Die Rolle der antimikrobiellen Peptide und des E-Cadherins in der

Pathogenese der Nekrotisierenden Enterokolitis

Der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. med. vorgelegt von Agnes Kaiser

aus Neustadt a.d. Waldnaab

Als Dissertation genehmigt

von der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Mai 2014

Dekan (Vorsitzender des Promotionsorgans): Prof. Dr. med. Dr. h.c.

Jürgen Schüttler

Gutachter: Prof. Dr. Henrik Köhler

Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Rascher

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung 1

1.1. Hintergrund und Ziele der Arbeit 1

1.2. Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden) 1

1.3. Ergebnisse 1

1.4. Schlussfolgerungen 2

2. Summary 3

2.1. Background and Aims of This Thesis 3

2.2. Methodology (subjects, materials and research methods) 3

2.3. Results 3

2.4. Conclusions 4

3. Einleitung 5

3.1. Das Krankheitsbild der Nekrotisierenden Enterokolitis 5

3.1.1. Diagnostik, Therapie, Prognose 5

3.1.2. Epidemiologie 7

3.2. Entstehungsgrundlagen, Modelle der Pathogenese 7

3.2.1. Gastrointestinale Schutzfunktionen 8

3.2.2. Bakterien und Ernährung, zelluläre Transmitter 10

3.2.3. Zelluläre und immunologische Abwehr 13

3.2.4. Andere Risikofaktoren 16

4. Material und Methoden 18

4.1. Patientencharakteristika 18

4.2. Immunhistochemie 21

4.3. TaqMan-PCR 25

5. Ergebnisse 30

5.1. Immunhistochemische Färbungen 30

5.1.1. E-Cadherin 30

5.1.2. α-Defensin 3/5 31

5.1.3. TFF1 34

5.1.4. TFF2 36

5.1.5. LL-37 38

5.1.6. GKN1 40

5.2. PCR der Schnitte 41

6. Diskussion 42

7. Literaturverzeichnis 50

8. Abkürzungsverzeichnis 56

9. Danksagung 59

10. Erklärung 60

11. Lebenslauf 61

1

1. Zusammenfassung

1.1. Hintergrund und Ziele der Arbeit

Die nekrotisierende Enterokolitis (NEC) ist eine der Erkrankungen, die an

Häufigkeit zunimmt, weil sie vornehmlich die frühgeborenen Kinder betrifft.

Welcher entscheidende Mechanismus zur Erkrankung führt, ist heute immer noch

unklar, weshalb Therapie, Prophylaxe und Nachsorge große Herausforderungen

darstellen. Es sei auf diverse Studien von Salzman, Vieten und Schaart (Salzman et

al. 1998, Schaart et al. 2009, Vieten et al. 2005) hingewiesen, die antimikrobielle

Peptide (AMPs) bei NEC-Patienten im Darm untersucht haben und zu teilweise

unterschiedlichen Ergebnissen gekommen sind. Man vermutet mit einer

Verminderung dieser Peptide Parallelen zu den chronisch entzündlichen

Darmerkrankungen. Da die Probandenkollektive für jede der Studien nicht sehr groß

sind, war ein Ziel der vorliegenden Studie, die AMPs α-Defensin 5, TFF1 und

TFF2, LL-37 und das Peptid GKN1 in Expression und Darstellung im Darm (hier

ebenfalls E-Cadherin) zu untersuchen.

1.2. Methoden (Patienten, Material und Untersuchungsmethoden)

Für die Untersuchung griffen wir auf Resektate aus Operationen am Dünndarm

zurück, die in den Jahren von 1998 bis 2009 an der Universitätskinderklinik

Erlangen gesammelt wurden. Für die immunhistologischen Untersuchungen von E-

Cadherin, α-Defensin 5, TFF1, TFF2, LL-37 und GKN1 kamen sieben NEC-

Patienten zur Auswertung. Die drei Kontrollen stammten aus Operationen bei

Atresie oder Mekoniumileus. Um den Verlauf nach NEC zu untersuchen, wurden

fünf Patienten untersucht, die sich einer Stomarückverlagerungsoperation oder einer

Operation bei Stenose unterziehen mussten. Um die Expression des α-Defensin 5,

TFF1, TFF2, LL-37 und GKN1 zu untersuchen, kamen für die TaqMan-PCR vier

NEC-Patienten-, drei Verlauf-NEC-Patienten- und drei Kontroll-Patienten-Proben

zur Auswertung. Die Ergebnisse der PCR wurden nicht quantitativ ausgewertet.

1.3. Ergebnisse

Wir konnten nur geringe Unterschiede zwischen NEC- und Kontrollgruppe in der

immunhistologischen Färbung und der Expression feststellen. Es lassen sich

tendenziell mehr Panethzellen und damit α-Defensin 5, mehr TFF1 und LL-37 bei

der akuten NEC detektieren. In der Verlaufgruppe finden sich intensivere Färbungen

2

von α-Defensin 5 und Expression von TFF2, die sich in den anderen Gruppen nicht

zeigt. Die Expression von TFF1 zeigt sich in allen Gruppen. Vieten et al. kamen hier

zu anderen Ergebnissen (Vieten et al. 2005).

1.4. Schlussfolgerungen

Es zeigen sich Hinweise bei der NEC, die Produktion der AMPs zu steigern,

eventuell läuft diese Reaktion aber zu langsam und zu schwach ab. Möglicherweise

rühren jedoch die deutlicheren Unterschiede in der Verlaufgruppe nur daher, dass

die Patienten dieser Gruppe älter sind als die der anderen. Der Schluss einer

absoluten Verminderung der AMPs, entweder genetisch oder anderweitig bedingt,

kann für den Fall einer akuten NEC nicht gezogen werden. Leider kann bei diesen

Untersuchungen nicht beurteilt werden, wie sich die Verteilung vor Manifestation

der Erkrankung darstellt. Auch lassen sich kleine Unterschiede mit

immunhistologischer Färbung womöglich gar nicht sicher detektieren. Unser

Patientenkollektiv war von der Altersverteilung in den Gruppen NEC und Kontrolle

vergleichbar. Für niedrigere Gestationsalter konnten in anderen Studien verringerte

Mengen an α-Defensinen (Mallow et al. 1996) und β-Defensinen (Richter et al.

2010) nachgewiesen werden. Unklar bleibt, weshalb einzelne reifgeborene Kinder

erkranken.

3

2. Summary

2.1. Background and Aims of This Thesis

Necrotising enterocolitis (NEC) primarily affects premature infants. The definitive

cause of this condition remains obscure, which is why treatment, preventive care

and follow-up pose great challenges. In several studies Salzman, Vieten and Schaart

(Salzman et al. 1998, Schaart et al. 2009, Vieten et al. 2005) analysed antimicrobial

peptids (AMPs) in the intestines of NEC patients, with differing results. It is

assumed that the decrease of these peptides is connected with NEC and chronic

inflammatory bowel diseases. Since all of these studies were conducted on small

groups of test subjects, this thesis is to analyse the expression and representation of

α-defensin 5, TFF1, TFF2, LL-37 AMPs (only representation of α-defensin 3 and E-

cadherin) and the GKN1 peptides in the bowel in another study.

2.2. Methodology (subjects, materials and research methods)

Resections from small intestine, which were collected in the years between 1998

and 2009 at the university’s children’s hospital in Erlangen, were used for research.

Seven NEC patients were examined for the immunohistochemical analysis of E-

cadherin, α-defensin 5, TFF1, TFF2, LL-37 and GKN1. The three control samples

used came from atresia or meconium ileus surgeries because. In order to analyse

post-NEC development five patients which had to undergo ostomy conversion or

stenosis surgery were examined. In order to analyse the expression of α-defensin 5,

TFF1, TFF2, LL-37 and GKN1, samples from four current NEC patients, three

patients developing NEC and three control patients were examined using TaqMan

PCR. The PCR results were not analysed quantitatively.

2.3. Results

No wide differences could be detected between NEC patients and the control group

using immunohistochemical tinting and expression. In acute cases of NEC more

paneth cells and therefore α-defensin 5, more TFF1 and LL-37 may be detected. The

NEC developing group showed stronger tints of α-defensin 5 and expression of

TFF2, which did not occur in the other groups. TFF1 is expressed in all groups.

Here the findings of Vieten et al. differ (Vieten et al. 2005).

4

2.4. Conclusions

A potential for NEC to raise AMP production could be observed, however, this

reaction may occur too slowly. The differences between the groups may be a result

of the patients in the NEC developing group being older than patients in the other

groups. Acute NEC cannot be linked to an absolute drop of AMP levels, neither

genetically nor otherwise. Unfortunately these analyses cannot show AMP

distribution before the manifestation of NEC. It is also possible that small

differences cannot be measured accurately using immunohistochemical tinting. The

patients in the NEC and control groups were of similar ages, which may be another

reason for the lack of measurable differences and the difference in the NEC

developing group. Other studies have proven decreased amounts of α-defensins

(Mallow et al. 1996) and β-defensins (Richter et al. 2010) for younger gestational

ages. It remains uncertain why individual term infants develop the disease.

5

3. Einleitung

Die nekrotisierende Enterokolitis ist eine der Erkrankungen, die nicht trotz, sondern

vielmehr gerade wegen der medizinischen Fortschritte an Häufigkeit zunimmt, weil

sie vornehmlich die frühgeborenen Kinder betrifft. Die Pathogenese ist nicht

vollständig geklärt. Es gibt Puzzleteile und verschiedene Modelle. Eine große

Bedeutung wird den antimikrobiellen Peptiden in der Darmschleimhaut

beigemessen. In unserer Arbeit haben wir α-Defensin 5, die trefoil factors TFF1 und

2, das Cathelicidin LL-37, das Gastrokin GKN1 und das E-Cadherin bei NEC-

Patienten und Kontrollen sowohl färberisch zur Darstellung gebracht als auch ihre

Expression (mit Ausnahme von E-Cadherin) mittels PCR gemessen. Die These war,

dass diese Peptide in der Darmschleimhaut bei akuter NEC verringert sind.

Untersuchungsmaterial waren für diese Peptide Dünndarmschnitte.

3.1. Das Krankheitsbild der Nekrotisierenden Enterokolitis

3.1.1. Diagnostik, Therapie, Prognose

Die NEC ist eine Darmerkrankung, die nur Säuglinge und von diesen besonders

frühgeborene Neugeborene betrifft. Sie trat früher wie heute auf, ja sie ist eine der

Krankheiten, deren Inzidenz zunimmt. Gründe dafür mögen einerseits die bessere

Versorgung frühgeborener Kinder sein, die es heute immer häufiger zu Wege bringt,

dass auch kleinste Kinder, die mit 23 Schwangerschaftswochen geboren werden,

überleben (Ramsay and Santella 2011). Andererseits hat die in den letzten 40 Jahren

verstärkte Forschung auf diesem Gebiet bewirkt, dass heute ein erhöhtes

Augenmerk darauf gelegt wird und Pädiater für diese Erkrankung sensibilisiert sind.

Die Gefahr, diese Erkrankung zu entwickeln, besteht nur ein paar Wochen bis etwa

drei Monate nach Geburt. Wobei jedoch zu beachten ist, dass, je jünger das Kind bei

der Geburt ist, desto länger nach der Geburt die Gefahr besteht, eine NEC zu

entwickeln (González-Rivera et al. 2011). Die Krankheit umfasst in ihrer

Präsentation ein breites Spektrum. Das Krankheitsbild reicht von systemischen

Zeichen wie Apnoen, Bradykardie und geblähtem Abdomen ohne weitere

sonographische oder röntgenologische Zeichen (Bell Stadium I) bis zur

Darmperforation und Sepsis (Bell Stadium III) (siehe Abbildung 1). Erste Zeichen

sind meist Apnoen und Bradykardie. Dann treten die abdominellen Symptome hinzu

wie ein geblähter Bauch, blutige Stühle und Magenreste. In diesem Stadium I wird

zunächst nur von einer suspekten NEC gesprochen. Andere neonatale Erkrankungen

6

müssen ausgeschlossen werden, indem Elektrolyte kontrolliert, infektiöse Ursachen

in Betracht gezogen oder Intoxikationen durch die Mutter ausgeschlossen werden.

Im Bell-Stadium II, der gesicherten NEC, kommen fehlende Darmgeräusche und

eine Abwehrspannung des Abdomens hinzu. Radiologisch oder sonographisch lässt

sich die pathognomonische Pneumatosis intestinalis, die intramurale Luft in der

Darmwand, darstellen oder Luft in den Portalvenen. Es treten schwerere

systemische Beschwerden, eine metabolische Azidose und Thrombozytopenie auf.

Wichtigste und erste Maßnahme zur Therapie ist das Absetzen der oralen Nahrung.

Die Nahrungskarenz entlastet den Darm, in dem sich die Nahrung staut. Eine

Magensonde wird gelegt um Magenreste ableiten zu können. Zusätzlich obligat ist

eine breite antibiotische Therapie, meist bestehend aus einem β-Laktam-

Antibiotikum, einem Aminoglykosid (wie Tobramycin oder Gentamicin) oder

Glykopeptid (wie Vancomycin) und Metronidazol. Im Stadium III ist die Operation

dringend indiziert, kann aber schon im Stadium II notwendig sein. Bei der Operation

zeigt sich ein nekrotischer Darm mit Schleimhautödem, Hämorrhagie und

mukosaler Ulzeration. Die Entscheidung dazu muss individuell gefällt werden (Bell

et al. 1978). Bis zu 50% der NEC-Fälle müssen operiert werden (Ade-Ajayi et al.

1996). Meist wird in einer ersten Operation ein Enterostoma angelegt, das in einer

Folge-Operation nach ein bis zwei Monaten wieder revidiert wird. Komplikationen

der Operation sind das Kurzdarmsyndrom nach ausgedehnten Resektionen,

Strikturen mit notwendiger Reoperation, Platzbauch und intraabdominelle Abszesse

(Lin and Stoll 2006). Die schwere Komplikation der Sepsis bei einer NEC wird mit

einer Inzidenz von 20-40% angegeben (Bhatia 2010).

