen in der kultivierten Retina ist noch unbekannt.
Auch elektronenmikroskopische Analysen der Photorezeptor-Terminalien von 17 Tage lang
kultivierter Mausretina zeigen nur sehr vereinzelt intakte Photorezeptor-Bandsynapsen, wobei
in den meisten Fällen keine vollständige Triade aus zwei Horizontalzell-Fortsätzen und einem
Bipolarzell-Fortsatz erkennbar ist (Abbildung 29A). Häufiger sind Terminalien mit unreifem,
also stabförmigem, aber freischwimmendem Bandmaterial zu beobachten (Abbildung 29B
und C). Die meisten Terminalien sind leer und zeigen keine erkennbaren elektronendichten
Strukturen, die auf Bandmaterial schließen lassen.
Abbildung 29: Präsynaptische Bänder in Photorezeptor-Terminalien der ex vivo Retina A, B, C: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Photorezeptor-Terminalien in der wildtypischen Mausretina nach 17 Tagen ex vivo mit unterschiedlichen Bandmaterial-Strukturen (Pfeilköpfe). Nur selten sind intakte, verankerte Bänder in Photorezeptor-Terminalien zu detektieren (A). Häufiger ist unreifes (frei schwimmendes und stabförmiges) Bandmaterial zu beobachten (B und C). HZ: Horizontalzelle Größenbalken C: 0,2 µm.
Insgesamt lässt sich sagen, dass die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes in Bezug auf das Auftreten der precursor spheres in der NBL und deren Transport
in die zukünftigen Photorezeptor-Terminalien in der ex vivo Mausretina mit der in vivo
Mausretina vergleichbar ist. Lediglich der letzte Schritt in der Synaptogenese - die
Verankerung der präsynaptischen Bänder an der arciform density - scheint stark beeinträchtigt
zu sein.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
55
2.4.2 Lentiviraler Gentransfer in die organotypische Retinakultur
Eine Schwierigkeit der RNAi-Methode ist die Einschleusung der shRNAs in die Zellen des
Zielgewebes. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden eine Reihe von gängigen und neu
entwickelten Transfektionsmethoden wie Elektroporation, Lipofektion und magnetvermittelte
Transfektion zum Einbringen von DNA in Neurone der sich entwickelnden retinalen Explant-
Kultur getestet. Neuronales Gewebe ist schwer zu transfizieren und keine der getesteten
Techniken führte zu einem zufriedenstellenden Ergebnis, was die Transfektionsrate betraf
(ohne Abbildung).
Eine Methode, die vor allem bei neuronalem Gewebe in den letzten Jahren immer mehr
Verwendung findet, ist die Einschleusung von DNA mit Hilfe von attenuierten Lentiviren.
Lentivirale Systeme haben mehrere Vorteile: Zum einen können mit ihnen besonders lange
Nukleotidsequenzen transportiert werden und zum anderen werden diese direkt in das Genom
der Wirtszelle integriert, so dass der Effekt einer spezifischen RNAi über einen langen
Zeitraum analysiert werden kann. Hinzu kommt, dass lentivirale Partikel auch
ausdifferenzierte Neuronen, also sich nicht mehr teilende Zellen, infizieren können.
Die Arbeitsgruppe von Professor Craig Garner (Department of Psychiatry and Behavior
Sciences, Stanford University, Kalifornien) – ein Kooperationspartner - erzielte mit einem
lentiviralen Drei-Vektoren-System gute Transfektionserfolge an primären dissoziierten
Hippocampus-Kulturen. Das Vektorensystem wurde mir für die vorliegende Arbeit zum
Testen in der Retinakultur freundlicherweise zur Verfügung gestellt (4.10).
Die Tansfektionseffizienz des lentiviralen Systems in der organotypischen retinalen
Explantkultur sollte zunächst mit eGFP-tragenden lentiviralen Partikeln (FUGW) getestet
werden. Abbildungen 30A und B zeigen eine wholemount-Präparation einer Kulturretina nach
8 Tagen ex vivo, die am Tag der Kultivierung (E18) mit FUGW transfiziert wurde. Zur
deutlicheren Sichtbarkeit der transfizierten Zellen wurde das wholemount-Präparat mit einem
Antikörper gegen GFP markiert. Die intrinsische Fluoreszenz des eGFP war aufgrund der
geringen Expression in den retinalen Neuronen zu schwach. Besonders im Randbereich der
Retina ist eine starke GFP-Markierung zu verzeichnen (Abbildung 30A). Der mit hoher
Vergrößerung aufgenommene Bereich aus der zentralen Region der transfizierten Kulturretina
aus (A) zeigt jedoch auch im Zentrum eine sehr hohe Dichte an transfizierten Zellen
(Abbildung 30B).
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
56
Abbildung 30: Lentiviraler Gentransfer in die ex vivo Retina A: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines wholemount-Prapärats der mit FUGW transfizierten Retina nach 8 Tagen ex vivo (A) gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP. Die Transfektion erfolgte am Tag E18. B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines zentralen Bereichs des wholemount-Prapärats aus (A). C: Quantifizierung der Neuronenklassen in der mit FUGW transfizierten ex vivo Retina. D: Laserscanning-Aufnahme eines vertikalen Gefrierschnitts durch die mit FUGW transfizierte Retina nach 8 Tagen ex vivo gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP. Größenbalken A: 500 µm, B und D: 50 µm.
In einem vertikalen Gefrierschnitt durch eine mit FUGW transfizierte Kulturretina gefärbt mit
einem Antikörper gegen GFP wird erneut deutlich, dass vor allem der Randbereich der Retina
transfiziert wird (Abbildung 30D). Darüber hinaus ist zu erkennen, dass nicht nur eine,
sondern alle Neuronenklassen (Photorezeptoren, Bipolarzellen, Ganglienzellen,
Amakrinzellen und Horizontalzellen) der Retina transfiziert werden. Eine quantitative
Analyse von 575 transfizierten Zellen anhand der Lage, Morphologie und Doppelfärbungen
mit zelltypspezifischen Markern ergab, dass den Hauptteil der transfizierten Neurone die
Photorezeptoren mit 58% ausmachen (Abbildung 30C). Wesentlich seltener werden
beispielsweise Bipolarzellen (8%) und Ganglienzellen (11%) transfiziert.
Die Zahl der transfizierten Photorezeptoren sinkt bereits bei einer Transfektion der ex vivo
Retina am Tag der Geburt und eine Transfektion mit zunehmendem Alter der Retina resultiert
in einem immer kleiner werdenden Prozentsatz an transfizierten Zellen (ohne Abbildung).
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
57
2.4.3 Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren der ex vivo Retina
Nachdem die Vorversuche zur lentiviralen Transfektion der organotypischen Retinakultur mit
FUGW den erwünschten Erfolg erzielten, war der nächste Schritt die Transfektion mit
shRNA-tragenden lentiviralen Partikeln. Die einfachste Möglichkeit, die RNAi-Technik für
Bandsynapsen-Proteine in Photorezeptoren zu etablieren, besteht im Knockdown eines
Proteins, dessen Funktion bereits untersucht und dessen Photorezeptor-Phänotyp bereits
beschrieben ist. Lentivirale Transfervektoren mit shRNA gegen Basoon-mRNA (FUGW
TS16), Piccolo-mRNA (FUGW TS28), sowie gegen beide mRNAs zusammen (FUGW DKD)
waren in der Arbeitsgruppe von Craig Garner (Department of Psychiatry and Behavior
Sciences, Stanford University, Kalifornien) vorhanden und wurden ebenfalls für diese Arbeit
zur Verfügung gestellt. Der retinale Phänotyp einer erfolgten Degradierung von Bassoon-
mRNA durch FUGW TS16 kann somit direkt mit dem Phänotyp der Bassoon-mutanten Maus
verglichen werden. Eine Piccolo-Knockout-Maus stand zu diesem Zeitpunkt noch nicht zur
Verfügung. Deshalb ist ein längerfristiges Ziel, die Auswirkung der Degradierung dieses zu
Bassoon homologen Proteins auf die Bildung und Funktion der Bandsynapse zu untersuchen,
sowie mit dem Doppelkonstrukt FUGW DKD den Phänotyp nach einem Doppel-Knockdown
beider Proteine zu analysieren.
2.4.3.1 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD im
heterologen System
Die Knockdown-Effizienz der verwendeten shRNAs wurde mit einem Luziferase Assay in
HEK293-Zellen bestimmt (4.9.3, Abbildung 31). Die Analyse ergab, dass die Einzel-
Konstrukte FUGW TS16 und FUGW TS28 eine sehr effiziente Degradierung der
entsprechenden mRNA bewirken (verbleibender gemittelter Prozentsatz an Bassoon-mRNA:
<1% und an Piccolo-mRNA: ~12%; n = 3).
Die gleichen shRNA-Sequenzen finden sich in dem Doppelkonstrukt FUGW DKD, welches
daher theoretisch beide Zielsequenzen ebenso effizient degradieren sollte. In der Praxis trifft
dies jedoch nur für die Bassoon-mRNA zu. Der verbleibende Prozentsatz an Bassoon-mRNA
beträgt wie bei dem Einzelkonstrukt <1%. Die Piccolo-mRNA wird hingegen nur annähernd
halb so effizient abgebaut wie mit dem Einzelkonstrukt (verbleibender gemittelter Prozentsatz
an Piccolo-mRNA: 22%; n = 3).
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
58
2.4.3.2 Die Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in
Photorezeptoren der ex vivo Retina
Die Knockdown-Effizienz im heterologen System lässt zwar eine recht zuverlässige
Einschätzung für andere Zellpopulationen zu, kann jedoch nicht direkt übertragen werden. In
einem nächsten Schritt musste daher die Knockdown-Effizienz in Neuronen der Retina
getestet werden. Leider war die Transfektionsrate der shRNA-tragenden lentiviralen Partikel
in der retinalen Explantkultur für eine Detektion der Knockdown-Effizienz auf Western Blot-
Ebene zu niedrig (ohne Abbildung). Der Nachweis einer mRNA-Degradierung fand aus
diesem Grund anhand von immunzytochemischen Färbungen in einzelnen Photorezeptoren
statt. Zu diesem Zweck wurden Retinae am Tag E18 mit den entsprechenden shRNA-
tragenden lentiviralen Partikeln transfiziert und für 8 beziehungsweise 18 Tage in Kultur
gehalten. Die anschließende Analyse erfolgte durch Doppel- beziehungsweise
Tripelfärbungen des Reporterproteins eGFP und der zu degradierenden Genprodukte an
vertikalen Gefrierschnitten der transfizierten Retina.
Abbildung 32 zeigt beispielhaft Aufnahmen von mit FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW
DKD transfizierten Photorezeptoren nach 8 Tagen ex vivo. Die fehlende Färbung des
entsprechenden Proteins in den Photorezeptor-Terminalien spricht für eine erfolgte
Degradierung der dazugehörigen mRNA. Der Anteil an Proteinen, die dennoch translatiert
werden, ist zu gering für eine immunzytochemische Detektion.
Abbildung 31: Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD in HEK293-Zellen Luziferase-Assay zur Bestimmung der Knockdown-Effizienz von FUGW TS16, FUGW TS28 und FUGW DKD. Die Balken entsprechen dem nach dem Abbau verbleibenden Anteil an mRNA. Die shRNA TS16 gegen Bassoon-mRNA ist am effektivsten, es bleibt ein Rest von <1%. Die shRNA TS28 degradiert etwa 88% der Piccolo-mRNA. Auffällig ist der deutlich schlechtere Abbau der Piccolo-mRNA durch dieselbe shRNA-Sequenz in dem Doppelkonstrukt DKD.
Ergebnisse ___________________________________________________________________________
59
Abbildung 32: Beispiele für einen erfolgten Knockdown von Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren der ex vivo Retina A, B, C: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme eines mit FUGW TS16 (shRNA gegen Bassoon-mRNA) transfizierten Photorezeptors (A), mehrerer mit FUGW TS28 (shRNA gegen Piccolo-mRNA) transfizierter Photorezeptoren (B) und eines mit FUGW DKD (shRNAs gegen Bassoon und Piccolo) transfizierten Photorezeptors in vertikalen Gefrierschnitten der ex vivo Retina doppel- oder tripelgefärbt für GFP (grün) und Bassoon (magenta in A / blau in C) und / oder Piccolo (magenta in B / rot in C). Die in den weißen Kästen gezeigten Photorezeptor-Terminalien sind in den rechten Bildern in höherer Vergrößerung dargestellt. In den gezeigten Terminalien ist eine Degradierung der entsprechenden mRNA erfolgt. Größenbalken A: 10 µm.
Eine Analyse der Knockdown-Effizienz der shRNAs in Photorezeptoren nach 8
beziehungsweise 18 Tagen ex vivo ergab, dass mit FUGW TS16 nach 8 Tagen ex vivo erst
etwas mehr als die Hälfte der analysierten Photorezeptor-Terminalien frei von Bassoon-
Färbung war (n = 8). Nach 18 Tagen ex vivo waren es bereits 10 von 11 Terminalien. Mit
FUGW TS28 waren nach 8 Tagen ex vivo die Hälfte der Photorezeptor-Terminalien frei von
Piccolo-Färbung (n = 16). Nach 18 Tagen ex vivo zeigten nur unwesentlich mehr eine
fehlende Piccolo-Färbung (8 von 13). Dies stimmt mit der besseren Knockdown-Effizienz von
FUGW TS16 im heterologen System überein. Offensichtlich erfordert die Degradierung im
retinalen Gewebe jedoch mehr Zeit als im heterologen System und ist auch nach 18 Tagen ex
vivo noch nicht vollständig erfolgt.
Aus dieser Analyse ausgeschlossen wurden Terminalien, in denen Bassoon- oder Piccolo-
mRNA nur teilweise degradiert wurde. Solche oft nur geringen Veränderungen in der
Proteinkonzentration im Vergleich zu untransfizierten Terminalien sind aus technischen
Gründen nur schwer messbar. Daher ist es denkbar, dass eine Degradierung der mRNAs in
einem höheren Prozentsatz der transfizierten Photorezeptoren stattfindet, als hier dargestellt
wurde.
Diskussion ___________________________________________________________________________
60
3 Diskussion Nervenzellen übertragen Informationen an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen.
Chemische Synapsen nutzen zur Informationsübertragung die regulierte vesikuläre
Ausschüttung von Transmittermolekülen, die von Rezeptoren der Postsynapse detektiert
werden. Der Transmittervesikel-Exozytoseprozeß vollzieht sich im präsynaptischen Terminal
an einem definierten Ort, der aktiven Zone, die den Ablauf der Transmitterfreisetzung
räumlich und zeitlich organisiert und somit eine zentrale Aufgabe in chemischen Synapsen
übernimmt.
Ein Modellsystem zur Untersuchung der Zusammensetzung, Struktur und Funktion der
aktiven Zone ist der Bandsynapsen-Komplex in Photorezeptoren der Retina. Die
Photorezeptor-Bandsynapse ist auf die tonische Ausschüttung des Transmitters Glutamat und
die Übertragung feinster graduierter Unterschiede in der Lichtintensität angepasst. Ein Ziel
dieser Dissertation war es, die Abfolge der Schritte und Protein-Interaktionen, die zu einem
funktionstüchtigen Bandsynapsen-Komplex führen, während der Photorezeptor-
Synaptogenese zu untersuchen. Desweiteren wurde die Funktion von zwei an der Regulation
der Transmitterausschüttung beteiligter Proteine, Complexin 3 und 4, in Photorezeptoren
untersucht. Es wurde außerdem eine Methode etabliert, die effiziente und zielgerichtete
funktionelle Eingriffe in Photorezeptoren möglich macht und dadurch in Zukunft zum
besseren Verständnis dieser hochkomplexen Synapse beitragen wird.
Diskussion ___________________________________________________________________________
61
3.1 Die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
Die Neubildung aktiver Zonen in konventionellen chemischen Synapsen erfolgt über 80 nm
große Transportvesikel, die „Piccolo-Bassoon-Transport-Vesikel“ (PTVs). Neben Piccolo und
Bassoon beinhalten sie ein Set an Proteinen der aktiven Zone und können über die
Fusionierung mit der präsynaptischen Plasmamembran zur schnellen Neubildung von
Synapsen führen.
