Immunzytologie bei Patienten mit Klinisch Isoliertem Syndrom · Aus der Klinik fur Neurologie...

Aus der Klinik fur Neurologie

Direktor: Prof. Dr. Dr.h.c. Wolfgang H. Oertel

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universitat Marburg

in Zusammenarbeit mit dem

Universitatsklinikum Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg

Arbeitsgruppe Klinische Neuroimmunologie

Leiter: PD Dr. Bjorn Tackenberg

Immunzytologie bei Patienten mitKlinisch isoliertem Syndrom verdachtig auf

Multiple Sklerose

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der

gesamten Medizin

Dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universitat Marburg vorgelegt von

Johannes Till Elzer

aus Frankfurt am Main

Marburg 2012

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universitat Marburg

am: 22.02.2012

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs.

Dekan: Prof. Dr. Matthias Rothmund

Referent: PD Dr. Bjorn Tackenberg

Koreferent: Prof. Dr. Dr. Heverhagen

Inhaltsverzeichnis

Stichwortverzeichnis vii

Abbildungsverzeichnis viii

Tabellenverzeichnis ix

Abkurzungsverzeichnis x

1. Einleitung 1

1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose . . . . . . . . . 1

1.1.1. Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.2. Verlauf und Prognose der MS . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.3. Das klinisch isolierte Syndrom . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2. Apparative Diagnostik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.1. Magnetresonanztomografie . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.2.2. Liquoranalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.3. Immunpathogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3.1. Pathologie der MS-Lasion . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3.2. Die zellulare Immunantwort bei Multipler Sklerose . . . . 10

1.3.3. Immunhomoostase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.4. Ableitung der Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2. Material und Methoden 25

2.1. Patienten und Probanden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.2. Skalen, Definitionen und Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.2.1. Expanded Disability Status Scale Score (EDSS) . . . . . . 27

2.2.2. Die Diagnosekriterien nach McDonald . . . . . . . . . . . 27

2.2.3. Gerate und Verbrauchsmaterialien . . . . . . . . . . . . . 28

2.3. Probenasservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3.1. Gewinnung von mononuklearen Zellen aus peripher-ve-

nosem Blut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.3.2. Kryoasservierung von PBMCs . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.3. Kryoasservierung von Liquor . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.4. Durchflusszytometrie (FACS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.4.1. Farbung von peripherem Blut . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.4.2. Farbung von Liquor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

v

Inhaltsverzeichnis vi

2.4.3. Auswertung im FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2.5. Magnetresonanztomografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.6. Biostatistische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3. Ergebnisse 39

3.1. Patientenkollektiv . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

3.2. Farbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high) . . . . . . . . . . . 41

3.3. Farbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28) . . . . . . . . . . . . . . 46

3.4. Farbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138) . . . . . . . . . . . . . 49

3.5. Farbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L) . . . . . . . 53

3.6. Farbung V: Monozyten (CD14, CD16) . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4. Diskussion 59

4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik . . . . . . . . . . 59

4.2. Diskussion der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.2.1. Reduzierte Haufigkeit der TREG bei Patienten mit CIS . 63

4.2.2. Reduzierte MFI fur VLA-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.2.3. Rezeptorverlust und Defekte in Adhasionsmolekulen . . . 68

4.2.4. Assoziation der TREG mit der Krankheitsaktivitat . . . . 71

4.2.5. Keine quantitativen Unterschiede fur CD28 . . . . . . . . 74

4.2.6. Erhohter Anteil von B-Zellen im CSF bei Patienten . . . 75

4.2.7. Assoziation von Plasmazellen mit dem Lasionsvolumen . . 78

4.2.8. Keine quantitativen Unterschiede fur Thymusemigranten 79

4.2.9. Quantitative Unterschiede fur Monozyten bei CIS . . . . 81

4.3. Vorschlage fur weitergehende Forschungsanstrengung . . . . . . . 82

4.4. Kritische Wurdigung und Grenzen der Studie . . . . . . . . . . . 85

5. Zusammenfassung/Summary 87

A. Anhang 91

Literatur 99

Curriculum Vitae (entfernt) 118

Verzeichnis der akademischen Lehrer 119

Danksagung 120

Ehrenwortliche Erklarung (entfernt) 122

Stichwortverzeichnis

Clinical isolated syndrome (CIS, klinisch isoliertes Syndrom)

EDSS

Immunhomoostase

Lasionslast im kranialen MRT

Liquorzytologie

Multiple Sklerose

Receiver-Operator-Characteristics (ROC)

Regulatorische T-Zellen (T-REG, CD25)

Very late antigen (VLA-4)

vii

Abbildungsverzeichnis

1.1. Verlaufsformen der MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2. CIS und Konversion zu MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.3. T-Zellrezeptor und CD28/B7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.1. Fuchs-Rosenthal Zahlkammer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.2. FACS: Hydrodynamische Fokussierung . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3. FACS: Vollblutprobe im FSC/SSC Dotplot . . . . . . . . . . . . 31

2.4. FACS: Identifikation von CD25high TREG . . . . . . . . . . . . . 33

2.5. FACS: Berechnung des Quotienten QPBL:CSF . . . . . . . . . . . 34

2.6. Ubersicht der Farbungen im FACS . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.7. MS-Lasionen in verschiedenen MRT-Wichtungen . . . . . . . . . 36

3.1. Vergleich der Quotienten fur CD25high im Boxplot . . . . . . . . 42

3.2. Korrelations- und ROC-Analyse fur TREG . . . . . . . . . . . . 44

3.3. MFI fur VLA-4 (PBL) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.4. MFI fur VLA-4 (CSF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.5. Vergleich der Quotienten fur CD28+ im Boxplot . . . . . . . . . 48

3.6. Vergleich der Quotienten fur CD19+ im Boxplot . . . . . . . . . 49

3.7. Korrelations- und ROC-Analyse fur CD19 . . . . . . . . . . . . . 52

3.8. Vergleich der Quotienten fur CD45 im Boxplot . . . . . . . . . . 53

3.9. Vergleich der Quotienten fur CD14+/CD16+ im Boxplot . . . . 55

3.10. Korrelations- und ROC-Analyse fur CD14 . . . . . . . . . . . . . 57

A.1. EDSS-Dokumentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

viii

Tabellenverzeichnis

1.1. Studien zur prognostischen Wertigkeit des cMRT . . . . . . . . . 7

2.1. Antikorperpanels und untersuchte Zellpopulationen . . . . . . . . 30

3.1. Patientencharakteristik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.2. Patientencharakteristik – Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.3. Deskriptive Statistik Farbung I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.4. Ergebnisse Farbung I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.5. Ergebnisse VLA-4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.6. Deskriptive Statistik Farbung II . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.7. Ergebnisse Farbung II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.8. Deskriptive Statistik Farbung III . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.9. Ergebnisse Farbung III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.10. Deskriptive Statistik Farbung IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.11. Ergebnisse Farbung IV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.12. Deskriptive Statistik Farbung V . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.13. Ergebnisse Farbung V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1. Vergleich des Studienkollektivs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.2. Studienvergleich fur CD25 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.3. Migrationspfade der Lymphozyten ins ZNS . . . . . . . . . . . . 70

4.4. Subpopulationen humaner regulatorischer T-Zellen . . . . . . . . 84

A.1. Expanded Disability Status Scale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

A.2. Diagnosekriterien nach McDonald . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

A.3. Verwendetes Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

ix

Abkurzungsverzeichnis

AK Antikorper

AG Antigen

APC antigenprasentierende Zelle

AUC area under curve, Flache unter der Kurve

BCSFS Blut-CSF-Scharanke

BHS Blut-Hirn-Schranke

ax. axial

CAM cellular adhesion molecule, Adhasionsmolekul

CDMS klinisch definitive MS

CI Konfidenzintervall

CIS clinical isolated syndrome, klinisch isoliertes Syndrom

CSF cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis

Cut Cut-off, Grenzwert

EAE experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis

EDSS Expanded Eisability Status Scale

FU Follow-Up

Gd Kurzform fur Gadopentetat-Dimeglumin

Gd-DTPA Gadopentetat-Dimeglumin

HR hazard ratio, Risikoquotient

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

LHR likelihood-ratio, Likelihood-Quotient

MBP Myelin-basische Protein

x

Abkurzungsverzeichnis xi

MHC major histocompatibility complex

MS Multiple Sklerose

MW Mittelwert

NPV negativ pradiktiver Wert

NS Nicht signifikant

cMRT kraniale Magnetresonanztomografie

OKB oligoklonale Banden

PBL peripheral blood leukocytes, Leukozyten aus dem peripheren Blut

PBMCs peripheral blood momonuclear cells, Mononukleare Zellen

PD Protonendichtewichtung

PI Progressionsindex

PP-MS primar progrediente MS

PPV positiv pradiktiver Wert

ROC receiver operator characteristics

RR-MS schubformig remittierende MS

sag. saggital

SD Standarddeviation, Standardabweichung

Sens Sensitivitat

SP-MS sekundar progrediente MS

Spez Spezifitat

TCR T-Zell-Rezeptor

TREC T-cell receptor excision circle

T-REGs regulatorische T-Zellen

VLA-4 very late antigen 4

vs. versus

1. Einleitung

1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose

1.1.1. Epidemiologie

Bei der uberwiegenden Zahl der Patienten1 manifestiert sich die Multiple Skle-

rose (MS) im Alter zwischen 20 und 40 Jahren (Goodkin u. a. 1989). Jedoch ist

mittlerweile bekannt, dass auch bei weniger als 10 % die Krankheit schon im

Jugendalter und bei ca. 15 % jenseits des 40. Lebensjahres auftritt und auch

Ausbruche bis hin zur 80. Lebensdekade dokumentiert wurden (Confavreux,

Vukusic 2006; Renoux u. a. 2008). Bei diesen beiden Extrema der Altersvertei-

lung ist die Geschlechtspravalenz mit ca. 3:1 deutlich ausgepragt und in der

Altersgruppe der 20 bis 40 jahrigen in Deutschland sind Frauen etwa 2,5-mal

haufiger betroffen als Manner (Flachenecker u. a. 2008).

Die globale Verteilung der MS ist ungleich, aber nicht zufallig. Die Pravalenz-

raten schwanken zwischen 1:100 000 in Japan und 300:100 000 auf den Orkney-

Inseln (Sadovnick, Ebers 1993), Schatzungen zufolge sind weltweit mehr als

eine Millionen Menschen betroffen (Compston, Coles 2002). Hein, Hopfenmuller

(2000) fanden auch innerhalb Deutschlands unterschiedliche Pravalenzraten von

50–170 pro 100 000 Einwohner. Insgesamt sind aktuell ca. 120 000 Patienten in

der BRD betroffen (Hein, Hopfenmuller 2000).

1.1.2. Verlauf und Prognose der MS

Der Krankheitsverlauf der Multiplen Sklerose ist variabel und im Einzelfall nur

schwer vorhersagbar. Das Spektrum reicht von einem einzigen Schub (klinisch

isolierte Syndrom) bis zur rasch progredienten chronischen Erkrankung. All-

gemein anerkannt sind folgende Verlaufsformen (siehe auch Abbildung 1.1 auf

Seite 2, nach Lublin, Reingold 1996):

1Aufgrund der besseren Lesbarkeit wird im Folgenden durchgangig die maskuline Form ver-

wendent, beide Geschlechter sind jedoch gemeint

1

1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose 2

� Schubformiger Verlauf (RRMS), klare Schube mit vollstandiger Re-

mission oder Residuen, keine Progression im Intervall

� Sekundar chronischer Verlauf (SP-MS), initial schubformig, dann

progressive Verschlechterung

� Primar chronischer Verlauf (PP-MS), progrediente Verschlechterung

von Beginn an mit Plateaus oder Verbesserungen

Uber 90 % der Patienten prasentieren sich

Abbildung 1.1.:

Verlaufsformen der MS, oben:

schubformiger Verlauf, mitte: se-

kundar chronischer Verlauf, un-

ten: primar chronischer Verlauf.

Abbildung: eigene Grafik, modifi-

ziert nach Lublin, Reingold (1996)

initial mit dem schubformigen Typ, nur ca.

10 % nehmen einen primar chronischen Ver-

lauf (Thompson u. a. 1997). Allerdings geht

ein Großteil der RRMS-Patienten in sekundare

Formen uber und nach durchschnittlich 10–

15 Jahren betragt der Anteil der SP-MS Pa-

tienten 30–40 %. Nach 20 Jahren Krankheits-

dauer sind bis zu 90 % der RRMS Patien-

ten korperlich behindert (Trojano u. a. 2003).

Scalfari u. a. (2010) fanden mediane Schub-

raten von 0,93 pro Jahr in einer großen ge-

mischten Patientenpopulation unter Thera-

pie. Haufige und prolongierte Schube mit in-

kompletter Remission sowie kurze Intervalle

zwischen erstem und zweitem Schub in den

ersten zwei Jahren waren im Hinblick auf spa-

tere Behinderung prognostisch ungunstig (Scal-

fari u. a. 2010). Der EDSS als Goldstandard

der validen Beschreibung eines neurologischen

Defizits weist eine bimodale Haufigkeitsver-

teilung auf: Es finden sich Maxima bei EDSS 1–1,5 und 6–6,5. Nach einer

mittleren Krankheitsdauer von ca. 13 Jahren sind noch etwa 70 % der Pati-

enten uneingeschrankt gehfahig (EDSS ≤ 4,0) und nur 3 % schwer behindert

(Flachenecker u. a. 2008). Eine Studie von Pittock u. a. (2004) an 161 Patienten

konnte eine Progression des EDSS um ca. einen Punkt uber zehn Jahre feststel-

len, die Mehrzahl blieb also stabil. 30 % der Patienten waren nach einer Dekade

auf Hilfsmittel angewiesen. 14 % der Patienten starben im Beobachtungszeit-

raum (Pittock u. a. 2004).

1.1. Epidemiologie und Verlauf der Multiplen Sklerose 3

1.1.3. Das klinisch isolierte Syndrom

Der Begriff CIS (zu deutsch”klinisch isoliertes Syndrom“) ist ein Fachtermi-

nus, der das Auftreten eines ersten fokal-neurologischen Defizits beschreibt und

verdachtig fur die Entwicklung einer Multiplen Sklerose ist. Es muss von der

Diagnose”MS“ abgegrenzt werden, denn

”nur“ 45–68 % der Patienten entwi-

ckeln in einem Zwei Jahres-Zeitraum nach Diagnosestellung des CIS eine kli-

nisch definitive MS (CDMS) nach Poser (Poser u. a. 1983; Kappos u. a. 2006).

Bei Anwendung der MRT-gestutzen McDonald-Kriterien bis zu 85 %. im Jahre

2001 wurden die Poser- von den McDonald-Kriterien abgelost, der Begriff der

CDMS nach Poser wird jedoch international noch verwendet und beschreibt

das Auftreten von zwei zeitlich getrennten, klinisch fassbaren Schuben oder das

Auftreten von einem klinischen Schub und eine weitere, paraklinische Evidenz.

Retrospektiv weisen 85 % der MS-Patienten eingangs ein akut oder subakutes

neurologisches Ereignis auf, das auf eine einzelne Lasion der weißen Substanz

zuruckzufuhren ist (Kappos u. a. 2006). Multifokalitat, hohe Schubrate, Affek-

tion des efferenten Systems und schnelle EDSS-Progression gehen mit einer

schlechteren Prognose einher (Comi u. a. 2001; Eriksson u. a. 2003; Weinshen-

ker u. a. 1989).

Anhand paraklinischer Befunde wie MRT

Abbildung 1.2.:

CIS und Konversion zu MS.

30–70 % der Patienten mit CIS ent-

wickeln eine MS, wahrend retro-

spektiv ca. 85 % der MS-Patienten

ein CIS in der Vorgeschichte hat-

ten. Abbildung: eigene Grafik

oder Liquoranalyse kann das Risiko fur den

Ubergang in eine MS abgeschatzt werden. Der

positiv pradiktive Wert fur die Entwicklung

einer CDMS ist fur das MRT mit 53 % am

hochsten, gefolgt von oligoklonalen Banden

(OKB) im Liquor mit 44 % und evozierten

Potentialen mit 26–50 % (Filippini u. a. 1994).

Weitere Pradiktoren scheinen u. a. die Geno-

typen HLA-DR2 oder DRB1∗15 zu sein (Bar-

cellos u. a. 2006). Etwa zwei Drittel der Pa-

tienten mit CIS prasentieren sich initial mit

oligoklonalen Banden im Liquor, diese stellen

dabei einen Risikofaktor fur die Entwicklung einer MS dar (Rojas u. a. 2010).

Eine neuere Studie konnte allerdings zeigen, dass die Abwesenheit oligoklonaler

Banden allein keinen benigneren Krankheitsverlauf bedeutet (Siritho, Freed-

man 2009). Zur prognostischen Wertigkeit des MRT siehe Abschnitt 1.2.1 auf

Seite 4.

1.2. Apparative Diagnostik 4

Die Diagnose des CIS/MS wird anhand klinischer, radiologischer und la-

borchemischer Kriterien gestellt. Es gelten die zweimal revidierten McDonald-

Kriterien nach Polman. Wesentliche Neuerungen umfassen dabei u. a. die Er-

fullung des Kriteriums der zeitlichen Dissemination im cMRT. Dieses ist gege-

ben bei Nachweis einer neuen Gadolinium-speichernden oder T2-hyperintensen

Lasion in einem Follow-Up MRT oder beim gleichzeitigen Vorliegen von asym-

ptomatischen Gadolinium-speichernden und nicht-speichernden Lasionen zu ei-

nem beliebigen Zeitpunkt (McDonald u. a. 2001; Polman u. a. 2011). Sensitivitat

und Spezifitat der McDonald-Kriterien im 1-Jahres Follow-Up fur die Voraus-

sage eine MS nach drei oder mehr Jahren nach CIS zu entwickeln, lag in ver-

schiedenen Studien bei 74 bis 86 % (Dalton u. a. 2002; Tintore u. a. 2003).

Viele Patienten erholen sich nach einem CIS bis zur Rekonvaleszenz. Im Optic

Neuritis Treatment Trial (ONTT) konnte fur das bestuntersuchte CIS, die Opti-

kusneuritis, eine dreitagige i.v. Prednisolontherapie gefolgt von einer elftagigen

oralen Steroidtherapie fur eine schnellstmogliche Besserung des Visus ermittelt

werden (Beck u. a. 1993). Eine langfristige Prognoseverbesserung konnte jedoch

nicht nachgewiesen werden (Beck, Cleary 1993). In besonders schweren Fallen,

vor allem bei Patienten mit hochgradiger Beeintrachtigung durch einzelne stra-

tegische Lasionen (im Gegensatz zu erworbener Behinderung durch kumulative

Lasionslast) oder Versagen der Therapie mit Steroiden muß eine Plasmapherese

in Erwagung gezogen werden (Ruprecht u. a. 2004).

1.2. Apparative Diagnostik

1.2.1. Magnetresonanztomografie

Das bildgebende Verfahren der Wahl zum Nachweis der Dissemination im Raum

ist die Magnetresonanztomografie. Sie ist das sensitivste Verfahren fur die De-

tektion demyelinisierender Lasionen im ZNS (Fazekas u. a. 1999).

Hohe T2- und PD-gewichtete Signalintensitat charakterisieren die akute sowie

die chronische MS-Lasion. Topografisch werden als Pradilektionsstellen subkor-

tikale, kortikale, juxtakortikale und periventrikulare Lasionen unterschieden.

Diese Einteilung findet sich in den sog. Barkhof-Kriterien (Barkhof u. a. 1997)

und ihrer modifizierten Version nach Tintore (Tintore u. a. 2003), die Eingang

in die diagnostischen Kriterien nach McDonald gefunden haben. Morphologisch

erscheint die MS Lasion in ihrem Signalverhalten meist homogen, sie weist

eine runde oder ovale Form auf. Abweichungen von Form oder Homogenitat


konnen auf das Uberlappen mehrerer Lasionen zuruckzufuhren sein, was u. U.

die Identifikation und numerische Bestimmung erschweren kann. Im akuten Sta-

dium konnen die Lasionen auch von einem weniger signalintensiven Ring aus

Entzundungszellen und perifokalem Odem umgeben sein (Fazekas u. a. 1999).

Durch die Applikation des paramagnetischen Kontrastmittels Gadopentetat-

Dimeglumin (Gd) kann das MR-Signal verstarkt werden. Beinahe alle neu en-

standenen Lasionen speichern initial Kontrastmittel, das pathologische Korre-

lat dazu ist eine fruhe Storung der Blut-Hirn-Schranke (Tortorella u. a. 1999).

Einige Studien untersuchten die prognostische Wertigkeit der Gd-speichernden

Lasionen in Bezug auf Schubrate und Schwere der konsekutiven Schube und fan-

den allenfalls eine schwache Korrelation (Albert u. a. 1994; Kappos u. a. 1999).

Wahrend Daten existieren, die eine moderate Korrelation mit dem Grad der

Behinderung im kurzfristigen Krankheitsverlauf suggerieren (Losseff u. a. 2001),

konnte eine andere Studie diese Ergebnisse, gemessen an der kumulativen Gd-

speichernden Lasionslast und dem Behinderungsgrad nach acht Jahren fur den

Langzeitverlauf nicht bestatigen (Frank u. a. 1994).

Die prognostische Wertigkeit des cMRT

Als Resultat der hohen Sensitivitat fur die Detektion entzundlicher Lasionen

(s. o.) ist das MRT fur Diagnosestellung und als prognostischer Marker in der

initialen Krankheitsphase unverzichtbar. Sowohl als Pradiktor in Bezug auf

Haufigkeit und Schwere konsekutiver Schube als auch fur den spateren Grad

der Behinderung werden magnetresonanztomografische Befunde eingesetzt (Br-

ex u. a. 2002; Kappos u. a. 2006; Tintore u. a. 2003).

Fruhe Studien fanden in T2-gewichteten cMRT bei CIS eine Pravalenz ent-

zundlicher Lasionen von 50–70 % (Ormerod u. a. 1987). Das Risiko fur einen

zweiten Schub ist hoher beim Vorliegen einer abnormen MRT (Morrissey u. a.

1993; Minneboo u. a. 2004). Brex u. a. (2002) fanden im Jahre 2002, dass die

Konversionsraten in eine CDMS nach Poser bei Patienten mit CIS und Optikus-

neuritis bei initial unauffalligem MRT nach 5, 10 und 14 Jahren 6, 11 und 19 %

betrugen. Beim Vorliegen kernspintomografischer Lasionen entwickelten bis zu

72, 83 und 88 % einen zweiten Schub im gleichen Beobachtungszeitraum (Brex

u. a. 2002). Bei Beobachtung desselben Patientenkollektivs uber insgesamt 20

Jahre lag die Konversionsrate bei initial normalem Scan bei 21 %, bei patholo-

gischem Scan bei 82 %. Unter diesen behielten 39 % einen”benignen Verlauf“

bei (EDSS< 3,0), 42 % entwickelten eine SP-MS (Fisniku u. a. 2008).


Die Auswertung der Daten der BENEFIT Studie an 468 Patienten mit CIS

zeigte, dass die Barkhof-Kriterien neun T2 gewichtete Lasionen (HR = 1,64)

und drei periventrikulare Lasionen (HR = 1,66) die starksten Pradiktoren fur

die Konversion zu MS sind, ungeachtet der erhaltenen Therapie (Interferone

vs. Placebo). Ein Follow-Up MRT nach neun Monaten zur Evaluierung der

Dissemination in Zeit bei Patienten ohne CDMS war im Vergleich zu Scans in

kurzeren Intervallen nach Diagnosestellung am Starksten mit einer Konversion

zu CDMS nach Poser assoziiert (Moraal u. a. 2009).

Jungere Auswertungen der Daten des Optic Neuritis Treatment Trial (ONTT)

konnten fur eines der haufigsten CIS, der Optikusneuritis (ON), ein kumulatives

Risiko von 50 % fur die Entwicklung einer MS in den ersten 15 Jahren nach ON

zeigen. Dabei waren Patienten mit mindestens einer Lasion im initialen cMRT

einem vielfach hoheren Risiko ausgesetzt als Patienten ohne sichtbare Lasionen

(25 % vs. 72 %) (ONTT 2008).

Rojas u. a. (2010) fanden in einer Kohorte von 40 Patienten mit CIS ein

signifikant erhohtes Risiko fur die Konversion zu definitiver MS nach Poser

in Abhangigkeit vom Liquor- und MRT Befund. Im Vergleich zu Patienten

ohne oder mit nur einem Risikofaktor stellt das Vorliegen positiver OKBs und

abnormer Baseline-MRT in Kombination ein signifikant erhohtes Risiko dar

(RR = 9,1). Die Zeitspanne bis zur Konversion betrug ca. sieben Monate fur

Patienten mit OKB und abnormem Scan und 19 Monate fur Patienten mit nur

einem Risikofaktor (Rojas u. a. 2010).

Korrelation von Lasionslast und Behinderungsgrad

Die Daten zur Korrelation von Lasionslast und Grad der Behinderung sind

nicht immer eindeutig und stark vom untersuchten Patientenkollektiv und dem

Beobachtungszeitraum abhangig. Die starkste Korrelation der Lasionslast mit

dem Behinderungsgrad liefern Longitudinalstudien uber funf Jahre. Sailer u. a.

(1999) bestimmten die Lasionslast im cMRT von 71 Patienten mit CIS zu Be-

ginn und nach einem 5- und 10-Jahres Follow-Up. Von 34 Patienten mit geringer

initialer Lasionslast (≤ 3 cm3) entwickelten 78 % eine definitive MS und 18 %

wiesen einen EDSS von sechs und mehr auf. Alle Patienten mit hoher initialer

Lasionslast entwickelten innerhalb von zehn Jahren eine CDMS und 45 % wiesen

einen EDSS von sechs oder mehr auf. Die Quantifikation der Lasionen vorallem

in den ersten funf Krankheitsjahren korrelierte signifikant mit der Zeitspanne

bis zur Entwicklung einer klinisch definitiven MS nach Poser (Sailer u. a. 1999).


Tabelle 1.1.:

Studien zur prognostischen Wertigkeit des cMRT. Dargestellt ist eine Auswahl an

Studien, die die prognostische Wertigkeit der Lasionslast im T2-gewichteten cMRT in ver-

schiedenen Beobachtungszeitraumen untersucht haben. Auffallig ist eine Heterogenitat der

Ergebnisse in Abhangigkeit des gewahlten Follow-Ups und der untersuchten Studienpo-

pulation. Es finden sich schwache bis starke Korrelationen der initialen Lasionslast mit

dem EDSS im Follow-Up. K = Korrelation, r = Korrelationskoeffizient, TLV = total lesion

volume (Lasionsvolumen), † Diesen Studien liegt dieselbe Patientenpopulation zugrunde.

Studie Patienten Ergebnis (Korrelation)

Filippi

1995

n = 281 (RR, SP, PP)

2 Jahres-FU

Schache K. neuer Lasionen mit EDSS Veranderung

im 2-Jahres FU (r = 0,13)

Schache K. vergroßernder Lasionen mit EDSS

Veranderung im 2-Jahres FU (r = 0,13)

Mammi

1996

n = 130 (RR, SP,PP) Schwache K. von TLV mit EDSS (r = 0,3)

Sailer

1999

n = 58 (CIS)

10 Jahres-FU

K. TLV mit EDSS im 10-Jahres FU (r = 0,81)

keine K. von TLV im 5-Jahres FU zum 10-Jahres FU

Filippi†1994

n = 84 (CIS)

5 Jahres-FU

K. TLV mit EDSS nach 5 Jahren

K. TLV mit Zunahme der TLV nach 5 Jahren

Brex†2001

n = 79 (CIS)

14 Jahres-FU

K. TLV nach 5 Jahren mit EDSS nach 14 Jahren

(r = 0,60)

K. Zunahme des TLV uber 5 Jahre mit EDSS nach

14 Jahren

Fisniku†2008

n = 107 (CIS)

20 Jahres-FU

K. TLV mit EDSS nach 20 Jahren (r = 0,48–0,67)

K. Zunahme des TLV uber 5 Jahre mit EDSS nach

20 Jahren

Sormani†2009

n = 107 (RR, SP)

1 Jahre-FU

K. TLV mit EDSS bei Baseline (r = 0,39)

kein K. des TLV bei Baseline mit EDSS nach 1 Jahr

Zu ahnlichem Ergebnis gelangte eine fruhere Studie, im Rahmen derer 84

Patienten mit CIS uber funf Jahre kernspintomografisch untersucht wurden.

