Die Rolle der durch den Verzehr von rotem Fleisch endogen ... · Döhring et al.-Journal of...

Die Rolle der durch den Verzehr

von rotem Fleisch endogen

gebildeten Nitrosoverbindungen in

der malignen Transformation von

humanen Kolonepithelzellen

INAUGURAL -DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Naturwissenschaften

-Doctor rerum naturalium -

(Dr. rer. nat.)

vorgelegt von

Janine Döhring

Hagen

Hannover 2017

Tierärztliche Hochschule Hannover

Institut für Lebensmitteltoxikologie

Wissenschaftliche Betreuung Prof. Dr. Pablo Steinberg

Prof. Dr. Gerd Bicker

1. Gutachter:

Prof. Dr. Manfred Kietzmann

Prof. Dr. Pablo Steinberg

Prof. Dr. Gerd Bicker

2. Gutachter:

Prof. Dr. Walther Honscha

Tag der mündlichen Prüfung: 15.08.2017

Diese Studie wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert-

Aktenzeichen STE 493/21-1

Meiner Familie und bestem Freund und

Partner gewidmet

Teilergebnisse der vorliegenden Dissertation wurden bereits in folgenden Artikeln

veröffentlicht bzw. in Form von Postern präsentiert:

03/2017 The role of red meat derived nitroso compound NO-heme in

the malignant transformation of human colon epithelial cells

Döhring et al.-Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharma-

cology, Volume 390, Issue1 Supplement (Abstract und

Poster)

09/2016 Repair of the mutagenic DNA lesion O6-CMG in human co-

lon epithelial cells

Döhring et al.-Journal of Clinical Toxicology, Proceedings

of 7th Euro-Global Summit on Toxicology & Applied Phar-

macology (Abstract und Poster)

03/2016 The role of the enzyme O6-alkylguanine DNA alkyltransfer-

ase in a non-transformed human colon epithelial cell line

Döhring et al.-Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharma-

cology, Volume 389, Issue 1 Supplement (Abstract und

Poster)

http://programm.conventus.de/index.php?id=dgpt2017&tx_coprogramm_programm%5Bprogramm%5D=157&tx_coprogramm_programm%5Bsession%5D=28&tx_coprogramm_programm%5BcurrentPage%5D=&tx_coprogramm_programm%5Baction%5D=programm&tx_coprogramm_programm%5Bcontroller%5D=Source&cHash=58c83bd53ec76c2da4a06de1169ffa97

http://programm.conventus.de/index.php?id=dgpt2017&tx_coprogramm_programm%5Bprogramm%5D=157&tx_coprogramm_programm%5Bsession%5D=28&tx_coprogramm_programm%5BcurrentPage%5D=&tx_coprogramm_programm%5Baction%5D=programm&tx_coprogramm_programm%5Bcontroller%5D=Source&cHash=58c83bd53ec76c2da4a06de1169ffa97

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ................................................................................................................. 1

1.1 Ziel der Arbeit ............................................................................................ 2

1.2 Literaturübersicht ....................................................................................... 4

1.2.1 Das kolorektale Karzinom .............................................................................. 4

1.2.1.1 Epidemiologie ....................................................................................... 4

1.2.1.2 Mehrstufenmodell der Kanzerogenese .................................................. 4

1.2.1.3 Ätiologie des kolorektalen Karzinoms .................................................. 5

1.2.2 Risikofaktor rotes Fleisch ............................................................................... 6

1.2.3 Komponenten des roten Fleisches und das davon ausgehende Risiko ........... 7

1.2.4 Häm-induzierte Nitrosoverbindungen .......................................................... 10

1.2.5 DNA-Alkylierung durch Nitrosoverbindungen ............................................ 13

1.2.6 DNA-Reparaturmechanismen....................................................................... 14

1.2.7 Biologische Konsequenzen nicht reparierter DNA-Addukte ....................... 17

1.2.8 Die Rolle von O6-CMG in CRC ................................................................... 18

1.2.9 In vitro-Modelle zur Untersuchung von CRC .............................................. 19

1.2.10 Maligne Zelltransformation ....................................................... 21

2 Material und Methoden .......................................................................................... 23

2.1 Material .................................................................................................... 23

2.1.1 Chemikalien und Enzyme ............................................................................. 23

2.1.2 Kommerziell erworbene Lösungen und Testkits .......................................... 24

2.1.2.1 Lösungen ............................................................................................. 24

2.1.2.2 Testkits ................................................................................................ 24

2.1.3 Testsubstanzen .............................................................................................. 25

2.1.4 Hergestellte Lösungen/Puffer ....................................................................... 25

2.1.5 Laborgeräte und -hilfsmittel ......................................................................... 26

2.1.6 Verbrauchsmaterialien .................................................................................. 27

2.1.7 Software 28

2.1.8 Allgemeine Materialien in der Zellkultur ..................................................... 28

2.1.8.1 Adhärente Zelllinien ............................................................................ 28

2.1.8.2 Zellkulturflaschen und -platten ........................................................... 29

2.1.8.3 Basale Nährmedien ............................................................................. 29

2.1.8.4 Nährmedienzusätze ............................................................................. 29

2.1.8.5 Nährmedienzusammensetzung ............................................................ 30

2.1.9 Antikörper und Proteinmarker ...................................................................... 30

2.1.9.1 Primärantikörper ................................................................................. 30

2.1.9.2 Sekundärantikörper ............................................................................. 31

2.1.9.3 Proteinmarker ...................................................................................... 31

2.2 Methoden ................................................................................................. 31

2.2.1 Zellbiologische Methoden ............................................................................ 31

Inhaltsverzeichnis

2.2.1.1 Allgemeine Zellkulturbedingungen .................................................... 31

2.2.1.2 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen ........................... 31

2.2.1.3 Subkultivierung von Zellen ................................................................. 32

2.2.1.4 Zellzahlbestimmung ............................................................................ 32

2.2.1.5 Zellaussaat für In vitro-Versuche ........................................................ 33

2.2.2 Zellcharakterisierung .................................................................................... 33

2.2.2.1 Bestimmung der Sättigungsdichte ....................................................... 33

2.2.2.2 Ermittlung der Verdopplungszeit ........................................................ 34

2.2.2.3 Verankerungsunabhängiges Wachstum .............................................. 34

2.2.2.4 Fokusbildung von konfluenten Zellen ................................................ 35

2.2.3 Toxizitätsanalysen ........................................................................................ 35

2.2.3.1 Zytotoxizität ........................................................................................ 35

2.2.3.2 Genotoxizitätsbestimmung-Comet-Assay ........................................... 36

2.2.3.3 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest ................................................. 37

2.2.4 Molekularbiologische Methoden .................................................................. 39

2.2.4.1 DNA-Addukt-Quantifizierung ............................................................ 39

2.2.4.2 Addukt-Quantifizierung mittels HRMS/PRM .................................... 39

2.2.4.3 shRNA-vermitteltes silencing der MGMT .......................................... 40

2.2.4.4 Aktivitätsbestimmung der MGMT ...................................................... 41

2.2.4.5 MGMT-Expressionsanalyse mittels Real time-qPCR ......................... 41

2.2.5 Biochemische Methoden .............................................................................. 42

2.2.5.1 Proteinexpressionsanalyse-Western Blot ............................................ 42

2.2.5.2 Immunzytochemie ............................................................................... 43

2.2.6 Herstellung und Analytik von NO-Häm ....................................................... 45

2.2.6.1 NO-Häm-Herstellung .......................................................................... 45

2.2.6.2 UV/Vis-Spektroskopie ........................................................................ 45

2.2.6.3 NO-Häm-Verifizierung und Konzentrationsbestimmung mittels

Stickstoffmonoxid Analyzer ............................................................... 45

2.2.7 Statistik 46

3 Ergebnisse .............................................................................................................. 47

3.1 Die Rolle der MGMT in der O6-CMG-Reparatur.................................... 47

3.1.1 Immunzytochemische Charakterisierung der HCEC-Zellen ........................ 47

3.1.1.1 Ausdifferenzierung der HCEC WT-Zellen ......................................... 47

3.1.1.2 Immunzytochemische Färbung der HCEC WT-Zellen ....................... 48

3.1.2 shRNA-vermitteltes MGMT-silencing in HCEC-Zellen.............................. 49

3.1.2.1 MGMT-Expressionsanalyse in HCEC WT- und MGMT --Zellen ..... 49

3.1.2.2 Aktivitätsbestimmung der MGMT in HCEC WT- und HCEC MGMT -

-Zellen ................................................................................................. 50

3.1.3 Charakterisierung der HCEC WT- und HCEC MGMT – -Zellen ................ 50

3.1.3.1 Erstellung der Wachstumskurven ....................................................... 51

3.1.3.2 Bestimmung der Sättigungsdichte ....................................................... 51

Inhaltsverzeichnis

3.1.3.3 Prüfung des verankerungsunabhängigen Wachstums von HCEC WT-

und HCEC MGMT --Zellen im GILA-Assay ..................................... 52

3.1.4 Azaserin-induzierte Zytotoxizität in HCEC WT- und MGMT --Zellen ....... 53

3.1.5 Azaserin-induzierte Genotoxizität in HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen

54

3.1.6 DNA-Addukt-Quantifizierung in Azaserin-behandelten HCEC WT- und

HCEC MGMT --Zellen ................................................................................. 56

3.1.7 MGMT-Proteinexpressions- und Aktivitätsanalyse in HCEC WT-Zellen nach

Azaserin-Behandlung ................................................................................... 57

3.2 Auswirkungen von NO-Häm auf HCEC-Zellen ...................................... 59

3.2.1 NO-Häm-Synthese und -Verifizierung ......................................................... 59

3.2.1.1 Synthese und Quantifizierung ............................................................. 59

3.2.1.2 Absorptionsspektren ............................................................................ 61

3.2.1.3 Stabilität von NO-Häm unter Zellkulturbedingungen ......................... 62

3.2.2 Analyse der Expression von HO-1 und 3-NT............................................... 63

3.2.3 Toxizitätsanalysen nach einmaliger NO-Häm-Behandlung ......................... 64

3.2.3.1 NO-Häm-induzierte Zytotoxizität ....................................................... 64

3.2.3.2 NO-Häm-induzierte Genotoxizität ...................................................... 65

3.2.4 Zyklische NO-Häm-Behandlung der Zelllinien HCEC WT und HCEC

MGMT - 66

3.2.4.1 Morphologie der mit NO-Häm zyklisch behandelten Zelllinien ........ 67

3.2.4.2 Zell-Zell-Kontaktinhibition der mit NO-Häm zyklisch behandelten

Zelllinien ............................................................................................. 68

3.2.4.3 Focusbildung der zyklisch behandelten Zelllinien .............................. 69

3.2.4.4 Verankerungsunabhängiges Wachstum der zyklisch behandelten

Zelllinien ............................................................................................. 70

3.2.5 Prüfung der zelltransformierenden Wirkung von NO-Häm im BALB/c-3T3-

Zelltransformationstest ................................................................................. 71

4 Diskussion .............................................................................................................. 73

4.1 Rolle der MGMT in der Reparatur der CRC-relevanten O6-CMG-Addukte

73

4.1.1 Charakterisierung der in dieser Arbeit eingesetzten humanen

Dickdarmepithelzelllinie............................................................................... 73

4.1.2 MGMT-silencing in HCEC-Zellen und Prüfung des

Zelltransformationsstatus .............................................................................. 74

4.1.3 Toxizitätsanalysen in den mit Azaserin behandelten humanen

Dickdarmepithelzelllinien............................................................................. 76

4.1.4 Analyse der DNA-Addukte in den Azaserin behandelten HCEC WT und

HCEC MGMT --Zellen ................................................................................. 80

4.1.5 Schlussbemerkung zur Reparatur des O6-CMG-Adduktes in HCEC-Zellen

und Ausblick ................................................................................................. 82

4.2 Auswirkungen von NO-Häm auf HCEC-Zellen ..................................... 83

Inhaltsverzeichnis

4.2.1 NO-Häm-Synthese und -Verifizierung ......................................................... 84

4.2.2 NO-Häm-Quantifizierung ............................................................................. 87

4.2.3 Stabilität von NO-Häm ................................................................................. 89

4.2.4 Auswirkung der NO-Häm-Behandlung auf die HCEC-Zellen ..................... 90

4.2.4.1 Einmalige NO-Häm-Behandlung ........................................................ 90

4.2.4.2 Zyklische NO-Häm-Behandlung ........................................................ 94

4.2.5 BALB/c-3T3-Zelltransformationsassay ....................................................... 96

4.2.6 Schlussbemerkung zur Rolle von NO-Häm im Prozess der

Dickdarmkrebsentstehung und Ausblick ...................................................... 97

4.3 Schlussbetrachtung .................................................................................. 99

5 Literaturverzeichnis.............................................................................................. 102

6 Anhang ................................................................................................................. 116

7 Abbildungs-, Formel- und Tabellenverzeichnis ................................................... 120

7.1 Abbildungsverzeichnis ........................................................................... 120

7.2 Tabellenverzeichnis ............................................................................... 122

7.3 Formelverzeichnis .................................................................................. 122

8 Zusammenfassung ................................................................................................ 123

9 Summary .............................................................................................................. 126

10 Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................... 129

11 Danksagung .......................................................................................................... 130

Abkürzungsverzeichnis


°C Grad Celsius

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

µM Mikromolar

µm Mikrometer

3-NT 3-Nitrotyrosin

ACF Engl.: Aberrant Crypt Foci

ACN Acetonitril

ACTB β-Actin

ANOVA Varianzanalyse (Engl.: analysis of variance)

APC Adenomatous-polyposis-coli

ATCC Engl.: American Type Culture Collection

B[a]P Benzo[a] pyren

BER Engl.: Base excision repair

BIO Engl.: 6-Bromoindirubin-3-oxime

BSA Bovines Serumalbumin

CCS Engl.: Cosmic Calf Serum

CDK4 Engl.: Cyclin-dependent kinase 4

CO2 Kohlenstoffdioxid

CRC Kolorektales Karzinom

CYP Cytochrom P450

d.h. Das heißt

dH2O Destilliertes Wasser

ddH2O Doppelt destilliertes Wasser-MilliQ

DMEM Engl.: Dulbecco´s Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DTT Dithiothreitol

ECL Engl.: Enhanced Chemiluminescence

EDTA (Na2) Ethylendiamintretaacetat

EGF Engl.: Epidermal Growth Factor

EMT Epithelial-mesenchymale Transition

EtOH Ethanol

FAP Familiäre adenomatöse Polyposis

FaPy Formamido-pyrimidine

FBS Fötales bovines Serum

FTIR Fourier-Transform-Infrarotspektrometer

g Gramm

GILA Engl.: Growth in low attachment

GIT Gastrointestinaltrakt

GSNO S-Nitrosoglutathion

HCA Engl.: Heterocyclic aromatic amines

HCD Engl.: Higher Energy Collisional Dissociation

HCEC (WT) Engl.: Human Colon Epithelial Cells

HCEC MGMT - Engl.: Human Colon Epithelial Cells MGMT-defizient

HCEC RPA-A1309 HCEC-Zellen mit p53-, KRAS- und APC-Mutationen


HO-1 Hämoxygenase 1

HRMS/PRM Engl.: High-Resolution Mass Spectrometry and parallel Re-

action Monitoring

HRP Engl.: Horseradish Peroxidase

hTERT Engl.: Human Telomerase reverse transcriptase

IARC Engl.: International Agency for Research on Cancer

IQ Engl.: 2-Amino-3-methylimidazo[4,5-f]quinoline

KCl Kaliumchlorid

L-Glut. L-Glutamin

M Molar

M199 Medium 199

MDF Engl.: Mucin depleted foci

MEME Engl.: Minimal Essential Medium Eagle

MET Mesenchymal–epithelial transition

MGMT O6-Methylguanin Methyltransferase

Min. Minute

ml Milliliter

mM Millimolar

MMR Engl.: Mismatch repair

MSI Engl.: Microsatellite instability

MW Mittelwert

N2 Stickstoff

NaCl Natriumchlorid

NaNO2 Natriumnitrit

NaOH Natriumhydroxid

NER Engl.: Nucleotide excision repair

Neu5Ac N-Acetylneuraminsäure

Neu5Gc N-Glycolylneuraminsäure

nl Nanoliter

nm Nanometer

NMR Engl.: Nuclear Magnetic Resonance

NO Engl.: Nitric Oxide

NOA Engl.: Nitric Oxide Analyzer

NOC Engl.: Nitroso compound

NOS Engl.: Nitric Oxide Synthase

O4-MeT O4-Methylthymin

O6-CMG O6-Carboxymethylguanin

O6-EG O6-Ethylguanin

O6-MeG O6-Methylguanin

P/S Penicillin/Streptomycin

PAH Engl.: Polycyclic aromatic hydrocarbons

Rb Retinoblastom-Protein

PBS Engl.: Phosphate buffered saline

PCR Engl.: Polymerase chain reaction

pH Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-

konzentration

PI Propidiumiodid

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

RAS Engl.: Rat sarcoma

RCF Engl.: Relative centrifugal force


RIPA-Puffer Engl.: Radioimmunoprecipitation assay buffer

RISC Engl.: RNA-induced silencing complex

SD Engl.: Standard deviation

SDS Engl.: Sodium dodecyl sulfate

Sek. Sekunde

SHE Engl.: Syrian hamster embryo cells

shRNA Engl.: Small Hairpin RNA

SM-Actin Engl.: Smooth Muscle Actin

SNAP S-Nitroso-N-acetylpenicillamin

Std. Stunde

T/E Trypsin/EDTA-Lösung

TEMED Tetramethylethylendiamin

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

u.a. Unter anderem

u.U. Unter Umständen

V Volt

WT Wildtyp

Einleitung

1

1 Einleitung

Das kolorektale Karzinom (CRC) zählt zu den zweithäufigsten malignen Erkrankungen

weltweit. In Deutschland erkranken jährlich bis zu 60.000 Menschen und rund ein Drittel

verstirbt an den Folgen dieser Krankheit [3]. Diese hohe Mortalität verdeutlicht, welche

Rolle diese Erkrankung im Gesundheitswesen spielt und erklärt die intensive Forschung

in diesem Bereich. Über die schrittweise Entstehung des CRCs vom Adenom bis zum

Karzinom und die Rolle bestimmter Genmutationen in der malignen Transformation der

Kolonepithelzellen ist einiges bekannt, die genauen Ursachen jedoch sind noch nicht voll-

ständig geklärt. Es gibt einige bekannte Risikofaktoren, die die Entstehung von CRC för-

dern. Doch im Fall des Dickdarms ist sicherlich die Nahrung einer der wichtigsten Risi-

kofaktoren, die es zu beachten gilt. Schon früh konnte gezeigt werden, dass der Konsum

von Fleisch mit der Entstehung von CRC korreliert. Dabei fokussierte man sich lange u.a.

auf die Art und Weise der Zubereitung des Fleisches, bei der Verbindungen wie hetero-

zyklische aromatische Amine (HCA) und polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe

entstehen (PAH). In beiden Fällen wurde ein mutagenes Potenzial nachgewiesen [4-7].

Jedoch zeigte sich, dass weißes Fleisch, welches große Mengen von HCAs enthält, nicht

mit der Entstehung des CRCs korreliert [8]. Seither wird postuliert, dass ausschließlich

der Konsum von rotem Fleisch zu einer CRC-fördernden Wirkung führt. In diesem Zu-

sammenhang zeigten viele der in den letzten Jahren durchgeführten epidemiologischen

Studien, dass die CRC-Inzidenzrate direkt mit dem Konsum von rotem Fleisch korreliert.

Westliche Industrienationen mit hohem Fleischkonsum zeigen gleichzeitig hohe CRC-

Inzidenzraten (Globocan 2012). Ende 2015 wurde verarbeitetes rotes Fleisch dann offi-

ziell durch die „International Agency for Research on Cancer“ (IARC) als kanzerogen

eingestuft [9]. Unverarbeitetes rotes Fleisch wurde aufgrund der derzeit vorhandenen Da-

ten vorerst als vermutlich kanzerogen eingestuft, jedoch scheint auch hier eine direkte

Verbindung zum Kolonkrebs zu bestehen. Damit ist aktuell zwar bekannt, dass der Ver-

zehr von rotem Fleisch zur Induktion von CRC führt, welche Komponenten im roten

Fleisch jedoch dafür verantwortlich sind, ist bisher nicht eindeutig geklärt worden.

Es gibt bereits einige Studien, die darauf hinweisen, dass sogenannte endogen gebildete

Nitrosoverbindungen (NOC) eine wichtige Rolle dabei spielen könnten. Diese werden

vorwiegend nach dem Verzehr von rotem Fleisch im Gastrointestinaltrakt gebildet und

Einleitung

2

konnten in humanen Fäzesproben nachgewiesen werden. NOCs sind alkylierende Agen-

zien, die zu DNA-Läsionen in den Darmepithelzellen führen können. In den meisten Fäl-

len werden diese durch effiziente Reparaturmechanismen entfernt. Jedoch können bei-

spielsweise genetische Polymorphismen oder ein durch Genmutationen induzierter Ver-

lust von DNA-Reparaturenzymen dazu führen, dass einige DNA-Läsionen nicht repariert

werden. Ist dies der Fall, können DNA-Schädigungen zu Genmutationen führen. Oftmals

sind davon Gene betroffen, die eine wichtige Rolle während der Dickdarmkrebsentste-

hung spielen können. So ist bekannt, dass vermehrt TP53, APC und KRAS davon betrof-

fen sind.

Es gibt eine Reihe von verschiedenen DNA-Läsionen, die durch NOCs induziert werden

können. Das Auftreten und die Persistenz dieser Läsionen in der DNA können zudem

stark variieren. Selten kommt es hier zur Alkylierung an der O6-Position des Guanins,

jedoch weisen diese DNA-Läsionen ein stark mutagenes Potenzial auf und spielen daher

eine sehr wichtige Rolle in der Entstehung des kolorektalen Karzinoms. Zu diesen Läsi-

onen gehört O6-Carboxymethylguanin (O6-CMG). Wie auch bei anderen DNA-Läsionen,

konnte hier ebenfalls nachgewiesen werden, dass sie zu Punktmutationen im TP53-Gen

führt [1]. Sehr lange Zeit wurde davon ausgegangen, dass es keinen spezifischen Repara-

turmechanismus für die O6-CMG-Läsion gibt. Normalerweise ist die O6-Methylguanin

Methyltransferse (MGMT) für die Reparatur von Läsionen an der O6-Position des Gua-

nins zuständig, jedoch konnte dies im Falle von O6-CMG bis heute nicht eindeutig nach-

gewiesen werden. In einem zellfreien System wurde 2013 von Senthong et al. [10] jedoch

gezeigt, dass O6-CMG sehr wohl ein Substrat für die MGMT ist und dementsprechend,

wie alle anderen Addukte an dieser Position, repariert wird.

1.1 Ziel der Arbeit

Bisher ist nur bekannt, dass der Verzehr von rotem Fleisch eine CRC-fördernde Wirkung

aufweist. Welche Verbindungen im roten Fleisch dafür verantwortlich sind, ist jedoch bis

heute nicht aufgeklärt worden. Es gibt einige Hinweise, dass Häm aus dem sauerstoff-

transportierenden Muskelprotein Myoglobin eine der Komponenten aus rotem Fleisch

sein könnte, die bei der CRC-Entstehung eine wichtige Rolle spielen. Häm wird leicht

nitrosiert und fungiert somit innerhalb des Gastrointestinaltraktes (GIT) als nitrosierendes

Einleitung

3

Agens. Dies wiederum führt zur Bildung von den bereits beschriebenen NOCs, die ver-

schiedene mutagene DNA-Läsionen induzieren können.

I. Daher wurden in dieser Arbeit die Auswirkungen von nitrosiertem Häm (NO-

Häm) auf humane Dickdarmepithelzellen (HCEC) untersucht. Dabei wurde ge-

testet, ob eine einmalige oder zyklische Behandlung der Zellen mit NO-Häm zu

einer malignen Zelltransformation führt.

Unabhängig von der Rolle des NO-Häms in der endogenen Bildung von NOCs, ist bereits

bekannt, dass NOCs mutagene DNA-Läsionen wie O6-CMG induzieren. Bis heute ist je-

doch nicht geklärt inwieweit eukaryotische Zellen in der Lage sind O6-CMG-Addukte zu

reparieren.

II. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob O6-CMG ein Substrat für die MGMT

humaner Dickdarmepithelzellen darstellt. Dafür wurden HCEC-Zellen mit einer

erhöhten MGMT-Expression mit MGMT-defizienten HCEC-Zellen bezüglich ih-

rer O6-CMG-Reparaturkapazität verglichen.

Einleitung

4

1.2 Literaturübersicht

1.2.1 Das kolorektale Karzinom

1.2.1.1 Epidemiologie

Das kolorektale Karzinom (CRC) gehört zu den häufigsten Krebsleiden in den westlichen

Industrienationen. In Deutschland ist das CRC, nach dem Prostatakarzinom beim Mann

bzw. dem Mammakarzinom bei der Frau, die zweithäufigste Krebserkrankung, weltweit

ist es das dritthäufigste Krebsleiden. In Deutschland werden jährlich etwa 60.000 Neuer-

krankungen dokumentiert [3]. Global betrachtet sind die Inzidenzraten sehr unterschied-

lich. Länder mit einer westlichen Ernährungsweise wie Australien, Nordamerika und Eu-

ropa zeigen deutlich höhere Inzidenzen als z.B. Länder im asiatischen oder afrikanischen

Raum.

Abgesehen von der hereditären Form von CRC, die sich wesentlich früher manifestiert

[11], entstehen 90% des kolorektalen Karzinoms nach dem 50. Lebensjahr, wobei Frauen

durchschnittlich später als Männer erkranken. Dazu kommt, dass Männer häufiger vom

Kolonkarzinom betroffen sind als Frauen. Der vom Robert Koch Institut veröffentlichte

Bericht zum Krebsgeschehen in Deutschland 2016 prognostizierte jedoch bereits, dass

„bei Fortsetzung der aktuellen Entwicklung bis 2020 mit einem weiteren Rückgang der

absoluten Zahl an Neuerkrankungen, vor allem bei Frauen, zu rechnen“ sei [3].

1.2.1.2 Mehrstufenmodell der Kanzerogenese

Das von dem amerikanischen Arzt Bert Vogelstein und seinem Kollegen Eric Fearon

publizierte Konzept der Adenom-Karzinom-Sequenz besagt, dass kolorektale Karzinome

in den meisten Fällen aus der gutartigen Vorstufe der Adenome entstehen [12]. Dabei

liegt eine gestörte Regulation von wichtigen Prozessen wie Zellwachstum, Differenzie-

rung und dem kontrollierten Zelltod vor. Dies wird hervorgerufen durch Veränderungen

mehrerer Gene, die meist aus der Gruppe der Proto-Onkogene und Tumorsuppressorgene

stammen [13, 14]. Proto-Onkogene, wie beispielsweise KRAS, dienen der Regulation des

Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Liegt eine Mutation in einem dieser Proto-

Onkogen vor, werden diese als Onkogen bezeichnet, da sie eine tumorfördernde Wirkung

haben [15]. Tumorsuppressorgene hingegen, wie z.B. TP53 oder APC, dienen der Ex-

pression von Proteinen, die den Zellzyklus kontrollieren und unter Umständen die

Einleitung

5

Apoptose einleiten [15]. Dabei soll nach dem Konzept von Fearon und Vogelstein eine

bestimmte Mutationsreihenfolge vorliegen (Abbildung 1-1).

Abbildung 1-1: Adenom-Karzinom-Sequenz nach Fearon und Vogelstein [14, 16].

Als initialer Schritt wird die Bildung des gutartigen Adenoms beschrieben, der durch eine Mutation im

Tumorsuppressorgen APC hervorgerufen werden soll. Große Adenome und auch Karzinome sollen jedoch

erst nach der Induktion von Mutationen in den Genen TP53 und KRAS entstehen. Eine „microsatellite in-

stability“ (MSI) soll durch eine Defizienz im „mismatch repair“ (MMR) verursacht werden und beeinflusst

die genomische Stabilität; CIN: „chromosomal instability“, Abbildung modifiziert nach [16].

Eine Mutation im Tumorsuppressorgen APC soll in einem ersten Schritt zur Bildung des

gutartigen Adenoms führen. Zur Bildung von größeren Adenomen und Karzinomen

braucht es u. a. Mutationen in den Genen KRAS und TP53. Liegt eine Mutation im „mis-

match repair“ (MMR)-Gen vor, führt es dazu, dass während der Replikation entstandene

Basenfehlpaarungen nicht repariert werden können [17]. Die dadurch hervorgerufene

Mikrosatelliteninstabilität (MSI) führt zu einer Akkumulation diverser Mutationen,

wodurch ein maligner Phänotyp entwickelt wird [18, 19]. Zur Entstehung eines kolorek-

talen Karzinoms müssen also Mutationen von „caretaker“-Genen, die die genomische

Stabilität aufrechterhalten, aber auch von „gatekeeper“-Genen, die die Proliferation und

den Zelltod kontrollieren, vorliegen [17].

1.2.1.3 Ätiologie des kolorektalen Karzinoms

Bezüglich der Ätiologie des sporadisch kolorektalen Karzinoms, das ca. 80 % aller kolo-

rektalen Karzinome ausmacht, gibt es viele Faktoren, die die Entstehung beeinflussen

oder gar begünstigen können. Neben den Faktoren, die generell das Risiko für Krebs er-

höhen, ist das Alter wohl einer der wichtigsten Risikofaktoren [3, 20]. Entzündliche Dar-

merkrankungen, wie Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, erhöhen ebenfalls die Wahr-

scheinlichkeit [21], wobei Patienten mit Morbus Crohn im Vergleich zur Gesamtbevöl-

GesundeDarmmukosa

Dysplasie /ACF

Frühes Adenom

Intermediäres Adenom

Spätes Adenom

Karzinom Metastasen

APCKRASBRAF

SMAD4CDC4 TP53

Genomische Instabilität (CIN, MSI)

Einleitung

6

kerung nur einem eher leicht erhöhtem Risiko ausgesetzt sind [22]. Darüber hinaus erhö-

hen auch diverse andere Vorerkrankungen und genetische Syndrome, wie die familiäre

adenomatöse Polyposis (FAP), die Wahrscheinlichkeit, an CRC zu erkranken.

Neben diesen genetischen und auch alters-bzw. krankheitsbedingten Risikofaktoren spie-

len auch exogene Faktoren eine immer wichtigere Rolle. Abgesehen vom Rauchen und

dem übermäßigen Alkoholkonsum, zählen auch Übergewicht, Bewegungsmangel und

eine Fehlernährung zu wichtigen Risikofaktoren. Beispielsweise wird Nahrungsfett als

tumorpromovierender1 Faktor angesehen. Dabei führte eine Steigerung des Fettanteils

von 5 % auf 20 % bei einer Fütterungsstudie zu einer 4-bis 5-fach erhöhten Tumorinzi-

denz und -ausbeute in Ratten [23, 24]. Weiterhin zählt eine ballaststoffarme und kalorien-

reiche Nahrung ebenfalls zu den promovierenden Ernährungsfaktoren bei der Entstehung

des kolorektalen Karzinoms [25]. Aufgrund einer Stellungnahme der „International

Agency for Research on Cancer“ (IARC) Ende 2015 wird jedoch aktuell vermutlich am

meisten über den Verzehr von rotem Fleisch als Risikofaktor für Kolonkrebs debattiert.

Nach Aussage der IARC wurde verarbeitetes rotes Fleisch als kanzerogen und rotes

Fleisch als vermutlich kanzerogen für den Menschen eingestuft [9]. Bei der Zubereitung

von Fleisch können zudem HCAs und PAHs entstehen, denen ebenfalls kanzerogene Ei-

genschaften zugeschrieben werden [26-29]. Insgesamt sind viele verschiedene endogene

und exogene Risikofaktoren beschrieben worden, wobei jedoch eher das Zusammenwir-

ken aller Faktoren als tumorpromovierend angesehen werden sollte.

1.2.2 Risikofaktor rotes Fleisch

Im Oktober 2015 haben 22 Wissenschaftler aus zehn verschiedenen Ländern das Risiko,

das von verarbeitetem und unverarbeitetem roten Fleisch ausgeht, evaluiert [9]. Als rotes

Fleisch wird beispielsweise Schweine- und Rindfleisch definiert, das hauptsächlich ge-

kocht oder gebraten konsumiert wird. Verarbeitetes rotes Fleisch stammt von denselben

Tieren, jedoch wird dies im Zuge der Zubereitung und Verlängerung der Haltbarkeit ge-

pökelt, fermentiert oder geräuchert. Für die Risikoeinschätzung wurden mehrere hoch-

1 Tumorpromotor: Verstärkung und Beschleunigung der Tumorentwicklung

Einleitung

7

qualitative Kohortenstudien herangezogen [9]. Dabei zeigten über die Hälfte der haupt-

sächlich in Europa und Australien durchgeführten Studien eine Korrelation zwischen dem

Konsum von rotem Fleisch und CRC [30-32].

Weitaus eindeutiger zeigten 12

von 18 in Europa, den USA und

Japan durchgeführten Kohorten-

studien, dass der Verzehr von ver-

arbeitetem rotem Fleisch direkt

mit der Inzidenz von CRC korre-

liert [30-34]. Ausgehend davon

besteht bereits bei dem Verzehr

von 100 g rotem Fleisch pro Tag

ein 17 % erhöhtes Risiko und bei

50 g verarbeitetem roten Fleisch

pro Tag ein 18 % erhöhtes Risiko

an CRC zu erkranken [35]. Auf-

grund dieser Ergebnisse wurde der

Konsum von verarbeitetem roten

Fleisch als kanzerogen für den

Menschen eingestuft (Kategorie

1). Da es bisher nur begrenzt Hinweise auf eine kanzerogene Wirkung von unverarbeite-

tem roten Fleisch auf den Menschen gibt, wurde rotes Fleisch vorerst als vermutlich kan-

zerogen für den Menschen eingestuft (Kategorie 2A) (Abbildung 1-2) [9].

1.2.3 Komponenten des roten Fleisches und das davon ausgehende Risiko

Nachdem bestätigt wurde, dass der Verzehr von rotem Fleisch eine Rolle in der Entste-

hung von CRC spielt, sind viele Arbeitsgruppen an der Identifizierung der dafür verant-

wortlichen Komponenten im Fleisch beteiligt. Es gibt einige Bestandteile des Fleisches,

denen ein kanzerogenes Potenzial zugesprochen wird [36].

Abbildung 1-2: Kanzerogenitäts-Klassifizierung von rotem

und verarbeitetem rotem Fleisch seitens der IARC.

Abbildung: Cancer Research UK

Einleitung

8

Fette

Einige epidemiologische Studien sowie Fütterungsstudien an Nagern weisen darauf hin,

dass eine fettreiche Nahrung CRC-promovierend wirkt. Pence et al. [37] haben gezeigt,

dass unabhängig von der Fettquelle eine 20 %-ige-Fettdiät die Anzahl der Adenome im

Rattenkolon signifikant erhöht. Reddy et al. [38] haben festgestellt, dass Protein und Fett

aus Fleisch die Inzidenz an kolorektalen Tumoren in F344-Ratten erhöht. Im Gegensatz

dazu zeigen neuere Studien, dass eine fettreiche Diät die CRC-Inzidenz nicht erhöht [39-

41]. Alexander et al. [42] berichteten in einer Metanalyse, dass tierisches Fett nicht CRC-

promovierend wirkt. Lange wurde Fett als einer der wichtigsten Risikofaktoren bei der

Kolonkrebsentstehung angesehen, aber die bereits genannten Studien und auch einige an-

dere konnten bisher nicht eindeutig nachweisen, dass es eine Verbindung zwischen Fett

und CRC gibt [36].

HCAs und PAHs

Während der Zubereitung des Fleisches können HCAs und PAHs entstehen. HCAs wer-

den bei der pyrolytischen Zersetzung von Aminosäuren und Proteinen gebildet [43], wo-

hingegen PAHs durch die unvollständige Verbrennung von organischen Materialien, wie

beispielsweise Kohle und Holz, entstehen und sich daher nach der Zubereitung auf bzw.

im dem Fleisch befinden. Sowohl HCAs als auch PAHs werden mutagene Wirkungen

zugeschrieben. Eine Fütterungsstudie mit Ratten zeigte, dass Fleisch mit einem hohen

HCA-Anteil vermehrt zu Kolon- und Magenkrebs der Tiere führt [44]. PAHs, wie bei-

spielsweise Benzo[a]pyren (B[a]P), induzierten “Aberrant crypt foci” (ACF) im Kolon

von Mäusen und DNA-Addukte in der menschlichen Darmschleimhaut [4, 5]. Doch trotz

der nachgewiesenen Wirkung an HCAs, ist es eher unwahrscheinlich, dass diese haupt-

verantwortlich für die Entstehung von CRC sind. Helles Fleisch, wie z.B. Hähnchen, ent-

hält große Mengen von HCAs, doch epidemiologische Studien zeigten keine Korrelation

zwischen der HCA-Menge im Fleisch und der CRC-Inzidenz [45-47]. Bezüglich der

PAHs berichteten einige Studien von einer Korrelation zwischen der PAH-Aufnahme und

dem CRC-Risiko [6, 7, 48, 49], jedoch sind die bisherigen Daten nicht ausreichend für

eine abschließende Risikobewertung. Zusammenfassend muss festgestellt werden, dass

bis heute ein kausaler Zusammenhang zwischen der Aufnahme von HCAs und PAHs mit

rotem Fleisch und der Entstehung von CRC nicht nachgewiesen werden konnte.

