Einfluss einer Gentherapie mit Thrombospondin 1 und 2 auf ... · 3.1 Bedeutung der Diabetischen...

Aus der Medizinischen Klinik 4 – Nephrologie und Hypertensiologie

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Kai-Uwe Eckardt

Einfluss einer Gentherapie mit

Thrombospondin 1 und 2 auf die Progression

der Diabetischen Nephropathie

in der Maus

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Sebastian Graf

aus

Eichstätt

2

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler Referent: PD Dr. rer. nat. Christoph Daniel Korreferentin: Prof. Dr. med. Kerstin Amann Tag der mündlichen Prüfung: 14.3.2012

3

Für meine Eltern

4

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ................................................................................. 7

2 Abstract ................................................................................................... 9

3 Einleitung .............................................................................................. 10

3.1 Bedeutung der Diabetischen Nephropathie ............................................ 10

3.2 Histologische Kennzeichen ..................................................................... 11

3.3 Pathomechanismen der Diabetischen Nephropathie .............................. 12

3.3.1 Biochemische Veränderungen durch Hyperglykämie ............................. 12

3.3.2 Hämodynamische Veränderungen ......................................................... 13

3.3.3 Beeinflussung durch das Renin-Angiotensin-System ............................. 14

3.3.4 Genetische Determinanten der Diabetischen Nephropathie ................... 14

3.3.5 Rolle der Zytokine ................................................................................... 14

3.4 TGF-β als Mediator bei der Diabetischen Nephropathie ......................... 15

3.4.1 TGF-β als verbindendes Element der Pathomechanismen .................... 15

3.4.2 Aktuelle Erkenntnisse über den Zusammenhang von TGF-β und der Diabetischen Nephropathie .............................................................. 16

3.4.3 Molekularstruktur und Signaltransduktionswege von TGF-β .................. 16

3.5 Aufbau und Funktion der Thrombospondine ........................................... 18

3.5.1 Familie der Thrombospondine ................................................................ 18

3.5.2 Biologische Rolle der Thrombospondine ................................................ 19

3.5.3 Molekulare Struktur der Thrombospondine 1 und 2 ................................ 20

3.5.4 Interaktion der Thrombospondine 1 und 2 mit TGF-β ............................. 21

3.6 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................. 23

4 Material und Methoden ......................................................................... 24

4.1 Tierversuch ............................................................................................. 24

4.1.1 Versuchstiere .......................................................................................... 24

4.1.2 Experimentelles Design .......................................................................... 24

4.1.3 Vorgehensweise bei der Nephrektomie .................................................. 27

4.1.4 Töten der Tiere ....................................................................................... 27

4.2 Gewinnung & Analyse des Probenmaterials ........................................... 27

4.2.1 Glukosespiegel im Blut ........................................................................... 27

4.2.2 24 Stunden Sammelurin ......................................................................... 28

4.2.3 Gewichtskontrolle ................................................................................... 28

4.2.4 Serumgewinnung .................................................................................... 28

4.2.5 Bestimmung von Serumharnstoff und Serum- und Urinkreatinin ............ 28

4.2.6 Berechnung der Kreatinin-Clearance ...................................................... 29

4.2.7 Bestimmung der Proteinmenge im Urin .................................................. 29

4.2.8 Konservierung des Versuchstiergewebes ............................................... 30

5

4.3 Aufbereitung der Gewebe für die Immunhistochemie ............................. 31

4.3.1 Prozessieren des Gewebes .................................................................... 31

4.3.2 Anfertigen von Schnitten aus Gefriergewebe .......................................... 33

4.3.3 Anfertigen von Schnitten aus Paraffinblöcken ........................................ 33

4.4 (Immun)histochemische Färbungen ....................................................... 33

4.4.1 Periodsäure-Schiff-Färbung (PAS) ......................................................... 33

4.4.2 Immunfluoreszenzfärbung an Gefrierschnitten ....................................... 34

4.4.3 Immunfluoreszenzfärbung an Paraffinschnitten ...................................... 35

4.4.4 Immunperoxidasefärbung ....................................................................... 36

4.4.5 Primärantikörper ..................................................................................... 37

4.4.6 Sekundärantikörper und deren Substrate ............................................... 38

4.4.7 Mikroskopische Auswertung ................................................................... 39

4.5 Zymogramme .......................................................................................... 40

4.5.1 Proteinextraktion ..................................................................................... 40

4.5.2 Proteinbestimmung detergenzhaltiger Proben ........................................ 41

4.5.3 Anfertigen der nativen Polyacrylamid-Gele ............................................. 41

4.5.4 Beladen und Lauf der Gele ..................................................................... 41

4.5.5 Inkubation der Gele ................................................................................ 42

4.5.6 Blockieren der Matrixmetalloproteinasen ................................................ 42

4.5.7 Auswertung ............................................................................................. 42

4.5.8 Lösungen ................................................................................................ 43

4.6 Enzyme Linked Immunosorbent Assay ................................................... 44

4.6.1 Messung der Albuminurie ....................................................................... 44

4.6.2 Pufferlösungen ........................................................................................ 45

4.7 Real-Time PCR ....................................................................................... 45

4.7.1 RNA-Isolierung ....................................................................................... 45

4.7.2 Herstellung der cDNA ............................................................................. 46

4.7.3 Real-Time PCR ....................................................................................... 46

4.8 Statistische Auswertung.......................................................................... 47

4.9 Material ................................................................................................... 47

4.9.1 Chemikalien ............................................................................................ 47

4.9.2 Medikamente & Plasmide ....................................................................... 49

4.9.3 Geräte ..................................................................................................... 49

4.9.4 Verbrauchsmaterial ................................................................................. 51

4.9.5 Lösungen ................................................................................................ 51

5 Ergebnisse ............................................................................................ 52

5.1 Die Gentherapie hat keinen Einfluss auf die Blutzuckerwerte ................. 52

5.2 Die Gentherapie hat keinen Einfluss auf das Nierengewicht .................. 53

5.3 Thrombospondin 1 erhöht und Thrombospondin 2 reduziert das Level von aktivem TGF-β ........................................................................ 54

6

5.4 Modulation der Fibrose durch TSP1 und TSP2 ...................................... 56

5.5 Diabetische Tiere zeigen eine erhöhte MMP2 Aktivität ........................... 59

5.6 TSP2 schützt Podozyten vor einer Schädigung ...................................... 60

5.7 TSP2 hemmt die Infiltration von Entzündungszellen ............................... 61

5.8 Diabetes Mellitus Typ 1 führt zu einem renalen peritubulären Kapillarverlust ......................................................................................... 63

5.9 Die Behandlung mit TSP1 und TSP2 hat keinen Einfluss auf die Nierenfunktion ......................................................................................... 64

6 Diskussion ............................................................................................. 66

6.1 Aktuelle Datenlage .................................................................................. 66

6.2 Induktion eines Diabetes Mellitus und Entwicklung einer Diabetischen Nephropathie ..................................................................... 67

6.3 Aktivierung von TGF-β ............................................................................ 68

6.4 Modulation der Fibrose ........................................................................... 69

6.5 Infiltration durch Entzündungszellen ....................................................... 71

6.6 Schädigung der Podozyten ..................................................................... 71

6.7 Verlust der Kapillardichte ........................................................................ 72

6.8 Beeinflussung der Nierenfunktion ........................................................... 72

6.9 Zusammenfassung, Kritische Beurteilung und Ausblick ......................... 74

7 Abbildungsverzeichnis ......................................................................... 75

8 Literaturverzeichnis .............................................................................. 76

9 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................ 84

10 Danksagung .......................................................................................... 86

7

1 Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Diabetes Mellitus ist mittlerweile die häufigste

Ursache für eine fortgeschrittene Niereninsuffizienz und Dialysepflichtigkeit in

der westlichen Welt. Das Zytokin Transforming Growth Factor beta (TGF-β)

spielt eine zentrale Rolle bei der Krankheitsentstehung und Progression.

Damit TGF-β an seine Rezeptoren binden kann, muss es zuerst aktiviert

werden. Ein bereits bekannter Aktivator ist Thrombospondin 1 (TSP1). In

dieser Arbeit soll zum einen gezeigt werden, dass durch systemische Über-

expression von TSP1 die diabetische Nephropathie in vivo aggraviert wird.

Zum anderen soll demonstriert werden, dass die systemische Überexpres-

sion von TSP2 die Thrombospondin 1 vermittelte Aktivierung inhibiert und

damit die Progression der diabetischen Nephropathie reduziert.

Methodische Aspekte: Im Versuch wurde bei 27 Mäusen mittels Streptozoto-

cin (STZ) ein Diabetes Mellitus Typ 1 induziert. Bei einer Gruppe (n=9)

wurde mittels intramuskulärer Transfektion mit einem Plasmid TSP1 syste-

misch überexprimiert, bei einer weiteren Gruppe (n=9) wurde TSP2

systemisch überexprimiert. Bei einer dritten Gruppe (n=9) verwendeten wir

ein Kontrollplasmid (pUBlux). Als gesunde Kontrolle diente eine Gruppe von

8 Tieren ohne jegliche STZ-Injektion. Die diabetischen Tiere wurden 14

Wochen unter hyperglykämischen Bedingungen beobachtet. Mittels 24h-

Sammelurin wurde die Nierenfunktion überprüft. Das Level der Aktivierung

von TGF-β, der Grad der Fibrosierung, die Infiltration von Entzündungszel-

len, die Podozytenschädigung und der peritubuläre Kapillarverlust wurden

mit Hilfe von (immun)histochemischen Methoden in Nierenbiopsien überprüft.

Weiterhin gab eine Real-Time PCR Messung Auskunft über die Expression

von TGF-β1. Zymogramme zeigten die Aktivität der Matrix-Metalloproteinase

des Typs 2 (MMP2) an.

Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass die systemische

Überexpression von TSP1 das Level von aktivem TGF-β erhöht, und die

Überexpression von TSP2 das Level von aktivem TGF-β erniedrigt. Weiter-

hin führte die TSP2 Überexpression zu einer verringerten Deposition von

Kollagen IV, einer abgemilderten Infiltration durch Entzündungszellen

(Makrophagen, CD3+, CD4+, und CD8+ Zellen) und zu einem geringeren

8

Verlust der Podozytenanzahl. Die Aktivität von MMP2 und die Nierenfunktion

wurden durch die Überexpressionen nicht signifikant beeinflusst.

Praktische Schlussfolgerungen: Zusammenfassend konnten wir in dieser

Studie erstmalig in vivo nach dem Ursache-Wirkungs-Prinzip zeigen, dass

eine Überexpression von TSP1 die Aktivität von TGF-β bei der diabetischen

Nephropathie steigert und TSP2 ebendiese Aktivitätssteigerung verhindert.

Weiterhin reduzierte die TSP2 Überexpression die histologische Ausprägung

der diabetischen Nephropathie. Daher ist das Eingreifen in die

Thrombospondin-TGF-β-Achse eine vielversprechende Option bei der

Prävention und Therapie der diabetischen Nephropathie.

9

2 Abstract

Background: Diabetes is the most common cause of end-stage renal disease

in the western world. The cytokine Transforming Growth Factor beta (TGF-β)

plays a central role in the development and progression of diabetic

nephropathy. TGF-β needs to be activated to be able to bind to its receptors.

One known activator is Thrombospondin 1 (TSP1). This study aims to show,

that the systemic overexpression of TSP1 aggravates diabetic nephropathy

in vivo. Furthermore the study intends to demonstrate that the systemic

overexpression of TSP2 inhibits the TSP1 mediated activation of TGF-β and

therefore reduces the progression of diabetic nephropathy.

Methods: Type 1 diabetes was induced in wild-type mice (n=27) via the

injection of Streptocotocin. After intramuscular transfection of a plasmid one

group of 9 animals overexpressed TSP1, another group of 9 mice

overexpressed TSP2 and a control plasmid was used in a third group (n=9)

(pUBlux). We compared these three groups with one group of non-diabetic

mice (n=8). The animals lived 14 weeks under hyperglycemic conditions.

Renal function was evaluated with the help of 24h-urine samples. We

measured the level of activation of TGF-β, the degree of fibrosis/sclerosis,

the damage of podocytes and the loss of capillaries with

(immune)histochemical stainings of renal biopsies. With a real-time PCR, we

quantified the level of expression of TGF-β1. Furthermore zymographies

showed the activation of Matrix-Metalloproteinase 2 (MMP2).

Results: The systemic overexpression of TSP1 increased the level of active

TGF-β while TSP2 overexpression reduced it. Furthermore TSP2 overex-

pression reduced the deposition of Collagen Type IV and the influx of

inflammatory cells (macrophages, CD3+, CD4+ and CD8+ cells). Moreover,

TSP2 reduced the loss of podocytes. The activity of MMP2 and the renal

function was not significantly affected by the overexpressions.

Conclusions: This study shows for the first time in vivo that TSP1 increases

the level of active TGF-β in diabetic nephropathy, while TSP2 reduces it.

Furthermore, the overexpression of TSP2 ameliorated some histological

findings of diabetic nephropathy. Therefore, TSP1 blocking therapies may be

considered as a promising future treatment option for diabetic nephropathy.

10

3 Einleitung

Dieses Kapitel stellt einige Grundlagen der diabetischen Nephropathie dar:

Besonders berücksichtigt werden die verschiedenen Pathomechanismen, die

auch Möglichkeiten der Intervention, wie im Rahmen der vorgestellten

Studie, bieten.

3.1 Bedeutung der Diabetischen Nephropathie

Der Begriff „Diabetes Mellitus“ leitet sich vom altgriechischen διαβαίνειν

(hindurchfließen) und lateinischen mellitus (honigsüß) ab. Schon in der

Antike war das Krankheitsbild mit dem in Folge der Glucosurie honigsüß

schmeckenden Urin bekannt. Bis zum heutigen Tage hat sich der Diabetes

Mellitus mit einer Prävalenz von circa 10 % in Deutschland zu einer „Volks-

krankheit“ entwickelt, mit enormen gesundheitlichen Folgen für den Patienten

und immensen sozioökonomischen Auswirkungen auf die Gesellschaft.

Diabetes Mellitus ist jedoch nicht nur ein nationales Problem; weltweit wird

die Prävalenz weiter zunehmen [93]: Die Weltgesundheitsorganisation

rechnet mit einer Zunahme von aktuell 250 Millionen Erkrankten auf über 350

Millionen im Jahr 2030 [84].

Betroffene Patienten leiden dabei nicht so sehr an der Stoffwechselstörung

selbst, sondern an den Komplikationen, die ein langjähriger Diabetes mit sich

bringt: So kommt es in Folge einer Makroangiopathie zu einer erhöhten Rate

an kardiovaskulären Ereignissen wie Myokardinfarkten und Schlaganfällen.

Auf Seiten der kleinen Gefäße kommt es zu einer Retinopathie, Neuropathie,

Mikroangiopathie der kleinen Koronararterien und mehr. Ein weiteres betrof-

fenes Endorgan ist die Niere, deren durch die Stoffwechselstörung

verursachten Schäden unter dem Begriff der „Diabetischen Nephropathie“

subsummiert werden. Dabei kann die diabetische Nephropathie im fortge-

schrittenen Stadium bis zu einer chronischen Niereninsuffizienz und final zu

einer Dialysebedürftigkeit führen.

Mit der Prävalenzzunahme des Diabetes Mellitus kommt es auch zu einem

dramatischen Anstieg der Häufigkeit von niereninsuffizienten Patienten unter

den Diabetikern: Dies wird mittlerweile als „Katastrophe von globalem

Ausmaße“ angesehen [64]. So ist die diabetische Nephropathie mittlerweile

11

die häufigste Ursache für die fortgeschrittene Niereninsuffizienz in der

westlichen Welt [65]. In Deutschland ging man 2006 bei über 48.000 dialyse-

pflichtigen Patienten in 28 % der Fälle von Diabetes Mellitus als Verursacher

der Nierenfehlfunktion aus [70]. Neben den individuellen Auswirkungen auf

den Patienten ist die ökologische Dimension des Problems mit direkten

Behandlungskosten von 30.000 bis 50.000 Euro im Jahr beträchtlich [68].

Laut der Deutschen Diabetes Gesellschaft beruht die aktuelle Therapie der

diabetischen Nephropathie auf zwei Säulen [34]: Auf der einen Seite sollte

eine strikte Kontrolle des Blutzuckerspiegels beachtet werden. Zum anderen

sollten auch normotensive Patienten konsequent mit Blutdruckmedikamenten

behandelt werden. Hier werden vor allem ACE-Hemmer und Angiotensin-

Rezeptor-Blocker empfohlen, die auch in die Pathophysiologie und zugrun-

deliegenden Mechanismen eingreifen. Anzumerken ist, dass durch diese

Maßnahmen zwar die Progression der Krankheit verlangsamt, nicht jedoch

gestoppt wird [47].

Die Wahrscheinlichkeit, eine diabetische Nephropathie überhaupt erst zu

entwickeln, hängt stark von einer erfolgreichen Prävention und

Diabetesbehandlung ab: Angaben zum Risiko variieren daher je nach Studie:

Beispielsweise entwickeln 20 bis 40 % der Patienten mit DM Typ 1 eine Mik-

roalbuminurie – ein erstes Anzeichen einer Nierenschädigung [57]. Im Allge-

meinen wird das Risiko bei Typ 1 und 2 als gleichwertig eingeschätzt [63].

3.2 Histologische Kennzeichen

Die diabetische Nephropathie zeigt typische mikroskopische Veränderungen,

die partiell auch mit den klinischen Symptomen korrelieren [1, 28, 50]:

Die zuerst messbare und eine der zentralen Veränderungen ist die

Verdickung der glomerulären Basalmembran; zeitlich nahezu parallel findet

eine Verdickung der tubulären Basalmembran statt. Diesen Entwicklungen

folgt eine Expansion der mesangialen Matrix. Diese beruht vor allem auf

einer verstärkten Produktion von auch in der gesunden Niere vorhandenen

Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen Typ IV, Laminin und

Fibronektin. Es findet jedoch auch ein gestörter Umsatz und Abbau dieser

Moleküle statt. Die daraus folgende verstärkte Ablagerung zeigt sich als

diffuse Glomerulosklerose oder als noduläre Kimmelstiel-Wilson-Läsion.

