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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.
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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007
-~
......,.__~/
Fachbereich eHE M I E der Fhilipps-Universität l':arburg
Protokoll zum 1. Experimentalvortrag vom 03.06.1980
Thema des Vortrags: PRO TEl N E
Rudolf Bochskanl
Feldweg 5
3550 Marburg/Cappel
Chemie in der Schule: www.chids.de
G 1 i e der u n g
1. Vorkommen
2. Bau und Struktur
a) Elementare Zusammensetzung
b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Primärstruktur
c) Räumliche Anordnung Sekundärstruktur
d) Molekülgröße und -gestalt Tertiärstruktur
J. Eigenschaften
a) Art und Struktur des Froteins
b) Art des Lösungsmittels
c) pH-Wert der Lösung
d) Veränderung der Tertiärstruktur
Literaturverzeichnis
Anhang
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1. Vor kom m e n
Die Materie der lebenden Welt besteht aus einer großen Vielfalt
organischer Verbindungen, von denen sehr viele makromolekularen
Charakter haben. Im pflanzlichen Bereich handelt es sich dabei
vorwiegend um Polysaccharide, im tierischen um Eiweiße oder
Proteine.
Der Name "Frotein", von BERZELIUS geprägt und zuerst in M(fL/D:f:RS' s
Lehrbuch (1840) gebraucht, ist abeeleitet vom eriech. protos
das Erste, Ursprüngliche. Diesen Namen tragen die Froteine zu
Recht, denn zahlreiche Lebensfunktionen sind anspezifische
Proteine gebunden; ja wir kennen kein Lecen ohne Froteine.
So ist jeder heterotrophe Organismus, sprich jedes Tier, zur
Aufnahme von Froteinen mit der Nahrung gezwungen, die er über
Assimilationsprozesse in körpereigene Proteine umbaut.
Als Beispiele proteinhaltiger Nahrungsmittel seien als pflanz
liches ~rodukt Sojamehl (40 % ~roteingehalt) und Hühnereiklar
(12 % Proteingehalt) als tierisches Frodukt vorgestellt, in
denen durch die sog. 'Xanthoproteinreaktion' die Anwesenheit
von ~roteinen nachgewiesen werden kann. - Der Name 'Xantho
proteinreaktion' enthält das grieche Wort 'xanthos' - gelb,
blond; es ist also mit einer Gelbfärbung des Reaktionsgemisches
zu rechnen:
Versuch 1: Xanthoproteinreaktion
2 ml einer proteinhaltigen Lösung werden in einern
HG mit 2 ml c on c , Hl'~CIJ versetzt. Dann wird das
Reaktionsgemisch lanesam gekocht, bis die zunächst
auftretende Fällung wieder verschwindet.
Nach dem Abktihlen gibt man vorsichtig conc. NaOH
hinzu. Im alkalischen Bereich schlägt die gelbe
Farbe nach orange um.
Der Chemismus dieser Reaktion wird aus methodischen Gründen
an anderer Stelle nachgeholt.
2. Bau und S t r u k t u r
a) Elementare Zusammensetzung
Wie oben bereits angesprochen, handelt es sich bei den Froteinen
um biologische Makromoleküle, denen L-Aminosäuren als Bausteine
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zugrunde gelegt sind; man kennt heute 20 dieser Aminosäuren.
Die Verkntipfung der Aminosäuren zu einern Protein verläuft stets
geordnet, über die sog. Peptidbindung, zu Polyarninosäuren oder
Proteinen, falls diese aus mehr als 100 Aminosäuren bestehen,
wie man als Richtgröße festgelegt hat. Dabei erstreckt sich das
Spektrum der Molekulargewichte von froteinen von wenigen Tausend
bis zu mehreren Millionen. (Folie 1,.oben).
Trotz der Vielfalt der ~roteine (201 = 2,4x1018
Verknüpfungs
möglichkeiten der 20 Aminosäuren) ist ihre Zusammensetzung auf
lallend gleichförmig; sie vermag daher über die Eigenschaften
eines Froteins nicht viel auszusagen.
Proteine enthalten meist im selben Ausmaß: (Folie " unten).
Wie sofort auffällt, nimmt der Stickstoff, mit einem prozentualen
Anteil von 1;-18 %, eine wesentliche Stellung ein, wodurch sich
die Froteine von den anderen biologischen Makromolekülen wie
den Kohlenhydraten und den meisten Lipiden grundsätzlich unter
scheiden.
Neben diesen genannten Elementen enthalten viele Froteine noch
Spuren von: Pt Fe, Cu, Zn, 1'1n, Cl, Er, J.
b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Frimärstruktur
Um den Aufbau eines Froteins besser verstehen zu kannen, ist es
notwendig, sich genauer mit der Verknüpfung der Aminosäuren zu
einem Frotein auseinanderzusetzen: (Folie 2, oben).
