Automatische Nitratbestimmung in pflanzlichem Material nach dem FIA- Prinzip

Von E. ScHWERDTFEGER'f)

Einleitung

Nitrat ist ein unerwünschter Inhaltsstoff pflanzlicher Produkte. Seiner Bestimmung wurde und wird daher breites Interesse entgegengebracht. Im wesentlichen sind es drei Wege, die hierfür beschritten wurden: 1. Colorimetrische Verfahren (z. B. die Xylenolmethode), Redukti~nsmethoden,

bei denen das Nitrat chemisch oder enzymatisch zu Nitrit reduziert wird, das sich leicht colorimetrisch erfassen läßt.

3. potentiometrisch durch Einsatz ionensensitiver Elektroden. Vergleiche verschie­dener Methoden führten u. a. MüLLER und SrEPE (1979) und ADAMOWICZ et al. (1980) durch. Für Nitratbestimmungen im ppb- Bereich beschreibt Cox (1980) eine Methode unter Anwendung der Chemilumineszenz.

Für die Automatisierung bieten sich besonders Verfahren nach 2 bzw. 3 an. Von den zur Verfügung stehenden Methoden erschien uns das,Prinzip der Flow Injection Analy­sis (FIA) als technisch am einfachsten zu realisieren (Ubersicht z.B. bei RANGER (1981). Dieses von RuzrcKA und HANSEN 1975 entwickelte Prinzip sieht einen unsegmentierten Trägerstrom vor, dem intermittierend Probenmaterial zugeführt wird. Die Probe di­spergiert während des Fließens und reagiert mit Komponenten des Trägerstroms unter Bildung von Umsetzungsprodukten, welche in entsprechenden Durchflußküvetten auf­grund ihres veränderten physikalischen Verhaltens nachgewiesen und quantitativ be­stimmt werden. Mit Hilfe von vorhandenen Bauteilen haben wir eine nach der Cadmium-Reduktionsmethode arbeitende Apparatur zusammengestellt.

Material und Methodik

Das Fließschema ist in Abbildung 1 wiedergegeben. Die durch einen Probengeber (A) entnommene Probe wird mit Hilfe einer Peristaltikpumpe (B) durch eine mit metalli­schem Cadmium gefüllte Reduktorsäure (D) geleitet, wobei vorhandenes Nitrat in Ni­trit umgewandelt wird.

A

B

1

)-;-{WASCH LÖSUNG 8WASH SOLUTION

E F

Abb. 1

Fließdiagramm Flow diagram

Das gebildete Nitrit wird dem Trägerstrom zugeführt, der im wesentlichen aus Reagens nach GRIESS besteht. Um die Farbreaktion möglichst vollständig ablaufen zu lassen, wird das Gemisch über eine Verzögerungsspirale (E) geleitet und der gebildete Farbstoff

" ) Dir. u. Prof. Dr. E. ScHWERDTFEGER, Bundesforschungsanstalt für Ernährung, Außenstelle, D-6222 Gei­senheim

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dann in einem Durchflußphotometer (F) bei 540 nm gemessen. Der Probengeber (A) ist so eingerichtet, daß alternierend Probe bzw. Spülflüssigkeit (zur Regenerierung der Säu­le) aufgenommen und dem Analysensystem zugeführt werden.

Vor der Reduktorsäule befindet sich ein Dreiwegehahn, der es gestattet, den Flüssig­keitsstrom an der Säule vorbeizuleiten, um so präformiertes Nitrit messen zu können. Alle angegebenen Reagentien sollen von p. a.-Qualität sein.

1 2

3

4

5 5.1

5.2

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Pr~be~g~ber _(A): Ist auf 110 sec (Probe) b_zw. 190 sec (Sp_ülung) eii:igestellt. Spulflussigkeit: 250 mg Cetyl-N,N,N -tnmethylammomumbromid + O 5 ml HCl conc. in 2 500 ml Wasser. ' Sä~le (D): Glasrohr mit 6 mm I~nei:i- 0, Füllhöhe 50 mm, beidseitig mit Gum­n::istop~~n verschlossen~ durch die em. Schlauch (1 mm Innen- 0) geführt ist. Saulenfull~ng: Zur Bestimmung des Nitratgehaltes ca. 10 g Cadmiummetall, grob gepulvei:: m 25 ~l 0,5 mmol PdC12-Lösung (schwach Hel-sauer) geben und 10 mm schutteln, mit 0,05 n HCl waschen, unter Vermeidung von Luftblasen in die Säule einfüllen (dies gelingt am einfachsten, wenn die Säule zuvor mit Wasser ge­füllt ist) und Säule anschließen. Farbreagens: ~O g Sulfanilsäure nach Zusatz von 10 ml Ammoniak-Lösung (mindestens 25%) m Wasser lösen und auf 1000 ml auffüllen. 400 mg N-(1-Naphthyl)-ethylendiammoniumdichlorid in 1000 ml Wasser lö­sen. Diese Stammlösungen sind im Kühlschrank mindestens 1 Monat haltbar. Für_ den täglichen Gebrauch werden je 200 ml der Lösungen 5.1und5.2 mit 20 ml Essigsäure conc. und 2 ml Salzsäure conc. gemischt. Peristaltikpumpe (B): Die Schlauchdurchmesser sind so zu wählen daß sich die geförderten Volumen von Probe bzw. Reagens wie 80: 20 verhal;en. Durchge­setzte Probemenge 4 ml/ min. Verzögerungsspirale (E): Teflonschlauch (Innen -0 1 mm) 2 m lang. D~rchflußphot_omet_er (F): M_ess~ng bei 5~0 :im (oder 560 nm, je nach Möglich­keit), 1 cm Schichtdicke, Registrierung mit emem angepaßten Schreiber.

