Immunhistochemische Untersuchungen mittels

S100 und NSE nach Schädel-Hirn-Trauma

Kumulative Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät

der Universität Leipzig

Eingereicht von: Michael Krohn

geboren am 22.12.1986 in Esslingen am Neckar

Angefertigt an der: Universität Leipzig

Medizinische Fakultät

Institut für Rechtsmedizin

Betreuer: Prof. Dr. med. Jan Dreßler

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 17.11.2015

3

I. Inhaltverzeichnis

I. Inhaltverzeichnis ..................................................................................................................... 3

II. Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................................... 4

III. Bibliographische Beschreibung ............................................................................................ 5

Referat .................................................................................................................................... 5

III. Einleitung ............................................................................................................................. 6

1. Klassische klinische Einteilung des Schädel-Hirn-Traumas (SHT)................................ 6

2. Folgen und Komplikationen ............................................................................................ 7

3. Pathophysiologie ............................................................................................................. 9

4. Epidemiologie des SHT ................................................................................................ 12

5. Methode der Immunhistochemie ................................................................................... 13

IV. Untersuchte Proteine .......................................................................................................... 16

1. S100 ............................................................................................................................... 16

2. NSE ............................................................................................................................... 17

V. Zielstellung der publizierten Studie .................................................................................... 18

VI. Publikationsmanuskript ...................................................................................................... 18

VII. Zusammenfassung ............................................................................................................ 20

1. Hintergrund ................................................................................................................... 20

2. Fragestellungen ............................................................................................................. 21

3. Material und Methoden ................................................................................................. 21

4. Ergebnisse ..................................................................................................................... 22

5. Schlussfolgerungen ....................................................................................................... 24

VIII. Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 25

IX. Anhang ............................................................................................................................... 33

Fallübersicht ......................................................................................................................... 33

Statistik ................................................................................................................................. 33

Beispiele verwendeter Hirnschnitte...................................................................................... 36

Immunhistochemisch gefärbte Schnitte ............................................................................... 37

Anteil S100-positiver Oligodendrozyten ............................................................................ 38

Anteil NSE-positiver Neurone

Fälle mit S100-positiven Neuronen ...................................................................................... 40

X. Eigenständigkeitserklärung ................................................................................................. 41

XI. Curriculum vitae ................................................................................................................ 42

XII. Danksagung ...................................................................................................................... 43

4

II. Abkürzungsverzeichnis

APAAP Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase

Geschl. Geschlecht

H.E. Hämatoxylin-Eosin

HC Hippocampus

KH Kleinhirn

LAB Labeled-Avdin-Biotin

LSAB Labeled-Strept-Avidin-Biotin

NSE Neuronenspezifische Enolase

PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase

PCZ Kontusionsumgebung (pericontusional zone)

S100 S100-Protein

SHT Schädel-Hirn-Trauma

ÜLZ Überlebenszeit

ZNS Zentrales Nervensystem

5

III. Bibliographische Beschreibung

Michael Krohn

Immunhistochemische Untersuchungen auf S100 und NSE nach Schädel-Hirn-Trauma

Universität Leipzig, kumulative Dissertation

54 Seiten, 73 Literaturangaben, 5 Tabellen, 5 Abbildungen, 1 Publikationsmanuskript

Referat

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Proteinexpression der Biomarker S100 und

NSE im humanen Hirngewebe nach tödlichen Schädel-Hirn-Traumen (SHT). Dafür wurden

semiquantative Untersuchungen von auf S100 und NSE gefärbten Gliazellen und Neuronen

im Cortex, Hippocampus und Kleinhirn durchgeführt. Diese Auszählungen wurden zu den

jeweiligen Trauma-Überlebenszeiten (ÜLZ) und den autoptisch diagnostizierten

Todesursachen korreliert.

Zur Untersuchung gelangten Hirngewebeproben aus 57 Obduktionen, davon 47 mit tödlichem

SHT und ÜLZ zwischen wenigen Sekunden und 34 Tagen. Zehn Fälle mit kardiovaskulären

Todesursachen wurden als Kontrolle herangezogen.

Ergebnisse: Der Anteil S100-positiver Oligodendrozyten in der Umgebung der Kontusion und

im Hippocampus sank dabei signifikant mit zunehmender Überlebenszeit ab. Überraschend

konnte das Auftreten von S100-positiv gefärbten Neuronen in der Traumaregion und den

Hippocampus-Proben in Fällen mit mehr als zwei Stunden ÜLZ beobachtet werden. NSE-

positive Neuronen waren in der Akutphase nach Traumatisierung signifikant vermindert, nach

längerer Überlebenszeit kam es zu einem Wiederanstieg (Neurogenese). Im Färbeverhalten

der Astrozyten konnten keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

Schlussfolgerung: Immunhistochemische Untersuchungen von S 100 und NSE sind eine

sinnvolle Ergänzung der rechtsmedizinischen Obduktionshistologie und sind zur

Verifizierung von Überlebenszeiten sowie zur Einschätzung des Alters von Hirnverletzungen

geeignet.

6

III. Einleitung

1. Klassische klinische Einteilung des Schädel-Hirn-Traumas (SHT)

Kopfprellungen entstehen bei leichter Gewalteinwirkung gegen den Kopf und führen zu

Verletzungen der Kopfhaut in Form von Hämatomen, Abschürfungen oder Quetsch-Riss-

Wunden. Verletzungen im Schädelinneren treten dabei nicht auf. (Pearce, 2008)

Die Gehirnerschütterung (Commotio cerebri) ist gekennzeichnet durch kurzfristige vegetative

und neurologische Symptomatik wie z. B. Bewusstlosigkeit, retrograde Amnesie, Übelkeit

oder Erbrechen. Morphologisch gibt es hierzu in der Regel kein Verletzungskorrelat. In

einigen Fällen wird ein diffuser Axonschaden als Ursache der klinischen Symptome

angenommen. (Delank und Gehlen 2006; Kirov et al. 2013)

Bei der Hirnprellung (Contusio cerebri) sind Verletzungen im Schädelinneren in Form von

Blutungen über und unter die Hirnhäute bzw. Kontusionsblutungen der Hirnrinde zu

diagnostizieren. Die entsprechende klinische Symptomatik besteht über einen längeren

Zeitraum und in schwererer Form. (Delank und Gehlen 2006)

