Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von...
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Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von
Mikroorganismen
Thema: Mikroorganismen, Wärme
26.11.2014 V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 1
V11
1. Einleitung
Mikroorganismen spielen in unserem Leben eine wichtige Rolle. So sind
Mikroorganismen mitverantwortlich für die Mineralisierung von organischem
Material und somit für den natürlichen Stoffkreislauf.
Beim Menschen können sie auch für Krankheiten verantwortlich sein, (z.B.
wird Scharlach durch Bakterien verursacht). Weiterhin können sie
Lebensmittel verderben (z.B. Schimmelpilze).
Sie können jedoch auch gezielt eingesetzt werden, um bestimmte Stoffe
herzustellen. So wird z.B. Alkohol durch Hefen produziert, Joghurt mit Hilfe
von Bakterien hergestellt oder das Antibiotikum Penicillin durch einen Pilz.
Bei diesen technischen Prozessen spielt deshalb das gezielte Handling von
Mikroorganismen eine wesentliche Rolle.
2. Grundlagen
Für ein gezieltes mikrobiologisches Arbeiten oder bei der Konservierung von
Lebensmitteln ist die Abtötung von Mikroorganismen ein zentrales Thema.
Hierbei geht es darum, die Mikroorganismen einerseits unschädlich zu
machen, gleichzeitig sollen jedoch die im Produkt enthaltenen Wertstoffe
(z.B. Vitamine) möglichst erhalten bleiben. In diesem Versuch soll untersucht
werden, welchen Einfluss eine Wärmebehandlung auf die Vitalität von
Mikroorganismen hat.
Als Mikroorganismus wird hierbei die Hefe Saccheromyces cerevisiae
eingesetzt, die allen als Backhefe bekannt ist. Weiterhin ist diese Hefe auch
für die alkoholische Gärung (Wein-/Bierherstellung) von Bedeutung.
In diesem Versuch soll über eine Färbung mit einem bestimmten Farbstoff,
eine sogenannte Lebend-Tot-Färbung, der Vitalitätszustand der Zellen in
Anbhängigkeit von der Temperatru durchgeführt werden. Für solche
Färbungen kommen verschiedene Farbstoffe zum Einsatz.
Info:
Saccheromyces cerevisiae:
Backhefe, Bierhefe
Info:
Vitalität = Lebenskraft
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Methylenblau:
Methylenblau wird von den Enzymen der Hefezellen in farbloses Leukoform
umgewandelt. D. h. Zellen, bei denen die Enzyme noch funktionieren,
erscheinen im Mikroskop farblos, Zellen bei denen die Enzyme nicht
funktionieren, erscheinen im Mikroskop violett [1].
Abb. 1: Mit Methylenblau angefärbte Hefezellen nach der Erhitzung. In den hellen Zellen wurde der Farbstoff durch Enzyme abgebaut. Diese Zellen werden als lebend gewertet. Bei den dunkel gefärbten Zellen konnte der Farbstoff nicht abgebaut werden, diese werden als tot gewertet.
Eosin /Trypanblau:
Die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau können die Zellwand intakter Zellen
nicht durchdringen. Der Farbstoff kann somit nur in Zellen eindringen, deren
Zellwand nicht mehr intakt ist. Diese erscheinen im Mikroskop blau-violett,
die intakten Zellen sind farblos.
Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer
Über eine Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer kann die Anzahl der Zellen in
einem Medium bestimmt werden.
Eine Zählkammer ist ein (dickerer) Objektträger mit 3 quer verlaufenden Stegen
(2 schmale an den Seiten und ein dickerer in der Mitte). Die beiden äußeren
Stege sind genau 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens. In die
Oberfläche des etwas breiteren Mittelstreifens sind zwei kreuzförmige Netze
lebend
tot
Kurz gesagt:
Die Zellen werden gefärbt
und dann in eine Zählkam-
mer eingebracht. In der
Zählkammer befindet sich
ein bestimmtes Volumen.