Proteine

Einleitung

9

Eine proteinreiche Nahrung wird ebenfalls als CRC-Risikofaktor angesehen. Eine Diät

reich an Protein aus Fleisch oder Sojabohnen führte in beiden Fällen zu einer erhöhten

CRC-Inzidenz in F344-Ratten [38]. Dagegen haben Belobrajdic et al. [50] in einer Fütte-

rungsstudie mit Ratten bei verschiedenen Proteinkonzentrationen im Futter keinen Un-

terschied in der Anzahl der gebildeten ACFs in der Darmschleimhaut beobachtet. Auch

Alexander et al. [42] haben gezeigt, dass weder tierisches Protein noch Fett mit der Ent-

stehung des CRCs korrelieren. Dementsprechend ist ebenfalls zwischen der Protein-

menge in der Diät und der Entstehung des CRCs bisher keine eindeutige Korrelation

nachweisbar.

Salze

Bei der Zubereitung von rotem Fleisch wird oftmals auch Salz verwendet, um den Ge-

schmack zu verbessern und/oder die Haltbarkeit zu verlängern. Auch Salz wird als ein

Risikofaktor für CRC gehandelt. Jedoch konnte bisher keine eindeutige Verbindung zwi-

schen der Salzaufnahme und CRC nachgewiesen werden. Vielmehr wurde gezeigt, dass

eine NaCl-reiche Diät in Ratten zu einer Reduktion der ACF-Anzahl führte, was jedoch

vermutlich auf die erhöhte Wasseraufnahme der Tiere zurückgeführt wird [51, 52].

Myoglobin und Häm

Der wohl offensichtlichste Unterschied zwischen weißem und rotem Fleisch ist die Farbe.

Die Farbe wird durch die unterschiedlichen Muskelfasern des Fleisches bestimmt. Ab-

hängig von der Kontraktionsart haben Tiere unterschiedliche Muskelfasern. Hühner ha-

ben meist „fast twitch“-Fasern (Typ II), wohingegen Rinder und Schweine „slow twitch“-

Fasern (Typ I) aufweisen. Beide Fasertypen unterscheiden sich in der Art der Energiege-

winnung. Slow twitch-Fasern gewinnen ihre Energie durch aerobe Glykolyse, das heißt

sie benötigen Sauerstoff, der vom Myoglobin stammt. Fast twitch-Fasern hingegen ge-

winnen Energie aus der anaeroben Glykolyse. Daher enthalten diese Muskelfasern weni-

ger sauerstofftransportierendes Myoglobin [53]. Das Muskelprotein Myoglobin besitzt

als prosthetische Gruppe ein Häm. Das Häm selbst setzt sich aus dem Protoporphyrin IX

und einem Eisen-Atom zusammen [15]. Aufgrund von mehreren In vitro- und In vivo-

Studien wird aktuell angenommen, dass das Myoglobin und/oder dessen Häm eine wich-

tige Rolle während der Dickdarmkrebsentstehung spielen könnte(n). In einer Studie von

Sesink et al. [54] wurde in einer Fütterungsstudie an Ratten gezeigt, dass Hämin, ein mit

Chlorid stabilisiertes Häm, die Proliferationsrate der Darmepithelzellen fördert. Zudem

Einleitung

10

wurde beobachtet, dass Hämin sowie Hämoglobin, das sauerstofftransportierende Protein

mit vier Häm-Gruppen, zu einem konzentrationsabhängigen Wachstum von ACFs in

F344-Ratten führten [55]. In einer weiteren Fütterungsstudie wurde untersucht, welche

Auswirkungen vollfertiges gefriergetrocknetes Fleisch im Futter der Tiere auf die Bil-

dung von ACFs und „mucin depleted foci“ (MDF) hatte: Die MDF-Induktion hing von

der Konzentration des Fleisches in der Diät ab [56]. In vitro führten Hämin und Hämo-

globin ebenfalls zu Zyto- und Genotoxizität in der Dickdarmepithelzelllinie HT29 sowie

in primären humanen Kolonozyten [57]. Auffällig jedoch ist die Tatsache, dass in allen

Studien die Effekte sowohl durch Myoglobin als auch durch Häm selbst hervorgerufen

wurden. Daher kann angenommen werden, dass nicht die Globinuntereinheiten, sondern

vorwiegend das Häm eine entscheidende Rolle spielt. Diese Annahme lässt sich damit

begründen, dass während der Zubereitung (Erhitzung) des Fleisches, aber spätestens

durch den sauren pH im Magen und die proteolytische Enzymaktivität im Dünndarm, die

Globinkomponente denaturiert und Häm freigesetzt wird [58-60].

Über die Rolle des Häms in der CRC-Entstehung wurden bereits verschiedene Arbeiten

veröffentlicht. Sawa et al. [61] konnte zeigen, dass die Fütterung einer fettreichen und

Häm-haltigen Diät zu einer signifikant erhöhten CRC-Inzidenz führte. Eine Lipidperoxi-

dation führte demnach zu reaktiven Fettsäure-Radikalen, die die Zellen der Darmschleim-

haut schädigen. Die dadurch hervorgerufene erhöhte Proliferationsrate soll die CRC-In-

zidenz erhöhen. Andere Arbeiten deuten darauf hin, dass das Häm während der Verdau-

ung zu einer zytotoxischen und CRC-induzierenden Verbindung metabolisiert wird [54].

Ein weiterer Erklärungsansatz beschreibt die durch Häm induzierte N-Nitrosierung im

Gastrointestinaltrakt (GIT), die zur Aktivierung von HCAs wie 2-Amino-3-methyli-

midazo [4,5-f] chinolin (IQ) führen soll, wobei das mutagene 2-Nitrosoamin-3-methyli-

midazo [4,5-f] chinolin entsteht [62-64].

1.2.4 Häm-induzierte Nitrosoverbindungen

All diese zuvor beschriebenen Erklärungsansätze zur Entstehung des kolorektalen Karzi-

noms sind nachvollziehbar, jedoch wird zunehmend über weitere Verbindungen, die in

Anwesenheit von Häm entstehen können, diskutiert. Bingham et al. [65] publizierte in

ihrer Arbeit von 1996 Ergebnisse, die eindeutig zeigten, dass der Verzehr von rotem

Fleisch zur Bildung von sogenannten Nitrosoverbindungen (Engl.: Nitroso compounds-

Einleitung

11

NOC) führte. Generell sollen 45-75 % der im Körper vorliegenden NOCs endogen gebil-

det werden [66]. Cross et al. [67] zeigte zudem, dass ausschließlich Häm, und nicht Pro-

tein oder die Eisengruppe des Häms, zur Bildung von NOCs führt. Es ist bekannt, dass

Häm sehr leicht nitrosiert wird (NO-Akzeptor) und daraufhin als nitrosierendes Agens im

GIT agieren kann [68-70]. Wissenschaftler gehen mittlerweile davon aus, dass NO-Häm

eines der wichtigsten nitrosierenden Agenzien im Verdauungstrakt darstellt [71].

In welchem Ausmaß Häm als NO-Akzeptor und daraufhin als Donor fungieren kann,

hängt auch von der endogenen NO-Produktion ab. Es gibt innerhalb des GITs einige NO-

Quellen. Dazu gehört unter anderem die nahrungsbedingte Aufnahme von Nitrit und Nit-

rat. Beides ist beispielsweise ausreichend in Gemüse vorhanden. Außerdem werden Nitrit

und Nitrat auch bei der Verarbeitung von Fleisch (beim Pökeln) verwendet. Nitrat wird

im oberen Teil des GITs schnell resorbiert und gelangt somit in den Blutkreislauf. Von

dort aus erreicht es die Speicheldrüsen und wird vom Blut in den Speichel abgegeben [72,

73]. Bakterien in der Mundhöhle reduzieren das Nitrat zu Nitrit [74]. Nitrit gelangt da-

raufhin erneut in den Magen und wird dort unter sauren Bedingungen protoniert. Die da-

bei entstandene salpetrige Säure wiederum zerfällt zu NO und anderen Nitrosospezies

(siehe Reaktionsgleichungen) [75].

NO2-+ H+

HNO2

3HNO2 H2O + 2NO + NO3-

2HNO2 H2O + N2O3

N2O3 NO + NO2

Die bakterielle Denitrifikation im Kolon stellt ebenfalls eine wichtige NO-Quelle dar.

Dabei nutzen Bakterien Nitrat und Nitrit für ihre Energiegewinnung. Die Nitratreduktase

stellt aus Nitrat zuerst Nitrit her, woraufhin aus Nitrit NO hergestellt wird. Zudem kann

auch die NO-Synthase (NOS) Stickstoffmonoxid (NO) generieren. Dabei wird L-Arginin

zu L-Citrullin und NO umgesetzt. Die NOS-Aktivität im Darmepithel ist beispielsweise

bei Patienten mit Colitis ulcerosa stark erhöht und stellt deshalb eine zusätzliche NO-

Quelle dar [76]. Das aus diversen NO-Quellen stammende NO bindet schnell und mit

hoher Affinität an Ferro-Häm (Fe2+) und führt zur Bildung des bereits beschriebenen nit-

rosierenden NO-Häms (Häm2+-NO) [77-79] (Abbildung 1-3). Eine Bindung von NO an

Einleitung

12

Ferri-Häm (Fe3+) ist ebenfalls möglich, jedoch findet diese Reaktion wesentlich langsa-

mer statt und führt zur Bildung von Nitrosyl-Addukten wie Häm2+-NO+ und Häm3+-NO

[79-82].

Abbildung 1-3: Darstellung der 3D-Struktur von NO-Hämoglobin mit den vier Häm-Komponenten.

NO kann an Ferri (Fe3+)- und Ferro (Fe2+)-Häm binden, was zu unterschiedlichen räumlichen Anordnungen

des NOs am Eisen des Häms führt (Lila= Eisenatom; Rot+ Blau= NO; Grün= proximales Histidin), Abbil-

dung modifiziert nach [83].

Im GIT sind ausreichend Aminosäuren, Amine und Amide vorhanden, die durch NO-

Häm nitrosiert werden und zur Bildung von NOCs führen können. In mehreren Fütte-

rungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung von Häm im Futter und Nit-

rat im Trinkwasser bei Ratten mit einer normalen Darmflora zu einer signifikant erhöhten

NOC-Bildung führte [84-86]. Bei keimfreien Tieren hingegen wurde bei Verabreichung

von Nitrat und Häm keine vermehrte NOC-Bildung beobachtet [87]. Das verdeutlicht,

dass Bakterien, die Nitrat und Nitrit für ihre Energiegewinnung benötigen und dabei diese

in NO umwandeln, wesentlich zur Entstehung von NO-Häm und NOCs beitragen [88].

In vivo-Studien an Nagern zeigten, dass vermutlich die hauptsächlich durch NO-Häm ge-

bildeten NOCs zu kolorektalen Tumoren führen [89, 90]. Die Tatsache, dass rotes verar-

beitetes Fleisch eher zu CRC führt als rotes unverarbeitetes Fleisch, ließe sich somit

dadurch erklären, dass verarbeitetes Fleisch durch Pökeln und andere Prozesse mehr Nit-

rat und Nitrit enthält, wodurch bereits, unabhängig von der Verdauung, NO-Häm und

NOCs entstehen. Diese werden daraufhin zu den nach dem Verzehr endogen gebildeten

NOCs hinzukommen, was die Kanzerogenität von verarbeitetem roten Fleisch erhöhen

NO-Hämoglobin

HämII-NO

HämIII-NO

Einleitung

13

könnte. Die wichtige Rolle von NO-Häm in der Entstehung von CRC wird dadurch ver-

deutlicht, dass zum einen weißes Fleisch mit wenig Myoglobin und dadurch wenig Häm

zur Bildung von nur sehr geringen NOC-Mengen führt und dass zum anderen der Konsum

von weißem Fleisch nicht mit der CRC-Inzidenzrate korreliert [45-47].

1.2.5 DNA-Alkylierung durch Nitrosoverbindungen

NOCs sind elektrophile Agenzien, die direkt oder nach metabolischer Aktivierung Alkyl-

gruppen (z.B. Methyl- oder Carboxymethylgruppen) an verschiedene nukleophile Stellen

der Nukleinsäuren heften. Die DNA-Basen besitzen viele verschiedene Stellen, die alky-

liert werden können. Diese nukleophilen Angriffspunkte sind in Abbildung 1-6 darge-

stellt. Die stärkste nukleophile Stelle in der DNA ist die N7-Position des Guanins. Ausge-

hend von diesen DNA-Addukten entstehen apurinische/apyrimidinische Stellen (AP-

Stellen) und Formamido-pyrimidine (FaPy) [91, 92]. Beide weisen ein mutagenes und

zytotoxisches Potenzial auf. Falls AP-Stellen nicht repariert werden, kann es zu Mutatio-

nen während der Replikation der DNA kommen. Bei FaPy hingegen kommt es zu einer

Imidazolringöffnung des alkylierten Guanins [93]. Auch diese Läsion wurde als zytoto-

xisch und mutagen beschrieben [94]. Neben der N7-Position des Guanins gibt es an den

anderen Basen ebenfalls Stellen, an denen diese Art von N-Alkylierung stattfinden kann.

Bei der O-Alkylierung der DNA werden die Sauerstoffatome der DNA-Basen alkyliert.

Am häufigsten ist dabei die O6-Position des Guanins betroffen. Die Alkylierung an dieser

Position des Guanins findet insgesamt nicht sehr häufig statt, aber aufgrund der mehrere

Tage anhaltenden Persistenz dieser Addukte und der Tendenz zur schnellen Basenpaa-

rung mit Thymin, sollen diese DNA-Addukte durch ihre Mutagenität und Zytotoxizität

eine wichtige Rolle in der Kanzerogenese spielen [95, 96].

Die wohl relevanteste Gruppe unter den NOCs im Zusammenhang mit der Kolonkanze-

rogenese sind die N-Nitrosamine. Die als prokanzerogen beschriebenen NOCs werden

durch Cytochrom P450-Enzyme (CYP) metabolisch aktiviert und führen dann zur Alky-

lierung der DNA. Die metabolische Aktivierung von N-Nitrosaminen wird hauptsächlich

durch CYP2E1 katalysiert [97]. Wie viele andere CYPs wird CYP2E1 hauptsächlich in

der Leber exprimiert, jedoch auch zu geringeren Anteilen im Kolon [98]. Die durch

CYP2E1 initiierte α-Hydroxylierung der N-Nitrosamine führt zur Bildung von Diazome-

than [97]. Diese Diazoverbindung ist stark nitrosierend, da die spontan entstehenden re-

aktiven Methyl-Carbokationen mit der nukleophilen DNA reagieren und zur Alkylierung

Einleitung

14

führen können [99, 100]. Die O- und N-Alkylierung durch Diazomethan führt zu einer

Reihe von DNA-Addukten [96]. Hauptsächlich werden N3-Methyladenin- und N7-Me-

thylguanin-Addukte gebildet. Mit rund 75 % machen sie den Hauptanteil aller NOC-in-

duzierten DNA-Addukte aus [96]. Ein weitaus geringerer Anteil von DNA-Addukten ent-

steht durch die O-Alkylierung am Guanin und Thymin. Jedoch entstehen dabei mutagene

DNA-Addukte wie O6-Methylguanin (O6-MeG) und O4-Methylthymin (O4-MeT) [96].

Glycin, als eine der strukturell einfachsten Aminosäuren, ist nahrungsbedingt in großen

Mengen im Darm vorhanden. Die Nitrosierung von Glycin führt zur Bildung von Nitro-

soverbindungen wie Diazoacetat [101]. Ähnlich wie Diazomethan ist auch Diazoacetat

ein Alkylierungsagenz. Es zerfällt spontan entweder zu Carboxymethyldiazonium-Ionen

oder Methyldiazonium-Ionen, die jeweils stark elektrophil sind und zur Bildung von O6-

MeG- und O6-CMG-Addukten führen [102, 103]. Neben O6-MeG ist auch O6-CMG eine

promutagene DNA-Läsion [1].

1.2.6 DNA-Reparaturmechanismen

Die O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase (MGMT) ist ein Protein, das zur Repara-

tur von alkylierter DNA beiträgt. Das humane MGMT-Gen ist in der Chromosomenbande

10q26 lokalisiert [104] und besteht aus einem nicht-kodierenden und vier kodierenden

Exons, die für das 24 kDa-schwere Protein MGMT kodieren. Die MGMT ist größtenteils

im Zytoplasma lokalisiert und transloziert nach erfolgter Alkylierung der DNA in den

Zellkern [105]. Die MGMT repariert hauptsächlich DNA-Läsionen an der O6-Position

des Guanins. Um die DNA-Läsionen zu entfernen, bindet die MGMT an der DNA und

gleitet an dieser entlang. Dabei wird jede einzelne Base durch das aktive Zentrum der

MGMT geschleust und auf Veränderungen kontrolliert [106]. Liegt eine Alkylierung an

der O6-Position des Guanins vor, wird diese kovalent auf das Cystein145 der MGMT

übertragen (Abbildung 1-4) [107]. Diese Translokation der Alkylgruppe in das MGMT-

Zentrum führt zur irreversiblen Inaktivierung des Proteins. Es löst sich von der DNA,

wird ubiquitinyliert [108] und im Proteasom abgebaut [107, 109]. Daher wird dieses En-

zym auch als Suizid-Enzym beschrieben, wobei es genau genommen nicht als Enzym

bezeichnet werden kann, da der Alkylgruppen-Transfer auf die MGMT ein irreversibler

Prozess ist. Die Reparatur durch die MGMT ist daher eine Ein-Schritt-Reparatur und ist

die einzige bekannte Form der Ein-Schritt-DNA-Reparatur beim Menschen [106]. Die

DNA-Reparatur durch die MGMT ist eine der effizientesten Reparaturen, da ca. 90 % der

Einleitung

15

Methylierungen an der O6-Position des Guanins innerhalb von 10 Min. nach der Entste-

hung entfernt werden [106].

Abbildung 1-4: DNA-Reparatur von O6-MeG durch die O6-Methylguanin DNA-Methyltransferase,

Abbildung modifiziert nach [110].

Die MGMT wird konstitutiv exprimiert [106, 111]. Dennoch variiert die Expression zwi-

schen verschiedenen Zelltypen und in Abhängigkeit des Malignitätsstatus der Zellen. Im

gesunden Organismus ist die Expression der MGMT in der Leber am höchsten und im

Gehirn und der Lunge am niedrigsten. Unter den tumortragenden Organen ist die Expres-

sion am höchsten in der Leber und den Ovarien und am niedrigsten im Gehirn (Abbildung

1-5) [112]. Eine Behandlung mit DNA-alkylierenden Agenzien führt zum Verbrauch der

MGMT und somit zur Induktion der MGMT-Transkription [111, 113, 114]. Neben der

direkten Ein-Schritt-Reparatur durch die MGMT gibt es auch eine andere Möglichkeit

DNA-Addukte zu entfernen. Durch die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) beispiels-

weise werden wesentlich größere DNA-Addukte, die sogenannten „bulky adducts“, repa-

riert. Dazu gehören vor allem DNA-Addukte, die durch die Einwirkung von UV-Strahlen

oder chemischen Mutagenen wie das Aflatoxin B1 oder B[a]P entstehen können. Die Re-

paratur durch NER erfolgt in mehreren Schritten: Der Schaden wird erkannt, daraufhin

wird der DNA-Strang geschnitten und der Schaden entfernt. Danach werden die entspre-

chenden DNA-Basen eingefügt und es erfolgt die Ligation des DNA-Stranges.

O6- Methylguanin Guanin

MGMT

Cys CysSH SH CH3

Aktive MGMT Inaktive MGMT

Einleitung

16

Abbildung 1-5: Darstellung der MGMT-Aktivität [fmol/mg Gesamtprotein] in verschiedenen gesunden und

tumortragenden Organen. Abbildung übernommen von [112].

Ein weiterer Mechanismus der DNA-Reparatur ist die Basenexzisionsreparatur (BER).

Hauptsächlich werden durch BER „kleine Basenmodifikationen, die durch Oxidierung,

Desaminierung und Alkylierung entstanden sind, sowie apurinische und apyrimidinische

Stellen und DNA-Einzelstrangbrüche“ repariert [106]. Die Vielzahl der Substrate ver-

deutlicht, dass die BER von essentieller Bedeutung für die genomische Stabilität ist. Die

Reparatur durch BER erfolgt ebenfalls in mehreren Schritten: Nach der Schadenserken-

nung durch DNA-Glycosylasen, die die Läsion aus der DNA schneiden, führen AP-En-

donukleasen zu einem Einzelstrangbruch im Zucker-Phosphat-Rückgrat und DNA-Poly-

merasen fügen mithilfe des komplementären Stranges die korrekte Base ein [106, 115].

Bezogen auf die NOC-induzierten DNA-Addukte ist BER hauptsächlich für die Repara-

tur von N-alkylierten DNA-Läsionen zuständig.

In Abbildung 1-6 sind mögliche Angriffsstellen in den vier verschiedenen DNA-Basen

mit den zuständigen Reparatursystemen dargestellt [116]. Neben der DNA-Reparatur

durch MGMT und BER können auch die Proteine ABH2 und ABH3 DNA-Läsionen ent-

fernen [117, 118]. ABH2 und ABH3 sind hauptsächlich für die Reparatur von N-Methyl-

Addukten zuständig, wobei sich beide Proteine nur in ihrer Strangspezifität unterschei-

den. ABH2 repariert bevorzugt DNA-Läsionen in doppelsträngiger DNA, ABH3 hinge-

gen in einzelsträngiger DNA [119, 120].

Einleitung

17

Abbildung 1-6: Mögliche elektrophile Angriffsstellen in den DNA-Basen und die dazugehörenden DNA-

Reparaturwege, Abbildung modifiziert nach [116].

Die verschiedenen NOC-induzierten DNA-Addukte weisen unterschiedliche Persisten-

zen innerhalb der DNA auf. Während beispielsweise Addukte wie N3-Methylguanin und

N3-Methyladenin eher instabil sind, sind N7-Methylguanin- und O6-Methylguanin-

Addukte wesentlich stabiler [96]. Die Persistenz der DNA-Addukte in der DNA ist zudem

abhängig von der jeweiligen DNA-Reparatur. Im Zusammenhang mit der Persistenz der

mutagenen O6-Guanin-Addukte muss berücksichtigt werden, dass die MGMT-Expres-

sion in verschiedenen Geweben unterschiedlich stark ist und generell intraindividuelle

Unterschiede durch genetische Polymorphismen bestehen können. Weiterhin ist die Ge-

schwindigkeit der DNA-Reparatur durch die MGMT abhängig von der Adduktgröße.

Methyl-Addukte werden aufgrund ihrer geringen Größe wesentlich schneller durch die

MGMT repariert als größere Läsionen wie beispielsweise Ethyl-Addukte [116].

1.2.7 Biologische Konsequenzen nicht reparierter DNA-Addukte

Da die Reparatur von DNA-Addukten von der Effizienz und Spezifität des jeweiligen

Mechanismus abhängt, kann es unter Umständen dazu kommen, dass einige der bereits

genannten Addukte nicht repariert werden. Wird beispielsweise O6-MeG nicht durch

MGMT repariert, kann das zur Zytotoxizität bis hin zur Kanzerogenität führen [121, 122].

Tritt die geschädigte Zelle in die Replikation, wird das O6-MeG nicht als Guanin erkannt

und anstelle von Thymin wird ein Cytosin eingebaut [123]. Dadurch kommt es zu einer

G:C/A:T -Transitionsmutation [124]. Diese Basenfehlpaarung wird vom MMR-System

erkannt [125]. MMR besteht aus den zwei heterodimeren Proteinkomplexen MutS und

MutL. Die Basenfehlpaarung wird durch MutS erkannt. Dabei wird zwischen MutSα und

BER

BER

BER

MGMT MGMT

ABHABH ABH ABH

Einleitung

18

MutSβ unterschieden. Während MutSα kleine Verformungen der Helix erkennt, ist

MutSβ auf einzelsträngige DNA-Schleifen fokussiert [106]. Nachdem die Fehlpaarung

durch MutS identifiziert wurde, wird MutL rekrutiert. MutL aktiviert die Exonuklease

MutH, die für die Strangdiskriminierung sorgt [126]. Polymerase Polδ, Exonuklease I

und die DNA-Helikase II sorgen für die Entfernung des fehlerhaften DNA-Fragments

und die Resynthese [127]. Das jedoch folgenreiche Problem an dieser Form der DNA-

Reparatur ist, dass MMR ausschließlich die Läsion im neusynthetisierten Strang repariert,

wohingegen die eigentliche Läsion, O6-MeG, nach wie vor erhalten bleibt [106]. Das

führt dann zu einer Reihe zweckloser MMR-Zyklen, was letztendlich die Apoptose der

Zelle einleitet [128, 129]. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass erst durch die MMR die

DNA-Läsion O6-MeG zytotoxisch wirkt. Nichtsdestotrotz, oder gerade deswegen, schützt

MMR vor der Mutagenität, die von O6-MeG ausgeht. Eine Inaktivierung der MMR führt

zwar zu keiner zytotoxischen Wirkung, jedoch können dadurch O6-MeG-induzierte Gen-

mutationen entstehen [130, 131]. Dies wurde beispielsweise in einem Mausmodell ge-

zeigt, in der eine erhöhte MGMT-Expression vor NOC-induzierten ACFs im Kolon und

Punktmutationen im KRAS-Onkogen schützte [132]. Ein Verlust der MGMT-Aktivität

führte wiederum schon in mehreren Studien zu G:C/A:T-Transitionsmutationen im

KRAS-Onkogen [133-137].

Die Diazoacetat-induzierte DNA-Läsion O6-CMG weist ebenfalls mutagenes Potenzial

auf [1]. Auch hier kommt es zu einer Basenfehlpaarung [138], die zu CRC-relevanten

Genmutationen wie die im Tumorsuppressorgen TP53 führen kann [1].

Zusammenfassend konnte also bisher gezeigt werden, dass NOC-induzierte DNA-

Addukte wie O6-MeG und O6-CMG, wenn sie nicht repariert werden, zu Basenfehlpaa-

rungen der DNA führen. Wenn diese Fehlpaarungen nicht vor der Replikation repariert

werden können, kann es zur Bildung und Manifestation von Genmutationen in CRC-re-

levanten Genen wie TP53, KRAS und APC kommen. Diese wiederum wurden bereits bei

der Adenom-Karzinom-Sequenz von Fearon und Vogelstein als CRC-initiierende und -

promovierende Mutationen beschrieben [12, 14].

1.2.8 Die Rolle von O6-CMG in CRC

Die DNA-Läsion O6-CMG scheint eine besondere Rolle in der CRC-Entstehung zu spie-

len. Wie einige andere DNA-Addukte, wurden auch O6-CMG-Läsionen in Kolonepithel-

zellen detektiert [139]. Zusätzlich korrelierte die Menge der O6-CMG-Addukte mit der

Einleitung

19

zuvor konsumierten Menge an rotem

Fleisch [139]. Auch waren die TP53-Mu-

tationen, die durch das hauptsächlich O6-

CMG-Addukt induzierende Diazoacetat

entstanden, ähnlich zu den Mutationen, die

im TP53-Gen von Kolonkrebszellen detek-

tiert wurden [1] (Abbildung 1-7). Auch in

diesem Fall wird der MGMT eine wichtige

Rolle während der CRC-Entstehung zuge-

schrieben. Es wird vermutet, dass O6-CMG

eines der wenigen Addukte ist, das nicht

durch die MGMT repariert werden kann.

Es ist bekannt, dass die MGMT ein breites

Substratspektrum hat, jedoch zeigten Shu-

ker und Kollegen [103], dass sowohl die

Produkte der E.coli MGMT-homologen

Gene ada und ogt als auch humane Fib-

roblasten mit erhöhter MGMT-Expression

O6-CMG nicht reparieren können. Seither

wird angenommen, dass dieses Addukt

kein Substrat für die MGMT darstellt. Einige Jahre später veröffentlichte Senthong et al.

[10] eine Studie, in der zum ersten Mal, jedoch in einem zellfreien System, gezeigt wurde,

dass O6-CMG sehr wohl durch die MGMT repariert wird. Synthetisch hergestellte Oli-

gonukleotide mit O6-MeG- und O6-CMG-Addukten führten zur Inaktivierung der

MGMT. Zur Bestimmung der Rolle der MGMT und des O6-CMG-Adduktes in der CRC-

Entstehung muss in vitro mithilfe eines Zellsystems sowie in vivo bestätigt werden, dass

die MGMT für die Reparatur des O6-CMG-Adduktes verantwortlich ist. Weiterhin sollten

mögliche Unterschiede in der Effizienz des Reparaturmechanismus bestimmt werden.

1.2.9 In vitro-Modelle zur Untersuchung von CRC

Das kolorektale Karzinom ist in Deutschland und in anderen westlichen Industrienationen

neben Brust- und Prostatakrebs eines der häufigsten Krebsleiden. Um die CRC-Entste-

hung vollständig aufzuklären und mögliche neue Therapieansätze zu entwickeln, wird

Abbildung 1-7: Vergleich der TP53-Mutationen, die

durch KDA (Diazoacetat) induziert und die in CRC-

Zellen detektiert wurden [1].

Einleitung

20

intensiv in diesem Bereich geforscht. Neben epidemiologischen Studien, die Aufschluss

über z.B. Risikofaktoren geben, gilt es ebenfalls mechanistisch zu prüfen, welche Aus-

wirkungen die ermittelten Risikofaktoren haben. Mögliche Hypothesen können natürlich

im Tiermodell getestet werden, diese sollten aber zur Reduktion der Tierversuchsanzahl

vorrangig zuerst in vitro genauer untersucht werden.

Mittlerweile wird angenommen, dass intestinale Stammzellen (ISC) den Ursprung eines

kolorektalen Karzinoms darstellen [140]. Diese Stammzellen sind am Boden einer jeden

Darmkrypte lokalisiert und „exprimieren Bcl-2, ein Protein, das sie nach einer Schädi-

gung der DNA vor Zelltod schützt“ [106]. Dadurch können sich in diesen Zellen Genmu-

tationen manifestieren und die Tumorgenese einleiten. Um eben diese Zellen im Kontext

der Dickdarmkrebsentstehung genauer zu analysieren, wurden 3D-Kultursysteme entwi-

ckelt. Im Jahr 1992 wurde das erste intestinale 3D-Organoidsystem vorgestellt, jedoch

noch mit begrenzten Kultivierdauer [141, 142]. Das Problem der kurzen Kultivierdauer

konnte dann 2009 gelöst werden, sodass es heute die Möglichkeit gibt mit selbsterneu-

ernden intestinalen Organoidsystemen zu arbeiten. Die Organoide weisen im Vergleich

zur 2D-Zellkultur eine Reihe von Vorteilen auf, die helfen, den Link zwischen den In

vitro- und In vivo-Studien zu geben, doch leider sind 3D-Zellkulturen wesentlich auf-

wendiger und teurer als 2D-Kulturen. Daher wird noch mehrheitlich auf die 2D-Zellkultur

mit intestinalen Zellen zurückgegriffen. Für diese 2D-Zellkulturen werden neben Dauer-

zelllinien auch Primärzellen eingesetzt, die nicht immortalisiert sind. Das bedeutet, dass

auch diese Zellen eine begrenzte Kultivierdauer haben. Die Immortalisierung von Zellen

führt dazu, dass diese meist unbegrenzt kultiviert werden können. Dieses unbegrenzte

Zellwachstum wird meist durch eine Infektion, wie die mit dem SV40-Virus, durch eine

Transfektion von immortalisierenden Genen wie dem T-Antigen des SV40-Virus oder

durch die Expression von hTERT erreicht [15]. Neben der induzierten Immortalisierung

können Primärzellen auch spontan immortalisieren. Ein Beispiel dafür ist die embryonale

Mausfibroblasten-Zelllinie BALB/c. Da diese Zelllinie nicht aus einem malignen Gewebe

stammt, wird sie auch standardmäßig im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest verwen-

det. Im Bereich der Dickdarmkrebsforschung ist es natürlich sinnvoll Zellen zu verwen-

den, die bisher keine Anzeichen von Malignität aufweisen, um der Ursprungssituation

während der CRC-Entstehung möglichst nahe zu kommen. Es gibt eine Reihe von nicht-

malignen Zelllinien murinen Ursprungs, jedoch nur sehr wenige humanen Ursprungs. Das

lässt sich darauf zurückführen, dass primäre humane Zellen nur sehr selten spontan im-

mortalisieren und dadurch selten aus Primärzellkulturen Dauerzelllinien entstehen, die

Einleitung

21

dann weiter verwendet werden können [15]. Um mit humanen Zelllinien arbeiten zu kön-

nen, müssen diese dementsprechend immortalisiert werden. Wie bereits beschrieben, gibt

es dafür einige Möglichkeiten, jedoch führt der Prozess der Immortalisierung neben der

unbegrenzten Kultivierdauer auch zu anderen, zum Teil unerwünschten, Veränderungen

innerhalb der Zelle. So ist bekannt, dass die SV40-induzierte Immortalisierung zu einer

malignen Transformation der Zellen führen kann [143-145]. Daher wurde mittlerweile

Abstand von der SV40-Immortalisierung genommen und auf Proteine zurückgegriffen,

die ebenfalls die Lebensdauer von Zelllinien verlängern. So führt die Expression der

Cyklin-abhängigen Kinase 4 (Cdk4) in Kombination mit der humanen Telomerase

(hTERT) ebenfalls zur Immortalisierung. Mithilfe der hTERT wird die replikative Senes-

zenz kultivierter Zellen umgangen [146]. Da hTERT in den meisten somatischen Zellen

inaktiv ist, werden die Telomerenden nach der Replikation nicht weiter aufgefüllt. Die

Expression von hTERT führt zur Stabilisierung der Telomerlänge. Im Gegensatz zur Im-

mortalisierung mit SV40 kommt es bei der Expression von hTERT zu keiner malignen

Zelltransformation [147, 148]. Die gleichzeitige Expression von Cdk4 führt zur Phospho-

rylierung des Retinoblastom (Rb)-Proteins. Diese inaktive Form des Rb-Proteins ist nicht

mehr in der Lage, Transkriptionsfaktoren wie E2F zu binden, was zur Promotoraktivie-

rung und Progression des Zellzyklus führt [149]. Mithilfe dieser Methode konnten bereits

einige Zelllinien humanen und murinen Ursprungs immortalisiert werden, ohne dabei zu

transformieren. Beispielsweise hat Roig et al. [150] eine humane Dickdarmepithelzellli-

nie (HCEC) generiert, die durch hTERT und Cdk4 immortalisiert wurde. Diese HCEC-

Zelllinie stammt von gesundem Darmgewebe, welches 2010 während einer Koloskopie

gewonnen wurde. Neben den bereits gut entwickelten intestinalen Organoiden lassen sich

auch diese nicht-transformierten humanen Darmepithelzellen für Forschungsarbeiten im

Bereich der Dickdarmkrebsentstehung verwenden.

1.2.10 Maligne Zelltransformation

Die maligne Zelltransformation und deren Vorgang hat eine große Bedeutung für das

Verständnis der Krebsentstehung. Aufgrund dessen wird, wie bereits erläutert, meistens

mit nicht transformierten Zelllinien gearbeitet, um mechanistisch zu prüfen, welche

Schritte eine maligne Zelltransformation induzieren können. Der wohl bekannteste

In vitro-Zelltransformationstest setzt „syrian hamster emryo cells“ (SHE)- oder BALB/c-

Einleitung

22

3T3-Zellen ein. Mithilfe dieses Tests kann geprüft werden, ob die Zellen nach der Be-

handlung mit einer Substanz Zellherde (Foci) bilden, welches eines der wichtigsten Merk-

male der malignen Zelltransformation darstellt. Nach Angaben von Baserga [151] gibt es

verschiedene Stadien während der malignen Zelltransformation. Eine minimale Transfor-

mation liegt bereits vor, wenn Zellen unbegrenztes Wachstumspotenzial und einen mini-

mierten Bedarf an Wachstumsfaktoren aufweisen [151]. Des Weiteren ist eine erhöhte

Sättigungsdichte ein Merkmal einer minimalen Transformation. Eine intermediäre Trans-

formation liegt vor, wenn die Zell-Zell-Kontaktinhibition aufgehoben wird. Dabei wach-

sen die Zellen übereinander und bilden Foci. Ein Kriterium einer intermediär transfor-

mierten Zelle ist auch, dass sie verankerungsunabhängig wächst. Somit muss die Zelle

nicht mehr an einer festen Oberfläche adhärieren, sondern proliferiert in einem halbfesten

Agar oder sogar in Suspension. Liegen alle oben genannten morphologischen Verände-

rungen vor, wird die vollständige Transformation einer Zelllinie überprüft, indem ihr tu-

morigenes Potenzial in vivo getestet wird. Dafür werden Zellen subkutan in Nacktmäuse

injiziert und über eine bestimmte Zeit beobachtet, ob sich Tumore im Bereich der Injek-

tionsstelle bilden. Nach Tötung der Tiere werden die gebildeten Tumore histopatholo-

gisch untersucht. Werden durch die Injektion der Zellen in Nacktmäuse Tumore induziert,

spricht man von einer vollständig maligne transformierten Zelllinie.