Bei der Gehirnquetschung (Compressio cerebri) wird durch die intrakranielle

Volumenzunahme infolge der Ödementwicklung oder nach Schädelknochenbrüchen der

Hirnstamm in der Incisura tentorii bzw. die Medulla oblongata im Foramen magnum

eingeklemmt (sog. obere bzw. untere Herniation). Dies führt zum Versagen der zentralen

Regulation und damit zur sofortigen Bewusstlosigkeit und zum Todeseintritt. (Delank und

Gehlen 2006)

Diese anschauliche, auf morphologischen Veränderungen basierende Einteilung ist klinisch

weitgehend durch die Untergliederung mithilfe der Glasgow Coma Scale (Teasdale und

Jennett 1974) verdrängt worden (Kolodziejczyk 2008). Es können nach entsprechender

Kategorisierung der drei Parameter „Augen öffnen, beste motorische Antwort, beste verbale

7

Antwort“ bereits in der Notfallsituation somit folgende Stadien unterschieden und damit die

weitere Prognose abgeschätzt werden:

leichtes SHT, Überleben sicher: 13 - 15 Punkte

mittelschweres SHT, Überleben anzunehmen: 12 - 9 Punkte

schweres SHT, Überleben unwahrscheinlich: 8 - 3 Punkte

Eine weitere, international gebräuchliche Einteilung ist die nach Tönnis und Loew. (Tönnis

und Loew 1953) Diese setzt den Schwerpunkt auf den Schweregrad der posttraumatischen

Hirnschädigung und deren neurologische Auswirkungen. Sie kann daher nur retrospektiv

angewendet werden. (Wallesch et al. 2005)

Grad I: Rückbildung der Hirnfunktionsstörungen innerhalb von 4 Tagen

Grad II: Rückbildung der Hirnfunktionsstörungen innerhalb von 3 Wochen

Grad III: Persistieren der Störungen über 3 Wochen

2. Folgen und Komplikationen

Traumatische Hämatome. Die epidurale Blutung ist meist arteriellen Ursprungs, meist infolge

von Gewalteinwirkungen gegen die Kopfseiten mit Verletzung der Arteria meningea media.

Durch die langsame Größenzunahme im Epiduralraum wird oft ein beschwerdefreies Intervall

nach dem verursachenden Ereignis beobachtet (sog. luzide Phase). (Zink 2001) Subdurale

Blutungen sind meist venösen Ursprungs durch Abriss von Brückenvenen bei einem

Rotations- oder Translationstrauma. Die meist sofortige Symptomatik besteht in

zunehmendem Kopfschmerz sowie Bewusstseinsstörungen bis hin zum Koma, chronische

Subduralhämatome kommen gelegentlich als radiologische Zufallsbefunde nach symptomarm

verlaufenden Kopfverletzungen vor. (Maxeiner 1997; Sanders et al. 2011) Subarachnoidale

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Blutungen sind bei einer traumatischen Verletzung oft an der Stelle des Stoßes (Coup) oder

auf der diagonal gegenüberliegenden Seite des Hirnschädels (Gegenstoßherd; Contre-Coup)

lokalisiert. Das Auftreten der Contre-Coup-Blutung erklärt sich durch den infolge des

Traumas entstehenden Unterdruck auf dieser Hirnseite. Vorbestehende Aneurysmen des

zerebral-arteriellen Gefäßgeflechts als häufigste Ursache für spontane

Subarachnoidalblutungen können auch durch Kopftraumata rupturieren.

Intrazerebrale Blutungen befinden sich im Hirngewebe und kommen zumeist im

Zusammenhang mit hypertensiven Krisen oder im höheren Alter bei einer

Amyloidangiopathie vor. Entsprechend sind sie zumeist Blutungen aus krankhafter, innerer

Ursache und nicht auf Traumatisierungen zurückzuführen. (van Gijn et al. 2007) Die

Posttraumatisches Hirnödem. Diese Komplikation ist vor allem wegen den Folgen eines

intrakraniellen Druckanstiegs für die Prognose der Trauma-Patienten gefürchtet. Das

Hirnödem, welches sich besonders im Marklagerraum entwickelt, führt zu einer

Komprimierung des Hirngewebes, was wiederrum zu einer Hypoxie der Nervenzellen infolge

fehlender Durchblutung führt. Im schlimmsten Fall ist ein Marklagerschwund die Folge.

(Fukuda et al. 2013)

Entzündliche Komplikationen. Offene Schädelfrakturen sind grundsätzlich als infiziert zu

betrachten und benötigen daher eine antibiotische Abschirmung und zumeist eine

intensivmedizinische Therapie. Es kann es zu diffusen Meningoenzephalitiden,

Markphlegmonen, subduralen und epiduralen Empyemen kommen. Auch hieraus resultieren

potentielle Komplikationen in Form von perifokalen Ödemen, Nekrosen und Abszessen. Hier

kann es v.a. bei Nichtbehandlung zu einer sekundären Schwellung von Hirngewebe und damit

zum Prolaps kommen. Allein die Fraktur der Schädelkalotte oder die Ruptur der Dura mater

scheint das Outcome der Patienten nicht signifikant zu beeinflussen. Allerdings ermöglicht

9

deren Lokalisation eine Aussage über den Ort intrakranieller Schädigungen und möglicher

intrakranieller Hämatome. (Silver et al. 2011; Mendelow et al. 1983)

3. Pathophysiologie

Die molekularen Abläufe nach einem SHT sind noch nicht vollständig verstanden. In dem

Bestreben, die wichtigsten zerebralen Funktionen wiederherzustellen, erfolgen auf

molekularer Ebene tiefgreifende Veränderungen der physiologischen Abläufe. Eine

intrakranielle Verletzung bewirkt eine lokal beschränkten unmittelbar beginnende neuronale

Zellnekrose und nach ca. 2 Stunden einsetzende Apoptose (Dressler et al. 2007) sowie eine

etwas später einsetzende Glia-Zell-Aktivierung. Mit dieser Aktivierung ist wiederum eine

Neurotoxizität verbunden, die zu weiterer neuronaler Dysfunktion führen kann (DeKosky et

al. 2010)

Neuroinflammation. Nach SHT fördern exzitatorische Aminosäuren den Kalziumeinstrom in

die Zellen. Eine intrazelluläre Kalziumüberladung bedingt die Bildung freier Radikale und

Stickstoffmonoxid mit hierdurch verursachter Lipidperoxidation (Braughler und Hall 1992)

und weiterer Zellschädigung durch Hypoxie. (Lau und Tymianski 2010) Die hierdurch

bedingte Zellnekrose und –apoptose wird durch eine Verschiebung des Gleichgewichts von

überlebensfördernden Proteinen zu Apoptose-fördernden Proteinen zusätzlich begünstigt.