Die komplex aufgebauten Photorezeptor-Bandsynapsen unterscheiden sich von
konventionellen chemischen Synapsen in mehreren Aspekten. Das auffälligste
morphologische Merkmal der Photorezeptor-Bandsynapse ist die Ausbildung des
präsynaptischen Bandes, eines elektronendichten Organells, welches von der aktiven Zone in
das Terminal reicht und mit hunderten von synaptischen Vesikeln besetzt ist (Sterling und
Matthews, 2005). Erst vor kurzem wurde der Nachweis erbracht, dass das synaptische Band
an der Transmitterfreisetzung beteiligt ist (Dick et al., 2003). Proteine am Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplex lassen sich räumlich in das Kompartiment des präsynaptischen
Bandes (RIBEYE, CtBP1, KIF3A, Piccolo und RIM1) und das Kompartiment der
darunterliegenden arciform density / Plasmamembran unterteilen (RIM2, Munc13, CAST1,
sowie eine Ca2+-Kanal-Untereinheit α1; tom Dieck et al., 2005). Das Verbindungsmolekül
zwischen den beiden Kompartimenten ist Bassoon (Dick et al., 2003).
Über den molekularen Zusammenbau des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes während
der Photorezeptor-Synaptogenese war bislang nur wenig bekannt (Dick et al., 2003; tom
Dieck et al., 2006) und wurde in meiner Dissertation detailliert untersucht. Doch läßt sich die
Entwicklung des Bandsynapsen-Komplexes in den zwei Photorezeptortypen, den Stäbchen
und den Zapfen, überhaupt miteinander vergleichen?
Ein großer Unterschied zwischen Stäbchen und Zapfen besteht in der Anzahl der exprimierten
präsynaptischen Bänder. Während Stäbchen nur ein einzelnes Band exprimieren, finden sich
in Zapfen – je nach Lokalisation in der Retina – 20 bis 50 individuelle Bänder (Haverkamp et
al., 2000; tom Dieck und Brandstätter, 2006). Desweiteren hat sich der retinale Stäbchen-
Signalweg in Säugern in der Evolution vermutlich auf einen bereits bestehenden Zapfen-
Signalweg aufgesetzt. Das Resultat ist, dass die Stäbchen-Bipolarzellen in den Zapfen-
Signalweg einmünden, so dass die gleichen Ganglienzellen sowohl beim photopischen
Zapfensehen als auch beim skotopischen Stäbchensehen benutzt werden (Smith et al., 1986;
Diskussion ___________________________________________________________________________
62
Strettoi et al., 1990). Die Differenzierung der evolutiv älteren Zapfen findet daher in der
Retinogenese zeitlich vor der Differenzierung der Stäbchen statt. Trotz dieser Unterschiede ist
die bisher identifizierte Proteinausstattung des Bandsynapsen-Komplexes in Stäbchen und
Zapfen die gleiche und die von mir gewonnenen Daten sprechen dafür, dass der Mechanismus
der Bildung des Bandsynapsen-Komplexes in Stäbchen und Zapfen ebenfalls miteinander
vergleichbar ist.
3.1.1 Proteine des Bandsynaspen-Komplexes werden während der Photorezeptor-
Synaptogenese auf zwei unterschiedliche Arten transportiert
Die Analyse der Veteilungsmuster verschiedener Proteine des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes in der Neuroblastenschicht (NBL) der frühen postnatalen Retina ergab eine
Einteilung der Proteine in zwei Kategorien. Die eine Kategorie beinhaltet Komponenten, die
immunzytochemisch bereits ab dem Stadium P0 deutlich in der NBL nachweisbar sind. Die
zweite Kategorie beinhaltet Proteine, die immunzytochemisch erst am Tag P4 zu detektieren
sind (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Die Proteine wurden deshalb in „früh
detektierbare“ und „spät detektierbare“ Proteine unterteilt. Eine ähnliche Einteilung wählten
Kriegstein und Schmitz (2003) für die Untersuchung des Expressionsmusters
membranassoziierter Synapsen-Proteine, bei der die untersuchten Proteine in früh und spät
exprimierte Komponenten getrennt wurden.
Die Kategorie der früh detektierbaren Proteine in der Entwicklung der Photorezeptor-
Bandsynapse bilden Proteine des Bandkompartiments adulter Photorezeptoren - RIBEYE,
Piccolo, RIM1 - sowie das Verbindungsmolekül zwischen dem Bandkompartiment und der
arciform density – Bassoon. Diese Proteine sind bereits am Tag der Geburt als Transport-
Aggregate in der NBL detektierbar und akkumulieren bis zum Tag P6 in den zukünftigen
Photorezeptor-Terminalien (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Zur Kategorie der spät
detektierbaren Proteine gehören Proteine des arciform density-Kompartiments – RIM2,
CAST1, Munc13-2 und die Ca2+-Kanal-Untereinheit α1. Diese Proteine können erst ab dem
Tag P4 als schwache und größtenteils noch diffuse Markierung in der sich entwickelnden
OPL detektiert werden (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht).
Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, dass die Proteine des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes während der Synaptogenese auf mindestens zwei unterschiedliche Arten
transportiert werden. Sobald die Proteine des Bandkompartiments in den Photorezeptor-
Diskussion ___________________________________________________________________________
63
Terminalien angelangt sind, kann auch die Aggregation der arciform density-Proteine an der
Plasmamembran beobachtet werden (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Vermutlich sind
daher die Zytomatrix-Proteine RIBEYE, Piccolo und Bassoon als Gerüstmoleküle für die
Verankerung von Proteinen des arciform density-Kompartiments und somit bei der Bildung
der arciform density von größter Bedeutung.
3.1.2 Precursor spheres: Die Transport-Aggregate von Zytomatrix-Proteinen des
präsynaptischen Bandes
Während der Photorezeptor-Synaptogenese werden Proteine des präsynaptischen Bandes -
RIBEYE, Piccolo, RIM1 - und das Ankerprotein Bassoon in Transport-Aggregaten zu den
zukünftigen Photorezeptor-Terminalien transportiert. Aufgrund ihrer lichtmikroskopisch wie
elektronenmikroskopisch erkennbaren sphärischen Erscheinung gaben wir ihnen den
englischen Terminus „precursor spheres“ (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht).
Precursor spheres sind im Durchschnitt 129 nm große sphärische Protein-Aggregate, die im
Gegensatz zu PTVs selbst nicht membranös sind, aber von einer Reihe von Membranvesikeln
umgeben sind. Die Quantifizierung der Tripelfärbungen von Bassoon, Piccolo und RIBEYE
zwischen P2 und P6 zeigte, dass mit dem Alter der Prozentsatz an Kolokalisation der drei
Proteine ansteigt. Dies spricht für eine zunehmende Aggregierung der drei
Bandkompartiment-Proteine auf dem Weg zum und im Photorezeptor-Terminal. Die
precursor spheres sind also vermutlich keine einheitlich gebildeten Komplexe, sondern –
zumindest in der Anfangsphase – Transport-Aggregate einzelner Zytomatrix-Proteine, die
sich erst im Laufe der Synaptogenese zu größeren Protein-Aggregaten zusammenfinden
(Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht).
Dennoch bleibt die Frage offen, ob die kolokalisiert auftretenden Proteinkomplexe tatsächlich
eine kompakte Transport-„Einheit“ darstellen oder ob es sich hierbei lediglich um eine
Aneinanderlagerung einzelner precursor spheres für Bassoon, Piccolo und RIBEYE handelt,
die lichtmikroskopisch nicht einzeln aufgelöst werden können. Zur Beantwortung dieser
Frage sind mehrere Ansätze denkbar. Eine Methode, die in der vorliegenden Arbeit mehrfach
mit unterschiedlichen Protokollen getestet wurde, ist die immunzytochemische
„postembedding“-Markierung dieser Proteine auf Ultradünnschnitten für die
Elektronenmikroskopie. Diese Methode erzielt im Vergleich zur „preembedding“-Methode
eine wesentlich höhere räumliche Auflösung, da der Nachweis des Primärantikörpers über
Diskussion ___________________________________________________________________________
64
gold-gekoppelte Sekundärantikörper erfolgt. Somit beträgt der Abstand des Goldpartikels
zum Protein maximal zwei Antikörperlängen. Mit Doppelfärbungen hätte geklärt werden
sollen, ob ein elektronenmikroskopsich zu detektierendes precursor sphere lediglich ein oder
mehrere Zytomatrix-Proteine umfasst. Durch die Präparation und Vorbereitung des Gewebes
für diese postembeding-Methode wird die größtenteils noch undifferenzierte Retina jedoch
sehr strapaziert. Der lockere Zellverband der NBL resultierte so in einer schlechten
Gewebeerhaltung, die für eine Analyse leider nicht ausreichte.
Desweiteren wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit der Versuch unternommen, STED-
Aufnahmen der für zwei CAZ-Proteine doppelgefärbten precursor spheres durchzuführen.
Problematisch bei der STED-Mikroskopie ist jedoch eine unspezifische Hintergrundfärbung,
die umso höher wird, je dicker der gefärbte Gewebeschnitt ist. Auch spielen die Qualität der
Primär- und Sekundär-Antikörper bei dem Signal-zu-Rausch-Verhältnis eine große Rolle.
Aus den genannten Gründen war die STED-Analyse von Doppelfärbungen bislang erfolglos.
In der Synaptogenese von konventionellen chemischen Synapsen setzt sich eine aktive Zone
aus 2-3 PTVs zusammen (Shapira et al., 2003). Wieviel precursor spheres sind nötig, um ein
präsynaptisches Band in Photorezeptoren zu bilden?
Obwohl aus technischen Gründen die Frage nach der benötigten Anzahl an precursor spheres
für die Bildung eines synaptischen Bandes nicht direkt beantwortet werden kann, können
durch die Kombination der licht- und elektronenmikroskopischen Analyse Aussagen über die
durchschnittliche Anzahl an precursor spheres in den Photorezeptoren getroffen werden. So
finden sich in Zapfen im Durchschnitt 7-8 precursor spheres und in Stäbchen lediglich 1-2
precursor spheres (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Die Zahl von 1-2 precursor
spheres pro Stäbchen ergab sich aus der quantitativen elektronenmikroskopischen Analyse
der Bandmaterialformen in Photorezeptor-Terminalien zu unterschiedlichen
Entwicklungszeitpunkten der Retina und damit sind für die Bildung eines präsynaptischen
Bandes – zumindest in Stäbchen – tatsächlich 1-2 precursor spheres ausreichend. Im Fall der
Zapfen bezieht sich die ermittelte durchschnittliche Anzahl an precursor spheres nicht auf die
elektronenmikroskopischen, sondern auf die lichtmikroskopischen Daten mit herkömmlicher
Fluoreszenzmikroskopie. Die STED-Analyse der precursor spheres mit der Markierung von
Basoon hat jedoch gezeigt, dass es sich bei einem immunfluoreszierenden Punkt oft um zwei
kleinere Aggregate handelt (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Daher liegt die Anzahl an
Diskussion ___________________________________________________________________________
65
precursor spheres in Zapfen vermutlich deutlich höher als die ermittelten 7-8 precursor
spheres pro Axon oder Terminal.
Letztlich wäre das in vivo-imaging von GFP-Fusionsproteinen die eleganteste und
beweiskräftigste Analyse zur Klärung der Frage, aus wie vielen precursor spheres ein
synaptisches Band aufgebaut wird.
3.1.3 Die Reifung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
Nach der Ankunft der precursor spheres im Photorezeptor-Terminal um den Tag P4 / P6
ändern die sphärischen Protein-Komplexe ihre Form und nehmen eine stabförmige Struktur
an (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Diese unreifen Bänder schwimmen noch frei im
Zytoplasma der Terminalien. Precursor spheres müssen also nicht verankert sein, um die
Formveränderung durchzuführen. Unterstützt wird dieser Befund durch die Analyse der
Bassoon-mutanten Retina, in der trotz des fehlenden Ankerproteins freischwimmende, unreife
Bänder gefunden werden (Dick et al., 2003; diese Arbeit). Der Auslöser für die
Formveränderung ist noch unverstanden.
In einem nächsten Schritt findet die Verankerung der unreifen Bänder an der präsynaptischen
Plasmamembran statt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Photorezeptor-Bandsynapse
funktionstüchtig, jedoch noch nicht vollständig ausgereift. Auch nach der Verankerung
werden den präsynaptischen Bändern Proteine zugeführt, was in einem Anwachsen der
Bänder resultiert. So sind verankerte Bänder zum Zeitpunkt P14 im Schnitt um etwa 150 nm
größer als verankerte Bänder am Tag P4 (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Dieser letzte
Schritt in der Reifung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes wird nicht über precursor
spheres vollzogen, sondern vermutlich über die lokale Zufuhr kleinerer Proteineinheiten und
könnte der Feineinstellung dienen. Möglicherweise gleicht dieser Nachschub an Proteinen
bereits dem Mechanismus für den steten Proteinumsatz an der adulten Photorezeptor-
Bandsynapse. An konventionellen chemischen Synapsen konnte für das präsynaptische
Protein Synapsin bereits gezeigt werden, dass Synapsin-Moleküle kontinuierlich ausgetauscht
und ersetzt werden (Tsuriel et al., 2006).
Aufgrund der gewonnen Daten lässt sich die Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes wie in Abbildung 33 schematisch darstellen.
Diskussion ___________________________________________________________________________
66
Abbildung 33: Wichtige Schritte in der Entwicklung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes Gelb: Proteine des Bandkompartiments (Piccolo, RIBEYE, RIM1) und Bassoon Rot: Proteine des arciform density / Plasmamembran-Kompartiments: Munc13-2, CAST1, RIM2 und die Ca2+-Kanal Untereinheit α1 E = embryonaler Tag; P = postnataler Tag
3.1.4 Die Rolle von Bassoon in der Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes
Das Zytomatrix-Protein Bassoon nimmt eine besondere Stellung in der Bildung des
Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes ein.
Gemeinsam mit Piccolo ist Bassoon mit 350 – 500 kDa das bislang größte identifizierte
Zytomatrix-Protein an der Präsynapse von chemischen Synapsen (Cases-Langhoff et al.,
1996; tom Dieck et al., 1998; Wang et al., 1999; Fenster et al., 2000). Beide sind
Diskussion ___________________________________________________________________________
67
Multidomänenproteine und viele Interaktionspartner sind bekannt (Schoch und Gundelfinger,
2006). Es ist daher nicht verwunderlich, dass Bassoon in konventionellen chemischen
Synapsen und in Photorezeptor-Bandsynapsen als erstes Zytomatrix-Protein in der
Synaptogenese exprimiert wird, da es als direkte und indirekte Andockstelle für viele weitere
präsynaptische Proteine fungiert. Direkte Interaktionen wurden bislang für RIBEYE / CtBP2
und CAST gezeigt (Takao-Rikitsu et al., 2004; tom Dieck et al., 2005).
Die lichtmikroskopischen Analysen der Bassoon-mutanten Retina ergaben, dass Bassoon
jedoch nicht für den generellen Transport der Bandproteine essentiell ist. Piccolo, RIBEYE
und RIM1 gelangen auch in der Bassoon-mutanten Retina zu den zukünftigen Photorezeptor-
Terminalien und sind ab dem Tag P6 in der sich entwickelnden OPL kolokalisiert.
Das Fehlen von funktionstüchtigem Bassoon-Protein scheint allerdings die Bildung der
precursor spheres in der frühen postnatalen Entwicklung stark zu beeinträchtigen. Im
Gegensatz zur wildtypischen Retina konnten in der Bassoon-mutanten Retina
lichtmikroskopisch keine Transport-Aggregate für die Bandproteine RIBEYE und RIM1 in
der NBL zwischen P0 und P6 detektiert werden. Die precursor spheres mit Piccolo scheinen
sowohl in der Anzahl als auch in der Größe drastisch reduziert. Offensichtlich ist Bassoon
daher an der frühen Aggregierung der Band-Proteine beteiligt. Fehlt Bassoon als
Interaktionspartner, bleiben Piccolo, RIBEYE und RIM1 größtenteils diffus verteilt und
aggregieren erst bei ihrer Ankunft im Photorezeptor-Terminal. Die ab dem Tag P10 in den
Photorezeptor-Terminalien detektierbaren precursor spheres haben einen mittleren
Durchmesser von 117 nm und sind somit 12 nm kleiner als im Wildtyp. Dies könnte dem
Anteil an Bassoon-Proteinen entsprechen, der in der Bassoon-mutanten Mausretina fehlt.
