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Funktionelle Untersuchung des 5-HT 2B Rezeptors in einem Tiermodell für Pulmonale Hypertonie mit Bezug zur Pathologie der M igräne

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Tierphysiologie

vorgelegt von

Ingo Bäcker

aus

Leverkusen

Bochum

Februar 2012

Functional investigation of the 5-HT 2B receptor in an animal model for pulmonary hypertension with regard to the pathology of migraine

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Biosciences

Ruhr-University Bochum

Department of Animal Physiology

submitted by

Ingo Bäcker

from

Leverkusen, Germany

Bochum

February 2012

Referent: Prof. Dr. Hermann Lübbert

Korreferent: Prof. Dr. Dr. Dr. med. habil. Hanns Hatt

Abkürzungsverzeichnis

IV

33P Radioisotop des Phosphors

5-HT 5-Hydroxytryptamin, Serotonin

α-SMA α-smooth muscle actin; α-Glattmuskelaktin

µ mikro

A A Ampere

A. dest destilliertes Wasser

Abb. Abbildung

ABC Avidin-Biotin-Komplex

ANO1 Anoctamin-1 (TMEM16A)

ANOVA analysis of variance, Varianzanalyse

ATP Adenosintriphosphat

B b2mg β2-microglobulin

b.i.d. bis in die; zweimal am Tag

bp Basenpaar

Bq Becquerel

BSA Rinderserumalbumin

C c centi

C Celsius

ca. zirka

cDNA complementary DNA

CGRP Calcitonin gene-related peptide

Ci Curie

CO2 Kohlenstoffdioxid

D DAB 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat

dCTP Desoxy-Cytosintriphosphat

DIG Digoxiginin

DMSO Dimethysulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP 2-Desoxyribonukleotid-5-Triphosphat


V

E EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure

ERK extracellular signal-regulated kinases

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

ET-1 Endothelin-1

F fw forward

G g Gramm

G Gauge

H h Stunde

H20 Wasser

HE Hämatoxylin-Eosin

HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase

HPV hypoxische pulmonale Vasokonstriktion

I ICC Interstitial Cells of Cajal

IHC Immunhistochemie

i.p. intraperitoneal; in die Bauchhöhle

IUPHAR International Union of Basic and Clinical

Pharmacology

ISH in situ-Hybridisierung

i.v. intravenös

K k kilo

L l Liter

L-NAME Nitro-L-Arginin-methylester

LM Längsmuskulatur, longitudinale Muskulatur

M m Meter

m milli

M Mol/molar

M Mega

MAPK mitogen-activated protein kinase


VI

MCT Monocrotalin

mmHG Millimeter-Quecksilbersäule (auch:Torr)

M-MuLV moloney murine leukemia virus

MAO Monoaminooxidase

mCPP 1-(3-Chlorphenyl)piperazin

min Minute

Mio. Million

N n Stichprobenumfang

n nano

N. Nervus

NGS normal goat serum

NHS normal horse serum

NO Stickstoffmonoxid

NOS Stickstoffmonoxid-Synthase

O OD optische Dichte

O2 Disauerstoff

P p Irrtumswahrscheinlichkeit

p pico

p Partialdruck

p phosphoryliert

p.o. per os; über den Mund

PAH Pulmonalarterielle Hypertonie

PB Phosphatpuffer

PBS Phosphatpuffer-Saline

PCR Polymerase-Kettenreaktion

PDGF Platelet-derived growth factor

PFA Paraformaldehyd

pH potentia Hydrogenii

PH Pulmonale Hypertonie


VII

PM Plexus Myentericus, Auerbach Plexus

ppET-1 präproEndothelin-1

PPE Plasmaproteinextravasation

PVR pulmonary vascular resistance

px Pixel

R rcf relative centrifugation force

RM Ringmuskulatur, zirkuläre Muskulatur

RNA Ribonukleinsäure

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

RT Reverse Transkiptase

rv reverse

RVH Rechtsventrikuläre Hypertrophie

S s Sekunde

SCF stem cell factor

SD standard deviation, Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat

SEM standard error of mean, Standardfehler

SERT Serotonintransporter

SMC smooth muscle cells; Glattmuskelzellen

SMGM smooth muscle growth medium

sq semiquantitativ

SSRI (selektiver) Serotonin-Wiederaufnahmehemmer

T TAE Tris / Essigsäure / EDTA

Taq Thermophilus aquaticus

TBS-T Tris-Buffered Saline-Tween

TE Tris / EDTA

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin

TPH Tryptophanhydroxylase


VIII

U U Unit; Einheit

üN über Nacht

V v Volume; Volumen

VE voll entsalzt

VEGF Vascular endothelial growth factor

vgl. vergleiche

vWF von-Willebrand Faktor

W w Weight; Gewicht

x -fach

Z z.B. zum Beispiel

ZNS zentrales Nervensyste

Inhaltsverzeichnis

IX

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... IV

1. Einleitung ........................................................................................................................ 13

1.1 Serotonin .................................................................................................................... 13

1.2 5-HT Rezeptoren ........................................................................................................ 14

1.2.1 5-HT2B Rezeptor ................................................................................................... 14

1.3 Migräne ....................................................................................................................... 15

1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik ......................................................... 15

1.3.2 Hypothesen zur Migräneentstehung und Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors ......... 16

1.3.3 Tiermodelle für Migräne ........................................................................................ 17

1.4 Pulmonale Hypertonie ................................................................................................. 18

1.4.1 Aufbau der Lunge und des pulmonalen Blutgefäßsystems ................................... 18

1.4.2 Symptomatik und klinische Klassifizierung der Pulmonalen Hypertonie ................ 20

1.4.3 Physiologische Anpassung des Organismus an hypoxische Luftverhältnisse ....... 21

1.4.4 Pathophysiologie der Pulmonalen Hypertonie ...................................................... 22

1.4.5 Tiermodelle für Pulmonale Hypertonie .................................................................. 24

1.4.6 Bedeutung von 5-HT und des 5-HT2B Rezeptors in der Pulmonalen Hypertonie ... 25

1.5 Zielsetzung ................................................................................................................. 28

2. Material und Methoden ................................................................................................... 29

2.1 Material ....................................................................................................................... 29

2.1.1 Versuchstiere ....................................................................................................... 29

2.1.2 Laborgeräte .......................................................................................................... 29

2.1.3 Verbrauchsmaterial .............................................................................................. 30

Inhaltsverzeichnis

X

2.1.4 Chemikalien ......................................................................................................... 30

2.1.5 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 33

2.1.6 Antikörper, Primer und pharmakologische Substanzen ........................................ 45

2.2 Methoden .................................................................................................................... 47

2.2.1 Tiermodell der normobaren Hypoxie ..................................................................... 47

2.2.2 Perfusion und histologische Aufarbeitung der Lunge ............................................ 47

2.2.3 Untersuchung des Herzens auf Hypertrophie des rechten Ventrikels ................... 48

2.2.4 Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten der Lunge ........................ 48

2.2.5 Quantitative Auswertung der Gewebeschnitte der Lunge ..................................... 49

2.2.6 Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion ................... 50

2.2.7 Western Blot ......................................................................................................... 53

2.2.8 in situ-Hybridisierung ............................................................................................ 55

2.2.9 Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten des Rattenvormagen ....... 57

2.2.10 Anlegen einer Primärkultur aus Zellen des Rattenvormagen .............................. 57

2.2.11 Calcium-Imaging an Primärkulturen des Rattenvormagen .................................. 58

2.2.12 Immunzytochemische Färbungen von Primärkulturen des Rattenvormagen ...... 58

2.2.13 Vitalfärbung von Primärkulturen des Rattenvormagen ........................................ 59

3. Ergebnisse ...................................................................................................................... 60

3.1 Validierung des Tiermodells der normobaren Hypoxie ................................................ 60

3.1.1 Visualisierung glatter Muskulatur in der Lunge von Mäusen ................................. 60

3.1.2 Induktion der PH ................................................................................................... 62

3.1.3 Rechtsherzhypertrophie (RVH) nach Hypoxie-Behandlung .................................. 64

3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung ....................................................................... 65

3.3 Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors ............................................................................... 67

3.3.1 Pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors ........................................ 67

3.3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung bei Blockierung des 5-HT2B Rezeptors .... 70

Inhaltsverzeichnis

XI

3.3.3 Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge von Mäusen unter Hypoxie ......... 72

3.3.4 Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors unter Hypoxie ...................................... 74

3.4 Wirkungsweise von Migräne-assoziierten Pharmaka in der PH ................................... 80

3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid-Synthase durch L-NAME .................................... 80

3.4.2 Aktivierung des 5-HT1B Rezeptors durch Sumatriptan .......................................... 82

3.4.3 Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors durch mCPP ................................................... 85

3.4.4 Zusammenhang zwischen Hypoxie- und mCPP-induzierter Neomuskularisierung ...................................................................................................................................... 88

3.5 Zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors ............................................................... 90

3.5.1 in situ-Hybridisierung im Vormagen der Ratte....................................................... 90

3.5.2 in situ-Hybridisierung in der Lunge der Ratte ........................................................ 93

3.5.3 Immunhistochemische Färbungen im Vormagen der Ratte .................................. 94

3.5.4 Immunhistochemische Färbungen in der Lunge der Ratte ................................... 96

3.6 Primärkultur von ICC aus dem Rattenvormagen ......................................................... 97

3.6.1 Charakterisierung der Zelltypen ........................................................................... 97

3.6.1.1 Nachweis von Muskelzellen und Neuronen .................................................. 98

3.6.1.2 Nachweis von ICC ......................................................................................... 98

3.6.2 Calcium Imaging ................................................................................................. 100

4. Diskussion .................................................................................................................... 102

4.1. Induktion und Reversibilität der vaskulären Neomuskularisierung ............................ 102

4.1.1 Transfer des Tiermodells der normobaren Hypoxie auf den Organismus Maus .. 102

4.1.2 Notwendige Dauer der Hypoxiebehandlung zur Induktion der PH ...................... 103

4.1.3 Reversibilität der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung .............................. 105

4.1.4 Gemeinsamkeiten und Unterschiede zum Tiermodell der Migräne ..................... 106

4.2. Die Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors in der Pathogenese der PH .......................... 108

4.2.1 Pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der Hypoxiebehandlung..................................................................................................... 108

Inhaltsverzeichnis

XII

4.2.2 Pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors nach der Hypoxiebehandlung .................................................................................................... 110

4.2.3 Expression des 5-HT2B Rezeptors unter Einfluss von Hypoxie ........................... 111

4.2.4 Die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors unter Hypoxiebedingungen ......... 112

4.3. Einsatz von Migräne-assoziierten Pharmaka im Tiermodell der PH ......................... 113

4.3.1 L-NAME und die Bedeutung von NO .................................................................. 113

4.3.2 Sumatriptan und die Bedeutung des 5-HT1B Rezeptors ..................................... 115

4.3.3 mCPP und die dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors ............................. 117

4.4. Zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors ........................................................... 119

4.4.1 Lokalisation in der Lunge ............................................................................... 119

4.4.2 Lokalisation im Magen .................................................................................... 120

4.5. Ausblick ................................................................................................................... 122

5. Zusammenfassung ....................................................................................................... 124

6. Summary ....................................................................................................................... 126

7. Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 128

Danksagung ...................................................................................................................... 146

Lebenslauf ........................................................................................................................ 147

Veröffentlichungen ........................................................................................................... 148

Erklärung .......................................................................................................................... 149

Einleitung

13

1. Einleitung

1.1 Serotonin

Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) stellt eines der wichtigsten biogenen Amine für den

Organismus dar. Es fungiert sowohl als Gewebshormon in der Peripherie als auch in Form

eines Neurotransmitters im Zentralen Nervensystem (ZNS). Dadurch beeinflusst und

reguliert es unterschiedlichste vegetative Prozesse wie z.B. die Motilität des

Verdauungstrakts (Beattie & Smith, 2008) oder die Kontrolle über die vaskuläre Muskulatur

(Vanhoutte, 1989). Im ZNS spielt 5-HT unter anderem eine bedeutende Rolle bei der

Modulation von Lernen und Gedächtnis (Buhot et al., 2000) sowie Emotionen (Graeff et al.,

1996).

Die Synthese von 5-HT erfolgt in zwei Schritten aus der Aminosäure L-Tryptophan durch

Hydrolyse und Decarboxylierung, wobei die Tryptophanhydroxylase das ratenbestimmende

Enzym darstellt. (Mohammad-Zadeh et al., 2008). Der Abbau von Serotonin geschieht

ebenfalls in zwei Reaktionen. Von besonderer Bedeutung sind hier die Monoaminooxidasen

(MAO), da sie 5-HT in eine biologisch inaktive Form überführen (Shih, 2004). Der zuletzt

entstehende Metabolit 5-Hydroxyindolylessigsäure (5-HIAA) wird über den Harn

ausgeschieden.

Der Transport von 5-HT über die Zellmembran erfolgt durch den Serotonin Transporter

(SERT, 5-HTT). Nach der Bindung des Liganden am Rezeptor sorgt der SERT für die

Wiederaufnahme von 5-HT und beendet damit die biologische Wirkung des Monoamins

(Canli & Lesch, 2010). Neben Inhibitoren der MAO sind Hemmer des SERT ein Ansatzpunkt

für Pharmaka, welche einen erhöhten Serotoninspiegel erzeugen. Diese so genannten

Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) stellen das Mittel der Wahl bei verschiedenen

psychischen Erkrankungen wie z.B. Depressionen (Blier & de Montigny, 1994) oder

Bipolaren Störungen (Sachs et al., 2000) dar.

Der Hauptanteil des für den Körper verfügbaren 5-HT entstammt den Enterochromaffinzellen

des Gastrointestinalstrakts (GIT) und den Thrombozyten. Etwa 95% werden in diesen Zellen

synthetisiert bzw. gespeichert (Erspamer & Asero, 1952; De Ponti, 2004), wohingegen

lediglich geringe Mengen 5-HT in den Neuronen der Raphe Kerne im Hirnstamm produziert

werden (Jonnakuty & Gragnoli, 2008). Da 5-HT eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung

spielt, befinden sich nur äußerst geringe Mengen 5-HT gelöst im Blutplasma (de Clerk et al.,

1982). Die Blut-Hirn Schranke ist impermeabel für 5-HT, so dass es nicht über das Blut in

den neuronalen Kreislauf überführt werden kann. Daher wird die Menge von 5-Hydroxy-

Tryptophan, welches die Blut-Hirn Schranke überwinden kann, zum limitierenden Faktor des

zentralnervösen 5-HT Gehalts (Hardebow & Owman, 1980).

Einleitung

14

1.2 5-HT Rezeptoren

Bis heute sind, je nach Spezies, bis zu 14 5-HT Rezeptoren beschrieben, welche gemäß der

Klassifizierung der IUPHAR (International Union of Basic and Clinical Pharmacology) in

sieben Familien eingeteilt werden. Bei allen Serotonin Rezeptoren handelt es sich mit

Ausnahme des 5-HT3 Rezeptors um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Diese koppeln

sowohl über stimulierende (z.B. 5-HT2) als auch über inhibierende (z.B. 5-HT1) G-Proteine

(Pytliak et al., 2011).

Durch die große Anzahl und Vielfalt der 5-HT Rezeptoren kommen sie in nahezu jedem

Gewebe vor. Zudem können in einem Gewebetyp auch mehrere unterschiedliche 5-HT

Rezeptoren gefunden werden. So sind z.B. in den verschiedenen Zelltypen der Blutgefäße

5-HT Rezeptoren aus jeder Familie vertreten (Kaumann & Levy, 2006).

1.2.1 5-HT2B Rezeptor

Die Familie der 5-HT2 Rezeptoren umfasst den 5-HT2A, den 5-HT2B sowie den 5-HT2C

Rezeptor. Bislang wurde für alle drei Rezeptoren eine Kopplung über das Gq/11-Protein

beschrieben (Hoyer et al., 2002). Während dieser Signalweg für die 5-HT2A und 5-HT2C

Rezeptoren durch in vivo-Studien als gesichert gilt (Conn et al., 1986; Day et al., 2002)

konnte diese Kopplung für den 5-HT2B Rezeptor bislang nur in heterologen

Expressionssystemen gezeigt werden (Choi et al., 1994; Bonhaus et al., 1995; Jerman et al.,

2001).

Der Rezeptor wurde erstmals aus dem Gewebe des Vormagens der Ratte (Rattus

norvegicus) kloniert und als 5-HT2F Rezeptor benannt. (Foguet et al., 1992; Kursar et al.,

1992). Kurz darauf wurde die Nomenklatur geändert und der 5-HT2B Rezeptor erhielt seine

heutige Bezeichnung (Humphrey et al., 1993).

Die Funktion des 5-HT2B Rezeptors wurde schon weitaus früher im Vormagen der Ratte

beschrieben (Vane, 1957). Die zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in diesem

Magenabschnitt ist bis heute jedoch nicht vollständig aufgeklärt. Allerdings wurden bisher

ausschließlich Studien veröffentlicht, welche Strukturen innerhalb der Tunica muscularis

(siehe Abb. 1.1) als Expressionsort nennen. In einer Studie wurde der 5-HT2B Rezeptor in der

glatten Muskulatur des Vormagens nachgewiesen (Duxon et al., 1997). Andere

Arbeitsgruppen fanden den Rezeptor im Plexus Myentericus (Fiorica-Howells et al., 2002;

Borman et al., 2002; Zhang et al., 2009), einer ganglionären Struktur des Enterischen

Nervensystems (ENS).

Neben der Expression im Magen wurde das Vorkommen des 5

Bereichen des GIT (Choi & Maroteaux, 1996), der Lunge (Ullmer

(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus

Herzen (Monassier et al.,2008, Jaffre

sowie in Blutgefäßen verschiedenster Gewebe (Ullmer

Strukturen des ZNS sind Verbreitung und Funktionen des Rezeptors beschrieben (Choi

et al., 1997; Bonaventure et

Aufgrund seiner weiten Verbreitung im Organismus wird dem 5

Beteiligung an vielen Pathologien zugeschrieben. In der Folge wird auf die Bedeutung des

Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie

eingegangen.

1.3 Migräne

1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik

Die Migräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz

wird für Männer mit 6-8% beziffert, bei Frauen wird sie auf 12

2008). Mit Kosten von mehr als 27 Milliarden Euro, welche den Staaten der Europäischen

Union jährlich entstehen, gilt die Migräne als die das Gesundheitssystem am meisten

belastende neurologische Erkrankung (Andlin

Abb. 1.1: Aufbau der Tunica muscularisRadenkovic, 2005)

Die Tunica muscularis bestehtKontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT) verantwortlich ist. Die glatte Muskulatur liegt sowohl in LängsZwischen diesen Schichten befindet sich der eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich unter anderem die Enterischen Neurone sowie Zelltypen sind an der Steuerung der Motilität des GIT beteiwird durch die Tela submucosavon der Tunica mucosa, der Schleimhaut, getrennt.

Neben der Expression im Magen wurde das Vorkommen des 5-HT2B Rezeptors in weiteren

hen des GIT (Choi & Maroteaux, 1996), der Lunge (Ullmer et al.

(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus

,2008, Jaffre et al.,2008), der Dura mater (Schmuck

sowie in Blutgefäßen verschiedenster Gewebe (Ullmer et al., 1995) nachgewiesen. Auch in


et al., 2002; Murray et al., 2010; MacFarlane

Aufgrund seiner weiten Verbreitung im Organismus wird dem 5-HT


Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie

1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik

gräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz

8% beziffert, bei Frauen wird sie auf 12-15% geschätzt (



belastende neurologische Erkrankung (Andlin-Sobocki et al., 2005).

Tunica muscularis in Vormagen der Ratte (verändert nach

besteht im Wesentlichen aus glatter Muskulatur, welche mit ihrer Kontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT) verantwortlich ist. Die glatte Muskulatur liegt sowohl in Längs- als auch in Ringform vor. Zwischen diesen Schichten befindet sich der Plexus Myentericus, eine in Bindegewebe eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich unter anderem die Enterischen Neurone sowie Interstitial Cells of CajalZelltypen sind an der Steuerung der Motilität des GIT beteiligt. Die Tunica muscularis

Tela submucosa, einer Schicht bestehend aus lockerem Bindegewebe, , der Schleimhaut, getrennt.

Einleitung

15

Rezeptors in weiteren

al., 1995), der Niere

(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus et al., 1995), im

(Schmuck et al., 1996)

, 1995) nachgewiesen. Auch in


, 2010; MacFarlane et al., 2011).

HT2B Rezeptor eine


Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie (PH)

gräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz

15% geschätzt (Diener et al.,



in Vormagen der Ratte (verändert nach

glatter Muskulatur, welche mit ihrer Kontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT)

als auch in Ringform vor. , eine in Bindegewebe

eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich Interstitial Cells of Cajal. Beide

Tunica muscularis , einer Schicht bestehend aus lockerem Bindegewebe,

Einleitung

16

Damit ein Ereignis als Migräneattacke bezeichnet werden kann, müssen verschiedene

Kriterien erfüllt sein, welche von der International Headache Society in der Klassifizierung

der Migräne veröffentlicht wurden. So muss der Kopfschmerz 4-72 h anhalten, wobei er in

der Regel unilateral lokalisiert und von pulsierendem Charakter ist. Zumeist führt die Attacke

dazu, dass physische Routineabläufe wie z.B. Gehen und Bewegen nicht erfüllt werden

können ohne dass diese die Symptome weiter verstärken. Neben Übelkeit und Erbrechen

treten häufig Phono- und Photophobie auf (Olesen et al., 2004).

5-HT nimmt eine zentrale Rolle in der Erforschung der Migräne ein (Hamel, 2007; Schwedt,

2007). So konnten Studien zeigen, dass der Serotoninspiegel im Blut vor und während einer

Migräneattacke verändert vorliegt (Anthony et al., 1967; Ferrari et al., 1989). Daher sind

auch die 5-HT Rezeptoren von großer Bedeutung. Agonisten der 5-HT1B/1D Rezeptoren, die

Triptane, stellen das Mittel der Wahl zur Behandlung akuter Migräneattacken dar. Zudem

löste die Substanz 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP), ein partieller Agonist der 5-HT2B und

5-HT2C Rezeptoren, in Patienten Migräneattacken aus (Brewerton et al., 1988; Kalkman,

1997; Leone et al., 2000).

1.3.2 Hypothesen zur Migräneentstehung und Bedeutun g des 5-HT 2B Rezeptors

Eine von mehreren Theorien zur Entstehung der Migräne stellt die Hypothese der

neurogenen Inflammation der äußersten Hirnhaut, der Dura mater, dar. Im Zentrum der

Hypothese steht die Annahme, dass die Migräneattacke durch Reizung freier

Nervenendigungen des N. trigeminus hervorgerufen wird (Moskowitz, 1993; Johnson et al.,

1998). Daraufhin werden proinflammatorische Substanzen wie Substanz P oder das

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) aus den Nervenendigungen freigesetzt (Edvinsson

& Goadsby, 1994; Buzzi et al., 1995).

Die Ausschüttung führt zu einer CGRP Rezeptor-vermittelten Vasodilatation meningealer

Blutgefäße (Williamson et al., 1997) und zu einer anhaltenden Reizung von freien

Nervenendigungen des N. trigeminus. Dadurch kommt es zur Ausschüttung weiterer Peptide

und zur Aktivierung von Mastzellen, welche durch Abgabe von Histamin eine Verstärkung

der Vasodilatation hervorrufen (Tani et al., 1990). Durch die Wirkung von Substanz P am

Neurokinin-1 Rezeptor entsteht eine erhöhte Permeabilität der duralen Blutgefäße (Brain &

Cox, 2006), was den Austritt der Proteine aus dem Blutplasma in das perivaskuläre Gewebe

zur Folge hat. Dieser Vorgang wird als Plasmaproteinextravasation (PPE) bezeichnet und

konnte sowohl im Menschen als auch im Tier beobachtet werden (Herbert & Holzer, 2002).

Einleitung

17

Durch die PPE und die Vasodilatation kommt es zu einer sterilen Entzündung der Dura

mater und einer verstärkten Reizung von Nozizeptoren des N. trigeminus, welcher die

Blutgefäße der Dura mater mit schmerzsensitiven Fasern innerviert (Fricke et al., 2001).

Vom N. trigeminus werden die Informationen über den Ncl. caudalis in höhere,

schmerzrelevante Hirnareale weitergeleitet und dort integriert (Link et al., 2008).

Die Mechanismen, die zur erstmaligen Reizung des N. trigeminus führen, sind Gegenstand

der derzeitigen Migräneforschung. Eine Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors wurde allerdings

bereits schon kurz nach seiner Klonierung diskutiert (Fozard & Kalkman, 1994).

Nach Stimulation des 5-HT2B Rezeptors kommt es auf einem bisher nicht vollständig

geklärten Signalweg zur Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) (Schmuck et al., 1996). NO

wird ebenfalls eine wichtige Rolle in der Migräneentstehung zugesprochen (Fozard, 1995;

Olesen et al., 1994; Hobbs et al., 1999). Da NO die Fähigkeit besitzt die freien

Nervenendigungen des N. trigeminus zu reizen (Schmuck et al., 1996), stellt dieser

Zusammenhang einen möglichen Entstehungsweg der Migräne dar. Weitere Hinweise für die

Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors lieferte die Arbeitsgruppe um Johnson (2003) sowie

Arbeiten am Lehrstuhl für Tierphysiologie.

1.3.3 Tiermodelle für Migräne

Neben Tiermodellen in denen das trigeminale System elektrisch stimuliert wird, existiert auch

ein Modell in dem die Induktion der artifiziellen Migräne pharmakologisch erfolgt. Dabei

macht man sich die PPE (siehe 1.3.2) zunutze (Johnson et al., 2003). Den Tieren wird der

Azofarbstoff Evans Blue injiziert, welcher unselektiv an Plasmaproteine bindet (Gregersen,

1951) und somit als Tracer fungiert. Treten die Plasmaproteine während der PPE aus den

meningealen Blutgefäßen in das perivaskuläre Gewebe über, kann dies durch

photometrische Quantifizierung von Evans Blue nachgewiesen werden.

Die Induktion der PPE ist in diesem Modell pharmakologisch sowohl induzier- als auch

blockierbar. Die Arbeitsgruppe um Johnson konnte zeigen, dass die Injektion von mCPP

(siehe 1.3.1) eine PPE in der Dura mater von Meerschweinchen (Cavia porcellus) auslöst.

Dieser Effekt war nach vorheriger Applikation eines selektiven 5-HT2B Antagonisten nicht

mehr vorhanden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Nitro-L-Arginin-methylester

(L-NAME), ein Inhibitor der NO-Synthase (NOS), sowie Sumatriptan (siehe 1.3.1.) die PPE

verhindern konnten. Eine weitere Arbeitsgruppe wies nach, dass die Injektion von mCPP in

Ratten zu einer erhöhten Aktivität der Neurone im trigeminalen Nucleus caudalis (TNC)

führte, wenngleich sich dieser Befund nach Applikation des 5-HT2B Rezeptor-spezifischen

Einleitung

18

Agonisten BW723C86 nicht bestätigte (Martin & Martin, 2001). Durch diese Studien wurde

der Bezug vom Tiermodell zur Migränepathologie deutlich.

Am Lehrstuhl für Tierphysiologie konnten diese Ergebnisse bestätigt und erweitert werden.

Neben der Validierung des Tiermodells im Meerschweinchen wurde es auf die Spezies Ratte

und Maus (Mus musculus) übertragen. Hier zeigte sich ebenfalls die 5-HT2B Rezeptor-

spezifische Abhängigkeit der PPE. Diese konnte zum einen durch BW723C86 induziert, zum

anderen mit dem 5-HT2B Rezeptor-spezifischen Antagonisten BF-1 blockiert werden (Daniel

Segelcke, persönliche Mitteilung).

1.4 Pulmonale Hypertonie

Da in dieser Arbeit Aspekte des pathologischen Profils der Pulmonalen Hypertonie (PH)

untersucht wurden, wird zunächst ein Überblick über die Anatomie der Lunge sowie den

pulmonalen vaskulären Aufbau besprochen.

1.4.1 Aufbau der Lunge und des pulmonalen Blutgefäß systems

Die Lunge dient bei nahezu allen landlebenden Wirbeltieren der Aufnahme von molekularem

Sauerstoff (O2) sowie der Abgabe von Kohlendioxid (CO2) und stellt damit eines der

wichtigsten Organe des Organismus dar. Zur optimalen Funktion der Lunge müssen einige

Kriterien erfüllt werden. Bei der Ventilation der Lunge muss gewährleistet sein, dass

sämtliche Bereiche mit einer ausreichenden Menge Luft versorgt werden. Zudem muss eine

effiziente Diffusion von O2 und CO2 erfolgen können und die Perfusion des Lungengewebes

mit einer entsprechenden Menge Blut gegeben sein (Huppelsberg & Walter, 2009).

Die Lunge besteht in der Regel aus zwei Lungenhälften, die sich bei der Maus wie folgt

gliedern. Der rechte Lungenlappen baut sich aus vier Loben auf: dem kranialen, dem

medialen, dem kaudalen sowie dem akzessorischen Lobus. Die linke Hälfte der Lunge

besteht aus einem einzigen Lobus, welcher daher als linker Lobus bezeichnet wird.

Die durch Nase oder Mund eingeatmete Luft gelangt über den Rachen in die Luftröhre, die

Trachea. Diese verzweigt sich weiter kaudal in einen rechten und einen linken Ast. Ab

diesem Punkt spricht man bei den luftleitenden Strukturen von Bronchien (Abb. 1.2). Die

knorpeltragenden Hauptbronchien treten am so genannten Hilus in die Lunge ein und

verzweigen sich weiter zu feineren Abschnitten mit einem geringeren Durchmesser bis hin zu

den Bronchioli terminales. Bis zu diesem Bereich wird vom anatomischen Totraum

gesprochen, da hier kein Gasaustausch stattfindet sondern lediglich die Weiterleitung der

Einleitung

19

Atemluft erfolgt. Teile der Bronchien verfügen über glatte Muskulatur, die eine Konstriktion

der Atemwege ermöglicht. Dadurch können die Atemwege auf unterschiedliche

Anforderungen an den Luftstrom reagieren.

Die Übergangszone zu den Segmenten in denen die Atmung stattfindet beginnt mit den

Bronchioli respiratorii. Dieser verzweigen sich weiter über die Ducti alveolaris hin zur

kleinsten funktionellen Einheit der Lunge, den Alveolen. Die Lunge des Menschen besitzt

350 - 700 Mio. Alveolen auf einer Fläche von etwa 100 m² (Schmidt et al., 2007).

In den Alveolen wird die Blut-Luft-Schranke gebildet. Der Abstand zwischen luftführenden

Strukturen und Blutgefäßen beträgt hier weniger als 1 µm. Das Kapillarbett der Alveolen wird

aus der Arteria pulmonalis gespeist. Die zuführenden Gefäße verlaufen dabei unmittelbar

neben den Atemwegen. Nach dem Gasaustausch wird das sauerstoffreiche Blut über die

Lungenvene zum Herzen befördert.

Abb. 1.2: Morphologische Gliederung der Lunge des M enschen (Modell nach Weibel, aus van den Berg, 2005)

Die von kranial über die Luftröhre (Trachea) eintreffende Luft wird über die Atemwege in die Lunge geleitet. Innerhalb der luftleitenden Zone verzweigen sich die Hauptbronchien bis zu den Bronchioli terminales. Dieser Bereich wird als anatomischer Totraum bezeichnet, da hier kein Gasaustausch stattfindet. Die respirative Zone beginnt mit den Bronchioli respiratorii. Die Blut-Luft-Schranke befindet sich an dem in den Alveolen lokalisierten Kapillargeflecht. Dort wird Sauerstoff aus der Luft ins Blut transportiert und Kohlenstoffdioxid aus dem Blut in die Luft abgegeben.

Einleitung

20

Die intrapulmonalen Blutgefäße bestehen aus maximal drei Schichten: Der Tunica externa

(Adventitia), der Tunica media (Media), sowie der Tunica interna (Intima).

Als Adventitia bezeichnet man das lockere Bindegewebe, welches die Blutgefäße von außen

her stützt. Die Media, welche im Wesentlichen von glatter Muskulatur gebildet wird, tritt nicht

bei sämtlichen Blutgefäßen auf. Diese vom vegetativen Nervensystem gesteuerte

Muskulatur ermöglicht die Konstriktion und Dilatation von Blutgefäßen und spielt dadurch

eine wichtige Rolle bei der Steuerung von Blutdruck und Fließgeschwindigkeit. Neben den

meisten Arterien besitzen auch größere Venen eine Media. Kleinere Arteriolen und Venulen

sowie Kapillaren verfügen in der Regel über keine Muskulatur und bestehen ausschließlich

aus Adventitia und/oder Intima. Letztere wird aus einer Schicht Endothelzellen gebildet,

welche als Monolayer vorliegt. Sie bilden eine semipermeable Barriere gegen das Blut und

stehen über aktive und passive Transportmechanismen in ständigem Kontakt zum

Blutkreislauf. Sie nehmen durch die Sekretion von vasoaktiven Substanzen wie Endothelin-1

(ET-1) oder NO direkten Einfluss auf die Gefäßstellung und den Blutdruck.

In der Lunge liegt der systolische Wert des Blutdrucks in Ruhe mit 15-20 mmHg weit unter

dem des Körperkreislaufs (ca. 120 mmHg). Daher wird das Blutgefäßsystem der Lunge

häufig als Niederdrucksystem bezeichnet.

1.4.2 Symptomatik und klinische Klassifizierung der Pulmonalen Hypertonie

Der Begriff der Pulmonalen Hypertonie (PH) umfasst eine weitreichende Anzahl von

Lungenerkrankungen. Per Definition spricht man von PH, sofern der mittlere

Lungenblutdruck einen Wert von 25 mmHG in Ruhe oder 30 mmHG bei Belastung übersteigt

(Petkov & Doberer, 2003). Die Prävalenz der PH wird auf 25-50 Fälle / Mio. Einwohner bei

einer Inzidenz von sieben Fällen / Mio. Einwohner geschätzt (Peacock et al., 2007;

Rosenblum, 2010).

Die Erhöhung des Blutdrucks geht mit einem Anstieg des Gefäßwiderstands des pulmonalen

Blutgefäßsystems einher, was eine Verstärkung der Herzaktivität nach sich zieht. Dadurch

kommt es im Verlauf der Krankheit zur Ausbildung einer Rechtsherzhypertrophie, auch Cor

pulmonale genannt. Diese kann in schweren Fällen zur Herzinsuffizienz und damit letztlich

zum Tod führen (Mullen & Landzberg, 2010).

Bis heute sind, sofern überhaupt möglich, lediglich die Symptome der PH zu behandeln.