(Raghupathi et al. 2000)

Astrogliose. Einen Schutz vor diesen inflammatorischen Vorgängen zu bieten ist neben vielen

anderen eine Funktion der reaktiven Astrogliose. Nachdem in den ersten Stunden nach

erfolgtem Trauma Neuronen sowie Gliazellen untergegangen und Mikroglia sowie

Makrophagen aktiviert wurden, wandern Astrozyten vom umgebednen gesunden in Richtung

geschädigtes Gewebe ein. (Franke et al. 2012, Hatten et al.1991) Die gebildete Glianarbe

trennt gesundes Hirngewebe vom geschädigten Areal, indem sie als neuroprotektive Barriere

10

gegenüber Entzündungszellen und infektiösen Organismen fungiert. (Franke et al. 2012,

Sofroniew et al. 2010) Der Nachteil dieser Abschottung ist die Unterbindung von

regenerativen Prozessen wie z.B. axonalen Aussprossungen. (Franke et al. 2012, Neary et al.

1996) Weitere Funktionen der Glianarbe sind u.a. die Aufnahme potentiell exzitatorischen

Glutamats, Bekämpfung oxidativen Stresses, Abbau von Amiloid-β-Peptiden, einer

graduellen Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und der Recduktion von Hirnödemen. (Franke et

al. 2012, Sofroniew 2009, Sofroniew et al. 2010, Kimelberg et al. 2010, Fuller et al. 2009)

Bisher wurden zwei Formen der Astrogliose beschrieben: Zum ersten wäre da die

anisomorphe Astrogliose, welche als derbe Struktur auftritt und am ehesten zur Abkapselung

von geschädigtem ZNS-Gewebe dient. Desweiteren beschrieben ist die isomorphe

Astrogliose, welche mit einer oft reversiblen Hypertrophie der Astrozyten verbunden ist und

sich positiv auf die posttraumatische Regeneration auswirken kann. (Franke et al. 2012,

McGraw et al. 2001)

Weitere neurochemische Veränderungen. Durch die Zerstörung der Zellmembran durch

genannte neuroinflammatorische Prozesse werden über die Freisetzung von

Arachnoidonsäure diverse Enzyme und Zytokine (z. B. Phospholipase, Lipooxigenase,

Cyclooxigenase und Leukotriene) aktiviert. (Wei et al. 1982; Yergey und Heyes 1990;

Nakashima et al. 1993; Shohami et al. 1994) Diese bedingen eine Freisetzung weiterer Akute-

Phase-Proteine und komplexe Interaktionen zwischen den jeweiligen Biomarkern (z.B. IL-1,

IL-6, TNF-α und Prostaglandine). (Shohami et al. 1987; Shohami et al. 1994; Fan et al. 1995).

Als Ausdruck einer hormonellen Reaktion und Interaktion des Körpers auf die

Hirntraumatisierung verändern sich posttraumatisch auch die Konzentrationen von

Katecholaminen, endogener Opioide und diverser Wachstumsfaktoren im Hirngewebe.

(Prasad et al. 1992; Conner et al. 1994; McIntosh et al. 1987)

11

Im notfall- und intensivmedizinischen Alltag weitgehend etabliert ist die laborchemische

Bestimmung der Neuromarker S100 und NSE im Serum oder Liquor zur Bestimmung der

Traumaschwere und dem Ausmaß einer Gewebehypoxie. Die Messwerte scheinen geeignet,

das spätere funktionelle Outcome bereits initial abschätzen zu können. (Olivecrona et al.

2014; Wang et al. 2014) Auch postmortal-biochemisch sind beide Marker zur Differenzierung

von Todesursachen bei einer Messung im Liquor wie auch im Serum geeignet. Eine Erhöhung

der Marker lässt auf eine Hirnbeteiligung schließen. Darüber hinaus lässt sich auch die ÜLZ

einschätzen. Erhöhte Konzentrationen von S100 und NSE wurden erst nach mindestens 15

min. Überlebenszeit nachgewiesen. (Ondruschka et al. 2013)

Zelluläre Veränderungen. Neben diesen Prozessen finden komplexe Interaktionen zwischen

geschädigten Neuronen und Gliazellen statt. (Lo 2008) So kommt es schon 90 Minuten nach

der Verletzung zu ersten Anzeichen einer reaktiven Astrogliose. (Takano et al. 2014)

Weiterhin finden durch histomorphologische Untersuchungen verifizierbare Umbau- und

Regenerationsprozesse wie Angiogenese, axonaler Umbau, Neuro- und Synaptogenese in

zeitlich weitgehend standardisiert aufeinanderfolgenden Stadien statt. (Smith et al. 1997b;

Xiong et al. 2010; Franke et al. 2013) Veränderungen wie Zell- und Volumenverluste im

Hippocampus konnten im Tierversuch auch noch Wochen bis Monate nach dem Trauma-

Ereignis dokumentiert werden, auch in Fällen ohne traumatische Verletzung des

Hippocampus selbst (sekundäre Veränderungen). (Bramlett et al. 1997; Smith et al. 1997a;

Pierce et al. 1998) Zudem konnten traumaspezifische Veränderungen und Reaktionen des

Kleinhirns und des Hippocampus nach primärer Großhirnschädigung nachgewiesen werden.

