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erg Differenzierung von

Mikroorganismen mitmolekularbiologischen Methoden

Karlsruher Futtermitteltag

am CVUA Karlsruhe, 22.07.14

Dr. Wolfgang Wagner, LTZ Augustenberg,Referat 24 SG Mikrobiologie und Molekularbiologie

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Zur Unterstützung mikrobiol. Analysen

Fusarium oxysporum?

Peronospora oder nicht?

Anwendung bei

morphologisch/biochemisch nichtweiter differenzierbaren Kriterien

konkreten Zusatzfragen (Toxingene,Verwandtschaftsgrad, etc.)

Als Ersatz für komplexe, nichtetablierte kulturelle Methoden

Artbestimmung entweder mikrobiologisch/biochemisch oder durch PCR.

Aber enthält diese Clostridienart auch dasgesuchte Toxingen?

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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ

Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien

• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche

• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken

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Erbsen und Bohnen ausLandessortenversuchenMikrobiologische Analysevon Proben unter-schiedlicher Sorten,Standorte, Böden,Anbauweisen (öko – konv.)

Erarbeitung v. Orientierungs-werten zur mikrobiologischenQualitätsbeurteilung vonFuttermitteln

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Bakterien in Futtererbsen,Artbestimmung von KolonienErwinia spp.

Bacillus spp.

Pantoea spp.

Enterobacter spp.

Bacillus spp.

durch DNA-Sequenzierung

oder biochemisch:

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MSB Milchsäurebakterien- Milchsäuregärung, Konservierung

von Silagen, Verbesserung vonFutteraufnahme u. Verdaulichkeit

- Futtermittelzusatzstoff gem. VO(EU) 1831/2003, Verwendung alsProbiotikum und Siliermittel

- Aktuell ca. 15 Arten, > 90 Stämmeim FutterzusatzstoffverzeichnisAnhang 1k gelistet

- LTZ kontrolliert Deklarationen,bislang meist nur mikrobiologisch

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Mikrobiologische Möglichkeiten:

Gesamtkeimzahl:2 x 1011 KBE/g

MSB

Artbestimmung

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Molekularbiologische Möglichkeiten

Teil-Quantifizierungeinzelner Arten odereinzelner Stämme

MSB

Identifizierung derdeklarierten Stämme

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MSBFall eines RP im Mai 2014: 2 flüssigeVormischungen mit mangelhafter Deklarationund Verdacht auf Falschdeklaration:

- Lactobacillus plantarum: Stamm-ID fehlt;deklariert aber nicht nachgewiesen

- Lactobacillus casei: Stamm-ID fehlt;deklariert und als Art nachgewiesen(16S-Sequenzierung)

- zusätzlich wurden Hefen der GattungenPichia und Candida (Lebensmittelverderber)nachgewiesen (26S/28S-Sequenzierung)

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MSB - Isolierung eines Stammes aus einer Probe

- DNA-Sequenzierung des recA-Gens einer isolierten Kolonie

- Sequenzunterschiede bei verschiedenen Stämmen sinderkennbar und können genutzt werden

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Neuzulassung nachVO (EU) 1831/2003,

z.B. BIO-SIL Fa. Pieper

MSB+Probiotika

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erg EU-Projekt zur Entwicklung u.

Validierung von Methoden zurQuantifiz. und Identifizierungvon zugelassenen Probiotika aufStammebene (2002)

Bacillus, Lactobacillus,Bifidobacterium, Pediococcus,Enterococcus, Hefen

Literaturmethoden +eigene Entwicklungen

Validierungen mit21 Laboren (kulturell),8 Labs (PCR), 1 Lab (PFGE1)

Grundlage für (zu) vieleEURL evaluation reports

1 Pulsfeldgelelektrophorese

MSB+Probiotika

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Simpson et al. 2002

MSB+Probiotika Probleme der PFGE- nur ein Labor wendet PFGE

an (EU-Projekt 2002 mit 57von >200 Stämmen)

- Methode basiert aufMustererkennung, die nichteindeutig und nicht leichtinterpretierbar ist

- Fragestellung ist zu selten

- Stämme sind geschützt undnicht als Referenzmaterial zubekommen, auch nicht füramtliche Labore

- dadurch Entwicklung vonAlternativmethoden langwierig

- Stämme müssen in Reinkulturvorliegen; nicht direkt aus derProbe analysierbar

- Keine Quantifizierung möglich

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Fus

Feldbürtige, phytopathogene Pilze anGetreide, Mais, Früchten, etc.

