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Aus der Klinik für Urologie an der

Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. D. Jocham

Immunhistochemische Parameter und deren prognostische

Bedeutung beim Nierenzellkarzinom im Stadium T3

Inauguraldissertation

Zur Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

~ Aus der Sektion Medizin ~

vorgelegt von Philippe Niels Korn

aus Nancy

Lübeck 2012

I

1. Berichterstatter: Prof. Dr. Christian Doehn

2. Berichterstatter: Prof. Dr. Lutz Fricke

Tag der mündlichen Prüfung: 12.09.2012

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 12.09.2012

Promotionskommission der Sektion Medizin

II

1 Einleitung ................................................................................................. 1

1.1 Historisches ...................................................................................................................................... 1 1.2 Epidemiologie .................................................................................................................................. 1 1.3 Ätiologie ............................................................................................................................................. 2 1.4 Klassifikation ................................................................................................................................... 5 1.5 Staging ................................................................................................................................................ 8 1.6 Grading ............................................................................................................................................ 10 1.7 Prognose und Prognosefaktoren ............................................................................................ 10 1.8 Die Marker ..................................................................................................................................... 13 1.8.1 CD44 ............................................................................................................................................................. 13 1.8.2 Cadherine ................................................................................................................................................... 14 1.8.2.1 E-‐Cadherin .......................................................................................................................................................... 15 1.8.2.2 N-‐Cadherin ......................................................................................................................................................... 15 1.8.2.3 K-‐Cadherin .......................................................................................................................................................... 16

1.8.3 Ki-‐67 ............................................................................................................................................................. 16 1.8.4 p16 ................................................................................................................................................................ 18 1.8.5 PTEN ............................................................................................................................................................ 18

1.9 Ziele der Arbeit ............................................................................................................................. 20

2 Material und Methoden ......................................................................... 21

2.1 Das Patientenkollektiv ............................................................................................................... 21 2.2 Datenerhebung ............................................................................................................................. 21 2.3 Immunhistochemie ..................................................................................................................... 22 2.4 Tumormaterial/ Zuschnitt ....................................................................................................... 23 2.5 Antigendemaskierung ................................................................................................................ 24 2.6 Färbeprozedur .............................................................................................................................. 24 2.7 Färbeprotokoll .............................................................................................................................. 25 2.8 Materialien und Reagentien ..................................................................................................... 26 2.9 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen ..................................................... 27 2.10 Statistische Auswertung ......................................................................................................... 32

III

3 Ergebnisse .............................................................................................. 33

3.1 Das Patientenkollektiv ............................................................................................................... 33 3.2 Etablierte Prognosefaktoren ................................................................................................... 36 3.2.1 Tumorstadium ......................................................................................................................................... 36 3.2.2 Nodalstatus ............................................................................................................................................... 37 3.2.3 Metastasen ................................................................................................................................................ 38 3.2.4 Grading ........................................................................................................................................................ 39 3.2.5 Tumorgröße .............................................................................................................................................. 40 3.2.6 Histologie ................................................................................................................................................... 42 3.2.7 Alter .............................................................................................................................................................. 43 3.2.8 Geschlecht .................................................................................................................................................. 44

3.3 Immunhistochemische Marker ............................................................................................... 45 3.3.1 CD44 ............................................................................................................................................................. 45 3.3.2 E-‐Cadherin ................................................................................................................................................. 48 3.3.3 N-‐Cadherin ................................................................................................................................................ 50 3.3.4 K-‐Cadherin ................................................................................................................................................ 52 3.3.5 Ki-‐67 ............................................................................................................................................................. 54 3.3.6 p16 ................................................................................................................................................................ 55 3.3.7 PTEN ............................................................................................................................................................ 58

3.4 Kreuztabellen ................................................................................................................................ 59 3.4.1 CD44 ............................................................................................................................................................. 59 3.4.2 E-‐Cadherin ................................................................................................................................................. 62 3.4.3 N-‐Cadherin ................................................................................................................................................ 63 3.4.4 K-‐Cadherin ................................................................................................................................................ 64 3.4.5 Ki-‐67: ........................................................................................................................................................... 64 3.4.6 p16 ................................................................................................................................................................ 65 3.4.7 PTEN ............................................................................................................................................................ 66

IV

4 Diskussion .............................................................................................. 67

5 Zusammenfassung .................................................................................. 81

6 Quellenverzeichnis ................................................................................. 82

7 Abbildungsverzeichnis .......................................................................... 100

8 Anhang: ................................................................................................ 103

8.1 Einverständniserklärung der Patienten: ........................................................................... 103 8.2 Anschreiben Patienten ............................................................................................................. 104 8.3 Anschreiben Einwohnermeldeamt ...................................................................................... 106 8.4 Anschreiben Krankenkasse ................................................................................................... 107 8.5 Anschreiben Ärzte ..................................................................................................................... 108 8.6 Anschreiben Vertrauensstelle des Krebsregisters ......................................................... 109 8.7 Genetische Aberrationen ........................................................................................................ 110 8.8 Nicht signifikante Kreuztabellen: ........................................................................................ 110

9 Danksagungen ...................................................................................... 141

10 Lebenslauf .......................................................................................... 142

V

Abkürzungsverzeichnis:

ADPKD Autosomal dominant polycystic kidney disease

AJCC American Joint Committee on Cancer

ca. Circa

CDH1 Cadherin 1

CD44 Cluster of differentation 44

CDK Cyclin-‐dependent Kinases

CDKN2A Cyclin-‐dependent Kinase Inhibitor 2A

DAB 3,3'-‐Diaminobenzidin

E2F Transcription factor 1

HAV Histidin-‐Alanin-‐Valin

HE Hämatoxylin-‐Eosin

HRP Horseradish peroxidasae

HRPCC Hereditary papillary renal cell cancer

IgG Immunglobulin G

INK4a Inhibitor of kinase 4

IMBS Institut für medizinische Biometrie und Statistik

kD Kilodalton

LCAM Liver cell adhesion molecule

MIB-‐1 Molecular Immunology Borstel 1

MMAC1 Mutated in Multiple Advanced Cancers

mRNA Messenger ribonucleic acid

Ms/Rb/Rt Mouse/Rabbit/Rat

mTOR Mammalian target of rapamycin

pgp1 Phosphoglycoprotein 1

PIP2 Phosphatidylinositol-‐4,5-‐bisphosphate

PIP3 Phosphatidylinositol-‐3,4,5-‐triphosphate

PI3K Phosphatidylinositol-‐3-‐Kinase

PKB/AKT Proteinkinase B

pRB Retinoblastom-‐Protein

PTEN Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten

VI

p16 Protein 16

QAI Histidin-‐Alanin-‐Valin

RKI Robert Koch-‐Institut

TBS Tris-‐bufferd-‐saline

TEP1 TGF-‐β-‐regulated and epithelial cell-‐enriched phosphatase

TNM Tumor Nodes Metastasen

UICC Union internationale contre le cancer

UVO Uvomorulin

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VHL Von Hippel-‐Lindau-‐Syndrom

1

1 Einleitung

1.1 Historisches

Bereits vor über 140 Jahren beschrieb Virchow in seinem Werk „Die krankhaften

Geschwülste“ Tumoren der Niere [Virchow, 1863]. Aufgrund ihres makroskopischen

Aussehens zählte er sie zu den Lipomen. Einer seiner Schüler, Paul Grawitz, glaubte

aufgrund des histologischen Aussehens den Ursprung des Tumors in „versprengten

Keimen der Nebennierenrinde“ erkannt zu haben [Grawitz, 1883]. Aus diesem Grund

entwickelte sich der Begriff des Hypernephroms, der, neben der Bezeichnung Grawitz-‐

Tumor, fälschlicherweise zum Teil als Synonym des Nierenzellkarzinoms gebraucht wird.

Erst spät konnte die Abstammung dieser Tumoren von Tubuluszellen nachgewiesen

werden. Von der Bezeichnung Hypernephrom oder hypernephroides Karzinom muss seit

diesen Erkenntnissen abgesehen werden [Oberling et al., 1960; Nizze et al., 2004]. Der

heute u.a. auch von der WHO verwendete allgemein gehaltene Begriff Nierenzellkarzinom

berücksichtigt zusätzlich auch die Heterogenität dieser Neoplasie.

1.2 Epidemiologie

Bösartige Neubildungen der Niere stellen etwa 3,1% der Krebserkrankungen in Europa bei

Männern und 2,3% bei Frauen dar [Ferlay et al., 2007]. In Deutschland wird dieser Anteil

etwas höher mit 4,7% und 3,2% angegeben, was einer jährlichen Rate von 10.750

männlichen und 6.650 weiblichen Neuerkrankten entspricht. Trotz ihres geringen Anteils

an bösartigen Neoplasien stehen sie an sechster beziehungsweise elfter Stelle der

Krebstodesursachen in Deutschland [www.rki.de, 2010]. Die Inzidenz wird mit ungefähr

20 pro 100.000 für Männer und zwischen 10 bis 14 pro 100.000 für Frauen angegeben

[Schubert-‐Fritschle et al., 2002]. Jedoch wurde zwischen 1980 und 2004 eine Verdopplung

dieser Rate beobachtet, was zum Teil auf die verbesserte Qualität sowie bessere

2

Verfügbarkeit bildgebender Verfahren zurückzuführen ist, da hierdurch die Diagnose

einfacher gestellt werden konnte [www.rki.de, 2010]. Das Nierenzellkarzinom ist nach

dem Harnblasen-‐ und Prostatakarzinom der dritthäufigste urologische Tumor sowie das

häufigste Malignom der Niere [Boeckmann und Jakse, 1993; Decker J, 2002]. Es kann

grundsätzlich in jedem Lebensalter auftreten, bevorzugt jedoch im siebten und achten

Dezennium. Allgemein erkranken Männer im Mittel mit 67 Jahren, Frauen hingegen etwas

später mit 71 Jahren. Bei einem Geschlechterverhältnis von 3:2 bis 2:1 sind Frauen

außerdem seltener betroffen [Pascual und Borque, 2008; www.rki.de, 2010; Bretheau et

al., 1998]. Auch konnten unterschiedliche geographische und ethnische

Häufigkeitsverteilungen aufgezeigt werden [Pantuck et al., 2001]. Des Weiteren wird die

Diagnose Nierenzellkarzinom häufiger bei Patienten aus urbanen Ballungsräumen als bei

Patienten aus ländlicherem Raum gestellt, wobei ein genauer Grund hierfür nicht genannt

wird [Stafford et al., 2008]. Betrachtet man die Überlebenswahrscheinlichkeit der

urologischen Tumorentitäten, ist das Nierenzellkarzinom mit Abstand dasjenige mit der

schlechtesten Prognose [Brenner, 2002].

1.3 Ätiologie

Die genaue Ätiologie des Nierenzellkarzinoms ist nicht vollständig geklärt. Es wurden

jedoch einige Risikofaktoren für das Auftreten dieser Krankheit erkannt.

Rauchen ist der stärkste beeinflussbare Risikofaktor des Nierenzellkarzinoms, wobei das

Risiko proportional zur Anzahl der gerauchten Zigaretten pro Tag sowie der „pack-‐years“,

also der Anzahl täglich gerauchter Schachteln mal Raucherjahre, ansteigt [McLaughlin et

al., 1995].

Adipositas gilt als ein weiterer gesicherter Faktor, der das Erkrankungsrisiko erhöht. Auch

eine ungünstige Fettverteilung, eine hohe so genannte „waist-‐to-‐hip-‐ratio“, vermag eine

Rolle zu spielen, wohingegen körperliche Aktivität das Risiko zu mindern scheint [Adams

et al., 2008; Menezes et al., 2003].

3

Der arterielle Hypertonus ist ebenfalls als gesicherter Risikofaktor anzusehen [Weikert et

al., 2008]. Inwieweit die antihypertensive Medikation allgemein und die Einnahme von

Diuretika im Besonderen ein unabhängiges Risiko darstellen ist Gegenstand von

Diskussionen [Grossman et al., 1999].

Für Analgetika gilt gleiches. Hier ist die Datenlage am deutlichsten für Phenacetin,

welches jedoch 1986 vom deutschen Markt genommen wurde und somit -‐ auch bei einer

Tumorinduktionszeit von 20-‐30 Jahren -‐ mittlerweile zu vernachlässigen ist. Einige

Autoren sehen hingegen keinen Zusammenhang zwischen Analgetika und einem

erhöhten Auftreten des Nierenzellkarzinoms [Lipworth et al., 2006; McCredie et al., 1995;

Gago-‐Dominguez et al., 1999].

Diabetes mellitus wird als weitere Allgemeinerkrankung mit erhöhter

Erkrankungswahrscheinlichkeit für ein Nierenzellkarzinom genannt, wobei dies ebenfalls

nicht abschließend geklärt ist [Lindblad et al., 1999; Zucchetto et al., 2007]. Inwieweit

weitere hormonelle Einflussfaktoren wie Schwangerschaft, die Einnahme von

Kontrazeptiva, Hormonsubstitution oder Alter bei Menarche beziehungsweise

Menopause die Ereigniswahrscheinlichkeit beeinflussen, wird kontrovers diskutiert [Lee

et al., 2009; Zucchetto et al., 2008; Kabat et al., 2007].

Die meisten Tumoren der Niere treten sporadisch auf, es konnte aber ein erhöhtes

Erkrankungsrisiko bei positiver Familienanamnese aufgezeigt werden [Gago-‐Dominguez

et al., 2001; Hung et al., 2007]. Des Weiteren sind zurzeit ca. zehn genetische

Erkrankungen, die mit einer erhöhten Neigung zu Nierenzellkarzinomen einhergehen,

bekannt [Kopper und Timar, 2006]. Die bekanntesten unter ihnen sind das von Hippel-‐

Lindau-‐Syndrom, die autosomal dominant vererbte polyzystische Nierenerkrankung

(ADPKD), die familiäre Form des papillären Nierenzellkarzinoms (HPRCC), das Birt-‐Hogg-‐

Dube-‐Syndrom sowie die tuberöse Sklerose. Diese erblichen Tumorfälle belaufen sich

jedoch nur auf etwa 3 bis 5 % aller Fälle und manifestieren sich meist in einem früheren

Alter als das sporadische Nierenzellkarzinom [Coleman und Russo, 2009; Hajj et al., 2009].

4

Nicht nur hereditäre sondern auch andere sporadische Erkrankungen prädisponieren für

die Entwicklung eines Nierentumors. So gelten sowohl das dialysepflichtige chronische

Nierenversagen wie auch die längerfristige Hämodialyse selbst als Risikofaktor [Nouh et

al., 2009; Vamvakas et al., 1998; Kojima et al., 2006].

Die Art der Ernährung scheint im Gegensatz zu früheren Meinungen keine Rolle in der

Entwicklung des Nierenzellkarzinoms zu spielen [Lee et al., 2008]. Es zeigte sich hingegen,

dass moderater Alkoholkonsum die Erkrankungswahrscheinlichkeit sogar zu senken

vermag [Lee et al., 2007; Pelucchi et al., 2008].

Auch sozioökonomische Faktoren beeinflussen die Erkrankungsrate. So stehen die

Schwermetallverarbeitung, die Petrochemie oder die Arbeit mit Lösungsmitteln -‐ wie

etwa in chemischen Reinigungen -‐ und noch viele weitere gewerblich genutzte Stoffe im

Verdacht diese zu erhöhen [Mandel et al., 1995; Heck et al., 2009]. Die berufliche

Exposition gegenüber Metallen wie Cadmiumverbindungen oder Blei sowie zu Stoffen wie

Asbest oder Trichlorethylen scheint nephrokanzerogen zu sein [Chow und Devesa, 2008;

Pesch et al., 2000].

Das Entstehen eines Sekundärkarzinoms durch ionisierende Strahlen, beispielsweise bei

Behandlung aufgrund eines Zervixkarzinoms oder Spondylitis ankylosans, kann nicht

ausgeschlossen werden [Pascual und Borque, 2008; Lipworth et al., 2006].

Für einen Zusammenhang zwischen oberen Harnwegsinfekten und einem daraus

folgendem erhöhten Risiko besteht eine nur dürftige Datenlage [Parker et al., 2004]. Als

weitere Infektionskrankheit geht eine HIV-‐Infektion mit einer bis zu 8,5fach erhöhten

Prävalenz des Nierenzellkarzinoms einher [Pascual und Borque, 2008].

5

1.4 Klassifikation

So wie das Nierenzellkarzinom makroskopisch aufgrund von Nekrosen, Hämorrhagien und

Zysten ein „buntes“ Bild aufweist [Nizze et al., 2004], ist es auch histopathologisch eine

heterogene Entität. Aus diesem Grund stehen verschiedene Klassifikationen zur Auswahl.

Der vorliegenden Arbeit dienen die Heidelberg-‐Klassifikation und die Klassifikation der

UICC und AJCC als Grundlage, welche sich im Wesentlichen decken und auf welchen die

noch weiter unterteilten Klassifikationen der WHO von 1998 und 2004 aufbauen [Storkel

et al., 1997; Kovacs et al., 1997; Montironi et al., 1999]. In beiden Klassifikationen werden

die benignen parenchymatösen Neoplasien von den malignen getrennt. Innerhalb der

Malignome werden im Einzelnen das klarzellige Nierenzellkarzinom, das papilläre

Nierenzellkarzinom, das chromophobe Nierenzellkarzinom sowie das

Sammelrohrkarzinom (Ductus-‐Bellini-‐Karzinom) mit dessen Variante, dem medullären

Nierenzellkarzinom, unterschieden. Eine weitere Gruppe stellen die nicht klassifizierbaren

Nierenzellkarzinome dar (siehe Tabelle 1). Die häufigste Entität ist mit mindestens 80%

das klarzellige Nierenzellkarzinom, gefolgt vom papillären Nierenzellkarzinom mit circa

10%. Chromophobe Nierenzellkarzinome belaufen sich auf maximal 5%. Gerade 1% aller

Nierenzellkarzinome sind Ductus-‐Bellini-‐Karzinome. Die übrigen Karzinome lasen sich

nicht klassifizieren [Capitanio et al., 2009; Moch et al., 2000; Patard et al., 2005].