(Joashi et al. 1999; Staffa et al. 2012; Schober et al. 2014)

12

4. Epidemiologie des SHT

Das SHT ist nicht nur eine der häufigsten Ursachen für eine stationäre / intensivmedizinische

Behandlung, sondern zählt zu den häufigsten Ursachen eines nichtnatürlichen Todes bzw.

relevanter Begleitverletzungen. (H. Maxeiner und C. Schirmer 2011) Es ist statistisch die

häufigste Todesursache bei Erwachsenen unter 40 Jahren in den USA. (Thurman et al. 1999;

Asemota et al. 2013) Zusätzliche Relevanz erlangt das SHT als wesentlichster

Verletzungsbefund bei 1500 tödlichen Arbeitsunfällen pro Jahr. (Tiesman et al. 2011)

Eine Studie aus Deutschland errechnete die Inzidenz mit 332 pro 100.000 Einwohner. Dies

wären umgerechnet auf alle Einwohner Deutschlands ca. 270.000 Schädel-Hirn-Verletzte

insgesamt pro Jahr. Die Untersuchung der Schweregradverteilung während der initialen

Notfallversorgung in der Akutklinik ergab folgende Ergebnisse:

90,9% ( 302/100.000) leichte Schädel-Hirn-Traumen

3,9% ( 13/100.000) mittlerschwere Schädel-Hirn-Traumen

5,2% ( 17/100.000) schwere Schädel-Hirn-Traumen.

Die Geschlechterverteilung zeigt eine höhere Beteilung der männlichen (58,4%) gegenüber

der weiblichen Bevölkerung (41,6%). (Rickels et al. 2006)

13

5. Methode der Immunhistochemie

Die Immunhistochemie hat das Ziel, neben einer Grundfärbung (meistens Hämatoxylin-

Eosin) ein bestimmtes Protein durch gezielte Markierung nachzuweisen. Dieser Nachweis

beruht auf einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen Primärantikörper und

nachzuweisendem Epitop. (Lang 2006) Auf diese Reaktion folgt eine Bindung, an welche

wiederum ein Detektionssystem gekoppelt ist. Diese Detektion kann auf unterschiedliche Art

und Weise erfolgen:

Direkte Methode. Hier befindet sich ein Enzym direkt am Primärantikörper. Diesem wird

nach ausreichender Bindung Substrat zugeführt, welches vor Ort zu einer Farbreaktion führt.

Indirekte Methode. Hier wird nachdem der Primärantikörper an das Epitop gebunden ist, ein

Sekundärantikörper hinzugegeben, an welchen das Enzym gebunden ist.

PAP (APAAP) – Methode. Hier wird nach dem Sekundärantikörper ein Peroxidase-Anti-

Peroxidase-Komplex hinzugegeben. Dieser Komplex besteht aus zwei Antikörpern, die gegen

3 Enzyme Peroxidase gerichtet sind. Die APAAP-Methode funktioniert vergleichbar, nur dass

hier ein Alkalische-Phosphatase-Anti-Alkalische-Phosphatase-Komplex zum Einsatz kommt.

LAB / LSAB-Methode (Labeled-Strept-Avidin-Biotin). Bei dieser Methode ist der

Sekundärantikörper mehrfach biotinyliert. So kann sich enzymkonjugiertes Avidin bzw.

Streptavidin an das Biotin heften. Diese Methode ist die am meisten verbreitetste in der

Immunhistochemie, da sie eine höhere Sensitivität durch die Amplifikation mit mehreren

Biotin-Molekülen pro Sekundärantikörper erreicht. Der Nachteil liegt im endogenen

Vorkommen von Biotin. Bindung von (Strept-) Avdin an endogenes Biotin kann zu falsch-

positiven Ergebnissen führen.

Dextran-Polymer-Methode. In dieser Studie wurde deshalb die Dextran-Polymer-Methode

verwendet. Hierbei wird ein konjugiertes Polymer verwendet. Dieses besteht aus vielen

Molekülen Peroxidase und sekundären Antikörpern, welche wiederum direkt an ein Dextran-

14

Gerüst gebunden sind. Die Vorteile liegen vor allem in der höheren Spezifität gegenüber der

LAB-Methode bei gleichbleibender Sensitivität. (Sabattini et al. 1998)

Umsetzung. Für die immunhistochemische Färbung war eine vorherige Antigendemaskierung

über eine Erhitzung auf 70°C (S100) und 43°C(NSE) in Citrat-gepufferter Kochsalzlösung

über 20 min nötig. Anschließend wurden die endogene Peroxidase durch Peroxidase-

Blocking-Lösung (DakoCytomation) gehemmt. Wie oben erwähnt wurde die

immunhistochemische Färbung auf S100 und NSE mit der indirekten Dextran-Polymer-

Methode (DakoCytomation) durchgeführt. Verwendet wurden ein polyklonaler S100-

Kaninchen-Antikörper (333 lg/L über 30 min) sowie ein monoklonaler NSE-Maus-Antikörper

(524 lg/L über 30 min, beide AK DakoCytomation). 3,3‘-Diaminobenzidine in

Wasserstoffperoxid/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung funktionierte als Farbstoff. Für die

Gegenfärbung wurde Hämatoxylin nach Mayer benutzt.

15

Methoden der Immunhistochemie. (Abb. modifiziert nach Sabattini et al. 1998; Lang 2006)

16

IV. Untersuchte Proteine

1. S100

Verteilung. S100 kommt in seiner höchsten Konzentration im Zytoplasma und im Zellkern

von Zellen des Zentralen Nervensystems vor. In niedrigerer Konzentration findet man es aber

auch in verschiedenen anderen Geweben wie Kardiomyozyten, Adipozyten, Chondrozyten

und in bestimmten neuroendokrinen Tumoren. (Donato 2001; Zimmer et al. 2005) S100 ist

ein Dimer mit unterschiedlichen Untergruppen. 95% des gesamten S100-Vorkommens im

Körper ist dabei in Form der Untergruppe S100B gespeichert. (Moore 1965; Hidaka et al.

1983; Steiner et al. 2007; Donato et al. 2009)

S100 wird in der diagnostischen Immunhistochemie als Gliazellmarker verwendet. (Donato

2001) Es wurde hingegen bereits auch in anderen Zelltypen des ZNS, wie z.B. in

Ependymzellen, im Epithel des Plexus choroideus und vereinzelt in Neuronen beobachtet.