Stadium I: V. a. NEC milde systemische Zeichen: Apnoe, Bradykardie, Temperaturschwankungen milde intestinale Zeichen: aufgetriebenes Abdomen, Magenreste, blutige Stühle radiologisch unauffällig Stadium II: gesicherte NEC milde bis mäßige systemische Zeichen intestinal zusätzlich fehlende Darmgeräusche, abdomineller Druckschmerz spezifische radiologische Zeichen: Pneumatosis intestinalis oder portalvenöse Luft Laborveränderungen: metabolische Azidose, Thrombozytopenie Stadium III: fortgeschrittene NEC schwere systemische Krankheit: Hypotension intestinal zusätzlich auffallend aufgetriebenes Abdomen, Peritonitis schwere radiologische Zeichen: Pneumoperitoneum zusätzliche Laborveränderungen: auch respiratorische Azidose, DIC Abbildung 1: Stadien der nekrotisierenden Enterokolitis nach Bell (Lin and Stoll 2006)

7

3.1.2. Epidemiologie

In der Literatur sind inzwischen etliche prädisponierende Faktoren beschrieben, die

genaue Ätiologie ist jedoch weiterhin unklar. Die schon erwähnte Frühgeburtlichkeit

spielt mit dem Geburtsgewicht die größte Rolle für die Entwicklung einer NEC und

auch für die Prognose in Bezug auf die Mortalität. Die Inzidenz der Erkrankung

liegt bei 0,5 bis 5 pro 1000 Lebendgeburten (Lin and Stoll 2006). Für besonders

leichte Kinder ist die Inzidenz höher: In einer Fall-Kontroll-Studie des NICHD

(National Institute of Child Health and Human Development) erkrankten 11,5% der

Kinder mit einem Geburtsgewicht von 401-750g, 9,1% mit einem Geburtsgewicht

von 751-1000g, 6,0% mit 1001-1250g, und 3,9% mit 1251-1500g. Insgesamt

erkrankten 7,1% der Kinder mit extrem niedrigem Geburtsgewicht (VLBW) (bis

1500g) (Guillet et al. 2006). Der Einfluss des Gestationsalters geht aus folgenden

Zahlen hervor: Bei Frühgeborenen ist die NEC bis zu zehnmal häufiger, die

Inzidenz liegt hier bei 2 bis 5% (Hunter et al. 2008). Oder anders ausgedrückt: 90%

der Kinder, die an einer NEC erkranken, sind frühgeboren. Die Letalität der NEC

liegt bei 20 bis 50% (Schnabl et al. 2008). Von Kindern mit extrem niedrigem

Geburtsgewicht, die wegen einer NEC oder einer intestinalen Perforation operiert

wurden, starben in einer Studie 49% (Blakely et al. 2005), in einer Studie von

Guthrie et al. lag die Letalität der NEC auf einer Neugeborenen-Intensivstation

(Kinder bis 34 SSW) bei 12%. Die Letalität war höher bei Säuglingen, die sich einer

Operation unterziehen mussten, bei denen also auch die Krankheit fortgeschrittener

und kritischer war (Guthrie et al. 2003). Ein weiterer interessanter Aspekt ist die

höhere Mortalität von männlichen Neugeborenen und afroamerikanischen Kindern,

wobei letztere auch eine höhere Inzidenz der NEC aufweisen (Llanos et al. 2002).

3.2. Entstehungsgrundlagen, Modelle der Pathogenese

Dass vor allem Frühgeborene und untergewichtige Kinder betroffen sind, muss in

der Natur der Erkrankung liegen. Man vermutet, dass die NEC Ausdruck der

inadäquaten Immunabwehr des noch unreifen Darms ist, seiner unreifen Motilität,

Digestion und Kreislaufregulation, der noch nicht abgeschlossenen Besiedelung mit

der späteren kommensalen Keimflora und der fehlenden Fähigkeit, eine

funktionierende Barriere zwischen äußerem und innerem Milieu aufzubauen und zu

erhalten (Lin and Stoll 2006). Die Barriere besteht aus einer Muzinschicht,

Schleimhaut mit Darmepithel und den darin enthaltenen körpereigenen

8

Abwehrsystemen. Es sind verschiedenste antimikrobielle Peptide bekannt, von

denen man weiß, dass sie bei frühgeborenen Kindern noch nicht in den später

vorhandenen Mengen vorliegen (Mallow et al. 1996, Richter et al. 2010, Salzman et

al. 1998). Die Erkrankung ist jedoch auch vereinzelt bei reifen Kindern zu finden,

weshalb man eine genetische Ursache vermutet. Ein Ansatz ist hier die

Genkopienzahl von β-Defensin 2. Entsprechende Untersuchungen haben bei Morbus

Crohn Unterschiede in der Genkopienzahl gezeigt. Auf der anderen Seite wird auch

von überschießenden Abwehrmechanismen gesprochen, die durch eine überstarke

Aktivierung von Entzündungsmediatoren erst die intakte Barriere zerstören, auf

einen Reiz hin gibt also der Darm selbst seine Schutzfunktion auf. Welche dieser

Einflussgrößen der auslösende Faktor ist, ist noch nicht klar (Lin and Stoll 2006),

möglicherweise sind es bei verschiedenen Kindern unterschiedliche. Die These der

Beteiligung von Bakterien an der Entstehung stützt sich auf folgende Beobachtung:

Man hat gesehen, dass die NEC niemals intrauterin auftritt und sehr selten ist bei

Kindern, die nie enteral ernährt wurden (Berseth 2005). Weitere Risikofaktoren sind

einige angeborene Herzfehler oder ein Atemnotsyndrom (Lin and Stoll 2006).

3.2.1. Gastrointestinale Schutzfunktionen

In erster Reihe für die Abwehr pathogener Keime steht der Magen mit seiner

Produktion von Magensäure. Neugeborene weisen noch eine niedrigere

Säuresekretion auf als Erwachsene (Hoy et al. 2000). Der intrauterine

Gastrointestinaltrakt weist zunächst noch keine geregelte Peristaltik auf. Erst mit 34

SSW werden wandernde Kontraktionswellen beobachtet (Berseth 1989). Das

bedeutet, dass vorher durch ungeregelte Kontraktionen die Weiterbeförderung des

Darminhaltes verzögert ist, woraus eine verlängerte Kontaktzeit möglicherweise

pathogener Bakterien mit der Schleimhaut resultiert. Das begünstigt im unreifen

Darm eine Schädigung. Bifidobakterien und Laktobazillen können auf die Motilität

fördernd wirken (Husebye et al. 2001).

Im Kontakt mit der Schleimhaut hat der reife Darm weitere Möglichkeiten der

Abwehr. Er produziert eine Schleimschicht, die eine mechanische Barriere zum

Epithel bildet und somit Schutz vor eindringenden Bakterien und enzymatischem

Eigenverdau ist. Diese Schleimschicht ist im Dünndarm dünner – auf den

Peyer’schen Plaques fehlt sie – und nimmt im Dickdarm zu. Im Rektum nimmt sie

Dicken von 285 µm an. Sie besteht vor allem aus dem Glykoprotein Muzin, das der

9

Schicht ihre Gelkonsistenz und dem Darm die wichtige Gleitfähigkeit verleiht. Auch

das bakterizide Lysozym ist Bestandteil des Schleims. Sezerniert werden die

Muzine von darmständigen Goblet-Zellen. Diese befinden sich in den Zotten und

Krypten des Dünn- und Dickdarms und produzieren weiterhin den zur Abwehr

wichtigen trefoil factor. Die Sekretion von Muzinen geschieht konstitutiv und kann

u. a. durch inflammatorische Zytokine wie TNFα, IL1, IL6, Neuropeptide und

Hormone gesteigert werden. T-Lymphozyten und lokale Entzündung führten im

Versuch zu einer Veränderung in der Zusammensetzung der Muzine und in der Zahl

der Goblet-Zellen. Bakterien wie Staphylococcus sp., Pseudomonas aeruginosa und

Laktobazillus wirken auf die Schleimproduktion fördernd. Die Muzine sind also die

erste Barriere für Bakterien im Darm und bestimmen die kommensale Keimflora,

die Bakterien wiederum beeinflussen die Expression und Sekretion der Muzine

(Deplancke and Gaskins 2001). Bei frühgeborenen Kindern dürften noch viele

Veränderungen in der Muzinexpression stattfinden (Buisine et al. 1998), auch haben

die Goblet-Zellen noch nicht ihre spätere Reife erlangt (Lin and Stoll 2006). Ein

unterstützender Mechanismus ist die Chlorid-Wassersekretion aus Enterozyten als

Waschfunktion. Der Prozess, der zu dieser Waschfunktion befähigt, ist

kontinuierlich und bei Frühgeborenen noch nicht abgeschlossen (Lebenthal and

Lebenthal 1999).

Ein Protein zur Abwehr, das in dieser Arbeit untersucht wird, ist der schon erwähnte

trefoil factor. Es sind heute drei verschiedene Peptide bekannt, TFF1-3. TFF1, auch

pS2 genannt, und TFF2, oder spasmolytisches Peptid, kommen vor allem im Magen

vor, während der intestinale TFF, oder TFF3, der dominierende TFF der intestinalen

Goblet-Zellen ist (Soriano-Izquierdo et al. 2004). Alle drei werden sie aber in den

muzinbildenden Schleimhäuten wie Gastrointestinaltrakt, den Konjunktiven, dem

Respirationstrakt oder den Speicheldrüsen gebildet. Ihnen kommen wichtige

Aufgaben im Epithelschutz, in der Epithelregeneration nach einer Schädigung durch

die Migration von epithelialen Zellen und in der Verhinderung von Apoptose zu. In

frühen Stadien nach einer Schleimhautverletzung ist ihre Expression erhöht. Ein

Fehlen dieser Produktionssteigerung bei Früh- oder Neugeborenen könnte ein

Faktor in der Pathogenese einer NEC sein. Vieten et al. konnten in einer

Untersuchung ähnlich der unseren im Darm bei akuter NEC keine Expression von

TFF1 und 2, von TFF3 eine verminderte nachweisen (Vieten et al. 2005). Schaart et

al. fanden während der akuten NEC bei epithelialen Schäden in der Zahl verringerte

10

Goblet- und Paneth-Zellen, die zu einem späteren Zeitpunkt nach überstandener

Krankheit wieder normal erhöht war (Schaart et al. 2009). Die fehlende sofortige

Reaktion auf eine Epithelschädigung könnte mitverantwortlich sein für die

Entstehung einer NEC und die Schwere des Krankheitsbildes.

Für den Zusammenhalt der Epithelzellen und die Dichtigkeit der Epithelschicht

zuständig sind die Zonula occludens, bestehend aus tight junctions, und die

Adhärensverbindungen (Zonula adhaerens, Fascia adhaerens, Punctum adhaerens)

und Desmosomen (Macula adhaerens), letztere beide eher für die mechanische

Stärke des Zellverbundes und die Gewährleistung der Kontraktilität des Darms.

Tight junctions bestehen aus den Membranproteinen Occludin und Claudin, welche

vor allem eine Barriere für kleinste Ionen darstellen, aber auch mit dem Aktin-

Zytoskelett in Kontakt stehen. Adhärensverbindungen verbinden vor allem das

Zytoskelett über die Epithelzellen hinweg miteinander, Desmosomen das

Intermediärfilament Keratin, wodurch sie mehr mechanische Funktion haben; dazu

verwenden sie Transmembranproteine. Die wichtigsten sind verschiedene

Cadherine, weswegen wir in unserer Arbeit das E-Cadherin untersuchten. Cadherine

sind Typ1 transmembrane Glykoproteine, die Ca²+-abhängig aneinander binden.

Die Ektodomäne bindet an die Ektodomäne eines Cadherins einer benachbarten

Zelle, die zytoplasmatische Domäne bindet an β-Catenin und darüber indirekt an α-

Catenin, das mit seiner Aktin-bindenden Domäne an Aktin koppelt. Ein anderer

intrazellulärer Partner des Cadherins ist das p120-Catenin, das eine wichtige Rolle

in der Regulation der Stärke der Adhäsion zu spielen scheint und die Endozytose

von Cadherinen verhindert. Es bindet nicht direkt an Aktin, sondern steuert seine

Bewegungen (Niessen and Gottardi 2008). Einen Einfluss auf diese Strukturen

haben verschiedene Mediatoren wie Wachstumsfaktoren und Myosin (Franke 2009,

Niessen and Gottardi 2008). Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

weisen im entzündeten Darmabschnitt eine Affektion von Adhärensverbindungen

auf. Der betroffene Darmabschnitt zeigt eine verringerte Expression u. a. von E-

Cadherin, die bis zur immunhistochemisch fehlenden Nachweisbarkeit geht (Gassler

et al. 2001).

3.2.2. Bakterien und Ernährung, zelluläre Transmitter

Bei vielen NEC-Fällen werden pathogene Keime gefunden, jedoch gibt es kein

„NEC-Bakterium“ (Peter et al. 1999). Häufigste Keime sind Enterobacteriaceae sp.

11

(E. coli, Salmonellen, Klebsiellen, Enterobacter sp.), es finden sich auch Clostridia

sp., Staphylococcus sp., Viren und Pilze (Bhatia 2010). Man vermutet, dass auch nur

eine Imbalance in der Besiedelung des Darms zu einer NEC führen kann.

Frühgeborene weisen eine andere Keimbesiedelung auf als Reifgeborene. Das mag

dem Umstand geschuldet sein, dass Kaiserschnittgeburten häufiger sind, auf

Intensivstationen bestimmte nosokomiale Keime durch Personal verteilt werden,

häufig Antibiotika gegeben werden und seltener gestillt wird (Hoy et al. 2000). Die

Art der Ernährung hat auf das Gleichgewicht der Darmflora einen großen Einfluss.

Im Mutterleib ist der kindliche Darm noch völlig keimfrei, nach der Geburt wird er

sofort von Bakterien besiedelt. Es ist wichtig, dass sich ein bestimmtes

Gleichgewicht einstellt und dass sich die richtigen Keime ansiedeln. Die richtige

Nahrungsstrategie ist bei Frühgeborenen noch immer umstritten. Zwar zeigen

Kinder, die nie enteral ernährt wurden, sehr selten das Bild einer NEC, jedoch ist

das Risiko dafür bei Beginn der oralen Ernährung erhöht. Fehlende enterale

Nahrung hat die Atrophie des Darms gefördert und nicht seine Reifung. Wenn jetzt

pathogene Keime, auf Intensivstationen vermehrt, in dieses Milieu eindringen, ist

die Entstehung einer NEC wahrscheinlicher. Auf der einen Seite steht also die

Befürchtung, mit oraler Ernährung die Entstehung der NEC zu fördern, auf der

anderen Seite trägt die Nahrung zur Reifung des Darmes bei (Hay 2008). Studien

zeigen eine 3-10fach erhöhte Inzidenz der NEC bei Formula-ernährten Kindern

(Lucas and Cole 1990), wohingegen unter den Frühgeborenen gestillte Kinder

weniger NEC entwickelten (Schanler et al. 1999). Das Stillen gilt als wichtiger

Protektionsfaktor. In der Muttermilch sind sogenannte Prebiotika, nicht verdauliche

Oligosaccharide, enthalten, die die Vermehrung von Bifidobakterien fördern.