Die Bassoon-Mutation hat nicht nur Auswirkungen auf die Aggregierung der Bandproteine,
sondern auch auf deren Expressionsstärke. Die vergleichenden Western-Blot-Analysen
zeigen, dass bereits in der frühen postnatalen Retina die Konzentration der Proteine Piccolo
und RIBEYE in der Bassoon-mutanten Retina wesentlich geringer als in der wildtypischen
Retina ist. Es ist möglich, dass die Interaktion von Piccolo und RIBEYE mit Bassoon bereits
während der Synaptogenese eine wichtige stabilisierende Rolle spielt und eine fehlende
Aggregierung den Abbau der Proteine zur Folge hat. Denkbar wäre auch, dass Bassoon als
erstes detektierbares Zytomatrix-Protein einen direkten Einfluß auf die Expression der
Bandproteine hat. Dies müsste sich in der mRNA-Konzentration von Piccolo und RIBEYE
Diskussion ___________________________________________________________________________
68
widerspiegeln und ließe sich mit vergleichenden Northern-Blot-Analysen oder quantitativer
PCR nachweisen.
Das Fehlen von funktionstüchtigem Bassoon-Protein verhindert desweiteren die Verankerung
der präsynaptischen Bänder an der Plasmamembran (Dick et al., 2003, diese Arbeit). Dennoch
macht ein hoher Prozentsatz an precursor spheres in den Photorezeptor-Terminalien der
Bassoon-mutanten Retina einen Formwandel zu unreifen, gestreckten Bändern durch
(höchster Prozentsatz 82% am Tag P14). Dies ist ein weiterer Beweis dafür, dass die
Formveränderung der precursor spheres unabhängig von ihrer präsynaptischen Verankerung
ist. Eine Verankerung an der Membran scheint jedoch essentiell für die Aufrechterhaltung der
gestreckten, stabförmigen Struktur des synaptischen Bandes zu sein. Es ist nämlich zu
beobachten, dass der Prozentsatz an spheres in der Bassoon-mutanten Retina nach dem Tag
P14 wieder rapide zunimmt und am Tag P35 bereits 54% beträgt. Dementsprechend nimmt
der Prozentsatz an gestreckten Bändern wieder ab und ist am Tag P35 nur noch bei bei 44%.
Es ist möglich, dass der Auslöser für die Streckung der precursor spheres nur in einem
gewissen zeitlichen Fenster während der Retinogenese vorhanden ist, so dass sich die nicht
verankerten, unreifen Bänder später wieder abkugeln. Vorstellbar ist auch, dass synaptische
Aktivität wichtig für den Erhalt der Struktur ist. Die freischwimmenden Bänder in den
Photorezeptor-Terminalien der Bassoon-mutanten Mausretina können ihre synaptische
Funktion nicht erfüllen und deshalb scheint ihr Formerhalt nicht notwendig zu sein.
Interessanterweise hat die Bassoon-Mutation auf die Ausbildung konventioneller chemischer
Synapsen keine so offensichtlichen strukturellen und funktionellen Auswirkungen. Studien an
der Bassoon-mutanten Maus haben gezeigt, dass die Hippocampus-Synapsen morphologisch
intakt sind und nur ein Teil von ihnen funktionell beeinträchtigt ist (Altrock et al., 2003). Es
wird diskutiert, ob in konventionellen chemischen Synapsen das zu Bassoon homologe
Piccolo dessen Funktion teilweise übernehmen kann oder aber das noch vorhandene
Restprotein von Bassoon in der mutanten Maus funktionstüchtig bleibt.
Der gravierendere Phänotyp an den Photorezeptor-Synapsen der Bassoon-mutanten Retina
lässt die Komplexität dieser Sinneszelle und ihrer Synapse deutlich werden. Mit der
Spezialisierung auf eine tonische Transmitterausschüttung haben Bassoon und Piccolo
möglicherweise getrennte Funktionen an den Photorezeptor-Bandsynapsen übernommen.
Diskussion ___________________________________________________________________________
69
3.1.5 Die Entwicklung der aktiven Zone: Vergleich zwischen der Photorezeptor-
Bandsynapse und der konventionellen chemischen Synapse
Die Bildung präsynaptischer aktiver Zonen während der Entwicklung von konventionellen
chemischen Synapsen und Photorezeptor-Bandsynapsen unterliegt einem ähnlichen
Grundprinzip. Zytomatrix-Proteine der aktiven Zone werden vor der Ankunft an der
präsynaptischen Plasmamembran aggregiert und gemeinsam transportiert. Dennoch gibt es in
Photorezeptoren auffällige Unterschiede, die sich im Laufe der Evolution entwickelt haben
und unter Umständen die Ausbildung eines präsynaptischen Bandes ermöglichten.
In konventionellen chemischen Synapsen findet die Aggregation von Bassoon und Piccolo im
trans-Golgi-Netzwerk statt (Dresbach et al., 2006). Der Golgi-Apparat ist das Zellorganell,
das für die Proteinsortierung und den gezielten vesikulären Transport von Proteinen in die
unterschiedlichen Zellkompartimente zuständig ist. Für Bassoon konnte gezeigt werden, dass
der Weg über den Golgi-Appaprat essentiell ist. Wird der Weg über den Golgi-Apparat
blockiert, so findet kein Bassoon-Transport aus dem Soma mehr statt (Dresbach et al., 2006).
Es ist erstaunlich, dass der Transport von Nicht-Transmembran-Proteinen, wie Bassoon und
Piccolo, in konventionellen chemischen Synapsen über Vesikel vollzogen wird. Es wird
diskutiert, ob auf diese Art möglicherweise früh in der Synaptogenese sichergestellt wird,
dass ein bestimmtes Verhältnis von Proteinen der aktiven Zone auf jedem Vesikel vorhanden
ist (Dresbach et al., 2006).
Es ist auch denkbar, dass durch den Weg über den Golgi-Apparat der Tendenz von Bassoon
und Piccolo zur Aggregatbildung entgegengewirkt wird. Wird der Golgi-Apparat zerstört, so
können Bassoon und Piccolo lichtmikroskopisch in somatodendritischen Komplexen
detektiert werden (Dresbach et al., 2006). Interessanterweise ähneln solche Komplexe in
auffälliger Weise den precursor spheres, die man während der Photorezeptor-Synaptogenese
findet (Regus-Leidig et al., 2008, eingereicht). Es ist daher möglich, dass CAZ-Proteine in
Photorezeptoren die Signalsequenz zur Sortierung über den Golgi-Appaprat verloren haben,
so dass sie nun von freien Ribosomen im Zytoplasma translatiert werden. Die Proteine
können dort miteinander aggregieren und größere Komplexe bilden. Tatsächlich sind die
precursor spheres im Durchschnitt um etwa 50 nm größer als die PTVs in konventionellen
chemischen Synapsen.
Diskussion ___________________________________________________________________________
70
Hinzu kommt in Photorezeptoren die Expression des Bandsynapsen-spezifischen Proteins
RIBEYE, das als Gerüstprotein am Aufbau des adulten präsynaptischen Bandes beteiligt ist
(Schmitz et al., 2000; tom Dieck und Brandstätter, 2006). Wan et al. (2005) haben gezeigt,
dass in Zebrafischlarven der Knockdown von RIBEYE über Morpholinos die Bildung der
präsynaptischen Bänder in der Retina stark beeinträchtigt. Dies ist vor allem in Bipolarzellen
der Fall, die im Zebrafisch vermutlich nur eine Isoform von RIBEYE exprimieren (Wan et al.,
2005). RIBEYE scheint daher eine prominente Rolle bei der Bildung der präsynaptischen
Bänder zu spielen. Es wäre interessant, diese Funktion von RIBEYE in der Maus zu
bestätigen.
Es ist also möglich, dass die genannten Faktoren – die zusätzliche Expression eines weiteren
CAZ-Proteins (RIBEYE) und der Golgi-unabhängige Transport von CAZ-Proteinen – in
Photorezeptoren dazu geführt haben, dass sich eine Struktur wie das präsynaptische Band
bilden konnte. Möglicherweise findet für andere Komponenten des Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes ein vesikulärer Transport statt. In meinen Untersuchungen habe
ich allerdings zu keinem der untersuchten Zeitpunkte während der Photorezeptor-
Synaptogenese PTV-ähnliche elektronendichte Vesikel gefunden.
3.2 Die Proteinausstattung der Photorezeptor-Bandsynapse ist an die tonische
Transmitterausschüttung angepasst
Die meisten Proteine, die auf Transmittervesikeln lokalisiert oder mit diesen assoziiert sind,
sind zwischen konventionellen chemischen Synapsen und Photorezeptor-Bandsynapsen
konserviert. Dies deutet darauf hin, dass die grundlegenden Aspekte des Vesikelzyklus gleich
ablaufen (Ullrich und Südhof, 1994; von Kriegstein et al., 1999).
Photorezeptoren der Retina haben sich jedoch in vielerlei Hinsicht in ihrer präsynaptischen
Proteinausstattung spezialisiert und so an die kontinuierliche Ausschüttung des Transmitters
Glutamat und an die Übermittlung feinster Unterschiede in der Lichtintensität angepasst.
Besonders auffällig wird diese Anpassung in der Expression spezifischer Proteine, die in
konventionellen chemischen Synapsen nicht vorkommen. Dies sind zum einen das bereits
diskutierte Zytomatrix-Protein RIBEYE und das eingangs erwähnte KIF3A, dessen Funktion
an der Photorezeptor-Bandsynapse noch unbekannt ist. Demgegenüber gibt es in
konventionellen chemischen Synapsen Proteine, die von Photorezeptoren nicht exprimiert
Diskussion ___________________________________________________________________________
71
werden. Im Gegensatz zu konventionellen chemischen Synapsen findet man beispielsweise in
Photorezeptor-Terminalien keine Synapsin-Expression. Synapsine spielen in der zeitlichen
Kontrolle und Reproduzierbarkeit von Aktionspotentialen eine Rolle (Pieribone et al., 1995;
Rosahl et al., 1995) und werden daher in Photorezeptoren nicht benötigt (Mandell et al.,
1990).
Von vielen präsynpatischen Proteinen werden darüber hinaus in den Photorezeptoren
spezifische Isoformen exprimiert, die vermutlich funktionelle Anpassungen widerspiegeln.
Beispiele hierfür sind Syntaxin 3, einem an der Ca2+-vermittelten Transmitterausschüttung
beteiligten Protein (Morgans et al., 1996; Sherry et al., 2006), und SV2B (englisch: synaptic
vesicle protein 2B; Wang et al., 2003). Syntaxin3 vermittelt vermutlich eine höhere Ca2+-
Sensitivität und könnte für die schnelle und tonische Transmittervesikel-Exozytose in
Photorezeptoren mit verantwortlich sein (Heidelberger et al., 1994; Lagnado et al., 1996). Die
Rolle der SV2-Proteine ist noch unverstanden.
3.2.1 Complexine 3 und 4: Zwei spezifische Complexin-Isoformen an der
Photorezeptor-Bandsynapse
Auch Proteine, die regulierend in die Bildung des SNARE-Komplexes eingreifen, können
zwischen konventionellen chemischen Synapsen und Photorezeptor-Bandsynapsen
unterschiedlich exprimiert sein. Die Complexin-Proteinfamilie zählt zu den wichtigsten
Vertretern der SNARE-Komplex-Stabilisatoren (Brose, 2008). Das Maus-Genom besitzt vier
Complexin-Gene (Complexin 1-4), die alle in der Retina exprimiert werden (Reim et al.,
2005). Complexin 1 und 2 sind an konventionellen Synapsen von Amakrinzellen zu finden.
An den Bandsynapsen von Bipolarzellen und Photorezeptoren hingegen sind die Complexin-
Isoformen 3 und 4 lokalisiert, wobei Complexin 3 hauptsächlich von Zapfen und Complexin 4
vor allem von Stäbchen exprimiert wird (Reim et al., 2005). Von Reim und Kollegen (2005)
wurde postuliert, dass die spezifische Expression von Complexin 3 und 4 in Photorezeptoren
eine wichtige Rolle in der graduierten Freisetzung von Glutamat an Photorezeptor-
Bandsynapsen spielen könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die funktionellen und
strukturellen Auswirkungen einer Deletion von Complexin 3 und 4 auf den retinalen
Phänotyp anhand von Complexin 3 und 4 Einzel-Knockout (KO)- und Doppel-Knockout
(DKO)-Mäusen untersucht.
Diskussion ___________________________________________________________________________
72
3.2.1.1 Die Funktion von Complexin 3 und 4 an der Photorezeptor-Bandsynapse
Die Elektroretinogramme (ERGs) der Complexin 3 und 4 Einzel-KO-Mäuse zeigten
Veränderungen in der Amplitude und der zeitlichen Komponente der b-Welle, welche die
Aktivität der ON-Bipolarzellen widerspiegelt. In der Complexin 3-KO-Retina war eine
verlängerte Latenzzeit bis zum Maximum der b-Welle im Vergleich zur wildtypischen Retina
zu detektieren. Die b-Wellen-Amplitude hingegen war unverändert. In der Complexin 4-KO-
Retina konnte keine Veränderung in der zeitlichen Komponente der b-Welle, aber eine
minimale Reduktion der b-Wellen-Amplitude verzeichnet werden (Reim et al., 2008,
eingereicht). Diese Ergebnisse deuten an, dass zwar eine grundlegende Übertragung von
Photorezeptoren auf nachgeschaltete ON-Bipolarzellen stattfindet, wohl aber die
Feineinstellung in der Übertragung gestört ist. Die Feineinstellung der Glutamat-Freisetzung
ist jedoch bei Photorezeptoren zur exakten Übertragung kleinster Änderungen des
Membranpotentials als Reaktion auf Unterschiede in der Lichtintensität essentiell.
Auffällig war, dass die elektroretinographisch gemessenen Effekte in der Complexin 3/4
DKO-Retina stärker waren als in den Einzel-KO-Retinae (Reim et al., 2008, eingereicht). So
war in der doppeldefizienten Retina sowohl die Amplitude der b-Welle signifikant reduziert,
als auch die Latenzzeit bis zum Maximum bei allen Lichtintensitäten verlängert. Bei der stark
reduzierten b-Wellen-Amplitude handelt es sich aber um keine bloße Addition der Effekte der
beiden Einzeldeletionen (Reim et al., 2008, eingereicht). Dies ist ein Indiz dafür, dass
Complexin 3 und 4 in den Photorezeptor-Terminalien bei der Transmitterfreisetzung
kooperativ zusammen wirken und gemeinsam in einem Photorezeptor-Terminal vorliegen. In
der Tat konnte in Stäbchen eine schwache Expression von Complexin 3 detektiert werden
(Reim et al., 2005).
Die ERG-Daten deuten über den kooperativen Effekt hinaus an, dass Complexin 3 und 4
teilweise auch redundante Funktionen übernehmen können. Dafür spricht der Befund, dass in
der Complexin 4 Einzel-KO-Retina im Gegensatz zur Complexin 3 Einzel-KO-Retina keine
Veränderung in der zeitlichen Komponente der b-Welle detektiert werden konnte. In diesem
Fall kann Complexin 3 die Funktion des fehlenden Complexin 4 offensichtlich ausgleichen
(Reim et al., 2008, eingereicht).
Diskussion ___________________________________________________________________________
73
Complexine 3 und 4 scheinen also für die exakte und zuverlässige Übermittlung graduierter
Signale in Photorezeptoren essentiell zu sein. Wo liegt nun der Unterschied der Complexine 3
und 4 zu den Complexinen 1 und 2?
Die vier Complexin-Isoformen haben die gleichen grundlegenden Eigenschaften. Sie binden
an SNARE-Komplexe und können nach Überexpression in Complexin 1 und 2-defizienten
Hippocampus-Neuronen den Phänotypen retten (Reim et al., 2005). Complexin 3 und 4
besitzen jedoch strukturelle Eigenschaften, die sie von Complexin 1 und 2 unterscheiden und
für die Funktion der Photorezeptor-Bandsynapse relevant sein könnten: Beide Isoformen
exprimieren an ihrem C-Terminus eine Farnesylierungs-Stelle, welche die Membran-
Assoziation von Proteinen reguliert (Reim et al., 2005). Diese könnte bei der gezielten
Lokalisation der Complexine 3 und 4 am Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex eine Rolle
spielen (Reim et al., 2008, eingereicht). Vesikel, die am präsynaptischen Band lokalisiert sind,
sind bereits geprimt und bilden den Großteil des readily releasable pool (Heidelberger, 1998;
Heidelberger et al., 2002, 2005). Wenn die Complexine 3 und 4 am Priming der Vesikel
maßgeblich involviert sind, so müssten sie in der Nähe des präsynaptischen Bandes oder der
gebunden Vesikel detektiert werden können. Aus technischen Gründen konnte dieser
Nachweis bislang jedoch noch nicht erbracht werden.