Material und Methoden

23

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Chemikalien und Enzyme

Chemikalie/Enzym Reinheit Artikelnummer Hersteller/

Vertrieb

Ammoniumpersulfat (APS) ≥ 98 % A6761 A

Agarose-low melt k. A. V2111 B

Agarose-regular melt k. A. 35-1010 C

BIO ≥ 98 % B1686 A

Bromphenolblau ≥ 90 % A3640.0005 D

Dinatriumhydrogenphosphat ≥ 99,5 % K29977180147 E

DMSO ≥ 99,5 % 7029.1 F

DTT ≥ 99 % D9779 A

EDTA (Na2) ≥ 99 % 8043.1 F

Eindeckmedium k. A. 03989 A

EtOH ≥ 99,9 % 64102 G

Essigsäure 100 % 3738.2 F

Glycin ≥ 99 % 3908.2 F

Harnstoff ≥ 99,9 % K21204688 E

Hämin ≥ 97 % 51280 A

Hexadimethrinbromid ≥ 94 % H9268 A

Isopropanol ≥ 99,5 % CP41.3 F

Kaliumdihydrogenphosphat ≥ 99,5 % A377073.218 E

Kaliumhexacyanoferrat III ≥ 98 % 196785000 H

Kaliumiodid ≥ 99 % P2963 A

KCl ≥ 99,5 % K30323436213 E

Kupfersulfat ≥ 99-101 % 231-847-6 E

Magermilchpulver k. A. T145.2 F

Methanol ≥ 99 % 8388.5 F

NaCl ≥ 99,5 % P029.2 F

Natriumdithionit 85 % 157953 A

NaOH ≥ 99 % 6771.1 F

Natriumnitrit ≥ 99 % 8604.1 F

N-Lauroylsarcosin ≥ 97 % L-9150 F

Nonidet™ P40 k. A. 74385 A

Paraformaldehyd k. A. P6148 A

PMSF ≥ 99 % 6367.1 F

Puromycin k. A. P8833 A

cOmplete, Mini-Tabletten

mit EDTA

k. A. 04693124001 I

SDS ≥ 99,5 % 0183.3 F

Sucrose ≥ 99,5 % S7903 A


24

TEMED ≈ 99% T9281 A

TRIS ≥ 99,9 % 0188.3 F

TritonX-100 k. A. 3051.4 F

Trypanblau k. A. CN76.1 F

Tween®20 k. A. 437082Q H A: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf; B: Promega GmbH, Mannheim; C: PEQLAB Biotechno-

logie GmbH, Erlangen; D: AppliChem GmbH, Darmstadt; E: Merck KGaA, Darmstadt; F: Carlo Roth

GmbH & Co. KG, Karlsruhe; G: Kraul & Wilkening u. Stelling GmbH, Hannover; H: Thermo Fisher

Scientific p/a Perbio Science Deutschland, Bonn; I: Roche Deutschland Holding GmbH, Mannheim; H:

VWR International GmbH, Darmstadt

2.1.2 Kommerziell erworbene Lösungen und Testkits

2.1.2.1 Lösungen

Lösung Artikelnummer Hersteller/Vertrieb

Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung 3029.2 A

BSA-Standards 23208 B

ECL-Lösung P90720 C

Giemsa-Lösung T862.2 D

Ponceau S Solution P7170 E

Propidiumiodid -Lösung P4864 E

Trypsin/EDTA L2153 F A: Carlo Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe; B: Thermo Fisher Scientific p/a Perbio Science Deutschland,

Bonn; C: Millipore GmbH, Schwalbach am Taunus; D: Carlo Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe; E: Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf; F: Merck KGaA, Darmstadt

2.1.2.2 Testkits

Testkit Artikelnummer Hersteller/Vertrieb

AlamarBlue® Cell

Proliferation Assay

BUF012A A

CellTiter-Glo®-Luminescent

Cell Viability Assay

G7571 B

Pierce™ Microplate

BCA Protein Assay Kit

23252 C

RNA II Isolation Kit 740955.10 D

SensiMix™ SYBR®

& Fluorescein Kit

QT615-05 E

Verso cDNA Synthesis Kit AB1453A C A: Bio-Rad AbD Serotec GmbH, Puchheim; B: Promega GmbH, Mannheim; C: Thermo Fisher Scientific

p/a Perbio Science Deutschland, Bonn; D: MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren; E: Bioline

GmbH, Luckenwalde


25

2.1.3 Testsubstanzen

Substanz Artikelnummer Lösungsmittel Hersteller/

Vertrieb

Azaserin Sc-29063 ddH2O A

Diazald D28000 Ethanol B A: Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg; B: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf

2.1.4 Hergestellte Lösungen/Puffer

Lösung Zusammensetzung

Antikörperlösung (Immunzytochemie) 1 % BSA, 0,05 % Tween 20 in PBS

Entwinde-/Elektrophoresepuffer 0,3 M NaOH, 2 mM Na2EDTA in dH2O,

pH ≥13

Fixierlösung 4 % Paraformaldehyd, 1 % Sucrose in

PBS, erwärmen und pH 7,0

Laufpuffer (10x) 1,92 M Glycin, 34,67 mM (1 %) SDS,

250mM TRIS in dH2O

Lysispuffer 2,5 M NaCl, 0,1 M Na2EDTA,

1 % N-Lauroylsarcosin, 0,01 M TRIS,

0,2 M NaOH, pH 10 einstellen,

danach 1% Triton-X 100 hinzugeben

Transferpuffer (10x) 1,92 M Glycin, 250 mM TRIS in dH2O

Probenladepuffer (2x) 4 M Harnstoff, 69,35 mM (2 %) SDS,

62,5 mM TRIS, Spachtelspitze

Bromphenolblau in dH2O

Probenladepuffer (5x) 4 M Harnstoff, 0,35 M (10 %) SDS,

62,5 mM TRIS, Spachtelspitze

Bromphenolblau in dH2O; nach Anferti-

gung Zugabe von 20% (w/v) DTT

Blocklösung/Antikörperlösung

(Western Blot)

5 % Magermilchpulver in

1x TBS-Tween® 0,2 %

Blocklösung (Immunzytochemie) 10 % Sucrose, 0,5 % Nonidet™ P40, 5 %

Magermilchpulver,

100 mM Glycin in PBS

PBS, pH 7,4 0,4 g/l (w/v) KCl, 0,2 g/l (w/v) KH2PO4,

8 g/l (w/v) NaCl, 1,43 g/l (w/v)

Na2HPO4 . 2 H2O in dH2O

PMSF-Lösung 100mM in EtOH

RIPA-Puffer 50 mM TRIS, 150 mM NaCl, 1 mM

EDTA, 1 % Triton X 100, 0,1 % SDS,

1 % Natriumdesoxycholat,

pH 7,6 einstellen, 100 µM PMSF und Pro-

tease Inhibitor-Tablette frisch zugeben

Sammelgelpuffer, pH 6,8 17,34 mM (0,5 %) SDS,

1,875 M TRIS in dH2O


26

Stripping-Puffer 0,2 M Glycin, 0,05 % Tween-20, pH auf

2,0 einstellen, dann Zugabe von 1 % SDS

TBS-Tween (10x) 0,68 M NaCl, 0,1M TRIS in dH2O,

pH 7,6, danach Zugabe von Tween

Trenngelpuffer, pH 8,8 34,67 mM (1 %) SDS,

1,875 M TRIS in dH2O

Waschlösung (Immunzytochemie) PBS, 0,05 % Tween 20

2.1.5 Laborgeräte und -hilfsmittel

Gerät/Hilfsmittel Eigenschaften/Typ Hersteller/Vertrieb

Absaugrechen 8-Kanals-Pipettiereinheit A

Analysewaage OL210-A B

Blot Imager Fusion-SL 3500-WL C

CO2-Inkubator Heracell 150 bzw. 150i D

Deckgläser für die

Zählkammer

24 x 24 mm E

N2-Inkubator CB53 F

Einfrierröhrchen-

Container

Mr. Frosty D

Elektrophoresekammer MS Choice G

Fluoreszenzmikroskop Axiovert 200M H

Glasflaschen Volumina: 100, 250, 500,

1000 ml

I

Handstück für die

Absaugung

VacuuHandControl, VHC J

Heizblock Thermomixer comfort K

Heizofen ULE 600 L

Hypoxiekammer O2 Control Glove Box M

Inkubator (1) 400 L

Inkubator (2) UF-S5 L

Lichtmikroskop Eclipse Ti-S N

Magnetrührer VMS-C7 O

Mehrkanal-Pipetten Transferpette®-8/

Transferpette®s-8

A

NanoDrop 1000

Spektrophotometer

k. A. P

Oberschalenwaage BA BF 500 Q

Objektträger (rund) 631-1340 O

Pinzetten Wironit 4235 R

Pipetten Reference®-/Research®-Pi-

petten mit varia. Volumen

K

Pipettierhilfe PIPETBOY acu S

Plattenlesegerät Infinite® M200 T

Plattenschüttler Titramay 100 U

Plattenzentrifuge Universal 320 V


27

CFX96 Real-Time PCR

Detection System

k. A. W

Sicherheitswerkbank

(Klasse II)

Hersafe KS D

Stickstoffmonoxid-

Analysegerät (NOA)

CLD 88 NO et

X

PowerPac Basic/HC W

Ultraschall-

Homogenisator

HTU SONI130 Y

Vortexer Vortex-Genie® 2 K

Wasserbad 1086 Z

Western Blot

Hilfsmittel

Elektrophore- und Transfer-

kammer, Glaslatten, Kämme

W

Wippschüttler (1) Mini see-saw rocker SSM4 O

Wippschüttler (2) Kat.-Nr.: 40000-302 O

Zählkammer Neubauer/Neubauer improved Aa

Zentrifuge (1) 5702 RH K

Zentrifuge (2) 5415 R K A: BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim; B: Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Bremen; C: Vilber

Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell; D: Thermo Electron LED GmbH, Langenselbold; E: Gerhard

Menzel GmbH, Braunschweig; F: Binder GmbH, Tuttlingen; G: Biozym Scientific GmbH, Hessisch

Oldendorf , H: Carl Zeiss AG, Oberkochen; I: DURAN Group GmbH, Mainz; J: Vacuubrand GmbH &

Co. KG, Wertheim; K: Eppendorf AG, Hamburg; L: Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach; M: Coy

Laboratory Products Inc., Grass Lake, MI, USA; N: Nikon GmbH, Düsseldorf; O: VWR International

GmbH, Darmstadt; P: Thermo Fisher Scientific p/a Perbio Science Deutschland, Bonn; Q: Sartorius AG,

Göttingen; R: Karl Hammacher GmbH, Solingen; S: INTEGRA Biosciences GmbH, München; T: Tecan

Deutschland GmbH, Crailsheim; U: Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach; V: Andreas Het-

tich GmbH & Co. KG, Tuttlingen; W: Bio-Rad Laboratories GmbH, München ; X: Eco Physics GmbH,

München; Y: Heinemann Ultraschall- und Labortechnik, Schwäbisch Gmünd; Z: GFL Gesellschaft für

Labortechnik mbH, Burgwedel; Aa: Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co. KG, Sondheim vor der

Rhön

2.1.6 Verbrauchsmaterialien

Verbrauchsmaterial Eigenschaften/

Herstellerbezeichnung

Hersteller/

Vertrieb

15 ml/50 ml-Röhrchen

mit konischem Boden

CELLSTAR®-Röhrchen A

10 cm/6 cm/3 cm-

Zellkulturschalen

Material: Polysterol B

6/12/24/96-Well Mikroti-

terplatten (Primaria™)

Material: Polysterol C

96-Well-

Mikrotiterplatten

Material: Polysterol, Boden:

flach

A


28

96-Well-Ultra low attach-

ment-Platten

Hydrogel-beschichtet C

Einfrierröhrchen Cryo.s™ A

Filterpapier Papierdicke: 0,8 mm D

Mikroreaktionsgefäße Größe: 0,5, 1,5 und 2 ml E

Objektträger Super Frost Ultra Plus F

Pasteuerpipetten Kalksoda-Klarglas G

Pipettenspitzen Volumina: 10, 20, 200, 1000,

2500, 5000

H

Serologische Pipetten Volumina: 5, 10 und 25 ml I

Transfermembran Protran™-Nitrocellulosememb-

ran (Porengröße: 0,2 µm)

E

Vakuum-Sterilfilter „rapid“-Filtermax

(Porengröße: 0,22 µm)

B

Zellkulturflaschen Fläche: 75 und 25 cm2 B

Zellkulturflaschen

Primaria™

Fläche: 75 cm2 C

A: Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen; B: TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz;

C: Corning B.V. Life Sciences, Amsterdam, Niederlande; D: Whatman GmbH, Dassel; E: Eppendorf AG,

Hamburg; F: Thermo Fisher Scientific p/a Perbio Science Deutschland, Bonn; G: Carl Roth GmbH & Co

KG, Karlsruhe; H: STARLAB GmbH, Hamburg; I: Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

2.1.7 Software

Software Version Hersteller/Vertrieb

AxioVision 4.8.2 (06-2010) A

CFX Manager™-Software Version 3.1 B

Comet-Assay III 3 C

eDAQ Chart V5 for Windows D

Excel (Windows) 2010 E

Fusion-Analysesoftware Bio 1D F

GraphPad Prism 7.02.197.0 G A: Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena; B: Biorad, Bio-Rad Laboratories GmbH, München; C: Perceptive

Instruments Ltd., Bury St Edmunds, UK; D: eDAQ Pty Ltd, Spechbach; E: Microsoft Corporation,

Redmond, WA, USA; F: VILBER LOURMAT Deutschland GmbH, Eberhardzell; G: GraphPad Prism

Software, Inc., La Jolla, CA, USA

2.1.8 Allgemeine Materialien in der Zellkultur

2.1.8.1 Adhärente Zelllinien

Tabelle 2.1: In dieser Studie verwendete adhärente Zelllinien humanen und tierischen Ursprungs

Zelllinie Ursprungsspezies Ursprungsgewebe Herkunft

BALB/c 3T3 A31

(Subklon 1-1)

Maus Embryonale

Fibroblasten

A


29

CaCo-2 Mensch Kolorektales

Adenokarzinom

B

HCEC WT Mensch Kolonepithelzellen

(Progenitor)

C

HCEC MGMT - Mensch Kolonepithelzellen

(Progenitor)

D

HCEC RPA-

A1309 (kurz:

HCEC RPA)

Mensch Kolonepithelzellen

(Progenitor)

C

HCT 116 Mensch Kolorektales

Karzinom

E

HT29 Mensch Kolorektales

Adenokarzinom

E

A: Hatano Research Institute, Hadano, Japan; B: DSMZ, Braunschweig; C: Labor von Prof. Jerry Shay,

TX, USA [150]; D: Institut Lebensmitteltoxikologie und chemische Analytik-Tierärztliche Hochschule

Hannover, Deutschland; E: ATCC, Manassas, VA, USA

2.1.8.2 Zellkulturflaschen und -platten

Für die Kultivierung und Durchführung von In vitro-Experimenten wurden im Fall der

humanen Dickdarmepithelzelllinie HCEC und ihrer Subklone BD Primaria™-Zellkultur-

material (Corning B.V. Life Sciences, Amsterdam, Niederlande) verwendet. Für alle an-

deren Zelllinien wurde das herkömmliche TPP®-Zellkulturmaterial (Techno Plastic Pro-

ducts AG, Trasadingen, Schweiz) genutzt.

2.1.8.3 Basale Nährmedien

Nährmedium Artikelnummer Hersteller/Vertrieb

Dulbecco´s Modified Eagle Medium

(DMEM)

FG0445 A

DMEM GlutaMAX™ 31966-021 B

Minimum Essential Medium (MEM) F0325 C

Medium 199 (M199) 22340-020 B A: Biochrom AG, Berlin; B: Invitrogen by Thermo Fisher Scientific p/a Perbio Science Deutschland, Bonn;

C: Merck KGaA, Darmstadt

2.1.8.4 Nährmedienzusätze

Zusatz Verwendete

Endkonzentration

Artikelnummer Hersteller/

Vertrieb

Epidermal Growth

Factor human

(hEGF)

25 ng/ml E9644 A

FBS 10% S0115 B

Gentamycin 50 ug/ml G1264 A


30

Hyclone™ Cos-

mic Calf Serum

(CCS)

2% SH 3008704 C

Hydrocortison 1 ug/ml H0888 A

Insulin (bovin) 10 ug/ml I1882 A

L-Glut-Lösung 2 mM K0283 D

Natriumselenit 5 nM S5261 A

P/S-Lösung 100IE/ml/100µg/ml A2213 D

Transferrin

(human)

2 ug/ml T8158 A

A: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf; B: Biochrom AG, Berlin; C: GE Healthcare GmbH, So-

lingen; D: Merck KGaA, Darmstadt

2.1.8.5 Nährmedienzusammensetzung

Tabelle 2.2: Nährmedien und ihre Zusammensetzungen für die Kultivierung der in dieser Studie verwen-

deten Zelllinien

Zelllinie Basalmedium Zusätze

BALB/c 3T3

A31 (Subklon 1-

1)

MEM FBS, L-Glutamin, P/S

CaCo-2 MEM FBS, L-Glutamin, P/S

HCEC

+ Subklone

4/5 DMEM Gluta-

MAX™+ 1/5 M199

hEGF, Gentamycin, CCS, Hydrocortison,

Insulin, Natriumselenit, Transferrin

HCT 116 DMEM FBS, L-Glutamin, P/S

HT29 DMEM FBS, L-Glutamin, P/S

2.1.9 Antikörper und Proteinmarker

2.1.9.1 Primärantikörper

Protein-bzw.

Epitopbindung


Vertrieb

Häm-Oxygenase 1 (HO-1) 5061S A

3-Nitrotyrosin (3-NT) sc-32757 B

O6-Methylguanin DNA-

Methyltransferase (MGMT)

MAB16200 C

ß-Actin (ACTB) (1) sc-516102-HRP B

ß-Actin (ACTB) (2) sc-47778 B

α-smooth muscle actin (SM-Ac-

tin)

M0851 D

PanCytokeratin (panCK) Z0622 D

A: Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA; B: Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg;

C: Merck KGaA, Darmstadt; D: Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA


31

2.1.9.2 Sekundärantikörper

Protein-bzw.

Epitopbindung


Vertrieb

Alexa Fluor 488 A11001 A

Alexa Fluor 568 A11036 A

Hoechst 62249 A

Anti-Maus-IgGκ Sc-516102 B

Anti-Kaninchen-IgG A0545 C A: Thermo Fisher Scientific p/a Perbio Science Deutschland, Bonn; B: Santa Cruz Biotechnology, Inc.,

Heidelberg; C: Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf

2.1.9.3 Proteinmarker

Proteinmarker Artikelnummer Hersteller/Vertrieb

PeqGOLD Protein-Marker V 27-2210 A A: PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen

2.2 Methoden

2.2.1 Zellbiologische Methoden

2.2.1.1 Allgemeine Zellkulturbedingungen

Die Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten adhärenten Zelllinien erfolgte routine-

mäßig bei 37 °C, 5 % CO2 sowie einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95 %. Je nach Zell-

linie wurden die Zellen entweder unter atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen (21

% O2) oder hypoxischen Bedingungen (2 % O2) kultiviert. Des Weiteren wurden alle

Arbeitsschritte, die zur Kultivierung der Zellen notwendig waren, unter einer biologi-

schen Sicherheitswerkbank der Klasse II durchgeführt.

2.2.1.2 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen

Um permanente Zelllinien langfristig zu lagern, wurden diese mithilfe der Kryokonser-

vierung im flüssigen Stickstoff bei -190 °C aufbewahrt. Dafür wurden die Zellen zunächst

aus ihrem Kulturgefäß mithilfe von Trypsin/EDTA abgelöst und in Suspension gebracht.

Nach Zentrifugation der Zellen (5 Min., RT, 500 RCF) wurden die Zellen vom Kultur-

medium getrennt. Nach erneuter Resuspension der Zellen und Ermittlung der Zellzahl

(Kap. 2.2.1.4) erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt. Das Zellpellet wurde daraufhin

in einer FBS/DMSO-Mischung (9:1) aufgenommen und resuspendiert. Hierbei diente das

hinzugefügte DMSO als Gefrierschutzmittel. Die Kryoröhrchen wurden mit mindestens

1*106 Zellen befüllt und in einem mit 100 % -igem Isopropanol gefüllten Kryoröhrchen-


32

Container gestellt. Dieser Container wurde bei -80 °C für mindestens 24 Stunden gelagert,

um ein langsames aber stetiges Einfrieren der Zellen zu gewährleisten. Nach 24 Std. wur-

den die Einfrierröhrchen in den flüssigen Stickstoff überführt und die Zellen dort dauer-

haft gelagert.

Zum Rekultivieren der Zellen wurden diese aus dem flüssigen Stickstoff entnommen und

zügig in einem 37 °C warmen Wasserbad aufgetaut. Die Zellsuspension wurde in ein

15 ml Falcon-Röhrchen überführt und zentrifugiert (5 Min., RT, 500 RCF). Nach Absau-

gen des Überstandes wurde das Zellpellet in vorgewärmtem Medium resuspendiert und

in eine Zellkulturflasche mit 15 ml Medium gegeben. Nach jeder Rekultivierung wurden

die Zellen mindestens zwei Mal passagiert, bevor sie für eines der In vitro-Testsysteme

verwendet wurden.

2.2.1.3 Subkultivierung von Zellen

Zur Kultivierung von Zellen müssen diese in regelmäßigen Abständen passagiert/gesplit-

tet werden. Dies erfolgt bei Erreichen der Subkonfluenz, das bedeutet wenn ca. 90 % des

Bodens der Zellkulturflasche/Petrischale mit Zellen bewachsen ist. Dafür wurde zunächst

das Nährmedium aus dem Kulturgefäß entnommen, die Zellen mit warmem PBS gewa-

schen und danach mithilfe von Trypsin/EDTA abgelöst. Das EDTA komplexiert dabei

irreversibel die Ca2+-Ionen und verhindert dadurch die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-

Kontakte. Die Serinprotease Trypsin spaltet zudem Proteine, die für die Adhäsion der

Zellen an der Oberfläche der Zellkulturflasche/Petrischale sorgen [15]. Die proteolytische

Aktivität des Trypsins wurde nach dem Ablösen der Zellen mit demselben Volumen an

Nährmedium gestoppt. Die in dem Medium enthaltenen Proteine dienten als alternative

Substrate für das Trypsin, sodass die proteolytische Wirkung des Enzyms aufgehoben

wird. Die Zellsuspension wurde daraufhin in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt und

bei 500 RCF für 5 Min. und RT zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und

das Zellpellet in 5 ml Nährmedium aufgenommen. Nach Zählung der Zellen (Kapitel

2.2.1.4) wurde die benötigte Zellzahl in ein neues Kulturgefäß überführt, die Zellen durch

vorsichtiges Schwenken verteilt und wieder unter den bereits beschriebenen Bedingungen

kultiviert.

2.2.1.4 Zellzahlbestimmung

Für die Subkultivierung sowie die in dieser Studie durchgeführten Versuche war es not-

wendig, die Zellzahl zu ermitteln, um eine Vergleichbarkeit der Experimente untereinan-


33

der zu gewährleisten. Um diese zu ermitteln, wurde der Trypanblau-Ausschlusstest ver-

wendet, welcher darauf beruht, dass die intakte Zellmembran lebender Zellen die Auf-

nahme des Diazofarbstoffs Trypanblau verhindert, wohingegen die beschädigte Membran

toter Zellen die Aufnahme der Substanz nicht verhindern kann. Dadurch lässt sich die

Anzahl lebender Zellen in der Suspension bestimmen.

Zur Durchführung des Trypanblau-Ausschlusstests wurden die Zellen, wie bereits be-

schrieben, vom Kulturgefäß gelöst und in Suspension gebracht. Daraufhin wurde diese

Suspension 1:10 mit der Trypanblau-Lösung gemischt und in eine Neubauer-Zählkam-

mer eingebracht. Mithilfe eines Lichtmikroskops wurden die lebenden Zellen in den vier

großen Eckquadraten gezählt. Aus den ermittelten Zellzahlen eines jeden Eckquadrates

wurde der Mittelwert (MW) gebildet und unter Berücksichtigung des vorangegangenen

Verdünnungsfaktors der Zellsuspension als auch des Kammerfaktors die genaue Zellzahl

berechnet (Formel 1).

Formel 1: Berechnung der Zellzahl/ml nach Zählung in der Neubauer-Zählkammer

𝑍𝑒𝑙𝑙𝑧𝑎ℎ𝑙/𝑚𝑙 𝑍𝑒𝑙𝑙𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑠𝑖𝑜𝑛

= 𝑀𝑊 𝑥 𝑍𝑒𝑙𝑙𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑠𝑖𝑜𝑛𝑠𝑣𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑢𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 (10) 𝑥 𝐾𝑎𝑚𝑚𝑒𝑟𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 (10.000)

2.2.1.5 Zellaussaat für In vitro-Versuche

Nachdem die Zellen mithilfe des Trypanblau-Ausschlusstests gezählt wurden, wurde die

benötigte Zellzahl in der entsprechenden Menge an vorgewärmtem Nährmedium aufge-

nommen, mehrmals resuspendiert, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, und

daraufhin in das für das In vitro-Testsystem benötigte Zellkulturgefäß überführt.

2.2.2 Zellcharakterisierung

2.2.2.1 Bestimmung der Sättigungsdichte

Ein wichtiges Kriterium bei der Charakterisierung von Zellen, vor allem einer vorliegen-

den malignen Zelltransformation, ist die Bestimmung der Sättigungsdichte. Zellen, die

bisher nicht maligne transformiert sind, unterliegen einer strikten Regulation durch mito-

gene und anti-mitogene Signale, wobei anti-mitogene Signale über Zell-Zell-Kontakte

übermittelt werden. Bei Erreichen der Konfluenz kommt es zur Zell-Zell-Kontaktinhibi-

tion [152, 153]. Die Ermittlung der Sättigungsdichte (Zellen/cm2) wird durchgeführt, um


34

nachzuweisen, dass Zellen diesen Regulationsmechanismus aufweisen oder unter Um-

ständen bereits im Zuge der malignen Transformation verloren haben. In diesem Fall

wachsen die Zellen nach Erreichen der Konfluenz weiter und lagern sich dabei überei-

nander, wobei ein sogenannter Focus entsteht.

Um die Sättigungsdichte zu ermitteln, wurden entweder 5*104 Zellen pro Well einer 6-

Wellplatte oder alternativ 0,6*104 Zellen pro Well einer 24-Wellplatte ausgesät. Nach

regelmäßigem Wechsel des Nährmediums und Erreichen der Konfluenz, wurde die Zell-

zahl, wie bereits in Kap. 2.2.1.4 beschrieben, ermittelt. Um zu testen, ob die Zellen noch

immer eine Kontaktinhibition aufweisen, wurde nach weiteren vier Tagen erneut die Zell-

zahl ermittelt und diese mit dem ersten Wert verglichen. Bei einem weiteren Anstieg der

Zellzahl konnte geschlussfolgert werden, dass die Kontaktinhibition der Zellen aufgeho-

ben worden war.

2.2.2.2 Ermittlung der Verdopplungszeit

Zum einen ist die Bestimmung der Verdopplungszeit wichtig, um zu erfassen, wann sich

eine Zelllinie in ihrer exponentiellen Wachstumsphase befindet. Zum anderen kann eine

veränderte Verdopplungszeit darauf hindeuten, dass die Zelllinie erste Anzeichen einer

malignen Transformation aufweist.

Um die Verdopplungszeit zu bestimmen, wurden 5*104 Zellen pro Well einer 6-Well-

platte ausplattiert und nach 24 Std. die Zellzahl ermittelt (Kap. 2.2.1.4). Dies wurde täg-

lich zur selben Zeit über eine Dauer von max. 14 Tagen wiederholt, bis die Zelllinie das

Wachstumsplateau erreicht hatte.

2.2.2.3 Verankerungsunabhängiges Wachstum

Um eine Zelllinie als maligne transformiert einzustufen, gibt es, wie bereits beschrieben,

mehrere Aspekte, die zu beachten sind. Eines der Hauptmerkmale einer transformierten

Zelle ist die verankerungsunabhängige Zellproliferation. Das bedeutet, dass die Zellen,

die zum Proliferieren an einer Oberfläche adhärieren müssen, bei Vorliegen einer malig-

nen Transformation ohne zu adhärieren in einem halbfesten Agar oder sogar in Suspen-

sion wachsen können [154].

Zur Untersuchung des Transformationsgrades einer Zelllinie wurden die Zellen auf eine

Oberfläche ausplattiert, die mit Hydrogel beschichtet war und somit keine Zelladhärenz

ermöglichte [155]. Dafür wurden Zellkulturplatten der Firma Corning® verwendet und

1*103 Zellen pro Well einer 96-Wellplatte ausgesät. 24 Std. und 120 Std. nach Aussaat

wurde die Zellzahl mittels CellTiterGlo®-Assay (Kapitel 2.2.3.1.1) bestimmt. Dadurch


35

konnte das zelluläre ATP als Lumineszenzsignal gemessen werden, welches wiederum

proportional zur Zellzahl war. Ein Anstieg des zellulären ATPs nach fünf Tagen bedeu-

tete, dass die Zellen verankerungsunabhängig proliferieren können. Dieser Assay wird

als „Growth in low attachment“ (GILA)-Assay bezeichnet.

2.2.2.4 Fokusbildung von konfluenten Zellen

Neben einem verankerungsunabhängigen Zellwachstum und aufgrund des Verlustes der

Zell-Zell-Kontaktinhibition bilden die meisten Zellen bei Erreichen der Konfluenz Zell-

herde, sogenannte Foci. Eine derartige Veränderung des Phänotyps wurde bereits in den

70er Jahren durch Reznikoff et al. und DiPaolo et al. beschrieben [156, 157]. Dabei wach-

sen die Zellen unkontrolliert übereinander und es entstehen auf der Zellkulturoberfläche

Bereiche mit erhöhter Zelldichte.

Um diese besser zu visualisieren, wurde der vollständige Monolayer im Kulturgefäß mit

eiskaltem Methanol fixiert (10 Min.) und daraufhin durch eine Giemsa-Lösung angefärbt.

Dafür wurden 2 ml der Giemsa-Stammlösung pro 6-Well hinzugegeben und nach 10 Min.

Inkubation bei RT weitere 4 ml dH2O zugefügt. Nach 20 Min. wurde die Färbelösung

entnommen.

2.2.3 Toxizitätsanalysen

2.2.3.1 Zytotoxizität

2.2.3.1.1 CellTiterGlo®-Cell viability-Assay

Die Bestimmung der Zellviabilität erfolgte mithilfe des CellTiterGlo®-Cell viability-As-

says. Das Prinzip dieses Assays beruht auf der Messung des zellulären ATP-Gehalts als

Maß metabolisch aktiver (= lebender) Zellen. Dabei oxidiert die Luciferase in einer ATP-

abhängigen Reaktion Luciferin zu Oxyluciferin, welches als Lumineszenz in einem Plat-

tenmessgerät quantifiziert werden kann. Das dabei gemessene Signal ist direkt proporti-

onal zum ATP-Gehalt der Zellen und kann deshalb als Viabilitätsmarker angesehen wer-

den.

Dieser Assay wurde wie vom Hersteller beschrieben durchgeführt. Um die Zytotoxizität

einer Substanz zu bestimmen, wurden die Zellen in 96-Wellplatten ausgesät und am Fol-

getag mit der zu testenden Substanz behandelt. Nach dem gewünschten Inkubationszeit-

raum wurde das Behandlungsmedium entnommen und durch frisches Medium ersetzt.


36

Danach erfolgte die Zugabe des CellTiterGlo®-Reagenzes, gefolgt von einer zweiminüti-

gen Zelllyse und einer 10-minütigen Inkubation bei RT. Die Lumineszenzintensität

wurde daraufhin in einem Plattenmessgerät gemessen und relativ zur Lösungsmittelkon-

trolle in % dargestellt. Je nach Testsystem erfolgte die Angabe als Zellviabilität in %,

Lumineszenzintensität in % oder „relative luminescent units“ (RLU).

2.2.3.1.2 Alamar Blue®-Zellproliferations-Assay

Eine Alternative zum vorangegangenen Test ist der Alamar Blue®-Assay. Auch hier wird

die metabolische Aktivität und damit die Zellviabilität bestimmt. Grundlage dieses Test-

systems ist, dass metabolisch aktive Zellen den nicht-fluoreszierenden, blauen Farbstoff

Resazurin zum fluoreszierenden, pinken Resorufin umsetzen und dieser mittels Fluores-

zenzmessung in einem Plattenmessgerät quantifiziert werden kann. Da diese Reaktion

nur von vitalen und metabolisch aktiven Zellen durchgeführt wird, wird das Fluoreszenz-

signal direkt proportional zur Zellproliferation bzw. Zellviabilität gesetzt.

Um die Zytotoxizität einer Substanz zu ermitteln, wurden die Zellen nach der Behandlung

mit Medium gewaschen, um mögliche Reaktionen der Behandlungssubstanz mit Resazu-

rin zu vermeiden, 200 µl frisches Medium auf die Zellen gegeben und 20 µl Alamar

Blue®-Reagenz hinzugefügt. Nach acht Stunden bei 37 °C im Inkubator wurde die Fluo-

reszenzmessung durchgeführt. Dabei wurde das Resorufin bei 530 nm angeregt und die

Emission bei 590 nm gemessen. Die Messwerte wurden relativ zur Lösungsmittelkon-

trolle gesetzt und die IC50-Werte mithilfe von GraphPad Prism berechnet.

2.2.3.2 Genotoxizitätsbestimmung-Comet-Assay

Der alkalische Comet-Assay ist eine Methode zur Detektion von Doppel- und Einzel-

strangbrüchen sowie AP-Stellen und bestimmt dadurch die Genotoxizität einer Substanz.

Die Methode wurde erstmals 1988 von Singh et al. [158] beschrieben. 2006 veröffent-

lichten Olive und Banath [159] eine Modifikation des Ursprungsprotokolls, welches in

dieser Studie Anwendung fand.

Dafür wurden Zellen nach 4- und 24-stündiger Behandlung mit der Testsubstanz mit

Trypsin abgelöst und ca. 5*104 Zellen in 400 µl PBS aufgenommen. Die Zellen wurden

daraufhin in 1 ml low melt-Agarose (40 °C) aufgenommen (Endkonzentration

0,71 mg/ml) und ca. 0,7 ml dieser Suspension auf einen mit regular melt-Agarose be-

schichteten Objektträger aufgetragen. Nach Aushärtung der Gele wurden die Zellen über

Nacht bei 4 °C lysiert. Am Folgetag wurde die Elektrophorese durchgeführt. Dafür wur-

den die Zellen der Lyse-Lösung entnommen und 40 Min. in den Elektrophoresepuffer


37

(pH >13) gelegt. Während dieser Zeit trennten sich die DNA-Doppelstränge und die al-

kalisensitiven DNA-Veränderungen wurden in Strangbrüche umgewandelt. In der darauf-

folgenden Elektrophorese (1 V/cm, 25 Min., 0,29-0,3 A, 4 °C) wanderten die negativ ge-

ladenen DNA-Fragmente zur Anode. Beim Vorliegen von DNA-Schäden entstand durch

das Laufverhalten der DNA-Fragmente eine Kometen-Form, da die intakte DNA der

Zelle im Zellkern verblieb, während DNA-Fragmente einen Schweif bildeten-daher der

Name „Comet-Assay“. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 10 Min. in kaltem

PBS und 10 Min. in kaltem dH2O neutralisiert und danach mit einer Propidiumiodid-

Lösung (15 µg/ml, 20 Min., im Dunkeln) gefärbt [159, 160].

Anschließend wurden die Objektträger mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops bei Grün-

anregung analysiert und die für die Auswertung nötigen Bilder aufgenommen. Von jedem

Objektträger wurden 50 Bilder bei 200facher Vergrößerung aufgenommen und mithilfe

des Bildanalyseprogramms (Comet III-Perceptive Instruments Ltd., Bury St Edmunds,

UK) ausgewertet. Als Maß für die DNA-Schädigung der Zellen wurde die Messgröße

„tail intensity in %“ verwendet.

2.2.3.3 BALB/c-3T3-Zelltransformationstest

Neben den zuvor beschriebenen In vitro-Testsystemen, die morphologische Merkmale

einer transformierten Zelle untersuchen, kann mithilfe des Zelltransformationstests direkt

bestimmt werden, ob eine Zelle maligne transformiert ist. Dabei wird das transformie-

rende Potenzial einer chemischen Substanz in murinen BALB/c-3T3-Zellen getestet.