Außerdem wirken enthaltene Immunglobuline, aktive Leukozyten, Zytokine,

Laktoferrin und Glykoproteine protektiv (Hunter et al. 2008). In Formulanahrung

wird versucht die Eigenschaften der Muttermilch nachzuahmen, indem sie mit

Prebiotika wie Frukto- und Galakto-Oligosacchariden und Inulin angereichert wird.

Probiotika, das sind Bakterien wie Laktobazillen und Bifidobakterien (z. B.

Infloran®), vermindern das Risiko der Entstehung einer NEC. In einem Cochrane-

Review über 16 randomisierte und quasi-randomisierte kontrollierte Studien traten

signifikant weniger NEC-Fälle bei Frühgeborenen, v. a. bei Kindern < 1500g

Geburtsgewicht auf und es zeigte sich bei den Kindern eine geringere Mortalität. In

Bezug auf die Entstehung einer Sepsis zeigte sich kein Unterschied. In keiner der

12

ausgewerteten Studien fand sich eine systemische Infektion mit dem verabreichten

Bakterium. Die Empfehlung zur Gabe von Probiotika gilt für Kinder > 1000 g

Geburtsgewicht (Alfaleh et al. 2011). Die kommensale Keimflora hat u. a. über

folgende Mechanismen große Bedeutung: Über sogenannte MAMPs (microbial-

associated molecular patterns) signalisieren kommensale Keime wie das

Bifidobakterium den Darmzellen bestimmte Zellvorgänge. MAMPs binden als

Ligand an PRRs (pattern recognition receptors) wie etwa toll-like-Rezeptoren

(TLRs) des Epithels und aktivieren den NF-κB-Signalweg, indem sie den

Transkriptionsfaktor NF-κB (nuclear factor κB) von seinem Inhibitor IκB lösen. NF-

κB tritt in den Zellkern ein und induziert die Transkription von Genen, die wichtig

sind für die Nahrungsaufnahme, die Barrierefunktion, die Angiogenese und die

Reifung (Hooper et al. 2001), und die Transkription proinflammatorischer Zytokine

wie TNFα, IL1β, IL6 und IL8 (Cantó et al. 2009). Ein weiterer Signalweg der TLRs,

der auch in der Transkription dieser Gene mündet, geht über MAPK (mitogen-

activated protein kinase). Eine alternative Aktivierung dieser Kaskaden läuft über

NOD2 (nucleotide-binding oligomerization domain), einen intrazellulären PRR für

Muramyldipeptid (MDP) (Kumar et al. 2009). Dadurch werden die Reaktionen, die

über TLRs getriggert werden, noch verstärkt. Die Vorgänge in der Zelle gibt

folgende Abbildung wieder:

Abbildung 2: Steuerung der antimikrobiellen Peptide (Cantó et al. 2009, Hooper et al. 2001, Kumar et al. 2009)

TAK1

MAPK

NOD2

TLR

IκB NF-κB

Bakterium

MDP

MAMP

inflammatorische Zytokine antimikrobielle Peptide

13

Eine Vorstellung ist, dass Bifidobakterien beispielsweise durch die Stimulation zur

Produktion eines nicht funktionierenden Rezeptors auf diese Weise ganz direkt die

Aufnahme von pathogenen Keimen verhindern (Hunter et al. 2008). Außerdem wird

den Kommensalen eine Rolle in der Inhibition einer überschießenden

Entzündungsantwort und der Apoptose zugeschrieben. Muramyldipeptide,

Bestandteile von gram-positiven und gram-negativen Bakterien, regulieren über

NOD2-Aktivierung die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen. Die

Imbalance in der Regulierung der Entzündungsantwort durch die veränderte

Ausschüttung pro- und antiinflammatorischer Substanzen wird als eine Ursache des

Morbus Crohn gesehen, da eine NOD2-Mutation als ein Risikofaktor für die

Entwicklung dieser chronisch-entzündlichen Darmerkrankung gilt (Cantó et al.

2009). NOD2-Mutationen zeigten auch eine verminderte Produktion von α-Defensin

5 und 6. Allgemein waren beim aktivierten Morbus Crohn diese Defensine im Ileum

vermindert, bei Morbus Crohn-Patienten mit NOD2-Mutation war dieses Bild

jedoch noch deutlicher zu sehen (Wehkamp et al. 2004). Studien hierzu konnten bei

NEC-Patienten die typischen Mutationen nicht nachweisen (Zouali et al. 2005).

3.2.3. Zelluläre und immunologische Abwehr

Eine Rolle in der Abwehr spielen Transmitter wie NO und andere

Entzündungsmediatoren wie TNFα, IL1β, IL6, IL8 und IFNγ. Neonatale und unreife

Zellen weisen ein anderes Reaktionsmuster auf (Claud et al. 2004, Shu et al. 1994).

Eine weitere Möglichkeit im angeborenen Immunsystem ist die Abwehr von

Bakterien mit Hilfe von antimikrobiellen Peptiden, die lokal im Darm von Paneth-

Zellen in den Lieberkühn-Krypten des Dünndarms und von Enterozyten gebildet

werden. Das erste entdeckte AMP war das von Alexander Fleming identifizierte

Lysozym, ein antimikrobielles Enzym, das in den Paneth-Zellen produziert wird

(Keshav 2006). Später entdeckte Peptide sind die α-Defensine, β-Defensine und

Cathelicidine (LL-37/hCAP-18). Sie sind eigentliches Untersuchungsziel dieser

Arbeit. Diese zum angeborenen Immunsystem gehörenden Abwehrmechanismen

sind wie die anderen Barrierefaktoren wichtig für die erste Abwehr von jeglichen

Keimen, die Trennung von äußerem und innerem Milieu. Defensine sind kationische

cysteinreiche Peptide mit drei Disulfid-Brücken, die sowohl von Vertebraten,

Invertebraten wie Insekten als auch von Pflanzen gebildet werden. Ihr

Wirkspektrum reicht von Bakterien über Viren bis hin zu Pilzen. Beim Menschen

14

finden sich α- und β-Defensine, die θ-Defensine kommen bei Menschen und

Mäusen nicht vor. Die α-Defensine 1-4 (HNP-1-4) werden in Neutrophilen gebildet,

5 und 6 (HD-5 und -6) sind Produkte der Paneth-Zellen des Dünndarms. Sie werden

konstitutiv exprimiert, gespeichert als Propeptide und durch Trypsin (bei Mäusen

durch MMP7) bei Sekretion aktiviert. Sie sind für die Erhaltung der Homöostase der

Keimflora des Dünndarms verantwortlich (Salzman 2010). Dadurch wirken sie

indirekt auch an der Reifung des erworbenen Immunsystems mit und in der

Modulation von dessen Immunantworten. Sie induzieren Zytokine, der direkte

Wirkmechanismus ist die Abwehr der Pathogene durch Porenbildung in deren

Zellwänden und Membranen (Wiesner and Vilcinskas 2010).

Im Dickdarm kommen die α-Defensine nur in metaplastischen Paneth-Zellen bei

Colitis ulcerosa vor (Hase et al. 2002). Die α-Defensin-Sekretion der Paneth-Zellen

ist reguliert über Acetylcholin, T-Zell-Zytokine und über NOD2 und damit ebenso

wie die Produktion inflammatorischer Zytokine durch bakterielle Stimuli (Keshav

2006). Frühgeborene zeigen eine verminderte Expression der α-Defensine 5 und 6

und haben auch weniger Peptide. In NEC-erkranktem Darm konnten Salzman et al.

eine verstärkte Expression und vermehrt Paneth-Zellen, aber keine adäquat dazu

vermehrten intrazellulären Peptide finden (Salzman et al. 1998). Dies könnte im

Sinne einer Translationsdysfunktion auftreten (Lin and Stoll 2006). Schaart et al.

hingegen fanden bei akuter NEC bei epithelialen Schäden die Paneth-Zellen

vermindert (Schaart et al. 2009). In Versuchen an Mäusen, die HD-5 exprimierten,

zeigte sich eine erhöhte Resistenz gegen Salmonellen-Infektion. Es fand sich auch

eine reduzierte Zahl an Th17-Zellen in der Lamina propria, sozusagen als Antwort

auf bestimmte fehlende Keime. Ein Beispiel dafür, dass Defensine Einfluss auf das

erworbene Immunsystem haben (Salzman 2010).

Die β-Defensine sind breit verteilt über die Schleimhäute. Es sind inzwischen die β-

Defensine 1-4 (hBD-1-4) bekannt. Sie sind chemotaktisch für dendritische Zellen

und T-Zellen (Wiesner and Vilcinskas 2010). hBD-1 wird vornehmlich konstitutiv

exprimiert und ist zu einem kleinen Teil auch induzierbar. hBD-2-4 sind in den

meisten Geweben induzierbar auf entzündliche und pathogene Stimuli hin. Dabei

beschränkt sich die Expression von hBD-2 im Darm auf das Colon (Doss et al.

2010). In anderen Quellen wird es als ubiquitär exprimierbar beschrieben (Hase et

al. 2002). Es wurde in unseren Dünndarmpräparaten nicht bestimmt. Dass

frühgeborene Kinder noch weniger β-Defensin produzieren, konnten Richter et al.

15

zeigen. Sie stellten mit Zunahme des Gestationsalters im Stuhl vermehrt β-Defensin

2 fest (Richter et al. 2010).

Das Gen CAMP codiert u. a. das AMP Cathelicidin. Es wird in der Haut vermehrt

bei der Wundheilung gefunden und ist induzierbar. Nach Translation wird

Cathelicidin als Präpropeptid (hCAP-18) gespeichert. Nach Abspaltung von

Cathelin entsteht das aktive antimikrobielle Peptid LL-37. Diese Abspaltung findet

außerhalb der Zelle statt, bei neutrophilen Granulozyten durch die Serinprotease

Proteinase 3 und bei epithelialen Zellen an der Hautoberfläche durch Kallikrein-

Isoenzyme, die LL-37 in die zwei kleineren Peptide RK-31 und KS-30 spalten

(Wiesner and Vilcinskas 2010) (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: LL-37 (Wiesner and Vilcinskas 2010)

Es wird sowohl im Dünn- als auch im Dickdarm exprimiert, im Dünndarm

allerdings deutlich weniger (Hase et al. 2002). Ein weiterer Produktionsort sind

Makrophagen. Eine wichtige Rolle in der Regulation der Expression spielt Vitamin

D. Wie die β-Defensine wirkt LL-37 chemotaktisch für Neutrophile, Monozyten und

T-Zellen. In Monozyten senkt es die Produktion proinflammatorischer Zytokine auf

bakterielle Stimuli. Bei Morbus Crohn im Colon zeigten LL-37 wie hBD-2

verringerte Antworten. Anders bei der Colitis ulcerosa: Hier zeigt sich hBD-2 und

LL-37 im entzündlichen Darm erhöht (Doss et al. 2010). Daher wird die Defizienz

von α-Defensinen im Dünndarm und β-Defensinen im Dickdarm, in der Parallele

Exon 1-3: Signalpeptid, Cathelin-Domäne Exon 4: antimikro- bielle Aktivität

CAMP-Gen

Präpropeptid: Speicherung in zellulären Granula

Propeptid: Freisetzung

extrazelluläre Proteinasen: Cathelin und C-terminales AMP

Cathelin C-terminales antimikrobielles Peptid (LL-37)

16

zum Morbus Crohn, verdächtigt, ursächlich an der Entstehung der NEC mitbeteiligt

zu sein, resultierend aus einer fehlenden Steuerung durch die Zusammensetzung der

Keimflora. Dass die kommensalen Keime wichtig sind für die Aufrechterhaltung der

Schranken, beispielsweise in der Stimulation zur Muzinproduktion, wurde oben

gezeigt (Salzman 2010). Die Peyer-Plaques, die B- und T-Zellen enthalten, sind in

ihrer Zahl und Größe beim Neugeborenen reduziert. Ihre komplette Reifung findet

erst im Laufe der Zeit durch den Kontakt mit Keimen statt (Hunter et al. 2008).

3.2.4. Andere Risikofaktoren

Im Tiermodell der NEC wird die Erkrankung ausgelöst durch

Hypoxie/Ischämie/Asphyxie und Formula-Nahrung (Sodhi et al. 2008). Als Ursache

für eine solche hypoxische Situation kommt beim Säugling beispielsweise ein

offener Ductus arteriosus Botalli (persistierender Ductus arteriosus PDA) in Frage,

der tatsächlich als Risikofaktor für eine NEC identifiziert werden konnte. Im Sinne

eines Steal-Phänomens „entzieht“ der Ductus der Aorta das Blut des systemischen

Kreislaufs. Die Minderperfusion erhöht das Risiko für Schäden wie die

intraventrikuläre Blutung (IVH), transiente renale Insuffizienz und die NEC

(Hamrick and Hansmann 2010). Ein Atemnotsyndrom und perinatale Asphyxie

vermindern direkt den Sauerstoffpartialdruck und wirken damit hypoxisch auf den

Darm. Vor allem bei reifgeborenen Kindern mögen diese zusätzlichen Faktoren von

Bedeutung sein, da hier das Problem der Unreife des Darms weniger gegeben ist

(Lin and Stoll 2006). O’Donovan et al. fanden bei VLBW- und ELBW-Kindern mit

Behandlung eines PDA retrospektiv eine Inzidenz der NEC (mind. Bell-Stadium II)

von 12-14% (O'Donovan et al. 2003). Andere Studien berichten von einer Inzidenz

der NEC bei mit Indometacin behandeltem PDA von 30-35% bei ELBW-Kindern

(Bell-Stadium I eingeschlossen) (Fujii et al. 2002, Grosfeld et al. 1996). Obwohl der

PDA-Verschluss vor der Entwicklung einer NEC schützt, wird Indometacin selbst in

einigen Studien – im Gegensatz zu der von O’Donovan et al. – als eigenständiger

Risikofaktor für spontane intestinale Perforationen beschrieben, möglicherweise

durch die folgende Hyperämie und das Anschwellen des Darms. Besonders die

frühe (innerhalb der ersten 48 Stunden) präventive Behandlung frühgeborener

Kinder – primär zur Verhütung einer IVH, dann bei PDA appliziert – vermindert

zwar die Rate an operationsbedürftigen PDAs, erhöht andererseits aber die Inzidenz

17

intestinaler Perforationen bei NEC im Gegensatz zu späterer Medikamenten-Gabe

bei Indikation. Dieses Phänomen verstärken Steroide (Fujii et al. 2002).

