Immunologische methoden zum nachweis von diphtherie-toxin (Passive Haemagglutination und ELISA zum...

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Zbl. Bakt. Hyg. A 265, 124-135 (1987) Immunologische Methoden zum Nachweis von Diphtherie-Toxin (Passive Haemagglutination und ELISA zum Toxinnachweis aus Kulturen und im Serum)1 Immunological Methods for Detection of Diphtheria Toxin (Passive Haemagglutination and ELISA for Detection of Toxin from Cultures and Serum) T. KRECH und CHRISTIANE WITTELSBURGER Institut fur Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitiit Dusseldorf (Direktor: Prof. Dr. med. P. Naumann), D-4000 Dusseldorf Mit 2 Abbildungen . Eingegangen 16. August 1986 . Angenommen 23. Oktober 1986 Summary A competitive passive hemagglutination assay (cPHA) easy to perform and a highly sensitive ELISA have been investigated for detection of diphtheria toxin from cultures and from human serum. The sensitivity of the cPHA (8 ng toxin/ml) was high enough to detect toxin in pure cultures containing C. diphtheriae. For this application the cPHA proved to be a simple and reproducible alternative to the Elek-Ouchterlony test. Toxin in culture filtrates of nasal and tonsillar swabs containing toxinogenic strains of C. diphtheriae together with germs of the physiological flora and toxin in serum can be detect- ed with the more sensitive BiotiniStreptavidin ELISA (0,6 ng toxin/ml). This allows the confirmation of the clinical diagnosis "diphtheria" within 24-48 h. Zusammenfassung Die Eignung einer einfach durchfuhrbaren kompetitiven passiven Haemagglutination (cPHA) und eines hochsensitiven ELISA zum Diphtherie-Toxinnachweis in Bakterienkultu- ren und menschlichem Serum wurde untersucht. Die Empfindlichkeit der cPHA (8 ng Toxin/ ml) reichte aus, urn im Kulturfiltrat von Reinkulturen Toxin nachzuweisen. Hier bietet die cPHA wegen ihrer einfachen und reproduzierbaren Durchfiihrbarkeit und ihrer hohen Spe- 1 Herrn Professor Dr. H. Brandis in dankbarer Verbundenheit zum 70. Geburtstag ge- widmet. Die dargestellten Untersuchungen sind ein Teil aus der z. Z. in unserem Institut durchge- fuhrten Promotionsarbeit von Frau Christiane Wittelsbiirger.

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Zbl. Bakt. Hyg. A 265, 124-135 (1987)

Immunologische Methoden zum Nachweisvon Diphtherie-Toxin(Passive Haemagglutination und ELISA zum Toxinnachweisaus Kulturen und im Serum)1

Immunological Methods for Detection of Diphtheria Toxin(Passive Haemagglutination and ELISA for Detection of Toxin from Culturesand Serum)

T. KRECH und CHRISTIANE WITTELSBURGER

Institut fur Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitiit Dusseldorf (Direktor:Prof. Dr. med. P. Naumann), D-4000 Dusseldorf

Mit 2 Abbildungen . Eingegangen 16. August 1986 . Angenommen 23. Oktober 1986

Summary

A competitive passive hemagglutination assay (cPHA) easy to perform and a highlysensitive ELISA have been investigated for detection of diphtheria toxin from cultures andfrom human serum. The sensitivity of the cPHA (8 ng toxin/ml) was high enough to detecttoxin in pure cultures containing C. diphtheriae. For this application the cPHA proved to bea simple and reproducible alternative to the Elek-Ouchterlony test.

Toxin in culture filtrates of nasal and tonsillar swabs containing toxinogenic strains of C.diphtheriae together with germs of the physiological flora and toxin in serum can be detect­ed with the more sensitive BiotiniStreptavidin ELISA (0,6 ng toxin/ml). This allows theconfirmation of the clinical diagnosis "diphtheria" within 24-48 h.