Obwohl nur 40 % der Patienten eine definitive MS entwickelten, war die kra-

niale Lasionslast bei dieser Subgruppe signifikant hoher als bei Patienten ohne

zweiten Schub. Weiterhin fanden die Autoren eine Korrelation der initialen

Lasionslast mit dem Zuwachs an Lasionen, sowie dem Grad der klinischen Be-

eintrachtigung im Follow-Up (Filippi u. a. 1994). Am gleichen Patientenkollek-

tiv fuhrten Brex u. a. (2002) das Follow-Up nach 14 Jahren bei 79 Patienten

und Fisniku u. a. (2008) nach 20 Jahren durch. Es wurde eine zwar schwache,

jedoch signifikante Korrelation der Lasionslast nach funf Jahren und der Zunah-


me der Lasionslast in den ersten funf Jahren mit dem Grad der Behinderung

beim 14-Jahres-Follow-Up gefunden (Brex u. a. 2002) und im Langzeit-Follow-

Up bestatigt (Fisniku u. a. 2008).

Fur eine tabellarische Zusammenfassung relevanter Studien siehe Tabelle 1.1

auf Seite 7.

1.2.2. Liquoranalyse

In Deutschland wird i. d. R. eine einzelne Liquoruntersuchung wird zur Beginn

des diagnostischen Prozesses durchgefuhrt, serielle Untersuchungen sind nicht

vorgesehen. Sie dient der Abgrenzung zu anderen, infektiosen Erkrankungen wie

z. B. der Borreliose oder Lues und sollte Zytologie, Albumin- sowie IgG-, IgA-

und IgM-Bestimmungen nach dem Quotienten-Schema (Reiber-Felgenhauer-

Diagramm), den Nachweis oligoklonaler IgG- und IgM-Banden im Liquor und

ggf. Antikorper-Synthese-Indizes fur neurotrope Viren (Masern, Roteln, Zoster;

sog. MRZ-Reaktion) umfassen (Leitlinien der DGN 2008, http://www.dgn.

org/images/stries/dgn/leitlinien/LL2008/ll08kap_034.pdf). Charakte-

ristisch ist eine leichte lymphozytare Pleozytose (R. Schmidt 1983). Eine intrat-

hekale IgG-Synthese liegt bei uber 90 % vor, in ca. einem Drittel der Falle wird

sie von einer IgM-Synthese begleitet (Pohl u. a. 2004). Als sensitivste Metho-

de der Wahl zur Detektion von OKB bietet sich in der Klinik die isoelektrische

Fokussierung (IEF) an, mit der bei ca. 95 % aller Patienten unspezifisches oligo-

klonales IgG im Sinne einer humoralen Entzundung nachgewiesen werden kann

(Andersson u. a. 1994).

Die Beteiligung des zellularen Immunsystems am Fortschritt der Entzundung

im Krankheitsverlauf gab Anlaß zur Hoffnung, mit seriellen Subgruppenanaly-

sen z. B. im FACS das Krankheitsstadium und den Erkrankungstyp definieren

zu konnen. Besonderes Interesse, sozusagen als Bruckenschlag zwischen klinisch

verwertbarer Diagnostik und pathogenetischer”Grundlagenforschung“, erlang-

ten Studien, die liquorzytologische Befunddifferenzen mit pathogenetischer He-

terogenitat zu erklaren versuchten. Cepok u. a. (2001) fanden z. B., dass das

Verhaltnis von B-Zellen zu Monozyten im Liquor bei bestimmten Patienten in-

traindividuell stabil bleibt. Es korrelierte mit der Krankheitsprogression, aber

nicht mit Beeintrachtigung gemessen am EDSS. Die Autoren stellten die Theo-

rie auf, dass diese Heterogenitat im Liquor einzelner Patienten das pathologische

Korrelat auf histologischer Ebene wiederspiegele (Cepok u. a. 2001). Studien zu

diesem Thema mit Schwerpunkt auf dem CIS finden sich leider im Vergleich zu

Publikationen zur definitiven MS nur sehr sparlich.

http://www.dgn.org/images/stries/dgn/leitlinien/LL2008/ll08kap_034.pdf

http://www.dgn.org/images/stries/dgn/leitlinien/LL2008/ll08kap_034.pdf

1.3. Immunpathogenese 9

1.3. Immunpathogenese

Das gegenwartige Verstandnis von Pathogenese und Immunreaktion bei MS ist

im Laufe der Jahre hauptsachlich aus Tierversuchen heraus entstanden. Myel-

inspezifische T-Zellen werden außerhalb des ZNS aktiviert und beginnen mit

der Aufregulation von Adhasionsmolekulen und Chemokinrezeptoren um zur

Adhasion,”rolling“ und schließlich Migration durch das Endothel befahigt zu

werden (Engelhardt, Ransohoff 2005). Im perivaskularen Raum werden auto-

reaktive T-Zellen von lokalen antigenprasentierenden Zellen, wie z. B. dendriti-

schen Zellen, re-aktiviert und wandern ins ZNS Parenchym ein. Von T-Zellen

und Mikroglia sezernierte proinflammatorische Zytokine fuhren zu einer weiter-

gehenden Rekrutierung inflammatorischer Zellen und konsekutiver Zerstorung

des Myelins (Greter u. a. 2005).

1.3.1. Pathologie der MS-Lasion

Die MS ist eine Autoimmunerkrankung, bei der autoreaktive T-Zellen einen

Entzundungsprozess gegen Myelinbestandteile des ZNS induzieren (Fletcher

u. a. 2010). Das histopathologische Korrelat dieser im gesamten ZNS zu fin-

denden Entzundung sind fokale, scharf begrenzte Entmarkungsherde mit astro-

zytarer Gliose und variabler Axondestruktion (McFarland 1999).

Postmortem-Studien an Lasionen in einem fruhen Stadium zeigten apopto-

tische Oligodendrozyten ohne Makrophageninfiltration, strukturellem Myelin-

schaden oder parenchymalen T-Zellen im Infiltrat. Signifikante Makrophagen-

und T-Zellrekrutierung als amplifizierende systemische Entzundungsreaktion

wurde erst bei demyelinisiertem, postphagozytotischem Gewebe beobachtet (Bar-

nett u. a. 2009b). T-Zellen werden entweder durch Selbst-Antigen aus dem

Oligodendrozyten/Myelin-Komplex oder durch Fremdantigen aktiviert und fuh-

ren zu axonaler und neuronaler Degeneration im Bereich demyelinisierender

Lasionen (Barnett, Sutton 2006). Ihr Ausmaß korreliert mit dem Grad der Be-

hinderung (Frischer u. a. 2009).

Aus dem Tiermodell der MS, der EAE, ergaben sich Hinweise, dass neben der

entzundlichen Komponente noch weitere, amplifizierende Faktoren vorhanden

sein mussen um zum typischen Bild der konfluierenden MS-Lasion zu fuhren.

Schon fruh wurde die Rolle gegen Epitope auf der Oberflache von Myelinschei-

den gerichteter demyelinisierender Antikorper erkannt. Eine Studie von 2003

zeigte, dass anti-Myelin AK (vorallem anti-MOG und anti-MBP) bei Patienten


mit CIS einen prognostischen Faktor fur kurze Intervalle zwischen einzelnen

Schuben darstellt (Berger u. a. 2003). Eine ahnlich aufgebaute, doppelblinde

Studie vier Jahre spater konnte dieses Ergebnis allerdings nicht reproduzieren

(Kuhle u. a. 2007). Eine Analyse der Reaktivitat gegen MOG stratifiziert nach

dem klinischen Subtyp zeigte eine starkere Reaktion bei CIS und RR-MS als

bei gesunden Kontrollen (Lalive u. a. 2006). Diese Ergebnisse sprechen dafur,

dass anti-MOG AK fruhe Krankheitsstadien mit Immunantwort gegen intaktes

Myelin reprasentieren.

Histopathologische Studien konnten im Wesentlichen vier Entmarkungsty-

pen in Lasionen bei der MS identifizieren (Lucchinetti u. a. 1996; Lucchinetti

u. a. 2000). Neben einem durch T-Lymphozyten gepragten Bild, welches alle

Lasionstypen aufwiesen, konnten folgende Muster der Myelindestruktion iden-

tifiziert werden:

� (I) Makrophagen-assoziiert

� (II) Makrophagen assoziiert mit Antikorpern und Komplement

� (III) Distale Oligodendrogliopathie und Apoptose

� (IV) Primare Oligodendrozyendegeneration

Ergebnisse jungerer Studien fuhrten dazu, den Erklarungsansatz einer heteroge-

nen histopathologischen Atiologie zusehends in Frage zu stellen (Breij u. a. 2008;

Barnett u. a. 2009b). So scheint z. B. Probenentnahme aus aktiven Lasionen

zu spezifischen Zeitpunkten und die haufige Ubereinanderlagerung aktiver und

chronischer Lasionen im Biopsat eine wahrscheinlichere Erklarung pathogene-

tischer Heterogenitat zu sein anstatt das Vorhandensein einer quadritomen hi-

stopathologische Entitat (Barnett u. a. 2009a).

1.3.2. Die zellulare Immunantwort bei Multipler Sklerose

T-Zell Rezeptor und Aktivierung von T-Zellen mittels CD28

T-Zellen erkennen mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TCR) ein antigenes Peptid, wel-

ches ihnen im Kontext von HLA-Molekulen von Makrophagen, dendritischen

Zellen und Mikrogliazellen in immunogener Form prasentiert wird. Im Ge-

gensatz zu B-Zellen sind sie nicht in der Lage, ein losliches Antigen zu er-

kennen (Aloisi u. a. 2000). Der Aktivierungsprozess einer naiven, d. h. noch

nicht Ag-erfahrenen T-Zelle erfordert neben dem direkten Kontakt uber den


Abbildung 1.3.:

T-Zellrezeptor und CD28/B7. Links: Die Liganden fur CD28, z. B. B7, werden auf

speziellen APC exprimiert. rechts: Aktivierung der T-Zelle durch den CD3/MHC Komplex

sowie durch den 2. Signalweg mit CD28/B7 fuhrt zu einer intrazellularen Signalkaskade,

die in Zytokinsezernierung und Proliferationsmetabolismus resultiert. Abb.: Eigene Grafik,

modifiziert nach Janeway (2008).

TCR zusatzliche ko-stimulatorische Signale. Die erste Signalkaskade ist anti-

genabhangig und wird uber den TCR und peptidgebundenes MHC initiiert.

Der zweite Signalweg wird uber Proteinkomplexe, z. B. uber die Interaktion

von auf T-Zellen exprimierten CD28/CTLA-4 Molekulen mit Proteinen der

B7-Familie auf APC vermittelt (Bhatia u. a. 2005). Dieser”co-stimulatory pa-

thway“ ist notig zur Produktion von Interleukinen, Rezeptoren wie dem IL-2

Rezeptor (CD25, s. u.) und Zellproliferation. Der alleinige Kontakt des TCR

mit an MHC-Molekulen gebundenen Proteinen allein ist fur die Effektorfunk-

tion aktivierter T-Zellen ausreichend, allerdings induziert er Inaktivitat und

kann zu Anergie oder programmiertem Zelltod fuhren. Man geht davon aus,

dass Anergie ein wichtiger Faktor fur Immuntoleranz ist und entscheidend dazu

beitragt, die Aktivierung autoreaktiver T-Zellen in der Peripherie zu verhin-

dern, die nicht im Thymus negativ selektiert wurden (Lovett-Racke u. a. 1998).

Signale, die uber CD28 ins Zellinnere weitergeleitet werden, tragen durch Mo-

dulation des Zellzyklus zum Uberleben von aktivierten Zellen in vitro bei. Somit

spielt CD28 eine wichtige Rolle bei der Verstarkung der Aktivierung von Im-

munzellen (Reichert u. a. 2001; Kovalev u. a. 2001), siehe auch Abbildung 1.3.


Bei MS wird die Beeinflussung des”co-stimulatory pathway“ mittels an

CTLA-4 gekoppelten Immunglobulin fur therapeutische Studien benutzt. CTLA-

4 blockiert die CD28-B7 Interaktion. Viglietta u. a. (2008) konnten eine re-

duzierte Proliferation von Major-basic-protien (MBP) und Interferon-γ nach

CTLA-4 Ig-Infusion nachweisen (Viglietta u. a. 2008). Daten aus Tierexperi-

menten der 1990er Jahre (z.B. Miller u. a. 1995) unterstutzen die Hypothese,

dass die ersten Schritte im Aktivierungsprozess naiver CD4+ T-Zellen durch

Deprivation des co-stimulatorischen Signals durch CD28/CD80 inhibiert wer-

den konnen (Podojil, Miller 2009). Klinisch fassbare MS-Schube gehen mit ei-

ner Aktivierung des Immunsystems, wobei die Datenlage uber die Rolle ko-

stimulatorischer Signale bei Patienten mit CIS in der Liquoranalyse schlecht

ist. Eine neuere Studie von Fransson u. a. (2009) fand signifikant hohere Antei-

le CD8+ CD28+ Zellen an allen CD8+ im Blut von Patienten mit RRMS im

Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen, unabhangig vom Krankheitsstadium

oder erhaltener Therapie. Trotzdem waren T-Zellen von Patienten in Remission

anergisch, diese konnte durch die Zugabe von anti-CD28 aufgehoben werden.

Patienten im Schub zeigten bessere Proliferationskapazitat und die Autoren

schlussfolgerten, dass Anergie bei diesen Patienten durch bislang unbekannte

Faktoren durchbrochen wurde (Fransson u. a. 2009). Widerspruchliche Daten

lieferte eine andere Studie, die sowohl vor, als auch nach i. v. Steroidtherapie

bei RRMS-Patienten keine relevanten oder signifikanten Unterschiede im pro-

zentualen Anteil der CD28+ Zellen im Blut fand (Aristimuno u. a. 2008).

Aufrechterhaltung von Immuntoleranz

Das Immunsystem ist generell tolerant gegenuber Selbst-Antigenen (Ag) und

zentrale und periphere Toleranzmechanismen wirken der Induktion von Autoim-

munitat entgegen: T-Zellen mit hoher Affinitat gegenuber Selbst-Antigen wer-

den durch klonale Deletion im Thymus eliminiert (zentrale Toleranz), wahrend

T-Zellen mit niedriger Affinitat in die Zirkulation ausgeschuttet werden. Auto-

reaktive und myelinspezifische T-Zellen sind sowohl im Blut von MS-Patienten,

sowie auch bei Gesunden vorhanden (Meinl u. a. 1993). Dies ist hinweisend auf

das Vorliegen weiterer protektiver Faktoren um Immuntoleranz beim Gesunden

aufrechterhalten. Zusatzliche Mechanismen neben klonaler Deletion im Thy-

mus, wie z. B. die aktive Suppression durch regulatorische T-Zellen (periphere

Toleranz) scheinen eine wichtige Rolle in der Pathogenese autoimmunogener

Krankheiten zu spielen (Martinez-Forero u. a. 2008).


Humane regulatorische T-Zellen (TREG) beinhalten sowohl naturliche als

auch adaptive TREG. Naturliche (n)TREG exprimieren CD25 (die α-Kette

des IL-2 Rezeptors) auf der Oberflache und den fur die regulatorische Funktion

essentiellen Transkriptionsfaktor FoxP3 (Hori, Sakaguchi 2004). Aufmerksam-

keit erlangten die T-Zellen durch ihre Funktion, Autoimmunitat durch die Ad-

aptation immunologischer Toleranz gegenuber Selbst-Antigen zu kontrollieren

(Sakaguchi u. a. 1995). Im Tierversuch mit CD4+ CD25+ depletierten Mausen

konnten schon fruh experimentell organspezifische Krankheiten induziert wer-

den (Sakaguchi u. a. 1985), umgekehrt verhinderte der Kotransfer CD4+ CD25+

und CD4+ CD25- (Responder-) Zellen die Entwicklung experimentell induzier-

ter autoimmunologischer Krankheiten (Viglietta u. a. 2004). Die bei unter steri-

len Umweltbedingungen gezuchteten Mausen gefundene CD4+ CD25+ Popula-

tion lasst sich beim Menschen daruber hinaus in eine CD25high-Population mit

gleichen Suppressorfunktionen und eine CD25med/low (Responder-)Population

unterteilen. Nach Aktivierung uber den TCR proliferieren diese Zellen nicht,

sondern inhibieren uber direkten Zell-Zell-Kontakt die Proliferation und Zy-

tokinsekretion aktivierter (HLA-II+, CD71+, CD45RA-) CD4+/CD8+ CD25-

Zellen (Baecher-Allan u. a. 2001). Neben der Phanotypisierung mit CD4 CD25high

und FoxP3 konnen weitere naturlich vorkommende TREG differenziert wer-

den. Zwei Subgruppen von CD25hi FoxP3+ Zellen werden anhand der Expres-

sion des co-stimulierenden Molekuls ICOS unterschieden. Der ICOS+ Phanotyp

sezerniert dabei TGF-β zur Suppression der T-Zell Funktion (Ito u. a. 2008).

Daruberhinaus gibt es Anhaltspunkte fur die Existenz CD25- und FoxP3- negati-

ver regulatorischer Zellen, z. b. CD4+/CD8+ HLA-G+ Lymphozyten (Feger

u. a. 2007b).

Weiterhin wird in adaptive und differenzierte TREG unterschieden. Adapti-

ve TREG beinhalten Tr1, Th3 und verschiedene CD8+ TREG und entwickeln

sich in der Peripherie unter dem Einfluss immunsuppressiver Zytokine wie IL-10

und TGF-β (Roncarolo u. a. 2006). Differenzierte nTREG entstehen im Thy-

mus, wenn CD4+ T-Zellen mit großer Affinitat fur Selbst-Ag durch positive

Selektion expandieren (Liston, Rudensky 2007). Gangige Hypothesen gehen da-

von aus, dass diese Selbst-Ag spezifischen nTREG eine dominante Rolle in der

Pravention von Autoimmunitat spielen und adaptive TREG wahrscheinlich im

Rahmen einer Immunantwort als Reaktion auf Fremdantigen wahrend einer

Infektion entstehen (Review in Lafaille, Lafaille 2009).

Erstmalig finden sich Hinweise fur eine gestorte Suppressorfunktion der TREG

bei Patienten mit MS bei Viglietta u. a. (2004). Obwohl gleiche Haufigkeiten der


TREG im Vergleich mit Gesunden gefunden wurden, konnte eine reduzierte

Zytokinsekretion (z. B. IL-10) gezeigt werden. Dabei wurden Populationen aus

verschiedenen Verhaltnissen an CD4+ CD25high / CD4+ CD25med/low Zellen mit

unterschiedlichen Konzentrationen von anti-CD3 AK als APC-unabhangiger

Stimulus beschickt. Lagen bei hohen Konzentrationen noch keine Unterschiede

in der Zytokinsekretion vor, zeigte sich in starkerer Verdunnung eine Abnahme

der sekretorischen Kapazitat der CD25high Population. Die Forscher postulier-

ten, dass qualitative Unterschiede in der Starke des durch den TCR vermittelten

Signals an Responder-Zellen nach antigener Stimulation in vivo (z.B. mikrobiell

vs. autoantigen) fur den unterschiedlichen suppressiven Effekt verantwortlich

seien. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass bei MS-Patienten die TREG in

ihrer Effektorfunktion behindert scheinen und nicht umgekehrt eine refraktare

Empfanglichkeit der Responderpopulation (CD25-) vorliegt, die selbst keine re-

gulatorische Funktion inne hat (Viglietta u. a. 2004). Weiterfuhrende Studien

fanden ebenfalls eine reduzierte Zytokinantwort der TR1-Zellen bei Patienten

mit MS (Martinez-Forero u. a. 2008) und unterstutzen die Resultate von Vi-

glietta u. a. (2004) (Venken u. a. 2008a; Frisullo u. a. 2009). Die Reduzierte Ef-

fektorfunktion kann ganz oder teilweise durch immunmodulatorische Therapie

wiederhergestellt werden (Korporal u. a. 2008).

Im Gegensatz dazu ist die Datenlage zur Haufigkeit der TREG im peripheren

Blut widerspruchlich. Es finden sich Studien, die einen erniedrigten Anteil wie

auch identische Haufigkeiten bei Patienten mit MS im Vergleich zu gesunden

Kontrollen fanden (Haas u. a. 2005; Feger u. a. 2007a; Venken u. a. 2008a). Ei-

ne großere Haufigkeit CD25+ FoxP3+ nTREG wurde im Liquor, aber nicht im

peripheren Blut von MS-Patienten gefunden (Feger u. a. 2007a). Vereinbar mit

der Heterogenitat in Pathogenese und Klinik der MS finden sich Studien, die

ein unterschiedliches Verhalten der TREG bei verschiedenen Krankheitsstadien

fanden. Obwohl die Haufigkeit der Zellen im PBL keine signifikanten Unter-

schiede bei Patienten mit RR-MS und SP-MS aufwies, konnte eine verminderte

Suppressorfunktion nur fur erste festgestellt werden. Somit scheint die Funk-

tionsbeeintrachtigung der TREG besonders im fruhen Krankheitsverlauf eine

Rolle in der Immunregulation zu spielen (Venken u. a. 2006). Die folgerichtige

Konsequenz ist die Betrachtung der TREG im fruhestmoglichen Krankheitssta-

dium, dem CIS. Erstaunlicherweise finden sich hierzu nur wenige Studien. Eine

altere Arbeit von Jensen u. a. (2004) untersuchte ebenfalls die Haufigkeit der

TREG im PBL und CSF und stellte diese der Krankheitsaktivitat gemessen

an der kranialen Lasionslast gegenuber. Die Autoren fanden signifikant großere


Haufigkeiten CD4+ CD25+ TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu nicht-

inflammatorischen neurologischen Krankheiten. CIS Patienten mit abnormem

cMRT wiesen niedrigere Haufigkeiten im PBL und CSF auf als Patienten mit

normalem cMRT (Jensen u. a. 2004).

Emigration und Reifung von T-Zellen

T-Zellen unterlaufen nach ihrer Reifung im Thymus und Kontakt mit ihrem

Antigen eine Reihe von Veranderungen in Bezug auf Rezeptorbesatz, Zytokinse-

kretionsmuster und Funktionalitat. Beim Menschen kann eine Phanotypisierung

anhand der Expressivitat fur die CD45 Isoformen RA und RO erreicht werden

(Baars u. a. 1995). Naive CD45RA+ T-Zellen haben die Fahigkeit, zu den se-

kundaren lymphatischen Organen zu wandern und dort durch Antigenkontakt

aktiviert zu werden. Memoryzellen stellen ein Repertoire an spezialisierten Ef-

fektorzellen dar, die nach Zweitkontakt mit ihrem Antigen fur eine schnelle und

effektive Immunantwort sorgen. Bei Patienten mit Autoimmunkranheiten und

chronischer Stimulation des Immunsystems wie bei MS ist eine Verschiebung

des Phanotyps vom naiven zum Memorytyp zu erwarten (Mikulkova u. a. 2010).

Anhand von Oberflachenmolekulen wie CCR7 (ein Zytokinrezeptor fur das

Homing in Lymphknoten durch hochendotheliale Venolen) und CD62L (ein L-

Selektin) konnten mindestens zwei Phanotypen von Memory T-Zellen definiert

werden: schnell reagierende CD45RA+CD62Lhi TEM Effektor-Memoryzellen

und langsamer reagierende CD45RA+/-CD62Llow TCM Central-Memoryzellen

(Seder, Ahmed 2003).

Muraro u. a. (2000) untersuchten die Fragestellung, aus welcher der beiden

Populationen CD4+ naiv vs. Memory sich autoreaktive Zellen bei Patienten mit

RR-MS rekrutieren. In der FACS-Analyse MBP- und Tetanus-Toxoid spezifi-

scher Zellklone aus CD4+ CD45RA+ CD45RO- und CD4+ CD45RA- CD45RO+

Populationen konnte gezeigt werden, dass demyelinisierende T-Zellen de novo

aus dem Pool der naiven CD45RA+ CD45RO- rekrutiert werden und anschlie-

ßend in doppelt-positive Effektorzellen oder langlebige Memoryzellen differen-

zieren. In der gleichen Studie wurde eine erhohte Expressivitat von CD62L auf

naiven Zellen im Vergleich zu Memoryzellen gefunden (Muraro u. a. 2000). Nai-

ve T-Zellen benotigen fur den Ubertritt aus dem Blut in Lymphknoten CD62L

um das sog.”rolling“ entlang der hochendothelialen Venolen zu ermoglichen

(Sallusto u. a. 1999). Mikulkova u. a. (2011) fanden eine negative Korrelation

CD4+ CD8+ CD45RA+ CCR7+ Zellen mit dem Lebensalter bei gesunden Kon-


trollpersonen. Erwartungsgemaß zeigte sich ein Ruckgang naiver T-Zellen und

ein Anstieg von Memory T-Zellen mit fortschreitendem Alter. Fur MS konnte

diese Beobachtung nicht reproduziert werden (Mikulkova u. a. 2011).

Zum gegenwartigen Zeitpunkt sind keine Studien zu Immunphanotypisierung

mit CD45RA/CD62L bei Patienten mit CIS erschienen.

Die Rolle von B-Zellen und ihre Interaktion mit T-Zellen

Der Vorteil B-Zell depletierender Therapien bei Patienten mit MS zeigt, dass

B-Zellen eine zentrale Rolle in der Pathogenese innehaben (Hauser u. a. 2008).

Nachdem die initiale Entzundungsreaktion zu einer Schadigung der Blut-Hirn-

Schranke (BHS) gefuhrt hat, wandern B-Zellen und Antikorper ins ZNS ein und

partizipieren an der spezifischen Entzundungsreaktion durch verschiedene Me-

chanismen: Deregulation der Produktion von myelinspezifischen B-Zellen (Pas-

henkov u. a. 2003), Formierung ektoper lymphoider Strukturen in den Meningen

von MS-Patienten (Serafini u. a. 2004), Differenzierung in Plasmazellen mit Pro-

duktion von Autoantikorpern gegen Myelin und Oligodendrozyten-Antigenen

im ZNS (Sellebjerg u. a. 2000) und Antigenprasentation fur T-Zellen (Crawford

u. a. 2006). Die Rolle sezernierter Antikorper bei MS wird durch eine intrat-

hekale Antikorpersynthese von CD138+ Plasmazellen und dem Nachweis von

Ig-Ablagerungen in demyelinisierenden Lasionen im ZNS unterstutzt (Owens

u. a. 2007; Lucchinetti u. a. 2000).

CD27 als Marker fur Gedachtniszellen findet sich nicht nur auf B-Zellen.