12

Auch im Tubulointerstitium kommt es zu einer Fibrose. Diese beiden

Veränderungen korrelieren mit dem Abfall der Kreatinin-Clearance [59, 83].

Begleitend kommt es zu einer Hyalinose der glomerulären Gefäße und einer

Arteriolosklerose der afferenten und efferenten Arterien. Eine weitere renale

Zellpopulation nimmt ebenfalls Schaden: Es kommt zu Veränderungen und

zu einem Verlust von Podozyten und damit ihrer Filterfunktion [76].

Begleitend kommt es zu einer Infiltration durch Entzündungszellen, die auch

die Fibrose modulieren können [17-18, 29].

Das erste klinische Zeichen ist häufig die Mikroalbuminurie. Diese tritt jedoch

erst nach den ersten mikroskopischen Veränderungen auf. Sie kann sich

über das Stadium einer Makroalbuminurie bis zu einer chronischen Nierenin-

suffizienz entwickeln [53].

3.3 Pathomechanismen der Diabetischen Nephropathie

Die molekularen Mechanismen dieser Veränderungen sind sehr komplex.

Aber gerade in den letzten Jahren gelangte man zu einigen neuen Erkennt-

nissen über die einzelnen Faktoren. Neben den direkten biochemischen

Auswirkungen der Hyperglykämie und hämodynamischen Veränderungen

spielen das Renin-Angiotensin-System und genetische Ursachen eine Rolle.

Als ein verbindendes Element und gleichsam einer gemeinsamen

Endstrecke dienen Zytokine.

3.3.1 Biochemische Veränderungen durch Hyperglykämie

Eine hohe Glukosekonzentration per se führt bereits direkt zu Schäden an

der Niere. Beispielsweise konnte in vitro gezeigt werden, dass

Hyperglykämie die Apoptose von mesangialen Zellen fördert [51]. Dabei

kommt es vor allem auf die intrazelluläre Glukosekonzentration an, die durch

Glukosetranstporter wie GLUT1 und GLUT4 vermittelt wird [35].

Vier verschiedene Stoffwechselpfade sind hier von Bedeutung [13]:

1. Über den Polyolpfad wird die erhöhte Menge an zellulärer Glucose zu

Fructose umgebaut. Die entstehenden Intermediärmetabolite spielen

eine Rolle bei der Progression der diabetischen Nephropathie.

13

2. Der Hexosamin-Stoffwechselweg, in dem Aminozucker synthetisiert

werden, scheint ebenfalls für einige Manifestationen von diabetischen

Komplikationen verantwortlich zu sein.

3. Ein dritter untersuchter biochemischer Mechanismus der

hyperglykämischen Schädigung ist die Aktivierung von Proteinkinase

C, einem intrazellulären second messenger.

4. Als ein weiterer entscheidender biochemischer Prozess konnte die

nicht-enzymatische Glykosilierung von Proteinen identifiziert werden.

Diese Proteine werden als advanced glycation end products (AGE)

bezeichnet und können unter anderem über einen Rezeptor die

Genexpression von Zytokinen beeinflussen.

Weiterhin kommt es durch die Hyperglykämie zu einer Überproduktion von

reaktiven Sauerstoffradikalen im Rahmen der mitrochondrialen

Atmungskette. Diese Sauerstoffradikale scheinen ein übergeordnetes

Element zu sein, welches mit mindestens drei der genannten Mechanismen

interagiert [58].

3.3.2 Hämodynamische Veränderungen

Seit über zwei Dekaden ist bekannt, dass auch hämodynamische

Veränderungen bei der Entwicklung der diabetischen Nephropathie eine

Rolle spielen [31, 87]: Es kommt zu einer Hyperperfusion und Hyperfiltration

im Glomerulus, auch unabhängig vom systemischen Blutdruck. Die Verände-

rungen begünstigen auch den Verlust von Proteinen in den Primärharn. Der

Anstieg des glomerulären Plasmaflusses und der erhöhte transkapilläre

hydrostatische Druck resultieren aus einem Abfall des Widerstandes in den

efferenten und vor allem in den afferenten Arteriolen. In einer gesunden

Niere würde der gesteigerte Druck durch eine Autoregulation der Gefäße

kompensiert werden. Bei der diabetischen Nephropathie scheint die

Autoregulation gestört; viele Faktoren spielen hierbei eine Rolle (NO, ANP,

Angiotensin II, Zytokine und weitere). Der gesteigerte Druck und die

Proteinurie wiederum lösen strukturelle Veränderungen an der Niere aus.

14

3.3.3 Beeinflussung durch das Renin-Angiotensin-System

Ursprünglich wurde das Renin-Angiotensin-System (RAS) als systemischer

Regulator des Blutdruckes begriffen. Bei der diabetischen Nephropathie

spielt jedoch vielmehr das lokale RAS eine große Rolle und hat vielfältige

Effekte [66, 77, 86]:

So fördert das lokal aktivierte RAS sowohl über den Druck im Glomerulus als

auch über eine Schädigung der ultrafiltrierenden Membran die Proteinurie.

Angiotensin II selbst wirkt profibrotisch und proinflammatorisch.

Die Blockierung des Renin-Angiotensin-Systems über ACE-Hemmer oder

Angiotensinrezeptor-Blocker macht man sich in der Therapie der diabeti-

schen Nephropathie zu Nutze [47].

3.3.4 Genetische Determinanten der Diabetischen Nephropathie

Es gibt deutliche Hinweise, dass der genetische Hintergrund die Entwicklung

einer diabetischen Nephropathie beeinflusst [19, 49]. So entwickelt nur

ungefähr ein Drittel der Diabetiker einen Nierenschaden, jedoch teilweise

unabhängig von der Blutzuckerkontrolle. Außerdem lassen sich familiäre und

ethnische Häufungen feststellen.

Konsequenterweise wurden einige genetische Studien publiziert, in denen

man Polymorphismen in sog. Kandidatengenen identifizieren konnte.

Zurzeit werden genomweite Studien durchgeführt, bei denen man versucht,

sogenannte Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) außerhalb der Kandi-

datengene zu lokalisieren.

3.3.5 Rolle der Zytokine

Zwischen den einzelnen Mechanismen als Mediatoren fungierend konnten

einige Zytokine identifiziert werden [26, 86]. Vascular endothelial growth

factor (VEGF) und Insulin-like growth factors (IGFs) wurden bereits intensiv

untersucht; die Ergebnisse sind jedoch nicht immer eindeutig und schlüssig.

Als wichtigstes Zytokin bei der Progression der diabetischen Nephropathie

wird der Wachstumsfaktor Transforming Growth Factor beta gesehen.

15

3.4 TGF-β als Mediator bei der Diabetischen Nephropathie

Transforming Growth Factor beta (TGF-β) gehört zu einer Gruppe von

Signalmolekülen, die an elementaren Steuerungsvorgängen im Körper

beteiligt sind und zu denen man unter anderem auch die Subfamilien TGF-α

und die bone morphogenitc proteins (BMPs) zählt [7]. TGF-β wird in nahezu

allen Gewebearten exprimiert und ist ein wichtiger Modulator von

Zellwachstum, Entzündung, Matrix-Synthese, Angiogenese und Apoptose.

Dementsprechend konnte seine Rolle bei der Kanzerogenese, bei der

Wundheilung, bei der Rheumatoiden Arthritis, in der embryonalen Entwick-

lung und bei fibrotischen Erkrankungen nachgewiesen werden [7, 62]. Zur

letzteren Gruppe zählt auch die diabetische Nephropathie, wo vor allem die

profibrotischen Effekte von TGF-β (vor allem der Isoform TGF-β1) auf die

extrazelluläre Matrix (ECM) gut untersucht sind: TGF-β stimuliert die

Synthese von Schlüsselproteinen der ECM wie Kollagen Typ I und IV,

Fibronektin und Laminin.

3.4.1 TGF-β als verbindendes Element der Pathomechanismen

Wie unter 3.3 beschrieben fungieren die Zytokine, allen voran TGF-β, als

Mediatoren bei den verschiedenen pathogenetischen Mechanismen:

1. Biochemische Prozesse: Hyperglykämie löst eine Erhöhung von AGE-

Proteinen, die Aktivierung von Protein Kinase C und einen Anstieg der

intrazellulären Glucosaminproduktion aus. Diese wiederum erhöhten

die TGF-β Expression in vivo und in vitro [62].

2. Hämodynamik: Anderseits spielen Zytokine auch eine Rolle bei der

Entwicklung der Hyperfiltration und Hyperperfusion [87].

3. Renin-Angiotensin-System: Weiterhin ist Angiotensin II in der Lage,

TGF-β in verschiedenen Nierenzellen zu induzieren [85] und darüber

die Synthese von Matrixmolekülen zu stimulieren [43].

4. Genetischer Hintergrund: Polymorphismen im TGF-β-Gen zeigen eine

Assoziation mit der Nephropathie beim Typ 1 Diabetiker [19].

16

3.4.2 Aktuelle Erkenntnisse über den Zusammenhang von TGF-β und

der Diabetischen Nephropathie

Die Zusammenhänge zwischen der diabetischen Nephropathie und TGF-β

(v.a. der Isoform TGF-β1) wurden bereits in einigen Studien dargestellt [95]:

So erhöht ein Medium mit erhöhter Glukosekonzentration in nahezu allen

renalen Zelllinien die Expression und die Bioaktivität von TGF-β, in einigen

Fällen werden auch die TGF-β Rezeptoren hochreguliert. Die

Antagonisierung mit Antisense-Oligonukleotiden führt konsequenterweise zu

einer reduzierten Expression von Matrixmolekülen in vitro [32].

Die Ergebnisse konnten in experimentellen Tiermodellen bestätigt werden

[30, 36, 42, 56, 73, 88]: Die Level von TGF-β1 auf mRNA- und auf

Proteinebene sind erhöht, sowohl im glomerulären als auch im tubulären

Kompartiment. Smad, ein Downstreammokelül von TGF-β, wird ebenfalls

signifikant aktiviert. In zwei diabetischen Tiermodellen konnten Ziyadeh et al.

zeigen, dass durch die Gabe von neutralisierenden monoklonalen anti-TGF-β

Antikörpern sowohl die frühen Zeichen einer diabetischen Nephropathie wie

die renale Hypertrophie als auch späte Merkmale wie die mesangiale Matrix-

akkumulation und der Serumkreatininanstieg verhindert oder abgemildert

werden konnten [74, 94]. Transgene Mäuse mit erhöhtem TGF-β1-Plasma-

Leveln entwickeln im Gegensatz dazu eine progressive renale Erkrankung,

die einer diabetischen Nephropathie sehr ähnlich ist ( dazu gehören unter

anderem eine mesangiale Matrixexpansion, verdickte Kapillarschlingen,

interstitielle Fibrose und eine tubuläre Atrophie) [44].

Auch Studien mit Patienten mit diabetischer Nephropathie untermauern die

Bedeutung von TGF-β [62]: So fand man in entnommenem Nierengewebe

ein erhöhtes Level von TGF-β auf Protein- und mRNA-Ebene.

3.4.3 Molekularstruktur und Signaltransduktionswege von TGF-β

Kenntnisse über den molekularen Aufbau von TGF-β helfen, seine

Funktionsweise zu verstehen [3, 7]:

Die drei Isoformen TGF-β1, TGF-β2 und TGF-β3 sind homodimerische

Polypeptide. TGF-β und das sogenannte latency assoziierte Protein (LAP)

werden zusammen als inaktives Proprotein synthetisiert (Molekulare Masse:

75 kDa), im Golgi-Apparat gespalten und extrazellulär sezerniert. Sie bleiben

17

jedoch weiter über nicht-kovalente Verbindungen assoziiert. Das LAP ist über

Disulfidbrücken mit dem latent-TGF-β-bindenden-Protein (LABP) verbunden.

Das LAB-Protein wiederum ist mit Proteinen der extrazellulären Matrix

verknüpft. Der Komplex aus TGF-β, LAP und LABP wird auch LLC (large

latent complex) genannt. Als Teil von LLC kann TGF-β nicht mit seinen

Rezeptoren interagieren und ist somit inaktiv. Verschiedene Moleküle, die

die Rezeptorbindungsstellen von TGF-β freisetzen und es damit aktivieren,

wurden bereits identifiziert: Matrix-Metalloproteinasen (MMP2 und MMP9),

Plasmin, Integrine, eine Behandlung mit leichten Säuren und TSP1 können

TGF-β aktivieren. Gemeinsam ist diesen Aktivatoren, dass sie jeweils

Indikatoren für eine Änderung bzw. Störung der extrazellulären Matrix sind.

Über diesen Schritt und weniger über seine absolute Konzentration wird

TGF-β reguliert. Verschiedenartige Variablen (unterschiedliche Aktivität,

gewebespezifische Verteilung, Verknüpfung mit der ECM und mehr) erklären

auch, dass die drei Isoformen in vitro, nicht jedoch in vivo nahezu identische

Effekte besitzen.

Abb. 3-1 Molekularstruktur von TGF-β

TGF-β ist über nicht-kovalente Bindungen mit dem latency assoziierten Protein (LAP) verbunden. Dieses steht über Disulfidbrücken in Verbindung mit dem latent-TGF-β-bindenden-Protein (LABP). Diese drei Moleküle bilden den large latent complex (LLC), welcher über Isopeptidbindungen mit der extrazellulären Matrix interagieren kann. Schema frei nach [3]

TGF-β Latency assoziiertes Protein (LAP)

Latent-TGF-β-bindendes-Protein (LABP)

Extrazelluläre Matrix

TGF-β

Latency assoziiertes Protein (LAP)

Latent-TGF-β-bindendes-Protein (LABP)

Extrazelluläre Matrix

Large Latent Complex (LLC)

18

Nach seiner Aktivierung bindet TGF-β an den drei Zelloberflächenrezeptoren

Typ I, II, und III. TGF-β bindet entweder am Typ III Rezeptor, der TGF-β dem

Typ II Rezeptor präsentiert, oder direkt an Typ II. Dieser Rezeptor rekrutiert,

bindet und transphosphoryliert den Typ I Rezeptor. Dadurch wird dessen

Proteinkinase aktiviert. Als intrazelluläre Signaltransduktoren fungieren dann

vor allem verschiedene Smad-Proteine, von denen man bis heute

mindestens zehn verschiedene kennt. Der aktivierte Typ I Rezeptor

phosporyliert Smad 2 oder 3, welche an Smad 4 binden. Der daraus resultie-

rende Komplex interagiert dann im Nukleus zellspezifisch mit Transkript-

ionsfaktoren, die die Genexpression steuern.

Zusammenfassend werden TGF-β und seine Effekte auf die Genexpression

vor allem über dessen Aktivierung reguliert. Als wichtiger Aktivator konnte ein

Thrombospondin identifiziert werden.

3.5 Aufbau und Funktion der Thrombospondine

3.5.1 Familie der Thrombospondine

Thrombospondine (TSP) sind eine kleine Familie von sezernierten

Glykoproteinen, die Wachstum, Adhäsion und Migration von Zellen

modulieren und außerdem die Angiogenese beeinflussen [10]: Die fünf

Mitglieder (TSP 1-5) werden aus funktionellen und strukturellen Gründen in

zwei Untergruppen eingeteilt: TSP1 und TSP2 sind Trimere mit drei

Untereinheiten (jeweils 180 kDA) und TSP 3-5 sind Pentamere, deren

Untereinheiten jeweils 105 kDa schwer sind. TSP1 wurde zuerst als

Thrombin-sensitives-Protein (TSP) identifiziert, welches als Antwort auf

Thrombin von den Thrombozyten sezerniert wird. TSP1 ist auch der am

besten untersuchte Vertreter aus dieser Familie.

Thrombospondine zählen zu den sog. matrizellulären Proteinen; das heißt,

sie interagieren sowohl mit der extrazellulären Matrix als auch mit Zellen an

sich. So ist TSP1 in der Lage an verschiedene Zelloberflächenrezeptoren wie

z.B. Integrinrezeptoren zu binden. Andererseits kann TSP1 auch mit

Strukturproteinen wie Kollagen, Fibronektin und Laminin interagieren und die

Aktivität von Proteasen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren beeinflussen [8].

19

3.5.2 Biologische Rolle der Thrombospondine

Obwohl TSP1 und TSP2 in vielen embryonalen Geweben exprimiert werden,

haben sie einen offenkundigeren Einfluss beim Erwachsenen.

Entsprechende Knockout-Tiere haben einen relativ milden Phänotyp, der erst

bei exogenen Einflüssen stärker zu Tage tritt [45]. Dennoch konnten mit Hilfe

dieser Tiermodelle einige Funktionen genauer beschrieben werden [37].

Diese Funktionen unterscheiden sich partiell trotz der hohen Sequenzhomo-

logie (vgl. 3.5.3) zwischen TSP1 und 2, wohl aufgrund der unterschiedlichen

zeitlichen und räumlichen Expression:

1. TSP1 und 2 sind in der Lage, die Adhäsionsfähigkeit von Zellen und

der extrazellulären Matrix zu modulieren. Einige Mechanismen wurden

bis heute als Erklärung für diese Eigenschaft beschrieben: So kann

beispielsweise TSP1 die Struktur- und Adhäsionsmoleküle Kollagen,

Laminin und Fibronektin binden. TSP2 kann über eine Regulation der

Verfügbarkeit von MMP2 die Zelladhäsion von Fibroblasten

beeinflussen [9]. Wie bereits beschrieben, kann TSP1 auch über die

Aktivierung von TGF-β die Zusammensetzung der ECM beeinflussen.