Somit kann die ermittelte
Zellzahl immer auf ein be-
stimmtes Volumen bezogen
werden und man kann eine
Konzentrationsangabe ma-
chen.
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von Linien eingeätzt, die als Flächenorientierung bei der Zählung verwendet
werden.
die den Grundriss der Kammern bilden. Zu beiden Seiten des Mittelstreifens,
jeweils auf der anderen Seite der tiefen Rinnen, befindet sich ein etwas
schmalerer Steg. Die Oberflächen dieser beiden äußeren Stege sind ebenfalls
plangeschliffen und liegen 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens.
Abb. 2: Thoma-Zählkammer: In der Mitte der etwas tiefer gelegene Steg mit den Liniennetzen zum Zählen (die Liniennetze sind in der Aufnahme nicht sichtbar). Rechts und links davon die etwas höher gelegenen Stege.
Durch Auflegen eines dicken, plangeschliffenen Deckglases auf diese beiden
höheren Stege entsteht ein Zwischenraum definierter Größe (Grundfläche x
Höhe), in welche die Probe eingefüllt wird. Die auf einer bestimmten Fläche des
Netzes liegenden Zellen werden ausgezählt.
Sie können somit auf das Volumen der Zählkammern bezogen werden, womit
die Angabe einer Zellkonzentration möglich wird. Die Zellkonzentration wird
nach folgender Formel berechnet:
Die Angaben zur Fläche und Kammertiefe findest du auf der Zählkammer [2].
Info:
Eine Konzentration muss in
diesem Versuch nicht
ermittelt werden, da nur
das Verhältnis lebender
Zellen im Vergleich zu der
Gesamtzellzahl berechnet
wird.
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3. Versuchsdurchführung
3.1 Versuchsvariante 1
Lebend-/Tot-Färbung
Material:
Zellsuspension (z.B. Hefen im Apfelsaft)
Objektträger, Deckgläschen
0,1 %-ihr Methylenblaulösung (in H2O)
Pasteurpipette oder Pipette (1 ml)
Reagenzglas oder Reaktionsgefäß
Aufgabenstellung:
Führe eine Lebend-/Tot-Färbung der Mikroorganismen durch und betrachte diese unter dem Mikroskop.
Versuchsdurchführung:
Mische die Zellsuspension mit der gleichen Menge 0,1%igen Methylenblaulösung.
Beobachtung:
Betrachte die gefärbten Zellen nach einer Einwirkzeit von 5 min unter dem Mikroskop
Aufgabe:
a) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. b) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau?
Vorsicht:
Methylenblauflecken las-
sen sich nur schlecht ent-
fernen.
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3.2 Versuchsvariante 2
Teilversuch 1
Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in
der Mikrowelle
Material
Mikrowelle
Stoppuhr
Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein)
1 Schüssel mit Eiswasser
7x Erlenmeyerkolben (250 ml)
Aufgabe
Bestimme, wie lange du einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml Flüssigkeit in die
Mikrowelle stellen musst, um bestimmte Temperaturen zu erreichen.
Versuchsdurchführung
Erlenmeyerkolben mit 100 ml Leitungswasser (Raumtemperatur) füllen
Die Mikrowelle auf volle Leistung stellen
Bei der Mikrowelle eine längere Zeit einstellen, die exakte Zeit wird
mittels Stoppuhr und durch das Öffnen der Mikrowellentür vorgegeben
Die Temperatur des Wassers in Abhängigkeit von verschiedenen Zeiten
ermitteln
Aufgaben und Messwerte:
a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft.
b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird.
c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der
Größenordnung von 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C zu
erhalten?
Achtung:
Der Temperaturbereich
zwischen Raumtemperatur
und 80°C sollte abgedeckt
sein.
Achtung:
Da es in der Mikrowelle
punktuelle Temperaturun-
terschiede gibt (so ge-
nannte Hot Spots) muss
der Erlenmeyerkolben im-
mer auf dieselbe Stelle
platziert werden (Markie-
rung vornehmen).