Basierend auf der Analyse dieses Oberflachenmarkers konnen T-Zellen in eine

großere, aus Memory- und naiven T-Zellen bestehende und in eine Effektor-

population (CD27-) unterschieden werden. Untersuchungen, die den Rezeptor-

besatz der Effektorpopulation als gewebsspezifisch und weniger der Migrati-

on in Lymphknoten dienend klassifizierten, unterstutzen diese These. Es exis-

tiert eine Reihe von weiteren phanotypischen Markern fur Gedachtniszellen, wie

z. B. CD45RO und CCR7 (s. o. Giunti u. a. 2003). In-vitro Experimente haben

gezeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen mittels dem TCR-CD3-Komplex

eine starke Hochregulierung von CD27 zur Folge hat, vor allem auf naiven

CD45RA+ Zellen, bevor diese zu CD45R0+ Memoryzellen werden. CD27+

T-Zellen sind in der Lage, uber Zytokinsekretion B-Zellen zu aktivieren. In-

teressanterweise verlieren sie ihren Rezeptorbesatz bei Dauerstimulation mit

Antigenen und andern ihren Phanotyp zu CD27-. Diese Effektorpopulation

unterscheidet sich im Hinblick auf Zytokinsekretion (vorallem IL-4 und 5),


Integrin- und Selektinbesatz wie VLA-4 und VLA-5, einem Verlust an CD28

und einer damit verbundenen Aufregulierung von CD11b (Baars u. a. 1995).

Neuere Studien beleuchten das Zusammenspiel von B- und T-Zellen im Im-

munsystem (Harp u. a. 2008). Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung

von B-Zellen durch T-Zell spezifische Zytokine, nicht aber unspezifische Stimuli

zur Myelin-Ag abhangigen Aktivierung der T-Zellen befahigt. Diese Ativierung

scheint wichtig fur die Ausubung der antigenprasentierenden Funktion der B-

Zelle zu sein. Somit stehen T- und B-Zellen in einem reziproken Verhaltnis

zueinander (Harp u. a. 2008). Auch regulatorische T-Zellen werden auf diesem

Weg aktiviert. Die Blockade des co-stimulatorischen CD86 in vitro verstarkte

die Fahigkeit von B-Zellen zur Induktion von TREG (Zhong u. a. 2007).

Nach der klassischen Theorie der klonalen Selektion nach Burnet reagiert das

Immunsystem nach primarer Immunisierung mit der Generierung eines großen

Pools an Memory-B-Zellen, die sich von naiven Zellen in Bezug auf Rezeptor-

repertoire, Antigenprasentation, intrinsische Aktivitat, Toleranz und Lebens-

spanne unterscheiden. Im Rahmen der spezifischen Immunantwort ist es nach

der initialen klonalen Expansion von großer Wichtigkeit, dass aktivierte Zellen

spezifisch auf ihr Antigen reagieren, ohne unbeteiligtes Gewebe (”bystander“)

zu schadigen (Burnet 1962).

Das lymphozytenspezifische CD27 aus der TNF-Rezeptorfamilie und sein Li-

gand CD70 haben eine Schlusselrolle in der Kontrolle der Differenzierungs-

und Effektorfunktion aktivierter (B-)Lymphozyten inne. Auf T-Zellen wirkt

die Aktivierung von CD27 ahnlich dem TCR-assoziierten CD28 (s. o.) prolife-

rationsfordernd. CD27 ist zusammen mit Interleukinen an der Weiterdifferen-

zierung zur CD138+ Plasmazelle beteiligt. CD27+ B-Lymphozyten finden sich

vor allem in Geweben, die reich an Memoryzellen sind (wie z. B. der Marginal-

zone der Milz) und tragen bereits Mutationen in der variablen Kette des IgD,

was sie von naiven B-Zellen unterscheidet (Lens u. a. 1998).

Corcione u. a. (2004) untersuchten die Differenzierung von B-Zellen bei MS.

Im CSF von MS-Patienten finden sich signifikant mehr Plasmazellen (CD138+)

und Memoryzellen (CD19+/-CD27+) als im PBL. Plasmazellen im Liquor fan-

den sich auch bei anderen entzundlichen Erkrankungen, jedoch zu einem ge-

ringeren Prozentsatz. Dies konnte Ausdruck des chronischen Verlaufs der MS

im Vergleich zu akuten Krankheiten, wie z. B. viraler Meningitis, sein, her-

vorgerufen durch persistierende antigene Stimulation und Defekte in der Im-

munantwort. Die Autoren schlussfolgerten, dass eine kompartimentalisierte B-

Zellreaktion im ZNS stattfindet (Corcione u. a. 2004). Im Wesentlichen fehlen B-


Zellen nahezu vollig im Liquor Gesunder, bei Patienten mit MS oder auch aku-

ten Infektionen wurden jedoch Expansionen von bis zu 30 % aller Zellen im CSF

gefunden. Dabei handelt es sich hauptsachlich um CD27+ Gedachtniszellen, die

schon Kontakt mit einem Antigen hatten (Cepok u. a. 2005).

Bei Patienten mit CIS ist die Rolle der B-Zellen weniger gut untersucht.

Kuenz u. a. (2008) konnten eine Akkumulation reifer B-Zellen (CD19+ CD1382)

und Plasmablasten (CD19+ CD138+) im CSF bei CIS und RR-MS, nicht aber

bei SP-MS nachweisen. B-Zellen korrelierten mit entzundlicher Aktivitat, ge-

messen an T2-hyperintensen und Gd-aufnehmenden Lasionen im cMRT und Li-

quorparametern (Leukozytenzahl, intrathekale Ig-Synthese) (Kuenz u. a. 2008).

Die Bedeutung von B-Zellen in fruhen Krankheitsstadien wird auch duch Stu-

dien unterstutzt, die das proinflammatorische Zytokinmilieu bei Patienten mit

CIS untersuchten (Sellebjerg u. a. 2009).

Die Rolle von Makrophagen in der Immunpathogenese

Die Prasenz von Makrophagen in demyelinisierenden Lasionen bei MS konnte

schon fruh in histopathologischen Studien gezeigt werden (Bruck u. a. 1995).

Hamatogene Makrophagen und Mikroglia als ihr Pendant im ZNS haben zahl-

reiche immunmodulatorische Funktionen. Makrophagen und Mikroglia dienen

als Antigenprasentation fur T-Zellen. MHC-II Molekule und co-stimulatorische

Molekule wie B7.1 werden verstarkt bei MS-Patienten exprimiert (Gobin u. a.

2001). Wahrend MHC-II Expression auf Mikroglia im ZNS moglicherweise eine

Dampfung der Immunantwort durch Aktivierung regulatorischer T-Zellen hat

(Almolda u. a. 2010), konnte der Expression auf perivaskularen Makrophagen

eine proinflammatorische Rolle in der EAE nachgewiesen werden (Hickey, Ki-

mura 1998). Makrophagen im ZNS konnen Myelinabbauprodukte phagpzytie-

ren und sezernieren eine Vielzahl an pro- und antiinflammatorischen Zytokinen

(Glim u. a. 2010).

Der klassische immunphanotypische Marker fur Monozyten ist CD14, der

Pattern-recognition-Rezeptor fur Lipopolysaccharide in der außeren Zellwand

gramnegativer Bakterien. Innerhalb dieser Population exprimieren ca. 10 %

zusatzlich zu CD14 CD16, den niedrig-affinen Fc-γ Rezeptor III. Diese unter-

scheiden sich in Bezug auf ihr Verhalten bei Immunstimulation von den”klassi-

schen“ Monozyten und wurden von einigen Autoren als”proinflammatorische“

Monozyten bezeichnet (Bergh u. a. 2004).

Obwohl die MS hauptsachlich eine T-Zell-mediierte Autoimmunerkrankung


ist, spielen Monozyten bzw. Makrophagen als Vertreter des angeborenen Im-

munsystems eine wichtige Rolle in der Pathogenese. Vaknin-Dembinsky u. a.

(2008) konnten bei RR-MS Patienten ein verandertes, von Makrophagen se-

zerniertes Zytokinprofil im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen feststellen.

Insbesondere in sehr fruhen Krankheitsstadien war membrangebundenes IL-15

auf CD14+ Monozyten verstarkt exprimiert, analog dazu wurde eine erhohte

Anzahl an IL-15 Rezeptoren auf CD4+ T-Zellen bei MS-Patienten gefunden.

Die Autoren schlussfolgern daraus, dass IL-15 und Makrophagen besonders in

der Fruhphase (also beim CIS) einen wichtigen Faktor in der Unterhaltung

der T-Zellantwort darstellen und in Zukunft moglicherweise als Therapieansatz

dienen konnten (Vaknin-Dembinsky u. a. 2008). Weitere Studien unterstreichen

neben dem erworbenen Immunsystem immer auch die Rolle des angeborenen

Immunsystems bei der MS. Im Tiermodell wurde die immunmodulatorische

Funktion des CD14-Rezeptors auf Monozyten gezeigt. CD14 defiziente Mause

mit EAE prasentierten sich klinisch und histopathologisch mit starkerer neu-

ronaler Entzundung als die nicht-CD14 kompromittierten Tiere. Somit wurde

CD14 eine protektive Funktion, analog zu regulatorischen T-Zellen (s. o.), zuge-

schrieben. Weitere Studien sollten allerdings klaren, ob die artifizielle Depletion

von CD14 nicht eine uberschiessende Antwort des erworbenen Immunsystems

im Tiermodell nach sich zieht und so eine kunstliche Verschlechterung im Hin-

blick auf Entzundung und Beeintrachtigung nach sich zieht (Walter u. a. 2006).

Interessanterweise ist CD14 als glycosyl-phosphatidyl-inositol verankertes Mo-

lekul auf die Zusammenarbeit mit dem Co-Rezeptor TLR4 angewiesen, welcher

auch auf regulatorischen T-Zellen gefunden wurde und dem damit ebenso eine

regulatorische Funktion zugeschrieben wird (Pasare, Medzhitov 2004). Bis jetzt

existieren keine Studien uber einen moglichen synergistischen Effekt von CD25

und TLR4 bei Autoimmunerkrankungen und das Zusammenspiel von CD14,

CD25 und TLR4 bietet Raum fur weitere Forschung in der Zukunft.

Bei MS-Patienten, die mit Interferon-β behandelt wurden, konnte mithilfe

des FACS eine Expansion von CD14+ auf proinflammatorischen Monozyten zu

Lasten von CD16+ nach einem Monat antiinflammatorischer Therapie gefun-

den werden. Da die proinflammatorischen Monozyten eine Vorstufe im Entwi-

ckungszyklus zu dendritischen Zellen darstellen (s. o.), konnte dies ein weite-

rer Erklarungsansatz fur die Wirkungsweise von Interferonen bei MS Patienten

sein, indem das Gleichgewicht der differenzierten Monozyten durch die Therapie

zugunsten der Makrophagen verschoben wird (Bergh u. a. 2004). Eine ahnliche

Wirkung zeigen Monozyten bei MS-Patienten, die mit einer funftagigen hoch-


dosierten Steroidtherapie behandelt wurden. Es zeigte sich ein Ruckgang der

CD14+ CD16+ Monozyten auf teils nicht mehr messbare Werte, wahrend die

Population der”klassischen“ Monozyten um fast 50 % expandierte. Allerdings

wurden in dieser Studie keine Liquorwerte erhoben, und war mit n = 10 relativ

klein bemessen (Fingerle-Rowson u. a. 1998). Studien zur Immunphanotypisie-

rung bei Patienten mit CIS und CD14/CD16 existieren nicht.

1.3.3. Immunhomoostase

Um ins ZNS einwandern zu konnen mussen zirkulierende Zellen die zellularen

Barrieren uberwinden, die fur die Aufrechterhaltung der Immunhomoostase ver-

antwortlich sind. Unspezifischer trans- und parazellularer Transport vom Blut

ins ZNS Parenchym wird durch die endotheliale Blut-Hirn-Schranke (BHS) ver-

hindert, die als einzigartige morphologische Charakteristika fehlende Fenestrati-

on und hocheffiziente tight junctions aufweist (Wolburg u. a. 2003). Eine zweite

Barriere stellt die Blut-CSF-Schranke (BCSFS), bestehend aus spezialisierten

Epithelzellen des Plexus choroideus dar, welche den Liquorraum gegen das pe-

riphere Blutkompartiment abschottet und in jungerer Zeit als mogliche Ein-

trittspforte fur Immunzellen ins ZNS diskutiert wurde (Reboldi u. a. 2009)

Initialer Kontakt der zirkulierenden Zellen wird durch die Interaktion von

Adhasionsmolekulen der Selektin- oder Ig-Superfamilie und ihrer Liganden auf

dem Gefaßendothel hergestellt. Es folgt das sog.”rolling“ mit verminderter

Fließgeschwindigkeit und zytokinvermittelter Konformitatsanderung der Ad-

hasionsmolekule. Beim Ubertritt ins ZNS befinden sich die T-Zellen nun im

Liquor-drainierten perivaskularen Raum, der von der glia limitans gegen das

Hirnparenchym abgegrenzt wird (Engelhardt 2010).

Erste Hinweise, dass T-Zellen beim Gesunden zur Uberwindung der BHS

und BCSFS fahig sind lieferten Studien mit radioaktiv markierten enzephalito-

genen T-Lymphoblasten. Sechs Stunden nach Injektion der Zellen konnte eine

Anreicherung im perivaskularen Raum bei Ratten nachgewiesen werden (Hickey

1991). Im Ruckenmark wurde ein VLA-4/VCAM-I (CD49d) abhangiger Trans-

port aktivierter, antigenspezifischer T-Zellen ins ZNS nachgewiesen (Vajkoc-

zy u. a. 2001). Neure Studien bestatgten diese Hypothesen und mittels intra-

vitaler Mikroskopie (IVM) konnten ovalbumin-spezifische T-Zellen nach ihrer

Diapedese uber meningeale Gefaße im Subarachnoidalraum, nicht aber Hirn-

parenchym beobachtet werden. Die Autoren leiteten daraus ab, dass T-Zellen

die Uberwachung des zentralnervosen Immunsytems im Subarachnoidalraum


ausuben, in Abwesenheit spezifischer perivaskularer Antigene jedoch die notigen

Signale zur Migration uber die glia limitans fehlen (Bartholomaus u. a. 2009).

Das Uberwiegen von Memory T-Zellen im CSF gegenuber dem PBL bei Gesun-

den legt den Schluss nahe, dass Zellen direkt uber den Plexus choroidus und

die BCSFS in den Liquor ubertreten konnen (Kivisakk u. a. 2003). Hinweise

auf die Rolle bestimmter Zytokine wie CCL20 fur die Mediation der zellularen

Diapedese uber die BCSF sind Gegenstand aktueller Forschung (Reboldi u. a.

2009). Zusammengefasst findet also unter physiologischen Bedingungen eine

strikte Selektion immunkompetenter Zellen beim Ubertritt ins ZNS und Auf-

rechterhaltung einer zellularen Homoostase statt. Ohne antigene Aktivierung

pesistieren die T-Zellen nicht jenseits von BHS und BCSFS und imigrieren

nicht ins Hirnparenchym (Bartholomaus u. a. 2009).

Reaktivierung einer T-Zelle im Subarachnoidalraum fuhrt zu einer Aktivie-

rung der zellularen Schranken, was den weiteren Einstrom immunmodulato-

rischer Zellen uber die entzundete BHS bei MS erleichtert. Initiale Schritte

umfassen das α4-Integrin/VCAM-1 medierte”rolling“ in der Fruhphase des T-

Zell-Endothel Kontaktes (Battistini u. a. 2003) und Endothelin Interaktionen

nach initialem Kontakt (Bahbouhi u. a. 2009). In vitro Studien konnten zeigen,

dass T-Lymphozyten uber LFA-1 und α4-Integrine und ihre endothelialen Li-

ganden ICAM-I und VCAM-I an der entzundeten Gefaßwand haften (Man u. a.

2009) und die interzellularen Adhasionsmolekule wahrend EAE auf meninge-

alen und auf Endothelzellen des Plexus choroideus hochreguliert sind (Steffen

u. a. 1996). Der letzte Schritt, die Diapedese uber die zellulare Barriere, ist am

wenigsten gut erforscht. Es gibt allerdings Hinweise auf einen transzellularen

Mechanismus, der LFA-1/ICAM-I und ICAM-2 Interaktionen nahelegt (Green-

wood u. a. 2003).

Schlussendlich fuhrt die Produktion von Zytokinen und Metalloproteasen zur

Degradation der glia limitans und Einstrom encephalitogener Zellen ins Hirn-

parenchym (Agrawal u. a. 2006).

Spezielle Aspekte in der Homoostase der TREG

In der ersten Lebenswoche thymektomierter Mause entwickeln eine Autoimmu-

nekrankung ohne Beteiligung des ZNS (Sakaguchi u. a. 1985). Im Mausmodell

der MS, der EAE, konnte gezeigt werden, dass CD4+ CD25+ Lymphozyten

die Entstehung und Progression der Krankheit aufhalten konnen (Kohm u. a.

2002) und es fand sich eine Akkumulation peripher expandierter TREG im ZNS


(Korn u. a. 2007). Es finden sich Studien, die eine Anreicherung auch im Liquor

von MS Patienten zeigen konnten (Feger u. a. 2007a), auch wenn die Studienlage

hierzu kontrovers diskutiert wird (siehe auch Abschnitt “Aufrechterhaltung von

Immuntoleranz“ auf Seite 12 und Tabelle 4.2 auf Seite 64). Diese Daten legen

die Vermutung nahe, dass TREG beim Menschen aktiv ins entzundliche Mi-

lieu rekrutiert werden konnen. Es existieren Studien zur Korrelation von Schub

und Remission mit der Haufigkeit von regulatorischen T-Zellen (Aristimuno

u. a. 2008). Fletcher u. a. (2010) formulieren die Hypothesen, dass Autoimmu-

nitat und konsekutive Entzundung von der Balance zwischen regulatorischer

und inflammatorischer Kapazitat auf zellularer Ebene abhangt. Wahrend die

entzundliche Komponente zu Beginn der Krankheit dominiert, kommt es zur

Expansion der regulatorischen Antwort (im Liquorkompartiment) zugunsten

von regulatorischen Zellen und Zytokinen wahrend der Remission (Fletcher u. a.

2010).

In jungerer Zeit wurden TREG aufgrund ihres Oberflachenbesatzes an Ad-

hasionsmolekulen klassifiziert. Diese ermoglichen T-Zellen den Ubertritt vom

Lymph- ins Blutkompartiment oder die Diapedese der Blut-Hirn-Schranke oder

sind fur die Retention der Zellen im entzundeten Gewebe verantwortlich. Soilu-

Hanninen u. a. (2005) fanden eine erhohte Expression von CD49d (α-4 Ket-

te des Very Late Activation Antigen, VLA-4) in der Gesamtpopulation der

T-Zellen bei Patienten mit MS im Schub (Soilu-Hanninen u. a. 2005). Eine

neuere Studie zeigte eine signifikant erhohte Haufigkeit CD49d+ Zellen unter

allen TREG bei Patienten mit RR-MS (nicht aber SP-MS) im Vergleich zu ge-

sunden Kontrollen (Venken u. a. 2008a). Stenner u. a. (2008) untersuchten den

Effekt einer VLA-4 Blockade mit dem monoklonalen Antikorper Natalizumab

auf CD25high FoxP3+ TREG bei Patienten mit RR-MS. Die Autoren konn-

ten zeigen, dass die Bindungskapazitat von Natalizumab bei TREG signifikant

schwacher ist und TREG weniger VLA-4 exprimieren als FoxP3- T-Zellen. Die-

se Ergebnisse fanden sich jedoch sowohl im Blut von RR-MS Patienten, als auch

bei gesunden Kontrollen (Stenner u. a. 2008). Allerdings untersuchte die Studie

kein Liquormaterial und beinhaltete keine Patienten mit CIS. Eine spatere Stu-

die aus der selben Arbeitsgruppe konnte nachweisen, dass TREG konstitutiv

eine hohere Zellmotilitat uber die BHS in vitro unter nicht-inflammatorischen

Bedingungen aufweisen, als CD4+ FoxP3- Effektorzellen. Es zeigte sich eine Ak-

kumulation der TREG in oder auf einer in vitro kultivierten Endothelschicht,

was hinweisend auf einen Vorteil in der Initiierung der fruhen Schritte der Diape-

dese uber die BHS ist. TREG von Patienten mit RR-MS wiesen eine reduzierte

1.4. Ableitung der Fragestellung 23

Fahigkeit zur Diapedese auf verglichen mit gesunden Kontrollen. Die Autoren

schlußfolgerten, dass die gesteigerte Migratonsfahigkeit der TREG unter physio-

logischen Bedingungen zum Erhalt der Immunhomoostase und eines regulatori-

schen Equilibriums im ZNS beitragt. Die beeintrachtige Migrationsfahigkeit bei

Patienten mit MS ist hinweisend auf zusatzliche Aspekte in der Pathophysiolo-

gie der TREG neben einer gestorten Effektorfunktion und konnte zur Bildung

fruher ZNS-Lasionen beitragen (Schneider-Hohendorf u. a. 2010).

1.4. Ableitung der Fragestellung

Aktuelle Hypothesen zur Immunpathogenese der MS beinhalten als zellulare

Komponente u. a. die Involvierung von regulatorischen T-Zellen, CD4+/CD8+

T-Zellen, Makrophagen und B-Zellen im ZNS. Autoreaktive T-Zellen aus der

Peripherie wandern ins ZNS ein, treffen dort auf ihr Antigen und sind fur

die neuroinflammatorische Reaktion verantwortlich, die uber humorale und

zellulare Immunreaktion zu Myelin- und Axonschaden fuhrt (Bhat, Steinman

2009). Dabei spielt die Aufrechterhaltung der zellularen Homoostase uber die

Blut-Hirn-Schranke und die Blut-CSF-Schranke eine entscheidende Rolle (En-

gelhardt 2010), auch uber quantitative Unterschiede einzelner Zellpopulationen

im CSF und PBL wurde bei Patienten mit definitiver MS berichtet (Feger

u. a. 2007a; Venken u. a. 2008a; Lee-Chang u. a. 2011). Das MRT als Surro-

gatparamter fur entzundliche Aktivitat erlaubt dabei eine Quantifizierung und

Objektivierung zerebraler Entzundung, gemessen an Lasionslast und Anzahl

T2-hyperintenser Lasionen (Fisniku u. a. 2008).

Diese Studie geht der Fragestellung nach, ob eine Dysbalance zwischen Blut-

und Liquorkompartiment bestimmter Immunzelltypen bei Patienten mit CIS im

Vergleich zu gesunden Kontrollen besteht und ob das Ausmaß einer moglichen

Dysbalance mit dem Grad der zentralnervosen Entzundung, gemessen anhand

der Lasionslast im cMRT, korreliert. Die Darstellungsweise der Haufigkeiten

durch Quotienten (PBL/CSF) erlaubt dabei ein relatives (Un)-Gleichgewicht

zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment zu erfassen und Hypothesen zur

Immunhomoostase aufzustellen und wurde schon von fruheren Forschungsgrup-

pen zur Charakterisierung einer gestorten Zellhomoostase eingesetzt (Kleine

u. a. 1999). Aktualitat erlangt das Konzept der Dysbalance und Immunhomo-

ostase durch gegenwartige erfolgreiche Therapiestrategien, die eine Re-balan-

cierung pro- und antientzundlicher Zellen z. B. durch Transfer regulatorischer

Zellen im Tierversuch (Stephens u. a. 2009) oder Beeinflussung der Diapedese

1.4. Ableitung der Fragestellung 24

von Leukozyten uber die Blut-Hirn-Schranke (Horga, Tintore 2010) erfolgreich

einsetzen.

Wir entschieden uns fur eine Auswahl an immunphanotypischen Markern im

FACS fur T-, B-, Plasma- und Memoryzellen und Makrophagen wie in Tabel-

le 2.1 auf Seite 30 beschrieben, weil die kombinierte quantitative Analyse dieser

Zellpopulationen moglicherweise Schlusse auf ein fur das CIS charakteristisches

Immunzellprofil und seine Verteilung uber die Kompartimente erlaubt.

2. Material und Methoden

2.1. Patienten und Probanden

Die Studienkohorte setzt sich aus 46 Patienten mit CIS (CIS-I), 18 Patienten

mit MS und 25 gesunden Kontrollpersonen (KONTROLLE-I) zusammen. Die

Indikation zur Lumbalpunktion bei Patienten der Kontrollgruppe bestand aus

unklarem (Kopf)Schmerzsyndrom, Normaldruckhydrozephalus, Pseudotumor

cerebri, Verdacht auf Neuroborreliose und psychiatrischer Indikation. Durch-

flusszytometrisch wurden von allen Patienten Blut- und Liquorporoben in den

Farbungen I–V untersucht (siehe Tabelle 2.1 auf Seite 30). Nachdem sich in

Zwischenanalysen ein quantitativer Unterschied fur CD25+ TREGs abzeichne-

te, wurde das Antikorperpanel um eine weitere Farbung mit CD25 und CD49d

erweitert. Um genugend Zellmaterial an CD25high CD49d+ Zellen im FACS ein-

setzen zu konnen, wurde auf das bisherige Panel der Farbungen I–V in einer

zweiten Kohorte verzichtet. Diese VLA-4 Kohorte setzt sich aus n = 18 (CIS-II)

und n = 18 (KONTROLLE-II) Patienten zusammen, fur die nur Farbung VI

vorliegt. Es galten die selben Einschlusskriterien wie fur die Kohorten CIS-I,

MS-I und KONTROLLE-I.

Neben kranialer Magnetresonanztomografie nach standardisiertem Protokoll

(T2 Fast-spin-echo, T1 Spin-Echo, FLAIR, Protonendichtewichtung + T2 Fast-

spin-echo, T1 Spin-echo + Kontrastmittel, siehe Abschnitt 2.5 auf Seite 36),

Liquor- und Venenpunktion wurde von allen Patienten mit CIS bei Diagno-

sestellung und als Follow-up nach einem Jahr der EDSS-Score von zertifizier-

ten EDSS-Untersuchern (Expanded Disability Status Scale, EDSS, L. Kappos,

CH-4031 Basel, Schweiz, siehe http://www.neurostatus.net/index.php) er-

hoben.

Die Patientenrekrutierung begann im Jahr 2007 und endete im Jahr 2010.

Retrospektiv wurden alle Patienten eingeschlossen, welche die Einschlusskriteri-

en erfullten. Somit datieren die stationaren Aufenthalte der Patienten aus den

Jahren 2005 bis 2010. Einschlusskriterien fur die Kohorte der CIS-Patienten

waren folgende:

25

http://www.neurostatus.net/index.php

2.1. Patienten und Probanden 26

� Auftreten eines ersten fokal-neurologischen Defizits wie z. B. einer Opti-

kusneuritis, welches nicht durch andere Krankheiten erklart werden kann

und mindestens fur 24 Stunden persistiert

� Objektivierbarkeit des Defizits im Krankenhaus, z. B. durch eine klini-

sche Untersuchung mit Erhebung des EDSS-Scores oder Elektrophysiolo-

gie (anamnestische Defizite wurden nicht berucksichtigt)

� Fehlen einer anderen entzundlichen (chronischen) demyelinisierenden ZNS-

Erkrankung

� Keine Einnahme immunmodulatorischer Medikamente, wie z. B. Cortison

oder Interferone

� Liquor- und Venenpunktion zum Zeitpunkt der Diagnosestellung

� Zeitnahes cMRT nicht spater als 90 Tage nach der Punktion in der neu-

roradiologischen Abteilung der Uniklinik Marburg mit”MS-Programm“,

bestehend aus Protonenwichtung, FLAIR-Sequenz, T1 und T2-Wichtung.

Einschlusskriterien fur die Kohorte der gesunden Kontrollpersonen waren fol-

gende:

� Fehlen einer zentral-neurologischen Erkrankung (z. B. Morbus Parkinson,

Schlaganfall, Gehirntumor, Meningitis) oder peripher-entzundlichen Er-

krankung

� Keine Einnahme einer immunmodulatorischen Therapie, wie z. B. Corti-

son oder Interferone

� Liquorpunktion und Venenpunktion zum Zeitpunkt der Diagnosestellung

Alle Patienten wurden aus dem MS-Zentrum der Neurologischen Universitats-

klinik Marburg rekrutiert, es wurden keine Daten aus Drittlaboren oder von

niedergelassenen Arzten verwendet. Die Liquor- und Venenpunktion sowie das

cMRT und auch die klinische Untersuchung mit Erhebung des EDSS waren

regularer Bestandteil der diagnostischen Routine im Krankenhaus, somit wur-

den ausschliesslich Restproben im FACS verwertet und die Patienten keiner

zusatzlichen paraklinischen Diagnostik unterzogen.