Zusammenfassung

Die Eignung einer einfach durchfuhrbaren kompetitiven passiven Haemagglutination(cPHA) und eines hochsensitiven ELISA zum Diphtherie-Toxinnachweis in Bakterienkultu­ren und menschlichem Serum wurde untersucht. Die Empfindlichkeit der cPHA (8 ng Toxin/ml) reichte aus, urn im Kulturfiltrat von Reinkulturen Toxin nachzuweisen. Hier bietet diecPHA wegen ihrer einfachen und reproduzierbaren Durchfiihrbarkeit und ihrer hohen Spe-

1 Herrn Professor Dr. H. Brandis in dankbarer Verbundenheit zum 70. Geburtstag ge­widmet.

Die dargestellten Untersuchungen sind ein Teil aus der z. Z. in unserem Institut durchge­fuhrten Promotionsarbeit von Frau Christiane Wittelsbiirger.

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Immunologische Methoden zum Nachweis von Diphtherie-Toxin 125

zifitiit eine Alternative zum Agardiffusionstest nach Elek-Ouchterlony. Der Toxinnachweisin Kulturfiltraten von Nasen- und Rachenabstrichen mit toxinogenen C. diphtheriae-Stiim­men sowie aus Serum kann mit dem empfindlichen Biotin/Streptavidin ELISA (0,6 ng Toxin/ml) gefiihrt werden. Daraus ergibt sich die Moglichkeit, die klinische Verdachtsdiagnose"Diphtherie" bereits nach 24-48 Std. zu bestiitigen.

Einleitung

Moderne immunologische Methoden ermoglichen einen sehr empfindlichen undspezifischen Nachweis von Antigenen in Virus- und Bakterienkulturen oder direkt inmenschlichem Untersuchungsmaterial. Besonders weit gediehen ist diese Diagnostik inder Virologie, wo die Typisierung von Viren in der Zellkultur sowie der Nachweis vonHepatitis B-Antigen aus Serum, von respiratorischen Viren aus Nasopharyngealaspiratund von Rotavirus aus Stuhl mittels RIA und ELISA bereits Eingang in die Diagnostikgefunden hat. In der Bakteriologie gestaltet sich dieser Zugang schwieriger, weiI diegroge antigenetische Vielfalt der Bakterien auch antigenetische Oberschneidungen zwi­schen verschiedenen Spezies zur Foige hat. Mit der Entwicklung spezies- und typspezi­fischer monoklonaler Antikorper durfte sich aber auch hier ein weites Feld fur dieDiagnostik eroffnen. Insbesondere der Nachweis von bakteriellen Stoffwechselproduk­ten, die fur die Pathogenese verantwortlich sind, unterstreicht gleichzeitig die aetiologi­sche Bedeutung des Erregers. Gut erforscht sind Botulinus- und Tetanus-Toxin, Sta­phylokokken-Enterotoxin und Toxic-Schock-Syndrom-Toxin sowie Diphtherie-Toxin.Diese Exotoxine, die im Tierversuch nachgewiesen werden konnen, stellen ein Modelldar, an we1chem Sensitivitiit und Spezifitiit immunologischer in vitro-Methoden auchim Hinblick auf nicht-tierpathogene Stoffwechselprodukte bzw. Virulenzfaktoren un­tersucht werden konnen.

In dieser Studie ging es uns darum, am Beispiel der Diphtherie zwei verschiedeneimmunologische Methoden auf ihre Eignung zum Toxinnachweis aus Kulturfiltratenoder Serum zu untersuchen. Dabei strebten wir neben einem Verzicht auf den Tierver­such eine beschleunigte Diagnostik an, da nur die fruhzeitige Verabreichung von anti­toxischem Serum den Verlauf der Erkrankung beeinflussen kann. Unsere Erkenntnissesind auch von praktischer Relevanz, weil seit 1975 in der Bundesrepublik 109 Diphthe­rieerkrankungen bekannt wurden, die in 22 Fiillen todlich verliefen (14). Mit einerschnellen Diagnostik konnte diese hohe Letalitiit moglicherweise gesenkt werden.

Nach Vorversuchen mit insgesamt 17 verschiedenen Testvarianten der kompetitivenpassiven Haemagglutination (cPHA) und des Enzymimmunoassays (ELISA) (zur Ver­offentlichung eingereicht) wiihlten wir fur diese Studie von beiden Systemen den emp­findlichsten Test. Die cPHA interessierte uns, weiI sie einfach und ohne groBen Auf­wand·durchfuhrbar ist. Sie ist jedoch rund 15 mal unempfindlicher als der 4-schichtigeELISA. Da es vorerst unsicher war, ob die Sensitivitiit und Spezifitiit der cPHA allenAnforderungen genugen wurde, fuhrten wir siimtliche Untersuchungen mit beidenTests durch.