6

Heidelberg 1997

UICC/AJCC 1997

Benign

Benign Metanephric adenoma and adenofibroma Metanephric adenoma and adenofibroma

Papillary renal cell adenoma

Papillary renal cell adenoma Renal oncocytoma

Renal oncocytoma

Malignant

Malignant

Common or conventional renal cell carcinoma Conventional (clear cell ) renal carcinoma Papillary renal cell carcinoma

Papillary renal cell carcinoma

Chromophobe renal cell carcinoma Chromophobe renal cell carcinoma Collecting duct carcinoma

Collecting duct carcinoma

(variant: medullary carcinoma) (variant: medullary carcinoma) Renal cell carcinoma, unclassified Renal cell carcinoma, unclassified

Tabelle 1: Klassifikation des Nierenzellkarzinoms, nach [Montironi et al., 1999]

Das klarzellige Nierenzellkarzinom erscheint aufgrund des hohen Glykogen-‐ und

Lipidanteils im HE gefärbten Schnitt farblos beziehungsweise hell weshalb z. T. auch der

Begriff hellzelliges Nierenzellkarzinom benutzt wird. Als Ausgangsgewebe wird der

proximale Tubulus angenommen (siehe Abbildung 1) [Decker J, 2002; Nizze et al., 2004].

Mutationen im VHL-‐Gen auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 sind der Auslöser des

gleichnamigen Syndroms. Bei diesem Syndrom ist das klarzellige Nierenzellkarzinom die

häufigste Todesursache. Auch in circa 80% der sporadischen Fälle finden sich

Veränderungen in diesem Gen [Decker J, 2002; Latif et al., 1993; Whaley et al., 1994;

Brauch et al., 2000; Nickerson et al., 2008]. Weitere genetische Aberrationen können

Tabelle 24 im Anhang entnommen werden.

7

Abb. 1: Ursprungsorte des Nierenzellkarzinoms, aus [Decker J, 2002]

Das papilläre Nierenzellkarzinom entstammt ebenfalls dem proximalen Tubulus. Es wurde

aufgrund seines Wachstumsmusters benannt und wird in Typ I und II, welche

unterschiedliche Eigenschaften und Prognosen haben, eingeteilt [Delahunt und Eble,

1997; Decker J, 2002]. Sie werden in anderen Klassifikationen der Histologie wegen auch

als eosinophil und basophil bezeichnet. Verschiedene Trisomien sowie der Verlust des Y-‐

Chromosoms scheinen mit dem papillären Karzinom assoziiert [Lopez-‐Beltran et al.,

2009]. Des Weiteren kann sowohl bei der sporadischen als auch bei der familiären Form

(HPRCC) des papillären Nierenzellkarzinoms eine Aktivierung des c-‐Met-‐Onkogens auf

dem langen Arm des Chromosoms 7 gefunden werden [Coleman und Russo, 2009].

Die Zellen des chromophoben Karzinoms stammen aus distalen Nephronabschnitten

[Storkel et al., 1989; Decker J, 2002]. Das Birt-‐Hogg-‐Dube-‐Syndrom kann mit mehreren

Formen des Nierenzellkarzinoms einhergehen, manifestiert sich jedoch in über 80% der

Fälle als chromophobes Karzinom oder als Mischform mit chromophoben und

onkozytären Anteilen.

Ein weiterer Tumor des distalen Nephronabschnittes ist das eher seltene Sammelrohr-‐

oder Ductus-‐Bellini-‐Karzinom. Auch diesem Tumor konnten, wie Tabelle 24 im Anhang

zeigt, genetische Veränderungen zugeordnet werden. Jedoch ist diese Entität aufgrund

8

ihrer niedrigen Inzidenz insgesamt wenig erforscht und verstanden [Chao et al., 2002;

Polascik et al., 2002].

1.5 Staging

Alternativ zur histologischen Klassifikationen lassen sich Nierenzellkarzinome anhand

ihrer Ausdehnung einteilen. Hierfür wird die von der UICC herausgegebene so genannte

TNM-‐Klassifikation benutzt, welche Tumoren nach Tumorausdehnung beziehungsweise

Größe, Lymphknotenbefall sowie Metastasierungsstatus beschreibt. Die Tumoren werden

hiernach in Gruppen eingeteilt, sodass sich aufgrund statistischer Untersuchungen

Aussagen über das biologische Verhalten in einzelnen Stadien treffen lassen. Dieses

histologische Staging wird laufend aktualisiert. Im Zeitraum der Datenerhebung sind

mehrere Auflagen dieser Klassifikation erschienen (siehe Tabelle 2). Was das Stadium T3

betrifft, welches Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist, wurde in den neueren

Versionen eine weitere Untergruppe hinzugefügt. Dieses Stadium T3c war im

Patientenkollektiv dieser Arbeit jedoch nicht vertreten [UICC, 1998, 2002, 2010].

9

TNM 1997 TNM 2002 TNM 2010

Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden

T0 Kein Anhalt für Primärtumor

T1 Tumor 7 cm oder weniger in größter Ausdehnung, begrenzt auf die Niere

T1a Tumor 4 cm oder weniger in größter Ausdehnung, begrenzt auf die Niere

T1b Tumor mehr als 4 cm, aber nicht mehr als 7 cm in größter Ausdehnung,

begrenzt auf die Niere

T2 Tumor mehr als 7 cm in größter Ausdehnung, begrenzt auf die Niere

T2a Tumor mehr als 7 cm, aber nicht

mehr als 10 cm in größter

Ausdehnung

T2b Tumor mehr als 10 cm in größter

Ausdehnung

T3 Tumor breitet sich in größere Venen aus, oder infiltriert Nebenniere oder

perirenales Gewebe, jedoch nicht jenseits der Gerota-‐Faszie

Tumor breitet sich in größere Venen

aus oder infiltriert direkt perirenales

Gewebe, jedoch nicht in die

ipsilaterale Nebenniere und nicht

über die Gerota-‐Faszie hinaus

T3a Tumor infiltriert Nebenniere oder perirenales Gewebe, aber nicht jenseits

der Gerota-‐Faszie

Tumor mit makroskopischer

Ausbreitung in die Nierenvene oder

ihre segmentalen Äste (mit

muskulärer Wand) oder Infiltration

des perirenalen und/oder

peripelvinen Fettgewebes, aber nicht

über die Gerota-‐Faszie hinaus

T3b Tumor infiltriert Nierenvene oder

Hohlvene

Tumor infiltriert Nierenvene oder

Hohlvene unterhalb des

Zwerchfells


Ausdehnung in die Vena cava

unterhalb des Zwerchfells

T3c Tumorausdehnung in Hohlvene

oberhalb des Zwerchfells


Ausdehnung in die Vena cava

oberhalb des Zwerchfells oder mit

Infiltration der Wand der Vena cava

T4 Tumorausdehnung über Gerota-‐Faszie hinaus Tumor infiltriert über Gerota-‐Faszie

hinaus oder die kontinuierliche

Ausbreitung in die ipsilaterale

Nebenniere

10

Nx regionäre Lymphknoten nicht beurteilbar

N0 Kein Anhalt für regionäre Lymphknotenmetastasen

N1 Metastase in einem benachbarten Lymphknoten

N2 Metastase in mehr als einem benachbarten Lymphknoten

Mx Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden

M0 Kein Anhalt für Fernmetastasen

M1 Fernmetastasen

Tabelle 2: Modifikationen der TNM Stadien, eigene Grafik

1.6 Grading

Nierenzellkarzinome werden auch nach ihrem histologischen Malignitätsgrad beurteilt.

Dieses als Grading bezeichnete Differenzierungsmerkmal beurteilt Tumorzellen anhand

zytoplasmatischer und architektonischer Merkmale. Das im angloamerikanischen

Sprachraum etablierte vierstufige Grading nach Fuhrman ist nur eines von vielen

vorgeschlagenen Systemen [Fuhrman et al., 1982; Novara et al., 2007]. In der

vorliegenden Arbeit wird wie auch bei der Klassifikation, in Anlehnung an die UICC, ein

dreistufiges Grading benutzt. Dieses beurteilt die Abweichung der Tumorzellen vom

Normalgewebe. Die Einteilung unterscheidet gut (G1) von mäßig (G2) und schlecht (G3)

differenzierten Tumoren. Als Gx werden nicht beurteilbare Tumoren bezeichnet.

1.7 Prognose und Prognosefaktoren

Wie bereits erwähnt ist das Nierenzellkarzinom der Tumor mit der schlechtesten

Prognose unter den urologischen Malignomen [Brenner, 2002]. Die 5-‐Jahres-‐

Überlebensrate aller Nierenzellkarzinome liegt bei 66% [www.rki.de, 2010]. Das

Überleben in organbegrenzten Stadien (T1, T2) ohne Lymphknotenbefall (N0), die mit

einer 5 Jahres-‐Überlebensrate von 85% angegeben werden, ist im Vergleich zum

organübergreifenden Stadium (ab T3) deutlich besser. Im Stadium T3 weist die

Erkrankung eine 5-‐Jahres-‐Überlebensrate von nur noch etwa 53% auf. Diese sinkt in

11

einem bereits metastasierten Stadium auf gerade 10% [www.rki.de, 2010; Bukowski,

2009; Eggener et al., 2006]. Angesichts der Tatsache, dass bei bereits 20-‐30% der

Patienten bei Diagnose Fernmetastasen bestehen sowie nochmals ca. 20-‐30% nach

Nephrektomie Fernmetastasen entwickeln, sind besonders in diesen höheren Stadien

weitere prognostische Unterteilungshilfen erforderlich [Bukowski, 2009; Ljungberg,

2007].

Die verschiedenen Prognosefaktoren lassen sich in anatomische, histologische, klinische

und molekulare Kategorien einteilen [Ljungberg et al., 2007]. Weiterhin stehen mehrere

Prognosescores zur Auswahl.

Die anatomischen Faktoren, welche die Prognose bestimmen, werden weitestgehend in

der TNM-‐Klassifikation zusammengefasst (s. oben). Deren prognostische Aussagekraft

wurde in zahlreichen Studien belegt [Gettman et al., 2001; Kanao et al., 2009].

Unabhängig von anderen Parametern besitzt die Tumorgröße eine Aussage über das

Überleben. Die kritische Größe, ab welcher die Prognose signifikant schlechter wird, ist

hingegen Gegenstand von Diskussionen [Miyagawa et al., 2007; Lam et al., 2005; Ficarra

et al., 2005]. Aus diesem Grund wurden in der aktuellen Version der TNM-‐Klassifikation

die Stadieneinteilungen hinsichtlich der Tumorgröße verändert. Auch die

Tumorausdehnung bestimmt je nach Infiltration von Nachbargeweben wie Venensystem,

Nebenniere oder perirenalem Fett das Überleben und fließt hier mit ein [Lam et al.,

2005]. Nicht berücksichtigt wurde hingegen eine Beteiligung der ableitenden Harnwege,

die mit einer schlechteren Prognose assoziiert sein soll [Verhoest et al., 2009]. Des

Weiteren wird der Lymphknotenstatus berücksichtigt, welcher auch beim bereits

metastasierten Nierenzellkarzinom zusätzliche Informationskraft zu besitzen scheint

[Lughezzani et al., 2009]. Das Vorhandensein von Fernmetastasen stellt unter den

anatomische Prognosefaktoren den wichtigsten dar und entscheidet, wie oben

verdeutlicht, wesentlich das Überleben [www.rki.de, 2010]. Im Falle eines metastasierten

Nierenzellkarzinoms spielen die übrigen anatomischen Prognosefaktoren eine nur noch

untergeordnete Rolle [Neuzillet et al., 2009].

12

Beim Vergleich der einzelnen histologischen Subtypen fallen unterschiedliche Prognosen

auf. Es wurde gezeigt, dass die 5-‐Jahres-‐Überlebensrate des klarzelligen

Nierenzellkarzinoms mit annähernd 70% im Vergleich zu der der papillären und

chromophoben Form mit ca. 85% deutlich schlechter ist [Cheville et al., 2003]. Bezieht

man jedoch weitere Prognosefaktoren wie das TNM Stadium oder das Grading mit ein,

verliert diese Aussage an Bedeutung [Capitanio et al., 2009]. Als weiterem histologischen

Merkmal kommt dem Vorhandensein von Nekrosezonen innerhalb des Tumors

unabhängige prognostische Bedeutung zu [Sengupta et al., 2005]. Eine sarkomatoide

Differenzierung des Tumorgewebes sowie positive Schnittränder nach

Tumornephrektomie gehen ebenfalls mit einer eingeschränkten Prognose einher [Coons

et al., 2009].

Auch das klinische Bild des Patienten kann weiteren Aufschluss über die zu erwartende

Überlebensdauer geben. Allgemeinzustand, Alter, Geschlecht, Kachexie, Anämie sowie

eine erhöhte Thrombozytenzahl scheinen sich auf die Prognose auszuwirken [Kim et al.,

2003; Erdemir et al., 2007; Yasunaga et al., 1998; Sunela et al., 2009].

Es wurden verschiedenste molekulare Marker beschrieben, die eine prognostische

Aussage besitzen sollen. Die prominentesten unter ihnen sind die Carboanhydrase IX und

der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF, vascular endothelial growth factor).

Die Datenlage bei einer Vielzahl weiterer Biomarker ist vielversprechend. Jedoch ist noch

keiner von ihnen im allgemeinen Gebrauch [McGuire und Fitzpatrick, 2009; Ljungberg et

al., 2007]. Im Folgenden werden jedoch nur diejenigen Biomarker, die in dieser Arbeit

verwendet werden, ausführlich erläutert.

13

1.8 Die Marker

1.8.1 CD44

CD44 (cluster of differentation 44) charakterisiert eine heterogene Gruppe von

Adhäsionsmolekülen. Dies sind verschiedene Glykoproteine, die integraler Bestandteil der

Zellmembran sind [Aruffo et al., 1990]. Sie sind die Endprodukte eines ca. 50 Kilobasen

großen DNA-‐Abschnittes auf dem kurzen Arm von Chromosom 11, der mindestens 20

Exons umfasst. Für die von diesen Genen kodierten Produkte wurde zunächst ein Protein

mit einem Molekulargewicht von 85 kD identifiziert. Diese Standardform CD44s wird

aufgrund der Erstbeschreibung auf hämatopetischen Zellen auch CD44h genannt. Durch

alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikation, wie beispielsweise

Glykosylierung, können ca. 10 verschiedene Isoformen generiert werden. Diese Varianten

werden mit CD44v 1 bis 10 bezeichnet und unterscheiden sich in der Länge ihrer

extrazellulären Domäne. Dies findet einerseits Ausdruck im Molekulargewicht (85 bis 200

kD), andererseits äußert es sich in der Funktion [Rudzki und Jothy, 1997; Tolg et al., 1993;

Borland et al., 1998]. Der Hauptligand von CD44 ist das Matrixprotein Hyaluronsäure, was

der Adhäsion an die extrazelluläre Matrix dient. Weitere Liganden sind unter anderem

Kollagen Typ 1, Laminin und Fibronektin. CD44 ist jedoch nicht nur mit dem

Extrazellularraum, sondern auch mit dem Zytoskelett verbunden, vermittelt hierdurch

Zell-‐Zell-‐Kontakte und scheint auch an der Signaltransduktion beteiligt zu sein [Isacke,

1994]. Eine weitere Rolle spielt das auch Hermes Antigen oder pgp1 genannte Molekül in

der Lymphopoese, der Hämatopoese sowie dem Lymphozyten-‐Homing, einem

Rezirkulationsprozess der Lymphozyten zwischen Blutgefäßsystem und lymphatischen

Organen [Underhill, 1992; Aruffo et al., 1990; Rudzki und Jothy, 1997; Isacke und

Yarwood, 2002].

Im Ausblick auf die hier behandelte Fragestellung steht jedoch die Rolle von CD44 bei der

Entstehung von Neoplasien beziehungsweise Metastasen sowie dem biologischen

Verhalten von Tumoren im Vordergrund. Dieses biologische Verhalten zeigte sich bei

einer Vielzahl von Tumoren mit abweichender CD44 Expression im Vergleich zum

Normalgewebe verändert, wie beispielsweise bei Tumoren der Lunge, des Ovars, des

14

Darmes, der Harnblase, der weiblichen Brust sowie bei neuroendokrinen Tumoren und

hämatoonkologischen Erkrankungen [Du et al., 2008; Cho et al., 2006; Liu und Jiang, 2006;

Lai et al., 2005; Le et al., 2006; Muramaki et al., 2004; Abraham et al., 2005].

1.8.2 Cadherine

Die Gruppe der Cadherine gehört, wie auch CD44, zu den Adhäsionsmolekülen. Es handelt

sich um transmembranöse Glykoproteine, die zunächst dadurch charakterisiert wurden

kalziumabhängig Zellkontakte zu vermitteln [Takeichi, 1990]. Der Name leitet sich vom

englischen „calcium adhering“ (Kalzium anheftend) ab. Man findet diese Proteine in

verschiedenen Zellkontakten, unter anderem in Desmosomen [Pokutta und Weis, 2007].

Die Cadherinfamilie umfasst mittlerweile über 100 Moleküle, die in 6 Unterfamilien

eingeteilt werden [Nollet et al., 2000]. Die in dieser Arbeit untersuchten Cadherine E, N

und K gehören zu den so genannten klassischen Cadherinen, welche strukturell 5

Ectodomänen besitzten. Diese auch Cadherindomänen oder Cadherinmotive genannten

Abfolgen von ca. 110 Aminosäureresten sind für die unterschiedlichen Cadherine jeweils

charakteristisch. Unter ihnen richtet sich besonderes Augenmerk auf die Ectodomäne 1,

da sie hauptsächlich für die Interaktion zwischen den Cadherinen verantwortlich ist.