(Moore 1965; Hidaka et al. 1983; Li et al. 2006; Steiner et al. 2007; Donato et al. 2009)

Funktion. S100 stimuliert in nanomolekularen Konzentrationen das Wachstum und die

Regeneration von Neuriten und scheint das Überleben von Neuronen in deren Entwicklung

und nach Verletzungen zu verbessern. (Donato et al. 2009) In höheren, d.h. mikromolaren

Konzentrationen hat S100 hingegen toxische Effekte auf Zellen des ZNS, wie z.B. Apoptose

und Zellnekrose. (Hu et al. 1997). Interessant v. a. im Zusammenhang mit den Ergebnissen

dieser Arbeit ist die experimentell nachgewiesene protektive Funktion von S100 u. a. für

Neuronen des Hippocampus. (Barger et al. 1995; Ahlemeyer et al. 2000) Bei

immunhostochemischen Untersuchungen konnten nicht nur deutliche Unterschiede der

Menge an S100-positiven Gliazellen bei unterschiedlichen Todesursachen sondern auch eine

Abnahme der Immunopositivität für Astrozyten des Hippocampus mit zunehmender ÜLZ

festgestellt werden. (Li et al. 2006; Li et al. 2012)

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2. NSE

Verteilung. NSE kommt in hohen Konzentrationen im Zytoplasma reifer Neuronen sowohl im

ZNS als auch im peripheren Nervensystem vor. Desweiteren findet sie sich in Zellen

neuronalen Ursprungs v.a. Zellen des Diffusen Neuroendokrinen Systems. Sie wurde aber

auch in Thrombozyten und Erythrozyten gefunden. (Gao et al. 1997; Jeter et al. 2013) In

Gliazellen wurde bisher kein NSE nachgewiesen. (Schmechel et al. 1978; Murray et al. 1993)

Funktion. Als eine der Hauptform der Enolasen, katalysiert die Neuronenspezifische Enolase

in der Glykolyse die Umwandlung von 2-Phosphoglycerat zu Phosphoenolpyruvat.

Immunhistochemisch wurde NSE zum Vergleich von nekrotischen Veränderungen und deren

Anteil am Apoptose- und Nekrosemechanismus nach ischämischen Hirnschädigungen

verwendet. Hierbei zeigte die immunopositive Neuronen-Färbung eine vitale neuronale

Reaktion nach SHT an. (Nogami et al. 1998b; Nogami et al. 1998a) Außerdem stellt sich NSE

als effektiver Marker von axonaler Schädigung in frühen Stadien des SHT (ab 1,5 h ÜLZ) dar.

(Nogami et al. 1998a; Nogami et al. 1998b; Ogata und Tsuganezawa 1999; Raabe et al. 1999;

Uzan et al. 1995) Der Neuronenmarker ist in der pathologischen Berufspraxis regelmäßig im

Einsatz.

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V. Zielstellung der publizierten Studie

Nach umfassender Literatur-Recherche sind bisher keine kombinierten Studien für die

immunhistochemische Untersuchung von S100 und NSE publiziert worden. Auch für den

konkreten Vergleich des überlebenszeitabhängigen Auftretens von S100- oder NSE-positiven

Zellen nach SHT sind nur vereinzelt Arbeiten verfügbar. Diese Studie sollte dazu dienen,

diese Wissenslücken zu minimieren und die forensisch relevante Bestimmung von

Überlebenszeiten und Einschätzung des Alters von Hirnverletzungen anhand von

immunhistochemischen Markern zu ermöglichen.

Im Detail waren dabei folgende Fragen zu klären:

Existiert eine Korrelation zwischen dem Anteil positiv auf S100 gefärbter Gliazellen

(Astroglia und Oligodendroglia) und der Überlebenszeit?

Ist eine Korrelation zwischen dem Anteil positiv auf NSE gefärbter Neuronen und der

Überlebenszeit möglich?

Welche lokalisationsspezifische Veränderungen in den untersuchten Hirnregionen

(Umgebung der Kontusion, Hippocampus, Kleinhirn) in Bezug auf die Überlebenszeit

existieren?

Gibt es signifikante Unterschiede zwischen Fall- und Kontrollgruppe?

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VI. Publikationsmanuskript

Title: Immunohistochemical investigation of S100 and NSE in cases of

traumatic brain injury (TBI) and its application for survival time

determination.

Author(s): Krohn M, Dressler J, Bauer M, Schober K, Franke H, Ondruschka B.

Source: Journal of Neurotrauma

Accepted: 23.08.2014

Epub ahead of print: 14.09.2014

References: 79

Language: English

Publisher: Mary Ann Liebert, Inc.

DOI: 10.1089/neu.2014.3524

Impact Factor (2013): 3.968

20

VII. Zusammenfassung

Kumulative Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades „Dr. med.“

Promotionstitel: Immunhistochemische Untersuchungen mittels S100 und NSE

nach Schädel-Hirn-Trauma

eingereicht von: Michael Krohn

angefertigt an der: Universität Leipzig; Medizinische Fakultät

Institut für Rechtsmedizin

Betreut von: Prof. Dr. med. Jan Dreßler

Leipzig, März 2015

1. Hintergrund

Das Schädel-Hirn-Trauma (SHT) stellt eine der häufigsten Todesursachen und

Begleitverletzungen bei nichtnatürlichen Todesfällen dar und ist damit Gegenstand der

Routine-Untersuchungen in der Rechtsmedizin. Eine Abschätzung der Überlebenszeit (ÜLZ,

d.h. der Zeitraum zwischen der Verletzungsentstehung und dem Todeseintritt) ist für die

Chronologie eines Tatablaufs und Überprüfung von Zeugenaussagen / Alibiangaben von

großer Bedeutung. Primär werden hierfür postmortal pathomorphologische und klassische

histologische Befunde herangezogen. Immunhistochemische Untersuchungen haben bisher

kaum Eingang in die Überlebenszeitdiagnostik gefunden, könnten aber zur Konkretisierung

der bisher gängigen Methoden beitragen.

Häufig untersuchte Proteine im Gehirn sind das S100-Protein (S100) und die

Neuronenspezifische Enolase (NSE). Die Spiegel beider Marker werden im klinischen Alltag

vielfach zur Abschätzung der Schwere und der Prognose eines SHT im Blut und Liquor

gemessen. Immunhistochemisch wurden beide Proteine bisher vor allem auf deren

allgemeines Vorhandensein und Verteilung im Zusammenhang mit SHT untersucht. Nur eine

Studie beschäftigte sich bisher mit einer möglichen zeitlichen Dynamik.

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2. Fragestellungen

Folgende Fragen sollten durch vorliegende Arbeit beantwortet werden:

Existiert eine Korrelation zwischen dem Anteil positiv auf S100 gefärbter Gliazellen

(Astroglia und Oligodendroglia) und der Überlebenszeit?

Ist eine Korrelation zwischen dem Anteil positiv auf NSE gefärbter Neuronen und der

Überlebenszeit möglich?