2. Obwohl TSP1 und 2 unter bestimmten Umständen proangiogenetisch

wirken, sind sie doch im Allgemeinen sehr potente Inhibitoren der

Angiogenese [37]. Die dabei involvierten Mechanismen sind zum

Beispiel eine CD36-vermittelte Apoptose von Endothelzellen oder eine

Inhibition der Migration dieser Zellen. Diese Fähigkeiten machte man

sich in einer klinischen Phase II-Studie zu Nutze, bei der man ein

Fragment von TSP1 (ABT-510) als anti-angiogenetische

Krebstherapie einsetzte [4].

3. Die generellen Eigenschaften von Thrombospondinen bei Tumoren

sind dennoch wenig verstanden und widersprüchlich: So gibt es

Tumore, bei denen die Expression von TSP1 eine bessere Prognose

bedingen, bei anderen Entitäten jedoch eine schlechtere. Auch in vitro

und in vivo Ergebnisse zeigen sowohl eine Beschleunigung als auch

eine Verlangsamung der Tumorprogression [27].

20

4. Beim Prozess der Wundheilung sind die Ergebnisse klarer: Sowohl

TSP1 als auch TSP2 werden für eine „normale“ Wiederherstellung von

Haut und Bindegewebe benötigt. Nach einer Verletzung kommt es erst

zu einem Anstieg von TSP1, das von Entzündungszellen und

Thrombozyten sezerniert wird. In den späteren Phasen kommt es zu

einem Abfall von TSP1 und einem Anstieg von TSP2 durch

Fibroblasten. Bis heute konnten MMP2, MMP9 und TGF-β1 als

wichtige Mediatoren dieser Reaktion identifiziert werden [2, 11].

Die Vielfalt an Funktionen (nur die vier wichtigsten wurden aufgeführt) beruht

teilweise auf der komplexen Struktur der Thrombospondine.

3.5.3 Molekulare Struktur der Thrombospondine 1 und 2

Thrombospondin 1 und 2 bestehen aus drei identischen Polypeptiden, die

nahe am N-Terminus über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.

Jedes Polypeptid beinhaltet 6 verschiedene Domänen [14, 27]:

• die aminoterminale Domäne

• eine Region mit Homologien zu Prokollagen

• drei Typen von sich wiederholenden Domänen:

� Typ 1 ähnelt dabei Sequenzen in Komplementfaktoren wie

Properdin und interagiert mit TGF-β

� Typ 2 hat Homologien zum Epidermal Growth Factor

� Typ 3 hat Ähnlichkeiten zu Calmodulin

• ein carboxyterminales Ende

Geringere Gemeinsamkeiten zwischen TSP1 und TSP2 bestehen am

Aminoterminus [37] und höhere am carboxyterminalen Ende.

21

Abb. 3-2 Molekularstruktur von TSP1 und TSP2

Die Grafik zeigt schematisch den Aufbau von TSP1 und TSP2 mit den drei identischen Untereinheiten. Diese sind aus einem aminoterminalen Ende, einer Prokollagen ähnlichen Domäne, den Typ 1-3 Bereichen und dem carboxyterminalen Ende aufgebaut. Jeder Ab-schnitt kann mit verschiedenen Rezeptoren und Molekülen interagieren. Der Abschnitt, der mit TGF-β interagiert, liegt im Typ 1 Bereich. Die Sequenzhomologie zwischen TSP1 und TSP2 nimmt vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende zu. Schema frei nach [27]

3.5.4 Interaktion der Thrombospondine 1 und 2 mit TGF-β

Die molekularen Mechanismen der Interaktion mit TGF-β konnten bereits

teilweise aufgeklärt werden. Wie unter Punkt 3.4.3 bereits erläutert wird TGF-

β als inaktives Zytokin in Verbindung mit dem latency assoziierten Protein

(LAP) (zusammen als small latent complex bezeichnet) sezerniert. Das

latent-TGF-β-bindende-Protein verknüpft das LAP mit der extrazellulären

Matrix. Der gesamte Komplex wird als large latent complex bezeichnet.

TSP1 ist in der Lage, sowohl den small latent complex als auch den large

latent complex von TGF-β zu binden und zu aktivieren [20, 71]. Es wurden

bisher zwei Sequenzen identifiziert, die für eine effiziente Aktivierung

notwendig sind [72]. Eines ist das WxxW Motiv vom Typ 1 Abschnitt im TSP1

Molekül. TSP1 bindet über dieses Motiv an das LAP und TGF-β selbst [92]

und wird dadurch in die korrekte Orientierung und Positionierung zu TGF-β

gebracht. Das zweite wichtige Motiv (K)RFK kann dann mit einer anderen

Bindungsstelle von TGF-β interagieren: Dies führt zu einer Konformationsän-

derung wahrscheinlich innerhalb des LAP. Weiterhin im Gesamtkomplex

inkorporiert kann TGF-β nun an seine Rezeptoren binden [40].

Sequenzhomologie

AminoterminalesEnde

Prokollagen homologe Domäne

Typ 1 Bereich

Typ 2 Bereich

Typ 3 Bereich

CarboxyterminalesEnde

22

TSP2 besitzt zwar das WxxW Motiv, aber nicht die (K)RFK Sequenz. Daher

bindet TSP2 an den TGF-β-Komplexen, ohne sie zu aktivieren. TSP2 ist

dadurch in der Lage die Aktivierung durch TSP1 zu verhindern, wie Schultz-

Cherry et al in vitro zeigen konnten [72].

Abb. 3-3 Interaktion von TSP1 und 2 mit TGF-β

TSP1 (oben in blau) bindet über das WxxW Motiv an die VLAL Sequenz sowohl von TGF-β als auch vom latency assoziierten Protein (LAP). Dadurch wird die (K)RFK Sequenz von TSP1 richtig positioniert und orientiert. Über eine Bindung zum LSKL Motiv von TGF-β kommt es zur Aktivierung von TGF-β. Diese beruht wahrscheinlich auf einer Konformationsänderung innerhalb des LAP, wodurch TGF-β nun an seine Rezeptoren binden kann. TSP2 besitzt ebenso das WxxW Motiv und kann daher ebenfalls an TGF-β binden. Wegen des fehlendes (K)RFK Motivs kommt es jedoch zu keiner Aktivierung. TSP1 kann infolgedessen nicht mehr binden: TSP2 verhindert damit die Aktivierung von TGF-β durch TSP1. Schema frei nach [41] und [55]

TSP1

(K)RFK

WxxWVLAL

VLALLSKL

TSP2

WxxW

VLAL

LSKL

TGF-β

VLAL

Latency assoziiertesProtein

23

3.6 Zielsetzung der Arbeit

Viele Studien zeigen einen großen Nutzen in der Blockierung von TGF-β bei

fibrotischen Nierenerkankungen in Tiermodellen. Aufgrund der potentiellen

vielfältigen Nebenwirkungen entfällt diese Möglichkeit bei der Therapie am

Patienten. So zeigen TGF-β Knockout-Mäuse eine generalisierte

übersteigerte Immunantwort und sterben nach wenigen Wochen. Daher

bietet die lokale und spezifische Blockierung der TGF-ß Aktivierung eine

bessere Möglichkeit. In dieser Arbeit wird versucht, mittels systemischer

Überexpression von TSP2 die Thrombospondin 1 vermittelte TGF-ß-

Aktivierung zu blockieren und damit die Ausprägung einer experimentellen

diabetischen Nephropathie zu reduzieren. Zum anderen soll gezeigt werden,

dass mit Hilfe einer systemischen TSP1 Überexpression die diabetische

Nephropathie aggraviert werden kann.

24

4 Material und Methoden

4.1 Tierversuch

4.1.1 Versuchstiere

Für die Versuche wurden Mäuse aus dem Stamm C57/Bl6 verwendet. Die

Tiere wurden von Charles-River (Sulzfeld, Deutschland) bezogen oder

stammten aus eigener Zucht. Im Tierhaltungsraum wurde ein 12-stündiger

Wechsel von Tag und Nacht simuliert. Die Tiere wurden in Typ IV

Makrolonkäfigen gehalten und erhielten Standardfutter (Altromin 1324,

Spezialfutterwerke GmbH, Lage) und Trinkwasser ad libitum.

4.1.2 Experimentelles Design

Dieser Versuch wurde von der Nationalen Tieraufsichtsbehörde (Regierung

von Mittelfranken: 621-2531.31-17/05) genehmigt. Es wurden 55 männliche

Mäuse im Alter von 20 Wochen mit einem Gewicht zwischen 20 g und 30 g

verwendet. 39 Tiere waren den experimentellen Teilgruppen zugeordnet und

durchliefen den kompletten Versuchszeitraum von 18 Wochen. Als gesunde

Kontrollgruppe dienten 8 Tiere aus dem gleichen Stamm und mit vergleich-

barem Gewicht und Alter.

Den 39 Tieren aus der experimentellen Behandlungsgruppen wurde jeweils

die rechte Niere entfernt. Durch diese unilaterale Nephrektomie sollen die

durch die diabetische Stoffwechsellage verursachten Schäden an der

verbleibenden Niere potenziert werden [48].

Nach zwei Wochen Regenerationszeit wurde mit Hilfe einer intraperitonealen

Gabe von Streptozotocin (STZ) ein Diabetes Mellitus Typ 1 induziert. STZ

schädigt selektiv die Beta-Zellen im Pankreas und führt dadurch zu einem

Insulinmangel. Es erfolgten mehrere gewichtsadaptierte Applikationen an

verschiedenen Tagen über einen Zeitraum von drei Wochen mit 100 mg/kg

Körpergewicht (KG), 80 mg/kg KG oder 50 mg/kg (KG). Der Blutzuckerspie-

gel wurde mindestens jeden zweiten Tag gemessen. Über einen Zielwert von

mindestens 300 mg/dl Glukose im Blut wurde die Frequenz der STZ-

Applikation angepasst. Somit betrug die minimale Menge an STZ 300 mg/kg

KG an drei Tagen und die maximale Dosis 480 mg/kg KG an sechs Tagen.

25

Drei Wochen nach der ersten Injektion wurde mit der Insulintherapie

begonnen. Wir verwendeten ein langwirksames Insulin Glargin (Lantus® von

Sanofi-Aventis). Bis zum Ende des Experimentes erhielt jedes Tier jeden

zweiten Tag zwei Einheiten Insulin Glargin. Dadurch konnten wir die Tiere

vor einer diabetischen Ketoazidose schützen.

Nach einer weiteren Woche wurden die diabetischen Tiere randomisiert in

drei Gruppen eingeteilt und mit drei verschiedenen Plasmiden behandelt. Die

Plasmide dienten als Vektoren und führten zu einer systemischen und

dauerhaften Überexpression des jeweiligen Proteins. 10 µg der folgenden

Plasmide wurden jeweils in 15 µl PBS gelöst:

• pUBlux: Das Plasmid enthält einen Poly-Ubiquitin C Promoter und die

Sequenz für eine Firefly-Luciferase, in deren Anwesenheit Luciferin

mit Sauerstoff zu energiereichen Produkten reagiert. Bei deren Zerfall

kommt es zur Biolumineszenz. Dieses Plasmid wurde als

Kontrollplasmid verwendet.

• TSP1: Die multiple cloning site aus dem Plasmid pcDNA 3.1 His/C

wurde mit pUBlux ligiert und das Luciferasegen deletiert. Die Sequenz

von humanem TSP1 wurde mit Hilfe von Restriktionsenzymen (Kpnl

und Xbal) eingefügt. Nach der Deletion der schwachen

Startsequenzen wurde die starke Startsequenz ACCATGG mittels

Mutagenese-PCR eingefügt.

• TSP2: Bei der Herstellung des TSP2 Plasmides wurde ähnlich

verfahren: Statt einer TSP1 Sequenz wurde jedoch eine murine TSP2

Sequenz verwendet.

Zur Injektion der jeweiligen Lösungen wurden die Tiere sediert und der

rechte und linke Oberschenkel durch zwei einfache Hautschnitte freigelegt.

Es wurden in jedem Muskel an drei verschiedenen Injektionsstellen jeweils

10 µg Plasmid, die in 15 µl PBS gelöst waren, appliziert. Danach wurden die

Oberschenkelmuskel mit 6 Stromstößen mit einer Spannung von 50 V, einer

Dauer von 50 ms und einem Intervall von 950 ms elektroporiert. Die

Elektroporation (EPO) diente der Permeabilitätssteigerung der Muskelzellen,

um die Aufnahme der Vektoren in die Zellen (= Transfektion) zu erleichtern.

Die Tiere wurden weitere 10 Wochen beobachtet: Die Insulintherapie wurde

fortgeführt; es erfolgte mindestens einmal in der Woche eine Gewichts- und

26

Blutzuckerkontrolle. Am Ende des Experimentes wurden die Tiere unter

Narkose getötet und mehrere Proben und Gewebebiopsien entnommen.

Während des Versuchszeitraumes starben fünf Tiere, wahrscheinlich auf-

grund der diabetischen Stoffwechsellage. Ein durchschnittlicher Blutzucker-

wert von mindestens 300 mg/dl über 12-13 Wochen wurde als

Einschlusskriterium festgelegt. Sieben Tiere erfüllten dieses Kriterium nicht

und wurden aus der weiteren Wertung ausgeschlossen.

TSP1 Überexpression

n=9

pUBlux Überexpression

n=9

TSP2 Überexpression

n=9

Gesunde Kontrollgruppe

n=8

Abb. 4-1 Schema über Gruppenverteilung und Studiendesign

Am Tag Null wurden die Tiere unilateral nephrektomiert. Zwischen den Wochen 3 und 5 erfolgte die Induktion eines Diabetes Mellitus Typ 1 durch Applikationen von Streptozotocin. Nach einer einwöchigen Phase der Rekonvaleszenz begannen wir mit der Insulintherapie zur Prävention einer Ketoazidose. In der 9. Woche wurden die Tiere mit Plasmiden, die jeweils TSP1, TSP2 oder pUBlux enthielten, transfiziert. Nach insgesamt 18 Wochen und 14 Wochen unter Hyperglykämie wurden die Tiere getötet.

Unilaterale Nephrektomie

0

Applikationen von STZ

Transfektionvon TSP1 & 2und pUBlux

Töten der Tiere

Zeitachsein Wochen

3 6 9 18

Beginn der Insulintherapie

27

4.1.3 Vorgehensweise bei der Nephrektomie

Für die unilaterale Nephrektomie wurden die Tiere mit Isofluran (2 % bis 3 %

in Sauerstoff) narkotisiert. Danach wurde die rechte Flanke rasiert und

desinfiziert. Der retroperitoneale Raum wurde nach einem circa 1 cm großen

Schnitt in der Haut und der darunterliegenden Faszie dargestellt. Das

umliegende Fettgewebe wurde entfernt und die Niere dadurch freipräpariert.

Am Nierenhilus wurden die Nierenarterie und die Nierenvene mit Hilfe eines

Baumwollfadens und eines dreifachen chirurgischen Knotens abgebunden.

Anschließend wurde die rechte Niere unter minimalem Blutverlust entfernt.

Die Faszie wurde daraufhin mit einer fortlaufenden Naht und die Cutis mit

zwei bis drei Einzelknopfnähten verschlossen. Um eine Auskühlung zu

vermeiden, befanden die Tiere sich während der Operation auf einem Wär-

metisch und nach der Operation unter einer Wärmelampe.

4.1.4 Töten der Tiere

Unter Isoflurannarkose (siehe 4.1.3) wurde das Abdomen nach einem Längs-

und zwei Querbauchschnitten eröffnet. Die Präparation des retroperitonealen

Raumes diente zur Darstellung der Bauchaorta, der Vena cava inferior und

der verbliebenen Niere. Mit Hilfe einer Kanüle wurde aus der Vena cava

inferior jeweils circa 1 ml Blut entnommen. Nach einer Thorakotomie wurde

der linke Ventrikel punktiert und der Körperkreislauf mit 0,9 % NaCl-Lösung

gespült. Diese Maßnahme erhöhte die Qualität der später angefertigten

Gewebepräparate der Niere, indem die renalen Gefäße weitgehend frei von

Erythrozyten waren. Die noch verbliebene Niere wurde entnommen,

umliegendes Fett und die Kapsel wurden entfernt. Weiterhin wurde jedem

Tier ein Oberschenkelmuskel entnommen, um die lokale Plasmid-Expression

überprüfen zu können. Die Tiere starben nach Eröffnung der Bauchaorta.

4.2 Gewinnung & Analyse des Probenmaterials

4.2.1 Glukosespiegel im Blut

Um an Probenmaterial zu gelangen, wurde der Schwanz der Mäuse mit

einem Skalpell leicht verletzt und das austretende venöse Blut in einem

Blutglukosemessgerät analysiert. Die Messung erfolgte während der

28

Streptozotocinapplikationen jeden zweiten Tag, danach mindestens einmal

pro Woche.

4.2.2 24 Stunden Sammelurin

Die Tiere wurden einzeln für 24 Stunden in metabolische Käfige gesetzt. Die

gesammelte Urinmenge wurde daraufhin notiert und ein Teil des Urins bis

zur weiteren Analyse bei einer Temperatur von -20°C gelagert. Insgesamt

wurden dadurch an vier verschiedenen Zeitpunkten des Experimentes

Urinproben gewonnen (in den Wochen 1, 10, 14, 18). Im Urin bestimmten

wir die Albumin- und Kreatininkonzentrationen.

4.2.3 Gewichtskontrolle

Die Tiere wurden zu Beginn des Experimentes mehrmals pro Woche und im

Verlauf mindestens einmal pro Woche gewogen, um krankheitsbedingte

Gewichtsabnahmen rechtzeitig feststellen zu können.

