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$: Folien 8 LC3 MP - analytik.ethz.ch · (refractive index detector = RID) 11 Signal: Brechungsindex-Änderung im Vergleich zum Eluenten Prinzip: Durchflussrefraktometer Messung der$
Herbstsemester 2013

Analytische Chemie(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophore se)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Pabst , mar [email protected]

HCI D323

[email protected]

http://www.analytik.ethz.ch/

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DETEKTOREN


Flüssigchromatographie (LC)Detektoren

Trennsäule

Detektor

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1. UV/VIS-Detektor (ultraviolet/visible)

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Signal: Extinktion von Eluent + Analyt

Grundlinie: Extinktion des Eluenten (oft automatisch abgezogen)

Prinzip: Messung der optischen Transmission (wie bei einem UV/VIS-Spektrometer)

UV: 190 bis 400 nm

VIS: 400 (violett) bis 800 nm (rot)


UV/VIS-Detektor

5

d

I0

IProbe

Lich

tinte

nsitä

Abstand

Lich

tinte

nsitä

t

= lgI0

I= ε λ( ) c d

Lambert-Beersches Gesetz

E

E .... Extinktion

ε .... Extinktionskoeffizient

c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung(‘extra column effects’)


UV/VIS-Detektor

6

d

I0

IProbe

Lich

tinte

nsitä

Abstand

Lich

tinte

nsitä

t

• Hohe Schichtdicke der Messzelle für eine empfindliche Detektion

• Geringes Volumen der Messzelle zur Verhinderung zusätzlicher Peakverbreiterung(‘extra column effects’)


Varianten des UV/VIS-Detektor

7

• Festwellenlängengeräte(z.B. Hg-Dampflampe mit λ = 254 nm)

• Geräte mit variabler Wellenlängeneinstellung

• Dioden array detektoren (DAD)


UV/VIS-Detektor

8

mit variabler Wellenlängeneinstellung

Lichtquellen: Deuteriumlampe (λ = 190-370 nm) und/oderWolfram-Halogenlampe (λ = 370-800 nm)

Wellenlänge wählbar mittels eines Monochromators (z.B. Prisma + Spalt)


UV/VIS-Detektor

9

Diodenarraydetektor (DAD)

Polychromatische Anregung (Deuteriumlampe und/oder Wolfram-Halogenlampe)

Zu jedem Zeitpunkt wird das ganze Spektrum von einem Diodenarray erfasst.


UV/VIS-Detektor

10

Der UV/VIS-Detektor erfasst nur Analyten, die ausreichend UV-Strahlung bzw. sichtbares Licht (VIS) absorbieren.

Bei kleinen Wellenlängen um 200 nm absorbieren viele Substanzen, meist aber auch der Eluent. Das Absorbptionsmaximum des Analyten soll längerwelligals die Eluentabsorption sein.

UV/VIS-aktiv:

• (polyzyklische) Aromaten, konjugierte Doppelbindungssysteme

• Doppel- und Mehrfachbindungen

• Carbonylgruppen C=O

• –Br, –I

R R R

......


2. Brechungsindexdetektor(refractive index detector = RID)

11

Signal: Brechungsindex-Änderungim Vergleich zum Eluenten

Prinzip: DurchflussrefraktometerMessung der Änderung von Brechungswinkeln

- Vielseitig, da praktisch jeder Analyt den Brechungs index ändert, aber unspezifisch

- Empfindlichkeit bei vielen Analyten um 2–3 Grössenordnungen schlechter als bei UV/VIS-Detektion. Nicht kompatibel mit Gradientenelution .

- Verwendung: Zuckerbestimmung in Wein


Verdampfungs-Lichtstreudetektor(evaporative light scattering detector = ELSD)

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Signal: Intensität des an festen Analytpartikeln gestreuten Lichts

Prinzip: Eluent + Analyt werden fein vernebelt. Lösungsmittel verdampft

Das an den festen Analytpartikelngestreute Laserlicht wird von einem Photodetektor erfasst

Universeller Detektor

Siedepunkt Eluent < Siedepunkt Analyten

Kompatibel mit Gradientenelution

Inkompatibel mit salzhaltigen Eluenten


Fluoreszenz-Detektor

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I f ∝ I0 ⋅ Φ ⋅ ε λAnregung( ) ⋅ c ⋅ d