Dadurch wird die Lebensqualität der Patienten zwar häufig verbessert, nichtsdestoweniger

besteht großer Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten (Ghofrani et al., 2009; Anderson

et al., 2010; Murthy et al., 2010)

Einleitung

21

Eine erste klinische Klassifizierung der PH wurde 1998 beim Second World Symposium on

Pulmonary Hypertension in Evian (Frankreich) vorgenommen (Rubin et al., 1998), welche

mittlerweile während zwei weiteren Symposien überarbeitet wurde (Simonneau et al., 2004 &

2009).

Gemäß der aktuellen Klassifizierung, welche 2008 in Dana Point (USA) ausgearbeitet wurde,

werden fünf übergeordnete Gruppen der PH unterschieden:

1. Pulmonalarterielle Hypertonie (PAH)

2. Pulmonale Hypertonie bedingt durch Linksherzerkrankung

3. Pulmonale Hypertonie bedingt durch Lungenerkrankung und/oder Hypoxie

4. Chronische thromboembolische Pulmonale Hypertonie

5. Pulmonale Hypertonie aufgrund unklarer multifaktorieller Mechanismen

Von besonderer Bedeutung sind dabei die Gruppen 1 und 3, da sie zu den am besten

untersuchten Formen, sowohl beim Menschen als auch in Tiermodellen gehören.

Die Kategorie der PAH stellt die umfangreichste Gruppe innerhalb der Klassifizierung dar.

Neben der idiopathischen Form werden auch die hereditären Formen der PH zu dieser

Klasse gezählt. Zudem sind auch Drogen- und Toxin-induzierte Formen der PH dieser

Gruppe zugehörig. Die PH kann auch als Begleiterscheinung assoziiert mit anderen, nicht

ausschließlich die Lunge betreffenden Erkrankungen wie z.B. einer HIV-Infektion oder

chronischer hämolytischer Anämie auftreten. Auch diese Formen der PH werden der ersten

Gruppe zugeordnet.

Bei den Ursachen der PH-Formen der Klasse 3 handelt es sich zumeist um direkte

Lungenerkrankungen wie z.B. die chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) oder

die Interstitielle Lungenerkrankung (ILD). Aber auch Formen der PH welche durch die

Unterversorgung der Lunge mit O2 entstehen, werden zu dieser Gruppe gerechnet. Die

reduzierte Sauerstoffversorgung kann dabei temporär, z.B. durch Schlafapnoe, erfolgen, was

in der Regel nur leichte Formen der PH nach sich zieht. Ist der Organismus über einen

längeren Zeitraum hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, z.B. durch Aufenthalt in großer

Höhe, treten schwerere Formen der PH auf.

1.4.3 Physiologische Anpassung des Organismus an hy poxische Luftverhältnisse

Der Anteil von O2 an der Atmosphäre beträgt auf Höhe des Meeresspiegels ca. 20,9%. Mit

steigender Höhe nimmt der Sauerstoffpartialdruck (pO2) kontinuierlich ab. Der O2-Gehalt liegt

Einleitung

22

in einer Höhe von 5000 m nur noch bei etwa 10%. Diese Luftbedingungen werden als

hypobare Hypoxie bezeichnet (Beall, 2007).

Im Gegensatz zum systemischen Blutkreislauf reagiert das intrapulmonale Blutgefäßsystem

nicht mit einer Vasodilatation sondern einer Vasokonstriktion auf hypoxische Luftverhältnisse

(Sommer et al., 2008). Diese physiologische Reaktion betrifft im Wesentlichen die

präkapillären Arterien (Staub, 1985) und bewirkt, dass der Blutdruck in der Lunge steigt.

Dadurch können kraniale Bereiche der Lunge, welche unter normoxischen

Ruhebedingungen kaum genutzt werden, besser durchblutet werden, wodurch das

Verhältnis von Ventilation und Perfusion verbessert wird (Aaronson et al., 2005). Dieser

Vorgang wird als hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) bezeichnet (von Euler &

Liljestrand, 1946; Moudgil et al., 2005).

Neben dieser Anpassung kommt es unter hypoxischen Luftverhältnissen auch zu einer

verstärkten Produktion von Erythropoietin (Zhu et al., 2002). Die daraus resultierende

Zunahme von roten Blutkörperchen gewährleistet eine höhere Sauerstoffkapazität. Zudem

erhöht sich die Atemfrequenz (Easton & Anthonisen, 1988), wodurch der Partialdruck von

CO2 (pCO2) gesenkt und daher der pO2 erhöht wird (Peyraud-Waitzenegger et al., 1989).

Dieser Prozess wird als hypoxische Hyperventilation bezeichnet.

Bei diesen physiologischen Adaptionen spielt sowohl der Zeitrahmen der Hypoxie als auch

der unterversorgte Bereich der Lunge eine entscheidende Rolle. So können kurzfristige

hypoxische Episoden mittels der HPV gut kompensiert werden, wohingegen der langfristige

Aufenthalt in Hypoxie zu schwerwiegenden strukturellen (Weissmann et al., 2001) und

funktionalen (Groves et al., 1987) Veränderungen des pulmonalen Blutgefäßsystems führt.

Diese spielen in der Pathogenese der Pulmonalen Hypertonie eine wichtige Rolle.

1.4.4 Pathophysiologie der Pulmonalen Hypertonie

Während des Krankheitsverlaufs der PH kommt es neben der verstärkten Vasokonstriktion

zu morphologischen Umbauprozessen im Blutgefäßsystem der Lunge (siehe Abb. 1.3),

welche auch als vaskuläre Remodellierung bezeichnet werden. Charakteristisch ist hierbei

die Ausprägung einer Muskelschicht an arteriellen Gefäßen, welche vormals keine Media

aufwiesen. Dieser Prozess wird als Neomuskularisierung bezeichnet und wird sowohl durch

Hyperplasie als auch Hypertrophie hervorgerufen (Jeffery & Wannstall, 2001). Zusätzlich

kommt es bei bereits muskularisierten Arterien zu einer Verdickung der Media durch

Proliferation der Glattmuskelzellen (Jones et al., 1999).

Die zellulären Veränderungen bei der Hypoxie

betreffen dabei jeden Zelltyp. Es kommt zur Freisetzung vasoaktiver Substanzen aus

Endothelzellen wie z.B. Vascular endothelial g

factor (PDGF), ET-1, 5-HT sowie NO (Faller, 1999; Jeffer

2006). Zudem entstehen plexiforme Läsionen durch die fehlgeleitete Proliferation der

Endothelzellen (Cool et al., 1999).

Hypoxische Luftverhältnisse führen bei den Glattmuskelzellen der Media wie bereits

beschrieben zu verstärkter Vasokonstriktion und Proliferation. Desweiteren sekretieren sie

vermehrt Proteine der Extrazellulären Matrix

al., 1989; Poiani et al., 1990).

Die Fibroblasten der Adventitia reagieren als erster der genannten Zelltypen auf Hypoxie

(Stenmark et al., 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren

genannten Myofibroblasten. Als solche besitzen sie kontraktile Eigenschaften, wie der

Nachweis von α-Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In

einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zelle

(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert

Hassoun et al., 2009).

Abb. 1. 3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH (verändert nach Jones et al.

Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu Myofibroblasten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des Lumens und damit zum Anstieg des intrapulmonalen Gefäßwiderstands.

Die zellulären Veränderungen bei der Hypoxie-induzierten PH sind äußerst komplex und


Vascular endothelial growth factor (VEGF), Platelet

sowie NO (Faller, 1999; Jeffery & Morell, 2002; Stenmark


, 1999).



vermehrt Proteine der Extrazellulären Matrix (ECM), wie z.B. Collagen und Elastin (Crouch

, 1990).


, 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren


Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In

einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zelle

(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert

3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH et al., 1999)

Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu

asten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des

ns und damit zum Anstieg des intrapulmonalen Gefäßwiderstands.

Einleitung

23

induzierten PH sind äußerst komplex und


Platelet-derived growth

y & Morell, 2002; Stenmark et al.,




(ECM), wie z.B. Collagen und Elastin (Crouch et


, 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren zu so


Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In

einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zellen

(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert et al., 2004;

3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH

Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu

asten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des

Einleitung

24

All diese Prozesse führen zur Verengung des Lumens intrapulmonaler Blutgefäße und damit

zu einem Anstieg des Gefäßwiderstands, welchem mit erhöhter Leistung des Herzens

entgegen gearbeitet werden muss.

1.4.5 Tiermodelle für Pulmonale Hypertonie

In den ersten Tiermodellen zur Erforschung der PH wurden mitunter relativ große Spezies

wie Schweine (Sus scrofa domestica) oder Schafe (Ovis orientalis aries) eingesetzt.

Heutzutage werden in der Regel Mäuse, Ratten oder Meerschweinchen verwendet. Dabei

existieren teilweise gravierende interspezielle Unterschiede in der Ausprägung der PH

(Tucker et al., 1975). Das tibetanische Yak (Bos mutus) ist durch die Lebensweise in großer

Höhe an hypoxische Verhältnisse adaptiert, weshalb die Lunge den reduzierten O2-Gehalt

sehr gut kompensieren kann (Durmowicz et al., 1993; Groves et al., 1993). Im Gegensatz

dazu ist der Phänotyp der PH in Kälbern (Bos taurus) besonders stark ausgeprägt.

Es existiert inzwischen eine Vielzahl von Tiermodellen zur Erforschung der PH (Ryan et al.,

2011). Durch den biotechnologischen Fortschritt werden z.B. immer häufiger transgene Tiere

verwendet. Die meisten Arbeitsgruppen konzentrieren sich allerdings weiterhin auf die

beiden klassischen Modelle der PH: (i) das Monocrotalin-Modell (MCT) sowie (ii) das

Hypoxie-Modell. Wenngleich in beiden Modellen pathologische Merkmale der PH induziert

werden können, bestehen teils große Unterschiede im Prozess der Remodellierung

pulmonaler Blutgefäße (van Suylen et al., 1998).

Das MCT-Modell wird vornehmlich an Ratten des Stammes Sprague Dawley durchgeführt. In

den ersten Versuchen stellte sich heraus, dass die orale Gabe von Samen der Pflanze

Crotolaria spectabilis zur Ausprägung der PH führte (Kay et al., 1967). In der Folge wurde

das Pyrrolizidin-Alkaloid MCT als Wirkstoff isoliert (Plestina & Stoner, 1971; Huxtable, 1980;

Meyrick et al., 1980). Wird MCT in der Leber des Organismus verstoffwechselt, entsteht als

Metabolit MCT-Pyrrol (MCTP). Der genaue Mechanismus der zur Entstehung der PH nach

Gabe von MCT führt, ist bis heute jedoch nicht geklärt.

Ein Vorteil dieses Tiermodells besteht in der einfachen Handhabung der Tiere, da bereits

eine Injektion von MCT ausreichend ist, um nach etwa fünf Wochen den Phänotypen der PH

hervorzurufen (Werchan et al., 1989; Uzzaman et al., 2000). Dieser ist mit einer massiven

Verdickung der Media, die bis hin zu Okklusionen der Blutgefäße führt, sehr stark

ausgeprägt (Lee et al., 2005). Ein Nachteil besteht in der mäßigen Reproduzierbarkeit des

Phänotyps, da die Wirkung des MCTP immer abhängig vom Metabolismus des einzelnen

Versuchstieres ist. Zudem wird das MCT-Modell eher als akutes toxisches Modell

Einleitung

25

angesehen, welches direkten Schaden an den Blutgefäßen verursacht. Daher bleibt fraglich

inwiefern dieses Modell das Erscheinungsbild der PH beim Menschen widerspiegelt.

(Stenmark et al., 2009).

Die ersten Versuchsreihen, bei denen der Einfluss der Hypoxie auf Tiere beobachtet werden

sollte, wurden in großer Höhe, also natürlicher hypobarer Hypoxie, durchgeführt (Hultgren

et al., 1963). Heutzutage werden die Versuchstiere fast ausschließlich in so genannten

Hypoxie-Kammern gehalten. Um Tiere unter hypoxischen Bedingungen zu halten, sind zwei

Varianten möglich. Zum einen kann in einer Unterdruckkammer mit Hilfe einer

Vakuumpumpe hypobare Hypoxie simuliert werden. Zum anderen besteht die Möglichkeit ein

Luftgemisch aus Raumluft und Stickstoff in die Hypoxie-Kammer strömen zu lassen und so

den Gehalt des O2 zu reduzieren. Diese Variante wird als normobare Hypoxie bezeichnet.

Der genaue Mechanismus zur Entstehung der PH im Hypoxie-Modell ist bis heute ebenfalls

nicht geklärt. Es ist jedoch naheliegend, dass die vaskuläre Remodellierung durch

O2-sensitive Prozesse eingeleitet wird. So sind vor allem Transkriptionsfaktoren wie die

Hypoxia inducible factors (HIFs) von Bedeutung. Es konnte beispielsweise gezeigt werden,

dass der HIF-1 unter hypoxischen Bedingungen essentiell für die verstärkte Expression von

Erythropoietin sowie VEGF ist (Forsythe et al., 1996; Tzusuki et al., 2000). Da eine Vielzahl

von Genen über so genannten Hypoxia response elements (HRE) verfügt, sind die zellulären

Folgen der Hypoxie sehr komplex (Melillo et al., 1996; Lok & Ponka, 1999; Minchenko &

Caro, 2000).

Ein Vorteil der Hypoxiebehandlung liegt darin, dass der identische Stimulus auch beim

Menschen zur Ausprägung der PH führt. Daher sollten die im Tiermodell erzielten

Erkenntnisse mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einem verbesserten Verständnis der

Erkrankung beim Menschen führen und die Behandlungsmöglichkeiten verbessern. Zudem

besteht im hypoxischen Tiermodell keine Speziesabhängigkeit (Ratte) wie beim MCT-Modell.

Daher wurde für diese Arbeit das Modell der normobaren Hypoxie verwendet.

1.4.6 Bedeutung von 5-HT und des 5-HT 2B Rezeptors in der Pulmonalen Hypertonie

Die Rolle von 5-HT in der Pathogenese der PH ist für die Forschung von großer Bedeutung.

Erste Hinweise auf die Beteiligung von 5-HT resultierten aus dem vermehrten Auftreten der

PH in den 1960er sowie 1980er Jahren bei Patienten, welche die Appetitzügler Aminorex

und Dexfenfluramin einnahmen (Kay et al., 1971; Abenhaim et al., 1996). Es stellte sich

heraus, dass diese Substanzen weitreichende Wirkungen innerhalb des serotonergen

Systems entfalteten (MacLean, 1999). Später wurde nachgewiesen, dass der 5-HT Gehalt

Einleitung

26

im Blut von Patienten mit PH erhöht vorliegt (Herve et al., 1995; Kéreveur et al., 2000). Es

bleibt bisher fraglich über welche Mechanismen dieser Anstieg entsteht und welche

Rezeptoren die Wirkung des 5-HT in der Pathologie der PH vermitteln.

Die Tryptophan Hydroxylase (TPH) ist das ratenbestimmende Enzym bei der 5-HT Synthese.

Bei Patienten mit PH konnte eine gesteigerte Expression der TPH nachgewiesen werden

(Dempsie & MacLean, 2008). Durch in vitro Experimente konnte gezeigt werden, dass die

Inhibition der TPH zu einer verringerten Proliferation glatter Muskelzellen (smooth muscle

cells, SMC) führte. Der Effekt der Inhibition war in SMC von Patienten mit PH größer als bei

den Zellen der Kontrollgruppe (Eddahibi et al., 2006). Zudem zeigten Mäuse, welche eine

Defizienz des TPH-Gens aufwiesen, eine starke Reduktion des Phänotyps der PH nach

Hypoxiebehandlung (Morecroft et al., 2007).

Da der SERT für die zelluläre Regulation des 5-HT Spiegels verantwortlich ist, spielt auch

dieser wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Entstehung der PH. In Tiermodellen der PH

zeigten Mäuse, die den SERT überexprimierten (SERT+/+), eine stärkere Ausprägung der PH

als die entsprechenden Littermates (MacLean et al., 2004; Guignabert et al., 2006). Im

Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass SERT-Knock Out Mäuse (SERT-/-) einen

reduzierten Phänotypen ausbildeten (Eddahibi et al., 2000).

5-HT verfügt nicht nur über vasoaktive Eigenschaften sondern stellt auch ein potentes

Mitogen dar (Egermeyer et al., 1999). Diese Prozesse werden von den Serotonin

Rezeptoren vermittelt. In der Pathologie der PH scheinen vor allem der 5-HT1B Rezeptor, der

5-HT2A sowie der 5-HT2B Rezeptor involviert zu sein (Esteve et al., 2007; MacLean, 2007).

Die genaue Bedeutung der einzelnen Rezeptoren ist bisher nicht geklärt, es wird aber auch

die Möglichkeit der Interaktion dieser Rezeptoren diskutiert (Naeije & Eddahibi, 2004).

Erstmalig wurde eine mögliche Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Pathogenese der

PH in einem hypoxischen Mausmodell gezeigt (Launay et al., 2002). Diese Arbeitsgruppe

konnte durch pharmakologische Inhibition des 5-HT2B Rezeptors den Prozess der

Neomuskularisierung blockieren. Auch bei Mäusen, die über eine genetische Ablation des

5-HT2B Rezeptors verfügten (5-HT2B-/-), kam es nicht zur Ausbildung einer neuen

Muskelschicht an den Blutgefäßen. Die Gabe von Dexfenfluramin, dessen Metabolit

Nordexfenfluramin ein agonistische Potential am 5-HT2B Rezeptor aufweist, verstärkte den

Effekt der Hypoxie. Desweiteren wurde eine gesteigerte Expression des Rezeptors nach der

Hypoxie-Behandlung festgestellt.

Innerhalb der letzten zwei Jahre wurden weitere Studien veröffentlicht, in welchen die

Funktion des 5-HT2B Rezeptors in Tiermodellen der Pulmonalen Hypertonie untersucht

wurde (Porvasnik et al., 2010; Dumitrascu et al., 2011, Zopf et al., 2011). Sämtliche

Einleitung

27

Arbeitsgruppen verwendeten das MCT-Modell in Ratten und konnten zeigen, dass die

pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Reduktion der Pathologie der

PH (Neomuskularisierung pulmonaler Blutgefäße, RVH) führte. Zudem konnte eine

verstärkte Expression des Rezeptors nachgewiesen werden. Aus in vitro Experimenten ging

hervor, dass die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Verminderung der Proliferation

humaner SMC führte.

Einleitung

28

1.5 Zielsetzung

Bei der Pulmonalen Hypertonie (PH) handelt es sich um eine Erkrankung, in welcher es

durch physiologische sowie morphologische Veränderungen im Blutgefäßsystem der Lunge

zu einem Anstieg des Blutdrucks innerhalb der pulmonalen Zirkulation kommt. Die

prognostizierte Überlebensdauer für Patienten mit PH beträgt in schweren Fällen drei Jahre

ab Diagnose.

Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Auswirkungen von Pharmaka, welche im

Zusammenhang mit der Krankheit Migräne stehen, in einem Tiermodell der Pulmonalen

Hypertonie zu untersuchen.

Zwischen der Pulmonalen Hypertonie und der Migräne bestehen einige Parallelen. Die

pathologischen Prozesse beider Krankheiten betreffen vornehmlich die Blutgefäße in der

Lunge bzw. der Dura mater. Zudem scheint die Ursache im serotonergen System zu liegen.

Zur Induktion der Pulmonalen Hypertonie wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie

verwendet. Dieses Modell wurde bereits in vorherigen Arbeiten am Lehrstuhl für

Tierphysiologie in Meerschweinchen und Ratten etabliert und sollte in dieser Arbeit auf den

Organismus Maus übertragen werden. Als Maß für die Ausprägung des Phänotyps der

Pulmonalen Hypertonie wurde die Zunahme der Muskularisierung intrapulmonaler

Blutgefäße histologisch quantifiziert.

Bei den Analysen stand vor allem die Funktion des 5-HT2B Rezeptors im Vordergrund, da

diesem bereits eine Rolle sowohl in der Pathogenese der Migräne als auch der PH

zugesprochen wird. Daher sollten die Effekte der pharmakologischen Blockierung durch eine

Antagonisten (BF-1) sowie der Aktivierung des Rezeptors mittels eines Agonisten (mCPP)

untersucht werden.

Zusätzlich wurde die Expression des Rezeptors nach hypoxischer Behandlung der

Versuchstiere auf Veränderungen mittels semiquantitativer RT-PCR überprüft. Da die

zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge bisher noch unklar ist, sollte dies

durch in situ Hybridisierung und immunhistochemische Färbungen untersucht werden.

Zudem ist die Signaltransduktion des Rezeptors bisher nicht abschließend geklärt, so dass

hierzu proteinbiochemische Untersuchungen mittels Western Blot durchgeführt wurden.

Darüber hinaus wurden im Tiermodell der PH die Substanzen Sumatriptan, ein 5-HT1B

Rezeptor Agonist, und L-NAME, ein Inhibitor der Stickstoffmonoxid Synthase (NOS),

verabreicht, welche bereits in Patienten oder auch in Tiermodellen der Migräne positive

Effekte gezeigt haben. Dadurch konnten weitere mögliche Parallelen zwischen den beiden

Erkrankungen untersucht werden.

Material und Methoden

29

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1. Versuchstiere

Für die Versuche des Hypoxie-Tiermodells wurden ausschließlich Männchen des

Mausstammes NMRI im Alter von ca. zwölf Wochen verwendet. Für die Untersuchungen des

Rattenmagens wurden Tiere des Stammes Wistar verwendet. Alle Tiere wurden von der

Firma Janvier (Le Genest Saint Isle, Frankreich) bezogen und entweder direkt in den

Versuchen oder als Zuchttiere verwendet, so dass die Nachkommen in den Versuchen

genutzt wurden. Die Stallungen unterlagen einem künstlichen Tag/Nacht-Zyklus von je zwölf

Stunden. Pelletiertes Zuchtfutter sowie Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.

2.1.2 Laborgeräte

Aufrechtes Mikroskop Axioskop 2 Zeiss

Einbettungsapparatur Tissue Console Miles Scientific

Gefriermikrotom CM3050 Leica

Geldokumentationsgerät Gel Doc 2 Biometra

Geltrockner Modell 543 Bio-Rad

Inverses Mikroskop Zeiss

Laserscanner FLA-3000 Fujifilm

Mikrotom RM 2145 Leica

Monochromator Polychrom V TILL Photonics

Perfusionspumpe Typ 313S Watson Marlow

RoboCycler Gradient 96 Stratagene

Ultra Turrax T25 basic IKA Laboratories


30

2.1.3 Verbrauchsmaterial:

40 µm/100µm Cell Strainer BD Bioscience

Cellulose-Acetat Streifen Sartorius

Cover Slips Deckgläser Menzel

Hybond-N+ Nylonmembran Amersham Biosciences

Kanülen B. Braun Medical

Objektträger SuperFrost Plus Menzel-Gläser

Schnappdeckelgläser Kimble Glas, Inc.

Tissue Freezing Medium Jung

Küvetten UVette Eppendorf

PVDF-Membran Roth

2.1.4 Chemikalien

Standardchemikalien wurden in p.A. Qualität von verschiedenen Herstellern bezogen. Alle

weiteren Chemikalien befinden sich in der folgenden Liste.

3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat (DAB) Fluka

40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid 37,5:1 Bio-Rad

[α-33P] dCTP Hartmann Analytic

Agarose Eurogentec

Alkohole J.T. Baker

Ameisensäure J.T.Baker

Amidoschwarz Roth

Ammoniumperoxodisulfat AppliChem

Atemkalk Intersurgical


31

ATP Sigma

BCIP Roche

Blocking-Reagenz Roche

Bromphenolblau Roth

Chloroform J.T. Baker

Collagenlösung Beckton Dickinson

Collagenase Worthington

Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche

Coomassie AppliChem

Denhardt’s-Reagenz Sigma

Dextransulfat AppliChem

DMSO Sigma

DIG-labeling Mix Roche

EDTA Sigma

Essigsäure J.T. Baker

Essigsäureanhydrid VWR

Ethidiumbromid Roth

Euparal 3C 239 Eindeckmedium Chroma

Fluorescein Isothiocyanat Dextran Sigma

Formamid VWR

Fura-2/AM Sigma

Glycerin Riedel-de Haën

Glycin Roth

Heringssperma Sigma

HEPES Invitrogen


32

Isopentan VWR

Kalziumchlorid VWR

Ketamin Heinrich Fromm

Methylenblau Chroma

NBT Roche

Nonidet P40 AppliChem

Paraffin Sherwood Medical

Paraformaldehyd VWRTM

Phenol Roth

Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad

Proteinase K Roche

RNase Zap Invitrogen

Rinderserumalbumin Roth

Rotihistol Roth

SDS Applichem

Smart Ladder Eurogentec

Sucrose J.T. Baker

t-RNA (Hefe) Roche

T3/T7 Polymerase Roche

Taq-Polymerase Fermentas

Taq-Puffer Fermentas

TEMED Riedel-de Haën

Triethanolaminhydrochlorid Acros Organics

Trichloressigsäure J. T. Baker

Tris-base Sigma


33

Tris-HCl J.T. Baker

Triton X-100 Sigma

TRIzol Invitrogen

Trypsin Inhibitor Sigma

Tween 20 Sigma

Wasserstoffperoxid J. T. Baker

Xylazin Ceva Tiergesundheit

Xylencyanol Sigma

Kits:

Avidin Biotin Kit Vector Laboratories

Digest-All 2 Trypsin Kit Invitrogen

SMGM-2 Bullet Kit Lonza

RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas

2.1.5 Puffer und Lösungen

Perfusion und Präparation

Perfusions-Saline:

9 g NaCl

500 ml 0,2 M PB

ad 1l A. dest


34

4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA), pH 7,3 – 7,4

400 ml A. bidest

40 g Paraformaldehyd

bei max. 60°C unter Rühren lösen

2 x NaOH Plätzchen

Lösung filtrieren

500 ml 0,2 M PB

PH auf 7,3-7,4 einstellen

ad 1l A. dest

Immunhistochemie, Immunzytochemie und Western Blot

0,2 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,3:

6,35 g NaH2PO4

27,34 g Na2HPO4

ad 1l A. dest

0,01 M Phosphatpuffer-Saline (PBS), pH 7,3:

50 ml 0,2 M PB

9 g NaCl

ad 1l A. dest

0,07% DAB-Gebrauchslösung:

2 ml 7% DAB-Stammlösung

ad 200 ml 0,1 M PB

kurz vor dem Gebrauch ansetzen, rühren, filtrieren


35

TDL-Puffer

50 mM HEPES, pH 7,4

150 mM NaCl

10 mM EDTA

1% Nonidet P40

0,5% Natriumdeoxycholat

0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS)

1fach Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim)

2x Laemmli-Probenpuffer

25 mM Tris/HCl, pH 6,8

1% SDS

2% (v/v) Mercaptoethanol

10% (v/v) Glycerin

1,5% 0,5% Bromphenolblau-Lösung

Sammelgelpuffer

1 M Tris/HCl, pH 6,8

Trenngelpuffer


Laufpuffer (10x)

1,92 M Glyzin

250 mM Tris-basisch


36

Laufpuffer

100 ml 10x Laufpuffer

10 ml 10% SDS

ad 1l A. bidest

TBS-T, pH 7,6

20 mM Tris-basisch

137 mM NaCl

0,1% Tween 20

10% Polyacrylamid/SDS-Sammelgel

2,86 ml A. bidest

0,5 ml 40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid 37,5:1

0,52 ml Sammelgelpuffer

40 µl 10% SDS

4 µl N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

80 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat (APS)

Transferpuffer

100 ml 10fach Laufpuffer

200 ml Methanol

ad 1000 ml A. bidest


37

Proteinbestimmung

Amidoschwarzlösung:

1,2 g Amidoschwarz

225 ml Methanol

225 ml A. bidest

50 ml Essigsäure

Entfärbelösung:

40% Methanol

10% Essigsäure

Eluierlösung:

800 ml Essigsäure

100 ml Ameisensäure

100 ml A. bidest

10 g Trichloressigsäure

RT-PCR

TE-Puffer (10x):

0,1 M Tris/HCl, pH 7,4

0,01 M EDTA


38

Probenpuffer:

0,025% Xylencyanol

0,025% Bromphenolblau

40% Sucrose

TAE-Puffer (50fach):

242 g Tris-base

57,1 ml Essigsäure

100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0

in situ-Hybridisierung

10 x PBS (pH 7,4)

72 g NaCl

14,8 g Na2HPO4

4,3 g KH2PO4

800 ml A. bidest

pH auf 7,4 einstellen

ad 1 l A. bidest


121,1 g Tris

800 ml dH2O


ad 1 l A. bidest


39

0,5 M EDTA, pH 8,0

186,1g Ethylendinitrilotetraessigsäure x 2 H2O

800 ml A. bidest

20 g NaOH Plätzchen


ad 1 l A. bidest

Proteinase K Puffer

12,5 ml 1 M Tris/HCl, pH 7,0

2,5 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0

ad 250 ml A. bidest

100 µl Proteinase K (25 mg/ml)kurz vor der Inkubation der Schnitte hinzufügen

5 M NaOH

100 g NaOH

ad 500 ml A. bidest

Acetylierungslösung

4,6 g Triethanolaminhydrochlorid (TEA)

200 ml A. bidest

1,25 ml 5 M NaOH

ad 250 ml A. bidest

0,625 ml Essigsäureanhydrid kurz vor der Inkubation der Schnitte hinzufügen


40

1 M Na2HPO4, pH 6,5

89 g Na2HPO4 x H2O

400 ml dH2O

pH mit ortho-Phosphorsäure auf 6,5 einstellen

ad 500ml A. bidest

20 x SSC

175,3 g NaCl

88,2 g Natriumcitrat

800 ml A. bidest


ad 1 l A. bidest

50% Dextransulfat

50 g Dextransulfat

80 ml A. bidest

bei 50°C lösen

ad 100 ml A. bidest

2 x SSC

50 ml 20 x SSC

ad 500 ml A. bidest


41

Hybridisierungsmix

5000 µl Formamid

940 µl A. bidest

500 µl 1 M Na2HPO4 (pH 6,5)

2000 µl 20 x SSC

100 µl Hefe-tRNA (10 mg/ml)

1000 µl 50% Dextransulphat

200 µl 50 x Denhardt’s-Reagenz (Sigma)

250 µl Heringssperma (10 mg/ml, vor Zugabe 5 min kochen, dann abkühlen)

2 x SSC/ 50% Formamid

25 ml 20 x SSC

125 ml Formamid

ad 250 ml A. bidest

2 x SSC/ 50% Formamid

1,25 ml 20 x SSC

125 ml Formamid

ad 250 ml A. bidest

0,1 x SSC

2,5 ml 20 x SSC

ad 500 ml A. bidest


42


121,1 g Tris base

800 ml A. bidest


ad 1 l A. bidest

5 M NaCl

292,2 g NaCl

ad 1l A. bidest

Puffer 1, pH 7,5

100 ml 1 M Tris/HCl pH 7,5

30 ml 5 M NaCl

800 ml A. bidest


ad 1 l A. bidest

1 M Tris / HCl, pH 9,5

121,1 g Tris/HCl

800 ml A. bidest


ad 1 l A. bidest


43

1 M MgCl2

101,65 g MgCl2 x 6 H2O

ad 500ml A. bidest

Puffer 2

1 g Blocking-Reagenz

100 ml Puffer 1

Puffer 3, pH 9,5

100 ml 1 M Tris/HCl pH 9,5

20 ml 5 M NaCl

50 ml 1 M MgCl2

600 ml A. bidest


ad 500 ml A. bidest

Färbelösung

10 ml Puffer 3

34 µl NBT (100 mg/ml)

35 µl BCIP (50 mg/ml)


44


121,1 g Tris/HCl

800 ml dH2O


ad 1 l A. bidest

Zellkultur

Smooth Muscle Growth Medium-2

Basal Medium + Single Quots

Calcium-free Hanks‘ Solution (nach Koh et al., 1998)

125 mM NaCl

5,36 mM KCl

15,5 mM NaHCO3

0,336 mM Na2HPO4

0,44 mM KH2PO4

10 mM Glucose

2,9 mM Sucrose

11 mM Hepes

Enyzm Mix (in Calcium free Hanks’ Solution)

1,3 mg/ml Collagenase Typ II

0,5 mg/ml BSA

0,5 mg/ml Trypsin Inhibitor

0,07 mg/ml ATP


45

1 x HBSS

100 ml 10x HBSS

900ml A. bidest

steril filtrieren

2.1.6 Antikörper, Primer und Pharmakologische Subst anzen

Tab 2.1: Primärantikörper

Antigen Wirt Verdünnung Hersteller Bestellnummer

β-III Tubulin Maus 1:1000 Sigma T8660

ANO1 Kaninchen 1:250 Abcam ab53212

c-Kit Kaninchen 1:250 Santa Cruz sc-168

eNOS Kaninchen 1:1000 BD 610296

ERK (K-23) Kaninchen 1:1000 Santa Cruz sc-94

pERK (E-4) Maus 1:500 Santa Cruz sc-7383

Glattmuskelactin Maus 1:16.000 (IHC)

1:200.000 (WB) Sigma A5228

Hu C/D Maus 1:100 Invitrogen A21271

von-Willebrand-

Faktor Kaninchen 1:4000 Sigma F3520

Tab. 2.2: Seren und Sekundärantikörper

Antikörper/Serum Abkürzung Hersteller Verdünnung

biotinylierter goat anti rabbit bio-a-rb Vector Laboratories 1:300

biotinylierter horse anti mouse bio-a-ms Vector Laboratories 1:300

Peroxidase-gekoppelter sheep anti

mouse

ECL-ms GE Healthcare 1:1000

Normalserum aus Ziege NGS Vector Laboratories 7%

Normalserum aus Pferd NHS Vector Laboratories 3%

Avidin-Biotin-Komplex ABC Vector Laboratories 1:100


46

Tab. 2.3: Primer

Target Spezies Primer Sequenz Amplikon Accession

Number

5-HT2B Maus fw

rv

GGAAGCCACAGAAGACAAGC

CAGCCAAGGTGACTTCTTCC 149 bp NM_008311

ET-1 Maus fw

rv

CCAAGGAGCTCCAGAAACAG

TGTCCATCAAGGAAGAACAGG 137 bp NM_010104

HPRT Maus fw

rv

CGTGATTAGCGATGATGAACC

AATCCAGCAGGTCAGCAAAG 218 bp NM_013556

5-HT2B Ratte fw

rv

TCTCCTGATCTTCGCGGTAA

AGGGAAATGGCACAGAGATG 279 bp NM_017250

b2mg Ratte fw

rv

CCACCGAGACCGATGTATATG

GAAGATGGTGTGCTCATTGCT 199 bp NM_012512

c-Kit Ratte fw

rv

CTCCCTCATTGAGTGTGATGG

GAGTCCACGGATGTAGACACG 294 bp NM_022264

Tab. 2.4 Pharmakologische Substanzen

Substanz Abkürzung Hersteller

Adenosintriphosphat ATP AppliChem

BF-1 - Biofrontera

BW723C86 - Sigma

1-(3-Chlorphenyl)piperazin mCPP Sigma

L-NG-Nitroarginine methyl ester L-Name Sigma

Sumatriptan - Sigma

Stem Cell Factor SCF Sigma


47

2.2 Methoden

2.2.1 Tiermodell – Hypoxie

Zur Induktion der Pulmonalen Hypertonie wurden männliche Mäuse des Stammes NMRI für

einen Zeitraum von 28 Tagen in einer so genannten Hypoxiekammer gehalten. Diese

Plexiglasbox misst 90 x 30 x 65 cm (Breite x Höhe x Tiefe). Um einen Sauerstoffgehalt von

10% am Eingang der Kammer zu erreichen, wurde ein Luftgemisch aus der Umgebungsluft

und Stickstoff im Verhältnis von nahezu 1:1 hergestellt. Das Volumen des Gemisches betrug

etwa 200 l / h. Der Sauerstoffgehalt wurde permanent am Ausgang der Kammer

aufgezeichnet um aktivitätsbedingte Schwankungen sichtbar machen zu können und

sicherzustellen, dass der Sauerstoffgehalt nicht unter einen Wert von 8,5% absinkt. Am

zuleitenden Schlauch wurde der Sauerstoffgehalt mehrmals pro Woche auf den Sollwert von

10% kontrolliert.