Probenvorbereitung: 10 g vorzerkleinertes Frischmaterial werden mit 90 ml Wasser ho­mogenisiert, mit je 5 ml Zinkacetat-Lösung (13,7 g Zn-Acetat in 100 ml), Kalium­Hexacyanoferrat-II-Lösung (9,0 g K · Hexacyanoferrat-(II) in 100 ml) und 0,25 n Na­OH versetzt, mit 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 (enthaltend 200 mg Cetyl-N,N,N­trimethylammoniumbromid je 1000 ml), auf 200 ml aufgefüllt und klarfiltriert. Das Fil­trat wird mit 1 : 1 verdünntem Trispuffer auf einen Nitratgehalt von ca. 5 ppm ge­bracht. Die erforderliche Verdünnung muß bei unbekanntem Material in einem Vor­versuch ermittelt werden.

Analyse: Zur möglichst weitgehenden Ausschaltung von Matrixeffekten wird nach der Methode der Standardzugabe gearbeitet. 5 ml der Probenverdünnung werden zusam­men mit steigenden Mengen eines Nitratstandards (O; 0,4; 0,8; 1,2 und 1,6 ppm) in Meß­kölbchen mit 1 : 1 verdünntem Trispuffer auf 50 ml aufgefüllt und in die Gefäße des Probengebers überführt. Vor dem Lauf wird die Reduktionskapazität der Reduktorsäu­le durch Analyse von äquimolekularen Nitrat- und Nitrit -Lösungen geprüft. Sie sollte nicht unter 80% des theoretischen Wertes liegen.

Berechnung: Sie erfolgt nach dem Prinzif der linearen Regression, wie sie auch von Lox und ÜKABE (1982) empfohlen wird (vg. Abb. 2). Durch Verwendung eines program­mierbaren Taschenrechners läßt sich der hierfür erforderliche Rechenaufwand auf ein Minimum reduzieren. Als Meßgrößen dienen die Gipfelhöhen.

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Abb. 2

Schreiberdiagramm Recorder diagram

Ergebnisse

Die Farbbildung des durch Reduktion erhaltenen Nitrits folgt zwischen 0,05 und 10 ppm dem BEER'SCHEN Gesetz. Nimmt man 0, 1 ppm als Erfassungsgrenze, so können bei Berücksichtigung der bei der Probenvorbereitung auftretenden Verdünnung noch Men­gen bis herunter zu 2 ppm Nitrat im Frischmaterial bestimmt werden. Die mittlere re­lative Standardabweichung im Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 5 ppm Nitrat beträgt 1,6% (n=6).

Diskussion

Die von zahlreichen Autoren beschriebene Methode der Nitratbestimmung auf dem Weg über eine Reduktion zu Nitrit mittels Cadmium (KAMM et al., 1965; SEN und LEE, 1979) eignet sich gut für eine Automatisierung. So berichten WoOLLARD und FoRREST (1980) über die Nitratbestimmung in Casein mit einer Technicon-Apparatur. Läuft die Analyse nach dem Technicon-Prinzip in einem segmentierten Flüssigkeitsstrom ab, so müssen vor Passage der Reduktorsäule die Luftblasen entfernt werden, falls nicht mit ei-

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nem drahtförmigen Reduktor gearbeitet wird (WILLIS, 1980). Dieser zusätzliche Schritt ist bei Anwendung der HA-Technik überflüssig, was mitbestimmend dafür war, daß wir uns für dieses System entschieden haben.

Für die Säulenfüllung werden neben dem metallischen Cadmium und Cadmium -Schwamm auch Kupfer-, Silber- oder Quecksilberbehandeltes Cadmium empfohlen (DAVISON und WooF, 1978). Wesentliche Kriterien sind hier eine möglichst vollständige Reduktion und eine lange Stabilität der Reduktionskapazität . Beides kann nach unseren Erfahrungen durch eine Behandlung des Cadmiums mit Palladium-II-Chlorid erreicht werden. Mit diesem Reduktormaterial können 500 - 1000 Analysen durchgeführt wer­den, bis die Reduktionskapazität auf unter 80% der Theorie absinkt . Im Gegensatz da­zu beobachteten MARGESON et al. (1980) bereits nach 30 Läufen ein Nachlassen der Re­duktorkapazität. Die geringen Dimensionen des Reduktors gestatten es, mit Peristaltik­pumpen zu arbeiten, während andere Autoren hier die aufwendigeren Hochdruckpum­pen einsetzen müssen (GREEN et al., 1982).