Fur Serum-Toxinbestimmungen am Tiermodell muBten wir aus technischen Grun­den einen 3-schichtigen ELISA einsetzen.

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Material und Methoden

Die Tests wurden in Mikrotitrations-Rundbodenplatten der Firma Greiner durchgefiihrt,die sich in Vorversuchen als geeignet erwiesen hatten. In Einzelfallen kamen fiir die cPHAauch Spitzbodenplatten gleicher Herkunft zur Anwendung.

In der cPHA verwendete Reagenzien: Die Sensibilisierung der Schaferythrozyten wurdemit Diphtherie-Toxoid (Fa. Behring, 2.500 Lf/ml) wie friiher beschrieben durchgefiihrt (13).Ais Verdiinnungspuffer fiir Erythrozyten und Proben diente PBS 0.15 M, pH 7,2. AisProbenpuffer wurde auch Adsorptionspuffer aus dem TPHA-Kit der Fa. Fuji Rebio (Fa.Mast, Hamburg) benutzt.

1m ELISA verwendete Reagenzien: Beschichtungspuffer: PBS 0,14 M, pH 7,2. Waschpuf­fer: 0,35 M NaCl, 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH2P04, 6,5 mM Na2HP04 x 2 H20, 0,05%Tween 20, pH 7,2. Verdiinnungspuffer: Waschpuffer, 0,5% BSA (Sigma, A7888) enthal­tend.

Substratlosung fiir Meerrettich-Peroxidase: 10 mg OPD (Riedel de Haen Nr. 65083) pro10 ml Zitratpuffer (42 mM C6Hg0 7 X H20, 0,12 M Na2HP04 X 2 H20, 5%0 (v/v) 30%H20z, pH 5,6). Stoplosung: 1 N HC!.

Antiseren

Die antitoxischen Antikorper stammten yom pferd (11 IE/ml, Fa. Behring, Marburg) undyom Meerschweinchen (Vollserum, eigene Herstellung, 576 IE/ml).

Konjugat

Gegen Meerschweinchen gerichtete IgG-Antikorper (Fa. Nordic 26-581) wurden mitBiotin (Enzo Biochem EAB-406, Vertrieb Ortho Diagnostics, Neckargemiind) nach derMethode von Guesdon u. Mitarb. (5), modifiziert von Kendall u. Mitarb. (9), gekoppelt.Vergleichsweise wurden auch gebrauchsfertige biotinylierte Antikorper der Fa. Enzo Bio­chern (EAB-927) benutzt.

Standards

Mit jedem Test wurde der WHO-Standard fiir Diphtherie-Toxoid mitgefiihrt in einerAnfangsverdiinnung von 1 : 104, entsprechend 0,11 Lf/ml bzw. 0,01 IElml. In einigenAnsatzen wurden zusatzlich Kulturfiltrate des stark toxinbildenden Stammes PW 8 und deratoxischen Spezies C. pseudodiphtheriticum oder des atoxischen C. diphtheriae-StammesNCTC 10356 als positive bzw. negative Kontrolle eingesetzt. RegelmaJSig wurde eine Puf­ferkontrolle mitgefiihrt.

Selektives Diphtherie-Anreicherungsmedium (pH 7,4): 9 g Proteose Pepton (Nr. 3, Fa.Difco), 9 g Fleischextrakt, 2,7 g NaCl, 1,8 g di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat,1,8 g Glucose, 75 ml2%ige wassrige Kaliumtelluritlosung, 900 ml A. dest., 100 ml Rinder­serum, 1000 E/ml Nystatin, 132 I-Ig/ml Fosfomycin, 29,25 I-Ig/ml Glucose-6-Phosphat, sterileEigelbsuspension aus 10 Eidottern.

Proteose-Pepton Bouillon (pH 7,8): 4 g Proteose-Pepton (Nr. 3, Fa. Difco), 0,6 g Malto­se, 100 ml A. dest.

Toxinnachweis aus Kulturfiltraten

Kulturen im selektiven Diphtherie-Anreicherungsmedium oder in Proteose-Pepton-Bouil­Ion wurden bei 37°C iiber Nacht bebriitet und zentrifugiert. Nach einer anschlie/SendenFiltration (Millex GV 0,22 1-1, Fa. Millipore, Eschborn) konnten die Proben in der cPHAoder im ELISA eingesetzt werden.