4.2.4 Serumgewinnung

Serumproben wurden an zwei verschiedenen Zeitpunkten gewonnen. 4 Wo-

chen vor Versuchsende entnahmen wir den Tieren mit Hilfe einer Glaskapil-

lare retrobulbäres Blut.

Das Probenmaterial am Ende des Versuches stammte aus der Vena Cava

inferior. Anschließend wurden die zellulären Bestandteile für 10 Minuten bei

8000 rpm in einer Tischzentrifuge (Biofuge fresco, Heraeus) sedimentiert und

das sich im Überstand befindliche Serum abpippetiert. Wir lagerten die

Proben bis zur weiteren Analyse bei -20°C.

4.2.5 Bestimmung von Serumharnstoff und Serum- und Urinkreatinin

Kreatinin im Serum bzw. im Urin und Harnstoff im Serum wurden mit einem

automatischen Analysegerät (Beckmann Instruments GmbH, München) im

Klinischen Labor der Kinderklinik Erlangen gemessen.

29

4.2.6 Berechnung der Kreatinin-Clearance

Mit Hilfe folgender Formel erfolgte die Berechnung der Kreatinin-Clearance in

der Einheit µl pro Minute:

1440

24

×

×=

Serumim][Kreatinin

h/Urinmenge] im Urin[KreatininClearance

4.2.7 Bestimmung der Proteinmenge im Urin

Die Proteinkonzentration im Urin wurde nach dem Prinzip von Bradford

bestimmt. Hierbei entsteht durch Komplexierung von Coomassie Brilliant

Blau mit den Seitenketten von Proteinen ein Farbumschlag, der

photometrisch detektiert werden kann.

Die Quantifizierung erfolgte mittels des BioRad Protein Kits (BioRad,

München). Als Standard diente BSA in Konzentrationen von 10 µg/ml bis 500

µg/ml. Es wurden jeweils 10 µl vom Standard und den Proben als Duplikate

in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Sarstedt, Nümbrecht) pipettiert.

Die Proben wurden entweder unverdünnt oder in Verdünnungen bis 1:5

angesetzt, um Ergebnisse im linearen Messbereich der Standardkurve zu

erhalten. Nach dem Hinzufügen von jeweils 200 µl BioRad Reagenz wurde

die Absorption bei 595 nm an einem Mikrotiterplatten-Photometer (Tecan,

Crailsheim) gemessen.

30

4.2.8 Konservierung des Versuchstiergewebes

Nach Entnahme der verbliebenen Niere wurden Fett und Kapsel entfernt und

die Niere anschließend gewogen. Daraufhin wurde sie in mehrere Teile

geschnitten und unterschiedlich konserviert: (siehe auch 4.3)

Tabelle 1 Konservierung des Nierengewebes

Fixierung Anwendung Zusammensetzung/Hersteller

Tissue Tek Gefrierschnitte Sakura Finetek, Zoekterwomde, NL

MC Immunhistochemie Siehe 4.3.1

PAF Immunhistochemie Siehe 4.3.1

Zink Immunhistochemie Siehe 4.3.1

1% SDS Zymogramme 1 g SDS in 100 ml aqua dest.

Soerensen Puffer Semidünnschnitte 8,54 g Natriumhydrogenphosphat

1,985 h Kaliumhydrogenphosphat

3 % Glutaraldiaaldehyd

In 1 L aqua dest.

RLT Realtime-PCR Aus RNeasy MiniKit mit β-Mercaptoethanol

Ein Oberschenkelpräparat aus der TSP2 Gruppe wurde jeweils in PAF-

Lösung fixiert und weiterprozessiert, aus der TSP1 und pUBlux Gruppe

jeweils in MC-Lösung.

31

4.3 Aufbereitung der Gewebe für die Immunhistochemie

4.3.1 Prozessieren des Gewebes

Nach Entnahme der Niere wurde das Gewebe für die Dauer von mindestens

24h in Zinklösung, Paraformaldehyd oder Methyl Carnoy fixiert.

Zinklösung:

� 0,5 g Calciumacetat

� 5 g Zinkacetat

� 5 g Zinkchlorid

� in 1000 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,4

Paraformaldehyd (PAF)

3 g Paraformaldehyd wurden in 100 ml PBS bei 60°C im Wasserbad gelöst und danach bei

4°C im Dunkeln gelagert.

Methyl Carnoy (MC)

� 60 % Methanol

� 30 % Chloroform

� 10 % Eisessig

Die Lösung wurde bei 4°C gelagert.

Das Gewebe wurde hierauf wie in der folgenden Tabelle dargestellt weiter

prozessiert.

32

Tabelle 2 Prozessierschema für MC- und PAF-fixiertes Gewebe

Tag Konzentration in % Fixierung für MC-Gewebe

Fixierung für PAF-Gewebe

Dauer & Temperatur

1 MC PAF 24 h RT

2 70 Methanol Isopropanol mind. 40 min RT

80 Methanol Isopropanol 40 min RT



100 Isopropanol 40 min RT

100 Isopropanol 40 min RT

100 Isopropanol ü.N. bei RT

3 100 Isopropanol 1 h 60°C

Isopropanol-Paraffin (1:1) 1 h 60°C

Paraffin 2 h 60°C

Paraffin 2 h 60°C

Paraffin 2 h 60°C

Tabelle 3 Prozessierschema für Zink-fixiertes Gewebe

Tag Konzentration in % Fixierung für Zink-Gewebe Dauer & Temperatur

1 Zink ü.N. 4°C

2 70 Ethanol mind. 1 h RT

90 Ethanol 1 h RT

95 Ethanol 1 h RT

100 Ethanol 1 h RT

100 Ethanol 1 h RT

100 Xylol 50 min RT

100 Xylol 50 min RT

Paraffin 2 h 60°C

3 Paraffin 2 h 60°C

Paraffin 2 h 60°C

33

4.3.2 Anfertigen von Schnitten aus Gefriergewebe

Das Gewebe lagerte konserviert bei -70°C in Tissue Tek. Zur Anfertigung der

Schnitte wurden die Biopsien im Gefriermikrotom auf -20°C erwärmt. Die 5

µm dicken Schnitte wurden auf speziell für Gefriergewebe geeignete Super

Frost Objektträger gezogen und danach für 10 Minuten in -20°C kaltem

Aceton fixiert. In Alufolie verpackt wurden die Schnitte bis zum weiteren

Gebrauch in einem -70°C kalten Tiefkühlschrank gelagert.

4.3.3 Anfertigen von Schnitten aus Paraffinblöcken

Die bei Raumtemperatur gelagerten Gewebeblöcke wurden vor dem

Schneiden auf eine Kühlplatte mit -10°C überführt. Nach Erreichen der

gewünschten Temperatur wurden die Blöcke in das Mikrotom eingespannt.

Die 2 µm dicken Schnitte wurden dann auf der Oberfläche eines auf 45°C

erwärmten Wasserbad geglättet und danach die Objektträger aufgezogen.

Zur Entfernung des Paraffins und zur besseren Haftung wurden die Schnitte

in einem Ofen bei 60°C mindestens 20 min gebacken. Die fertigen Schnitte

wurden wiederum bei Raumtemperatur gelagert.

4.4 (Immun)histochemische Färbungen

Der Großteil der Schnitte wurde immunhistochemisch angefärbt. Das zu

untersuchende Protein fungiert als Antigen und geht mit dem hinzugefügten

Antikörper eine Bindung ein. Das Protein kann dann mit einem Chromogen

sichtbar gemacht werden.

4.4.1 Periodsäure-Schiff-Färbung (PAS)

Die PAS-Färbung beruht auf einer chemischen Reaktion. Es können dadurch

kohlenhydratreiche Strukturen wie Bestandteile der EZM angefärbt werden.

Periodsäure führt zu einer Oxidation von Glykolgruppen zu Aldehydgruppen.

Diese können danach durch das Schiffsche Reagenz sichtbar gemacht

werden. Das Schiffsche Reagenz ist eine farblose fuchsinschweflige Säure.

Bei der Reaktion wird Fuchsin wieder frei und bewirkt die typische rötliche

34

Färbung. Es wurde MC-fixiertes Gewebe verwendet und die Präparate zur

besseren Beurteilbarkeit mit Hämatoxylin gegengefärbt.

Tabelle 4 PAS-Färbung

Deparaffinieren 100 % Xylol 3 x 5 min

Rehydrieren 100 % Ethanol 3 x 3 min

95 % Ethanol 2 x 2 min

Aldehydgruppenbildung 2 % Periodsäure 15 min

Waschen Aqua dest. 2 x 3 min

Schiffsches Reagenz Schiffsches Reagenz 25 min

Waschen Aqua dest. 2 x 3 min

Gegenfärben Hämatoxylin 20 sec

Bläuen Laufendes Leitungswasser 5 min

Dehydrieren 70 % Ethanol 2 min



100 % Xylol 3 x 5 min

4.4.2 Immunfluoreszenzfärbung an Gefrierschnitten

Bei der Immunfluoreszenzfärbung wird der primäre Antikörper mit einem

fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper sichtbar gemacht.

Nach dem Auftauen der bei -70°C gelagerten Schnitte wurden diese in

Aceton überführt und dann luftgetrocknet. Die Präparate auf dem

Objektträger wurden mit einem wasserabweisenden Stift umkreist. Um

unspezifische Bindungen zu vermeiden, wurde jede Biopsie mit 50 µl von

einem 100% fetalem Kälberserum (FCS) inkubiert. Nach einem

Waschvorgang wurde der gewünschte primäre Antikörper (Anti CD4 in einer

Verdünnung von 1:200, Anti CD8 in einer Verdünnung von 1:400 in 1 % BSA

in TBS) über Nacht auf den Schnitten belassen. Am darauffolgenden Tag

wurden die Schnitte mit einem Sekundärantikörper in einer Verdünnung von

1:400 inkubiert. Eine Gegenfärbung der Kerne erfolgte mit 4′,6-Diamidin-2-

phenylindol (DAPI). Nach dem Eindecken mit Mowiol (Merck, Darmstadt)

wurden die Präparate möglichst kühl und im Dunklen gelagert, um die

Fluoreszenzintensität zu erhalten.

35

Tabelle 5 Immunfluoreszenzfärbung bei Gefrierschnitten

Auftauen der Schnitte 2-3 min bei RT

Fixierung Aceton 10 min bei 4°C

Trocknen 10 min bei RT

Waschen TBS 3 x 2 min

Blockieren 100 % FCS 30 min

Primärantikörper In TBS/BSA verdünnt ü.N. bei 4°C


Sekundärantikörper 1:400 verdünnt in TBS/BSA 2 h bei RT


Gegenfärben DAPI 10 sec


4.4.3 Immunfluoreszenzfärbung an Paraffinschnitten

Auch bei der Immunfluoreszenzfärbung an Paraffinschnitten wird der primäre

Antikörper mit einem sekundären Antikörper sichtbar gemacht. Wir setzten

einen Anti-CD31 Antikörper in einer Verdünnung von 1:50 ein.

Tabelle 6 Immunfluoreszenzfärbung an Paraffinschnitten





Primärantikörper In TBS/BSA verdünnt ü.N. bei 4°C


Sekundärantikörper 1:250 verdünnt in TBS/BSA 2 h bei RT


Gegenfärben DAPI 10 sec


36

4.4.4 Immunperoxidasefärbung

Bei dieser Färbemethode wird ein biotinylierter Sekundärantikörper

eingesetzt, der von einer mit Avidin komplexierten Meerrettichperoxidase

detektiert werden kann. Nach Zugabe von Wasserstoffperoxid bewirken die

freiwerdenden Protonen durch ein Chromogen einen Farbumschlag. In

unserem Fall diente 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) als Farbstoff.

Sämtliche Immunperoxidasefärbungen der Niere wurden an Zink-fixiertem

Gewebe angefertigt.

Tabelle 7 Immunperoxidasefärbung




Blocken der endogenen

Peroxidase

10 % H2O2 in Methanol 20 min


Primärantikörper Verdünnt in 1 % BSA/TBS ü. N. bei 4°C


Sekundärantikörper 1:500 in 1 % BSA/TBS 30 min


Avidin-D Peroxidase 1:2000 in 1 % BSA/TBS


Chromogen DAB 10 min

Waschen Aqua dest. 5 min

Gegenfärbung Hämatoxylin 20 sec

Bläuen Laufendes Leitungswasser 3 x 2 min

Dehydrierung 70 % Ethanol 2 min



100 % Xylol 3 x 5 min

Eindecken Entellan

37

Bei ausgewählten Färbungen wurden die Präparate vor der Inkubation mit

dem Primärantikörper chemisch vorbehandelt, um die Antigenpräsentation zu

verstärken.

Tabelle 8 Verdünnung der Primärantikörper und Vorbehandlungen

Primärantikörper Verdünnung Vorbehandlung

CD3 1:100 Keine

F 4/80 1:25 10 mM Citronensäure pH 6 für 2 min bei 1000 Watt in

der Mikrowelle

Fibronektin 1:500 Keine

Kollagen I 1:30 0,1 % Pronase für 10 sec

1 % BSA/TBS für 30 mins

Kollagen IV 1:200 Keine

P-Smad 2/3 1:400 Keine

Wilms Tumor 1 1:250 Target Retrieval Solution für 2,5 min bei 1000 Watt in

der Mikrowelle

4.4.5 Primärantikörper

� Kollagen I, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen Kollagen I in der

Ratte mit Kreuzreaktivität gegen Maus Kollagen I (AbD Serotec,

Düsseldorf)

� Kollagen IV, ein polyklonaler Ziegen-Ak gegen humanes Kollagen IV

mit Kreuzreaktivität gegen Maus Kollagen IV (Southern Biotechnology

Associates, Birmingham, UK)

� Fibronektin, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen Maus Fibronektin

(Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA)

� CD3, ein monoklonaler Kaninchen-Ak gegen das humane CD3

Antigen mit Kreuzreaktivität gegen Maus CD3 (Thermo Scientific,

Fremont, CA, USA)

� Phospho-Smad 2/3, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen die

phosphorylierte Form von humanem Smad 2/3 mit Kreuzreaktivität

gegen Maus P-Smad2/3 (sc-11769; Santa Cruz Biotechnology, Santa

Cruz, CA, USA)

38

� F 4/80, ein monoklonaler Ratten-Ak gegen ein auf Makrophagen

exprimiertes murines Glykoprotein (Caltag Laboratories, Burlingame,

CA, USA)

� CD8a, ein monoklonaler Ratten-Ak gegen CD8+ T-Lymphozyten in der

Maus (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)

� CD4, ein monoklonaler Ratten-Ak gegen CD4+ T-Lymphozyten in der

Maus (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA)

� CD31, ein monoklonaler Ratten-Ak gegen das Oberflächenprotein

CD31 (PECAM-1) auf Maus-Endothelzellen (Cell Signalin, Boston,

MA, USA)

� Wilms Tumor 1, ein polyklonaler Ratten-Ak gegen Podozyten in der

Maus (Thermo Scientific, Fremont, CA, USA)

4.4.6 Sekundärantikörper und deren Substrate

� Biotinylierter Anti-Rabbit IgG Antikörper (Vector, Burlingame, USA)

� Biotinylierter Anti-Maus IgG Antikörper (Vector, Burlingame, CA, USA)

� Biotinylierter Anti-Ziegen IgG Antikörper (Vector, Burlingame, USA)

� Horseradish Peroxidase Avidin D (Vector, Burlingame, CA, USA)

� ImPACT DAB Kit (Vector, Burlingame, CA, USA)

� Alexa Fluor 488 Anti-Ratten Antikörper (Invitrogen, Eugene, USA)

� Cy 3-konjugierter Anti-Ratten Antikörper (Jackson Immuno Research,

Newmarket, UK)

39

4.4.7 Mikroskopische Auswertung

Die Quantifizierung der histologischen Färbungen erfolgte verblindet, d.h.

ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit des Präparates.

� Zur Evaluierung des glomerulären Schadens wurden 30 Querschnitte

pro Präparat bei 400-facher Vergrößerung auf PAS-Positivität

beurteilt. Dabei wurde ein von 0 bis 4 reichender Score für die

mesangiale Expansion angewandt: 0 = normal, 1 < 25 %, 2 < 50 %,

3 < 75 % und 4 > 75 %.

� Die Expression von Fibronektin wurde an 30 glomerulären

Querschnitten bei 400-facher Vergrößerung pro Biopsie bewertet.

Zum Einsatz kam der obengenannte semiquantitative Score.

� Die Einwanderung von Makrophagen wurde mit der F 4/80 Färbung

bestimmt. Es wurden positive Zellen bei 600-facher Vergrößerung in

25 Gesichtsfeldern im Cortex gezählt.

� Für die kortikale T-Lymphozyten Dichte wurden CD3+Zellen in 25

Gesichtsfeldern bei 600-facher Vergrößerung gezählt.

� Die Einwanderung von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten wurde in den

jeweiligen Färbungen bestimmt. Dazu wurden 20 Gesichtsfelder über

dem Cortex bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt.

� Die tubulointerstitielle Deposition von Kollagen I wurde über 25

Gesichtsfelder bei 400-facher Vergrößerung anhand eines

semiquantitativen Scores ermittelt: unter 10 % des Gesichtsfeldes: 0

Punkte, unter 25 % 1 Punkt, 25 – 50 % 2 Punkte, 50 – 75 % 3 Punkte

und über 75 % 4 Punkte.

� Die Aktivierung von TGF-β wurde indirekt über den Anteil von

Phospho-Smad 2/3 positiven Zellkernen in 20 Glomeruli bei 600-

facher Vergrößerung analysiert.

� Die Anzahl an Podozyten wurde über WT 1 positive Zellkerne als

relativer Anteil an allen Zellkernen in 20 Glomeruli in 1000-facher

Vergrößerung gezählt.

