H. W. DExKER, Freiburg:

Furchung heim Säugetier: Differenzierung von Trophoblast- und Embryonal­knotenzellen

Mit:2 Abbildungen im Text

Die Furchung ist beim plazentalen Säugetier total Das Ergebnis ist ein Zellhaufen.der Üblicherweise ohne weiteres der Morula anderer, holoblastischer Tiere gleichgesetztwird (ygl. z. B. A mphibicn). Das Schicksal dieser zwei Arten von "J!om/ae" ist abersehr yersehieden. Aus der typischen Holoblastier-Mornla wird eine Blastula, die spätergastrnliert und ihr gesamtes Zellmaterial dem Aufbau des Embryonalkörpers beisteuert.Aus der Säuger-"l\[orula" dagegcn wird eine IJ/astozyste, die ans cmbryonalem (Embryonal­knoten) und extraembryonalem (Trophoblast) :JIaterial besteht. Ein Blastulastadiumund ein Blastozöl gibt es beim Säugetier nicht. Die Blastozystenhöhle ist yielmehr imtypischen Fall der direkte Yorläufer der Dottersackhöhle. Wenn es beim Säugetier einBlastozöl gäbe, so mÜßte dieses im Embr:-·onalknoten liegen und nur yon Embryoblast­(nicht Trophoblast-) Zel1en nrngeben sein. Die Bildung der Keimblätter erfolgt ohneZwischenschaltung eines solchen Blastulastadiums. Sie beginnt beim Kaninchen etwaeinen Tag nach Bildung der Blastozyste (ygl. DExKER. 1970a). Wenn man mit dentypischen Holoblastiern yergleichen will. sollte man sich auf die Betrachtung der Em­bryonalknotenzellcn und ihrer Yorläufer beschränken. jIan könnte dann sogar sagen.daß beim Kaninchen die Furchung (des Embryollalknotenmaterials) nach Bildung derBlastozyste noch einen Tag andauert.

[nter "Furchung" yersteht man aber beim Säugerkeim Üblichel'weise nur die Ent­wicklungsschritte bis zur Bildung der Blastozyste. Der wesentliche entwicklungsphysiolo­gischI' Vorgang während dieser Säuger-" Furc h ung" ist di t' 11orbereituny der B/astozysten­bi/dung durch Differenzieruny zlceier Zellinien: prtisll1nptive F:mbryona/knotenzellen und

priisumptive l'rophoblastzellen. Entwicklullgsphysiologische Experimente (SEIDEL, 19GO)und Beobachtungen an Zellkulturen (COLE. EDW.-\.RDSund PAUL, 19(6) weisen darauf hin.daß die Differenziernng schon in sehr frÜhen Fnrehungsstadien, lange yor Bildnng derBlastozyste, beginnt. AJs besonders gÜnstige jIethode, diese zwei Zellinien morphologischzu unterseheiden und zu yerfolgen, erwies sieh uns beim Kaninchen die Bromphenol­blaufärbllng (BPB bzw. HgBPB) von l'araffinschnitten nach FAE (Formol-Alkohol­Eisessig)- Fixierung (DEXKER, 1970 b). Die Keimc sollten stets isoliert fixiert werden.Eine Fixierung in der Tube bringt beim Kaninchen diese Unterschiede weniger klar zurDarstellung. Auf Grund zweier IÜiterien könuen beim Kaninchen bestimmte BlastomereJlals präsurnptive Trophoblastzellen angesprochen wcrden: stärkere Farbstoffaufnahme undtangentiale Ausrichtung. Die prtisumptivell Emhryonallmotenzellen bilden einen kompaktenHaufen rundlicher bis radiär gestellter, heller gefärbter Zellen, dem die Trophoblastzellenals einschichtige Kappe aufsitzen, ohue ihn aber yollständig zu umgeben (A bb. 1 a---c). Diesetopographischen Verhältnisse ließen sich zuerst im 8-Zell-Stadiul1l zeigen; sie bleiben bisin die ältesten Furchungsstadien (64 -128 Zellen) bestehen. Die Bedeckung der Em­bryonalknotenzellen durch die Trophoblastzellen wird offenbar erst bei der Bildung derBlastozyste yollständig. Daß diese Kappe während der Furchung immer nur einen Teilder Zirkumferenz bedeckt, ist wichtig für die Diskussion des Mechanismus der Differen­zierung dieser zwei ZeJltypCl1. Es spricht gegen die Auffassuug, daß Furchungszellen

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dadurch zu Embryonalknotenzellen determiniert werden, dal3 sie von anderen Blasto­meren vollständig umgeben werden (TARKOWSKI und WROBLEWSKA, 1967; JVIINTZ, 1965):es spricht fÜr den von SEIDEL vorgeschlagenen :\leehanismus (SEIDEL, 1960, J969:MUL:\'ARD, 1966).