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Durchfiihrung der cPHA

Der Test wurde im Mikrotitersystem quantitativ in geometrischer Verdiinnungsreihedurchgefiihrt, beginnend mit einer unverdiinnten Probe. Nach Zugabe von Antitoxin (11 IEIml) in einer Verdiinnung von 1 : 3000 erfolgte eine Inkubation von 2 Std. bei Zimmertempe­ratur. Die maximale Empfindlichkeit wird zwar erst bei 18stiindiger Inkubation erreicht;wir nahmen jedoch den Sensitivitatsverlust von 1 bis 2 Titerstufen im Interesse einer be­schleunigten Diagnostik in Kauf. Bei dieser Inkubation werden die antitoxischen Antik6rperdurch das gesuchte Toxin neutralisiert und k6nnen mit den nun zugegebenen toxinsensibili­sierten Erythrozyten nicht mehr reagieren. Zum AusschluS einer unspezifischen Bindungund Agglutination wurden parallel nicht sensibilisierte Erythrozyten mitgefiihrt. Die endgiil­tige Ablesung des Tests erfolgte nach 2 Std. Eine Knopfbildung bedeutet einen positivenAusfall, d.h. die Probe enthalt Toxin, und zwar bis zu jenem Titer, bei dem im Vergleich zurnegativen Kontrolle gleicher Verdiinnung noch gerade eine angedeutete Knopfbildung sicht­bar ist. 1m negativen Fall belegen die Erythrozyten eine groSe Kreisflache auf dem Boden derVertiefung infolge Agglutination (Abb. 1).

Durchfiihrung des 4-schichtigen ELISA

Mikrotitrationsplatten wurden pro Vertiefung mit 100 [tl Diphtherie-Antitoxin vompferd in einer Verdiinnung von 1 : 1000 beschickt und fiir 1 Std. inkubiert; samtlicheInkubationen erfolgten bei 3rc. Nach diesem und allen folgenden Inkubationsschritten(auSer der Substratinkubation) wurden die Platten jeweils durch Fiillen und Ausklopfen derVertiefungen bei 1-miniitiger Eimyirkzeit des Puffers 4 mal gewaschen. AnschlieSend erfolg­te die Auftragung der Proben in geometrischer Verdiinnungsreihe (100 [tINertiefung) und

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T. Krech 1984

Abb. 1. Nachweis von Diphtherie-Toxin mit der Passiven Hamagglutination.

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Inkubation £iir 2 Std. Die Verdiinnung des Meerschweinchenantiserums betrug 1 : 200 (90[-tINertiefung), die Inkubationszeit 1 Std. Das 1 : 800 verdiinnte Konjugat (75 [-tl) wurde £iir1 Std. inkubiert, darau£ der Streptavidin-Peroxidase-Komplex (1 : 1000) aufgetragen (75 [-tl)und £iir eine halbe Stunde stehen gelassen. 30 Min. nach Zugabe von 75 [-tl der Substratlo­sung wurde die Reaktion mit 75 [-tIl N HCI gestoppt. Die Ablesung erfolgte photometrischbei 492 nm. Eine Probe galt als positiv, wenn ihr Extinktionswert das Doppelte der negati­ven Konrolle iibertra£ und wenn sich die Reaktion durch 30miniitige Vorinkubation mit 100[-tl antitoxischem Diphtherie-Serum (vom Scha£, Fa. Berna/Schweiz) hemmen lieK

Durchfiihrung des 3-schichtigen ELISA

Beschickungsvolumina und Inkubationszeiten entsprachen dem 4-schichtigen ELISA. ZurBeschichtung wurde jedoch anstelle des Antitoxins vom pferd das Antiserum vom Meer­schweinchen verwendet. In Biotin-gekoppelter Form kam dasselbe Serum als Konjugat zumEinsatz.