40

� Die glomeruläre Deposition von Kollagen IV wurde an 20

Querschnitten pro Biopsie bei 600-facher Vergrößerung mit einem

semiquantitativen Score bewertet: unter 10 % Ausdehnung pro

Glomerulus: 0 Punkte, unter 25 % 1 Punkt, 25 – 50 % 2 Punkte, 50 –

75 % 3 Punkte und über 75 % 4 Punkte.

� Zur Evaluierung der Gefäßdichte wurde ein intraokulares Gitter mit 10

x 10 Quadraten verwendet. Jede Kammer, die keine CD31- Positivität

als Endothelzellmarker zeigte, wurde als negativ gewertet. Bei der

verwendeten Vergrößerung von 400 hatte ein Quadrat eine Größe von

0,0625 mm. Pro Biopsie wurden nach diesem Schema 13 mal 10 x 10

Quadrate ausgewertet.

4.5 Zymogramme

Bei Zymogrammen handelt es sich um eine Variante der SDS-Polyacrylamid-

Gelektrophorese, bei der man enzymatische Aktivitäten sichtbar machen

kann. In unserem Fall wurden Acrylamidgele mit Gelatine (hydrolisiertes

Kollagen) copolymerisiert, um die Aktivität von kollagendegradierenden

Proteasen zu demonstrieren.

4.5.1 Proteinextraktion

Das Nierengewebe für die Zymogramme wurde bei -70°C in einer 1-

prozentigen SDS-Lösung gelagert. Die Biopsien wurden langsam aufgetaut

und für das folgende Prozedere möglichst kühl gehalten. Die Proben wurden

mit einem Ultra-Turrax-Gerät (IKA, Staufen) mechanisch zerkleinert und

homogenisiert. Zum weiteren Aufschluss der Zellen wurde das Gewebe

zusätzlich einer Behandlung mit einem Ultraschallgerät (Bandelin, Berlin)

unterzogen. Dabei wurden sieben Zyklen mit einer maximalen Spannung

von 70 V und einer Amplitudeneinstellung von 50 % appliziert.

Nach dem Zentrifugieren mit 13000 rpm für 2 min wurden die Überstände

überführt.

41

4.5.2 Proteinbestimmung detergenzhaltiger Proben

Die Konzentrationsbestimmung in dem Protein-SDS-Gemisch erfolgte mittels

des BioRAD Dc Protein Assays. Die Proben wurden 1:5 oder 1:15 in PBS

verdünnt und jeweils 10 µl in Duplikaten in eine Mikrotiterplatte mit 96

Vertiefungen pipettiert. Als Standard diente BSA in Konzentrationen von

10µg/ml bis 500 µg/ml. Den Proben wurde 225 µl des BioRad Reagenzgemi-

sches hinzugefügt. Die Auslesung erfolgte an einem Mikrotiter-Photometer

bei einer Wellenlänge von 690 nm.

4.5.3 Anfertigen der nativen Polyacrylamid-Gele

Vier Gele mit einer Dicke von 0,75 mm wurden in einem Gelgießstand nach

folgendem Muster gegossen:

Tabelle 9 Zusammensetzung der Sammel- und Trenngele

Trenngel 8 % Sammelgel 5 %

Acrylamid 30 % 10,6 ml 2,64 ml

H2O Mit 0,2 % Gelatine: 13,3 ml 9,36 ml

Upper/Lower Tris Lower Tris: 8,0 ml Upper Tris: 4,0 ml

Temed 24 µl 24 µl

APS 200 µl 200 µl

Vor dem Auftragen des Sammelgels wurde das Trenngel 15 min getrocknet.

Pro Gel waren Taschen für jeweils 10 Proben vorhanden.

4.5.4 Beladen und Lauf der Gele

In jede Tasche wurden 30 µg Protein in einem Laufpuffer verdünnt pipettiert.

Die Menge des Laufpuffers orientierte sich am Volumen des Proteingemi-

sches und betrug mindestens 25 %.

Die Proteine wurden für 90 min bei 4°C und einer Spannung von 120 V

elektrophoretisch getrennt.

42

4.5.5 Inkubation der Gele

Um das SDS aus dem Gel und den aufgetrennten Proben zu entfernen,

wurden die Gele zunächst mit 2,5 % Triton X in 100 mM Tris-Lösung (pH 7,5)

für 2 mal 60 min behandelt. Im Folgenden wurden die Proben für 3 mal 20

Minuten mit einer Aktivationslösung auf einem Schüttler bei Raumtemperatur

gewaschen. Dieser Schritt diente zum Auswaschen von Triton X und zur

Aktivierung der Kollagenasen. Die Gele wurden anschließend bei 37°C für

36h in einem Brutschrank mit der Aktivationslösung inkubiert. Das Anfärben

der Kollagenstrukturen erfolgte mit einer 0,1 prozentigen Coomassielösung

für 2 bis 3 Stunden auf einem Schüttler. Um unspezifisches Anfärben zu

minimieren, wurden die Gele danach mit einer Entfärbungslösung für 5 bis 25

Minuten behandelt. Zur besseren Handhabung wurden die Gele in einen

Rahmen gespannt und zwischen zwei transparenten Folien getrocknet.

4.5.6 Blockieren der Matrixmetalloproteinasen

Um die Spezifität der Methode zu überprüfen, blockierten wir indirekt die

Aktivität der Metalloproteinasen durch Zugabe von Ethylendiamintetraacetat

(EDTA). Der Waschlösung wurde EDTA hinzugefügt und der Aktivationslö-

sung wurde EDTA im Austausch gegen die Elektrolyte beigegeben.

4.5.7 Auswertung

Nach dem Trocknen wurden die Gele mit einem handelsüblichen Scanner

(Hewlett Packard, Böblingen) in der Durchlichtmethode eingelesen.

Die weitere Auswertung erfolgte digital mit ImageJ (Open Source). Es

befanden sich aus jeder Gruppe jeweils zwei Proben auf vier verschiedenen

Gelen. Die Aktivität von MMP2 erschien als helle Bande, deren Intensität

gemessen wurde und von dem jeweils der Grauwert des Geles als

Hintergrundrauschen abgezogen wurde. Anschließend wurden die Werte

gegen die Kontrollgruppe normalisiert.

43

4.5.8 Lösungen

Laufpuffer Glycerin 50 %

Bromphenolblau 0,2 %

Waschlösung pH 7,5 Triton X 2,5 %

Aktivationslösung Tris 100 mM, pH 7,5

CaCl2 10 mM

NaCl 150 mM

ZnSO4 2 µM

Färbelösung Methanol 40 %

Essigsäure 10 %

Aqua dest. 50 %

Coomassie 0,1 %

Entfärbelösung Essigsäure 10 %

Methanol 40 %

Aqua dest. 50 %

Upper Tris pH 6,8 Aqua dest. 500 ml

Tris 30,3 g

SDS 20 % 10 ml

Lower Tris pH 8,8 Aqua dest. 1 l

Tris 181,7 g

SDS 20 % 20 ml

APS Ammoniumpersulfat 10 %

44

4.6 Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Mittels eines Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) können

Proteine in verschiedenen Proben wie Urin oder Serum nachgewiesen und

quantifiziert werden. Dabei bindet ein enzymmarkierter Antikörper an das

gewünschte Antigen und nach Zugabe eines Substrates kommt es dann zu

einer messbaren Farbreaktion.

4.6.1 Messung der Albuminurie

Um die Nierenschädigung abzuschätzen, bestimmten wir die Konzentration

von Albumin im Urin (Albuminurie). Wir benutzten ein Maus Albumin Elisa

Quantifizierungs-Kit von Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA) und

beschichtete Mikrotiterplatten ELISA Nunc Maxisorp (Thermo Scientific,

Dänemark) mit 96 Vertiefungen. Der mitgelieferte Albumin-Ak wurde in dem

Coating Puffer nach Herstellerangaben verdünnt und die Mikrotiterplatte

damit ü.N. bei 4°C behandelt. Der mitgelieferte Standard wurde in der

Probenlösung in einer absteigenden Reihe verdünnt (500 ng/ml bis

7,81 ng/ml); die Proben je nach Vorkonzentration zwischen 1:500 bis 1:2000.

Proben und Standard wurden in Duplikaten auf die Mikrotiterplatte

aufgetragen und bei RT für 60 Minuten inkubiert. Für weitere 60 Minuten

wurde die Mikrotiterplatte mit einem Meerrettichperoxidase-Antikörper des

Kits behandelt. Zwischen den einzelnen Schritten erfolgten automatisierte 3-

fache Waschvorgänge mit der Waschlösung. Als Substrat dienten je 100 µl

ABTS Farbreagenz (1 ABTS Tablette in 50 ml ABTS-Puffer, Roche Applied

Science, Mannheim). Der Farbumschlag wurde nach 30 Minuten in einem

Mikrotiterplatte-Photometer bei 405 nm bestimmt.

45

4.6.2 Pufferlösungen

Coating Puffer 0,05 M Natriumcarbonat pH 9,6

Waschlösung � 50 mM Tris

� 0,14 M NaCl

� 0,05 % Tween 20 bei pH 8,0

Blockierungslösung � 50 mM Tris

� 0,14 NaCl

� 1% BSA bei pH 8,0

Probenlösung � 50 mM Tris

� 0,14 M NaCl

� 1 % BSA

� 0,05 % Tween 20 bei pH 8,0

4.7 Real-Time PCR

Die Real-Time PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die

auf dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht. Zusätzlich zur

konventionellen PCR bietet die Real-Time PCR die Möglichkeit der

Quantifizierung der eingesetzten Nukleinsäuren durch Messung eines

Fluoreszenzsignals nach jedem PCR-Zyklus.

4.7.1 RNA-Isolierung

Sämtliche Schritte erfolgten mit RNAse-freien Pipettenspitzen, Reaktionsge-

fäßen und RNAse-freiem Wasser.

Das für die Real-Time PCR bestimmte Nierengewebe wurde bei -70°C in

RLT-Puffer gelagert. Dem Puffer wurde β-Mercaptoethanol zugesetzt, um

mögliche RNAsen zu inaktivieren und so die Qualität der Proben zu erhöhen.

Die eigentliche Isolierung der RNA erfolgte nach Auftauen der Proben mittels

des RNeasy Mini Kits (Quiagen, Hilden) den Herstellerangaben folgend. Die

jeweilige Konzentration wurde photometrisch (BioPhotometer, Eppendorf,

Hamburg) bei 260 nm bestimmt.

46

4.7.2 Herstellung der cDNA

Das Umschreiben von RNA in cDNA erfolgte mittels des VERSO cDNA Kits

(Abgene, UK) gemäß der Herstellerangaben. Als Vorlage diente RNA in einer

Konzentration von 15 ng/µl.

4.7.3 Real-Time PCR

Als Fluoreszenzsignal nutzten wir SYBR-Green. Die Signalintensität nimmt

dabei mit jedem Vervielfältigungsschritt zu und korreliert mit der ursprüngli-

chen RNA-Menge. Wir setzten 3 µl Probe und 17 µl Reaktionsgemisch ein.

Die Endkonzentrationen für Vorwärts- und Rückwärtsprimer betrugen jeweils

100 nM. Die Signalstärke wurde in der exponentiellen Phase der PCR

bestimmt und dann mit der delta-delta-CT Methode ausgewertet. Die

Ergebnisse wurden gegen die universell exprimierte 18S-RNA normalisiert.

Folgende Primer wurden eingesetzt:

18S

Forward: 5‘ TTGATTAAGTCCCTGCCCTTTGT 3‘

Reverse: 5‘ CGATCCGAGGGCCTCACTA 3‘

TGF-β1

Forward: 5‘ TGACGTCACTGGAGTTGTACGG 3‘

Reverse: 5‘ GGTTCATGTCATGGATGGTGC 3‘

47

4.8 Statistische Auswertung

Zur statistischen Auswertung nutzten wir GraphPad Prism 5.00 für Windows

(GraphPad Software, San Diego, CA). Die Evaluierung der Blutzuckerkurve

erfolgte mit einer 2-seitigen ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-

Test. Für die statistische Auswertung der Überlebenskurve verwendeten wir

den Mantel-Cox Log-rank Test. Bei dem restlichen Großteil der Ergebnisse

wurden die Daten in einem ersten Schritt mittels des Kolmogorov-Smirnov-

Tests auf Normalverteilung überprüft. Es wurde daraufhin eine ANOVA-

Analyse mit Tukey’s Multiple Comparision Test durchgeführt. Alle Werte

werden als Mittelwerte ± SEM angegeben und das ermittelte

Signifikanzniveau wird folgendermaßen angegeben:

Tabelle 10 Signifikanzniveau

P Wert Signifikanzniveau Symbol

< 0,001 Hoch signifikant ***

0,001 bis 0,01 Sehr signifikant **

0,01 bis 0,05 signifikant *

> 0,05 Nicht signifikant Kein Symbol

4.9 Material

4.9.1 Chemikalien

beta-Mercaptoethanol Sigma, Taufkirchen

ABTS Roche, Mannheim

Aceton Chem solute, Renningen

Acrylamid AppliChem, Darmstadt

Ammoniumpersulfat AppliChem, Darmstadt

BSA (Rinderserumalbumin) Merck, Darmstadt

BioRad Protein Kit BioRad, München

BioRAD Dc Protein Assay BioRad, München

Bromphenolblau Merck, Darmstadt

48

Calciumacetat Merck, Darmstadt

Calciumchlorid Merck, Darmstadt

Chloroform Geyer GmbH, Renningen

Coomassie Merck, Darmstadt

DAB Vector Laboratories

Entellan Merck, Darmstadt

EDTA Merck, Darmstadt

Ethanol Merck, Darmstadt

Essigsäure Roth, Karlsruhe

Forene (Isofluran) Abbott, Wiesbaden

Fötales Kälberserum PAA, Pasching

Gelatine Serva, Heidelberg

Glycerin Merck, Darmstadt

Hämatoxylin III nach Gill Merck, Darmstadt

Isopropanol Merck, Darmstadt

Methanol Merck, Darmstadt

Mowiol Merck, Darmstadt

Natriumcarbonat Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumchlorid Merck, Darmstadt

Ortho-phenylendiamin Merck, Darmstadt

Paraffin Merck, Darmstadt

Paraformaldehyd Merck, Damrstadt

PBS Dulbecco Biochrom AG, Berlin

Periodsäure VWR, Darmstadt

Pronase Qiagen, Düsseldorf

RNeasy Mini Kit Qiagen, Düsseldorf

Salzsäure 25% Merck, Darmstadt

SDS Roth, Karlsruhe

Schiff-Reagenz Merck, Darmstadt

Schwefelsäure Merck, Darmstadt

SYBR Green Invitrogen, Darmstadt

Target Retrieval Solution Dako, Glostrup, DK

Temed AppliChem, Darmstadt

Tris Merck, Damstadt

Triton X 100 BioRad, München

49

Tween 20 Merck, Darmstadt

Verso cDNA Kit Abgene, UK

Wasserstoffperoxid 30 % Chem solute, Renningen

Xylol Merck, Darmstadt

Zinkacetat Merck, Darmstadt

Zinkchlorid Sigma, Taufkirchen

Zinksulfat Merck, Darmstadt

4.9.2 Medikamente & Plasmide

Streptozotocin SIGMA, St. Louis, Miss., USA

Insulin Glargin (Lantus®) als Opti Set Pen

Sanofi-Aventis, Paris, Frankfreich

Thrombospondin 1, pUBTSP1 humanes TSP1 Plasmid, das in einen

langexprimierenden Vektor mit Ubiquitin

Promoter umkloniert wurde

Thrombospondin 2, pUBTSP2 murines TSP2 Plasmid, das in einen

langexprimierenden Vektor mit Ubiquitin


Luciferase, pUBlux Firefly Luciferase, die in ein lang-

exprimierendes Plasmid mit Ubiquitin


4.9.3 Geräte

Blutzuckermessgerät

Ascensia Elite und Sensoren Elite Sensor

Bayer, Leverkusen

Deionosierungsanlage

Seralpur pro90C

Veolia Water Systems GmbH, Wien

Elektroporator

Electro Square Porator ECM 830

BTX, Holliston, USA

Laufstation

Mini Trans-Blot Cell 37S

Bio-Rad, München

Magnetrührer

Heidolph MR3001

Heildorf, Schwabach

Mikroskope

50

Nikon eclipse 80i

Zeiss OPMI 1-FC

Nikon, Düsseldorf

Carl Zeiss, Jena

Mikroskopkamera Visitron Systems GmbH, Purchheim

Mikrotiterplatten-Photometer: Sunrise Tecan, Crailsheim

Mikrotiterplaten-Washer

Tecan M12/4R

Tecan, Crailsheim

Mikroliter- und Mehrkanalpipetten Eppendorf, Hamburg

Narkoseanlage

ZUA-82-GME Gasmisch-Einheit

Föhr Medical Instruments GmbH, Seeheim-

Ober Berrbach

Operationsbesteck Fine Science Tools, Heidelberg

OP-Tisch für Kleintiere Hans Sachs Elektronik, March-Hugstetten

Paraffinausblockeinheit

Leica EG1120

Leica, Bensheim

Real-Time-PCR ABI Prism 7000 SDS Applied Biosystems, USA

pH-Meter CG812 Schott Geräte, Mainz

Photometer BioPhotometer Hamburg, Eppendorf

Rotationsmikrotom

Microm HM335E

Mikrom GmbH, Walldorf

Stechnadeln für Insulinpen: Micro Fine BD Medical, Heidelberg

Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg

Vortexer Heidolph REAX top Heidolph, Schwabach

Ultraschallgerät: Sonopuls HD 70 Bandelin, Berlin

UItra-Turrax: T10 basic IKA, Staufen

Waagen

Feinwaage U4100S

Tierwaage FTC3K01

Sartorius Universal, Göttingen

Kern & Sohn, Balingen, Frommern

Wasserbad Gesellschaft für Labortechnik, Burgwendel

Zentrifugen

Biofuge fresco, Heraeus

5810R

Thermo Scientific, Dänemark

Eppendorf, Hamburg

51

4.9.4 Verbrauchsmaterial

Deckgläser 24 x 50 mm Menzel Gläser, Braunschweig

Einwegskalpelle No. 21 und 11 PFM, Köln

Glaskapillare zur Blutentnahme Terumo Corporation, Tokyo, Japan

Injektionskanülen Gr.16, 18 und 20 B. Braun, Melsungen

Liquid Blocker SCI Science Services, München

Mikrotiterplatte

für Proteinurie

ELISA Nunc Maxisorp F96

Sarstedt, Nümbrecht

Thermo Scientific, Dänemark

Mikrotommesser Leica, Bensheim

Objektträger R. Langenbrinck, Emmendingen

Parafilm M Pechiney, USA

Pipettenspitzen

10 µl

200 µl und 1000 µl

Biozym Scientific GmbH, Hess, Oldendorf

Sarstedt, Nümbrecht

Polypropylenröhrchen 15 und 20 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen

Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml Eppendorf, Hamburg

Super Frost Objektträger R. Langenbrinck, Emmendingen

Spritzen B. Braun, Melsungen

Tissue Tek Sakura Finetek, Zoekterwomde, NL

4.9.5 Lösungen

TBS pH 7,6 6,055 g Tris

8,52 g NaCl

Eingestellt mit HCL und mit Aqua dest. auf 1 Liter aufgefüllt

TBS/BSA TBS mit 1 % BSA

52

5 Ergebnisse

5.1 Die Gentherapie hat keinen Einfluss auf die Blutzuckerwerte

Die Grundlage unseres Diabetesmodells war die toxische Wirkung von

Streptozotocin auf die β-Zellen des Pankreas, die zu einem absoluten Insu-

linmangel führte. Der Blutzuckerspiegel wurde daher aus zwei Gründen

gemessen: Zur Evaluierung der erforderlichen Dosis von STZ für eine

erfolgreiche Diabetesinduktion und zur Beurteilung des Blutzuckerverlaufs.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 180

200

400

600 pUBLux

TSP1 TSP2

Wochen

Blu

tzu

cker

spie

gel

[m

g/d

l]

Abb. 5-1 Verlauf des Blutzuckerspiegels

Der Glukosespiegel wurde während der STZ-Applikationen jeden zweiten Tag, danach jede Woche bestimmt. Als Probenmaterial diente venöses Blut aus dem Schwanz der Tiere. Die Grafik zeigt den Verlauf des Blutzuckerspiegels in mg/dl über den gesamten Versuchszeitraum, beginnend am Punkt 0 mit der unilateralen Nephrektomie und endend in der 18. Woche mit dem Töten der Tiere. Die Überexpression mit TSP1 und 2 beeinflusste die Blutzuckerwerte nicht.

Der Mittelwert der gesunden Tiere der Kontrollgruppe lag einmalig gemessen

bei 143 mg/dl ± 8,7 mg/dl. Von der dritten bis zur fünften Woche erfolgten die

STZ-Applikationen. Der Anstieg der Blutzuckerwerte erfolgte mit einer Ver-

zögerung von circa 1,5 Wochen bis zu maximalen Werten zwischen 416

mg/dl und 483 mg/dl in den Wochen 5 bis 8. Ab der siebten Woche wurden

die Tieren an jedem zweiten Tag mit zwei Einheiten Insulin Glargin

behandelt. Dies führte zu keinen signifikanten Änderungen des Blutzuckers.

Wir konnten jedoch mit der Insulintherapie größtenteils diabetische

Ketoazidosen vermeiden und folglich den Versuchstierverlust durch Stoff-

wechselentgleisungen verringern. Während der Beobachtungszeit kam es zu

53

einem Absinken der Blutzuckerwerte bis minimal 307 mg/dl in der 14.

Woche. Als Einschlusskriterium für diese Diabetesstudie mussten die

diabetischen Versuchstiere über den gesamten Versuchszeitraum nach

Streptozotocingabe Blutzuckerwerte über 300 mg/dl aufweisen: Tiere, deren

Werte sich unterhalb dieser Marke befanden, wurden aus den folgenden

Auswertungen ausgenommen. Schwankungen wie in der 14. Woche lassen

sich teilweise durch unterschiedliche Messzeitpunkte erklären. Die Kontrollen

erfolgten entweder morgens oder abends; die unterschiedliche Stoffwechsel-

und Hormonlage im Tagesprofil wird dadurch deutlich.

Die systemische Überexpression der Thrombospondine hatte auf die

Blutzuckerwerte keinen Einfluss. Ebenso wurde die Überlebensrate der Tiere

durch die Überexpression mit unterschiedlichen Plasmiden nicht beeinflusst:

0 2 4 6 8 10 12 14 16 180

25

50

75

100

pUBlux

TSP1

TSP2

Zeit in Wochen

Üb

erle

ben

[%

]

Abb. 5-2 Überlebenszeitanalyse der Versuchsgruppen

Eine Überlebenszeitanalyse wurde mit dem Mantel-Cox Log-rank Test angefertigt. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0,9978).

5.2 Die Gentherapie hat keinen Einfluss auf das Nierengewicht

Sowohl beim Tier als auch beim Menschen ist Diabetes Mellitus mit einem

frühen Anstieg des Nierengewichts assoziiert. Diese Zunahme beruht auf

einer Zellhypertrophie und einer verstärkten extrazellulären Matrixakkumula-

tion sowohl im Glomerulus als auch im Tubulointerstitium [67]. Daher wurde

das Nierengewicht am Ende des Experimentes gemessen.

54

Kontrolle pUBlux TSP1 TSP20.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5 ***

Nie

ren

ge

wic

ht

/ T

ierg

ew

ich

t [m

g/g

]

Abb. 5-3 Nierengewicht in Relation zum Tiergewicht

Die Nieren wurden am Ende des Experimentes gewogen und die gemessenen Werte in Relation gesetzt zum aktuellen Tiergewicht.

Bei allen diabetischen Tieren fanden wir eine Erhöhung des Nierengewichts

ungefähr um den Faktor 1,5. Zwischen den einzelnen Therapiegruppen

zeigten sich jedoch keine Unterschiede.

5.3 Thrombospondin 1 erhöht und Thrombospondin 2 reduziert

das Level von aktivem TGF-β

Ein wichtiger Mediator bei der Entwicklung der diabetischen Nephropathie ist

TGF-β. So führt z.B. dessen Aktivierung zu einer verstärkten Fibrose.

Thrombospondine können verschiedenartig mit TGF-β interagieren.

Thrombospondin 1 ist in der Lage, TGF-β zu aktivieren. Thrombospondin 2

blockiert Bindungsstellen so, dass TGF-β nicht mehr durch TSP1 aktiviert

werden kann. Um das Aktivitätsniveau von TGF-β zu beurteilen, untersuch-

ten wir eines seiner Signaltransduktionsmoleküle: Smad 2/3 liegt nach

Aktivierung von TGF-β vermehrt in phosporylierter Form vor. Daher

ermittelten wir den prozentualen Anteil von phosphoryliertem Smad 2/3

(P-Smad) pro Glomerulus mittels einer immunhistochemischen Färbung.

Weiter von Interesse war der Gesamtgehalt von TGF-β: Mit Hilfe einer Real-

Time PCR bestimmten wir die Expression von TGF-β1 und TGF-β2 (nicht

dargestellt) im kortikalen Anteil der Niere. Die eingesetzten Primer

unterscheiden nicht zwischen aktiver und passiver Form von TGF-β.

55


10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

*****

*

Glo

me

rulä

re p

osi

tive

Ze

lle

n [

in %

]

Abb. 5-4 Aktivitätsniveau von TGF-β

P-Smad 2/3 – ein Signaltransduktionsmolekül von TGF-β – wurde immunhistochemisch dargestellt und der relative Anteil von P-Smad positiven Zellen über 20 Glomeruli bestimmt. Deren Verteilung in den verschiedenen Gruppen zeigt Bild A. In Bild B ist beispielhaft ein Glomerulus mit mehreren positiv gefärbten Zellkernen (braun) bei einer 200fachen Vergrößerung gezeigt. TSP1 erhöhte den Anteil an P-Smad positiven Zellen, im Gegensatz dazu führte TSP2 zu einer Reduktion.


1.0

2.0

3.0

*

X-f

ach

e E

xp

ress

ion

Abb. 5-5 Expression von TGF-β1

Mittels einer Real-Time PCR ermittelten wir den kortikalen mRNA-Gehalt von TGF-β1, der gegen 18s RNA normalisiert wurde. Die unterschiedlichen Expressionen werden in dem Diagramm in Relation zur Kontrollgruppe dargestellt. TSP2 führte zu einer Erhöhung des TGF-β Gesamtgehaltes.

In der diabetischen pUBLux-Gruppe zeigt sich im Vergleich zur gesunden

Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg von P-Smad 2/3 in den Glomeruli um

circa 10 % (p < 0,01). Innerhalb der diabetischen Tiere hatten die mit einer

Überexpression von TSP1 behandelten Tieren den höchsten Anteil an P-

Smad 2/3, im Vergleich zur pUBLux Gruppe konnten wir einen signifikanten

Anstieg um über 10 % nachweisen (p < 0,001). Bei den mit einer

Überexpression von TSP2 behandelten Tieren lag der Anteil mit 32 % nur

leicht oberhalb der gesunden Kontrollgruppe und signifikant unter der

diabetischen pUBLux-Gruppe (p < 0,05).

B A

Auf RNA-Ebene stellte sich ein anderes Expressionsmuster dar: Der kortikale

Gehalt von TGF-β war in der TSP1

Gruppe erhöht.

Zusammenfassend führte die TSP1

TGF-β; TSP2 verhindert

5.4 Modulation der Fibrose durch TSP1 und TSP2

Das prominenteste pathologische Merkmal der diabetischen Nephropathie ist

die Fibrosierung und Sklerosierung der Niere. Diese manifestieren sich

sowohl im Tubulointerstitium als auch in den Glomeruli.

Abb. 5-6 Histologische Veränderungen der diabetischen Nephropathie

Der Semidünnschnitt einer Niere aus der pUBluxhistopathologische Veränderungen der diabetigesunden Niere (Bild A):Basalmembran (GBM) und zuMesangium.

Einer der wichtigsten Mediatoren bei der Ent

Um den Einfluss auf dieses Zytokin und damit auf die Nierenfibrose durch

TSP1 und TSP2 zu beurteilen

küle. Über das Gesamtausmaß der Sklerose in den Glomeruli gab die PAS

Färbung Auskunft, in der kohlenhydratreiche Strukturen sichtbar wurden.

Drei spezifische Matrixproteine wurden mittels immunhistochemischer

Färbungen bewertet: Kollagen IV

im mesangialen interstitiellen Raum. Das zuletzt genan

untersuchten wir auf das Vorhandensein von

interstitiellen Fibrose nutzten wir eine Färbung gegen Kollagen I.

56

stellte sich ein anderes Expressionsmuster dar: Der kortikale

β war in der TSP1 Gruppe erniedrigt und in der TSP2

Zusammenfassend führte die TSP1 Überexpression zu einer Aktivierung von

β; TSP2 verhinderte eben diese.

Modulation der Fibrose durch TSP1 und TSP2



sowohl im Tubulointerstitium als auch in den Glomeruli.

Histologische Veränderungen der diabetischen Nephropathie

Der Semidünnschnitt einer Niere aus der pUBlux-Gruppe (Bild B) verdeutlicht einige histopathologische Veränderungen der diabetischen Nephropathie im Vergleich zu einer gesunden Niere (Bild A): In diesen kommt es zur Verdickung der glomeruBasalmembran (GBM) und zu einer Akkumulation von extrazellulären Matrixproteinen im

Einer der wichtigsten Mediatoren bei der Entwicklung der Fibrose ist TGF


TSP1 und TSP2 zu beurteilen, untersuchten wir verschiedene Matrixmole

küle. Über das Gesamtausmaß der Sklerose in den Glomeruli gab die PAS

kunft, in der kohlenhydratreiche Strukturen sichtbar wurden.


Färbungen bewertet: Kollagen IV befindet sich sowohl in der GBM

ialen interstitiellen Raum. Das zuletzt genannte Kompart

untersuchten wir auf das Vorhandensein von Fibronektin. Zur Evaluation der


A

stellte sich ein anderes Expressionsmuster dar: Der kortikale

uppe erniedrigt und in der TSP2

Überexpression zu einer Aktivierung von

Modulation der Fibrose durch TSP1 und TSP2



Histologische Veränderungen der diabetischen Nephropathie

Gruppe (Bild B) verdeutlicht einige schen Nephropathie im Vergleich zu einer

In diesen kommt es zur Verdickung der glomerulären einer Akkumulation von extrazellulären Matrixproteinen im

wicklung der Fibrose ist TGF-β.


untersuchten wir verschiedene Matrixmole-

küle. Über das Gesamtausmaß der Sklerose in den Glomeruli gab die PAS-

kunft, in der kohlenhydratreiche Strukturen sichtbar wurden.


befindet sich sowohl in der GBM als auch

nte Kompartiment

Fibronektin. Zur Evaluation der


B

57


0.5

1.0

1.5

2.0

**

Glo

me

rulo

skle

rose

[S

co

re 0

-4]

Abb. 5-7 Glomerulosklerose

Die PAS-Positivität von 30 Glomeruli wurde mittels eines semiquantitativen Scores beurteilt (Bild A). PAS-Positivität stellt sich als rosa Färbung dar und deutet auf vermehrte Sklerosierung hin: Diese nahm bei den diabetischen Tieren (beispielhaft Bild B) im Vergleich zu der gesunden Kontrollgruppe (beispielhaft Bild C) zu.


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

***

Ko

lla

ge

n I

[S

co

re 0

-4]

Abb. 5-8 Akkumulation von Kollagen I im Tubulointerstitium

Ein semiquantitativer Score über 25 Gesichtsfelder pro Biopsie diente zur immunhistochemischen Darstellung von Kollagen I und zur Evaluation seiner Deposition im tubulointerstitiellen Raum. Bild B zeigt einen Ausschnitt aus einer diabetischen Niere (pUBlux-Gruppe). Die Kollagenablagerung – visualisiert durch eine Braunfärbung – war im Vergleich zu einer Niere aus der gesunden Kontrollgruppe erhöht.

A

B C

A B

58


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5 *** ***

Ko

lla

ge

n I

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-4]


0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

***

Fib

ron

ek

tin

[S

core

0-4

]

Abb. 5-9 Akkumulation der Matrixmoleküle Kollagen IV und Fibronektin

Die entsprechenden Proteine wurden immunhistochemisch dargestellt. Über glomerulären Querschnitten wurde mittels eines semiquantitativen Scores die Deposition der Matrixmoleküle Kollagen IV (Bild A) und Fibronektin (Bild B) beurteilt. Die Therapie beeinflusste die Fibronektinakkumulation nicht, jedoch führte die TSP2 Überexpression zu einer signifikanten Verminderung der Kollagen IV Deposition. Bild D (TSP2) im Vergleich zu Bild C (pUBlux) verdeutlicht dies: Eine geringere Braunfärbung im Glomerulus spricht für eine geringere Kollagen IV Akkumulation.

Insgesamt waren alle vier untersuchten Fibrosemarker bei der diabetischen

pUBlux-Gruppe im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe signifikant erhöht

(mindestens p < 0,01), wenn auch nur auf relativ niedrigem absoluten

Niveau. Bezüglich der Glomerulosklerose, der Fibronektinakkumulation und

der Deposition von Kollagen I waren keine Unterschiede innerhalb der thera-

pierten Gruppen festzustellen. Jedoch führte die TSP2 Überexpression zu

einer signifikanten Reduktion von Kollagen IV im Glomerulus (p < 0,001).

C D

A B

59

5.5 Diabetische Tiere zeigen eine erhöhte MMP2 Aktivität

Die Fibrose im Kontext der diabetischen Nephropathie ist nur zu einem Teil

durch die vermehrte Produktion von Matrixproteinen bedingt. Zusätzlich

beeinflussen degradierende Proteinasen die Bindegewebsakkumulation. Zu

dieser Gruppe gehören die Matrix Metalloproteinasen (MMP), deren wich-

tigster Vertreter MMP2 ist. TSP2 wurde bereits als Regulator von MMP2

identifiziert. Daher untersuchten wir die Aktivität dieses Enzyms mit Hilfe von

Zymogrammen. Die hierzu verwendeten Gele enthielten Gelatine, welche

durch MMP2 verdaut wurde.


1.0

2.0

3.0

4.0

5.0 *

Re

lati

ve

Akti

vit

ät

Abb. 5-10 Aktivität der Metalloproteinase 2

Es wurden Zymogramme angefertigt, die die Aktivität von Kollagenasen als helle Banden anzeigen. Auf vier Gelen wurden jeweils zwei Tiere aus jeder Gruppe aufgetragen (ein Gelausschnitt ist links in der Abbildung B zu sehen). Die aktive Form von MMP2 hat ein Molekulargewicht von circa 65 kDa und seine Funktionalität konnte erfolgreich mit EDTA blockiert werden (Bild B rechts). Die gemessenen Lichtintesitäten der Banden wurden gegen den Gelhintergrund normalisiert und gegen die Kontrollgruppe standardisiert (Bild A). Alle diabetischen Gruppen zeigten eine erhöhte Aktivität von MMP2.

Alle diabetischen Tiere zeigten eine Erhöhung der MMP2 Aktivität im

Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe. So stellten wir eine signifikante

Zunahme der pUBlux-Gruppe auf das 3,5-fache Niveau fest. Die TSP1

Überexpression führte zu einer Reduktion der Aktivität, ohne das

Signifikanzniveau zu erreichen.