Welche lokalisationsspezifische Veränderungen in den untersuchten Hirnregionen

(Umgebung der Kontusion, Hippocampus, Kleinhirn) in Bezug auf die Überlebenszeit

existieren?

Gibt es signifikante Unterschiede zwischen Fall- und Kontrollgruppe?

3. Material und Methoden

Für diese Untersuchung wurden Hirngewebeproben aus 57 gerichtlich angeordneten

Sektionen verwendet. Davon wiesen 47 ein tödliches SHT und ÜLZ zwischen wenigen

Sekunden und 34 Tagen auf. Zehn Fälle mit kardiovaskulären Todesursachen wurden als

Kontrolle herangezogen. Die Überlebenszeiten der Fälle mit tödlichem SHT wurden in

Übereinstimmung mit bisherigen Studien in folgende Kategorien eingeteilt: Akuter

Todeseintritt nach SHT (ÜLZ bis 2 Stunden), subakuter Todeseintritt nach SHT (ÜLZ 2

Stunden bis 4 Tage) und verzögerter Todeseintritt nach SHT (ÜLZ über 4 Tage). Die zur

Untersuchung gelangten Proben wurden spätestens 6 Tage nach dem Versterben der Personen

entnommen (Mittelwert 2,7 Tage).

In allen Fällen wurde die Umgebung der Kontusion, bei 35 dieser Fälle der Hippocampus und

bei 31 der Fälle auch das Kleinhirn untersucht. Die verschiedenen Regionen wurden jeweils

gesondert für Rinde und Mark bzw. im Hippocampus für Stratum pyramidale und radiatum

beurteilt.

22

Die immunhistochemische Färbung auf S100 und NSE wurde mit der indirekten Dextran-

Polymer-Methode (DakoCytomation), die Gegenfärbung mit Hämatoxylin nach Mayer

durchgeführt. Verwendet wurden ein polyklonaler S100-Kaninchen-Antikörper sowie ein

monoklonaler NSE-Maus-Antikörper (beide DakoCytomation).

Für die semiquantitative Evaluation wurden gefärbte und ungefärbte Neuronen,

Oligodendrozyten sowie Astrozyten in jeweils 20 High Power Fields gezählt. So konnte für

jede Region und Zellart ein Prozentsatz positiver Zellen ermittelt werden.

Für die statistische Auswertung wurde SPSS Statistics (Version 21, 2012 IBM) und

OpenOffice Calc (Version 3.4.1, 2012 Apache Software Foundation) verwendet, es kamen der

Mann-Whitney-Wilcoxon-Test (nicht-parametrisch), die Spearman-Korrelation und die

Benjamini-Hochberg-Prozedur zum Einsatz.

Eine Zustimmung zu dem der Promotionsschrift zugrunde liegendem Forschungsvorhaben

wurde durch die Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig erteilt

(Nr. 117-12-23012012).

4. Ergebnisse

Äußere Einflüsse. Es konnte keine Korrelation zwischen dem Anteil positiver Zellen und der

Leichenliegezeit (rs= -0.27 bis 0.15, p = 0.1 bis 0.96) oder dem Geschlecht (p = 0.07 bis 0.98)

festgestellt werden. Aufgrund des häufigeren Auftretens verzögerter Todeseintritte bei älteren

Personen (rs = 0,33, p < 0.05) konnte keine sinnvolle Korrelation zwischen Alter und

Zellpositivität durchgeführt werden.

Zellzahlen insgesamt. Zur Qualitätssicherung und zur Vergleichbarkeit mit anderen Studien,

wurden die Zellzahlen insgesamt erfasst. Hierbei wurden keine signifikanten Unterschiede in

den unterschiedlichen ÜLZ-Kategorien festgestellt. Die Zellzahlen in den SHT-Fällen waren

hingegen signifikant niedriger als in den Kontrollfällen.

23

Unterschiede in den Kategorien der Überlebenszeit. Die Anteile S100-positiver

Oligodendrozyten waren in Kontusionsumgebung signifikant niedriger in der Gruppe mit

subakutem Todeseintritt als in der Gruppe mit akutem Todeseintritt (p < 0,05) sowie der

Kontrollgruppe (p < 0,05). Im Hippocampus waren die Anteile S100-positiv gefärbter

Oligodendrozyten in der Gruppe der akuten sowie subakuten Todeseintritte niedriger als in

der Kontrollgruppe (jeweils p < 0,05).

Im Vergleich mit der Kontrollgruppe waren die Anteile NSE-positiver Neuronen sowohl im

Hippocampus als auch in der Kontusionsumgebung in der Gruppe der akuten Todeseintritte

(jeweils p < 0,05) höher. Die Anteile NSE-positiver Neuronen im Hippocampus sanken in der

Gruppe der subakuten im Vergleich zur Gruppe der akuten Todeseintritte ab (p < 0,05).

Astrozyten zeigten bei dieser Studie keine signifikanten Unterschiede in ihrem Färbeverhalten

in Bezug auf die ÜLZ.

Überraschenderweise zeigten sich in den Gruppen mit subakutem und verzögertem

Todeseintritt auch S100-positive Neuronen im Hippocampus und der Kontusionsumgebung.

Diese Beobachtung konnte in der Akutphase nach Traumatisierung und in der Kontrollgruppe

nicht gemacht werden.

Im Hippocampus war eher eine diffuse neuroplasmatische, in der Kontusionsumgebung eine

eher juxtanukleäre Färbung zu finden. In beiden Regionen war die Verteilung der S100-

positiven Neuronen unsystematisch oft in räumlicher Nähe zu S100-positiven Gliazellen zu

finden.

24

5. Schlussfolgerungen

Die Leichenliegezeit hat keine statistisch nachweisbare Korrelation mit dem Anteil der

Immunopositivität für S100 und NSE in den untersuchten Zellen. Somit liegt

wahrscheinlich für den untersuchten Zeitraum eine Autolyseresistenz vor. Eine

immunhistochemische Untersuchung im rechtsmedizinischen Alltag ist also möglich.

Die immunhistochemischen Untersuchungen auf S100 und NSE v. a. in der

Umgebung der Kontusion sowie im Hippocampus zeigen Momentaufnahmen im

Ablauf der Restrukturierung im Hirngewebe nach SHT zum Todeszeitpunkt. Diese

weisen für die Positivität von S100 und NSE in Gliazellen und Neuronen jeweils einen

typischen Verlauf auf. Mit der Kombination der Ergebnisse für Auszählungen beider

Proteine können ÜLZ besser eingeschätzt werden als bisher.