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Teilversuch 2
Erhitzen von Hefezellsuspensionen
Material
Mikrowelle
Stoppuhr
Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein)
1 Schüssel mit Eiswasser
7x Erlenmeyerkolben (250 ml)
2x Erlenmeyerkolben 1 l
2 l A-Saft
2 Päckchen Backhefe
Aufgabe:
Erhitze verschiedene Hefezellsuspensionen auf ca. 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C,
70°C und 80°C
Versuchsdurchführung
1 Päckchen Backhefe und 500 ml Apfelsaft werden über Nacht
vorkultiviert (bei Raumtemperatur). Der Kolben sollte dabei ein Volumen
von mindestens 1 l fassen, damit die Sauerstoffversorgung der Hefe
gewährleistet ist. Wenn alle o.g. Temperaturen untersucht werden, muss
dieser Ansatz doppelt gemacht werden, da für jede Temperatur 100 ml
benötigt werden.
Am Versuchstag werden in die 7 Erlenmeyerkolben je 100 ml der Hefe-
/Apfelsaftsuspension gegeben.
Einen Kolben nicht erhitzen, die anderen Kolben für die oben ermittelten
Zeiten auf ca. 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C in der
Mikrowelle erhitzen, danach sofort die Temperatur messen und die
Kolben in Eiswasser auf Raumtemperatur abkühlen.
Aufgaben und Messwerte:
a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft.
Achtung:
Da es in der Mikrowelle
punktuelle Temperaturun-
terschiede gibt (so ge-
nannte Hot Spots) muss
der Erlenmeyerkolben im-
mer auf dieselbe Stelle
platziert werden (Markie-
rung vornehmen).
Achtung:
Die Hefesuspension muss
am Tag zuvor angesetzt
werden.
Achtung:
Vergiss nicht, die Kolben
entsprechend zu beschrif-
ten.
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Teilversuch 3
Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen
Material
Hefezählkammer (z.B. Thomazählkammer oder Neubauer improved) mit Deckgläschen
0,1 %-ige Methylenblaulösung
Reagenz- oder Zentrifugenröhrchen
Pasteurpipetten oder Pipetten
Aufgabe
Ermittle den Anteil vitaler Zellen in Abhängigkeit von der Erhitzungstemperatur.
Versuchsdurchführung
Probenvorbereitung
1 ml Hefesuspension und 1 ml Methylenblaulösung in ein Röhrchen
pipettieren.
Probe gut schütteln (falls vorhanden Vortexer verwenden)
Probe 5 min stehen lassen
Mikroskopische Auswertung
Deckglas auf Zählkammer legen
Die Außenstege mit destilliertem Wasser befeuchten und das Deckglas mit
sanftem Druck von vorn auf die Zählkammer schieben.
Probe gut mischen und mit einer Pipette einen Tropfen entnehmen. Den
Tropfen vorsichtig an die Stelle zwischen Deckglas und Kammerboden bringen.
Abb. 3: Befüllen der Thoma-Zählkammer
Sind Luftblasen sichtbar oder ist die Flüssigkeit über die Ränder in die Rinnen
übergequollen, so muss die Kammer gereinigt und nochmals befüllt werden.
VORSICHT!:
Das Deckgläschen ist leicht
zerbrechlich.
Info:
Durch die Kpillarwirkung
füllt sich der Spalt
zwischen Deckglas und
Kammerboden
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Die Zellen werden unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung gezählt.
Dabei wird die Kultursuspension so verdünnt, dass man in einen zählbaren
Bereich kommt. Die verdünnte Kultursuspension wird dabei auf einen speziellen
Objektträger, die Zählkammer pipettiert.
Auszählen:
Das Liniennetz der Thomazählkammern hat 25 Großquadrate. Ausgezählt werden
die 5 diagonal verlaufenden (s. Abb.).