Gemeinsam sind den Catherinen eine einzelne transmembranöse Domäne sowie die

intrazelluläre Interaktion mit Cateninen [Shapiro und Weis, 2009]. Die klassischen

Cadherine werden aufgrund ihrer extrazellulären, N-‐terminalen Aminosäuresequenz in

zwei Untergruppen eingeteilt. E-‐Cadherin und N-‐Cadherin gehören zu Typ I, welcher sich

durch das so genannte HAV-‐Motiv (Histidin-‐Alanin-‐Valin) auszeichnet. K-‐Cadherin besitzt

zwar ebenfalls 5 Ectodomänen und interagiert intrazellulär mit Cateninen, zeigt jedoch

die Abfolge QAI (Glutamin-‐Alanin-‐Isoleucin), weshalb es zu den Cadherinen des Typs II

gezählt wird [Stemmler, 2008]. In den unterschiedlichen Gewebearten werden

verschiedene Cadherinexpressionsmuster gefunden, was bereits darauf hinweist, dass

Catherine außer der mechanischen Verbindung von Zellen untereinander noch weitere,

spezifische Funktionen besitzen [Halbleib und Nelson, 2006]. Sie spielen eine essentielle

Rolle in der Gewebedifferenzierung sowie der Aufrechterhaltung der Zellpolarität

15

innerhalb eines Gewebeverbandes. Auch beispielsweise an der Neuroplastizität von

Synapsen scheinen sie beteiligt zu sein [Halbleib und Nelson, 2006; Gumbiner, 2005;

Stepniak et al., 2009].

1.8.2.1 E-‐Cadherin

E-‐Cadherin gilt als Prototyp der gesamten Cadherinfamilie und wurde innerhalb dieser

Familie am besten untersucht. Es handelt sich hierbei um ein Glykoprotein mit einem

Molekulargewicht von 120 kD, welches von einem Gen namens CDH1 (Synonyme: UVO,

LCAM) auf dem langen Arm von Chromosom 16 kodiert wird [Berx et al., 1995]. E steht

für epithelial, da E-‐Cadherin auf allen Epithelien nachgewiesen werden kann [Jiang, 1996].

Es spielt eine essentielle Rolle bei der Stabilität eines Zellverbandes. So ist E-‐Cadherin

beispielsweise Bestandteil von Desmosomen. Hauptsächlich vermittelt E-‐Cadherin

homotype Bindungen; es verbindet also Zellen miteinander, die beide dieses Cadherin

exprimieren. Jedoch wurden auch heterotype Bindungen beschrieben [Stemmler, 2008].

Für die Stabilität dieser Verbindungen wird ionisiertes Kalzium benötigt [Pokutta und

Weis, 2007].

1.8.2.2 N-‐Cadherin

Wie E-‐Cadherin gehört auch N-‐Cadherin zur Gruppe der klassischen Cadherine. Zunächst

wurde N-‐Cadherin auf neuronalem Gewebe beschrieben, woraus später der Name

resultierte. Es handelt sich um ein Protein mit einer Molekülmasse von 130 kD, welches

von einem 16 Exons umfassenden Gen auf dem langen Arm von Chromosom 18 kodiert

wird [Gumbiner, 2005; Grunwald et al., 1982; Wallis et al., 1994]. Als Adhäsionsmolekül

vermittelt auch N-‐Cadherin in der Hauptsache homotype Bindungen, wenngleich auch

Heterodimere nachgewiesen wurden [Shan et al., 2000]. Wie auch andere Mitglieder

seiner Familie spielt N-‐Cadherin eine bedeutende Rolle in der Embryonalentwicklung

16

sowie der Aufrechterhaltung von Gewebearchitektur und Zellmorphologie. Hierbei ist

hervorzuheben, dass N-‐Cadherin diese Aufgaben nicht ausschließlich in neuronalem

Gewebe wahrnimmt, sondern beispielsweise auch für die Organogenese des Herzens

unerlässlich ist [Kadowaki et al., 2007; Derycke und Bracke, 2004; Redies und Takeichi,

1996].

1.8.2.3 K-‐Cadherin

K-‐Cadherin (Kidney-‐Cadherin) wurde erstmals in Nieren und Gehirn von Ratten gefunden.

Ein erhöhtes Maß an dieses Protein kodierende mRNA konnte in Tumoren der

Rattenniere nachgewiesen werden. Kurz darauf fand man in Cadherin 6 das humane

Gegenstück, welches in der menschlichen Niere und auch in menschlichen Tumoren,

insbesondere solcher der Niere, exprimiert wird [Xiang et al., 1994; Shimoyama et al.,

1995]. K-‐Cadherin und Cadherin 6 werden synonym benutzt und von einem Gen auf dem

kurzen Arm von Chromosom 5 kodiert [Chalmers et al., 1999]. Es handelt sich um ein 790

Aminosäuren umfassendes Molekül, welches in der gesunden Niere nur im proximalen

Tubulus nachweisbar ist und zu den klassische Cadherinen vom Typ II gezählt wird [Paul et

al., 1997; Shimoyama et al., 1995; Stemmler, 2008].

1.8.3 Ki-‐67

Das Ki-‐67 Antigen ist ein so genannter Proliferationsmarker. Gerdes et al. entdeckten bei

der Forschung mit Hodgkin-‐ und Sternberg-‐Reed-‐Zellen durch den Ki-‐67-‐Antikörper

markierte nukleäre Proteine, die nur in proliferierenden Zellen, d.h. in Zellen, die sich in

den Phasen G1,S,G2 und der Mitose befinden, vorhanden waren [Gerdes et al., 1983;

Gerdes et al., 1984]. Über zwanzig Jahre hatte diese Aussage Bestand. Heute ist bekannt,

dass auch ruhende Zellen in der G0 Phase dieses Protein, wenngleich in minimaler Weise,

exprimieren, was die Aussagekraft dieses Moleküls jedoch nicht schmälert [Bullwinkel et

17

al., 2006]. Der Name setzt sich aus dem Entdeckungsort Kiel sowie der Nummer des

Zellklons, welcher diesen Antikörper produzierte, zusammen [Scholzen und Gerdes,

2000].

Zwar wurde bewiesen, dass Ki-‐67 essentiell für die Proliferation von Zellen ist und es

liegen zwar genaue Erkenntnisse über Menge und Lokalisation des Proteins während des

Zellzyklus vor. Trotz all dem ist jedoch über die genaue Funktion des Proteins wenig

bekannt [Kausch et al., 2003; Schluter et al., 1993]. Das kodierende Gen befindet sich auf

dem langen Arm von Chromosom 10 und setzt sich aus 15 Exons zusammen [Schonk et

al., 1989; Fonatsch et al., 1991]. Durch alternatives Spleißen entstehen zwei Isoformen,

die sich in ihren Molekülmassen von 345 bzw. 395 kD unterscheiden [Gerdes et al., 1991].

Gemeinsam haben die Isoformen eine Abfolge von 22 Aminosäuren, die von einem als

„Ki-‐67 motif“ bezeichnetem Genlocus kodiert wird. Diese Abfolge enthält das Epitop,

welches von dem in dieser Arbeit verwendeten Antikörper MIB-‐1 (Molecular Immunology

Borstel) markiert wird [Schluter et al., 1993].

18

1.8.4 p16

P16 ist eines von zwei Produkten, die durch Verschiebung des Leserasters aus einem Gen

namens INK4A oder auch CDKN2A auf dem kurzen Arm von Chromosom 9 hervorgehen

können [Robertson und Jones, 1999]. P16 ist ein Inhibitor so genannter Cyklin-‐abhängiger

Kinasen (CDKs, Cyclin-‐dependent Kinases) [Serrano et al., 1993]. Diese Kinasen

kontrollieren die verschiedenen Abschnitte des Zellzyklus und stehen ihrerseits unter der

Kontrolle der regulatorischen Cykline.

P16 greift in den Retinoblastom-‐Signalweg ein, in welchem CDKs in Anwesenheit von

Cyklinen das Produkt des Retinoblastomgens (pRB) phosphorylieren. Durch den hierdurch

losgetretenen Signalweg kommt es zur Freisetzung von Transkriptionsfaktoren,

insbesondere von E2F, welcher maßgeblich am Übergang der G1-‐ zur S-‐Phase des

Zellzyklus beteiligt ist [Sherr, 2000]. Durch die Inhibierung der Phosphorylierung von pRB

durch p16 ist ein Fortschreiten des Zellzyklus nicht möglich und es kommt zum Arrest in

der G1 Phase [Sherr, 1996].

1.8.5 PTEN

PTEN (Phosphatase and Tensin homolog deleted on chromosome Ten) ist ein

Tumorsupressorgen, das auf dem langen Arm von Chromosom 10 (10q23.3) lokalisiert ist.

Es umfasst neun Exons mit einem variablen Exon 5b. 1997 wurde PTEN von gleich drei

Forschungsgruppen unter unterschiedlichen Namen beschrieben, weshalb auch die

Synonyme MMAC1 (Mutated in Multiple Advanced Cancers) und TEP1 (TGF-‐β-‐regulated

and epithelial cell-‐enriched phosphatase) verwendet werden. Das Transskript ist eine aus

403 Aminosäuren bestehende Phosphatase, die eine Sequenzhomologie zu Tensin besitzt;

einem aktinbindenden Protein, das beispielsweise in Zell-‐Zell-‐Kontakten vorkommt [Li et

al., 1997; Sharrard und Maitland, 2000; Steck et al., 1997; Li und Sun, 1997].

Neben einer essentiellen Funktion während der Embriogenese und Zellmigration greift

PTEN in wichtige Signalwege des Zellzyklus ein [Yamada und Araki, 2001].

19

Einer unter ihnen ist der Phosphatidyl-‐Inositol-‐3-‐Kinase (PI3K)-‐Signalweg. Bereits zu

Beginn dieses Signalweges wird Phosphatidylinositol-‐4,5-‐Bisphosphat (PIP2) zu

Phosphatidylinositol-‐3,4,5-‐Trisphosphat (PIP3) phosphoryliert. PIP3 bringt im Rahmen

eines second messenger Signals weitere Signalkaskaden wie den Proteinkinase-‐B-‐

Singnalweg (PKB/AKT) in Gang, welcher wiederum vielschichtige Auswirkungen auf die

Zellregulation besitzt. Unter anderem aktiviert PKB/AKT die Kinase mTOR, dem

Angriffspunkt von Temsirolimus, einem Immunsuppressivum, welches beim bereits

metastasierten Nierenzellkarzinom Verwendung findet.

Im Zellkern kommt es über weitere Zwischenschritte durch den PI3K Signalweg

beispielweise zur Aktivierung von proapoptotischen Genen [Cully et al., 2006; Leslie und

Downes, 2004; Di Cristofano und Pandolfi, 2000; Dahia et al., 1999; Nakamura et al.,

2000].

Die Phosphatase PTEN unterbricht diese Signalkaskade, indem PIP3 an Position 3

dephosphoryliert wird. Ein Mangel an PTEN kann also zu verminderter Apoptose sowie

gesteigerter Proliferation und Angioneogenese in Tumoren führen und scheint über

seinen Einfluss im PI3K Signalweg an der Entstehung von Tumoren mitbeteiligt zu sein

[Hamada et al., 2005; Blanco-‐Aparicio et al., 2007].

20

1.9 Ziele der Arbeit

Die bekannten klinischen und histopatholgischen Parameter Staging und Grading können

die Prognose gerade in den höheren Tumorstadien nur unzureichend und undifferenziert

wiedergeben. Wie oben beschrieben sind bei Diagnose jedoch viele Tumoren bereits in

fortgeschrittenem Stadium. Da gerade diese Stadien schlechte Therapiemöglichkeiten

und eine ungünstige Prognose besitzen, besteht großes Interesse weitere, sichere

Unterscheidungsmerkmale hinsichtlich des Überlebens sowie potentielle Angriffspunkte

neuer, zielgerichteter Therapien ausfindig zu machen.

Ziel dieser Arbeit ist es, die beschriebenen immunhistochemischen Marker auf eine

mögliche Korrelation mit dem Überleben von an einem Nierenzellkarzinom im Stadium T3

erkrankten Patienten zu überprüfen und hinsichtlich ihrer Tauglichkeit als Prognosefaktor

zu erörtern.

Des Weiteren werden bereits etablierte histopathologische Parameter am vorliegenden

Kollektiv verifiziert und auf einen Zusammenhang mit den verwendeten Biomarkern

untersucht.

21

2 Material und Methoden

2.1 Das Patientenkollektiv

Das Kollektiv umfasste zunächst alle 122 an einem Nierenzellkarzinom im Stadium T3

erkrankten Patienten, die im Zeitraum von 1993 bis 2002 in der Klinik für Urologie des

Universitätsklinikums der Universität zu Lübeck operativ versorgt wurden. Bei Proben von

lebenden Patienten bedurfte es laut Ethikkommission (Antragnummer 06-‐134 vom

21.7.2008) zur Verwendung des Tumormaterials einer Einwilligungserklärung. Um die

Einwilligung beziehungsweise Informationen über den Verbleib oder das mögliche

Ableben der Patienten zu erhalten, wurden verschiedene Stellen angeschrieben.

Nachdem die Eigenauskunft der Patienten sowie die Informationen von Angehörigen, des

Einwohnermeldeamtes, der zuletzt behandelnden Ärzte, der Vertrauensstelle des

Krebsregisters sowie der Krankenkassen zusammengetragen wurden, konnten 96 Proben

verwendet werden. (Fragebögen/ Anschreiben siehe Anhang)

Zu einer weiteren Reduktion des Kollektivs kam es, da 3 Gewebeproben nicht auffindbar

waren oder durch vorherige Untersuchungen nicht ausreichend repräsentatives Material

vorhanden war. Im Verlauf wurde eine weitere Probe als Urothelkarzinom identifiziert

und deshalb nicht in die Studie aufgenommen. Das Kollektiv setzte sich somit aus 92

Patienten zusammen.

2.2 Datenerhebung

Die Datenerhebung erfolgte retrospektiv und die erforderlichen Parameter wurden den

Krankenakten bzw. den Datenbanken der Klinik für Urologie und dem Institut für

Pathologie der Universität zu Lübeck entnommen. Gegebenenfalls mussten sie durch

Auskünfte der Patienten, deren Angehörigen oder durch die behandelnden Hausärzte

22

ergänzt werden. Das Follow-‐up der Patienten endete bei einer mittleren

Nachbeobachtungszeit von 129,2 Monaten am 12.11.2008.

2.3 Immunhistochemie

Antikörper binden spezifisch und mit hoher Affinität an einen bestimmten

Molekülabschnitt eines Antigens, einem sogenannten Epitop. Diese Eigenschaft macht

sich die Immunhistochemie zu Nutze. Das gewünschte Antigen wird nicht selbst

angefärbt, sondern durch einen markierten Antikörper, der an seinem entsprechenden

Epitop bindet, sichtbar gemacht. Wird der Antikörper zuvor mit einem fluoreszierenden

Stoff verbunden, kann der Antikörper, und damit auch das Antigen, im

Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.

Um dies auch im Lichtmikroskop zu erreichen müssen andere Markermoleküle verwendet

werden. Hierbei wird der Antikörper zuvor mit einem Enzym verbunden, das eine

Reaktion katalysiert. So entsteht unter Zugabe eines Chromogens ein Farbstoff, welcher

die Lokalisation des Antigens sichtbar macht. Dies wird als direkte Methode bezeichnet.

Wird jedoch nicht der Antikörper (=Primärantikörper) mit einem Enzym konjugiert,

sondern in einem zweiten Schritt ein (mehrfach) enzymmarkierter Sekundärantikörper

(Enhancer) mit dem primären verbunden, spricht man von indirekter Immunhistochemie.

Diese Technik wurde in der vorliegenden Arbeit verwendet und hat den Vorteil, das

Farbsignal zu verstärken. Als Sekundärantikörper wurden von der Ziege stammende

Immunglobuline verwendet, die gegen Immunglobuline der Gruppe G von Maus,

Kaninchen und Ratte gerichtet waren (PowerVision +Poly-‐Hrp-‐Anti Ms/Rb/Rt IgG Biotn-‐

free, Ready-‐to-‐use, ImmunoLogic). Dieser Sekundärantikörper war mit

Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase) konjugiert. Diese katalysiert unter

Zugabe von Wasserstoffperoxid eine Reaktion, bei der Protonen frei werden. Die

freigewordenen Protonen oxidieren das Chromogen 3,3'-‐Diaminobenzidin (DAB). Das

zuvor farblose Substrat wird hierdurch in ein braunes Produkt umgewandelt. Um eine

unspezifische Hintergrundfärbung zu verhindern wird die endogene Peroxidase mit

Wasserstoffperoxid (H2O2) blockiert und somit der Kontrast verstärkt.

23

2.4 Tumormaterial/ Zuschnitt

Das operativ gewonnene Tumormaterial stand formalinfixiert und in Paraffin

eingebetteten Gewebeblöcken im Archiv des Institutes für Pathologie der Universität zu

Lübeck zur Verfügung. Anhand der jedem Paraffinblock zugeordneten HE gefärbten

Testschnitte wurde zunächst jeweils derjenige Paraffinblock mit dem repräsentativsten

Tumoranteil ausgewählt.

Die Blöcke wurden nach vorheriger Kühlung mit einem Mikrotom in ca. 5µm dicke

Scheiben geschnitten. In einem erwärmten Wasserbad wurden diese gestreckt und auf

sialinierte Objektträger aufgebracht. Nach dem Trocknen konnten die Schnitte durch Xylol

und eine absteigende Alkoholreihe entparaffiniert und dehydriert werden. Ein Schnitt

jedes Blockes wurde mit Hämatoxylin-‐Eosin gefärbt, um das Vorhandensein von

Tumorgewebe nochmals zu verifizieren. Ein Beispiel zeigt Abbildung 2.

Abbildung 2: HE Färbung Nierenzellkarzinom

24

2.5 Antigendemaskierung

Durch die Fixierung der Gewebeproben mit Formalin werden Proteine miteinander

vernetzt [Werner et al., 2000]. Deshalb können die Antikörper teilweise nicht mehr an die

passenden Epitope binden. Man spricht hierbei von Maskierung des Antigens. Um dies

zumindest teilweise rückgängig zu machen, müssen die einzelnen Schnitte zur

Antigendemaskierung in einer Pufferlösung erhitzt beziehungsweise enzymatisch

behandelt werden. In dieser Arbeit wurden zur Demaskierung ein Dampfgarer und ein

Dampftopf benutzt. Anschließend konnte mit der Färbung begonnen werden.