If .... Fluoreszenzintensität

Φ ... Quantenausbeute

ε .... Extinktionskoeffizient

c .... Konzentration

d .... Schichtdicke

Im Gegensatz zu UV/VIS:

Signal(Photodiode) = 0 bei c = 0Signal ∝ I0

λEmission ≥ λAnregung (Rotverschiebung)


Fluoreszenz-Detektor

14

Signal: Fluoreszenzintensität

Prinzip: Anregung mit einer definierten Wellenlänge (Lichtfilter 1)

Detektion meist im 90°-Winkel der rot verschobenen (Lichtfilter 2) Fluoreszenzstrahlung

Sehr empfindlich(Faktor 100–1000 besser als UV/VIS)

Nicht universell – abhängig von der chemischen Natur der Analyten

Nur fluoreszierende Analyten (z.B. polyzyklische Aromaten), alternativ: Derivatisierung


3.Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern zu detektieren, muss man dieAnalytenmoleküle vorher ionisieren! = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionizationEI = Electron impact ionizationCI = Chemical IonisationMALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (Selten an LC gekoppelt)


ESI produziert„Pseudo-

Molekülionen“[M+H]+

• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions-zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

• Massenselektive Detektion(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

• ESI: v.a. für Moleküle mit protonierbaren oder deprotonierbaren funktionellen Gruppen

LC-ESI-MS(ESI = electrospray ionization)

Ausgang der Trennsäule


LC-APCI-MS(APCI = atmospheric pressure chemical ionization)

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• Weiches Ionisationsverfahren, das unfragmentierte Pseudomolekülionen erzeugt

• Fragmentierungen zur Strukturaufklärung in Massenspektrometern mit Kollisions-zelle möglich (z.B. Triple-Quadrupol-MS oder Quadrupol-TOF-MS)

• Massenselektive Detektion(sogar koeluierende Analyten werden getrennt detektiert)

• Stabil-isotopenmarkierte Verbindungen als interner Standard möglich

• APCI: auch für kleine Moleküle ohne polare funktionelle Gruppen gut geeignet

Ausgang der Trennsäule


Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)

18

Detektor Empfindlichkeit Linearbereich Analyten

UV/VIS + +++ UV- und VIS-Absorber

RID – – + universeller Detektor

ELSD o ++ universeller Detektor

Fluoreszenz +++ +++ Fluorophore

Elektrochemisch ++ / +++ ++ reduzier- und oxidierbareAnalyten

MS + / +++ + / ++ universeller Detektor+ massenselektive Detektion+ Massenspektren zur

Strukturaufklärung

Ausführlichere Tabelle in: Cammann, Instrumentelle Analytische Chemie


Derivatisierung

19

Derivatisierung: � Wenn Analyten nicht oder mit ungenügender Empfindlichkeit durch einen bestimmten Detektor erfasst werden können.

� Umsetzung z.B. mit Fluorophoren oder starken UV-Absorbern

NH3C CH3

SO O

Cl

H2N R+- HCl

NH3C CH3

SO O

HN

R

Fluoreszenzz.B. primäre Amine

5-(N,N-Dimethylamino)-

naphthalin-1-sulfonylchlorid

= Dansylchlorid

Blau-blaugrünfluoreszierende

Sulfonamide

NO2

NO2

NH

NH2

R1 R2

O+

- H2O

NO2

NO2

NH

N

R2

R1

UV/VISz.B. Aldehyde und Ketone

2,4-Dinitrophenyl-hydrazin

= DNPH

DNP-Hydrazone

max ≈ 360 nm


Beispiele:HPLC-Trennungen


Anwendungsbeispiele HPLC

21

Trennung von Pestiziden

Säule: C18 (RP)Eluenten: Wasser –

Acetonitril55%:45%

Flussrate: 1 mL/min

Detektor UV = 225 nm

1. Benfuresate2. Dymron3. Iprodione4. Pyrazoxyfen5. Tebufenozide6. Iprodione Metabolite7. Pencycuron

t (min)

O

CH3H3C

OS

O

O

H3C

NH

O

N

Cl



22

t

Trennung von polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAHs)

Säule: C18 (RP)Eluenten: (A) Wasser

(B) Acetonitril

Gradient:0–10 min 48% A, 52% B16 min 20% A, 80% B21 min 0% A, 100% B28 min 0% A, 100% B30 min 48% A, 52% B30 min stop