Das Auftreten von morphologischen Unterschieden zwischen präsumptiven Tropho­blast- und Embryonalknotenzellen in frÜhen Furchungsstadien ist schon um die .Jahr­hundertwende fÜr verschiedene Säugerarten oft diskutiert worden, wenn auch vorwiegendnnter anderem Aspekt (Lit. s. n.). Es fand sich keine einhellige Zustimmung, da färberischeUnterschiede mit den verwendeten :\Iethoden nur ge1egentlich, nicht aber sicher reprodn-

j k lAbb. 1. a-,.l) Kaninchen. HgBPB, 230 x. EmbryonaJknotenzellen hell, Trophoblastzellen dunkel.a) 40 h p.c. Drei helle und vier dunkle Zellen sine] angeschnitten. b) nm] c) 63 h p.c. Die dunklenBlastomeren umgreifen die Grnppe der hellen bei verschiedenen Keimen verschieden weit.cl) 3 d 8 h p.c. Junge Blastozyste.e-h) Mans. 370 x.e) 8-Zell-Stadium, 3. Tag 9 Uhr. HgEPH. Vier BJastomeren angeschnitten, keine Färbllllgs­unterschiede. f) 12-Zell-Stadinm, 3. Tag 16 Uhr. HgEPB. Sechs Zellen getroffen. g) Blastozyste,4. Tag 9 Uhr. HgBPE. Das Zytoplasma einer Zelle der Rauberschen Deckschicht (oben) istgeringfÜgig stärker gefärbt. h) Blastozyste, 4. Tag 9 Uhr. BPB. Gleichmäßige Anfärbung allerZellen.

i-I) Hamster. 370 x.i) 4-Zell-Stadium, 60 h p.c. EP B. Die obere der drei angeschnittenen Blastomeren ist geringfÜgigschwächer gefärbt. j-I) Blastozysten, 3 d 12 h p.c. HgBPB. Alle Zellen gleich gefärbt (j) oderTrophoblastzellen dunkler (bei k links vom Embryonalknoten, bei I Über nnd neben dem EIIl­bryonalknoten ).

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zierbar zu zeigen waren, so da13 meist nur das unsichere Kriterium der Zeilgröße und

ZelJgestalt blieb (vgL HEIiSER und STREETER, 1929; A~IORoso u. a., 1942). Abbildungen,die solche Blastomerenunterschiede wiedergeben, finden sich nur vereinzelt, und zwarfÜr das Kaninchen bei VAN BEXEDEX 1880 (PLANCHE IV Fig. 1-7), AssHEToK 1896

(PI. 14 Fig. 18-20, PI. 16 Fig. 22), GREGORY 1930 (PUTE 2 Fig. 25-27); fÜr die Fleder­maus bei VA1'\BENEDEN und JULII\ 1880 (Planche XXIII Fig. 6, 6), VAN BENEDEN 1899

(Fig. 1 S. 310), VAK BENEDEN HH1 (Planche II Fig. 25, 29; Planche III Fig. 37, 40, 42),DuvAL 1895 (Fig. X S. 151, PI. III Fig. 9-21, 24, 25); fÜr den Maulwurf bei HEAPE 1886(PI. XI Fig. 20); fÜr das Schaf bei ASSHETOK 1898/99 (PI. 15 Fig. 7-12, PI. 18); fÜr dasSchwein bei HEUSER und STREETER 1929 (Fig. 6 S. 16, Fig. 6 S. 17, PJate 12); fÜr die

Ziege bei Amoroso u. a. 1942 (Text-fig. 4 S. 388, Text-fig. 6 S. 390); fÜr Ratte und Maussiehe die Arbeiten von DALcQ nnd }IuLxARD (Literaturverzeichnis s. DEXKER, 1970b,

vgJ. z. B. JVImxARD, 1966, Fig. 2 S. 260), CALARCOund BRO"'X 1969 (Plate 2 Fig. 1).Wir haben jetzt geprÜft, ob die beim Kaninchen erfolgreiche FAE-HgBPB-}Iethode

(s.o.) sich bei Maus und Syrischem Goldhamster bewährt.