Mykotoxin-Bildner: Fumonisine, Zearalenonund Trichothecene wie DON, T2 + HT-2

Beeinträchtigung der Tiergesundheit durchSchädigung von inneren Organen,Immunsystem, Haut, Hormonsystem

Morphologische/MikrobiologischeFeindifferenzierung nur durch absoluteExperten möglich; Bestimmungsschlüssellückenhaft

Fusarien

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Fus Fusarienbefall?

Wieviel Körner befallen?

Welche Arten u. Toxine?

F. proliferatum

F. culmorum

F. tricinctumF. sporotrichioides

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Fus 11 Arten mit157 Stämmen

PCR-Direkt-nachweis inGetreide-proben

qualitativ

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Fus

SpezifischerPCR-Nachweisder 11 Fusarien-Arten am LTZ

Methodeausbaubar fürweitere Artennach Wunsch

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Fus

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Assay auf Basis von 9 Fusarien-Artenund 33 anderen Pilzen entwickelt;für Direktnachweis und aus Gerste- u. Maisproben

+ gruppenspezifischer Nachweis von• Der Gattung Fusarium (ITS)• Trichothecen-bildende Fusarien (tri6)• Fumonisin-bildende Fusarien (fum1)

- kein Spezies-spezifischer Nachweis

- Quantifizierung muss optimiert werden

Fus

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Til Steinbrand(Tilletia)

Phytopathogene undMykotoxin-Bildner inGetreide und Gräsern:Trimethylamin hemmtWachstum, schädigt Nieren,führt zu Verwerfungen undMinderung der Milchleistung

Sensorische Minderung derFuttermittelqualität: Geruchnach Heringslake

Hohe Infektionsrate, z. B.durch Mähdrescher

Klassische Mikroskopie bzw.Filtration + Haemocytometersind aufwändig

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Til Steinbrand (Tilletia)

- Weizensteinbrand (Tilletia caries)oder Zwergsteinbrand(T. controversa)?

- Orientierungswerte fürVerwendbarkeit

Öko-Saatgut < 20 Sporen/KornFuttermittel 10.000 Sporen/Korn

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Til Tilletia-Artidentifizierung- PCR-RFLP1 am LTZ entwickelt

zur Differenzierung von T.controversa und T. caries

1 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismuseines 620bp-Amplifikats am DNA-AbschnittRPB2, das mit dem Enzym HinfI bei T.controversa in 2 und bei T. caries in 3Fragmente geschnitten wird.

Gattungsnachweis durch PCR-Amplifikation,Artdifferenzierung durch Fragmentmuster

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Til Tilletia-Quantifizierung- Projekt 2011-13 um Alternative für aufwändige

mikroskopische Filtrationsmethode (Saatgut) zuentwickeln

- Literaturmethode zur Quantifizierung (realtime PCR,McNeil, Plant Pathology 2004, 53, 741-750)weiterentwickelt, etabliert und validiert; hat 2013Filtrationsmethode ersetzt

Anzahl der Sporen/ Korn Tilletia spp.