2.6 Färbeprozedur

Die optimale Verdünnung der Marker, die Verweildauer im Dampfgarer bzw. Dampftopf

sowie die jeweilig optimale Pufferlösung wurden vorangehend an Testschnitten ermittelt.

Es ergaben sich die in Tabelle 3 angegebenen Werte:

Marker Vorbehandlung Verdünnung Puffer Zeit

CD44 Dampfgarer 1:50 pH 9,0 40 min

E-‐Cadherin Dampfgarer 1:5000 pH 9,0 40 min

N-‐Cadherin Dampfgarer 1:100 pH 9,0 40 min

K-‐Cadherin Dampfgarer 1:25 pH 9,0 40 min

Ki-‐67 Dampftopf 1:100 pH 6,1 15 min

PTEN Dampfgarer 1:30 pH 6,1 40 min

P16 Dampfgarer 1:50 pH 6,1 40 min

Tabelle 3: Antigendemaskierung, eigene Grafik

25

2.7 Färbeprotokoll

2 x 5 min Xylol (Entparaffinieren)

Absteigende Alkoholreihe (Rehydrieren)

5 min TBS (Tris-‐buffered-‐saline)

10 min H2O2 (Blockierung)

30 min Primärantikörper

5 min TBS

15 min Post-‐antibody Blocking

5 min TBS

15 min Sekundärantikörper (Enhancer)

3 x 5 min TBS

8-‐10 min DAB (Diaminobenzidin)

Spülen in Leitungswasser

3 min Gegenfärbung mit Hämatoxylin

Fließend bläuen in Leitungswasser

Aufsteigende Alkoholreihe (3 x Xylol)

Eindecken der Objektträger

26

2.8 Materialien und Reagenzien

Geräte/ Materialien:

Microtom Reichelt & Jung

Tube cooler Wendt Maschinenbau

Wasserbad Medax

Dampfgarer Miele

Dampftopf Braun

Mikroskop Olympus

Objektträger DAKO

Chemikalien:

DAB Thermo Fisher Scientific

Hämatoxylin Dako

TBS-‐Puffer Eigenherstellung

Xylol Abbott

Antikörper:

CD44 Millipore

E-‐Cadherin Zytomed

N-‐Cadherin Thermo Scientific

K-‐Cadherin Dianova

Ki-‐67 (MIB-‐1) DAKO

P16 DAKO

PTEN DAKO

Poly-‐HRP-‐Anti-‐mouse/rabbit/rat IgG ImmunoLogic

27

2.9 Auswertung der immunhistochemischen Färbungen

Die einzelnen gefärbten Schnitte wurden im Rahmen einer Konsensusentscheidung durch

drei Personen, D.F., P.K. und einem erfahrenem Facharzt für Pathologie Prof. Dr. C.T., der

keine Kenntnis über die klinischen Parameter der individuellen Fälle hatte, ausgewertet.

Mit dem Mehrkopfmikroskop wurde zunächst der repräsentativste Bereich des Tumors

aufgesucht und die durch die Färbung dunkelbraun markierten Zellbestandteile in

verschiedenen Vergrößerungen evaluiert. Da die jeweiligen Marker unterschiedliche

Färbeverhalten zeigten und da in der Literatur keine einheitlichen

Bewertungsmodalitäten vorliegen, wurden je nach Marker verschiedene Merkmale

beurteilt. Ausgewählte Schnitte wurden fotografisch dokumentiert. Ein Negativbeispiel

ohne immunhistochemische Anfärbung zeigt Abbildung 3 (Vergrößerung stets x200).

Da einzelne Schnitte nicht auswertbar waren, kommt es im Vergleich der Marker

untereinander zu leicht divergierenden Fallzahlen.

Abb. 3: negative Färbung

28

Für Ki-‐67 und PTEN wurde der prozentuale Anteil der immunhistochemisch angefärbten

Kerne in 10% Schritten von 0 bis 100 ausgewertet. (siehe Abbildungen 4 und 5)

Abb. 4: Immunhistochemische Färbung Ki-‐67

Abb. 5: Immunhistochemische Färbung PTEN

29

Bei den Cadherinen wurde ebenfalls der prozentuale Anteil angefärbter Zellen evaluiert.

Diese wurden hier jedoch durch eine Markierung der Zellmembran gekennzeichnet.

Zusätzlich wurde die Intensität der Färbung in drei semiquantitative Kategorien bewertet:

0 – keine Anfärbbarkeit, 1 – schwache Anfärbbarkeit, 2 – starke Anfärbbarkeit (s.

Abbildungen 6-‐8).

Abb. 6: Immunhistochemische Färbung K-‐Cadherin

30

Abb. 7: Immunhistochemische Färbung E-‐Cadherin

Abb. 8: Immunhistochemische Färbung N-‐Cadherin

31

Bei der Färbung von CD44 wurde ebenfalls hauptsächlich die Zellmembran markiert und

der prozentuale Anteil der so farblich gekennzeichneten Tumorzellen in 10 % Schritten

eingeteilt. Analog zu den Cadherinen wurde die Färbeintensität beurteilt. Des Weiteren

wurde, da teilweise das Zytoplasma ebenfalls angefärbt wurde, dieses semiquantitativ in

3 Untergruppen eingeteilt: 0 – keine Anfärbung, 1 – weniger als 50% der Zytoplasmen

färbbar, 2 – mehr als 50% der Zytoplasmen färbbar. Ein Beispiel zeigt Abbildung 9.

Abb. 9: Immunhistochemische Färbung CD44

Da die Färbung für p16 diffus mehrere Kompartimente der Tumorzellen anfärbt, wurden

sowohl braun markierte Zellkerne als auch angefärbte Zytoplasmen in 10% Schritten

ausgewertet. Zusätzlich wurde die Färbeintensität analog zu den Cadherinen beurteilt

(siehe Abbildung 10).

32

Abb. 10: Immunhistochemische Färbung p16

2.10 Statistische Auswertung

Im Rahmen der Vorbereitung wurde das Kooperationsangebot des Institutes für

Medizinische Biometrie und Statistik der Universität zu Lübeck (IMBS) in Anspruch

genommen. Nach Auswertung wurden die Daten erneut dem IMBS vorgestellt.

Die Datenerfassung erfolgte mittels Microsoft Office Excel, die statistische Auswertung

mit SPSS Statistics für Windows Version 16. Zur Darstellung der Überlebenszeitanalyse

wurden Kaplan-‐Meier-‐Kurven verwendet. Gruppenvergleiche wurden mit Hilfe des Log-‐

Rank Tests mit einem Signifikanzniveau von p ≤ 0,05 ausgewertet. Assoziative

Beziehungen zwischen den verschiedenen Parametern wurden anhand zuvor stets nach

Median dichotomisierten Datensätzen mittels Mehrfeldertafeln getestet. Sie wurden mit

Fishers exaktem Test und einem Signifikanzniveau von ebenfalls p ≤ 0,05 überprüft. Ab

einem Signifikanzwert von p ≤ 0,1 wurde von einem Trend gesprochen, die maximale

Irrtumswahrscheinlichkeit beträgt hierbei jedoch 10%.

33

3 Ergebnisse

3.1 Das Patientenkollektiv

Das untersuchte Kollektiv setzte sich aus 92 Patienten zusammen. Das Verhältnis der

Geschlechter betrug 63 männliche zu 29 weiblichen Probanden und damit nahezu 2:1. Im

Mittel waren die Patienten bei Operation 64,8 Jahre alt (Spannweite 34 bis 87 Jahre).

Abbildung 11 zeigt die Altersverteilung der Patienten. Der Mittelwert der

Nachbeobachtungszeit betrug 129,2 Monate, bei einer Spannweite von 114 Monaten

(range 72-‐186). Am Ende der Datenerhebung waren 76 Patienten bereits verstorben

(82,6%). Abbildung 12 zeigt dies als Kaplan-‐Meier-‐Kurve. 82 der beobachteten Tumoren

waren klarzellige Karzinome, jeweils 3 zeigten chromophobe und spindelzellige

Differenzierung und jeweils ein Karzinom war von chromophiler, onkozytärer,

sarkomatöser und tubulopapillärer Gestalt. Somit waren 89,9% der Proben klarzellige

Nierenzellkarzinome und 10,9 % andere Subtypen. Histopathologisch wurden 42 der

Proben dem Stadium T3a, und 50 dem Stadium T3b zugeordnet. In 6 Fällen war ein

Lymphknoten, in 9 Fällen bereits mehrere befallen. In 46 Proben wurden die

untersuchten Lymphknoten als tumorfrei bewertet und im Rest der Fälle konnten die

Lymphknoten nicht beurteilt werden. 12 Tumoren waren zum Operationszeitpunkt

bereits fernmetastasiert, 22 zeigten keine Fernmetastasen und in 58 Fällen konnte das M-‐

Stadium nicht sicher beurteilt werden. Hinsichtlich des histopathologischen Gradings

zeigten sich 10 Tumore als gut, 60 als mäßig und 22 als schlecht differenziert. Die Größe

der Tumoren betrug im Mittel 7,94 Zentimeter, schwankte jedoch deutlich von 2,2 bis

17,0 cm. Tabelle 4 zeigt die verschiedenen Parameter im Überblick.

34

Variable n % Mittelwert Median Range

92

Geschlecht

m 63 68,5

w 29 31,5

Alter

64,8 65 34-‐87

< 60 22 23,9

> 60 70 76,1

Histologie

kleinzellig 82 89,1

andere 10 10,9

Tumorgröße

7,94 7,5 2,2-‐17,0

<4cm 10 10,9

4-‐7cm 34 37

>7cm 48 52,2

T-‐Stadium

T3a 42 45,7

T3b 50 54,3

N-‐Stadium

N0/Nx 77 83,7

N1/N2 15 16,3

M-‐Stadium

M0/Mx 80 86,9

M1 12 13

Grading

G1 10 10,9

G2 60 65,2

G3 22 23,9

Tabelle 4: Überblick über die erhobenen Daten

35

Abb. 11: Alter der Patienten bei Operation in Dekaden.

Abb. 12: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Gesamtüberleben des Patientenkollektives.

36

3.2 Etablierte Prognosefaktoren

3.2.1 Tumorstadium

Das untersuchte Patientenkollektiv bestand aus 42 Patienten mit Nierenzellkarzinom im

Stadium T3a und 50 Patienten im Stadium T3b. Hinsichtlich des Gesamtüberlebens zeigte

sich kein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Subgruppen (Log-‐Rank-‐Test:

p=0,968). Abbildung 13 stellt als Kaplan-‐Meier-‐Kurve das Gesamtüberleben der Patienten

im Stadium T3a versus T3b dar.

Abb. 13: Kaplan-‐Meier-‐Kurve T3a vs. T3b

37

3.2.2 Nodalstatus

Bei 15 Patienten konnten lokale Lymphknotenmetastasen des Primärtumors

nachgewiesen werden. In 31 Fällen konnte der Lymphknotenstatus nicht sicher beurteilt

werden. Da jedoch das sichere Vorhandensein von Lymphknotenabsiedlungen die

Prognose entscheidend verschlechtert, wurde das Stadium Nx zur lymphatisch nicht

metastasierten Subgruppe hinzugefügt. Abbildung 14 zeigt als Kaplan-‐Meier-‐Kurve das

Gesamtüberleben hinsichtlich des Nodalstatus unterteilt in sicher positiv (N>0) und

negativ bzw. nicht sicher positiv (N0/Nx). Jedoch bestand kein signifikanter Unterschied

hinsichtlich des Überlebens beider Untergruppen (Log-‐Rank-‐Test: p=0,791).

Abb. 14: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Nodalstatus

38

3.2.3 Metastasen

12 Tumoren zeigten zum Operationszeitpunkt bereits Fernmetastasen (M1). Da der

sichere Nachweis von Metastasen die Prognose wesentlich beeinflusst, wurde analog zum

Nodalstatus das Mx Stadium der metastasenfreien Subgruppe hinzugerechnet (M0/Mx).

Abbildung 15 zeigt die Kaplan-‐Meier-‐Kurven dieser beiden Untergruppen. Das

Gesamtüberleben der Patienten mit bereits metastasierten Karzinom zeigte sich im

Vergleich zum Rest des Patientenkollektiv signifikant vermindert (Log-‐Rank-‐Test:

p=0,016).

Abb. 15: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Metastasen

39

3.2.4 Grading

Abbildung 16 zeigt die Kaplan-‐Meier-‐Kurve der drei durch Grading determinierten

Untergruppen. Das Gesamtüberleben unterschied sich bei diesen drei Subgruppen

signifikant und verminderte sich bei erhöhtem Grading (Log-‐Rank-‐Test: p=0,02).

Abb. 16: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Grading

40

3.2.5 Tumorgröße

Die absolute Größe des Primärtumors hingegen hatte in der untersuchten Kohorte keinen

Einfluss auf das Gesamtüberleben. Weder dichotomisiert nach Median noch in drei

Subgruppen in Anlehnung der Unterscheidungsgröße im Stadium T1 der TNM

Klassifikation unterteilt, wurden signifikante Unterschiede hinsichtlich des

Gesamtüberlebens gefunden (Log-‐Rank-‐Test: p=0,568 und 0,446). Die Abbildungen 17

und 18 zeigen dies dargestellt als Kaplan-‐Meier-‐Kurven.

Abb. 17: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Größe (dichotomisiert nach Median)

41

Abb. 18: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Größe (gruppiert nach TNM)

42

3.2.6 Histologie

Aufgeteilt nach Histologie in klarzellige versus andere Nierenzellkarzinome fand sich im

Kaplan-‐Meier-‐Diagramm (Abbildung 19) kein signifikanter Unterschied bezüglich des

Gesamtüberlebens. (Log-‐Rank-‐Test: p=0,189)

Abb. 19: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Histologie

43

3.2.7 Alter

Auch beim Vergleich des Alters bei Operation dichotomisiert nach dem Median (65 Jahre)

zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Gesamtüberlebens. Der p-‐Wert

nach Log-‐Rank-‐Test betrug 0,381. Siehe Abbildung 20.

Abb. 20: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Histologie

44

3.2.8 Geschlecht

Gemessen an der Überlebenswahrscheinlichkeit hatte das Geschlecht des Patienten im

untersuchten Kollektiv keine Bedeutung. Die Kaplan-‐Meier-‐Kurven in Abbildung 21

verlaufen nahezu gleich. Der p-‐Wert beträgt 0,870.

Abb. 21: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Geschlecht

45

3.3 Immunhistochemische Marker

3.3.1 CD44

Für diesen Marker wurden 3 Parameter, die Färbeintensität, die Anzahl der gefärbten

Zellen und die Zytoplasmafärbung, ausgewertet. Für die Anzahl markierter Zellen wurden

die Daten nach Median (0%) zuvor dichotomisiert. Analog hierzu wurde bei der Färbung

des Zytoplasmas verfahren, welches bei nur etwas über 20 % der Proben mit CD44 positiv

gefärbt war. Die Abbildungen 22 bis 24 zeigen die Kaplan-‐Meier-‐Kurven für diese

Merkmale. Für keine dieser Parameter wurde das Signifikanzniveau von p=0,05

unterschritten.

Abb. 22: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 Färbeintensität

46

Abb. 23: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 % gefärbte Zellen

47

Abb. 24: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 Zytoplasmafärbung

48

3.3.2 E-‐Cadherin

Analog zu CD44 wurde auch hier die Färbeintensität und zusätzlich der prozentuale

Anzahl der membranständig gefärbten Zellen beurteilt. Abbildung 25 zeigt die Kaplan-‐

Meier-‐Kurven der drei verschiedenen Färbeintensitäten, Abbildung 26 die Kaplan-‐Meier-‐

Kurve der zuvor nach Median (0%) dichotomisierten Daten für den prozentualen Anzahl

der gefärbten Zellen. Für keine der beiden Merkmale wurde das Signifikanzniveau

unterschritten, jedoch wurde für die Anzahl der gefärbten Zellen mit einem nach Log-‐

Rank-‐Test bestimmten p=0,108 der Grenzwert zu einem Trend nur leicht überschritten.

Abb. 25: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität E-‐Cadherin

49

Abb. 26: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Anzahl gefärbter Zellen E-‐Cadherin

50

3.3.3 N-‐Cadherin

Wie auch bei E-‐Cadherin wurden für N-‐Cadherin Kaplan-‐Meier-‐Kurven für Intensität und

prozentualen Anteil der angefärbten Zellen erstellt. (Siehe Abbildungen 27 und 28) Der p-‐

Wert für die Anzahl der gefärbten Zellen lag mit 0,092 unter dem Trendniveau von 0,1.

Abb. 27: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität N-‐Cadherin

51

Abb. 28: Kaplan-‐Meier-‐Kurve N-‐Cadherin % gefärbte Zellen

52

3.3.4 K-‐Cadherin

Analog zu den vorherigen Cadherinen zeigen die Abbildungen 29 und 30 Kaplan-‐Meier-‐

Kurven der beiden bestimmten Färbemerkmale. Für diesen Marker wurde das

Signifikanzniveau nicht unterschritten.

Abb. 29: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität K-‐Cadherin

53

Abb. 30: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen K-‐Cadherin

54

3.3.5 Ki-‐67

Für Ki-‐67 wurde die Anzahl der gefärbten Zellkerne in 10% Schritten bestimmt. Abbildung

31 zeigt die Kaplan-‐Meier-‐Kurve der zuvor nach Median (10%) dichotomisierten Daten.

Nach dem Log-‐Rank-‐Test wurde mit einem p-‐Wert von 0,098 das Trendniveau knapp

unterschritten.

Abb. 31: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen Ki-‐67

55

3.3.6 p16

Für diesen Marker wurden sowohl die Anzahl der membranständig gefärbten als auch

zytoplasmatisch markierten Zellen getrennt voneinander in 10% Schritten ausgewertet.

Zusätzlich wurde die Färbeintensität bewertet. Die Abbildungen 32 bis 34 zeigen die

Kaplan-‐Meier-‐Kurven der einzelnen Färbemerkmale. Einen signifikanten Unterschied

zeigte keiner dieser Parameter.