Material und Methoden

65 Keime von 14 Mäusen und 42 Keime von 7 Hamstern wurden untersucht. Die Tiere wurdenbei konstantem HelJ-DunkeJ-Rhythmus (Dunkelphase 18.00 Uhr bis 6.00 Uhr) nach Geschlech­tern getrennt gehalten. Die Hamster wurden unter Beobachtung belegt (Stadienangabe postcoitum, p.c.). Die Mäuse wurden über Nacht mit }Iännchen zusammengesetzt; der Tag, an demein Vaginalpfropf gefunden wird, gilt als erster Tag der Trächtigkeit. Die meisten Keime wurdentrotz der obengenannten Einwände aus technischen Gründen in der Tube bzw. im Uterus fixiert.

Material von der l'vlaus

3. Tag vormittags und nachmittags: Alle Keime in der Tube fixiert. 10 Tiere. Keime: 2-Zeller,morphologisch normal: 1; 2-Zeller, pathologisch: 3; 4-Zeller: 24; 6-Zeller: 2; 8-Zeller: 19; 9-15­Zeller: 2; 16-Zeller: 2.

4. Tag vormittags: Isoliert fixierte Keime: 4 Keime von 2 Tieren, davon 2 }Iorlllae, 2 Blasto­zysten. Im Uterus fixierte Keime: 8 Blastozysten von 2 Tieren.

Material vom Hamster

21/2-23/4 d p.c.: alle Keime in der Tube fixiert. 4 Tiere. Keime: 2-Zeller: 2; 4-Zellel': 22; 8-Zeller: 3.3 d p.c.: alle Keime im Uterus fixiert. 1 Tier. 8-Zeller: 6.31/2 d p.c.: aUe Keime isoliert fixiert. 2 Tiere. 9 Blastozysten.Das Material wurde mit FAE fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5-7 ,um-Serienschnitte zer­

legt. Färbung mit Bromphenolblall mit und ohne Sllblimatzusatz (BPB bzw. HgBPB, S. }IAZL\u. a., 1953). Zur Methodik vgI. DExKER 1970a u. b. Von allen Schnitten wurden Fotografienangefertigt und zur Auswertung mit herangezogen.

Ergebnisse

Bei der ilJ aus zeigen sich nur bei einigen Keimen geringe Färbungsunterschiede zwi­schen den Blastomeren, vor allem in späteren Furchungsstadien. Sie sind nie sehr aus­

geprägt; das gilt fÜr ausgespÜlte Keime ebenso wie fÜr in der Tube fixierte. Eine Korre­lation der Färbungseigenschaften mit Unterschieden der Zellgestalt (wie beim Kanin­chen) gelingt nicht. Auch im Blastozystenstadium sind Trophoblast und Embryonal­knoten entweder gleich oder nur undeutlich verschieden angefärbt (Abb. 1 e-h).

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Bei Hamster-Blastozysten dagegen färbt sich der Trophoblast in der Regel wesentliehstärke r an als der Embryonalknoten (vgI. Abb. 11; HANuLToN und SAJ'vIUEL1966, Plate 7Fig. 62). Dies ist nieht durehweg zu beobaehten; vor alJem werden bei jüngsten Blasto­zystenstadien oft all e Zellen gleich gefärbt. In Furchungsstadien treten hin und wiederFärbbarkeitsunterschiede zwischen den Blastomeren deutlich hervor. Sie lasscn sich

nicht mit Unterschieden der Zellgestalt korre1ieren (Abb. Li). Da alle Furchungsstadiendes Hamsters in der Tub e bzw. im Uterus fixiert wurden, ist eine IV eiterführung derUntersuchungen an ausges pÜlten Keimen notwendig .

.. Furchung" ..··------~I~ Blastozystenbildung ----1

F

Abb.2. Schema der Entwicklungsschritte bis zum Blastozystenstadium.