Zur Bindung von überschüssigem CO2 wurde Atemkalk (Intersorb Plus, Intersurgical, Sankt

Augustin) verwendet. Dieser verfügte bei maximaler CO2-Bindung über eine Indikatorfärbung

und wurde bei Bedarf gewechselt. Darüber hinaus wurden in der Kammer Schalen mit

Kalziumchlorid (techn., VWR, Darmstadt) platziert, um den Gehalt der Luftfeuchtigkeit auf

50% - 70% zu halten.

Die Kammer wurde maximal einmal am Tag geöffnet, um der Tierpflege nachzukommen,

das Gewicht der Tier zu überwachen und Substanzen zu applizieren. Die Käfige der

Kontrolltiere, welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, befanden sich im

gleichen Raum.

2.2.2 Perfusion und histologische Aufarbeitung der Lunge

Zur Gewebegewinnung wurden die Tiere zuerst mit einem Gemisch aus Ketamin (0,5%,

Heinrich Fromme, Warburg) und Xylazin (0,05%, Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf) betäubt.

Nach einer zehnminütigen Wartezeit wurden die Tiere durch starkes Kneifen der Hinterpfote

auf Schmerzunempfindlichkeit geprüft. War diese gegeben, wurde ein Fellschnitt vom

Abdomen bis auf Höhe der Speicheldrüsen durchgeführt. Diese Drüsen wurden mit Pinzetten

getrennt, so dass die Trachea sichtbar wurde. Nachdem die die Trachea umgebende

Muskulatur ebenfalls mit Pinzetten entfernt wurde, wurde die Trachea über eine eingeführte

Kanüle mit 0,9% NaCl geflutet, um ein Kollabieren der Lunge bei der späteren Eröffnung der

Brusthöhle zu vermeiden. Nach etwa 20 s wurde die Trachea abgeklemmt.

Danach wurde die Bauch- bzw. Brusthöhle geöffnet und über den Lungenkreislauf

transkardial perfundiert. Dazu wurde eine Kanüle (26 G x ½´´, B. Braun Medical,

Emmenbrücke, CH) in den rechten Ventrikel eingeführt und das linke Atrium angeschnitten,


48

um den Ablauf der Flüssigkeit zu gewährleisten. Das Blut wurde für etwa 1 min mit Saline

ausgewaschen, danach wurde der Lungenkreislauf mit eiskaltem Fixativ (4% PFA)

durchspült.

Nach etwa 10 min wurde der linke Lobus entnommen und über Nacht bei 4°C

immersionsfixiert. Nach weiteren 24 h in 0,1 M PB folgte der erste Dehydrierungsschritt in

70% EtOH. In der Folge wurde weiter entwässert (je 24 h in 98% EtOH und Isopropanol).

Darauf folgte eine Inkubation von 2 h in Isopropanol bei 60°C, welches anschließend 1:1 mit

Paraffin (Sherwood Medical, Sulzbach) aufgefüllt und über Nacht bei 60°C inkubiert wurde.

Durch das darauf folgende Ersetzen des Isopropanol-Paraffin-Gemisches durch reines

Paraffin und weiteres dreimaliges Austauschen des Paraffins nach jeweils zweistündiger

Inkubation bei 60°C, wurde dem Gewebe jegliches Iso propanol entzogen. Das Gewebe

konnte schließlich in reinem Paraffin eingebettet werden. Von den Präparaten wurden am

Mikrotom (Typ RM 2145, Leica, Wetzlar) Schnitte mit einer Stärke von 7 µm angefertigt, die

auf Objektträger aufgezogen wurden. Diese wurden entweder selbst hergestellt oder von

Frau Kathrin Schuster, Frau Petra Jergolla und Frau Renate Scholl angefertigt.

2.2.3 Untersuchung auf Hypertrophie des rechten Herzventrikels

Eine Folge der Hypoxiebehandlung und Merkmal der PH ist die Hypertrophie des rechten

Herzventrikels. Um zu überprüfen, ob bei den Tieren diese Pathologie vorlag, wurde das

Herz entnommen und mit einem Frontalschnitt in zwei Teile, so dass in jedem Gewebestück

beide Ventrikel, getrennt vom Septum, zu sehen waren. Mit einer feinen Schere wurde die

rechte Herzwand abgetrennt. Die Gewebestücke wurden mit einer Feinwaage (Sartorius

Stedim Biotech S.A., Frankreich) gewogen und das Gewicht des rechten Ventrikels in

Relation zum Gewicht des linken Ventrikels sowie des Septums gesetzt (RV/LV+S).

2.2.4. Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten der Lunge

Zur Untersuchung der Muskularisierung der intrapulmonalen Blutgefäße wurden die

Gewebeschnitte mit einem Antikörper gegen Glattmuskelaktin (α-smooth muscle actin,

α-SMA, Sigma Aldrich, München) behandelt. Dafür wurden die Schnitte zunächst zweimal

10 min in Rotihistol entparaffiniert und danach in einer absteigenden Alkoholreihe (je 2 min;

dreimal Isopropanol, einmal 96%, einmal 80% und einmal 70% Ethanol) rehydriert.

Anschließend wurden die Schnitte für 15 min in 3% H2O2 (in MeOH) inkubiert. Danach

erfolgten Waschschritte in VE-H2O sowie in 0,01 M PBS für je 5 min. Daraufhin wurde eine

Trypsinlösung (0,17%, Digest All-2 Kit, Invitrogen) aufgetragen und für 10 min bei 37°C

inkubiert. Nach erneutem Waschen in 0,01 M PBS (5 min) wurde mit der Inkubation in 10%

Normalserum (normal horse serum, NHS, Vector Laboratories, Axxora, Lörrach) für 30 min

fortgefahren, wodurch unspezifische Bindestellen abgedeckt werden sollten. Nach dieser


49

Inkubation wurde der Primärantikörper (ms anti α-SMA, 1:16.000 in PBS) aufgetragen und

üN bei 4°C inkubiert.

Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Waschen mit 0,01 M PBS ein Biotin-gekoppelter

Sekundärantikörper gegen Immunglobuline der Maus (bio-anti ms, Vector Laboratories,

Axxora, Lörrach) in einer Verdünnung von 1:300 in (PBS) aufgetragen und 45 min inkubiert.

Gleichzeitig wurde der Avidin-Biotin-Komplex (ABC, Vector Laboratories, Axxora,

Lörrach, 1:1:100 in PBS) angesetzt. Die Schnitte wurden nach der Inkubation erneut dreimal

mit 0,01 M PBS gewaschen, der ABC aufgetragen und wiederum für 45 min inkubiert.

Anschließend wurde zunächst mit 0,01 M PBS und danach mit 0,1 M PB gewaschen. Zur

Detektion des Primärantikörpers diente eine Reaktion, bei der durch Substratzugabe

(3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid-dihydrat, DAB, Fluka) ein braunes Phenazinpolymer

gebildet wird. Die Reaktion wird durch Peroxidasen, welche an Biotin gekoppelt sind,

katalysiert und durch Wasserstoffperoxid verstärkt. Durch das Polymer werden die

Strukturen, gegen die sich der Primärantikörper richtet, sichtbar.

Es wurden zunächst 2 ml der 7%igen DAB-Stammlösung in 200 ml 0,1 M PB gelöst und

filtriert. In dieser Lösung wurden die Schnitte für 2 min vorinkubiert, bevor 66,6 µl

Wasserstoffperoxid hinzugegeben wurden und für weitere 4 min inkubiert wurde. In dieser

Zeit erfolgte die Braunfärbung. Die Reaktion wurde schließlich in eiskaltem 0,1 M PB

gestoppt. Daraufhin wurden die Schnitte dreimal mit VE-H2O gewaschen. Die

Gewebeschnitte wurden im Anschluss über eine aufsteigende Alkoholreihe (je 2 Min; einmal

70% EtOH, einmal 80% EtOH, einmal 98% EtOH und viermal Isopropanol) dehydriert und

mit Euparal eingedeckt.

2.2.5. Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Gewebeschnitte der Lunge

Zur histologischen Auswertung wurde ein Schnitt pro Tier verwendet. Der Schnitt wurde

unter Verwendung des 2,5x Objektivs mikroskopiert (Axioskop 2, Zeiss), komplett

abfotografiert (3 CCD Color Camera, Sony; Diskus, Hilgers, Winterberg) und digital

gespeichert.

Die Bilder wurden danach mit Hilfe des Grafikprogramms GIMP 2.0 (Open Source Freeware)

weiterbearbeitet. Mit Hilfe von Dipl. Biol. Björn Röder wurden die Stempel modifiziert, welche

in seiner Diplomarbeit verwendet wurden. So wurden runde Stempel mit einem grünen und

einem roten Quadrat von je 9 px x 9 px in der Mitte erstellt. Die Stempel hatten einen

Gesamtdurchmesser von 9 px und 18 px, was einem Durchmesser von 25 µm bzw. 50 µm

im Präparat entsprach. Mit diesen Stempeln wurden α-SMA-positive Blutgefäße markiert.


50

Zudem wurden die Flächen des Hintergrunds sowie muskularisierter Atemwege blau

markiert, um sie schließlich aus der Berechnung der Gewebefläche subtrahieren zu können.

Das Zählen der Blutgefäße sowie die Kalkulation der Gewebefläche erfolgte über ein Tool,

welches von Dipl. Biol. Björn Röder geschrieben wurde und für diese Arbeit gemeinsam

modifiziert wurde. Es wurde in der Programmiersprache Python (OpenSource Freeware)

geschrieben und nutzt das Modul Python Imaging Library sowie Teile des Pakets Image

Magick (ImageMagick Studio LLC).

Das bearbeitete Bild wird im .xcf Format gespeichert. Das Programm konvertiert das Bild in

eine .bmp Datei und scannt in der Folge die Bilddatei im Abstand von 9 px, wobei es die

grünen bzw. roten Quadrate in den Stempeln erkennt und die blaue Fläche von der

Gesamtfläche subtrahiert. Man erhält somit für jedes Bild Angaben über die Anzahl der

Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤25 µm, zwischen 26 µm - 50 µm sowie die Fläche des

untersuchten Lungengewebes in mm².

2.2.6 Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

Mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR kann die Regulation der Genexpression innerhalb

eines Gewebes auf Ebene der mRNA untersucht werden. Hierzu wird die RNA durch die

Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) übersetzt. Die anschließenden PCRs

werden mit aufsteigender Konzentration der Primer durchgeführt, sodass eine Abhängigkeit

zwischen den PCR-Produkten und der Primerkonzentration hergestellt wird. Durch einen

Vergleich dieser Abhängigkeit können Unterschiede in der Genexpression analysiert werden.

Für die Gewebepräparation wurde an den Mäusen eine zervikale Dislokation vorgenommen,

der linke Lobus der Lunge entnommen und dieser in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die

Isolierung der RNA erfolgte innerhalb einer Woche nach der Präparation. Das Gewebe

wurde dazu in 1 ml Trizol (Invitrogen, Darmstadt) /50-100 mg Gewebe homogenisiert. Nach

einer Inkubation von 5 min bei RT wurden 200 µl Chloroform/ml Trizol zugegeben. Die

Proben wurden kräftig geschüttelt und für 3 min bei RT inkubiert. Darauf folgte eine

Zentrifugation für 15 min bei 12000 rcf und 4°C. Di e obere, wässrige Phase, welche die RNA

enthält, wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur Fällung der RNA wurden 500 µl

Isopropanol/ml Trizol zur Probe gegeben. Diese wurde für 15 s geschüttelt und für 10 min bei

RT inkubiert. Um die RNA zu pelletieren wurden die Proben für 10 min bei 12000 rcf und 4°C

zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Das Pellet wurde in

sterilem 70% EtOH gewaschen und auf einem Vortex gelöst. Es folgte eine Zentrifugation für

5 min bei 7500 rcf und 4°C. Der Überstand wurde abg enommen und das Pellet im

Reaktionsgefäß mit geöffnetem Deckel getrocknet (10 - 20 min bei RT). Das Pellet wurde in

A. bidest resuspendiert und anschließend für 10 min bei 60°C inkubiert und daurch gelöst.


51

Die RNA Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Dazu wurde die RNA

1:50 in TE-Puffer verdünnt. Die Proben wurden aliquotiert und bei –20°C gelagert.

Die cDNA-Synthese wurde mit Hilfe eines Kits (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,

(Fermentas, St. Leon-Rot) durchgeführt. Es wurden 15 µg totale RNA eingesetzt. Dann

wurden 3 µl random hexamer primer zugegeben und der Ansatz auf ein Volumen von 36 µl

mit A. bidest aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 5 min bei 70°C inkubiert. Danach erfolgte die

Zugabe von 12 µl 5x Buffer M-MuLV RT, 3 µl RiboLock (20 U/µl) und 6 µl dNTP-Mix

(10 mM). Dieser Ansatz wurde für 5 min bei 25°C ink ubiert. Zuletzt wurden 3 µl Reverse

Transkriptase (RT) zugegeben. Beim Ansatz der Negativkontrolle wurde anstelle der RT

Wasser zugegeben (-RT).

Die folgenden Inkubationen wurden im RoboCycler (Stratagene, Santa Clara, CA, USA)

durchgeführt:

- 10 Min bei 25°C inkubieren



Nach der Reaktion wurden Aliqouts angefertigt, die bei –20°C gelagert wurden.

2 µl der hergestellten cDNA wurden pro Ansatz als Template verwendet. Pro Ansatz kamen

noch folgende Reagenzien hinzu:

- 2 µl 10x Taq-Puffer (+ (NH4)SO4 ; – MgCl2)

- 2 µl dNTP (2 mM)

- 1,5 µl MgCl2 (25 mM)

- 0,2 µl Taq-Polymerase (5 U/µl)

- 1 µl Referenz (forward) (2 pmol/µl)

- 1 µl Referenz (reverse) (2 pmol/µl)

- 9,3 µl A. bidest

- 1 µl Target (forward)

- 1 µl Target (reverse)

Für jede Probe wird eine Kontrolle (-RT; Zugabe von -RT statt cDNA) angefertigt.


52

Das Programm des Cyclers wurde wie folgt eingestellt:

1. 5 min 95°C

2. Denaturierung 45 s 95°C

Annealing 45 s 61°C

Elongation 15 s 72°C

Schritt 2 wurde 28x (ET-1) oder 35x (5-HT2B) wiederholt. Danach wurden die Ansätze bis

zum Auftragen auf das Gel bei 4°C gehalten.

Es wurden 3 g Agarose in 150 ml 1x TAE-Puffer gelöst und in einer Mikrowelle aufgekocht,

um ein Agarosegel (2%) herzustellen. Zu dieser Lösung wurden 10 µl EtBr (100 mg/ml)

gegeben und in eine Gelkammer mit aufgesetztem Kamm gegossen. Als Laufpuffer wurde

1x TAE-Puffer verwendet, der das komplette Gel bedeckte.

Bevor die Proben auf das Gel aufgetragen wurden, wurden 4 µl Probenpuffer (6x)

zugegeben. Um die Amplikongröße zu definieren, wurde ein DNA Marker aufgetragen

(Smart Ladder, Eurogentec, Köln). Das Gel lief bei einer konstanten Stromstärke von

120 mA. Die Aufnahmen der Gele wurden mit dem Programm Biodoc von Biometra

angefertigt.

Die Quantifizierung der PCR-Produkte erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Tina 2.09.

Die Farbe der Gelbilder wurden invertiert und die Intensität der Schwärzung der Banden

bestimmt. Dazu wurde zu jeder Primerkonzentration eine immer gleich große area of interest

verwendet und der lokale Hintergrund von jeder Bande separat abgezogen. Die Intensität der

Banden des zu untersuchenden Proteins wurde über die Intensität der Banden von HPRT

normalisiert, um das Verhältnis der Banden zu verschiedenen Primerkonzentrationen zu

erhalten. Aus den Werten ergab sich eine Ausgleichskurve. Durch Zwei-Wege ANOVA

wurde überprüft, ob sich die Genexpression im Gewebe verschiedener Versuchsgruppen

statistisch signifikant unterschied.

Modifikationen für radioaktive PCR

Die PCR wurde wie oben (siehe 2.2.6) beschrieben durchgeführt. Den Ansätzen wurden

zusätzlich 0,125 µl [α-33P] dCTP (Hartmann Analytic, Braunschweig) hinzugefügt. Dies

entsprach einer Aktivität von 1,25 µCi, bzw 46,25 KBq pro Ansatz. Das Agarosegel wurde

ohne die Zugabe von EtBr hergestellt.

Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das Gel in einem Geltrockner (Bio-Rad,

München) üN getrocknet (10 h, 60°C). Während des Tr ocknungsprozesses besteht die

Gefahr, dass DNA aus dem Gel tritt. Um dies zu verhindern wurde das Gel auf einer

Nylonmembran (Amersham Hybond–N+, GE Healthcare, München) platziert. Die


53

getrockneten Gele sowie die Nylonmembranen wurden in Frischhaltefolie verpackt, die

Image-Platte aufgelegt und in der Bio Max Kassette bei 4°C gelagert. Die Expositionsdauer

richtete sich nach der Stärke der Strahlung und betrug zwei bis drei Stunden.

Die Auswertung der Image-Platte erfolgte im Laserscanner (FLA3000, Fujifilm, Düsseldorf).

Der Scan wurde mit dem Programm Bas Reader 3.14 angefertigt, die Auswertung wurde mit

dem Programm Aida Image Analyse 4.03 durchgeführt. Dies geschah analog zur

beschriebenen Auswertung mit dem Programm Tina 2.09 (s.o.).

2.2.7 Western Blot

Das Lungengewebe für die Proteinanalyse mittels Western Blot wurde wie unter 2.2.2.

beschrieben gewonnen. Allerdings wurde lediglich das Blut mit 0,9% NaCl Lösung aus dem

Lungenkreislauf gewaschen und nicht mit 4% PFA fixiert. Das native Gewebe wurde in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und innerhalb einer Woche aufgearbeitet.

Dazu wurden die Lungen in 1 ml TDL-Puffer aufgenommen und mit Hilfe eines Ultra Turrax

(T25 basic, IKA Laboratories) homogenisiert. Nach 30 min wurden die Proben bei 12.000 rcf

für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Von dem entstande nen Überstand wurden 500 µl

abgenommen und das Pellet verworfen. Die Überstände wurden mit 500 µl zweifach

konzentriertem Laemmli-Puffer gemischt, aliquotiert und bei -20°C gelagert.

Um die Proteinkonzentration zu ermitteln, wurde eine Proteinbestimmung mit Amidoschwarz

durchgeführt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei RT. Es wurden 10 µl der Proteinlösung auf

einen Celluloseacetat-Streifen (Sartorius Stedim Biotech S.A., Frankreich) aufgetragen,

wobei zur Bestimmung des Leerwerts 10 µl Laemmli Puffer verwendet wurden. Nachdem die

Proben getrocknet waren (ca. 2 min) wurde die Membran 10 min in Amidoschwarz (Carl

Roth, Karlsruhe) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit A. bidest (je 30 s) wurde der

Streifen mit Entfärbelösung behandelt, bis die Hintergrundfärbung auf dem Streifen

verschwunden war. Der Streifen wurde getrocknet und die Bereiche, auf denen die einzelnen

Proben aufgetragen wurden, wurden aus der Membran geschnitten und in ein

Schnappdeckelglas mit 3 ml Eluierlösung überführt. Um die Teile der Streifen aufzulösen,

wurden die Gläser für 20 min auf einem Schüttler platziert. Danach wurde die Extinktion der

Proben bei 630 nm gemessen und der Messwert der Probe, die nur Laemmli-Puffer enthielt,

abgezogen. Mit Hilfe einer BSA Standardgeraden konnte nun der Proteingehalt bestimmt

werden.

Zur Proteinauftrennung wurden 10%ige Polyacrylamid-Gele mit einer Dicke von 0,75 mm

verwendet. Zwischen zwei Glassplatten wurde zuerst das Trenngel gegossenund direkt mit

A. bidest gesättigtem n-Butanol überschichtet. Nachdem das Trenngel polymerisiert war,


54

wurde das n-Butanol entfernt, das Sammelgel gegossen und der entsprechende Kamm

eingesetzt. War auch das Sammelgel polymerisiert, wurde der Kamm entfernt und das Gel in

den Puffertank gehangen. Der Tank wurde dann mit Laufpuffer gefüllt und die Proben in die

Taschen des Gels pipettiert, wobei die aufgetragene Proteinmenge 30 µg betrug. Zur

Größendetektion wurde ein Proteinmarker genutzt (Precision Plus Protein All Blue

Standards, Bio-Rad, München) Um die Proteine im Gel aufzutrennen, wurde eine

Stromstärke von 40mA für etwa 60 min angelegt. Danach wurde das Gel von den

Glasscheiben gelöst und in Transferpuffer inkubiert (10 min). Gleichzeitig wurde die

Blotmembran (PVDF-Membran, Carl Roth, Karlsruhe) für 1 min in Methanol aktiviert und

dann 10 min in Transferpuffer inkubiert. Das Blotsandwich wurde entsprechend der

Anordnung in Abb. 2.1 zusammengesetzt. Das Blotten erfolgte bei 4°C und 200 mA für

90 min.

Nach dem Blotten wurden die Bereiche der Membran, in denen sich die zu quantifizierenden

Proteine befanden, ausgeschnitten. Die restlichen Teile wurden in TBS-T Puffer überführt

und bei 4°C gelagert üN gelagert. Der andere Teil d er Membran wurde für 60 min in

Blockpuffer (BP) inkubiert. Danach wurde der BP verworfen und die Membran üN in der

Primärantikörperlösung (in BP) bei 4°C und auf eine m Schüttler inkubiert. Am nächsten Tag

wurde der Blot zunächst dreimal mit TBS-T Puffer gewaschen (2 x 5 min, 1 x 10 min) und

dann in HRP-gekoppeltem Sekundärantikörper (GE Healthcare, München) 1:1000 in BP)für

90 min bei RT und auf einem Schüttler inkubiert. Danach wurde der Blot einmal kurz in

TBS-T und dreimal in PB gewaschen (2 x 5 min, 1 x 10 min). Die Detektion des

Sekundärantikörpers erfolgte wie unter 2.2.3. beschrieben unter Verwendung der DAB-

Reaktion.

Kathode

Schwamm

Whatman

Gel

Membran

Whatman

Schwamm

Anode

Abb. 2.1: Aufbau des Blot-Sandwich


55

Dieser Teil des Blots wurde fotografiert und danach mit transparentem Klebeband mit den

restlichen Teilen zusammengefügt. Dadurch war es möglich den gesamten Blot mittels

Coomassie zu färben. Dies diente zur Quantifizierung der aufgetragenen Proteinmenge und

somit als Referenz. Die Auswertung der Blots erfolgte analog zur Auswertung der RT-PCR

(siehe 2.2.5), wobei der Wert für die zu quantifizierende Bande in Relation zum Wert der

gesamten Spur in der Coomassie-Färbung gesetzt wurde. Für eine bessere Darstellung der

Ergebnisse wurden die Gruppenwerte so normiert, dass der Wert der Kontrollgruppe den

Wert 1 erhält.

2.2.8 in situ-Hybridisierung

Mit der in situ-Hybridisierung (ISH) kann das RNA Transkript eines Proteins auf zellulärer

Ebene nachgewiesen werden. Dies sollte für den 5-HT2B Rezeptor erfolgen. Die Herstellung

der erforderlichen Plasmide erfolgte bereits in vorangegangenen Arbeiten am Lehrstuhl für

Tierphysiologie, so dass direkt mit der Sondensynthese begonnen werden konnte. Es

standen drei Plasmide mit unterschiedlichen Zielsequenzen zur Verfügung, von denen

jedoch in der Folge nur noch ein Plasmid (Plasmid 3) verwendet wurde, da mit der daraus

hergestellten Sonde die besten Ergebnisse erzielt wurden.

Alle Arbeiten erfolgten in einer möglichst RNase-freien Umgebung. Dazu wurde der

Arbeitsplatz mit RNase Zap (Sigma-Aldrich, München) gereinigt und ausschließlich sterile

Materialien verwendet.

Die ISH wurde an nativem Rattengewebe durchgeführt. Zur Betäubung der Tiere wurde ein

gemischtes Anästhetikum aus Ketamin (1,6%, Heinrich Fromme, Warburg) und Xylazin

(0,3%, Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf) verwendet. Nachdem die Tiere nachweislich

schmerzfrei waren, wurden sie mit Hilfe einer Guillotine dekapitiert. Es wurde sowohl die

Lunge als auch der verhornte Teil des Magens (Fundus) entnommen und in Tissue-Tek

Freezing Medium (Jung, Leica, Wetzlar) eingebettet. Dazu wurde Isopentan mittels

Trockeneis auf eine Temperatur von ca. -60°C abgekü hlt und das mit Einbettmeduim

überzogene Gewebe darin für etwa 30 s eingetaucht. Das Gewebe wurde bis zur

Verwendung bei -80°C gelagert. Es wurden Gefriersch nitte mit einer Stärke von 30 µm

hergestellt (Gefriermikrotom CM3050, Leica, Wetzlar). Diese wurden entweder selbst oder

von Frau Kathrin Schuster angefertigt.

Für die Synthese der RNA-Sonden wurden die Plasmide zunächst passend zur Lage der

entsprechenden T3/T7-Primersequenzen linearisiert. Danach erfolgte die Fällung der DNA

mit Hilfe der Phenol/Chloroform Methode.


56

Die Linearisierung der DNA wurde überprüft, indem 1 µl aus dem Ansatz auf ein 1%iges

Agarosegel aufgetragen wurde und mit dem Marker verglichen wurde. Zudem konnte die

Konzentration der DNA durch einen Abgleich mit dem Marker geschätzt werden. Für die

Sondensynthese wurden 1 µg DNA. Zum Ansatz wurden noch 5x Transkriptionspuffer (4 µl),

10x DIG-Labeling Mix (2 µl), T3- bzw. T7-Polymerase (2µl), sowie 0,5 µl RNase Inhibitor

(40 U/µl) zugegeben und mit A. bidest auf 20 µl aufgefüllt (sämtliche Chemikalien: Roche,

Mannheim). Die Synthese wurde für 2 h bei 37°C durc hgeführt und durch Zugabe von 2 µl

0,5 M EDTA gestoppt. Um die nicht in die Sonden eingebauten DIG-Moleküle aus dem

Ansatz zu entfernen wurde eine Dialyse durchgeführt. Dazu wurde eine Petrischale mit

A. bidest gefüllt und ein Stück Filterpapier (0,025 µm, White VSWP, Millipore, Schwalbach)

darauf ausgelegt. Die gesamte Probe wurde auf den Filter pipettiert und dann für 15 min

dialysiert. Danach wurde die Probe wieder abgenommen, 1:1 (v/v) mit Formamid verdünnt

und bei -20°C gelagert.

Zu Beginn der ISH wurden die Gewebeschnitte aufgetaut und in PBS überführt. Darauf folgte

die Inkubation in Proteinase K (für 10 min bei 37°C . Der Verdau wurde durch eine

fünfminütige Inkubation in 4% PFA gestoppt und die Schnitte danach zweimal in A. bidest

gewaschen (5 min). Danach folgte die Inkubation in der Acetylierungslösung für 10 min bei

RT. Nach zwei weiteren Waschschritten (1x 5 min PBS, 1x 5 min A. bidest) wurde der

Hybridisierungsmix aufgetragen, der jedoch noch keine Sonden enthielt. Diese Präinkubation

erfolgte bei 45°C für 30 min. Danach wurde der Hybr idisierungsmix auf die Schnitte

gegeben, welcher die entsprechenden Sonden enthielt. Diese Inkubation erfolgte bei 45°C

üN.

Am nächsten Tag erfolgten zunächst Waschschritte in SSC. Zuerst wurde zweimal in

2x SSC für 15 min gewaschen. Die weiteren Schritte wurden bei 55°C für je 15 min

durchgeführt. Zuerst wurde 2x SSC / 50% Formamid verwendet, danach erfolgte das

Waschen mit 0,1x SSC / 50% Formamid. Zuletzt wurden die Schnitte zweimal in 0,1 SSC

gewaschen. Daraufhin erfolgte eine zweifache Inkubation in Puffer 1 für je 10 min bei RT.

Zur Blockierung unspezifischer Bindestellen wurden die Schnitte dann für 30 min in Puffer 2

inkubiert. Zuletzt wurde der Antikörper gegen DIG in einer Verdünnung von 1:2000 (in

Puffer 2) aufgetragen und dieser üN auf den Schnitten belassen (4°C).

Am folgenden Tag wurden die Schnitte zunächst in Puffer 1 überführt (2x 10 min, RT). und

danach für 10 min in Puffer 3 inkubiert. Als nächstes wurde die Färbelösung aufgetragen und

die Schnitte im Dunkeln belassen. In der Folge wurden die Schnitte alle 15 min auf eine

auftretende Färbung untersucht. Zumeist dauerte die Inkubation in der Färbelösung ca. 3 h,


57

dann war eine zufriedenstellende Färbeintensität erreicht und die Reaktion wurde in

TE-Puffer abgestoppt. Zur Lagerung wurden die Schnitte luftgetrocknet und in einem

Schnittkasten aufbewahrt. Um die Schnitte mikroskopieren zu können wurde TE-Puffer

auftragen und ein Deckglas aufgelegt.

2.2.9 Immunohistochemische Färbung von Gewebeschnitten des Fundus des Rattenmagen

Zur Gewebegewinnung wurde vorgegangen wie unter 2.2.2 beschrieben, allerdings wurden

die Ratten über den linken Herzventrikel und somit über den Körperkreislauf perfundiert. Die

Schnitte wurden in einer Stärke von 9 µm angefertigt.

Die Methode der immunhistochemischen Färbung wurde im Vergleich zur unter 2.2.2

beschriebenen Vorgehensweise dahingehend geändert, dass weder Trypsin noch H2O2 zum

Einsatz kamen. Bei Bedarf erfolgte vor dem Serumblock eine Inkubation in 0,1%

Collagenase (Typ 1, Worthington, Lakewood, NJ, USA) für 10 min bei RT. Zudem wurden

Fluoreszenz-gekoppelte Sekundärantikörper verwendet (vgl. Tab 2.2). Die Schnitte wurden

in Vectashield Mounting Medium eingedeckt.

2.2.10 Anlegen der Primärkultur des Fundus des Rattenmagen

Zur in vitro Untersuchung von Zellen des Rattenfundus wurden Primärkulturen angelegt.

Dazu wurden Tiere im Alter von 4-6 Tagen verwendet. Der Kopf wurde mit einer groben

Schere abgetrennt und das Abdomen eröffnet. Der Fundus wurde mit einer feinen Schere

herausgetrennt, in Calcium-freier Hanks Lösung aufgenommen und für 20 min bei 37°C darin

equilibriert. Danach wurde der Ansatz zentrifugiert (3 min, 163 rcf), die Enzymlösung

zugegeben und für 60 min bei 37°C inkubiert.

Die Zellen wurden später auf Collagen-beschichtete Coverslips ausgesät. Dazu wurden die

Coverslips (Thermo Scientific, Menzel, Braunschweig) mit einer Collagenlösung (1 mg/ml,

Beckton Dickinson, Heidelberg) bedeckt und für 60 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die

Collagenlösung abgenommen und die Coverslips wurden dreimal mit vorher auf 37°C

erwärmtem PBS gewaschen und bis zur Verwendung im Brutschrank belassen.

Der Verdauungsansatz wurde nach der Inkubation zentrifugiert (3 min, 163 rcf) und die

Enymlösung wurde abgenommen. Das Pellet wurde in Calcium-freier Hanks Lösung

gewaschen. Dieser Schritt erfolgte dreimal. Danach wurde das Gewebe trituriert, bis eine

leicht trübe Zellsuspension entstanden war. Diese wurde zuerst mit einem 100 µm Cell

Strainer, dann mit einem 40 µm Cell Strainer von Zelltrümmern befreit. Daanch wurde die

Suspension erneut zentrifugiert und in Medium (SMGM-2, Clonetics, Lonza, Köln)

aufgenommen. Diesem wurde noch SCF (10 ng/ml, Sigma Aldrich, München) sowie

Antibiotikum (0,25% Penicillin & Streptomycin, Sigma Aldrich, München) hinzugefügt. Zuletzt


58

wurden etwa 60.000 Zellen je 30 mm Coverslip ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C und

95% O2 gehalten. Es erfolgte täglicher Mediumwechsel, wobei vor der Zugabe des frischen

Mediums mit PBS (37°C) gewaschen wurde. Ab dem zwei ten Tag wurde kein Antibiotikum

verwendet.

2.2.11 Calcium Imaging von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen

Mit der Methode des Calcium Imaging kann die funktionelle Expression von Rezeptoren

überprüft werden. Als Calcium Indikator kommt die grün fluoreszierende Substanz

Fura-2/AM (Sigma Aldrich, München) zum Einsatz. Dieses bindet an freies Calcium in der

Zelle. Kommt es zum Einstrom von Calcium ins Zytoplasma erhöht sich dementsprechend

die Menge des an Calcium gebundenen Fura-2/AM. Da dieses (340 nm) ein anderes

Exitationsmaximum als freies Fura-2/AM aufweist (380 nm), kann aus der Ratio der beiden

Wellenlängen auf die Aktivierung von Rezeptoren in Folge von Ligandenbindung

geschlossen werden.

Durch Zugabe von Fura-2/AM in das Medium (Endkonzentration 5 µM) und einer

einstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit dem Calcium Indikator beladen.