Kulturart Anzahl derProben 0 unter20 zw. 20 und

100 über 100

Sommerweizen 2 1 1Triticale 10 4 6

Spelzweizen 32 15 (47%) 12 (38%) 5 (16%)Winterweizen 42 3 (7%) 23 (55%) 8 (19%) 8 (19%)

gesamt 86 23 (27%) 42 (49%) 13 (15%) 8 (9%)

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Clos

Foto: RP Tübingen

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Foto: RP Tübingen

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Clos Fall am RP Tübingen im Nov. 2013: CrossCompliance Kontrolle bei einem Milchviehhalter:

- Erhebliche Mängel bei Tierschutz,Futtermittelqualität und –sicherheit

- Minderung der Futtermittelqualität durchClostridien u. a. Mikroorganismen

- DNA-Sequenzierung von Stichproben-Kolonienergab die Futtermittelverderber Clostridiumglycolicum, C.septicum und C.tertium, sowie denGasbranderreger C. perfringens (Toxinbildner,nekrotische Enteritidis bei oraler Aufnahme vonWiederkäuern)

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Clos Fall am RP Freiburg im Herbst 2013: tote Mastbullen –Diagnose Clostridium chauvoei:

- Erreger des Rauschbrands bei Rindern, Schafen undZiegen: nicht ansteckende Tierseuche, verläuft akut, hoheMortalität (Gasödeme im Muskelgewebe); Infektion überFutteraufnahme

- ob nur Grundfutter des Betriebs oder auch Handelsfutterverseucht ist?

- rasche Untersuchung, um Versorgung des Tierbestands zusichern bzw. im Handel Gefahr im Verzug auszuschließen;Transport über CVUA-Kurier – vielen Dank!!!

- Etablierung einer spez. PCR aus der Literatur am LTZ(Mikrobio kurzfristig zu aufwändig); Absicherung durchdas NRL Rauschbrand in Jena (Außenstelle des Friedrich-Loeffler-Instituts)

- Erreger wurde nicht nachgewiesen; Beprobung zu spät?

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Clos Nachweis vonClostridium

perfringens undseinen Toxinen:

cpa, cpb, cpe,iA, etx

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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ

Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien

• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche

• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken

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Datenbank-RechercheFast unbegrenzte Möglichkeiten auf DNA-Informationen zurückzugreifen:

kostenfrei, durch immense Forschungstätigkeitauf allen Gebieten fast lückenlosdurch immer neue Methoden (z. B. NextGeneration Sequenzing) fast exponentiellanwachsender Datenberg(Vgl. API mit nur ca. 600 Arten)Vergleich eigener Daten mit Datenbanken zurIdentifizierung von DNA-Abschnitten von Arten,Stämmen, Toxingenen, etc.Entwicklung eigener PCR-Nachweise auf dieserDatengrundlage

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• NCBI Datenbank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

• Sequenzierte Genomehttp://www.genomenewsnetwork.org/resources/sequenced_genomes/genome_guide_p1.shtml

• Genom-Atlas http://www.cbs.dtu.dk/services/GenomeAtlas/

• GOLD http://genomesonline.org/

Datenbank-Recherche

Ein paar Beispiele:

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erg • Anwendungsbeispiele am LTZ

Keimbesatz von Erbsen und BohnenMilchsäurebakterien und ProbiotikaFusarienTilletiaClostridien

• Möglichkeiten der MolekularbiologieDatenbank-Recherche

• weiteres Anwendungsbeispiel am LTZIntestinale Enterokokken

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Kolonien auf Filter +Slanetz&Bartley-Agar

Kolonien nach Abklatschauf Galle-Äskulin-Agar

Intestinale EnterokokkenHygieneindikator in Badegewässer, Trinkwasser, etc. undGärresten; auch für Futtermittel denkbar

oft Antibiotika-resistent

ISO7899-2 u. a. mikrobiologische Nachweismethoden erfassenKrankheitserreger bis hin zu harmlosen Arten und Probiotika

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- Auf Basis einer EFSA-Stellungnahme (EFSA Journal2012;10(5):2682) wurden am LTZ PCR-Nachweiseetabliert, um die krankheitsauslösenden Gene IS16, espund hylEfm nachzuweisen

- Artbestimmung mit anderen PCR oder DNA-Sequenzierung

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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !!!

S2-Labor LTZ Augustenberg nachexplodiertem Gärrest 2007

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