Die unterschiedlich starke Expression von Complexin 3 und 4 in Zapfen und Stäbchen lässt
außerdem vermuten, dass die beiden Proteine in den Photorezeptoren unterschiedliche
Funktionen übernehmen. Die Kinetik der Transmitter-Exozytose ist in Zapfen etwa 10mal
schneller als in Stäbchen (Rabl et al., 2005). Es ist daher vorstellbar, dass Complexin 3 und
eventuell weitere, noch nicht identifizierte Proteine der Exozytose eine schnelle Komponente
zur Transmitterfreisetzung hinzufügen.
3.2.1.2 Auswirkungen der Complexin 3 und 4-Deletion auf die Stabilität des
Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes
Die Deletion von Complexin 3 und 4 in den Einzel-KO-Mäusen hat keine Auswirkungen auf
die allgemeine zelluläre und synaptische Struktur der Retina (Reim et al., 2008, eingereicht).
Die Doppeldeletion hingegen bewirkt nicht nur eine funktionelle Störung im ERG, sondern
auch strukturelle Veränderungen an der Photorezeptor-Synapse. Die OPL der Complexin 3/4
DKO-Retina erschien bereits lichtmikroskopisch unorganisierter als die OPL der Wildtyp-
Retina. In den elektronenmikroskopischen Untersuchungen war besonders auffällig, dass in
Diskussion ___________________________________________________________________________
74
etwa 24% der Photorezeptor-Terminalien sphärische Ablösungen (spheres) vom
Bandsynapsen-Komplex zu finden waren (Reim et al., 2008, eingereicht).
Wir vermuten, dass diese spheres als Folge eines frühzeitig einsetzenden
Degenerationsprozesses des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes auftreten. Auch in der
wildtypischen Retina findet sich mit steigendem Alter vermehrt sphärisches Bandmaterial in
den Photorezeptor-Terminalien (11%; < 1 Jahr; Reim et al., 2008, eingereicht). Im Wildtyp
spiegeln diese spheres im Alter vermutlich Abbauprodukte des Bandsynapsen-Komplexes
wider, die durch eine verminderte Funktionsfähigkeit einzelner Photorezeptoren
hervorgerufen werden. Das Ablösen von Bandmaterial in den Complexin 3/4-DKO-Mäusen
ist daher wahrscheinlich ein sekundärer Effekt, der durch die beeinträchtigte
Signalübertragung ausgelöst wird. Das Vorhandensein vieler intakter Photorezeptor-
Bandsynapsen (40%) in den Doppel-Deletionsmäusen spricht dafür, dass Complexine als
SNARE-Regulatoren während der Synaptogenese nicht essentiell am Aufbau des
Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes beteiligt sind (Reim et al., 2008, eingereicht).
Mutationen oder Deletionen anderer präynaptischer Proteine zeigen weitaus stärkere
phänotypische Ausprägungen als die Deletion von Complexin 3 und 4. Zum einen ist in
diesem Zusammenhang die Bassoon-mutante Retina zu nennen. Die Mutation des
Ankerproteins verhindert nicht nur die Bildung eines funktionstüchtigen Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplexes, sondern führt bereits früh zum Auswachsen von Horizontalzell-
und Bipolarzell-Fortsätzen in die ONL und zur Bildung von ektopischen Synapsen (Dick et
al., 2003; Specht et al., 2007).
Ein weiteres Tiermodell, in dem ebenfalls eine gestörte Bandsynapsenstruktur und das
Auswachsen von Horizontalzell- und Bipolarzell-Fortsätzen in die ONL beschrieben wurde,
ist die nob2 (englisch: no b-wave 2)-Mauslinie. Dieser Mauslinie fehlt durch eine
Spontanmutation im Cacna1f-Gen die funktionstüchtige retinaspezifische Ca2+-Kanal
Untereinheit α1F (Chang et al., 2006; Bayley und Morgans, 2007). Bei der nob2-Mauslinie
konnten wie bei der Bassoon-mutanten Maus ektopische Synapsen in der ONL gezeigt
werden und die Transmission der Photorezeptoren auf die nachgeschalteten Bipolarzellen ist
ebenfalls gestört. Der gleiche Phänotyp wurde auch bei der Cabp4-KO-Maus gefunden. Das
CaBP4 (englisch: Ca2+-binding protein 4) ist eine Photorezeptor-spezifische Isoform der
Ca2+-bindenden CaBP-Proteinfamilie und interagiert an den Photorezeptor-Bandsynapsen mit
der Ca2+-Kanal Untereinheit α1F (Haeseleer et al., 2004).
Diskussion ___________________________________________________________________________
75
Die Entwicklungsstörung des Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes und das Auswachsen
von interneuronalen Fortsätzen in die ONL könnte somit ein Zeichen für die Stellung der
Proteine in der Hierarchie der Photorezeptor-Synaptogenese und in der Signalübertragungs-
Maschinerie sein.
3.3 Funktionelle Eingriffe in die Photorezeptor-Bandsynapse
Die Photorezeptor-Bandsynapse ist ein ideales Modellsystem zur strukturellen und
funktionellen Untersuchung von Proteinen der aktiven Zone. Die räumliche Aufteilung des
Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in zwei Subkompartimente - das Band-
Kompartiment und das arciform density / Plasmamembran-Kompartiment (tom Dieck et al.,
2005) - bietet die Möglichkeit, nach der Deletion, dem Knockdown mittels RNA Interferenz
(RNAi) oder der Überexpression von präsynaptischen Proteinen strukturelle Veränderungen
der aktiven Zone bereits lichtmikroskopisch zu detektieren. In Kombination mit
biochemischen und funktionellen Analysen kann so die Rolle eines Proteins bei der
Signalübertragung gezielt untersucht werden.
Solche funktionellen Eingriffe erfordern die effektive und gezielte Einschleusung von DNA in
die Photorezeptoren. Manche Zellen - und dazu gehören retinale Neurone - sind jedoch
resistent gegenüber gängigen Transfektionsmethoden wie Elektroporation oder Lipofektion.
In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Transfektion der organotypischen retinalen
Explantkultur mit lentiviralen Partikeln etabliert.
3.3.1 Das Potential viraler Transfektion von Photorezeptoren
Ein erheblicher Vorteil viraler Systeme zur Transfektion von Zellen ist die
Langzeitexpression von Genen und die Möglichkeit der Einschleusung großer DNA-
Sequenzen. Dadurch haben virale Systeme das Potential für Gentherapien im Auge
(Bainbridge und Ali, 2006). Viele retinale Degenerationen wie Retinitis Pigmentosa oder
Leber Congenital Amaurosis werden durch Mutationen in Genen verursacht, die vor allem in
Photorezeptoren und in Zellen des retinalen Pigmentepithels exprimiert werden (Kaplan et al.,
2000; Dryja et al., 2001; Cremers et al., 2002).
Typische Ansätze zur Therapie solcher Erkrankungen, die durch rezessive oder dominante
Mutationen hervorgerufen werden, basieren auf „gene replacement“ oder Gen-Inaktivierung
Diskussion ___________________________________________________________________________
76
(Farrar et al., 2002; Dinculescu et al., 2005). Rekombinante Adeno-assoziierte virale
Vektoren sind zurzeit aufgrund ihrer Fähigkeit zur Langzeitexpression und der Möglichkeit
ausdifferenzierte, postmitotische Zellen zu transfizieren, die effizientesten Werkzeuge für den
Gentransfer in Photorezeptoren der in vivo Retina. Darüber hinaus besitzen AAVs im Auge
eine geringe Pathogenität und Immunogenität (Martin et al., 2002; Dinculescu et al., 2005;
Surace und Auricchio, 2008). Einige Tiermodelle für retinale Erkrankungen wurden bereits
erfolgreich mit der subretinalen Injektion von AAV-Vektoren behandelt (Min et al., 2005;
Pawlyk et al., 2005; Janssen et al., 2008).
Subretinal injizierte Lentiviren haben einen hohen Tropismus für Pigmentepithelzellen und
sind nur gering neurotrop (Galileo et al., 1999; Pang et al., 2006). Die subretinale Injektion
von GFP-produzierenden lentiviralen Partikeln resultiert in einer hohen Transfektionrate von
Pigmentepithelzellen, Photorezeptoren werden jedoch nur selten transfiziert (Pang et al.,
2006). Daher eignen sich lentivirale Systeme für die Transfektion von Photorezeptorzellen in
vivo nicht sehr gut. In der hier verwendeten organotypischen retinalen Explantkultur
funktionieren lentivirale Partikel für die Photorezeptor-Transfektion dennoch, da die
Kultivierung der Retina ohne Pigmentepithel durchgeführt wird.
Die hohe Transfektionsrate von Photorezeptoren im Gegensatz zu anderen retinalen Neuronen
wie beispielsweise Bipolarzellen oder Ganglienzellen in der organotypischen retinalen
Explantkultur ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die sich differenzierenden
Photorezeptoren zum Zeitpunkt der Transfektion (E18) auf ihrer Oberfläche vermehrt
Moleküle exprimieren, an welche die lentiviralen Partikel andocken können. Denkbar ist
allerdings auch, dass die hohe Photorezeptor-Transfektionsrate in der embryonalen Retina im
Vergleich zur postnatalen Retina ein Zeichen dafür ist, dass Lentiviren doch nur bedingt zur
Infektion postmitotischer Zellen fähig sind (Pang et al., 2006). Photorezeptoren teilen sich
lediglich in der Peripherie der Retina noch bis zum Ende der zweiten postnatalen Woche
(Blanks und Bok, 1977; Carter-Dawson und LaVail, 1979; Young, 1985).
3.3.2 RNA Interferenz von Komponenten des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes in der ex vivo Retina
Die Transfektion von short interfering RNAs (siRNAs) in Zellen resultiert in dem effektiven,
langanhaltenden posttranskriptionellen Knockdown von komplementärer mRNA (Caplen et
al., 2001; Elbashir et al., 2001). Der Mechanismus der RNAi wird vor allem durch das Enzym
Diskussion ___________________________________________________________________________
77
Dicer und den Enzymkomplex RISC (englisch: RNA-induced silencing complex) vermittelt.
Dicer ist eine Typ-III-Ribonuclease und maßgeblich an der Prozessierung von etwa 21
Nukleotiden langen RNAs aus größeren Vorläufermolekülen beteiligt (Hutvágner et al.,
2001). Der Enzymkomplex RISC sorgt anschließend unter Verwendung dieser siRNA-
Matrizen für die spezifische Degradierung der komplementären mRNAs (Hammond et al.,
2000). Für die Untersuchung der Funktion von Genen ist RNAi eine zuverlässige Methode
und zudem eine kostengünstige und zeitsparende Alternative zur Generierung von Knockout-
Tieren. Bei der Herstellung von gentechnisch veränderten Tieren ist immer der gesamte
Organismus betroffen, und es bleibt die Ungewissheit, ob sich die Deletion eines Gens letal
auswirkt. Durch die gezielte lokale Initiierung eines Knockdowns über RNAi können dagegen
zeitlich und örtlich begrenzte „Knockouts“ generiert werden. Darüber hinaus bietet RNAi die
Möglichkeit, zwei oder mehr Gene gleichzeitig herabzuregulieren oder gezielt einzelne
Spleißvarianten eines Gens auszuschalten (Dorsett und Tuschl, 2004).
Der Knockdown von Proteinen des Bandkompartiments in Photorezeptoren der ex vivo-
Mausretina wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal erfolgreich getestet.
Zwischen 70% und 90% zufällig ausgewählter siRNA-Sequenzen für eine mRNA sind in der
Lage, diese mRNA zu über 80% zu degradieren (Tuschl und Borkhardt, 2002). Die in der
vorliegenden Arbeit verwendeten siRNA-Sequenzen für Bassoon- und Piccolo-mRNA
bewirkten im heterologen System einen überaus effizienten Abbau von bis zu 99%. Der
Einsatz der gleichen siRNAs über lentivirale Transfektion der organotypischen retinalen
Explantkultur resultierte in einem späteren und nicht ganz so effizienten Abbau der Bassoon-
und Piccolo-mRNAs in Photorezeptoren. Es kann jedoch nicht davon ausgegangen werden,
dass die Protein-Expression in HEK-Zellen mit der natürlichen Expression in Photorezeptoren
übereinstimmt. Dennoch konnte gezeigt werden, dass ein spezifischer Knockdown der großen
Zytomatrix-Proteine Bassoon und Piccolo in Photorezeptoren möglich ist.
Generell bietet die organotypische retinale Explantkultur die Möglichkeit, Studien an der
Retina durchzuführen, ohne dabei am lebenden Tier arbeiten zu müssen. In der vorliegenden
Arbeit konnte ich zeigen, dass in Photorezeptoren der ex vivo Retina ebenso wie in der in vivo
Retina die Expression und der Transport von precursor spheres in die zukünftigen
Photorezeptor-Terminalien stattfindet. Leider bilden sich die präsynaptischen Bänder in
Photorezeptoren der organotypischen Retinakultur jedoch nicht vollständig aus. Es wäre
wünschenswert gewesen, die Auswirkungen des Knockdowns von präsynaptischen Proteinen
Diskussion ___________________________________________________________________________
78
auf die Photorezeptor-Bandsynapse in der organotypischen Retinakultur zu untersuchen, um
unnötige Tierversuche zu vermeiden. Solche Analysen sind in der Retinakultur jedoch nicht
realisierbar, da eventuelle strukturelle Veränderungen des Bandsynapsen-Komplexes nicht
nachvollziehbar und funktionelle Untersuchungen nur schwer durchführbar sind. Aus diesem
Grund wird es für weitere Untersuchungen erforderlich sein, die virale Transfektion von
Photorezeptoren durch subretinale Injektion viraler Partikel in vivo zu etablieren. So kann die
Photorezeptor-Synaptogenese in der natürlichen Umgebung stattfinden.
Unter Anwendung der RNAi-Methode können so in Zukunft präsynaptische Proteine der
aktiven Zone in beliebiger Kombination und Zahl zu funktionellen Untersuchungen
herabreguliert werden ohne dabei auf die Generierung von Knockout-Mäusen angewiesen zu
sein. Durch die Herabregulierung der mRNAs im lebenden Tier und die virusvermittelte
dauerhafte RNA Interferenz werden auch funktionelle Langzeit-Untersuchungen wie ERG-
Messungen möglich. Interessant ist hier zunächst der Knockdown von Piccolo und der
Doppel-Knockdown von Bassoon und Piccolo mit den vorhandenen Vektoren.
Das Potential viraler Systeme zum Einschleusen großer DNA-Sequenzen kann außerdem
dazu genutzt werden, in Photorezeptoren vormarkierte Fusionsproteine exprimieren zu lassen.
So könnten in der Zukunft Fragestellungen zum Transport von Proteinen der aktiven Zone
während der Synaptogenese, aber auch zum Proteinumsatz des adulten Bandsynapsen-
Komplexes in der in vivo-Retina mit live imaging-Mikroskopierverfahren analysiert werden.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
79
4 Material und Methoden
4.1 Versuchstiere
In der vorliegenden Arbeit wurden Mäuse des Wildtyp-Stammes C57/Bl6, Bassoon-mutante
Mäuse, Complexin 3 Knockout (KO), Complexin 4 KO, Complexin 3/4 Doppel-Knockout
(DKO)-Mäuse und Munc13-2 Knockin (KI)-Mäuse untersucht. C57Bl6- und Bassoon-
mutante Mäuse stammten aus eigener Zucht (Max-Planck-Institut für Hirnforschung,
Frankfurt am Main und Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen). Complexin 3 KO-,
Complexin 4 KO- und Complexin 3/4 DKO-Mäuse wurden von Kerstin Reim (Max-Planck-
Institut für Experimentelle Medizin, Göttingen) generiert und freundlicherweise zur
Verfügung gestellt. Die Munc13-2 KI-Mäuse wurden von Stefan Kalla generiert und
freundlicherweise von Nils Brose (Max-Planck-Institut für Experimentelle Medizin,
Göttingen) zur Verfügung gestellt.
In vergleichenden Experimenten mit wildtypischen und genetisch veränderten Mäusen
stammten die Tiere jeweils aus demselben Wurf.
4.2 Genotypisierung der Bassoon-mutanten Mäuse
Bassoon-mutante Mäuse sind äußerlich schwer von wildtypischen Mäusen zu unterscheiden.
Adulte mutante Mäuse sind in der Regel etwas kleiner und zeigen hin und wieder epileptische
Krämpfe. Dies ist jedoch zur sicheren Charakterisierung des Genotyps speziell bei jungen
Mäusen nicht ausreichend. Daher wurde die Genotypisierung mittels DNA-Analyse
vorgenommen.