18

4. Material und Methoden

Die Proben entstammen Kollektiven, die zwischen den Jahren 1998 und 2009 an der

Kinder- und Jugendklinik der Universtitätsklinik Erlangen gesammelt wurden. In

dieser Zeit wurde Material in Operationen von an NEC erkrankten Kindern

gewonnen, bei denen Darmresektionen notwendig waren. Die Resektate wurden in

Paraffin eingebettet und somit haltbar gemacht. Ebenso wurde mit Resektaten

verfahren, die nach Abheilung der Krankheit in Stomarückverlagerungsoperationen

oder Stenoseoperationen gewonnen wurden. Diese stellten das Kollektiv der

Verlaufskontrolle nach NEC. Als Kontrolle dienten Resektate aus Operationen bei

Mekoniumileus oder Darmatresie. Nach Sichtung der Patientenakten blieben mit

Erfüllung der Einschlusskriterien (jeweils erste NEC-Operation und klinische

Zeichen der NEC in der NEC-Gruppe, unversehrter Darm bei den Kontrollen,

jeweils betroffener Darmabschnitt Dünndarm) sieben NEC-Patienten, fünf

Verlaufskontroll-Patienten und drei Kontroll-Patienten. Zur Darstellung der

verschiedenen antimikrobiellen Peptide in der Darmschleimhaut wurden

immunhistochemische Schnitte angefertigt. Zu beurteilen waren sowohl Verteilung

als auch Menge der Proteine. Zur weiteren Genauigkeit wurde die Expression der

histologisch gesehenen Proteine mittels TaqMan-RT-PCR untersucht. Hier ergab

sich durch die Art der Konservierung der Proben (Paraffinmaterial) und die

jahrelange Lagerung das Problem, dass in einigen Resektaten keine sauberen

Kurven mehr zu ermitteln waren bzw. keine nennbaren Mengen an

Housekeepinggen-RNA mehr nachzuweisen waren. Daher sind hierbei nur vier

NEC-Patienten, drei Verlauf-NEC-Patienten und die drei Kontroll-Patienten zur

Auswertung gekommen, die deshalb auch nicht quantitativ geschah.

4.1. Patientencharakteristika

Unsere Patientencharakteristika sind der Tabelle 1 und der Abbildung 4 zu

entnehmen. Es kamen sieben NEC-Patienten zur Auswertung und durchweg nur

Patienten mit mindestens Bell-Stadium II. Mittlerer Wert für das Auftreten der

ersten Symptome war der 5. Lebenstag (4,6. ± 2,2; Bereich von 2. bis 8.), für die

Operation der 10. Lebenstag (10,1. ± 7,2; Bereich von 3. bis 20.). Alle Resektate

sind Dünndarmresektate und stammen aus der ersten Operation im Verlauf der

Krankheit. Zur Verlaufbeurteilung kamen fünf Patienten zur Auswertung, die

Resektate stammen aus der Stomarückverlagerungsoperation oder Operation bei

19

Stenose. Sie fand im Mittel 37 Tage (37,4 ± 11,3; Bereich von 24 bis 52) nach der

ersten NEC-Operation statt. Zwei dieser Patienten kamen schon als NEC-Patienten

zur Auswertung. Die drei Kontrollpatienten wurden wegen eines Mekoniumileus

oder einer Darmatresie im Mittel am 14. Lebenstag (14,3 ± 13,8; Bereich von 4. bis

30.) operiert.

Nr. Geschlecht SSW Geburtsgewicht (g)

Alter bei OP

(LT)

OP Pathologie-Befund

NEC-Patienten

1 w 29. 710 17 NEC Ileum Transmurale und hämorrhagisch durchsetzte Nekrosen mit umschriebener Perforation, dichtere Infiltrate Lymphozyten und Plasmazellen, neutrophile Granulozyten bis an Serosa und Dünndarmabtragung heran

2 w 28. 700 20 NEC Ileum Hämorrhagische Wandnekrosen, Perforation, granulozytäre Infiltrate gesamte Wandung, Epithel mit verstärkter Regeneration, Ulzerationen und Reepithelialisierung, außen subserös Blasenbildung

3 w 41. 3730 4 NEC Dünndarm

-

4 m 30. 730 3 NEC Dünndarm

Weite Strecken und lumenseitig betonte ausgedehnte Nekrosen auf gesamter Darmwandung, Hämorrhagien

5 m 36. 2200 16 NEC Ileum Ulzerationen der Schleimhaut bis Submukosa, stellenweise transmural Einblutung und chronisch-granulierende Entzündung, Ulzerationen bis in Resektionsränder

6 w 34. 1840 7 NEC Ileum Teilweise transmurale Nekrosen, umschriebene Perforation, eitrig-kotige Peritonitis, Oberfläche mit breiten Belägen aus Fibrin und neutrophile Granulozyten

7 w 32. 1210 4 NEC Ileum Ausgeprägte hämorrhagische Infarzierung mit fibrinöser Entzündung, Absetzungsränder entzündungsfrei

20

Verlaufskontroll-Patienten

1 w 36. 1890 56 Dünndarmileus nach NEC

Dünndarmwandung mit teils chronisch granulierender, teils fibrosierender, teils florider eitriger Entzündung, überwiegend in (Sub-)Mukosa, Lymphangiektasien, hyperplastisch lympho-epitheliales Gewebe, stellenweise Regeneratepithel, fokal Fissur, Verwachsungen, riesenzellhaltige Fremdkörperreaktion (Granulation)

2 w 26. 740 64 Stomarückver-lagerung nach

NEC

Transmurale phlegmonöse floride Entzündung, intakte Schleimhaut vital und entzündungsfrei, am Übergang zur Haut oberflächliche Schleimhauterosionen, darunter schütteres neutrophiles granulozytäres Infiltrat

3 w 41. 3730 36 Stenose nach NEC

Dünndarmsegment mit mäßiggradig florider hämorrhagischer, z.T. ulzerierender Enteritis, ausgeprägte Wandfibrose bei Stenose

4 w 34. 1840 31 Stomarückver-lagerung nach

NEC

Dünndarmschleimhaut, ringförmige Muskulatur, Faservermehrungen im Bereich der Submukosa und subperitoneal, keine ausgeprägten Stenosierungen

5 m 30. 1470 51 Stomarückver-lagerung nach

NEC

Entzündungsfrei, regelrechtes Zottenrelief, im Stomabereich Übergang zwischen Haut / Dünndarmschleimhaut chronisches lympho-plasmazellulär entzündliches Infiltrat, Abflachung Zottenrelief mit reichlich Becherzellen, submuköse Vernarbungen

Kontroll-Patienten

1 m 35. 2610 30 Dünndarm-atresie

Segmente mit jeweils entzündungsfreien Absetzungsrändern, Mukosa durch fibrinöses Septum verschlossen, auf gegenüberliegender Seite unauffälliges Epithel

2 w 28. 760 9 Mekonium-ileus

Dünndarm mit intakter Schleimhaut, regelhafter Aufbau, eingedickter kotiger Inhalt ohne Mikroorganismen, keine Aganglionose

3 w 32. 1830 4 Mekonium-ileus

Regelrechter Aufbau, einzelne vergrößerte Ganglienzellen ohne Atypien

LT: Lebenstag; NEC: nekrotische Enterokolitis Alle Resektate stellen Dünndarm dar. Bei den NEC-Patienten stammen die Resektate jeweils aus der ersten OP im Krankheitsverlauf. Tabelle 1: Patientencharakteristika

21

Geburtsgewicht NEC-Kinder

ELBW

VLBW

LBW

normal birth weight

Frühgeburtlichkeit bei den NEC-Kindern

extrem früh

sehr früh

früh

reif

Ernährung NEC-Kinder vor Auftreten der Erkrankung

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

Formula-

Nahrung

Muttermilch Formula und

Muttermilch

Ante

il

NEC-Kinder

Darmbeteiligung NEC

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

nur Ileum Ileum und Jejunum Colonbeteiligung

Ante

il

NEC-Kinder

Geburtsgewicht: ELBW: extremely low birth weight (< 1000g); VLBW: very low birth weight (1000 bis < 1500g); LBW: low birth weight (1500 bis < 2500g); NBW: normal birth weight (≥ 2500g) (Wang et al. 2007) Frühgeburtlichkeit: extrem früh (< 28+0 SSW), sehr früh (bis < 32+0 SSW), früh (bis < 37+0 SSW), reif (≥ 37+0 SSW) (Himpens et al. 2008) Abbildung 4: Patientencharakteristika NEC-Kinder

4.2. Immunhistochemie

Für die immunhistochemischen Schnitte wurden Paraffinblöcke verwendet, in die

das OP-Material eingebettet wurde, nachdem es in Formalin fixiert worden war.

Diese Blöcke waren bis zu elf Jahre gelagert. Zur Anfertigung der Schnitte wurden

mit einem Mikrotom 5µm dicke Scheibchen vom kalten Paraffinblock gewonnen,

die dann auf einem auf 60-70°C geheizten Wasserbad (Aqua dest.) gestreckt

wurden. Anschließend wurden die Schichten auf einen Objektträger aufgezogen und

einen Tag getrocknet. Zur weiteren Verarbeitung mussten die gewonnenen

Leerschnitte zunächst entparaffiniert werden: Bei 60-minütiger Inkubation bei 60°C

in einem Heißluftofen wird das Gewebe an den Objektträger fixiert und das Paraffin

weich gemacht, so dass es sich im daran anschließenden Xylolbad leicht entfernt. In

der absteigenden Alkoholreihe wurde nun das Gewebe entparaffiniert: Die Küvette

mit den Objektträgern wurde jeweils 5 Minuten dreimal in Xylol, zweimal in

Ethanol 100%, zweimal in Ethanol 96%, zweimal in Ethanol 70% und einmal in

TBS-Puffer eingelegt. Die so erfolgte Rehydrierung ermöglicht das Färben mit

22

wässrigen Lösungen. Zuvor muss jedoch eine Antigendemaskierung vorgenommen

werden. Aldehydverkettungen, die durch die Fixierung zustande kommen,

maskieren sonst einige Antigene, so dass sie vom Antikörper nicht erkannt werden

(Flenker 1998). Dazu wurden die Objektträger in der Demaskierungslösung G

(BioLogo BioPrime® Demaskierungslösung G, Konzentrat auf Glykol-Basis) in

einem gewöhnlichen haushaltsgebräuchlichen Steamer gekocht. Der Steamer wurde

mit Aqua dest. gefüllt, die Küvette mit der Demaskierungslösung noch ohne die

Objektträger hineingestellt und 30 Minuten erhitzt. Der Objektträgerhalter mit den

Schnitten wurde direkt aus dem TBS-Puffer in das schon heiße Demaskierungsbad

gebracht. Hier wurden die Schnitte 20 Minuten gekocht. Danach wurden sie in dem

Bad auf Raumtemperatur heruntergekühlt. Nachdem die Objektträger noch zweimal

5 Minuten in einem TBS-Bad gespült worden waren, wurde mit einem Tuch um das

Gewebe herum überschüssige Flüssigkeit abgetupft und das Gewebe mit einem

Fettstift (ImmEdge™ Pen, Vector®) umrandet und wieder in den Puffer überführt.

So wird gewährleistet, dass die folgenden auf das Gewebe zu pipettierenden

Flüssigkeiten auch darauf verbleiben und nicht abfließen. Bevor auf die Schnitte

Antikörper aufgebracht werden können, muss das Gewebe blockiert werden, um

keine unspezifischen Hintergrundfärbungen zu erhalten: Um die endogene

Peroxidase zu zerstören, die sonst wie die später zugeführte Peroxidase reagieren

würde, wurde zunächst Peroxidase-Blocking Solution (Dako® REAL™) auf das

Gewebe gegeben und 5 Minuten in einer Feuchtkammer inkubiert. Dann wurde

überschüssige Flüssigkeit abgeschüttelt und Protein Block (Dako® Serum-free)

aufpipettiert. Auch dieser wurde 5 Minuten inkubiert und dann abgeschüttelt.

Dadurch, dass sich Protein an Kollagen und Bindegewebe bindet, wird auch mit

diesem Schritt die Hintergrundfärbung auf ein Minimum reduziert. Bis jetzt wurde

mit allen Schnitten für alle Färbungen gleich verfahren. Nun wurden die

verschiedenen Primärantikörper verschiedener Spezies und in verschiedenen

Konzentrationen aufgebracht. Für die E-Cadherin-Färbung wurde ein Maus-

Primärantikörper (Abcam Antibody IgG1 Mouse monoclonal HECD-1 to human E-

Cadherin 0,05mg/ml) in Antibodydiluent (Dako® Background Reducing) auf 1:50

verdünnt (1µg/ml). Der TFF1-Antikörper (Sigma-Aldrich Prestige Antibodies® IgG

Rabbit polyklonal to human TFF1 0,4mg/ml) wurde 1:1000 verdünnt aufpipettiert

(0,4µg/ml). Ebenso der TFF2-Antikörper (R&D Systems® Antibody IgG2b Mouse

monoclonal Clone 366508 to human TFF2 0,5mg/ml) in 1:1000-Verdünnung

23

(0,5µg/ml). Für die LL-37-Färbung wurde der Antikörper (Antibodies-online®

Antibody IgG Rabbit polyclonal to human cAMP 1mg/ml) 1:750 verdünnt

(1,3µg/ml). Die α-Defensine wurden in einer Doppelfärbung gemacht, dazu wurde

α-Defensin 5-Antikörper (Abcam® antibody IgG2b Mouse monoclonal 8C8 to

human alpha Defensin NP5 2,35mg/ml) in einer 1:500-Verdünnung verwendet

(4,7µg/ml), und α-Defensin 3-Antikörper (BioLogo® polyklonal Rabbitserum) in

einer 1:1250-Verdünnung. Bei den Doppelfärbungen wurde genauso verfahren wie

mit den Einzelfärbungen, es konnten beide Antikörper gleichzeitig aufpipettiert

werden, da es sich jeweils um einen Maus- und einen Kaninchen-Antikörper

handelte.