Im Protein ist am ~-C-Atom die Carboxylgruppe einer Aminosäure
mit der Aminogruppe am ~-C-Atom einer zweiten Aminosäure durch
eine Peptidbindung - auch Amidbindung genal~t - kovalent ver
knüpft. Zwei Aminosäuren können formal unter Wasserabspalt~ng
zu einem Dipeptia kondensieren.
Das Gleichgewicht dieser Kondensation liegt bei Raumtemperatur
allerdings ganz auf der Seite der Edukte - die Feptidbindung ist
also endergonisch, da die Aminogruppe viel zu schwach nucleo
phil ist, um direkt mit der Carboxylgrup~e ein Amid zu liefern.
Bei der synthetischen Bildung von Feptiden und ~roteinen müssen
deshalb des reaktiven Gruppen zuerst "aktiviert", d v h , in eine
reaktionsfähigere Form gebracht werden, indem man z.B. die
Carboxylgruppe zunächst in eine Acylhalogenidgruppe überführt.
Durch fortgesetzte Kondensation bilden sich Tripeptide, Tetra
peptide und schließlich folypeptide, kettenförmige, aus Amino-
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säuren aufgebaute Makromoleküle. Dem auf diese Weise ent
standenen langgestreckten Molekül teilt man die Bezeichnung
Frimärstruktur zu: (Folie 3).
Zum besseren Verständnis dieses Sachverhaltes soll hierzu das
Modell einer Peptidkette, genauer, eines Fentapeptids, dienen,
das aus den Aminosäuren Cystein, Tyrosin, Glutaminsäure, Arginin
und Histidin aufgebaut ist. An diesem Peptidfaden kann man auf
grund der Feptidbildung zwei verschiedene freie Enden unter
scheiden: Einmal das Ende mit der freien Aminogruppe oder das
N-terminale Ende und andererseits das Ende mit der freien
Carboxylgruppe oder das C-terminale Emde. Auch am Modell wird
deutlich, daß die Aminosäure-Reste an der Feptidradenbildung
nicht beteiligt sind, sondern als voluminöse Reste seitlich
herausragen. Um möglichst große Abstände zwischen den Resten
zu erhalten, ist der reptidfaden jeweils am ~C-Atom gewinkelt
(1100
) ,
Da eine synthetische Peptidbildung über mehrere Reaktions
schritte verläuft und einen enormen Zeitaufwand erfordern würde,
soll auf einen Modellversuch zurtickgeriffen werden, der eben
falls eine Verknüpfung kleiner Bausteine zu einem Polymerisat
über Feptidbindungen zeigt:
Versuch 2: Darstellung von ~ylon 6,10 (Modellversuch)
Man füllt eine Lösung von 1,5 ml Sebacinsäuredi
chlorid im 50 ml CC1 4 in ein Becherglas. Darüber
schichtet man eine Lösung von 2,2 g Hexamethylen
diamin und 4 g ~a2coJ in 50 ml Aq. desto desto
Mit einer }inzette wird der sich bildende Grenz
flächenfilm in der Mitte der Oberfläche erfaßt und
als laufend sich bildender Faden aus dem Becherglas
abgezogen.
Der dabei ablaufende Kondensationsprozeß unter Freisetzung von
Hel ist auf Folie 2, unten dargestellt. Der Zusatz von Na 2CO Jbewirkt das Abfangen von Hel unter Freisetzung von CO2•
Der Nachweis, daß Froteine nun wirklich peptidarti~ verknüpft
sind, soll durch eine spezifische Nachweisreaktion für gebundene
Aminogruppen, der sog. Biuretprobe, erbracht werden:
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Versuch J: Biuretprobe: Na c hw e d s der Fept idbindung
Wenige ml verdürmter
a) Biuret-,
b) Eiklar-,
c) Glycinlösungen (= Glykokoll)
werden mit demselben Volumen 2 N NaOH und wenigen
Tropfen 0,1 %iger CuS04-Lösung versetzt. - Bei einem,. 2+ ( )Vberschuß an Cu -Ionen in jeder ~robe fällt Cu OH 2
in feinen, hellblauen Flocken aus.
Es bildet sich in den ~roben a) und b) sofort ein
intensiv violett gefärbter Komplex, während in Frobe
c) eine intensive Blaufärbung zu beobachten ist.
In allen drei Fällen beruht die Färbung auf einer
Komplexierung der Cu2+-Ionen.
Wie Folie 4 deutlich zeigt, bildet sich in den Froben a) und b)
der Biuretkomplex (violett), dagegen in Frobe c) der Arnino
glykokollkomplex (blau).