72 kDa

55 kDa

} } } }

pUBlux KontrolleTSP2TSP1}

pUBlux

Ohne Kollagenasenblock durch EDTA Mit EDTA

A

B

60

5.6 TSP2 schützt Podozyten vor einer Schädigung

Bei der diabetischen Nephropathie kommt es bereits in frühen Stadien zu

einer Schädigung und einem Verlust von Podozyten. Um die Auswirkung der

Überexpression von TSP1 und TSP2 auf diesen Zelltypus beurteilen zu

können, setzten wir in einer immunhistochemischen Färbung einen

Antikörper gegen das Wilms-Tumor-1-Protein (WT1) ein. WT1 spielt eine

wichtige Rolle bei der embryonalen Entwicklung, befindet sich jedoch auch

in der adulten Niere noch in den Kernen von Podozyten.


5.0

10.0

15.0 *** **

Glo

me

rulä

re W

T1-p

osi

tive

Ze

lle

n [

in %

]

Abb. 5-11 Podozytendichte im Glomerulus

Die Zellkerne der Podozyten wurden immunhistochemisch mittels einer WT1-Färbung dargestellt. Die braungefärbten Podozyten (Bild B) wurden pro Glomerulus gezählt und in Relation zur Gesamtzahl der Zellkerne gesetzt. In der diabetischen pUBlux-Gruppe waren die Podozyten signifikant reduziert. Dagegen führte die TSP2 Überexpression zu einem geringeren Podozytenverlust.

Bei allen drei STZ-behandelten Gruppen führte die diabetische

Stoffwechsellage zu einer signifikanten Reduktion der Podozytenanzahl pro

Glomerulus. Die Unterschiede bewegten sich jedoch auf insgesamt niedri-

gem Niveau, in der gesunden Kontrollgruppe lag der Anteil der WT1-

positiven Zellen bei 13,4 %, in der kranken pUBLux-Gruppe bei 9,3 %. Durch

die TSP2 Überexpression wurde bei den entsprechenden Tieren der

Podozytenverlust signifikant reduziert (p < 0,01).

A B

61

5.7 TSP2 hemmt die Infiltration von Entzündungszellen

Einige aktuelle Studien betonen die Bedeutung der Entzündungsreaktion in

der Niere bei der Entstehung der diabetischen Nephropathie. Dabei spielen

verschiedene Typen von Entzündungszellen wie Maphrophagen und T-

Lymphozyten eine Rolle. Daher quantifizierten wir die Einwanderung von

Immunzellen mittels verschiedener immunhistochemischer Färbungen gegen

vier verschiedene Antigene: CD3+ Zellen entsprechen den T-Lymphozyten,

der Oberflächenmarker F 4/80 ist auf Makrophagen lokalisiert und die

Rezeptoren CD4 und CD8 befinden sich auf zwei verschiedenen Unterpo-

pulationen von T-Zellen.


20.0

40.0

60.0 *** *

F4/8

0 p

osi

tive

Ze

lle

n p

ro G

esi

ch

tsfe

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5.0

10.0

15.0

20.0

25.0 *** *

CD

3 p

osi

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e Z

ell

en

pro

Ge

sic

hts

feld

Abb. 5-12 Infiltration von Makrophagen und T-Zellen

Wir inkubierten die Präparate mit Antikörpern gegen F 4/80 als Makrophagenmarker (Bild A) und gegen CD3 als T-Zellmarker (Bild B). Anschließend wurden die positiv gefärbten Zellen über 25 Gesichtsfelder im Kortexbereich bei 600-facher Vergrößerung gezählt. Die TSP2 Überexpression reduzierte signifikant die Anzahl der infiltrierenden Zellen, sowohl der Makrophagen als auch der T-Zellen. Bild C zeigt beispielhaft die Makrophageninfiltration, Bild D die T-Lymphozyteninfiltration.

C D

A B

62


5.0

10.0

15.0

20.0

25.0 ****

CD

4+

Ze

lle

n p

ro G

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ch

tsfe

ld


5.0

10.0

15.0

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25.0

30.0

*****

CD

8+

Ze

lle

n p

ro G

esi

ch

tsfe

ld

Abb. 5-13 Differenzierung der T-Zellen in CD4+ und CD8+ Zellen

Zur genaueren Differenzierung der T-Zellen in CD4+ (Bild A) und CD8+ Zellen (Bild B) detektierten wir diese Zelltypen in einer Immunfluoreszenz und zählten positiv gefärbte Zellen über 20 Gesichtsfelder bei 400-facher Vergrößerung im Cortexbereich der Biopsien. Wir konnten eine signifikante Reduzierung durch TSP2 Überexpression der Infiltration sowohl von CD4+ Zellen, als auch von CD8+ Zellen feststellen. Bild C zeigt beispielhaft einen Ausschnitt einer Niere der pUBlux Gruppe.

Diabetes Mellitus führte bei allen drei STZ-behandelten Gruppen zu einer

signifikanten Steigerung der Infiltration der untersuchten Entzündungszellen.

Die Zellen befanden sich vor allem außerhalb der Glomeruli. Durch die TSP2

Überexpression wurde die Infiltration von CD3+ T-Zellen um 20 % und der

Influx von F 4/80 positiven Makrophagen um 45 % signifikant reduziert (bei

beiden p < 0,05). Der Effekt bei den T-Zellen wirkte sich nahezu in gleichem

Maße auf die Populationen der CD4+ und CD8+ Zellen aus (jeweils p < 0,05).

A B

C

63

5.8 Diabetes Mellitus Typ 1 führt zu einem renalen peritubulären

Kapillarverlust

Bei der diabetischen Nephropathie kommt es zu glomerulären und

peritubulären Gefäßprozessen. Diese Vorgänge können quantitativer Natur

(Gefäßdichte) oder qualitativer Natur sein, wie z.B. arteriosklerotische

Veränderungen.

Um mögliche Einflüsse der Thrombospondine auf die kapilläre Dichte zu

untersuchen, färbten wir die Biopsien mit einem Antikörper gegen den

Rezeptor CD31. Dieser Rezeptor – auch PECAM-1 (platelet endothelial cell

adhesion molecule) genannt – ist auf Endothellzellen lokalisiert. Damit war

die Identifikation von Gefäßen möglich und wir untersuchten daraufhin die

Nierenbiopsien auf die Rarefizierung von kapillären Gefäßen, das heißt den

Anteil ohne jegliche Gefäßanschnitte. Das zur Analyse benutzte Gitter hat ein

relativ grobes Raster, daher geben unterschiedliche Befunde vor allem

Unterschiede im Gefäßnetz außerhalb der Glomeruli wider. Veränderungen

innerhalb der Glomeruli konnten aufgrund der dort sehr dichten Gefäßknäuel

nicht detektiert werden.


5.0

10.0

15.0

***

Inv

ers

e k

ap

illä

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ich

te[i

n %

de

s G

esi

ch

tsfe

lde

s]

Abb. 5-14 Rarefizierung der Kapillargefäße

Die durch eine CD31-Immunfluoreszenzfärbung sichtbaren Gefäßendothelien (Bild B) wurden mittels eines intraokularen Gitters mit 10 x 10 Quadraten in einem Gesichtsfeld im Cortex ausgewertet. Jedes Feld ohne CD31-Positivität wurde gezählt. Somit ergab sich ein inverser relativer Anteil der kapillären Dichte, vor allem des Tubulointerstitiums. Die diabetischen Tiere der pUBlux-Gruppe zeigten hierbei eine signifikante Reduzierung der Gefäßdichte im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Die diabetische pUBlux Gruppe zeigte eine signifikante Reduzierung der

peritubulären Gefäßdichte – wenn auch sehr milde um 4%. Bei der TSP1

und TSP2 Gruppe war kein Unterschied zur Gruppe ohne systemische

Thrombospondin Überexpression festzustellen.

A B

64

5.9 Die Behandlung mit TSP1 und TSP2 hat keinen Einfluss auf

die Nierenfunktion

Wir konnten einige Unterschiede auf histologischer und molekularer Ebene

durch die Überexpression feststellen. Um deren Effekt auf die Nierenleistung

zu beurteilen, untersuchten wir vier Nierenfunktionsparameter, unter

anderem die Ausscheidung von Albumin über den Urin – ein frühes

Kennzeichen der diabetischen Nephropathie. Kreatinin wurde im Serum und

Urin gemessen und daraus die Kreatinin-Clearance berechnet. Daneben

bestimmten wir die Serumharnstoffkonzentration als Retentionsparameter.

Die Konzentration von Albumin in den Mäuseurinen erhielten wir mittels

eines ELISA-Kits. Zusätzlich bestimmten wir die Proteinurie.


20.0

40.0

60.0

80.0*

Se

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ha

rnst

off

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l]


100.0

200.0

300.0

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nin

-Cle

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min

]

Abb. 5-15 Nierenfunktionsparameter am Endzeitpunkt

Aus dem Serum der Tiere wurde Harnstoff (Bild A) an einem automatischen Analysegerät bestimmt. Ebenso wurde die Kreatininkonzentration im Serum und im Urin bestimmt und daraus die Kreatinin-Clearance (Bild B) berechnet. Die Überexpression mit TSP1 und TSP2 hatte keinen Einfluss auf die Nierenfunktion.


0.5

1.0

1.5

2.0

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[µµ µµ

g/2

4h

]

Abb. 5-16 Protein- und Albuminurie

Die Proteinurie (Bild A) wurde mittels eines Bradford-Kits bestimmt, die Albuminurie (Bild B) mit Hilfe eines Elisa-Kits. Die diabetischen Tiere schieden signifikant höhere Konzentrationen an Protein und Albumin aus (pUBlux Gruppe versus Kontrolle). Die Überexpression zeigte keinen Einfluss auf diese beiden Parameter.

A B

A B

65

Die diabetischen Tiere zeigten signifikant erhöhte Werte an Serumharnstoff,

Proteinurie und Albuminurie. Der durch die STZ-Injektion ausgelöste

Diabetes Mellitus hatte also einen funktionseinschränkenden Effekt auf die

Niere. Die in Gefolge der Überexpression von TSP1 und TSP2 aufgetrete-

nen Veränderungen hatten jedoch keinen Einfluss auf die Nierenleistung.

66

6 Diskussion

6.1 Aktuelle Datenlage

Die diabetische Nephropathie ist mittlerweile die häufigste Ursache für ein

chronisches Nierenversagen mit Dialysepflichtigkeit in der westlichen Welt

[65]. Aufgrund der aktuellen Therapiemöglichkeiten ist man in der Lage, die

Progression der Erkrankung zu verlangsamen, nicht aber zu stoppen oder

umzukehren [47]. Daher ist die Erforschung der Mechanismen, die zur Ent-

wicklung der diabetischen Nephropathie beitragen, besonders wichtig.

Einer der wichtigsten Mediatoren bei der diabetischen Nephropathie ist

TGF-β, das als Prozytokin-Komplex sezerniert wird und extrazellulär aktiviert

werden muss [95]. Thrombospondin 1 und 2 spielen dabei eine Rolle:

In mehreren Studien konnte in vivo und in vitro gezeigt werden, dass ein

erhöhter Glukosespiegel TSP1 hochreguliert. So führt die Glukosestimulation

von Mesangiumzellen [61], proximalen Tubuluszellen [91], distalen Tubulus-

zellen [89], Endothelzellen, glatten Gefäßmuskelzellen und Fibroblasten [78]

zu einer Erhöhung der Expression von TSP1 und zu einer Aktivierung von

TGF-β in diesen Zellen. In Tierstudien konnte demonstriert werden, dass die

Produktion von TSP1, das in der gesunden Niere kaum exprimiert wird, stark

ansteigt [24]. In zwei Studien mit Nierenbiopsien von Patienten mit Diabetes

Mellitus Typ 1 [81] und Diabetes Mellitus Typ 2 [39] zeigte sich, dass die

Expression von TSP1 mit der Schwere der Erkrankung und der Aktivität von

TGF-β korreliert. Weiterhin demonstrierten Moczulski et al., dass TSP1

neben der Cyclooxygenase 1 als einziges Produkt von 198 Kandiatengenen

in peripheren mononukleären Blutzellen bei Patienten mit einer diabetischen

Nephropathie hochreguliert war [52]. Unsere Arbeitsgruppe konnte in einem

STZ-Diabetes-Modell mit TSP1 Knockout Mäusen zeigen, dass das Fehlen

von TSP1 protektiv bei der Entwicklung der diabetischen Nephropathie wirkt:

Der Grad der Matrixakkumulation, der TGF-β Aktivierung, des

Podozytenschadens, der Entzündungszelleninfiltration und der funktionellen

Schädigung waren in diabetische TSP1 defizienten Mäusen reduziert [24].

67

Auch in Tiermodellen anderer fibrotischer Nierenerkrankungen (Anti-GBM

Nephritis, Anti Thy 1 Modell) wirkte das Fehlen von TSP1 (durch Knockout

oder durch Blockierung der Aktivierung von TGF-β) protektiv [21-22, 38].

Zu Thrombospondin 2 existieren weitaus weniger Daten: In vitro konnten

Schultz-Cherry et al. zeigen, dass TSP2 in der Lage ist, die Aktivierung von

TGF-β durch TSP1 zu verhindern. Unsere Arbeitsgruppe konnte dies in zwei

Tierstudien bestätigen: In einem Experiment mit TSP2 Knockout Mäusen

waren einige Merkmale der anti-GBM Nephritis verstärkt [23]. Weiterhin

wirkte die Überexpression von TSP2 protektiv bei einem Rattenmodell der

mesangioproliferativen Glomerulonephritis (Anti Thy1 Modell) durch die

Inhibition der Zellproliferation, der Entzündungszellinfiltration und der TGF-β-

Aktivierung [25].

Ziel dieser Arbeit war es daher zu überprüfen, ob eine gentherapeutische

Überexpression von TSP2 vor der Entwicklung einer diabetischen

Nephropatie schützt bzw. die Überexpression von TSP1 diese aggraviert.

6.2 Induktion eines Diabetes Mellitus und Entwicklung einer

Diabetischen Nephropathie

Als Grundlage für unser Experiment diente uns ein Tiermodel, bei dem ein

Diabetes Mellitus Typ 1 durch Streptozotocinapplikation induziert wurde. STZ

– ursprünglich als Antibiotikum identifiziert – wirkt toxisch vor allem auf die

insulinproduzierenden Zellen im Pankreas. Dieses Tiermodel ist bereits seit

zwei bis drei Jahrzenten gut etabliert. STZ kann jedoch auch potentiell an-

dere Gewebe schädigen. Um diesem Nebeneffekt entgegenzuwirken, haben

wir uns für ein Low-Dose Regime (geringere Dosis auf mehrere Tage verteilt)

entschieden, wodurch das toxische Potential verringert werden kann [12]. Die

applizierte Menge richtete sich nach der erzielten Blutzuckersteigerung, so

dass wir den Tieren individuell zwischen 300 mg/kg KG an drei Tagen und

480 mg/kg KG an sechs Tagen verabreichten. Nichtsdestotrotz können

potentielle toxische Nebenwirkungen an der Niere nicht ausgeschlossen

werden.

68

Der Erfolg einer Diabetesinduktion hängt von der STZ-Aktivität und vom

Stamm der Tiere ab [79]: Wir setzten 300 mg/dl als minimalen

durchschnittlichen Blutzuckerwert über 12-13 Wochen fest; Tiere, die diesen

Wert nicht erreichten, wurden von der weiteren Auswertung ausgenommen.

Die drei wichtigsten Kennzeichen einer diabetischen Nephropathie sind eine

Verdickung der glomerulären Basalmembran, eine Expansion der

extrazellulären Matrix und als funktioneller Ausdruck der Schädigung eine

Proteinurie. Wir konnten immunhistologisch eine verstärkte Ablagerung der

wichtigsten Matrixmoleküle bei allen drei diabetischen Gruppen feststellen.

Diese drei Gruppen zeigten ebenso einen signifikanten Anstieg der

Albuminuriekonzentration zum Endzeitpunkt.

Zusammengefasst zeigten alle STZ-behandelten und ausgewerteten Tiere

eine milde bis moderate diabetische Nephropathie. Ungeachtet dessen

waren die Tiere physiognomisch gesund; die Überexpression hatte keine

makroskopisch erkennbaren Nebeneffekte.

6.3 Aktivierung von TGF-β

Einer der wichtigstes Mediatoren der diabetischen Nephropathie ist TGF-β.

Diese Studie zeigt zum ersten Mal an einem diabetischen Tiermodell, dass

TSP1 das Aktivitätsniveau von TGF-β erhöht und TSP2 dieses erniedrigt:

P-Smad 2/3 als Ausdruck der Aktivität von TGF-β war in der TSP1 Gruppe

erhöht und in der TSP2 Gruppe erniedrigt. Diese Änderungen komplettieren

Ergebnisse aus zwei früheren Studien unserer Arbeitsgruppe mit einem

Glomerulonephritismodell mit TSP2 Überexpression und einem

Diabetesmodell mit TSP1 Knockout-Mäusen.

Damit bestätigen diese Ergebnisse bisherige Beobachtungen, dass TGF-β

durch TSP1 aktiviert wird und diese Aktivierung durch TSP2 inhibiert wird.

Wir konnten dies jedoch zum ersten Mal in einem Tiermodel der diabetischen

Nephropathie nachweisen.

Die drei diabetischen Gruppen zeigten keine erhöhte Expression von TGF-β1

und TGF-β2 auf mRNA-Ebene. Bei den Messungen kann jedoch nicht

zwischen aktiver und passiver Form unterschieden werden. Die Ergebnisse

stehen in Kontrast zum Befund der meisten Tierstudien, bei denen im Rah-

men der diabetischen Nephropathie TGF-β hochreguliert wird [95].