Die Studie wurde von der Ethikkommission des Fachbereichs Medizin der Phil-

ipps-Universitat Marburg gepruft (positives Ethikvotum vom 23.10.2000, Studie

126/00, liegt vor).

2.2. Skalen, Definitionen und Material 27

2.2. Skalen, Definitionen und Material

2.2.1. Expanded Disability Status Scale Score (EDSS)

Zur Erfassung der korperlichen Beeintrachtigung durch MS wurde eine von

Kappos (L. Kappos, Department of Neurology, University Hospitals, CH-4031

Basel, Version 11/99) leicht modifizierte Version des etablierten EDSS-Scores

(Kurtzke 1983) benutzt. Dieser beruht auf einer standardisierten neurologischen

Untersuchung, mit der sich anhand von Beurteilung in acht Funktionssystemen

ein nominaler Scorewert von eins bis zehn in Schritten von jeweils einem halben

Punktwert ableiten lasst. Es werden die Ergebnisse der neurologischen Untersu-

chung in den Bereichen Optik, Hirnstamm, Motorik, Cerebellum, Sensibilitat,

Blasen- und Mastdarmfunktion, mentaler Status und Gehstrecke berucksichtigt

und in Schweregrade unterteilt. Aus den Graden errechnet sich nach einem stan-

dardisierten Verfahren der EDSS-Score. Dabei bedeutet ein EDSS < 4,0 eine

weitgehend uneingeschrankte Gehstrecke, wahrend Patienten mit einem EDSS

> 4,0 abhangig von der Gehstrecke weiter differenziert werden. Ab einem Punkt-

wert von 7,0 ist der Patient auf einen Rollstuhl angewiesen, ab einem Wert von

8,5 uberwiegend bettlagerig. Ein Wert von 10 bedeutet den Tod durch MS. Fur

eine detailliertere Beschreibung und eine Kopie des in dieser Studie verwen-

deten Erfassungsbogens siehe Tabelle A.1 auf Seite 91 im Anhang. Ein EDSS

Score von 0–3 nach 10 Jahren weist auf eine langsam progrediente Erkrankung,

hin wie sie bei ca. 20 % der Patienten mit MS nach 10 Jahren Krankheitsdauer

vorliegt (Hawkins, McDonnell 1999).

2.2.2. Die Diagnosekriterien nach McDonald

Die Diagnose”MS“ ist eine klinische Diagnose, wobei nach Ausschluß aller an-

deren in Frage kommenden demyelinisierenden Erkrankungen die topische und

zeitliche Dissemination der Entmarkung ausschlaggebend ist. Fur die Diagno-

sestellung der in dieser Studie eingeschlossenen Patienten wurden die im Jahr

2001 von der internationalen Expertenkommission zur MS-Diagnostik erstellten

und 2005 und 2011 von Polman revidierten McDonald-Kriterien berucksichtigt

(McDonald u. a. 2001; Polman u. a. 2005; Polman u. a. 2011). Raumliche Dis-

semination bei CIS wurde nach Korteweg u. a. (2009) anhand einer klinischen

Untersuchung und eines initialen cMRT diagnostiziert. Fur eine detailliertere

Darstellung siehe auch Tabelle A.2 auf Seite 92 im Anhang.

2.3. Probenasservierung 28

2.2.3. Gerate und Verbrauchsmaterialien

Die verwendeten Gerate, Verbrauchsmaterialien und eingesetzten Computer-

programme sind in Tabelle A auf Seite 94 aufgefuhrt.

2.3. Probenasservierung

2.3.1. Gewinnung von mononuklearen Zellen aus peripher-venosem

Blut

Zur Gewinnung mononuklearen Zellen (PBMCs, peripheral blood mononucle-

ar cells = T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten) wurde

das synthetische Polysaccharid BICOLL® (Eine Separationssolution mit ei-

ner Dichte von ρ=1,077 g/ml) verwendet: Peripher-venoses EDTA-Blut wur-

de im Verhaltnis 1:1 mit PBS (phosphate buffer saline, Phosphatgepufferte

NaCl-Losung) in einer 50 ml Greiner-Tube verdunnt und uber 10 ml steri-

lem BICOLL® mit einer 10 ml Pipette geschichtet. Aufgrund der geringeren

Dichte im Vergleich zum Trennmedium, bzw. der hoheren Dichte im Vergleich

zum Serum sammeln sich die PBMCs in einer Zwischenphase (Interphase), ge-

trennt von den restlichen zellularen Blutbestandteilen und dem Serum. Nach

35 minutiger Zentrifugation bei 1500 U/Minute ohne Bremse und maximaler

Auslaufzeit (verhindert die erneute Vermischung der eben getrennten Phasen)

wurde der Uberstand abgehoben, der oberhalb des Bicollpaques befindliche

Ring bestehend aus PBMCs abgeschopft und in ein neues 50 ml Greiner-Tube

uberfuhrt. Nach mehrmaligem Waschen (Resuspension mit 30 ml 4°C kaltem

PBS, Zentrifugieren bei 1500 U/Minute fur 12 Minuten bei 20°C mit Bremse,

Verwerfen des Uberstandes) erfolgte die Resuspension mit 20 ml RPMI (ein na-

tives Kulturmedium). Aufgrund der Zytotoxizitat des BICOLL® (es ist mit

uber 40 % Zellverlust zu rechnen) wurde darauf geachtet, moglichst wenig in

das neue Rohrchen mit zu uberfuhren. Die Zahl der PBMCs wurde ansch-

liessend mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal Zahlkammer (siehe Abb.2.1 auf Seite

29) unter Verwendung von 4 %igem Tryptanblau bestimmt und die bicolysierte

Blutprobe ggf. kryoasserviert. Zunachst wurden hierzu die Zellen im Verhaltnis

1:1 mit Tryptanblau versetzt. Durch ansetzen der Pipettenspitze an der Kante

zwischen Deckglas und Kammerboden wurde die Zellsuspension befullt, durch

Kapillarwirkung fullt sich der Spalt ohne Bildung von Luftblasen. Anschließend

werden alle Quadrate maanderformig in Doppelbestimmung (Auszahlen beider

Zahlnetze mit Bildung des Mittelwerts) ausgezahlt und die Zahl der PBMCs

2.3. Probenasservierung 29

Abbildung 2.1.:

Schematische Abbildung einer Fuchs-Rosenthal Zahlkammer. Fur die Zellzahlung

im Liquor wird am haufigsten die Fuchs-Rosenthal Kammer verwendet. Es wird die gesam-

te Flache, die 16 x 16 Großquadrate aufweist, ausgezahlt. Diese Zahlkammer unterschei-

det sich von den ublichen Kammern zur Blutzellenzahlung nicht nur durch den großeren

Flacheninhalt (16 mm2), sondern auch durch die großere Kammertiefe (0,2 mm) und damit

großeren Rauminhalt (3,2 ml). Bildquelle: http://www.zaehlkammer.de/deutsch/fuchs.

rosenthal.html

nach folgender Formel bestimmt:

ausgez. Zellen

ausgez. Flache (mm2) x Tiefe (mm) x Verdunnung ml Blut= Zellen pro ml Blut

Als Verdunnung durch das Tryptanblau gilt in diesem Fall ein Verhaltnis von 1:2.

2.3.2. Kryoasservierung von PBMCs

Zur Asservierung bei -140°C wurden die Zellen zentrifugiert (10 Minuten bei

1200 U/Minute), in 800µl CTM aufgenommen und bei Kuhlung auf Eis in Kryo-

rohrchen uberfuhrt. Anschliessend wurden 800µl steril filtrierte Einfrierlosung

(20 % DMSO, 80 % FCS) langsam hinzu gegeben. Die Rohrchen wurden ansch-

liessend in speziellen Nalgene®-Einfrierboxen zunachst uber Nacht bei -80°C

eingefroren und am darauf folgenden Tag auf -140°C heruntergekuhlt.

2.3.3. Kryoasservierung von Liquor

Zur Asservierung der Zellen des Liquor cerebrospinalis wurde die Probe (opti-

malerweise mindestens 15 ml fur eine ausreichende Zellzahl) bei 1200 U/Minute

http://www.zaehlkammer.de/deutsch/fuchs.rosenthal.html

http://www.zaehlkammer.de/deutsch/fuchs.rosenthal.html

2.4. Durchflusszytometrie (FACS) 30

fur zehn Minuten abzentrifugiert. Nach Abwurf des Uberstandes wurde sie mit

500µl RPMI 1640 und 500µl Kryomedium (Exothermes Medium, bestehend

aus 50 % FCS, 30 % RPMI und 20 % DMSO) versetzt und in ein 20 ml Kryo-

Rohrchen uberfuhrt. In einer Einfrierbox wurde die Probe uber Nacht bei -80°C

auf Propanol tiefgefroren und anschliessend bei -140°C gelagert.

2.4. Durchflusszytometrie (FACS)

Tabelle 2.1.:

Antikorperpanels und untersuchte Zellpopulationen. Ein”+“ bedeutet die Expri-

mation der jeweiligen Zellpopulation fur das CD-Molekul, gegen das der Antikorper ge-

richtet ist. Fur eine tabellarische Darstellung der Klone und Firmen siehe Tabelle A auf

Seite 94

Antikorperpanel Untersuchte Zellpopulation

Farbung I CD3 (PerCP), CD4 (FITC), CD8

(APC), CD25 (PE)

CD4+ CD25high TREGs

Farbung II CD3 (PerCP), CD4 (APC), CD8

(FITC), CD28 (PE)

CD4+ CD28+ T-Zellen

CD8+ CD28+ T-Zellen

Farbung III CD4 (PerCP), CD19 (APC), CD27

(FITC), CD138 (PE)

CD19+ B-Zellen

CD19- CD138+ Plasmazellen

CD19+ CD27+ Memory B-Zellen

CD4+ CD27+ Memory B-Zellen

CD4+ CD27- Memory B-Zellen

Farbung IV CD4 (APC), CD8 (PerCP),

CD45RA (PE), CD62L (FITC)

CD4+ CD45RA+ CD62L+

Thymusemigranten

CD8+ CD45RA +CD62L+

Thymusemigranten

Farbung V CD3 (PerCP), CD14 (FITC), CD16

(PerCP), CD20 (APC),

CD14+ CD16- Monozyten

CD14- CD16+ Monozyten

CD14+ CD16+ Monozyten

Farbung VI CD3 (PerCP), CD4 (APC), CD25

(FITC), CD49d (PE)

CD4+ CD25high CD49d+ TREGs

CD4+ CD25med CD49d+ TREGs

CD4+ CD25low CD49d+ TREGs

Im FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting; Durchflusszytometrie) konnen

Zellen anhand ihrer spezifischen Große, Struktur, Oberflachenbeschaffenheit

und intrazellularen Struktur unterschieden und gezahlt werden. Die Durchfluss-

zytometrie quantifiziert dabei im Vergleich zur Mikroskopie simultan mehrere

optische Eigenschaften (Parameter) kompletter Zellen mit hoher Durchsatzra-


Abbildung 2.2.:

Hydrodynamische Fo-

kussierung in der Mess-

kuvette. Abb.: BD Bios-

ciences

Abbildung 2.3.:

FACS: Vollblutprobe im FSC/SSC Dotplot.

Im FSC/SSC Dotplot lassen sich folgende Zellpopu-

lationen erkennen, wenn man die Zellen nach Gra-

nularitat und Große trennt: Granulozyten, Mono-

zyten und Makrophagen, Lymphozyten und Zellde-

bris. Abb.: Eigene Grafik

te, indem diese nach Markierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorochrom)

an einem Laserstrahl vorbeigeleitet werden. Passieren die suspendierten Einzel-

zellen den Laserstrahl, senden sie dabei in Abhangigkeit vom Zelltyp und der

Probenvorbereitung charakteristische Lichtsignale aus, die mittels geeigneter

Detektoren nachgewiesen werden. Dabei entsteht zum einen Streulicht, welches

als Vorwarts- (Forwardscatter, FSC) sowie Seitwartsstreulicht (Sidewardscat-

ter, SCC) Aussagen uber folgende Zellparameter erlaubt:

� Ihre relative Große (im Vorwartsstreulicht)

� Ihre relative Granularitat (im Seitwartsstreulicht)

� Ihre spezifische Fluoreszenz (FL1, FL2, FL3, FL4 . . . ) und die entspre-

chende relative Fluoreszenzintensitat

Der Einsatz mehrerer verschiedener Fluorochrome erlaubt anhand ihres spe-

zifischen Absorptions- und Emissionsspektrums und der Zuordnung zu ober-

flachenspezifischen monoklonalen Antikorpern eine Bestimmung verschiedener

Zellcharakteristika (Zellpopulationen, siehe Abbildung 2.3 auf Seite 31). Die re-

lative Fluoreszenzintensitat ist dabei direkt proportional zur Menge der uber

Antikorper gebundenen Fluorochrommolekule. Zur Beschleunigung und Erzeu-

gung eines laminaren Stroms aus Zellen erfolgt in der Messkuvette eine Redu-

zierung des Querschnitts (hydrodynamische Fokussierung, siehe Abbildung 2.2

auf Seite 31). Fur eine Ubersicht der durchgefuhrten Farbungen, der dabei ver-

wendeten Antikorper und der untersuchten Zellpopulationen siehe Tabelle 2.1

auf Seite 30.


2.4.1. Farbung von peripherem Blut

Sich an publizierten Methoden orientierend (Tackenberg u. a. 2007), wurde das

peripher-venose Blut nach Aufbereitung (siehe 2.3.1 auf Seite 28) wie im fol-

genden dargestellt fur die FACS-Analyse bearbeitet: Nach 1:1 Verdunnung mit

PBS wurden jeweils 200µl EDTA-versetztes Blut pro Well auf eine 96-well-

Rundboden-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platte wurde anschliessend fur vier

Minuten bei 1200 U/Minute und 10°C zentrifugiert, der Uberstand verworfen

und die Platte z.B. mit Zellstoff getrocknet. Danach erfolgte die Farbung der

im Rundboden verbliebenen Blutzellen mit je 5µl pro Well des spezifischen

Antikorperpanels. Nach sorgfaltiger Resuspension mit einer Mehrkanalpipet-

te wurde die Platte fur 25 Minuten auf Eis in Dunkelheit inkubiert. Das Mi-

schungsverhaltnis der Antikorper war abhangig vom fluoreszierenden Farbstoff,

mit dem der Antikorper gekoppelt, war und betrug PerCP(1 Teil): APC(1 Teil):

PE(1,5 Teile):FITC(1,5 Teile). Die unter allen Zellen noch verbliebenen Ery-

throzyten wurden zweimal mit je 180µl Erythrozytenlyse (PharMingen Ly-

se; Ammoniumchloridlosung zu Aqua dest. im Verhaltnis 1:10) lysiert und im

Anschluß fur zehn Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach

vierminutiger Zentrifugation bei 1200 U/Minute und Abwurf des Uberstandes

wurden die Wells mit einer Waschlosung (4°C kaltes PBS mit 2,5 Fetal Calf

Serum [FCS]) einmal gewaschen und erneut fur vier Minuten zentrifugiert. Im

letzten Schritt wurden die jetzt gefarbten Zellen in 200µl CellWash® Losung

resuspendiert, in 5 ml Falcon-Rohrchen uberfuhrt und am Durchflusszytometer

mittels CellQuest® Software quantifiziert. Weisse Blutzellen konnen am Zyto-

meter durch die charakteristische Verteilung der Werte fur SSC/FSC (Granula-

ritat/Zellgrosse) identifiziert und entsprechend der Verwendung der monoklona-

len AK weiter spezifiziert werden. Aus statistischen Grunden bedarf es hierbei

einer Mindestmenge von ca. 5000 Lymphozyten pro Messung (Tackenberg u. a.

2007).

2.4.2. Farbung von Liquor

Die Aufbereitung der Zellen im Liquor fur die FACS-Analyse unterscheidet sich

nicht grundlegend von der Aufbereitung der Blutzellen: 15 ml Liquor wurden fur

10 Minuten bei 1200 U/Minute abzentrifugiert, der Uberstand abgehoben und

das Sediment auf dem Schuttler gelockert. Ohne Verdunnung erhielt jedes Well

der 96-well-Rundboden-Mikrotiterplatte 25µl der Zellen und je 5µl des spezifi-

schen Antikorperpanels (Siehe Tabelle 2.1 auf Seite 30), anschliessend gab man


die Platte im Dunklen fur 25 Minuten auf Eis. Nach Ablauf der Zeit wurden

die wells mit je 150µl Cellwash oder Waschlosung (siehe Abschnitt 2.4.1 auf

Seite 32) beschickt und resuspensiert, fur vier Minuten bei 1200 U/Minute ab-

zentrifugiert und der Uberstand verworfen. Dieser Waschvorgang wurde zwei-

bis dreimal wiederholt. Zur Analyse im FACS-Gerat wurden die Zellen abpi-

pettiert und in ein Falcon-Rohrchen uberfuhrt.

2.4.3. Auswertung im FACS

Abbildung 2.4.:

Identifikation von CD25high TREG. Links: Es ist deutlich eine CD25high Population

zu erkennen, die sich von einer CD25med und einer CD25low Population unterscheidet.

Rechts: Farbung der TREG mit CD49d und Darstellung der MFI. Ein Marker selektiert

den Peak der VLA-4 Intensitat. Abb.: Eigene Grafik

In dieser Arbeit wurden die durch Venenpunktion gewonnen PBMCs und

der Liquor cerebrospinalis aller Probanden durchflusszytometrisch untersucht.

In die statistische Berechnung ging sowohl die Zellzahl einer bestimmten Zellpo-

pulation als Absolutwert, wie auch das Verhaltnis der Zellen in Blut und Liquor

(Quotient QPBL:CSF ) ein. Dabei wurde der relative Anteil der speziellen Po-

pulation an T-Zellen, B-Zellen oder Monozyten fur Blut und Liquor getrennt

bestimmt und anschliessend daraus der Quotient gebildet (siehe Abbildung 2.5

auf Seite 34). Somit lasst sich ein bestehendes relatives Ungleichgewicht der

Zellen uber die humoralen Kompartimente Blut und Liquor quantifizieren. Fur

die Angabe der Prozentwerte bei der Berechnung der Quotienten gilt, dass die

Bezugspopulation fur B-Zellen jeweils”alle Lymphozyten“, fur T-Zellen

”alle

CD4+ bzw. CD8+ Lymphozyten“ und fur Monozyten und Makrophagen”alle


Abbildung 2.5.:

Berechnung des Quotienten QPBL:CSF am Beispiel der Farbung I. Linke Reihe

PBL, rechte Reihe CSF. Im FSC/SSC Dotplot (erste Bildreihe) wurden die Lymphozyten

ausgewahlt und hinsichtlich ihrer Exprimierung von CD3 und CD4 weiter differenziert

(zweite Bildreihe). Im letzten Schritt wurden die CD25high positiven Zellen sondiert und

ihr prozentualer Anteil an allen CD4 positiven Zellen errechnet. Aus den beiden Anteilen

in Blut und Liquor berechnet sich anschliessen der Quotient QPBL:CSF .

PBMCs“ ist. Die Angabe”5,6 % CD4+CD25+ Zellen“ liest sich also

”5,6 % al-

ler CD4+ Zellen waren CD25+“. Die Quotienten errechneten sich immer nach

der Formel ProzentwertPBLProzentwertCSF .

In Farbung I wurden CD4+ CD25high TREG untersucht. Im FSC/SSC Dot-

plot wurden alle Lymphozyten erfasst, R2 beinhaltete CD3+ CD4+ Zellen. R3

umfasste CD4+ CD25high Lymphozyten. Farbung VI untersuchte die mittlere

Fluoreszenzintensitat (MFI) der TREG. R1–R3 war identisch mit Farbung I.

Zusatzlich wurden die TREG mit CD49d gefarbt und die MFI aller Zellen be-

rechnet. Die gleiche Analyse wurde fur CD25med mit mittelstarker Expression

von CD25 und CD25low mit schwacher Expression von CD25 durchgefuhrt (sie-

he Abbildung 2.4 auf Seite 33). Fur eine Ubersicht der Farbungen im FACS

siehe Abbildung 2.6 auf Seite 35.


Abbildung 2.6.:

Ubersicht der Lymphozytensubpopulationen im FACS. A1, A2 (CD28): Im

FSC/ SSC Dotplot wurden alle Lymphozyten einbezogen. In R2 wurden CD3+ CD4+ und

CD3+ CD4- ( = CD8+) Zellen identifiziert (A1). Im 3. Gate lassen sich CD28+ Lympho-

zyten abgrenzen (A2). B1, B2 (Thymusemigranten): Im FSC/SSC Dotplot wurden

alle Lymphozyten erfasst, das zweite Gate wurde auf CD4+ bzw. CD8+ Zellen gelegt.

In R3 lassen sich CD4+ CD45RA+ CD62L+ und CD8+ CD45RA+ CD62L+ Lymphozyten

abgrenzen. C1, C2, C3, C4 (B-Zellreihe): Im FSC/SSC Dotplot wurden alle Lympho-

zyten erfasst, R2 enthielt alle CD4- CD19+ Zellen (C1). Es sind deutlich Populationen fur

CD19 und CD27 zu erkennen (C2). In R3 lassen sich CD19 CD27+ Memory B-Zellen ab-

grenzen (C3). Fur Plasmazellen umfasste R2 alle CD4- CD19- Zellen, in R3 wurden CD138+

Plasmazellen identifiziert (nicht dargestellt). Fur T-Zellen lag R2 auf CD19- CD4+ Zellen,

in R3 wurden dann CD27+ Memory-T und CD27- Effektor T-Zellen unterschieden (C4).

D1, D2 (Monozyten): Im FSC/SSC Dotplot wurden alle mononuklearen Zellen erfasst.

R2 lag auf CD3- CD20- Non-B-non-T-Zellen (D1). In R3 wurden die verschiedenen Mono-

zytensubpopulationen analysiert (D4). Abb.: Eigene Grafik

2.5. Magnetresonanztomografie 36

2.5. Magnetresonanztomografie

Abbildung 2.7.:

MS-Lasionen in verschiedenen MRT-Wichtungen. Links: Zwei periventrikulare

Lasionen einer Patientin mit CIS im T1-gewichteten MRT. Rechts: Volumetrische Bestim-

mung der Lasionslast in Protonenwichtung bei der selben Patientin. Samtliche Lasionen

wurden mithilfe eines Werkzeugs in der Workstation fur jede Schicht separat manuell um-

fahren um die kumulative Lasionslast in mm2 zu erhalten (unten rechts). Zur Errechnung

der kumulierten Lasionslast uber alle Schichten wurden die EInzellasionen addiert und mit

dem Faktor 6,6 mm multipliziert. Zu erkennen ist ausserdem das perifokale Odem. Abbil-

dung: eigene Grafik

Als Meßgerat diente ein Kernspintomograf der Firma General Electrics He-

althcare (Signa Horizon) mit 1,5 Tesla Feldstarke. Folgenden Sequenzen und

Parametern wurden bei Patienten mit CIS und MS gemessen:

� Sag. T2 Fast-spin-echo (TE 85 ms, TR 3000 ms, FOV 24 cm, Frequenz 320,

Phase 256, Schichtdicke 3 mm, gap 10 %)

� Ax. T1 Spin-Echo (TE Min Full, TR 475 ms, FOV 24 cm, Frequenz 320,

Phase 224, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)

� Ax. FLAIR (TE 80 ms, TR 10000, FOV 24 cm, Frequenz 256, Phase 192,

Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)

� Ax. Protonendichtewichtung + T2 Fast-spin-echo (TE 25 ms, TR 3250 ms,

FOV 24 cm, Frequenz 320, Phase 256, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)

� Ax. T1 Spin-echo + Kontrastmittel (TE Min Full, TR 475 ms, FOV 24 cm,

Frequenz 320, Phase 224, Schichtdicke 6 mm, gap 10 %)

2.6. Biostatistische Methoden 37

Fur die quantitative Analyse wurden in PD und T2-Wichtung hyperinten-

se Lasionen berucksichtig, wie in der Literatur beschrieben (CHAMPS Study

Group, 2002) . Die FLAIR-Sequenz diente als Suchsequenz fur die Lasionen,

die eigentliche Volumetrie wurde in der Protonendichtewichtung (PD) mittels

des integrierten Werkzeuges der Advantage Workstation der Firma GE Heal-

thcare durchgefuhrt. Die Software erlaubt es dabei, Schichtbilder in PD und

T2-Wichtung simultan zu befunden um besser zwischen Lasionen und Liquor

diskriminieren zu konnen. Dabei wurden Lasionen ausgewertet, die sowohl in

der FLAIR, als auch in der PD-Sequenz erkennbar waren und manuell mithilfe

des integrierten Werkzeuges umfahren, um eine zweidimensionale Lasionsflache

pro Schicht zu erhalten. Zur Quantifizierung der kumulativen Lasionslast wur-

den die gesamten Lasionsflachen in mm2 aller Lasionen und aller Schichten

in PD-Wichtung addiert und mit dem Faktor 6,6 mm multipliziert, um eine

bestmogliche Naherung fur die Lasionslast in mm3 zu erhalten. Der Faktor

setzt sich aus 6mm Schichtdicke und einem nicht vom Scanner erfassten Zwi-

schenraum von 10 % (sog. Gap) zusammen. In Abbildung 2.7 auf Seite 36 sind

exemplarisch zwei Lasionen in T1-Wichtung und die volumetrische Bestimmung

in PD-Wichtung dargestellt.

In der Protonenwichtung lassen sich Lasionen durch den starken Kontrast der

Graustufen gut volumetrisch bestimmen. Die kumulative zerebrale Lasionslast

dient dabei der Quantifizierung und Objektivierung der entzundlichen Akti-

vitat bei Patienten mit MS und dient als Surrogatmarker fur die Evolution der

Krankheit (Brex u. a. 2002; Sormani u. a. 2009).

2.6. Biostatistische Methoden

Zur Uberprufung signifikanter Unterschiede zwischen der CIS, MS und Kontroll-

kohorte wurde der zweiseitige Mann-Whitney-U Test fur unverbundene Stich-

proben benutzt. Die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der Lasionslast er-

folgte mittels dem bivariaten Korrelationskoeffizient Spearman´s rho. Die ROC-

Analyse der Quotienten beinhaltete die”Area under the curve“ als globaler

Paramter fur die Gute der ROC sowie den p-Wert. Der optimale Cut-off wur-

de aus dem maximalen Produkt aus Sensitivitat und Spezifitat aller moglichen

Cutoffs bestimmt und entspricht in der grafischen Auftragung der Sensitivitat

(Ordinate) gegen 1-Spezifitat (Abszisse) dem Scheitelpunkt der Kurve. Die

ROC wurde nur bei signifikantem Unterschied der Quotienten durchgefuhrt. Bei

samtlichen statistischen Vergleichen wurden zweiseitige Tests auf einem 5 %igen

2.6. Biostatistische Methoden 38

Signifikanzniveau durchgefuhrt, Konfidenzintervalle wurden auf dem 95 % Ni-

veau als signifikant betrachtet. Wenn notig, wurde die konservative Bonferroni-

Korrektur fur multiples Testen angewendet und der p-Wert entsprechend an-

geglichen. Fur samtliche statistische Auswertungen wurde SPSS®16.0 (Stati-

stical Package for the Social Sciences) benutzt, fur die Datenorganisation MS

Excel® 2007 und MS Word® 2007.