Werden die Zellen mit einer kanzerogenen Substanz behandelt, ändern diese ihr Wachs-

tumsverhalten und verlieren die Zell-Zell-Kontaktinhibition. Aufgrund dessen wachsen

die Zellen übereinander und bilden Foci.

Der Zelltransformationstest wurde von Dr. Michael T. Empl sowie Julia Hausmann und

Jutta Barras-Akhnoukh (Institut für Lebensmitteltoxikologie, Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover) nach dem Protokoll von Sasaki et al. [161] durchgeführt. Für die

Dosisfindung wurde zuerst eine Plattierungseffizienz bestimmt und die benötigten Kon-

zentrationen nach dem Protokoll von Sasaki et al. [161] berechnet. Dafür wurden

BALB/c-3T3-Zellen ausgesät und 24 Std. nach der Aussaat mit verschiedenen Konzent-

rationen der Testsubstanzen behandelt. Nach 72 Std. wurde das Medium gewechselt und

die Zellen fünf weitere Tage kultiviert. An Tag neun erfolgte die Fixierung der Zellen.

Anschließend wurden die Kolonien gefärbt und gezählt. Die Plattierungseffizienz wurde

mithilfe von Formel 2 berechnet:


38

Nach Ermittlung der Koloniebildungseffizienz nach einer einmaligen NO-Häm-Behand-

lung konnten die NO-Häm-Konzentrationen für den Zelltransformationstest berechnet

werden. Die dabei ermittelten IC50- und IC90- Werte lagen bei 1 µM und 5 µM. Daher

wurde für die Durchführung des Transformationstests 0,1/ 1/ 5 und zusätzlich 10 µM NO-

Häm verwendet. Für den Zelltransformationstest wurden 2*104 Zellen in 10 cm-TPP®-

Zellkulturschalen ausplattiert und nach 24 Std. mit der Testsubstanz behandelt. In Tabelle

2.3 sind die verschiedenen Behandlungsgruppen des Transformationstests aufgeführt. Bei

den einmaligen Behandlungen wurde das Medium nach einer 72-stündigen Inkubations-

zeit entnommen und von nun an zweimal wöchentlich gewechselt. Bei mehrmaliger Be-

handlung wurden die Zellen zweimal pro Woche mit der Testsubstanz behandelt. Die

Fixierung der Zellen erfolgte eine Woche nach dem letzten Mediumwechsel an Tag 31.

Nach Färbung der Kolonien wurden diese von zwei unabhängigen Personen gezählt.

Tabelle 2.3: Behandlungsgruppen im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest.

Die Behandlungen erfolgten entweder einmalig oder zweimal/Woche. MCA diente als Positivkontrolle,

NaOH, DMSO/H2O und DMSO als Lösungsmittelkontrollen, 10 Platten/Behandlungsgruppe.

Testsubstanz Konzentration Einmalig 2x/Woche

Medium - X

DMSO 0,1 % X

DMSO/H2O 0,48 % X X

NaOH 30,7 mM X

Hämin in NaOH 10 µM X

Blank (Häm) 0,1 µM X

Blank (Häm) 10 µM X X

NO-Häm 0,1 µM X

NO-Häm 1 µM X

NO-Häm 5 µM X

NO-Häm 10 µM X X

MCA 4 µg/ml X

𝑅𝑒𝑙. 𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑏𝑖𝑙𝑑𝑢𝑛𝑔𝑠𝑒𝑓𝑓𝑖𝑧𝑖𝑒𝑛𝑧 (%):

𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝑔𝑒𝑏𝑖𝑙𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟 𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑛

𝐴𝑛𝑧𝑎ℎ𝑙 𝑔𝑒𝑏𝑖𝑙𝑑𝑒𝑡𝑒𝑟 𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑒𝑛 𝑖𝑛 𝐿𝑆𝐺𝑀 − 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑙𝑒 𝑥 100

Formel 2: Formel zur Errechnung der Plattierungseffizienz


39

2.2.4 Molekularbiologische Methoden

2.2.4.1 DNA-Addukt-Quantifizierung

Die DNA-Addukt-Quantifizierung wurde im Rahmen einer Kooperation von Prof. Shana

J. Sturla, Alessia Stornetta und Peter Villalta an der ETH in Zürich und am Masonic

Cancer Center in Minneapolis durchgeführt.

2.2.4.1.1 Probenaufarbeitung

Für die DNA-Addukt-Quantifizierung wurden HCEC WT- und MGMT – -Zellen mit

75 µM Azaserin für 4 Std. und 24 Std. behandelt. Daraufhin wurden die Zellen abtrypsi-

niert und die Zellpellets für die DNA-Isolierung verwendet. Die genomische DNA wurde

mithilfe des „DNA isolation kit for cells and tissues“ von Roche (Schweiz) extrahiert.

Nach der Extraktion der DNA wurde diese in 0,1 M Ameisensäure (500 µl, pH 2.0) auf-

genommen und mit dem isotopenmarkierten internen Standard O6CD3G (2 pmol) verse-

hen. Die DNA-Hydrolyse erfolgte für 60 Min. bei 80 °C. Nach Abkühlung (RT) der Pro-

ben wurden diese mit 1 N NaOH neutralisiert und mittels der Centrifree®-Ultrafiltrations-

einheit (cutoff MW 30 000 Da) filtriert. Ein Teil der Probe wurde für die Bestimmung des

Adenin-Gehalts mittels „ultra performance liquid chromatography“ (UPLC) verwendet.

Die hydrosylierte DNA wurde mit 0,1 N HCl angesäuert und mittels Festphasenextrak-

tion unter Verwendung einer MCX Ionenaustauscher-Kartusche aufgereinigt. Nach der

Beladung der Kartusche wurden die Proben mit 1 ml 0,1 N HCl und 1 ml Methanol ge-

waschen und mit 1 ml Methanol/5 % Ammoniakwasser eluiert.

2.2.4.2 Addukt-Quantifizierung mittels HRMS/PRM

Die Proben wurden in 5 µl dH2O mit 0,1 % Trifluoressigsäure resuspendiert. Die Flüs-

sigchromatographie erfolgte mithilfe der Dionex RSLCnano UPLC (Thermo Fisher, Dub-

lin, CA). Das Injektionsvolumen der Proben betrug 1 µl und wurde auf eine Kapillarsäule

(75 µm ID, 20 cm Länge, 10 µm orifice) bestehend aus Hydro RP C18 bonded separation

media (Phenomenex, Torrance, CA) geladen. Die Durchflussrate betrug 300 nl/min bei

0 % Acetonitril (ACN) für 3,5 Min., gefolgt von 13 Min. linearem Gradienten bis zu 20 %

ACN. Daraufhin wurde der Gradient in 0,5 Min auf 90 % ACN (900 nl/Min.) erhöht,

1 Min. gehalten und die Säule re-äquilibriert (0 % ACN, 7 Min., 900 nl/Min.).

Die massenspektrometrische Analyse erfolgte nach ESI mithilfe eines LTQ-Orbitrap

Elite (Thermo Scientific, Waltham, MA). Die Einstellungen waren wie folgt: Quellen-


40

spannung 2,2 kV, Kapillartemperatur 350 °C, S-Lens RF Level 50 %. Die Addukte wur-

den mithilfe der HRMS/PRM „high-resolution mass spectrometry and parallel reaction

monitoring“ bei 5 ppm Massengenauigkeit unter Verwendung des Orbitrap-Detektors

nach folgenden Angaben detektiert: O6-MeG bei m/z 166.1 [M + H]+ m/z 134.0461

[M -CH3OH + H]+, D3-O6-MeG bei m/z 169.1 m/z 152.0647 [M -NH3 + H]+, und O6-

CMG bei 210.1 [M + H]+ m/z 152.0567 [Gua + H]+. Dafür wurde eine „Higher-

energy collisional dissociation (HCD)“-Fragmentierung mit einer Kollisionsenergie von

60 % verwendet, für O6-MeG und D3-O6-MeG eine Isolationsbreite von 1,5 amu und für

O6-CMG von 3 amu. Die Daten wurden mit einer Auflösung von 15.000 (bei m/z 400)

und einer tatsächlichen Auflösung von 25.000 (bei m/z 134 und 152) gesammelt und die

Kalibriergerade mithilfe des Isotopen-markierten Standards O6CD3G sowie den Stan-

dards O6-MeG und O6-CMG erstellt. Die Quantifizierung von O6-CMG konnte daher nur

semiquantitativ erfolgen.

2.2.4.3 shRNA-vermitteltes silencing der MGMT

Für die konstitutive shRNA-vermittelte Herunterregulation der MGMT in den HCEC-

Zellen wurde die Methode der lentiviralen Transduktion gewählt. Die dafür benötigten

lentiviralen Transduktionspartikel wurden bei Sigma Aldrich käuflich erworben und ver-

wendet (Tabelle 2.4).

Für die Transduktion wurden 5*103 Zellen pro Well in eine 96-Wellplatte ausgesät. Zur

Steigerung der Transduktionseffizienz erfolgte nach 24 Std. eine Hexadimethrinbromid-

Behandlung (8 µg/ml). Gleichzeitig wurden die lentiviralen Partikel in einer Konzentra-

tion von MOI (multiplicity of infection) = 7 hinzugegeben. Die Inkubation der lentiviralen

Partikel erfolgte für 18 Std. unter den bereits erläuterten Zellkulturbedingungen. Nach

anschließendem Mediumwechsel wurden die Zellen für weitere 24 Std. inkubiert. Die

Selektion der erfolgreich transduzierten HCEC-Zellen erfolgte mit 0,5 µg/ml Puromycin-

haltigem Zellkulturmedium. Nach mehrmaliger Puromycin-Behandlung der Zellen und

Absterben der nicht-transduzierten HCEC-Zellen, wurde eine Einzelzellklonierung mit-

hilfe der seriellen Verdünnung durchgeführt. Nach dem Ablösen der Zellen wurden diese

in einer 96-Wellplatte soweit verdünnt, bis schlussendlich nur noch eine Zelle pro Well

vorhanden war. Diese wurde so lange kultiviert, bis die Zellen im Well subkonfluent wa-

ren und in ein größeres Wellformat überführt werden konnten. Die dadurch isolierten

homogenen Zellkulturklone wurden dann zur Testung der MGMT-Aktivität sowie der

MGMT-Expression herangezogen, um die für die weiteren Experimente benötigten


41

MGMT-knockdown-Zellen zu identifizieren. In beiden Experimenten wurden neun

Klone sowie der WT getestet. Dabei wurden von jedem der zuvor verwendeten shRNA-

Konstrukte 1-2 Klone ausgewählt.

Tabelle 2.4: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten lentiviralen Kontrukte.

(Mission® shRNA transduction particles-Sigma Aldrich, Schnelldorf) -Genaue Sequenzangaben zu den

Konstrukten können mithilfe der angegebenen Bestellnummer auf der Herstellerseite eingesehen werden.

Zielgen Bestellnummer Bezeichnung Virustiter (TU/ml)

MGMT TRCN0000022364 shRNA-1 1,7 *107

MGMT TRCN0000022365 shRNA-2 1,5 *107

MGMT TRCN0000022366 shRNA-3 2,4 *107

MGMT TRCN0000022367 shRNA-4 1,9 *107

MGMT TRCN0000022368 shRNA-5 2,1 *107

2.2.4.4 Aktivitätsbestimmung der MGMT

Die Aktivitätsanalyse der MGMT-knockdown Klone wurde von der Arbeitsgruppe um

Prof. Dr. Markus Christmann -Institut für Toxikologie des Universitätsklinikums Mainz-

durchgeführt. Dabei wurde nach dem bereits von Preuss et al. [162] und Christmann et

al. [163] beschriebenen Protokoll vorgegangen. Tiefgefrorene Zellpellets wurden homo-

genisiert und die Proteinmenge mithilfe der BCA-Methode bestimmt. Danach wurde die

MGMT-Aktivität ermittelt, indem der Transfer von radioaktiv-markiertem O6-Methylgu-

anin von einem DNA-Substrat zum MGMT-Protein gemessen wurde [164]. Die MGMT-

Aktivität wurde in fmol [3H]-Methyl pro mg Gesamtprotein dargestellt. HelaS3-Zellen

dienten als Positivkontrolle.

2.2.4.5 MGMT-Expressionsanalyse mittels Real time-qPCR

Eine weitere Methode zur Sicherstellung der MGMT-Herunterregulation der HCEC-Zel-

len stellte die MGMT-Expressionsanalyse mittels Real time-qPCR (RT-qPCR) dar. Diese

wurde ebenfalls von der Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Markus Christmann am Universi-

tätsklinikum Mainz durchgeführt. Dabei wurde nach dem von Roos et al. [165] beschrie-

benen Protokoll vorgegangen.

Die RNA aus den Zellpellets wurde mithilfe des RNA II Isolation Kit (Macherey und

Nagel, Düren) isoliert. Daraufhin wurde die RNA-Konzentration mithilfe des Nano-

Drop 1000 bestimmt und die RNA in cDNA umgeschrieben (Verso cDNA Kit, Thermo

Scientific, Darmstadt). Für die Durchführung der RT-qPCR wurde das SensiMix™ SYBR

Green & Fluorescein Kit (Bioline, London, UK) und das CFX96 Real-Time PCR Detek-


42

tionssystem (Biorad, München) verwendet. Die Daten wurden mithilfe der CFX Mana-

ger™-Software ausgewertet und die Expression auf GAPDH und ß-Actin (ACTB) norma-

lisiert und relativ zum WT dargestellt. In der folgenden Tabelle 2.5 sind die verwendeten

Primer aufgelistet.

Tabelle 2.5: Auflistung der für die RT-qPCR verwendeten sense- und antisense-Primer

Protein Primer (Sense/Antisense)

ß-Actin (ACTB) Sense-5’-TGGCATCCACGAAACTACC-3’

Antisense-5’-GTGTTGGCGTACAGGTCTT-3’

GAPDH Sense-5’-CATGAGAAGTATGACAACAG-3’

Antisense-5’-ATGAGTCCTTCCACGATA-3’

MGMT Sense-5’-AATCACTTCTCCGAATTTCAC-3’

Antisense-5’-CTCTTCACCATCCCGTTT-3’ sense: Vorwärts-Primer, antisense: Rückwärts-Primer

2.2.5 Biochemische Methoden

2.2.5.1 Proteinexpressionsanalyse-Western Blot

Die Proteinexpressionsanalyse erfolgte in dieser Studie mithilfe des Western Blot-Ver-

fahrens. Dabei wurde grundlegend nach der Methode von Towbin et al. [166], die Ende

der 70er Jahre veröffentlicht, und vor kurzem von Wang et al. [167] beschrieben wurde,

verfahren. Das Prinzip dieser Methode beruht darauf, dass Proteine aus einem Proteinge-

misch zuerst mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)

der Größe nach aufgetrennt werden. Daraufhin folgt das Übertragen auf eine Trä-

germembran, gefolgt von der Detektion der Zielproteine mittels Primär- und HRP-gekop-

pelten Sekundärantikörpern im Rahmen einer Lumineszenzreaktion [168]. In dieser Stu-

die wurde das Protokoll von Wang et al. [167] unter optimierten SDS-Page-sowie Trans-

ferbedingungen durchgeführt. Das Einlaufen der Proben (25 µg/Lane) in das Sammelgel

erfolgte bei 100 V für 30 Min., die Auftrennung der Proteine in 10 %-igem Trenngel bei

130 V für 100 Min. Der Transfer der Proteine aus dem Acrylamidgel auf die Nitrocellu-

lose-Membran wurde bei 100 V für 1 Std. und 4 °C durchgeführt. Abgesehen davon wur-

den Proteinextraktion, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Proteintransfer nach dem

bereits ausführlich beschriebenen Protokoll in der Dissertation von Michael T. Empl

(2013) durchgeführt [169]. In der nachfolgenden Tabelle 2.6 sind die verwendeten Anti-

körper und deren Verdünnungen dargestellt.


43

Tabelle 2.6: Die verwendeten Primär-sowie Sekundärantikörper, deren Verdünnungen und verwendete An-

tikörperpuffer

Protein Antikörper Verdünnung Puffer

3-Nitrotyrosin

(3-NT)

sc-32757 1:1000 5 % iger Magermilch-

Blocking-Puffer in

TBS-Tween 0,2 %

Hämoxygenase-1

(HO-1)

5061S

1:1000 5 % iger Magermilch-

Blocking-Puffer in

TBS-Tween 0,2 %

O6-Methylguanin-

DNA Methyltransferase

(MGMT)

MAB16200


Blocking-Puffer in

TBS-Tween 0,2 %

ß-Actin (ACTB) (1) sc-516102-

HRP


Blocking-Puffer in

TBS-Tween 0,2 %

ß-Actin (ACTB) (2) sc-47778 1:2000 5 % iger Magermilch-

Blocking-Puffer in

TBS-Tween 0,2 %

Die Proteinexpressionsanalysen zur MGMT-Expression in den MGMT-knockdown-Zel-

len nach der lentiviralen Transduktion im ersten Teil der Studie wurde durch die Arbeits-

gruppe um Prof. Christmann am Universitätsklinikum Mainz durchgeführt. Die verwen-

deten Antikörper sind ebenfalls in der oben dargestellten Tabelle aufgeführt.

2.2.5.2 Immunzytochemie

Das Prinzip der Immunzytochemie ist, dass mithilfe von Antikörpern intrazelluläre, aber

auch extrazelluläre, membrangebundene Strukturen nachgewiesen werden können. Dafür

bindet ein Primärantikörper an einem spezifischen Epitop und wird durch einen Sekun-

därantikörper, der am Primärantikörper bindet, mittels Fluoreszenz sichtbar gemacht. In

dieser Studie wurde die immunzytochemische Färbung durchgeführt, um die HCEC-Zel-

len zu charakterisieren und nachzuweisen, dass es sich bei dieser Zelllinie um Epithelzel-

len handelt.

2.2.5.2.1 Ausdifferenzierung der HCEC-Zellen

Da es sich bei den HCEC-Zellen um epitheliale Vorläuferzellen handelt [150], mussten

diese vor Beginn der immunzytochemischen Färbung in vollständig differenzierte

Epithelzellen umgewandelt werden. Dabei wurde vorgegangen wie bereits von Roig et

al. [150] beschrieben. Es wurden 5*103 Zellen auf Deckgläschen in 24-Wellplatten aus-

gesät und nach Erreichen der Subkonfluenz für max. 12 Tage mit 5 µM BIO (Engl.: 6-

Bromoindirubin-3-oxime) behandelt. Zudem enthielt das Nährmedium nur 1,25 ng/ml


44

hEGF und 0,1 % Cosmic Calf Serum. Nach 12 Tagen waren die Zellen ausdifferenziert

und konnten für die Immunzytochemie verwendet werden.

2.2.5.2.2 Fixierung der Zellen

Zur Erhaltung der Zellmorphologie mussten diese zuerst auf den Deckgläschen fixiert

werden. Dafür wurden die Zellen mit eiskaltem Methanol für 10 Min. bei – 20 °C behan-

delt. Danach wurden die Zellen mit PBS für 5 Min. rehydriert und anschließend mit der

Paraformaldehyd-haltigen Fixierlösung für 20 Min. bei RT fixiert. Vor dem Blockieren

und Färben der Zellen wurden diese mehrmals mit PBS gewaschen, um das Paraformal-

dehyd vollständig zu entfernen.

2.2.5.2.3 Antikörperfärbung

Nach der 45-minütigen Blockade von unspezifischen Bindungsstellen mit 5 % Mager-

milch bei RT wurden die Primärantikörper auf die Zellen gegeben. Diese wurden, wie in

der Tabelle 2.7 beschrieben, verdünnt und für eine Stunde bei RT inkubiert. Nach der

Inkubation und dem dreimaligen Waschen der Zellen mit PBS-Tween (0,05 %) wurden

die Sekundärantikörper hinzugegeben. Die Inkubationszeit der Sekundärantikörper be-

trug 45 Min. und wurde bei RT und im Dunkeln durchgeführt. Auch nach diesem Färbe-

schritt wurden die Zellen erneut gewaschen, gefolgt von einer Zellkernfärbung mittels

Hoechst-Farbstoff (1:15000 verdünnt) für 5 Min. bei RT. Anschließend wurden die Ob-

jektträger mithilfe von Eindeckmedium auf einem Objektträger fixiert und die fertigen

Präparate mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops bei 200 und 400facher Vergrößerung

ausgewertet.

Tabelle 2.7: Für die Immunzytochemie verwendete Primär- und Sekundärantikörper, deren Verdünnungen

und Antikörperpuffer

Primärantikörper Artikelnummer Verdünnung Puffer

smooth muscle

actin (SM Actin)

M0851

1:250 1 % BSA, 0,05 %

Tween 20 in PBS

Zytokeratin Z0622 1:500 1 % BSA, 0,05 %

Tween 20 in PBS

Sekundärantikörper

Alexa Fluor 488 A11001 1:1500 1 % BSA, 0,05 %

Tween 20 in PBS

Alexa Fluor 568 A11036 1:1000 1 % BSA, 0,05 %

Tween 20 in PBS

Hoechst 33342 62249 1:15000 PBS


45

2.2.6 Herstellung und Analytik von NO-Häm

2.2.6.1 NO-Häm-Herstellung

Die Nitrosoverbindung NO-Häm wurde nach dem Protokoll von Jankiewicz et al. [170]

hergestellt. Dafür wurde Hämin, gelöst in einem DMSO/H2O-Gemisch, mithilfe von Nat-

riumdithionit zu Häm reduziert. Durch Zugabe von Natriumnitrit entstand NO, welches

an Häm band und zur Bildung von NO-Häm führte. Vergleichend zum NO-Häm wurde

in jedem In vitro-Experiment die Kontrollsubstanz Häm (Blank) mitgeführt. Dafür wurde

dieselbe Reaktion, wie bereits oben beschrieben, durchgeführt, jedoch ohne Zugabe von

Natriumnitrit. Dadurch wurde lediglich das Hämin zu Häm reduziert. Alle dafür nötigen

Arbeitsschritte wurden in einer Hypoxiekammer mit einem Sauerstoffgehalt von max.

0,2 % durchgeführt. Der Sauerstoff wurde aus allen benötigten Lösungen 24 Std. vor Be-

ginn der Arbeiten durch stetiges Rühren in der Hypoxiekammer entfernt. Zudem wurde

unter möglichst UV-freien Bedingungen gearbeitet, um einen Zerfall des NO-Häms durch

UV-Strahlung zu verhindern. Das unter diesen Bedingungen hergestellte NO-Häm (und

Häm) wurde nach einer Reaktionszeit von ca. 20 Min. innerhalb der Hypoxiekammer in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und danach bei -80 °C gelagert.

2.2.6.2 UV/Vis-Spektroskopie

Zur Verifizierung der Identität von NO-Häm und Häm wurde mithilfe der UV/Vis-Spekt-

roskopie das spezifische Absorptionsspektrum der Substanzen aufgezeichnet. Dafür

wurde die Probe im Lösungsmittel verdünnt, in gasdichte Küvetten mit Deckel überführt

und das Spektrum von 300 bis zu 700 nm mithilfe eines Plattenlesegerätes aufgezeichnet.

Das Lösungsmittel wurde als Blank von allen aufgezeichneten Werten abgezogen.

2.2.6.3 NO-Häm-Verifizierung und Konzentrationsbestimmung mittels

Stickstoffmonoxid Analyzer

Aufgrund des fehlenden Standards und Extinktionskoeffizienten ließ sich die Konzentra-

tion der hergestellten NO-Häm-Lösung mithilfe der UV/Vis-Spektroskopie nicht bestim-

men. Dafür wurde der Stickstoffmonoxid Analyzer (NOA) verwendet. Zur Quantifizie-

rung von NO-Häm wurde nach dem bereits von Kuhnle et al. [171] beschriebenen Ver-

fahren mithilfe von Natriumnitrit eine Kalibriergerade erstellt. Natriumnitrit wurde in

ddH2O gelöst und verschiedene Verdünnungen in die Reaktionskammer des NOAs inji-

ziert. Diese enthielt ein Reaktionsgemisch bestehend aus Essigsäure und Kaliumiodid,


46

das Natriumnitrit zu NO reduziert. Das NO wurde daraufhin durch das inerte Gas Stick-

stoff zum NOA transportiert, wo es in einer Reaktionskammer mit Ozon reagierte. Die

dabei entstandenen angeregten Stickstoffdioxid-Moleküle gelangten wieder in den

Grundzustand, indem sie Licht im roten bis infraroten Spektralbereich emittierten (For-

mel 3) [172]. Das so gemessene Signal konnte durch die Software eDAQ-Chart aufge-

zeichnet und durch Ermittlung der „area under curve“ ausgewertet werden.

Die Messung des NO-Häms erfolgte ebenfalls mithilfe des NOAs, jedoch wurde hier nach

dem Protokoll von Salgado et al. [173] verfahren. Das in der Reaktionskammer enthaltene

Kaliumhexacyanoferrat(III) spaltete spezifisch die Bindung von NO und dem Eisen des

Häm-Komplexes, das dann, wie bereits beschrieben, mit Ozon reagierte und zur Emission

von Licht führte. Die Errechnung der NO-Häm-Konzentration erfolgte daraufhin mit der

zuvor erstellten Natriumnitrit-Kalibriergeraden.

2.2.7 Statistik

Alle Rohdaten wurden vor der statistischen Auswertung mithilfe von Excel 2010 doku-

mentiert. Nach der Durchführung der verschiedenen Versuche wurde mithilfe von Excel

der Mittelwert einer jeden Triplikatbestimmung (n) errechnet und diese im Statistikpro-

gramm GraphPad Prism zusammengeführt. Die Berechnung der Standardabweichung,

des Variationskoeffizienten und die darauffolgenden statistischen Auswertungen und Er-

stellung der Graphen gelangten mithilfe von GraphPad Prism.

Die statistische Auswertung erfolgte je nach Normalverteilung und n-Zahl entweder

durch den nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test mit anschießendem Dunn´s Post-

hoc-Test, dem Mann-Whitney-Test, dem t-test mit Welch-Korrektur oder dem One-Way

ANOVA gefolgt vom Tukey’s multiple comparison-Test. Signifikanzangaben waren wie

folgt: *: p < 0,5; **: p < 0,01; ***: p <0,001; ****: p < 0,0001.

NO + O3 NO2* + O2 (NO2

*= Angeregtes Stickstoffdioxid-Molekül)

NO2* NO2 + h⋅ν

Formel 3: Reaktionsgleichung von NO und Ozon unter Bildung des angeregten Stickstoff-Moleküls

Ergebnisse

47

3 Ergebnisse

3.1 Die Rolle der MGMT in der O6-CMG-Reparatur

3.1.1 Immunzytochemische Charakterisierung der HCEC-Zellen

3.1.1.1 Ausdifferenzierung der HCEC WT-Zellen

Aufgrund der Fibroblasten-ähnlichen Struktur der in dieser Studie verwendeten Progeni-

tor-Epithelzelllinie HCEC, sollte in einem ersten Schritt untersucht werden, ob es sich bei

diesen Zellen tatsächlich um Epithelzellen handelt. Die Ausdifferenzierung der Progeni-

torzelllinie HCEC WT erfolgte durch eine 12-tägige BIO-Behandlung.

A

B

C

D

Abbildung 3-1: Morphologische Veränderungen der HCEC WT-Zellen während des Ausdifferenzierungs-

prozesses mit BIO.

A: Fibroblasten-ähnliche Strukturen der HCEC WT-Zellen vor der Ausdifferenzierung; B: im Vergleich

dazu die typische Epithelzellstruktur der CaCo2-Zellen; C: HCEC WT-Zellen nach 6-tägiger Ausdifferen-

zierungszeit mit BIO; D: nach 12-tägiger Ausdifferenzierungszeit mit BIO. Alle Bilder wurden mithilfe

eines Lichtmikroskops in 100facher-Vergrößerung aufgenommen.

Ergebnisse

48

Vor der Ausdifferenzierung wiesen die Epithelzellen noch eine Fibroblasten-ähnliche

Struktur auf (Abbildung 3-1A). Vergleichend dazu ist in Abbildung 3-1B die Epithelzell-

linie CaCo-2 dargestellt. Nach 6-tägiger BIO-Behandlung zeigten die Zellen bereits eine

eindeutige Veränderung der Zellmorphologie, diese verstärkte sich nach sechs weiteren

Tagen BIO-Behandlung und wies nun dieselbe Morphologie auf wie die Epithelzelllinie

CaCo-2 (Abbildung 3-1 C und D).

3.1.1.2 Immunzytochemische Färbung der HCEC WT-Zellen

Nach der Ausdifferenzierung der Progenitorzellen wurde die Expression des Epithelzell-

markers Zytokeratin und des Fibroblastenmarkers smooth muscle actin (SM-Actin) im-

munzytochemisch untersucht. In Abbildung 3-2 sind jeweils die Überlagerungsbilder der

drei verschiedenen Fluoreszenzanregungen gezeigt.

A

B

C

D

Abbildung 3-2: Immunzytochemische Färbung der HCEC WT-Zellen in der exponentiellen Wachstums-

phase vor der Ausdifferenzierung (A) sowie nach 12-tägiger Ausdifferenzierungszeit mit BIO (B).

Die Zelllinie BALB/c diente als Positivkontrolle für den Fibroblastenmarker SM-Actin (C), die Zelllinie

HCT116 als Positivkontrolle für den Epithelzellmarker Zytokeratin (D). Dargestellt sind die Überlage-

rungsbilder aller verwendeten Fluoreszenzanregungen. Zytokeratin: rot, SM-Actin: grün, Zellkern: blau.

Ergebnisse

49

Die HCEC WT-Zellen sind bereits vor der Ausdifferenzierung mit BIO Zytokeratin-po-

sitiv (rot) sowie SM-Actin-negativ (grün) (Abbildung 3-2A). Die vollständige Ausdiffe-

renzierung der Zellen führte zu keiner Änderung der Zytoskelett-Strukturen (Abbildung

3-2B).

Die Fibroblasten-Zelllinie BALB/c-3T3 diente als Positivkontrolle für SM-Actin (Abbil-

dung 3-2C), die Epithelzelllinie HCT116 als Positivkontrolle für Zytokeratin (Abbildung

3-2D).

3.1.2 shRNA-vermitteltes MGMT-silencing in HCEC-Zellen

Die trotz ihrer Fibroblasten-ähnlichen Struktur identifizierten Epithelzellen HCEC WT

wurden mithilfe von lentiviralen Partikeln transduziert, um durch das Prinzip der RNA-

Interferenz eine MGMT-defiziente Zelllinie zu generieren.

3.1.2.1 MGMT-Expressionsanalyse in HCEC WT- und MGMT --Zellen

Um nach der Transduktion MGMT-knockdown Zellen zu identifizieren, wurde zuerst die

MGMT-Expression mittels RT-qPCR in neun verschiedenen Klonen ermittelt. Die Ex-

pression war im Vergleich zur WT-Linie (auf 100 % gesetzt) in allen Klonen herunterre-

guliert. Klon 9 zeigte mit einer 30 %-igen MGMT-Expression im Vergleich zum WT die

stärkste Herunterregulation der MGMT-Expression (Abbildung 3-3).

Abbildung 3-3: MGMT-Expressionsanalyse in neun HCEC-Klonen, in denen die MGMT-Expression her-

unterreguliert wurde.

0

20

40

60

80

100

120

WT Klon 1 Klon 2 Klon 3 Klon 4 Klon 5 Klon 6 Klon 7 Klon 8 Klon 9

MG

MT-

Exp

ress

ion

[%]

Ergebnisse

50

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD in % relativ zum WT. Die Messung erfolgte mittels RT-qPCR und

im technischen Duplikat; daher wurde keine statistische Auswertung vorgenommen.

3.1.2.2 Aktivitätsbestimmung der MGMT in HCEC WT- und HCEC

MGMT - -Zellen

Die neun Klone wurden auch bezüglich ihrer MGMT-Aktivität untersucht. Die Darstel-

lung der MGMT-Aktivität erfolgte in fmol transferiertes radioaktiv-markiertes Substrat

zur MGMT pro mg Gesamtprotein. Die Positivkontrollzelllinie HelaS3 sowie der zur

Kontrolle mitgeführte WT wiesen jeweils eine hohe MGMT-Aktivität auf. Bei fast allen

untersuchten Klonen hingegen zeigte sich eine verringerte Aktivität der MGMT. Klon 9

wies mit 0,5 fmol/mg Protein die mit Abstand geringste MGMT-Aktivität auf. Aufgrund

der Ergebnisse der Expressionsanalyse sowie der Aktivitätsbestimmung der MGMT

wurde Klon 9 als MGMT-knockdown für die folgenden Experimente verwendet und von

da an als HCEC MGMT – bezeichnet (Tabelle 3.1).

Tabelle 3.1: Darstellung der MGMT-Aktivität in fmol/mg Protein nach der shRNA-Transduktion.

Getestet wurden neun transduzierte Klone sowie der WT und die Positivkontrolle HelaS3. Die Messung

erfolgte im technischen Duplikat und dargestellt ist der Mittelwert ± SD.

Klonnummer/

Kontrollen

MGMT-Aktivität in

fmol/mg Protein

SD

1 133,6 96,7

2 60,6 1,1

3 103,4 8,0

4 72,7 5,6

5 70,1 0,9

6 69,8 4,6

7 37,8 5,0

8 165,5 51,4

9 0,5 0,8

WT 128,6 11,2

HelaS3 367,9 0

3.1.3 Charakterisierung der HCEC WT- und HCEC MGMT – -Zellen

Um durch den Transduktionsprozess induzierte morphologische Unterschiede auszu-

schließen, wurden die Zelllinien HCEC WT und HCEC MGMT – vor Beginn der nach-

folgenden Experimente charakterisiert.

Ergebnisse

51

3.1.3.1 Erstellung der Wachstumskurven

Die Erstellung der Wachstumskurven beider Zelllinien zeigte, dass kein Unterschied im

Wachstumsverhalten oder bei der Verdopplungszeit bestand. Die errechnete Verdopp-

lungszeit lag bei den HCEC WT-Zellen sowie bei den HCEC MGMT --Zellen bei ca. 22

Std. (Abbildung 3-4).

Abbildung 3-4: Wachstumskurven der Zelllinien HCEC WT und HCEC MGMT -.

Dargestellt wird jeweils die Zellzahl ± SD über die Zeit [Std.] von drei unabhängigen Experimenten.

3.1.3.2 Bestimmung der Sättigungsdichte

Die Ermittlung der Sättigungsdichte und der damit nachzuweisenden Zell-Zell-Kontak-

tinhibition erfolgte durch die Zählung der Zellen nach Erreichen der Konfluenz und vier

Tage danach. Die HCEC WT-Zellen sowie die HCEC MGMT --Zellen wiesen bei beiden

Zählungen dieselbe Zellzahl auf, d.h. die Zell-Zell-Kontaktinhibition blieb erhalten (Ab-

bildung 3-5).

Ergebnisse

52

Abbildung 3-5: Ermittlung der Sättigungsdichte zur Prüfung der Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kontak-

tinhibition.

Dargestellt ist die Zellzahl/cm2 der HCEC WT und HCEC MGMT --Zellen nach Erreichen der Konfluenz

(1. Zählung) und vier Tage später (2. Zählung) als Mittelwert ± SD von vier unabhängigen Experimenten.

3.1.3.3 Prüfung des verankerungsunabhängigen Wachstums von HCEC

WT- und HCEC MGMT --Zellen im GILA-Assay

Mithilfe des GILA-Assays wurden die HCEC WT und HCEC MGMT --Zellen auf mög-

liches verankerungsunabhängiges Wachstum getestet. Dargestellt ist das Lumineszenz-

signal [RLU] des zellulären ATPs, welches äquivalent zur Zellzahl ist. Beide HCEC-

Zelllinien zeigten keinen Anstieg des zellulären ATPs und dadurch kein verankerungsun-

abhängiges Wachstum nach 120 Std. Kultivierung auf den low attachment-Platten (Ab-

bildung 3-6). HT29-Zellen dienten als Positiv- und BALB/c-Zellen als Negativkontrolle.

Ergebnisse

53

Abbildung 3-6: Prüfung des verankerungsunabhängigen Wachstums von HCEC WT- und MGMT --Zellen

in low attachment-Platten.

Dargestellt ist das Lumineszenzsignal [RLU] 24 Std. und 120 Std. nach Aussaat der Zellen. BALB/c-Zellen

dienten als Negativkontrolle, HT29-Zellen als Positivkontrolle. Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen

Experimenten. Die statistische Auswertung erfolgte durch den unpaired t-test und der Welch´s Korrektur;

**: p < 0,01; ***: p <0,001.

3.1.4 Azaserin-induzierte Zytotoxizität in HCEC WT- und MGMT --

Zellen

Um die Rolle des DNA-Reparaturenzyms MGMT in der Reparatur des DNA-Adduktes

O6-CMG zu ermitteln, wurden HCEC WT-sowie MGMT-defiziente Zellen für 4 Std. so-

wie 24 Std. mit Azaserin behandelt. Azaserin zählt zu den carboxymethylierenden Sub-

stanzen, die hauptsächlich zur Bildung von O6-CMG-Addukte führen [174]. Nach der

Behandlung wurden die die Azaserin-induzierte Zellviabilität und Genotoxizität unter-

sucht sowie die O6-CMG -Addukte quantifiziert.