Ergebnisse

Spezifitat

Die Untersuchungen zur Spezi£itiit sind in Tabelle 1 zusammengefaRt. Es wurdennicht-toxinhaltige Reinkulturen, Anreicherungsmedien und Seren gepriift. Wiihrenddie cPHA sehr spezi£isch ist, reagieren im ELISA einige Proben mit erhohten Werten.Nach Vorinkubation des Testmaterials mit einem anderen antitoxischen Diphtherie­Serum als im Test verwendet (vom Scha£, Fa. Berna/Schweiz) liiRt sich die Reaktivitiitdieser Proben jedoch nicht blockieren. Enhiilt im Gegensatz dazu die TestsubstanzToxin, so wird dieses durch die Vorbehandlung mit Antitoxin neutralisiert und derTest £aUt negativ aus. Aus diesen Resultaten wird klar, daR im ELISA eine Probe immerdoppelt angesetzt werden muR, einmal ohne und einmal mit Vorinkubation, urn Fehl­interpretationen zu vermeiden.

Keine erhohten Absorptionswerte ergaben sich bei Vorliegen von Staphylococcusaureus, obwohl bekannt ist, daR sein Protein A in immunologischen Tests zu unspezi£i­schen Reaktionen AniaR geben kann (10).

~-haemolysierende Streptokokken und Seren von Mumps- und EBV-Erkranktenwurden untersucht, weil In£ektionen durch diese Erreger zu einem Diphtherie-iihnli­chen Krankheitsbild £iihren konnen. Deshalb ist es wesentlich, daR Proben dieser Pa­tienten beim Diphtherie-Antitoxinnachweis nicht eine £alsch positive Reaktion hervor­ru£en, die eine nicht indizierte Verabreichung von antitoxischem Serum zur Folge hiitte.

Zwei Isolate von C. diphtheriae mit unspezi£ischenPriizipitationslinien im Elek-Test(Di-73/83 und Di-6) wurden sowohl im ELISAals auch in der cPHA geprii£t undergaben korrekte Ergebnisse (nicht dargesteUt).

Sensitivitat

Mit der cPHA gelang es, 8 ng/ml desWHO-Standard-Toxoids nachzuweisen. Diesentspricht etwa 3 Tausendste1 Lf/ml oder 3 X 10-4 IE/mi. Mit dem 4-schichtigen ELISAerreichten wir 0,6 ng/ml, mit dem 3-schichtigen 0,9 ng/mi.

Vergleiche mit einem hochgereinigten Toxinpraparat ergaben, daR aktives Toxin mitgleicher Emp£indlichkeit wie Toxoid reagiert, weshalb die Konzentrationsberechnun­gen ohne Einschriinkung auch fiir Toxin Giiltigkeit haben.

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In den Empfindlichkeitsvergleichen der Tests diente als Grundmedium Puffer. Dawir aber den Toxinnachweis aus Kulturfiltraten und Serum anstrebten, mugte dieNachweisgrenze auch in diesen Medien bestimmt werden. Die zu dem Zweck durchge­fiihrten Blocktitrationen ergaben keine Beeinflussung der Empfindlichkeit durch Kul­turmedium oder Serum. Einzig beim Toxoidnachweis aus Meerschweinchenserum re­sultierten im 4-schichtigen ELISA unannehmbar hohe Hintergrundsfiirbungen, wes­halb diese Bestimmungen im 3-schichtigen Test durchgefiihrt werden mugten.

Toxinnachweis aus Kulturiiberstanden (Tabelle 2)

Insgesamt 45 toxinogene Stiimme in Reinkultur wurden in der cPHA vergleichendmit dem Tierversuch und/oder der Gewebekultur bzw. dem Agar-Immunpriizipita­tionstest nach Elek-Ouchterlony gepriift. Dabei konnten wir eine v611ige Obereinstim­mung erzielen, sofern ein optimierter Elek-Test mit hochspezifischem Antiserum (vomMeerschweinchen, eigene Herstellung) zur Vermeidung irrefiihrender Priizipitationsli­nien verwendet wurde. Analoge Ergebnisse erhielten wir mit dem ELISA an 9 gepriiftenStiimmen.

Die oben beschriebenen Resultate zeigen, dag in Oberstiinden von Reinkulturennach Bebriitung iiber Nacht in jedem Fall Toxinkonzentrationen erreicht werden, diesowohl im ELISA als auch in der unempfindlicheren cPHA sicher megbar sind.