Verwendet man jedoch für die Biuretprobe eine Eiklarlösung, die
ca. JO Min. mit 2 N NaOH gekocht wurde, so fällt zunächst die
Braunfärbung der Lösung auf. Diese beruht auf der Anwesenheit
von Huminfarbstoff, einern C40-Molekül, das sich aus Zuckern Ce
bildet hat, die im Eiklar vorhanden sind. hach Zusatz von CuS04
Lösung müßte eich die Lösung blau gefärbt haben, die jedoch von
der Farbe des Huminfarbstofrs, trotz starker Verdünnung mit
Wasser, überdeckt wurde. Diese Reaktion ist dadruch zu erklären,
daß die Proteine im Eiklar hydrolytisch gespalten wurden, wodurch
die einzelnen Aminosäuren freieesetzt wurden.
Man kann also daraus schließen, daß sich die Spezifität der
Biuretprobe nur auf Peptidbindungen erstreckt, nicht aber auf
freie Aminosäuren.
Wie der letzte Versuch deutlich gezeigt hat, dürfte auch ex
perimentell die hohe Stabilität der kovalenten Feptidbindung
bewiesen sein, die erst nach längerem Kochen - hier: alkalische
Hydrolyse - gespalten wurde.
Diese Reaktion mach~man sich in der analytischen Biochemie zu
nutze; hier verfährt man in der Weise, daß man die Proteine
entweder durch Säure hydrolysiert oder durch Enzyme, was inso
fern von Vorteil ist, als hierbei keine Aminosäuren zerstört
werden.
Als Beispiel einer sauren Hydrolyse soll die Hydrolyse von Eiklar
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demonstriert werden:
Versuch 4: Saure Hydrolyse und Dünnschichtchromatographie von
Eiklar
10 g Hühnereiklar werden 24 h mit 40 ml 6 N HCI am
Rückflußkühler bei 110°C gekocht.
Am Rotationsverdarnpfer wird das Gemisch fast bis zur
Trockene eingedampft und anschließend zweimal mit
Wasser aufgenommen und der Vorgang wiederholt, um
die überschüssige Salzsäure zu vertreiben.
Dieses Hydrolysat wird chromatographisch untersucht:
Als Trägermaterial verwendet man DC-Flatten (20x20 cm)
Auf einer Ecke der ~latte, etwa 2 cm von den Rändern
entfernt, wird die Lösung des Eiweißhydrolysates mit
einer Mikropipette auIgetragen. Die Auftragung wird
7-8x wiederholt, jedoch erst dann, wenn der Fleck an
der Luft eingetrocknet ist.
Als Fließmittel verwendet man zwei verschiedene Ge-
mische:
1. F 1 i e ß mit tel: n - E u t an 0 1 : Eis e s s i g : }I20 = 4: 1 : 1
2. " Phenol: H20 = 4:1
Zur Entwicklung des Chromatogramms besprüht man mit
einer 0,1 %igen an Wasser gesättigten Lösung von
IJinhydrin in n-Butanol, der einiEe Tropfen Eisessig
zugesetzt wurden. Das Chromato€rarnm wird bei 105°C
im Trockenschrank getrocknet.
Die Reaktionsmechanismen der Hydrolyse entsprechen den Mech
anismen der Esterspaltung. Die Ninhydrinreaktion beruht auf
der Komplexierung der Aminstickstoffs der Aminosäuren.
Eine weitere Möglichkeit qualitativ zu überprüfen, welche
Aminosäuren am Aufbau eines Froteins beteiligt sind, liegt
darin, daß man spezifische Nachweisreaktionen der Arninosäure
Reste gefunden hat. Als ein Beispiel sei die spezifische Nach
weisreaktion auf den Aminosäure-Rest von Tryptophan demonstriert,
indem zwei verschiedene Froteine, nebst Tryptophan als Blind
probe, untersucht werden:
Versuch 5: Tryptophan-Nachweis nach HOfKINS & COLE
2 rnl verdünnter
a) Tryptophan-
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Versuch 5: (Fortsetzung)
b) Eiklar-
c) Gelatinelösungen
werden mit 1 ml Glyoxylsäurelösungen (10 %ig) ver
mischt. Anschließend wird das Stoffgemisch vor
sichtig mit cone. H2S04 unterschichtet.
Es bilden sich zwei Phasen, an deren Berührungs
fläche ein violetter Ring entsteht. Gewisse Verun
reinigungen können eine Verschiebung des Farbtons
nach Braunviolett hervorrufen.
Dieser violette Ring ist jedoch nur in den Froben a)
(Blindprobe) und b) zu beobachten. Frobe c) zeigt
keine Farbveränderung.
Hieraus läßt sich der Schluß ziehen, daß Tryptophan am Aufbau
der froteine im Hühnereiklar beteiligt ist, im Gegensatz zur
Gelatine.
Reaktionsmechanismus: Folie 5.
An dieser Stelle bietet sich die Erklärung der anfangs durch
geführten Xanthoproteinreaktion an, da diese ebenfalls auf dem
~achweis bestimmter Aminosäure-Reste beruht: Folie 6.