Flussrate: 1 ml/min

Detektor UV = 260 nm

(Minuten)



23

HPLC-Trennung vonSerotonin-Wiederaufnahmehemmern(Antidepressiva)

Stationäre Phase: Cyanopropyl-Kieselgel

Mobile Phase: Wasser (Phosphatpuffer, pH 7) – Acetonitril40%:60%

Flussrate: 1 ml/min

Detektor: UV, = 230 nm

Uracil

Verunreinigung

Fluvoxamin

Sertralin

Fluoxetin

NH

NH

O

O

CF3

N

O

H2N O

HN

H3C

H

HCl

Cl

CF3

OHN

Schlechte Retention der teilweise protonierten Amine auf RP-18-Phase,gute Trennung auf Cyanopropyl-Phase


Vergleich: LC-Detektoren (HPLC oder LC)

24

Detektor Empfindlichkeit Analyten

UV/VIS + UV- und VIS-Absorber

Fluoreszenz +++ Fluorophore

MS + / +++ universeller Detektormassenselektive DetektionMSn (Fragmentierung) zur Strukturaufklärung

Fluorescein

FITC fluorescin-Iso thiocyanate

Emission beihöherer

Wellenlänge!

Derivatisierung: Markieren von Analyten mit UV- oder fluoreszenzaktiven Molekülen:


UV Detektor … Detektoren sind selektiv

25

HPLC-Analyse von Olivenölproben. UV-Detektion bei zwei Wellenlängen .DAD = Diode Array Detektor


UV und RI Detektor

26

Untersuchung einer Bierprobe

Kombination von 2 Detektoren

(1) Brechungsindexdetektor (RI):

universell: erfasst alle Analyten

(2) UV/VIS-Detektor (280 nm):

für einige Analyten empfindlicher als RI

J. Chromatograph. Sci. 39 (2001) 235

Peak 9: 5-HydroxymethylfurfuralPeak 8: Ethanol


Massendetektoren

http://www.dgms-online.de/dgms1/Wissen/Das-ist-MS/massenspektrometer.php?navid=43

Um Analyten mit Massenspektrometern analysieren zu k önnen, muss mandiese vorher ionisieren = IONENQUELLE

ESI = Electrospray ionizationEI = Electron impakt ionizationCI = Chemical Ionization

MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (selten mit Trenntechnik gekoppelt)


Massendetektoren „2 Spuren“

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Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: Porous Graphitized Carbon(PGC)

Eluenten: Wasser /Acetonitril

Flussrate: 5 uL/min

Detektor ESI-MS

1. ATP (506)2. ADP (426)3. AMP (346)

All (M-H)-

"Chromatogram"TIC = total ion current

Massenspur

1

2

3

1

2

3


Massendetektoren „Analyten getrennt betrachtbar“

29

Trennung von Metaboliten aus tierischen Zellen

(CHO)

Säule: PGC

Eluenten: Wasser /Acetonitril

Flussrate: 5 µl/min

Detektor ESI-MS

1. ATP (506)2. ADP (426)3. AMP (346)

All (M-H)-

ChromatogramTIC = total ion current

1

23

1

2

3

SIM = single ion monitoring

m/z = 506

m/z = 426

m/z = 346



30

HPLC-MS-Trennung von Triglyceriden

A) Gesamtionenstrom(total ion current = TIC)

B) Single ion monitoring = SIM

Masse 1

Masse 2

Masse 3

Masse 4

TIC



31

Analyse der Probe ohne vorhergehende Trenntechnik o ft auch bei MS nicht möglich.

Chromatographie trotz Massenselektiven Detektor meis t notwendig/sinnvoll!

� Zu viele Analyten mit den gleichen oder ähnlichenMassen (isobare Analyten)

� Schlechte Ionisierung durch Hintergrundsubstanzender Probe (Salze, kleine polare Analyten....)

Hunderte Analytenin einem kleinem Massenbereich

Identifizierung nicht mehrmöglich!



32

m/z = 342.2

m/z = 400.1

m/z = 404.0

m/z = 384.1

m/z = 331.0

m/z = 332.1

m/z = 706.4

m/z = 657.4

HPLC-ESI-MS-Trennung von Mykotoxinen (Giftstoffe au s Schimmelpilzen)

Säule: C18 (RP)

Eluent:Wasser (+ NH4OAc)+ Acetonitril

Aflatoxin B1

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