Auch im Anreicherungsmedium (Primiirkultur) kann Toxin nachgewiesen werden,noch bevor eine Reinkultur hergestellt ist. Dadurch wird die Diagnosestellung be­schleunigt. Der Nachweis ist allerdings auch problematischer, da der Abstrich immerKeime der physiologischen Mund- und Rachen- oder Nasenflora enthiilt. Das Wachs­tum der meisten dieser Keime wird durch das verwendete tellurithaltige Anreicherungs­medium unterdriickt. Wesentlich ist aber auch eine Hemmung von Staphylococcus

Tabelle 2. Untersuchungen zur Empfindlichkeit von cPHA und ELISA an toxinhaltigenProben

cPHA ELISA

gepriift positiv gepriift positivReinkulturen

mit toxinogenem C. diphtheriae: 44 44 8 8mit toxinogenem C. ulcerans: 1 1 1 1

Anreicherungsmedien vonNasen- und Rachenabstrichenmit toxinogenen C. diphtheriae: 4 0 4 11

Serenvon infizierten Meerschweinchen: 22 0 5 5von Kaninchen3: - 3 2

1 Die iibrigen 3 Abstriche enthielten Staph. aureus, der das nachweisbare Diphtherie-Toxinin der Kultur reduziert.

2 Von jedem Tier wurden mehrere Seren gewonnen, die Zahlen beziehen sich auf die unter­suchten Ticre.

3 Den Kaninchen wurde 680 ng und 6800 ng Toxin bzw. 3400 ng Toxoid i. v. verabreicht.Der Nachweis fiel beim mit 680 ng gespritzten Tier negativ aus.

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aureus durch Fosfomycin-Zusatz, denn wir machten die Beobachtung, daR dieser Keirnden Toxinnachweis in starkem AusmaRe beeintriichtigt.

In einem der 4 Nasen- und Rachenabstriche von 3 Triigern toxinogener Diphtherie­bakterien gelang mit dem ELISA der Toxinnachweis, nicht aber mit der unempfind­licheren cPHA. Bei den 3 Versagern handelt es sich urn Kulturen, die Staphylococcusaureus enthielten und denen noch kein Fosfomycin zugesetzt war, wodurch die Toxin­bildung wahrscheinlich unterdriickt wurde.

Toxinnachweis im Serum (Tabelle 2)

Die Eignung der cPHA und des ELISA zum direkten Diphtherietoxinnachweis imSerum wurde vorerst am Tiermodell gepriift. Meerschweinchen erhielten 0,5 ml einergewaschenen Suspension (ca. 107 Keime/ml) toxinogener Diphtheriebakterien s.c. ap­pliziert. Es handelte sich urn den stark toxinbildenden Laborstamm PW8 sowie urn diebeiden Wildisolate Di-3 und GS-l. Als negative Kontrolle diente der nicht-toxinogeneDiphtherie-Stamm NCTC 10356.

18 Stunden nach Infektion wurden mit dem ELISA folgende Serumspiegel gemessen:PW8: 179,2 ng/ml, Di-3: 0,7 ng/ml und GS-l: 5,6 ng/ml, NCTC 10356: nichtreaktiv.Mit der cPHA konnte in einem anderen, iihnlich angelegten Versuch kein Diphtherieto­xin nachgewiesen werden, im empfindlicheren ELISA jedoch wurden auch in diesenSeren bis zu 11,2 ng Toxin/ml gemessen. Mit der Gewebekultur war ebenfalls ToxinmeRbar, wodurch die Spezifitiit des ELISA bestiitigt wurde.

Ein Toxinnachweis im Serum ist nach antibiotischer Anbehandlung des Patienten dieeinzige Moglichkeit, die Diagnose "Diphtherie" mikrobiologisch noch zu sichern. MitEinsetzen der antibiotischen Therapie sistiert aber die Toxinbildung. Je langsamer dasResttoxin aus dem Blutkreislauf eliminiert wird, desto liinger ist ein Nachweis nochmoglich. Da iiber die Toxinkinetik bei Menschen keine Kenntnisse bestehen, versuch­ten wir, einen Anhalt am Kaninchen zu gewinnen. Einem Tier wurde 500 ng Toxin i.v.gespritzt und in zeitlichen Abstiinden Blut zur Toxinbestimmung im 3-schichtigenELISA entnommen. Die daraus errechnete Halbwertszeit betrug etwa 6 Std. Auf weite­re Tierversuche wurde verzichtet, weil solche Ergebnisse nm bedingt auf den Menscheniibertragbar sind. Andere Autoren (2, 4) sind bei ihren Untersuchungen am Meer­schweinchen zu ahnlichen Resultaten gekommen.