Das Farbreagens nach GRIESS (Fox, 1974) erwies sich in der nunmehr schon klassisch gewordenen Zusammensetzung aus Sulfanilsäure bzw. Sulfanilamid und Naphthylethy­lendiammoniumdichlorid trotz umfangreicher Versuche eines Austausches der diazo­tierbaren Verbindung bzw. der Kupplungskomponente als kaum verbesserungsfähig. Wie schon SEN und Mc PHERSON ( 1978) zeigten, spielt es kaum eine Rolle, ob beide Rea­gentien getrennt oder vorgemischt eingesetzt werden, jedoch scheint die Empfindlich­keit gegen reduzierende Substanzen im letzteren Fall etwas geringer iu sein.

Der Zusatz von Cetyltrimethylammoniumbromid zur Probe führt zur Ausbildung schärferer und schmalerer Gipfel im Schreiberdiagramm. Dieser Effekt konnte durch andere Tenside (z. B. Triton X, Span, Brij, Na-Dodecylsulfat) nicht erreicht werden.

0,60

0,40

0

Abb. 3

Eichgerade Standard graph

Der Zeitbedarf pro Analyse richtet sich nach den Ansprüchen an die Genauigkeit. Wird die Zeit für die Probenahme herabgesetzt, so vermindert sich die Gipfelhöhe (Abb. 4), was sich nur in gewissen Grenzen durch eine erhöhte Empfindlichkeit des Schreibers ausgleichen läßt. Wird die Regenerier- bzw. Spülzeit herabgesetzt, so kehren die Kurven nicht zur Grundlinie zurück. Dies kann aber in gewissem Umfang toleriert werden, wenn Blindproben zur Kontrolle der Basislinie eingestreut werden.

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Die vorgestellte Methode erwies sich in zweijähriger Erprobung als gut geeignet, um pflanzliches Material ohne großen manuellen Aufwand auf den Nitratgehalt zu untersu­chen. Sie erfordert keine besonders kostspielige apparative Ausstattung und arbeitet verläßlich.

PROBENAHME SAMPLING

Abb. 4

SPÜLUNG WASHING

Einfluß der Probenahme- und Regenerierzeit Influence of time for sample input and regeneration

Zusammenfassung

Das von RuzrcKA und HANSEN entwickelte Prinzip der Flow Injection Analysis (FIA) bietet günstige Möglichkeiten für eine automatisierte Nitratbestimmung. Hierfür ent­hält der Trägerstrom das GRIEss-IwsvAY-Reagens auf Nitrit. Der Probenstrom (pH 8,0) wird über eine mit Palladium belegte Cadmiumsäule geführt, wobei Nitrat zu Ni­trit reduziert und dann mit dem Trägerstrom vereinigt wird. Die durch Nitrit bedingte Färbung wird bei 540 nm gemessen und auf einem Schreiber registriert.

Die geringe Säulendimension erfordert nur einen geringen Druck für den Flüssigkeit­stransport und die spezielle Füllung sichert eine Langzeitstabilität der Reduktionskapa­zität . Um Matrixeffekte weitgehend auszuschalten, wird die Methode der Standardzu­gabe angewandt unter Auswertung über die lineare Regression. Die mittlere relative Standardabweichung im Konzentrationsbereich zwischen 0,5 und 5,0 ppm Nitrat be­trägt 1,6% (n=6); die Nachweisgrenze liegt bei 0,05 ppm.

Summary

ScHWERDTFEGER, E.: Automatische Nitratbestimmung in pflanzlichem Material nach dem FIA- Prinzip (Automated nitrate assay in plant material jollowing the FIA principle}.

Landwirtsch. Forsch. 37, Kongreßband 1984

The principle of Flow Injection Analysis (FIA) developped by RuzrcKA and HANSEN offers good opportunities for an automated nitrate assay. In this case the GRIESS­lLOSVAY reagent for nitrite is part of the carrier stream. The sample (pH 8,0) is first gi­ven through a column containing Palladium-covered Cadmium, whereby nitrate is re­duced to nitrite which is then incorporated in the carrier stream. The coloration due to nitrite is read at 540 nm and registered by a recorder.

The small column needs only a low pressure for liquid transportation and the special filling secures a lang-time stability of the reducing power. For greatly eliminating ma­trix effects the method of standard addition is used and evaluation is done by linear re­gression. The mean relative standard deviation in the range between 0,5 and 5,0 ppm ni­trate is 1,6% (n=6), the limit of detection lies at 0,05 ppm.

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Literatur

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