Der Primärantikörper wurde jeweils eine Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag

wurden die Objektträger dreimal jeweils 5 Minuten in TBS-Puffer gespült um

überschüssige Antikörper zu entfernen. Dann konnte das Gewebe mit dem

Zweitantikörper inkubiert werden. Hierfür wurde ein biotinylierter Goat Anti-Mouse

IgG oder Anti-Rabbit IgG (Vector®) 1:500 verdünnt mit Antibodydiluent

verwendet. Bei der α-Defensin-Doppelfärbung konnten beide Zweitantikörper direkt

nacheinander inkubiert werden, da beide durch eine Färbung dargestellt wurden. Der

Zweitantikörper wurde jeweils 30 Minuten auf dem Gewebe in der Feuchtkammer

inkubiert. Während dieser Zeit wurde der Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex

(Vectastain® Elite ABC Kit) in TBS-Puffer angesetzt. Dafür wurden je zwei

Tropfen Reagens A (Avidin DH solution) und Reagens B (biotinylated enzyme) in

5ml TBS gegeben. Dieser Ansatz wurde im Kühlschrank bei 4°C 30 Minuten stehen

gelassen, um die Vernetzung der Avidin-Moleküle mit den Biotin-Peroxidase-

Molekülen zu gewährleisten. Nach der Zweitantikörper-Inkubation wurden die

Schnitte wiederum dreimal jeweils 5 Minuten in TBS-Puffer gespült, um

überschüssige Antikörper zu entfernen. Daraufhin wurden sie erneut in die

Feuchtkammer gegeben und der vorbereitete Vector ABC Kit aufpipettiert und für

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Hier binden sich Avidin-Biotin-Enzym-

Komlexe an das schon vorhandene Biotin, verstärken somit das Signal und bringen

das gebundene Enzym Peroxidase mit. Die ans Avidin gekoppelte Peroxidase wird

später die Chromogenumwandlung katalysieren. Nach einer weiteren 5-minütigen

Spülung in TBS-Puffer wurden unter mikroskopischer Sicht einige Tropfen frisch

angesetzte Peroxidase-Substrate (Vector® DAB Peroxidase Substrate Kit) -

Wasserstoffperoxid und 3,3’-Diaminobenzidin (DAB) - auf den Objektträger

24

gegeben. Unter Beobachtung der Anfärbung wurde je nach Antigenfärbung 5 bis 30

Sekunden inkubiert, um eine möglichst gute Färbung ohne Hintergrundfärbung zu

erreichen. Das Prinzip dieser Färbemethode ist, durch Biotinkopplung des

Zweitantikörpers und Verstärkung mit Hilfe des Avidin-Biotin-Peroxidase-

Komplexes ein Chromogen sichtbar zu machen. Dies geschieht, indem das

Chromogen DAB und das Substrat, in diesem Fall Wasserstoffperoxid, erst ganz

zum Schluss zugegeben werden. Wasserstoffperoxid setzt dann durch seine

Reaktion mit Peroxidase, die nur am Avidin vorhanden ist, Protonen frei, die das

Chromogen braun werden lassen. So kann der Ort des Antigens genau detektiert und

seine Menge abgeschätzt werden. Die Färbung wurde gestoppt, indem die

Objektträger in ein TBS-Puffer-Bad gestellt wurden. Anschließend wurde kurz in

Aqua dest. gewaschen. Es wurde die Gegenfärbung für 3 Sekunden mit Hämalaun

(Merck® Mayers Hämalaunlösung) durchgeführt und anschließend 7 Minuten unter

laufendem Leitungswasser gebläut. Die lila Gegenfärbung macht die Zellkerne und

das Gewebe sichtbar ohne die braune Färbung zu überdecken. Durch das Bläuen

wird der Farbstoff stabilisiert, sodass er sich im daran anschließenden Alkoholbad

nicht wegwäscht. Analog zur Rehydrierung wurden für die Entwässerung alle

Schnitte in eine aufsteigende Alkoholreihe gegeben. Nach dem dritten Xylolbad

wurden die Objektträger direkt in Entellan (Fluka® Analytical, Eukitt®

Schnelleinschlussmittel) eingedeckt und mit einem Deckglas geschützt.

Für die Negativkontrollen wurde statt des Primärantikörpers jeweils ein Isotyp

desselben verwendet, der nicht gegen spezielle Antigene gerichtet ist. Es sind dies

Immunglobulinfraktionen derselben Tierspezies, aber eines nicht immunisierten

Tieres. Es konnte gezeigt werden, dass keine unspezifischen antikörperbedingten

Färbungen auftreten, sondern nur Antikörper-gebundenes Antigen detektiert wird.

Es wurde verwendet:

Dianova® DLN-05791 IgG1 aus Maus NCG01 0,2mg/ml in 1:200-Verdünnung

(1µg/ml),

Dianova® DLN-05809 IgG2b aus Maus NCG2B.01 0,2mg/ml in 1:42,55-

Verdünnung (4,7µg/ml) und 1:400-Verdünnung (0,5µg/ml) und Dianova® PHA-

70833 Negativkontrollserum aus Kaninchen polyklonal.

25

4.3. TaqMan-PCR

Um die Expression der AMPs zu untersuchen, wurde eine Real-Time-PCR

durchgeführt. Mit dieser Methode kann die mRNA eines bestimmten Gens und

damit seine Expression quantitativ bestimmt werden. Wir haben dazu die übliche

TaqMan-PCR verwendet. Um die RNA per PCR messen zu können, muss sie

zunächst isoliert und dann in einer RT-PCR-Reaktion in kopierte DNA (cDNA)

umgeschrieben werden. Zur RNA-Isolation aus unserem paraffingelagerten Material

wurde der RNeasy° von Qiagen verwendet.

Dazu wurden zunächst acht 5µm-Schnitte pro Paraffinblock gewonnen und in ein

2ml Eppendorfgefäß gegeben. Die folgenden Schritte wurden alle bei

Raumtemperatur durchgeführt. Zur Entparaffinierung wurde 1ml Xylol zupipettiert

und die Probe gevortext. Dann wurde sie 2 Minuten bei 14000 U/min zentrifugiert,

um überstehendes Xylol wieder vom Gewebepellet abpipettieren zu können. Ebenso

wurde mit 100%igem Ethanol verfahren. Dann wurden die Pellets an der Luft

getrocknet, so dass keine Alkoholrückstände mehr vorhanden waren. Es wurden

240µl PKD-Pufferlösung und 10µl Proteinase K zugegeben und durch Vortexen mit

den Zellen des Pellets vermischt, bevor die Eppendorfgefäße bei 55°C und dann bei

80°C jeweils 15 Minuten auf einem Heizblock inkubiert wurden. Dadurch wird die

RNA aus den Zellen freigegeben und durch das Formalin entstandene

Querverbindungen gelöst. Um die noch enthaltene genomische DNA (gDNA) aus

der Probe zu entfernen, wurden 500µl des RBC-Puffers zupipettiert und das ganze

Volumen (750µl) auf eine gDNA Filtersäule gegeben. Die Proben wurden in den

Filtersäulen für 30 Sekunden bei 10000 U/min zentrifugiert und die Säule mit der

gDNA verworfen. Das durchgepresste Eluat wurde mit 1200µl Ethanol 100%

versetzt und durch Pipettieren gut vermischt. Jetzt wurde das ganze Volumen

(1950µl), verteilt auf kleinere Mengen von 700µl, nacheinander auf die RNeasy

MinElute-Säule gegeben und 15 Sekunden bei 10000 U/min zentrifugiert. Das Eluat

wurde jeweils verworfen. Nach dreimaliger Durchführung ist alle Flüssigkeit

entfernt und die RNA in der Säule „gefangen“. Der sich anschließende

Waschvorgang wurde mit RPE-Puffer durchgeführt, der zuvor mit Ethanol versetzt

wurde (11ml Ethanol zu 44ml Puffer-Konzentrat). 500µl dieses Puffers wurden auf

die Säule pipettiert, die dann 2 Minuten bei 10000 U/min zentrifugiert wurde. Das

Eluat wurde jeweils wieder verworfen. Noch einmal wurde 5 Minuten bei 14000

U/min mit geöffnetem Deckel zentrifugiert, um alle Flüssigkeit und Alkohol zu

26

entfernen, und das Eluat verworfen. Die Säule wurde in ein neues 1,5ml-

Sammelröhrchen gestellt und direkt auf die Säulenmembran 24µl RNase-freies

Wasser gebracht. Um die RNA aus der Säule zu lösen, wurde noch einmal 1 Minute

bei 14000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule verworfen. Die 22µl

Eluat wurden gevortext und auf Eis gelegt bis sie bei 260nm photometrisch auf

ihren RNA-Gehalt bzw. ihre RNA-Konzentration gemessen wurden. Bis zur

weiteren Verarbeitung wurden sie bei -80°C gelagert.

Für die cDNA-Synthese mittels RT-PCR wurde nach gängigem Protokoll

vorgegangen. Dazu wurde die RNA aller Proben in eine Konzentration von

0,125µg/µl gebracht. Mit Hilfe der photometrisch gemessenen RNA-

Konzentrationen konnte genau 1µg RNA einer Probe entnommen werden. Mit

DEPC-Aqua dest. wurde das Volumen von 1µg Gesamt-RNA auf ein

Gesamtvolumen von 8µl aufgefüllt. Da im Doppelansatz vorgegangen wurde, hatten

wir jeweils 2µg in 16µl. Zunächst wurden die benötigten Mengen für alle Proben

mit Excel berechnet und alle Ansätze für die einzelnen Schritte vorbereitet. Wir

verwendeten jeweils 2µl 10x DNase I-Puffer und 2µl RNase-freie DNase I

(RQ1/Promega) für den DNase-Verdau. Dieser wurde 15 Minuten bei

Raumtemperatur durchgeführt und mit 2µl 25mM EDTA Stop-Solution gestoppt. Es

wurde 15 Minuten bei 65°C inkubiert. Der Mastermix A enthielt 1,2µl

Randomprimer, 0,8µl Oligo dT-Primer und 8µl DEPC-Aqua dest. Mit ihm wurde 5

Minuten bei 70°C zur Anlagerung der Primer inkubiert und die Probe anschließend

1 Minute auf Eis gegeben. Für die reverse Transkription wurde der Mastermix B

zupipettiert. Er enthielt 10µl 5x MMLV-Puffer, 2,5µl dNTP-Mix, 1µl RNase-

Inhibitor, 2µl MMLV, und 4,5µl DEPC-Aqua dest. Die reverse Transkription wurde

im Thermoblock 60 Minuten bei 37°C durchgeführt, anschließend wurden die

Proben mit der gewonnenen cDNA auf Eis gegeben und bei -20°C bis zum weiteren

Gebrauch gelagert.

Die quantitative Expressionsbestimmung geschah mittels einer TaqMan-PCR

(Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR System). Diese ist ein quantitatives

Echtzeit-PCR-Verfahren. Sie ermöglicht die Detektion von spezifisch synthetisierter

DNA mittels Sonden, die zur Synthese einer bestimmten Nukleotidsequenz und

somit eines speziellen Genprodukts (in unserem Fall in cDNA umgeschriebene

mRNA-Produkte der Gene der AMPs) nötig sind und durch Lichtemission

detektierbar sind. Die Sonden, die also an ein spezielles Gen angepasst sein müssen,

27

wurden wie die Primer sorgfältig ausgesucht und auf ihre Spezifität mittels

Elekrophoreselauf getestet (siehe Abbildung 5). Um sie und besonders auch ihren

Verbrauch im TaqMan detektieren zu können, sind sie mit zwei verschiedenen

Fluoreszenzfarbstoffen ausgestattet. Am 5’-Ende befindet sich das FAM (6-

Carboxyfluoreszein), am 3’-Ende das TAMRA (Tetramethylrhodamin). FAM ist der

Donorfarbstoff, auch Reporter genannt, TAMRA der Akzeptorfarbstoff oder

Quencher. Durch die Lichtquelle im TaqMan-Gerät wird der Donorfarbstoff

angeregt, der seine Energie aber nicht in Form von Licht abgibt, sondern sie auf den

Akzeptor überträgt (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer bzw. Förster-

Resonanzenergietransfer FRET). Im TaqMan ist dieser Akzeptorfarbstoff nicht

emissiv, er gibt seine Energie nicht in Form von Licht ab, sondern löscht einfach das

Fluoreszenzsignal des Donors (dark quencher). Dies geschieht jedoch nur bei sehr

enger räumlicher Nähe, wie sie bei der intakten Sonde, die nur ein paar Nukleotide

lang ist, gegeben ist. In der TaqMan-PCR macht man sich jetzt die 5’-3’-

Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase zunutze. Nachdem sie am 3’-Ende eines

Primers angesetzt hat, synthetisiert sie komplementäre DNA und spaltet, sobald sie

auf die ebenfalls gebundene Sonde trifft, diese in ihre einzelnen Nukleotide auf, um

das DNA-Stück bis zum reversen Primer fertigzustellen. Reporter und Quencher

werden so voneinander getrennt und beeinflussen sich gegenseitig nicht mehr. Das

Reportersignal wird nun durch den Quencher nicht mehr unterdrückt und kann als

Fluoreszenz detektiert werden. Die Fluoreszenz steigt direkt proportional mit der

synthetisierten DNA. Gemessen wird die Fluoreszenz am Ende der Elongation eines

jeden PCR-Zyklus. Aus der Menge der Zyklen, die bis zu einer Signalwahrnehmung

nötig sind und damit den Beginn der exponentiellen Phase der DNA-Vermehrung

(Threshold) markieren (Ct-Wert), lässt sich auf die Menge der zu Beginn

vorhandenen cDNA des spezifischen AMPs schließen. Dies geschieht dadurch, dass

der Ct-Wert einer Probe mit denen einer Standardverdünnungsreihe von bekannten

DNA-Konzentrationen, die für jedes Gen mitgeführt wird, verglichen wird. Die

Standardverdünnungsreihe ergibt eine Standardkurve, die jedem Ct-Wert eine

bestimmte Konzentration zuweist. So lässt sich für jede Probe die Konzentration der

Gen-cDNA ablesen. Dabei verhält sich der Ct-Wert indirekt proportional zur DNA-

Menge. Je höher dieser Wert ist, d.h. je mehr Zyklen bis zur Signalwahrnehmung

nötig sind, desto weniger cDNA war zu Beginn in dieser Probe vorhanden. Die

Standardverdünnungsreihe aus 21 verschiedenen Verdünnungen wurde in solchen

28

Schritten gewählt, dass jede Verdünnung noch einmal auf das Doppelte verdünnt

wurde (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, …, 1:33554432). Verwendet wurden dafür Kryo-Magen-

und -Dünndarm-Proben und mit Qiagenkit gewonnene Blut-cDNA. Ein Ansatz für

die TaqMan-PCR enthielt 2,5µl 10x Taq-Puffer II, 1,75µl ROX Passive, 1µl dNTP-

Mix (UTP) 5mM, 2µl MgCl2 4mM, 0,13µl AmpliTaq gold (5U/µl), 0,25µl

AmpERaseUNg, 7,37µl H2O, 2,5µl Sonde taq (2µM), 2,5µl Primer forward (3µM),

2,5µl Primer reverse (3µM) und 2,5µl des bei der reversen Transkrition gewonnenen

Templates. Nachdem eine Background-Messung mit der leeren Platte durchgeführt

wurde, wurde 2 Minuten bei 50°C inkubiert, dann zur Denaturierung 10 Minuten bei

95°C. Dann wurden 40 Zyklen durchgeführt: 15 Sekunden 94°C zur Denaturierung,

60 Sekunden 64°C zur Strangsynthese. An jedem Zyklusende nach dem Annealing

wurde die Fluoreszenz gemessen. Um die Güte der Proben zu prüfen, wurden

Housekeeping-Gene für jede gemessen. Housekeeping-Gene sind konstitutiv

exprimierte, nicht regulierte Gene, die gewebsunspezifisch sind. So konnten die

gefundenen AMP-Gen-Mengen immer auf die Housekeeping-Gen-Mengen dieser

Probe bezogen werden. Um auch hier ausschließen zu können, dass für dieses

Housekeeping-Gen individuelle Expressionsmuster vorliegen, wurden zwei

verschiedene Housekeeping-Gene (Hypoxanthinphosphoribosyltransferase HPRT

und Porphobilinogendeaminase PBGD) gemessen und die AMP-Gene auch auf

beide bezogen. Es ergab sich jedoch innerindividuell kein Unterschied in der

Expression. Ausgewertet wurde mit dem Programm 7500 System Software,

Grafiken wurden mit Graph Pad Prism 4 erstellt.