In Abbildung 3-7 sind die Ergebnisse der Zellviabilitätsanalyse dargestellt. Die Zellvia-

bilität wurde mithilfe des CellTiterGlo®-Luminescent Cell Viability-Assays bestimmt.

Eine 4-stündige Azaserin-Behandlung führte in keiner der beiden Zelllinien zu einem sig-

nifikanten Verlust der Zellviabilität. Nach 24 Std. hingegen konnte ein konzentrationsab-

hängiger Verlust der Zellviabilität beobachtet werden. MGMT-defiziente Zellen reagier-

ten nach 24 Std. zudem bei Konzentrationen höher als 75 µM signifikant empfindlicher

auf Azaserin als die WT-Zellen. Der errechnete IC50-Wert nach 24 Std. Behandlung lag

Ergebnisse

54

bei 546 µM im Fall der WT-Zellen, bei den MGMT-defizienten Zellen hingegen bei nur

143 µM.

Abbildung 3-7: Darstellung der konzentrationsabhängigen Azaserin-induzierten Zytotoxizität

in HCEC WT und HCEC MGMT --Zellen nach 4 Std. und 24 Std. Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD

im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle aus vier unabhängigen Experimenten. Die statistische Auswer-

tung erfolgte durch Two-Way ANOVA mit Bonferroni´s multiple comparisons test; **: p< 0,01; ***: p<

0,001 (WT vs. MGMT -).

3.1.5 Azaserin-induzierte Genotoxizität in HCEC WT- und HCEC

MGMT--Zellen

Die Zellen wurden ebenfalls bezüglich der Azaserin-induzierten Genotoxizität unter-

sucht. Diese wurde mittels alkalischer Einzelzellelektrophorese, dem Comet-Assay, er-

mittelt.

Abbildung 3-8 zeigt repräsentativ, welche Auswirkung eine 75 µM Azaserin-Behandlung

für 4 Std. und 24 Std. auf die Zellen hatte. Bereits nach 4 Std. veränderte sich die kreis-

runde Form der MGMT-defizienten Zellen zu einer kometenartigen Struktur, die nach

24 Std. nochmals verstärkt wurde.

Die Auswertung der Schweifintensitäten erfolgte mit der Software CometAssay III und

ist in Abbildung 3-9 dargestellt. Die Azaserin-Behandlung führte bei den WT-Zellen so-

wohl nach 4 Std. als auch nach 24 Std. zu keiner signifikanten Veränderung der Schwei-

Ergebnisse

55

fintensitäten. Die MGMT-defizienten Zellen hingegen wiesen bereits nach 4 Std. im Ver-

gleich zum WT einen signifikanten Anstieg der Schweifintensität auf, die nach 24 Std.

nochmals zunahm.

0 Std. 4 Std. 24 Std.

HCEC WT

HCEC MGMT -

Abbildung 3-8: Darstellung der Azaserin-induzierten Veränderung repräsentativer Zellen zur typischen Ko-

metenform bei vorliegender Genotoxizität.

Abbildung 3-9: Darstellung der im Comet-Assay ermittelten Schweifintensitäten [%] Azaserin-behandelter

HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen.

HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen wurden nach 4 Std. und 24 Std. bezüglich der Azaserin-induzierten

Genotoxizität untersucht. Dargestellt werden die aus mindestens fünf unabhängigen Experimenten ermit-

telten Mediane der Schweifintensität [%] und die daraus errechneten Mittelwerte der Mediane. Die statis-

tische Auswertung erfolgte durch den Mann Whitney-Test; **: p< 0,01.

Ergebnisse

56

3.1.6 DNA-Addukt-Quantifizierung in Azaserin-behandelten HCEC WT-

und HCEC MGMT --Zellen

Die Azaserin-induzierten DNA-Addukte O6-MeG und O6-CMG wurden mittels hochauf-

lösender Massenspektrometrie (HRMS/PRM) quantifiziert. Dafür wurden die Zellen für

4 Std. sowie 24 Std. mit 75 µM Azaserin behandelt. Beide Zelllinien wiesen bereits ohne

Azaserin-Behandlung ein sehr geringes Basallevel an O6-MeG-Addukten auf (Abbildung

3-10A). Nach 4 Std. konnte kein nennenswerter Anstieg in der Zahl der detektierten O6-

MeG-Addukte in WT-Zellen beobachtet werden, wohingegen in MGMT-defizienten Zel-

len nach 24 Std. wesentlich mehr O6-MeG-Addukte detektiert wurden. Das Azaserin-in-

duzierte Addukt O6-CMG konnte weder nach 4 Std. noch nach 24 Std. in WT-Zellen

detektiert werden. Verglichen dazu induzierte Azaserin bereits nach 4 Std. einen Anstieg

der O6-CMG-Addukte in den MGMT-defizienten Zellen (Abbildung 3-10B). Nach 24

Std. stieg die O6-CMG-Konzentration sogar bis zu 55 fmol O6-CMG/µg DNA an. Da es

sich hierbei jedoch um vorläufige Daten handelt und die Messung nur in zwei unabhän-

gigen Experimenten erfolgte, konnte keine statistische Auswertung durchgeführt werden.

Im Rahmen der Methodenentwicklung wurden die DNA-Addukte ebenfalls mittels LC-

ESI-MS/MS quantifiziert (Anhang-Abbildung 6-1). Dabei zeigten sich ähnliche Ergeb-

nisse wie bei der hochauflösenden Massenspektrometrie. MGMT-defiziente Zellen wie-

sen mehr O6-CMG-Addukte nach 4 Std. und 24 Std. auf als HCEC WT-Zellen. Jedoch

wurden ebenfalls in HCEC WT-Zellen geringe Mengen an O6-CMG-Addukten detektiert.

Aber auch diese Messung konnte nicht statistisch ausgewertet werden, da sie nur einmalig

erfolgte.

Ergebnisse

57

A

B

Abbildung 3-10: Vorläufige Daten zur O6-MeG-(A) und O6-CMG-Addukt-Quantifizierung (B) mittels

HRMS/PRM in HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen nach 4- und 24-stündiger Azaserin-Behandlung

(75 µM).

Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD der Adduktmenge in fmol Addukt/µg DNA nach 4 Std. und 24 Std.

von zwei unabhängigen Experimenten. Eine statistische Auswertung konnte im Fall dieser vorläufigen Da-

ten (n=2) nicht erfolgen.

3.1.7 MGMT-Proteinexpressions- und Aktivitätsanalyse in HCEC WT-

Zellen nach Azaserin-Behandlung

Basierend auf den Daten der DNA-Addukt-Quantifizierung wurden in den HCEC WT-

Zellen, trotz ihrer hohen MGMT-Expression und -Aktivität, nach der Azaserin-Behand-

lung noch immer O6-MeG- und O6-CMG-Addukte (LC-ESI-MS/MS-Messung-siehe An-

Ergebnisse

58

hang) nachgewiesen. Daher wurde die MGMT-Aktivität und -Expression nach der Be-

handlung mit Azaserin erneut untersucht, um festzustellen, ob die in den HCEC WT-

Zellen vorhandene Menge an MGMT-Enzym genügte, um alle Azaserin-induzierten

Addukte zu reparieren.

Abbildung 3-11: A: MGMT-Aktivitätsanalyse der Azaserin-behandelten HCEC WT-Zellen

nach 4 Std., 24 Std. und 24-stündiger Regenerationszeit (24 rec.). Dargestellt sind die Mittelwerte ± SD

von drei unabhängigen Experimenten. Die statistische Auswertung erfolgte durch One-Way-ANOVA mit

Tukey´s Post-hoc-Test; *: p < 0,05 vs. 0 Std.; ****: p < 0,0001 vs. 0 Std.; ###: p < 0,001 vs. 24 Std. B:

Proteinexpressionsanalyse mittels Western Blot der Azaserin-behandelten HCEC WT-Zellen nach 4 Std.,

24 Std. und 24-stündiger Regenerationszeit (24 rec.). ACTB diente als Ladekontrolle.

In Abbildung 3-11A ist die MGMT-Aktivität der WT-Zellen nach einer 75 µM-Azaserin-

Behandlung dargestellt. Die Aktivität des Reparaturenzyms nahm nach 4 Std. nicht ab,

nach 24 Std. hingegen sank sie signifikant im Vergleich zu den unbehandelten Zellen

(0 Std.). Nach 24-stündiger Regenerationszeit (24 rec.) nahm die Aktivität der MGMT

im Vergleich zu den Zeitpunkten 0 Std. und 24 Std. wieder signifikant zu.

A

B

A

Ergebnisse

59

Dasselbe Ergebnis ist auch auf der Proteinexpressionsebene beobachtet worden. 24 Std.

nach der Azaserin-Behandlung wurde sichtbar weniger Protein detektiert, wohingegen

nach 24 Std. Regenerationszeit die Expression wieder zunahm (Abbildung 3-11B).

3.2 Auswirkungen von NO-Häm auf HCEC-Zellen

3.2.1 NO-Häm-Synthese und -Verifizierung

3.2.1.1 Synthese und Quantifizierung

Die NO-Häm-Synthese wurde nach dem Protokoll von Jankiewicz et al. [170] durchge-

führt. Nach der Reduktion des Hämins zu Häm erfolgte die Zugabe von Natriumnitrit

(NaNO2). Aufgrund fehlender Angaben zur NaNO2-Konzentration im Protokoll von Jan-

kiewicz et al. [170], wurden für die NO-Häm-Synthese verschiedene NaNO2-Konzentra-

tionen verwendet. Mithilfe des NOAs wurde dann ermittelt, welche dieser Konzentratio-

nen ausreicht, um das Häm vollständig in NO-Häm umzuwandeln. Für diese Messung

wurde die Methode von Salgado et al. [173] verwendet, bei der Kaliumhexacyanofer-

rat(III) spezifisch die Bindung zwischen NO und dem Eisen des Häms spaltet. Mithilfe

des NOAs wurde daraufhin das abgespaltene NO durch die Reaktion mit Ozon gemessen.

Um sicherzustellen, dass es sich bei dem detektierten Signal nur um NO-Häm handelt,

wurden zuerst alle Komponenten, die für die NO-Häm-Synthese verwendet wurden, auf

eventuelle falsch-positiv-Signale getestet (Abbildung 3-12). Zusätzlich wurden weitere

Nitrosoverbindungen wie die Nitrosothiole SNAP und GSNO aber auch das NO-Häm-

strukturähnliche Nitroprussid als Negativkontrollen getestet. Bis auf NO-Häm führte

keine der verwendeten Kontrollen zu einem Signal im NOA.

Abbildung 3-12: Ausschnitt aus der NO-Häm-Messung im NOA mit den entsprechenden Kontrollen.

Ergebnisse

60

Alle Komponenten (NaNO2, Na-Dithionit, Hämin), die zur NO-Häm-Synthese verwendet wurden, wurden

auf Störsignale (V*s) getestet. Weitere Nitrosoverbindungen wie Nitroprussid und SNAP dienten ebenfalls

als Kontrollen. Y-Achse: Volt, X-Achse: Sek.

Nachdem sichergestellt wurde, dass die Methode von Salgado et al. [173] ausschließlich

NO-Häm misst, wurde die genaue NaNO2-Konzentration für die NO-Häm-Synthese er-

mittelt. Bei der Verwendung der verschiedenen NaNO2-Konzentrationen blieb die Höhe

der NO-Häm-Peaks bei NaNO2-Konzentrationen von 3,75 bis 1,5 mM unverändert.

Wurde eine geringere NaNO2-Konzentration als 1,5 mM verwendet, wurde der NO-Häm-

Peak im NOA sichtlich kleiner (Abbildung 3-13).

Mithilfe der ermittelten area under curve (V * Sek.) wurde die Konzentration des gene-

rierten NO-Häms und somit die zu verwendende NaNO2-Konzentration für die NO-Häm-

Synthese bestimmt (Abbildung 3-14). Bei einer NaNO2-Konzentration größer als 1,5 mM

ließ sich kein weiterer Anstieg in der NO-Häm-Konzentration verzeichnen. Wurde jedoch

weniger als 1,5 mM NaNO2 für die NO-Häm-Synthese genutzt, wurde mit abnehmender

NaNO2-Konzentration auch weniger NO-Häm detektiert. Daher wurde für die NO-Häm-

Synthese fortan eine NaNO2-Endkonzentration von max. 1,8 mM verwendet.

Da für die Quantifizierung des NO-Häms kein Standard erhältlich war, wurde dafür nach

dem Protokoll von Kuhnle et al. [171] verfahren. Dabei wurde für die Erstellung der Ka-

libriergeraden Natriumnitrit verwendet, das in einer sauren Kaliumiodid/Kupfersulfat-

Lösung zu NO reagiert.

Abbildung 3-13: Ausschnitt aus der NaNO2-Konzentrationsermittlung für die NO-Häm-Synthese mithilfe

des NOAs.

Es wurden verschiedene Konzentrationen von NaNO2 (3 mM [NO-Häm 7]-0,15 mM [NO-Häm 1]) ver-

wendet, um die Konzentration zu ermitteln, die für die NO-Häm-Synthese benötigt wurde. Jede Messung

erfolgte im Duplikat; bei jeder Probe wurde der Häm-Blank, der kein Nitrit enthielt, mitgeführt. Y-Achse:

Volt, X-Achse: Sek.

Ergebnisse

61

Abbildung 3-14: Graphische Darstellung der NaNO2-Konzentrationsermittlung für die NO-Häm-Synthese.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der area under curve [V* Sek.] von drei unabhängigen Experi-

menten, aufgetragen gegen die verwendete NaNO2-Konzentration [mM].

3.2.1.2 Absorptionsspektren

Zur Verifizierung der Identität des NO-Häms wurde auch die UV/Vis-Spektroskopie an-

gewandt. Dabei wurden die spezifischen Absorptionsspektren von NO-Häm sowie dessen

Vorstufen während der Synthese aufgezeichnet.

Abbildung 3-15: Absorptionsspektren von NO-Häm und seinen Vorstufen.

Aufgezeichnet wurden die Spektren von 300 bis zu 700 nm. Hämin: schwarz; Deoxy-Häm: hellgrau; NO-

Häm: dunkelgrau.

Das Spektrum von Hämin (schwarz), der Ausgangssubstanz bei der NO-Häm-Synthese,

zeigte die typische Soret-Bande bei 404 nm. Die Zugabe von Natriumdithionit führte zur

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

3,75 3 2,55 2,25 1,95 1,5 0,3 0,15

Are

a [V

.* S

ek.

]

NaNO2 [mM]

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

30

0

31

8

33

6

35

4

37

2

39

0

40

8

42

6

44

4

46

2

48

0

49

8

51

6

53

4

55

2

57

0

58

8

60

6

62

4

64

2

66

0

67

8

69

6

Ab

sorp

tio

n

nm

Hämin

Deoxy-Häm

NO-Häm

Ergebnisse

62

Reduktion des Hämins zu Deoxy-Häm (hellgrau), wodurch sich die Soret-Bande von

404 nm nach 420 nm verschob. Zudem zeigte Deoxy-Häm die beiden typischen Q-Ban-

den bei 526 nm und 556 nm. Die Zugabe von NaNO2 führte daraufhin zur Bildung von

NO-Häm (dunkelgrau), das die Soret-Bande bei 398 nm aufwies. Ebenfalls konnte eine

Änderung der Q-Banden beobachtet werden. Die bei Deoxy-Häm typischen zwei Q-Ban-

den wurden beim NO-Häm zu einer länglichen Q-Bande (Abbildung 3-15).

3.2.1.3 Stabilität von NO-Häm unter Zellkulturbedingungen

Weiterhin wurde die Stabilität des NO-Häms im Zellkulturmedium (± Serum) unter Zell-

kulturbedingungen getestet. Dafür wurde NO-Häm in Zellkulturmedium verdünnt, unter

hypoxischen Bedingungen inkubiert und die Konzentration über 24 Std. im NOA gemes-

sen. Abbildung 3-16 zeigt die NO-Häm-Konzentration über die Zeit in Zellkulturmedium

mit und ohne Serum. Sowohl mit als auch ohne Serum sank die NO-Häm-Konzentration

in den ersten fünf Stunden deutlich. Medium mit Serum schien die Stabilität des NO-

Häms zu begünstigen. Die Halbwertszeit von NO-Häm im Zellkulturmedium ohne Serum

lag bei ca. 4 Std., im Zellkulturmedium mit Serum hingegen bei ca. 8 Std.

Abbildung 3-16: Stabilität von NO-Häm im Medium mit und ohne Serum unter hypoxischen Bedingungen.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der NO-Häm-Konzentration [%] von drei unabhängigen Experi-

menten relativ zur Ausgangskonzentration über die Zeit [Std.]. Medium mit Serum: schwarz, Medium ohne

Serum: hellgrau.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20 25 30

NO

-Häm

[%

]

Zeit [Std.]

Medium - Serum

Medium + Serum

Ergebnisse

63

3.2.2 Analyse der Expression von HO-1 und 3-NT

Nach der Verifizierung und Quantifizierung von NO-Häm wurden die Zelllinien HCEC

WT und HCEC MGMT – einmalig mit NO-Häm im geringen µM-Bereich behandelt. Um

sicherzustellen, dass das NO-Häm überhaupt in die Zellen gelangt, wurde die Expression

der Hämoxygenase 1 (HO-1), das in Anwesenheit von Häm hochreguliert wird und für

den zellulären Abbau von Häm verantwortlich ist, untersucht.

Abbildung 3-17: Western Blot-Expressionsanalyse der Hämoxygenase-1 (HO-1) in HCEC WT-Zellen.

Die Zellen wurden 4 Std. und 24 Std. mit 0-5 µM NO-Häm behandelt. ACTB diente als Ladekontrolle.

In Abbildung 3-17 ist die Expression von HO-1 in HCEC WT-Zellen dargestellt. Dabei

war eine zeit- und dosisabhängige Expression von HO-1 zu beobachten. Die HO-1-Ex-

pression in MGMT-defizienten Zellen war ebenfalls zeit- und dosisabhängig (Anhang-

Abbildung 6-2).

Neben der HO-1-Expression wurde ebenfalls die 3-Nitrotyrosin (3-NT)-Expression un-

tersucht. 3-NT ist ein Marker für nitrosativen Stress. Dieser wurde verwendet, um zu

prüfen, ob die NO-Bindung an dem Eisen des Häms stabil ist und ebenfalls in die Zellen

gelangt, um dort mit Proteinen interagieren zu können.

ACTB

HO-1

4 Std. 24 Std.

0 [µM NO-Häm] 1 2 5 0 1 2 5

Ergebnisse

64

Abbildung 3-18: Western Blot-Analyse der durch NO-Häm nitrosierten Proteine (Bereich: 10 -170 kDa).

HCEC WT-Zellen wurden 4 Std. bzw. 24 Std. mit 35 µM bzw. 70 µM NO-Häm behandelt. Als Ladekon-

trolle diente ACTB, als Positivkontrolle Peroxynitrit (rechts im Blot).

Dafür wurden HCEC WT-sowie HCEC MGMT-defiziente Zellen mit 35 µM und 70 µM

NO-Häm für 4 Std. und 24 Std. behandelt. Die NO-Häm-Behandlung führte in den HCEC

WT-Zellen zu einer verstärkten Nitrosierung der zellulären Proteine im Bereich von 10

bis 170 kDa (Abbildung 3-18). Die Nitrosierung war dosis-jedoch nicht zeitabhängig.

Nach 4 Std. wurden mehr Proteine nitrosiert als nach 24 Std. Die Nitrosierung in MGMT-

defizienten Zellen war ebenfalls dosis-aber nicht zeitabhängig (Anhang-Abbildung 6-3).

3.2.3 Toxizitätsanalysen nach einmaliger NO-Häm-Behandlung

3.2.3.1 NO-Häm-induzierte Zytotoxizität

Die zytotoxische Wirkung von NO-Häm wurde mithilfe des AlamarBlue®-Zellprolifera-

tionsassays bestimmt. Dafür wurden HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen für 4 Std.,

ACTB

Nit

rosi

erte

Pro

tein

e

170 kDa

10 kDa

24 Std. 4 Std.

0 35 70 0 35 70 µM

Ergebnisse

65

24 Std. und 48 Std. mit 2-50 µM NO-Häm behandelt. Die ermittelten IC50-Werte sind in

Tabelle 3.2 aufgeführt. Generell ließ sich kein signifikanter Unterschied zwischen den

beiden verwendeten Zelllinien ausmachen. Der IC50-Wert betrug ~ 100 µM bei einer 4-

stündigen NO-Häm-Behandlung und ~ 35 µM nach einer 24-stündigen NO-Häm-Be-

handlung. Die Zellen wurden ebenfalls mit der Häm-Kontrolle behandelt. Dabei zeigte

sich, dass 50 µM Häm ähnliche zytotoxische Wirkungen auf die Zellen ausübt wie 50 µM

NO-Häm (Anhang-Abbildung 6-4, Abbildung 6-5).

Tabelle 3.2: Auflistung der errechneten IC50-Werte nach einmaliger NO-Häm-Behandlung.

Die ermittelten Testsubstanzkonzentrationen (IC50), die zu einer halbmaximalen Zellzahlverminderung von

HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen nach 4 Std., 24 Std. und 48 Std. NO-Häm-Behandlung in drei

unabhängigen Experimenten führten.

Inkubationszeit

[Std.]

Zelllinie und IC50-Wert [µM]

HCEC WT HCEC MGMT -

4 104,9 103,0

24 34,88 39,9

48 24,72 27,78

3.2.3.2 NO-Häm-induzierte Genotoxizität

Ein weiterer Teil der Toxizitätsanalyse stellte die NO-Häm-induzierte Genotoxizität dar.

Diese wurde mithilfe des alkalischen Comet-Assays ermittelt. Die Zellen wurden jeweils

für 4 Std. bzw. 24 Std. mit den im Zytotoxizitästest ermittelten NO-Häm-Konzentratio-

nen von 20 µM und 40 µM behandelt. Als Kontrolle für NO-Häm wurde der Häm-Blank

in der höchsten Konzentration mitgeführt. In

Abbildung 3-19 sind die Ergebnisse der Genotoxizitätsanalyse anhand der ermittelten

Schweifintensitäten der Kometen dargestellt. Eine 4-stündige NO-Häm-Behandlung

führte in den HCEC MGMT --sowie in den HCEC WT-Zellen zu einer leichten Genoto-

xizität. Nach 24 Std. war die NO-Häm-induzierte Genotoxizität in den 40 µM-behandel-

ten WT und MGMT-defizienten Zellen signifikant erhöht. In den MGMT-defizienten

Zellen führte auch schon eine 20 µM-NO-Häm-Behandlung zu einer statistisch signifi-

kanten Erhöhung der Schweifintensität. Die Kontrollsubstanz Häm führte nach 4 Std. zu

keinem und nach 24 Std. nur zu einem leichten Anstieg der Genotoxizität.

Ergebnisse

66

Abbildung 3-19: Analyse der NO-Häm-induzierten Genotoxizität.

Durchgeführt wurde diese Analyse mithilfe des alkalischen Comet-Assays. HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen wurden 4 Std. bzw. 24 Std. mit 20 µM bzw. 40 µM NO-Häm behandelt. Als Kontrolle diente

40 µM Häm. Dargestellt werden die aus mindestens drei unabhängigen Experimenten ermittelten Mittel-

werte ± SD der Mediane aus jedem Experiment. Die statistische Auswertung erfolgte durch den Kruskal

Wallis-Test mit Dunn´s Post-hoc-Test.; *: p< 0,05 (im Vergleich zu den unbehandelten Zellen).

3.2.4 Zyklische NO-Häm-Behandlung der Zelllinien HCEC WT und

HCEC MGMT -

Neben der einmaligen NO-Häm-Behandlung wurde auch eine zyklische Behandlung

durchgeführt, um die Langzeitwirkung von NO-Häm auf die Zellen und deren Morpho-

logie zu bestimmen.

Zusätzlich zu den beiden Zelllinien HCEC WT und HCEC MGMT – wurde die mehrfach

mutierte Zelllinie HCEC RPA-A1309 (HCEC RPA) mitgeführt.

Während der zyklischen Behandlung wurden die drei Zelllinien fünf Zyklen lang, in jeder

exponentiellen Wachstumsphase, je 24 Std. mit verschiedenen Konzentrationen von NO-

Unbehandelt + - - - + - - - + - - - + - - -

Häm [40µM] - + - - - + - - - + - - - + - -

NO-Häm [20µM] - - + - - - + - - - + - - - + -

NO-Häm [40µM] - - - + - - - + - - - + - - - +

4 Std. 24 Std.

MGMT WT WT MGMT

*

*

*

Ergebnisse

67

Häm, dem Häm-Blank sowie Diazald behandelt. Diazald ist als Diazomethan-Vorläufer

eine stark kanzerogene Verbindung und sollte als Positivkontrolle fungieren. Nach Been-

digung der zyklischen Behandlung wurden die Zelllinien bezüglich morphologischer

Veränderungen, die durch eine maligne Zelltransformation einhergehen können, unter-

sucht. Dazu dienten u.a. Parameter wie die Sättigungsdichte und verankerungsunabhän-

giges Wachstum als Endpunkte. Eine statistische Auswertung der nachfolgenden Experi-

mente konnte bei einem technischen Triplikat pro untersuchten Endpunkt nicht erfolgen.

Dargestellt sind ausschließlich die Standardabweichungen des technischen Triplikats.

3.2.4.1 Morphologie der mit NO-Häm zyklisch behandelten Zelllinien

Die zyklische Behandlung mit NO-Häm und Diazald führte zu offensichtlichen Verände-

rungen der Zellmorphologie. Abbildung 3-20 A und B zeigen die Zelllinie HCEC-RPA,

die mit 2,5 µM Diazald (B) und Ethanol (A; Lösungsmittelkontrolle) behandelt wurden.

Die Behandlung führte zu einer Vergrößerung der Zellen, die zudem lange Ausläufer bil-

deten (Abbildung 3-20 C und D, siehe Markierung). Die gleichen morphologischen Ver-

änderungen wurden durch eine NO-Häm-Behandlung (40 µM) induziert (Abbildung

3-20 C und D). Die HCEC WT-Zellen bildeten nach der zyklischen Behandlung mit NO-

Häm (D) untypisch lange Ausläufer im Vergleich zu den Zellen, die mit DMSO/H2O

(Abbildung 3-20 C, Lösungsmittelkontrolle) behandelt wurden.

Ergebnisse

68

A

B

C

D

Abbildung 3-20: Morphologische Veränderungen der Zellen durch die zyklische NO-Häm – und Diazald-

Behandlung (repräsentative Bilder).

A: HCEC RPA-Zellen inkubiert mit Ethanol (Lösungsmittelkontrolle); B: HCEC RPA-Zellen inkubiert mit

2,5µM Diazald; C: HCEC WT-Zellen inkubiert mit DMSO/H2O (Lösungsmittelkontrolle); D: HCEC WT-

Zellen inkubiert mit 40 µM NO-Häm.

3.2.4.2 Zell-Zell-Kontaktinhibition der mit NO-Häm zyklisch

behandelten Zelllinien

Die Sättigungsdichte wurde bestimmt, um festzustellen, ob die Zellen nach der zyklischen

Behandlung noch immer kontaktinhibiert wuchsen oder aufgrund einer malignen Trans-

formation unkontrolliert proliferierten. Abbildung 3-21 zeigt beispielhaft die Ergebnisse

für die Zelllinie HCEC MGMT -. Keine der Behandlungen führte zu einem signifikanten

Unterschied der Zellzahl/cm2. Selbst Diazald als stark kanzerogene Verbindung führte

nicht zu einem Verlust der Kontaktinhibition. Ähnliche Ergebnisse wurden im Fall der

Zelllinien HCEC WT und HCEC RPA erzielt (Anhang-Abbildung 6-6, Abbildung 6-7).

Ergebnisse

69

Abbildung 3-21: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC MGMT – nach der zyklischen Be-

handlung.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der Zellzahl/cm2 von einem technischen Triplikat bei Erreichen

der Konfluenz (1. Zählung) sowie vier Tage später (2. Zählung). Neben den Behandlungssubstanzen Dia-

zald, dem Häm-Blank und NO-Häm wurden auch die entsprechenden Lösungsmittelkontrollen mitgeführt.

3.2.4.3 Focusbildung der zyklisch behandelten Zelllinien

Wenn Zellen unkontrolliert proliferieren, kommt es bei konfluenten Zellen zur Bildung

von Foci. Daher wurden die Zellen nach der zyklischen Behandlung auch bezüglich die-

ser morphologischen Veränderung untersucht. Durch die Giemsa-Färbung konnten mög-

liche Foci einfacher visualisiert werden. Dennoch konnte in keinem Fall eine Foci-Bil-

dung beobachtet werden.

A

B

Abbildung 3-22: Repräsentative unvergrößerte Darstellung der konfluenten Giemsa-gefärbten HCEC WT-

(A) und RPA-Zellen (B) nach der zyklischen Behandlung.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000Ze

llen

/cm

2

1. Zählung

2. Zählung

Ergebnisse

70

Die Zelllinie HCEC RPA zeigte im Vergleich zu den anderen beiden Zelllinien generell

ein anderes Wachstumsmuster in den 6-Wellplatten, jedoch handelte es sich dabei nicht

um Foci (Abbildung 3-22).

3.2.4.4 Verankerungsunabhängiges Wachstum der zyklisch behandelten

Zelllinien

Das verankerungsunabhängige Wachstum wurde mithilfe des GILA-Assays untersucht.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3-23 dargestellt. Im Vergleich zur Messung an Tag 1

konnte bei keiner der drei Zelllinien und Behandlungen an Tag 5 ein signifikanter Anstieg

des Lumineszenzsignals detektiert werden (rote Linie). Dementsprechend wurde kein

verankerungsunabhängiges Wachstum der Zellen beobachtet. Die mikroskopischen Auf-

nahmen vor der Quantifizierung des zellulären ATP-Gehalts wiesen bereits darauf hin,

dass die Zellen nicht proliferieren konnten. An Tag 1 nach der Aussaat befanden sich

noch alle Zellen verteilt im Well (Abbildung 3-24 A und C), an Tag 5 hingegen sammel-

ten sich die Zellen am Rand des Wells (Abbildung 3-24 B und D). Im Vergleich zur Po-

sitivkontrollzelllinie HT29, die maligne transformiert ist, konnte an Tag 5 z.B. bei HCEC

RPA-Zellen, die mit 5 µM Diazald zyklisch behandelt worden waren, keine Zunahme der

Zellzahl beobachtet werden.

Abbildung 3-23: Ergebnisse des GILA-Assays nach der zyklischen Behandlung.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der Lumineszenz [%] von einem technischen Triplikat. Die Mit-

telwerte sind relativ zum Wert an Tag 1 gesetzt und daher als % -Werte dargestellt. Die Zelllinie HT29

fungierte als Positivkontrolle, BALB/c als Negativkontrolle.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Lum

ine

sze

nz

[% z

u T

ag1

]

WT

MGMT

RPA

Balb/c

HT29

Ergebnisse

71

A

B

C

D

Abbildung 3-24: Verankerungsunabhängiges Wachstum im GILA-Assay.

A: Positivkontrolle HT29 an Tag 1; B: Positivkontrolle HT29 an Tag 5; C: HCEC RPA zyklisch behandelt

mit 5 µM Diazald an Tag 1 und Tag 5 (D). 40fache Vergrößerung im Auflichtmikroskop.

3.2.5 Prüfung der zelltransformierenden Wirkung von NO-Häm im

BALB/c-3T3-Zelltransformationstest

Im letzten Teil der Studie wurde die zelltransformierende Wirkung von NO-Häm im

BALB/c-3T3-Zelltransformationstest untersucht. Zur Durchführung des Transformati-

onstests wurden 0,1, 1, 5 und 10 µM NO-Häm verwendet. Vergleichend dazu wurden 0,1

und 10 µM des Häm-Blanks sowie 10 µM Hämin gelöst in NaOH geprüft. Neben der

einmaligen Behandlung der Zellen wurden drei weitere Gruppen zweimal wöchentlich

mit 10 µM NO-Häm, dem Häm-Blank sowie DMSO/H2O als Lösungsmittelkontrolle be-

handelt.

Ergebnisse

72

Abbildung 3-25: Ergebnisdarstellung des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests.

BALB/c-3T3-Zellen wurden mit NO-Häm und den entsprechenden Kontrollen einmalig oder wöchentlich

behandelt (10 Platten/Behandlung). Außerdem wurden der Häm-Blank sowie Hämin gelöst in NaOH ge-

prüft. Als Lösungsmittelkontrollen dienten mit DMSO, NaOH und DMSO/H2O behandelte BALB/c-3T3-

Zellen. MCA diente als Positivkontrolle. Medium: unbehandelte Zellen. Die statistische Auswertung von

n=10 erfolgte durch den Kruskal-Wallis-Test mit Dunn´s Post-hoc-Test.; **: p< 0,01, ****: p< 0,0001

(verglichen zur jeweiligen Lösungsmittelkontrolle). Zwei Ausreißer (1 µM NO-Häm [9 Foci] und

DMSO/H2O wöchentlich [8 Foci]) wurden nicht in die Auswertung mit einbezogen.

Die Ergebnisse des Zelltransformationstests sind in Abbildung 3-25 dargestellt. Bei der

einmaligen Behandlung führten sowohl der Häm-Blank und Hämin als auch NO-Häm zur

Bildung von wenigen Typ III-Foci, jedoch ohne signifikanten Unterschied im Vergleich

zu den Lösungsmittelkontrollen. Im Gegensatz dazu führte die wöchentliche Behandlung

mit NO-Häm zu einem signifikanten Anstieg der Foci-Anzahl/Well im Vergleich zur Lö-

sungsmittelkontrolle DMSO/H2O. Die Häm-Kontrolle hingegen zeigte keine transfor-

mierende Wirkung.

einmalig wöchentlich

Diskussion

73

4 Diskussion

4.1 Rolle der MGMT in der Reparatur der CRC-relevanten O6-

CMG-Addukte

4.1.1 Charakterisierung der in dieser Arbeit eingesetzten humanen

Dickdarmepithelzelllinie

Ziel dieser Studie war es, zum einen herauszufinden, welche Rolle NO-Häm in der Dick-

darmkrebsentstehung spielt, und zum anderen, ob das DNA-Reparaturenzym MGMT in

der Reparatur des CRC-relevanten DNA-Adduktes O6-CMG involviert ist. Um diese bei-

den Fragestellungen zu untersuchen, wurden die dafür nötigen In vitro-Experimente mit

der humanen Dickdarmepithelzelllinie HCEC durchgeführt. Diese Zelllinie wurde von

Roig und Kollegen [150] durch die hTERT- und CDK4-vermittelte Immortalisierung von

im Rahmen einer Koloskopie gewonnenen Dickdarmepithelzellen etabliert. In epithelia-

len Geweben ist eine direkte und/oder indirekte Wechselwirkung zwischen Epithelzellen

und Fibroblasten bekannt. Eine Kokultivierung von Fibroblasten mit Epithelzellen führte

bereits in mehreren Studien zu einer verstärkten Proliferations- und Differenzierungsrate

[175, 176]. Doch diese sehr enge Wechselwirkung zwischen Epithelzellen und Fibroblas-

ten führt bei der späteren Isolierung der Epithelzellen oft zu Mischkulturen der beiden

Zelltypen.

Die verwendeten HCEC-Zellen sind epitheliale Vorläuferzellen und weisen eine Mor-

phologie auf, die der von Fibroblasten ähnelt. Während der Isolierung der Zellen wurden

diese kurzzeitig mit Fibroblasten kokultiviert, um ein besseres Wachstum nach der Ge-

winnung der Zellen zu gewährleisten [150]. Um auszuschließen, dass es sich bei den iso-

lierten Zellen nicht um Fibroblasten handelt, die aus einer vorangegangenen Mischkultur

hervorgegangen sind, wurde zu Beginn der Studie eine immunzytochemische Färbung

durchgeführt. Dafür wurden die HCEC-Zellen vollständig zu Epithelzellen ausdifferen-

ziert und bezüglich ihrer typischen Epithelzellmarker untersucht.

Die Ausdifferenzierung erfolgte mithilfe einer mehrtägigen BIO-Behandlung. BIO ist ein

GSK-3-Inhibitor. Diese Serin/Threonin-Protein-Kinase ist in verschiedenen zellulären

Signalwegen involviert [177, 178]. Die Inaktivierung der GSK-3 führt zum Zellzyklusar-

rest und induziert eine Zelldifferenzierung [179, 180]. Bereits vor der Ausdifferenzierung

https://de.wikipedia.org/wiki/Serin

https://de.wikipedia.org/wiki/Threonin

https://de.wikipedia.org/wiki/Protein

https://de.wikipedia.org/wiki/Kinase

Diskussion

74

wiesen die HCEC-Zellen trotz ihrer Fibroblasten-ähnlichen Morphologie Epithelzellmar-

ker auf. Im ausdifferenzierten Zustand änderte sich jedoch die Morphologie der Zellen.