Die DNA-Proben für die Genotypisierung wurden aus 1-3 mm langen Schwanzstücken der zu
untersuchenden Mäusen gewonnen, indem das Gewebe über Nacht in 500 µl Lysispuffer mit
20 µl Proteinase K bei 55°C inkubiert wurde. Am nächsten Tag wurden die Proben zur
Inaktivierung der Proteinase K für 10 Minuten auf 95°C erhitzt und die nicht verdauten
Bestandteile für 5 Minuten abzentrifugiert. Alle DNA-Proben wurden jeweils mit einem
Primerpaar für das wildtypische (wt; Primerpaar A: V2/V3) und das mutante Bassoon-Allel
(mt: Primerpaar B: KOS1/pWHAS1) in einer PCR-Reaktion amplifiziert und die Amplifikate
gelelektrophoretisch aufgetrennt (siehe 4.2.1). Das Vorhandensein zweier Banden wies auf
Heterozygotie hin, das Erscheinen lediglich einer Bande entsprechend der verwendeten
Primer auf den Wildtyp oder die homozygote Mutante.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
80
Primer wt (V2/V3): Primer mt (KOS1/pWHAS1):
V2: AGTTGTCAAGCCTGTTCCAGAAGC KOS1: GGTATCCTGTTCTGAAAGACTT
V3: ACACCGTCGGAGGAGTAGCCTGT pWHAS1: AAGCTTGATATCGAATTTGGCCT
PCR-Produkt ca. 700 bp PCR-Produkt ca. 400 bp
4.2.1 Polymerase-Kettenreaktion
Bei der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, englisch: polymerase chain reaction) werden
DNA-Abschnitte in vitro exponentiell vervielfältigt. Um nur bestimmte DNA-Abschnitte zu
amplifizieren, werden zwei spezifische künstliche Oligonukleotide, die den entsprechenden
Abschnitt gegenläufig flankieren, der PCR als „Primer“ zugesetzt. Die Vervielfältigung
erfolgt über mehrere Zyklen der wiederholten Denaturierung der DNA-Doppelstränge,
Hybridisierung der Primer und darauf folgender Elongation der Einzelstränge. Nach 30-40
Zyklen liegen ausreichend Kopien des gewünschten DNA-Abschnittes für eine
Nachweisreaktion vor (230 = ca.109 Kopien). Die PCR erfolgte üblicherweise in einem
Reaktionsvolumen von 25 µl in einem Thermocycler mit Deckelheizung (PTC-200, Biozyme
Diagnostik GmbH). Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte elektrophoretisch in einem
Agarosegel bei 120 V. Zum Anfärben der DNA diente Ethidiumbromid, das in die PCR-
Amplifikate interkaliert und unter UV-Licht fluoresziert. Das Gel wurde dafür nach der
Auftrennung für etwa 15 Minuten in einer Ethidiumbromidlösung (1 µg / ml) inkubiert, für 10
Minuten in Wasser gewaschen und unter UV-Licht mit einem Geldokumentationssystem
(Eagle Sight, Stratagene, Amsterdam, Holland) aufgenommen.
4.3 Präparation der Retina
Für die Entnahme der Augen wurden die Mäuse durch Dekapitation getötet, ältere Mäuse ab
dem Stadium P10 zuvor durch inhalative Betäubung mit Isofluran narkotisiert. Anschließend
wurden die Augen präpariert. Für proteinbiochemische Versuche wurde die Retina direkt
nach der Augenentnahme vom Augenbecher getrennt und in Homogenisierungspuffer
homogenisiert. Hierfür wurde die Hornhaut (Cornea) in der Mitte mit einem Skalpell
eingestochen, bis zur ora serrata eingeschnitten und entfernt. Anschließend wurden Linse und
Glaskörper mit einer Pinzette entnommen, der Augenbecher unterhalb der ora serrata geöffnet
und die Retina mit Hilfe einer Pinzette vorsichtig vom Pigmentepithel gelöst. Für
mikroskopische Analysen wurden die Retinae vor der Entnahme nach Entfernung der Cornea
und Linse im noch intakten Augenbecher fixiert, um die Gewebestruktur zu erhalten.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
81
4.4 Lichtmikroskopie
4.4.1 Fixierung und Herstellung von Gefrierschnitten für die Fluoreszenzmikroskopie
Die Retina wurde nach Entfernung der Cornea und Linse für 15 beziehungsweise 30 Minuten
im Augenbecher in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,01 M phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS) bei Raumtemperatur (RT) fixiert. Nach der Fixierung wurde die Retina mit
Augenbecher in PBS gewaschen und in einer aufsteigenden Saccharosereihe (10%, 20% und
30% in PBS) bei 4°C auf die Einbettung vorbereitet. Nach Freilegung der Retina wurde das
Gewebe mit einer Rasierklinge quadratisch zurecht geschnitten und für etwa 15 Minuten in
Einbettmedium für Gefrierschnitte (Tissuetec Freezing Medium, Reichert-Jung, Heidelberg,
Deutschland) bei 4°C inkubiert. Für die Entwicklungsreihen wurde je eine Retina zweier
aufeinander folgender Altersstadien übereinander aufgefroren. Von diesen
Sandwichpräparaten wurden an einem Gefriermikrotom (Kryostat CM3050 S, Leica, Wetzlar,
Deutschland) bei –21°C Objekttemperatur und –17°C Kammertemperatur 16 µm dicke
Vertikalschnitte angefertigt, die auf speziell beschichtete Objektträger (Menzel-Gläser,
Braunschweig, Deutschland) aufgenommen wurden. Zum besseren Vergleich wurden jeweils
die vier Altersstadien P0, P2, P4 und P6 und P8, P10, P12 und P14 auf einen Objektträger
gebracht. Diese Methode hat den Vorteil, dass bei immunzytochemischen Färbungen vier
unterschiedliche Altersstadien mit derselben Antikörperlösung behandelt und dadurch
Abweichungen in der Immunfluoreszenzfärbung als Grund für unterschiedliche
Färbeintensität als Fehlerquelle ausgeschlossen werden können.
Die Schnitte konnten entweder sofort für immunzytochemische Färbungen verwendet oder für
längere Zeit bei -20°C gelagert werden.
4.4.2 Immunzytochemische Färbungen
Zur besseren Haftung der Schnitte auf den Objektträgern wurden diese für 15 Minuten bei RT
angetrocknet. Währenddessen wurden sie mit einem Fettstift (Pap-Pen, SCI Science,
München, Deutschland) umrandet, um ein Abfließen der Inkubationslösungen zu verhindern.
Zur Absättigung freier Proteinbindungsstellen wurden die Schnitte 60 Minuten in
Präinkubationslösung vorinkubiert. Im Anschluss wurden sie über Nacht in einer feuchten
Kammer mit dem Primärantikörper in Primärantikörper-Inkubationslösung bedeckt
(Verdünnungen: siehe 4.14). Am nächsten Tag folgte eine 60-minütige Inkubation mit einer
1:500 (1:200)-Verdünnung des entsprechenden Sekundärantikörpers (4.15). Das Eindecken
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
82
der Schnitte erfolgte mit einem Kunstharz (Aqua-Poly-Mount, Polysciences Europe,
Eppelheim, Deutschland).
4.4.3 Wholemount-Färbung der Retina
Für eine wholemount-Färbung der Retina erfolgten Fixierung und Inkubation in der
aufsteigenden Saccharosereihe wie unter 4.4.1 beschrieben. Vor dem 60-minütigen Blocken
in Präinkubationslösung wurde die Retina 3x über einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten
Metallblock „gecrackt“, um die Antikörperpenetration ins Gewebe zu erleichtern. Die
Primärantikörperinkubation erfolgte über 2 Tage, die Sekundärantikörperinkubation für zwei
Stunden bei Raumtemperatur. Die gründlich in PBS gewaschene Retina wurden in Aqua
Polymount, mit der Photorezeptorseite nach oben weisend, eingebettet.
4.4.4 Lichtmikroskopische Analyse
Die Analyse der immunzytochemischen Einzel-, Doppel-, und Tripelfärbungen erfolgte mit
einem konfokalen Laserscanning Mikroskop (LSM Pascal, Zeiss, Oberkochen, Deutschland)
oder einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop mit Apotomfunktion (ApoTome, Zeiss).
Es wurden jeweils mehrere übereinander liegende Ebenen, sogenannte „Stacks“,
aufgenommen. Zur besseren Darstellung wurden einige aufeinander folgende Ebenen
ausgewählt und in eine Ebene projiziert.
Kontrast und Helligkeit der digitalen Bilder wurden mit Photoshop CS optimiert und die
Abbildungen in Photoshop oder Corel Draw 11.0 arrangiert.
Die 3D-Darstellung der tripelgefärbten Transport-Aggregate erfolgte mit Axiovision 4.6
(Zeiss).
4.4.5 Bestimmung und Quantifizierung der Kolokalisation von Proteinen
Zur Quantifizierung der Kolokalisation der drei CAZ-Proteine Bassoon, Piccolo und RIBEYE
wurden Doppel- und Tripelfärbungen angefertigt und mit 63-facher Vergrößerung als
Mehrkanalbild aufgenommen. Die Kanäle wurden in Photoshop wieder getrennt und einzeln
mit hoher Qualität ausgedruckt. Die punktförmige Markierung der Proteine wurde auf Folie
übertragen und durch genaues Übereinanderlegen mit der jeweiligen Färbung des anderen
Proteins verglichen. Für die Kolokalisation in der Doppelmarkierung wurde ein
Computerprogramm (Kolokalisationsmodul für AxioVison 4.6, Zeiss) im Vergleich getestet.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
83
4.4.6 STED-Mikroskopie
Mit dem auf konfokalem Laser-Scanning basierenden STED (englisch: stimulated emission
depletion)-Verfahren lassen sich Strukturen lichtmikroskopisch mit einer Auflösung abbilden,
die weit unter der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts liegt. Während konventionelle
Fluoreszenz-Laser-Scanning-Mikroskopie in Abhängigkeit von der Wellenlänge eine
maximale laterale Auflösung von etwa 200 nm erreicht, können mit dem STED-Verfahren
Strukturen mit bis zu 10fach höherer Auflösung dargestellt werden. Dies wird durch das
Prinzip der induzierten Emission erreicht. Wie bei der konventionellen Laser-Scanning-
Mikroskopie wird eine minimal 200 nm kleine punktförmige Fläche mittels eines fokussierten
Lichtstrahls angeregt (hier: λ = 635 nm). Wenige Picosekunden später wird dieselbe Stelle mit
einem ringförmigen zweiten Puls niedrigerer Energie (hier: λ = 750 nm) „gequencht“
(gebleicht), so dass die Randbereiche der zuvor angeregten Fläche bei der Detektion nicht
mehr fluoreszieren. Die Auflösung des STED-Verfahrens ist somit theoretisch nur noch durch
die Größe des Ring-Zentrums limitiert.
Die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Experimente wurden in Zusammenarbeit mit
Lars Meyer unter der Leitung von Stefan Hell am Max-Planck-Institut für biophysikalische
Chemie in Göttingen durchgeführt.
4.5 Elektronenmikroskopie
4.5.1 Fixierung für gute Gewebeerhaltung
Ziel dieser Methode ist es, für elektronenmikroskopische Analysen Zellstrukturen derart zu
fixieren, dass sie auf ultrastruktureller Ebene mit bestmöglicher Gewebeerhaltung
kontrastreich zu sehen sind. Hierfür wurde die Retina bei frühen Entwicklungsstadien im
Augenbecher für 2 Stunden in 2,5% Glutaraldehyd (GA) und 4% PFA fixiert. Lediglich die
Linse wurde durch einen kleinen Schnitt in der Cornea zuvor entfernt. Nach dreimaligem
Waschen in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) wurde die Retina isoliert und geviertelt. Die
anschließende Osmierung erfolgte für 90 Minuten im Dunkeln (1,5% Natriumhexacyanoferrat
+ 2% Osmium in Cacodylatpuffer). Es schloss sich eine dehydrierende aufsteigenden
Ethanolreihe an (jeweils 15 Minuten in 30% / 50% / 70% / 90% / 2x 100% Ethanol und 2x 5
Minuten Propylenoxid). Zusätzlich wurden die Retinastücke während des
Dehydrationschrittes in 70%igem Ethanol für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 0,5%
Uranylacetat versetzt. Zur Vorbereitung auf das Einbetten in das Kunstharz Epon (Fluka,
Basel, Schweiz) wurden sie in einer 1:1 Mischung aus Propylenoxid und Epon eine halbe
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
84
Stunde vorinkubiert und anschließend in reines Epon überführt. Am nächsten Tag wurden die
Retinastücke einzeln in mit frischem Epon ausgegossene Silikonförmchen eingebettet und
mindestens 2 Tage bei 60°C auspolymerisiert. Mit einem Ultramikrotom (Ultracut, Reichert-
Jung, Heidelberg, Deutschland) wurden etwa 70 nm dicke Ultradünnschnitte angefertigt.
4.5.2 Immunoelektronenmikroskopie: Preembedding
Für die Preembedding-Methode wurde die Retina im Augenbecher für 50 Minuten in 4%iger
PFA-Lösung fixiert. Die anschließende Inkubation in einem aufsteigendem
Saccharosegradienten und die Präparation der Retina erfolgten wie für die Lichtmikroskopie
(4.4.1). Anschließend wurde die Retina drei Mal gecrackt. Nach gründlichem Waschen in
PBS wurden die Retinastücke einzeln in 4%iger Agar / PBS-Lösung eingebettet und die
Agarblöcke trapezförmig zurechtgeschnitten. Von den derart eingebetteten Retinae wurden
mit einem Vibratom (Leica VT1000S) 50-100 µm dicke Vibratomschnitte angefertigt. Diese
wurden zur Absättigung freier Proteinbindungsstellen einer zweistündigen Präinkubation
unterzogen. Die anschließende Primärantikörperinkubation erfolgte über 4 Tage bei 4°C. Im
nächsten Schritt wurden die Schnitte zwei Stunden mit einem biotinylierten
speziesspezifischen Sekundär-Antikörper inkubiert. Mit Hilfe eines enzymatischen
Detektionssystems (Vectastain ABC-Kit, Vector, Wertheim, Deutschland) konnte über eine
Avidin-gekoppelte Meerrettichperoxidase unter Zugabe des Substrats 3,3’-Diaminobenzidin
(DAB) die Markierung des Primärantikörpers sichtbar gemacht werden. Die Schnitte wurden
danach mit 2,5% GA für 1 Stunde nachfixiert. Es folgten eine Silberintensivierung und eine
Goldchloridbehandlung zur Überführung der DAB-Färbung in eine elektronendichte
Markierung. Die Kontrastierung des Gewebes wurde für 30 Minuten mit 0,5% Osmium in
Cacodylatpuffer bei 4°C durchgeführt. Die weitere Aufbereitung erfolgte wie bei der
Standard-Elektronenmikroskopie-Methode (4.5.1).
4.5.3 Elektronenmikroskopische Analyse
Die ultrastrukturelle Analyse und Aufnahme der Präparate erfolgte an einem Zeiss EM 10
Elektronenmikroskop (Zeiss) mit einer Gatan BioScan Digitalkamera (GATAN, München,
Deutschland).
Zur genaueren Analyse der Protein-Aggregate, die in der Entwicklung der Photorezeptor-
Synapsen untersucht wurden, wurden 3D-Rekonstruktionen durchgeführt. Hierfür wurden
Serienschnitte von gut fixierten Retinae mit geringstmöglicher Dicke (etwa 40 nm)
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
85
angefertigt. Die Rekonstruktion des Bandmaterials erfolgte mit reconstruct v1.0.3.0 (J. Fiala,
Medical College of Georgia).
4.6 Western-Blot Analysen
4.6.1 Herstellung von Retina-Homogenaten
Für die proteinbiochemische Analyse wurden die Retinae in 1 ml Homogenisierungspuffer
mit Protease-Inhibitoren aufgenommen und mit einem Handpotter homogenisiert. Die
Proteine wurden mit 30%iger Trichloressigsäure (TCA) gefällt und nach 10-minütiger
Inkubation auf Eis bei 4°C zentrifugiert. Nach einmaligem Waschen in eiskaltem Aceton
wurde der Überstand entfernt, das Pellet luftgetrocknet und in 1,5x SDS-Probenpuffer mit
DTT für ca. 20 Minuten bei 37°C unter Schütteln aufgenommen (Thermoschüttler,
Eppendorf, Hamburg, Deutschland). Anschließend wurden die Proben zur vollständigen
Denaturierung für 10 Minuten bei 95°C erhitzt. Nach Zugabe von 0,2% Iodacetamid wurden
unlösliche Bestandteile durch kurze Zentrifugation entfernt, das gelöste Protein in ein neues
Reagenzgefäß überführt und eingefroren aufbewahrt.