Danach wurden die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen. Daraufhin wurden die Zellen an

einem Zeiss Axiovert 200 mit Polychrom V Monochromator (Till Photonics, Gräfelfing)

gemessen. Dabei werden die Zellen im Abstand von 0,5 s alternierend bei 340 nm und 380

nm angeregt. Aus den Einzelwerten der Emissionen wird dann der Quotient gebildet

(340/380 nm), welcher Auskunft über die Calciumslevel innerhalb der Zelle gibt.

2.2.12 Immunzytochemische Färbung von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen

Die Charakterisierung der Primärkultur erfolgte immunzytochemisch. Dafür wurden die Zellen

wie unter 2.2.11 auf 10 mm Deckgläsern ausgesät und kultiviert Es wurden verschiedene

Antikörper verwendet, um die Zelltypen zu bestimmen (siehe Tab. 2.1). Die Zellen wurden

mit 4% PFA fixiert (5 min, RT) und mehrfach mit PBS gewaschen. Der Serumblock erfolgte

in 0,1% Triton-X100 (Sigma Aldrich, München) für 45-60 min (RT). Die Primärantikörper

wurden über Nacht bei 4°C inkubiert.

Am nächsten Tag wurden die Präparate zunächst dreimal in PBS gewaschen. Darauf folgte

die Inkubation im Sekundärantikörper für 45 min bei RT. Um die Zellkerne der Zellen zu

färben wurde Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, München) verwendet. Die Konzentration betrug

10 µg/ml (in PBS) und die Inkubation erfolgte für 20 min. Nach einem erneuten Waschschritt

wurden die Deckgläser mit VectaShield Eindeckmedium (Vector Laboratories, Axxora,

Lörrach) auf Objektträger aufgezogen und bei 4°C ge lagert.

2.2.13 Vitalfärbung von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen


59

Neben den immuncytochemischen Färbungen wurden auch Vitalfärbungen durchgeführt.

Zum Nachweis von ICC wurde Methylenblau (Chroma, Köngen) verwendet (Mikkelsen et al.,

1988). Dazu wurden die Zellen für 45 min mit einer 50 µM Methylenblaulösung (in Calcium-

freier Hanks Lösung) bei 37°C inkubiert. Danach erf olgten drei Waschschritte in Hanks

Lösung und die Zellen wurden in Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories,

Axxora, Lörrach) eingedeckt.

Ergebnisse

60

3. Ergebnisse

In dieser Arbeit sollte ein Tiermodell für Pulmonale Hypertonie (PH) in dem

Modellorganismus Maus etabliert und charakterisiert werden. Besonders von Interesse

waren dabei Prozesse, die im Zusammenhang mit dem 5-HT2B Rezeptor stehen. Neben

einer bereits beschriebenen Funktion bei der Entstehung der PH (Launay et al., 2002), wird

dem Rezeptor eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Migräne zugesprochen

(Johnson et al., 2003). Daher war es von besonderer Bedeutung, Substanzen, die in

Tiermodellen Migräne-ähnliche Symptome induzieren oder verhindern können, auf ihre

Wirkungsweise in der Entstehung der PH zu untersuchen.

Eines der Leitsymptome der PH, welches sowohl beim Menschen als auch bei Tieren auftritt,

stellt die Muskularisierung von unter nicht-pathologischen Bedingungen nicht

muskularisierten Blutgefäßen dar. Dieser Prozess wird als Neomuskularisierung bezeichnet

und wurde bereits in vorangegangenen Studien am Lehrstuhl für Tierphysiologie an

Meerschweinchen und Ratten untersucht. Die Untersuchung der vaskulären Remodellierung

sollte in dieser Arbeit auf den Modellorganismus Maus übertragen und durch

pharmakologische Studien erweitert werden.

3.1 Validierung des Tiermodells der normobaren Hypo xie

3.1.1. Visualisierung glatter Muskulatur in der Lun ge von Mäusen

Zur Detektion der Muskulatur pulmonaler Blutgefäße wurde ein Antikörper gegen einen

Subtypen des zytoskelettalen Proteins Aktin verwendet, welcher ausschließlich in glatten

Muskelzellen (smooth muscle cells, SMC) exprimiert wird (α-Glattmuskelaktin, smooth

muscle actin, SMA).

In Abb. 3.1 ist eine immunhistochemische Fluoreszenz-Doppelfärbung von Lungengewebe

der Maus zu sehen. Durch diese Methode wurden zwei Schichten der pulmonalen

Blutgefäße sichtbar gemacht. Mit dem Antikörper gegen SMA wurde die glatte Muskulatur

der Lunge gefärbt (A, grün), mit einem Antikörper gegen den von-Willebrand-Faktor (vWF)

wurde das Endothel markiert (B, rot). Wie aus Abb. 3.1 C ersichtlich wird, konnte die glatte

Muskulatur nicht nur in den Blutgefäßen der Lunge (BV), sondern auch in den Atemwegen,

den Bronchioli (BR), detektiert werden. Die Atemwege verfügen nicht wie Blutgefäße über

ein flaches Endothel sondern über ein hochprismatisches Epithel und waren daher auch

nicht immunpositiv für den vWF. In der Detaildarstellung (D) wird auch die Spezifität der

Antikörper deutlich. Das zum Lumen des Blutgefäßes orientierte Endothel (rot) wird von einer

kontinuierlichen Schicht glatter Muskulatur umschlossen (grün). Im Bronchiolus hingegen

fehlte die Endothelfärbung und die für diese Struktur cha

Muskularisierung wurde sichtbar (Pfeil).

Für die quantitative Auswertung der muskularisierten Blutgefäße war die Zuordnung der

pulmonalen Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen

Arteriolen statt (Stenmark et al.

einem Durchmesser von bis zu 50

Gefäßremodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der

histologischen Auswertung zu keiner Verwechslung zwischen der Muskulatur von

Blutgefäßen und Teilen der Atemwege kommen konnte. Dies war jedoch auszuschließen, da

BV

BR

Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter MuskulaturLunge von Mäusen

Die Bilder zeigen die Fluoreszenz einer immunhistochemisα-Glattmuskelaktin (SMA, A) und den vonbeiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereich(hier: Bronchiolus, BR) glatte Muskulatur tragen. Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu weist der Brochiolus kein von-WillebrandMuskelschicht in dieser Struktur diskontinuierlich vor (Pfeil).

fehlte die Endothelfärbung und die für diese Struktur charakteristische, diskontinuierliche

Muskularisierung wurde sichtbar (Pfeil).


Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen

et al., 2006). Für die Lunge der Maus waren daher Blutgefäße mit

einem Durchmesser von bis zu 50 µm von Interesse, da hier der stärkste Grad der

remodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der



R

Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter Muskulatur

Die Bilder zeigen die Fluoreszenz einer immunhistochemischen Färbung mit Antikörpern gegen A) und den von-Willebrand-Faktor (vWF, B). In der Überlagerung der

beiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereich, BR) glatte Muskulatur tragen. Im Detail (D) sieht man, dass nur Blutgefäße von

Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu Willebrand-Faktor immunpositives Endothel auf. Zudem l

Muskelschicht in dieser Struktur diskontinuierlich vor (Pfeil).

SMA

Ergebnisse

61

rakteristische, diskontinuierliche


Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen

waren daher Blutgefäße mit

µm von Interesse, da hier der stärkste Grad der

remodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der



Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter Muskulatur in der

chen Färbung mit Antikörpern gegen B). In der Überlagerung der

beiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereiche der Atemwege Im Detail (D) sieht man, dass nur Blutgefäße von

Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu Faktor immunpositives Endothel auf. Zudem liegt die

vWF

Ergebnisse

62

nur Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤50 µm über eine kontinuierliche Muskelschicht

verfügen. Bronchioli hingegen weisen in diesem Größenbereich zumeist gar keine

Muskularisierung auf, da sich die Bronchioli hier bereits zu Bronchioli terminales verzweigt

haben, welche komplett unmuskularisiert vorliegen. Selbst verhältnismäßig große

Atemwegsabschnitte mit einem Durchmesser von mehreren hundert Mikrometern (vgl. Abb.

3.1 C) zeigen lediglich eine mehrfach unterbrochene Schicht glatter Muskulatur.

Da sich die Antikörperfärbung für die Quantifizierung der vaskulären Muskulatur als geeignet

erwies, konnte mit der histologischen Untersuchung der Lungen fortgefahren werden. Dazu

wurden die Lungen immunhistochemisch gegen SMA gefärbt und muskularisierte Blutgefäße

mit einem Durchmesser ≤25 µm sowie 26 µm – 50 µm gezählt.

3.1.2 Induktion der PH

Zuerst wurde analysiert, für welchen Zeitraum die Tiere hypoxischen Bedingungen

ausgesetzt werden mussten, um die Pathologie der PH in Form der Neomuskularisierung

hervorzurufen. Dazu wurden die Tiere über einen Zeitraum von einer Woche bis zu fünf

Wochen unter hypoxischen Bedingungen (10% O2) gehalten. Als Vergleichsgruppe dienten

Tiere, die unter normoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden. Für die Untersuchung der

Neomuskularisierung wurde die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in einem Schnitt des

linken Lobus gezählt und auf die Fläche des Lungengewebes umgerechnet (siehe 2.2.5)

Das Ergebnis der Quantifizierung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem Durchmesser

≤25 µm ist in Abb. 3.2 dargestellt. Es wird ersichtlich, dass die Hypoxiebehandlung bei einer

Dauer von einer oder zwei Wochen keine Auswirkung auf die Anzahl muskularisierter

Gefäße hatte. Nach drei Wochen war ein leichter, aber nicht signifikanter Anstieg zu

verzeichnen. Erst nach vier bzw. fünf Wochen des Aufenthalts in der Hypoxiekammer konnte

in den Lungen der Tiere ein signifikanter Anstieg der Anzahl muskularisierter Blutgefäße

detektiert werden (p>0,01). Es fand jedoch keine weitere Zunahme der muskularisierten

Blutgefäße nach fünf wöchiger Hypoxiebehandlung im Vergleich zur vierwöchigen

Behandlung statt.

Ergebnisse

63

In Abb. 3.3 ist das Resultat der Zählung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem

Durchmesser von 26 µm – 50 µm zu sehen. Das Ergebnis entsprach im Wesentlichen der

vorangegangenen Quantifizierung. Auch hier zeigte sich nach einwöchiger bzw.

zweiwöchiger Hypoxiebehandlung keine Veränderung in der Anzahl muskularisierter

Blutgefäße. Bei der Tiergruppe, welche drei Wochen unter hypoxischen Bedingungen

gehalten wurde, zeigte sich eine geringe, nicht signifikante Erhöhung der Anzahl

muskularisierter Blutgefäße. Nach vier und fünf Wochen Hypoxiebehandlung konnte auch

bei den Gefäßen mit einem Durchmesser von 26 µm – 50 µm eine signifikante Zunahme der

Anzahl muskularisierter Blutgefäße festgestellt werden. Der maximale

Muskularisierungseffekt trat hier ebenfalls bereits nach vier Wochen Hypoxiebehandlung auf.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Normoxie 1 W Hypoxie

2 W Hypoxie

3 W Hypoxie

4 W Hypoxie

5 W Hypoxie

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e) ** **

Abb. 3.2: Untersuchung der Neomuskularisierung an G efäßen mit einem Durchmesser ≤25 µm in der Lunge von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Hypoxie-Behandlung

Tiere, welche eine oder zwei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Ein leichter, nicht signifikanter Anstieg war nach drei Wochen zu beobachten. Wurden die Tiere für die Dauer von vier oder fünf Wochen bei 10% O2 gehalten, zeigte sich ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,01, ANOVA). Der maximale Effekt der Behandlung war bereits nach vier Wochen eingetreten, da sich im Vergleich zur fünfwöchigen Hypoxiebehandlung keine Steigerung zeigte. (n≥5; ±SEM)

Ergebnisse

64

Somit konnte festgestellt werden, dass es bei den untersuchten Blutgefäßen durch die

Hypoxiebehandlung zu einer Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße kam. Dies

war sowohl für die kleinsten Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤25 µm als auch für

Blutgefäße mit einem Durchmesser zwischen 26 µm – 50 µm der Fall. Dabei erwies sich eine

vierwöchige Hypoxiebehandlung als optimaler Behandlungszeitraum, da hier die maximale

Ausprägung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung vorlag.

3.1.3 Rechtsherzhypertrophie nach Hypoxie-Behandlun g

Die verstärkte Muskularisierung der pulmonalen Blutgefäße in der Pathologie der PH führt zu

einer Zunahme des Gefäßwiderstands. Aufgrund des erhöhten Leistungsbedarfs des

Herzens kommt es zu einer Rechtsventrikulären Hypertrophie (RVH, right ventricular

hypertrophy). Diese lässt sich auch im Hypoxie-Tiermodell nachweisen und bietet die

Möglichkeit, die Auswirkungen der durch die Gefäßremodellierung veränderten

Lungenphysiologie zu untersuchen.

0

0,5

1

1,5

2

2,5


2 W Hypoxie

3 W Hypoxie

4 W Hypoxie

5 W Hypoxie

mus

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e)

*** ***

Abb. 3.3: Untersuchung der Neomuskularisierung an G efäßen mit einem Durchmesser von 26 µm - 50 µm in der Lunge von Mäus en zu verschiedenen Zeitpunkten nach Hypoxie-Behandlung

Tiere, welche eine oder zwei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Ein leichter, nicht signifikanter Anstieg war nach drei Wochen zu beobachten. Wurden die Tiere für die Dauer von vier oder fünf Wochen bei 10% O2 gehalten, zeigte sich ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,001, ANOVA). Der maximale Effekt der Behandlung war bereits nach vier Wochen eingetreten, da sich im Vergleich zur fünfwöchigen Hypoxiebehandlung keine Steigerung zeigte. (n≥5; ±SEM)

Ergebnisse

65

Das Ergebnis eines Vergleichs zwischen dem Gewicht der Herzen von Tieren, die vier

Wochen unter normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ist in

Abb. 3.4 dargestellt. Dabei wurde das Gewicht des rechten Ventrikels (RV) in Relation zum

Gewicht des linken Ventrikels mit dem Septum (LV+S) gesetzt. So war es möglich generelle

Gewichtsunterschiede zwischen den Herzen einzelner Tiere auszuschließen. Aus dem

errechneten Gewichtsverhältnis zeigte sich, dass durch die Hypoxiebehandlung das Gewicht

des rechten Ventrikels um etwa 50 % zugenommen hatte. Dieser Effekt ist auf die RVH

zurückzuführen. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die in dieser Arbeit induzierte

Neomuskularisierung pathologische Prozesse im Herzen nach sich zog.

3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung

Nachdem gezeigt werden konnte, dass es durch die Hypoxiebehandlung zur Ausbildung

neuer vaskulärer Muskelzellen kam (vgl. 3.1.2), war von Interesse, über welchen Zeitraum

diese zellulären Veränderungen bestehen blieben. Dazu wurden die Tiere einer

vierwöchigen Hypoxiebehandlung unterzogen und dann über variierende Zeiträume unter

normoxischen Luftbedingungen gehalten.

Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Abb. 3.5 dargestellt. Da es zwischen den beiden

untersuchten Größen von Blutgefäßen (≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm) keine signifikanten

Unterschiede gab (vgl. 3.1.2), wird in der Folge die Gesamtheit der untersuchten Blutgefäße

(≤50 µm) gezeigt.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5


RV

/LV

+S

***

Abb. 3.4: Untersuchung der Rechtsherzhypertrophie ( RVH) nach Hypoxie-Behandlung

Das Verhältnis zwischen dem Gewicht des rechten Ventrikels und des linken Ventrikels samt Septum nahm durch die Hypoxiebehandlung um etwa 50 % zu. Dies resultierte aus der Hypertrophie des rechten Ventrikels.(t-Test; ***: p<0,001;n=15; ±SEM)

Aus diesem Experiment ging hervor, dass zu keinem der untersuchten Zeitpunkte eine

Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass

die Hypoxiebehandlung etwa zu einer Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit

einem Durchmesser ≤50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen

Bedingungen hatten darauf keinen Einfluss.

Daher konnte festgehalten werden, d

eine persistierende morphologische Differenzierung der pulmonalen Blutgefäße handelte, die

bis zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung Bestand hatte.

0

0,5

1

1,5

2

2,5


mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.5: Untersuchung der Reversibilität einem Durchmesser von ≤50 µm

In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht führte. Dies war unabhängig voGruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen werden. (†:p=0,051; *:p<0,05; n=5; ±SEM)


Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass


≤50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen

Bedingungen hatten darauf keinen Einfluss.

Daher konnte festgehalten werden, dass es sich bei der neu entstandenen Muskelschicht um


bis zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung Bestand hatte.

4 W Hypoxie

4 W Hypoxie

1 W Normoxie

4 W Hypoxie

2 W Normoxie

4 W Hypoxie

3 W Normoxie

4 W Hypoxie

4 W Normoxie

Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularisierung von Blutgefäßen µm in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung

In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht führte. Dies war unabhängig vom hier untersuchten Zeitraum von bis zu acht Wochen. In diesen Gruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen werden. (†:p=0,051; *:p<0,05; n=5; ±SEM)

†

Ergebnisse

66


Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass es durch


50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen

ass es sich bei der neu entstandenen Muskelschicht um


4 W Hypoxie

4 W Normoxie

4 W Hypoxie

8 W Normoxie

der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit Hypoxiebehandlung

In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter

Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht

m hier untersuchten Zeitraum von bis zu acht Wochen. In diesen Gruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen

Ergebnisse

67

3.3 Bedeutung des 5-HT 2B Rezeptors

Sowohl in der Entstehung der Migräne als auch der PH wird dem 5-HT2B Rezeptor eine

wichtige Funktion zugesprochen (Launay et al., 2002, Johnson et al., 2003). Dies sollte in

den folgenden Versuchen mittels verschiedener Methoden überprüft werden. Darüber hinaus

sollte die Expression des Rezeptors unter hypoxischen Bedingungen geprüft sowie mögliche

Signaltransduktionswege untersucht werden.

3.3.1 Pharmakologische Inaktivierung des 5-HT 2B Rezeptors

Um die Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Entstehung der PH zu analysieren, wurde

der für diesen Rezeptor spezifische Antagonist BF-1 verwendet. Diese Substanz wurde den

Versuchstieren in drei verschiedenen Dosen (1 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg) alle 24 h

intraperitoneal während der Hypoxiebehandlung verabreicht. Durch diesen Versuchsansatz

konnte zum einen überprüft werden, ob die Blockierung des Rezeptors eine Auswirkung auf

die Entstehung der Neomuskularisierung während Hypoxiebehandlung hatte, zum anderen,

ob eine Dosisabhängigkeit bestand.

Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Abb. 3.6 dargestellt. Da es auch in diesem Versuch

keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Größen von

Blutgefäßen (≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm) gab (vgl. 3.1.2), wird in der Folge die Gesamtheit

der untersuchten Blutgefäße gezeigt.

Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass es in der Tiergruppe, der keine Substanz injiziert

wurde, zur Ausprägung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung kam. Es fand im

Vergleich zur Kontrollgruppe, welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurde,

nahezu eine Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm

statt. Dieser Effekt wurde in allen Gruppen, die BF-1 erhielten, um etwa 50 % reduziert.

Durch die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors wurde demnach der pathologische Prozess der

Neomuskularisierung zum Teil inhibiert.

Ergebnisse

68

Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die statistische Auswertung Tab 3.1 zu entnehmen.

Hier wird ersichtlich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den Tiergruppen, die BF-1

erhielten, und der Gruppe, die auch hypoxischen Bedingungen ausgesetzt war, aber keine

Substanz erhielt, bestand. Einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den

Gruppen, die BF-1 erhielten, und der Normoxie-Gruppe konnte nur bei einer Dosis von

1 mg/kg festgestellt werden. Zudem gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den

Gruppen, denen unterschiedliche Dosen BF-1 verabreicht wurden.

Normoxie Hypoxie BF-1

[1 mg/kg]

BF-1

[5 mg/kg]

BF-1

[20 mg/kg]

Normoxie - *** * n.s. n.s.

**

n.s.

Hypoxie *** - ** **

BF-1 [1 mg/kg] * ** - n.s.

BF-1 [5 mg/kg] n.s. ** n.s. - n.s.

BF-1 [20 mg/kg] n.s. ** n.s. n.s. -

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Normoxie 4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + BF-1 [1 mg/kg]

4 W Hypoxie + BF-1 [5 mg/kg]

4 W Hypoxie + BF-1 [20 mg/kg]

Anz

ahl m

usku

laris

iert

er

Blu

tgef

äße

(nor

mie

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uf N

orm

oxie

-Gru

ppe)

Abb. 3.6: Untersuchung der Beteiligung des 5-HT 2B Rezeptors an der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung

In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von BF-1 führte in allen Dosen zu einer Reduktion der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung um ca. 50 %. (Statistik siehe Tab. 3.1; n≥5; ±SEM)

Tab. 3.1: Statistische Auswertung zum Versuch ‚ Pha rmakologische Inaktivierung des 5-HT 2B Rezeptors ‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n .s.: nicht signifikant)

Die methodischen Kontrollen zu dieser Versuchsreihe sind in Abb. 3.7 dargestellt. Zum einen

musste ausgeschlossen werden, dass bereits das Lösungsmittel

10% DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.

Daher wurde hypoxisch gehaltenen Tieren alle 24 h das

Außerdem musste überprüft werden, ob BF

hatte oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führt

Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF

(20 mg/kg) verabreicht.

Aus der Abbildung geht hervor, dass weder die Injektion des

(20 mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen

Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen d

Gruppe, die das Vehicle erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,

festgestellt werden.

Daraus konnte gefolgert werden, dass die oben beschriebene Inhibition der

Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch

des 5-HT2B Rezeptors mit dem spezifischen Antagonisten BF

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Normoxie

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.7: Kontrollexperimente zur an der Neomuskularisierung von Blutgefäßen der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung

Es zeigte sich, dass weder die Injektion von BFVeränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die Injektion des Vehicles keinen Einfluss auBedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren Gruppen. (ANOVA; **: p<0,01; *:p<0,05;


musste ausgeschlossen werden, dass bereits das Lösungsmittel der Substanz (

DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.

Daher wurde hypoxisch gehaltenen Tieren alle 24 h das Vehicle injiziert.

Außerdem musste überprüft werden, ob BF-1 nur einen Effekt auf die Neomusk

oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führt

Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF

Aus der Abbildung geht hervor, dass weder die Injektion des Vehicle noch die von BF

mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen

Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen d

erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,


Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch

Rezeptors mit dem spezifischen Antagonisten BF-1 verursacht wurde.

Normoxie Normoxie + Vehicle

Normoxie + BF-1

[20 mg/kg]

Hypoxie

Kontrollexperimente zur Untersuchung der Beteiligung des 5- HTan der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung

Es zeigte sich, dass weder die Injektion von BF-1 (20 mg/kg) noch des Veränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die

keinen Einfluss auf die Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren Gruppen. (ANOVA; **: p<0,01; *:p<0,05; n≥4; ±SEM)

Ergebnisse

69


der Substanz (Vehicle,

DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.

1 nur einen Effekt auf die Neomuskularisierung

oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führte. Dazu wurde

Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF-1

noch die von BF-1

mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen

Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen der

erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,


Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch Blockierung

1 verursacht wurde.

Hypoxie + Vehicle

HT2B Rezeptors einem Durchmesser von ≤50 µm in

1 (20 mg/kg) noch des Vehicles eine Veränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die

f die Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren

Ergebnisse

70

Neben der histologischen Auswertung wurden einige Tiergruppen auf die Ausprägung der

RVH untersucht (vgl. 3.1.3). Das Ergebnis ist in Abb. 3.8 dargestellt. Es zeigte sich auch

hier, dass die Injektion von BF-1 in einer Dosis von 5 mg/kg einen reduzierenden Effekt auf

die Ausprägung der Rechtsherzhypertrophie hatte. Wie schon in der histologischen

Auswertung (siehe Abb. 3.6) konnte der Hypoxie-induzierte Effekt nicht komplett blockiert

werden, jedoch wurde er um etwa 50% verringert. So bestanden für die Gruppe, welche

unter hypoxischen Bedingungen BF-1 erhielt, statistisch signifikante Unterschiede sowohl zur

normoxisch gehaltenen Kontrollgruppe, als auch zu der Gruppe, welche unter Hypoxie

gehalten wurde, aber keine Substanz erhielt.

3.3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung bei Bl ockierung des 5-HT 2B Rezeptors

Wie unter 3.2 beschrieben, handelt es sich bei der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung

um eine stabile vaskuläre Veränderung, die zumindest über einen Zeitraum von acht

Wochen nach der Hypoxiebehandlung vorherrscht. Allerdings konnte auch gezeigt werden

(siehe 3.3.1), dass die Neuausbildung der Muskelschicht durch Behandlung mit einem

Antagonisten des 5-HT2B Rezeptors reduziert werden konnte.

Daher sollte im folgenden Experiment untersucht werden, ob durch die Blockierung des

5-HT2B Rezeptors die Reversibilität der Neomuskularisierung induziert werden konnte. Dazu

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5


RV

/LV

+S

Abb. 3.8: Untersuchung der Rechtsherzhypertrophie ( RVH) nach Hypoxie-Behandlung und Gabe von BF-1

Der relative Wert für das Verhältnis zwischen dem Gewicht des rechten Ventrikels und des linken Ventrikels samt Septum nahm durch die Hypoxiebehandlung stark zu. Dies resultierte aus der Hypertrophie des rechten Ventrikels. Durch die tägliche Gabe von BF-1 (5 mg/kg) konnte dieser Effekt reduziert, jedoch nicht komplett verhindert werden. Es bestand statistische Signifikanz lediglich für den Unterschied zwischen den normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tiergruppen. Der Mittelwert der hypoxisch gehaltenen Gruppe, welche zusätzlich BF-1 erhielt lag zwischen diesen Gruppen und wies keine statistische Signifikanz zu den anderen Tiergruppen auf. (ANOVA, n=8; ±SEM)

**

wurden die Tiere zuerst vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten. Danach

wurden sie in normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von

24 h eine Injektion (i.p.) BF-1 mit einer Dosis von 5 mg/kg.

Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.9 dargestellt. Im Vergleich zur normoxisch

gehaltenen Gruppe entwickelte sic

Muskularisierung in Blutgefäßen mit einem Durchmesser

Dadurch zeigte sich, dass ein an die Hypoxiebehandlung anschließender vierwöchiger

Aufenthalt unter normoxischen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF

keine Reversibilität der Neomuskularisierung hervorrufen konnte. Es konnte somit festgestellt

werden, dass lediglich eine Blockierung des 5

Hypoxiebehandlung die Ausbildu

ausgeprägte Neomuskularisierung kann durch die Injektion des Antagonisten nicht reduziert

werden.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Normoxie

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.9 : Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von Hypoxiebehandlung durch Blockierung des 5

Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser aufwiesen als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit zusätzlicher Gabe von BF-1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. Somit konnte die Blockierung des 5Muskelschicht erzielen. (***: p<0,001; **:p<0,01; n


normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von

1 mit einer Dosis von 5 mg/kg.


gehaltenen Gruppe entwickelte sich in allen weiteren Gruppen eine verstärkte

Muskularisierung in Blutgefäßen mit einem Durchmesser ≤50 µm.


hen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF


werden, dass lediglich eine Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der

Hypoxiebehandlung die Ausbildung einer neuen Muskelschicht verhindern kann. Eine bereits


4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + 4 W Normoxie

4 W Hypoxie + 4 W Normoxie + BF-1 [5 mg/kg]

***

: Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach

poxiebehandlung durch Blockierung des 5 -HT2B Rezeptors

Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser

als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit

1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. konnte die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors keine Reduktion der neu gebildeten

Muskelschicht erzielen. (***: p<0,001; **:p<0,01; n≥5; ±SEM)

Ergebnisse

71


normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von


h in allen weiteren Gruppen eine verstärkte


hen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF-1 (5 mg/kg)


Rezeptors während der

ng einer neuen Muskelschicht verhindern kann. Eine bereits


4 W Hypoxie + 4 W Normoxie +

1 [5 mg/kg]

: Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen in der Lunge von Mäusen nach

Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm

als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit

1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. Rezeptors keine Reduktion der neu gebildeten

Ergebnisse

72

3.3.3 Expression des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxie

Nachdem nachgewiesen werden konnte, dass der 5-HT2B eine Rolle in der Entstehung der

PH spielt, sollte die Expression des Rezeptors in der Lunge der Mäuse untersucht werden. In

nahezu allen pathologischen Zuständen kommt es zur Expressionsregulierung von

Proteinen, was häufig allerdings schon auf Ebene der mRNA erfolgt. Aus diesem Grund

wurde in dieser Arbeit die Expression der mRNA des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge von

normoxisch und hypoxisch gehaltenen Mäusen mittels der semiquantitativen Reverse

Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (sq RT-PCR) untersucht und verglichen.

Als methodische Positivkontrolle wurde die mRNA der Vorstufe (Präpro-Form) des

vasoaktiven Peptids Endothelin-1 (ET-1) analysiert. In mehreren Studien konnte eine

verstärkte Expression der mRNA von Präproendothelin-1 (ppET-1) unter Hypoxie

nachgewiesen werden (Elton et al., 1992, Li et al., 1994, Zamora et al., 1996, Nakanishi et

al., 1999). Durch diesen Vorversuch konnte zum einen kontrolliert werden, ob die

Hypoxiebehandlung erfolgreich war, zum anderen wurde geprüft, ob sich die Methode der sq

RT-PCR als geeignet zur Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors erwies.

Bei der Methode der sq RT-PCR wird die mRNA Sequenz eines Gens als Referenz

verwendet, welches unter den gegebenen Versuchsbedingungen, Normoxie und Hypoxie,

als nicht reguliert gilt. Für diesen Versuch wurde daher die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-

Transferase (HPRT) ausgewählt (Iizuka et al.,1994, Cherin et al., 2006). Die Menge des zu

quantifizierenden PCR-Produkts wurde für die Auswertung in Relation zur Menge des PCR-

Produkts der Referenz gesetzt. Durch die Verwendung aufsteigender Primerkonzentrationen

wurde sichergestellt, dass sich die PCR nicht in der Sättigung befand und die Quantifizierung

im linearen Bereich der Reaktion erfolgte.

Abb. 3.10 zeigt die Auswertung der sq RT-PCR für das Transkript von ppET-1. Hier zeigte

sich, dass mit steigender ppET-1 Primerkonzentration auch die relative Menge des PCR-

Produkts zunahm. Ein Vergleich der beiden Gruppen (Normoxie und Hypoxie) ergab, dass

an jedem Datenpunkt die relative Menge der Produkt-DNA in den Proben der Tiere, die unter

hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, höher war als in der Kontrollgruppe. Dieser

Unterschied war statistisch signifikant (t-Test, p<0,01 bzw. p<0,001).

Somit kann man sagen, dass in den Proben der Hypoxie-Gruppe mehr Ausgangsmaterial

des Transkripts (cDNA, Template) vorlag. Die Hypoxiebehandlung führte, wie erwartet, zu

einer verstärkten Expression der mRNA von ppET-1 in den Lungen der Mäuse. Dadurch war

zum einen gesichert, dass die Hypoxiebehandlung erfolgreich war, zum anderen zeigte sich

die Methode als zur Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors geeignet.

Die Messung der Expression des mRNA Tr

zur Messung des ppET-1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend

modifiziert, dass während der PCR radioaktivmarkierte dCTP in die DNA eingebaut wurden

und dieses Signal auf einer Imagerplatte sich

Sensitivität der Methode, so dass auch kleinere Expressionsunterschiede sichtbar gemacht

werden konnten.

Das Ergebnis der Quantifizierung des Transkripts des 5

dargestellt. Im Gegensatz zu ppET

Gruppen. Lediglich in der höchsten Primerkonzentration (8 pmol/ml) ist eine leichte Tendenz

für eine Hochregulation des Transkripts des 5

hohe Standardabweichung ergab sich hier, wie auch für alle anderen Datenpunkte, keine

statistische Signifikanz (t-Test). Zudem bef

Primerkonzentration schon nahe der Sättigung. S

verwendeten Methode keine veränderte Expression der mRNA des 5

Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung festgestellt werden konnte.

-50

0

50

100

150

0

% I

nte

nsi

tät

HP

RT

Normoxie

Hypoxie

Abb. 3.10: Quantifizierung des ppETHypoxiebehan dlung mittels sq RT

Es zeigte sich, dass die relative Menge des ppEThypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehalKontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der sq RT-PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden. (***: p<0,001; **:p<0,01; t

Die Messung der Expression des mRNA Transkripts des 5-HT2B Rezeptors erfolgte analog

1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend


und dieses Signal auf einer Imagerplatte sichtbar gemacht wurde. Dies erhöhte die


Das Ergebnis der Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors ist in Abb. 3.11

u ppET-1 zeigte sich hier kein Unterschied zwischen den beiden


für eine Hochregulation des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Durch die recht


Test). Zudem befand sich die PCR-Reaktion in der höchsten

Primerkonzentration schon nahe der Sättigung. Somit lässt sich festhalten, dass mit der hier

verwendeten Methode keine veränderte Expression der mRNA des 5-HT

Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung festgestellt werden konnte.

1 2 4 5

ET-1 Primer [pmol/µl]

Normoxie

Hypoxie

Quantifizierung des ppET -1 Transkripts in der Lunge von Mäusen nach dlung mittels sq RT -PCR

Es zeigte sich, dass die relative Menge des ppET-1 Transkripts in den Lungen hypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehalKontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der

PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden. (***: p<0,001; **:p<0,01; t-Test; n=5; ±SD)

Ergebnisse

73

Rezeptors erfolgte analog

1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend


tbar gemacht wurde. Dies erhöhte die


Rezeptors ist in Abb. 3.11

1 zeigte sich hier kein Unterschied zwischen den beiden


Rezeptors zu sehen. Durch die recht


Reaktion in der höchsten

omit lässt sich festhalten, dass mit der hier

HT2B Rezeptors in der

6

in der Lunge von Mäusen nach

1 Transkripts in den Lungen hypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehaltenen Kontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der

PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden.

Ergebnisse

74

3.3.4 Signaltransduktion des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxie

Die intrazellulären Signalwege, welche in Folge der Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors

auftreten, sind weitestgehend unbekannt. In bisherigen Studien wurden zumeist Zelllinien

verwendet, die nicht zwangsläufig die nativen Signalwege des Rezeptors widerspiegeln, da

sie möglichweise nicht über die nötigen Interaktionspartner verfügen.

In dieser Arbeit wurden Proteinlystate der Lunge mittels Western Blot untersucht und die

Expression verschiedener Proteine untersucht. Um Rückschlüsse auf die intrazelluläre

Kopplung des 5-HT2B Rezeptors ziehen zu können, wurde neben Tiergruppen, die unter

normoxischen und hypoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden, eine Gruppe verwendet,

deren Tiere während der Hypoxiebehandlung Injektionen von BF-1 in einer Dosis von

5 mg/kg erhielt. Dadurch konnte die Auswirkung der Blockierung des 5-HT2B Rezeptors auf

das Zielprotein überprüft werden.