Abb. 32: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zelle p16

56

Abb. 33: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbte Zytoplasmen p16

57

Abb. 34: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität p16

58

3.3.7 PTEN

Wie bei Ki-‐67 wurde für diesen Marker ausschließlich die Kernfärbung in 10% Schritten

beurteilt. Abbildung 35 die Kaplan-‐Meier-‐Kurve mit dem nach Median (10%)

dichotomisierten Datensatz. Es bestand kein signifikanter Unterschied der beiden

Subgruppen.

Abb. 35: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen PTEN

59

3.4 Kreuztabellen

Die verschiedenen immunhistochemischen Marker wurden mittels Kreuztabellen und

Fishers exaktem Test auf Korrelationen mit den bereits etablierten prognostischen

Faktoren und den weiteren erhobenen Merkmalen überprüft. Aufgrund der Datenmenge

werden hier nur die Tabellen mit signifikanten Ergebnissen bzw. Trends, also Ergebnisse

mit einem p-‐Wert < 0,1 abgebildet. Die übrigen Vier-‐ bzw. Mehrfeldertafeln finden sich im

Anhang. Die leicht unterschiedlichen Fallzahlen ergeben sich aus einzelnen nicht

auswertbaren Proben.

3.4.1 CD44

Je nach Färbemerkmal zeigte dieser Marker unterschiedliche Korrelationen mit weiteren

Parametern. Alle Färbemerkmale zeigten eine signifikante Korrelation mit dem

histologischen Grading (siehe Tabellen 5 bis 7). Des Weiteren waren Wechselbeziehungen

zwischen Färbeintensität und Anzahl der gefärbten Zellen mit der Tumorgröße

festzustellen (Abbildungen 8 und 9). Trends konnten für die Anzahl gefärbter Zellen mit

dem Metastasierungsstatus (Tabelle 10) sowie für die zytoplasmatische Färbung mit der

histologische Entität ermittelt werden (Tabelle 11).

p=0,023 Grading

1 2 3 Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität = 0 8 33 7 48

Intensität > 0 1 21 13 35

Gesamt 9 54 20 83

Tabelle 5: Korrelation der Färbeintensität von CD44 mit dem Grading

60

p=0,017 Grading

1 2 3 Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 8 34 7 49

> 0 % 1 20 13 34

Gesamt 9 54 20 83

Tabelle 6: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Grading

p=0,007 Grading

1 2 3 Gesamt

CD44 Zytoplasmafärbung

dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 8 46 10 64

Färbung 1 bis 2 1 8 10 19

Gesamt 9 54 20 83

Tabelle 7: Korrelation der CD44 Zytoplasmafärbung und Grading

p=0,039 Größe nach TNM Einteilung

<4 cm 4-‐7 cm >7 cm Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 9 30 44 83

Tabelle 8: Korrelation der Färbeintensität von CD44 mit der Tumorgröße

61



CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 2 21 26 49

> 0 % 7 9 18 34

Gesamt 9 30 44 83

Tabelle 9: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Tumorgröße

p=0,087 Metastasen

0 1 x Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 7 8 34 49

> 0 % 12 3 19 34

Gesamt 19 11 53 83

Tabelle 10: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Metastasen

p=0,076 Histo dichotomisiert

klarzellig andere Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 60 4 64

Färbung 1 bis 2 15 4 19

Gesamt 75 8 83

Tabelle 11: Korrelation von CD44 Zytoplasmafärbung und Histologie

62

3.4.2 E-‐Cadherin

Für diesen Marker zeigte sich ein Trend für eine Korrelation der beiden erhobenen

Färbemerkmale Intensität und Anzahl gefärbter Zellen mit dem histologischen Grading.

Der p-‐Wert betrug jeweils 0,074 (Siehe Tabellen 12 und 13).

p=0,074 Grading

1 2 3 Gesamt

E-‐Cadherin Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität 0 4 40 9 53

Intensität 1 bis 2 6 20 12 38

Gesamt 10 60 21 91

Tabelle 12: Korrelation von E-‐Cadherin Färbeintensität und Grading

p=0,074 Grading

1 2 3 Gesamt

E-‐Cadherin % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 4 40 9 53

10-‐100% 6 20 12 38

Gesamt 10 60 21 91

Tabelle 13: Korrelation von Anzahl E-‐Cadherin markierten Zellen und Grading

63

3.4.3 N-‐Cadherin

Wie die Tabellen 14 und 15 verdeutlichen, bestanden bei diesem Marker

Wechselbeziehungen zwischen der Histologie und beiden Färbemerkmalen (p=0,019 bzw.

0,019). Des Weiteren wurde für die Korrelation von Färbeintensität mit Geschlecht das

Signifikanzniveau für einen Trend mit p=0,093 leicht unterschritten (Tabelle 16).



N-‐Cadherin Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität = 0 40 8 48

Intensität = 1 bis 2 34 0 34

Gesamt 74 8 82

Tabelle 14: Korrelation von N-‐Cadherin Färbeintensität und Histologie



N-‐Cadherin % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 41 8 49

> 0 % 33 0 33

Gesamt 74 8 82

Tabelle 15: Korrelation Anzahl N-‐Cadherin markierten Zellen in Histologie

p=0,093 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 56 26 82

Tabelle 16: Korrelation von N-‐Cadherin Färbeintensität und Geschlecht

64

3.4.4 K-‐Cadherin

Hier wurde mit einem p-‐Wert von 0,054 das Signifikanzniveau für eine Korrelation der

Anzahl der angefärbten Zellen mit dem histologischen Grading leicht überschritten

(Tabelle 17).

p=0,054 Grading

1 2 3 Gesamt

K-‐Cadherin % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 6 27 16 49

70-‐100% 4 28 4 36

Gesamt 10 55 20 85

Tabelle 17: Korrelation der Anzahl K-‐Cadherin markierter Zellen und Grading

3.4.5 Ki-‐67:

Auch für Ki-‐67 zeigte sich, wie Tabelle 18 veranschaulicht, mit einem p-‐Wert von 0,08 ein

Trend für eine Korrelation mit dem histologischen Grading.

p=0,080 Grading

1 2 3 Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 6 34 9 49

20-‐100% 1 12 10 23

Gesamt 7 46 19 72

Tabelle 18: Korrelation der Anzahl Ki-‐67 markierter Zellen und Grading

65

3.4.6 p16

Bei diesem Marker korrelierte die Anzahl der angefärbten Zellen wie auch die

zytoplasmatische Färbung mit dem histologischen Grading. Einmal ist dies statistisch

signifikant und einmal als Trend erkennbar (p=0,021; p=0,099) (Tabellen 19 und 20). Des

Weiteren bestanden Trends zu einer Assoziation der Färbeintensität mit der Tumorgröße

und der Anzahl gefärbter Zellen mit dem Geschlecht (Tabellen 21 und 22).

p=0,021 Grading

1 2 3 Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 6 39 7 52

10-‐100% 4 18 14 36

Gesamt 10 57 21 88

Tabelle 19: Korrelation der Anzahl p16 membranös markierter Zellen und Grading

p=0,099 Grading

1 2 3 Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 8 32 8 48

10-‐100% 2 25 13 40

Gesamt 10 57 21 88

Tabelle 20: Korrelation der Anzahl p16 zytoplasmatisch markierter Zellen und Grading

p=0,057 Geschlecht

M w Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 41 11 52

10-‐100% 21 15 36

Gesamt 62 26 88

Tabelle 21: Korrelation der Anzahl p16 membranös markierter Zellen mit Geschlecht

66

p=0,069 Größe dichotomisiert nach Median

bis 8cm <8cm Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)

Intensität 0 bis 1 38 31 69


Gesamt 53 35 88

Tabelle 22: Korrelation der p16 Färbeintensität und Tumorgröße

3.4.7 PTEN

Hier zeigte sich mit einem p-‐Wert von 0,076 ein Trend für eine Wechselbeziehung

zwischen der Anzahl der angefärbten Zellkerne und dem Tumorstadium (siehe Tabelle

23).

p=0,076 Unterteilung des T3 Stadiums

A b Gesamt

PTEN % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 29 27 56

10-‐100% 10 22 32

Gesamt 39 49 88

Tabelle 23: Korrelation der Anzahl PTEN markierten Zellen mit Tumorstadium

67

4 Diskussion

In Deutschland erkranken jährlich mehr als 17.000 Menschen an einem

Nierenzellkarzinom. Im Vergleich zu anderen urologischen Tumoren ist die Prognose

ungünstig [Brenner, 2002]. In der Statistik der Todesursachen in Deutschland ist das

Nierenzellkarzinom gemessen an der Häufigkeit des Auftretens deutlich überrepräsentiert

[www.rki.de, 2010]. Umso wichtiger erscheint es die Prognose einzelner Patienten

genauer abschätzen zu können. Welches biologische Verhalten ein Tumor zeigen wird,

lässt sich anhand der etablierten Prognosefaktoren nur unzureichend vorherzusagen. Ziel

dieser Arbeit ist es, dies mittels immunhistochemischer Parameter zu untersuchen und

mit den etablierten Faktoren zu vergleichen.

Im untersuchten Patientenkollektiv betrug das Geschlechterverhältnis mit 63 männlichen

und 29 weiblichen Patienten 2,17:1, was in etwa dem in der Literatur angegebenen

Verteilungsmuster entspricht [Bretheau et al., 1998]. Ein Grund für dieses Missverhältnis

könnte das im Vergleich häufigere Vorkommen vermeidbarer Risiokofaktoren wie

Rauchen oder Adipositas sein [McLaughlin et al., 1995; Mensink et al., 2005]. Auch die

Verteilung des Erkrankungsalters, gemessen zum Zeitpunkt der Nephrektomie, deckt sich

im Wesentlichen mit den Angaben aus der Literatur [www.rki.de, 2010].

Mit einem Anteil von 89,9% klarzelligen Nierenzellkarzinomen repräsentiert das

untersuchte Kollektiv auch in diesem Punkt die Angaben anderer Autoren [Patard et al.,

2005]. Die Verteilung der Tumorstadien T3a zu T3b war mit 45,7% zu 54,3% annähernd

gleich.

68

Das Tumorstadium (T-‐Stadium) stellt einen der wichtigsten bekannten

Prognoseparameter dar. Jedoch wurden gerade im Hinblick auf höhere Stadien

Modifikationen notwendig, da sie die Prognose nur unzureichend wiedergaben [Ficarra et

al., 2007; Leibovich et al., 2005]. Im untersuchten Kollektiv fand sich hinsichtlich des

Gesamtüberlebens kein Unterschied zwischen den Stadien T3a und T3b (p=0,968). Diese

von der Vergleichsliteratur teilweise abweichenden Ergebnisse mögen einerseits der

Größe des Kollektivs geschuldet sein, spiegeln jedoch andererseits, da das Kollektiv

hinsichtlich der Zusammensetzung derjenigen der Vergleichsliteratur gleicht, die

Notwendigkeit genauerer Klassifikationen wieder.

Der Nodalstatus vermag ebenfalls die Prognose abzubilden [Volpe und Patard, 2010]. In

der untersuchten Kohorte war dieser Unterschied jedoch nicht signifikant (p=0,791). Dies

mag zwei Ursachen haben: Zum einen, dass in 31 Fällen der Lymphknotenstatus mit Nx

nur unsicher bewertet wurde, zum anderen wurde in der vorliegenden Arbeit, im

Gegensatz zum in anderen Arbeiten verwendeten tumorspezifischen Überleben, das

Gesamtüberleben als Endpunkt erhoben. Beide Punkte spielten jedoch beim

Metastasierungsstatus keine Rolle. Obwohl in der vorliegenden Arbeit ein Großteil der

Patienten als Mx klassifiziert wurde und mit 13% im Vergleich zur Literatur weniger

Patienten bei Diagnose gesichert Fernmetastasen aufwiesen, war das Gesamtüberleben

der Patienten mit nachgewiesenen Metastasen mit einem p-‐Wert von 0,016 signifikant

reduziert [Bukowski, 2009]. Dies deckt sich mit Angaben aus der Literatur, wo Metastasen

die Prognose ebenfalls am stärksten limitieren [www.rki.de, 2010; Lughezzani et al.,

2009].

Auch das histopathologische Grading hat Einfluss auf die Prognose. Im untersuchten

Kollektiv war ein schlechteres Grading signifikant mit einem reduzierten

Gesamtüberleben assoziiert (p=0,02). Dies spiegelt die Ergebnisse anderer Autoren,

wenngleich mit unterschiedlichen Gradingsystemen oder Abstufungsgraden, wieder

[Novara et al., 2007; Karakiewicz et al., 2007].

Die histologische Subklassifizierung wird in der Literatur ebenfalls als prognostischer

Parameter erwähnt. Das klarzellige Nierenzellkarzinom soll mit einer schlechteren

Prognose einhergehen [Cheville et al., 2003]. Dies konnte im untersuchten

69

Patientenkollektiv nicht bestätigt werden. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied

zwischen klarzelligen und anderen Nierenzellkarzinomen (p=0,186). Da sich die Gruppe

der nicht klarzelligen Karzinome jedoch nur aus 10 Patienten zusammensetzt, ist diese

Aussage nur eingeschränkt beurteilbar.

Die Größe des Tumors ist noch immer Gegenstand von Diskussionen und, wie bereits

beschrieben, Grund für Änderungen der Klassifikationen [Lam et al., 2005; Miyagawa et

al., 2007]. In der vorliegenden Studie war die absolute Größe des Tumors weder nach

Median dichotomisiert noch in Anlehnung an die TNM Klassifikation unterteilt für die

Prognose ausschlaggebend. Dies veranschaulicht, dass in höheren T-‐Stadien die

Tumorausdehnung über die Organgrenzen hinaus eher als die absolute Tumorgröße die

Prognose bestimmt [Siddiqui et al., 2007].

Weitere Unterscheidungsmerkmale wie Alter oder Geschlecht werden in einigen

Publikationen, jedoch insgesamt sehr uneinheitlich, als Prognoseindikatoren genannt

[Sunela et al., 2009]. Bei den hier untersuchten Patienten fand sich kein signifikanter

Unterschied bezüglich dieser Faktoren. Dies überrascht zumindest beim Alter, da in dieser

Studie das Gesamtüberleben als Endpunkt gewählt wurde und sich somit weitere, im

Alter häufigere, Erkrankungen hier hätten widerspiegeln können.

Wie bereits in der Einleitung beschrieben wurde eine Assoziation von veränderten

Expressionsmustern des Adhäsionsmoleküls CD44 mit Veränderungen des biologischen

Verhaltens von Tumoren in einer Vielzahl von neoplastischen Erkrankungen beschrieben.

Die Datenlage beim Nierenzellkarzinom ist jedoch heterogen. Hinsichtlich der Prognose

schwanken die Aussagen von keiner Assoziation einer erhöhten Expression von CD44 mit

der Überlebenswahrscheinlichkeit bis hin zur Postulierung dieses Markers als

unabhängigem Prognosefaktor [Bamias et al., 2003; Gilcrease et al., 1999; Lim et al.,

2008; Rioux-‐Leclercq et al., 2001; Lucin et al., 2004; Paradis et al., 1999; Tawfik et al.,

2007; Yildiz et al., 2004]. Auch schwanken die Aussagen hinsichtlich der Isoform mit dem

größten prädiktiven Wert. Ein Autor berichtet, eine geringe (!) Expression der Isoform

CD44v5 gehe mit erhöhter Mortalität einher [Wu et al., 2003]. Bei vielen dieser Studien

wurde jedoch, unabhängig von der prognostischen Bedeutung des Markers, eine

signifikante Korrelation mit klinischen Prognoseparametern wie Staging und Grading

70

festgestellt. Altinel et al. berichten über eine Korrelation erhöhter CD44 Expression mit

dem Vorhandensein von Tumorthromben, einem wichtigen Unterscheidungsmerkmal des

in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tumorstadiums T3 [Altinel et al., 2008].

Um das Färbeverhalten zu beurteilen wurden in den Vergleichsarbeiten unterschiedliche

Parameter gewählt. In der vorliegenden Arbeit wurden die drei in der Literatur am

häufigsten verwendeten Färbeparameter (Färbeintensität, membranständige und

zytoplasmatische Färbung) bestimmt.

Es fand sich jedoch bei keinem dieser Parameter ein signifikanter Unterschied des

Gesamtüberlebens nach der Kaplan-‐Meier-‐Methode. Dies deckt sich mit den

Beobachtungen einiger Autoren, könnte jedoch auch durch unterschiedliche Endpunkte

(tumorspezifisches Überleben versus Gesamtüberleben) und durch die uneinheitliche

Methodik bedingt sein. So wurde in dieser Arbeit für alle immunhistochemischen Marker

die prozentuale Anzahl der gefärbten Zellen in 10% Schritten bewertet und anschließend

nach Median in zwei Subgruppen dichotomisiert. Weitere Autoren unterteilen z.T. in

mehr Gruppen oder verwenden andere cut-‐off-‐Werte.

Eine Korrelation der CD44 Expression mit anderen histopathologischen Parametern

wurde mittels Vier-‐ bzw. Mehrfeldertafeln untersucht. Hierbei fand sich eine Assoziation

sämtlicher Färbemerkmale mit dem Grading (nach Fishers exaktem Test p=0,023; 0,017;

0,007). Dies deckt sich mit den Aussagen der Vergleichsliteratur [Gilcrease et al., 1999;

Lucin et al., 2004; Paradis et al., 1999; Tawfik et al., 2007; Terpe et al., 1996]. Des

Weiteren fand sich eine Korrelation von den Merkmalen Färbeintensität und Anzahl

gefärbter Zellen mit der Tumorgröße (p=0,039; 0,042). In der Literatur ist dies von Paradis

et al. ähnlich beschrieben [Paradis et al., 1999]. Weiterhin zeigte sich ein Trend für eine

Assoziation der Anzahl CD44 positiver Zellen und dem Vorhandensein von Metastasen

(p=0,087). Auch dies wurde bereits in der Literatur erwähnt [Lim et al., 2008]. Außerdem

war ein Trend (p=0,076) für eine Korrelation einer zytoplasmatischen Anfärbung von

CD44 mit der histologischen Form des Nierenzellkarzinoms erkennbar. Hierfür finden sich

in der Literatur keine ähnlichen Aussagen.