4.6.2 Proteinmengenbestimmung
Die Proteinmengenbestimmung erfolgte mit dem Micro Amidoblack Protein Assay nach
Popov et al. (1975). Ein Aliquot der Probe wurde mit Aqua bidest. auf 100 µl eingestellt und
mit 200 µl der Amidoschwarzlösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das
gefällte Protein wurde anschließend für 5 Minuten zentrifugiert und solange mit Methanol-
Eisessig (9:1) gewaschen bis der Überstand farblos war. Das Pellet wurde luftgetrocknet und
für 30 Minuten in 1 ml 0,1 N NaOH gelöst. Eine Kalibriergerade wurde mit einer
Standardreihe von 2, 4, 8, 12, 16, 20 und 40 µg BSA erstellt. Die Messung erfolgte bei einer
Wellenlänge von 620 nm gegen NaOH als Nullwert (Spectrophotometer LC-55, Perkin-
Elmer, Waltham, Massachusetts).
4.6.3 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unter
reduzierenden Bedingungen nach dem TrisAcetat-System
Die SDS-PAGE nach dem TrisAcetat-System (NuPAGE-System) wurde von der Firma
Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) speziell für die Auftrennung von Proteingemischen mit
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
86
besonders großen Proteinen wie Bassoon (420 kDa) oder Piccolo (>500 kDa) mit
anschließendem Western Blot-Transfer entwickelt.
Die in SDS-Probenpuffer aufgenommenen Proben wurden zur erneuten vollständigen
Denaturierung nach dem Auftauen für 5 Minuten bei 95°C erhitzt, 2 Minuten zentrifugiert
und vor dem Auftragen auf Eis gekühlt. Das Gel wurde idealerweise mit 25 µg des Retina-
Homogenats beladen. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in vorgefertigten
Gradientengelen (3–8%) bei einer konstanten Spannung von 120 V. Gele (NuPAGE
Gradientengele) und Elektrophoresekammer (Xcell SureLock Mini-Cell) waren von
Invitrogen.
4.6.4 Western Blot-Transfer und Analyse
Für die Proteine der aktiven Zone erfolgte der Western Blot-Transfer der Proteine aus dem
Gel auf WESTRAN Clear Signal-PVDF-Membranen (Schleicher & Schuell). Vor dem
Transfer wurden die hydrophoben Membranen einige Sekunden mit Methanol aktiviert und
für mindestens 10 Minuten in Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer erfolgte in einer
Tankblot-Kammer von BioRAD (München, Deutschland) bei konstanten 200 mA für 3
Stunden. Die reversible Färbung der Proteine erfolgte über PonceauS (Sigma, Basel,
Schweiz). Hierfür wurden die Membranen für etwa 1-2 Minuten in der Färbelösung inkubiert
und der Restfarbstoff so lange mit Aqua bidest. entfernt, bis die Proteinbanden deutlich
sichtbar waren.
Geblottete Proteine können auf einer Blot-Membran mit spezifischen Primär-Antikörpern
markiert und durch geeignete Sekundär-Antikörper sichtbar gemacht werden. Hierfür wurden
die Membranen nach Abblocken freier Proteinbindungsstellen mit 5% Magermilchpulver über
Nacht bei 4°C mit dem Primärantikörper inkubiert (in TBST + 3% BSA + 0,02% Natrium-
Azid; Antikörperverdünnungen: siehe 4.14). Zum Sichtbarmachen und zur Verstärkung des
Signals erfolgte eine einstündige Inkubation mit einem Meerettich-Peroxidase-gekoppelten
Sekundärantikörper. Durch enzymatische Umwandlung des Substrats Luminol (ECL Plus,
Amersham Biosciences, Freiburg, Deutschland) entsteht Chemolumineszenz, welche durch
Exposition auf Röntgenfilm (BioMax MR Film, Kodak, New York, USA) und anschließende
Entwicklung (Curix60, Agfa, Leverkusen, Deutschland) als schwarze Banden detektiert
werden kann.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
87
4.7 Organotypische Explant-Kultivierung der Mäuseretina
Zur Herstellung der organotypischen Kultur wurde die Retina in antibiotoikahaltigem
Kulturmedium aus dem Augenbecher isoliert und mit der Photorezeptorseite nach unten auf
Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) aufgezogen. Die Membranen
wurden in ein speziell angefertigtes Nylon-Netz eingesteckt und auf den Boden einer 6-well-
Platte gesetzt. Dieses wurde mit 1 ml Medium gefüllt, so dass die Retina mit Flüssigkeit
benetzt, jedoch nicht vollständig bedeckt war. Eine derartige Retinakultur konnte bei 37°C
und einem CO2-Gehalt von 5% für etwa 14 Tage aufrechterhalten werden, wobei das Medium
am Tag nach dem Ansetzen der Kultur und anschließend alle 2 Tage gewechselt wurde
(verändert nach Caffe et al, 1989; Reidel et al., 2006).
4.8 Transfektion der organotypischen Retinakultur
Das Einschleusen von DNA in retinale Neurone der organotypischen Kultur erfolgte über
lentivirale Transfektion. Zur Herstellung der replikationsdefekten viralen Partikel diente ein
3-Vektoren-System. Die drei viralen Vektoren [(1) lentiviraler Vektor pCMVΔR8.9, Zufferey
et al., 1997; (2) Hüllproteinvektor pVsVg und (3) Transfervektor FUGW inklusive dem
Reportergen für eGFP als Kontrolle für eine erfolgte Transfektion, verändert nach Lois et al,
2002] wurden freundlicherweise von Craig Garner (Department of Psychiatry and Behavior
Sciences, Stanford University, Kalifornien) zur Verfügung gestellt. Die Virus-Produktion
erfolgte über die Koexpression der drei Vektoren in der Helferzelllinie HEK 293T.
4.8.1 Kultivierung von HEK 293T-Zellen
Die HEK 293-Zelllinie (engl.: human embryonic kidney cells) stammt von menschlichen
Nierenzellen ab, die durch Transformation mit Teilen des menschlichen Adenovirus 5
immortalisiert wurden (Graham et al., 1977). Eine Variante der ursprünglichen Zelllinie, die
HEK 293T-Zellen, exprimieren zusätzlich das SV40 large T-Antigen, welches die Replikation
von episomalen Plasmiden mit dem SV40 origin of replication ermöglicht. Somit eignet sich
diese Zelllinie zur Herstellung von Retroviren, wie den Lentiviren, die in dieser Arbeit zur
Transfektion von retinalen Neuronen verwendet wurden.
Die Kultivierung der Zellen erfolgte in 10 cm Petrischalen mit 10 ml Nährmedium (DMEM /
Ham’s F-12, PAA, Cölbe, Deutschland, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum) bei
37°C und einem CO2-Gehalt von 5%. Der Medium-Wechsel erfolgte alle 3-4 Tage. Bei etwa
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
88
90%iger Konfluenz wurden die Zellen passagiert. Hierzu wurde das Medium für kurze Zeit
mit 2-3 ml Trypsin-EDTA ersetzt um die Zellen vom Boden der Kulturschale zu lösen. Die
Trypsinierung wurde durch Zugabe von 4 ml Kulturmedium und einer kurzen Zentrifugation
bei 1000 x g beendet. Die Zellen wurden resuspendiert und im Verhältnis 1:4 auf neue
Petrischalen verteilt. Wurde eine schnelle und stabile Anheftung der Zellen an den Boden der
Petrischale für eine anschließende Transfektionen zur Virusproduktion benötigt, wurden die
entsprechenden Petrischalen vor dem Aussäen der Zellen mit 1-2 ml steriler Poly-D-Lysin-
Lösung (GIBCO, Karlsruhe, Deutschland) beschichtet.
4.8.2 Generierung der Lentiviren
Zur Generierung der Lentiviren wurden HEK293T-Zellen mit den drei viralen Vektoren
kotransfiziert (siehe 4.8). Die Transfektion erfolgte bei 30-40%iger Konfluenz der HEK293T-
Zellen über Lipofektion (Lipofectamin 2000, Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) in
serumfreiem Medium. Die anschließende Inkubation der virusproduzierenden Zellen erfolgte
bei 32°C und einem CO2-Gehalt von 5%. Nach 60-72 Stunden wurde der virusenthaltende
Überstand abgenommen und zur Erhöhung des Titers für 90 Minuten bei 21000 x g
zentrifugiert (Ultrazentrifuge Optima Max, Beckman Coulter, Fullerton, Kalifornien). Das
Virus-Pellet wurde in 100fach geringerem Volumen in Opti-MEM (Invitrogen) über Nacht
bei 4°C gelöst und das Virus-Konzentrat in Aliquots zu je 10 µl bei –80°C gelagert.
4.8.3 Durchführung der lentiviralen Transfektion von organotypischen Retinakulturen
Die lentivirale Transfektion von Retinakulturen erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von
Hatakeyama und Kageyama (2002). In der vorliegenden Arbeit wurden embryonale Retinae
zwischen E17 und E19 verwendet, da die Transfektionsrate mit zunehmendem
Differenzierungsgrad der Zellen abnimmt. Die Transfektion erfolgte unter Abwesenheit von
Kulturmedium. Hierfür wurden die Retinae nach Aufziehen auf die Membran in eine leere 6-
well-Platte überführt und diese mit je einem Tropfen konzentrierter Viruslösung (ca. 10 µl)
benetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 37° C und einem CO2-Gehalt von 5% wurde
diese Prozedur einmal wiederholt. Die Kultur wurde anschließend mit 1 ml Medium versetzt
und wie unter 4.7 beschrieben weitergeführt.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
89
4.9 RNA Interferenz
4.9.1 Auswahl geeigneter shRNA-Sequenzen
Geeignete Zielsequenzen der mRNA präsynaptischer Proteine wurden mit dem
Computerprogramm iRNAi von www.mekentosj.com ermittelt. Getestet wurden jeweils 3-4
verschiedene shRNA-Sequenzen für jede mRNA (Bassoon und Piccolo). Die Generierung der
shRNA-Oligonukleotide erfolgte durch die Firma MWG (Ebersberg, Deutschland).
Eine erste Einschätzung der Knockdown-Effizienz geschah proteinbiochemisch in einem
heterologen System. Hierfür wurden COS7-Zellen mit einem Fusionsprodukt aus den
Zielsequenzen und eGFP im Expressionsvektor pZoff (pEGFP-C1, Clontech; verändert)
zusammen mit dem entsprechenden shRNA-Konstrukt über Lipofektion kotransfiziert. Nach
48 Stunden wurden die Zellen lysiert, die homogenisierten Proteine elektrophoretisch
aufgetrennt und anschließend auf eine Membran transferiert. Mit Antikörpern gegen GFP
konnten die Fusionsprodukte detektiert und deren Bandenstärke mit einer Kontrolle
(Expression des Fusionsproteins ohne shRNA) verglichen werden.
Die auf diese Weise ermittelten shRNAs TS16 (gegen Bassoon) TS28 (gegen Piccolo)
wurden in den Transfervektor FUGW H1 kloniert.
4.9.2 Konstruktion des Transfervektors FUGW H1 mit shRNA-Inserts
Der Transfervektor FUGW H1 trägt neben der Sequenz zur Herstellung von eGFP als
Reportermolekül einen H1-Promotor zur Transkription von RNA. Die shRNA-
Oligonukleotide wurden in eine multiple cloning site nach dem H1-Promotor kloniert
(Abbildung 34). Die in dieser Arbeit verwendeten shRNA-tragenden Transfervektoren
FUGW TS16 (gegen Bassoon), FUGW TS28 (gegen Piccolo) und FUGW DKD (gegen
Bassoon und Piccolo) wurden von Sergio Leal-Ortiz generiert und freundlicherweise von
Craig Garner (Department of Psychiatry and Behavior Sciences, Stanford University,
Kalifornien) zur Verfügung gestellt.
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
90
Abbildung 34: Schematische Darstellung des Vektors FUGW H1 mit multiple cloning site env = Hüllproteine (Knöpfe der Virushülle) (englisch: envelope) H1 = H1-Promotor eGFP = enhanced green fluorescent protein nef = negative regulatory factor gag = “gruppenspezifische Antigene” (Kernproteine) (englisch: group specific antigens) AMP = Ampicillin-Resistenzgen
Im Folgenden werden die wichtigsten molekularbiologische Techniken zu Herstellung des
Vektors kurz erläutert.
4.9.2.1 Restriktionsverdau von DNA
Zur präparativen Linearisierung der Plasmide und Generierung von DNA-Fragmenten für
anschließende Klonierungsarbeiten wurden jeweils 10 µg DNA pro Verdau eingesetzt. Der
Ansatz erfolgte in einem Endvolumen von 20-50 µl des empfohlenen Puffers mit 25-50
Einheiten der entsprechenden Restriktionsenzyme (New England Biolabs; Frankfurt,
Deutschland) für 2 Stunden bei der angegebenen Temperatur (üblicherweise 37°C).
Für Kontrollverdaue zur Überprüfung von Ligationen wurden in der Regel 1 µl
Plasmidlösung mit 2 U Restriktionsenzym in einem Endvolumen von 20 µl Puffer bei
entsprechender Temperatur (üblicherweise 37°C) für 1-2 Stunden umgesetzt.
10256 bp
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
91
4.9.2.2 Ligation und Transformation von Bakterien
Ligationen von DNA-Fragmenten und linearisierten Vektoren erfolgten gemäß TA cloning
Kit (Invitrogen). 100 ng des Vektors wurden mit der dreifachen Menge an DNA-Fragment
und 0,5-1 µl T4 DNA-Ligase mit entsprechendem Puffer in einem Endvolumen von 10 µl bei
14°C über Nacht oder länger inkubiert. 1-10 µl des Ligationsansatzes wurden für die
Transformation chemisch kompetenter E. coli Bakterien (TOP10 oder DH5α) verwendet.
Hierfür wurden zunächst die kompetenten Zellen auf Eis aufgetaut und mit dem
Ligationsansatz versetzt. Nach einer einstündigen Inkubation auf Eis erfolgte die
Transformation für 45 sec bei 42°C. Die transformierten Zellen wurden anschließend in 1 ml
SOC-Medium überführt und für 30 Minuten bei 37°C geschüttelt (Thermoschüttler,
Eppendorf, Hamburg, Deutschland). 100 µl der Suspension wurden auf ampicillinhaltigen
Agarplatten ausplattiert. Die Inkubation der Platten erfolgte bei 37°C über Nacht.
4.9.2.3 Präparation von Plasmid-DNA aus Bakterien
Für eine Plasmid-Maxipräparation wurden für eine Vorkultur 5 ml ampicillinhaltiges LB-
Medium mit einer Bakterienkolonie angeimpft und für 8 Stunden bei 37°C geschüttelt
(Bakterienschüttler G24, New Brunswick Scientific, Nürtingen, Deutschland). Diese wurden
anschließend in 100 ml LB-Medium überführt und erneut über Nacht kultiviert. Die
Plasmidextraktion erfolgte nach Protokoll mit dem Plasmid Purification Kit von QIAGEN
(Hilden, Deutschland). Die Präparation der viralen Vektoren wurde mit endotoxinfreien
Lösungen durchgeführt, da Endotoxine die Transfektionseffizienz von Zellen negativ
beeinflussen können.
4.9.3 Analyse der Knockdown-Effizienz der shRNA-Konstrukte
Die Knockdown-Effizienz der ermittelten shRNA-Sequenzen (TS16 gegen Bassoon und TS28
gegen Piccolo) wurde mit einem Luziferase Assay (siCheckTM-Vektor-System, Promega,
Mannheim, Deutschland) im heterologen System analysiert. Hierbei kann über die
Abschwächung eines Lumineszenz-Signals eine Aussage über den verbleibenden Prozentsatz
an mRNA gegeben werden. Die Zielsequenz der jeweiligen shRNA wurde hierfür in den
Vektor psiCheckTM-2 (Promega) downstream eines primären Reportergens (Renilla
Luziferase) kloniert. HEK293-Zellen wurden mit diesem Vektor und dem entsprechenden
shRNA-Vektor (FUGW TS16, TS28 oder DKD) über magnetvermittelte Transfektion
(MATra Magnetic Transfection, IBA BioTAGnology, Göttingen, Deutschland) kotransfiziert,
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
92
so dass die Initiierung einer spezifischen RNAi in der Degradierung der Fusions-mRNA
resultierte. Die Höhe der verminderten Luziferase-Aktivität in Relation zu einer sekundären
Referenz-Luziferase (Leuchtkäfer Luziferase) ist ein Maß für die Spezifität und Effizienz der
shRNA. Gemessen wurde die Lumineszenz in einem Multiwellreader (GloMax, Promega)
und die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe des GloMax-Programms (Promega).