3. Ergebnisse

3.1. Patientenkollektiv

Insgesamt wurden 64 therapienaive Patienten mit CIS, 18 Patienten mit defini-

tiver MS und 43 Patienten mit nicht-inflammatorischen neurologischen Krank-

heiten eingeschlossen und in insgesamt funf Kohorten eingeteilt (CIS-I, CIS-

II, MS, KONTROLLE-I, KONTROLLE-II). Die MS-Kohorte setzt sich aus 11

Patienten mit RR-MS, 6 mit SP-MS und einem mit PP-MS zusammen. Die

Liquorpunktion wurde im Durchschnitt mit 15± 28 Tagen Abstand zum MRT

durchgefuhrt. Oligoklonale Banden im Liquor fanden sich in 98,8 % der Patien-

ten mit CIS und bei keinem Patient in der Kontrollkohorte.

Die mittlere Lasionslast im T2-gewichteten cMRT aller CIS-Patienten lag bei

3 188± 7 452 mm3. Insgesamt drei Patienten prasentierten sich mit initial un-

auffalligem MRT, die mittlere Lasionszahl betrug 17± 23. Es bestand kein si-

gnifikanter Unterschied zwischen den Kohorten CIS-I und CIS-II im Hinblick

auf Lasionsvolumen oder Anzahl der Lasionen (Daten nicht abgebildet).

Ein initialer EDSS lag von allen eingeschlossenen Patienten mit CIS und MS

vor. Der Median des initialen EDSS bei CIS lag bei 2,0. Der 1-Jahres Follow-

Up EDSS konnte von 50 (ca. 78 %) der Patienten mit CIS erhoben werden. Von

insgesamt 14 Patienten konnte kein Follow-up erhoben werden (lost to follow-

up) oder ihr Studieneinschluss lag zeitlich zu nah am Studienende, sodass das

1-Jahres Intervall nicht eingehalten werden konnte.

Fur eine umfassende Patientencharakteristik siehe Tabelle 3.1 auf Seite 40,

zum therapeutischen Vorgehen im Schub und Intervalltherapie Tabelle 3.2 auf

Seite 41.

39

n Geschlecht Alter CSF EDSS Klinik Multifokal

Jahre Zellen OKB Beginn FU PI ON S B P O

n (f:m) MW± SD,

range

MW± SD,

range

n, % MW±SD, range n, % n,%

Studienkohorte

CIS-I 46 35:11 31± 9,7

[17�52]

15± 13

[2�66]

45, 98 2,4± 1,0

[1�6]

1,8± 1,3

[0�6]

0,5± 1,1

[-3,5�2]

14, 30 23, 50 8, 17 9, 20 12, 26 13, 28

MS 18 13:05 37± 11,3

[18�56]

10± 8

[1�31]

17, 94 2,8± 1,4

[1�6]

1,8± 1,0

[0�3,5]

0,3± 1,4

[-3,0�1,8]

4, 22 9, 50 1, 7 2, 11 2, 11 0, 0

Kontrolle-I 25 15:10 49± 16,5

[19�74]

3± 1

[1�5]

0, 0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

VLA-4 Kohorte

CIS-II 18 13:5 35± 8,8

[18�48]

1± 16

[3�73]

18, 100 2,5± 0,81

[1�4]

1,8± 0,93

[0�3]

2,5± 1,9

[-5,0�0,0]

1, 7 10, 57 6, 33 3, 17 4, 22 3, 17

Kontrolle-II 18 06:12 44± 13,4

[22�66]

3± 1

[1�5]

0, 0 n.a. n. a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

Tabelle 3.1.:

Patientencharakteristik. Das Patientenkollektiv gliedert sich in die Studienkohorte mit insgesamt n = 89 und die VLA-4 Kohorte mit insgesamt n = 36 Pro-

banden. Fur Einzelheiten siehe Abschnitt 3.1 auf Seite 39, zur erhaltenen Therapie siehe Tabelle 3.2 auf Seite 41. Der EDSS Wert wurde bei Krankheitsbeginn

und als 1-Jahres Follow-Up (FU) erhoben. Fur Patienten, bei denen kein Follow-Up vorlag oder die innerhalb des letzten Jahres vor Studienende einge-

schlossen wurden, wurde der Progressionsindex (PI) berechnet. Es sind Doppelnennung bei Prozentangaben unter”Klinik“ moglich. ON = Optikusneuritis,

S = Sensibilitatsstorungen, B = Bulbare Symptome, P = Paresen, O = Andere

3.2. Farbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high) 41

Tabelle 3.2.:

Patientencharakteristik – Therapie. In der Summe der Prozentwerte sind

Abweichungen von 100 % rundungsbedingt. Plasm = Plasmapherese, IF = Interferone,

Glat = Glatirameracetat, Nata = Natalizumab, Mitox = Mitoxantron

n Therapie

Im Schub Intervalltherapie

keine

n, %

Steroide

n, %

Plasma

n, %

keine

n, %

IF

n, %

Glat

n, %

Nata

n, %

Mitox

n, %

Studienkohorte

CIS-I 46 7, 15 37, 80 2, 4 23, 50 18, 39 3, 7 2, 4 0, 0

MS 18 4, 22 14, 78 0, 0 9, 50 5, 28 2, 11 0, 0 2, 11

VLA-4 Kohorte

CIS-II 18 6, 33 12, 66 0, 0 9, 50 6, 33 1, 6 1, 6 0, 0

3.2. Farbung I: regulatorische T-Zellen (CD25high)

Es wurden die Haufigkeiten der TREG unter allen CD4+ Lymphozyten im pe-

ripheren Blut und Liquor berechnet und zueinander ins Verhaltnis gesetzt. Der

fur die Kohorten getrennt berechnete Quotient Q wurde untereinander vergli-

chen, die Ergebnisse sind in Abbildung 3.1 auf Seite 42 und Tabelle 3.3 auf Sei-

te 42 dargestellt. Es findet sich ein signifikanter Unterschied der Quotienten im

Vergleich der Kohorten CIS-I und KONTROLLE-I (p≤ 0,001; Q = 1,6± 0,76 vs.

1,0± 0,78) mit einem großeren Quotienten in der CIS-Kohorte. Eine schwachere

Signifikanz lag fur den Vergleich von MS und KONTROLLE-I vor (p = 0,014;

Q = 1,5± 1,02 vs. 1,0± 0,78). Diese Ergebnisse sind hinweisend auf ein Ungleich-

gewicht zwischen Blut- und Liquorkompartiment mit relativem Uberwiegen der

TREG im peripheren Blut bei Patienten mit CIS und MS.

In der Korrelationsanalyse nach Spearman ergaben sich signifikante positive

Korrelationen in allen Stratifizierungen (keine, nach geringer Lasionslast und

nach EDSS Verbesserung im 1-Jahres FU). Die beste Korrelation konnte fur

die Stratifizierung nach Lasionslast gezeigt werden (r = 0,68; p≤ 0,001), die an-

deren Korrelationskoeffizienten waren mit 0,35 (keine Stratifizierung) bzw. 0,37

(EDSS Verbesserung) deutlich schwacher. Besonders fur Patienten mit eher

milder zerebraler Lasionslast besteht somit ein positiver Zusammenhang zwi-

schen Quotient und Lasionsvolumen. Je großer das Ungleichgewicht zwischen


Abbildung 3.1.:

Vergleich der Quotienten fur CD25high im Boxplot. Signifikante Unterschiede der

Quotienten fur den Vergleich der Kohorte CIS-I/MS mit KONTROLLE-I. Die Quotien-

ten fur CIS und MS sind erhoht und deuten auf ein relatives Uberwiegen der TREG im

peripheren Blut im Vergleich zum Liquorkompartiment bei Patienten mit CIS und MS hin.

Tabelle 3.3.:

Deskriptive Statistik Farbung I. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der CD25high

Zellen an allen CD4+ Lymphozyten, getrennt fur Blut und Liquor sowie der Quotient

PBL/CSF. Angaben im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-

I, p†= Vergleich von CIS-I:MS, p‡= Vergleich von MS:KONTROLLE-I.

p

n % PBL % CSF Quotient p†

p‡

CD4+ CD25high

CIS-I 46 6± 3,0

[1�19]

4± 1,8

[0,5�9]

1,6± 0,76

[0,4�4,3]

≤ .001

MS 16 8± 3,7

[4�18]

6± 3,2

[2�14]

1,5± 1,02

[0,6�4,6]

NS

KONTROLLE-I 25 4± 2,0

[1�10]

6± 2,8

[1�11]

1,0± 0,78

[0,2�4,7]

.014


Tabelle 3.4.:

Ergebnisse Farbung I. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse des Quotienten mit der

Lasionslast im cMRT. Es liegt eine positive signifikante Korrelation vor, der großte Kor-

relationskoeffizient findet sich in der Stratifizierung fur geringe Lasionslast (≤ 6 Lasionen,

p = 0,68). in der ROC finden sich fur alle Stratifizierungen annahernd identische signifikant-

signifikante AUC Werte und Sensitivitaten/spezifitaten. r = Korrelationskoeffizient nach

Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechneter Cut-off.

Stratifizierung Korrelation ROC

r p AUC p Cut Sens Spez PPV NPV LHR

CD4+ CD25high

keine 0,35 .007 0,79 ≤ .001 1,1 0,76 0,76 0,81 0,70 3,19

≤ 6 Lasionen 0,68 ≤ .001 0,77 ≤ .001 1,1 0,76 0,76 0,69 0,82 3,19

EDSS 0,37 .016 0,81 ≤ .001 1,1 0,79 0,76 0,77 0,78 3,30

Blut- und Liquorkompartiment mit relativem Uberwiegen der TREG im pe-

ripheren Blut ist, desto großer ist die kraniale Lasionslast im initialen cMRT.

In der ROC zeigte sich eine durchgangig gute und signifikante AUC zwischen

0,76 und 0,79, was einer Sensitivitat und Spezifitat von ca. 0,76 entspricht. Die

Berechnung ergab einen Cut-off von 1,1 fur den Quotienten. Werte oberhalb

des Cut-offs sprechen starker fur den”positiven Ist-Zustand“, in diesem Fall

die Diagnose”CIS“. Fur die Berechnung wurden deshalb Patienten mit CIS

und einem Quotienten großer als 1,1 als”richtig positiv“ zur Bemessung der

Testgutekriterien betrachtet, gesunde Kontrollpersonen mit einem Quotienten

kleiner 1,1 als”richtig negativ“. Ein Quotient fur TREG von 1,1 diskriminiert in

ca. 75 % der Falle erfolgreich zwischen den Diagnosen”CIS“ und

”kein CIS“. Bei

Betrachtung aller Patienten lag bei 81 % der Patienten mit einem Quotienten

großer als 1,1 tatsachlich ein CIS vor (positiv pradiktiver Wert, PPW), wahrend

bei 70 % mit einem Quotienten kleiner als 1,1 tatsachlich kein CIS diagnostiziert

wurde (negativ pradiktiver Wert, NPW). Die Ergebnisse der Korrelationsanaly-

se und der ROC sind tabellarisch auf Seite 43 und in Abbildung 3.2 auf Seite 44

dargestellt. Die Bonferroni-Korrektur betrug fur insgesamt neunfaches Testen

der TREG 0,05/9 = 0,0055. Deshalb wurde α= 0,55 % als signifikant betrachtet.

In CIS-II wurde die mittlere Fluoreszenzintensitat (MFI) fur VLA-4 (CD49d)

in Abhangigkeit der Expression fur CD25 untersucht. Sowohl im PBL als auch

im CSF wurde eine absteigende Tendenz der MFI mit steigender Expression von

CD25 beobachtet. Die großte MFI wurde bei CD4+ CD25low, die niedrigste fur

CD4+ CD25high TREG gefunden. Insgesamt war die MFI im PBL signifikant


Abbildung 3.2.:

Korrelations- und ROC-Analyse fur TREG. Links: Signifikante Korrelation nach

Spearman fur CD4+ CD25high TREG, stratifiziert nach Lasionslast (≤ 6 Lasionen).

Je großer das Ungleichgewicht zwischen Blut- und Liquorkompartiment mit relativem

Uberwiegen der TREG im peripheren Blut ist, desto großer ist die kraniale Lasionslast

im initialen cMRT. Rechts: Signifikante ROC fur die selbe Zellpopulation in gleicher Stra-

tifizierung.

Tabelle 3.5.:

Ergebnisse fur VLA-4. Dargestellt sind mittlere Fluoreszenzintensitaten (MFI) fur

VLA-4 der Kohorten CIS-II und KONTROLLE-II im PBL und CSF. Es zeigt sich eine

verminderte MFI fur alle Expressionsniveaus von CD25 bei Patienten mit CIS. Angaben

im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-II und KONTROLLE-II im PBL,

p†= Vergleich von CIS-II und KONTROLLE-II im CSF.

MFI PBL p MFI CSF p†

CIS-II KONTROLLE-II CIS-II KONTROLLE-II

CD25low

229± 98

[48�403]

338± 139

[167�726]

.029 543± 216

[92�988]

715± 235

[319�1 193]

.038

CD25med

185± 65

[65�286]

244± 69

[130�379]

.012 422± 145

[106�678]

539± 140

[281�806]

.017

CD25high

167± 65

[70�286]

232± 65

[140�396]

.010 431± 146

[107�650]

489± 111

[303�691]

NS


Abbildung 3.3.:

MFI fur VLA-4 im PBL stratifiziert nach Expressionsniveau fur CD25. Es finden sich

signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit CIS und Kontrollen fur CD25med und

CD25high CD4+ T-Zellen mit einem reduzierten Rezeptorbesatz fur VLA-4 bei Patienten

mit CIS, CD25low ist knapp nicht signifikant. Transparent hinterlegt: CD4+ CD25low-high

TREG im FACS .

niedriger als im CSF (Daten nicht gezeigt, p≤ 0,001), siehe Abbildungen 3.3

und 3.4 auf Seite 45 und 46. Signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit

CIS und Kontrollen wurden fur CD4+ CD25med und CD4+ CD25high T-Zellen

im PBL gefunden, CD4+ CD25low verpasste Signifikanz knapp (p = 0,029). Im

CSF war das Ergebnis fur CD4+ CD25med ebenfalls signifikant, auch hier war

CD4+ CD25low knapp nicht mehr signifikant (p = 0,038). Da die MFI ein in-

direktes Maß fur die Bindungsfahigkeit eines Antikorpers uber Rezeptoren auf

der Zelloberflache darstellt, scheint also der Rezeptorbesatz fur VLA-4 bei Pati-

enten mit CIS auf allen CD4+ T-Zellen erniedrigt zu sein. Fur eine detaillierte

Ubersicht der MFI siehe Tabelle 3.5 auf Seite 44. Angepasst fur die Testung von

je zwei Hypothesen fur VLA-4 betrug die Bonferroni-Korrektur 0,05/2 = 0,025.

Daher wurde im Folgenden α= 2,5 % als statistisch signifikant betrachtet.

3.3. Farbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28) 46

Abbildung 3.4.:

MFI fur VLA-4 im CSF stratifiziert nach Expressionsniveau fur CD25. Es finden sich

signifikante Unterschiede zwischen Patienten mit CIS und Kontrollen fur CD4+ CD25med

T-Zellen mit einem reduzierten Rezeptorbesatz fur VLA-4 bei Patienten mit CIS,

CD4+ CD25low verpasst knapp Signifikanz. Transparent hinterlegt: CD4+ CD25low-high

TREG im FACS.

3.3. Farbung II: T-Zell Co-Rezeptor (CD28)

Die prozentualen Anteile der CD28+ T-Lymphozyten an allen CD4+ bzw.

CD8+ Zellen wurden errechnet und jeweils der Quotient aus PBL und CSF

gebildet (siehe Tabelle 3.6 auf Seite 47 und Abbildung 3.5 auf Seite 48). Es

ergaben sich keine relevanten und signifikanten Unterschiede der Quotienten im

Vergleich der Kohorten CIS-I (1,0± 0,04 fur CD4+ und 1,0± 0,5 fur CD8), MS

(1,0± 0,05 fur CD4 und 0,9± 0,3 fur CD8) und KONTROLLE-I (1,0± 0,1 fur

CD4 und 0,8± 0,3 fur CD8). Diese Daten sprechen gegen das Vorliegen eines

relativen Ungleichgewichts im Blut- und Liquorkompartiment bei den Patien-

tenkohorten.

In der Korrelationsanalyse nach Spearman ergaben sich keine Hinweise auf

eine Korrelation der Quotienten mit der kranialen Lasionslast in beiden Zellpo-

pulationen und allen Stratifizierungen (siehe Tabelle 3.7 auf Seite 48). Es konnte

kein Zusammenhang zwischen der Verteilung der Zellen im PBL und CSF und


Tabelle 3.6.:

Deskriptive Statistik Farbung II. Dargestellt sind die prozentualen Anteile der CD28+

Zellen an allen CD4+ bzw. CD8+ Lymphozyten, getrennt fur Blut und Liquor sowie

der Quotient PBL/CSF. Angaben im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-

I:KONTROLLE-I, p†= Vergleich von CIS-I:MS, p‡= Vergleich von MS:KONTROLLE-1.

p


p‡

CD4+ CD28+

CIS-I 45 95± 3,6

[84�99]

95± 2,2

[90�99]

1,0± 0,04

[0,9�1,0]

NS

MS 18 94± 4,6

[82�98]

93± 4,8

[84�99]

1,0± 0,05

[0,9�1,1]

NS


[70�99]

89± 7,4

[63�98]

1,0± 0,1

[0,7�1,2]

NS

CD8+ CD28+

CIS-I 45 54± 15,3

[14�88]

61± 11,7

[30�86]

1,0± 0,5

[0,3�2,7]

NS

MS 18 51± 12,3

[27�69]

56± 11,4

[29�78]

0,9± 0,3

[0,4�1,4]

NS


[21�72]

60± 9,2

[41�77]

0,8± 0,3

[0,3�1,6]

NS

der kranialen Lasionslast als Surrogatparameter fur die Schwere der Erkran-

kung gezeigt werden. Auf eine ROC-Analyse wurde aufgrund des fehlenden

Unterschieds der Quotienten verzichtet. Angepasst fur die Testung von sechs

Hypothesen pro untersuchter Zellpopulation betrug die Bonferroni-Korrektur

0,05/6 = 0,0083. Daher wurde im folgenden α= 0,83 % als statistisch signifikant

betrachtet.


Abbildung 3.5.:

Vergleich der Quotienten fur CD28+ im Boxplot. Links: Boxplots fur CD4+ CD28+

Zellen. Rechts: Boxplots fur CD8+ CD28+ Zellen. Keine relevanten oder signifikanten Un-

terschiede in den Quotienten im Vergleich der Kohorte CIS-I, MS und gesunden Kontrollen

im zweiseitigen Mann-Whitney-U Test fur unverbundene Stichproben. Es liegt kein Un-

gleichgewicht zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment vor.

Tabelle 3.7.:

Ergebnisse Farbung II.Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der

Lasionslast im cMRT. r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under cur-

ve, Cut = errechnete Cut-off. Keine Korrelation in allen Stratifizierungen. Es konnte kein

Zusammenhang zwischen der Verteilung der Zellen im PBL und CSF und der kranialen

Lasionslast als Surrogatparameter fur die Schwere der Erkrankung gefunden werden. Auf

die Durchfuhrung der ROC wurde verzichtet.



CD4+ CD28+

keine -0,3 NS NA

≤ 6 Lasionen 0,1 NS NA

EDSS -0,1 NS NA

CD8+ CD28+

keine -0,2 NS NA


EDSS 0,1 NS NA

3.4. Farbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138) 49

3.4. Farbung III: B-Zell-Reihe (CD27, CD138)

Abbildung 3.6.:

Vergleich der Quotienten fur CD19+ im Boxplot. Links: Boxplots fur reife B-Zellen.

Rechts: Boxplots fur Memoryzellen. Signifikante Unterschiede der Quotienten im Vergleich

der Kohorten CIS-I/MS mit gesunden Kontrollen im zweiseitigen Mann-Whitney-U Test

fur unverbundene Stichproben. Die erniedrigten Quotienten in den Patientenkohorten re-

sultieren aus einem erhohten Zellanteil im Liquor.

In Farbung III wurde Blut und Liquor auf reife B-Zellen (CD19+), Memory-

B-Zellen (CD19+ CD27+), Plasmazellen (CD19- CD138+), Memory-T-Zellen

(CD4+ CD27+) und Effektor-T-Zellen (CD4+ CD27-) untersucht.

Die Quotienten und Prozentwerte sind in Tabelle 3.8 auf Seite 50 und Abbil-

dung 3.6 auf Seite 49 dargestellt. Nach Bonferroni-Korrektur mit 0,05/6 = 0,0083

fur multiples Testen der Quotienten und Korrelationen blieben als statistisch si-

gnifikant die p-Werte fur reife B-Zellen und Memory B-Zellen (jeweils p≤ 0,001).

Fur reife B-Zellen lag der mittlere Quotient bei 4,9± 5,5 (CIS) und 14,4± 13,2

(Kontrolle), fur Memory B-Zellen bei 1,8± 1,8 (CIS) und 6,1± 4,2 (Kontrol-

le). Die kleineren Quotienten in den Patientenkohorten resultieren aus einer

großeren Haufigkeit der Zellen im Liquor. Es fanden sich signifikant mehr CD19+

und CD19+ CD27+ Zellen im CSF von Patienten als in der Kontrollkohorte.Fur

reife B-Zellen und Memory B-Zellen wurde im folgenden die ROC Auswertung

durchgefuhrt und die Bonferroni-Korrektur betrug fur dreifach zusatzliche Tes-

tung 0,05/9 = 0,0055. Der p-Wert der Quotienten fur Plasmazellen wurde nach

Bonferroni-Adjustierung als nicht signifikant betrachtet.

In der ROC fur reife und Memory B-Zellen deuten kleinere Werte der Quo-

tienten starker auf den positiven Ist-Zustand hin, in diesem Fall die Diagnose

CIS. Das bedeutet, dass im folgenden Patienten mit einem Quotient kleiner

oder gleich als der errechnete Cut-off und der Diagnose CIS als”richtig positiv“


Tabelle 3.8.:

Deskriptive Statistik Farbung III. Dargestellt sind Prozentwerte und Quotien-

ten. Angaben im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-I,

p†= Vergleich von CIS-I:MS, p‡= Vergleich von MS:KONTROLLE-1.

p


p‡

CD19+ (reife B-Zellen)

CIS-I 45 12± 5,0

[5�35]

5± 5,6

[0,5�33]

4,9± 5,5

[0,7�25,0]

≤ .001

MS 16 12± 6,0

[6�25]

6± 4,7

[0,7�21]

4,3± 5,0

[0,9�21,2]

NS


[4�28]

2± 1,5

[0,3�6]

14,4± 13,2

[1,4�49,5]

≤ .001

CD19- CD138+ (Plasmazellen)

CIS-I 45 0,3± 0,4

[0�3]

1± 2,7

[0�16]

0,4± 0,5

[0,0�2,8]

.021

MS 16 0,2± 0,1

[0,1�0,5]

1± 2,2

[0,1�9]

0,7± 1,3

[0,1�5,0]

NS

KONTROLLE-I 22 0,4± 0,7

[0�3]

2± 1,7

[0�5]

0,2± 0,2

[0,1�0,7

NS

CD19+ CD27+ (Memory-B-Zellen)

CIS-I 45 4± 2,0

[0,8�11]

4± 5,0

[0,3�23]

1,8± 1,8

[0,3�9,4]

≤ .001

MS 16 3± 1,6

[0,1�7]

4± 4,5

[0,2�19]

1,7± 1,9

[0,3�7,4]

NS


[2�15]

1± 1,3

[0,1�6]

6,1± 4,2

[0,4�17,5]

≤.001

CD4+ CD27+ (Memory-T-Zellen)

CIS-I 30 92± 4,5

[81�97]

91± 6,6

[60�99]

1,0± 0,1

[0,9�1,6]

NS

MS 2 92± 0,6

[92�93]

88± 3,1

[86�91]

1,0± 0,04

[1,0�1,1]

NS


[72�93]

85± 5,1

[74�90]

1,0± 0,1

[0,9�1,4]

NS

CD4+ CD27- (Effektor-T-Zellen)

CIS-I 30 8± 4,5

[3�19]

7,8± 3,1

[1�14]

1,2± 1,1

[0,4�6,1]

NS

MS 2 8± 0,5

[7�8]

10± 1,6

[9�11]

0,7± 0,2

[0,6�0,9]

NS


[4�29]

14± 5,6

[4�25]

0,9± 0,5

[0,4�1,8]

NS


Tabelle 3.9.:

Ergebnisse Farbung III. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit

der Lasionslast im cMRT und die ROC-Analyse. Es liegt eine signifikante Korrelation fur

Plasmazellen vor. Die ROC wurde fur reife B-Zellen und Memory-B-Zellen durchgefuhrt.

r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechnete

Cut-off.



CD19+ (reife B-Zellen)

keine -0,07 NS 0,85 ≤ .001 4,4 0,74 0,92 0,94 0,68 9,44

≤ 6 Lasionen -0,24 NS 0,87 ≤ .001 4,4 0,78 0,92 0,90 0,82 9,78

EDSS -0,21 NS 0,83 ≤ .001 4,4 0,76 0,92 0,93 0,72 9,29

CD19- CD138+ (Plasmazellen)

keine 0,41 .006 NA

≤ 6 Lasionen 0,55 .007 NA

EDSS 0,26 NS NA

CD19+ CD27+ (Memory-B-Zellen)

keine -0,20 NS 0,84 ≤ .001 2,8 0,84 0,74 0,86 0,71 3,24

≤ 6 Lasionen -0,35 NS 0,86 ≤ .001 2,6 0,83 0,78 0,79 0,82 3,80

EDSS -0,24 NS 0,83 ≤ .001 4,6 0,91 0,65 0,80 0,83 2,63

CD4+ CD27+ (Memory-T-Zellen)

keine -0,01 NS NA


EDSS 0,06 NS NA

CD4+ CD27- (Effektor-T-Zellen)

keine -0,02 NS NA

≤ 6 Lasionen -0,40 NS NA

EDSS -0,12 NS NA

betrachtet wurden, Patienten mit einem Quotienten kleiner als der Cut-off aber

ohne klinisch-isoliertes Syndrom als”falsch positiv“.

Fur reife B-Zellen erbrachte die ROC fur alle Stratifizierungen mit einer Sen-

sitivitat von ca. 0,78 und die Spezifitat von 0,92 ahnliche Werte. 92 % der

Probanden, bei denen ein Quotient kleiner als der errechnete Cut-off gefun-

den wurde, wurde tatsachlich die Diagnose”CIS“ gestellt (PPV, stratifiziert

nach Lasionslast). Bei 82 % der Probanden mit einem Quotienten großer als

der Cut-off konnte die Diagnose”CIS“ nicht gestellt werden (NPV). Fur Me-

mory B-Zellen ohne Stratifizierung lag die Sensitivitat bei 0,84 und Spezifitat

bei 0,74. PPV und NPV waren etwas schwacher als bei der Betrachtung aller


reifen B-Zellen. Die Quotienten waren damit in der Lage, zwischen Patienten

mit CIS und anderen neurologischen Krankheiten zu diskriminieren.

Die Korrelationsanalyse erbrachte schwache bis keine Korrelationen der Quoti-

enten mit der kranialen Lasionslast (nicht signifikant). Lediglich fur Plasmazel-

len deuten r≈ 0,5 und p-Werte kleiner als 0,008 auf eine mittelgradige positive

Korrelation des Quotienten mit der kranialen Lasionslast hin (siehe Tabelle 3.9

auf Seite 51 und Abbildung 3.7 auf Seite 52). Dies wurde paradoxerweise bedeu-

ten, dass je mehr Plasmazellen im Blut bzw. je weniger im Liquor vorhanden

sind, desto großer die Lasionslast ist.