Die Zellen mit der zuvor spindelförmigen Struktur und der geringen Zahl an Zell-Zell-

Kontakten zeigten nun die typisch epitheliale Zellmorphologie und wuchsen mit vielen

Zell-Zell-Kontakten dicht aneinander. Roig et al. [150] berichteten von ähnlichen Ergeb-

nissen bei der Charakterisierung der von ihnen etablierten Zelllinie. Die recht untypische

Morphologie der HCEC-Zellen vor der Ausdifferenzierung lässt sich vermutlich auf die

Art der Kultivierung zurückführen. Es ist bekannt, dass die 2D-Zellkultur sowie andere

Stressfaktoren bei nicht-transformierten Epithelzellen dazu führen können, dass Epithel-

zellmarker herunterreguliert werden und ein mesenchymaler Phänotyp ausgebildet wird

[181-184]. Darüber hinaus können auch Komponenten des Mediums bei dieser morpho-

logischen Veränderung eine Rolle spielen. TGF-β, ein Wachstumsfaktor, der dem Me-

dium zugegeben wird, führte in vitro zu einer Differenzierung von Epithel-zu Mesen-

chymzellen [185]. Da die Progenitorzelllinie HCEC bereits vor und nach der Ausdiffe-

renzierung Epithelzellmarker aufwies, kann angenommen werden, dass es sich bei diesen

Zellen trotz ihrer Fibroblasten-ähnlichen Struktur um Epithelzellen handelt. Eine weitaus

genauere Charakterisierung der Zellen erfolgte bereits durch Roig und Kollegen [150],

bei der diverse Marker auf unterschiedlichsten zellulären Ebenen ebenfalls bestätigten,

dass es sich bei den Zellen um epitheliale Vorläuferzellen mit teils mesenchymalen Merk-

malen handelt.

4.1.2 MGMT-silencing in HCEC-Zellen und Prüfung des

Zelltransformationsstatus

Um einen genaueren Einblick in die Rolle des DNA-Reparaturenzyms MGMT bei der

Reparatur des O6-CMG-Adduktes zu bekommen, wurde eine MGMT-knockdown-

HCEC-Zelllinie generiert. Diese wurde daraufhin in allen folgenden In vitro-Experimen-

ten mit der HCEC WT-Zelllinie verglichen. Der MGMT-knockdown wurde mithilfe der

RNA-Interferenz-Technik induziert. Dafür schleusen lentivirale Vektoren die small hair-

pin RNA (shRNA) in die Zellen ein, die daraufhin von Polymerasen transkribiert wird.

Die nach einigen Schritten entstandene pre-shRNA wird aus dem Kern ins Zytoplasma

exportiert und auf den RNA-induzierten silencing-Komplex (RISC) geladen. Nach Ab-

bau des Sinnstrangs wird der Gegensinnstrang mit der Komplementärsequenz hybridi-

siert. Bei perfekter Komplementarität schneidet RISC die mRNA, bei unvollständiger

Diskussion

75

Komplementarität unterdrückt RISC die Translation der mRNA. So kommt es in beiden

Fällen zur Verhinderung der Proteinexpression [15]. Nach der Zelltransduktion mit den

lentiviralen Partikeln wurden neun Klone für die MGMT-Expressionsanalyse ausge-

wählt. Dabei zeigte sich bei allen Klonen eine eindeutig verminderte MGMT-Expression

im Vergleich zu den WT-Zellen. Da eine Proteinexpression nicht gleichbedeutend ist mit

der Aktivität des Enzyms, wurde die MGMT-Aktivität mithilfe eines Aktivitätsassays er-

mittelt. Ähnlich zu dem Ergebnis zuvor wiesen fast allen Klone eine verminderte MGMT-

Aktivität auf. Jedoch war Klon 9 der einzige, bei dem fast keine MGMT-Aktivität mehr

nachgewiesen werden konnte. Daher wurde Klon 9 als MGMT-knockdown-Zelllinie

(HCEC MGMT -) für die folgenden Experimente verwendet. Verglichen mit den Werten,

die in der Literatur beschrieben worden sind, zeigten die WT-Zellen mit rund

130 fmol/mg Protein eine leicht verringerte MGMT-Aktivität. Zellen aus gesundem Ko-

lonepithelgewebe weisen normalerweise eine durchschnittliche Aktivität von

200 fmol/mg Protein auf, die durch eine maligne Zelltransformation zusätzlich ansteigt

[112]. Nichtsdestotrotz war ausreichend MGMT-Aktivität in den WT-Zellen vorhanden,

um diese mit der MGMT-defizienten Zelllinie zu vergleichen und die Rolle der MGMT

im Prozess der Dickdarmkrebsentstehung zu eruieren.

Eine virale Transduktion hat jedoch schon in einigen Fällen zu einer malignen Zelltrans-

formation geführt, da virale Onko-Proteine mit wichtigen zellulären Regulatoren intera-

gieren und dadurch zu Veränderungen der Genexpression, des Zellwachstums und der

Differenzierung führen [186-189]. Um das auszuschließen, wurden die MGMT-defizien-

ten Zellen bezüglich verschiedener phänotypischer Veränderungen, die bei einer malig-

nen Transformation vorliegen, untersucht. Roig et al. [150] zeigten bereits im Rahmen

der Charakterisierung der HCEC WT-Zellen, dass in diesen keine Anzeichen einer ma-

lignen Transformation festzustellen war. Bei der Charakterisierung der MGMT-defizien-

ten Zellen in der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch diese Zellen keine

phänotypischen Veränderungen im Vergleich zu den WT-Zellen aufwiesen. Die Wachs-

tumskurve der MGMT-defizienten Zellen wies keinen signifikanten Unterschied im Ver-

gleich zum WT auf und auch die Verdopplungszeit veränderte sich nicht. Die Aufhebung

der Zell-Zell-Kontaktinhibition ist ebenfalls ein wichtiges Merkmal von maligne trans-

formierten Zellen, jedoch blieb die Zell-Zell-Kontaktinhibition in den MGMT-defizien-

ten Zellen ebenfalls erhalten. Mithilfe des GILA-Assays wurden die Zellen bezüglich ei-

nes möglichen verankerungsunabhängigen Wachstums untersucht. Roig et al. [150] be-

Diskussion

76

richteten bereits, dass die HCEC WT-Zellen sehr kleine Kolonien im Softagar-Assay bil-

deten, die im Vergleich zur Positivkontrolle jedoch wesentlich kleiner waren. Die lenti-

virale Transduktion führte auch in dieser Studie zu einem ähnlichen Ergebnis. Die Prü-

fung des verankerungsunabhängigen Wachstums wurde in dieser Studie jedoch nicht mit

dem oft genutzten Softagar-Assay untersucht. Dafür wurde der kürzlich entwickelte

GILA-Assay verwendet, der nicht die Koloniebildung im halbfesten Agar, sondern das

Wachstum von Zellen auf einer Oberfläche, an der sie nicht adhärieren können, prüft

[155]. Der Vorteil des GILA-Assays im Vergleich zum Softagar-Assay ist, dass veranke-

rungsunabhängiges Wachstum besser quantifiziert werden kann und dadurch bereits

leichte Veränderungen im Wachstumsverhalten detektiert werden können. Aufgrund der

Ergebnisse der Zellcharakterisierung lässt sich schlussfolgern, dass der Prozess der lenti-

viralen Transduktion nicht zu einer malignen Zelltransformation führte. Die von Roig und

Kollegen durchgeführte Zellcharakterisierung der HCEC WT-Zellen beinhaltete eben-

falls DNA-Mutationsanalysen sowie die Prüfung der Tumorbildung in Nacktmäusen.

Diese zeigten, dass die Zellen weder DNA-Veränderungen (TP53, KRAS und APC) auf-

wiesen noch Tumore induzierten. Die MGMT-defizienten Zellen wurden bezüglich die-

ser Parameter nicht getestet, daher kann, auch wenn sie keine phänotypischen Verände-

rungen im Vergleich zur WT-Zelllinie aufwiesen, nicht ausgeschlossen werden, dass das

lentiviral-induzierte MGMT-silencing u. U. zu DNA-Mutationen oder veränderten Pro-

teinexpressionen geführt haben könnte. So ist bekannt, dass die Expression des large T-

Antigens des SV40-Virus, aber auch die anderer viraler Onko-Proteine, wie das Epstein

Barr-Virus Protein EBNA-5 oder Hepatitis B Virus-Protein X, zu einer Inaktivierung des

Tumorsuppressorproteins p53 führen können [190-192].

Da die HCEC WT- und HCEC MGMT-defizienten Zellen keine Unterschiede in ihrem

Wachstumsverhalten aufwiesen, konnten diese beiden Zelllinien für die NO-Häm-Be-

handlungen verwendet und gleichzeitig der Einfluss der MGMT auf NO-Häm-induzierte

Veränderungen der Zellen analysiert werden.

4.1.3 Toxizitätsanalysen in den mit Azaserin behandelten humanen

Dickdarmepithelzelllinien

Nicht nur exogene sondern auch endogene Faktoren können eine wichtige Rolle in der

Dickdarmkrebsentstehung spielen. Wie bereits eingangs beschrieben, kommt es bei der

CRC-Entstehung zur endogenen NOC-Bildung, die wiederum die DNA der GIT-Zellen

Diskussion

77

alkylieren. Bei ausbleibender DNA-Reparatur können diese Addukte zu Mutationen füh-

ren.

Die Induktion einiger DNA-Addukte, wie beispielsweise O6-MeG, hat zur Folge, dass

eine Fehlpaarung mit Thymin entsteht, die wiederum vom MMR-Reparaturmechanismus

erkannt und repariert wird. Da jedoch bei der Reparatur ausschließlich die Fehlpaarung,

nicht aber das Addukt selbst, repariert wird, kommt es zu einer Reihe von ineffizienten

Reparaturversuchen, die über die Induktion von DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüchen

schlussendlich zur Apoptose führen [129, 193]. Dementsprechend konnte bereits gezeigt

werden, dass MMR/MGMT-defiziente Zellen wesentlich resistenter gegenüber methyl-

ierenden Agenzien sind [131, 194].

Um die Rolle der MGMT in der Reparatur des CRC-relevanten O6-CMG-Adduktes zu

analysieren, wurden die WT- und MGMT-defizienten Zellen mit Azaserin, einem haupt-

sächlich carboxymethylierenden Agens, behandelt. Azaserin ist ein Vorläufer von Dia-

zoacetat und induziert die Bildung von N7-CMG- und O6-CMG-Addukte [195]. Die Be-

handlung wurde für 4 Std. bzw. 24 Std. durchgeführt. Allem voran wurde die Azaserin-

vermittelte Zytotoxizität getestet. Nach 4 Std. konnte in beiden Zelllinien keine Azaserin-

induzierte Zytotoxizität beobachtet werden, nach 24 Std. hingegen konnte in beiden Zell-

linien eine konzentrationsabhängige Zytotoxizität festgestellt werden. Dabei zeigte sich

bereits hier, dass die MGMT-defizienten Zellen nach 24 Std. signifikant sensitiver gegen-

über Azaserin waren als die WT-Zellen. O´Driscoll und Kollegen [174] publizierten ähn-

liche Ergebnisse. Azaserin führte bei humanen Lymphomzellen ebenfalls zu einer kon-

zentrationsabhängigen Zytotoxizität, jedoch mit dem Unterschied, dass O´Driscoll et al.

[174] keine MGMT-abhängige Zytotoxizität beobachten konnten. Azaserin induziert ne-

ben den CMG-Addukten auch, jedoch zu wesentlich geringeren Anteilen, O6-MeG-

Addukte [103], die ebenfalls von der MGMT repariert werden. Es ist beschrieben worden,

dass diese Addukte zur Apoptose führen können [196]. Daher lässt sich ein Teil der

Azaserin-induzierten Zytotoxizität und die erhöhte Sensitivität der MGMT-knockdown-

Zelllinie auf diese Addukte zurückführen. Des Weiteren geht ebenso von den N7-CMG-

Addukten ein toxisches Potenzial aus, da AP-Stellen und FaPy die Folge sind und in

DNA-Strangbrüchen gipfeln können [91, 92]. Bisher ist nicht beschrieben, wie O6-CMG-

Addukte zur Zytotoxizität führen können. O´Driscoll et al. [195] zeigten, dass O6-CMG

scheinbar nicht mit Proteinen des MMR-Komplexes interagiert und dadurch nicht direkt

vom MMR-Komplex repariert werden kann. Jedoch ist bekannt, dass O6-CMG zu den-

selben Basenfehlpaarungen führt wie O6-MeG [138]. Daher kann angenommen werden,

Diskussion

78

dass zwar keine direkte Interaktion zwischen den O6-CMG-Addukten und der MMR be-

steht, dass aber auch hier, wie im Falle des O6-MeG-Adduktes, eine immer wiederkeh-

rende zwecklose Reparatur der Thymin-Basenfehlpaarung ebenfalls den Prozess der

Apoptose einleiten könnte. Insgesamt lässt sich die Azaserin-induzierte Zytotoxizität

nicht auf ein spezifisches DNA-Addukt zurückführen, da Azaserin neben CMG-Adduk-

ten auch O6-MeG-Addukte induziert und jedes Addukt Zytotoxizität auslösen kann. Je-

doch scheint die MGMT in der Reparatur von Azaserin-induzierten DNA-Addukten prin-

zipiell involviert zu sein.

Da anhand der Zytotoxizität kein direkter Rückschluss auf DNA-Schädigungen gezogen

werden kann, wurde ebenfalls die Azaserin-induzierte Genotoxizität in den behandelten

Zelllinien im alkalischen Comet-Assay untersucht. Es gibt verschiedene Formen des Co-

met-Assays, die, je nach pH-Bedingungen, zur Detektion von verschiedenen DNA-Läsi-

onen verwendet werden. Der alkalische Comet-Assay detektiert neben Einzel- und Dop-

pelstrangbrüchen auch AP-Stellen und Basenschäden. Um ein falsch-positives Ergebnis

im Comet-Assay zu vermeiden, muss zuvor die zytotoxische Wirkung der Substanz in

den Zellen untersucht werden, da Nekrose und Apoptose ebenfalls DNA-Fragmentierun-

gen induzieren. Da es offensichtlich bei vielen genotoxischen Substanzen auch immer zu

einer geringen Zytotoxizität kommt, weil die eine Wirkung mit der anderen einhergeht,

kann zwischen diesen beiden Formen der Toxizität jedoch schlecht unterschieden werden

[197]. Nichtsdestotrotz gibt es vorgeschlagene Viabilitätsgrenzen, die nicht unterschritten

werden sollten. Henderson et al. [198] empfiehlt, dass eine mindestens 70-75 % -ige Zell-

viabilität vorliegen sollte, um eventuelle falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden. Wird

die Zytotoxizität mithilfe der Messung des zellulären ATP-Gehalts ermittelt, wird für die

Durchführung des Comet-Assays eine maximale ATP-Reduktion von 50 % empfohlen

[199]. Dennoch reagieren viele Zellen unterschiedlich auf geno- und zytotoxische Sub-

stanzen. So führten die stark zytotoxischen Agenzien wie p-Nitrophenol und N-Lau-

roylsarcosin bei V79-Zellen zu keinem Signal im Comet-Assay; dieses Ergebnis zeigt,

dass die Zytotoxizität nicht immer gleich zu einem Signal im Comet-Assay führen muss

[200]. Daher ist es insgesamt recht schwierig, ein Zellviabilitätslimit für den Comet-As-

say zu definieren.

Die Viabilität der Azaserin-behandelten Zellen wurde mithilfe der Messung des zellulä-

ren ATP-Gehalts bestimmt. Eine 75 µM-Azaserin-Behandlung führte im Zytotoxizitäts-

test nach 24 Std. zu einer max. 40 %-igen Reduktion der Viabilität der MGMT-defizien-

Diskussion

79

ten HCEC-Zellen. Die WT-Zellen waren weniger sensitiv gegenüber Azaserin. Dement-

sprechend konnte diese Azaserin-Konzentration für den alkalischen Comet-Assay ver-

wendet werden, ohne dabei falsch-positive Ergebnisse zu erwarten. Beide Zelllinien wur-

den mit dieser Konzentration für 4 bzw. 24 Std. behandelt und daraufhin bezüglich DNA-

Schäden untersucht. Die Ergebnisse des Comet-Assays zeigten ebenfalls eine MGMT-

abhängige Sensitivität gegenüber Azaserin. Die MGMT-defizienten Zellen wiesen nach

4 Std. und 24 Std. eine signifikant höhere Schweifintensität als die WT-Zellen auf. Die

HCEC WT-Zellen hingegen zeigten nach 4 Std. und 24 Std. keine bzw. sehr geringe

DNA-Schädigung. Azaserin ist der stabile Vorläufer von Diazoacetat, bei dem Anderson

et al. [201] ebenfalls eine dosisabhängige DNA-Schädigung in drei verschiedenen Zell-

linien dokumentierte. Ähnlich wie im Fall der Zytotoxizität, kommen auch bei der Azase-

rin-induzierten Genotoxizität mehrere DNA-Läsionen infrage.

Wie bereits zuvor erwähnt, gehört das N7-CMG-Addukt zu einem der Azaserin-induzier-

ten Addukte. N7-CMG-Addukte führen in der Regel zu AP-Stellen, wobei es wiederum

zu einer formal positiven Ladung des Guanin-Rings kommt. Dadurch wird die Base zur

geeigneten Abgangsgruppe und es kommt zur Schwächung der glykosidischen Bindung

und folglich zu DNA-Strangbrüchen [92, 202]. Daher könnte vermutlich auch bei der

Bestimmung der Genotoxizität ein Teil des Signals auf die Induktion von Doppel- und

Einzelstrangbrüchen durch N7-CMG-Addukte zurückzuführen sein. Da jedoch bei den

MGMT-defizienten Zellen eine stärkere DNA-Schädigung vorliegt als bei den WT-Zel-

len und bisher nicht beschrieben worden ist, dass die MGMT für die Reparatur des N7-

CMG-Adduktes verantwortlich ist, scheint dieses Addukt nicht ausschlaggebend für die

Azaserin-induzierte Genotoxizität zu sein. Das O6-MeG-Addukt hingegen, das auch zu

geringen Anteilen durch Azaserin induziert wird, könnte eher eine Rolle im Fall der ge-

messenen Genotoxizität spielen. Dieses Addukt wird, wie bereits beschrieben, normaler-

weise von der MGMT repariert. Kommt es jedoch zu dessen Ausfall, entsteht eine Ba-

senfehlpaarung, die nicht vom MMR-Komplex repariert werden kann und somit zu

Strangbrüchen und Apoptose führt. Da O6-MeG-Addukte jedoch nur zu einem relativ ge-

ringen Anteil durch Azaserin induziert werden, die Genotoxizität aber in MGMT-defizi-

enten Zellen signifikant höher war als in den WT-Zellen, sollte auch dieses Addukt nicht

ausschlaggebend sein. Daher liegt es nahe, dass O6-CMG-Addukte, die größtenteils durch

Azaserin induziert werden, hauptverantwortlich für die beobachtete Genotoxizität sind.

Darüber hinaus weisen die bereits in diesem Teil der Studie erzielten Ergebnisse auf eine

mögliche MGMT-abhängige Reparatur des O6-CMG-Adduktes hin. Dem zustimmend

Diskussion

80

und entgegen aller Annahmen gehen Senthong et al. [10] davon aus, dass das O6-CMG-

Addukt sehr wohl ein Substrat für die MGMT darstellt. Insgesamt würde sich dadurch

auch die erhöhte Sensitivität der MGMT-defizienten Zellen gegenüber Azaserin in den

Geno- und Zytotoxizitätstests erklären und auf die fehlende Reparatur der O6-CMG-

Addukte durch die MGMT zurückführen lassen.

Der alkalische Comet-Assay detektiert zwar den Großteil aller DNA-Schäden, es ist je-

doch keinesfalls möglich, spezifisch zwischen den verschiedenen DNA-Schäden zu un-

terscheiden. Daher kann die ursprüngliche Fragestellung, ob die MGMT für die Reparatur

des O6-CMG-Adduktes verantwortlich ist, in diesem Versuchsteil nur angenommen, aber

noch nicht vollständig beantwortet werden. Die Azaserin-induzierte Genotoxizität gibt

zwar erste Hinweise darauf und zeigt, dass die MGMT eine Rolle bei der Azaserin-indu-

zierten Genotoxizität spielt, jedoch kann in dieser Frage nur eine O6-CMG-Addukt-Quan-

tifizierung Aufschluss geben.

4.1.4 Analyse der DNA-Addukte in den Azaserin behandelten HCEC WT

und HCEC MGMT --Zellen

Die DNA-Addukte wurden mithilfe einer hochauflösenden Massenspektrometrie quanti-

fiziert. Die vorläufigen Daten (n=2, ohne statistische Auswertung) bestätigten bisher die

Hinweise aus den Zyto- und Genotoxizitätsanalysen. Dabei wiesen die MGMT-defizien-

ten Zellen nach 4 Std. und 24 Std. O6-CMG-Addukte auf, WT-Zellen hingegen nicht. Zu-

vor ging man davon aus, dass O6-CMG als eines von sehr wenigen O6-Guaninaddukten

nicht von der MGMT repariert wird. Eine Studie von Shuker et al. [103] mit E.Coli- und

MCR5-Zellextrakten zeigte, dass O6-CMG kein Substrat für die MGMT darstellt. Aus

diesem Grund wurde seither angenommen, dass O6-CMG eine besondere Rolle in der

CRC-Entstehung spielt. Senthong et al. [10] veröffentlichte jedoch 2013 erstmalig, dass

neben anderen MGMT-Substraten auch O6-CMG zur Inaktivierung der MGMT führt.

Diese Studie wurde allerdings in einem zellfreien System durchgeführt. Dabei wurde die

aufgereinigte MGMT mit Oligonukleotiden und den entsprechenden DNA-Läsionen in-

kubiert und die Inaktivierung der MGMT gemessen. Die Ergebnisse der vorliegenden

Arbeit unterstützen die Hypothese von Senthong et al. [10] und zeigen erstmalig in einem

Zellkultursystem mit humanen Kolonepithelzellen, dass die MGMT an der Reparatur des

O6-CMG-Adduktes beteiligt ist. Im Rahmen der Methodenentwicklung für die DNA-

Diskussion

81

Addukt-Quantifizierung fiel jedoch auf, dass WT-Zellen mit ausreichender MGMT-Ex-

pression noch immer geringe Mengen an O6-MeG- und O6-CMG-Addukten aufwiesen

(vorläufige Quantifizierung der O6-CMG-Addukte mittels LC-ESI-MS/MS, Anhang Ab-

bildung 6-1). O6-MeG-Addukte werden normalerweise sehr schnell und effizient von der

MGMT repariert. Dabei ist bekannt, dass ein MGMT-Protein nur ein DNA-Addukt repa-

rieren kann und der Verbrauch der MGMT-Proteine die MGMT-Gentranskription inner-

halb der Zelle induziert. Aufgrund dessen musste also ausgeschlossen werden, dass even-

tuell nicht ausreichend MGMT vorhanden war, um alle Azaserin-induzierten Addukte zu

reparieren und dies möglicherweise der Grund für die in den WT-Zellen detektierten

Addukt-Restmengen war. Daher wurden die WT-Zellen nach der Azaserin-Behandlung

erneut bezüglich ihrer MGMT-Aktivität und Expression untersucht. Sowohl im Fall der

MGMT-Aktivitäts- als auch der MGMT-Proteinanalyse konnte eine Verminderung, aber

kein vollständiger Verbrauch der MGMT nach 24-stündiger Azaserin-Behandlung beo-

bachtet werden. Nach weiteren 24 Std. Regenerationszeit stiegen die MGMT-Aktivität

sowie die MGMT-Proteinmenge wieder auf Normalniveau an. Aus diesen Ergebnissen

kann geschlussfolgert werden, dass ausreichend MGMT in den WT-Zellen vorhanden

gewesen sein muss, um sowohl die O6-MeG- als auch die O6-CMG-Addukte zu reparie-

ren.

Die Tatsache, dass in vorläufigen Tests mit den WT-Zellen, die eine ausreichende

MGMT-Expression aufweisen, ebenfalls geringe Mengen an O6-CMG-Addukte detek-

tiert wurden (n=1, Anhang Abbildung 6-1), lässt vermuten, dass die MGMT nur teilweise

an der Reparatur des O6-CMG-Adduktes beteiligt ist. Kleinere Addukte, wie O6-MeG,

werden ausschließlich durch MGMT repariert, wohingegen größere Addukte, wie Ethyl-

gruppen am O6-Guanin, ebenfalls vom NER-System repariert werden können [203, 204].

Von der Größe und der räumlichen Anordnung her sind Ethyl- und Carboxymethylgrup-

pen ähnlich aufgebaut (Abbildung 4-1).

A

B

Abbildung 4-1: Räumliche Darstellung beginnend vom O6-Atom des Guanins von O6-CMG (A) und O6-

Ethylguanin (B).

Diskussion

82

Daher könnte das NER-System mit der MGMT bezüglich der Reparatur von O6-CMG-

Addukten konkurrieren. In der Arbeit von Senthong et al. [10] wurde zwar gezeigt, dass

die MGMT durch Oligonukleotide mit O6-CMG-Läsionen inaktiviert wird, aber der IC50-

Wert für die Inaktivierung der MGMT war im Fall des O6-CMG-Adduktes doppelt so

hoch wie beim O6-MeG-Addukt [10]. Das deutet auch darauf hin, dass kleinere Addukte

scheinbar effizienter durch die MGMT repariert werden als größere. In diesem Zusam-

menhang zeigten O´Driscoll und Kollegen [174], dass NER-defiziente Lymphomzellen

extrem sensitiv auf Azaserin reagieren. Die mögliche Konkurrenz zwischen NER und

MGMT bezüglich der O6-CMG-Reparatur ließe erklären, warum bisher nicht eindeutig

gezeigt werden konnte, welcher Reparaturmechanismus für dieses Addukt verantwortlich

ist.

4.1.5 Schlussbemerkung zur Reparatur des O6-CMG-Adduktes in HCEC-

Zellen und Ausblick

In der vorliegenden Arbeit konnte die Hypothese von Senthong et al. [10], dass das O6-

CMG-Addukt ein Substrat der MGMT ist, bestätigt werden. MGMT-knockdown Zellen

waren signifikant empfindlicher gegenüber der O6-CMG-induzierenden Substanz Azase-

rin in den Zyto- und Genotoxizitätsassays und wiesen in vorläufigen Experimenten zur

DNA-Addukt-Quantifizierung ein Defizit in der Reparatur des O6-CMG-Adduktes auf.

Die Adduktrestmenge in den WT-Zellen mit hoher MGMT-Aktivität deute dennoch da-

rauf hin, dass größere Addukte, wie das CMG-Addukt, weniger effizient von der MGMT

repariert werden als kleinere Addukte. Da größere Addukte auch vom NER-System re-

pariert werden, könnten NER und MGMT, bezogen auf die O6-CMG-Reparatur, mitei-

nander konkurrieren. Bisher konnte nicht vollständig geklärt werden, welcher Repara-

turmechanismus für O6-CMG verantwortlich ist. Dennoch wurde dieses Addukt vermehrt

in Kolonepithelzellen nach dem Verzehr von rotem Fleisch nachgewiesen, weshalb davon

ausgegangen wird, dass O6-CMG-Addukte eine besondere Rolle in der CRC-Entstehung

spielen. Auch wenn NER sowie MGMT für die Reparatur von O6-CMG-Addukten ver-

antwortlich sein sollte, kann die Expression beider Proteine in der Darmmukosa der ver-

schiedenen Individuen in der Bevölkerung stark variieren. Dazu trägt zum einen die un-

terschiedliche Humanexposition gegenüber nitrosierenden Agenzien sowie die daraus re-

sultierende temporäre Reduktion der MGMT- und NER-Aktivität und zum anderen das

Auftreten von genetischen Polymorphismen im Fall der DNA-Reparatur-Enzyme bei. So

Diskussion

83

konnte gezeigt werden, dass MGMT-Polymorphismen das CRC-Risiko beeinflussen kön-

nen [205-207]. Durch den Konsum von rotem Fleisch und auch anderen Lebensmitteln

nehmen wir beträchtliche Mengen an Aminosäuren auf. Eine der wichtigsten Aminosäu-

ren ist Glycin. Nitrosiertes Glycin führt, genau wie Azaserin, zur Entstehung von Dia-

zoacetat. Wie bereits erläutert, induziert dieses hauptsächlich CMG-Addukte. Dadurch

ließe sich erklären, warum die Aufnahme von proteinhaltiger Nahrung wie Fleisch eher

zu O6-CMG-Addukten als zu anderen Addukten führt. Die biologische Relevanz des O6-

CMG-Adduktes während der CRC-Entstehung wird zudem dadurch verdeutlicht, dass

CMG-Addukte p53-Mutationen induzieren, die nahezu identisch mit den Mutationen in

Kolonkrebszellen sind, wohingegen O6-MeG ein anderes Mutationsspektrum aufweist

[1]. Aufgrund dieser Erkenntnisse lässt sich schlussfolgern, dass Reparaturmechanismen

wie MGMT, NER und BER eine protektive Wirkung während der CRC-Entstehung zu-

geschrieben werden können und dadurch die Entstehung des CRCs beeinflussen. Um

vollends zu klären, ob neben der MGMT auch NER an der Reparatur des O6-CMG-

Adduktes beteiligt ist und beide konkurrieren, müssen zum einen die vorläufigen Daten

zur DNA-Addukt-Quantifizierung bestätigt und weitere In vitro-Experimente mit NER-

defizienten und NER/MGMT-defizienten Zellen durchgeführt werden.

4.2 Auswirkungen von NO-Häm auf HCEC-Zellen

Zellen des Gastrointestinaltrakts sind exogen sowie endogen gebildeten Nitrosoverbin-

dungen ausgesetzt. Diese alkylieren die DNA der Zellen und führen somit zu DNA-

Addukten, wie sie im ersten Teil der Dissertationsarbeit beschrieben wurden. Einige die-

ser DNA-Addukte konnten nach dem Verzehr von rotem Fleisch detektiert werden und

es ist bekannt, dass bei fehlender Reparatur der Addukte Genmutationen entstehen kön-

nen, die eine entscheidende Rolle in der CRC-Entstehung spielen. Ende 2015 wurde dann

von der IARC bekannt gegeben, dass verarbeitetes rotes Fleisch kanzerogen und unver-

arbeitetes rotes Fleisch vermutlich kanzerogen für den Menschen ist. Bisher ist nicht klar,

warum der Konsum von rotem Fleisch zur CRC-Entstehung führt, aber es scheint eine

Komponente im roten Fleisch zu geben, die nicht oder in geringeren Mengen in weißem

Fleisch vorhanden ist. Aus diesem Grund sollte im zweiten Teil dieser Arbeit analysiert

werden, ob das nach dem Verzehr von rotem Fleisch endogen gebildete NO-Häm even-

tuell dazu beiträgt. Dafür wurden humane Dickdarmepithelzellen ein- und mehrmalig mit

Diskussion

84

synthetisiertem NO-Häm behandelt und bezüglich verschiedene Parameter der malignen

Zelltransformation untersucht.

4.2.1 NO-Häm-Synthese und -Verifizierung

Da NO-Häm sehr instabil und nicht käuflich zu erwerben ist, musste es vor Ort syntheti-

siert werden. Für die Herstellung von NO-Häm sind einige Protokolle bekannt, jedoch

wurde das Protokoll von Jankiewicz et al. [170] verwendet, da hierbei das Lösungsmittel

DMSO, das am besten für die Zellkulturexperimente geeignet ist, eingesetzt wird. Für die

Herstellung wurde Hämin, eine mit Chlorid stabilisierte Form von Häm, in einem

DMSO/H2O-Gemisch gelöst. Da Hämin eine begrenzte Löslichkeit in DMSO aufweist,

konnte nur eine maximale Konzentration von ca. 1,8 mg Hämin/ml verwendet werden.

Die in der Literatur verwendeten Hämin-Konzentrationen liegen zwischen 1 und 5 mM

[208, 209], sodass die Endkonzentration des NO-Häms von 2,07 mM nach Zugabe aller

Reaktionskomponenten im Rahmen der Löslichkeitsgrenze liegen sollte. Die Löslichkeit

des Hämins in DMSO konnte durch Zugabe des Reduzierungsagens Natriumdithionit und

NaNO2 zusätzlich erhöht werden [170]. Zur Bestimmung der optimalen NaNO2-Konzent-

ration für die Herstellung von NO-Häm wurden nach Zugabe von Natriumdithionit, wel-

ches das Chlorid vom Eisen des Häms entfernt, verschiedene NaNO2-Konzentrationen

hinzugegeben. Das dabei entstandene NO-Häm wurde im NOA durch eine indirekte NO-

Häm-spezifische Messung quantifiziert. Dabei stellte sich heraus, dass eine NaNO2-End-

konzentration ≥ 1,5 mM zu keinem weiteren Anstieg der NO-Häm-Konzentration führte.

Daher wurde eine NaNO2-Konzentration von 1,8 mM für die Synthese von NO-Häm ver-

wendet. Jankiewicz et al. [170] zeigten bereits in ihrer Arbeit, dass ein etwa 1:1-Verhält-

nis von NaNO2 und reduziertem Hämin verwendet werden musste, um dieses vollständig

in NO-Häm umzuwandeln. Wenn ein NO-Molekül mit einem Häm-Molekül reagiert,

Diskussion

85

führt das zu Bildung von Mononitrosyl-Häm (NO-Häm). Jedoch besteht auch die Mög-

lichkeit, dass zwei NO-Moleküle mit einem Häm-Molekül reagieren. Dabei entsteht Di-

nitrosyl-Häm [2] (Abbildung 4-2).

Wird jedoch das Protokoll von Jankiewicz et al. [170] angewendet, so postulierten diese,

dass kein Dinitrosyl-Häm entsteht. Nach Angaben der Autoren stellt der Peak bei

1678 nm im Infrarotspektrum die Bindung zwischen NO und dem Eisen des Häms dar.

Ein Peak bei 1900 nm würde auf eine zweite NO-Bindung am Eisen hindeuten [210].

Jedoch konnte dieser in der Arbeit von Jankiewicz und Kollegen [170] nicht detektiert

werden, weshalb man ausschließlich von einer Mononitrosyl-Häm-Bildung ausging.

Auch Pegg und Shahidi [2], die nach demselben Protokoll vorgegangen waren, zeigten,

dass ca. 96 % des reduzierten Häms zu NO-Häm umgesetzt wurden. Außerdem beobach-

teten sie, dass ein 1:1-Verhältnis zwischen NO und Häm vorlag; dadurch haben die Au-

toren angenommen, dass ausschließlich Mononitrosyl-Häm entstand (NO-Häm). Auch

wenn in den zuvor genannten Arbeiten gezeigt wurde, dass es sich dabei jeweils um NO-

Häm handelte, musste dies ebenfalls in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Als direkte

Nachweismethode bot sich dabei die uns zur Verfügung stehende Infrarotspektroskopie

(Engl.: FTIR) und Kernspinresonanzspektroskopie (Engl.: NMR) an. Das FTIR fand

ebenfalls bei den zuvor erwähnten Arbeiten Anwendung. Das in dieser Arbeit hergestellte

NO-Häm wies dasselbe IR-Spektrum wie das in der Arbeit von Jankiewicz et al. [170]

hergestellte NO-Häm auf. Auch Sun et al. [60] und Yu et al. [211] zeigten ähnliche FTIR-

Spektren von NO-Häm. Während der Messung wurde jedoch beobachtet, dass das Spekt-

rum von Hämin, der Ausgangssubstanz zur Herstellung von NO-Häm, sehr ähnlich zum

FTIR-Spektrum von NO-Häm aus der Arbeit von Jankiewicz et al. [170] war (Abbildung

Abbildung 4-2 Darstellung von Mono- und Dinitrosyl-Häm. Abbildung modifiziert nach [2].

Mononitrosyl-Häm Dinitrosyl-Häm

Diskussion

86

4-3A). Dort wurde postuliert, dass der Peak bei ca. 1736 nm charakteristisch für die Häm-

Komponente und der Peak bei 1678 nm charakteristisch für die NO-Bindung am Eisen

des Häms sei. Jedoch fällt beim Hämin-Spektrum auf, dass beide Peaks bereits hier vor-

handen sind (Abbildung 4-3B). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die Annahme,

der Peak bei 1678 nm stünde ausschließlich für die NO-Bindung am Häm, nicht zutrifft.

Aufgrund der starken Häm-Bande bei ca. 1700 nm ist es generell sehr schwierig, den

Peak bei 1678 nm von diesem zu unterscheiden und somit eine eindeutige Aussage über

die NO-Bindung am Häm zu treffen.

A

B

Abbildung 4-3: IR-Spektrum von NO-Häm aus der Arbeit von Jankiewicz et al. [170] (A) und Hämin aus

der Datenbank für organische Verbindungen (SDBS) (B).