Der Toxinnachweis aus menschlichem Serum wurde simuliert, da uns bei der gegen­wiirtigen epidemiologischen Lage keine Proben von Erkrankten zur Verfiigung stan­den. Durch Beimischung des WHO-Standards zu einem Antitoxin-negativen Serumkonnte eine Nachweisgrenze von 0,9 ng Toxoid/ml Serum ermittelt werden.

Diskussion

In dieser Studie wurde die Eignung sowohl eines einfachen immunologischen Tests(cPHA) als auch eines hochsensitiven, aber aufwendigeren ELISA zum Nachweis vonToxin in Kulturfiltraten und menschlichem Serum untersucht.

Die von uns entwickelte cPHA erreichte eine Sensitivitiit von etwa 8 ng/m!. Damitliegen wir deutlich schlechter als andere Autoren, die von ihren Haemagglutinations­tests fiir Diphtherietoxin die erstaunliche Nachweisgrenze von 0,2 ng/ml bzw. 0,8 ng/ml berichten (3, 7). Die Werte wurden allerdings nicht an einem Standardtoxoid ermit­telt, was einen direkten Vergleich erschwert.

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Eine ahnliche Sensitivitat erreichten wir nur mit unserem empfindlichsten ELISA(0,6 ng/m!). Die Nachweisgrenze von Enzymimmunoassays zur Erfassung anderer To­xine liegt in derselben GroRenordnung. Aronsson u. Mitarb. (1) beispie1sweise erzieltenmit ihrem Sandwich-ELISA eine Nachweisgrenze von 5 ng/ml fur Clostridium difficile­Enterotoxin, Honda U. Mitarb. (8) kommen auf 0,1 ng/ml E. coli- bzw. Cholera­Enterotoxin. Staphylokokken-Enterotoxin wurde von Fey U. Mitarb. (4) ebenfalls biszu 0,1 ng/ml nachgewiesen, wahrend Hahn U. Mitarb. (6) mit einem Avidin-BiotinELISA auf 1 ng/ml kommen.

Mit einer Nachweisgrenze von etwa 0,6 ng/ml Toxoid gehort der von uns entwickel­te ELISA zu den empfindlichsten Methoden fur den Nachweis von Diphtherietoxin. Aissensitivstes Verfahren gilt der Kaninchen-Tierversuch. Damit konnen bei optimaler

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Abb. 2. Modifizierter Untersuchungsgang mit der Moglichkeit der schnelleren Bestiitigungeines Diphtherieverdachts.

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Versuchsanordnung auf der Haut des weiBen Kaninchens etwa umgerechnet 0,1 ng/mlToxin erfaBt werden (16), eine ahnliche Sensitivitat erreichen wir mit der Gewebekul­tur (unveroffentlichte Untersuchungen).

Der Toxinnachweis in Reinkultur-Filtraten laBt sich sowohl mit der cPHA als auchmit dem ELISA sicher fuhren. Ein sehr geringer Arbeitsaufwand und eine einfacheDurchfuhrung pradestinieren die cPHA geradezu fur diese Anwendung. Dadurch bietetsich die cPHA als Alternative zu dem nicht immer zuverlassigen (15) und bei seltenerAnwendung schwer standardisierbaren Elek-Ouchterlony-Test an.

Zur Beschleunigung der Diagnostik haben wir zwei Moglichkeiten gepruft: DenToxinnachweis im Anreicherungsmedium und den Toxinnachweis im Patientenserum.Aus Grunden der Empfindlichkeit eignet sich fur beide faile nur der ELISA. DerDiphtherietoxinnachweis im Anreicherungsmedium wird am Tage nach der Abstrich­entnahme durchgefiihrt, somit kann bereits am zweiten Untersuchungstag die Diagno­se bestatigt werden (Abb. 2). Obwohl wir mit dem ELISA das Toxin in einer Konzen­tration von 0,6 ng/ml nachweisen konnen, muB offen bleiben, ob in jedem Fall imAnreicherungsmedium eines Diphtherieabstriches diese Menge Toxin gebildet wird.Uns standen lediglich 4 positive Proben von 3 Keimtragern zur Verfiigung und nur ineinem Fall gelang der Toxinnachweis. Die 3 Abstriche der iibrigen 2 Probanden warenin Fosfomycin-freies Anreicherungsmedium gebracht worden. In diesen Proben wuchsdeshalb neben toxinogenen Diphtheriebakterien auch Staphylococcus aureus. DieserKeirn aber reduziert das nachweisbare Toxin in der Kultur, wie wir bei zusatzlichenUntersuchungen feststellen konnten. Der Mechanismus ist bisher nicht geklart. Koagu­lase-negative Staphylokokken sind ohne EinfluB

