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Prüfungen Zwei-Fach Bachelor & Bachelor Berufskolleg:

Klausur am 27. Juli

Bachelor of Science:

Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, 20-30 Min

Prüfer Botanik:

Finkemeyer, Kudla, von Schaewen

Prüfer Mikrobiologie:

Fetzner, Meinhardt, Philipp, Steinbüchel

Prüfer Zoologie:

Klämbt, Lammel, Paul, Weber, Zeis

Prüfungen Bachelor of Science:

Zwei von drei Fächern, Inhalt der Vorlesungen, 20-30 Min

Nach Bekanntgabe der Termine ist Änderung nur noch

möglich:

- aus wichtigem Grund

- mit Tauschpartner

- bis Mitte Juni

Prüfungsunterlagen 2 Wochen vor Ihrem ersten

Prüfungstermin im Dekanat abholen

und zu den Prüfungen mitbringen.

Zellbiologie und Physiologie

Woche 3

(4.5.-8.5.2015)

Bettina Zeis Institut für Zoophysiologie

Eva Klumpen, Christian Lischka, Chrishanti Lowe, Toni Weinhage

Enzymatische Metabolitbestimmung

Enzymatische Laktatbestimmung

1. Der biologische Hintergrund

funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation

Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel

2. Der methodische Hintergrund

Lambert-Beer‘sches Gesetz & Photometrie

enzymatische Metabolitbestimmung

Energiestoffwechsel

Kohlenhydrate

Glykolyse

Pyruvat

Proteine

Aminosäuren

NH3 Alanin

Harnstoff

cyclus

Fette

Glycerin, Fettsäuren

ß-Oxidation

Acetyl-CoA

Citratcyclus

Atmungskette

NADH O2

ADP ATP

Glykolyse

Voet & Voet: Biochemie VCH 1994

Glucose

Pyruvat

NAD+

NADH+H+

2 ADP

+Pi

2ATP

Substratketten-

Phosphorylierung

Atmungskette = oxidative Phosphorylierung

I NADH-Ubichinon-Reduktase

II Succinat-Ubichinon-Reduktase

III Ubichinon-Cytochrom-c-Reduktase

IV Cytochrom-C-Oxidase

V ATP-Synthase, F0F1-ATPase

O2

Energieausbeute

Glycolyse + Citratcyclus +

Atmungskette:

38 (36) ATP je Glucose

Energiestoffwechsel Kohlenhydrate

Glucose

Glykolyse

Pyruvat

Acetyl-CoA

Citratcyclus

Atmungskette

NADH O2

ADP ATP

2 ADP

+Pi

2ATP

NAD+

NADH+H+

NAD

NADH

NAD

Pyruvat

NAD+

NADH

+H+

L-Laktat Laktatdehydrogenase

LDH

NAD+

Funktion der Milchsäuregärung

1. Entfernen des Glykolyse-Endproduktes Pyruvat

2. Oxidation von NADH zu NAD

(Regeneration des Elektronenakzeptors NAD)

Ablauf der Glykolyse unter

anaeroben Bedingungen, ATP-Gewinnung

Laktatdehydrogenase

Voet & Voet:

Biochemie VCH 1994

Nativ als

Tetramer

Je UE ca.

330 aa

36 kDa

Stereospezifität

Laktatdehydrogenase

LDH

Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

COO-

HO-C-H

CH3

COO-

C=O

CH3

Oxidation Reduktion

In der Zelle

Energiegewinnung unter Sauerstoffmangel

1. Funktionsbedingte Anaerobiose

Exzessive Muskeltätigkeit (Endspurt bei Beutejagd, Fluchtreaktionen)

Sauerstoff ist vorhanden, reicht aber nicht aus

Atmungskette und Citratcyclus laufen auf Hochtouren

Kapazität der Atmungskette ist überschritten, Blutkreislauf kann trotz erhöhter Perfusion

nicht schnell genug Sauerstoff nachliefern

kurzfristige Bereitstellung von ATP durch zusätzliche Milchsäuregärung

2. Biotopbedingte Anaerobiose

Sauerstoffmangel im Umgebungsmedium (z.B. eutrophierte Gewässer, große Höhe)