Es handelt sich bei dieser Reaktion um eine elektrophile Sub
stitution, und zwar werden aromatische Ringsysteme dabei nitriert,
die charakteristisch gelbe Farbverbindungen bilden. Nach Zugabe
von conc. NaOH wird diese nitrierte Seitenkette in eine aci
Nitroverbindung tibergefUhrt, die orange gefärbt ist.
Diese Reaktion kann also nur stattfinden, wenn sich in dem nach
zuweisenden Protein Aminosäuren mit einem aromatischen Ring be
finden, wie bei Tyrosin, Tryptophan und Fhenylalanin.
c) Räumliche Anordnung: Sekundärstruktur
Da Froteine ein Molekulargewicht bis zu mehreren Millionen auf
weisen können, tritt nun die Frage auf, ob es sich bei der Foly
peptidkette um eine randorn chain (zufällige Verknäuelung) handelt
oder um eine geordnete sich wiederholende Struktur?
Aus der Tatsache, daß sich die meisten }roteine in kristalliner
ro r m gewinnarl La s s e n , geht h e r-v o r-, daß die Larige r, ~ept idke t t en
eine gesetzmäßige Anordnung im Raum aufweisen müssen. Die grund
legenden Uri t e r-s u c hu.ng e n von PAULING & COREY haben zu dem Schluß
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geführt, daß die ~eptidketten entweder in Form eines ß-Falt
blattes (= pleated sheet) (Folie 7) oder einer ~ -Helix (Folie 8)
vorliegen; diesen beiden Konformationen ordnet man den Begriff
Sekundärstruktur zu.
Beim ß-Faltblatt handelt es sich u~ eine parallele Anordnung
zweier oder mehrerer Folypeptidketten, die durch Wasserstoff
Brücken zwischen dem Peptid-Stickstoff der einen Kette und dem
Carbonyl-Sauerstoff einer anderen Kette gebildet werden, wo
durch sich ein flächiges Gerüst bildet. Dabei stehen die Amino
säure-Reste jeweils senkrecht zur Faltblattebene.
Während beim Faltblatt die Wasserstoff-Brücken zwischen Gruppen
verschiedener Ketten auftreten, besteht durch die Bildung einer
Helix die Möglichkeit der Ausbildung von H-Brücken zwischen
solchen Gruppen ein und derselben Kette, wie dies nach jeder
vierten Aminosäure der Fall ist.
Als weitere Stabilisierung der Sekundärstruktur wirkt die Pep
tidbindung selbst, die eine freie Rotation um die Bindung zwischel
dem C- und N-Atorn nicht zuläßt, da diese Bindung partiellen
Doppelbindungscharakter besitzt:
Mesomere Grenzformeln der ~eptidbindung:
oI.
-C-N-,H
-Q19' 0
~-~ -C=lJI
H
.~
d) Molekülgröße und -gestalt: Tertiärstruktur
Von noch größerer Bedeutung für die Stabilität von Proteinen
als die H-Brücken un der Doppelbindungscharakter der ~eptid
bindung sind die Seitenkettenwechselwirkungen der Aminosäure
Reste, wodurch es zur Ausbildung der sog. Tertiärstruktur kommt:
(Folie 9). Durch dieses Zusammenspiel der einzelnen Bindungen
und Bindungskräfte, die allein durch die Frimärstruktur, d.h.
Aminosäure-Sequenz, vorherbestimmt sind, bilden Proteine drei
dimensionale Moleküle von wohl definierter Beschaffenheit:
(Folie 10). Die treibende Kraft ist das Bestreben der Poly
peptidkette, ihre Konformation mit maximaler Zufälligkeit oder
Entropie zu rinden. Aufgrund ihrer Molekülgröße und Dissozia
tion der aus dem Molekül herausragenden Aminosäure-Reste in
wäßriger Lösung besitzen die Froteine (Ausnahmen) Kolloid
charakter, wie im Versuch gezeigt wird:
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Versuch 6: Kolloidnatur von Froteinen: TYNDALL-Effekt
Eine Glasküvette mit einer Eiklarlösung wird von
dem Licht eines Projektors durchstrahlt: TY~DALL
Effekt.
Den makromolekularen Charakter von Pz-o t e Lrien macht man sich bei
der Trennung von Froteingemischen in der Biochemie zunutze,
indem man sie über einer "Säule" mit einem Folydextrangel, wie
z.B. Sephadex, trennt.
Versuch 7: Trennung von Proteinen durch Gelfiltration
Ein Gemisch aus Hämoglobin (68 000), Cytochrom c
(17 500) und Nitro-Tyrosin (227) - ~itrierung der
Aminosäure zur Sichtbarmachung - wird auf eine
Sephadex-Säule aufgetragen und durch Elution der
Säule mit Tris-Puffer (pH 8,2) getrennt.