Ein Grund für konträre Aussagen anderer Autoren zur Prognose könnten die auch in der

vorliegenden Arbeit gesehenen Korrelationen mit den weiteren histopathologischen

Parametern sein. Über diese Korrelation könnte CD44 zu einer indirekten prognostischen

Bedeutung gelangt sein. Weitere Unterschiede bestehen in den betrachteten

71

Patientenkollektiven. In den meisten anderen Studien wurde eine kleinere

Patientengruppe untersucht und im Gegensatz zu dieser Arbeit sämtliche Tumorstadien

eingeschlossen. Darüber hinaus unterscheidet sich, wie schon erläutert, die Methodik

einzelner Studien deutlich. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass trotz umfangreicher

Studienlage eine eventuelle prognostische Bedeutung dieses Markers nicht abschließend

geklärt ist. Hierfür wäre zunächst die Etablierung einer einheitlichen Auswertung der

Färbung notwendig sowie eine hierauf folgende prospektive Studie.

Durch die Funktionen der verschiedenen Cadherine wie beispielsweise Zell-‐Zell-‐Kontakte,

Aufrechterhaltung der Zellpolarität sowie Gewebedifferenzierung wird deutlich, weshalb

quantitative oder auch qualitative Veränderungen in der Expression dieser Moleküle

Einfluss auf die Entstehung, die Progression oder das biologische Verhalten von Tumoren

haben können [Stemmler, 2008; Jeanes et al., 2008; Takeichi, 1993]. Morphologische und

molekulare Veränderungen gehen mit einem solchen veränderten biologischen Verhalten

einher. So wird aus einer hochdifferenzierten Tumorzelle mit epithelialem Phänotyp eine

Zelle eher mesenchymaler Morphe. Man spricht hierbei von epithelial-‐mesenchymaler

Transition. Im Zuge dessen kann es auch zu einem verändertem

Cadherinexpressionsmuster, dem so genannten Cadherin-‐switch, kommen. Dabei kommt

es beispielsweise zu einer verminderten Expression von E-‐Cadherin bei im Gegenzug

gesteigerter Expression von N-‐Cadherin, was mit einer erhöhten Invasionfähigkeit sowie

gesteigerter metastatischer Aussaat einhergehen soll [Christofori, 2006].

Oftmals werden in Karzinomen veränderte Cadherinexpressionsmuster gefunden. Eine

verminderte Expression von E-‐Cadherin geht hierbei sowohl mit einer gesteigerten

Invasionsfähigkeit als auch einer schnelleren Progression des Tumors einher. Auch ist eine

erhöhte Fähigkeit zur Metastasierung in diesem Zusammenhang beschrieben [Jeanes et

al., 2008; Hirohashi und Kanai, 2003]. Des Weiteren sind Keimzellmutationen des CDH1

Gens, beispielsweise in Familien mit gehäuftem Vorkommen von Magenkarzinomen,

bekannt [Guilford et al., 1998]. Dies ist der Grund, weshalb E-‐Cadherin nicht nur als

Invasionssuppressor sondern auch als klassischer Tumorsuppressor bezeichnet wird. In

einer Vielzahl verschiedener Malignome wurde E-‐Cadherin untersucht. So ist eine erhöhte

72

Mortalität beim Mammakarzinom mit verminderter oder fehlender Expression von E-‐

Cadherin belegt [Gould Rothberg und Bracken, 2006]. Auch bei verschieden Tumoren des

Gastrointestinaltraktes wie kolorektalen Karzinomen, Adenokarzinomen des Ösophagus

sowie Tumoren von Magen oder Pankreas ist eine solche Veränderung beschrieben

[Falkenback et al., 2008; Natalwala et al., 2008; Kwak et al., 2007; Shimada et al., 2004;

Shin et al., 2005]. In all diesen Fällen korreliert eine reduzierte Expression von E-‐Cadherin

mit einer schlechteren Prognose. Teilweise ist eine Assoziation dieses Markers mit

anderen prognostischen Merkmalen wie einer geringeren Differenzierung beschrieben.

Auch bei urologischen Tumoren wie Harnblase und Prostata ist dies der Fall [Eltz et al.,

2008; Musial et al., 2007].

Beim Nierenzellkarzinom wurde bereits früh ein Zusammenhang zwischen der Expression

von E-‐Cadherin und der Aggressivität des Tumors beschrieben [Katagiri et al., 1995].

Jedoch ist die Studienlage hinsichtlich der Prognose sehr heterogen. Zwar wird teilweise

ein solcher direkter Zusammenhang postuliert, in anderen Studien kann dies aber nicht

oder nur indirekt über eine Korrelation mit einem weiteren Marker aufrechterhalten

werden [Ronkainen et al., 2010; Shimazui et al., 1998; Langner et al., 2004; Katagiri et al.,

1995; Gervais et al., 2007].

In der vorliegenden Studie wurde kein signifikanter Unterschied bei verschiedener

Expression von E-‐Cadherin gefunden. Die p-‐Werte überschritten nach Log-‐Rank-‐Test das

Trendniveau jedoch nur knapp (p=0,108; 0,121). Eine gewisse Tendenz für eine größere

Überlebenswahrscheinlichkeit bei Patienten mit positivem E-‐Cadherin Nachweis kann in

Zusammenschau anderer Studien trotzdem erkannt werden. Diese Tendenz folgt den

Ergebnissen von Katagiri mit einer ähnlich großen Patientengruppe, die sich jedoch aus

sämtlichen Tumorstadien zusammensetzte [Katagiri et al., 1995]. Weitere Autoren sehen

in einem kleineren Kollektiv (n=46) einen ähnlichen Trend, benutzen jedoch eine andere

Methodik und unterteilen in normales versus abnormales Färbeverhalten [Shimazui et al.,

1998].

Ferner wurden Korrelationen des Stagings mit der Expression von E-‐Cadherin beschrieben

[Katagiri et al., 1995]. Dies bestätigte sich in den hier untersuchten, ausschließlich aus

Tumoren im Studium T3 bestehenden Proben, wo zusätzliche prognostische

Unterscheidungsmerkmale besonders sinnvoll erscheinen, nicht. Weitere, von einzelnen

Autoren beschriebene, Assoziationen wie dem histologischen Subtyp oder dem

73

Vorhandensein von Metastasen konnten in der vorliegenden Arbeit nicht erkannt werden

[Ronkainen et al., 2010; Katagiri et al., 1995].

Mit Hilfe von Vier-‐ bzw. Mehrfeldertafeln konnte eine Assoziation von beiden

Färbemerkmalen E-‐Cadherins mit dem histopathologischen Grading gezeigt werden. Dies

wurde bereits in der Arbeit von Langner beschrieben [Langner et al., 2004].

Zusammenfassend kann, aufgrund der unterschiedlichen Ergebnisse in der Literatur und

den nicht signifikanten Werten in der vorliegenden Arbeit, die prognostische Bedeutung

E-‐Cadherins nicht abschließend bewertet werden. Analog zu CD44 ist dies möglicherweise

in unterschiedlicher Methodik begründet, wie beispielsweise der Auswertung der

Färbungen oder den untersuchten Tumorstadien.

N-‐Cadherin spielt wie die anderen Mitglieder der Cadherinfamilie im Rahmen des

Cadherin-‐Switches eine Rolle im biologischen Verhalten von Tumoren. So ist bei

verschiedenen Tumorentitäten ein Zusammenhang mit veränderter Expression von N-‐

Cadherin beschrieben. Beim Prostatakarzinom wird beispielsweise dem Cadherin-‐Switch

eine Aussagekraft hinsichtlich der Progression des Tumors und der Prognose des

Patienten konstatiert [Gravdal et al., 2007]. Auch bei anderen urologischen Malignomen

wie beispielsweise dem invasiven Harnblasenkarzinom, scheint N-‐Cadherin prognostische

Aussagekraft zu besitzen [Wallerand et al., 2008]. Beim Mammakarzinom soll eine

erhöhte Expression dieses Markers mit erhöhter Invasions-‐ und Migrationsfähigkeit der

Tumorzellen einherzugehen [Nieman et al., 1999; Hazan et al., 2000].

In der gesunden Niere wird N-‐Cadherin von Zellen des proximalen Tubulussystems

exprimiert. E-‐Cadherin wird hier im Gegensatz dazu nicht gefunden [Nouwen et al., 1993].

Da das Nierenzellkarzinom zumeist aus dem proximalen Tubulussystem hervorgeht,

überrascht die dürftige Datenlage über die Expression von N-‐Cadherin im

Nierenzellkarzinom und über deren Bedeutung. Shimanzui et al. beobachteten bei

Patienten mit einer abnormalen Expression von N-‐Cadherin eine bessere Prognose.

Erklärt wurde dies mit der Vorstellung, N-‐Cadherin würde Invasion und Metastasierung

erleichtern [Shimazui et al., 2006]. Die geringe Fallzahl der genannten Studie (n=46)

erfordert jedoch weitere Untersuchungen über die prognostische Aussagekraft N-‐

Cadherins.

74

In der vorliegenden Studie zeigte sich ein Trend (p=0,092) für ein besseres Überleben der

Patientengruppe mit positiver Expression von N-‐Cadherin. Dies deckt sich in Teilen mit

der Vergleichsstudie, wo fehlende Anfärbbarkeit als abnormal gewertet wurde und somit

derselbe Cut-‐off benutzt wurde. Überdies sind jedoch methodische Unterschiede vor

allem hinsichtlich der Auswertung der Färbungen erkennbar. Des Weiteren fand sich in

der vorliegenden Studie eine signifikante Korrelation beider Färbemerkmale von N-‐

Cadherin mit dem histologischen Subtyp (p=0,018 bzw.0,019). So konnte N-‐Cadherin nur

in klarzelligen Karzinomen nachgewiesen werden, jedoch in keiner der anderen

Subentitäten, was so in der Literatur nicht vorbeschrieben ist. Eine Assoziation von

weiblichem Geschlecht und verminderter N-‐Cadherinexpression unterschritt das

Trendniveau von p=0,1 knapp.

Abschließend lässt sich sagen, da sowohl die Studie von Shimanzui N-‐Cadherin eine

prognostische Bedeutung zuschreibt und, trotz unterschiedlicher Methodik, auch in der

vorliegenden Arbeit ein solcher Trend erkennbar ist, N-‐Cadherin eingehender untersucht

werden sollte. Prospektive Studien sollten die Tauglichkeit von N-‐Cadherin als

prognostischer Biomarker verifizieren.

In der gesunden menschlichen Niere wird K-‐Cadherin ausschließlich im proximalen

Tubulus gefunden. Dies ist besonders interessant, da dies der Ursprungsort der meisten

renalen Malignome ist [Paul et al., 1997]. Die Studienlage für diesen Marker beim

Nierenzellkarzinom ist dürftig und hinsichtlich der prognostischen Aussagekraft sowie der

Korrelation mit etablierten prognostischen Faktoren uneinheitlich. Jedoch wird eine

veränderte Expression mit einer Verschlechterung der Prognose in den wenigen

verfügbaren Studien in Zusammenhang gebracht [Shimazui et al., 1998; Shimazui et al.,

2006; Paul et al., 2004]. Auch scheint im Blut zirkulierende K-‐Cadherin-‐mRNA beim

Nierenzellkarzinom ein Indikator für das Vorliegen beziehungsweise zukünftige Entstehen

von Metastasen zu sein [Shimazui et al., 2004].

Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Paul et al. und Shimazui et al. konnte in der

vorliegenden Studie keine Korrelation des Expressionsmusters von K-‐Cadherin und der

Prognose festgestellt werden. Das Signifikanzniveau für eine Korrelation mit dem Grading

75

wurde nur leicht überschritten, in den genannten Studien bestand jedoch in diesem Punkt

kein signifikanter Zusammenhang.

Eine Erklärung für diese abweichenden Ergebnisse ist abermals in der Methodik zu

suchen. Paul et al. benutzten kryokonservierte und nicht wie in der vorliegenden Studie in

Paraffin eingebettete Präparate und das begrenzte Follow-‐up ließ dort keine Auswertung

nach der Kaplan-‐Meier-‐Methode zu. Zum anderen unterscheiden sich die Studien

hinsichtlich der Evaluation der Färbungen.

Durch die dürftige Datenlage und aufgrund der divergierenden Ergebnisse muss gesagt

werden, dass sich seine Nutzbarkeit dieses Markers als Prognoseindikator nicht

abschließend beurteilen lässt.

Aufgrund des Vorhandenseins von Ki-‐67 in sämtlichen menschlichen Geweben,

insbesondere in Tumoren, hat dieser Marker breite Anwendung in der Bestimmung von

Proliferationsrate bzw. -‐index gefunden. Diese auch als Wachstumsrate oder im

Englischen als Growth-‐ oder Labeling Index bezeichnete Rate zeigt den durch Anfärbung

von Ki-‐67 markierten Anteil sich in Teilung befindlicher Zellen an. Hierdurch konnten bei

verschiedensten Neoplasien wie beispielsweise Brust-‐, Prostata-‐ und Harnblasenkrebs

oder Urothelkarzinomen Aussagen hinsichtlich deren Prognose oder hinsichtlich des

Behandlungserfolgs getroffen werden [Halvorsen, 2008; Scholzen und Gerdes, 2000;

Dowsett und Dunbier, 2008; Habuchi et al., 2005; Eltz et al., 2008]. Auch beim

Nierenzellkarzinom postulieren viele Studien einen signifikanten Zusammenhang

zwischen erhöhter Anfärbbarkeit des Tumorgewebes mit MIB-‐1 und einer

verschlechterten Prognose. Insbesondere hinsichtlich der Entwicklung von Metastasen

wird Ki-‐67 prognostische Aussagekraft zugeschrieben. Auch besteht in vielen Studien ein

direkter Zusammenhang mit bereits etablierten Prognosefaktoren [McGuire und

Fitzpatrick, 2009; Visapaa et al., 2003; Rioux-‐Leclercq et al., 2000; Jochum et al., 1996;

Delahunt et al., 1995; Pertia et al., 2009; Kankuri et al., 2006].

In der vorliegenden Studie sind die Ergebnisse nicht signifikant, jedoch zeigte sich für eine

hohe Expression von Ki-‐67 ein Trend zu einer schlechteren Überlebensrate, was in

dieselbe Richtung wie die Vergleichsarbeiten zeigt. Auch war mit einem p-‐Wert von 0,08

ein Trend für eine Korrelation von Ki-‐67 mit dem Grading zu sehen.

76

Da in den zitierten Arbeiten stets alle Stadien des Nierenzellkarzinoms eingeschlossen

waren und in der vorliegenden Arbeit das Signifikanzniveau nicht unterschritten wurde,

sollte die Bedeutung von Ki-‐67 gerade in den hier untersuchten höheren Stadien weiter

evaluiert werden. Analog zu den zuvor diskutierten Biomarkern sind auch bei Ki-‐67

methodische Unterschiede bezüglich der Auswertung der immunhistochemischen

Färbungen zu sehen und die cut-‐off Werte schwanken beträchtlich. Auch hier sollte eine

einheitliche Methodik Auswertung der Immunhistochemien gefunden werden.

Aufgrund der Pförtnerfunktion der Zellteilung, im englischen Sprachgebrauch als

gatekeeper bezeichnet, wird die wichtige Bedeutung der Funktion von p16 im Zellzyklus

ersichtlich. P16 wird auch als Tumorsuppressor bezeichnet, da der Verlust dieses Proteins

das Tumorwachstum begünstigen kann [Serrano et al., 1996]. Die Phosphorylierung von

pRB erfolgt durch einen Komplex von CDK4, CDK6 und Cyklin D, welcher bei

Vorhandensein von p16 nicht gebildet werden kann. Durch eine allosterische Bindung von

p16 an den Komplex aus CDK 4 und 6 kommt es zu einer Konformationsänderung, im

Zuge welcher einerseits die Bindung zu Cyklin D verhindert und andererseits die Affinität

zu ATP im katalytischen Zentrum verringert wird [Pavletich, 1999]. Ohne die

Phosphorylierung von pRB ist ein Fortschreiten des Zellzyklus nicht möglich. Es erstaunt

nicht, dass über Veränderungen innerhalb dieses Regelkreises in 80 % der menschlichen

Neoplasien berichtet wurde [Ortega et al., 2002].

Auch bei urologischen Malignomen ist dies der Fall. Ein signifikanter Zusammenhang

zwischen erniedrigter Expression von p16 und der Progression der Erkrankung wurde für

Tumoren der Harnblase in mehreren Studien beschrieben [Hitchings et al., 2004; Shariat

et al., 2004]. Ähnliches gilt für Prostatakarzinome, für welche eine Korrelation von

niedrigen p16 Niveaus und häufigerem Vorkommen von Fernmetastasen gezeigt wurde.

In einigen Studien geht jedoch im Gegensatz hierzu eine erhöhte Rate von p16 mit einer

schlechteren Prognose einher [Chakravarti et al., 2007; Lee et al., 1999].

Auch beim Nierenzellkarzinom konnte ein Zusammenhang von unterschiedlicher

immunhistochemischer Anfärbbarkeit von p16 und der Prognose aufgezeigt werden.

Hierbei korrelierte der Grad der Anfärbbarkeit positiv mit der Prognose. Assoziationen mit

weiteren klinisch pathologischen Parametern bestanden jedoch nicht [Ikuerowo et al.,

2007]. Andere Autoren wiederum sehen einen schwachen Zusammenhang zwischen einer

77

geringeren Expression von p16 und einem erhöhten Auftreten von Metastasen. Einen

Unterschied hinsichtlich des Gesamtüberlebens konstatieren sie jedoch nicht [Maruschke

et al., 2011].

Ein signifikant unterschiedliches Überleben je nach Expression von p16 konnte auch in der

vorliegenden Studie nicht festgestellt werden, jedoch bestand ein signifikanter

Zusammenhang der Membrananfärbbarkeit mit dem histopathologischen Grading. Des

Weiteren war ein Trend zu einer Korrelation der Membranfärbung mit dem weiblichen

Geschlecht sowie der Färbeintensität mit der Tumorgröße erkennbar.