Sauerstoff steht nicht zur Verfügung, Atmungskette und Citratcyclus kommen zum

Erliegen

Reaktion: Stoffwechselabsenkung (metabolic depression)

langfristig Energiegiegewinnung durch alternative Stoffwechselwege möglich

Akkumulation von Laktat, Succinat, Acetat, Propionat, Opinen

Cori Zyklus

Enzymatische Laktatbestimmung

1. Der biologische Hintergrund

funktionelle Anaerobiose Laktatakkumulation

Energiestoffwechsel unter Sauerstoffmangel

2. Der methodische Hintergrund

Lambert-Beer‘sches Gesetz & Photometrie

enzymatische Metabolitbestimmung

Laktatdehydrogenase

LDH

Laktat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

COO-

HO-C-H

CH3

COO-

C=O

CH3

Oxidation Reduktion Enzymatische

Laktatbestimmung

Lichtabsorption von NAD/NADH

Voet & Voet:

Biochemie VCH 1994

NADH

NAD+

Lambert-Beer‘sches Gesetz

Licht h . n Lösung des Chromophors ankommendes

Wellenlänge g mit Konzentration c Licht

Io Schichtdicke (d) 1 cm I

I -2,303 e . c . d

= e Io

Extinktion E = log = e . c . d Io

I

Extinktionskoeffizient e

für NADH: e340 nm = 6,3 l . mmol-1 . cm-1 Transmission: 100 . I / Io

(Angabe in %)

Zeitverlauf enzymatischer Reaktionen

Zeit (min)

0 1 2 3 4

E

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Enzym-

zugabe DE

DE

Dc =

e * d

Der Praktikumsversuch

Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose

Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der

Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender

Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer

GGruppe

Aktives Tier: Hämolymphentnahme nach

1 / 2

2 min

3 / 4

4 min

5 / 6

6 min

7 / 8

7 min

9 / 10

8 min

11/12

9 min

Je Gruppe:

1 Ruhewert ohne

Aktivität (0 min)

1 Wert nach Aktivität

vom gleichen Tier

Durchführung

- Hämolymphabnahme (Spritzen und Kanülen am Arbeitsplatz liegen lassen)

- Hitzedenaturierung der Proteine (Thermoblock 10 min)

- Zentrifugation (10 min 14000 rpm)

Pellet: denaturierte Eiweiße, Zellfraktionen

Überstand: niedermolekulare Metabolite

- enzymatische Laktatbestimmung

Photometrische Messung

1. Leerwert: Extinktionsänderung ohne Laktat

2. Standard, Kalibrierung (Messung bekannter

Laktatkonzentrationen)

3. Lösung unbekannter Laktatkonzentrationen

(Hämolymphproben)

Photometrische Messung

Leerwert Standard Probe

Puffer 860 µl 860 µl 860 µl

NAD 20 µl 20 µl 20 µl

Wasser 100 µl ad 100 µl ad 100 µl

Standard 10/20/30 µl

Probe 10/20 µl

E vorher

LDH 20 µl 20 µl 20 µl

1 h 37 °C

E nachher

Der Praktikumsversuch Laktatakkumulation nach funktioneller Anaerobiose

Bestimmung der Laktatkonzentration in der Hämolymphe der

Strandkrabbe Carcinus maenas vor und nach erschöpfender

Muskelaktivität unterschiedlicher Dauer

Je TISCH:

1 Ruhewert ohne

Aktivität (0 min)

1 Wert nach

Aktivität

vom gleichen Tier

Gruppe Ruhewert

Laktat

(mmol/l)

Null

Aktivität

Aktivitätsdauer

(Minuten)

Nach

Aktivität

Laktat

(mmol/l)

1/2 1

3/4 2

5/6 3

7/8 4

9/10 6

11/12 8

Protokoll:

1. Einleitung

2. Material und Methoden

3. Ergebnisse

Tabelle Original-Messwerte (eigene Gruppe)

Kalibrierungsgerade (Diagramm und Geradenfunktion, eigene Gruppe)

Berechnete Laktatkonzentration der Hämolymphproben (eigene Gruppe)

Tabelle der Ergebnisse aller Gruppen Grafik des Zeitverlaufs

Beschreibung der Ergebnisse in Textform

4. Diskussion

Standard für grafische Darstellungen:

• XY-Plot!

• Lineare Achsen!

• Achsenbeschriftung: Parameter und Einheit!

0

2

4

6

8

10

12

1 1,5 2 2,5 3 4 5 8 11 20

Lä

ng

e (

mm

)

Alter (Tage)

Alter (Tage)

0 5 10 15 20

Län

ge (

mm

)

0

2

4

6

8

10

Protokollstandards

Legenden

- befinden sich

oberhalb von Tabellen

unterhalb von Abbildungen

- fassen die Aussage der Abbildung (Tabelle) zusammen:

Welche Parameter wurden untersucht?

Was ist das Hauptergebnis?

Citratcyclus

Voet & Voet:

Biochemie VCH 1994