69

TGF-β wird jedoch in Folge der diabetischen Nierenschädigung im tubulären

Ultrafiltrat und im Urin gefunden [82]. Dieser Mechanismus eines Verlustes

von TGF-β erklärt jedoch nicht den fehlenden Anstieg auf mRNA-Ebene.

Allerdings sollte an dieser Stelle noch einmal betont werden, dass TGF-β

seine Funktion vor allem über sein Aktivitätsniveau ausübt, und nicht über

seine Expression [3]. Innerhalb der diabetischen Gruppen war bei der TSP2

Gruppe die höchste Expression von Gesamt TGF-β1 festzustellen. Dies

könnte man als kompensatorischen Anstieg infolge der gestörten Aktivierung

interpretieren.

6.4 Modulation der Fibrose

Eines der zentralen Elemente der diabetischen Nephropathie ist die

glomeruläre und interstitielle Fibrose. Beim Menschen treten diese

Veränderungen 5-7 Jahre nach Erstmanifestation eines Diabetes Mellitus auf

[28]; bei unseren Tieren waren sie am Ende des Experiments nach 14

Wochen unter Hyperglykämie ebenfalls zu sehen. Insgesamt waren die

histopathologischen Veränderungen aufgrund der vergleichsweise kurzen

Krankheitsdauer eher milde und entsprachen denen einer beginnenden

diabetischen Nephropathie.

In vielen fibrotischen Erkrankungen, wie auch der diabetischen

Nephropathie, ist TGF-β bei der Entwicklung der Fibrose involviert, indem es

die Produktion von EZM-Molekülen wie Fibronektin, Laminin und Kollagenen

anregt [16]. Dementsprechend führen Anti-TGF-β-Therapien zu einer

geringeren Matrixakkumulation [40, 94]. In unserer Studie zeigte die TSP2

Gruppe einen signifikant geringeren Gehalt an Kollagen IV im Glomerulus,

wahrscheinlich durch eine Reduktion der TGF-β Aktivität. Der Gehalt zweier

weiterer Matrixmoleküle (Kollagen I im tubulointerstitiellen Raum und Fibro-

nektin im Glomerulus) war jedoch nicht signifikant verändert, was auf einen

zusätzlichen TGF-β-unabhängigen Mechanismus hindeuten könnte.

Nach den Ergebnissen einer Studie mit diabetischen TSP1 Knockout Mäu-

sen, bei der unsere Arbeitsgruppe eine Erniedrigung der Glomerulosklerose

feststellte [24], erwarteten wir eine Verschlechterung dieser histologischen

Veränderung bei den Tieren mit TSP1 Überexpression. Bei der TSP1 Gruppe

war jedoch trotz der gesteigerten TGF-β Aktivierung die Deposition keines

70

der untersuchten Matrixmoleküle signifikant verändert: Möglicherweise

befand sich das TGF-β-System und seine nachgeschalteten Systeme bereits

durch den Diabetes Mellitus auf einem so hohen Aktivitätsniveau, dass eine

weitere Aktivierung keine weiteren Konsequenzen im Bezug auf die

Matrixmolekülproduktion hatte.

Die Matrixakkumulation bei der diabetischen Nephropathie beruht jedoch

nicht nur auf der gesteigerten Produktion von Proteinen der EZM, sondern

auch auf dem gestörten Umsatz dieser Matrixmoleküle. Dabei sind unter

anderem sogenannte Matrix-Metalloproteinasen (MMP) beteiligt. Ein

Vertreter dieser Familie – MMP2 – kann bekanntermaßen mit TSP2 inter-

agieren. TSP2 kann einen Komplex mit MMP2 bilden und dann über einen

Rezeptor in Fibroblasten internalisiert werden, wie Yang et al. in vitro

demonstrierten [90]. Cheng et al. konnten außerdem zeigen, dass MMP2

eine epitheliale mesenchymale Transition (EMT) induzieren kann [15] und

über diesen Mechanismus an der Entstehung der diabetischen Nierenfibrose

beteiligt sein könnte: So reichte die transgene Überexpression von MMP2 in

renalen Tubulusepithelzellen aus, um das Spektrum einer fibrotischen

Nierenerkrankung zu generieren [15]. Die in vivo-Daten im Bezug auf die

diabetische Nephropathie geben ein uneinheitliches Bild ab [80]: So fanden

die meisten Autoren eine verminderte Aktivität bzw. ein reduziertes Level von

MMP2 in Tierexperimenten; in humanen Studien war deren Niveau oft

erhöht. In unserer Studie fand sich bei allen drei diabetischen Tieren eine

erhöhte Aktivität von MMP2.

Die TSP2 Gruppe in unserem Experiment zeigte eine unveränderte Aktivität,

in der TSP1 Gruppe war jedoch eine verringerte Aktivität zu sehen; der

Unterschied erreichte jedoch nicht das Signifikanzniveau von p < 0,05.

In vitro-Daten zeigen, dass TSP1 die MMP2-Aktivität vermindern kann [5].

71

6.5 Infiltration durch Entzündungszellen

Einige aktuelle Studien untermauern die Bedeutung von Entzündungszellen

bei der Progression der diabetischen Nephropathie: Chow et al. konnten in

einem diabetischen Mausmodell zeigen, dass die Makrophageninfiltration mit

der Schwere des Nierenschadens zunimmt [17]. Darüber hinaus kommt es

auch zu einer Leukozyteninfiltration [6, 54].

In unserem Experiment erniedrigte TSP2 die Anzahl sowohl der

infiltrierenden Makrophagen als auch der CD3+-Lymphozyten; dabei hatten

CD4+- und CD8+-Zellen jeweils einen nahezu gleichen Anteil. Die TSP1

Gruppe zeigte keinen Unterschied zur Gruppe ohne Thrombospondin-Über-

expression. Dies könnte für einen von TGF-β-unabhängigen zusätzlichen

Mechanismus sprechen, der ein weiteres Voranschreiten der diabetischen

Nephropathie verhindert. Die Rolle von TGF-β im Bezug auf Entzündungsre-

aktionen zeigt darüber hinaus ein kontroverses und uneindeutiges Bild: So

sterben Mäuse mit einem TGF-β1-Knockout an einer multifokalen Entzün-

dung [75]. Andererseits induziert TGF-β1 in mesangialen Zellen das

monocyte chemoattractant protein 1 [82], das Makrophagen stimuliert.

Stattdessen könnte TSP2 seine antiinflammatorische Komponente über die

Regulation von Entzündungsmediatoren ausüben. In einem Rheumatoiden-

Arthritis-Modell demonstrierten Park et al., wie eine Überexpression von

TSP2 zu einer verringerten Produktion von Interferon-γ, Tumor-Nekrose-

Faktor-α und einer Reduktion von gewebeständigen T-Lymphozyten führte

[60]. Die antiinflammatorische Wirkung von TSP2 konnte durch unsere

Arbeitsgruppe in zwei Tiermodellen einer Glomerulonephritis bestätigt

werden [23, 25].

6.6 Schädigung der Podozyten

Neben den mesangialen Zellen rücken die Podozyten immer mehr ins

Interesse bei der Erforschung der Entwicklung einer diabetischen

Nephropathie. Der Verlust von Podozyten schon am Beginn der Erkrankung

wurde bereits an Tiermodellen und menschlichen Nierenproben beschrieben

[76]. Auch die diabetischen Tiere dieser Studie zeigten eine erniedrigte

Podozytenanzahl pro Glomerulus. Die TSP2 Überexpression führte zu einem

72

geringeren Verlust an Podozyten. Der Mechanismus, wie TSP2 auf die

Podozyten wirken könnte, ist noch nicht vollständig geklärt. Es könnte sich

wiederum um einen TGF-β-abhängigen Signalweg handeln: So induzierte die

Behandlung mit einem hohen Level an TGF-β1 in vitro die Apoptose von Po-

dozyten [69]. Unsere Arbeitsgruppe stellte in einem TSP1-Knockout Modell

einer diabetischen Nephropathie fest, dass der Schädigungsgrad der Podo-

zyten vermindert war [24]. Anderseits könnten Podozyten sogar eine Quelle

für sezernierte Thrombospondine sein: So fanden Han et al. bei mit Glucose

stimulierten Podozyten eine erhöhte Expression von TSP1 [33].

6.7 Verlust der Kapillardichte

Die Gefäßveränderungen, die bei der diabetischen Nephropathie entstehen,

sind vor allem qualitativer Natur, wie eine Arterio- und Arteriolosklerose in

den Nierengefäßen. Dennoch untersuchten wir die Nierenbiopsien in dieser

Studie auf quantitative Unterschiede in der Kapillardichte. TSP1 und vor

allem TSP2 gelten nämlich als potente Angiogeneseinhibitoren [46]. In unse-

rer Studie konnten wir einen leichten Verlust der kapillaren Dichte in allen

diabetischen Tieren feststellen. Die Überexpression mit TSP1 bzw. 2 hatte

darauf jedoch keinen Einfluss. In einem Glomerulonephritis-Modell mit TSP2-

Knockout-Mäusen konnte unsere Arbeitsgruppe den angiogenese-

inhibitorischen Effekt von endogenem TSP2 nachweisen [23]; bei diesem

Modell war jedoch der Kapillarverlust insgesamt bei den kranken Tieren

wesentlich ausgeprägter.

6.8 Beeinflussung der Nierenfunktion

Die bisher diskutierten Unterschiede zwischen den Gruppen hatten keinen

Einfluss auf die untersuchten Nierenfunktionsparameter: Serumharnstoff,

Proteinurie und Albuminurie war bei allen diabetischen Gruppen erhöht. Die

paradox anmutende Erhöhung der Kreatinin-Clearance in den diabetischen

Gruppen, die ja für eine verbesserte Nierenleistung spräche, beruht wohl auf

einer Hyperfiltration, die zu Beginn einer diabetischen Nephropathie auftritt.

Es fanden sich bei keiner der 4 Nierenfunktionsparameter Unterschiede

innerhalb der Therapiegruppen. Ein längerer Beobachtungszeitraum, in dem

73

die diabetischen Veränderungen weiter vorangeschritten wären, hätte

Unterschiede eventuell besser zum Vorschein gebracht: In einer ähnlichen

Studie unserer Arbeitsgruppe an TSP1-Knockout Mäusen mit STZ-

induzierter diabetischer Nephropathie zeigten die Tiere nach 9,5 Wochen

eine diesem Experiment vergleichbare Proteinurie [24]. Nach 20 Wochen

verdreifachte sich diese und in der TSP1 Gruppe war erstmals im Verlauf ein

signifikanter Unterschied zur Wildtyp Gruppe zu sehen.

74

6.9 Zusammenfassung, Kritische Beurteilung und Ausblick

Zusammenfassend konnten wir in dieser Studie erstmalig in vivo nach dem

Ursache-Wirkungs-Prinzip zeigen, dass eine Überexpression von TSP1 die

Aktivität von TGF-β bei der diabetischen Nephropathie steigert und TSP2

ebendiese Aktivitätssteigerung verhindert. Weiterhin führte die TSP2

Überexpression zu einer verringerten Deposition von Kollagen IV, einer ab-

gemilderten Infiltration der Niere durch Entzündungszellen und zu einem

Erhalt der Podozytenanzahl.

Nichtsdestotrotz müssen die Einschränkungen dieser Studie diskutiert

werden. Ein zentraler Aspekt der Arbeit beinhaltet die Aktivierung von TGF-β

im Rahmen der diabetischen Nephropathie. Die Beteiligung anderer Faktoren

kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Und nicht immer kann zwischen

TGF-β vermittelten Effekten und direkt durch die Thrombospondine

vermittelten Effekten differenziert werden. Weiterhin müssen auch potentielle

Interaktionen des Insulins und toxische Nebenwirkungen von Streptozotocin

berücksichtigt werden. Ein Einfluss der Thrombospondine auf den

Blutzuckerspiegel selbst erscheint unwahrscheinlich, da es keinen

signifikanten Unterschied in den Serumglukoseverläufen der Gruppen gab.

Bei einer Übertragung der Ergebnisse auf die humane diabetische

Nephropathie muss man berücksichtigen, dass wir nach 14 Wochen unter

Hyperglykämie nur milde histopathologische Veränderungen beobachteten.

Beim Menschen tritt als erste histologische Veränderung nach 1-2 Jahren

eine Verdickung der GBM auf [28]; die Erkrankung kann dann über mehrere

Dekaden bis zu einer Niereninsuffizienz fortschreiten. Unser Modell spiegelte

also den Beginn einer progredienten diabetischen Nephropathie wider.

Trotz dieser Einschränkungen ist das Eingreifen in die Thrombospondin-

TGF-β-Achse, wie in unserer Studie durch die Überexpression von TSP2,

eine vielversprechende Option bei der Prävention und Therapie der diabeti-

schen Nephropathie. Weitere Studien z.B. über einen längeren Zeitraum

könnten weitere Aufschlüsse über die Wirkmechanismen und potentielle

Nebenwirkungen von Thrombospondin 2 hervorbringen.

75

7 Abbildungsverzeichnis

Abb. 3-1 Molekularstruktur von TGF-β .............................................................. 17

Abb. 3-2 Molekularstruktur von TSP1 und TSP2 .............................................. 21

Abb. 3-3 Interaktion von TSP1 und 2 mit TGF-β ............................................... 22

Abb. 4-1 Schema über Gruppenverteilung und Studiendesign ......................... 26

Abb. 5-1 Verlauf des Blutzuckerspiegels .......................................................... 52

Abb. 5-2 Überlebenszeitanalyse der Versuchsgruppen .................................... 53

Abb. 5-3 Nierengewicht in Relation zum Tiergewicht ........................................ 54

Abb. 5-4 Aktivitätsniveau von TGF-β ................................................................ 55

Abb. 5-5 Expression von TGF-β1...................................................................... 55

Abb. 5-6 Histologische Veränderungen der diabetischen Nephropathie ........... 56

Abb. 5-7 Glomerulosklerose.............................................................................. 57

Abb. 5-8 Akkumulation von Kollagen I im Tubulointerstitium ............................ 57

Abb. 5-9 Akkumulation der Matrixmoleküle Kollagen IV und Fibronektin .......... 58

Abb. 5-10 Aktivität der Metalloproteinase 2 ...................................................... 59

Abb. 5-11 Podozytendichte im Glomerulus ....................................................... 60

Abb. 5-12 Infiltration von Makrophagen und T-Zellen ....................................... 61

Abb. 5-13 Differenzierung der T-Zellen in CD4+ und CD8+ Zellen .................... 62

Abb. 5-14 Rarefizierung der Kapillargefäße ...................................................... 63

Abb. 5-15 Nierenfunktionsparameter am Endzeitpunkt ..................................... 64

Abb. 5-16 Protein- und Albuminurie .................................................................. 64

76

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84

9 Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung ABTS 2,2'-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure ACE Angiotensin-Converting-Encyme Ak Antikörper ANP Atriales natriuretisches Peptid APS Ammoniumperoxodisulfat Aqua dest. Destilliertes Wasser BSA Rinderserumalbumin C Celsius CD Cluster of differentiation cDNA Komplemtäre DNA d Tag DAB 3,3'-Diaminobenzidine DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol DM Diabetes Mellitus DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EPO Elektroporation ECM/EZM Extrazelluläre Matrix FCS Fetales Kälberserum GBM glomeruläre Basalmembran GFR glomeruläre Filtrationsrate GLUT Glukosetransporter h Stunde kDA Kilodalton (atomare Masse) kg Kilogramm KG Körpergewicht LABP Latent-TGF-β-bindendes Protein LAP Latency assoziiertes Protein LLC Large latent complex MC Methyl Carnoy mg Milligramm min Minute MMP Matrix Metalloproteinasen ms Millisekunde mRNA Messenger Ribonukleinsäure µg Mikrogramm µl Mikroliter NaCl Natriumchlorid ODP Ortho-phenylendiamin P-Smad Phospholiertes Smad 2/3 PAF Paraformaldehyd PAS Periodsäure-Schiff-Färbung PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase-Kettenreaktion RAS Renin-Angiotensin-System

85

rpm Rounds per minute RT Raumtemperatur SDS sodium dodecylsulfate sec Sekunde STZ Streptozotocin SWK Stoffwechselkäfig T Temperatur TBS Tris buffered saline Temed Tetramethylethylendiamin TGF-β Transforming Growth Factor beta Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TRS Target Retrieval Solution TSP 1 Thrombospondin 1 TSP 2 Thrombospondin 2 ü.N. über Nacht V Volt WT 1 Wilms Tumor 1 ZN Zink

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10 Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Christian Hugo, der mittlerweile die

nephrologische Abteilung des Universitätsklinikums Dresden leitet, für die

Überlassung des Themas.

Weiterhin bedanke ich mich bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann aus der

nephropathologischen Abteilung in Erlangen für die Übernahme des

Zweitgutachtens.

Mein besonderer Dank gilt Herrn PD Dr. rer. nat. Christoph Daniel für die

erstklassige Betreuung. Seine immerwährende Unterstützung und seine

fachlichen Anregungen waren mir eine sehr große Hilfe.

Weiterhin möchte ich mich bei den Mitarbeitern der ehemaligen

Arbeitsgruppe Hugo bedanken, allen voran Tina, Tanja, Andrea und Susann.

Sie standen mir mit großer Geduld beim experimentellen Teil und bei der

Auswertung der Arbeit zur Seite.

Ein großes Dankeschön geht an meine Laborkollegin Regina für die große

wissenschaftliche und moralische Unterstützung.

Ein herzliches „Vergelt’s Gott“ geht an meine Freunde Benjamin und Christof,

die zeitgleich mit mir in der nephrologischen Abteilung promovierten.

Im Rahmen des SFB 423 der Deutschen Forschungsgemeinschaft und durch

die Dr. Ernst & Anita Bauer Stiftung erhielt ich eine finanzielle Förderung.

Vielen Dank.

Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinem Bruder Andreas.

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