Die Großquadrate sind ferner in 16 Kleinquadrate unterteilt. Hier werden alle Zellen
innerhalb des definierten Messbereiches gezählt.
Mitgezählt werden die an 2 (!) Kanten aufliegenden Zellen (schwarz). Die an den
anderen beiden Kanten aufliegenden Zellen werden nicht gezählt.
Der Zählvorgang erfolgt in der Reihenfolge, wie durch die Pfeile angegeben.
Aufgaben:
a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft)
b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der
Gesamtzellzahl
c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über
der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird.
d) Erläutere dieses Diagramm.
e) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen
vorhanden?
f) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind
sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft
behandeln, damit er nicht zu gären anfängt?
Abb. 4: Ausschnit eines Großquadrates mit 16 Kleinquadraten
Abb. 5 Thoma- oder Neubauer improved-Zählkammer mit 25 Großquadraten. Ausgezählt werden die 5 diagonal verlaufenden Großquadrate
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4. Weiterführende Literatur:
[1] Praktikum Mikro- und Zellbiologie im Modul Biobasics BPT1, 4. Auflage, 2010, Hochschule Furtwangen: Hochsieder, G.; Lachner, K.; Paatsch, T.; Salat, U.; Seidinger, H.; Kunzelmann, H.
[2] LO - Laboroptik Ltd, Information über Zählkammern
http://www.zaehlkammer.de/pdf/info_zaehlkammern.pdf
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5. Kurzbeschreibung
In diesem Versuch wird der Einfluss der Temperatur auf die Vitalität der
Hefezellen untersucht. Hierzu werden die Zellen unterschiedlich stark erhitzt,
anschließend eine Vitalitätsfärbung durchgeführt und mikroskopisch ausgewertet.
Zur Quantifizierung wird mit einer Zählkammer gearbeitet.
6. Lernziel
- Grundlagen Konservierung
- Erhitzung
- Arbeiten mit Mikroorganismen
- Mikroskopie
7. Versuchsdauer
Kalibrierung der Mikrowelle 1 Unterrichtsstunde
Lebend- /Tot Färbung: 1 Doppelstunde
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8. Beispiellösungen
Versuchsvariante 1
Lebend-/Tot-Färbung
Aufgabe:
c) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. Ein Teil der Hefezellen ist blau gefärbt, ein Teil ungefärbt.
d) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau? In den lebenden Zellen wird der Farbstoff Metyhlenblau umgebaut zu Leukoform, welche farblos ist.
Versuchsvariante 2
Teilversuch 1
Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in
der Mikrowelle
Aufgaben und Messwerte:
Die Kalibrierung muss für jede Mikrowelle individuell durchgeführt
werden.
a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft.
b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird.
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150
Temperatur [°C]
Zeit Mikrowelle [s]
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c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der
Größenordnung von 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C zu
erhalten?
Zei t [s]
Temp. [°C]
10 30
30 46,9
40 53,3
50 60,1
60 66
70 72,4
80 76,4
90 79,1
100 81,5
Teilversuch 2
Erhitzen von Hefezellsuspensionen
a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft.
Die ermittelten Temperaturen sollten größenordnungsmäßig den Werten der ermittelten Kalibrierkurve entsprechen.
Teilversuch 3
Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen
a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft)
Temperatur [C°]
Zellen insgesamt
lebende Zellen
Anteil lebender Zellen
[%]
20 144 102 71%
30 144 102 71%
40 113 72 64%
50 74 29 39%
60 59 16 27%
70 42 3 7%
80 48 1 2%
b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der
Gesamtzellzahl
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c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über
der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird.
d) Erläutere dieses Diagramm.
Mit zunehmender Erhitzungstemperatur nimmt der Anteil der
lebenden Zellen ab.
g) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen
vorhanden?
Auch Hefezellen werden nicht unendlich alt. In einer Kultur sind stets
Zellen in verschiedenen Stadien vorhanden, Zellen die sich vermehren
und Zellen die abgestorben sin.
e) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind
sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft
behandeln, damit er nicht zu gären anfängt?