Da bei Diphtherie-Keimtragern Corynebakterien wahrscheinlich nur in geringerKeimzahl vorhanden sind und sich dennoch Toxin in der Primarkultur nach Inkuba­tion iiber Nacht nachweisen lieB, muB dies bei manifest Erkankten noch viel sicherergelingen.

Der Toxinnachweis direkt im Serum ermoglicht eine sehr fruhzeitige Diagnose. ErsteVersuche, Diphtherietoxin in menschlichen Seren zu bestimmen, wurden vor beinahe40 Jahren unternommen. Wildfiihr (16) z. B. konnte auf diese Weise im Tierversuch bei15 von 40 mittelschwer und schwer Erkrankten Toxin nachweisen. 1966 wurde iibereine immunologische Serumtoxinspiegel-Messung mit der passiven Haemagglutinationberichtet (3).

In der gegenwartigen epidemiologischen Situation konnten wir keine Seren vonErkrankten gewinnen. Die Empfindlichkeit des ELISA wurde jedoch durch Toxinbei­mengung zu menschlichem Serum bestimmt und lag bei 0,9 ng/m!. Die von Wildfiihrmit dem Tierversuch im Serum von Diphtheriekranken gemessenen Toxinkonzentra­tionen liegen zwischen 0,1 bis 0,3 ng/ml (untere Nachweisgrenze) und 15 ng/m!. SomitmiiBte auch mit unserem ELISA in vielen Fallen Toxin nachweisbar sein. Da die inunserer Studie durchgefiihrten Untersuchungen am Kaninchen und die Ergebnisse an­derer Autoren (2, 11) auf eine lange Serumhalbwertszeit des Diphtherietoxins (6 Std.)hindeuten und Wildfiihr auch beim Menschen Toxin bis zu vier Wochen nach Erkran­kungsbeginn nachweisen konnte (17), sollte die mikrobiologische Diagnose se1bst nachantibiotischer Anbehandlung noch gelingen.

Durch vergleichende Messungen in der Gewebekultur konnte die Spezifitat des imELISA nachgewiesenen Serum-Diphtherietoxins gesichert werden.

Das diagnostische Vorgehen bei Verdacht auf Diphtherieerkrankung unter Einbezie­hung der hier vorgestellten neuen Methoden ist in Abb. 2 dargestellt und basiert aufden Empfehlungen von Naumann u. Mitarb. (12). Eine gute mikrobiologische Diagno-

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stik kann nur an optimalem Probenmaterial durchgefuhrt werden. Fur die Diphtherilbedeutet dies die Abnahme von Rachen- und Nasenabstrichen in jedem Verdachtsfalvar Beginn der antibiotischen Therapie und die gleichzeitige Entnahme einer Serumprobe zur Feststellung vorbestehender antitoxischer Antik6rper (Immunitiit) sowilzum Toxinnachweis. Erste Ergebnisse k6nnen somit noch am gleichen Tag erwartewerden und eine Entscheidungshilfe fur die Verabreichung von antitoxischem Serunbieten. Spatestens am vierten bis funften Tag kann eine Diphtherie sicher ausgeschlossen werden. '.

Die in dieser Studie erarbeiteten Ergebnisse zeigen, daB ein Nachweis von Diphtherietoxin in Kulturen und klinischem Material mit immunologischen Methoden m6gliclist. Ihre Brauchbarkeit zur routinemaRigen Diagnostik muRte in Entwicklungslanderrmit hoherer Diphtherieinzidenz untersucht werden. Zudem stellen diese Verfahren eirModell fiir den Nachweis von Toxinen und Stoffwechselprodukten anderer Bakterienspezies dar.

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Immunologische Methoden zum Nachweis von Diphtherie-Toxin 135

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Dr. med. T. Krech, Institut fur Medizinische Mikrobiologie und Virologie der Universitiit,Moorenstr. 5, D-4000 Dusseldorf 1