29

α-Defensin 5 Primer forward ACTCTCTGCTCTTAGAACCTCAGGTT Primer reverse CGGCCACTGATTTCACACAC Sonde CAAGAGCCACCTGCTATTGCCGAACC TFF1 Primer forward CGAGGCCCAGACAGAGACG Primer reverse CGAACGGTGTCGTCGAAAC Sonde TCACGCCCTCCCAGTGTGCAAATAA TFF2 Primer forward CCAGTGACCAGTGTTTTGACAATG Primer reverse GACGCACTGATCCGACTCTTG Sonde TCCCCTGGTGTTTCCACCCCCTC LL-37 Primer forward GACCCAGACACGCCAAAGC Primer reverse CATACACCGCTTCACCAGCC Sonde CCCAGGACGACACAGCAGTCACCAG GKN1 Primer forward TGAAGACAAGATGAAGTTCACAATTG Primer reverse TTGTTGTTGTCATCATTGACGTTG Sonde ACTTCTTGGAGTCTTTCTAGCTCCTGCCCTAGC HPRT Primer forward TGGACTAATTATGGACAGGACTGAAC Primer reverse GTAATCCAGCAGGTCAGCAAAG Sonde CCATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGCTC PBGD Primer forward GAACCAGCTCCCTGCGAAG Primer reverse GTGTTGAGGTTTCCCCGAATAC Sonde CCCAGCTGCAGAGAAAGTTCCCGC Abbildung 5: Primer und Sonden für TaqMan-PCR

30

5. Ergebnisse

5.1. Immunhistochemische Färbungen

5.1.1. E-Cadherin

Es zeigte sich bei den meisten Patienten eine apikal betonte Färbung der

Epithelzellen. In der NEC-Gruppe lag dieser Anteil bei 57,1% (4/7) - 42,9% (3/7)

zeigten eine fast ausschließlich apikale Anfärbung (siehe Abbildung 6, Bild A und

B) -, in der NEC-Verlaufgruppe bei 60% (3/5) und in der Kontrollgruppe bei 66,7%

(2/3). Die restlichen 42,9% (3/7) der NEC-Gruppe wiesen eine basal und apikal

gleichmäßig starke (28,6% (2/7)) bzw. basal stärkere (14,3% (1/7)) Anfärbung auf.

Von den 60% in der Verlaufgruppe, die eine stärkere apikale Färbung zeigten,

präsentierte sich ein Drittel mit fast nur apikaler Färbung. Bei den übrigen 40% (2/5)

dieser Gruppe verteilte sich die schwache Anfärbung gleichmäßig über das gesamte

Epithel. Dieses Bild zeigte sich in der Kontrollgruppe bei 33,3% (1/3) (siehe

Abbildung 6, Bild C und D).

A C E

fast ausschließlich apikale Färbung

31

B D F

Abbildung 6: Immunhistochemie E-Cadherin. A: NEC apikal, 20x Vergrößerung. B: NEC basal, 20x Vergrößerung. C: Kontrolle apikal, 20x Vergrößerung. D: Kontrolle basal, 20x Vergrößerung. E: Negativkontrolle apikal, 20x Vergrößerung. F: Negativkontrolle basal, 20x Vergrößerung.

5.1.2. α-Defensin 3/5

Das antimikrobielle Peptid α-Defensin 5 wird in den Paneth-Zellen des Dünndarms

gebildet. α-Defensin 3 ist ein Protein der neutrophilen Granulozyten. In der

Auswertung beschränkten wir uns auf die epitheliale Färbung, d.h. von α-Defensin

5. Generell zeigte sich in allen Schnitten ein gut gefärbtes Bild. Um dennoch die

Färbung quantifizieren zu können, wurde Verteilung und Stärke der Anfärbung von

Zotten und Krypten im Vergleich beurteilt. Zellen der Zotten waren in der NEC-

Gruppe in allen Schnitten angefärbt bis auf 28,6% (2/7). Bei diesen Patienten

zeigten sich in einem Fall nicht gefärbte, im anderen Fall nicht beurteilbare Zotten

(siehe Abbildung 7, Bild A). Bei den anderen NEC-Patienten fand sich eine sehr

spärliche Zottenanfärbung. Bei der Kryptenanfärbung waren 28,6% (2/7) quantitativ

nicht beurteilbar. Dies hängt mit der teilweise ziemlich defekten Darmschleimhaut

bei den NEC-Patienten zusammen. Von den restlichen stellten sich 80% (4/5) sehr

kräftig gefärbt dar, 20% (1/5) wiesen eine sehr geringe Färbung auf (siehe

Abbildung 7, Bild B). Die Verlaufgruppe zeigte ein etwas anderes Bild. Hier waren

die Krypten ausnahmslos kräftig gefärbt, auch die Zotten wiesen in 60% (3/5) viel

α-Defensin 5 auf (siehe Abbildung 7, Bild C). Die anderen 40% zeigten eine

geringere Färbung in den Zotten, die aber in jedem Schnitt vorhanden war.

Insgesamt ist also nach überstandener NEC eine deutlich stärkere Anfärbung zu

vermerken als in der akuten NEC-Phase. In der Kontrollgruppe zeigte sich in 66,7%

basale Färbung

32

(2/3) eine sehr schwache Kryptenfärbung, der dritte Patient zeigte eine kräftige

Anfärbung (siehe Abbildung 7, Bild E). Die Zotten waren in allen Fällen der

Kontrollgruppe sehr spärlich gefärbt (siehe Abbildung 7, Bild D).

A B

Zotten nicht gefärbt

geringe Kryptenfärbung

33

C

D

E

fehlende Zottenfärbung

kräftige Kryptenanfärbung

34

F G

Abbildung 7: Immunhistochemie α-Defensin 3/5. A: NEC apikal, 20x Vergrößerung. B: NEC basal, 20x Vergrößerung. C: Verlaufgruppe, 4x Vergrößerung. D: Kontrolle apikal, 20x Vergrößerung. E: Kontrolle basal, 20x Vergrößerung. F: Negativkontrolle apikal, 20x Vergrößerung. G: Negativkontrolle basal, 20x Vergrößerung.

5.1.3. TFF1

Die trefoil factors werden von den darmständigen Goblet-Zellen gebildet. TFF1 ist

sehr gut und kräftig in allen Schnitten gefärbt. Von den NEC-Patienten zeigten

85,7% (6/7) dicht stehend gefärbte Zellen in allen Zotten (siehe Abbildung 8, A und

B). 14,3% (1/7) wiesen dagegen in den meisten Zotten keine gefärbten Zellen auf,

einige enthielten ein paar wenige (siehe Abbildung 8, Bild C). In der Verlaufgruppe

zeigte sich in 100% (5/5) ein Bild wie bei der Mehrzahl der NEC-Gruppe. Die

Kontrollgruppe zeigte ein äußerst heterogenes Bild: 66,6% (2/3) präsentierten

gefärbte Zellen über alle Zotten, davon ein Patient mit dicht stehenden Zellen und

einer mit vereinzelten. Der dritte Kontrollpatient schließlich hatte viele Zotten gar

nicht gefärbt, einige mit relativ wenigen Zellen (siehe Abbildung 8, Bild D). Es

zeigten sich also 66,6% (2/3) mit weniger Zellen, 33,3% (1/3) mit vielen.

35

A

B

C

Zotten sehr spärlich gefärbt

36

D E

F

Abbildung 8: Immunhistochemie TFF1. A: NEC, 20x Vergrößerung. B: NEC, 100x Vergrößerung aus A. C: NEC, 20x Vergrößerung. D: Kontrolle, 20x Vergrößerung. E: Negativkontrolle apikal (Rabbitserum), 20x Vergrößerung. F: Negativkontrolle basal (Rabbitserum), 20x Vergrößerung.

5.1.4. TFF2

Dagegen war TFF2 in den meisten Schnitten nicht nachzuweisen. Aus der NEC-

Gruppe zeigte nur ein Präparat ein paar gefärbte Zellen apikal, die restlichen 85,7%

(6/7) waren nicht gefärbt (siehe Abbildung 9, Bild A und B). Ebenso in den anderen

Gruppen: Die Verlaufgruppe hatte ein Präparat mit einer ähnlichen Färbung

aufzuweisen (Abbildung 9, Bild D bis F), die Kontrollgruppe ebenfalls. Es zeigten

sich 80% (4/5) der Verlaufgruppe ungefärbt und 66,6% (2/3) der Kontrollgruppe

(siehe Abbildung 9, Bild C).

einzelne Zotten mit wenig gefärbten Zellen

37

A B

C D

E F

apikal ein paar gefärbte Zellen

TFF2-Färbung

basal keine gefärbten Zellen

38

G H

Abbildung 9: Immunhistochemie TFF2. A: NEC apikal, 20x Vergrößerung. B: NEC basal, 20x Vergrößerung. C: Kontrolle apikal, 20x Vergrößerung. D: Verlaufgruppe apikal, 20x Vergrößerung. E: Verlaufgruppe basal, 20x Vergrößerung. F: Verlaufgruppe, 100x Vergrößerung aus D. G: Negativkontrolle apikal, 20x Vergrößerung. H: Negativkontrolle basal, 20x Vergrößerung.

5.1.5. LL-37

LL-37 wird von verschiedenen epithelialen Zellen und so auch im Darm gebildet.

Vermutlich ist hauptsächlicher Produktionsort hier der Dickdarm. Es färbten sich in

unseren Dünndarmpräparaten vereinzelte epitheliale Zellen basal in Zotten und

Krypten. Aus der NEC-Gruppe kamen 28,6% (2/7) nicht zur Auswertung, weil die

Schnitte kein intaktes Epithel enthielten und nicht beurteilbar waren. Von den

anderen zeigten 60% (3/5) jede Zotte mehrere angefärbte Zellen (siehe Abbildung

10, Bild A bis C). Bei 40% (2/5) zählten wir weniger, d. h. nicht jede Zotte bzw.

Krypte mit gefärbten Zellen. In der Verlaufgruppe zeigten 100% (4/4) das Bild mit

den weniger gefärbten Zellen wie in der NEC-Gruppe (siehe Abbildung 10, Bild D

und E). Die Kontrollgruppe war ebenso zu beurteilen (siehe Abbildung 10, Bild F

bis H).

39

A B

C D

E F

LL37-Färbung

40

G

H

I J

Abbildung 10: Immunhistochemie LL-37. A: NEC apikal, 20x Vergrößerung. B: NEC basal, 20x Vergrößerung. C: NEC, 100x Vergrößerung aus B. D: Verlaufgruppe apikal, 20x Vergrößerung. E: Verlaufgruppe basal, 20x Vergrößerung. F: Kontrolle apikal, 20x Vergrößerung. G: Kontrolle basal, 20x Vergrößerung. H: Kontrolle, 100x Vergrößerung aus F. I: Negativkontrolle apikal (Rabbitserum), 20x Vergrößerung. J: Negativkontrolle basal (Rabbitserum), 20x Vergrößerung.

5.1.6. GKN1

Das Peptid Gastrokin1, auch Foveolin oder AMP-18 genannt, kommt in

gastrointestinalen Geweben nur im Magenepithel vor. Es wird im gesunden Magen

gefunden, bei Magenkarzinom oder Helicobacter pylori-Infektion ist es

LL37-Färbung

41

herunterreguliert. Studien konnten eine schnellere Wundheilung bei Vorhandensein

des Proteins feststellen (Rippa et al. 2010). Alle Schnitte waren für dieses Peptid

negativ (keine Abbildung).

5.2. PCR der Schnitte

Alle Proben zeigten eine Expression des Panethzell-Defensins α-Defensin 5 (siehe

Abbildung 11, Bild A), von TFF1 (siehe Abbildung 11, Bild B) und von

Cathelicidin (siehe Abbildung 11, Bild D). In keiner Probe der Kontrollgruppe

konnte eine Expression von TFF2 nachgewiesen werden. Dagegen zeigten sich alle

Proben der Verlaufkontrolle für cDNA von TFF2 positiv. In der NEC-Gruppe war

eine Probe positiv (siehe Abbildung 11, Bild C). Analog zur immunhistochemischen

Peptiddarstellung zeigte sich in allen Proben keine Expression von GKN1 (keine

Abbildung).

A

B

C

D

Abbildung 11: PCR cDNA. Mittelwert und Standardabweichung. A: α-Defensin 5. B: TFF1. C: TFF2. D: LL-37.

42

6. Diskussion

Ein Unterschied in der Intaktheit der Epithelbarriere zwischen den Gruppen zeigte

sich in unserer Untersuchung nicht. Die mehrheitlichen Schnitte in der NEC-Gruppe

wiesen Stellen geringerer Färbung von E-Cadherin auf im apikal-basalen Vergleich,

nur ein geringer Teil hingegen zeigte durchgehend starke Färbungen. Die

Darstellung in der Kontrollgruppe ist ähnlich der NEC-Gruppe. Stellenweise nicht

intaktes Epithel zeigt sich ebenfalls in beiden Gruppen. In der Verlaufgruppe zeigten

sich alle Patienten stellenweise oder global mit einer recht schwachen Färbung.

Zusammenfassend konnte jedenfalls bei den NEC-Kindern im Vergleich mit der

Verlauf- und Kontrollgruppe kein E-Cadherin-Mangel festgestellt werden, der

gegenüber pathogenen Faktoren wie Keimen eine mechanische Abwehrschwäche

darstellen und folglich zu einer überschießenden Immun- und Entzündungsantwort

führen würde. Es sei allerdings auf die kleine Untersuchungsgruppe für die

Kontrolle hingewiesen.