Eine Beobachtung S100-positiver Neuronen bei unbekannter ÜLZ legt eine

Mindestüberlebenszeit von 2 h nahe. Um einen noch exakteren Zeitpunkt („Cut-off“)

für dieses scheinbar reaktive Färbeverhalten festzulegen, sind weitere Untersuchungen

notwendig.

Die unerwartete und in der Literatur bisher kaum beschriebene Beobachtung S100-

positiver Neuronen fordert weitere Untersuchungen der Rolle von S100 in

neuroregenerativen Prozessen durch Folgestudien heraus. Es stellt sich die Frage, ob

S100 hier aufgrund einer erhöhten Aktivität von Gliazellen oder durch neuronale

Synthese zu detektieren ist.

25

VIII. Literaturverzeichnis

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33

IX. Anhang

Fallübersicht

Geschl. Alter in Jahren ÜLZ

n m w Spanne Mittel

wert Spanne Mittelw

ert Todesursache

Akuter Todeseintritt nach SHT (ÜLZ bis 2 Stunden)

25 18 7 18 - 73 38 wenige min

– 2h 21 min isoliertes SHT (n = 15), Polytrauma

inkl. SHT (n = 10) Subakuter Todeseintritt nach SHT (ÜLZ 2 Stunden bis 4 Tage)

18 11 7 19 - 85 54 2,2 h – 75 h 25 h Isoliertes SHT (n = 10), Polytrauma

inkl. SHT (n = 5), sekundäre

Komplikationen (n = 3) Verzögerter Todeseintritt nach SHT (ÜLZ über 4 Tage)

4 2 2 44 - 81 62 11 d – 37 d 22 d sekundäre Komplikationen (n = 4)

Kontrollgruppe

10 8 2 43 - 76 59 -/- -/- akuter Myokardinfarkt (n = 6),

rupturiertes Aortenaneurysma (n =

3), Lungenembolie (n = 1)

Statistik

Vergleich der ÜLZ-Gruppen mit dem Wilcoxon-Rangsummen-Test

p-Werte für S100 in Oligodendrozyten

PCZ HC KH

akut -

subakut 0,001 0,065 0,066

subakut -

delayed 0,327 0,937 0,182

akut -

delayed 0,921 0,452 0,421

akut -

Kontrolle 0,025 0,001 0,107

subakut -

Kontrolle 0,001 <0,001 0,035

delayed -

Kontrolle 0,24 0,112 0,582

Fettgedruckt: Benjamini-Hochberg-Prozedur bestanden

34

p-Werte für S100 in Neuronen

PCZ HC KH

akut -

subakut 0,74 0,011 0,022

subakut -

delayed 0,221 0,343 0,659

akut -

delayed 0,124 0,015 0,316

akut -

Kontrolle 1 1 1

subakut -

Kontrolle 0,807 0,036 0,05

delayed -

Kontrolle 0,188 0,036 0,364

Keine bestandene Benjamini-Hochberg-Prozedur

p-Werte für S100 in Astrozyten

PCZ HC KH

akut -

subakut 0,54 0,226 0,059

subakut -

delayed 0,233 0,209 0,606

akut -

delayed 0,186 0,082 1

akut -

Kontrolle 0,111 0,053 0,052

subakut -

Kontrolle 0,201 0,113 0,001

delayed -

Kontrolle 0,94 0,469 0,758

Keine bestandene Benjamini-Hochberg-Prozedur

p-Werte für NSE in Neuronen

PCZ HC KH

akut -

subakut 0,011 0,001 1

subakut -

delayed 0,022 0,038 1

akut -

delayed <0,001 0,001 1

akut -

Kontrolle <0,001 <0,001 1

subakut -

Kontrolle 0,31 0,605 1

delayed -

Kontrolle 0,008 0,049 1

Fettgedruckt: Benjamini-Hochberg-Prozedur bestanden

35

Durchschnittliche Anzahl aller gezählten Zelltypen (ohne Rücksicht auf immunhistochemische

Färbung) in zehn HPFs

Standardabweichung ±. Zahlen sind gerundet.

Kontusionsumgebung

Neuronen in Lamina III-V 57 ± 12

Astrozyten in der grauen Substanz 74 ± 4

Astrozyten in der weißen Substanz 142 ± 9

Oligodendrozyten in der grauen Substanz 97 ± 9

Oligodendrozyten in der weißen Substanz 242 ± 7

Hippocampus

Neuronen im Stratum pyramidale 38 ± 10

Astrozyten im Stratum pyramidale 94 ± 9

Astrozyten im Stratum radiatum 116 ± 7

Oligodendrozyten im Stratum pyramidale 89 ± 10

Oligodendrozyten im Stratum radiatum 166 ± 30

Cerebellum

Purkinje Zellen 24 ± 2

Astrozyten im Stratum moleculare 97 ± 11

Astrozyten in der weißen Substanz 85 ± 6

Oligodendrozyten im Stratum moleculare 22 ± 3

Oligodendrozyten in der weißen Substanz 44 ± 6

36

Beispiele verwendeter Hirnschnitte (jeweils H.E.-Färbung)

A: Kontusionszone mit Umgebung

(Frontalhirn). CZ, Kontusionszone; PCZ,

Umgebung der Kontusion. In diesen

Bereichen wurde gezählt: LI (PCZ),

Lamina I der Großhirnrinde; LIII-V

(PCZ), Lamina III-V der Großhirnrinde;

WM (PCZ), weiße Substanz.

B: Hippocampus. In diesen Bereichen

wurde gezählt: DG, Gyrus dentatus; Str.

pyr., Stratum pyramidale; Str. rad.,

Stratum radiatum.

C: Cerebellum. In diesen Bereichen wurde

gezählt: PC, Purkinje-Zellen; SM, Stratum

moleculare; WM, weiße Substanz.

A-C: Maßstabsbalken 1000 µm

37

Immunhistochemisch gefärbte Schnitte

Jeder Zelltyp ist pro Bildteil nur einmal markiert.

CA3, CA3-Region des Hippocampus. Cer, Cerebellum.