Nach ca. JO Min. erkennt man in der oberen Gelzone
die gelb gefärbte Aminosäure, in der Mitte das rot
orange gefärbte Cytochrom c und unten des rot-braune
Hämoglobin.
Die Ursache dieser Auftrennung liegt in der Struktur des Gels
begründet. Sephadex besteht aus einem dreidimensionalen Netz
werk von Polydextranmolekülen, das durch Quervlnetzen mit Epi
chlorhydrin hergestellt wird. Proteinmolektile, die gr6ßer als
die größten Poren im gequollenen Sephadex sind, können nicht
in die Gelperlen eindringen. Sie wandern an ihnen vorbei und
verlassen die Säule zuerst mit der Elutionsfront. Kleineren
Molekülen sind um so mehr }oren im ~el zugänglich, je kleiner
sie sind. Sie dringen daher in die Gelperlen ein und wandern
entsprechend verzögert in der Elutionsfront. Im Eluat erscheinen
sie daher in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße: (Folien 11,12) •
J. E i gen s c h a f t e n
a) Art und Struktur des Pro teins
Aus der bislang erfolgten Charakterisierung der Proteine ist
hervorgegangen, daß sich viele Eigenschaften stark von der
Molekülgröße und mehr noch von der Molekülgestalt, d.h. der
Tertiärstruktur, ableiten lassen.
Ein Beispiel hierfür soll das Lösungsverhalten verschiedener
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Froteine in Wasser sein:
Versuch 8: Lösungsverhalten von Albumin und Collagen in Wasser:
Albumin und Collagen (hier: Stück einer Sehne) werden
in RG vorgegeben und in Wasser zu lösen versucht.
Albumin löst sich vollständig, während sich beim
Collagen keinerlei Anzeichen deutlich machen. Eine
Überprüfung erfolgt mittels Biuretprobe.
Die Ursache für das fehlende Lösungsvermögen von Collagen in
Wasser liegt zum einen in seiner Struktur (Fasermolekül, Tripel
helix) (Folie 13) und zum anderen in der Aminosäure-Sequenz be
gründet. Collagen wird vorwiegend aus den Aminosäuren Hydroxy
prolin und Glycin aufgebaut, die beide über unpolare Seiten
ketten verfügen, wodurch die äußerst schlechte Löslichkeit in
Wasser erklärt wird. Anders liegen die Verhältnisse beim Al
bumin. Dieses Protein besitzt eine kugelförmjge Konformation,
in der die unpolaren Reste ins Molekülinnere verlagert sind
und die polaren Reste quasi die "Proteinhülle" bilden, was eine
Lösung in Wasser ermöglicht.
b) Art des Lösunesmittels
Daß neben der Struktur des Froteins auch das Lösungsmittel
selbst für dessen Löslichkeit verantwortlich ist, zeigt der
nächste Versuch:
Versuch 9: Herabsetzung der Löslichkeit von Froteinen durch
organische Lösungsmittel
Eine Albuminlösung wird mit abs. Ethanol versetzt.\ULtJ
Es kommt zur Au s f ä Ll urrgvd arnd t zur Dena turierung des
Proteins, die jedoch durch Wasser im Überschuß z.T.
wieder rückgängig gemacht werden kann.
Die Zugabe von Ethanol bewirkt eine starke Herabsetzung der
Dielektrizitätskonstante des wäßrißen Milieus. Wasser bat eine
Dielektrizitätskonstante von 81, Ethanol von 26. Dies hat eine
starke Zurückdrängung der Dissoziationsvorgänge der Aminosäure
Reste zur Folge; das Molekül wird dadurch partiell oder voll
ständig entladen. Dies führt zur Abnahme der Hydratation, was
wiederum mit einer Abnahme der Löslichkeit der Iroteine kor
reliert ist. Man sagt, die Froteine werden denaturiert, d.h.
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der native Zustand wird verändert.
Durch Wasserzugabe werde~ die Dielektrizitätskonstante wieder
erhöht und die Dissoziationsvorgänge versträkrt. Die Löslich
keit nimmt zu, d.h. die Denaturierung wird aufgehoben, wenn
auch nicht vollständig, was darauf zurückzuführen ist, daß
einige Proteinmoleküle irreversibel geschädigt sind.
c) pH-Wert der Lösung
Eine weitere MBglichkeit den Ladungszustand eines Protein
moleküls und damit seine Löslich~eit in wäßrigem Milieu zu
beeinflussen besteht in der Veränderung des pH-Wertes der
Lösung.
Versuch 10: Bestimmung des IEP von Casein
250 mg reines Casein wird in 20 ml Aq. dest sus
pendiert und mit 5 ml 1 N NaOH versetzt. Nach er
folgter Lösung wird mit 5 ml 1 N Essigsäure neu
tra2isiert und mit Aq. dest. zu 50 ml aufgefüllt.