Bei ähnlicher methodischer Vorgehensweise decken sich die Ergebnisse von Maruschke et

al. bezüglich des Überlebens mit der vorliegenden Arbeit, jedoch wurden dort sämtliche

Tumorstadien einbezogen. Die Studie von Ikuerowo et al. umfasst ein größeres Kollektiv

ebenfalls sämtlicher Stadien, jedoch wurde dort mit Tissue mikroarrays gearbeitet und die

prognostischen Unterschiede waren nur im kleinen Subkollektiv der hochpositiv

gefärbten Proben signifikant, was die Vergleichbarkeit der Studien einschränkt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zumindest nach der in der vorliegenden Arbeit

und der Studie von Maruschke et al. angewandten Methodik sich p16 auch für das

Stadium T3 nicht als prognostischer Marker zu eignen scheint.

Wie der Alternative Name MMAC1 (Mutated in Multiple Advanced Cancers 1) bereits

vermuten lässt, können Mutationen von PTEN in zahlreichen Tumorentitäten

nachgewiesen werden. Nach Mutationen von p53 finden sich auf diesem Genlocus die

häufigsten nachgewiesenen Mutationen in menschlichen Malignomen, weshalb bereits

PTEN wie p53 als Wächter des Genoms bezeichnet wurde [Phillips et al., 2009; Yin und

Shen, 2008].

Des Weiteren sind Keimbahnmutationen dieses Genlocus mit einer Gruppe von

Krankheiten assoziiert, die unter PHTS (PTEN hamartoma tumour syndrom)

zusammengefasst werden und mit einer unregulierten Zellproliferation einhergehen, die

zur Bildung von Hamartomen führt. Im Einzelnen umfasst diese Gruppe die

Krankheitsbilder des Cowden-‐Syndroms, des Bannayan-‐Riley-‐Ruvalcava-‐Syndroms, des

Proteus-‐Syndroms sowie des Proteus-‐Like-‐Syndroms. Das Cowden-‐Syndrom geht überdies

mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von malignen Tumoren einher [Hobert und

Eng, 2009].

78

Auch bei Nierenzellkarzinomen wurden Mutationen dieses Gens gefunden und die

Tumoren mit Veränderungen von PTEN unter den Verdacht gestellt, eine besonders

invasive Untergruppe zu bilden beziehungsweise eine erhöhte Tumorprogression zu

zeigen [Kondo et al., 2001; Velickovic et al., 2002]. Einige Studien berichten über eine

ungünstige Prognose bei Minderexpression von PTEN sowie von Korrelationen mit

weiteren prognostischen Parametern wie beispielsweise dem T-‐Stadium [Kondo et al.,

2001; Velickovic et al., 2002; Pantuck et al., 2007]. Doch die Studienlage ist nicht

einheitlich. So berichten Hager et al. Gegenteiliges: Zwar würde in den meisten

Nierentumoren vermindert PTEN nachgewiesen, jedoch habe dies keine Auswirkung auf

die Prognose der Patienten [Hager et al., 2007]. Weitere Autoren hingegen schreiben

PTEN unabhängige Prognosekraft zu [Kim et al., 2005].

In der vorliegenden Studie konnte wie bei Hager et al. kein Zusammenhang zwischen

veränderter Expression von PTEN und dem Überleben mittels der Kaplan-‐Meier-‐Methode

festgestellt werden. Auch bei diesem Biomarker unterscheiden sich die

Auswertmodalitäten zwischen den einzelnen Studien gravierend. So haben Pantuck et al.

den cut-‐off bei 75% festgelegt und beschreiben so einen signifikanten Einfluss auf das

Überleben. In der vorliegenden Studie wurden die Gruppen nach dem Median von 10%

getrennt und hierunter kein solcher Einfluss gesehen. Andererseits ähneln sich die

Ergebnisse hinsichtlich einer Korrelation mit dem T-‐Stadium. In der Vergleichsstudie von

Pantuck et al. wird berichtet, eine geringere Expression von PTEN korreliere mit einem

geringeren T-‐Stadium. Auch bei der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Subgruppe

T3 scheint dies der Fall zu sein und es zeigte sich ein Trend für eine Korrelation von dem

höheren Stadium T3b mit einer erhöhten Expression von PTEN.

Die Ursache dieser teilweise gegensätzlichen Ergebnisse ist abermals in den verwendeten

Methoden zu suchen. Einheitliche Modalitäten sollten auch hier diskutiert werden. Eine

endgültige Aussage zur prognostischen Bedeutung von PTEN kann aktuell nicht getroffen

werden.

79

Limitationen und Stärken der Arbeit

Wie zuvor bei einzelnen Markern beschrieben, limitiert vor allem die unterschiedliche

Methodik einzelner Studien deren direkten Vergleich. So ist zum einen das Auszählen der

positiv angefärbten Zellen auf den jeweiligen Schnitten selbst sehr subjektiv. In dieser

Arbeit wurde versucht, dem durch eine Konsensusentscheidung teilweise entgegen zu

wirken. Zum anderen divergieren die festgelegten Werte (Cut-‐off), ab welchen zwischen

hoher und niedriger Expression beziehungsweise normalem und normabweichendem

Färbemuster unterschieden wird, in der Literatur beträchtlich. Analog zu dem in der

Gynäkologie etablierten Rezeptor HER2neu, bei welchem definierte Auswertkriterien

bestehen, sollte dies für andere immunhistochemische Marker gelten. In der

vorliegenden Arbeit wurde diesem Punkt Rechnung getragen, indem stets nach

identischer Methodik verfahren wurde und zunächst der Median der ausgewerteten

Parameter bestimmt wurde, wonach in zwei Gruppen dichotomisiert wurde. Für das

verwendete Kollektiv wurde somit ein Referenzwert generiert über welchem die Färbung

als ungewöhnlich stark definiert wurde. Ein weiterer Kritikpunkt der Immunhistochemie

ist der Gebrauch unterschiedlicher Antikörper gegen dasselbe Epitop, wodurch es zu

abweichenden Färbeergebnissen kommen könnte. Unterschiede ergeben sich ebenfalls in

den verwendeten Patientenkollektiven. In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich

das Stadium T3 untersucht, da gerade in höheren Stadien mit entsprechend schlechterer

Prognose ein weiteres prognosebestimmendes Kriterium sinnvoll erscheint. Die meisten

zitierten Vergleichsarbeiten umfassen sämtliche Stadien, weshalb auch hier ein direkter

Vergleich der Ergebnisse nur unzureichend möglich ist.

80

Ausblick

In zahlreichen Studien über das Nierenzellkarzinom wurden immunhistochemische

Parameter und deren prognostische Bedeutung analysiert. Keiner von ihnen ist bisher

allgemein anerkannt oder in regelhaftem Gebrauch. Auch in dieser Arbeit kann kein

Marker abschließend als prognostisch relevant beurteilt werden. Die Erfolge bei anderen

Tumorerkrankungen, gerade auch im Hinblick auf die targeted therapy, ermutigen jedoch

zu weiteren Untersuchungen. In Zukunft könnte auch beim Nierenzellkarzinom ein

solcher Marker oder eine Kombination mehrerer gravierende therapeutische

Veränderungen nach sich ziehen. Hierbei wäre zum Beispiel das Patientenkollektiv mit

einem mutmaßlich tumorfreien Status nach erfolgter Therapie zu nennen. Trotz des

Erreichens dieses Primärziels werden 50% dieser Patienten ein Rezidiv erleiden und daran

höchstwahrscheinlich auch versterben. Insofern wäre die Kenntnis desjenigen Patienten,

welcher ein Rezidiv erfährt -‐ bei Verfügbarkeit einer adjuvanten Therapie – von

erheblicher Bedeutung [Doehn et al., 2007]. Bei wahrscheinlichem Vorliegen von

Metastasen eines Nierenzellkarzinoms kann die targeted therapy (beispielsweise mit

Tyrosinkinaseinhibitoren oder Inhibtoren des mamallian targed of rapamycin) effektiv

sein. Jedoch sind bislang weiterhin keine prädiktiven Marker verfügbar [Doehn, 2008].

81

5 Zusammenfassung

Auf das Nierenzellkarzinom entfallen zwischen 2 und 5% aller Krebserkrankungen. In

Deutschland steht es an 6. Stelle der Todesursache dieser Erkrankungsgruppe beim

Mann. Hieraus wird ersichtlich, dass es sich bei dieser Erkrankung um einen Tumor mit

nur eingeschränkter Prognose handelt. Etablierte Prognoseindikatoren wie das TNM-‐

Stadium oder histopathologische Parameter wie das Grading können den

Krankheitsverlauf gerade in höheren Stadien nur unbefriedigend vorhersagen. Ziel der

vorliegenden retrospektiven Arbeit war es, anhand von 92 Nierenzellkarzinomen des

Stadiums T3 verschiedene immunhistochemische Biomarker (CD44; E-‐Cadherin; N-‐

Kadherin; K-‐Cadherin; Ki-‐67; p16; PTEN) auf ihre prognostische Bedeutung zu überprüfen.

Hierfür wurden zunächst die klinisch-‐pathologischen Daten der Patienten erfasst und

Schnitte der in Paraffin eingebetteten Proben angefertigt und immunhistochemisch

gefärbt. Nach der mikroskopischen Auswertung erfolgte eine Überlebenszeitanalyse

mittels der Kaplan-‐Meier-‐Methode und Gruppenvergleiche durch den Log-‐Rank Test. Des

Weiteren wurde Assoziationen zu bereits etablierten Prognosefaktoren mittels Vier-‐

beziehungsweise Mehrfeldertalfeln untersucht und durch Fishers exakten Test auf

Signifikanz beurteilt.

Die Ergebnisse zeigten hinsichtlich der Prognose keine hochsignifikanten Korrelationen

des Gesamtüberlebens mit einer Markerexpression. Jedoch konnte ein statistischer Trend

für eine Korrelation der Marker N-‐Cadherin und Ki-‐67 mit der Prognose gesehen werden.

Eine Tendenz in diese Richtung zeigt auch E-‐Cadherin. Außerdem wurden zahlreiche

Assoziationen der Expressionsmuster der Biomarker mit den weiteren untersuchten

Parametern gefunden, die zum Teil so nicht vorbeschrieben waren.

Zwar konnte in dieser Studie kein eindeutig prognostisch relevanter Biomarker aufgezeigt

werden, jedoch weisen Teile der Ergebnisse auf eine solche potentielle Bedeutung einiger

Marker hin, weshalb diese eingehender untersucht werden sollten.

82

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100

7 Abbildungsverzeichnis

Tabellen:

1: Klassifikation des Nierenzellkarzinoms

2: Modifikationen der TNM Stadien

3: Antigendemaskierung

4. Überblick über die erhobenen Daten

5: Korrelation der Färbeintensität von CD44 mit dem Grading

6: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Grading

7: Korrelation der CD44 Zytoplasmafärbung und Grading

8: Korrelation der Färbeintensität von CD44 mit der Tumorgröße

9: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Tumorgröße

10: Korrelation der Anzahl der CD44 markierten Zellen und Metastasen

11: Korrelation von CD44 Zytoplasmafärbung und Histologie

12: Korrelation von E-‐Cadherin Färbeintensität und Grading

13: Korrelation von Anzahl E-‐Cadherin markierten Zellen und Grading

14: Korrelation von N-‐Cadherin Färbeintensität und Histologie

15: Korrelation Anzahl N-‐Cadherin markierten Zellen in Histologie

16: Korrelation von N-‐Cadherin Färbeintensität und Geschlecht

17: Korrelation der Anzahl K-‐Cadherin markierter Zellen und Grading

18: Korrelation der Anzahl Ki-‐67 markierter Zellen und Grading

19: Korrelation der Anzahl p16 membranös markierter Zellen und Grading

20: Korrelation der Anzahl p16 zytoplasmatisch markierter Zellen und

Grading

21: Korrelation der Anzahl p16 membranös markierter Zellen und dem

Geschlecht

22: Korrelation der p16 Färbeintensität und Tumorgröße

23: Korrelation der Anzahl PTEN markierten Zellen mit Tumorstadium

24: Genetische Aberrationen

101

Abbildungen:

1: Ursprungsorte des Nierenzellkarzinoms,

2: HE Färbung Nierenzellkarzinom

3: Negative Färbung

4: Immunhistochemische Färbung Ki-‐67

5: Immunhistochemische Färbung PTEN

6: Immunhistochemische Färbung K-‐Cadherin

7: Immunhistochemische Färbung E-‐Cadherin

8. Immunhistochemische Färbung N-‐Cadherin

9: Immunhistochemische Färbung CD44

10: Immunhistochemische Färbung p16

11: Alter der Patienten bei Operation in Dekaden

12: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Gesamtüberleben des Patientenkollektives

13: Kaplan-‐Meier-‐Kurve T3a vs. T3b

14: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Nodalstatus

15: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Metastasen

16: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Grading

17: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Größe (dichotomisiert nach Median

18: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Größe (gruppiert nach TNM)

19: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Histologie

20: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Histologie

21: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Geschlecht

22: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 Färbeintensität

23: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 % gefärbte Zellen

24: Kaplan-‐Meier-‐Kurve CD44 Zytoplasmafärbung

25: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität E-‐Cadherin

26: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Anzahl gefärbter Zellen E-‐Cadherin

27: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität N-‐Cadherin

28: Kaplan-‐Meier-‐Kurve N-‐Cadherin % gefärbte Zellen

29: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität K-‐Cadherin

30: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen K-‐Cadherin

31: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen Ki-‐67

102

32: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zelle p16

33: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbte Zytoplasmen p16

34: Kaplan-‐Meier-‐Kurve Färbeintensität p16

35: Kaplan-‐Meier-‐Kurve % gefärbter Zellen PTEN

103

8 Anhang:

8.1 Einverständniserklärung der Patienten:

Erklärung

Ich bin damit einverstanden, dass die Gewebeprobe unter der Verantwortung der Klinik & Poliklinik für Urologie des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein für Studien mit den wissenschaftlich in Betracht kommenden Fragestellungen in verschlüsselter Form (Persönliche Daten wie Namen und Anschrift werden durch eine Codenummer ersetzt, die nur über eine Referenzliste zugeordnet werden kann) verwendet wird. Ich bin damit einverstanden, dass ich keine Rückinformationen über die getätigte Forschung erhalte. Widerruf der Zustimmung zur Probenverwendung: Ich weiß, dass ich meine Zustimmung zur Verwendung meiner Gewebeprobe jederzeit und ohne Angaben von Gründen gegenüber der oben genannten Institution widerrufen kann und das dies keinen Einfluss auf meine etwaige weitere ärztliche Behandlung hat. Ich stimme zu, dass Krankheitsdaten aus meinen Krankenunterlagen unter der Verantwortung der oben genannten Institution für diese Studie in pseudonymisierter Form gespeichert und verarbeitet werden. Widerruf der Zustimmung zur Datenverwendung: Ich weiß, dass meine Zustimmung zur Verwendung meiner Daten jederzeit und ohne Angaben von Gründen gegenüber der einleitend genannten Institution widerrufen kann und dass dies keinen Einfluss auf meine etwaige ärztliche Behandlung hat. Im Falle eines Widerrufes bin ich einverstanden, dass meine Daten zu Kontrollzwecken gespeichert bleiben. Ich habe jedoch das Recht, deren Löschung zu verlangen, sofern gesetzliche Bestimmungen der Löschung nicht entgegenstehen. ------------------------------------------- Ort, Datum ------------------------------------------- Name in Druckschrift ------------------------------------------- Unterschrift

104

8.2 Anschreiben Patienten

Sehr geehrte(r) Frau/ Herr … Bei ihnen wurde einen operative Entfernung der Niere bei einem Nierenzellkarzinom vorgenommen. Wir interessieren uns für die Langzeitergebnisse bei diesen Operationen allgemein, die Abhängigkeit der Prognose von bestimmten molekularen Markern und ihrem persönlichen Behandlungserfolg. Zu diesem Zweck verschicken wir an alle Patienten, die aufgrund eines Nierentumors im sogenannten T3-Stadium zwischen 1993 und 2002 operiert worden sind, dieses Anschreiben sowie eine Einwilligungserklärung zu folgenden Untersuchungen: Die Gewebeproben die von ihrer Operation stammen und in der Pathologie archiviert sind, sollen von der Klinik für Urologie und dem Institut für Pathologie des UK S-H nachuntersucht werden. Hier sollen verschiedene „Marker“ durch Immunfärbung (Immunhistochemie) bestimmt werden, um neue Erkenntnisse und möglicherweise verbesserte Diagnosemöglichkeiten für zukünftige Patienten mit Nierentumoren zu gewinnen. Diese Untersuchungen unterliegen hinsichtlich der Archivierung bzw. späteren Vernichtung den üblichen pathologischen Richtlinien (Archivierung in dem Institut für Pathologie über 10 Jahre, nachfolgend Verbrennung durch autorisierte Firmen). Die Untersuchungen sind zweckgebunden an die Bestimmung immunhistochemischer Marker. Eine Erweiterung der Untersuchung findet nicht statt. Hiermit bitte wir sie um ihr Einverständnis zur wissenschaftlichen Verwendung der Gewebeproben und Ihrer personenbezogenen Daten. Das verwendete Material ist zur weiteren Diagnostik ihrer Erkrankung nicht erforderlich. Für sie entstehen somit weder in der Erkennung noch in der Behandlung irgendwelche Nachteile. Wir möchten Sie freundlich bitten, die unterschriebene Erklärung in dem beiliegenden Freiumschlag zurückzusenden und bedanken uns schon im Vorwege für ihre Mithilfe. Mit freundlichen Grüßen ______________________ _________ Priv.-Doz. Dr. med I Kausch Daniel Foss Oberarzt der Klinik Doktorand

UNIVERSITÄTSKLINIKUM Schleswig-Holstein

Campus Lübeck Abteilung Herr Mustermann Tel: 0451 / 500-0 Internet: www.uk-s-h.de Datum: /


Campus Lübeck Ratzeburger Allee 160 23538 Lübeck

105

Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Anstalt des öffentlichen Rechts

Vorstandsmitglieder: Prof. Dr. Jens Scholz (Vorsitzender) Peter Pansegrau Christa Meyer

Bankverbindungen: Förde Sparkasse Kto.-Nr. 100 206, BLZ 210 501 70 Commerzbank AG (vormals Dresdner Bank) Kto.-Nr. 300 041 200, BLZ 230 800 40

Sehr geehrte Frau ....,

nachdem wir sie in der Vergangenheit angeschrieben haben um eine Einverständiniss erklärung von

ihnen zu bekommen, geht es nun um die Aufstellung einer retrospektiven Studie wofür wir gerne noch

einige Daten zu ihrem Krankheitsverlauf haben würden.

bei Ihnen wurde eine operative Entfernung der Niere bei einem Nierengeschwulst vorgenommen. Wir

interessieren uns für die Langzeitergebnisse bei diesen Operationen allgemein, die Abhängigkeit der

Prognose von bestimmten molekularen Markern und Ihrem persönlichen Behandlungserfolg. Zu

diesem Zweck verschicken wir an alle Patienten, welche aufgrund eines Nierentumors im

sogenannten Stadium T3 zwischen 1993 und 2002 operiert worden sind, einen Fragebogen zu diesen

Untersuchungen.