Wie unter 3.1.3 beschrieben führte die Blockade des 5-HT2B Rezeptors durch BF-1 (5mg/kg)

zu einer Verminderung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung. Daher ist die

Aktivierung des Rezeptors essentiell für die Ausprägung der vaskulären Remodellierung.

Dementsprechend sollten die Signalwege, welche durch den 5-HT2B Rezeptor initiiert

werden, unter hypoxischen Bedingungen aktiviert sein. Gleichzeitig führt die Blockierung des

Rezeptors durch den Antagonisten dazu, dass die Signalwege gehemmt werden. Durch die

-50

0

50

100

150

200

250

300

350

0 1 2 4 6 8

% I

nte

nsi

tät

HP

RT

5-HT2B Primer [pmol/µl]

Normoxie

Hypoxie

Abb. 3.11: Quantifizierung des Transkripts des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung mittels sq RT-PCR

Die sq RT-PCR ergab, dass sich die relative Menge des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere nicht unterschied. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte festgestellt werden, dass es zu keiner Veränderung der Expression des 5-HT2B Rezeptors auf mRNA Ebene durch die Hypoxiebehandlung kam. (t-Test; n=5; ±SD)

Verwendung der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über

potentielle Signaltransduktionswege möglich sein.

Von besonderem Interesse waren dabei die

eine mögliche Kopplung dieser mit dem 5

2003; Li et al., 2008). Es existieren zwei Formen der ERK

(p42 MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie

Differenzierung und Proliferation

et al., 2011), wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im

Einklang mit den bisher beschriebenen Funktionen stehen würde.

Um die ERK zu aktivieren, muss eine Phosphorylierung

TEY-Motivs erfolgen (Roux & Blenis, 2004)

phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen

und der inaktiven Form der ERK unterschieden können.

Als methodische Positivkontrolle wurde die Expression von

beschriebenen Tiergruppen untersucht. Da die Blockierung des 5

Verminderung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die

Reduktion der Expression von α

Abb. 3 .12: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression von

Bei der Detektion von erwartet eine Bande bei 43 kDa. Die Intensität der Banden ist in den Proben der Normoxiefolgt die Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF(5 mg/kg) erhielt. Am kräftigsten wirken die Banden bei den Proben der Tiere, welche während des Aufenthalts in hypoxischen Verhältnissen keine Substanz erhielten.

der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über

potentielle Signaltransduktionswege möglich sein.

Von besonderem Interesse waren dabei die extracellular signal-regulated kinases

eine mögliche Kopplung dieser mit dem 5-HT2B in der Literatur beschrieben ist (Nebigil

Es existieren zwei Formen der ERK: ERK1 (p44 MAPK) sowie ERK2

MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie

Differenzierung und Proliferation (Johnson & Lapadat, 2002; Zhan et al.

wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im

Einklang mit den bisher beschriebenen Funktionen stehen würde.

Um die ERK zu aktivieren, muss eine Phosphorylierung innerhalb des konservierten

Roux & Blenis, 2004). Zur Detektion der ERK und ihrer

phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen

der ERK unterschieden können.

sche Positivkontrolle wurde die Expression von α-Glattmuskelaktin in den oben

beschriebenen Tiergruppen untersucht. Da die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors

induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die

duktion der Expression von α-Glattmuskelaktin im Western Blot detektierbar sein.

.12: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression von α-Glattmuskelaktin

Bei der Detektion von α-Glattmuskelaktin entstand wie erwartet eine Bande bei 43 kDa. Die Intensität der Banden ist in den Proben der Normoxie-Gruppe am schwächsten. Darauf folgt die Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF-1

mg/kg) erhielt. Am kräftigsten wirken die Banden bei den der Tiere, welche während des Aufenthalts in

hypoxischen Verhältnissen keine Substanz erhielten.

Ergebnisse

75

der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über

regulated kinases (ERK), da

in der Literatur beschrieben ist (Nebigil et al.,

MAPK) sowie ERK2

MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie

et al., 2003; Nagarajan

wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im

innerhalb des konservierten

. Zur Detektion der ERK und ihrer

phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen der aktiven

Glattmuskelaktin in den oben

Rezeptors zu einer

induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die

Glattmuskelaktin im Western Blot detektierbar sein.

Ergebnisse

76

Abb. 3.12 zeigt einen Ausschnitt der Blotmembran, auf welcher ein Antikörper gegen

α-Glattmuskelaktin nachgewiesen wurde. Hier wird ersichtlich, dass die Intensität der

Banden von Proben der Normoxie-Gruppe schwächer war, als in denen von Hypoxie-

behandelten Tieren. Die Banden der Proben von Tieren, welche während der

Hypoxiebehandlung BF-1 erhielten, erschienen leicht schwächer, als bei den Proben der

Tiere, die keine Substanz erhielten.

Um eine Aussage über die Expression treffen zu können, musste die Proteinmenge der

einzelnen Spuren auf den Blotmembranen bestimmt werden. Dazu wurden die kompletten

Membranen, nachdem ein Bild der zu quantifizieren Banden (hier: α-Glattmuskelaktin)

aufgenommen wurde, mit Coomassie gefärbt. Mittels des Programms TINA 2.0 konnte die

optische Dichte der Färbung auf der Membran bestimmt werden. Somit konnte die Intensität

der zu quantifizierenden Banden in Relation zur Gesamtproteinmenge einer Spur des Blots

gesetzt und dadurch normiert werden.

0

0,5

1

1,5

2

2,5


Ban

deni

nten

sitä

t (n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e) *

Abb. 3.13: Quantifizierung der Expression von α-Glattmuskelaktin in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung und Gabe de s 5-HT2B Rezeptor Antagonisten BF-1

Der Western Blot bestätigte das Ergebnis der histologischen Auswertung (vgl. 3.3.1) dahingehend, dass die Expression von α-Glattmuskelaktin durch die Hypoxiebehandlung zunahm (Faktor ca. 1,6), und dass es durch die Blockierung des 5-HT2B.Rezeptors zu einer Reduktion der Menge von glatter Muskulatur in der Lunge kam. Ein statistisch signifikanter Unterschied bestand lediglich zwischen der Gruppe normoxisch gehaltener Tiere und der Gruppe, welche unter hypoxischen Bedingungen keine Substanz erhielt. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (ANOVA, *: p<0,05, n=8; ±SEM)

Das Ergebnis der Quantifizierung von

geht hervor, dass sich das Ergebnis aus der

sich ein signifikanter Unterschied zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren

heraus (ANOVA, p<0,05). In der Gruppe, welche zur Hypoxiebehandlung zusätzlich

Injektionen von BF-1 (5 mg/kg) erhielt, w

Vergleich zur Hypoxie-Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch

signifikant. Trotzdem zeigte sich die Methode als geeignet, um die Expression von ERK

sowie pERK in den verschiedenen Tiergru

Für die Quantifizierung der Express

zwei verschiedene Antikörper eingesetzt. Beide konnten sowohl ERK 1 als auch ERK 2

detektieren. Allerdings besaß nur einer der Antikörper die Fähig

Formen zu erkennen. Somit war es möglich sowohl die inaktive Form (ERK) als auch die

aktive Form (pERK) in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.

Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in

sehen. Mit dem verwendeten Antikörper konnten sowohl die ERK1 als auch die ERK2

nachgewiesen werden. Die ERK1

werden, die ERK2-Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität d

ERK1-Banden war im Vergleich zu den ERK2

einzelnen Gruppen konnten allerdings keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt

werden.

Abb. 3.15 zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der

Mäuselungen. In den Proben der Hypoxie

auch für ERK 2 eine um etwa 20% verminderte Proteinmenge im Vergleich zur

Abb. 3.14 : Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n

Nach der Detektion des ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1Vergleich zu den ERK2-Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konntder Blotmembran keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt werden.

ERK1

ERK2

Das Ergebnis der Quantifizierung von α-Glattmuskelaktin ist in Abb. 3.13 abgebildet. Daraus

geht hervor, dass sich das Ergebnis aus der histologischen Auswertung bestätigte.



mg/kg) erhielt, war die Expression des α-Glattmuskelaktins im

Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch


sowie pERK in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.

Für die Quantifizierung der Expression der ERK sowie der phosphorylierten Formen wurden


detektieren. Allerdings besaß nur einer der Antikörper die Fähigkeit die phosphorylierten


aktive Form (pERK) in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.

Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in


nachgewiesen werden. Die ERK1-Banden konnten wie erwartet bei 44

Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität d

Banden war im Vergleich zu den ERK2-Banden etwas stärker, zwischen den


zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der

Mäuselungen. In den Proben der Hypoxie-behandelten Tiere konnte sowohl für die ERK1 als


: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n ERK

ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1

Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konntder Blotmembran keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt werden.

Ergebnisse

77

Glattmuskelaktin ist in Abb. 3.13 abgebildet. Daraus

histologischen Auswertung bestätigte. Es stellte



Glattmuskelaktins im

Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch


ion der ERK sowie der phosphorylierten Formen wurden


keit die phosphorylierten


Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in Abb. 3.14 zu


Banden konnten wie erwartet bei 44 kDa detektiert

Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität der

Banden etwas stärker, zwischen den


zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der

behandelten Tiere konnte sowohl für die ERK1 als


ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1-Banden war im

Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konnten bei Betrachtung

Ergebnisse

78

Kontrollgruppe beobachtet werden. Aufgrund des geringen Unterschieds und der Streuung

der Messwerte war dieser Unterschied jedoch nicht statistisch signifikant (n=7, ANOVA).

Daher zeigte sich hier lediglich ein Trend für das reduzierte Vorliegen der nicht

phosphorylierten ERK Formen nach Hypoxiebehandlung. In den Proben der Tiere, welche

während der Hypoxiebehandlung BF-1 (5 mg/kg) erhielten, konnte eine mit der

Kontrollgruppe vergleichbare Menge der ERK detektiert werden.

In Abb. 3.16 ist ein repräsentativer Ausschnitt einer Blotmembran nach der Detektion mit

dem Antikörper gegen pERK dargestellt. Auch hier konnte sowohl die Form bei 44 kDa

(pERK1) als auch die Form bei 42 kDa (pERK2) nachgewiesen werden. Die Intensität der

pERK1-Banden war im Vergleich zu den pERK2-Banden wie schon bei der Detektion von

ERK etwas höher. Die Banden waren in den Proben der Hypoxie-behandelten Tiere am

stärksten, wohingegen die Banden der Proben aus den anderen Gruppen etwas schwächer

erschienen.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4


4 W Hypoxie +

BF-1 [5 mg/kg]


4 W Hypoxie +

BF-1 [5 mg/kg]

ERK1 (p44) ERK2 (p42)

Ban

deni

nten

sitä

t (n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.15: Quantifizierung der Expression von ERK i n der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung und Gabe des 5-HT 2B Rezeptorantagonisten BF-1

Der Quantifizierung der Western Blots zur Analyse der ERK zeigte, dass sowohl für ERK1 als auch ERK2 eine reduzierte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxie-Gruppe gefunden wurde. Die Differenz zu den Proben der normoxisch gehaltenen Kontrollgruppe betrug etwa 20%, wobei keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA). Die Werte der Proben von den Tieren, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und BF-1 erhielten, lagen im Bereich der Werte der Kontrolltiere. Jedoch war auch hier der Unterschied zur Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung nicht den 5-HT2B Rezeptor Antagonisten erhielt, zu gering, so dass keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Somit handelte es bei der reduzierten Proteinmenge der ERK in der Hypoxie-Gruppe lediglich um einen Trend. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (ANOVA, n=7; ±SEM)

Das Ergebnis der Quantifizierung

Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinme

pERK war in den Proben hypoxisch gehaltener Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe und der

Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF

Allerdings war auch hier der Unterschied nicht statistisch signifikant (n

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6


pERK1 (p44)

Ban

deni

nten

sitä

t (n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

pERK1

pERK2

Abb. 3.16 : Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n

Nach der Detektion des pERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Antikörpers zwei Banden sichtbar. Die Intensität der ERK1Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der Hypoxie-behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.

Abb. 3.17: Quantifizierung der Expression von pHypoxiebehan dlung und Gabe des 5

Die Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% erhöhte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxiegefunden wurde. Dabei lag keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA)Tiere, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und Bder Werte der Kontrolltiere. Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie(ANOVA, n=7; ±SEM)

Das Ergebnis der Quantifizierung der pERK ist in Abb. 3.17 gezeigt. Hier verhielt sich das

Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinme


Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF-1 (5 mg/kg) erhielt, um ca. 20% erhöht.

Allerdings war auch hier der Unterschied nicht statistisch signifikant (n=7, ANOVA).

4 W Hypoxie

4 W Hypoxie +

BF-1 [5 mg/kg]

NormoxieHypoxie

pERK1 (p44) pERK2 (p42)

: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n pERK

ERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Antikörpers zwei Banden sichtbar. Die Intensität der ERK1-Banden war im Vergleich zu den ERK2Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der

behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.

Quantifizierung der Expression von p ERK in der Lunge von Mäusen nach dlung und Gabe des 5 -HT2B Rezeptorantagonisten BF-1

Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% erhöhte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxie-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden wurde. Dabei lag keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA). Die Werte der Proben der Tiere, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und BF-1 erhielten, lagen im Bereich

Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren.

Ergebnisse

79

der pERK ist in Abb. 3.17 gezeigt. Hier verhielt sich das

Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinmenge der


1 (5 mg/kg) erhielt, um ca. 20% erhöht.

=7, ANOVA).

4 W Hypoxie

4 W Hypoxie +

BF-1 [5 mg/kg]

pERK2 (p42)

ERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Banden war im Vergleich zu den ERK2-

Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.

in der Lunge von Mäusen nach

Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe

. Die Werte der Proben der 1 erhielten, lagen im Bereich

Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt Färbung der kompletten Laufspuren.

3.4. Wirkungs weise von Migräne

3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid

Die Bedeutung der endothelialen NO

bereits beschrieben (Johnson

Aktivierung des 5-HT2B Rezeptor

(NO) führt (Schmuck et al., 1996

werden, dass die Inhibition sowohl des

Plasmaproteinextravasation verhindern konnte (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Da

in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5

verminderten Neomuskularisierung führt (siehe

Inhibition der NOS auch im Tiermodell der PH zu untersuchen.

Vorab wurde mittels Western Blot überprüft, ob unter hypoxischen Bedingungen eine

Expressionsveränderung der eNOS stattfindet. Die Auswert

Abb. 3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung

tendenziell zu einer verstärkten Expression der eNOS kam.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Ban

deni

nten

sitä

t(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb.3.18: Quantifizierung der Expression von eNOS von Mäusen nach Hypoxiebehan

Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch die HypoxiebehaCoomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (tn=9; ±SEM)

weise von Migräne -assoziierten Pharmaka in der PH

3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid -Synthase durch L-NAME

endothelialen NO-Synthase (eNOS) wurde für das Migräne

bereits beschrieben (Johnson et al., 2003). Es konnte bereits gezeigt werden, dass die

Rezeptor zu einer verstärkten Freisetzung von Stickstoffmonoxid

, 1996). Gleichzeitig konnte im Tiermodell der Migräne gezeigt

werden, dass die Inhibition sowohl des 5-HT2B Rezeptors als auch der NOS die


in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5

Neomuskularisierung führt (siehe 3.3.1), war es von großem Interesse, die

Inhibition der NOS auch im Tiermodell der PH zu untersuchen.


Expressionsveränderung der eNOS stattfindet. Die Auswertung dieses Vers

3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung

tendenziell zu einer verstärkten Expression der eNOS kam.

Normoxie Hypoxie

Quantifizierung der Expression von eNOS in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehan dlung mittels Western Blot

Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch die Hypoxiebehandlung nahe. Die Normierung erfolgte gegen eine

Färbung der kompletten Laufspuren. (t-Test; †: p=0,053,

Ergebnisse

80

Synthase (eNOS) wurde für das Migräne-Tiermodell

konnte bereits gezeigt werden, dass die

zu einer verstärkten Freisetzung von Stickstoffmonoxid

). Gleichzeitig konnte im Tiermodell der Migräne gezeigt

s als auch der NOS die


in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5-HT2B zu einer

3.3.1), war es von großem Interesse, die


ung dieses Versuchs ist in

3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung

in der Lunge

Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch

ndlung nahe. Die Normierung erfolgte gegen eine : p=0,053,

Durch die hohe Streuung der Messwerte ergab sich nach der statistischen Prüfung keine

statistische Signifikanz (t-Test, p=0,

der Mittelwert für die Hypoxie-

hoch lag. Dies legt den Schluss nahe, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer

verstärkten Expression der eNOS kam.

Um die Bedeutung der NOS

Substanz NG-Nitro-L-Arginin

10 mg/kg, 20 mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht

Inhibitor (Kubes et al., 1991; Moore

normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen im Rhythmus von 24 h statt.

Das Ergebnis der Auszählung muskularisierte Blutgefäße ist in Abb. 3.19 zu sehen. Hieraus

wurde ersichtlich, dass die Injektion von L

der Blutgefäße mit einem Durchmesser

die höchste Dosis L-NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein

Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleic

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Normoxie Normoxie + 20 mg/kg L-

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.19: Untersuchung der Beteiligung Blutgefäßen mit einem Durchmesser von Hypoxiebehandlung durch Inhibition mittels L

In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA). Die tägliche Applikation von Lvon der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einhypoxisch bedingten Neomuskularisierung. (


Test, p=0,053). Es war allerdings ein klarer Trend erkennbar, da

-behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe doppelt so


eNOS kam.

Um die Bedeutung der NOS in der PH genauer zu untersuchen, wurde den

Arginin-methylester (L-NAME) in verschiedenen Dosen (1

mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht

, 1991; Moore et al., 1993). Die Injektion (i.p.) fand täglich sowohl unter



wurde ersichtlich, dass die Injektion von L-NAME keinen Einfluss auf die Muskularisierung

der Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm hatte. So bestand zwischen der Gruppe, die

NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein

Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleic

Normoxie + 20 mg/kg

-NAME

4 W Hypoxie 4 W Hypoxie +

1 mg/kg L-NAME

4 W Hypoxie +

10 mg/kg L-NAME

Untersuchung der Beteiligung der NOS an der Neomuskularisierung von einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach

durch Inhibition mittels L -NAME

In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter

Blutgefäße (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA). Die tägliche Applikation von L-NAME führte unabhängig von der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einhypoxisch bedingten Neomuskularisierung. (**: p<0,01; *:p<0,05; n≥4; ±SEM)

Ergebnisse

81


053). Es war allerdings ein klarer Trend erkennbar, da

behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe doppelt so


genauer zu untersuchen, wurde den Tieren die

NAME) in verschiedenen Dosen (1 mg/kg,

mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht-selektiven NOS-

, 1993). Die Injektion (i.p.) fand täglich sowohl unter



auf die Muskularisierung

50 µm hatte. So bestand zwischen der Gruppe, die

NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein

Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleichzeitig existierten

4 W Hypoxie +

10 mg/kg NAME

4 W Hypoxie +

20 mg/kg L-NAME

an der Neomuskularisierung von in der Lunge von Mäusen nach

In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter

NAME führte unabhängig von der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einer Veränderung der

Ergebnisse

82

statisch signifikante Unterschiede (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA) zwischen den Gruppen, die

in der Hypoxiekammer gehalten wurden und den unter normoxischen Luftverhältnissen

gehaltenen Tieren. Demnach kam es zur bereits beschriebenen Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung der pulmonalen Blutgefäße. Dieser Prozess war allerdings unabhängig

von der Gabe von L-NAME. Dies lässt den Schluss zu, dass die NOS keine Bedeutung für

die Entstehung der neuen vaskulären Muskelschicht hatte.

3.4.2 Aktivierung des 5-HT 1B Rezeptors durch Sumatriptan

Die am häufigsten verwendeten Medikamente zur akuten Migränebekämpfung stellen die

Triptane dar. Sie entfalten ihre Wirkung über 5-HT1B/1D Rezeptoren. Die Stimulation des

5-HT1B Rezeptors führt zu einer Vasokonstriktion duraler Blutgefäße (Tfelt-Hansen et al.,

2000). Durch Aktivierung von 5-HT1D Rezeptoren wird die Ausschüttung

proinflammatorsicher Neuropeptide reduziert (Buzzi & Moskowitz, 2005). Im Tiermodell der

Migräne vermögen Triptane die 5-HT2B-induzierte Plasmaproteinextravasation zu blockieren

(Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Daher war es von Interesse, die Wirkung des

5-HT1B/D Rezeptor Agonisten im Tiermodell der PH zu erforschen. Dabei war die Wirkung an

5-HT1D Rezptoren zu vernachlässigen (Keegan et al., 2001, siehe auch 4.3.2).

Dazu wurde den Tieren Sumatriptan in einer Dosis von 1 mg/kg sowohl unter normoxischen

als auch hypoxischen Bedingungen im Abstand von 24 h injiziert (i.p.). Im Anschluss wurden

die Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm quantifiziert.

Das Ergebnis der Zählung der muskularisierten Blutgefäße ist in Abb. 3.20 dargestellt. Da es

hier einen bedeutenden Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen untersuchter

Blutgefäße gab, sind die Werte für die kleinsten Blutgefäße (Durchmesser ≤25 µm) und die

etwas größeren Blutgefäße (26 µm – 50 µm) getrennt angegeben.

Abb. 3.20 A zeigt die Quantifizierung der muskularisierten Blutgefäße mit einem

Durchmesser von ≤25 µm. Daraus geht hervor, dass die Gabe von Sumatriptan unter

normoxischen Bedingungen keinen Einfluss auf die vaskuläre Muskulatur hatte. Die Anzahl

der muskularisierten Blutgefäße blieb nahezu unverändert. Anders verhielt es sich, wurden

die Tiere unter Hypoxiebedingungen gehalten. In der Gruppe, die keine pharmakologisch

aktive Substanz erhielt, zeigte sich eine Vermehrung muskularisierter Blutgefäße um den

Faktor 2,7. Erhielten die Tiere Sumatriptan stieg der Wert um den Faktor 5 im Vergleich zu

den Kontrolltieren. Die Gabe des 5-HT1B/1D Rezeptor Agonisten verstärkte somit den

Hypoxieeffekt und führte zu einer Verstärkung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung.

Ergebnisse

83

0

1

2

3

4

5

6

7

Normoxie Normoxie + Sumatriptan

1 mg/kg

4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + Sumatriptan

1 mg/kg

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Normoxie Normoxie + Sumatriptan

1 mg/kg

4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + Sumatriptan

1 mg/kg

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

A

B

Abb. 3.20: Untersuchung der Rolle des 5-HT 1B Rezeptors im Tiermodell der Pulmonalen Hypertonie durch Gabe des spezifischen R ezeptor Agonisten Sumatriptan

(A) Blutgefäße ≤25 µm: In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von Sumatriptan führte unter hypoxischen Bedingungen zu einer starken Zunahme muskularisierter Blutgefäße (Faktor 5). Die Applikation des 5-HT1B/1D Rezeptor Agonisten hatte bei Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, keinen Einfluss auf die vaskuläre Muskularisierung. (B) Blutgefäße 26 µm – 50 µm: Es zeigte sich die gleiche Tendenz wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings fiel der Sumatriptan-vermittelte Effekt in der Hypoxie-Gruppe etwas geringer aus (Faktor 3). Auch die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung war etwas schwächer (Faktor 2) (n≥6; ±SEM).

Ergebnisse

84

In Abb. 3.20 B ist das Ergebnis der Zählung der muskularisierten Blutgefäße mit einem

Durchmesser von 26 µm – 50 µm dargestellt. Hier zeigte sich im Wesentlichen der gleiche

Effekt wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings war er nicht so stark ausgeprägt. So rief

Sumatriptan in der hypoxisch gehaltenen Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine

Neomuskularisierung um den Faktor 3 hervor, wohingegen der 5-HT1B/1D Rezeptor Agonist

keine Auswirkung auf die Muskularisierung in der Lunge von Tieren hatte, die unter

normoxischen Bedingungen gehalten wurden. Die Gruppe, welche zwar unter

Hypoxiebedingungen lebte, aber nicht Sumatriptan erhielt, wies eine verdoppelte Anzahl

muskularisierter Blutgefäße der Größe 26 µm – 50 µm im Vergleich zur Kontrollgruppe auf.

Die statistische Auswertung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Tab. 3.2 gegeben.

Daraus geht hervor, dass alle beschriebenen Unterschiede zwischen den Gruppen

statistische Signifikanz aufwiesen. Die Zunahme der Muskularisierung nach

Hypoxiebehandlung und Sumatriptanapplikation zeigte im Vergleich zu den Kontrollgruppen

die höchste Signifikanz (p<0,001). Dies war für beide untersuchten Blutgefäßgrößen der Fall.

Die Differenz zur Gruppe, die ebenfalls unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde,

jedoch keine Substanz erhielt, war ebenfalls signifikant (p<0,01 bzw. p<0,05). Während sich

für diese Hypoxie-Gruppe statistisch signifikante Unterschiede zu den beiden Normoxie-

Gruppen bestätigten (p<0,01 bzw. p<0,05), war dies für die Kontrollgruppen nicht der Fall.

Normoxie

Normoxie +

Sumatriptan Hypoxie

Hypoxie +

Sumatriptan

≤25 µm

Normoxie - n.s. ** ***

Normoxie +

Sumatriptan n.s. - ** ***

Hypoxie ** ** - **

Hypoxie +

Sumatriptan *** *** ** -

26 µm

–

50 µm

Normoxie - n.s. ** ***

Normoxie +

Sumatriptan n.s. - * ***

Hypoxie ** * - *

Hypoxie +

Sumatriptan *** *** * -

Tab. 3.2: Statistische Auswertung zum Versuch ‚Akti vierung des 5-HT 1B Rezeptors durch Sumatriptan‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n.s.: nicht signifikant)

Ergebnisse

85

3.4.3 Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors durch mCPP

Nachdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Inhibition des 5-HT2B Rezeptors

die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung in den Blutgefäßen der Lunge vermindern

konnte (siehe 3.3.1), sollte überprüft werden, welche Auswirkungen die dauerhafte

pharmakologische Aktivierung des Rezeptors nach sich zieht. Damit konnte zudem überprüft

werden, ob der 5-HT2B unter hypoxischen Lebensbedingungen ebenfalls dauerhaft stimuliert

wird.

Auch bei diesem Versuchsansatz besteht eine Verbindung zur Pathogenese der Migräne. Es

konnte gezeigt werden, dass die Substanz 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP) beim

Menschen Migräne auslösen kann (Brewerton et al., 1988). Darüber hinaus löst dieses

Piperazin-Derivat im Tiermodell eine Plasmaproteinextravasation (PPE) aus (Johnson et al.,

2003; Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Es konnte bereits gezeigt werden, dass

mCPP als Agonist am 5-HT2B Rezeptor wirkt (Wainscott et al., 1993; Porter et al., 1999;

Martin & Martin, 2001). Daher wurde den Tieren während der Hypoxiebehandlung täglich

mCPP i.p. in einer Dosis von 1 mg/kg injiziert.

Das Resultat der Zählung muskularisierter Blutgefäße ist in Abb. 3.21 dargestellt. Da es hier

wie schon nach Verabreichung von Sumatriptan (siehe 3.4.2) einen bedeutenden

Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen untersuchter Blutgefäße gab, sind die

Werte für die kleinsten Blutgefäße (≤ 25 µm) und die etwas größeren Blutgefäße

(26 µm - 50 µm) gesondert angegeben.

Abb. 3.21 A zeigt das Ergebnis der Zählung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem

Durchmesser von ≤25 µm. Daraus geht hervor, dass die Gabe von mCPP (1 mg/kg) bereits

unter normoxischen Bedingungen einen Einfluss auf die vaskuläre Muskulatur hatte. Die

Anzahl der muskularisierten Blutgefäße befand sich auf dem Niveau der Hypoxie-Gruppe

und war im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) etwa doppelt so hoch. In der Gruppe der

Tiere, die unter Hypoxiebedingungen gehalten wurden und zusätzlich täglich mCPP

(1 mg/kg) erhielten, zeigte sich eine Vervielfachung der muskularisierten Blutgefäße um den

Faktor 5,5. mCPP verstärkte somit die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung.

In Abb. 3.20 B ist das Resultat der Zählung der Blutgefäße mit einem Durchmesser von

26 µm – 50 µm dargestellt. In der Tendenz zeigte sich der gleiche Effekt wie bei den

kleineren Blutgefäßen, allerdings war die Ausprägung bei den Blutgefäßen dieser Größe

nicht so stark. Die Injektion von mCPP (1 mg/kg) führte in der hypoxisch gehaltenen

Tiergruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu einer Erhöhung der vaskulären

Muskularisierung um den Faktor 3.

Ergebnisse

86

0

1

2

3

4

5

6

7

Normoxie Normoxie + mCPP (1mg/kg)

4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + mCPP (1mg/kg)

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Normoxie Normoxie + mCPP (1mg/kg)

4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + mCPP (1mg/kg)

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

A

B

Abb. 3.21: Untersuchung der Auswirkung der pharmako logischen Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors im Tiermodell der Pulmonalen Hypertonie d urch Gabe von 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP)

(A) Blutgefäße ≤25 µm: In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von mCPP (1 mg/kg) führte sowohl unter normoxischen (Faktor 2) als auch unter hypoxischen Bedingungen (Faktor 5,5) zu einer starken Zunahme muskularisierter Blutgefäße. (B) Blutgefäße 26 µm – 50 µm: Es zeigte sich die gleiche Tendenz wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings fiel der mCPP-vermittelte Effekt in der Hypoxie-Gruppe etwas geringer aus (Faktor 3,3). Somit konnte durch die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors unter normoxischen Bedingungen ein vaskulärer Muskularisierungsgrad hervorgerufen werden, der dem nach vierwöchiger Hypoxiebehandlung entspricht. Wurde mCPP unter hypoxischen Bedingungen verabreicht, fand eine nochmals verstärkte Zunahme der vaskulären Muskulatur statt. ( n≥6; ±SEM)

Ergebnisse

87

Die Gruppe, welche unter Hypoxiebedingungen gehalten, aber nicht Sumatriptan erhielt,

wies eine verdoppelte Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur Kontrollgruppe

auf. Dieser Befund zeigte sich auch in der Gruppe, welche mCPP erhielt und unter

normoxischen Bedingungen gehalten wurde.

Die statistische Auswertung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Tab. 3.3 gezeigt.

Abgesehen vom Vergleich der Hypoxie-Gruppe und der Gruppe der Tiere, welche mCPP

unter normoxischen Bedingungen erhielten, waren zwischen den Gruppen statistisch

signifikante Unterschiede zu finden. Diese waren in ihrer Stärke bei den beiden untersuchten

Größen der Blutgefäße identisch. Die Zunahme der Muskularisierung nach

Hypoxiebehandlung und der Verabreichung von mCCP zeigte im Vergleich zu allen anderen

Gruppen die höchste Signifikanz (p<0,001). Zudem zeigte die Kontrollgruppe statistisch

signifikante Unterschiede sowohl zur Hypoxie-behandelten Gruppe als auch zu den Tieren,

welche mCPP unter normoxischen Bedingungen erhielten. (p<0,01). Die beiden

letztgenannten Gruppen wiesen keine statistisch signifikanten Unterschiede zueinander auf.

Normoxie

Normoxie +

mCPP Hypoxie

Hypoxie +

mCPP

≤ 25 µm

Normoxie - ** ** ***

Normoxie +

mCPP ** - n.s. ***

Hypoxie ** n.s. - ***

Hypoxie +

mCPP *** *** *** -

26 µm

–

50 µm

Normoxie - ** ** ***

Normoxie +

mCPP **. - n.s. ***

Hypoxie ** n.s. - ***

Hypoxie +

mCPP *** *** *** -

Tab. 3.3: Statistische Auswertung zum Versuch ‚ Akt ivierung des 5-HT 2B Rezeptors durch mCPP ‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n.s.: nicht signifikant)

Ergebnisse

88

3.4.4 Zusammenhang zwischen Hypoxie- und mCPP-induz ierter Neomuskularisierung

In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige Rolle bei

der Remodellierung pulmonaler Blutgefäße spielt. Auch wenn die genaue Funktion des

Rezeptors in der Pathogenese der PH bisher nicht klar ist, liegt die Vermutung nahe, dass es

durch die Hypoxiebehandlung zu einer dauerhaften Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors

kommt, da die Blockierung des Rezeptors zu einer Reduktion der Neomuskularisierung

führte (siehe 3.3.1).

Um dies zu überprüfen, wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem die Tiere der

Hypoxiebehandlung nicht über die kompletten vier Wochen unterzogen wurden. So wurden

die Tiere zuerst für zwei Wochen unter hypoxischen Luftverhältnissen gehalten. Nach dieser

Periode sollte es, wie unter 3.1.2 beschrieben, nicht zur Ausprägung der

Neomuskularisierung kommen. Nach der zweiwöchigen Hypoxiebehandlung wurde den

Tieren täglich mCPP in einer Dosis von 1 mg/kg i.p. injiziert, was eine dauerhafte Aktivierung

des 5-HT2B Rezeptors nach sich ziehen sollte. Die Substanz erhielten die Tiere für zwei bzw.

vier Wochen unter normoxischen Bedingungen. Dadurch sollte überprüft werden, ob die

dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors ausreichend ist, um die Effekte der

Hypoxiebehandlung hervorzurufen. Zudem wurde eine Tiergruppe einer vierwöchigen

Hypoxiebehandlung unterzogen und erhielt im Anschluss für weitere vier Wochen eine

tägliche Injektion mCPP (1 mg/kg). Dadurch sollte überprüft werden, ob es sich bei der

mCPP-induzierten Neomuskularisierung um einen additiven oder synergistischen Effekt in

Kombination mit der Hypoxie handelte.

Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.22 dargestellt. Da es keinen relevanten

Unterschied in den Ergebnissen der beiden untersuchten Größen von Blutgefäßen gab, ist

hier das Ergebnis für alle Blutgefäße ≤50 µm zusammen gezeigt.

Wie in den vorangegangenen Versuchen kam es durch die vierwöchige Hypoxiebehandlung

zu einer Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur

Kontrollgruppe (p<0,001). Die Tiergruppe, welche nach der zweiwöchigen

Hypoxiebehandlung für weitere zwei Wochen tägliche Injektionen mCPP erhielt, zeigte keine

Ausprägung einer Neomuskularisi

dauerhafte Stimulation des

Hypoxiebehandlung nicht ausreichte, um eine Neomuskularisierung

Die beiden Tiergruppen, welche mCPP übe

zeigten die Ausprägung einer Neomuskularisierung im Vergleich zur normoxisch gehaltenen

Kontrollgruppe (p<0,001). Die Anzahl der muskularisierten Blutgefäße verdoppelte sich hier

ebenfalls und befand sich damit a

hypoxischen Luftbedingungen gehalten wurde.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Normoxie

mus

kula

risie

rte

Blu

tgef

äße

(n

orm

iert

auf

Nor

mox

ie-G

rupp

e)

Abb. 3.22: Quantifi zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer nach Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von m-Chlorphenylpiperazin (mCPP)

In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplungmuskularisierten Blutgefäße nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären MuskelschichtWurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen erhalten. Somit kam es zu keinem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP. ±SEM)


opplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur



Ausprägung einer Neomuskularisierung der Blutgefäße. Daraus lässt sich ableiten, dass die

dauerhafte Stimulation des 5-HT2B Rezeptors nach vorangegangener zweiwöchiger

t ausreichte, um eine Neomuskularisierung zu induzieren.