Hanby et al. sehen in E-Cadherin nicht nur einen Marker für die Epithelbarriere,

sondern schließen aus Menge und Verteilung auf die Aktivität der Regeneration. Sie

stellen die These auf, dass bei Wundheilungsprozessen des Epithels E-Cadherin

stellenweise verringert ist und die Epithelzellen so die notwendige Mobilität

erhalten, andererseits aber auch Inseln mit vermehrtem E-Cadherin vorhanden sind,

um die Position von deren Zellen zu halten. Dazu untersuchten sie neben einer

gesunden Kontrollgruppe ileales und kolonisches Epithel bei der chronisch

entzündlichen Darmerkrankung Morbus Crohn, gastroduodenale peptische Ulzera

und ein in-vitro-Modell mit einer Epithelzelllinie des kolorektalen Karzinoms. Sie

sahen in gesundem Epithel durchgehend starke Färbungen, bei der chronisch

entzündlichen Darmerkrankung an entzündeten Stellen Krypten und apikale Zellen

stark gefärbt, die im mittleren Bereich dazwischenliegenden Zellen schwach bis gar

nicht. Ebenso bei Gastritis. Bei Ulzera waren die Färbungen der apikalen Zellen und

vor allem der Krypten meist schwach, mit Säulen stärkerer Färbung dazwischen.

Hanby et al. erklären die fehlenden oder schwachen Färbungen bei Ulzera mit der

Regeneration der Zellen und ihrer notwendigen Mobilität aufgrund der

Epithelerneuerung, die bei Entzündung mit dem erhöhten Zellumsatz. In den stärker

gefärbten Stellen bei Ulzera sehen sie kürzlich erneuertes Epithel als Ausdruck der

Chronizität (Hanby et al. 1996). Analog dazu sehen wir vielleicht in der schwachen

Färbung der Verlaufgruppe einen frühen Wundheilungsprozess in der Situation der

43

Stomarückverlagerung und sowohl in der NEC-Gruppe als auch in der

Kontrollgruppe generell regenerative oder entzündliche und, vor allem in der NEC-

Gruppe, auch ulzeröse Prozesse.

Insgesamt ist nach überstandener NEC eine deutlich stärkere Anfärbung von α-

Defensin 5 zu vermerken als in der akuten NEC-Phase bzw. in der Kontrolle. Im

Vergleich der NEC- mit der Kontrollgruppe lässt sich andeutungsweise eine

vermehrte Färbung der Krypten bei akuter NEC feststellen. Vermindert konnten wir

die Panethzellen bzw. deren Produkte bei NEC im Vergleich mit der Kontrolle nicht

finden. Salzman et al. stellten in einer Untersuchung ähnlich der unseren α-Defensin

5 immunhistologisch und die Expression von α-Defensin 5 und 6 mittels mRNA-

Messung dar. Sie untersuchten dazu sechs Ileum- und Jejunum-Schnitte von

operiertem Darm von NEC-Kindern, fünf Dünndarm-Kontrollschnitte von Kindern

mit Darmatresie und Mekoniumileus kamen zur Auswertung. Die NEC-Kinder

waren mit 25 bis 31 SSW alle jünger als die Kontrollkinder, die in den SSW 35 bis

40 geboren wurden. Das Lebensalter der NEC-Kinder war 5 bis 45 Tage, die

Kontrollkinder wurden am ersten oder zweiten Lebenstag operiert. In einer weiteren

Untersuchung zeigte ein Fetus der SSW 24 ein geringeres Level an α-Defensin 5,

sowohl mRNA als auch Peptid, als reifgeborene Kinder oder Erwachsene. Die NEC-

Kinder zeigten eine vermehrte Expression von α-Defensin 5 und 6 und mehr Paneth-

Zellen als die Kontrollgruppe. Die Peptide waren aber nicht gleichermaßen erhöht

und in NEC-Gruppe und Kontrolle gleich. Physiologisch müsste die Expression

erniedrigt sein bei den NEC-Kindern aufgrund ihres geringeren Gestationsalters,

Salzman et al. folgern deshalb, die NEC induziere die Expression und erhöhe auch

die Paneth-Zellzahl. Sie deuten diese Befunde als Auswirkung der NEC und, was

auch denkbar wäre, nicht als Ursache für sie. Dass sie nicht das höhere postnatale

Alter der NEC-Kinder widerspiegeln, sehen sie darin bestätigt, dass die

Veränderungen über die verschiedenen Zeitpunkte der Operation bei den einzelnen

NEC-Patienten (5. bis 45. Lebenstag) sehr konsistent auftreten. Sie folgern, dass

durch die inflammatorischen Vorgänge bei der NEC die α-Defensine 5 und 6

vermehrt exprimiert und sezerniert werden, weshalb die intrazellulären Peptide sich

auch nicht erhöht darstellen (Salzman et al. 1998). Die vermehrte Anfärbung von α-

Defensin 5 in der NEC- im Vergleich mit der Kontrollgruppe, sei es durch mehr

Paneth-Zellen oder stärkere Färbung der einzelnen Zelle, können wir in unserer

Untersuchung auch tendenziell sehen. Aufgrund des Alters der Proben und der

44

resultierenden Anfälligkeit der Werte einer PCR haben wir unsere

Expressionsuntersuchung nicht quantitativ ausgewertet. Sieht man sich die Werte im

Vergleich an, lässt sich aber eine Tendenz zu der von Salzman et al. gefundenen

gesteigerten Expression in der akuten NEC-Phase noch nicht beobachten, erst in der

Verlaufgruppe. Problematisch sind bei Salzman et al. die deutlich geringeren

Gestationswochen der NEC-Gruppe, jedoch sehen sie darin, vermutlich auch zu

Recht, noch eine Bestätigung für die gefundene verstärkte Expression bei NEC.

Trotz des relativ gleichen Gestationsalters unserer Gruppen NEC und Kontrolle,

also der geringen Gestationsalter der Kontrollkinder, sehen wir keinen starken

Unterschied im Sinne einer geringeren Färbung bei der Kontrolle. Dennoch können

wir die These von Salzman et al. unterstützen, dass die NEC oder die Prozesse, die

zur NEC führen, eine vermehrte Produktion von α-Defensin 5 hervorrufen. Die

vermehrte Anfärbung in der Verlaufgruppe kann einerseits eine Steigerung der im

akuten Stadium schon und im abgeheilten noch zu sehenden Vermehrung von α-

Defensin 5 – als Abwehrreaktion und Bestandteil der NEC – bedeuten, oder aber

auch nur die natürliche Zunahme dieses Peptids mit dem Alter zeigen.

Schaart et al. untersuchten in den Resektionsrändern von Darmpräparaten bei NEC

u. a. das Goblet-Zell-Peptid TFF3 und die Paneth-Zellen mit Hilfe von deren

Lysozym-Produktion. Sie verwendeten dazu sowohl Dünn- als auch Dickdarm aus

21 NEC-Operationen, 17 Stomarückverlagerungen und 9 Kontrollen. Auch hier

wies die NEC-Gruppe wie bei Salzman et al. ein geringeres Gestationsalter als die

Kontrollgruppe auf (25 bis 39 SSW, Median 32 vs. 35 bis 40 SSW, Median 39). Sie

weisen darauf hin, dass TFF3 ab der 12. SSW exprimiert wird und sich Lysozym in

der SSW 20 findet. Für die Paneth-Zellen treffen sie die Feststellung, dass sie nur an

der Kryptenbasis zu finden sind. Bei akuter NEC stellen sie sowohl eine schwächere

Färbung der einzelnen Zelle fest als auch bei schweren Zellschäden eine verringerte

Zahl an Zellen. Zum Zeitpunkt der Stomarückverlagerung sehen sie vermehrt

Paneth-Zellen (Schaart et al. 2009). Im Gegensatz dazu sehen wir Paneth-Zellen

auch in den Zotten, kräftig in den meisten Schnitten der Verlaufgruppe. Es mag sein,

dass Paneth-Zellen das Lysozym nur in den basalen Zellen exprimieren im

Gegensatz zum α-Defensin. Auch sehen wir ihr Produkt α-Defensin 5 in unseren

NEC-Schnitten kräftig gefärbt, wohingegen die Kontrollgruppe in der Mehrzahl eine

schwache Färbung zeigt. Diese Ergebnisse müssen nicht zwingend im Widerspruch

stehen, da Schaart et al. mit Lysozym ein anderes Produkt der Paneth-Zellen

45

untersuchen. Wir ziehen jedoch die Frühgeburtlichkeit der NEC-Kinder als

mögliche Ursache der geringeren Lysozym-Färbung in Betracht. Diesen

Altersaspekt in ihrem Untersuchungsmodell lassen Schaart et al. außer Acht und

schließen aus ihren Ergebnissen nur auf die insuffiziente Reaktion auf einen Angriff

des Epithels. Wegen der kleinen Kollektive lässt sich nur eine Tendenz in der

Auswertung der Befunde von α-Defensin 5 erkennen, die aber die Ergebnisse der

Untersuchung von Salzman et al. bestätigt und eine vermehrte Peptidproduktion

durch die Paneth-Zellen bei akuter NEC postuliert.

In der Expression lassen sich bei TFF1 keine Unterschiede in den Gruppen

feststellen. In der Immunhistochemie zeigt die Mehrzahl der Kontrollen weniger

gefärbte Zellen, die Mehrheit der NEC-Gruppe zeigt viele Zellen und die

Verlaufgruppe schließlich ausnahmslos viele Zellen. Einen Mangel an TFF1 weist

der Großteil der NEC-Patienten gegenüber den Kontrollen in unserer Untersuchung

also nicht auf und TFF1 ist in allen Schnitten deutlich angefärbt. Vieten et al. haben

Expression und Immunhistochemie von TFF1-3 getestet bei zwölf NEC-Patienten,

acht Verlaufkontrollen, 20 Kontrollen und 15 Fetuskontrollen. Die NEC-Gruppe

war durchschnittlich deutlich jünger als die Kontrollgruppe, die Reifgeborene

repräsentierte. Die Feten entstammten der 11. bis 13. SSW. Durch die Untersuchung

der Feten stellten sie dar, dass diese schon das gleiche Peptidprofil wie Erwachsene

aufweisen und somit das Alter keine Rolle spielt. Für TFF3 fanden sie in den

Kontrollen die höchsten Werte, für TFF1 und 2 in der Verlaufgruppe, in der

regeneratives Epithel die stärkste Expression und Färbung zeigte. Allerdings waren

die Färbungen und auch die Expression für TFF1 jeweils nur schwach. Zwei NEC-

Proben zeigten bei ihnen schwache Färbung. TFF1 und 2 stellen sie als

normalerweise vom gesunden Darm nicht produziertes Peptid dar, nur TFF3 ist

konstitutiv exprimiert. Für TFF3 postulieren sie daher, dass bei NEC die notwendige

Hochregulierung fehlt, bei TFF1 und 2 die Ingangsetzung der Expression. Grund für

die Verringerung von TFF3 bei NEC sehen sie sowohl in dem Verlust von

Gobletzellen als auch dem Verlust von deren Produktion, da sie auch leere

Gobletzellen sehen (Vieten et al. 2005).

Schaart et al. haben in ihrer oben genannten Untersuchung TFF3 als Marker für die

Goblet-Zellen benutzt. Sie sehen in nicht so stark geschädigtem Epithel bei akuter

NEC eine normale bis erhöhte Goblet-Zellzahl und erhaltene TFF3-Produktion bei

allen Zellen. Sie vermuten jedoch, dass die Expression insuffizient ist im Zustand

46

der NEC (Schaart et al. 2009). Wir haben TFF3, den typischeren TFF des Darms,

nicht untersucht. Jedoch sehen wir für TFF1 viel stärkere Färbungen als Vieten et al.

Es zeigt sich wie bei ihnen in NEC- und Verlaufgruppe deutlicher als in den

Kontrollen. Die Aussage, dass die Expression von TFF1 bei NEC fehlt, können wir

nicht bestätigen. Allerdings lässt sich eine Tendenz zur Hochregulierung in unseren

Expressionen auch nicht finden, von einer Probe abgesehen. Ein Kritikpunkt an der

Untersuchung von Vieten et al. ist die Nichtunterscheidung von Dünn- und

Dickdarm. Es ist nicht nachvollziehbar, in welchen Schnitten sie Färbungen fanden

und in welchen nicht. Möglicherweise liegt auch hierin der Grund für die

unterschiedlichen Ergebnisse in Bezug auf TFF1. Wir finden keinen Mangel an

TFF1 gegenüber den Kontrollen bei akuter NEC, tendenziell eher eine Steigerung

der Produktion bzw. vermehrt Gobletzellen wie auch Schaart et al. Das Ergebnis ist

somit vergleichbar mit den Ergebnissen bei α-Defensin 5.

Aus der Färbung von TFF2 lassen sich keine Schlüsse ziehen. Die Ergebnisse

stimmen insofern mit denen von Vieten et al. überein, dass der Darm keine oder nur

eine schwache Färbung für dieses Peptid aufweist (Vieten et al. 2005). Anders als

TFF1 scheint TFF2 nur nach einer Schleimhautschädigung exprimiert zu werden

und sich im gesunden Darm nicht zu finden. In der Expression zeigte sich, mit einer

Ausnahme in der NEC-Gruppe, nur die Verlaufgruppe positiv. In der Proteinfärbung

war es dort in den meisten Schnitten (noch) nicht nachzuweisen. Allerdings ließ sich

auch in der Kontrollgruppe bei einem Schnitt färberisch Peptid nachweisen, ohne

dass es in der PCR gemessen werden konnte. Wir können also die Expression von

TFF2 in einer Probe der NEC-Gruppe messen, färberisch können wir es in einer

Probe der Kontrollgruppe nachweisen. Kontroll- und NEC-Gruppe unterscheiden

sich, alle Ergebnisse in Bezug auf TFF2 vergleichend, in unserer Untersuchung

nicht, die NEC-Gruppe weist keinen Mangel an TFF2 auf gegenüber der

Kontrollgruppe. Das Ergebnis zeigt aber auch, dass zum Zeitpunkt der Operation

der NEC noch keine sichtbare Steigerung der TFF2-Expression mit dem Ziel der

Regeneration und Wundheilung stattgefunden hat. Dass wir es färberisch sowohl in

der NEC- als auch in der Verlaufgruppe nicht messen können, kann auch auf eine

Translationsstörung bei der NEC zurückzuführen sein. Vieten et al. konnten zeigen,

dass die Produktion der TFFs schon im ersten Trimenon beim Feten stattfindet wie

beim Erwachsenen (Vieten et al. 2005). Möglicherweise läuft aber der Prozess, der

47

die Produktion als Reaktion auf eine Schädigung in Gang kommen lässt, bei

Frühgeborenen noch zu langsam ab und prädisponiert deshalb zur NEC.

Für LL-37 konnten keine gruppenspezifischen Unterschiede beobachtet werden,

evtl. lässt sich die Tendenz festhalten, dass es in der NEC-Gruppe färberisch etwas

deutlicher nachzuweisen war und sich in der Verlaufgruppe vermehrt exprimiert

darstellte. Es zeigt sich generell sehr schwach gefärbt. LL-37 gilt als ein Peptid der

differenzierten Zelle, weshalb es sich apikal im gesunden Darm des Erwachsenen

detektieren lässt. Es ist beschrieben, dass es sich im Dünndarm schwächer zeigt als

im Dickdarm. Es soll anders reguliert sein als andere AMPs wie die Defensine.