Aufgrund dessen wurde diese Methode nicht zur direkten Verifizierung oder Quantifizie-

rung von NO-Häm herangezogen. Ein ähnliches Ergebnis erzielte die NMR-Analyse. Die

Diskussion

87

maximale gebildete Menge an NO-Häm war nicht ausreichend, um ein Signal im NMR

zu detektieren. Deshalb konnte zur direkten Verifizierung ausschließlich die UV/Vis-

Spektroskopie verwendet werden. Dafür wurde das Spektrum von der Ausgangssubstanz

Hämin, dem Zwischenprodukt Deoxy-Häm und dem Produkt NO-Häm gemessen. Als

Blank diente das Lösungsmittel DMSO/H2O. Die in dieser Arbeit gemessenen Hämin-

und Deoxy-Häm-Spektren stimmten mit den in der Literatur beschriebenen Spektren

überein. Die Reduktion von Hämin führte zur Bildung von Deoxy-Häm mit den charak-

teristischen Q-Banden im Bereich von 520-570 nm [170, 212]. Nach Zugabe von NaNO2

entstand NO-Häm. Dabei veränderte sich das Spektrum und die beiden Q-Banden wurden

durch eine längliche Q-Bande ersetzt. Abhängig davon, ob am Eisen des Häms ein oder

zwei NO-Moleküle binden, entsteht das zuvor erwähnte Mono- oder Dinitrosyl-Häm.

Beide Formen weisen unterschiedliche Spektren auf. Dinitrosyl-Häm, hergestellt durch

die Reaktion der Häm-Komponente in der Guanylatzyklase und NO, wies nach Angaben

von Andrew et al. [212] zwei Q-Banden bei 540 nm und 575 nm auf, jedoch wurde an-

genommen, dass es instabil ist und zum Mononitrosyl-Häm zerfällt. Somit wurde nur

noch eine Bande bei rund 570 nm beobachtet. Auch bei Fotiou et al. [213] und Wang et

al. [214] entstand Mononitrosyl-Häm, das nur eine Bande bei 570 nm aufwies. Generell

gibt es in Abhängigkeit des verwendeten Lösungsmittels bzw. der eingesetzten Aus-

gangssubstanzen Abweichungen im NO-Häm-Spektrum. So zeigten Soltanizadeh und

Kadivar [215], dass NO-Myoglobin zu einem anderen Spektrum führte als NO-Häm.

Aufgrund des Spektrums von NO-Häm und den Vergleichsdaten der Literatur kann je-

doch angenommen werden, dass das in dieser Arbeit eingesetzte NO-Häm tatsächlich

NO-Häm war.

4.2.2 NO-Häm-Quantifizierung

Da keine Methode zur direkten Quantifizierung von NO-Häm zur Verfügung stand,

wurde NO-Häm mithilfe einer indirekten Messung im NOA erneut verifiziert und zusätz-

lich quantifiziert. Dafür wurde die Methode von Salgado et al. [173] verwendet, bei der

Kaliumhexacyanoferrat (III) spezifisch die Bindung zwischen NO und Häm spaltet. Das

freigesetzte NO reagiert dann im Gerät mit Ozon und das dabei entstandene Produkt wird

gemessen. Dementsprechend ergibt ein NO-Molekül ein Signal, welches der gebildeten

NO-Häm-Menge entspricht. Der Nachteil dieser Methode ist, dass man nicht zwischen

Mononitrosyl-Häm und Dinitrosyl-Häm unterscheiden kann. Dementsprechend könnte

Diskussion

88

Dinitrosyl-Häm während der Messung im NOA zwei NO-Signale hervorbringen, sodass

man die NO-Häm-Menge nicht korrekt quantifizieren würde. Jedoch geht man nach An-

gaben der Literatur davon aus, dass Dinitrosyl-Häm instabil ist und zu Mononitrosyl-Häm

zerfällt, weshalb man in dieser Arbeit bei der Quantifizierung ausschließlich von der Bil-

dung von Mononitrosyl-Häm ausging.

Zur Erstellung der Kalibriergeraden wurde Natriumnitrit verwendet. Dieses wurde in ei-

ner anderen Reaktionslösung als NO-Häm gemessen. Auch Salgado et al. [173] und

Kuhnle et al. [171] nutzten in ihren Arbeiten mit dem NOA eine NaNO2-Kalibriergerade.

Die Begründung dafür ist, dass, wie im Fall vom NO-Häm, aus einem NaNO2-Molekül

ein NO-Molekül freigesetzt wird und die freigesetzte NO-Menge somit direkt proportio-

nal zur eingesetzten NaNO2-Menge ist. Die für die Quantifizierung eingesetzte Methode

von Salgado et al. [173] ist eine oft verwendete Methode zur spezifischen NO-Häm-De-

tektion. Das in der Reaktionslösung enthaltene Kaliumhexacyanoferrat (III) führt zur Ein-

Elektron-Oxidation am Häm. Das oxidierte Eisen hat eine geringere Affinität zum NO

und es kommt zur Denitrosierung [82]. Nach Angaben von Gladwin und Kollegen [216]

spaltet Kaliumhexacyanoferrat (III) ausschließlich die Bindung zwischen dem Häm-Ei-

sen und NO. Weitere Bindungen, wie beispielsweise die von NO an dem Cystein 93 des

β-Globins vom Hämoglobin, werden nicht abgespalten [216]. Zudem ist bei dieser Me-

thode generell keine Kreuzreaktion mit anderen Nitrosoverbindungen sowie Nitrit oder

Nitrat zu erwarten [217] Auch die Kontrolle Nitroprussid, die einen ähnlichen Eisenkom-

plex mit NO-Bindung aufweist, führte, wie in einer früheren Arbeit [217] gezeigt wurde,

nicht zu einem Signal während der Messung. Bei der spezifischen Messung von NO-Häm

konnten ca. 95 % des eingesetzten Hämins zu NO-Häm umgesetzt werden, sodass in allen

In vitro-Experimenten mit einer Ausgangskonzentration von ~1,9 mM gearbeitet wurde.

Bei der Berechnung der Konzentration ging man, wie bereits erwähnt, davon aus, dass es

sich bei dem synthetisierten NO-Häm ausschließlich um Mononitrosyl-Häm handelt. Die

nicht vollständig erreichte Umsetzung von Hämin zu NO-Häm ist vermutlich auf Sauer-

stoffreste in den verwendeten Lösungen, die zur Bildung von Met-Häm führten, oder auf

die begrenzte Löslichkeit des Hämins zurückzuführen. Ein weiterer Grund könnte die

nicht 100 %-ige Reinheit des Ausgangsstoffes Hämin sein. Hämin hat nach Herstelleran-

gaben eine Reinheit von ≥ 90 %; die Reinheit des Hämins wurde jedoch bei der Konzent-

rationsberechnung nicht berücksichtigt.

Diskussion

89

Des Weiteren ist zu berücksichtigen, dass bei der Generierung von NO-Häm verschiedene

Verbindungen, wie z.B. das oxidierte Natriumdithionit, noch immer in der Reaktionslö-

sung enthalten waren. Diverse Versuche, die Lösung zu entsalzen und NO-Häm zu ext-

rahieren, waren nicht erfolgreich. Dabei wurde das NO-Häm-haltige Reaktionsgemisch

auf Entsalzungssäulen geladen. Jedoch war das NO-Häm-Molekulargewicht von

647 kDa für die meisten Säulen zu gering, sodass NO-Häm nicht extrahiert werden

konnte. Dazu kommt, dass der Extraktionsprozess zur Verringerung der Stabilität von

NO-Häm führte und dessen Ausbeute zusätzlich verringerte.

Aufgrund dessen wurde während dieser Studie mit dem im Methodenteil beschriebenen

Reaktionsgemisch gearbeitet, welches alle Reaktionskomponenten enthielt. Als Kontrolle

wurde deshalb der Blank (Häm) mitgeführt, der bis auf Nitrit alle Reaktionskomponenten

enthielt. Dieser wurde in allen In vitro-Experimenten mit NO-Häm mitgeführt, um mög-

liche Effekte durch andere Reaktionskomponenten auszuschließen.

4.2.3 Stabilität von NO-Häm

NO-Häm wurde in früheren Arbeiten teilweise als pH-, sauerstoff- und lichtempfindlich

beschrieben [60, 211]. Somit stellte sich die Frage, ob Komponenten des Mediums und/o-

der die geringen Sauerstoffkonzentrationen die Stabilität von NO-Häm beeinflussen

könnten. Um diese unter Zellkulturbedingungen zu analysieren, wurde NO-Häm in Zell-

kulturmedium verdünnt, unter hypoxischen Bedingungen inkubiert und die NO-Häm-

Menge im NOA quantifiziert. Zur Testung der Stabilität wurde außerdem zwischen se-

rumfreiem und serumhaltigem Medium unterschieden. Dabei konnte gezeigt werden,

dass NO-Häm im serumhaltigen Medium wesentlich stabiler als im serumfreien Medium

ist. Das Serum ist eine komplexe Mischung aus vielen Biomolekülen. Die darin enthalte-

nen Wachstumsfaktoren sollen u.a. das Wachstum der Zellen fördern. Die verminderte

Stabilität von NO-Häm könnte mit diesen im Serum enthaltenen Molekülen zusammen-

hängen. So ist bekannt, dass beispielsweise Albumin mit Häm interagieren kann [218].

Zwischen den Molekülen im Serum und NO-Häm könnte es zwar zu Interaktionen kom-

men, jedoch scheinen diese reversibel zu sein, da NO-Häm über die ganze Dauer der

Messung detektiert werden konnte. Zudem scheint das Serum die Halbwertszeit zu ver-

längern, wodurch eine längere Exposition der Zellen mit NO-Häm gewährleistet werden

konnte. Ein Effekt durch den pH des Mediums war nicht zu erwarten; Yu et al. [211]

konnten zeigen, dass NO-Häm unter stark basischen Bedingungen instabil ist, dass es

Diskussion

90

aber unter den pH-Bedingungen des Mediums (pH ~7,4) im Rahmen von EPR-, FTIR-

und UV/Vis-Analysen unverändert bleibt.

Aufgrund der oben genannten Gründe wurden die Zellen mit NO-Häm in Anwesenheit

des Serums inkubiert.

4.2.4 Auswirkung der NO-Häm-Behandlung auf die HCEC-Zellen

Die HCEC WT- und MGMT - -Zellen wurden in einem ersten Schritt einmalig mit NO-

Häm behandelt, um nachzuweisen, dass NO-Häm vollständig in die Zellen gelangt, und

um mögliche zyto- und genotoxische Effekte zu analysieren. Daraufhin wurden HCEC

WT-, MGMT -- und HCEC RPA-Zellen zyklisch mit NO-Häm behandelt und auf Para-

meter der malignen Zelltransformation untersucht.

4.2.4.1 Einmalige NO-Häm-Behandlung

4.2.4.1.1 Proteinexpressionsanalyse von HO-1 und 3-NT

Bei der einmaligen Behandlung mit NO-Häm sollte untersucht werden, ob NO-Häm in

die Zellen aufgenommen wird und mit intrazellulären Molekülen interagiert. Dafür wurde

die Expression von HO-1 und 3-NT analysiert. HO-1 ist eine Hämoxygenase, die durch

Häm induziert wird. 3-NT ist ein Marker für nitrosativen Stress, im Zuge dessen Tyro-

sinreste in verschiedenen Proteinen nitrosiert werden. Beide Marker wurden nach der ein-

maligen NO-Häm-Behandlung der Zellen analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Expres-

sion von HO-1 konzentrationsabhängig zunahm und 3-NT auch bei höheren NO-Häm-

Konzentrationen detektiert werden konnte. Somit wiesen die Ergebnisse nach, dass NO-

Häm in die Zellen aufgenommen wird und intrazellulär zu nitrosativem Stress führt.

Die erstmalige Charakterisierung und die Hämin-vermittelte Induktion der HO-1-Expres-

sion erfolgte in den späten 60er Jahren [219, 220]. Im Laufe der Jahre zeigte sich jedoch,

dass auch andere chemische und physikalische Stressoren, wie UV-Strahlung und diverse

NO-Donore in vielen verschiedenen Zelltypen zur HO-1-Expression führten [221-223].

Die Expression von HO-1 findet hauptsächlich in Geweben statt, die am Erythrozyten-

und Hämoglobin-Metabolismus beteiligt sind; in anderen Geweben wird HO-1 nur zu

einem sehr geringen Anteil oder gar nicht exprimiert. Die Exposition gegenüber verschie-

dene Stressoren führt jedoch auch in diesen Zellen zu einer schnellen Aktivierung der

Transkription [223]. Epithelzellen gehören zu den Zellen, die eine geringe HO-1-Expres-

sion aufweisen. Auch in der vorliegenden Arbeit war die Expression von HO-1 in den

Diskussion

91

unbehandelten HCEC-Zellen sehr gering. Die NO-Häm-Behandlung führte jedoch zu ei-

ner eindeutigen Erhöhung der HO-1-Expression. Auch wenn andere Stressoren die HO-

1-Expression induzieren können, lässt die konzentrationsabhängige Expressionserhöhung

von HO-1 insgesamt darauf schließen, dass auch NO-Häm tatsächlich in der Lage ist, die

HO-1-Transkription zu aktivieren.

Die NO-Häm-Behandlung induzierte auch nitrosativen Stress in beiden Zelllinien. Der

Stressmarker 3-NT konnte nach einer Inkubation mit 35 µM NO-Häm sowie mit 70 µM-

NO-Häm detektiert werden. Bei der Analyse von 3-NT werden alle Tyrosin-haltigen Pro-

teine detektiert, in denen die dritte Position des aromatischen Phenolrings nitrosiert vor-

liegt [224]. Dazu gehören beispielsweise Proteine wie die Superoxiddismutase, Cy-

tochrom c, GAPDH und γ-Actin [225-227]. Die Nitrosierung kann sowohl zu Struktur-

als auch zu Funktionsveränderungen des Proteins führen. Wenn es zu einer Funktions-

veränderung kommt, gewinnt das Protein an Funktionen oder verliert diese vollständig

[228]. Beispielsweise inaktiviert eine Nitrosierung die Glutathion-Reduktase, da nitro-

siertes Tyr-106 und Tyr-114 zur Verringerung der Substratbindung führt [229, 230]. Bei

einem möglichen Verlust oder Gewinn von Funktionen muss jedoch ebenfalls berück-

sichtigt werden, dass nitrosierende Agenzien auch immer die Aminosäuren Cystein und

Methionin nitrosieren und somit auch zu Proteinfunktionsveränderungen führen können

[231].

Die durch NO-Häm stattgefundene Nitrosierung der Proteine zeigte, dass NO-Häm voll-

ständig und ohne Verlust des NO-Restes in die Zellen gelangte. Eine Funktionsverände-

rung der Proteine wurde nicht genauer untersucht und kann deshalb im Rahmen dieser

Studie nicht ausgeschlossen werden.

4.2.4.1.2 NO-Häm-induzierte Zytotoxizität

Für die Zytotoxizitäts-Analyse wurden die HCEC WT- und MGMT --Zellen mit NO-Häm

behandelt und eine zelluläre ATP-Messung nach 4 Std, 24 Std. und 48 Std. durchgeführt.

Dabei führte NO-Häm in beiden Zelllinien zu einem zeit- und konzentrationsabhängigen

Verlust des zellulären ATPs und dadurch zu einem Verlust der Viabilität der Zellen. Ein

Unterschied zwischen den WT- und MGMT-defizienten Zellen konnte nicht beobachtet

werden. Diese Beobachtung deutet daraufhin hin, dass die MGMT keinen Einfluss auf

die NO-Häm-induzierte Zytotoxizität ausübt. Der Häm-Blank führte jedoch zu ähnlichen

Ergebnissen wie NO-Häm. Glei und Kollegen [57] konnten in einer früheren Studie zei-

Diskussion

92

gen, dass Hämin und Hämoglobin nach 24 Std. und 72 Std. die Zahl an HT29-Zellen so-

wie die von primären Kolonepithelzellen reduzierte. Hämin war dabei wesentlich effek-

tiver als Hämoglobin. Dies könnte darauf beruhen, dass Hämoglobin aufgrund seiner

Größe nur eingeschränkt intrazellulär wirken kann. So konnte auch gezeigt werden, dass

die zelluläre Eisenaufnahme im Fall des Hämins wesentlich effizienter verläuft als im

Fall des Hämoglobins [57]. Die zytotoxische Wirkung des NO-Häms und auch die ande-

rer Häm-Formen ist zum Teil auf den durch diese Verbindungen induzierten oxidativen

Stress zurückzuführen. So wurde berichtet, dass Antioxidantien protektiv gegenüber

Häm-induziertem oxidativen Stress wirken [232, 233]. Neben der Häm-Komponente an

sich könnte auch Stickstoffmonoxid am Eisenatom zur Zytotoxizität beigetragen haben.

NO-Häm ist ebenfalls ein NO-Donor, von dem bekannt ist, dass er zytotoxisch wirkt.

NO-Donore wie SNAP, GSNO und DEA/NO führen in einigen Zelltypen zur Zytotoxi-

zität [234-236]. Der NO-Häm-induzierte nitrosative Stress kann, wie bereits erwähnt, zur

Funktionsveränderung diverser Proteine führen. Veränderte Funktionen von Proteinen

können ebenfalls die Vitalität der Zelle beeinflussen oder bei mangelnder Funktion wich-

tiger zellulärer Proteine unter Umständen den Prozess der Apoptose einleiten.

4.2.4.1.3 NO-Häm-induzierte Genotoxizität

Um NO-Häm-induzierte DNA-Schäden zu untersuchen, wurde der alkalische Comet-As-

say durchgeführt. Dafür wurden die Zellen für 4 Std. und 24 Std. mit NO-Häm behandelt

und danach einer Einzelzellelektrophorese zur Detektion von fragmentierter DNA unter-

zogen. Nach 4 Std. konnte bereits in beiden Zelllinien eine zunehmende Schweifintensität

beobachtet werden. Nach 24 Std. konnte ein signifikanter Unterschied in der Schweifin-

tensität beider Zelllinien im Vergleich zur Kontrolle und zum Häm-Blank dokumentiert

werden. Dabei gab es aber auch hier keinen Unterschied zwischen WT- und MGMT-

defizienten Zellen. Ähnlich wie im Fall des Zytotoxizitätstests schien die MGMT keinen

Einfluss auf die NO-Häm-induzierten DNA-Schäden zu haben und an der DNA-Repara-

tur nicht beteiligt zu sein. Nichtsdestotrotz wurde ein genotoxisches Potenzial von NO-

Häm beobachtet. Glei et al. [57] konnten in einer früheren Studie zeigen, dass sowohl

Hämin als auch Hämoglobin genotoxisch in HT29 und primären Kolonepithelzellen wir-

ken. Seiwert et al. [237] berichtete im Rahmen eines in diesem Jahr gehaltenen Tagungs-

vortrages, dass Hämin zur Zytotoxizität und zu einem Anstieg des Genotoxizitäts-Mar-

kers γH2AX in den HCEC-Zellen und in vivo zum vermehrten Zelltod und zur DNA-

Schädigung in Kolonzellen führt. Bei der in der vorliegenden Arbeit beobachteten NO-

Diskussion

93

Häm-induzierten Genotoxizität ist jedoch zu beachten, dass gleichzeitig auch die Zytoto-

xizität relativ hoch war und dadurch falsch-positive Ergebnisse nicht ausgeschlossen wer-

den können. Wie bereits im ersten Teil dieser Arbeit diskutiert wurde, sollte zur Vermei-

dung von falsch- positiven Ergebnissen im Comet-Assay die in den Zellen gemessene

ATP-Menge nicht um mehr als 50 % vermindert werden. Bei einer 40 µM-NO-Häm-Be-

handlung sank die Vitalität der Zellen jedoch stark und dieser Effekt kann somit zur Frag-

mentierung der DNA geführt haben. Nichtsdestotrotz ist der Trend bezüglich der NO-

Häm-induzierten Genotoxizität in beiden Zelllinien zu beobachten gewesen. Der Häm-

Blank führte in diesem Testsystem zu keinem oder nur zu einem sehr geringen Anstieg

der Schweifintensität. Insgesamt deuten diese Ergebnisse und die von anderen Arbeits-

gruppen darauf hin, dass die Häm-Komponente an sich, unabhängig von der Bindung am

Eisen, zyto- und genotoxisch wirkt. Sowohl das mit Chlorid gebundene Hämin als auch

Hämo- und Myoglobin induzierten DNA-Schäden und verringerten die Zellviabilität in

vitro und in vivo. Des Weiteren kann nicht ausgeschlossen werden, dass die weiteren Re-

aktionskomponenten aus dem Gemisch zur Herstellung von NO-Häm zur Geno- und Zy-

totoxizität beigetragen haben. Die NO-Häm-Lösung enthält im Vergleich zum Häm-

Blank zusätzlich Nitrit, in dessen Fall ebenfalls zytotoxische Wirkungen beschrieben

wurden. Nitrit führte in einer früheren Studie zu einer konzentrationsabhängigen Vermin-

derung der Proliferation von Epithelzellen, wobei hier zu berücksichtigen ist, dass diese

Konzentrationen im mM-Bereich lagen [238]. Außerdem haben Stevanovic et al. [239]

festgestellt, dass Nitrit im Ames-Test mutagen wirkt. Zwar wurde bei der Herstellung des

NO-Häms die minimal benötigte Konzentration von Nitrit eingesetzt, jedoch kann nicht

ausgeschlossen werden, dass das Nitrit vollständig umgesetzt wurde. Somit könnte auch

eine gewisse Nitritrestmenge zur Genotoxizität beigetragen haben.

Zusammenfassend ist festgestellt worden, dass NO-Häm nach einer einmaligen Behand-

lung der HCEC-Zellen vollständig von den Zellen aufgenommen wurde und zu nitrosati-

vem Stress führte. Des Weiteren wirkte NO-Häm, aber auch der Häm-Blank, zytotoxisch.

Neben der Zytotoxizität induzierte NO-Häm bei höheren Konzentrationen ebenfalls

DNA-Schäden, die in diesem Maße bei dem Häm-Blank nicht zu beobachten waren. Ein

Unterschied zwischen WT- und MGMT-defizienten Zellen wurde bei den Zyto- und Ge-

notoxizitätsanalysen nicht beobachtet. Das deutet darauf hin, dass DNA-Schäden, die

durch NO-Häm induziert wurden, scheinbar nicht von der MGMT repariert werden konn-

ten.

Diskussion

94

4.2.4.2 Zyklische NO-Häm-Behandlung

In diesem Fall wurden die Zelllinien HCEC WT, MGMT - und RPA fünfmal mit NO-

Häm, jeweils in der exponentiellen Wachstumsphase, behandelt. Durch diese zyklische

Behandlung sollte die Langzeitwirkung von NO-Häm untersucht und die Zellen bezüg-

lich einer möglichen malignen Transformation analysiert werden. Die Zelllinie HCEC

RPA weist Mutationen in den Genen TP53, APC und KRAS auf. Diese Mutationen sind

nach dem Prinzip von Vogelstein und Fearon [14] in Kolonkrebszellen vorhanden. Daher

sollte analysiert werden, ob Zellen mit diesen bereits vorliegenden Mutationen suszeptib-

ler gegenüber einer potenziell transformierenden Chemikalie als WT- oder MGMT-defi-

ziente Zellen sind.

Nach der zyklischen Behandlung wurde festgestellt, dass weder NO-Häm und der Häm-

Blank noch Diazald, ein stark alkylierendes Agens, eine der drei Zelllinien maligne trans-

formieren konnte. NO-Häm wurde in vier Konzentrationen eingesetzt. Dabei lag die

höchste Konzentration bei 40 µM, die, wie zuvor gezeigt wurde, zu nitrosativem Stress,

Zytotoxizität und Genotoxizität führte. Nichtsdestotrotz zeigten die behandelten Zellen

kein verankerungsunabhängiges Wachstum oder den Verlust der Zell-Zell-Kontaktinhi-

bition. Diazald, das bereits bei 2,5 µM stark zytotoxisch wirkte, führte ebenfalls zu keinen

Veränderungen im Wachstumsverhalten der Zellen. Der einzige Unterschied zwischen

den behandelten und unbehandelten Zellen war, dass diese nach den Behandlungen kur-

zeitig morphologische Unterschiede aufwiesen. Die Behandlung führte zur Vergrößerung

der Zellen, die gleichzeitig lange Ausläufer ausbildeten und generell eine ungewöhnliche

Zellmorphologie annahmen. Diese phänotypische Veränderung war jedoch nur vorüber-

gehend zu sehen, und nicht alle Zellen waren davon betroffen. Daher wurde keine weitere

Auswertung bezüglich der veränderten Größe oder Länge der Zellen im Vergleich zur

Kontrolle vorgenommen. Nach dem Umsetzen der Zellen bildeten sich die Ausläufer

meist zurück. Sogar die mehrfach mutierte Zelllinie HCEC RPA wies keine Veränderun-

gen auf. Generell waren die RPA-Zellen im Vergleich zu den anderen beiden Zelllinien

kleiner und zeigten bei der Analyse der Focibildung ein anderes Wachstumsverhalten,

jedoch konnten nach der Behandlung keine Foci detektiert werden. Neben den Mehrfach-

mutationen von wichtigen regulatorischen Genen hatte auch das DNA-Reparaturenzym

MGMT keinen Einfluss auf das Ergebnis. Bei den MGMT-defizienten Zellen konnte

ebenfalls kein verankerungsunabhängiges Wachstum oder der Verlust der Zell-Zell-Kon-

taktinhibition beobachtet werden.

Diskussion

95

Wie bereits eingangs beschrieben, ist eine maligne Transformation von humanen Zellli-

nien eher selten und schwierig zu erreichen. Nichtsdestotrotz gibt es Arbeiten, in denen

humane Zelllinien bereits durch wenige Behandlungszyklen maligne transformierten. So

beschrieb Herbst et al. [240] die maligne Transformation von humanen Dickdarmepithel-

zellen durch Dihydrodiolepoxide des PAHs Benzo[c]phenanthren oder durch den HCA-

Metaboliten 2-Hydroxyamino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridin. Beide maligne

transformierte Zelllinien induzierten Tumore in Nacktmäusen. Auch Zhou et al. [241] er-

zielten eine maligne Transformation von humanen Lungenepithelzellen, indem sie diese

mit dem Tabak-spezifischen N-Nitrosamin NNK behandelten; bereits nach sieben Tagen

transformierten diese Zellen und induzierten ebenfalls Tumore in Nacktmäusen. In einer

weiteren Arbeit wurde eine andere humane Lungenepithelzelllinie mit nur fünf B[a]P-

Behandlungen maligne transformiert [242]. In allen drei Fällen wurden die verwendeten

Zellen mithilfe von SV-40-Viren oder Humanpapillomaviren (HPV E6/E7) immortali-

siert. Beide Immortalisierungsstrategien führen nachweislich zu entscheidenden Verän-

derungen in den immortalisierten Zellen. HPV E6/E7 beispielsweise destabilisiert das

Rb-Protein, wodurch kontinuierlich E2F-responsive Gene wie Cyclin A und Cyclin E ex-

primiert werden [243]. Generell interagiert HPV E6/E7 mit vielen Regulatoren und

nimmt dadurch Einfluss auf die Proliferation, Apoptose und die genomische Stabilität der

Zellen [244]. Aufgrund dieser weitgehenden Veränderungen wichtiger zellulärer Pro-

zesse ist bekannt, dass eine SV-40- oder HPV E6/E7-vermittelte Immortalisierung u. U.

per se zur malignen Zelltransformation führen kann [143-145, 245]. Dementsprechend

deutet manches darauf hin, dass im Zuge einer SV-40- bzw. HPV E6/E7-vermittelten

Immortalisierung bestimmte genetische Veränderungen stattfinden, die die Zellen „anfäl-

lig“ für eine chemisch-induzierte Transformation machen. Die in dieser Arbeit verwen-

deten HCEC-Zellen wurden durch eine CDK4- und hTERT-Genübertragung in primäre

Humankolonepithelzellen etabliert [150]. Bisher wurde die maligne Transformation von

HCEC-Zellen weder durch die alleinige Expression beider Proteine noch durch eine zu-

sätzliche chemische Behandlung beschrieben [150]. Im Gegenteil, hTERT soll das Ge-

nom stabilisieren und zur effizienteren Reparatur von DNA-Schäden führen [246, 247].

Dadurch können sich Genmutationen, die eine maligne Zelltransformation induzieren,

schlechter manifestieren. Zusammenfassend kann angenommen werden, dass die Art der

Immortalisierung der HCEC-Zellen den Prozess der malignen Zelltransformation ver-

mutlich verhindert bzw. stark erschwert.

Diskussion

96

Darüber hinaus könnten die phänotypischen Veränderungen der Zellen nach der zykli-

schen Behandlung auf eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) hindeuten. Wäh-

rend der EMT verlieren die Zellen den epithelialen Phänotyp und nehmen Eigenschaften

von Mesenchymzellen an, wodurch sie allem voran durch Herunterregulation der E Cad-

herin-Expression die Zell-Zell-Kontaktinhibition verlieren. Dieser Prozess spielt bei der

Malignisierung eine bedeutende Rolle und erhöht die Invasivität und Motilität der Zellen.

Im Fall der HCEC-Zellen muss beachtet werden, dass sie epitheliale Vorläuferzellen sind

und dadurch sowohl Epithelzellmarker als auch Mesenchymzellmarker exprimieren.

Dadurch kann eine EMT oder MET (mesenchymal-epitheliale Transition) in dieser Zell-

linie nur schlecht analysiert werden. Um eine EMT nachzuweisen, müssten die HCEC-

Zellen zuerst zu Epithelzellen ausdifferenziert und nach erfolgter Behandlung bezüglich

der Expression spezifischer Epithelzell- und Mesenchymzellmarker untersucht werden.

4.2.5 BALB/c-3T3-Zelltransformationsassay

Um die mögliche zelltransformierende Wirkung von NO-Häm zu prüfen, wurde der

BALB/c-3T3-Zelltransformationstest durchgeführt. Bei der Behandlung der BALB/c-

Zellen wurde neben dem vorgegebenen Behandlungsschema von Sasaki et al. [161] zu-

sätzlich eine Mehrfachbehandlung durchgeführt. Dabei wurden die Zellen zweimal wö-

chentlich mit NO-Häm und dem Häm-Blank behandelt, um eine Langzeitwirkung von

NO-Häm zu simulieren. Im Zelltransformationstest konnte keine transformierende Wir-

kung von NO-Häm oder den Kontrollen nach einer einmaligen Behandlung nachgewie-

sen werden. NO-Häm, der Häm-Blank und auch Hämin führten in den höchsten Konzent-

rationen zu einer geringen Zahl an Kolonien, wobei der Unterschied zu den Kontrollen

nicht signifikant war. Die wöchentliche Behandlung mit 10 µM NO-Häm und dem Häm-

Blank hingegen zeigte, dass NO-Häm signifikant mehr Kolonien im Vergleich zur

DMSO/H2O-Lösungsmittelkontrolle induzierte. Der Häm-Blank, der als Kontrolle für

NO-Häm und den darin enthaltenen Reaktionsprodukten dienen sollte, zeigte keine zell-

transformierende Wirkung.

Zusammenfassend konnte mithilfe des Zelltransformationstests gezeigt werden, dass eine

mehrmalige Behandlung mit 10 µM NO-Häm zu einer Zelltransformation führt, die Re-

aktionsprodukte aber nicht an der Transformation der Zellen beteiligt zu sein scheinen.

Auch in diesem Fall könnten NaNO2-Reste im Reaktionsgemisch im Prozess der Trans-

formation involviert sein. Es ist nachgewiesen worden, dass NaNO2 Genmutationen in

Diskussion

97

Bakterien induziert und somit eine entscheidende Rolle im Zelltransformationstest spie-

len könnte [239]. Nichtsdestotrotz scheint NO-Häm ebenfalls in der Zelltransformation

der BALB/c-Zellen involviert zu sein und unterstützt eine von Stevanovic et al. [239]

durchgeführte Studie, in der gezeigt wurde, dass NO-Häm eine leicht mutagene Aktivität

im Ames-Test aufweist. Die Ergebnisse des Zelltransformationstests unterstreichen eben-

falls die Annahme, dass die in dieser Studie verwendeten HCEC-Zellen scheinbar nicht

oder nur sehr schwer transformierbar sind. Die wesentlich empfindlicheren BALB/c-Zel-

len reagierten auf NO-Häm und weisen erstmalig auf das zelltransformierende Potenzial

dieser Substanz hin. Da die BALB/c-Zellen jedoch murine Fibroblasten sind, stellt dieses

System sicherlich nicht den besten Endpunkt dar, um die Rolle von NO-Häm in der Dick-

darmkrebsentstehung zu analysieren. Bisher ist jedoch kein Zelltransformationstest mit

humanen Dickdarmepithelzellen beschrieben worden, sodass die transformierende Wir-

kung von NO-Häm nur in diesem Testsystem analysiert werden konnte.

4.2.6 Schlussbemerkung zur Rolle von NO-Häm im Prozess der

Dickdarmkrebsentstehung und Ausblick

NO-Häm als nitrosierendes Agens scheint aufgrund von bisher veröffentlichten Untersu-

chungen eine Rolle in der Dickdarmkrebsentstehung zu spielen. Die Ergebnisse des

BALB/c-3T3-Zelltransformationstests weisen erstmalig darauf hin, dass NO-Häm als nit-

rosierendes Agens in den Prozess der Dickdarmkrebsentstehung involviert sein könnte.

Durch den Verzehr von rotem Fleisch wird vermehrt Myoglobin und dessen Häm-Kom-

ponente aufgenommen. Diese wird hauptsächlich durch Bakterien im GIT nitrosiert und

agiert dann als NO-Donor, wodurch Aminosäuren des GITs nitrosiert werden können.

Nitrosoverbindungen alkylieren die DNA und können dadurch DNA-Mutationen indu-

zieren, die für die Entstehung von CRC entscheidend sein können. Die Gruppe um Sheila

Bingham zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg der NOC-Exkretion durch den

Verzehr von rotem Fleisch. Weißes Fleisch, Protein aus pflanzlichen Quellen oder Eisen

führten hingegen zu keinem Anstieg von endogen gebildeten NOCs [65, 67, 248]. In vie-

len Studien wurden verschiedene Häm-Verbindungen, u.a. Hämin, NO-Häm, Häm, My-

oglobin und Hämoglobin, bezüglich ihrer Wirkung im GIT untersucht. Die Arbeitsgruppe

um Van de Meer [54] konnte zeigen, dass die Fütterung von Ratten mit Hämin zur Prolife-

ration der Epithelzellen im GIT führte und dass die Zytotoxizität des Fäkalwassers zu-

nahm. Weiterhin inhibiert Hämin die Zelldifferenzierung von Kolonzellen [249]. Neben

Diskussion

98

Hämin wirkt auch Hämoglobin genotoxisch auf Kolonzellen [57] und Häm verändert die

Zusammensetzung der Mikrobiota, was jedoch zu keiner Funktionsveränderung führte

[250]. Anhand dieser Beispiele zeigt sich, dass nicht ausschließlich NO-Häm für die Ent-

stehung von CRC verantwortlich sein kann, sondern eher Häm mit seinen verschiedenen

Metaboliten involviert zu sein scheint. Das Nitritpökelsalz, das beim Verarbeiten des

Fleisches hinzugegeben wird, ist ebenfalls an einer Reihe von Reaktionen, wie beispiels-

weise der Inhibierung der Lipidperoxidation, beteiligt [251]. Die exogene und endogene

Bildung der alkylierenden NOCs ist ebenfalls durch Anwesenheit von Nitrit erhöht, und

zusätzlich führt das Pökelsalz zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Die Tatsache,

dass bisher nur verarbeitetes rotes Fleisch und nicht unverarbeitetes rotes Fleisch als kan-

zerogen für den Menschen eingestuft wurde, lässt sich vermutlich dadurch erklären, dass

neben der Häm-induzierten Toxizität durch die Zugabe von Nitrit ein weiterer Risikofak-

tor hinzukommt und zur Entstehung von CRC beiträgt. Mittlerweile wird von der soge-

nannten „White Meat Controversy“ gesprochen, bei der ebenfalls nicht nur Häm als ein-

ziger Risikofaktor betrachtet wird. Verarbeitetes rotes Fleisch ist vorwiegend Schweine-

fleisch. Im Vergleich zum Rindfleisch enthält Schweinefleisch wesentlich weniger Myo-

globin. In einem Übersichtsartikel von Demeyer et al. [252] wurden die in der Vergan-

genheit ermittelten Häm-Werte in Rinder-, Schweine- und Hühnerfleisch zusammenge-

tragen und gezeigt, dass rohes und zubereitetes Schweinefleisch ähnlich viel Häm enthält

wie Hühnerfleisch. Da aber verarbeitetes rotes Fleisch als kanzerogen für den Menschen

eingestuft wurde, für diese Produkte jedoch meist nur Schweinefleisch verwendet wird,

gehen Demeyer et al. [252] davon aus, dass Myoglobin bzw. die Häm-Komponente und

seine Metabolite nicht hauptverantwortlich für die Entstehung von CRC sein können.