Die beiden Tiergruppen, welche mCPP über einen Zeitraum von vier Wochen erhielten,



ebenfalls und befand sich damit auf dem Niveau der Gruppe, welche vier Wochen unter

hypoxischen Luftbedingungen gehalten wurde.

Normoxie 4 W Hypoxie 2 W Hypoxie + 2 W mCPP

(in Normoxie)

2 W Hypoxie + 4 W mCPP

(in Normoxie) (in Normoxie)

zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von

Chlorphenylpiperazin (mCPP)

der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung

(p<0,001). Die tägliche Applikation von mCPP nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären MuskelschichtWurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen

hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, ohne pharmakologische Substanzen zu erhalten. Somit kam es zu keinem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP. (***: p<0,001;

Ergebnisse

89


opplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur



erung der Blutgefäße. Daraus lässt sich ableiten, dass die

Rezeptors nach vorangegangener zweiwöchiger

zu induzieren.

r einen Zeitraum von vier Wochen erhielten,



uf dem Niveau der Gruppe, welche vier Wochen unter

4 W Hypoxie + 4 W mCPP

(in Normoxie)

zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer ≤50 µm Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von

der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung der

. Die tägliche Applikation von mCPP (1 mg/kg) führte nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären Muskelschicht. Wurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen

gehalten wurde, ohne pharmakologische Substanzen zu ***: p<0,001; n≥5;

Ergebnisse

90

Somit kam es hier nicht zu einem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP, da maximal ein

Muskularisierungsgrad erreicht wurde, wie er durch die Haltung der Tiere unter hypoxischen

Bedingungen ohne Verwendung jeglicher Pharmaka erreicht wurde.

3.5 Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors

Nachdem in dieser Arbeit die Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung nachgewiesen werden konnte, war es von Bedeutung, zu bestimmen,

in welchen Zellen der Rezeptor lokalisiert ist. Dadurch könnte dieser Zelltyp näher

charakterisiert werden und im Hinblick auf 5-HT2B Rezeptor vermittelte Prozesse untersucht

werden. Zur zellulären Lokalisation des Rezeptors in der Lunge existieren bis heute kaum

publizierten Daten. In dieser Arbeit wurden sowohl immunhistochemische Färbungen als

auch die in situ-Hybridisierung verwendet, um sowohl die RNA des Rezeptors als auch das

Protein selbst nachzuweisen. Zudem bot sich so die Möglichkeit, die Ergebnisse beider

experimenteller Ansätze (RNA-Ebene und Protein-Ebene) zu vergleichen und auf

übereinstimmende Befunde zu prüfen.

3.5.1 in situ-Hybridisierung im Vormagen der Ratte

Der 5-HT2B Rezeptor wurde erstmals im Magen der Ratte beschrieben (siehe 1.2.1), daher

sollte dieses Organ als methodische Positivkontrolle verwendet werden, um die

Funktionalität der RNA-Sonden zu überprüfen.

Die verschiedenen Abschnitte des Magens der Ratte unterscheiden sich sowohl

morphologisch als auch funktionell recht stark voneinander. Auffällig ist der weißlich

schimmernde Teil, der Vormagen. Er verfügt über eine ausgeprägte Hornschicht, welche den

Magen vor mechanischen Verletzungen schützt und die Nahrung als erste Einheit des

Magens aufnimmt. Der folgende Abschnitt, der Fundus, weist keine Verhornung auf.

Stattdessen besitzt er die namengebenden Fundusdrüsen, welche den Magensaft

sezernieren.

Da der 5-HT2B Rezeptor im Vormagen lokalisiert ist, wurde natives Gewebe von diesem

Bereich des Magens bei ca. -60°C in Tissue-Tek Free zing Medium eingebettet. Davon

wurden 30 µm starke Gefrierschnitte angefertigt, welche in der in situ-Hybridisierung

verwendet wurden. Zur Detektion wurde die Methode der DIG-Markierung eingesetzt, so

dass Zellen, die das Transkript des 5-HT2B Rezeptor tragen, durch eine dunkle Färbung

detektierbar werden sollten. Als Kontrolle wurden Sense-Sonden verwendet. Die

Ergebnisse

91

Gewebeschnitte wurden daher entweder mit der Antisense- oder Sense-Sonde behandelt. In

beiden Fällen wurden die Schnitte dem exakt gleichen Prozedere unterzogen.

In Abb.3.23 sind mikroskopische Aufnahmen des Vormagens der Ratte zu sehen. Aufgrund

der Schnittdicke von 30 µm wiesen die Bilder der 400-fachen Vergrößerung leichte

Unschärfen auf.

Die Abb. 3.23 A und 3.23 C zeigen Schnitte des Vormagens, welche mit der

Antisense-Sonde des 5-HT2B Rezeptors hybridisiert wurden. In den Abb. 3.23 B und 3.23 D

sind Detailaufnahmen von Abb. 3.23 A und 3.23 C dargestellt. Abb. 3.23 E zeigt einen

Gewebeschnitt, der mit der Sense-Sonde behandelt wurde. Zur Visualisierung der

grundlegenden Strukturen des Vormagens wurde eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)

angefertigt, welche in Abb. 3.23 F dargestellt ist.

In Abb. 3.23 A sind distinkte Zellen zu erkennen, die nach der Färbeprozedur immunpositiv

waren. Sie befanden sich in unmittelbarer Nähe zur glatten Muskulatur (gM) in einem

bindegewebsreichen Segment, welches als Plexus Myentericus (PM) oder auch Auerbach

Plexus bekannt ist. Dabei handelt es sich um eine Struktur, welche aus Ganglien aufgebaut

ist und die sich durch den kompletten Magen-Darm-Trakt zieht. In der Detaildarstellung (B)

ist zu erkennen, dass die Zellkerne nicht angefärbt waren, sondern lediglich das Zytoplasma

der Zellen (Pfeile).

Da es auf Grund der Gewebebeschaffenheit nicht möglich war definierte Querschnitte

anzufertigen, war die Schnittebene nicht regelmäßig. In Abb. 3.23 C ist jedoch ein Ausschnitt

zu erkennen, der annähernd einen Querschnitt durch die Tunica Muskularis darstellt (vgl.

Abb. 1.1). Diese besteht aus der zirkulären (Ringmuskulatur, RM) sowie der longitudinalen

Muskulatur (LM). Dazwischen eingebettet findet sich der bereits erwähnte PM. Auch hier

waren distinkte Zellen innerhalb des Plexus immunpositiv (Abb. 3.23 D).

Aus Abb. 3.23 E geht hervor, dass die Behandlung mit der Sense-Sonde keine Färbung

nach sich zog, was die Spezifität der voran beschriebenen Färbung untermauerte. Die

Übersichtsfärbung mit HE (Abb. 3.23 F) zeigt die beschriebenen Strukturen genauer. Der

Plexus Myentericus (PM) ist zwischen der zirkulären und longitudinalen Muskulatur (RM bzw.

LM) lokalisiert. Auffällig ist das im Vergleich zur Muskulatur hellgefärbte Bindegewebe,

welches den Plexus Meyentericus auszeichnet. Darüber hinaus lässt sich auf Grund der

Orientierung der Zellkerne eine Aussage über die Lage der Muskelschichten treffen, so dass

zwischen Ring- und Längsmuskulatur unterschieden werden kann.

Ergebnisse

92

Abb. 3.23: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors im Vormagen der Ratte durch in situ-Hybridisierung

Auf den hier dargestellten Bildern ist die Anfärbung des Vormagengewebes der Ratte mit Hilfe der in situ-Hybridisierung zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Wie aus (A) zu entnehmen ist, waren distinkte Zellkörper angefärbt. Aufgrund des umliegenden Bindegewebes konnte diese Struktur als Plexus Myentericus (PM) identifiziert werden. In der glatten Muskulatur (gM) konnten keine immunpositiven Zellen detektiert werden. In der Detailaufnahme (B) ist gut zu erkennen, dass lediglich das Zytoplasma der Zellen, nicht aber der Kern (Pfeil) angefärbt war. (C) zeigt einen Ausschnitt, bei dem der Plexus Myentericus (PM) zwischen den Muskelschichten (LM bzw. RM) lokalisiert war. Die gefärbten Zellen beschränkten sich auch hier auf den Bereich des Plexus Myentericus (D). Die Behandlung der Gewebeschnitte mit der Sense-Sonde erbrachte keine zelluläre Anfärbung (E). Die in (F) dargestellte Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigt die Lage des Plexus Myentericus zwischen den beiden Muskelschichten. Die Orientierung der Muskelschichten lag im 90° Winkel zueinander, wie aus der Lage der Zellkerne hervorging. Daher handelte es sich hier sowohl um Längs- (LM) als auch Ringmuskulatur (RM). (Maßstäbe: F: 200 µm; A, C, E,: 100 µm; B, D: 50 µm; AS: Antisense; S: Sense; HE: Hämatoxylin-Eosin)

gM gM

LM

RM

LM

RM

PM

PM

PM

Ergebnisse

93

3.5.2 in situ-Hybridisierung in der Lunge der Ratte

Nachdem die Sonden zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors am Kontrollgewebe des

Rattenvormagen erfolgreich getestet wurden, konnte nun das Zielgewebe, die Lunge,

verwendet werden.

Das Ergebnis dieser in situ-Hybridisierung ist in Abb. 3.24 dargestellt. Wurden die Schnitte

mit der Antisense-Sonde behandelt, zeigte sich im Bereich der Blutgefäße eine dunkle

Färbung (Abb. 3.24 A). Diese war in den Atemwegen oder dem Alveolargewebe nicht zu

sehen. Unter Verwendung einer stärkeren Vergrößerung konnte die Färbung genauer

lokalisiert werden, was in Abb. 3.24 B gezeigt ist.

Abb. 3.23: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch in situ-Hybridisierung

In dieser Abbildung sind Gewebeschnitte der Rattenlunge dargestellt, welche der in situ-Hybridisierung zur Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors unterzogen wurden. Nach Verwendung der Antisense-Sonde kam es im Bereich der Blutgefäße zu einer deutlichen Färbung, wie aus (A) ersichtlich wird. Aus der Detaildarstellung (B) konnte diese Färbung als im Endothel lokalisiert bestimmt werden (Pfeile). Die Behandlung der Gewebeschnitte mit der Sense-Sonde erbrachte, wie aus (C) und (D) ersichtlich wird, keine Anfärbung im Bereich des Endothels (Maßstäbe: A, C,: 100 µm; B, D: 50 µm; AS: Antisense; S: Sense)

Ergebnisse

94

Die Färbung konnte in der innersten, zum Lumen orientierten Schicht nachgewiesen werden

(Pfeile). Somit handelte es sich bei den immunpositiven Zellen um Endothelzellen. Ein

solches Färbemuster konnte unter den Kontrollbedingungen (Sense-Sonde) nicht gefunden

werden (Abb. 3.24 C und D). Dies bestätigte die Spezifität der Färbung und spricht für die

Korrektheit der Färbung, welche durch Verwendung der Antisense-Sonde erreicht wurde.

Demnach konnte die RNA des 5-HT2B Rezeptors mittels in situ-Hybridisierung in den

Endothelzellen pulmonaler Blutgefäße nachgewiesen werden.

3.5.3 Immunhistochemische Färbungen im Vormagen der Ratte

Neben der in situ-Hybridisierung wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt, um

den 5-HT2B Rezeptor im Gewebe zu lokalisieren und den Zelltyp, welcher den 5-HT2B

Rezeptor exprimiert, zu bestimmen. Auch hier wurden zunächst Färbungen am Vormagen

der Ratte durchgeführt.

In Abb. 3.25 sind Gewebeschnitte des Vormagens der Ratte nach der

immunhistochemischen Färbung zu sehen. Es wurden Nachbarschnitte genutzt, wobei ein

Blutgefäß (bv) dazu diente, die identische Position in den Präparaten zu identifizieren. Nach

Verwendung des Antikörpers, welcher gegen den 5-HT2B Rezeptor gerichtet ist, zeigte sich

wie schon nach der in situ-Hybridisierung eine Färbung im Bereich des PM (Pfeile in A und

C).

Innerhalb des PM befinden sich neben den Enterischen Neuronen weitere Zelltypen. Einen

dieser Zelltypen stellen die Interstitial Cells of Cajal (ICC) dar, welche in engem Kontakt zu

den Neuronen und der glatten Muskulatur stehen (Daniel et al., 2001; Buist et al., 2010).

Eine Arbeitsgruppe konnte den 5-HT2B Rezeptor bereits in diesen Zellen im Jejunum der

Maus nachweisen (Wouters et al., 2007 & 2009).

Bisher sind zwei Marker für die ICC beschrieben: c-Kit (Epperson et al., 2000) & ANO1

(Gomez-Pinilla et al., 2009; Kashyap et al., 2011). Antikörper gegen diese beiden Proteine

wurden an Nachbarschnitten der Präparate verwendet, die mit dem Antikörper gegen den

5-HT2B Rezeptor gefärbt wurden. Das Ergebnis dieser Färbungen ist ebenfalls in Abb. 3.25

dargestellt. Abb. 3.25 B zeigt die Färbung unter Verwendung des Antikörpers gegen ANO1,

in Abb. 3.25 D ist die Färbung dargestellt, wobei das Gewebe mit dem Antikörper gegen c-Kit

behandelt wurde. Beide Antikörper konnten, wie schon der 5-HT2B Rezeptor, im Plexus

Myentericus detektiert werden. Diese Kolokalisation der Färbungen sprach dafür, dass der

5-HT2B Rezeptor im Vormagen der Ratte in ICC lokalisiert ist.

Ergebnisse

95

Abb. 3.25: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors im Vormagen der Ratte durch immunhistochemische Färbungen

Auf den hier dargestellten Bildern ist die Anfärbung des Vormagengewebes der Ratte durch immunhistochemische Färbungen zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Es handelte sich dabei um Nachbarschnitte, das Blutgefäß (bv) diente dabei der Sicherstellung, dass es sich immer um die identische Position im Gewebe handelte. In (A) und (C) sind Schnitte zu sehen, welche mit einem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor behandelt wurden. Wie bei der in situ-Hybridisierung zeigte sich eine Anfärbung des zwischen den Muskelschichten gelegenen Plexus Myentericus (PM) (Pfeile). Ein möglicher Zelltyp, welcher für die Expression des Rezeptors in Frage kam, waren die Interstitial Cells of Cajal (ICC). Die Marker ANO1 (B) und c-Kit (D) wurden verwendet, um diese Zellen im Vormagen der Ratte zu lokalisieren. Nach Verwendung dieser beiden Antikörper zeigte sich das gleiche Färbemuster wie es zuvor durch den Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor hervorgerufen wurde. Somit konnte mit dieser Methode die Expression des 5-HT2B Rezeptors im PM bestätigt werden. Zudem wurde mit den ICC der Zelltyp bestimmt. (E) und (F) zeigen die Negativkontrollen, bei welchen die Färbeprozedur ohne den Primärantikörper durchgeführt wurde. (Maßstab: 50 µm)

Ergebnisse

96

Es bestand allerdings auch die Möglichkeit, dass der 5-HT2B Rezeptor nicht nur in ICC

sondern auch in Enterischen Neuronen exprimiert wird. Daher wurde an weiteren

Nachbarschnitten eine Färbung mit dem Neuronenmarker HuC/D durchgeführt.

Ein Bild dieser immunhistochemische Färbung ist in Abb. 3.26 dargestellt. Hier zeigte sich,

dass im Bereich des Blutgefäßes (bv, vgl. Abb. 3.25) keine Neurone detektiert werden

konnten. Diese waren nur in einem weiter entfernten Gebiet des Gewebes zu finden (Pfeile).

Daher konnte die Expression des 5-HT2B Rezeptors in Neuronen ausgeschlossen werden.

3.5.4 Immunhistochemische Färbungen in der Lunge de r Ratte durch

Nachdem die Färbung mit dem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor erfolgreich etabliert

werden konnte (siehe 3.5.3), wurden immunhistochemische Färbungen an der Lunge der

Ratte durchgeführt. Zudem sollte der Zelltyp bestimmt werden, in dem der 5-HT2B Rezeptor

exprimiert wird.

Das Ergebnis der Antikörperfärbung ist in Abb. 3.27 dargestellt. Im Bereich der Blutgefäße

wurde, wie schon bei der in situ-Hybridisierung, eine Färbung festgestellt. Eine Aussage über

die genaue Lokalisation der Färbung war nur mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung

unter Verwendung von zwei Primärantikörpern möglich. Zur Bestimmung des Endothels

wurde erneut ein Antikörper gegen den von-Willebrand-Faktor (vWF) verwendet (vgl. 3.1.1).

Aus der Überlagerung der Färbungen gegen den 5-HT2B Rezeptor und den vWF wurde

ersichtlich, dass sich die Signale der Färbungen überschnitten, wodurch eine gelblich

erscheinende Fluoreszenz entstand. Daraus konnte geschlossen werden, dass beide

Abb. 3.26: Lokalisation von Neuronen im Vormagen de r Ratte durch immunhistochemische Färbungen

In dieser Abbildung sind immunhistochemische Färbungen des Vormagens der Ratte gezeigt. In (A) und (B) sind zum besseren Vergleich die Färbungen des 5-HT2B Rezeptors und c-Kit aus Abb. 3.26 erneut gezeigt. Daraus wird ersichtlich dass der Nachbarschnitt (C), welcher mit dem Neuronenmarker HuC/D behandelt wurde, keine Färbung im Bereich des Blutgefäßes (bv) auswies. Neurone waren allerdings in einem weiter entfernten Abschnitt des Gewebeschnitts detektierbar (Pfeile). (Maßstab: 50 µm)

Ergebnisse

97

Proteine in den gleichen Zellen nachgewiesen wurden, was für eine Expression des 5-HT2B

Rezeptors in Endothelzellen sprach.

3.6 Primärkultur von ICC aus dem Rattenvormagen

Die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors wurde bislang fast ausschließlich in stabilen

Zelllinien untersucht. Die verwendeten Zellen exprimieren den Rezeptor in nativem Zustand

nicht, so dass unklar ist, ob ein in diesen Zellen eingebrachter Rezeptor die gleichen

Proteine aktiviert, wie dies auch in den Zellen der Fall ist, die den 5-HT2B Rezeptor in

nativem Zustand besitzen.

Daher sollte eine Primärkultur von Zellen angelegt werden, die den 5-HT2B Rezeptor

exprimieren. Nachdem die Etablierung einer Kultur von Endothelzellen aus der Lunge

fehlschlug, wurde der Vormagen der Ratte verwendet, da die ICC aus diesem Gewebe den

5-HT2B Rezeptor besitzen (siehe 3.5.3).

3.6.1 Charakterisierung der Zelltypen

Nach dem Aussäen der Zellen konnte bereits nach wenigen Stunden festgestellt werden,

dass einige Zellen adhärent wurden und auf der Collagenbeschichtung anwuchsen. Da es

sich um eine heterogene Primärkultur handelte, bei der kein Selektionsmedium eingesetzt

Abb. 3.27: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch immunhistochemische Färbungen

In dieser Abbildung sind immunhistochemische Färbungen der Lunge der Ratte gezeigt. In (A) ist die Färbung unter Verwendung des Antikörpers gegen den 5-HT2B Rezeptor dargestellt. Eine Färbung war lediglich im Bereich der Blutgefäße zu sehen. Zur genauen Bestimmung der Rezeptor-exprimierenden Zellen wurde eine Doppelfärbung durchgeführt (B). Dabei wurde neben dem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor ein Antikörper gegen den Endothelmarker von-Willebrand-Faktor (vWF) verwendet. Aus der Überlagerung der Fluoreszenzsignale (C) wurde ersichtlich, dass die Signale in der gleichen Struktur des Blutgefäßes lagen, da eine gelbliche Färbung entstand. Somit konnte die Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge der Ratte in Endothelzellen nachgewiesen werden. (Maßstab: 50 µm)

Ergebnisse

98

wurde, wurden die Zelltypen, sofern Marker vorhanden waren, mit Hilfe von

immuncytochemischen Färbungen bestimmt.

3.6.1.1 Nachweis von Muskelzellen und Neuronen

In Abb. 3.28 ist das Ergebnis der immunzytochemischen Färbungen zu sehen. Daraus geht

hervor, dass nach drei Tagen in Kultur sowohl Muskelzellen (A) als auch Neurone (B)

vorhanden waren. Durch die Färbung gegen α-Glattmuskelaktin waren die

Zytoskelettfilamente der sich ausstreckenden Muskelzellen gut zu erkennen. Die Neurone

wiesen eine kugelförmige Morphologie auf. Zudem waren die Neurite immunpositiv für

β-III Tubulin (Pfeile). Die Kontrolle ohne Erstantikörper (C) zeigte keinerlei zelluläre

Anfärbung. Immunzytochemische Färbungen gegen den 5-HT2B Rezeptor sowie ICC

schlugen fehl (Daten nicht gezeigt).

Es fand keine genaue Bestimmung der Zellzahl statt. Es war jedoch ersichtlich, dass ein

Großteil der Zellen der Kultur aus Muskelzellen bestand, wohingegen die Menge der

Neurone sehr begrenzt war.

3.6.1.2 Nachweis von ICC

Da der Versuch der immunzytochemischen Färbung mit ICC-Markern fehl schlug, wurde

eine Vitalfärbung mit Methylenblau durchgeführt. Diese beruht auf einem bisher nicht

geklärten zellulären Transportmechanismus, es konnte jedoch gezeigt werden, dass

ausschließlich ICC diesen Farbstoff aufnehmen (Mikkelsen et al., 1988; Liu et al., 1993;

Faussone-Pellegrini & Thuneberg, 1999).

Abb. 3.28: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch immunhistochemische Färbungen

In dieser Abbildung sind immunzytochemische Färbungen der Primärkultur des Rattenvormagens dargestellt. Es konnten sowohl Muskelzellen (A) als auch Neurone (B) detektiert werden. Letztere zeigten Verbindungen über Neurite zu anderen Zellen (Pfeile). In der Negativkontrolle waren keine zellulären Anfärbungen zu sehen. (Maßstab: 50 µm)

Ergebnisse

99

Das Ergebnis der Vitalfärbung mit Methylenblau ist in Abb. 3.29 gezeigt. Es konnten distinkte

Zellen identifiziert werden, welche den Farbstoff aufnahmen (Pfeile). Diese Zellen waren

stets zusammen gelagert. Umliegende Zellen zeigten keine Färbung mit Methylenblau. Somit

konnten ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Färbung mit Methylenblau

nachgewiesen werden.

Neben der Vitalfärbung mit Methylenblau wurde die Primärkultur mittels RT-PCR auf den

ICC-Marker c-Kit sowie das Transkript des 5-HT2B Rezeptors untersucht.

Ein Bild der Gelelektophorese zum Nachweis der genannten Transkripte ist in Abb. 3.30

dargestellt. Es konnte sowohl das Transkript von c-Kit als auch das des 5-HT2B Rezeptors in

der Kultur nachgewiesen werden. Damit konnte bestätigt werden, dass sowohl ICC als auch

5-HT2B Rezeptor-tragende Zellen in der Kultur vorhanden waren. Mit Hilfe der hier

dargestellten Methoden war es jedoch nicht möglich zu zeigen, dass ICC den 5-HT2B

Rezeptor in vitro exprimieren.

Abb. 3.29 Nachweis von ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Vitalfärbung mit Methylenblau

In dieser Abbildung ist eine Vitalfärbung der Primärkultur des Rattenvormagens dargestellt. Es konnten mehrere Zellen detektiert werden, die den Farbstoff Methylenblau aufgenommen hatten (Pfeile). (Maßstab: 40 µm)

3.6.2 Calcium Imaging

Da es mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression

Rezeptors in ICC aus der Primärkultur des Rattenvormagens nachzuweisen, wurden die

Zellen mit Hilfe des Calcium

Zellen sowohl auf Substanzen reagieren, welche den 5

auf Liganden antworten, welche spezifisch für c

untersucht werden, ob Zellen den 5

die bereits beschriebene für ICC typische Tyrosinkinase, verfüg

Im Calcium Imaging kam die fluoreszierende Substanz Fura

Exzitation dieser Substanz erfolgt bei unterschiedlichen Wellenlängen, je nachdem, ob sie

frei (380 nm) oder an Kalzium gebunden (340

Abb. 3.31 zeigt exemplarisch

liegt. Zur Stimulation des 5

Konzentration von 10-8 M eingesetzt (Westbroek

für c-Kit wurde der stem cell factor

Es zeigte sich, dass es bei einer der beobachteten Zellen sowohl nach Stimulation mit dem

spezifischen 5-HT2B Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer

Verschiebung des Fura-2/AM Ve

Vitalitätskontrolle wurde ATP (10

Abb. 3. 30 Nachweis des 5Rattenvormagens durch RT

Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des 5-HT2B Rezeptors und von centhalten waren. c-Kit fungierte hier als dadurch indirekt gezeigt werden konnte. Die Kontrollen (Kontaminationen vorlagen.

mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression


Calcium-Imagings untersucht. Dadurch konnte überprüft werden, ob

Zellen sowohl auf Substanzen reagieren, welche den 5-HT2B Rezeptor aktiviere

auf Liganden antworten, welche spezifisch für c-Kit sind. Durch diesen Ansatz konnte

untersucht werden, ob Zellen den 5-HT2B Rezeptor exprimieren und gleichzeitig über c

die bereits beschriebene für ICC typische Tyrosinkinase, verfügten.

kam die fluoreszierende Substanz Fura-2/AM zum Einsatz. Die


nm) oder an Kalzium gebunden (340 nm) vorliegt.

Abb. 3.31 zeigt exemplarisch einen Graphen, dem ein Calcium Imaging-Versuch zu Grunde

liegt. Zur Stimulation des 5-HT2B Rezeptors wurde die Substanz BW723C86 in einer

M eingesetzt (Westbroek et al., 2001; Bhasin et al.

cell factor (SCF, 25 ng/ml) gewählt (Yuzawa et al., 2006).


Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer

2/AM Verhältnisses, also zu einer Zellantwort kam. Zur

Vitalitätskontrolle wurde ATP (10-5 M) verwendet. Es zeigte sich, dass es hier auch bei Zellen

30 Nachweis des 5 -HT2B Rezeptors und ICC in der PrimärRattenvormagens durch RT -PCR

Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des Rezeptors und von c-Kit in der Gesamt-RNA der Primärkultur des Rattenvormagens

Kit fungierte hier als Marker für ICC, deren Existenz in der Kultur dadurch indirekt gezeigt werden konnte. Die Kontrollen (-RT) zeigten, dass keine Kontaminationen vorlagen.

Ergebnisse

100

mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression des 5-HT2B


Dadurch konnte überprüft werden, ob

Rezeptor aktivieren, als auch

Kit sind. Durch diesen Ansatz konnte

Rezeptor exprimieren und gleichzeitig über c-Kit,

2/AM zum Einsatz. Die


Versuch zu Grunde

Rezeptors wurde die Substanz BW723C86 in einer

et al.,2004). Als Ligand

ng/ml) gewählt (Yuzawa et al., 2006).


Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer

rhältnisses, also zu einer Zellantwort kam. Zur

M) verwendet. Es zeigte sich, dass es hier auch bei Zellen

Rezeptors und ICC in der Primär kultur des

Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des RNA der Primärkultur des Rattenvormagens

Marker für ICC, deren Existenz in der Kultur RT) zeigten, dass keine

zu einem Einstrom von Kalzium in das Zytoplasma kam, welche auf die anderen Substanzen

nicht reagierten.

Durch diesen Versuch konnte belegt werden, dass der 5

identischen Zellen exprimiert werden. Da c

wurde, konnte festgestellt werden, dass der 5

Rattenvormagens lokalisiert ist.

des 5-HT2B eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der

gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die

ATP reagierte. Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf

BW723C86.

Abb. 3. 31 Nachweis der Expression des 5Rattenvormagens durch Calcium Imaging

Bei dem hier dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium ImagingExperiment. Es konnte sowohl nach der Applikation von BW723C86 (10(25 ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht antworteten. c-Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.


diesen Versuch konnte belegt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor sowie c

identischen Zellen exprimiert werden. Da c-Kit auch hier als Marker für ICC eingesetzt

wurde, konnte festgestellt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor in ICC in der Primärkultur des

attenvormagens lokalisiert ist. Zur näheren Untersuchung des pharmakologischen Profils

eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der

gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die

Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf

31 Nachweis der Expression des 5 -HT2B Rezeptors in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Calcium Imaging

er dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium ImagingExperiment. Es konnte sowohl nach der Applikation von BW723C86 (10-8 M) als auch SCF

ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht

Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.

Ergebnisse

101


Rezeptor sowie c-Kit in

Kit auch hier als Marker für ICC eingesetzt

Rezeptor in ICC in der Primärkultur des

Zur näheren Untersuchung des pharmakologischen Profils

eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der

gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die Applikation von

Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf

Rezeptors in ICC in der Primärkultur des

er dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium Imaging-M) als auch SCF

ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (10-5 M) eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht

Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.

Diskussion

102

4. Diskussion

In dieser Arbeit wurde der Effekt von Migräne-assoziierten Pharmaka auf die Pathologie der

Pulmonalen Hypertonie (PH) untersucht. Dazu wurde das Tiermodell der normobaren

Hypoxie verwendet. Dabei war die Untersuchung der Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors von

besonderem Interesse, da dieser sowohl in der Entstehung der PH als auch der Migräne

eine wichtige Rolle zu spielen scheint (Launay et al., 2002; Johnson et al., 2003). Als Maß

für die Ausprägung der PH wurde die Neomuskularisierung an Blutgefäßen herangezogen,

welche unter nicht pathologischen Bedingungen keine Muskulatur aufweisen. Diese

pathologischen Veränderungen wurden mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen

gegen α-Glattmuskelaktin analysiert.

Neben Untersuchungen zur Induktion und Reversibilität der PH, wurde den Versuchstieren

während der Hypoxie-Behandlung sowohl ein partieller Agonist (mCPP) als auch ein

spezifischer Antagonist (BF-1) des 5-HT2B Rezeptors injiziert. Zudem wurden die Tiere mit

Sumatriptan, einem Agonisten des 5-HT1B Rezeptors, sowie L-NAME, einem Inhibitor der

Stickstoffmonoxid Synthase (NOS), behandelt. Für diese beiden Substanzen wurde bereits

die Wirksamkeit im Tiermodell für Migräne beschrieben.

Weitere Analysen beschäftigten sich mit Expressionsveränderungen des 5-HT2B Rezeptors

unter hypoxischen Bedingungen und der Signaltransduktion sowie der zellulären Lokalisation

des 5-HT2B Rezeptors im Gewebe der Lunge.

4.1 Induktion und Reversibilität der vaskulären Neo muskularisierung

4.1.1 Transfer des Tiermodells der normobaren Hypox ie auf den Organismus Maus

Zu Beginn dieser Arbeit wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie, welches am

Lehrstuhl für Tierphysiologie bereits mit Ratten und Meerschweinchen durchgeführt wurde,

auf den Organismus Maus übertragen.

In den Spezies Ratte und Meerschweinchen wurden intrapulmonale Blutgefäße mit einem

Durchmesser <50 µm untersucht. Beim Organismus Maus wurde die Auswertung modifiziert.

Da Mäuse über eine kleinere Lunge als die Vergleichsspezies verfügen, war nicht klar, bis zu

welchem Durchmesser der Blutgefäße die Neomuskularisierung auftreten würde. Daher

wurde in der histologischen Auswertung zwischen Blutgefäßen mit einem Durchmesser

≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm unterschieden. Dass zwischen diesen Größen physiologische

Unterschiede bestehen, zeigte sich in den Ergebnissen der Quantifizierung muskularisierter

Diskussion

103

Blutgefäße, nachdem die Konzentrationsverhältnisse des zugeleiteten Luftgemisches variiert

wurden.

In den ersten Versuchen wurde der O2-Gehalt am Ausgang der Hypoxiekammer gemessen.

Die Zuleitung des Luftgemischs erfolgte so, dass hier ein Wert von 10% O2 vorlag. Hier

stellte sich eine Zunahme der muskularisierten Blutgefäße nach der Hypoxiebehandlung

lediglich bei den Blutgefäßen ≤25 µm ein. Der Muskularisierungsgrad blieb bei den

Blutgefäßen mit einem Durchmesser zwischen 26 µm - 50 µm unverändert (Daten nicht

gezeigt).

In allen in dieser Arbeit dargestellten Versuchen wurde der O2-Gehalt des zugeführten

Luftgemisches so eingestellt, dass der O2-Gehalt am Eingang der Hypoxiekammer 10%

betrug. Da die Tiere fortwährend O2 verbrauchten und im Gegenzug CO2 abatmeten, lag die

O2-Konzentration in der Kammer unterhalb von 10%. Vergleichende Messungen ergaben,

dass ein Gradient in der O2 Konzentration von ca. 1,2% vom Eingang zum Ausgang der

Kammer vorlag. Dieser geringe Unterschied hatte jedoch einen großen Einfluss auf den

Muskularisierungsgrad der intrapulmonalen Blutgefäße. Bei den Versuchen, die mit dem

noch weiter herabgesetzten O2-Gehalt durchgeführt wurden, zeigte sich nicht nur bei den

kleinsten untersuchten Blutgefäßen (<25 µm) eine Zunahme der Muskulatur um den

Faktor 2, sondern auch bei den größeren Blutgefäßen mit einem Durchmesser von

26 µm - 50 µm (siehe Abb. 3.1 & Abb. 3.2).

4.1.2 Notwendige Dauer der Hypoxiebehandlung zur In duktion der PH

Um den Phänotypen der vaskulären Neomuskularisierung in der Maus zu erzeugen, war

eine Hypoxiebehandlung mit einer Dauer von mindestens vier Wochen notwendig (siehe

3.1.2). Bei Tieren, die drei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, kam

es zu einem leichten, aber statistisch nicht signifikanten Anstieg im Muskularisierungsgrad

der intrapulmonalen Blutgefäße. Ein signifikanter Unterschied war erst nach vier- bzw.

fünfwöchiger Hypoxiebehandlung zu verzeichnen. Bei Tieren mit vierwöchiger

Behandlungsdauer war auch die Rechtsventrikuläre Hypertrophie (RVH) ausgeprägt (siehe

Abb. 3.4.). Dieser Befund bestätigte zusätzlich die Ausprägung der PH.