Wir möchten Sie freundlich bitten, den Fragebogen in dem beiliegenden Briefumschlag portofrei

zurückzusenden. Hierfür bedanken wir uns im Vorwege.

Mit freundlichen Grüßen.

PD Dr. med. I. Kausch D.Foss P. Korn

(Oberarzt der Klinik) (Doktorand) (Doktorand)


Campus Lübeck Klinik und Poliklinik für Urologie Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. D. Jocham Tel: 0451 / 500-2271 Fax 500-3338 (Klinikdirektion) 0451 / 500-6113 Fax 500-4666 (Sekr. Oberärzte) 0451 / 500-2102 Fax 500-6066 (Poliklinik) 0451 / 500-2042 Fax 500-6223 (Station 17) 0451 / 500-2484 Fax 500-6066 (Lithotripsie) Internet: www.urologie.uni-luebeck.de Datum: /

UNIVERSITÄTSKLINIKUM Schleswig-Holstein Campus Lübeck Ratzeburger Allee 160 23538 Lübeck

106

8.3 Anschreiben Einwohnermeldeamt

Sehr geehrte(r) Frau /Herr...,

Im Rahmen einer Doktorarbeit wollen wir bei Patienten mit Nierenzellkarzinom die alten

histologischen Schnitte der Niere verwenden. Wir wollen dabei herausfinden ob es

Parameter gibt, welche die Prognose beeinflussen. Dafür müssen bestimmte

Färbungsverfahren an den histologischen Schnitten durchgeführt werden.

Hierfür brauchen wir die Einwilligung der Patienten. Die Patienten sollen nun

angeschrieben werden. Um zu vermeiden, dass schon verstorbene Patienten

angeschrieben werden, bitten wir Sie um ihre Mithilfe.

Wir würden von Ihnen gerne wissen, welche Patienten noch leben und wenn es möglich

ist, eine Überprüfung unserer Adressen bekommen. Anbei liegt unsere Patientenliste.

Vielen Dank für ihre Mithilfe im Voraus.

Mit freundlichen Grüßen

_________________________ __________________

Prof. Dr. Jocham Doktorand Daniel Foss

107

8.4 Anschreiben Krankenkasse

Sehr geehrter Damen und Herren,

Im Rahmen einer Doktorarbeit wollen wir bei Patienten, welche an der Universitätsklinik

zu Lübeck an einem Nierentumor operiert wurden, heraus finden wie die

Langzeitprognose dieser Patienten ist. Um eine Aussage darüber machen zu können,

müssen wir wissen, ob die Patienten verstorben sind und wenn ja wann. Daher bitten wir

sie um ihre Mithilfe und übersenden ihnen im Anhang die Daten der Patienten.

Vielen Dank für ihre Mithilfe im Voraus


_________________________ __________________

PD. Dr. med. I. Kausch Doktorand Daniel Foss


Campus Lübeck Abteilung Herr Mustermann Tel: 0451 / 500-0 Internet: www.uk-s-h.de Datum: 21. 04. 2009



108

8.5 Anschreiben Ärzte

• «AnredePat» «NamePat», «VornamePat» geb. am «Gebdatum» Sehr geehrte(r) Frau/Herr im Rahmen einer retrospektiven Studie bezgl. des Nierenzellkarzinoms reevaluieren wir

Patienten, die an unserer Klinik operiert worden sind.

Wir möchten Sie höflichst bitten, in Bezug auf oben genannte/n Patient/en

freundlicherweise die im anliegenden Fragebogen aufgeführten Fragen zu beantworten

und diesen an uns zurückzusenden (gern auch per Fax).

Für Ihre Mitarbeit möchten wir uns schon im voraus ganz herzlich bedanken und

verbleiben


PD Dr. med. C. Doehn PD Dr. med.I. Kausch D. Foss P. Korn

Ltd. Oberarzt der Klinik Oberarzt der Klinik Doktorand Doktorand


Campus Lübeck Abteilung Ansprechpartner: Priv. Doz. Dr. med. C. Doehn Telefon: 0451 / 500-6113 Telefax: 0451 / 500-4666 e-mail: [email protected] Internet: www.uk-s-h.de Datum: 21.07.2008



109

8.6 Anschreiben Vertrauensstelle des Krebsregisters

Sehr geehrte Frau …,

im Rahmen einer Doktorarbeit wollen wir Patienten mit Nierenzellkarzinom die alten histologischen

Schnitte der Niere verwenden. Wir wollen dabei herausfinden ob es Parameter gibt, welche die

Prognose beeinflussen. Dafür müssen bestimmte Färbungsverfahren an den histologischen

Schnitten durchgeführt werden.

Hierfür brauchen wir die Einwilligung der Patienten. Die Patienten sollen nun angeschrieben

werden. Um zu vermeiden, dass schon verstorbene Patienten angeschrieben werden, bitten wir sie

um ihre Mithilfe.

Wir würden von ihnen gerne wissen, welche Patienten noch leben und wenn es möglich ist, eine

Überprüfung unserer Adressen bekommen. Anbei liegt unsere Patientenliste.

Vielen Dank für ihre Mithilfe im Voraus.


_____________ __________________

Prof. Dr. Jocham Doktorand Daniel Foss


Campus Lübeck Abteilung Herr Mustermann Tel: 0451 / 500-0 Internet: www.uk-s-h.de Datum: /



110

8.7 Genetische Aberrationen

Subtyp Genetische Aberration

Klarzelliges NZK -‐3p, +5q22, -‐6q, -‐8p, -‐9p, -‐14q

Papilläres NZK +3q, +7, +8, +12, +16, +17, +20, -‐Y

Chromophobes NZK -‐1, -‐2, -‐6, -‐10, -‐17, -‐21, Hypoploidität

Sammelrohrkarzinom -‐1q, -‐6p, -‐8p, -‐13q, -‐21q, -‐3p (selten)

Tabelle 24: Genetische Aberrationen, nach [Lopez-‐Beltran et al., 2009]

8.8 Nicht signifikante Kreuztabellen:


a b Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)


Intensität > 0 15 20 35

Gesamt 37 46 83

p=0,196 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität = 0 27 1 5 15 48

Intensität > 0 15 5 3 12 35

Gesamt 42 6 8 27 83

111

p=0,102 Metastasen

0 1 x Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 19 11 53 83

p=0,342 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 72 11 83



CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 75 8 83

p=0,246 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 69 14 83

112


<8cm >8cm Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 51 32 83

p=0,473 Geschlecht

m w Gesamt

CD44 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 57 26 83


a b Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 22 27 49

> 0 % 15 19 34

Gesamt 37 46 83

p=0,548 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 27 2 5 15 49

> 0 % 15 4 3 12 34

Gesamt 42 6 8 27 83

113

p=0,555 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 42 7 49

> 0 % 27 7 34

Gesamt 69 14 83

p=0,258 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 41 8 49

> 0 % 31 3 34

Gesamt 72 11 83



CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 45 4 49

> 0 % 30 4 34

Gesamt 75 8 83


>8cm >8cm Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 30 19 49

> 0 % 21 13 34

Gesamt 51 32 83

114

p=0,478 Geschlecht

m w Gesamt

CD44 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 32 17 49

> 0 % 25 9 34

Gesamt 57 26 83


a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 26 38 64


Gesamt 37 46 83

p=0,373 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 34 3 6 21 64

Färbung 1 bis 2 8 3 2 6 19

Gesamt 42 6 8 27 83

p=0,293 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 55 9 64


Gesamt 69 14 83

115

p=0,472 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 13 8 43 64


Gesamt 19 11 53 83

p=0,708 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 56 8 64


Gesamt 72 11 83


1 2 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 41 23 64


Gesamt 51 32 83




dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 7 24 33 64


Gesamt 9 30 44 83

116

p=0,581 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Färbung 0 45 19 64


Gesamt 57 26 83


a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität 0 25 28 53


Gesamt 42 49 91

p=0,470 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität 0 23 4 6 20 53

Intensität 1 bis 2 23 2 3 10 38

Gesamt 46 6 9 30 91

p=0,573 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 76 15 91

117

p=0,137 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 22 11 58 91

p=0,108 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 80 11 91




dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 82 9 91


<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 56 35 91

118




dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 10 33 48 91

p=0,646 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 63 28 91


a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 25 28 53

10-‐100% 17 21 38

Gesamt 42 49 91

p=0,470 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 23 4 6 20 53

10-‐100% 23 2 3 10 38

Gesamt 46 6 9 30 91

119

p=0,573 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 43 10 53

10-‐100% 33 5 38

Gesamt 76 15 91

p=0,137 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 11 4 38 53

10-‐100% 11 7 20 38

Gesamt 22 11 58 91

p=0,191 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 49 4 53

10-‐100% 31 7 38

Gesamt 80 11 91




dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 47 6 53

10-‐100% 35 3 38

Gesamt 82 9 91

120


<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 36 17 53

10-‐100% 20 18 38

Gesamt 56 35 91




dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 7 19 27 53

10-‐100% 3 14 21 38

Gesamt 10 33 48 91

p=0,646 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 38 15 53

10-‐100% 25 13 38

Gesamt 63 28 91

P=0,177 Unterteilung des T3 Stadiums

a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 37 45 82

121

p=0,558 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)

Intensität = 0 23 2 6 17 48

Intensität = 1 bis 2 19 3 2 10 34

Gesamt 42 5 8 27 82

p=1,0 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 69 13 82

p=0,802 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)


Intensität = 1 bis 2 9 4 21 34

Gesamt 19 11 52 82

p=1,0 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 71 11 82

122

p=0,414 Grading

1 2 3 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 9 53 20 82


<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 51 31 82




dichotomisiert nach

Median (=0)



Gesamt 9 30 43 82


a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 25 24 49

> 0 % 12 21 33

Gesamt 37 45 82

123

p=0,633 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 24 2 6 17 49

> 0 % 18 3 2 10 33

Gesamt 42 5 8 27 82

p=1,0 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 41 8 49

> 0 % 28 5 33

Gesamt 69 13 82

p=1,0 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 11 7 31 49

> 0 % 8 4 21 33

Gesamt 19 11 52 82

p=1,0 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 42 7 49

> 0 % 29 4 33

Gesamt 71 11 82

124

p=0,408 Grading

1 2 3 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 4 31 14 49

> 0 % 5 22 6 33

Gesamt 9 53 20 82


<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 32 17 49

> 0 % 19 14 33

Gesamt 51 31 82




dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 7 19 23 49

> 0 % 2 11 20 33

Gesamt 9 30 43 82

p=0,146 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=0%)

0 % 30 19 49

> 0 % 26 7 33

Gesamt 56 26 82

125


a b Gesamt

K-‐Cadherin Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 37 48 85

p=0,258 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)


Intensität = 2 7 3 1 5 16

Gesamt 44 6 8 27 85

p=0,453 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 71 14 85

p=0,434 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 22 11 52 85

126

p=0,681 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 74 11 85

p=0,919 Grading

1 2 3 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 10 55 20 85




dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 78 7 85

0,269 Größe dichotomisiert nach Median

<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 53 32 85

127




dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 9 32 44 85

p=0,251 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 58 27 85


a b Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 23 26 49

70-‐100% 14 22 36

Gesamt 37 48 85

p=0,341 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 22 5 6 16 49

70-‐100% 22 1 2 11 36

Gesamt 44 6 8 27 85

128

p=0,137 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 38 11 49

70-‐100% 33 3 36

Gesamt 71 14 85

p=0,133 Metastasen

0 1 x Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 10 9 30 49

70-‐100% 12 2 22 36

Gesamt 22 11 52 85

p=0,108 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 40 9 49

70-‐100% 34 2 36

Gesamt 74 11 85




dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 43 6 49

70-‐100% 35 1 36

Gesamt 78 7 85

129


<8cm >8cm Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 29 20 49

70-‐100% 24 12 36

Gesamt 53 32 85




dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 6 16 27 49

70-‐100% 3 16 17 36

Gesamt 9 32 44 85

p=1,0 Geschlecht

m w Gesamt


dichotomisiert nach

Median (=60%)

0-‐60% 33 16 49

70-‐100% 25 11 36

Gesamt 58 27 85


a b Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 22 27 49

20-‐100% 12 11 23

Gesamt 34 38 72

130

p=0,606 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 27 2 4 16 49

20-‐100% 13 2 3 5 23

Gesamt 40 4 7 21 72

p=0,312 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 43 6 49

20-‐100% 18 5 23

Gesamt 61 11 72

p=0,434 Metastasen

0 1 x Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 14 4 31 49

20-‐100% 7 4 12 23

Gesamt 21 8 43 72

p=0,257 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 45 4 49

20-‐100% 19 4 23

Gesamt 64 8 72

131



Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 45 4 49

20-‐100% 20 3 23

Gesamt 65 7 72


<8cm >8cm Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 29 20 49

20-‐100% 14 9 23

Gesamt 43 29 72



Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 5 17 27 49

20-‐100% 2 9 12 23

Gesamt 7 26 39 72

p=0,789 Geschlecht

m w Gesamt

Ki67 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 34 15 49

20-‐100% 15 8 23

Gesamt 49 23 72

132


a b Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 40 48 88

p=0,855 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)


Intensität = 2 9 2 2 6 19

Gesamt 46 6 9 27 88

p=0,713 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 73 15 88

p=0,480 Metastasen

0 1 x Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 22 11 55 88

133

p=0,444 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 77 11 88

p=0,374 Grading

1 2 3 Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 10 57 21 88



p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 80 8 88



p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 9 31 48 88

134

p=0,411 Geschlecht

m w Gesamt

p16 Intensität

dichotomisiert nach

Median (=1)



Gesamt 62 26 88


a b Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 23 29 52

10-‐100% 17 19 36

Gesamt 40 48 88

p=0,105 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 32 4 5 11 52

10-‐100% 14 2 4 16 36

Gesamt 46 6 9 27 88

p=1,0 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 43 9 52

10-‐100% 30 6 36

Gesamt 73 15 88

135

p=0,813 Metastasen

0 1 x Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 14 7 31 52

10-‐100% 8 4 24 36

Gesamt 22 11 55 88

p=1,0 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 45 7 52

10-‐100% 32 4 36

Gesamt 77 11 88



p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 49 3 52

10-‐100% 31 5 36

Gesamt 80 8 88


<8cm >8cm Gesamt

p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 30 22 52

10-‐100% 23 13 36

Gesamt 53 35 88

136



p16 % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 6 19 27 52

10-‐100% 3 12 21 36

Gesamt 9 31 48 88


a b Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 20 28 48

10-‐100% 20 20 40

Gesamt 40 48 88

p=0,714 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 24 3 4 17 48

10-‐100% 22 3 5 10 40

Gesamt 46 6 9 27 88

p=0,575 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 41 7 48

10-‐100% 32 8 40

Gesamt 73 15 88

137

p=0,819 Metastasen

0 1 x Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 12 5 31 48

10-‐100% 10 6 24 40

Gesamt 22 11 55 88

p=0,537 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 43 5 48

10-‐100% 34 6 40

Gesamt 77 11 88



p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 43 5 48

10-‐100% 37 3 40

Gesamt 80 8 88


(8cm)

<8cm >8cm Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 27 21 48

10-‐100% 26 14 40

Gesamt 53 35 88

138



p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 4 18 26 48

10-‐100% 5 13 22 40

Gesamt 9 31 48 88

p=0,242 Geschlecht

m w Gesamt

p16 % Zytopl.

dichotomisiert nach

Median (=0%)

0% 31 17 48

10-‐100% 31 9 40

Gesamt 62 26 88

p=0,916 Nodalstatus

0 1 2 x Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 27 4 5 20 56

10-‐100% 18 2 3 9 32

Gesamt 45 6 8 29 88

p=1,0 N0/Nx vs N>0

N0/Nx >N0 Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 47 9 56

10-‐100% 27 5 32

Gesamt 74 14 88

139

p=0,247 Metastasen

0 1 x Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 12 5 39 56

10-‐100% 9 6 17 32

Gesamt 21 11 56 88

p=0,198 M0/Mx vs M1

M0/Mx M1 Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 51 5 56

10-‐100% 26 6 32

Gesamt 77 11 88

p=0,392 Grading

1 2 3 Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 8 34 14 56

10-‐100% 2 24 6 32

Gesamt 10 58 20 88



pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 48 8 56

10-‐100% 31 1 32

Gesamt 79 9 88

140


<8cm >8cm Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 34 22 56

10-‐100% 20 12 32

Gesamt 54 34 88



pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 4 22 30 56

10-‐100% 5 10 17 32

Gesamt 9 32 47 88

p=0,341 Geschlecht

m w Gesamt

pTen % Zellen

dichotomisiert nach

Median (=10%)

0-‐10% 41 15 56

10-‐100% 20 12 32

Gesamt 61 27 88

141

9 Danksagungen (gekürzt)

142

10

11 Lebenslauf (gekürzt)

Persönliche Daten:

Geburtsdatum: 22.05.1984

Name: Philippe Niels Korn

Geburtsort: Nancy (Frankreich)

Ausbildung:

06/2011: Approbation als Arzt

05/2011: Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2008-‐2012: Dissertation zum Thema immunhistochemische Parameter und deren

prognostische Bedeutung beim Nierenzellkarzinom im Stadium T3

09/2006: Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2004-‐2011: Studium der Humanmedizin an der Universität zu Lübeck

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