Abbildung 3.7.:

Korrelations- und ROC-Analyse fur CD19. Links: signifikante Korrelationsanalyse

fur Plasmazellen. Rechts: ROC fur reife B-Zellen (Kreise) und Memory B-Zellen (Kreuze).

Beide ohne Stratifizierung.

3.5. Farbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L) 53

3.5. Farbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L)

Abbildung 3.8.:

Vergleich der Quotienten fur CD45 im Boxplot. Links: Boxplots fur CD4+ Thy-

musemigranten. Rechts: Boxplots fur CD8+ Thymusemigranten. Keine signifikanten Un-

terschiede der Quotienten und somit kein Dysaquilibrium fur Thymusemigranten in den

Patientenkohorten.

Fur eine Ubersichtliche Darstellung der Quotienten siehe Tabelle 3.10 auf

Seite 54 und Abbildung 3.8 auf Seite 53. Es ergaben sich keine relevanten und

signifikanten Unterschiede der Quotienten im Vergleich der Kohorten CIS-I, MS

und KONTROLLE-I. Somit liegt kein Dysaquilibrium fur Thymusemigranten

bei Patienten mit CIS oder MS vor.

In der Korrelationsanalyse ergaben sich keine Hinweise auf eine Korrelation

der Quotienten mit der Lasionslast fur CD8+ Zellen, jedoch eine schwache bis

mittelgradige negative Korrelation fur die CD4+ Population ohne Stratifizie-

rung (r = -0,38; p = 0,016, nicht mehr signifikant nach Bonferroni-Korrektur) so-

wie stratifiziert nach EDSS (r = -0,53; p = 0,004, signifikant), siehe Tabelle 3.11

auf Seite 54. Je haufiger Thymusemigranten im peripheren Blut bzw. je selte-

ner sie im Liquor vorkommen, desto geringer ist die kraniale Lasionslast. Auf

eine ROC-Analyse wurde aufgrund des fehlenden Unterschieds der Quotienten

verzichtet. Angepasst fur die Testung von sechs Hypothesen pro untersuchter

Zellpopulation betrug die Bonferroni-Korrektur 0,05/6 = 0,0083. Daher wurde

im folgenden α= 0,83 % als statistisch signifikant betrachtet.

3.5. Farbung IV: Thymusemigranten (CD45RA, CD62L) 54

Tabelle 3.10.:

Deskriptive Statistik Farbung IV. Dargestellt sind Prozentwerte und Quotien-

ten. Angaben im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-I:KONTROLLE-I,

p†= Vergleich von CIS-I:MS, p‡= Vergleich von MS:KONTROLLE-1.

p


p‡

CD4+ CD45RA+ CD62L+ (Thymusemigranten)

CIS-I 39 44± 16,0

[14�90]

2,8± 1,9

[0,6�11]

19,0± 8,9

[5,3�41,3]

NS

MS 16 41± 10,6

[27�57]

3,4± 1,7

[2�8]

14,4± 6,6

[4,2�27,1]

NS


[22�56]

3,8± 3,4

[0,7�12]

18,7± 12,3

[3,6�51,7]

NS

CD8+ CD45RA+ CD62L+ (Thymusemigranten)

CIS-I 37 31± 14,0

[6�54]

12,3± 8,6

[2�47]

3,7± 3,8

[0,5�22,7]

NS

MS 17 25± 13,9

[3�54]

13± 6,0

[5�29]

2,3± 1,4

[0,1�5,2]

NS


[6,4�55]

15± 8,8

[3�31]

2,5± 2,3

[3,6�51,7]

NS

Tabelle 3.11.:

Ergebnisse Farbung IV. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der

Lasionslast im cMRT. Schwache bis mittelgradige negative Korrelation fur CD4+ Thymuse-

migranten. Je haufiger Thymusemigranten im peripheren Blut bzw. je seltener sie im Liquor

vorkommen, desto geringer ist die kraniale Lasionslast. Auf eine ROC-Analyse wurde auf-

grund des fehlenden Unterschieds der Quotienten verzichtet. r = Korrelationskoeffizienten

nach Spearman, AUC = Area under curve, Cut = errechnete Cut-off.



CD4+ CD45RA+ CD62L+

keine -0,38 .016 NA

≤ 6 Lasionen -0,3 NS NA

EDSS -0,53 .004 NA

CD8+ CD45RA+ CD62L+

keine 0,18 NS NA


EDSS 0,15 NS NA

3.6. Farbung V: Monozyten (CD14, CD16) 55

3.6. Farbung V: Monozyten (CD14, CD16)

Abbildung 3.9.:

Vergleich der Quotienten fur CD14+/CD16+ im Boxplot. Links: Boxplots fur

CD14+ CD16- (linke Boxen, ausgefullt) und CD14- CD16+ (rechte Boxen, liniert), keine

signifikanten Unterschiede. Rechts: Boxplots fur CD14+ CD16+ Zellen. Signifikante Un-

terschiede der Quotienten fur CD14+ CD16+ Zellen im Vergleich von CIS-I:Kontrollen.

Bei Patienten mit CIS liegt somit ein Mißverhaltnis fur CD14+ CD16+ Monozyten mit

vermindertem Anteil im CSF vor. Zweiseitiger Mann-Whitney-U Test fur unverbundene

Stichproben.

Die Quotienten und Prozentwerte sind in Tabelle 3.12 auf Seite 56 und Abbil-

dung 3.9 auf Seite 55 dargestellt. Nach Bonferroni-Korrektur mit 0,05/6 = 0,0083

fur multiples Testen der Quotienten und Korrelationen blieben als statistisch si-

gnifikant die Werte fur CD14+ CD16+ Monozyten (p = 0,002) fur den Vergleich

der Quotienten der CIS-I und Kontrollkohorte; mit p = 0,049 war der Vergleich

der Kohorten MS und Kontrolle damit nicht mehr signifikant. Bei Patienten mit

CIS liegt somit ein Mißverhaltnis fur CD14+ CD16+ Monozyten mit verminder-

tem Anteil im CSF vor. Fur die anderen untersuchten Monozytenpopulationen

fand sich kein signifikanter Unterschied.

Die Korrelationsanalyse ergabe schwache bis keine Korrelationen der kra-

nialen Lasionslast mit den Quotienten fur alle Monozytenpopulationen (alle

nicht signifikant). Es ergaben sich somit keine Hinweise darauf, dass die Dys-

balance der CD14+ CD16+ Monozyten im Zusammenhang mit der kranialen

Lasionslast steht. Fur diese Population wurde die ROC durchgefuhrt und das Si-

gnifikanzniveau nach Bonferroni auf 0,05/9 = 0,0055 und α= 0,55 % angehoben.

Großere Werte der Quotienten deuteten dabei starker auf den positiven Zustand

(CIS) hin, kleinere Werte sprechen eher gegen das Vorliegen eines CIS. Die beste

Auswertung ergab die Stratifizierung nach Lasionslast (AUC = 0,78; p = 0,002


Sensitivitat = 0,74; Spezifitat = 0,73). Der Quotient fur CD14+ CD16+ Mono-

zyten ist in ca. 75 % der Falle geeignet um zwischen der Diagnose”CIS“ und

”kein CIS“ zu unterscheiden. Bei der Stratifizierung nach EDSS-Verbesserung

war der p-Wert mit 0,008 nach Bonferroni-Korrektur knapp nicht mehr signi-

fikant. Knapp 80 % der Probanden, bei denen ein Quotient großer als der er-

rechnete Cut-off gefunden wurde, wurde tatsachlich die Diagnose”CIS“ gestellt

(PPV, stratifiziert nach Lasionslast). 67 % der Probanden mit einem Quotienten

kleiner als der Cut-off hatten die Diagnose”kein CIS“ (NPV). Fur eine kom-

plette Ubersicht der Ergebnisse der ROC und Korrelationen siehe Tabelle 3.13

auf Seite 57 und Abbildung 3.10 auf Seite 57.

Tabelle 3.12.:

Deskriptive Statistik Farbung V. Dargestellt sind Prozentwerte an allen CD3- CD20-

Zellen und Quotienten. Angaben im Format MW± SD, [range]. p = Vergleich von CIS-

I:KONTROLLE-I, p†= Vergleich von CIS-I:MS, p‡= Vergleich von MS:KONTROLLE-1.

p


p‡

CD14+ CD16- (Monozyten)

CIS-I 40 41± 11,2

[4�67]

9± 7,9

[0,6�32]

14,2± 19,37

[0,25�47,76]

NS

MS 15 36± 19,2

[2�76]

9± 9,0

[0,9�37]

9,9± 11,69

[0,4�41,2]

NS


[5�53]

16± 14,5

[0,8�50]

7,3± 10,52

[0,3�42,6]

NS

CD14- CD16+ (Monozyten)

CIS-I 38 32± 11,7

[2�54]

4± 3,7

[0�13]

12,8± 11,47

[0,2�60,4]

NS

MS 15 26± 17,9

[1�76]

4± 3,8

[1�14]

10,9± 10,51

[0,5�33,8]

NS


[3�60]

2± 2,0

[0�6]

21± 22,4

[1,5�74,4]

NS

CD14+ CD16+ (Monozyten)

CIS-I 40 6± 2,6

[1�13]

11± 6,2

[1�84]

2,1± 3,60

[0,1�20,2]

.002

MS 15 7± 9,8

[0�44]

13± 18,8

[1�62]

2,3± 2,86

[0,1�8,9]

NS


[1�18]

26± 19,0

[1�64]

0,9± 1,6

[0,1�5,5]

.049


Tabelle 3.13.:

Ergebnisse Farbung V. Dargestellt ist die Korrelationsanalyse der Quotienten mit der

Lasionslast im cMRT und die ROC-Analyse. Es liegt keine signifikante Korrelation fur

CD14+ CD16+ Monozyten vor. Fur die Population stratifiziert nach Lasionslast wurde die

ROC durchgefuhrt. r = Korrelationskoeffizienten nach Spearman, AUC = Area under curve,

Cut = errechneter Cut-off.



CD14+ CD16- (Monozyten)

keine 0,09 NS NA


EDSS 0,01 NS NA

CD14- CD16+ (Monozyten)

keine -0,22 NS NA


EDSS -0,22 NS NA

CD14+ CD16+ (Monozyten)

keine -0,01 NS 0,73 .002 0,32 0,77 0,68 0,77 0,68 2,41

≤ 6 Lasionen 0,20 NS 0,78 .002 0,38 0,74 0,73 0,79 0,67 2,72

EDSS -0,09 NS 0,71 .008 0,38 0,74 0,73 0,79 0,67 2,72

Abbildung 3.10.:

Korrelations- und ROC-Analyse fur CD14. Links: Signifikante Korrelationsanalyse

fur CD14+ CD16+ Monozyten, stratifiziert nach Lasionslast (≤ 6 Lasionen). Rechts: ROC

fur die selbe Zellpopulation in gleicher Stratifizierung mit signifikanter AUC = 0,80.

3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse 58

3.7. Zusammenfassung der Ergebnisse

Die Analyse der Quotienten erbrachte nach Bonferroni-Korrektur signifikan-

te Unterschiede und somit einen Hinweis auf eine Dysbalance im Blut- und

Liquorkompartiment bei TREG (CD4+ CD25high), reifen B-Zellen (CD19+),

Memory B-Zellen (CD19+ CD27+) und Monozyten (CD14+ CD16+). Keine

Unterschiede wurden fur CD28 T-Zellen, Plasmazellen (CD138+, nicht signifi-

kant nach Bonferroni-Korrektur), T-Zellen (CD4+ CD27+ und CD4+ CD27-),

Thymusemigranten (CD45RA+ CD62L+) und Monozyten (CD14+ CD16- und

CD14- CD16+) gefunden. Fur TREG und Plasmazellen korrelierte der Quotient

positiv mit der kranialen Lasionslast im cMRT, das heisst, je großer die relative

Haufigkeit der Zellen im Blut im Vergleich zum Liquor bei Diagnosestellung

war, desto großer war die initiale kumulative Lasionslast. Fur CD4+ Thymu-

semigranten fand sich stratifiziert nach EDSS eine negative Korrelation mit

inverser Beziehung zwischen Quotient und Lasionslast. Die Analyse der TREG

hinsichtlich des Oberflachenbesatzes fur VLA-4 konnte eine signifikant vermin-

derte MFI bei Patienten mit CIS im Vergleich zu Kontrollen zeigen. Expression

fur VLA-4 war fur CD25high durchschnittlich bei allen Probanden schwacher als

fur CD25med und CD25low CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse deuten auf einen

Veranderten Rezeptorbesatz auf CD4+ T-Zellen fur VLA-4 bei Patienten mit

CIS hin.

4. Diskussion

4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik

Tabelle 4.1.:

Vergleich des Studienkollektivs (CIS) mit dem Verumarm der BENEFIT-

Kohorte (CIS) und dem deutschen MS-Register. Es finden sich annahernd gleiche

demografische und klinische Charaktersitika der Probanden. Flachenecker u. a. (2008) eva-

luierten MS-Patienten (und nicht CIS-Patienten) in Deutschland, deshalb liegt der initiale

EDSS und der Anteil mit einem EDSS ≤ 4,0 uber dem in dieser Studie gefundenen. Auffallig

ist die hohere Lasionslast in der BENEFIT-Kohorte.

n weibl. Alter EDSS T2 MRT

Beginn ≤ 4,0 Lasionen Vol [mm3]

n, % MW±SD Median % Median Median

CIS I+II 64 48, 75 32± 9,6 2,0 91 6 914

Kappos u. a.

(2006)

292 207, 71 30± k.A. 1,5 k.A. 18 1 951

Flachenecker

u. a. (2008)

3 223 ?, 72 31± 10,2 3,5 51 k.A. k.A.

Demografische und klinische Variablen des Studienkollektivs im Vergleich

zum Verumarm der BENEFIT Kohorte (Kappos u. a. 2006) und des MS-Registers

in Deutschland (Flachenecker u. a. 2008) sind in Tabelle 4.1 auf Seite 59 dar-

gestellt. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung und die Geschlechtsverteilung

mit ca 70 % weiblichen Probanden in unserem Studienkollektiv spiegeln gut die

demografischen Verhaltnisse in Deutschland und im großen Patientenkollek-

tiv der BENEFIT-Studie wider. Die Kohorte der CIS-Patienten ist mit n = 64

groß genug, um statistische Aussagen treffen zu konnen. Fruhere Studien wie-

sen erheblich kleinere Probandenzahlen auf (Viglietta u. a. 2004; Aristimuno

u. a. 2008). In die MS-Kohorte (n = 18) konnte keine vergleichbare Zahl an Pa-

tienten rekrutiert werden, da zur Diagnosestellung”MS“ das Kriterium der

zeitlichen und ortlichen Dissemination erfullt sein muss, serielle Liquorpunktio-

nen aber in der Regel nicht duchgefuhrt werden. Somit musste auf Patienten

gewartet werden, welche aus anderen Grunden eine Liquorpunktion benotigten,

59

4.1. Diskussion des Studienkollektivs und Methodik 60

oder nicht im Stadium “CIS“ erstmalig zur Diagnostik erschienen und gleich-

zeitig die Einschlusskriterien beachteten. Der Unterschied in der Alters- und

Geschlechtsstruktur der CIS und Kontrollgruppe (31± 9,7 vs. 49± 16,5 Jahre;

f:m = 35:11 in CIS-I) begrundet sich in der Epidemiologie des CIS mit einer

Praferenz fur Frauen im jungeren Lebensalter (Flachenecker u. a. 2008). Die

klinische Prasentation der Patienten ist im Einklang mit dem Beschwerdeprofil

des Verumarms der BENEFIT-Kohorte. Die haufigsten Symptomkombinatio-

nen beinhalteten das optische System mit 25 % (BENEFIT: 29 %), den Hirn-

stamm mit 22 % (22 %) und spinale Symptome (monofokales CIS) mit 35 %

(34 %) (vgl. Kappos u. a. 2006).

Ein initialer EDSS lag von allen eingeschlossenen Patienten mit CIS vor. Der

Median des initialen EDSS lag bei 2,0. Damit liegt er 0,5 Punkte hoher als in

der BENEFIT-Kohorte (Kappos u. a. 2006). Eine Abweichung von 0,5 Punkten

liegt allerdings im Rahmen der interrater-Variabilitat fur den EDSS Score (1,5

Punkte, Goodkin u. a. 1992)). Die mediane Lasionslast der Patienten in die-

ser Studie lag unter der in der BENEFIT-Kohorte. Diese Abweichung ist am

ehesten zufallsbedingt und durch die Einschlusskriterien der beiden Studien

beeinflusst. Wahrend in dieser Studie keine Anforderungen fur den Studienein-

schluss an das initiale MRT geknupft wurden, wurden in der BENEFIT Studie

Bedingungen an Anzahl und Form der Lasionen gestellt, die Patienten mit sehr

niedriger oder keiner Lasionslast ausschließen (mindestens zwei T2-hyperintense

Lasionen großer als 3 mm, periventrikular oder infratentoriell, ovoide Form). Der

Einschluss von drei Patienten mit unauffalligem MRT in dieser Studie fuhrt

moglicherweise zu einer Unterschatzung der kranialen Lasionslast. Da die vor-

liegende Studie das Lasionsvolumen mit den Quotienten linear korreliert und

somit nur Hinweise auf proportionale Verhaltnisse liefert, fuhrt eine mogliche

Unterschatzung der Lasionslast im gesamten Patientenkollektiv nicht zu einer

Verfalschung der Ergebnisse. Bei einer Ubertragung der Absolutwerte auf die

Grundgesamtheit sollte allerdings eine mogliche Unterschatzung der Lasionslast

berucksichtigt werden.

Zusammengefasst ist das hier beschriebene Patientenkollektiv in der Lage,

charakterisiert durch demografische und klinische Variablen die Epidemiologie

des CIS in Deutschland weitestgehend unverzerrt wiederzuspiegeln und somit

wird davon ausgegangen, dass die erhobenen Ergebnisse reprasentativ fur die

Grundgesamtheit der Patienten mit CIS sind.

Die intra- und interrater Variabilitat zur Quantifizierung der Lasionen kann

durch den Einsatz von fast FLAIR Sequenzen, wie in dieser Studie, signi-


fikant gesenkt werden; ausserdem erbrachte eine Reduzierung von funf auf

drei Millimeter Schichtdicke keinen zusatzlichen diagnostischen Gewinn (Fil-

ippi u. a. 1998). Der Vorteil der FLAIR liegt dabei in der hoheren Sensiti-

vitat subkortikaler und liquornaher Lasionen aufgrund eines geringeren Liquor-

Partialvolumeneffekts. Die Verwendung von FLAIR-Sequenzen in der klinischen

Routinediagnostik rechtfertigen Studien in denen gezeigt werden konnte, dass

mit ihr im Gegensatz zu auf Spin-Echo basierenden Sequenzen ca. 30 % mehr

Lasionen detektiert werden konnten (Tubridy u. a. 1998).

Quotienten zur Beschreibung einer zellularen Dysbalance zwischen den Kom-

partimenten wurden schon fruher durchflusszytometrisch in klinischen Studien

bei Patienten mit MS beschrieben. Die Analyse der Quotienten bei CIS so-

wie die Korrelation mit der Lasionslast ist in der Literatur allerdings nicht

vorbeschrieben. Die Erfassung des Verhaltnisses von verbundenen Daten in

Blut und Liquor erlaubt dabei die Beurteilung der Kapazitat von BHS und

BCSFS zum Lymphozytentransfer und spiegelt somit die Immunhomoostase

wider (Kleine u. a. 1999; Kleine, Benes 2006). Die kumulative T2-gewichtete

Lasionslast wurde in der Vergangenheit zur Quantifizierung und Objektivie-

rung der entzundlichen Aktivitat bei Patienten mit MS eingesetzt und dient als

Surrogatmarker fur die Evolution der Krankheit; zahlreiche Forschungsgrup-

pen haben die volumetrische Bestimmung zerebraler Lasionen zu Beginn und

im Follow-up bei Patienten mit MS benutzt, um Aussagen uber Prognose und

Fortschritt der Erkrankung treffen zu konnen (z.B. Brex u. a. 2002). Verschie-

dene Studien erbrachten allerdings unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf

Korrelation der Lasionslast mit dem Grad der Behinderung bei MS mit meist

moderaten Korrelationskoeffizienten (Brex u. a. 2002; Fisniku u. a. 2008; Sor-

mani u. a. 2009). Diese Ergebnisse sind wahrscheinlich eine Reflexion der be-

grenzten Aussagekraft verfugbarer Scores (Willoughby, Paty 1988) sowie der

begrenzten Fahigkeit konventioneller MRT Techniken, entzundliches Gewebe

ausserhalb makroskopisch sichtbarer Lasionen zu quantifizieren und die hete-

rogene Pathogenese der MS zu berucksichtigen (Pirko u. a. 2007). Trotzallem

wird die kumulative Lasionslast in einer Vielzahl an klinischen Studien als Sur-

rogatparameter fur die Entwicklung und Aktivitat der Krankheit genutzt und

hat sich im Forschungsalltag etabliert.

Aus diesen Aussagen geht hervor, dass die Korrelation des Quotienten mit der

kumulierten Lasionslast eine zulassige Methode darstellt. Wenn die Lasionslast

im MRT als Maß fur Entwicklung und Schwere einer MS geeignet ist, liegt

der Schluß nahe, dass auch die Quotienten in Korrelation mit der Lasionslast


zur Quantifizierung geeignet sind. Somit stunde erstmalig ein laborchemischer

Parameter zur Erfassung klinischer Beeintrachtigung bei MS zur Verfugung.

Wie hoch allerdings eine mogliche Korrelation sein wird, wenn eine moderate

Korrelation eines Quotienten mit der Lasionslast vorliegt und die Korrelati-

on der Lasionslast mit der Schwere der Erkrankung ebenfalls (nur) moderat

ist, sollte in prospektiven Studien weiter geklart werden. Nach dem heutigen

Wissensstand ist dies die erste Arbeit, die eine Korrelation der Quotienten mit

MRT-Parametern zur Beschreibung eines proportionalen Verhaltnisses einsetzt.

In dieser Studie wurde eine Stratifizierung der CIS-Kohorten in Patienten mit

milder Krankheitsaktivitat anhand von initial sechs und weniger Lasionen und

einem verbesserten oder konstanten EDSS im 1-Jahres Follow-Up durchgefuhrt.

In der vorliegenden Studie wurde die Stratifizierung von sechs und weniger

Lasionen gewahlt, da dies der Definition einer großen Lasionslast in den deut-

schen AWMF-Leitlinien entspricht (siehe http://www.awmf.org/leitlinien/

detail/ll/030-050.html). Im Vorliegenden entspricht ein Grenzwert von sechs

dem Median fur die Lasionszahl im Studienkollektiv. Auch Brex u. a. (2002,

s. u.) wahlten in ihrer Studie diesen Cut-off. Es gibt Hinweise auf einen Zusam-

menhang zwischen Lasionszahl bei Patienten mit CIS, Konversion zu klinisch

definitiver MS und der Wahrscheinlichkeit, milde oder moderate Behinderung

zu entwickeln (Brex u. a. 2002).

ROC Kurven werden benutzt, um die Effektivitat eines diagnostischen Markers

(hier die Quotienten) in der Unterscheidung zwischen kranken und gesunden

Individuen zu beurteilen. Meistens werden kontinuierliche Messungen durch-

gefuhrt. Die”Area under the ROC curve (AUC)“ ist der gangigste Global-

parameter der diagnostischen Prazision. Werte nahe an 1 sind hinweisend auf

eine hohe, wahrend Werte um 0,5 auf eine niedrige diagnostische Genauigkeit

hindeuten (Farcomeni, Ventura 2010). In dieser Studie wurden im Falle von

Signifikanz durchweg gute Werte von 0,71 bis 0,87 gefunden. Dies ist die erste

Studie, die ROC-Kurven fur die Evaluation liquorzytologischer Befunde in der

Diagnostik der MS einsetzt.

http://www.awmf.org/leitlinien/detail/ll/030-050.html

http://www.awmf.org/leitlinien/detail/ll/030-050.html

4.2. Diskussion der Ergebnisse 63

4.2. Diskussion der Ergebnisse

4.2.1. Die Haufigkeit CD4+ CD25high TREG ist im Liquor von

Patienten mit CIS reduziert und konnte als diagnostisches

Hilfsmittel eingesetzt werden

In dieser Studie konnte ein signifikanter Unterschied in der Haufigkeit der

CD25high TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu gesunden Kontroll-

personen gezeigt werden. Kein signifikanter Unterschied lag im Vergleich von

MS und CIS Patienten vor, was pathophysiologisch auch nicht zu erwarten ist.

Ein großerer Quotient bei Patienten mit CIS spricht fur einen großeren An-

teil der TREG im peripheren Blut als im Liquor im Vergleich mit Gesunden

oder im Umkehrschluß fur eine Verminderung der TREG im Liquor in der

Patientengruppe. Diese Beobachtung einer quantitativen Dysbalance ist ver-

einbar mit gangigen Hypothesen, die eine physiologisch protektive Funktion

der TREG in Bezug auf Kontrolle und Suppression von entzundlichen Reaktio-

nen postulieren (Venken u. a. 2010). Obwohl autoreaktive T-Zellen bei Gesun-

den sowie chronisch Kranken gefunden wurden, scheinen sie bei Patienten mit

Autoimmunkrankheiten leichter durch multilaterale Stimuli aktiviert werden

zu konnen (Lovett-Racke u. a. 1998). Diese Beobachtung veranlasste zahlrei-

che Forschungsgruppen der Frage nachzugehen, ob dies mit einer reduzierten

Funktion oder gestorten Homoostase regulatorischer Zellen erklarbar sei. Ei-

ne aktuelle Literaturrecherche erbrachte relativ eindeutige Ergebnisse in Bezug

auf eine reduzierte Effektorfunktion regulatorischer T-Zellen und somit eine

qualitative Storung bei Patienten mit MS (siehe auch Abschnitt 1.3.2 auf Sei-

te 12 der Einleitung und Viglietta u. a. 2004; Haas u. a. 2005; Venken u. a.

2006), obwohl diese Ergebnisse nicht in allen Studien validiert werden konn-

ten. So fanden Fransson u. a. (2009) z. B. eine normale Suppressionsfahigkeit in

CD25+ T-Zellen von MS-Patienten, wurden diese mit aktivierten Lymphozy-

ten von gesunden Kontrollpersonen inkubiert. Interessanterweise konnte dies fur

Patienten mit RR-MS, nicht aber fur SP-MS nachgewiesen werden (Fransson

u. a. 2009). Es wird mittlerweile davon ausgegangen, dass sich die Effektor-

funktion im spateren Krankheitsstadium rekonstituieren kann, obwohl spater

wahrscheinlich eher neurodegenerative als zellulare Prozesse eine Rolle fur die

Progression spielen (Venken u. a. 2008a). Weiterhin korrelierte die Funktions-

beeintrachtigung negativ mit der Krankheitsdauer, nicht jedoch mit dem Alter

der Patienten, was als Hinweis fur die Bedeutung der TREG im fruhen Krank-

heitsverlauf gewertet werden kann (Venken u. a. 2006). Haas u. a. (2005) fanden


eine identische reduzierte suppressive Kapazitat und Haufigkeiten der CD25+

TREG bei Patienten mit RR-MS in Remission sowie im Schub. Auch schien

diese nicht abhangig von der Schubrate und der klinischen Beeintrachtigung zu

sein. Diese Ergebnisse sprechen gegen eine Akkumulation der TREG im ZNS

wahrend eines Schubes und sind in Zusammenschau mit o.g. Studien als Hin-

wies darauf zu deuten, dass die beeintrachtigte Effektorfunktion weniger von der

kurzfristigen Krankheitsaktivitat, sondern eher vom naturlichen Krankheitsver-

lauf gemessen in Jahren und Jahrzenten abhangig ist (Haas u. a. 2005).