Erhitzen, auf mindestens 80°C
9. Anmerkungen für projektorientiertes / forschendes Arbeiten
Der Zusammenhang zwischen Temperatur und Zeit in der
Mikrowelle kann auch sehr frei formuliert werden, so dass Schüler
der Schüler sich seine Vorgehensweise selbst überlegen muss.
Dier Erhitzung kann auch auf andere Art (z.B. in Reagenzröhrchen in
einem Wasserbad) realisiert werden. Die Vorgehensweise wurde
hier so gewählt, weil die Prozedur dann vergleichbar mit dem
Versuch „Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von
Mikroorganismen ist, und die Ergebnisse verglichen werden
können.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
20 30 40 50 60 70 80
Erhitzungstemperatur [°C]
Anteil lebender Zellen
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Zur Vereinfachung könnten auch normale Objektträger eingesetzt
werden, und die Zellen in einigen mikroskopischen Gesichtsfeldern
ausgezählt werden.
Der Versuch kann insgesamt arbeitsteilig durchgeführt werden. (z.B.
jede Gruppe eine andere Temperatur)
Es könnte auch so umgesetzt werden, dass jede Schülergruppe
einen anderen Versuch zum Thema durchführt (eine Gruppe wertet
über die Lebend- / Tot-Färbung aus, eine Gruppe untersucht die
Aktiviät der Mirkoorganismen über die Gasbildung (Versuch:
Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen)
Eine Gruppe streicht Platten aus (Versuch geplant).
Oder alternativ: Eine Gruppe untersucht jeweils:
den Einfluss der Temperatur auf Mikroorganismen
den Einfluss der Temperatur auf Enzyme (Versuch zum Einfluss der Temperatur auf Polyphenoloxidasen (sind für die enzymatische Bräunung des Apfels zuständig) ist geplant.
Dem Einfluss der Temperatur auf Vitamine (Versuch zu Vit. C ist geplant)
10. FAQ / Tips & Tricks
Eine Hefesuspension muss bereits am Tag zuvor angesetzt werden!
Alternativ zu Methylenblau können auch die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau
eingesetzt werden.
10. Anmerkungen
In Zusammenhang mit diesem Versuch gibt es weiter die Versuche: Einfluss der
Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen (als Maß für die Aktivität wird
die Gasbildung von Hefen gemessen) und Einfluss der Temperatur auf das
Wachstum der Zellen (hier werden die Proben auf Nährmedien ausplattiert).
Dieser Versuch soll eine Vorbereitung auf den Gesamtzusammenhang des
Einsatzes unterschiedlicher Erhitzungsverfahren (Pasteurisation, UHT-Erhitzung,
Sterilisation,…) sein. Es sind weitere Versuche geplant, die den Einfluss der
Hitzeeinwirkung auf weitere Produktinhaltsstoffe, z.B. Vitamine oder Enzyme
zeigen. Die übergeordnete Fragestellung ist; Wie kann ich Mikroorganismen
ausreichend inaktivieren und dabei andere Produktinhaltsstoffe schonen?
Achtung!:
Hefesuspension am Tag
vorher ansetzen!!!
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11. Bezugsquellen
Apfelsaft und Backhefe könne im Supermarkt bezogen werden.
Thoma- oder Neubauer Zählkammer: im Laborbedarf erhältlich. Es sind spezielle,
dafür vorgesehene Deckgläschen erforderlich.
Preis:
Zählkammer ca. 30,00 €
10 Deckgläschen: ca. 16,00 €
10. Versuchslegende
Herausgeber: Technikinitiative NwT
Hochschule Furtwangen | Furtwangen University
Jakob-Kienzle-Str. 17
78054 Villingen-Schwenningen
http://technikinitiative-nwt.de/
Autor: Dipl.-Ing. (FH) Ursula Eschenhagen
Erstellt: Juni 2012
In Zusammenarbeit mit: Severin Gylstorff