4.10 Vektoren und Inserts
Tabelle 1: Verwendete Vektoren und Inserts
Bezeichnung Funktion Inserts
pCMVΔR8.9 Lentiviraler Vektor (Virusproteine) Zufferey et al. (1997)
pVsVg Lentiviraler Vektor (Hüllproteine des vesikulären Stomatitis Virus)
FUGW Lentiviraler Vektor (Transfervektor mit eGFP) Lois et al. (2002)
FUGW H1 Lentiviraler Vektor (Transfervektor mit eGFP und H1-Promotor zur Transkription von shRNAs) verändert nach Lois et al. (2002) von Sergio Leal-Ortiz (Department of Psychiatry and Behavior Sciences, Stanford University, Kalifornien)
FUGW TS16 FUGW H1 + shRNA-Insert Sergio Leal-Ortiz (Department of Psychiatry and Behavior Sciences, Stanford University, Kalifornien)
shRNA gegen Bassoon-mRNA (555-573): CACCTGCACCCAGTGTCAC
FUGW TS28 siehe oben shRNA gegen Piccolo-mRNA (786-804): GTGCTGTCTCCTCTGTTGT
FUGW DKD siehe oben shRNAs gegen Bassoon und Piccolo: siehe oben
psiCheckTM-2 Luziferase Assay Promega
Zielsequenzen für shRNAs TS16 und TS28
pZoff Expressionsvektor für GFP-Fusionsproteine pEGFP-C1, Clontech; verändert
Zielsequenzen für shRNAs TS16 und TS28
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
93
4.11 Lösungen und Medien
Tabelle 2: Verwendete Lösungen und Medien
Lösung Zusammensetzung
Amidoschwarz-Lösung 14,4 g Amidoschwarz auf 1 l Methanol-Essigsäure (9:1)
Blockierungslösung für Western-Blots 5% Magermilchpulver in TBST
Cacodylatpuffer [0,1 M; pH 7,4] 2,14 g Dinatriumdimethylarsinat pH mit HCl einstellen Aqua bidestillata (Aq. bidest.) ad 100 ml
3,3’-Diaminobenzidin-Lösung (DAB) 0,05% in Tris-Puffer
DNA-Ladepuffer 0,25% Bromphenolblau 0,25% Xylen Cyanol FF 30% Glycerol in Aq. bidest.
dNTPs 5 mM 5 µl 100 mM dATP 5 µl 100 mM dCTP 5 µl 100 mM dGTP 5 µl 100 mM dTTP Aq. bidest. ad 100 µl
EDTA [0,5 M; pH 7,5 und 8,0] 0,5 M in Aq. bidest. pH mit NaOH einstellen
Ethidiumbromid-Stammlösung 0,5% in Aq. bidest.
Ethidiumbromid-Gebrauchslösung (1 µg / ml)
80 µl Stammlösung Aq. bidest. ad 400 ml
Glutaraldehyd-Lösung 25% in H2O
Homogenisierungspuffer [pH 7,5] 320 mM Saccharose 4 mM Hepes in Aqua bidest. pH mit NaOH einstellen + Protease-Inhibitor vor Gebrauch frisch zusetzen
Inkubationslösung mit 3% Tierserum für die Elektronenmikroskopie „preembedding“
3% normales Ziegenserum 1% Rinderserumalbumin 0,025% bis 0,1% Triton X-100 in 0,1 M PB
Kulturmedium für HEK 293 / 293T-Zellen und organotypische Retinakultur
10% fötales Rinderserum (FBS) 50 U/ml Penicillin 50 µg/ml Streptomycin in Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham’s F-12
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
94
Lösung Zusammensetzung
LB-Medium [pH 7,2] 10 g Trypton 5 g Hefe-Extrakt 10 g NaCl pH mit NaOH einstellen Aq. bidest. ad 1000 ml
Lysispuffer 0,5 ml 5 M Natriumchloridlösung 0,25 ml 1 M Trizma-Lösung [pH 8,0] Aq. bidest. ad 25 ml
methanolische Essigsäure 10% Eisessig in Methanol
Osmiumtetroxid-Stammlösung 4% in Cacodylatpuffer
PFA-Lösung 4% in 0,1 M PB, im Wasserbad bei 65°C unter ständigem Rühren lösen und anschließend filtrieren
phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) [0,01 M] 8,76 g NaCl 0,2 g KCl 50 ml PB 0,2 M Aq. bidest. ad 1000 ml
Phosphatpuffer 0,2 M (PB) [0,2 M] 43,42 g Na2HPO4 * 7 H2O 5,24 g NaH2PO4 * H2O Aq. bidest. ad 1000 ml
Phosphatpuffer 0,1 M pH 7,4 (PB) [0,1 M] 50% PB 0,2 M in Aq. bidest.
Präinkubationslösung mit 10% Tierserum für die Elektronenmikroskopie „preembedding“
10% normales Ziegenserum 1% Rinderserumalbumin 0,025% bis 0,1% Triton X-100 in 0,1 M PB
Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung 3 g BSA 1 ml NaN3-Stammlösung TBST ad 100 ml
Saccharose 10%, 20%, 30% 10%, 20%, 30% in 0,1 M PB
SDS-Probenpuffer, 1,5 x [pH 8,5] 10 ml Glycerol 3,03 g Trizma-Base 2 g SDS 100 µl 0,5 M EDTA-Lösung [pH 8,0] 10 mg Bromphenolblau pH mit HCl einstellen 30 mg DTT (1,4-Dithiothreitol) pro ml Puffer hinzufügen
Transferpuffer für Western-Blots 8,2 g Bicine 10,5 g BisTris 4 ml EDTA [0,5 M; pH 7,5] 100 ml Methanol Aq. bidest. ad 2000 ml
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
95
Lösung Zusammensetzung
Trizma-Borsäure-EDTA-Puffer (TBE), 10x 108 g Trizma-Base 55 g Borsäure 40 ml EDTA [0,5 M; pH 8,0] Aq. bidest. ad 1000 ml
Trisgepufferte Salzlösung (TBS) 100 ml Tris-Puffer [0,05 M ; pH 7,4] 17,53 g NaCl Aq. bidest. ad 1000 ml
Trisgepufferte Salzlösung mit Tween (TBST) 100 ml Tris-Puffer [0,05 M ; pH 7,4] 17,53 g NaCl 1 ml Tween 20 Aq. bidest. ad 1000 ml
Tris-Puffer [0,05 M; pH 7,4] 12,114 g Trizma Base pH mit HCl einstellen Aq. bidest. ad 1000 ml
Tris-Puffer [1 M; pH 9,5] 24,23 g Trizma Base pH mit HCl einstellen Aq. bidest. ad 100 ml
Triton X-100-Stammlösung 5% in PB oder PBS
4.12 Chemikalien
Tabelle 3: Verwendete Chemikalien Soweit nicht anders erwähnt, stammt die Bezugsquelle aus Deutschland
Reagenz Bezugsquelle
ABC-Kit Vectastain Vector, Wertheim
Aceton Merck, Darmstadt
Agar Sigma, Taufkirchen
Agarose Roche, Mannheim
Amidoschwarz Merck, Darmstadt
Ampicillin Roth, Karlsruhe
Aqua Polymount Polysciences Europe, Eppelheim
Bicine Sigma, Taufkirchen
bovines Serumalbumin (BSA) Fraktion V Merck, Darmstadt
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
Cacodylat (Dinatriumdimethylarsinat) Merck, Darmstadt
Chemolumineszenz-Kit für Western Blot Amersham Biosciences, Freiburg
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
96
Reagenz Bezugsquelle
Deoxycholat Sigma, Taufkirchen
Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP) Invitrogen, Karlsruhe
Diaminobenzidin Sigma, Taufkirchen
1,4-Dithiothreitol (DTT) Boehringer, Mannheim
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham’s F-12
PAA, Cölbe
Einbettmedium für Gefrierschnitte (TFM, englisch: tissue freezing medium)
Reichert-Jung, Heidelberg
Epon-Kunstharz Fluka, Basel, Schweiz
Essigsäure 100% Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid Sigma, Taufkirchen
Fötales Rinderserum (FBS) PAA, Cölbe
Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Basel, Schweiz
Glycerol Merck, Darmstadt
Gold (III)-Chlorid-Chlorwasserstoffsäure Merck, Darmstadt
Hefe-Extrakt BD, Heidelberg
HEPES AppliChem, Darmstadt
Iodacetamid AppliChem, Darmstadt
Isofluran Curamed Pharma, Karlsruhe
Kaliumchlorid Sigma, Taufkirchen
Lipofectamin 2000 Invitrogen, Karlsruhe
Magermilchpulver BioRAD, München
Magnesiumchlorid Invitrogen, Karlsruhe
Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid Roth, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumdocecylsulfat (SDS) Roth, Karlsruhe
Natriumhexacyanoferrat Fluka, Basel, Schweiz
Natriumhydroxid Fluka, Basel, Schweiz
Normales Ziegenserum Sigma, Taufkirchen
Opti-MEM Gibco, Karlsruhe
Osmiumtetroxid Roth, Karlsruhe
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
97
Reagenz Bezugsquelle
Penicillin/Streptomycin PAA, Cölbe
Paraformaldehyd Merck, Darmstadt
Plasmid Purification Kit QIAGEN, Hilden
Poly-D-Lysin Hydrobromid Sigma, Taufkirchen
Polyacrylamidgele NuPAGE 3-8% Invitrogen, Karlsruhe
Ponceau S Solution Sigma, Taufkirchen
Propylenoxid Merck, Darmstadt
Proteaseinhibitorenmischung Roche, Mannheim
Proteinase K Sigma, Taufkirchen
Proteinstandard HiMarkTM Invitrogen, Karlsruhe
Restriktionsenzyme NEB, Frankfurt
Rinderserum, fötales PAA, Cölbe
RNAse-Inhibitor Boehringer, Mannheim
Saccharose D (+) Roth, Karlsruhe
Salzsäure 1 N Roth, Karlsruhe
Salzsäure 37% Merck, Darmstadt
Silbernitrat Merck, Darmstadt
Smart Ladder Eurogentec, Köln
T7 RNA Polymerase Boehringer, Mannheim
TA Cloning Kit Invitrogen, Karlsruhe
Taq-DNA Polymerase Invitrogen, Karlsruhe
Trichloressigsäure Merck, Darmstadt
Trishydroxymethylaminomethan (Base) Sigma, Taufkirchen
Trishydroxymethylaminomethan (HCl) Sigma, Taufkirchen
Triton X-100 Sigma, Taufkirchen
Trypsin-EDTA PAA, Cölbe
Trypton BD, Heidelberg
Tween 20 Merck, Darmstadt
Uranylacetat Agar Scientific, Stansted, England
Wasserstoffperoxid 30% Merck, Darmstadt
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
98
4.13 Geräte und Hilfsmittel
Tabelle 4: Verwendete Geräte und Hilfsmittel Soweit nicht anders erwähnt, stammt die Bezugsquelle aus Deutschland
Gerät bzw. Hilfsmittel Bezugsquelle
Adobe Photoshop CS Adobe Systems, München
AxioImager Z1 mit Apotom-Funktion Zeiss, Oberkochen
Axiovert 200 Zeiss, Oberkochen
Axiovision 4.6 Zeiss, Oberkochen
Bakterienschüttler G24 New Brunswick Scientific, Nürtingen
Binokular SMZ1000 Nikon, Düsseldorf
Blotkammer Trans-Blot Cell BioRAD, München
Brutschrank Hera cell 150 Heraeus, Hanau
Corel Draw 11.0 Corel Corporation, Unterschleißheim
Deckgläser 24x24 mm Menzel-Gläser, Braunschweig
DNA-Photometer ND1000 Thermo Scientific, Langenselbold
Elektronenmikroskop Zeiss EM 10 Zeiss, Oberkochen
Entwicklermaschine Curix60 Agfa, Leverkusen
Filter 0,8 µm, black, AABP, 25 mm Millipore, Schwalbach
Gatan BioScan Digitalkamera GATAN, München
Geldokumentationssystem Eagle Sight Stratagene, Amsterdam, Holland
Gelelektrophoresekammer Xcell SureLock Mini-Cell Invitrogen, Karlsruhe
Gelelektrophoresekammer für PCR Peqlab, Erlangen
Kontrastiergerät (EM STAIN) Leica, Wetzlar
Kryostat CM3050 S Leica, Wetzlar
Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 5 Pascal) Zeiss, Oberkochen
MATra Magnetplatte IBA BioTAGnology, Göttingen
MATra Reagenz IBA BioTAGnology, Göttingen
Megafuge 1.0R Heraeus, Hanau
Mikrotom Ultracut S Reichert-Jung, Heidelberg
Multiwellplatten Nunc, Wiesbaden
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
99
Gerät bzw. Hilfsmittel Bezugsquelle
Multiwellreader GloMax Promega, Mannheim
Nitrocellulosefilter Schleicher & Schuell, Dassel
Objektträger Menzel-Gläser, Braunschweig
Pap-Pen SCI Science Service, München
Photometer LC55 Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA
PVDF-Membranen für Western Blot WESTRAN® Schleicher & Schuell, Dassel
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Reconstruct v1.0.3.0 J. Fiala, Medical College of Georgia, USA
Röntgenfilme BioMax MR Film Kodak, New York, USA
Tankblotkammer BioRAD, München
Thermocycler PTC-225 DNA Engine Tetrad Cycler MJ Research, Ramsey, Minnesota, USA
Thermoschüttler Eppendorf, Hamburg
Ultramikrotom Reichert-Jung, Heidelberg
Vibratom VT 1000S Leica, Wetzlar
Wärmeschrank U25 Memmert, Schwabach
Wasserbad Memmert, Schwabach
Zentrifuge Optima Max Beckman Coulter, Fullerton, Kalifornien, USA
Zentrifuge Sorvall RC-5B Thermo, Langenselbold
Zentrifuge 5417R Eppendorf, Hamburg
Zentrifuge 5424 Eppendorf, Hamburg
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
100
4.14 Primärantikörper
Tabelle 5: Verwendete Primärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen Alle verwendeten Maus-Antikörper sind monoklonal, die Kaninchen- und Meerschweinchen-Antikörper sind polyklonal
Antigen Wirt Bezugsquelle Verdünnung Immunzytoch.
Verdünnung Western Blot
pan α1 (Ca2+-Kanal UE) Kaninchen Alomone 1:500
Bassoon sap7f Kaninchen J. H. Brandstätter, Univ. Erlangen-Nürnberg 1:16.000
CaB5 Kaninchen F. Haeseleer, University of Washington 1:1000
Calbindin Maus Swant 1:1000
Calretinin Kaninchen Swant 1:1000
CAST1 Kaninchen E. D. Gundelfinger, Leibniz-Inst., Magdeburg 1:5000 1:2500
CtBP2 Maus BD Transduction 1:10.000 1:5000
GFP Maus Chemicon 1:400
GFP Kaninchen Molecular Probes 1:2000
Glycogenphosphorylase Kaninchen B. Hamprecht Univ. Tübingen 1:2000
pan Munc13 Maus BD Transduction 1:1000 1:500
Piccolo 44a Meerschw. E. D. Gundelfinger, Leibniz-Inst., Magdeburg 1:8000 1:5000
PKCα Maus BD Transduction 1:10.000
PNA (FITC-gekoppelt) Vector Laboratories 1:1000
RIBEYE Kaninchen J. H. Brandstätter, Univ. Erlangen-Nürnberg 1:1000
RIM Maus BD Transduction 1:800
RIM1 Kaninchen Synaptic Systems 1:500
RIM2 Kaninchen Synaptic Systems 1:1000
VGLUT1 Meerschw. Chemicon 1:50.000
Material und Methoden ___________________________________________________________________________
101
4.15 Sekundärantikörper
Tabelle 6: Verwendete Sekundärantikörper für die Immunzytochemie und Western Blot-Analysen HRP = Meerrettich-Peroxidase (englisch: horse radish peroxidase)
IgG-Konjugat Wirt und Antigen Hersteller Verdünnung Fluorophor-Spezifikationen
Ziege anti-Maus
Ziege anti- Kaninchen
AlexaFluor 594TM
Ziege anti- Meerschweinchen
Anregung: λmax = 590 nm Emission: λmax = 617 nm
Ziege anti-Maus
Ziege anti- Kaninchen
Alexa Fluor 488TM
Ziege anti- Meerschweinchen
Molecular Probes 1:500
Anregung: λmax = 495 nm Emission: λmax = 519 nm
Ziege anti-Maus
Ziege anti- Kaninchen Cy3TM
Ziege anti- Meerschweinchen
Anregung: λmax = 550 nm Emission: λmax = 570 nm
Ziege anti-Maus
Ziege anti-Kaninchen Cy5TM
Ziege anti- Meerschweinchen
Dianova 1:200
Anregung: λmax = 649 nm Emission: λmax = 670 nm
Ziege anti-Maus Sigma
Ziege anti- Kaninchen NEB HRP
Ziege anti- Meerschweinchen Dianova
1:10.000
Ziege anti-Maus
Ziege anti- Kaninchen Biotin
Ziege anti- Meerschweinchen
Vector Laboratories 1:100
Atto 633 Ziege anti- Kaninchen Atto-Tec 1:1000
Anregung: λmax = 633 nm Emission: λmax = 654 nm
Zusammenfassung ___________________________________________________________________________
102
Zusammenfassung Nervenzellen übermitteln Informationen an hochspezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen.