Herstellung der Essigsäure-Casein-Gemische (10 ml)
RG-Nr.: 1 2 J 4 5
0,01 N HOAc (mI)
0,1 N HOAc (mI)
1 , 0 1\1 HOAc (mI)
Aq. dest. (mI)
Caseinlsg. (mI)
zu erwartendespH des vollsteAnsatzes
0,6
8,4
1 , 0
;,9
2,5
6,5
1 • 0
5,J
1 ,0
8,0
1 , 0
4,7
4,0
5,0
1 ,0
4 , 1
1 , 6
7,4
1 J 0
3,.5
Reaktion klareLsg.
schw.Trb.
starkestarke klareAusfl.Trüb. Lösung
Die Erklärung dieses Phänomens läßt sich wieder durch die ver
schiedenen Seitenketten der einzelnen Aminosäuren im Frotein
begründen. Da sowohl basische wie saure Seitenketten auftreten,
besetzen Froteine ebenso wie die freien Aminosäuren Ampholyt
charakter, d.h. je nach pH-Wert der Lösung liegen die Froteine
als ~ation, mit einem Überschuß an positiver Ladung, oder als
Anion, mit einem Uberschuß an negativer Ladung, vor. In beiden
Fällen zeigt es also geladene Gruppen und ist somit im polaren
Lösungsmittel Wasser löslich. Im isoelektrischen Funkt (IEl) da
gegegen heben sich die Summe aller Ladungen statistisch gesehenChemie in der Schule: www.chids.de
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auf, das ~roteinmolekül liegt als Zwitterion vor und kann uem
entsprechend keine Hyd r-a t lrü Ld e rne hz- aufbauen, es fällt aus.
Zwischen diesen drei angesprochenen Extrema gibt es natürlich
fließende Ubergänge, wie im Versuch gezeigt wurde. Der IEF von
Casein liegt bei pH = 4,7. (Folie 14).
d) Veränderung der Tertiärstruktur
Haben die beiden letzten Versuche die ~roteine als kolloidal
gelöste Ionen demonstriert, so sollen im folgenden Beein
flussungen der Tertiärstruktur nachgewiesen werden.
Versuch 11: Denaturierung durch Hitze: irreversibel
" " Kälte: reversibel
\..-)
.'0
Unverdünntes Eiklar in zwei RG wird einmal durch
Hitze (Wasserbad) und 4urch Kälte (flüssige Luft)
denaturiert. In beiden Fällen wird das Eiklar rest
und weiß. Nach etwa 5 ~in. bei Raumtemperatur zeigt
die durch Kälte behandelte Eiklarprobe wieder ihre
Ausgangsform; Vergleich mit einer unbehandelten
Frobe. Die durch Hitze behandelte Frobe bleibt un-
verändert weiß und fest,sie wurde irreversibel de
naturiert: gekochtes Ei.
Die Ursache der irreversiblen Denaturierung ist zum einen, daß
durch das Erhitzen die Hydratation der Froteine vermindert wurde
und zum anderen, daß die kinetische Energie der Moleküle ver
mehrt wurde, wodurch die funktionellen Gruppen der Aminosäure
Reste durch Auflösung der intermolekularen Bindungen aktiviert
wurden. Das führte dazu, daß sich die feptidketten weitgehend
entfaltet haben und sich zu einer random chain angeordnet haben,
was mit einem Anstieg der Viskosität verbunden ist.
Anders liegen die Verhältnisse in der Kälte: Durch das Einfrieren
ist die kinetische Energie stark herabgesetzt worden, wobei je
doch die Kettenkonformationen der Froteine nicht verändert
wurden; deshalb konnte die Denaturierung durch vorsichtiges Er
wärmen wieder rückgängig gemacht werden.
Ähnlich liegen die Verhältnisse bei der Denaturierung durch
Metallionen:
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Versuch 12: Denaturierune durch Metallionen:
a) Schwermetallionen: irreversibel
b) Eralkalimetallionen: reversibel
Man gibt zu zwei HG mit Eiklarlösung Cu 2+-ronen durch
eine CuS04-Lösung bzw. Ca 2+-Ionen durch eine CaC12
Lösung. In beiden Fällen tritt sofort eine Dena
turierung der Fr-o t e a n e ein, die durch einen Lber
schuß an Wasser bei der Probe mit Ca2+-Ionen wieder
rückgängig gemacht werden kann, im Gegensatz zur
Cu 2+-haltigen ~robe.
Festzustellen gilt, daß in beiden Fällen den Froteinen die
Hydrathülle entzogen worden ist, was mit einer Entropiezunahme
verbunden ist, die durch die Fällung sichtbar wurde.