Beispielsweise wird es unabhängig von einer Keimflora exprimiert (Hase et al.

2002). Erniedrigt ist dieses Peptid nicht nur beim Morbus Crohn (Doss et al. 2010),

sondern auch bei einer Shigellen-Infektion im Darm (Schauber et al. 2003).

Möglicherweise sind Cathelicidine bei Neugeborenen tatsächlich noch verringert,

als NEC-spezifisch vermindert stellt es sich bei uns nicht dar.

Es war ein Ziel der Arbeit, eine parallele Untersuchung der AMPs an jeweils

denselben Präparaten durchzuführen. Hierbei haben wir in den verschiedenen

Färbungen der AMPs unterschiedliche Ergebnisse gefunden. Während bei akuter

NEC das α-Defensin 5, TFF1 und, sehr leicht, LL-37 gegenüber den Kontrollen

ansatzweise erhöht war, ließ sich eine Steigerung der Produktion von TFF2 nicht

feststellen. Wir folgern daraus, dass sie jeweils unterschiedlich reguliert werden.

Ein Problem der Untersuchung der NEC sind die jeweils kleinen Fallzahlen

einzelner Studien, die die Aussagekraft der Ergebnisse einschränken. Ein weiterer

kritischer Punkt ist die Subjektivität der Auswertung der immunhistochemischen

Bilder, die wir durch Auszählung und Berücksichtigung der Verteilung der

angefärbten Peptide möglichst minimiert haben. Jedoch zeigt sich in unserer

Auswertung weitgehende Übereinstimmung mit ähnlichen Untersuchungen der

Literatur. Wir finden die Kapazität des erkrankten Darms, auf die Erkrankung zu

reagieren, in der Darstellung der Bilder der Verlaufkontrolle bestätigt. Diese

gefundenen Reaktionen mögen jedoch zu langsam erfolgen, möglicherweise

spiegelt, wie oben schon erwähnt, dieses Ergebnis auch nur die normale Reifung des

Darms wider: Unsere Kontrollgruppe und NEC-Gruppe sind von der

Altersverteilung in etwa gleich (Mittelwerte NEC-Gruppe: Alter bei OP 10

Lebenstage, Geburt in 32,9. SSW. Mittelwerte Kontrollgruppe: Alter bei OP 14

Lebenstage, Geburt in 31,7. SSW), die Verlaufgruppe ist mit einem Mittelwert von

48

56 Lebenstagen, Geburt in 35. SSW deutlich älter. Kontroll- und NEC-Gruppe

zeigen sich, auch aufgrund der kleinen Kollektive, bis auf Tendenzen in der Färbung

von α-Defensin 5, TFF1 und LL-37 weitgehend gleich. Eine Verringerung von α-

Defensin 5 – sei es als Resultat einer pathologischen Keimflora oder als Ursache für

eine solche, oder als Ausdruck einer Rezeptormutation – ist vermutlich nicht die

einzige Ursache für das Entstehen der NEC. Bei Frühgeborenen mag es eine Rolle

spielen, da die Paneth-Zellen und α-Defensine bei ihnen verringert sind, wie Mallow

et al. gezeigt haben (Mallow et al. 1996). Die Produktionssteigerung, die wir bei

akuter NEC sehen, ist in Bezug auf die Schwere der Erkrankung möglicherweise

noch nicht adäquat und α-Defensin 5 relativ verringert. Möglicherweise ist aber

auch eine vermehrte Produktion von α-Defensin 5 ein begünstigender Faktor als

pathologische Reaktion in der Kaskade der Induktion und Expression. Denkbar ist

nämlich, dass die Veränderungen, die wir sehen, nicht nur durch die NEC verursacht

sind – die AMPs waren verringert aufgrund der Frühgeburtlichkeit, was zur NEC

geführt hat; in ihrem Zuge wurde die Produktion im möglichen Rahmen, aber

insuffizient gesteigert –, sondern auch Prozesse sind, die zur NEC beigetragen

haben – durch AMPs wird eine Entzündungskaskade in Gang gesetzt.

Möglicherweise stimmt das Gleichgewicht in der Reaktion der verschiedenen AMPs

nicht. Die gleichzeitige Erhöhung von TFF2 fehlt beispielsweise. Eine verringerte

Reaktion in der Produktion von TFF spielt wahrscheinlich eine Rolle in der

Pathogenese der NEC. Die Tendenzen bleiben in weiteren Studien zu bestätigen.

Vermutlich spielen viele Faktoren mit hinein: die inflammatorische Antwort der

Zytokine, dieser Weg wird beispielsweise anders reguliert als die Produktion der

Cathelicidine (Hase et al. 2002), Neutrophile in hypoxischen Situationen spielen

eine Rolle, weil sie zu einem verminderten oxidativen Burst führen (Carr 2000), die

tight junctions sind in Bezug auf Zusammensetzung und Funktion bei

Frühgeborenen noch unreif (Hunter et al. 2008), Hypoxie und Ischämie führen

ebenfalls zur Barrierestörung und Einwanderung von Bakterien (Sodhi et al. 2008).

Festzuhalten bleibt, α-Defensin 5, TFF1 und LL-37 sind, absolut gesehen, nicht

vermindert im akuten Stadium der NEC im Vergleich zu den gleichaltrigen

Kontrollen, sie sind aber auch nicht deutlich erhöht. Es ist daher wahrscheinlich,

dass diese Reaktion zu langsam und möglicherweise auch zu wenig aggressiv

stattfindet. Das ist aus unseren Ergebnissen zu dem anderen AMP TFF2 zu lesen.

Dieses reagiert eventuell langsamer als das α-Defensin 5, TFF1 und LL-37, bei

49

denen wir die Erhöhung zum Zeitpunkt der Operation schon andeutungsweise

sehen. Nur durch eine multifaktorielle Genese kann erklärt werden, weshalb einige

reifgeborene Kinder erkranken oder andererseits nicht alle frühgeborenen Kinder

erkranken.

50

7. Literaturverzeichnis

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56

8. Abkürzungsverzeichnis

AMP antimikrobielles Peptid

APC Antigen-präsentierende Zellen

Aqua dest. Aqua destillata

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

CAMP Cathelicidin antimikrobielles Peptid

DAB 3,3’-Diaminobenzidin

DEPC-Aqua dest. Diethylpyrocarbonat-Aqua destillata

DIC disseminierte intravasale Gerinnung

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELBW extremely low birth weiht

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

FAM 6-Carboxyfluorescein

FRET Förster/Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer

GALT gut associated lymphoid tissue

gDNA genomische Desoxyribonukleinsäure

GKN1 Gastrokin 1

hBD-2 humanes β-Defensin 2

hCAP-18 humanes kationisches antimikrobielles Protein 18

HD-5, HD-6 humanes Defensin 5 und 6

HLHS hypoplastisches Linksherz-Syndrom

HNP-1-4 humane Neutrophilen-Peptide 1-4

HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase

IFNγ Interferon γ

IgA, IgG Immunglobuline A und G

IκB Inhibitor von κB

IL1, 1β, 4, 6, 8, 12, 18 Interleukine 1, 1β, 4, 6, 8, 12, 18

iNOS induzierbare NO-Synthase

IVH intraventrikuläre Hämorrhagie

KS-30 alternativ prozessiertes Derivat von LL-37

LBW low birth weight

57

LL-37 antimikrobiell wirksames C-terminales CAMP-Gen

Produkt aus 37 Aminosäuren

LPS Lipopolysaccharid

MAMP microbe-associated molecular pattern

MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase

MDP Muramyldipeptid

MEF minimal enteral feeding

MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification

MMLV-Puffer Puffer zur reversen Transkription

MMP7 Matrixmetalloproteinase 7

mRNA messenger RNA

NBW normal birth weight

NEC nekrotisierende Enterokolitis

NFκB nuclear factor κB

NICHD National Institute of Child Health and Human

Development

NK-Zelle natürliche Killerzelle

NO nitric oxide (Stickstoffmonoxid)

NOD2 Nucleotide-binding oligomerization domain-

containing protein 2

NOS NO-Synthase

OEIS-Syndrom kaudales Fehlbildungssyndrom

ONOOˉ Peroxynitrit

OP Operation

PAF Plättchen-aktivierender Faktor

Pank. an. Pankreas anulare

PBGD Porphobilinogen-Desaminase

PBMC peripheral blood mononuclear cells

PCR Polymerase Kettenreaktion

PDA persistierender Ductus arteriosus Botalli

PKD-Puffer Puffer zur Lösung von Formaldehydbrücken zwischen

Nukleinsäuren

PRR pattern recognition receptor

PRT paralogue ratio test

58

pS2 anderer Name für TFF1

RK-31 alternativ prozessiertes Derivat von LL-37

RNA Ribonukleinsäure

ROX Farbstoff als passive Referenz

RPE-Puffer Waschpuffer

RT-PCR reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion

sp. species

SSW Schwangerschaftswoche

TAK1 transforming growth factor β-aktivierte Kinase 1

TAMRA Tetramethylrhodamin

TaqMan-RT-PCR TaqMan-Real Time-Polmerase Kettenreaktion

TBS-Puffer Tris-Salz-Puffer

TFF trefoil factor

TLR toll-like receptor

TNFα Tumornekrosefaktor α

VACTERL-Assoziation komplexes Fehlbildungssyndrom

VLBW very low birth weight

Wnt/Tcf-4 Signalweg

59

9. Danksagung

Ich möchte mich bedanken bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Henrik Köhler für das

in mich gesetzte Vertrauen und die Betreuung meiner Arbeit. Nachdem Prof. Dr.

Köhler in die Schweiz gerufen worden war, bedanke ich mich ganz besonders bei

Aline Rückel, die es übernommen hat, jederzeit vor Ort ansprechbar zu sein und ein

offenes Ohr für meine Probleme zu haben. Vielen Dank für deine kritischen und

konstruktiven Anmerkungen!

Mein großer Dank gilt Elke Licha, die später Elke Schirmer wurde, aus dem

Forschungslabor der Kinderklinik Erlangen. Sie hat mich in alle Methoden

eingeführt, immer Zeit und Rat für mich gehabt. Ich danke dir!

Und allen anderen aus dem Laborteam: Krissy, Kathrin, Gudrun, Ida, Yvonne, Julia,

Sabine, Manu, Manfred, Tina, Beate, Annika, Nico und Ulla.

An das Humangenetische Institut der Universitätsklinik Erlangen ergeht mein Dank

für das Überlassen der Ergebnisse der Messung der Genkopienzahl von β-Defensin

2, auch wenn diese schließlich in der Arbeit nicht verwendet wurden. Vielen Dank

an Frau PD Dr. Ulrike Hüffmeier!

Ich danke Herrn Dr. Fröhlich, der nach dem Umzug des Forschungslabors in die alte

Dermatologie meine Immunhistochemie-Schnitte aufbewahrt hat.

Meinem Bruder Jeremias und meiner Schwester Hanna danke ich für das

Korrekturlesen meiner Arbeit. Vielen Dank an Sabine Neumann für das

Korrekturlesen der englischen Zusammenfassung!

Schlussendlich möchte ich mich bei meiner ganzen Familie für die Ermöglichung

meines Studiums, für das Interesse und die Unterstützung bedanken.

60

10. Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass die vorliegende Dissertation von mir in allen Teilen

selbstständig angefertigt wurde und keine anderen als die angegebenen Quellen und

Hilfsmittel benutzt wurden. Darüber hinaus erkläre ich, dass die Dissertationsschrift

weder vollständig, noch teilweise einer anderen Fakultät mit dem Ziel vorgelegt

wurde, einen akademischen Grad zu erwerben.

61

11. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name Kaiser

Vornamen Agnes Gabriele

Geburtsdatum 25.05.1986

Geburtsort Neustadt a.d. Waldnaab

Familienstand ledig

Religionszugehörigkeit evangelisch

Eltern Hanns-Friedrich Kaiser, Kantor

Friederike Kaiser, Hausfrau

Geschwister Dorothea Kaiser, Ausbildung Geigenbau

Hanna Kaiser, Studentin der Biologie

Jeremias Kaiser, Student der Elektrotechnik,

Elektronik und Informationstechnik

Schulausbildung:

1992 – 1996 Clausnitzer-Grundschule in Weiden i.d. Opf.

1996 – 2005 Humanistisches Augustinus-Gymnasium Weiden

i.d. Opf., Abschluss mit dem Abitur

Hochschulausbildung:

April 2006 – Juni 2012 Studium der Humanmedizin an der Friedrich-

Alexander-Universität Erlangen

01.04.2008 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Februar 2011 – Januar 2012 Praktisches Jahr:

1. Tertial: Chirurgische Klinik,

Universitätsklinikum Erlangen

2. Tertial: Kinder- und Jugendklinik,

Universitätsklinikum Erlangen

3. Tertial: Medizinische Kliniken 1 und 2,

Universitätsklinikum Erlangen

21.06.2012 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

62

Mai 2010 – heute Doktorarbeit bei Prof. Dr. H. Köhler,

Universitätskinderklinik Erlangen, Thema: „Die

Rolle der antimikrobiellen Peptide und des E-

Cadherins in der Pathogenese der

Nekrotisierenden Enterokolitis“

Pflegepraktikum:

Januar – März 2006 Neurologische Klinik, Klinikum Weiden i. d. Opf.;

Dr. med. M. Angerer

Famulaturen:

August 2008 Dr. med. H. Vielhaber, Klinik für Kinderheilkunde

und Jugendmedizin, Klinikum Weiden

September 2008 Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. U. Eysholdt,

Phoniatrische und Pädaudiologische Abteilung,

Universitätsklinikum Erlangen

Februar – März 2009 Dr. med. H. Beyer, Kardiologische Intensivstation,

Waldkrankenhaus Erlangen

Juli 2009 Dr. med. D. Kramer, Praktische Ärztin

Naturheilverfahren, Dechsendorf

September 2009 Prof. Dr. med. K.-H. Dietl, Kinik für Allgemein-,

Thorax- und Viszeralchirurgie, Klinikum Weiden

März 2010 Dr. med. T. Ebert, Kinder- und Jugendarztpraxis,

Veitsbronn

September 2010 Dr. med. J. Altmeppen, Klinik für Anästhesie,

operative Intensivmedizin und Notfallmedizin,

Klinikum Weiden

Beruflicher Werdegang:

September 2012 Assistenzärztin in der Klinik für Kinder und

Jugendmedizin des Klinikum Coburg