Die Dauer der notwendigen Hypoxiebehandlung kann stark variieren und ist immer abhängig

von dem verwendeten Aufbau der Hypoxiekammer, sowie der Tierspezies und des

Tierstamms. In einigen Studien wurden die Tiere lediglich einer zweiwöchigen (Eddahibi

et al., 1998) oder auch dreiwöchigen (Ozaki et al., 2001) Hypoxiebehandlung unterzogen.

Diskussion

104

Andere Arbeitsgruppen wiederum setzten die Tiere sechs (Steudel et al., 1998; Yu et al.,

1999) oder sieben (Crnkovic et al., 2011) Wochen der Hypoxie aus.

Es sind bisher einige Effekte bekannt, mit denen der Organismus innerhalb weniger Minuten

auf Hypoxie reagiert. Dazu gehören beispielsweise die hypoxische Hyperventilation oder

auch die verstärkte Ausschüttung von Erythropoietin (Piehl Aulin et al., 1998, siehe auch

1.4.3). Der genaue Zusammenhang zwischen diesen kurzfristigen Antworten und dem

Prozess der Remodellierung von Blutgefäßen, welcher vier Wochen in Anspruch nimmt, ist

bis heute noch unklar.

Es müssen zwei Klassen von Blutgefäßen unterschieden werden. Proximale Blutgefäße mit

einem relativ großen Durchmesser verfügen bereits vor den pathologischen Prozessen der

PH über eine Media mit glatter Muskulatur. Bei diesen Blutgefäßen kommt es zur

Proliferation der bereits existierenden Glattmuskelzellen (smooth muscle cells, SMC) und

damit zu einer Verdickung der bereits vorhandenen Muskelschicht (Jones et al., 1999). Eine

solche Hyperplasie innerhalb der intrapulmonalen Blutgefäße konnte in dieser Arbeit nicht

beobachtet werden. Die Dicke der Media von Blutgefäßen mit einem Durchmesser >50 µm

war bei hypoxisch behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe unverändert (Daten

nicht gezeigt). Die Hyperplasie der Media stellt bei Patienten ein wesentliches Merkmal der

PH dar. Es liegen Daten vor, aus denen hervorgeht, dass die Hyperplasie der Media von

5-HT induziert werden kann (Eddahibi et al., 2001; Marcos et al., 2004).

Die aus Tiermodellen erhobenen Daten sind in Bezug auf die Hyperplasie nicht eindeutig. Es

existieren Studien, in denen eine deutliche Hyperplasie der Media nachgewiesen werden

konnte (Christou et al., 2000; Minamino et al., 2001; Marcos et al., 2003). Von anderen

Arbeitsgruppen wird die Neomuskularisierung kleinerer Blutgefäße als charakteristischer

Phänotyp beschrieben (Ozaki et al., 2001; Fagan et al., 2004). Ein Vergleich dieser Studien

zeigt, dass die Dauer der Hypoxiebehandlung sowie der verwendete Tierstamm

unterschiedlich waren, so dass darin mögliche Gründe für die abweichenden Ergebnisse zu

finden sind. Im Monocrotalin-Modell (MCT, siehe 1.4.5) wird hingegen in nahezu allen

Studien eine massive Verdickung der vaskulären Muskelschicht beschrieben (Cho et al.,

2009; Revermann et al., 2011). In diesem Tiermodell besteht allerdings eine starke

Speziesabhängigkeit.

Wie bereits beschrieben, existiert an kleineren Blutgefäßen wie etwa präkapillären Arteriolen

unter normalen physiologischen Bedingungen keine Media. In der Pathogenese der PH

entsteht eine neue Muskelschicht aus einwandernden Zellen, welche sich erst zu

Glattmuskelzellen (smooth muscle cell, SMC) bzw. Glattmuskel-ähnlichen Zellen (SMC-like)

differenzieren. Dieser Prozess der Neomuskularisierung konnte in dieser Arbeit an den

Diskussion

105

Blutgefäßen mit einem Durchmesser ≤50 µm nachgewiesen werden, da es zu einer

Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße dieser Größe nach der

Hypoxiebehandlung kam (siehe 3.1.2).

Die Herkunft der Zellen der neuen vaskulären Muskelschicht ist bis heute nicht geklärt (Frid

et al., 2009). Möglicherweise kommt es zur Migration und/oder Differenzierung von Endothel-

assoziierten Perizyten oder intermediären Zellen der Media (Jeffery & Morrel, 2002). Eine

weitere Möglichkeit besteht darin, dass die neugebildete Muskulatur aus Myofibroblasten

hervorgeht (siehe auch 1.4.4). Fibroblasten der Adventitia differenzieren allerdings sowohl in

präkapillären Arteriolen als auch in größeren Arterien zu Myofibroblasten und sorgen mit

gesteigerter Proliferation dafür, dass das Lumen der Gefäße abnimmt und die Kontraktilität

eingeschränkt wird (Durmowicz & Stenmark, 1999). Neben residenten Zellen werden auch

im Blut zirkulierende Zellen als Ursprungsort diskutiert (Frid et al., 2006). In zuletzt genannter

Studie konnte gezeigt werden, dass eine Gruppe von mesenchymalen Vorläuferzellen

während der Hypoxiebehandlung aus dem Blut in die Gefäßwand einwanderte. Diese Zellen

differenzierten sich dort weiter und exprimierten kontraktile Proteine wie z.B.

α-Glattmuskelaktin. Auch eine Transdifferenzierung von Endothelzellen in den SMC-like

Zelltyp kann nicht ausgeschlossen werden (Arciniegas et al., 2005; Stenmark et al., 2006).

4.1.3 Reversibilität der Hypoxie-induzierten Neomus kularisierung

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung um einen persistierenden Remodellierungsvorgang der

intrapulmonalen Blutgefäße handelte. Die Zunahme der muskularisierten Blutgefäße blieb

bestehen, auch wenn die Tiere nach der vierwöchigen Hypoxiebehandlung für bis zu acht

Wochen unter normoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden (siehe 3.2).

Die Reversibilität der pathologischen Veränderungen ist bei Patienten mit PH abhängig von

der Ursache der Erkrankung. Liegt die Ursache der PH z.B. in einer linksventrikulären

Erkrankung (siehe 1.4.2), ist die Prognose sehr schlecht. In Folge einer Herztransplantation

kann sich allerdings eine Verbesserung der Pathologie zeigen. In einer Studie konnte

festgestellt werden, dass bei 80% der untersuchten Patienten der Gefäßwiderstand (PVR)

innerhalb eines Jahres auf das Normalniveau sank (Bhatia et al., 1987). Aus aktuelleren

Daten geht hervor, dass der PVR bereits nach einem Monat normalisiert vorliegen kann

(Delgardo et al., 2000). Somit handelt es sich bei dieser Form der PH nicht zwangsläufig um

irreversible vaskuläre Veränderungen. Nachdem die Ursache für die PH, in diesem Fall ein

Defekt am linken Ventrikel, entfernt wurde, normalisierte sich die Morphologie des

intrapulmonalen Blutgefäßsystems.

Diskussion

106

Bei den Formen der Pulmonalarteriellen Hypertonie (PAH, siehe 1.4.2) ist die Ursache der

PH häufig nicht klar. Selbst in Fällen der PAH mit bekannter Ursache sind in der Regel nur

die Symptome wie z.B. die Dyspnoe behandelbar. Die derzeit bei Patienten mit PH

eingesetzten Pharmaka wie Prostazyklin, ET-1 Rezeptor Antagonisten (z.B. Bosentan) oder

Inhibitoren der Phosphodiesterase-5 (PDE-5, z.B. Sildenafil) können die Progression der

Krankheit jedoch nicht verhindern. Die pathologischen Veränderungen der PH sind zum

jetzigen Stand der Forschung nicht vollständig reversibel (Moreno-Vinasco et al., 2008;

Ghofrani et al., 2009; Anderson & Newarkas, 2010; Murthy et al., 2010).

In dieser Arbeit führte die Entfernung des für die PH ursächlichen Stimulus, die Hypoxie,

nicht zu einer Reduktion der Muskularisierung. Zu diesem Versuchsansatz liegen keine

publizierten Daten aus Tiermodellen für das pulmonale Blutgefäßsystem zum Vergleich vor.

Eine Arbeitsgruppe aus Gießen (Hessen, Deutschland) um Prof. Dr. Weissmann berichtete

allerdings ebenfalls, dass der Phänotyp der Remodellierung sehr robust sei und mehrere

Wochen vorhält (Dr. Xin-Ran Zhu, persönliche Mitteilung). Es ist daher davon auszugehen,

dass die im Tiermodell beobachtete Neomuskularisierung die Charakteristik der

Remodellierung intrapulmonaler Blutgefäße im Menschen widerspiegelt.

4.1.4 Gemeinsamkeiten und Unterschiede zum Tiermode ll der Migräne

Das Tiermodell der Migräne (Johnson et al., 2003; siehe auch 1.3.3) basiert auf der Induktion

einer Plasmaproteinextravasation (PPE) in der Dura mater durch die Wirkung von

1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP) am 5-HT2B Rezeptor. Dieses Tiermodell wurde in der

Spezies des Meerschweinchens etabliert.

Am Lehrstuhl für Tierphysiologie wurde versucht, dieses Tiermodell auf die Spezies Maus zu

übertragen. Dabei zeigte sich, dass mCPP in einer Dosis von 1 µg/kg (i.v.) in der Maus, im

Gegensatz zum Meerschweinchen, keine PPE auslösen konnte. Unterzog man die Mäuse

jedoch einer vierwöchigen Hypoxiebehandlung, erzeugte mCPP in einer Dosis von 1 µg/kg

(i.v.) auch in der Maus eine verstärkte PPE (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Die

Tiere wurden durch die Hypoxiebehandlung durch einen bisher ungeklärten Mechanismus

für die Substanz mCPP sensitiviert.

Im Tiermodell der Migräne war eine Hypoxiebehandlung von mindestens vier Wochen nötig,

damit durch mCPP eine PPE in der Maus ausgelöst werden konnte (Daniel Segelcke,

persönliche Mitteilung). Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Übereinstimmung mit der

benötigten Dauer der Hypoxiebehandlung zwischen den Tiermodellen der Pulmonalen

Diskussion

107

Hypertonie und der Migräne bestand. In beiden Tiermodellen war eine vierwöchige

Hypoxiebehandlung nötig, um den entsprechenden Phänotypen zu generieren.

Es ist bekannt, dass während der vierwöchigen Hypoxiebehandlung eine Vielzahl von

physiologischen und morphologischen Veränderungen in der Lunge der Mäuse stattfinden.

Die physiologischen Änderungen wie z.B. die Ausschüttung vasoaktiver Substanzen finden

binnen kürzester Zeit (Stenmark et al., 2006) statt, die morphologischen Veränderungen

bedürfen dagegen weitaus länger, wie auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte (siehe

3.1.2). Eine kurzfristige physiologische Antwort wie z.B. die Ausschüttung einer Substanz als

Ursache für die Sensitivierung gegenüber mCPP scheint daher im Tiermodell der Migräne

eher unwahrscheinlich zu sein. Vielmehr handelt es sich vermutlich auch um

Umstrukturierungen im Blutgefäßsystem in der Dura mater der Mäuse während der

Hypoxiebehandlung. Aber auch ein Zusammenspiel zwischen physiologischen und

morphologischen Prozessen wäre denkbar, da die Konzentration von 5-HT im Plasma bei

Patienten der PH erhöht vorliegt (Hervé et al., 1995). Das bedeutet, auch wenn vasoaktive

Substanzen sehr schnell freigesetzt werden, kann dies über einen längeren Zeitraum

geschehen und somit zu dauerhaften Veränderungen der Plasmakonzentration führen.

Bislang liegen jedoch keine Daten vor, die einen solchen Mechanismus beschreiben.

Ein Unterschied zwischen den beiden Tiermodellen bestand in den Ergebnissen zur

Reversibilität der Hypoxie-induzierten Effekte. Nach vierwöchigem Aufenthalt unter

normoxischen Bedingungen in Folge der Hypoxiebehandlung war die erhöhte Sensitivität

gegenüber mCPP nicht mehr gegeben (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Im

Gegensatz dazu war die Neomuskularisierung in der Lunge der Mäuse auch acht Wochen

nach der Hypoxiebehandlung weiterhin vorhanden (siehe 3.2). Dies lässt darauf schließen,

dass es sich bei den möglichen morphologischen Veränderungen in den Blutgefäßen der

Dura mater um andere Prozesse handelt, als dies in der Lunge der Fall ist. Das systemische

Blutgefäßsystem reagiert im Gegensatz zum intrapulmonalen Kreislauf nicht mit einer

Vasokonstriktion sondern mit einer Vasodilatation auf hypoxische Reize (Sommer et al.,

2008). Es ist daher wahrscheinlich, dass sich auch die pathologischen Prozesse an den

Blutgefäßen in der Entstehung beider Krankheiten unterscheiden.

Die PH ist von den Veränderungen der glatten Muskulatur geprägt, im Tiermodell der

Migräne kommt es zum induzierten Austritt von Plasmaproteinen. Die Barriere für das Blut

stellen in erster Linie die Endothelzellen dar. Möglicherweise ist dieser Zelltyp für die

Sensitivierung gegenüber mCPP verantwortlich. In in vitro Studien konnten gezeigt werden,

dass Endothelzellen aus der Aorta und der Lunge, im Gegensatz zu Glattmuskelzellen, unter

hypoxischem Stress die identischen Proteine verstärkt exprimierten (Graven et al., 1993). Es

Diskussion

108

besteht daher die Möglichkeit, dass die Endothelzellen in der Dura mater in einer ähnlichen

Weise auf die Hypoxie reagieren, wie die Endothelzellen in der Lunge.

4.2 Die Bedeutung des 5-HT 2B Rezeptors in der Pathogenese der PH

4.2.1 Pharmakologische Blockierung des 5-HT 2B Rezeptors während der

Hypoxiebehandlung

Dass der 5-HT2B Rezeptor möglicherweise eine wichtige Rolle in der Pathogenese der PH

spielt, wurde erstmals 2002 von der Arbeitsgruppe um Launay publiziert. In der Studie wurde

gezeigt, dass die Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors (pharmakologisch und genetisch) die

Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung im vaskulären System der Lunge komplett

blockieren konnte (Launay et al., 2002). Dieser Befund wurde in dieser Arbeit überprüft,

indem der 5-HT2B Rezeptor durch tägliche Injektion des hochspezifischen Antagonisten BF-1

(pKi: 10.15, Beate Schmitz. persönliche Mitteilung) während der Hypoxiebehandlung

blockiert wurde. Es zeigte sich, dass es zu einer signifikanten Reduktion, nicht aber zu einer

kompletten Blockierung, der Neomuskularisierung der Blutgefäße mit einem Durchmesser

<50 µm kam. Zudem wurde die Hypertrophie des rechten Ventrikels durch die Applikation

von BF-1 vermindert (siehe 3.3.1).

Es bestehen einige Unterschiede zwischen den beiden Arbeiten, die für den abweichenden

Befund verantwortlich sein könnten. Launay et al. (2002) verwendeten Minipumpen, über die

kontinuierlich eine geringe Dosis des verwendeten Antagonisten RS127445 i.v. in das Blut

der Tiere gegeben wurde. In dieser Arbeit wurde den Mäusen täglich BF-1 in verschiedenen

Dosen (1 mg/kg - 20 mg/kg) i.p. injiziert. Die biologische Halbwertszeit von BF-1 beträgt

weniger als drei Stunden (Beate Schmitz, persönliche Mitteilung). Es wäre daher möglich,

dass die biologisch verfügbare Menge von BF-1 während der 24 h zwischen den einzelnen

Injektionen auf ein zu geringes Niveau gefallen war, um alle 5-HT2B Rezeptoren zu blockieren

und damit die Neomuskularisierung komplett zu verhindern. Dafür spricht auch, dass die

Gabe von BF-1, sofern sie lediglich alle zwei Tage erfolgte, keinen Einfluss auf die

Ausprägung der Neomuskularisierung hatte (Daten nicht gezeigt). Daher war die tägliche

Injektion von BF-1 nötig. Darüber hinaus wurden in beiden Arbeiten unterschiedliche

Tierstämme (NMRI bzw. 129/PAS) verwendet, was ebenfalls zu abweichenden Ergebnissen

führen kann.

In den letzten zwei Jahren sind weitere Studien publiziert worden, in denen beschrieben

wurde, dass die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Verringerung der

Neomuskularisierung intrapulmonaler Blutgefäße führte (Porvasnik et al., 2010; Dumitrascu

Diskussion

109

et al., 2011; Zopf et al., 2011). Diese Arbeitsgruppen verwendeten allerdings das MCT-

Modell in der Ratte (siehe 1.4.5).

Porvasnik et al. (2010) verwendeten die Substanz PRX08066 als Antagonist des 5-HT2B

Rezeptors. Die Gabe der Substanz erfolgte zweimal täglich p.o. in Dosen von bis zu

100 mg/kg. Selbst in dieser verhältnismäßig hohen Dosis konnte jedoch nur eine geringe

Reduktion der Neomuskularisierung erreicht werden. In der Studie von Dumitrascu et al.

(2011) wurde der partielle Antagonist des 5-HT2B Rezeptors Tergurid b.i.d. in einer Dosis von

1,2 mg/kg i.p. verabreicht. Diese Injektionen führten dazu, dass die Neomuskularisierung der

intrapulmonalen Blutgefäße nahezu komplett blockiert werden konnte. Zu dem gleichen

Ergebnis gelangte die Arbeitsgruppe um Zopf (2011). Der Antagonist C-122 inhibierte

dosisabhängig den Phänotypen der PH. Während eine Dosis von 1 mg/kg nur geringe

Auswirkungen auf die PH zeigte, verhinderte die Verabreichung von 10 mg/kg die

Neomuskularisierung der pulmonalen Blutgefäße nahezu vollständig.

Diese drei Studien zeigen, dass der 5-HT2B auch eine Rolle in der MCT-induzierten PH spielt.

Gleichzeitig traten jedoch auch Unterschiede in der Wirksamkeit der Antagonisten auf,

obwohl das identische Tiermodell verwendet wurde. Demnach nehmen die unterschiedlichen

Substanzen und deren Applikationsform einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in allen hier diskutierten Arbeiten

nachgewiesen werden konnte, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige Komponente in der

Pathogenese der PH darstellt, da die pharmakologische Inaktivierung des Rezeptors zu

einer Reduktion oder auch kompletten Blockierung der Neomuskularisierung im

intrapulmonalen Blutgefäßsystem führte.

In dieser Arbeit konnte eine Reduktion der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung durch

die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der Hypoxiebehandlung

erreicht werden. Daher ist davon auszugehen, dass noch andere Rezeptoren und

Substanzen an der Entstehung der PH beteiligt sind. Es existieren sehr viele Studien, in

denen mit Hilfe pharmakologischer Substanzen oder auch gentechnischer Methoden

Einfluss auf die Ausprägung der PH zu nehmen versucht wurde. Dabei kamen verschiedene

Pharmaka zum Einsatz, die eine vasodilatierende und/oder antimitogene Wirkung besitzen

(siehe auch 4.1.3). Neben den hier genannten Studien (Launay et al., 2002; Dumitrascu

et al., 2011) konnte der Phänotyp der PH auch in einer anderen Arbeit mittels Inhibition der

PDE-5 durch Sildenafil (75 mg/kg) blockiert werden (Sebkhi et al., 2003). In der Mehrzahl der

Untersuchungen konnte hingegen lediglich eine Reduktion der Neomuskularisierung gezeigt

werden. Dabei wurden unter anderem eine NO-Prodrug (Mathew et al., 1997), ein Antagonist

der 5-HT1B/1D Rezeptoren (Keegan et al., 2001), ein Inhibitor des SERT (Marcos et al., 2003),

Diskussion

110

ein Inhibitor der Rho-Kinase (Fagan et al., 2004) sowie ein HIF-Inhibitor (Abud et al., 2012)

verwendet. Desweiteren können auch die Effekte auf einzelne Parameter unterschiedlich

sein. In einer Studie kam es durch die pharmakologische Verstärkung der Hämoxigenase nur

zu einer Reduktion der MCT-induzierten Neomuskularisierung, der Rechtsventrikuläre Druck

(RVP) konnte jedoch auf Normalniveau gesenkt werden (Christou et al., 2000).

Die Variation der Erkenntnisse aus diesen Studien verdeutlicht, dass es sich bei der PH um

eine multifaktorielle Krankheit handelt. Aus diesem Grund sind inzwischen

Kombinationspräparate in der Behandlung der PH von besonderem Interesse (Clozel et al.,

2006). Die mögliche Signalkaskade der 5-HT2B Rezeptor-vermittelten Mechanismen wird an

anderer Stelle diskutiert (siehe 4.2.4).

4.2.2 Pharmakologische Blockierung des 5-HT 2B Rezeptors nach der

Hypoxiebehandlung

In einem weiteren Versuch wurde geprüft, ob die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B

Rezeptors einen Einfluss auf die Reversibilität der Neomuskularisierung nehmen konnte. Die

neugebildete vaskuläre Muskelschicht blieb bis acht Wochen nach dem Aufenthalt in der

Hypoxiekammer bestehen (siehe 3.2). Da die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors durch BF-1

während der Hypoxiebehandlung einen reduzierenden Effekt auf die Neomuskularisierung

hatte (siehe 3.3.1), wurde geprüft, ob die pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B

Rezeptors die Reversibilität der Muskularisierung positiv beeinflussen konnte. Die

Auswertung dieses Versuchs zeigte jedoch, dass die tägliche Applikation von BF-1 nach der

Hypoxiebehandlung keinen reduzierenden Effekt nach sich zog. Die erhöhte Anzahl

muskularisierter Blutgefäße war weiterhin vorhanden und nicht durch Blockierung des 5-HT2B

Rezeptors reversibel. Somit scheint der 5-HT2B Rezeptor lediglich eine Funktion in der

Entstehung der Neomuskularisierung zu besitzen, am Voranschreiten der PH jedoch nicht

beteiligt zu sein. Dafür spricht ebenfalls, dass die Stärke der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung bei fünfwöchiger Hypoxiebehandlung nicht zunahm (siehe 3.1.2). Der

Phänotyp war somit nach vier Wochen bereits voll ausgeprägt. Es besteht daher die

Möglichkeit, dass die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu diesem Zeitpunkt irrelevant für die

Ausprägung der PH war. In diesem Fall hätte auch die Blockierung des Rezeptors keine

Auswirkung auf die vaskuläre Muskulatur.

Es liegen bisher kaum Studien vor, in denen die Reversibilität der Neomuskularisierung nach

der Hypoxiebehandlung beschrieben wird. Im Tiermodell lässt sich der Phänotyp der PH

häufig während der Induktionsphase blockieren, nicht aber umkehren, was auch die

Problematik der Behandlung von Patienten der PH sehr gut widerspiegelt. Es existieren

Diskussion

111

allerdings auch Untersuchungen, in denen eine bereits ausgebildete Neomuskularisierung

sich wieder zurückbildete. In einer Studie wurde Imatinib, ein Antagonist des Rezeptors für

Platelet-derived growth factor (PDGF), eingesetzt. Sowohl im MCT-Modell als auch im

Hypoxie-Modell konnte die Applikation von Imatinib den bereits ausgebildeten Phänotypen

umkehren (Schermully et al., 2004). Eine weitere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die

Behandlung der Versuchstiere mit sehr geringen Dosen von Kohlenstoffmonoxid (CO)

sowohl im MCT-Modell als auch im Hypoxie-Modell zur Reversibilität der bereits

ausgeprägten Neomuskularisierung führte (Zuckerbraun et al., 2006). Dies geschah in

Abhängigkeit von Stickstoffmonoxid (NO), da die Umkehr des Phänotyps nicht in Tieren

möglich war, bei denen die NO-Synthase (NOS) gentechnisch ausgeschaltet wurde.

Die genauen Mechanismen sind bisher allerdings weiter unklar und Gegenstand der

aktuellen Forschung. Es lässt sich daher festhalten, dass die Inaktivierung des 5-HT2B

Rezeptors nicht zur Reversibilität der Neomuskularisierung führte. Dies scheint jedoch durch

andere Signalwege möglich.

4.2.3 Expression des 5-HT 2B Rezeptors unter Einfluss von Hypoxie

In dieser Arbeit bestätigte sich der Befund, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige

Bedeutung in der Pathogenese der Hypoxie-induzierten PH besitzt (siehe 3.3.1). Aus diesem

Grund wurde untersucht, ob die Hypoxiebehandlung zu einer Veränderung der Expression

des Rezeptors führte. Diese Untersuchung erfolgte mit Hilfe der sq RT-PCR. Ein Vergleich

zwischen RNA-Proben aus der Lunge von normoxisch und hypoxisch gehaltenen Mäusen

ergab jedoch, dass nach vierwöchiger Hypoxiebehandlung keinerlei Regulationsprozesse auf

Ebene der RNA detektierbar waren.

Methodische Fehler können nahezu ausgeschlossen werden, da die Quantifizierung von

Präproendothelin-1 (ppET-1) eine verstärkte Expression des entsprechenden Transkripts

ergab (siehe Abb. 3.10). Dieses Ergebnis steht in Einklang mit Literaturdaten, da die

verstärkte Ausschüttung von ppET-1 bzw. ET-1 unter hypoxischen Bedingungen bereits

mehrfach beschrieben wurde (Elton et al., 1992; Li et al., 1994; Zamora et al., 1996; Zhang

et al., 2009).

Die Arbeitsgruppe um Launay konnte eine erhöhte Expression des 5-HT2B Rezeptors

nachweisen (Launay et al., 2002). Dieses Ergebnis beruht allerdings auf

Ligandenbindungsassays und wurde somit auf Ebene des Rezeptorproteins durchgeführt. Im

Gegensatz dazu stehen die Untersuchungen einer weiteren Studie. Dort wurde eine

reduzierte Expression des RNA-Transkripts des 5-HT2B Rezeptors im Lungengewebe von

Diskussion

112

Patienten mit der idiopathischen Form der PH (IPAH) gezeigt (Dumitrascu et al., 2011). In

Anbetracht der Unterschiede zwischen den Studien, sind die erlangten Ergebnisse kaum zu

bewerten.

Unter Umständen spielt aber auch der Zeitpunkt der Gewebeentnahme eine Rolle. Eine

weitere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass es in den ersten zwei Wochen der

Hypoxiebehandlung zu einer verstärkten Expression von Angiopoietin-2 im Endothel

intrazerebraler Blutgefäße kam. Nach einer weiteren Woche, in der die Tiere unter

hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, fiel die Expression allerdings wieder auf das

Ausgangsniveau zurück (Pichiule & LaManna, 2002). Es ist daher möglich, dass etwaige

Regulationsprozesse des 5-HT2B Rezeptors nach der vierwöchigen Hypoxiebehandlung

bereits abgeschlossen waren, so dass diese nicht mehr detektiert werden konnten.

Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass der 5-HT2B Rezeptor eher eine Rolle bei der

Entstehung und nicht beim Voranschreiten der PH besitzt (siehe 4.2.2), wären weitere

Versuche sinnvoll, bei denen die Gewebeproben zu früheren Zeitpunkten der

Hypoxiebehandlung entnommen werden. Dies würde weitere Erkenntnisse zu einer

möglichen Regulation der Rezeptorexpression erbringen.

4.2.4 Die Signaltransduktion des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxiebedingungen

Bisher ist die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors nur unzureichend charakterisiert.

Zumeist wurde die intrazelluläre Kopplung in heterologen Expressionssystemen untersucht

(z.B. Jerman et al., 2001). Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass die

verwendeten Zellen den 5-HT2B Rezeptor im nativen Zustand nicht exprimieren. Daher wäre

es möglich, dass der Rezeptor nicht über die Proteine verschaltet ist, wie dies bei nativer

Expression der Fall wäre.

Die Pathogenese der PH ist gekennzeichnet von der Proliferation und Differenzierung von

nahezu allen vaskulären Zelltypen (siehe 1.4.4). Eine Gruppe von mitogen-activated protein

kinases (MAPK), die extracellular signal-regulated kinases (ERK), sind in vielen Pathologien

an diesen Prozessen beteiligt (Johnson & Lapadat, 2002; Zhan et al., 2003). Zudem konnte

die Aktivierung der ERK durch den 5-HT2B Rezeptor bereits gezeigt werden (Nebigil et al.,

2003; Li et al., 2008).

Die Western Blot Analysen (siehe 3.3.4) ergaben, dass es unter hypoxischen Bedingungen

tendenziell zu einer verstärkten Phosphorylierung der ERK kam. Wurde der 5-HT2B Rezeptor

pharmakologisch blockiert, war dieser Effekt nicht mehr detektierbar. Daher ist es sehr

Diskussion

113

wahrscheinlich, dass der 5-HT2B Rezeptor an der erhöhten Aktivierung der ERK unter

hypoxischen Bedingungen beteiligt war.

Die genaue Bedeutung der ERK in der Entstehung der PH ist Gegenstand der derzeitigen

Forschung. In einer Studie wurde nachgewiesen, dass Hypoxie zu einer verstärkten

Phosphorylierung der ERK führt (Jin et al., 2000). Darüber hinaus konnte durch in vitro

Experimente gezeigt werden, dass 5-HT direkt über die MAPK/ERK-Kaskade die

Proliferation pulmonaler Glattmuskelzellen (SMC) initiieren kann (Lee et al., 1999).

Fraglich bleibt weiterhin, über welche Proteine die mögliche Kopplung des 5-HT2B Rezeptors

und der ERK stattfindet. Allerdings konnte in einer Studie bereits gezeigt werden, dass die

Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Aktivierung der GTPase Ras führte (Launay et al.,

1996). Ras wiederrum steht in direktem Zusammenhang mit der ERK-Signalkaskade und

befindet sich in dieser upstream der ERK (Pearson et al., 2001). Ein alternativer Signalweg

zur Aktivierung der ERK liegt in der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration

(Mottet et al., 2002), welche bereits nach Stimulation des 5-HT2B Rezeptors beschrieben

wurde (Ullmer et al., 1996; Roth et al., 1998). Mögliche downstream Elemente der ERK sind

Transkriptionsfaktoren wie c-Myc oder c-Fos (Dworakowska et al., 2009). Weitere

Untersuchungen von Teilen der MAPK/ERK-Kaskade könnten Aufschluss über die genauen

Signalwege des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge liefern.

In jedem Fall stellt die MAPK/ERK-Kaskade einen potentiellen Signalweg des 5-HT2B

Rezeptors dar. Durch die pharmakologische Blockierung 5-HT2B Rezeptors im Tiermodell der

PH könnte die Inhibition dieser Kaskade, welche nachweislich an Proliferations- und

Differenzierungsprozessen beteiligt ist, zur Reduktion der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung führen.

4.3 Einsatz von Migräne-assoziierten Pharmaka im Ti ermodell der PH

4.3.1 L-NAME und die Bedeutung von NO

Das Gas NO verfügt über vasodilatierende sowie antimitogene Eigenschaften und stellt aus

diesem Grund eine wichtige Komponente in der Erforschung der PH dar (Hagan & Pepke-

Zaba, 2011). Allerdings steht NO auch im Zusammenhang mit der Pathogenese der Migräne

(siehe 1.3.2). Es wird vermutet, dass die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zur Freisetzung

von NO führt und dies den initialen Reiz für eine Migräneattacke darstellt. Es war daher

fraglich, ob die durch die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors verursachte Reduktion der

Neomuskularisierung im Tiermodell der PH in Zusammenhang mit einer verminderten

Freisetzung von NO stehen kann.

Diskussion

114

Daher wurde den Versuchstieren während der Hypoxiebehandlung der NOS Inhibitor

L-NAME injiziert. Die Hemmung der NOS hatte jedoch keinen Einfluss auf die Ausprägung

der vaskulären Neomuskularisierung (siehe 3.4.1). Dadurch wurde ersichtlich, dass der

reduzierende Effekt, welcher durch die Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors hervorgerufen

wurde, unabhängig von NO war. Dieser Befund stellt einen gravierenden Unterschied zu den

Daten der Migräneforschung dar. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse konnte

gezeigt werden, dass die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors bei der Entstehung der

PH unabhängig von NO erfolgt.

NO sollte aufgrund seiner vasodilatierenden und antimitogenen Eigenschaften der PH

entgegen wirken. Aus diesem Grund stellen NO-Donatoren sowie die Inhalationstherapie mit

NO einen mehrfach untersuchten Behandlungsansatz der PH dar (Fagan et al., 2001; Hagan

& Pepka-Zaba, 2011; Koo et al., 2011; Lasker et al., 2011). Die in dieser Arbeit erhobenen

Daten stehen in Einklang mit dieser Theorie. Es existieren allerdings auch Hinweise darauf,

dass eine Erhöhung der NO-Konzentration zu pathologischen Prozessen führen kann

(Michelakis, 2003). Durch die Reaktion von NO mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

entsteht z.B. Peroxynitrit, welches stark toxisch wirkt und direkten Schaden an vaskulären

Zellen verursachen kann (Hampl & Herget, 2000). Zudem inhibiert Peroxynitrit die

Prostazyklin Synthase und sorgt damit für eine Reduktion des vasoaktiven und antimitogen

wirkenden Prostazyklins (Zou & Ullrich, 1996). Es scheint daher wichtig, dass die NO-

Konzentration in einem gewissen Gleichgewicht vorliegt. Diese Tatsache stellt ein Problem

bei der Behandlung von Patienten mit NO-assoziierten Pharmaka dar.

Die in dieser Arbeit durchgeführten Western Blot Analysen mit einem Antikörper gegen die

endotheliale NOS (eNOS) zeigten, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer

verstärkten Expression des Proteins kam (siehe Abb 3.18). Obwohl es sich dabei lediglich

um das Enzym handelt, welches die Synthese von NO katalysiert, liegt der Schluss nahe,

dass es auch zu einer Erhöhung der NO-Konzentration als Folge der Hypoxie kam.

Interessanterweise hatte die verstärkte Expression der eNOS allerdings keinen Einfluss auf

den Phänotypen der PH. Hätte die erhöhte NO-Konzentration, die sich aus den Western Blot

Analysen ableiten ließ, einen reduzierenden Effekt auf die Hypoxie-induzierte

Neomuskularisierung, hätte die Blockierung der NOS zu einer Verstärkung des Phänotypen

führen müssen. Durch die pharmakologische Blockierung der NOS kam es jedoch nicht zu

einer Verstärkung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung (siehe 3.4.1).