A: Hippocampus, ÜLZ wenige Minuten. Immunhistochemische Färbung mit anti–S100.

Mehrere Satellitosen (Oligodendrozyten) in der Nähe von Neuronen.

B: Cerebellum, ÜLZ 21 Stunden. Immunhistochemische Färbung mit anti–S100. In der Mitte

rechts eine Purkinjezelle mit umgebenden Astrozyten.

C: Hippocampus, ÜLZ 10 Stunden. Immunhistochemische Färbung mit anti–S100. S100-

positives Neuron mit S100-positiven Oligodendrozyten in der rechten unteren Mitte.

D: Hippocampus, ÜLZ 2,5 Stunden. Immunhistochemische Färbung mit anti-NSE. Isolierte

NSE-positive Axone in der unteren Mitte.

A-D: Maßstabsbalken 50 µm

38

Anteil S100-positiver Oligodendrozyten in der Kontusionsumgebung, der hippocampalen

CA3-Region und dem Kleinhirn im Verhältnis zur ÜLZ

PCZ, Kontusionsumgebung; CA3, hippocampale CA3-Region; Cer, Cerebellum; ABI, akuter

Todeseintritt nach SHT (≤ 2 h); SBI, subakuter Todeseintritt nach SHT (2 h – 4 d); DBI,

verzögerter Todeseintritt nach SHT (> 4 d).

39

Anteil NSE-positiver Neuronen in der Kontusionsumgebung und der hippocampalen CA3-

Region im Verhältnis zur ÜLZ-Kategorie

PCZ, Kontusionsumgebung; CA3, hippocampale CA3-Region; Cer, Cerebellum; ABI, akuter

Todeseintritt nach SHT (≤ 2 h); SBI, subakuter Todeseintritt nach SHT (2 h – 4 d); DBI,

verzögerter Todeseintritt nach SHT (> 4 d).

40

Fälle mit S100-positiven Neuronen in der Kontusionsumgebung und der hippocampalen

CA3-Region im Verhältnis zur ÜLZ-Kategorie

PCZ, Kontusionsumgebung; CA3, hippocampale CA3-Region; ABI, akuter Todeseintritt nach

SHT (≤ 2 h); SBI, subakuter Todeseintritt nach SHT (2 h – 4 d); DBI, verzögerter

Todeseintritt nach SHT (> 4 d).

41

X. Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe oder

Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte

von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben,

die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die

vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer

anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens

vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material,

das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches

kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung

der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.

................................. .............................................................

Datum Unterschrift (Michael Krohn)

42

XI. Curriculum vitae

Persönliche Daten

Name: Michael Krohn

Anschrift: Sulzgrieser Straße 7

73733 Esslingen

Geburtsdatum und -ort: 22.12.1986 in Esslingen am Neckar

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: verheiratet, keine Kinder

Schulische Ausbildung: 2006: Abitur am Mörikegymnasium Esslingen

Zivildienst: 08/2006 – 06/2007: Persönliche Assistenz für Behinderte im

Kindergarten der Ev. Kirchengemeinde Bremen Arsten-

Habenhausen

Berufliche Ausbildung: 10/2008 – 09/2010: Studium der Medizin – Vorklinik – an der

Universität Ulm (1. ÄP 2,0)

10/2010 – vsl. 06/2015: Studium der Medizin – Klinik – an der

Universität Leipzig

i.R. dieser Publikation

entstandene Vorträge: 09/2014: Immunhistochemische Charakterisierung von S100

und NSE nach Schädel-Hirn-Trauma zur Wundalterbestimmung,

93. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Rechtsmedizin

05/2015: Immunhistochemische Untersuchungen mittels S100

und NSE nach Schädel-Hirn-Trauma, 24. Frühjahrstagung

Region Nord der Deutschen Gesellschaft für Rechtsmedizin

Ort, Datum, Unterschrift:

43

XII. Danksagung

Mein Dank gilt zunächst meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Dreßler für das in mich gesetzte

Vertrauen bei der Anfertigung dieser Promotion sowie die wichtige und konstruktive Kritik auf

dem langen Weg zur Fertigstellung meiner Arbeit.

Ganz besonders bedanken möchte ich mich außerdem bei Herrn Dr. med. Ondruschka vom

Institut für Rechtsmedizin in Leipzig für seine lückenlose Unterstützung, stetige Erreichbarkeit

und für seine gerechtfertigten Hinweise und Verbesserungsvorschläge – die ebenfalls einen

wichtigen Baustein für die Qualität dieser Arbeit darstellen.

Ebenso zu großer Dankbarkeit verpflichtet bin ich Herrn Dr. med. Bauer von der

neuropathologischen Abteilung des Instituts für Pathologie in Leipzig: Nicht nur, dass er meine

Arbeit mit großem Interesse verfolgt und mich kontinuierlich zur Weiterarbeit motiviert hat. Er

hat es auch geschafft, einen Teil seines weitläufigen Wissens im Bereich der Neuropathologie

mit mir zu teilen und mir so die fachlichen Fertigkeiten zur Auswertung der histologischen

Schnitte zu vermitteln. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei Frau Cornelia Pietschmann

bedanken, die mich beim Erlernen der handwerklichen Fähigkeiten der histologischen

Färbetechniken unterstützte.

Beim Schreiben des Artikels gilt mein Dank außerdem Frau Dr. rer. nat. Franke vom Rudolf-

Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie in Leipzig. Beruhend auf ihrer langjährigen

Erfahrung in der Veröffentlichung wissenschaftlicher Artikel, unterstützte sie mich besonders

in der letzten Phase meiner Arbeit. Ohne ihre Unterstützung wären wichtige Beweise –

besonders in Bezug auf die Doppelimmunfluororeszenz – nicht möglich gewesen.

Letztlich möchte ich mich auch bei meiner Frau Henriette Krohn bedanken. Aufgrund ihres

journalistischen Hintergrunds hat sie mich nicht nur bei der sprachlichen Verfeinerung des

Artikels unterstützt, sondern auch durch ihre Kenntnisse der englischen Sprache zur

rhetorischen Qualität dieses Textes beigetraten. Neben dieser rein fachlichen Unterstützung hat

mich meine Frau während schwieriger Phasen motiviert und die stressigsten Momente durch

ihre positive und stets optimistische Art relativiert.

Mein Dank gilt auch den Gutachtern für die Beurteilung dieser Arbeit.