Tabelle 4.2.:

Studienvergleich fur CD25. Dargestellt sind Studien, die die Haufigkeit von TREG bei

Patienten mit MS und CIS untersucht haben. Auffallig ist eine Heterogenitat der untersuch-

ten Zellpopulation in phanotypischer Hinsicht und der eingeschlossenen Studienpatienten,

was die Vergleichbarkeit erschwert und fur die diskrepanten Ergebnisse mitverantwortlich

sein kann. CS = Corticosteroide, GK = gesunde Kontrollpersonen, ANK = andere neurolo-

gische Erkrankungen

Studie Patienten Material Ergebnis (Auszug)

Aristimuno

2008

MS (n = 20) im

Schub

GK (n = 18)

CD4+CD25high im

Schub und funf Tage

post i.v. CS; PBL

MS >GK bei Baseline

MS �GK post i.v. CS

Feger

2007

MS (n = 14)

ANK (n = 9)

CD4+CD25high

FoxP3+ PBL u. CSF

MS (CSF) >MS (PBL)

ANK (PBL) ≈ANK (CSF)

Fransson

2009

RR-MS (n = 48)

GK (n = 44)

CD4+CD25+

Foxp3+CD127- PBL

RR-MS < GK

Haas

2005

RR-MS (n = 73)

GK (n = 73)

(CSF n = 15)

CD4+CD25high,

PBL und CSF

RR-MS ≈GK (PBL)

RR-MS (PBL) ≈GK (CSF)

CD25med RR-MS ≈GK

Jensen

2004

CIS (n = 44)

ANK (n = 49)

CD4+CD25high PBL

u. CSF

CIS (PBL)≈GK (PBL)

CIS (CSF)<ANK (CSF)

Ma 2009 MS/EAE (n = 4)

GK (n = 4) im

Tierversuch

CD4+CD25high im

Schub, Remission

und bei gesunden

Primatenaffen; PBL

MS Im Schub <MS in

Remission

MS in Remission �GK

Viglietta

2004

RR-MS (n = 15)

GK (n = 21)

CD4+CD25high,

PBL

RR-MS ≈GK

Vudattu

2009

SP-MS (n = 13)

RR-MS (n = 9)

ANK (n = 9)

GK (n = 15)

CD4+CD25high und

Subgruppen, PBL

SP-MS, RR-MS, ANK

<GK


Eine reduzierte Haufigkeit der TREG im Liquor von CIS-Patienten, wie in

dieser Studie gefunden, liefert neben dem qualitativen Erklarungsansatz ei-

ner gestorten exekutiven Funktion einen zusatzlichen quantitativen Aspekt mit

moglicherweise gestorter Homoostase der TREG und unterstreicht die Rolle

dieser Zellen in der Pathogenese des CIS als Beginn des Paradigmas MS.

Studien, die sich mit der Quantifizierung der Zellen in Blut und Liquor beschaf-

tigten lieferten allerdings z. T. widerspruchliche Ergebnisse. In Tabelle 4.2 auf

Seite 64 ist eine Auswahl an Studien aufgefuhrt, die sich mit der Haufigkeit der

TREG bei MS beschaftigten. Studien zu anderen Autoimmunerkrankungen wie

z. B. Diabetes Mellitus oder Rheumatoide Arthritis wurden nicht berucksichtigt,

liefern aber z. T. ebenfalls widerspruchliche Ergebnisse (Haas u. a. 2005).

Soweit anhand aktueller Literaturrecherche beurteilbar, ist dies die erste Ar-

beit, die systematisch Blut- und Liquoruntersuchungen fur CD25 bei Patienten

mit CIS durchgefuhrt hat. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstutzen die These,

daß regulatorische T-Zellen nicht ins ZNS emigrieren um lokal eine Dampfung

der Entzundungsantwort zu initiieren und somit aus dem peripheren Pool de-

pletiert werden; hierfur wurde ein kleinerer Quotient bei Patienten mit CIS

sprechen. Vielmehr sind zugrundeliegende pathogenetische Mechanismen, die

eine Erklarung divergierender Forschungsergebnisse darstellen konnten bis heu-

te leider kaum verstanden. Mogliche Ursachen fur diese Diskrepanz quantitati-

ver Studien konnten u. U. methodologischer Natur sein, z. b. war die Definition

eines Schubes im Rahmen einer RR-MS in den hier vorgestellten Studien nicht

identisch. Eine andere Fehlerquelle liegt in der immunzytologischen Auswahl

geeigneter Marker fur regulatorische Zellen (z. B. Foxp3), welche bis heute noch

nicht zufriedenstellend gelost ist (siehe auch Abschnitt 4.4 auf Seite 85) und

zwischen den Studien variiert. Andere Theorien, die den Einsatz von CD127 als

zusatzlichen immunphanotypischen Marker favoriseren, kritisieren eine Verun-

reinigung der TREG durch andere aktivierte T-Zellen aufgrund einer subopti-

malen Spezifitat existierender Marker wie CD25 und FoxP3 fur regulatorische

Zellen (siehe auch Seite 85 und Liu u. a. 2006).

Ein besseres Verstandnis der zugrundeliegenden kompromittierten Immun-

regulation ist wichtig fur die Entwicklung einer zukunftigen auf TREG basie-

renden Therapie. Die Schlusselfrage wird sein, ob es gelingen wird, die Balance

zwischen TREG und Effektorzellen zur richtigen Zeit und am richtigen Ort

wiederherzustellen. Venken u. a. (2010) sind der Ansicht, dass der gunstigste

Ansatz in einer Intervention im fruhen Krankheitsbeginn zwecks Wiederher-

stellung der Funktion und Homoostase der Zellen besteht (Venken u. a. 2010).


Um so erstaunlicher scheint es, daß bis dato kaum Forschungsanstrengungen

bei Patienten mit CIS unternommen wurden.

Erste therapeutische Ideen beinhalten die Isolierung von patienteneigenen TREG,

in-vitro Expansion und Refundierung der Zellen (Stephens u. a. 2009). Abgese-

hen von ethischen und technischen Problemen wirft dieser Ansatz eine Reihe

anderer Fragen auf: Welche phanotypischen Merkmale sollten zur Identifizie-

rung der Zellen benutzt werden? Welche Epitope sind am besten geeigent um

eine Expansion der Zellen zu erreichen? Aber auch die Applikation von etablier-

ten Immunmodulatoren hat signifikante Auswirkung auf TREG. So sind z.B.

Interferone und Glatirameracetat in der Lage, die Haufigkeit der RTE–TREG

bei MS-Patienten zu erhohen (Venken u. a. 2008b). Zusammengefasst bieten

TREG vielversprechendes Potential in der Therapie der MS, wobei die Mei-

nung vorherrscht, eine effiziente Therapie musse sowohl die Effektorfunktion,

als auch die Dysbalance uber die Kompartimente als Ziel haben.

4.2.2. Reduzierte MFI fur VLA-4 bei Patienten mit CIS

Um einen Erklarungsansatz fur die quantitativen Unterschiede der TREG bei

CIS und Kontrollprobanden zu liefern, wurde das Expressionsniveau fur CD49d

in Abhangigkeit von CD25 untersucht. Auf einem Signifikanzniveau von α= 5 %

fanden sich signifikant erniedrigte MFI fur die α-4 Kette von VLA-4 (CD49d)

im PBL fur alle CD4+ CD25low-high im Vergleich zu Kontrollen. Im CSF wurde

Signifikanz fur CD25low-med erreicht. Insgesamt war die MFI in allen Zellpopu-

lationen schwacher bei Patienten mit CIS im Vergleich zu Kontrollen (durch-

schnittlich um 28 % im PBL und 19 % im CSF). Es wurde daruberhinaus eine

abnehmende Tendenz der MFI mit zunehmender Expression fur CD25 uber das

gesamte Patientenkollektiv beobachtet.

Die MFI ist ein indirektes Maß fur den Oberflachenrezeptorbesatz auf Zellen.

Obwohl nach Bonferroni-Korrektur und α= 2,5 % knapp keine Signifikanz mehr

fur CD25low erreicht wurde (p = 0,029 im PBL und 0,038 im CSF), sind die-

se Ergebnisse hinweisend auf eine reduzierte Expression von VLA-4 auf CD4+

Lymphozyten bei Patienten mit CIS. Bei eindeutiger Tendenz zu erniedrigten

MFI bei Patienten sowohl im PBL, als auch im CSF fur alle Expressionsniveaus

von CD25 ist die Fallzahl von n = 18 moglicherweise nicht groß genug, um dem

nach Bonferroni korrigierten Signifikanzniveau standzuhalten. Da CD25high im

CSF der einzige Wert ist, fur den keine Signifikanz bei sonst eindeutigen Er-

gebnissen erreicht wurde, liegt hier moglicherweise ein zufalliges Ergebnis vor,

ebenfalls mitbedingt durch die Fallzahl. Hier sollte weitere Forschung erfolgen.


Besonders die Interaktion zwischen dem Integrin very late antigen (VLA)-4

und dem vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 auf dem Endothel konnte

als essentiell fur die Leukozytenadhasion- und Migration ins ZNS herausge-

stellt werden (z. B. Vajkoczy u. a. 2001). Dabei sind die beiden Proteine fur den

initialen Kontakt und folgende Anheftung der Lymphozyten ans Endothel ver-

antwortlich, die Transmigration wird an andere Stelle veranlasst, z. B. durch die

Interaktion von LFA-1 und ICAM-I (Vajkoczy u. a. 2001). Doerck u. a. (2010)

untersuchten das Migrationsverhalten proinflammatorischer und regulatorischer

T-Zellen bei Ratten mit EAE. Dabei folgte die Expression von VCAM-I dem

klinischen Verlauf von Schub und Remission und die Applikation von blockie-

renden Antikorpern fuhrte zu einer Aggravation im fruhen Krankheitsverlauf

der Tiere und ist hinweisend auf eine wichtige Rolle von VLA-4/VCAM-I Inter-

aktion in der Rekrutierung regulatorischer Zellen ins ZNS (Doerck u. a. 2010).

Bei Patienten mit CIS ist die Rolle von VLA-4 bisher noch nicht untersucht

worden. Es fand sich eine Verminderung von VLA-4 auf TREG des peripheren

Blutes von Patienten mit RR-MS (Stenner u. a. 2008) und eine gestorte Zell-

motilitat bei RR-MS im Gegensatz zu konstitutiv starkt ausgepragter Migra-

tionsfahigkeit von TREG unter normalen Bedingungen (Schneider-Hohendorf

u. a. 2010).

In der Zusammenschau der Ergebnisse konnte eine gestorte Homoostase der

TREG beim CIS mit verminderter Haufigkeit im CSF zumindest teilweise durch

eine reduzierte Expression von VLA-4 erklart werden. Da das absolute Expres-

sionsniveau fur VLA-4 auf CD25high TREG im Vergleich zu CD25med+lo nied-

riger ist (siehe Tabelle 3.5 auf Seite 44), fallt ein Verlust an Rezeptoren bei

TREG starker ins Gewicht als bei Populationen mit durchschnittlich hoherer

Expression des Rezeptors. Obwohl keine Signifikanz nach Bonferroni erreicht

wurde, lasst sich das Signifikanzniveau durch die Untersuchung einer großeren

Fallzahl moglicherweise verbessern. Mitverantwortlich fur eine Fehlfunktion der

CD25high Zellen bei Patienten mit CIS/MS konnte somit neben einer gestorten

Effektorfunktion auch eine gestorte Homoostase im Liquorkompartiment sein.

Trotzallem ist auch hier die Datenlage nicht immer eindeutig. Soilu-Hanninen

u. a. (2005) fanden eine erhohte Expression von CD49d auf allen T-Zellen bei Pa-

tienten mit MS im Schub, nicht aber in Remission (Soilu-Hanninen u. a. 2005).

Andere zeigtes eine gesteigerte Haufigkeit CD49d+ Zellen unter allen TREG bei

Patienten mit RR-MS (nicht aber SP-MS) im Vergleich zu gesunden Kontrollen

(Venken u. a. 2008a). Wie diese auf den ersten Blick divergierenden Erkenntnis-

se in den gesamten Prozeß der TREG Pathophysiologie zu integrieren sind und


ob eine Rekonstitution der Zellmotilitat im fortschreitenden Krankheitsverlauf

stattfindet, sollte Gegenstand zukunftiger Forschung sein.

4.2.3. Selektiver Rezeptorverlust fur IL-2 oder beeintrachtigte

Adhasionsmolekule als moglicher zugrundeliegender Defekt

Der hier gefundene Quotient von 1,0 in der Kohorte der Kontrollpersonen deu-

tet auf ein Aquilibrium zwischen dem Blut- und Liquorkompartiment mit wei-

testgehend ungehindertem Austausch der Zellen uber die Blut-Hirn-Schranke

(BHS) hin und erganzt die Ergebnisse einer alteren Studie, die ebenfalls glei-

che Haufigkeiten in Blut und Liquor bei Gesunden fand. Dort wurden aller-

dings alle aktivierten CD4+ Zellen untersucht (CD4+ CD25+) und die Auto-

ren argumentierten gegen damalige Hypothesen, die eine generelle Aktivierung

von Lymphozyten im ZNS selbst bei Gesunden postulierten (Svenningsson u. a.

1995). Feger u. a. (2007a) fanden ebenfalls ausgeglichene Haufigkeiten in Blut

und Liquor (Feger u. a. 2007a). Da eine Produktion von Lymphozyten im ZNS

ausgeschlossen ist und alle Lymphozyten somit ihren Ursprung im peripheren

Blut haben (Kleine u. a. 1999), konnte eine mogliche Erklarung fur den abwei-

chenden Quotienten bei Patienten mit CIS ein Rezeptorverlust fur IL-2 (CD25)

beim Ubertritt uber die BHS der regulatorischen T-Zellen sein.

Flugel u. a. (2001) untersuchten in einer Studie das Migrationsverhalten von

MBP-reaktiven T-Tellen im erweiterten Tiermodell der MS, der (transfer)-EAE.

Dabei wurden retrovirale Gene in die Zielzellen eingebracht, deren Translati-

on zur Expression des green fluorescent protein (GFP) fuhrt. Die transgene

Expression und somit Fluoreszenzintensitat des GFP kann dabei in Echtzeit

gemessen werden und ermoglicht die gezielte Identifikation und Isolierung der

Zellpopulation. Nach Injektion der Zellen umfasste ein fruher Migrationsweg

die parathymischen Lymphknoten, periphere Blut und Milz und schließlich das

ZNS. Interessanterweise unterliefen die ex vivo aktivierten T-Zellen wahrend

der Transmigration einer Reihe von Veranderungen ihrer Expressionsstruktur

an Aktivierungsmarkern und Rezeptoren, darunter auch fur den IL-2 Rezeptor,

CD25. Begleitet wurde dies von der Hochregulation anderer ZNS-spezifischer

Chemokinrezeptoren, die moglicherweise der Chemoattraktion der Zellen ins

ZNS dienen. In einer zweiten Migrationsphase ins ZNS am dritten Tag post

injectionem der Zellen reduzierte sich die Fluoreszenzintensitat von ca 90 %

auf 10 % der CD4+ Zellen im ZNS und lag damit etwas uber der in der Litera-

tur beschrieben Haufigkeit enzephalitogener Effektor-T-Zellen. Diese Reduktion

scheint hauptsachlich aufgrund apoptotischen Zelltodes stattzufinden. Die Au-


toren beschrieben somit einen komplexen Migrationsweg der Lymphozyten von

der Peripherie ins ZNS mit konsekutiver funktioneller Veranderung der Ober-

flachenbeschaffenheit und Apoptose (Flugel u. a. 2001).

Der großere Quotient in der Kohorte der CIS Patienten in dieser Studie setzt

sich sowohl aus einem hoheren Anteil im PBL (6 % vs. 4 %), als auch einem nied-

rigeren Anteil im CSF im Vergleich zu Gesunden zusammen (4 % vs. 6 %, vgl.

Tabelle 3.3 auf Seite 42). Weitere Untersuchungen zum Thema, ob der Ubertritt

der TREG bei Patienten mit CIS mit einem Rezeptorverlust oder vestarkter

Apoptose einhergeht, sind wunschenswert. Beide moglichen Erklarungsansatze

wurden eher einen reduzierten Anteil im CSF bei gleichem Anteil im PBL fa-

vorisieren.

Die ins Blut ausgeschutteten, aktivierten Lymphozyten rezirkulierenden zwi-

schen der Peripherie und dem ZNS in einem komplizierten Prozess, der das sog.

”rolling“, Anhaften der Zellen ans Endothel, Aktivierung, feste Adhasion und

Transmigration beinhaltet (Kleine, Benes 2006). Eine andere Forschungsgruppe

um Kleine u. a. (1999) untersuchte ebenfalls verschiedene Lymphozytensubpo-

pulationen mit Bildung des Quotienten PBL:CSF bei Patienten mit verschiede-

nen neurologischen Krankheiten. Die Autoren fanden signifikant unterschiedli-

che Quotienten, sowohl fur Zellen, als auch Proteine im inter- sowie im intrain-

dividuellen Vergleich. Eine andere mogliche Erklarung konnte in der Selekti-

vitat der BHS bzw. PBL-CSF-Schranke liegen. Die Selektion der Lymphozyten

scheint sich hauptsachlich am Kapillarendothel der BHS und der epithelialen

Blut-CSF-Barriere des Plexus choroideus abzuspielen. Dabei wird sie durch eine

Vielzahl von Transmigrationspfaden entlang der Kapillarwand ermoglicht, be-

stehend aus Rezeptor-Liganden Interaktionen von Adhasionsmolekulen der Zel-

loberflache und des Epithels (siehe Abschnitt 4.2.2 auf Seite 66). Ein Großteil

der Regulation des Leukozytentransfers konnte dabei uber die Rezeptor- und Li-

gandendichte geschehen, um die differenzierte Diapedese zu ermoglichen (Kleine

u. a. 1999). In der selben Studie wurde z.B. ein großerer Quotient fur aktivierte

T-Lymphozyten (CD3+ HLA-DR+) als fur nicht-aktivierte (CD3+ HLA-DR-)

gefunden und als Hinweis auf eine erschwerte Transmigration vom Blut- ins Li-

quorkompartiment gewertet. Dieses Ergebnis zeigte sich am ausgepragtesten in

der Gruppe der Patienten mit neuroimmunologischen Krankheiten (MS: n = 2;

Borreliose: n = 1) mit abnehmendem Unterschied bei Patienten mit subakuter

Entzundung, bis hin zum einem Quotienten Q≈ 1 bei Patienten mit Meningitis,

was hinweisend auf ein Aquilibrium der aktivierten T-Lymphozyten mit nahe-

zu komplettem Zusammenbruch der selektiven Funktion der BHS wahrend der


hochakuten Entzundungsphase ist. Mit n = 2 Patienten mit MS ist diese Studie

allerdings offensichtlich zu klein bemessen um eine allgemeingultige Aussage

treffen zu konnen.

Tabelle 4.3.:

Migrationspfade der verschiedenen Lymphozyten ins ZNS uber die BHS. Die

Migration der Immunzellen ins Liquorkompartiment gliedert sich in einen fruhen und

einen spaten Migrationsweg. BZ = B-Zelle, TZ = T-Zelle CAM =Cellular adhesion mole-

cule, Adhasionsmolekul. Auszug, in Anlehnung an Kleine, Benes (2006).

Expression auf

Endothel des Gehirns Lymphozyten B-Zellen

CAMs der spaten Lymphozyten-Endothel Interaktion auf kleinen Gehirngefassen

VCAM-1 (CD106) VLA-4 (CD49d/CD29) VLA-4 (CD49d/CD29)

Bp50 (CD40) CD40L (CD154) auf CD4+ Zellen und auf CD8+ (teilweise)

LFA-3 (CD58) LFA-2 (CD2)

ICAM-2 (CD102) LFA-1 (CD11a/CD18)

CAMs der fruhen Lymphozyten-Endothel Interaktion auf kleinen Gehirngefassen

Sgp90 (CD34)

(sLex (CD15s))

L-selectin (CD62L) auf naiven und

teilw. Memory TZ

L-selectin (CD62L) auf

naiven BZ

Junction adhesion molecules

(JAMs)

CD18 (integrin β2 Untereinheit)

P-Selectin (CD62P) CD162 (P-selectin Glycoprotein Li-

gand 1)

E-selectin (CD62E) CD162 (P-selectin Glycoprotein Li-

gand 1)

Eine mogliche Erklarung fur die reduzierte Haufigkeit der TREG im CSF bei

Patienten mit CIS in dieser Studie konnte ein selektiver Rezeptordefekt der in

die Transmigration involvierter Proteine, z. B. CD49d, sein (Siehe Tabelle 4.3

auf Seite 70).

Es soll hier nicht weiter im Detail auf die molekularbiologischen Mechanis-

men eingegangen werden, sondern vielmehr die Komplexitat dieses Vorgangs

verdeutlicht werden. Die Tabelle beschrankt sich auf einige wenige Transport-

proteine, außerdem gelten teilweise die gleichen Rezeptoren und Transporter

wie fur andere Leukozyten. Bei der Migration vom Liquor ins Hirngewebe uber

die Blut-CSF Barriere des Plexus choroideus gelten wiederum andere Mecha-

nismen (Kleine, Benes 2006).Wahrscheinlich sind noch eine Reihe weiterer Pro-

teine involviert und der komplette Mechanismus der Lymphozytenaktivierung

und ihrer Interaktion mit ebefalls aktiviertem Endothel, Lockerung der tight

junctions und anschliessender Diapedese ist im Detail noch wenig verstanden.


Eine differenzierte Betrachtung der in der Migration involvierten Proteine auf

T-Zellen ist notig um einen moglichen Erklarungsansatz fur das hier gefundene

Ungleichgewicht der Lymphozytensubpopulationen zu finden.

Aus bisher unbekannten Grunden ware es daruberhinaus moglich, dass sich

bei einem gewissen Prozentsatz der Patienten die gestorte Homoostase in re-

lativ schneller Zeit selbst reguliert, wie auch anscheinend eine Rekonvaleszenz

der Effektorfunktion im Verlauf des Krankheitskontinuums vom CIS bis zur SP-

MS stattfindet (Venken u. a. 2006). Obwohl keine signifikanten Unterschiede in

der CIS und MS Kohorte bestanden und die Unterschiede der Quotienten eher

marginal sind (1,6 vs. 1,5), spricht die in dieser Studie gefundene absteigende

Tendenz ebenfalls fur eine Dynamik der Verteilung der TREG im fortschrei-

tenden Krankheitsverlauf und eroffnet neue interessante Forschungsansatze fur

longitudinale Studien mit Patienten mit CIS und ihrer Transformation zur MS.

4.2.4. Die quantitativen Unterschiede der TREG sind mit der

Krankheitsaktivitat assoziiert

Ein besserer Korrelationskoeffizient als bei Betrachtung des gesamten Patien-

tenkollektivs zeigte sich in der Stratifizierung nach geringer Lasionslast mit

weniger als sieben Lasionen im initialen cMRT (r = 0,68 und p≤ 0,001). Dies

lasst sich durch die Tatsache erklaren, dass nicht jede magnettomografisch de-

tektierte Lasion zu einem klinisch erfassbaren Defizit fuhren muss und z. B.

Lasionen an strategisch weniger wichtigen Punkten vom Patienten unerkannt

bleiben konnen; grade in fruhen Krankheitsstadien ist die Korrelation des La-

sionsvolumens mit dem EDSS schwacher als im Verlauf (Brex u. a. 2002). Somit

geht ein hoherer Quotient in einem linearen Zusammenhang mit einer großeren

Lasionslast und somit starkerer Entzundungsaktivitat im ZNS einher. Diese

Ergebnisse sind hinweisend auf einen direkten Einfluss einer Dysbalance fur

TREG im Liquor. Je geringer die Haufigkeit im CSF ist, desto großerer ist die

Lasionslast im MRT.

Obwohl die Korrelation von kranialer Lasionslast und dem subjektiven Be-

eintrachtigungsgrad der Patienten mit MS eher moderat ist, sind Anzahl und

Volumen initialer Lasionen bei Patienten mit CIS ein robuster Prediktor konse-

kutiver Defizite. Studien konnten zeigen, dass das Risiko mit großerer initialer

Lasionslast steigt (Brex u. a. 2002). Eine neuere Studie stratifizierte das Pati-

entengut von 181 RR-MS Patienten nach niedriger Lasionslast (≤ 2,0 cm3) und

fand eine signifikante negative Korrelation zu einer EDSS Verschlechterung im


funf-Jahres FU (Vaneckova u. a. 2009). Die klinische Relevanz eines fruhzeitigen

MRT bei Patienten mit CIS ist unbestritten und wird in Zukunft im Rahmen

verbesserter Technik und Diagnosekriterien vermutlich noch steigen.

In einer longitudinalen Studie von Rinaldi u. a. (2006) untersuchten die Auto-

ren verschiedene Lymphozytenpopulationen im Blut von 20 Patienten mit CIS

und fuhrten serielle MRT-Scans uber einen Zeitraum von einem Jahr durch.

Die Patientenkohorte wurde in Personen mit aktiven und inaktiven Lasionen

im MRT stratifiziert und hinsichtlich Unterschiede in den absoluten und relati-

ven Lymphozytenpopulationen untersucht. Es fand sich zwar kein signifikanter

Unterschied fur CD4+ CD25high, jedoch fur zwei andere Untergruppen mit re-

gulatorischer Kapazitat (CD8+ CD25high und DNαβ T-Zellen) Es wurden al-

lerdings nur Zellen des peripheren Bluts untersucht und die Studie ist mit n = 20

relativ klein. Daruberhinaus liefert diese Studie keine Hinweise auf Kausalzu-

sammenhange zwischen peripheren Zellen und zentralnervoser Pathophysiolo-

gie (Rinaldi u. a. 2006). Jensen u. a. (2004) fanden reduzierte Haufigkeiten an

TREG im CSF bei Patienten mit abnormen MRT im Vergleich zu Probanden

mit normalem Scan (Jensen u. a. 2004).

Zusammengefasst sind die Ergebnisse dieser Studie hinweisend fur die Exis-

tenz einer Assoziation zwischen systemischer Immunreaktion und Entzundung

des ZNS bei Patienten mit CIS. Erstmals wird die Rolle regulatorischer T-Zellen

in der fruhen Pathogenese gezeigt und mogliche Defekte in Molekulen der Dia-

pedese als Ursache dargestellt. Obwohl genaue Ursache-Wirkungsbeziehungen

der verschiedenen Lymphozytenpopulationen mit der Krankheitsaktivitat im

Gehirn nach wie vor nur wenig verstanden sind, belegen diese Resultate die

Wichtigkeit subtiler, aber komplexer Anomalien im Immunsystem mit hochster

pathologischer Relevanz.

Der hier untersuchte Quotient scheint daruber hinaus die Krankheitsaktivitat

gemessen am cMRT in positiver Korrelation widerzuspiegeln. Hieraus ergibt sich

moglicherweise ein neuer, relativ einfach bestimmbarer Surrogatlaborparameter

fur den Kliniker. Patienten mit besonders hohem Quotienten befinden sich in

einem aktiven Krankheitsstadium, oder sind moglicherweise einem hohen Risiko

fur entzundliche Aktivitat im Gehirn und damit kumulativer Beeintrachtigung

im Krankheistverlauf ausgesetzt.