Die Singalweitergabe an chemischen Synapsen geschieht an der aktiven Zone, die für die
räumlich und zeitlich organisierte und regulierte Transmitterausschüttung essentiell ist. Ein
Modellsystem zur Untersuchung der Zusammensetzung, Struktur und Funktion der
präsynaptischen aktiven Zone ist der Bandsynapsen-Komplex in Photorezeptoren der Retina.
Der Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex ist auf die tonische Ausschüttung des
Transmitters Glutamat und die Übertragung feinster graduierter Unterschiede in der
Lichtintensität spezialisiert. Er setzt sich aus zwei räumlich getrennten Subkompartimenten
zusammen - dem Bandkompartiment und dem darunterliegenden arciform density /
Plasmamembran-Kompartiment. Das Zytomatrix-Protein Bassoon wurde als molekulare
Verbindung zwischen den beiden Kompartimenten identifiziert.
Eine zentrale Frage in der Synapsenforschung ist die Frage nach dem Zusammenbau der
aktiven Zone während der Synaptogenese. In konventionellen chemischen Synapsen erfolgt
der Transport von Proteinen der aktiven Zone zur präsynaptischen Endigung auf Vesikeln,
den Piccolo-Bassoon Transport Vesikeln (PTVs). Die Fusionierung der PTVs mit der
Plasmamembran resultiert in der schnellen Neubildung einer aktiven Zone.
In meiner Dissertation befasste ich mich mit der Frage, ob der hochkomplexe Photorezeptor-
Bandsynapsen-Komplex ebenfalls über PTVs gebildet wird. Ich konnte zeigen, dass
Zytomatrix-Proteine des Bandkompartiments - Piccolo, RIBEYE, RIM1 - und das
Verbindungsmolekül Bassoon früh in der postnatalen Retinogenese exprimiert und teilweise
gemeinsam als elektronendichte, nicht-vesikuläre, sphärische Komplexe – den precursor
spheres - zu den zukünftigen Photorezeptor-Terminalien transportiert werden. Proteine des
arciform density / Plasmamembran-Kompartiments - Munc13-2, CAST1, RIM2 und die Ca2+-
Kanal Untereinheit α1 - sind nicht mit den precursor spheres assoziiert und aggregieren erst
nach deren Ankunft im Terminal. Dort ändern die precursor spheres ihre Form zu
gestreckten, stabförmigen Bändern und werden anschließend an der Plasmamembran
verankert. Verankerte Bänder sind noch nicht völlig ausgereift und nehmen noch an Größe zu.
Dieses Größenwachstum wird vermutlich über die lokale Zufuhr kleinerer Proteinmengen
vollzogen. PTVs oder PTV-ähnliche, elektronendichte Vesikel konnten zu keiner Zeit
während der Photorezeptor-Synaptogenese beobachtet werden.
Bassoon spielt eine prominente Rolle bei der Bildung des Photorezeptor-Bandsynapsen-
Komplexes. Die Untersuchungen an der Bassoon-mutanten Retina zeigten, dass Bassoon
Zusammenfassung ___________________________________________________________________________
103
nicht nur bei der Verankerung der präsynaptischen Bänder eine elementare Rolle spielt,
sondern bereits bei der Aggregierung der precursor spheres. Für den generellen Transport von
Zytomatrix-Proteinen des Bandkompartiments zum Photorezeptor-Terminal ist Bassoon
jedoch nicht essentiell.
Photorezeptoren haben sich nicht nur in der Ausbildung des präsynaptischen Bandes
spezialisiert, sondern haben sich auch in ihrer Proteinausstattung an die tonische Freisetzung
von Glutamat angepasst. Zwei Photorezeptor-spezifische Proteine sind die SNARE-Komplex
regulierenden Complexin-Isoformen 3 und 4. ERG-Messungen von Complexin 3 und 4
Einzel-Knockout-Retinae zeigten unter anderem eine reduzierte b-Wellen-Amplitude und
Veränderungen in der zeitlichen Komponente der b-Welle. Diese Veränderungen sprechen für
eine beeinträchtigte Signalübertragung von den Photorezeptoren auf die nachgeschalteten
ON-Bipolarzellen. Die gemessenen Effekte in der Complexin 3 und 4 Doppel-KO-Retina
waren stärker als in den Einzel-KO-Retinae, was für eine kooperative Funktion der beiden
Complexin-Isoformen an den Photorezeptor-Bandsynapsen spricht.
Licht- und elektronenmikroskopische Analysen der OPL zeigten, dass die beeinträchtigte
Signalübertragung von Photorezeptoren auf ON-Bipolarzellen in einem sekundären Effekt
zum Ablösen von Bandmaterial in den beeinträchtigten Photorezeptor-Terminalien führt.
Somit scheinen die Complexine 3 und 4 nicht essentiell für die Entwicklung einer
funktionstüchtigen Bandsynapse zu sein, aber sie spielen eine wichtige Rolle bei der exakten
Ca2+-vermittelten Exozytose in Photorezeptor-Terminalien.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde darüber hinaus ein lentivirales System zur Einschleusung von
DNA in Photorezeptoren der organotypischen retinalen Explantkultur etabliert. Mit der
Transfektion spezifischer siRNAs wurde gezeigt, dass die effektive Herabregulierung der
mRNA von Zytomatrix-Proteinen der aktiven Zone, wie Bassoon und Piccolo, in
Photorezeptoren möglich ist. Es wird somit in Zukunft realisierbar sein, funktionelle Eingriffe
in den Photorezeptor-Bandsynapsen-Komplex zur Untersuchung von Genfunktionen
durchzuführen, ohne auf die Generierung von Knockout-Tieren angewiesen zu sein.
Summary ___________________________________________________________________________
104
5 Summary Neurons communicate with each other via highly specialized junctions, the synapses. The
transmission of information from one neuron to the other occurs at the active zone, which is
essential for the spatially and temporally organized and regulated transmitter release. A model
system to study active zone structure and function is the retinal photoreceptor ribbon synapse.
It is structurally and functionally specialized for the tonic release of the neurotransmitter
glutamate and it is characterized by the presynaptic ribbon, an electron-dense organelle
covered by hundreds of synaptic vesicles. The photoreceptor ribbon synaptic complex can be
divided into two molecular compartments, the ribbon compartment and the arciform density /
plasmamembrane compartment. Bassoon is the molecular link between these two
compartments.
A key question for understanding synapse structure and function is how the active zone is
assembled during synaptogenesis. Cytomatrix-carrying dense core transport vesicles, the so
called Piccolo-Bassoon-transport-vesicles (PTVs), are implicated in early steps of synapse
formation in conventional synapses. They carry a comprehensive set of active zone proteins
and, upon fusion with the presynaptic plasma membrane, lead to the rapid formation of a
functional active zone.
In this thesis I asked the question, whether the highly specialized photoreceptor ribbon
synaptic complex is also assembled from PTVs during synaptogenesis. The cytomatrix
proteins Bassoon, Piccolo, RIBEYE, and RIM1 appear early in synaptogenesis and are
transported in non-membranous, electron-dense, spherical transport units - so called precursor
spheres - to the future photoreceptor presynaptic site. Other cytomatrix proteins, i.e. Munc13-
2, CAST1, RIM2, and an L-type Ca2+ channel α1 subunit are not associated with the precursor
spheres. They cluster directly at the active zone some time after the first set of cytomatrix
proteins has arrived. In the developing photoreceptor synaptic terminals the precursor spheres
loosely congregate close to the membrane, rapidly change their shape to a ribbon-like
appearance and attach to the membrane. After attachment, the maturation of anchored ribbons
is not yet fully completed as anchored ribbons continue to grow for some time. This ribbon
material presumably derives from local protein supply. PTVs or PTV-like electron-dense
vesicles were not detected during photoreceptor synaptogenesis.
Bassoon plays an important role in the development of the photoreceptor ribbon synaptic
complex. Analysis of the Bassoon mutant retina further revealed that Bassoon is important for
Summary ___________________________________________________________________________
105
early stages in the assembly of the precursor spheres but not for the transport of cytomatrix
proteins of the ribbon compartment to the future synaptic site.
Photoreceptors have adapted to tonic transmitter release with the expression of a specialized
set of presynaptic proteins. Complexin 3 and 4, two isoforms of the SNARE complex
regulating Complexin-protein family, are specifically expressed in rod and cones. To test
whether the function of Complexins 3 and 4 contributes to the highly efficient transmitter
release of ribbon synapses, retina function and structure in Complexin 3 and 4 single and
double knockout mice were analyzed. ERG recordings revealed reduced b-wave amplitudes
and prolonged b-wave implicit times. This indicates that the continuous adjustment and fine-
tuning of transmitter release at the photoreceptor ribbon synapse, which is necessary to
faithfully reflect the changes in membrane potential to changing light intensities, is defective.
In the Complexin 3/4 double knockout retina, the reduction of the b-wave amplitude is larger
than expected from a mere addition of the effects of the single knockouts. These changes have
to be explained by a cooperative effect of the two complexin isoforms at photoreceptor ribbon
synapses.
In the Complexin 3/4 double knockout retina a high number of photoreceptor terminals
contain spherical shaped free floating ribbons, which are not observed in the wildtype at the
same age. This may be a secondary consequence of the disturbed synaptic activity in the
Complexin 3/4 double knockout retina. Complexin 3 and 4 do not seem to be essential for the
formation of a functional ribbon synapse, but they play an important role in the finetuning of
Ca2+ triggered transmitter release at photoreceptor ribbon synapses.
In my thesis I also established a lentiviral system to transfect photoreceptors in organotypic
retinal explant culture. I could show, that Piccolo and Bassoon mRNA were efficiently
knocked down after lentiviral transfection of specific siRNAs. Thus, in future it will be
possible to study gene function in photoreceptors of the retina without the generation of
genetically altered animals.
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Danksagung ___________________________________________________________________________
116
7 Vielen Dank…
Für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die Bereitstellung des spannenden Themas und die
umfassende Betreuung bedanke mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. Brandstätter.
Für die Möglichkeit, Teile meiner Doktorarbeit in der neuroanatomischen Abteilung am Max-
Planck-Institut für Hirnforschung anfertigen zu dürfen, danke ich Herrn Prof. Dr. Wässle.
Für die Betreuung während meines Aufenthalts an der Stanford Universität, Kalifornien,
danke ich Herrn Prof. Dr. Garner, sowie Herrn Prof. Dr. Gundelfinger für die Betreuung aus
der Ferne. Hier sei auch Sergio Leal-Ortiz genannt, der mir die Welt der Viren erschlossen
hat.
Für die freundschaftliche und entspannte Arbeitsatmosphäre am Max-Planck-Institut für
Hirnforschung danke ich meiner -leider- ehemaligen Arbeitsgruppe Susu und Dana. Vielen
Dank auch an das „befreundete Nachbarlabor“. Es hat viel Spaß gemacht!
Für die Möglichkeit, hin und wieder Arbeiten im S2-Labor seiner Abteilung durchführen zu
können, danke ich Herrn Prof. Dr. Wolfrum von der Universität Mainz. Vielen Dank auch an
alle anderen „Wolfrums“. Es war immer schön, mal wieder in Mainz zu sein!
Für die tolle Arbeitsatmosphäre im Department Biologie, Abteilung für Tierphysiologie an
der Universität Erlangen-Nürnberg danke ich meiner lieben Arbeitsgruppe! Ihr habt mir alle
den Start in der neuen Umgebung sehr erleichtert und ich fühle mich pudelwohl bei euch! Auf
die Zukunft!
Für das Dasein in allen Lebenslagen, die Fähigkeit Kraft zu spenden und die immer offenen
Ohren danke ich Heidi und Manfred.
Tobias! Dafür, dass es uns beide gibt und wir das gemeinsam geschafft haben!
Eidesstattliche Erklärung ___________________________________________________________________________
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8 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, Hanna Regus-Leidig, dass ich diese Doktorarbeit selbständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Ich habe keinen
anderen Promotionsversuch unternommen.
Erlangen, den 3. Juni 2008
Hanna Regus-Leidig
Publikationen ___________________________________________________________________________
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9 Publikationen
tom Dieck, S., Altrock, W.D., Kessels, M.M., Qualmann, B., Regus, H., Brauner, D., Fejtová,
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photoreceptor ribbon synapse: physical interaction of Bassoon and RIBEYE is essential
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in the assembly of photoreceptor ribbon synapses: The involvement of precursor
spheres. J Neurosci. (eingereicht)
Reim, K., Regus-Leidig, H., Ammermüller, J., Brandstätter, J.H., Brose, N. (2008) Aberrant
Function and Structure of Retinal Ribbon Synapses in the Absence of Complexins 3 and
4. (eingereicht)
Technische Mitarbeit:
Rauch, A., Thiel, C.T., Schindler, D., Wick, U., Crow, Y.J., Ekici, A.B., van Essen, A.J.,
Goecke, T.O., Al-Gazali, L., Chrzanowska, K.H., Zweier, C., Brunner, H.G., Becker,
K., Curry, C.J., Dallapiccola, B., Devriendt, K., Dörfler, A., Kinning, E., Megarbane,
A., Meinecke, P., Semple, R.K., Spranger, S., Toutain, A., Trembath, R.C., Voss, E.,
Wilson, L., Hennekam, R., de Zegher, F., Dörr, H.G., Reis, A. (2008) Mutations in the
pericentrin (PCNT) gene cause primordial dwarfism. Science. 319(5864):816-9.
Lebenslauf ___________________________________________________________________________
119
Persönliche Daten Vorname Hanna Nachname Regus-Leidig, geb. Regus Geburtsdatum 13. März 1979 Geburtsort Kassel Familienstand verheiratet Nationalität deutsch Adresse Nürnberger Strasse 112 90762 Fürth Telefon ++49 911 3479834 Mobil ++49 173 8839751 E-Mail [email protected] Ausbildung 11/2004 – 06/2008 Promotion am Max-Planck-Institut für Hirnforschung,
Frankfurt am Main und an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Titel: Die Photorezeptor-Bandsynapse der Säuger-Retina: Untersuchungen zur Entwicklung, Struktur und Funktion einer komplexen chemischen Synapse
01/2004 – 09/2004 Diplomarbeit am Max-Planck-Institut für Hirnforschung, Frankfurt am Main Titel: Untersuchungen zur Zusammensetzung des Photo-rezeptor-Bandsynapsen-Komplexes in der Retina der Maus
07/2001 – 07/2002 Erasmus-Stipendiatin an der Universität Bergen, Norwegen 04/1999 - 09/2004 Studium an der Johannes Gutenberg-Universität, Mainz
Studiengang: Diplom-Biologie mit den Schwerpunkten: Zoologie, Genetik, Immunologie
09/1995 – 06/1998 Jacob-Grimm-Schule, Oberstufengymnasium in Kassel
Schulabschluß: Abitur Extracurriculäre Aktivitäten 04/2005 – 06/2005 Forschungsaufenthalt im Rahmen der Promotion an der
University of Stanford, Kalifornien Department of Psychiatry and Behavior Sciences 05/2003 Praktikum an der University of Leicester, England
Department of Microbiology and Immunology 09/1998 – 12/1998 Volontariat am Christiana Care Hospital, Newark, Delaware
Hanna Regus-Leidig – Lebenslauf