Es liegen einige Studien vor, in denen vergleichbare Quantifizierungen der eNOS

durchgeführt wurden. Durch Analysen von humanem Gewebe von Patienten mit PH als auch

durch Experimente in Tiermodellen der PH konnte zumeist eine erhöhte Expression der

eNOS nachgewiesen werden (Isaacson et al., 1994; Xue et al., 1995; Le Cras et al., 1996;

Diskussion

115

Fagan et al., 2001). Dies bestätigt die Ergebnisse, welche in dieser Arbeit erzielt wurden. Es

liegen allerdings auch Studien vor, in denen eine unveränderte (Tuder et al., 1999) sowie

eine reduzierte (Giaid & Saleh, 1995) Expression der eNOS gezeigt wurde.

4.3.2 Sumatriptan und die Bedeutung des 5-HT 1B Rezeptors

Triptane stellen das Mittel der Wahl zur Behandlung einer akuten Migräneattacke dar. In

dieser Arbeit wurde der 5-HT1B/1D Rezeptor-Agonist Sumatriptan verwendet, um die

Auswirkung der Triptane im Tiermodell der PH zu untersuchen. In der Dura mater löst

Sumatriptan über den 5-HT1B Rezeptor eine Vasokonstriktion aus und wirkt damit der

Vasodilatation während des Migräneanfalls entgegen (siehe auch 1.3). Über die Wirkung an

5-HT1D Rezeptoren verhindert Sumatriptan die Ausschüttung proinflammatorischer

Neuropeptide aus den freien Nervenendigungen des N. trigeminus (Buzzi & Moskowitz,

2005).

Es war daher fraglich, wie sich die dauerhafte Aktivierung dieses Rezeptors auf den

Phänotypen der PH auswirken würde. In bisherigen Arbeiten wurde gezeigt, dass sowohl die

pharmakologische Inaktivierung als auch die genetische Ablation des 5-HT1B Rezeptors zu

einer verringerten Ausprägung der PH führte. Die Verwendung des 5-HT1B/1D Rezeptor

Antagonisten GR127935 führte zu einer Reduktion der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung. Knock-out Mäuse (5-HT1B-/-) zeigten den gleichen Effekt (Keegan

et al., 2001). Da in der Ausprägung der PH kein Unterschied zwischen den genetisch

veränderten Tieren und der Gruppe, die GR127935 erhielt, bestand, scheinen die 5-HT1D

Rezeptoren für die Entstehung der PH keine Relevanz zu besitzen. In einer später

publizierten Studie konnte gezeigt werden, dass ein Kombinationspräparat, welches sowohl

den 5-HT1B Rezeptor als auch den Serotonin Transporter (SERT) blockiert, die Hypoxie-

induzierte Neomuskularisierung nahezu komplett verhindern kann (Morecroft et al., 2010).

Dies zeigt erneut den multifaktoriellen Charakter der PH.

In dieser Arbeit führte die tägliche Applikation von Sumatriptan während der

Hypoxiebehandlung zu einer verstärkten Neomuskularisierung im Vergleich zu den Tieren,

welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, aber nicht den 5-HT1B/1D Rezeptor

Agonisten erhielten. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Hypoxie-induzierte

Neomuskularisierung weiter verstärkt werden kann und diese nicht den maximalen

Muskularisierungsgrad darstellt (siehe 3.4.2).

Die Ausprägung der Neomuskularisierung war in der pharmakologisch behandelten

Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe in den kleinsten Blutgefäßen (≤25 µm) stärker

Diskussion

116

(Faktor 5) als in den Blutgefäßen mit einem Durchmesser von 26 - 50 µm (Faktor 3, siehe

Abb. 3.20). Dieser Befund scheint widersprüchlich, da man davon ausgeht, dass die

Neomuskularisierung dadurch entsteht, dass sich die neugebildete Muskulatur von proximal

nach distal in die Blutgefäße erstreckt. Dieser Effekt lässt sich jedoch dadurch erklären, dass

die numerische Anzahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤25 µm

grundsätzlich geringer ist als die der Blutgefäße mit einem größeren Durchmesser. Lediglich

der relative Anstieg in der Anzahl muskularisierter Blutgefäße war in den kleinsten

Blutgefäßen höher.

Es ist bisher nicht geklärt, durch welchen zellulären Mechanismus Sumatriptan die Hypoxie-

induzierte Neomuskularisierung verstärkt. Studien haben allerdings gezeigt, dass die

pulmonale Vasokonstriktion unter normalen physiologischen Bedingungen hauptsächlich

durch den 5-HT2A Rezeptor vermittelt wird. Unter hypoxischen Luftverhältnissen wird die

pulmonale Vasokonstriktion hingegen überwiegend über den 5-HT1B Rezeptor reguliert

(MacLean et al., 1996; Morecroft et al., 1999). Die Theorie wird dadurch bekräftigt, dass die

Expression des 5-HT1B Rezeptors, nicht aber die des 5-HT2A Rezeptors, in den pulmonalen

Arterien von Patienten mit PH erhöht vorliegt (Launay et al., 2002).

Neben der Funktion im intrapulmonalen Gefäßsystem, steuern sowohl 5-HT2A Rezeptoren

als auch 5-HT1B Rezeptoren die Vasokonstriktion in systemischen Blutgefäßen (Tanaka

et al., 2008). Wie bereits beschrieben reagieren die Blutgefäße des Körperkreislaufs mit

einer Vasodilatation auf Hypoxie, wohingegen die pulmonale Zirkulation mit einer

Vasokonstriktion antwortet (siehe 1.4.3). 5-HT1B Rezeptoren vermitteln jedoch unabhängig

von ihrer Gewebelokalisation eine Vasokonstriktion. Es bleibt unklar, warum es bei der

Entstehung der PH zu einer endogenen 5-HT1B Rezeptor-vermittelten Vasokonstriktion

kommt, während die Vasokonstriktion in der Dura mater durch die Gabe exogener Agonisten

herbeigeführt werden muss, um einen Migräneanfall zu unterdrücken. Letztlich sollte der 5-

HT1B Rezeptor in beiden Geweben unter dem Einfluss der Hypoxie aktiviert werden.

Desweiteren besteht die Frage, welche Rolle der 5-HT1B Rezeptor in der Proliferation der

glatten Muskelzellen spielt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Stimulation des

Rezeptors mitogen wirken (Fanburg & Lee, 1997) und zudem die ERK aktivieren kann

(Pullarkat et al., 1998). Auch eine direkte Interaktion zwischen 5-HT1B Rezeptoren und

5-HT2B Rezeptoren wird diskutiert (Janoshazi et al., 2007).

4.3.3 mCPP und die dauerhafte Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors

Die Substanz mCPP wird sowohl im Menschen als auch im Tiermodell als Migräne-Induktor

beschrieben. Vermutlich wird diese Wirkung über den 5-HT2B Rezeptor vermittelt, da

Diskussion

117

Antagonisten dieses Rezeptors die im Tiermodell von mCPP verursachte

Plasmaproteinextravasation in der Dura mater blockieren können (siehe 1.3).

Bisher war unklar, ob der 5-HT2B Rezeptor durch die Hypoxie dauerhaft aktiviert wird. mCPP

wird in der Literatur als partieller Agonist des 5-HT2B Rezeptors beschrieben. Die Affinität

wird je nach verwendetem Versuchsaufbau mit einem pKi-Wert von 7,39 (Knight et al., 2004)

bis 8,49 (Rothman et al., 2000) angegeben. Um die Auswirkungen einer dauerhaften

Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors auf die Neomuskularisierung zu untersuchen, wurde den

Tieren täglich mCPP in einer Dosis von 1 mg/kg i.p. injiziert (siehe 3.4.3).

Die Auszählung der muskularisierten Blutgefäße zeigte, dass mCPP, ähnlich wie

Sumatriptan, die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung verstärkte. Wie schon bei der

Applikation des 5-HT1B Rezeptor Agonisten war auch hier der Effekt auf die kleinsten

Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤25 µm größer als auf die Gefäße mit einem

Durchmesser von 26 µm - 50 µm. Ein neuer Aspekt war jedoch, dass die tägliche Applikation

von mCPP auch in normoxisch gehaltenen Tieren zu einer Neomuskularisierung führte, die

in der Schwere der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung entsprach.

Es ist sehr wahrscheinlich, dass der Agonismus von mCPP am 5-HT2B Rezeptor für die

verstärkte Neomuskularisierung verantwortlich ist. In anderen Studien konnte bereits gezeigt

werden, dass der Einsatz von Dexfenfluramin, dessen Metabolit Norfenfluramin ein

agonistisches Potential am 5-HT2B Rezeptor aufweist (pKi: 7,57; Fitzgerald et al., 2000), im

Hypoxie-Tiermodell ebenfalls zu einer erhöhten Muskularisierung führte (Launay et al.,

2002). In 5-HT2B-/- Mäusen trat dieser Effekt nicht auf, was zusätzlich für die Aktivierung des

5-HT2B Rezeptors als Ursache für den verstärkten Phänotypen spricht. Auch bei unter

hypoxischen Bedingungen gehaltenen Hunden führte die Applikation von Dexfenfluramin zu

einer Erhöhung des PVR (Naeije et al., 1996). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass

Dexfenfluramin bei Ratten die Hypoxie-induzierte Rechtherzhypertrophie verstärkte

(Eddahibi et al., 2000). Im Gegensatz zu dieser Arbeit konnte allerdings in keiner dieser

Studien gezeigt werden, dass die dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors bei Tieren,

welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, zur Ausprägung eines

PH-typischen Phänotypten führte. Dies könnte in den differierenden Affinitäten von

Dexfenfluramin und dem in dieser Arbeit verwendeten mCPP zu anderen Rezeptoren

begründet liegen.

mCPP weist ein breites pharmakologisches Profil unter den 5-HT Rezeptoren auf.

Abgesehen vom 5-HT2B Rezeptor besitzt mCPP die höchste Affinität am 5-HT2C Rezeptor

(pKi:7,86; Knight et al., 2004). Dieser wird jedoch nicht in Blutgefäßen exprimiert (Ullmer

et al., 1995) und befindet sich hauptsächlich in neuronalen Strukturen (Pompainano et al.,

Diskussion

118

1994). Auch am 5-HT2A Rezeptor wurde die Bindung von mCPP bereits beschrieben

(pKi:7,26, Knight et al., 2004). Dieser wird in den Blutgefäßen der Lunge exprimiert und ist

dort an der Vasokonstriktion beteiligt (siehe 4.3.2). In einer Studie wurde bereits eine

Dexfenfluramin-vermittelte Vasokonstriktion über 5-HT2A Rezeptoren gezeigt (Hong et al.,

2003). Dies wäre auch für mCPP möglich. Es bleibt daher fraglich, welche Rolle der 5-HT2A

Rezeptor in der mCPP-induzierten Neomuskularisierung spielt.

Zudem stellte sich die Frage, inwiefern die Signalwege der mCPP-induzierten und der

Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung übereinstimmen. Um dies zu überprüfen, wurden

die Versuchstiere für zwei Wochen unter hypoxischen Luftverhältnissen gehalten. Danach

erhielten sie Injektionen von mCPP unter normoxischen Bedingungen (siehe 3.4.4). Dabei

zeigte sich, dass es nicht zur Ausprägung einer Neomuskularisierung kam. Daher liegt der

Schluss nahe, dass die Signalwege der mCPP-induzierten und der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung nicht übereinstimmen. Da die Herkunft der neugebildeten Muskelzellen

sowie die zellulären Mechanismen der vaskulären Remodellierung bislang ungeklärt ist, wäre

es möglich, dass unterschiedliche Zelltypen durch die verschiedenen Stimuli rekrutiert

werden (siehe 4.1.2).

Um zu überprüfen, ob es sich um einen additiven oder einen synergistischen Effekt bei der

mCPP-verstärkten Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen handelte, wurden

die Versuchstiere über variierende Zeiträume (zwei Wochen & vier Wochen) unter

hypoxischen Bedingungen gehalten und erhielten in der Folge Injektionen von mCPP unter

normoxischen Bedingungen für vier Wochen (siehe 3.4.4). Bei der Gruppe, welche nur zwei

Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, kam es zur Ausprägung der

mCPP-induzierten Neomuskularisierung. Im Gegensatz dazu führte die vierwöchige Haltung

unter hypoxischen Luftverhältnissen, zur Ausprägung der Hypoxie-induzierten

Neomuskularisierung, welche durch die anschließende Applikation von mCPP nicht verstärkt

werden konnte. Daraus lässt sich folgern, dass es einen synergistischen Effekt von Hypoxie

und mCPP geben muss, der zu dem vorher beschriebenen Verstärkungsmechanismus

führte.

Synergistische Effekte von Hypoxie und verschiedenen Stimuli durch Proteine sind in der

Literatur bereits beschrieben. In in vitro Studien führte die Behandlung von Zellen mit

transforming growth factor-beta (TGF-β) unter hypoxischen Bedingungen zu einem massiven

Anstieg der Expression des vascular endothelial growth factors (VEGF). Dieser Effekt war im

Vergleich zur Einzelstimulation mit TGF-β oder Hypoxie weitaus stärker (Sánchez-Elsner

et al., 2009). Auch für platelet derived growth factor (PDGF) und Hypoxie wurden bereits

synergistische Signalwege beschrieben (Stavri et al., 1995). In welcher Form mCPP und

Hypoxie interagieren können, ist bisher nicht bekannt. Allerdings wurde bereits gezeigt, dass

Diskussion

119

sowohl mCPP (Gobbi et al., 2002; Baumann et al., 2001) als auch Hypoxie (Fanburg & Lee,

2000; siehe auch 1.4.6) auf den SERT wirken können. Daher scheint auch hier ein

synergistischer Mechanismus bei der Entstehung der Neomuskularisierung möglich.

4.4 Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors

Um zu bestimmen, in welchem Zelltyp der 5-HT2B Rezeptor in der Lunge lokalisiert ist,

wurden sowohl immunhistochemische Färbungen als auch in situ-Hybridisierungen

durchgeführt. Als methodische Positivkontrolle wurde der Vormagen der Ratte verwendet, da

der 5-HT2B Rezeptor aus diesem Gewebe kloniert wurde (Foguet et al., 1992; Kursar et al.,

1992). Um die Lokalisation des Rezeptors in der Lunge zu untersuchen, wurde ebenfalls die

Spezies Ratte verwendet.

4.4.1 Lokalisation in der Lunge

Sowohl die immunhistochemische Färbung als auch die in situ-Hybridisierung zeigten, dass

der 5-HT2B Rezeptor in den Endothelzellen der intrapulmonalen Blutgefäße exprimiert wird

(siehe 3.5.2 & 3.5.4). In der in situ-Hybridisierung war die Färbung auf die dem Lumen

zugewandte Schicht, die Endothelzellen, beschränkt (siehe Abb. 3.23). Bei der

immunhistochemischen Färbung zeigte sich in der Überlagerung der Fluoreszenzsignale

keine vollständige Kolokalisation unter Verwendung der Antikörper gegen den 5-HT2B

Rezeptor sowie den von-Willebrand-Faktor (vWF), welcher als Endothelmarker verwendet

wurde. Das teilweise Fehlen einer Kolokalisation lässt sich dadurch erklären, dass der vWF

in so genannten Weibel-Palade Körpern lokalisiert ist (Wagner et al., 1982). Dabei handelt es

sich um Zellorganellen, die im Zytoplasma lokalisiert sind. Der 5-HT2B Rezeptor stellt jedoch

ein Transmembranprotein dar, so dass die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation eine

Erklärung für das Erscheinungsbild der immunhistochemischen Färbung sein könnte.

Desweiteren nimmt die Anzahl der Weibel-Palade-Körper mit geringer werdendem

Gefäßdurchmesser ab. Daher ist das Verteilungsmuster der immunhistochemischen Färbung

gegen den vWF sehr heterogen. Auch dies beeinträchtigt eine Kolokalisation. Es wurden

auch andere Endothelmarker wie z.B. ein Antikörper gegen eNOS verwendet. Diese stellten

sich jedoch als ungeeignet heraus.

Die zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors wurde in der Lunge bisher nur in wenigen

Studien beschrieben. Mittels RT-PCR wurde allerdings die RNA des Rezeptors in

pulmonalen Arterien sowie isolierten Endothelzellen nachgewiesen (Ullmer et al., 1995). In

einer weiteren Studie wurde der 5-HT2B Rezeptor in der glatten Muskulatur der Bronchien mit

Diskussion

120

einem polyklonalen Antikörper lokalisiert (Choi & Maroteaux, 1996). Dieser Befund steht im

Kontrast zu den Ergebnissen dieser Arbeit. Allerdings wurde bisher kein funktioneller

Hinweis auf eine Expression des Rezeptors in den Atemwegen publiziert. Launay et al.

verwendeten ebenfalls einen polyklonalen Antikörper zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors in

der Lunge. mit diesem Antikörper wurde der Rezeptor in der glatten Muskulatur der

pulmonalen Blutgefäße nachgewiesen (Launay et al., 2002). Eine Erklärung für diesen

Befund kann nicht gegeben werden. Allerdings besteht die Möglichkeit von interspezifischen

Unterschieden, wie sie für die Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge bereits

beschrieben wurden (Ullmer et al., 1995).

Die Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in Endothelzellen wirft die Frage auf, wie dieser

Befund im Kontext der PH zu werten ist. Zwar sind nahezu alle Zelltypen an der

Pathogenese der Krankheit beteiligt, jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die

Stimulation des 5-HT2B Rezeptors zur Ausbildung einer neuen Muskelschicht führte, die

durch die Blockierung des Rezeptors reduziert werden konnte (siehe 3.3.1). Auch eine

mögliche Induzierung von Proliferation und/oder Zelldifferenzierung über Aktivierung der

ERK (siehe 3.3.4) würde eher für die Lokalisation des Rezeptors in der glatten Muskulatur

sprechen. Da es sich bei der PH um eine multifaktorielle Krankheit handelt und bereits

mehrere Interaktionsproteine des 5-HT2B Rezeptors beschrieben wurden (siehe 4.2.4 &

4.2.3), besteht die Möglichkeit, dass der Prozess der Neomuskularisierung über einen im

Endothel lokalisierten Rezeptor initiiert wird. Die Kommunikation zwischen Endothelzellen

und glatter Muskulatur ist ebenfalls sehr komplex und es bedarf weiterer Untersuchungen,

um diese Zusammenhänge aufzuklären (Budel et al., 2001; Foubert et al., 2008; Kameritsch

et al., 2011).

4.4.2 Lokalisation im Magen

Die Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors mittels der in situ-Hybridisierung diente als

methodische Positivkontrolle für die verwendeten RNA-Sonden. Es fand eine spezifische

Anfärbung von Strukturen des Plexus Myentericus (PM) statt (siehe 3.5.1). Bereits in

anderen Studien wurde die Expression des 5-HT2B Rezeptors im PM beschrieben (Fiorica-

Howells et al., 2002; Bormann et al., 2002; Zhang et al., 2009). Lediglich die Arbeitsgruppe

um Duxon lokalisierte den 5-HT2B Rezeptor mittels immunhistochemischer Färbungen in der

glatten Muskulatur des Magens (Duxon et al., 1996). Die Ergebnisse der in situ-

Hybridisierung dieser Arbeit stehen daher weitestgehend im Einklang mit den Literaturdaten.

Die Bestimmung des Zelltyps innerhalb des PM warf allerdings Fragen auf. Vane (1957)

konnte zeigen, dass die Applikation von 5-HT zu einer gesteigerten Kontraktion des

Diskussion

121

Vormagens der Ratte führte. Dieser Effekt wird über den 5-HT2B Rezeptor vermittelt (Baxter

et al., 1994). In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass die 5-HT-induzierte

Kontraktion des Vormagens unabhängig von neuronaler Aktivität war (Amemiya et al., 1996),

so dass Neurone nicht der Expressionsort für den 5-HT2B Rezeptor sein können.

Daher wurde in dieser Arbeit mit den Interstitial Cells of Cajal (ICC) ein weiterer Zelltyp aus

dem PM auf die Expression des 5-HT2B Rezeptors überprüft. Die ICC werden auch als

Pacemaker bezeichnet und regulieren über spontane, rhythmische Kalzium-Wellen, so

genannte slow waves, die Motilität des gesamten Gastrointestinaltrakts (GIT) (Radenkovich

et al., 2005; Sanders et al., 2006; Takaki et al., 2010; van Helden et al., 2010). Die

Expression des 5-HT2B Rezeptors konnte bereits in ICC des Jejunum nachgewiesen werden

(Wouters et al., 2007 & 2009). In vitro Experimente zeigten jedoch, dass der 5-HT2B

Rezeptor in diesem Gewebe proliferationsfördernd wirkt. Möglicherweise handelt es sich um

gewebespezifische Unterschiede in der Funktion des Rezeptors im Vergleich zum

Vormagen.

Durch immunhistochemische Färbungen konnte der 5-HT2B Rezeptor in den ICC des

Rattenvormagens lokalisiert werden (siehe 3.5.3). Das Färbemuster des 5-HT2B Rezeptors

stimmte nahezu vollständig mit dem der ICC-Marker c-kit und ANO1 überein. Da im PM

jedoch auch weitere Zelltypen wie z.B. die enterischen Neurone oder enterische Glia

vorhanden sind, war es fraglich, warum durch die immunhistochemischen Färbungen der

komplette PM immunpositiv erschien. Eine mögliche Erklärung für diesen scheinbaren

Widerspruch liefern 3D-Rekonstruktionen der ICC im PM (Lee et al., 2009). In dieser

Darstellung zeigte sich, dass ICC die enterischen Neurone und deren Fortsätze mit

blattartigen Strukturen umhüllen, und sich deshalb mit Soma und Fortsätzen über den

kompletten PM erstrecken.

Neben den histologischen Arbeiten erfolgten durch die Etablierung einer Primärkultur aus

dem Vormagen der Ratte auch funktionelle Analysen der ICC. Diese untermauerten die

histologischen Ergebnisse, da die Stimulation von c-kit und des 5-HT2B Rezeptors zu einer

Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels in identischen Zellen führte (siehe 3.6.2).

Sehr auffällig war, dass in den kultivierten ICC keine slow waves detektierbar waren, obwohl

dies bereits mehrfach in vitro gezeigt wurde (Koh et al., 1998 & 2000; Parajuli et al., 2010;

Parsons & Huizinga, 2010). Es scheinen jedoch starke regionale Unterschiede innerhalb der

verschiedenen Abschnitte des Magens zu bestehen. In einer Studie konnte im Magen des

Meerschweinchens gezeigt werden, dass in Bereichen wie Antrum oder Corpus über slow

waves kommuniziert wird, wohingegen in dem Bereich, welcher dem Vormagen der Ratte

entspricht, keinerlei elektrische Spontanaktivität verzeichnet werden konnte (Hirst &

Diskussion

122

Edwards, 2006). Dagegen wurden slow waves in Präparationen des Rattenfundus

nachgewiesen (Kito et al., 2009). Es scheint daher ein funktioneller Unterschied zwischen

den einzelnen Magenabschnitten zu bestehen, der sich in der Aktivität der ICC widerspiegelt.

Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass durch histologische Untersuchungen sowie

in vitro Analysen der Nachweis erbracht wurde, dass der 5-HT2B Rezeptor im Vormagen der

Ratte nicht von Neuronen oder Glattmuskelzellen, sondern ICC exprimiert wird.

4.5 Ausblick

In dieser Arbeit wurden Bedeutung und Funktion des 5-HT2B Rezeptors im Tiermodell der PH

untersucht. Da dieser Rezeptor auch eine wichtige Rolle in der Migräneentstehung spielt,

wurden Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Pathologien untersucht

und herausgearbeitet.

Die Erkenntnisse dieser Arbeit können als Grundlage für weitere Forschungsarbeiten dienen.

Besonders die Wirkung von mCPP im Tiermodell der PH sollte weiter untersucht werden.

Sowohl die synergistischen Effekte mit der Hypoxie als auch die Fähigkeit unter

normoxischen Bedingungen eine Remodellierung der pulmonalen Blutgefäße auszulösen,

bieten viele Möglichkeiten für weitere Arbeiten. Da mCPP ein relativ breites

pharmakologisches Profil besitzt, sollte untersucht werden, ob neben dem 5-HT2B Rezeptor

weitere Rezeptoren an der mCPP-induzierten Neomuskularisierung beteiligt sind. Dazu

könnte Tieren während der Hypoxiebehandlung neben mCPP auch BF-1 verabreicht

werden. Dieser Ansatz wäre besonders dadurch interessant, als die Blockierung des 5-HT2B

Rezeptors zu einer Reduktion der Neomuskularisierung führte. Eine weitere Möglichkeit

besteht in der Verwendung von BW723C86 als spezifischem Agonisten des 5-HT2B

Rezeptors.

Auch weitere Untersuchungen zur Expression des 5-HT2B Rezeptors und von Proteinen,

welche der MAPK/ERK-Signalkaskade angehören, würden weitere wichtige Erkenntnisse

liefern. Versuchsansätze, in welchen das Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten zu Beginn

der Hypoxiebehandlung (z.B. 1-14 Tage) entnommen wird, könnten den Zeitpunkt der 5-HT2B

Rezeptor-vermittelten Prozesse eingrenzen.

Da der 5-HT2B Rezeptor in Endothelzellen lokalisiert werden konnte, wären weitere in vitro

Experimente interessant. Zwar scheiterte die Etablierung einer Primärkultur aus der Lunge

bisher, es könnten jedoch auch Zelllinien wie HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial

Cells) verwendet werden. Die Kommunikation zwischen Endothelzellen und

Glattmuskelzellen könnte in Kokulturen untersucht werden. Die Proliferation und

Diskussion

123

Differenzierung glatter Muskelzellen könnte durch den Transfer von konditioniertem Medium

nach Stimulation mit 5-HT, mCPP oder BW723C86 analysiert werden.

In Bezug auf die Erforschung der Migräne zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eher

Unterschiede als Gemeinsamkeiten zur Krankheit der PH bestehen. Trotzdem bleibt die

Frage besonders interessant, wie der 5-HT2B Rezeptor in beiden Pathologien eine wichtige

Bedeutung einnimmt, obwohl sich die Funktionsweise des Rezeptors in der Dura mater und

der Lunge stark zu unterscheiden scheint. Diese Besonderheit wird Bestandteil der weiteren

Erforschung der PH und der Migräne sein.

Zusammenfassung

124

5. Zusammenfassung

Bei der Pulmonalen Hypertonie (PH) handelt es sich um eine Erkrankung der Lunge, bei der

durch die Remodellierung pulmonaler Blutgefäße ein erhöhter Gefäßwiderstand

hervorgerufen wird. Im Verlauf der Krankheit kommt es zur Hypertrophie des rechten

Herzventrikels, welche schließlich zur Herzinsuffizienz führt.

Sowohl in der Entstehung der PH als auch der Migräne spielt der 5-HT2B Rezeptor eine

wichtige Rolle. Es wurde bereits gezeigt, dass die pharmakologische Blockierung des

Rezeptors in beiden Krankheiten zu einer Inhibition der pathologischen Prozesse führen

kann. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors sowie der

Einfluss von Migräne-assoziierten Pharmaka auf die Pathogenese der PH im Tiermodell

untersucht.

In dieser Arbeit wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie zur Induktion der PH in

Mäusen eingesetzt. Die histologische Quantifizierung muskularisierter Blutgefäße in der

Lunge ergab, dass eine Behandlungsdauer von vier Wochen notwendig war, um eine

Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung in intrapulmonalen Blutgefäßen hervorzurufen.

Dieser pathologische Prozess zeigte sich als persistierend, da die Neomuskularisierung bis

zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung bestehen blieb.

Es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B

Rezeptors während der Hypoxiebehandlung mit dem spezifischen Antagonisten BF-1 eine

Reduzierung der Neomuskularisierung pulmonaler Blutgefäße bedingte. Allerdings konnte

auch gezeigt werden, dass die Inaktivierung des Rezeptors nach der Hypoxiebehandlung die

Neomuskularisierung nicht umkehren konnte. Dieser Befund spricht dafür, dass der 5-HT2B

Rezeptor zwar eine Funktion in der Entstehung der PH einnimmt, am Fortschreiten der

Pathologie jedoch unbeteiligt ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die

Hypoxiebehandlung die Expression des 5-HT2B Rezeptors auf RNA-Ebene nicht veränderte.

Zudem wurde mittels Western Blot die MAPK/ERK-Signalkaskade als möglicher

Signaltransduktionsweg des Rezeptors identifiziert.

Die Inhibition der NO-Synthase (NOS), welche bereits im Tiermodell der Migräne zu einer

Blockierung des Phänotyps führte, zeigte im Tiermodell der PH keine Wirkung auf die

Remodellierung der intrapulmonalen Blutgefäße. Gleichwohl war die Expression der NOS in

der Lunge nach der Hypoxiebehandlung erhört. Die Applikation von Sumatriptan, einem

akuten Anti-Migränikum und Agonisten am 5-HT1B Rezeptor, verstärkte die Hypoxie-

induzierte Neomuskularisierung. Ebenso führte mCPP, ein partieller Agonist des 5-HT2B

Rezeptors und ein bekannter Migräneinduktor, ebenfalls zur Verstärkung der Hypoxie-

induzierten Neomuskularisierung der intrapulmonale Blutgefäße. Diese Verstärkung beruhte

Zusammenfassung

125

nicht auf einem additiven, sondern einem synergistischen Effekt von Hypoxie und mCPP.

Darüber hinaus verursachte die Applikation von mCPP auch unter normoxischen

Bedingungen die Neuausbildung einer vaskulären Muskelschicht. Es konnte gezeigt werden,

dass sich die zellulären Mechanismen der mCPP-induzierten Neomuskularisierung sowie der

Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung unterscheiden.

In weiteren Versuchen wurde die zelluläre Lokalisation des Rezeptors im Vormagen der

Ratte, dem Organ der Klonierung des Rezeptors, sowie der Lunge untersucht. Der 5-HT2B

Rezeptor konnte durch in situ-Hybridisierung, immunhistochemische Färbung sowie in vitro

Experimente in Interstitial Cells of Cajal lokalisiert werden. In der Lunge wurde der 5-HT2B

Rezeptor in Endothelzellen detektiert.

Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern neue Ansatzpunkte für die Erforschung der PH sowie der

Migräne. Zudem konnten weitere Erkenntnisse über die Lokalisation und Funktion des

5-HT2B Rezeptors gewonnen werden.

Summary

126

6. Summary

Pulmonary Hypertension (PH) is a disease affecting the lung. In the progress of PH

remodeling of the pulmonary blood vessels leads to an increase in the vascular resistance,

which finally causes right heart failure due to right ventricular hypertrophy.

The 5-HT2B receptor plays a major role in the pathogenesis of PH as well as in migraine.

Studies could show that the pharmacological inhibition of this receptor counteracts the

pathological events that occur in both conditions. In this work the role of the 5-HT2B receptor

and the impact of migraine-related pharmacological substances on PH were further

analyzed.

In this PhD work the animal model of normobaric hypoxia was used to trigger PH in mice.

The histological quantification of muscularized blood vessels in lung sections revealed that a

hypoxia treatment of four weeks was necessary to establish the hypoxia-induced

neomuscularization in the pulmonary vasculature. This effect turned out to be a persistent

morphological remodeling of the blood vessels that was not reversible up to eight weeks after

the hypoxia treatment.

Further experiments of this work confirmed that the inhibition of the 5-HT2B receptor during

the hypoxia treatment by the specific antagonist BF-1 leads to a reduction in the process of

vascular neomuscularization. However, the inactivation of the 5-HT2B receptor after the

hypoxia treatment failed to reverse the established vascular remodeling. These results

indicate that the 5-HT2B receptor exhibits a function in the onset but not in the progression of

PH. Aside from these findings the expression of the 5-HT2B receptor remained unchanged on

the RNA level after hypoxia treatment. In addition, the MAPK/ERK-pathway was identified as

a potential target for the 5-HT2B receptor mediated signaling.

The inhibition of the nitric oxide synthase (NOS), which is capable of beneficial effects in an

animal model of migraine, had no impact on the formation of the vascular remodeling in the

animal model of PH. Nonetheless, the expression of NOS was increased in the lung by the

hypoxia treatment. The application of Sumatriptan, the most widely used anti-migraine drug

and a potent agonist at 5-HT1B receptors, caused a severe enhancement of the hypoxia-

induced neomuscularization. mCPP, a partial agonist of the 5-HT2B receptor and know for its

migraine-inducing features, increased the hypoxia-induced neomuscularization as well. This

process was based on a synergistic, but not an additive effect of hypoxia and mCPP.

Furthermore, the application on mCPP under normoxic conditions caused the generation of a

new muscle layer in pulmonary blood vessels. It was apparent that the cellular mechanisms

of the hypoxia-induced neomuscularization and the mCPP-induced neomuscularization

differ.

Summary

127

In additional experiments the cellular expression of the 5-HT2B receptor was determined in

the forestomach, where the receptor has originally been cloned from, and the lung of the rat.

By means of in situ hybridization, immunohistochemical stainings and in vitro experiments

the 5-HT2B receptor was localized in Interstitial Cells of Cajal of the rat forestomach. In the

lung, the receptor was detected in endothelial cells.

The results of this PhD work present new perspectives for the research on PH and migraine.

In addition, further insights on the localization and function of the 5-HT2B receptor were

delivered.

Literaturverzeichnis

128

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Zopf, D. A., L. A. A. das Neves, K. J. Nikula, J. B . Huang, P. B. Senese, and M. R. Gralinski. 2011. C-122, a novel antagonist of serotonin receptor 5-HT2B, prevents monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats. European Journal of Pharmacology 670:195-203.

Zou, M. H. and V. Ullrich. 1996. Peroxynitrite formed by simultaneous generation of nitric oxide and superoxide selectively inhibits bovine aortic prostacyclin synthase. Febs Letters 382:101-104.

Zuckerbraun, B. S., B. Y. Chin, B. Wegiel, T. R. Bi lliar, E. Czsimadia, J. Rao, L. Shimoda, E. Ifedigbo, S. Kanno, and L. E. Otterbein . 2006. Carbon monoxide reverses established pulmonary hypertension. Journal of Experimental Medicine

Danksagung

146

Danksagung

Lebenslauf

147

Veröffentlichungen

148

Veröffentlichungen

Posterbeiträge:

Bäcker, I.; Zhu, X.; Lübbert, H.

Localization of the 5-HT2B receptor in Interstitial Cells of Cajal in the rat stomach

34. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie in Bonn

(30. März - 02. April 2011)

Zeitschriftenartikel:

Leichsenring, A., Bäcker, I., Wendt, W., Andriske, M., Schmitz, B., Foguet, M.,

McMahon, S., Stichel, C.C., Lübbert, H . Differential expression of Cathepsin S and X in the

spinal cord of a rat neuropathic pain model. BMC Neuroscience 2008 9:80-92

Leichsenring A., Andriske M., Bäcker I., Stichel C. C., Lübbert H. Analgesic and

antiinflammatory effects of cannabinoid receptor agonists in a rat model of neuropathic pain.

Naunyn-Schmiedeberg’s Archieves of Pharmacology 2009 379(6):627-636.

Erklärung

149

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät

eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es

handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild

völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 07. Februar 2012

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