Die FAE-HgBPB-JYIethode hat sich also bei der Maus nicht bewährt; beim Hamsterist ihr IV ert zweifelhaft. Erschwert wird die Analyse der Nagerkeime allerdings dadurch,daß die Zahl der Zellen beim Übergang ins Blastozystenstadium sehr klein ist (Hamster:Übergang 8 -'> 16 Zellen). Günstige Verhältnisse liegen bei den Tieren vor, die viele Fur­ehungszelJen bilden, vor alJem, wenn wie beim Kaninchen nach Beginn der Differenzierungvon Trophoblast- und Embrynalknotenzellen bis zur Bildung der Blastozyste noch eineReihe von Zellteilungen erfolgt (Abb. 2: C). Man hat dann eine Reihe von Stadien zurVerfügung, bei denen man mit jedem Schnitt viele Blastomeren trifft und miteinandervergleichen kann. Bei Maus und Hamster dagegen folgen das Auftreten von zytologisehenUnterschieden zwischen präsumptiven Tropho blast- und Embrynalknotenzellen unddie Bildung der Blastozyste vielleicht kurz aufeinander. Möglicherweise verhalten sichdiese Nager auch insofern etwas abweichend, als bei ihnen die Bedeckung der Embryonal­knotenzellen durch Trophoblastzellen noch vor Auftreten der Blastozystenhöhle voll­ständig wird (vgI. die Abbildungen bei DALcQ und MULNARD; HAMILTON und SAMUEL1966, Plate 7 Fig. 62). Es wÜrde dann auf Abb. 2 fÜr diese Tiere der IVeg A-B-F-Egelten, für das Kaninchen (ebenso wahrscheinlich Fledermäuse, Schwein und Ziege,Lit. s.o.) dagegen der Weg A-B-C-D-E. Das bisher vorliegende Material bietetzwar keine JHög1ichkeit, diese Frage endgÜltig zu entscheiden. Es fÜhrt aber zu der Auf-

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fassung, daß die Differenzierung von Trophoblast- und Embryonalknotenzellen sich anFurchungsstadien des Kaninchens sehr viel besser stndieren läßt als an denen der lnnriclenNager.

Frau SOPHU EL-DEEB bin ich sehr dankbar fÜr ihre gewissenhafte technische Assistenz. DieUntersuchungen wurden durch :lIittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstÜtzt(De 181/1).

Summary

Processes of mammalian development bctween fertilization amI blastocyst fonnation arecommonly named cleavage, although strict comparability to holoblastiers is lacking. In mamma­lian cleavage, the most important event is the preparation of blastocyst fonnation by precociollSdifferentiation of trophoblastic and embryonic cells. This is dcmonstrated in the rabbit byHgBPB-staining of sections of F AA (formol-alcohol - acetic acid)-fixeel material. In the Syrianhamster and in the mouse, this method eloes not prove very usefull. The possibility of flifferencesin the ways of development, physiological aspeets ami results from Jiterature are briefly discussefl.

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Anschrift des Verfassers: Dr. Dr. H. W. DENKER, Arbeitsgruppe Prof. Dr. G. H . .:vI. GOTT­SCHEWSKIam Max-Planck-Institut fÜr Immunbiologie, 78 Freiburg, Stefan-:\'Ieier-Straße 8.

Aussprache:

DENKER (Schlußwort): Unterschiede in der Aufnahme des Farbstoffes Bromphenolblau zwi­schen den Blastomeren haben wir nur nach FAE-Fixierung gesehen, nicht nach Bouin, Formol­Kalzium, Glutaraldehyd-Kalzium oder nach Gefriersubstitution mit dem Zyanurchlorid-Fixie­rungsgemisch von GOLAXDu. a. Da FAE sicher eine Reihe von Substanzen aus dem Gewebeextrahiert [vgl. C. DICK and E. W. JOH?\S: Exptl. Cell Res. 51, 626-632 (1968)] wäre es denkbar,daß der beobachtete Effekt auf einen besonderen Reichtum der präsumptiven Embryonal­knotenzellen an einer FAE-Iöslichen Proteinfraktion zurÜckzufÜhren ist. Aus den histochemischen

Tests, die wir bis jetzt durchgefÜhrt haben, können wir nur entnehmen, daß diese Blastomerenoffenbar eine höhere Konzentration an zytoplasmatischer RNS und in späteren Stadien auchan Glykogen besitzen. Extraktionsversuche an Schnitten haben wir gerade erst begonnen. Kon­trollen durch andere Proteinreaktionen sind vorbereitet.

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Einzeln nicht im Buchhandel

Sonderdruck aus

Überreicht vom Verfasser

Verhandlungender Anatomischen Gesellschaft

auf der sechsundsechzigsten Versammlung in Zagrebvom 1. bis 4. Juni 1971

Herausgegeben

von dem Schriftführer der Gesellschaft

Max Watzka, Mainzund

Hermann Voss, Greifswald

Ergänzungsheft zum 130. Band (1972)des Anatomischen Anzeigers

VEB GUSTAV FISOHER VERLAG JENA

Alle Rechte vorbehalten· Printed in the German Del110cratic Republic

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