Demeyer et al. [252] postulieren, dass die Säugetier-spezifische Sialinsäure N-Glycolyl-

neuraminsäure (Neu5Gc) ebenfalls wichtig in der CRC-Initiation sein könnte. Neu5Gc

wird in allen Säugerzellen produziert, nicht aber in Humanzellen. Durch eine Mutation

im CMAH-Gen exprimiert der Mensch keine CMP-Neu5Ac-Hydroxylase, die normaler-

weise für die Umwandlung von N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) zu Neu5Gc verant-

wortlich ist. Durch den Konsum von rotem Fleisch nimmt der Mensch große Mengen an

Neu5Gc auf, das im GIT akkumuliert und durch eine Antikörper-vermittelte Immunreak-

tion zu einer lokalen chronischen Entzündung im GIT führt [253]. Samraj et al. [254]

zeigten, dass Neu5Gc in CMAH-defizienten Mäusen zur Entzündung der Darmmukosa

führt und nach längerer Verabreichung sowohl die Krebsinzidenz in den Tieren als auch

die Menge an Neu5Gc in den Tumoren erhöht.

Diskussion

99

Die Neu5Gc-vermittelte Entzündung der Darmmukosa per se führt nicht zu CRC, sie ist

jedoch ein Risikofaktor, der spezifisch in Verbindung mit dem Verzehr von rotem Fleisch

steht und in Kombination mit Häm und anderen genotoxischen Komponenten wie NOCs,

PAHs und HCAs die Entwicklung eines CRCs begünstigen kann. Neu5Gc, Myoglobin

oder NOCs sind nicht im weißen Fleisch vorhanden, sodass weißes Fleisch generell we-

niger CRC-relevante Risikofaktoren enthält und somit bisher nicht als kanzerogen einge-

stuft wird. Bezogen auf die ursprüngliche Fragestellung scheint NO-Häm als nitrosieren-

des Agens deshalb nicht allein für die Entstehung von CRC verantwortlich zu sein, son-

dern das Zusammenwirken/die Interaktion von verschiedenen toxischen Substanzen mit

unterschiedlichen Wirkmechanismen führt dazu, dass rotes Fleisch und insbesondere ver-

arbeitetes rotes Fleisch als Hauptrisikofaktoren in der Dickdarmkrebsentstehung gelten.

Um das Ausmaß der NO-Häm-induzierten Toxizität während der CRC-Entstehung de-

taillierter zu analysieren, sollen in einem weiteren Teil der Arbeit die NO-Häm-induzier-

ten DNA-Addukte analysiert werden. Dabei soll der Fokus auf die bereits erläuterten

DNA-Addukte O6-MeG und O6-CMG gelegt werden, da diese Addukte nachweislich

zyto- und genotoxisch in Kolonepithelzellen wirken und daher mit großer Wahrschein-

lichkeit eine entscheidende Rolle in der Initiation von CRC spielen können. Des Weiteren

sollte das Protokoll zur Herstellung von NO-Häm optimiert werden, um auszuschließen,

dass weitere Reaktionsprodukte oder Nitritreste, die während der NO-Häm-Synthese ent-

stehen, zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Die relativ großen Standardabweichun-

gen in den verschiedenen Experimenten weisen darauf hin, dass NO-Häm nicht optimal

gelöst werden konnte und die Zellen vermutlich nicht immer mit derselben NO-Häm-

Konzentration behandelt wurden. Daher muss in künftigen Studien die Löslichkeit von

NO-Häm erhöht werden. Der Grund für die geringe Zahl an Studien mit NO-Häm liegt

vermutlich darin, dass die Nutzung von NO-Häm durch Faktoren wie Löslichkeit und

Stabilität limitiert ist und daher bei den meisten Studien auf Hämin oder äquivalente Häm-

Verbindungen zurückgegriffen wird.

4.3 Schlussbetrachtung

Verschiedene Substanzen im roten Fleisch sind in der Dickdarmkrebsentstehung invol-

viert. Durch die Verarbeitung und Zubereitung von rotem Fleisch entstehen weitere Sub-

stanzen, die das Risiko scheinbar zusätzlich erhöhen. Dabei kann vermutlich keine der

Diskussion

100

bereits genannten Substanzen alleine zur Bildung von CRC führen, sondern nur jede Sub-

stanz für sich an verschiedenen Stellen der CRC-Entstehung eingreifen und den Prozess

vorantreiben. In einer Studie von Lewin et al. [139] konnte nach dem Verzehr von rotem

Fleisch die vermehrte Bildung von NOCs und die der im ersten Teil dieser Studie disku-

tierten O6-CMG-Addukte in den mit den Fäzes ausgeschiedenen Darmepithelzellen fest-

gestellt werden. O6-CMG-Addukte werden hauptsächlich durch carboxymethylierende

Substanzen wie Diazoacetat induziert. Gottschalg et al. [1] konnten nachweisen, dass

KDA, der Vorläufer des Diazoacetats, dasselbe p53-Mutationsschema induzierte das in

Kolonkrebszellen vorzufinden ist. Daher kann der partielle oder vollständige Verlust der

MGMT- und/oder NER-Aktivität, die zur Reparatur dieser Addukte benötigt wird, die

CRC-Entstehung fördern.

Die Wahrscheinlichkeit, dass der Verzehr von rotem Fleisch das Risiko, an Dickdarm-

krebs zu erkranken, erhöht, hängt vor allem vom individuellen Fleischkonsum ab. Argen-

tinien und Uruguay verzehren überdurchschnittlich viel Rind- und Kalbsfleisch. Nach

Angaben der OECD konsumierte jeder Bewohner dieser beiden Länder im Jahr 2015 ca.

40-47 kg, umgerechnet ca. 110-130 g/Person/Tag [255]. In einem Übersichtsartikel von

Schönfeldt und Hall [256] wurden Daten zum Häm-Gehalt in rotem Fleisch zusammen-

getragen. Dabei lag der durchschnittliche Eisengehalt bei 2,83 mg/100 g Fleisch, d.h.

etwa 1,65 mg Häm/100 g Fleisch. Umgerechnet bedeutet es, dass jeder Argentinier und

Uruguayer durch den Verzehr von rotem Fleisch täglich ca. 1,8-2,15 mg Häm aufnimmt.

Betrachtet man diese Menge nun im Zusammenhang mit dem individuellen Dickdarm-

volumen (~0,4 l) ergeben sich Konzentrationen von ca. 8-10 µM Häm. Die Bioverfüg-

barkeit von Häm liegt bei nur 23 % [257, 258] und ein Großteil wird mit den Fäzes aus-

geschieden. In den Arbeiten von Lewin et al. [139] und Kuhnle et al. [171] konsumierten

die Probanden 240-420 g Fleisch pro Tag, d.h. das Doppelte bis Vierfache der Menge an

rotem Fleisch, die die Argentinier und Uruguayer täglich zu sich nehmen. Auch in der

vorliegenden Arbeit und vielen anderen Studien, die die potenziell krebserregende Wir-

kung von Häm und dessen Metabolite in Darmepithelzellen untersuchten, wurden unphy-

siologische Konzentrationen im höheren µM-bis mM-Bereich verwendet, die unter realen

Bedingungen nicht zu erreichen sind, da hierfür mehrere Kilogramm rotes Fleisch täglich

verzehrt werden müssten. Die endogene Bildung von NOCs, die Bildung der verschiede-

nen DNA-Addukte, die Induktion von Genmutationen sowie die geno- und zyotoxische

Diskussion

101

Wirkung der im roten Fleisch enthaltenen Stoffe, die in diversen Studien beobachtet wur-

den, werden daher unter realen Bedingungen vermutlich nicht in diesem Ausmaß statt-

finden. Deshalb sollten derartige Ergebnisse immer in Relation zur tatsächlich verzehrten

Menge an rotem Fleisch betrachtet werden. Um das CRC-Risiko möglichst gering zu hal-

ten und weil bisher seitens der WHO keine Menge an rotem Fleisch definiert werden

konnte, die als sicher betrachtet werden kann, wird deshalb von der WHO empfohlen

möglichst wenig verarbeitetes rotes Fleisch zu konsumieren.

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Anhang

116

6 Anhang

A

B

Abbildung 6-1: Im Rahmen der Methodenentwicklung gewonnene vorläufige Daten zur O6-MeG- (A) und

O6-CMG (B)-Addukt-Quantifizierung mittel LC-ESI-MS/MS.

WT- und MGMT-defiziente Zellen wurden für 4 Std. und 24 Std. mit 75 µM Azaserin behandelt. Die

Menge der DNA-Addukte ist in fmol/µmol DNA dargestellt. Eine statistische Auswertung der vorläufigen

Daten (n=1) konnte nicht erfolgen.

Anhang

117

Abbildung 6-2: Western-Blot-Analyse der HO-1-Expression in HCEC MGMT-defizienten Zellen.

Die Zellen wurden 4 Std. und 24 Std. mit 0-5 µM NO-Häm behandelt. ACTB diente als Ladekontrolle.

ACTB

HO-1

4 Std. 24 Std.

0 1 2 5 0 1 2 5 [µM]

Nit

rosi

erte

Pro

tein

e

170 kDa

10 kDa

24 Std. 4 Std.

0 35 70 0 35 70 µM

Abbildung 6-3: Western Blot-Analyse der durch NO-Häm nitrosierten Proteine (Bereich 10-170 kDa).

HCEC MGMT --Zellen wurden 4 Std. bzw. 24 Std. mit 35 µM bzw. 70 µM NO-Häm behandelt.

ACTB diente als Ladekontrolle, Peroxynitrit als Positivkontrolle (rechts im Blot).

ACTB

Anhang

118

Abbildung 6-4: NO-Häm-induzierte Zytotoxizität in WT-Zellen.

Die Zellen wurden für 4 Std., 24 Std. und 48 Std. mit verschiedenen NO-Häm-Konzentrationen behan-

delt. Häm (50 µM) wurde als Kontrolle für NO-Häm verwendet. Dargestellt ist die relative Zellviabilität

in % verglichen zur Lösungsmittelkontrolle. Mittelwert ± SD einer Triplikatbestimmung von drei unab-

hängigen Experimenten.

Abbildung 6-5: Zytotoxizität von NO-Häm in MGMT --Zellen.

Die Zellen wurden für 4 Std., 24 Std. und 48 Std. mit verschiedenen NO-Häm-Konzentrationen behan-

delt. Häm (50 µM) wurde als Kontrolle für NO-Häm verwendet. Dargestellt ist die relative Zellviabilität

in % verglichen zur Lösungsmittelkontrolle. Mittelwert ± SD einer Triplikatbestimmung von drei unab-

hängigen Experimenten.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 10 20 30 40 50

Zellv

iab

ilitä

t [%

]

NO -Häm [µM]

4 Std.

24 Std.

48 Std.

Häm 4 Std.

Häm 24 Std.

Häm 48 Std.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 2 10 20 30 40 50

Zellv

iab

ilitä

t [%

]

NO-Häm [µM]

4 Std.

24 Std.

48 Std.

Häm 4 Std.

Häm 24 Std.

Häm 48 Std.

Anhang

119

Abbildung 6-6: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC WT nach der zyklischen NO-Häm-

Behandlung.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der Zellzahl/cm2 von einem technischen Triplikat. Neben den

Behandlungssubstanzen Diazald, Häm und NO-Häm wurden auch die entsprechenden Lösungsmittelkon-

trollen mitgeführt.

Abbildung 6-7: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC RPA nach der zyklischen NO-Häm-

Behandlung.

Dargestellt werden die Mittelwerte ± SD der Zellzahl/cm2 von einem technischen Triplikat. Neben den

Behandlungssubstanzen Diazald, Häm und NO-Häm wurden auch die entsprechenden Lösungsmittelkon-

trollen mitgeführt.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000Ze

llen

/cm

2

1. Zählung

2. Zählung

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

Zelle

n/c

m2

1. Zählung

2. Zählung

Abbildungs-, Formel- und Tabellenverzeichnis

120

7 Abbildungs-, Formel- und Tabellenverzeichnis

7.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1-1: Adenom-Karzinom-Sequenz nach Fearon und Vogelstein [14, 16]. ...... 5

Abbildung 1-2: Kanzerogenitäts-Klassifizierung von rotem und verarbeitetem rotem

Fleisch seitens der IARC. ........................................................................................ 7

Abbildung 1-3: Darstellung der 3D-Struktur von NO-Hämoglobin mit den vier Häm-

Komponenten. ....................................................................................................... 12

Abbildung 1-4: DNA-Reparatur von O6-MeG durch die O6-Methylguanin DNA-

Methyltransferase, ................................................................................................. 15

Abbildung 1-5: Darstellung der MGMT-Aktivität [fmol/mg Gesamtprotein] in

verschiedenen gesunden und tumortragenden Organen. Abbildung übernommen

von [112]. .............................................................................................................. 16

Abbildung 1-6: Mögliche elektrophile Angriffsstellen in den DNA-Basen und die

dazugehörenden DNA-Reparaturwege, Abbildung modifiziert nach [116]. ........ 17

Abbildung 1-7: Vergleich der TP53-Mutationen, die durch KDA (Diazoacetat) induziert

und die in CRC-Zellen detektiert wurden [1]. ...................................................... 19

Abbildung 3-1: Morphologische Veränderungen der HCEC WT-Zellen während des

Ausdifferenzierungsprozesses mit BIO................................................................. 47

Abbildung 3-2: Immunzytochemische Färbung der HCEC WT-Zellen in der

exponentiellen Wachstumsphase vor der Ausdifferenzierung (A) sowie nach 12-

tägiger Ausdifferenzierungszeit mit BIO (B). ....................................................... 48

Abbildung 3-3: MGMT-Expressionsanalyse in neun HCEC-Klonen, in denen die

MGMT-Expression herunterreguliert wurde. ....................................................... 49

Abbildung 3-4: Wachstumskurven der Zelllinien HCEC WT und HCEC MGMT -. .... 51

Abbildung 3-5: Ermittlung der Sättigungsdichte zur Prüfung der Aufrechterhaltung der

Zell-Zell-Kontaktinhibition. .................................................................................. 52

Abbildung 3-6: Prüfung des verankerungsunabhängigen Wachstums von HCEC WT- und

MGMT --Zellen in low attachment-Platten. .......................................................... 53

Abbildung 3-7: Darstellung der konzentrationsabhängigen Azaserin-induzierten

Zytotoxizität .......................................................................................................... 54

Abbildung 3-8: Darstellung der Azaserin-induzierten Veränderung repräsentativer Zellen

zur typischen Kometenform bei vorliegender Genotoxizität. ............................... 55

Abbildung 3-9: Darstellung der im Comet-Assay ermittelten Schweifintensitäten [%]

Azaserin-behandelter HCEC WT- und HCEC MGMT --Zellen. .......................... 55

Abbildung 3-10: Vorläufige Daten zur O6-MeG-(A) und O6-CMG-Addukt-

Quantifizierung (B) mittels HRMS/PRM in HCEC WT- und HCEC MGMT --

Zellen nach 4- und 24-stündiger Azaserin-Behandlung (75 µM). ........................ 57


121

Abbildung 3-11: A: MGMT-Aktivitätsanalyse der Azaserin-behandelten HCEC WT-

Zellen..................................................................................................................... 58

Abbildung 3-12: Ausschnitt aus der NO-Häm-Messung im NOA mit den entsprechenden

Kontrollen. ............................................................................................................ 59

Abbildung 3-13: Ausschnitt aus der NaNO2-Konzentrationsermittlung für die NO-Häm-

Synthese mithilfe des NOAs. ................................................................................ 60

Abbildung 3-14: Graphische Darstellung der NaNO2-Konzentrationsermittlung für die

NO-Häm-Synthese. ............................................................................................... 61

Abbildung 3-15: Absorptionsspektren von NO-Häm und seinen Vorstufen. ................ 61

Abbildung 3-16: Stabilität von NO-Häm im Medium mit und ohne Serum unter

hypoxischen Bedingungen. ................................................................................... 62

Abbildung 3-17: Western Blot-Expressionsanalyse der Hämoxygenase-1 (HO-1) in

HCEC WT-Zellen. ................................................................................................ 63

Abbildung 3-18: Western Blot-Analyse der durch NO-Häm nitrosierten Proteine

(Bereich: 10 -170 kDa).......................................................................................... 64

Abbildung 3-19: Analyse der NO-Häm-induzierten Genotoxizität. .............................. 66

Abbildung 3-20: Morphologische Veränderungen der Zellen durch die zyklische NO-

Häm – und Diazald-Behandlung (repräsentative Bilder). ..................................... 68

Abbildung 3-21: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC MGMT – nach

der zyklischen Behandlung. .................................................................................. 69

Abbildung 3-22: Repräsentative unvergrößerte Darstellung der konfluenten Giemsa-

gefärbten HCEC WT-(A) und RPA-Zellen (B) nach der zyklischen Behandlung.

............................................................................................................................... 69

Abbildung 3-23: Ergebnisse des GILA-Assays nach der zyklischen Behandlung. ....... 70

Abbildung 3-24: Verankerungsunabhängiges Wachstum im GILA-Assay. .................. 71

Abbildung 3-25: Ergebnisdarstellung des BALB/c-3T3-Zelltransformationstests. ....... 72

Abbildung 4-1: Räumliche Darstellung beginnend vom O6-Atom des Guanins von O6-

CMG (A) und O6-Ethylguanin (B). ....................................................................... 81

Abbildung 4-2 Darstellung von Mono- und Dinitrosyl-Häm. Abbildung modifiziert nach

[2] .......................................................................................................................... 85

Abbildung 4-3: IR-Spektrum von NO-Häm aus der Arbeit von Jankiewicz et al. [170] (A)

und Hämin aus der Datenbank für organische Verbindungen (SDBS) (B). ......... 86

Abbildung 6-1: Im Rahmen der Methodenentwicklung gewonnene vorläufige Daten zur

O6-MeG-(A) und O6-CMG (B)-Addukt-Quantifizierung mittel LC-ESI-MS/MS.

............................................................................................................................. 116

Abbildung 6-2: Western-Blot-Analyse der HO-1-Expression in HCEC MGMT-

defizienten Zellen. ............................................................................................. 117

Abbildung 6-3: Western Blot-Analyse der durch NO-Häm nitrosierten Proteine (Bereich

10-170 kDa). ....................................................................................................... 117

Abbildung 6-4: NO-Häm-induzierte Zytotoxizität in WT-Zellen. .............................. 118

Abbildung 6-5: Zytotoxizität von NO-Häm in MGMT --Zellen. ................................ 118


122

Abbildung 6-6: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC WT nach der

zyklischen NO-Häm-Behandlung. ...................................................................... 119

Abbildung 6-7: Bestimmung der Sättigungsdichte der Zelllinie HCEC RPA nach der

zyklischen NO-Häm-Behandlung. ...................................................................... 119

7.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: In dieser Studie verwendete adhärente Zelllinien humanen und tierischen

Ursprungs .............................................................................................................. 28

Tabelle 2.2: Nährmedien und ihre Zusammensetzungen für die Kultivierung der in dieser

Studie verwendeten Zelllinien............................................................................... 30

Tabelle 2.3: Behandlungsgruppen im BALB/c-3T3-Zelltransformationstest. ............... 38

Tabelle 2.4: Auflistung der in dieser Arbeit verwendeten lentiviralen Kontrukte. ........ 41

Tabelle 2.5: Auflistung der für die RT-qPCR verwendeten sense- und antisense-Primer

............................................................................................................................... 42

Tabelle 2.6: Die verwendeten Primär-sowie Sekundärantikörper, deren Verdünnungen

und verwendete Antikörperpuffer ......................................................................... 43

Tabelle 2.7: Für die Immunzytochemie verwendete Primär- und Sekundärantikörper,

deren Verdünnungen und Antikörperpuffer .......................................................... 44

Tabelle 3.1: Darstellung der MGMT-Aktivität in fmol/mg Protein nach der shRNA-

Transduktion. ........................................................................................................ 50

Tabelle 3.2: Auflistung der errechneten IC50-Werte nach einmaliger NO-Häm-

Behandlung. .......................................................................................................... 65

7.3 Formelverzeichnis

Formel 1: Berechnung der Zellzahl/ml nach Zählung in der Neubauer-Zählkammer ... 33

Formel 2: Formel zur Errechnung der Plattierungseffizienz .......................................... 38

Formel 3: Reaktionsgleichung von NO und Ozon unter Bildung des angeregten

Stickstoff-Moleküls ............................................................................................... 46

Zusammenfassung

123

8 Zusammenfassung

Döhring, Janine:

Die Rolle der durch den Verzehr von rotem Fleisch endogen gebildeten Nitrosover-

bindungen in der malignen Transformation von humanen Kolonepithelzellen

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist eines der häufigsten Krebsleiden weltweit. Allein in

Deutschland erkranken jährlich mehr als 60.000 Menschen daran, wobei mehr Männer

als Frauen davon betroffen sind. Das Alter sowie chronisch entzündliche Darmerkran-

kungen und eine genetische Prädisposition zählen zu den wichtigsten Risikofaktoren. Ne-

ben diesen Faktoren gibt es natürlich auch eine Reihe von Nahrungsmitteln und –bestand-

teilen, die die Entstehung des CRCs fördern können. Nach der Stellungnahme der „Inter-

national Agency for Research on Cancer“ (IARC) Ende 2015 wird der Konsum von ro-

tem Fleisch als einer der wichtigsten nahrungsmittelbedingten Risikofaktoren betrachtet.

Des Weiteren klassifizierte die IARC verarbeitetes rotes Fleisch, wie beispielsweise Sa-

lami und Hot Dogs, als kanzerogen für den Menschen und aufgrund der bisherigen Da-

tenlage unverarbeitetes rotes Fleisch als vermutlich kanzerogen für den Menschen. Daten

aus vorangegangenen Arbeiten zeigen eine eindeutige Korrelation zwischen dem Kon-

sum von (verarbeitetem) roten Fleisch und der Inzidenzrate von CRC, jedoch ist bisher

nicht hinreichend erforscht worden, welche der Komponenten aus dem roten Fleisch

hauptverantwortlich für die Entstehung des CRCs sein könnte. Bisher ist bekannt, dass

der Konsum von rotem Fleisch zur endogenen Bildung von Nitrosoverbindungen führt,

die wiederum die DNA der Kolonepithelzellen modifizieren können. Die dabei gebilde-

ten DNA-Addukte können zu Mutationen in Genen führen, die wichtige Prozesse der

Zelle regulieren. Eine Akkumulation dieser Genmutationen kann den Prozess der CRC-

Entstehung vorantreiben und schlussendlich zum Tumor führen. Myoglobin bzw. dessen

Häm-Komponente ist ein wesentlicher Bestandteil von rotem Fleisch und wird bereits

beim Pökeln des Fleisches oder direkt im Gastrointestinaltrakt nitrosiert. NO-Häm nitro-

siert wiederum Aminosäuren und führt somit zur Bildung von Nitrosoverbindungen, die

die DNA der Epithelzellen alkylieren können. Darauf basierend kann NO-Häm als ein

potenzieller CRC-Risikofaktor betrachtet werden. Aufgrund dessen wurde im Rahmen

der vorliegenden Arbeit die potenzielle zelltransformierende Wirkung von NO-Häm in

humanen Dickdarmepithelzellen untersucht.

Zusammenfassung

124

Es ist bekannt, dass DNA-Läsionen wie O6-MeG und O6-CMG durch Nitrosoverbindun-

gen induziert werden können. Repariert wird das O6-MeG-Addukt durch die O6-Methyl-

guanin-DNA-Methyltransferase (MGMT). Im Fall des O6-CMG-Adduktes ging man bis-

her davon aus, dass es nicht von der MGMT repariert werden kann. Aus diesem Grund

wird spekuliert, dass das O6-CMG-Addukt eine besonders wichtige Rolle in der Induktion

von Genmutationen während der CRC-Entstehung spielt. Im Jahr 2013 wurde erstmalig

gezeigt, dass die MGMT doch O6-CMG-Addukte reparieren kann, wobei dieser Versuch

in einem zellfreien System durchgeführt wurde. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit,

die Rolle der MGMT in der Reparatur des O6-CMG-Adduktes in einem Zellkulturmodell

zu analysieren.

Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die frühere Annahme, dass die MGMT in der

Lage ist das O6-CMG zu reparieren. MGMT-defiziente Zellen waren wesentlich emp-

findlicher auf das carboxymethylierende Agens Azaserin als die WT-Zellen. Die vorläu-

figen Daten der DNA-Adduktanalyse bestätigen, dass MGMT-defiziente Zellen nicht in

der Lage sind diese Addukte zu reparieren. Die vorläufigen Daten weisen aber auch da-

rauf hin, dass in den WT-Zellen noch teilweise O6-MeG- und O6-CMG-Addukte detek-

tiert werden, sodass man davon ausgehen muss, dass die Effizienz, mit der die MGMT

O6-CMG-Addukte repariert werden, geringer ist als im Fall von anderen Guaninadduk-

ten. In früheren Arbeiten wurde bereits postuliert, dass auch die NER an der Reparatur

von O6-CMG-Addukten beteiligt sein könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass

vermutlich sowohl die NER als auch die MGMT in der Reparatur des O6-CMG-Adduktes

involviert sind.

NO-Häm als nitrosierendes Agens ist an der Bildung von Nitrosoverbindungen beteiligt

und soll aufgrund der Ergebnisse früherer Studien eine wichtige Rolle in der CRC-Ent-

stehung spielen. Die einmalige Inkubation der humanen Kolonepithelzellen (HCEC) mit

NO-Häm zeigt, dass NO-Häm in die Zellen gelangt und dort zu nitrosativem Stress führt.

Weiterhin wirkt es zyto- und genotoxisch. Eine mehrmalige Behandlung der Zellen führte

jedoch nicht zu einer malignen Zelltransformation. Da jedoch weitere stark mutagen wir-

kende Substanzen nicht in der Lage waren, die HCEC-Zellen maligne zu transformieren,

muss angenommen werden, dass diese Zellen aufgrund ihrer ausgeprägten genomischen

Stabilität nicht als Zelltransformationsmodell geeignet sind. Aus diesem Grund wurde die

potenziell zelltransformierende Wirkung von NO-Häm im BALB/c-3T3-Zelltransforma-

tionstest untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine mehrmalige Behandlung der

Zellen mit 10 µM NO-Häm zu einer Transformation der Zellen führte. Dieser Befund

Zusammenfassung

125

unterstützt die Hypothese, dass NO-Häm an der Entstehung des CRCs beteiligt sein

könnte. Nichtsdestotrotz muss bei der Analyse dieser Ergebnisse berücksichtigt werden,

dass das NO-Häm nach dessen Synthese nicht extrahiert werden konnte und somit nicht

in Reinform vorlag. Reaktionskomponenten und mögliche Nitritreste waren ebenfalls ent-

halten und könnten zu einem falsch-positiven Ergebnis beigetragen haben. Weiterfüh-

rende Experimente mit hochgereinigtem NO-Häm und weiteren nicht-transformierten hu-

manen Dickdarmepithelzelllinien sind nötig, um zu klären, ob NO-Häm tatsächlich an

der malignen Transformation dieser Zellen beteiligt ist.

Summary

126

9 Summary

Döhring, Janine:

The role of endogenously formed nitroso compounds derived from red meat in the

malignant transformation of human colon epithelial cells

Colorectal Cancer (CRC) is the third most commonly diagnosed cancer worldwide. Every

year more than 60.000 cases are diagnosed in Germany. The most important risk factors

are age, a genetic predisposition and chronic inflammatory bowel diseases such as Mor-

bus Crohn. Moreover, dietary factors are also involved in CRC development. In 2015 the

International Agency for Research on Cancer (IARC) classified processed red meat as

carcinogenic to humans. Because of limited experimental evidence, unprocessed red meat

was classified as probably carcinogenic to humans. Until now, the mechanism by which

these dietary compounds contribute to CRC induction is not fully understood. It is known

that the endogenous formation of nitroso compounds (NOC) is the consequence of red

meat consumption and that these NOCs are responsible for DNA alkylation in colonic

epithelial cells. The lack of DNA repair leads to DNA mutations in genes that are known

to be involved in important cellular processes such as proliferation and differentiation and

an accumulation of several different gene mutations leads to CRC initiation and progres-

sion. One of the major differences between red and white meat is their myoglobin con-

centration and, therefore, this is one of the most interesting possible risk factors for CRC

development. The heme moiety of myoglobin gets nitrosated during meat processing or

is endogenously nitrosated by bacterial processes. NO-heme is an important nitrosating

agent and among other compounds responsible for the formation of NOCs. NOCs are

alkylating agents, acting directly or after their activation, and induce DNA lesions in co-

lonic epithelial cells. NO-heme is consumed or endogenously formed and therefore one

of the possible risk factors present in (processed) red meat. The first aim of this study was

to analyze the effect of NO-heme on the human colon epithelial cell line HCEC and to

determine whether NO-heme could lead to a malignant cell transformation.

It is known that DNA lesions such as O6-MeG and O6-CMG can be induced by nitroso

compounds. The O6-MeG is repaired by the O6-methylguanine methyltransferase

(MGMT), while this seems not to be the case of the O6-CMG adduct. Because of this, it

Summary

127

has been speculated that the O6-CMG adduct plays a particularly important role in the

induction of genetic mutations during colon carcinogenesis.

In 2013 it was shown for the first time that MGMT does not repair O6-CMG adducts,

whereby it has to be mentioned that these experiments were performed in a cell-free sys-

tem. Because of this, the second aim of this study was to investigate the role of MGMT

in the repair of O6-CMG adducts in a human colon epithelial cell culture system.

The results of this study confirmed the previous hypothesis that MGMT is indeed able to

repair O6-CMG adducts. MGMT-deficient cells were much more sensitive towards the

carboxymethylating agent azaserine than the wild-type (WT) cells. However, the prelim-

inary results of the DNA adduct quantification also show that O6-MeG and O6-CMG ad-

ducts are still in part detected in WT cells, so that one has to assume that the efficiency

of MGMT to repair O6-CMG adducts is lower than that to repair other guanine adducts.

In earlier studies it was already speculated that nucleotide excision repair (NER) could

also be involved in the repair of O6-CMG adducts. Taken together, it can be said that NER

as well as MGMT seem to be involved in the repair of O6-CMG adducts.

NO-Heme as a nitrosating agent is involved in the formation of nitroso compounds and,

based on earlier findings, is expected to play an important role in colon carcinogenesis.

The experiment in which HCEC cells are exposed once to NO-heme shows that this com-

pounds is taken up by the cells and leads in them to nitrosative stress. Moreover, NO-

heme is cytotoxic and genotoxic. However, a repeated exposure of the cells to NO-heme

did not lead to the malignant transformation of the HCEC cells. Since further strongly

mutagenic compounds were not able to malignantly transform the cells, one has to con-

clude that these cells, because of their pronounced genomic stability, are not an adequate

cell transformation model. Because of this, the potential cell transforming capacity of

NO-heme was tested in the BALB/c-3T3 cell transformation assay. In this test system, it

could be shown that a repeated incubation of the cells with 10 µM NO-heme is able to

transform them. This finding supports the hypothesis that NO-heme could be involved in

colon carcinogenesis. Nevertheless, when analyzing these results one has to bear in mind

that, following its synthesis, NO-heme was not extracted and further purified, so that it

was not used in a highly purified form. Further reaction products and nitrite traces could

have been present in the NO-heme preparation and might have contributed to a false-

Summary

128

positive result. Future experiments with highly purified NO-heme and further human co-

lon epithelial cell lines are needed to determine whether NO-heme is indeed involved in

the malignant transformation of human colon epithelial cells.

Eidesstattliche Erklärung

129

10 Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Die Rolle der durch den Verzehr von rotem

Fleisch endogen gebildeten Nitrosoverbindungen in der malignen Transformation von

humanen Kolonepithelzellen“ selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

I. Prof. Dr. Markus Christmann und Mitarbeiter: MGMT-Aktivitätsbestimmung

und Expressionsanalyse der HCEC WT- und MGMT --Zellen

II. Prof. Dr. Shana J. Sturla, Alessia Stornetta und Peter Villalta: DNA-Addukt-

Quantifizierung der Azaserin-behandelten HCEC WT- und MGMT --Zellen

III. Dr. Michael T. Empl, Julia Hausmann und Jutta Barras-Akhnoukh: BALB/c-

3T3-Zelltransformationstest zur Analyse der transformierenden Wirkung von

NO-Häm

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs-bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt:

Institut für Lebensmitteltoxikologie an der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und

der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

______________________________________________________________________

Ort, Datum, Unterschrift

Danksagung

130

11 Danksagung

Ich danke von ganzem Herzen allen, die mich auf diesem Weg unterstützt und begleitet

haben.

Ganz besonders danke ich Herrn Steinberg für das interessante und vielseitige Projekt,

für Ihre Unterstützung und Geduld und dafür, dass Sie immer Zeit für jegliche Fragen

und Probleme gefunden haben. Aber auch dafür, dass Sie mir ermöglicht haben jede Idee

während der Dissertation umzusetzen und zusätzlich in anderen Projekten mitzuwirken.

Ich danke auch Herrn Bicker dafür, dass Sie das Projekt als Mitglied meiner Betreuungs-

gruppe mit vorangetrieben und sich für Gespräche stets Zeit genommen haben. Ebenfalls

danke ich Herrn Kietzmann, der im Laufe des Projekts zum kommissarischen Leiter der

LMTOX ernannt und ebenfalls Mitglied der Betreuungsgruppe wurde, für Ihre freundli-

che Unterstützung.

Michael, vielen Dank dafür, dass du stets ein offenes Ohr für alle Fragen hattest und im

Rahmen diverser Gespräche durch Projektplanung und konstruktiver Kritik wesentlich

zum Projekt beigetragen hast. Ohne deine Hilfe und dein eingebrachtes Wissen hätte ich

das so nicht hinbekommen. Danke!

Ich danke meinen Arbeitskollegen Betty, Steffi, Tina, Michael, Maren, Alex, Julia, Jutta,

Nicole, Frau Oberjatzas sowie auch Annika, Ina, Katharina, Laura, Nicole und Beate da-

für, dass ihr euch in diversen Seminaren immer die Probleme, die während meiner Dis-

sertation entstanden, angehört und versucht habt diese mit mir zu lösen. Ich danke auch

ganz besonders Annika, Ina, Laura und Katharina für eure stetige Unterstützung bei mei-

nen chemischen Fragen und Problemen. Danke, dass ihr mir immer weitergeholfen habt.

Ich danke euch allen für die schöne Zeit in der LMTOX und die abwechslungsreichen

und interessanten Gespräche.

Ohne die Unterstützung aus anderen Instituten wäre vieles während meiner Dissertation

nicht möglich gewesen. Deshalb möchte ich der Arbeitsgruppe von Frau Pfarrer aus der

Danksagung

131

Anatomie und ganz besonders Jan danken, dass ich die Räumlichkeiten und diverse Ge-

rätschaften stets und uneingeschränkt nutzen durfte. Jan, danke, dass du dir immer Zeit

für meine Fragen genommen hast und deine wissenschaftlichen Erfahrungen mit mir ge-

teilt hast.

Zudem möchte ich Frau Ziemann vom Fraunhofer Institut in Hannover danken, dass Sie

mich bei der Etablierung des Comet-Assays unterstützt haben. Auch Herrn Christmann

von der Universitätsmedizin in Mainz danke ich für den essentiellen Beitrag zu meiner

Dissertation.

Ebenfalls danke ich Frau Prof. von Köckritz-Blickwede und vor allem Helene Möller-

herm, dass ich diverse Gerätschaften im Institut der Physiologischen Chemie uneinge-

schränkt nutzen durfte. Helene, Danke, dass du dir immer Zeit fürs Aufschließen aller

Türen genommen hast und mich bei der Nutzung der Hypoxiekammer unterstützt hast.

Besonderen Dank gebührt auch Alessia, Shana und Peter. Ihr habt im Rahmen unserer

Kooperation so viel Zeit und Energie für die Methodenetablierung der DNA-Addukt-

Quantifizierung aufgebracht. Danke, dass ihr nicht aufgebt und unermüdlich weiter daran

arbeitet. Shana, danke, dass du mich zum Erlernen diverser Methoden mehrmals an der

ETH in Zürich aufgenommen hast und ich dadurch das schöne Zürich kennenlernen

durfte.

Und natürlich danke ich den Korrekturlesern dieser Arbeit. Danke, dass ihr euch dafür

extra Zeit genommen und der Arbeit den Feinschliff gegeben habt.

Von ganzem Herzen danke ich…

… meinem besten Freund und Partner Alex. Danke, dass du immer für mich da bist.

Danke für deine Unterstützung. Danke für dein immer offenes Ohr. Danke für deine Ab-

lenkung. Danke für deine Geduld. Danke fürs Ertragen meiner Launen. Danke, dass du

mir so viel Kraft gibst. Danke für alles.

… meiner Familie. Danke, dass ihr mich stets auf meinem Weg begleitet und immer für

mich da seid, egal was war, ist und kommt.

… meinen Freunden. Danke, dass ihr mein Leben schon so lange und derart bereichert.

Die Rolle der durch den Verzehr von rotem Fleisch endogen ... · Döhring et al.-Journal of...

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