Die Tatsache jedoch, daß nach Wasserzugabe im Überschuß nur die
Proteine in der Frobe mit Ca-Ionen wieder in Lösung gehen, d.h.
ihre Hydrathülle wieder aufbauen, läßt auf eine weitere Reaktion
schließen. Die Ursache fUr die irreversible Denaturierung durch
Cu-Ionen liegt darin begrlindet, daß neben einer Zerstörung der
H-Brücken eine Komplexierung der Peptidkette erfolgte.
In einem letzten Beispiel soll eine Veränderung der Tertiär
struktur gezeigt werden, die auf der Grundlage beruht, daß die
meisten }roteine in wäßriger Lösung als Anionen vorliegen, was
auf die Zusammensetzung der Aminosäure-Reste zurückzulühren ist.
Versuch 1): Denaturierung durch elektrische Felder:
a) Wechselspannung: reversibel
b) Gleichspannung= irreversibel
Eine Küvette wird mit Hühnereiklar gefüllt. In das
Eiweiß werden zwei Kupferdrahtelektroden gehängt,
an die
a) eine Wechselspannung von 25 v,b) eine Gleichspannung von 25 V
angelegt wird.
ad a) Zwischen den Elektroden entsteht eine schwache
Denaturierung, die nach Abschaltung der Spannung sich
langsam aufheben würde.
ad b) An der Anode ist eine starke Eiweibdenaturieruni
zu beobachten, die nach Abschaltung der Spannung
bleibt.
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Durch die Wechselspannung wird der Eiklarlösung Energie zuge
führt, wodurch die kinetische Energie der Proteinmoleküle erhöht
wird. Als Folge davon kommt es zu einer Verkntipfung einzelner
Moleküle und dadurch zur Makromolekularbildung. Da hierbei aber
weder die Hydrathülle, noch die Tertiärstruktur der Froteine
wesentlich verändert wurde, verläuft die Denaturierung nach
Aufhebung des elektrischen Feldes reversibel.
Durch Gleichspannung kommt es zur Entmischung der Eiwei131ösung.
Da die Froteine einen negativen Ladungsüberschuß aufweisen,
reichern sie sich an der Anode an, wo sie entladen werden.
Durch die Entladung kommt es zur Verminderung der Hydratation
und zur Veränderung der Bindungen innerhalb der Tertiärstruktur.
Die im Anodenraum auftretende Denaturierung ist deshalb auch
nach Aufhebung des elektrischen Feldes irreversibel •
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-'0
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L i t e rat u r ver z e ich n i s
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Kle ine Moleküle können in diewassergefüllten Hohlräume der
Kügelchen eindringen
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Das Proteingemischbeginnt,in die Säuleeinzudringen.
HydratisierteSephadexPartikel
PoröseScheibe
.66
Die Proteinebeginnen sichvoneinanderzu trennen.Die kleinerenMoleküledurchdringendie SephadexPartikel undwerden zurückgehalten.Die großenMoleküle
werden ausgeschlossen unddurchlaufen deshalb die Säuleschneller
66
Die beidenProteinesind
voneinandergetrenntund könnenim Eluatgesammeltwerden
66
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Schema 19 , Am inosä u rc-Scq uc u zcn um Jen Seri n-Rest im akti ven Zentrum vo n Se r in -Pro teas en
2.3 .1.1. ß cdl'ulll/lg einz elner Aminos .iuren {iir den Mecl1arlis-/IlItS der cll zymJ..-1l1111ysi erlell Reaktion
Die Bede ut u ng e inzelner Am in o säuren Für d a s akt iv e Zentrum undd .l ~ Z lI<" llI1l1lcw;rid d e r Amino sa u re n fü r J en Rca k t ionsmech anisrnusist a ru b est e-n 1>"i d en Hydrola sen untersu ch t. Seh r h ä ufig ist e in S er in-Res ] unter BilJung ei n es cov alen ten Ov Acvl-Derivates a m hyd rolyt isch en V o rg .l ng b et e il igt (S cherna 11\, S. 28 ) :' w :ih re n d e in H istid inR est und b ei e in igen En zy me n zu s.i tz lich ei n A s par ag in s .iu re-Rcs tdurch \ \'a s '> crst l lftbrii rken d ie rcaktion vf.ihigen Z w isch enzu st ände(tran s it ion !;ta ll' ) b ild en. D ie se En zy m e w e rd en al s Ser in -H ydrola sen(S e r in -Pro tc.r se n) bezeic h ne t . Zu ih ne n g ehö re n t: ß. TrYP::;I1, ClryTt! o /ry /, s ill , Ela~/t1 s e, T hrombin, {' ['ls m il1 , 5 111J tili:;;I1 , d ie alle in d erAminosau re-Seq ue n z um d ie sen akt iven Scrin-Re st g roße Überei n s t im m u n gen zei g e- n (Schema 19), so w ie d ie m e ist e n der Carbo xy -
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Z u r B,··;(hrr·ihung der f un ktionen d es A kt iven Z e ntrum s kann es inm ch rr-rv S uhn'lI t re ll [su b vit c s) unterteilt we rd e n . M <l n untersch e id etd -,l ~ [l ! n lh n ;.; ~ :! ('nt rum (L inJi ng ,ik) d .rs nur für d ie Bin,Jung d es Su bstral cs a n .1 .\ 5 En zym verantwortl ich is t, so w ie da s k J L1]yt islhe Ze n tru m (Cll.1I)-' II< s itc }, cl , I S d in -kt a n '! ('r k .1 1al yti sc1wn R,' ., k tin n b e te iligl j .; l. D ie A m in o s.iurcn des k a ta ly t ischen Z entru m s können b e ieini ge-n En zymcn unt e r te il! werden in so lch e, d ie im Verl auf d ere n zym.rtis clu -n Reak tion ei ne co va lc ntc Bindung m it d em S u bs t r a tei ngl'hen , lind andere, die nur üb er nicht -covalente Bindung en a n derR ea kti on teilnehmen.
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Bei ei ne r Gruppe w cite rcr H yJrolasen sind C a rboxy -Cr uppcn durchcova lcn tc Bindung en an J ('r Re.lkt io n beteil igt. Im Fa lle vo n Pro tea se n Irpten da b ei .IIs Zwi schenzus tä nJe gemisch te A n hyd r ide .1U f, d iein ei ne r FoIgere <1 kt io n h yd rolys io r j w erd en (SdH'm.l 21 , S . 3 1). Be isp iele da für sind die Car /JoxYT'ep lidllse und d .l ~ Pep sin , Im Falle desrc p~ i n s erfol);t jed o ch n icht nur eine an h yJriJart ige Bin d u ng derCollboxy -Kompnnen te , son dern an ei n e r zweite n Carboxy-G ruppew ird .ludI d ie A mi no-Kom pone n te a m id .irtig geb unde n (Sch ema 22,S . J2) . D u rch di e se räuml iche Fix ie run g der Ami no-Kompone n te wi rdd ie r ückl ä u fig e Reak tio n , die Bildung ei ner I' c'pliJ -BinJ lIn g , w escnt Ii." e rleich te r t. Dami t k önnen d ie be im Pepsin be ka nnten Transpep tid ie r u ng s-Reakr ionen erklä rt werden.
D e r Mech a nis m us der durch R iv ol/llc/cl/se k at al y s iert en S pa ltu ng vonNuclei n sa ure n verl äuft übe r ei nen cy cl ische n 2·,3'- f'ho~phor s ;i ure.evl cr (Sche m a 23, S . 3 3) . A n der Reak t ion sind zwe i H bt iJ in -ResteJ c ~ [ n zYllls bc tci lig t . ( D ie A rnin o sa u rr-n des ak tive n Ze n tru ms s indülu -r ei ne n wei ten Be reic h d er A mi nos.iu re-Sequcnz ver te ilt : Sc!H'l ua2-1. S . J .t. ) S pPL.Hische S u b s t r a te d es Ly so':Y/II s s ind I'olyscccha r id«, d iea lt er nie re n d d ie Z ucker- R e s te N -A cetyl -glu co sa m in u nd N -'\cet yl mu r ~ m in s :i ure e ntha lt e n (Sch ema 25.5.35). wobei eine gl ykos idischeBin d un g zwischen einem Muram in sau re - u nd ei nem C I U Co~,l lllin- Reslg e,pa lle n wird . Zur Sp.l lt u ng mu ß min .Ies tc n -, ei n He xa saccha r id vori iq ;en . I:.i n nur .IUS N-Accty l ··g ll1co~amin Resten be st eh en d es Trisacch a rid wi rd von de m En zy m n ur geb u nden, aber ni cht ge spalten(\..c1m p C't it iver Inh ib itor, s . S . 59 ). D ie Rönt gen slrukturan.ll yse d iesesk ri s t .rl livie rbarcn Kom plcxcs liefr-rt e wi , h tigl' Il in w C' bc über Ja s a kt ive Ze n t rum d e s Ly so zyms lind übe r d ie B i nJ u n~wcrhJltn i s sc arnS u h, t r.l!/ [ n zy rn -Ko m p le x. An d er S pa ltu ng der Uindllnp; w ir ken imk.lt.lly ti sch e n Zen trum C lu tamin s .iurc in I' o sif ion 35 und A sparag ins :iu re in Pos it ion 52 mit. Das Bindu ngSlell t ru m des Ly so zym s vertei lts i<!t iih t' r eine 1.1111;(' R iI1(', d ie an der :\ uE e!1';l ' ite de r T('rt i :ir ~tl uk t u rch, s Enzyms lie gt . An d er S ubs tr a tb in du ng si n d mindesten s 12 A m inosa u re- n be tcrlig ! (Schem a 25) ,
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Schema 23. M echanismus der Ribonuclease-k a talysierten Spaltung von Ribonu cleins äuren
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