Vor allem bei Patienten mit initial geringer Lasionslast scheint die Assoziati-

on starker zu sein. Gerade diese Patienten haben aber bei isolierter Betrach-

tung der Lasionslast ein eher niedrigeres Risiko, als z. B. Patienten mit hohem

Lasionsvolumen (s. o.). Die kombinierte Betrachtung strategischer Lasionen und


der Volumetrie in der Bildgebung zusammen mit liquorzytologischen Befunden

konnte also u. U. eine bessere Sondierung derjeniger Patienten ermoglichen, die

in besonderem Masse einer rascheren Konversion zu MS und klinischer Beein-

trachtigung ausgesetzt sind. Somit konnte der hier gemessene Quotient auch

eine Entscheidungshilfe fur eine immunmodulatorische Therapie darstellen und

auch solche Patienten selektieren, denen aufgrund geringer magnetresonanz-

tomografischer Befunde von einer Therapie abgeraten wurde. Ob die Bestim-

mung der Quotienten in der klinischen Routinediagnostik einsetzbar ist und

welches Potential sie als Prediktor fur den weiteren Krankheitsverlauf oder eine

Therapieentscheidung haben, sollte weiterhin Gegenstand intensiver Forschung

sein (siehe auch Abschnitt 4.3 auf Seite 82). Longitudinale Studien uber z. B.

funf Jahre konnten klaren, ob diese Patienten signifikant ofter Schube erlei-

den oder fruher in die sekundar-progressive Form der MS konvertieren; schon

heute weiß man, dass die T2-gewichtete Lasionslast bei SP-MS Patienten am

großten ist (Nijeholt u. a. 1998) und Assoziationen dieser weit fortgeschrittenen

Form der MS mit initialen Liquorbefunden stellen einen weiteren, interessanten

Forschungsansatz dar.

Die ROC-Analyse des Quotienten fur TREG bietet einen moglichen

Laborparameter fur die Diagnose

In dieser Studie wurde fur den Quotienten der TREG gute AUC von 0,79

bis 8,01 gefunden, mit geringfugig besseren Werten bei Patienten stratifiziert

nach EDSS Verbesserung im Follow-Up. Mit Werten fur Sensitivitat und Spe-

zifitat um 0,75 ist der Quotient daher moglicherweise geeignet, einen Laborpa-

rameter im Diagnosefindungsprozeß des CIS beizutragen. Stratifizierung nach

eher milder Krankheitsaktivitat erbrachten kaum diagnostischen Gewinn (siehe

auch Tabelle 3.4 auf Seite 43). Warum nicht noch bessere Werte fur Spezifitat

und Sensitivitat erreicht wurden, lasst sich moglicherweise durch die Tatsache

erklaren, dass TREG nicht nur in der Pathogenese der MS eine Rolle spie-

len. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass die Abwesenheit dieser Zellen

pradisponierend fur die Entwicklung auch anderer Autoimmunerkrankungen,

wie z. B. rheumatoide Arthritis, Diabetes Mellitus Typ I, systemischer Lupus

erythematosus, Thyreoiditis Hashimoto und Sjogren Syndrom, sein kann (Ma

u. a. 2009). Desweiteren konnte es noch andere krankhafte Zustande geben, in

denen die Haufigkeit der regulatorischen T-Zellen verandert ist, die aber in

dieser Studie nicht erfasst wurden.


4.2.5. Keine quantitativen Unterschiede fur die Expression von

CD28 bei Patienten mit CIS

Die Analyse der Quotienten fur CD28 ergab keine signifikanten und relevanten

Unterschiede im Kohortenvergleich. Fur CD4+ CD28+ Zellen wurden fur MS

und CIS Patienten sowie fur die Kontrollgruppe Quotienten von ca. 1,0 gefun-

den. Fur keine der teils marginalen Unterschiede bei CD8+ CD28+ im Vergleich

der CIS, MS und Kontrollkohorte wurde Signifikanz im nicht-parametrischen

Test erreicht. Der prozentuale Anteil aller T-Zellen von CD4+ CD28+ war da-

bei hoher als der Anteil der CD8+ CD28+ Zellen (ca. 90 % vs. 55 %). Auf eine

ROC-Analyse wurde wegen fehlender Diskriminationsmoglichkeit verzichtet.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß sich T-Zellen in Bezug auf ihren Re-

zeptorbesatz mit CD28 bei Patienten mit CIS und Gesunden nicht unterschei-

den und dass ein weitestgehend ungehinderter Austausch uber die Blut-Hirn-

Schranke dieser Zellen stattfinden kann, bzw. keine Selektion beim Ubertritt

ins Liquorkompartiment anhand des Oberflachenbesatzes mit CD28 vollzogen

wird. Sollte ein quantitativer Unterschied in einer Lymphozytenpopulation mit

anderem Phanotyp vorliegen (s. o.), so sprechen diese Ergebnisse dafur, daß

zumindest keine nennenswerten Unterschiede im Expressionsniveau fur CD28

besteht. Weiterhin sprechen diese Ergebnisse gegen eine gesonderte Rolle von

CD28 in der Pathogene des CIS, soweit dies mit der hier durchgefuhrten Im-

munphanotypisierung erfassbar erscheint, d. h. diese Aussage gilt fur quantita-

tive Unterschiede und muss fur einen moglichen qualitativen Defekt relativiert

werden. Fur eine qualitative Beeintrachtigung ließ sich jedoch auch nach inten-

siver Literaturrecherche kein Anhaltspunkt finden.

Ubereinstimmende Daten lieferte eine Studie, die sowohl vor, als auch nach

i. v. Steroidtherapie bei RR-MS Patienten keine Unterschiede in der Haufigkeit

der CD28+ Zellen im Blut im Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen fand

(Aristimuno u. a. 2008). Im Gegensatz dazu fanden Fransson u. a. (2009) in einer

kleinen Studie mit RR-MS eine verminderte Expression fur CD28+ im Blut auf

CD4+ und CD8+ Lymphozyten in der Kontrollgruppe (Fransson u. a. 2009). In

dieser Studie wurden zwar auch hohere Anteile in der CIS Kohorte gefunden, die

Unterschiede waren allerdings nicht signifikant und numerisch als unbedeutend

einzustufen (95 % vs. 91 % bei CIS und 54 % vs. 49 % bei Kontrollen).

CD28 als signaltransduzierendes Molekul auf der Oberflache der meisten T-

Zellen ist ein Marker fur die Aktivierungsfahigkeit der Zellen. Es initiiert ei-

ne aktivierende Signalkaskade und fuhrt u. a. zu Zellproliferation und Wachs-


tum (Reichert u. a. 2001). Auch fur CD25high TREG scheint die Interaktion

von CD28-CD80/86 notig fur Entwicklung und Reifung im Thymus zu sein

(Spence, Green 2008). Der genaue Mechanismus ist bis jetzt allerdings noch

unbekannt und die Ergebnisse dieser Studie liefern keinen Anhaltspunkt fur

einen pathophysiologisch relevanten Defekt in diesem co-stimulatorischen Pfad

der Signaltransduktion in Bezug auf Funktion der TREG und der Schwere der

Erkrankung, gemessen anhand magnetresonanztomografisch erkennbarer T2-

hyperintenser Lasionen.

4.2.6. B-Zellen finden sich verstarkt in Patientenliquor und konnen

diagnostische Hilfestellung bieten

Sowohl fur reife (CD19+) als auch fur Memory B-Zellen (CD19+ CD27+) fan-

den sich signifikant großere Quotienten in der Kontrollgruppe (p≤ 0,001). Nach

Bonferroni-Korrektur war der geringfugig großere Quotient fur Plasmazellen in

CIS-I nicht mehr als signifikant zu betrachten. Die unterschiedlichen Quotienten

resultieren bei annahernd identischen Haufigkeiten im PBL dabei ausschließlich

aus einer hoheren Pravalenz der B-Zellen im Liquor bei CIS Patienten, was sich

in einem erniedrigten Quotienten wiederspiegelt.

Insgesamt uberwiegen B-Zellen eindeutig im peripheren Blut im Vergleich

zum Liquor bei Patienten mit CIS sowie MS. Svenningsson u. a. (1995) fanden

im PBL von Gesunden einen Anteil von 14 % (hier 13 %) CD19+ Zellen an allen

Lymphozyten, im CSF betrug der Anteil 0,8 % (Svenningsson u. a. 1995, hier

1,5 %). Obwohl die MS als uberwiegend T-Zell mediierte Erkrankung angesehen

wird, ist schon seit Jahren die Rolle von B-Zellen in der Pathogenese erkannt

worden und Gegenstand intensiver Forschung. Klonal expandierte B-Zellen ak-

kumulieren im CSF und Lasionen der Patienten (Cepok u. a. 2001; Corcione

u. a. 2004). Corcione u. a. (2004) konnten zeigen, dass offenbar im ZNS von Pa-

tienten mit MS eine Rekapitulation der B-Zell-Differenzierung von naiven und

Memoryzellen bis hin zu CD19- Zentroblasten stattfindet. Die Autoren fanden

signifikant erhohte Level an CD138+ Plasmazellen und CD27+ Memoryzellen

im CSF bei MS-Patienten. Letztere zeigten eine starke Expression der Chemo-

kinrezeptoren CCR1, CCR2, und CCR4 im inflammatorischen Milieu, welche

fur die Chemotaxis naiver und Memory B-Zellen ins ZNS verantwortlich sein,

oder der Retention der Zellen im Liquorkompartiement dienen konnten (Corcio-

ne u. a. 2004). Die Autoren begrundeten daruber hinaus die Akkumulation von

Plasmazellen im Liquor mit der Chronizitat der Erkrankung, die im Verlauf zur


Enwicklung des 138+ Phanotyps gefuhrt haben konnte. Diese Aussage konnen

die Ergebnisse der vorliegenden Studie nicht bestatigen, da auch schon bei Pa-

tienten mit CIS erhohte Werte gefunden wurden. Es ware allerdings moglich,

das Plasmazellen schon vor dem ersten klinisch erfassbaren Defizit im ZNS ak-

kumulieren und dem Ausbruch der Krankehit vorangehen, bzw. dass sich naive

B-Zellen im ZNS in Plasmazellen umwandeln.

In einer anderen kleinen Studie wurden erhohte Haufigkeiten von CD19+ Zellen

im Liquor von MS Patienten gefunden und gegen niedriegere Haufigkeiten bei

Patienten mit anderen entzundlichen neurologischen Krankheiten abgegrenzt

(Oreja-Guevara u. a. 1998).

Die hier gefundenen Ergebnisse fur Patienten mit MS sind im Einklang mit

fruheren Forschungsanstrengungen (s. o.) und legen nahe, dass auch beim CIS

ahnliche pathogenetische Mechanismen in Bezug auf Expansion bzw. Rekru-

tierung von B-Zellen ins Liquorkompartiment verantwortlich sind. Obwohl ih-

re Rolle bei entzundlichen Nervenerkrankungen bewiesen wurde, ist die Stel-

lung von B-Zellen in der Evolution und Progression der MS noch wenig unter-

sucht. Im Gegensatz zu fruher RR-MS scheint die inflammatorische Reaktion

im spateren Krankheitsverlauf bei SP-MS in den Liquor kompartimentalisiert

zu sein (Kutzelnigg u. a. 2005). Dies spiegelt sich in der Bildung von aberrantem

lymphatischem Gewebe im Bindegewebe des ZNS (Hirngewebe, Meningen und

perivaskular) wieder. Diese ektopen follikularen B-Zell Strukturen entwickeln

sich im fortgeschrittenen Krankheitsverlauf und konnten eine wichtige Rolle in

der Unterhaltung der B-Zellreaktion einnehmen (Serafini u. a. 2004). Die B-

Zellantwort bei Patienten mit MS stellt demzufolge einen dynamischen Prozess

dar und es ist wichtig, den Einfluss der B-Zellen schon in fruhestmoglichen

Krankheitsstadien zu untersuchen und Veranderungen in der quantitativen Zu-

sammensetzung der Subpopulationen im gesamten Krankheitsverlauf erfassen

zu konnen.

Bei einem kleinen Patientenkollektiv mit CIS fand eine Forschungsgruppe

ebenfalls erhohte Haufigkeiten fur reife B-Zellen und Zellen mit Memory-Pha-

notyp (CD27) im CSF. Weiterhin war α4-Integrin, ein Adhasionsmolekul fur

den Ubertritt von Lymphozyten uber die BHS, verstarkt exprimiert und korre-

lierte positiv mit der Krankheitsaktivitat. Somit konnte α4-Integrin fur die Ak-

kumulation der B-Zellen im Liquor verantwortlich sein (Lee-Chang u. a. 2011).

Die meisten B-Zellen haben den reifen CD19+ Phanotyp. Diese haben die

Fahigkeit, fur Jahre im ZNS zu persistieren (Kuenz u. a. 2008). Kuenz u. a.

(2008) fanden bei Patienten mit CIS ebenfalls signifikant erhohte Haufigkeiten


fur reife B-Zellen, Plasmazellen und kurzlebigere Plasmablasten (CD19+ CD138+)

im Liquor. Die Mehrheit der B-Zellen trug dabei den CD19+ CD27+ Memory-

Phanotyp, gleiche Ergebnisse wurden in der vorliegenden Studie (Daten nicht

gezeigt) und in der Literatur gefunden. Die Minderheit war vom naiven Typ

(CD19+ CD27-). Daruber hinaus fand sich ein Abwartstrend der Haufigkeiten

im CSF vom CIS uber RR-MS zur SP-MS (Kuenz u. a. 2008). Diese Resul-

tate und die Ergebnisse der vorliegenden Studie implizieren, dass die inflam-

matorische B-Zellreaktion besonders in fruhen Krankheitsstadien und akuter

Entzundung eine Rolle spielt und eine veranderte Homoostase von B-Zellen

schon bei Patienten mit CIS vorliegt. Hier konnte kein signifikanter Unterschied

der B-Zellen im Vergleich der Kohorten CIS und MS gefunden werden (12 %

vs. 12 %).

Die ROC-Analyse des Quotienten fur B-Zellen stellt einen

moglichen Laborparameter fur die Diagnostik dar

In der ROC-Analyse wurden signifikante Werte mit einer guten AUC von ca.

0,85 fur reife B-Zellen und Memoryzellen gefunden (p≤ 0,001). Bei Betrach-

tung aller reifen B-Zellen fand sich eine Sensitivitat von 0,78 und Spezifitat von

0,92 bei einem guten Likelhood-ratio von annahernd 10. Fur Plasmazellen lagen

die Werte durchschnittlich niedriger bei besserer Sensitivitat. Somit stellt die

Bestimmung des Quotienten, besondes fur reife B-Zellen, einen moglichen La-

borparameter im diagnostischen Prozess dar. Ein Quotient kleiner oder gleich

4,4 fur reife B-Zellen diskriminiert mit hoher Spezifitat zwischen CIS und ge-

sunden Kontrollen. Ca. neun von zehn Patienten mit einem Quotienten kleiner

oder gleich 4,4 hatten tatsachlich ein CIS. Es zeigt sich auch hier eine – wenn

auch geringfugig – bessere diagnostische Prazision bei Stratifizierung nach ei-

nem fruhen Krankheitsbeginn. Dies unterstreicht die Rolle von B-Zellen in der

Pathogenese ganz zu Beginn der Krankheit und unterstutzt die gegenwartige

Auffassung, moglichst fruh mit einer immunmodulatorischen Therapie zu be-

ginnen. Die bessere Spezifitat der B-Zellen als der TREG (0,92 vs. 0,76) liegt

moglicherwiese in der Tatsache begrundet, dass sich in klinischen Studien, in

denen B-Zellen bei MS Patienten mit anderen neurologisch-inflammatorischen

Krankheiten (OIND) verglichen wurden, eine Akkumulation der Zellen nur bei

MS fand, nicht jedoch in der OIND Gruppe oder bei gesunden Kontrollen;

fur TREG konnte diese Beobachtung teilweise nicht gemacht werden (Oreja-

Guevara u. a. 1998).


4.2.7. Positive Korrelation des Quotienten fur Plasmazellen mit der

kranialen Lasionslast

Die Korrelationsanalyse der Quotienten erbrachte eine allenfalls schwach- bis

mittelgradige Assoziation mit der Lasionslast.

In dieser Studie wurde eine reziproke Beziehung zwischen Haufigkeit der Plas-

mazellen im CSF und Lasionslast gemessen. Dieses Ergebnis erscheint paradox,

denn nach dem gegenwartigen Verstandnis von Plasmazellen in der Pathogenese

der MS ware eine negative Korrelation des Quotienten mit der Lasionslast zu

erwarten: Je großer die Haufigkeit fur Plasmazellen im CSF, desto großer die

kraniale Lasionslast. Das vorliegende Ergebnis ist am ehesten zufallsbedingt.

Hinweise dafur finden sich in divergierender Polaritat der Korrelationskoeffizi-

enten fur reife B-Zellen und Memory B-Zellen (negativ) und Plasmazellen (po-

sitiv). Beiden Zellpopulationen wird eine proinflammatorische Funktion in der

Pathogenese zugesprochen (Corcione u. a. 2004), demzufolge ware ein gleich-

sinniger Koeffizient zu erwarten. Weiterhin sind die Ergebnisse mit p = 0,006

(keine Stratifizierung) und p = 0,007 (stratifiziert nach Lasionen) auf dem Si-

gnifikanzniveau von α= 0,8 % nach Bonferroni allenfalls knapp signifikant und

stratifiziert nach EDSS nicht signifikant.

Zu einem abweichenden Ergebnis kamen auch Kuenz u. a. (2008), die eben-

falls den Zusammenhang von B-Zellen und Krankheitsaktivitat, gemessen am

cMRT, untersuchten. Es fanden sich positive Korrelationen fur reife B-Zellen

und Plasmablasten mit hoher Lasionslast (≥ 9 Lasionen) und neu aufgetretenen

Gd-speichernden Lasionen. Fur klinische Parameter wie den EDSS fand sich

keine Korrelation der B-Zellen im CSF (Kuenz u. a. 2008). Diese Ergebnisse

sind hinweisend auf eine direkte Beteiligung von Plasmazellen an entzundlichen

ZNS-Lasionen. Auch bieten sie einen Erklarungsansatz fur Erkenntnisse, die aus

Therapiestudien mit Natalizumab gewonnen wurden. Es fand sich eine signifi-

kante Reduktion der Haufigkeit von CD19+ B-Zellen und CD138+ Plasmazel-

len im CSF unter Natalizumab, welche in positivem Zusammenhang mit einer

Reduktion der Schubrate sowie entzundlicher Aktivitat im MRT stand (Stuve

u. a. 2006).

Zusammenfassend konnte in dieser Studie kein proportionaler Zusammen-

hang zwischen einer Dysbalance fur B-Zellen und Entzundungsaktivitat im ZNS

gezeigt werden.


4.2.8. Keine quantitativen Unterschiede der Quotienten fur

Thymusemigranten bei Patienten mit CIS

In der Analyse der CD4+/CD8+ Thymusemigranten fand sich kein signifikanter

Unterschied der Quotienten im Kohrtenvergleich. In allen Kohorten uberwiegt

der Anteil im peripheren Blut im Vergleich zum Liquor. Fur CD8+ Thymuse-

migranten lag der Quotient deutlich niedriger. Dies ist Resultat sowohl einer

großeren Haufigkeit der CD8+ Zellen im CSF, als auch niedrigerer Pravalenz

im PBL. Fur MS zeigte sich ein Trend zu geringfugig niedrigeren Haufigkeiten

der Thymusemigranten im Blut und Liquor. Aufgrund nicht-signifikanter Un-

terschiede wurde auf eine ROC-Analyse verzichtet.

Es lasst sich somit keine Aussage uber eine relevante Akkumulation oder Ver-

minderung der Thymusemigranten bei Patienten mit CIS oder MS treffen.

Auch scheint der Auswurf der naiven Zellen aus dem Thymus keiner signifi-

kanten Veranderung unterworfen zu sein, wie sich an annahernd identischen

Haufigkeiten im peripheren Blut zeigt (41–44 % fur CD4+ und 25–31 % fur

CD8+). Wurden die T-Zellen beim Ubertritt uber die BHS ihren Phanotyp

zu Ungunsten der Expression von CD45RA verandern, ware eine Depletion aus

dem peripheren Blutpool bei Patienten mit CIS/MS zu erwarten. Hierfur zeigte

sich weder fur CD4+ noch CD8+ eine Tendenz.

CD45RA wird auf naiven, also noch nicht antigen-stimulierten T-Zellen ex-

primiert. Ein Ruckgang der Expression ist im Ag-stimulierten Milieu bei chro-

nischen Autoimmunerkrankungenzu erwarten, wahrend unter denselben Be-

dingungen eine Augmentation von Memoryzellen folgerichtig erscheint (Mi-

kulkova u. a. 2011). In einer kleineren Studie fand sich ein Trend zur redu-

zierten Haufigkeit naiver CD4+ T-Zellen im PBL bei Patienten mit RR-MS

und Diabetes Mellitus Typ I. Memoryzellen, durch negative Expression fur

CD45RO phanotypisiert, fanden sich signifikant erhoht bei DM Typ I, nicht

aber bei MS (Mikulkova u. a. 2010). Die selbe Arbeitsgruppe erzielte spater in

einer ahnlich aufgebauten Studie signifikante Ergebnisse mit einer reduzierten

Haufigkeit CD4+ CD45RA +CCR7+ Zellen bei Patienten mit RR-MS (Mikul-

kova u. a. 2011). In der neueren Studie wurde allerdings eine zusatzliche Im-

munphanotypisierung mit dem Zytokinrezeptor CCR7 vorgenommen und die

nicht eindeutig reproduzierbaren Ergebnisse sowie die Resultate der vorliegen-

den Arbeit konnen eine veranderte Homoostase fur Thymusemigranten bei der

MS nicht sicher bestatigen.

Zusammengefasst unterstreichen diese Daten, sowie auch die hier gefundenen


Ergebnisse, die Rolle von Memoryzellen in der Immunpathogenese der MS. Mi-

kulkova u. a. (2011) fanden signifikant reduzierte Haufigkeiten naiver T-Zellen

bei MS, wahrend in der vorliegenden Arbeit und in fruheren Studien allenfalls

Trends aufgezeigt werden konnten. Beim CIS als fruhstmogliche Manifestation

der Krankheit scheint eine mogliche Transformation der naiven Zellen zuguns-

ten des Memoryphanotyps anscheinend noch nicht stattgefunden zu haben.

Die Bestimmung der CD45RA Expression spielt auch eine Rolle in der Eva-

luation der TREG in der Pathogenese. TREG aus Nabelschnurblut haben

hauptsachlich einen naiven Phanotyp und ein kleiner Anteil dieser CD45RA+-

CD45RO- Zellen findet sich immernoch bei gesunden Erwachsenen. Die Zel-

len zeigen hohe Level an TRECs (T-cell receptor excision circles, ein Mar-

ker fur den Ausstoß der naiven Zellen aus dem Thymus). Diese recent-thymic-

emigrants (RTE)–TREG reprasentieren Vorlaufer der adulten, AG-spezifischen

CD45RO+ Memory–TREG, welche die Mehrheit der zirkulierenden TREG

ausmachen und ein breites T-Zell Rezeptor Repertoire aufweisen. Aufgrund

physiologischer Immunoseneszenz und Involution des Thymus reduzieren sich

die RTE–T-REgs mit fortschreitendem Alter, wahrend das Gesamtlevel der

TREG annahernd konstant bleibt oder sogar steigt. Moglicherweise findet ei-

ne Neubildung der Zellen in der Peripherie aus aktivierten Effektor/Memory

T-Zellen statt (Venken u. a. 2010). Jungere Untersuchungen legen eine ver-

minderte Haufigkeit der RTE–TREG bei Patienten mit MS nahe und konn-

ten verminderte Level an TRECs aufzeigen, was eine dem Alter unangemesse

niedrige Auswurfleistung des Thymus mit konsekutiver gestorter Homoostase

der Zellen suggeriert. Daruberhinaus ist schon die Effektorfunktion der frisch

emigrierten Zellen gestort und Hypothesen wurden aufgestellt, daß diese fur

die beeintrachtigte Funktion unter allen CD25high TREG verantwortlich seien

(Haas u. a. 2007; Venken u. a. 2008b).

Mittelgradige bis schwache negative Korrelationen mit der Lasionslast wur-

den fur CD4+ Thymusemigranten gefunden. Nach Bonferronikorrektur blieb als

statistisch signifikant nur die Stratifizierung nach EDSS Verbesserung (p = 0,004).

Patienten mit einem niedrigen Quotienten und somit großerem relativen Anteil

im Liquor hatten somit eine großere Lasionslast im MRT. Diese Beobachtung

ist vereinbar mit der Tatsache, dass die MS eine T-Zell mediierte Erkrankung ist

und aktivierte CD4+ Memoryzellen mit Krankheitsschuben assoziiert werden

(Okuda u. a. 2005), welche aus dem Pool der naiven T-Zellen hervorgehen und

fur Demyelinisierung verantwortlich sind (Muraro u. a. 2000). Somit scheinen

schon naive CD45RA+ T-Zellen Einfluß auf Pathogenese zu spielen.


4.2.9. Quantitative Unterschiede fur CD14+CD16+ Monozyten bei

Patienten mit CIS

Fur CD14+CD16+ Monozyten wurde ein signifikant großerer Quotient bei CIS

im Vergleich zu Kontrollen gefunden. Nach Bonferroni-Korrektur knapp nicht

mehr signifikant war der Vergleich von MS und gesunden Kontrollen (p = 0,049).

Dabei resultieren die großeren Quotienten bei CIS und MS aus einer verminder-

ten Haufigkeit im Liquor bei identischen Haufigkeiten im Blut. Es liegt somit

eine veranderte Homoostase der Monozyten im Patientenliquor vor.

In dieser Studie fanden sich normale Serumhaufigkeiten der Monozyten. Mit

einem Anteil von ca. 14–19 % wurden geringfugig mehr CD14+ CD16+ Zel-

len gefunden als mit ca. 10 % in der Literatur beschrieben (Bergh u. a. 2004).

Fruhere Studien fanden ebenfalls normale relative und absolute Haufigkeiten

aller Monozytenpopulationen im peripheren Blut bei Patienten sowie gesunden

Kontrollen (Bergh u. a. 2004; Kouwenhoven u. a. 2001). Dies die erste Arbeit,

die in der Betrachtung der Monozyten auch die durchflusszytometrische Ana-

lyse des Liquors bei Patienten mit CIS berucksichtigt.

Aus oben genannten Ergebnissen wird deutlich, dass die Zahl der CD14+-

CD16+ Zellen im Patientenliquor vermindert ist. Obwohl ein signifikanter Un-

terschied nur fur den Vergleich der CIS Kohorte mit normalen Kontrollen und

(nach Bonferroni) nicht fur die MS Kohorte besteht, unterscheiden sich die bei-

den Quotienten der Patientenkohorten jedoch kaum voneinander (2,1 vs. 2,3;

p = 0,81; Daten nicht gezeigt). Es ist daher moglich, dass prinzipielle Unterschie-

de der Haufigkeiten ebenfalls fur MS Patienten gelten und kein CIS-spezifisches

Phanomen darstellen.

Obwohl Makrophagen/Monozyten proinflammatorisch in die Pathogenese der

MS eingreifen (Vaknin-Dembinsky u. a. 2008), gibt es jedoch auch Hinweise

auf einen protektiven Effekt. Interleukin-10, ein Zytokin mit immunregulato-

rischen Eigenschaften im Sinne einer Augmentation der antiinflammatorischen

TH2-Antwort und Suppression der TH1 assoziierten Zytokine wird von Makro-

phagen sezerniert und konnte eine begunstigende Rolle bei MS spielen (Ozenci

u. a. 2000). Piccio u. a. (2008) fanden zwar großere Haufigkeiten IL-10 sezer-

nierender Zellen im Liquor von MS-Patienten, allerdings schloss das Studien-

design sowohl RR als auch SP-MS ein und die mittlere Krankheitsdauer der

MS-Patienten betrug 13 Jahre. Es ware also moglich, dass die hier erniedrigten

CD14+CD16+ Zellen im Liquor uber erniedrigte antiinflammatorische Zytokin-

spiegel eine entzundungsfordernde Wirkung im Liquorkompartiment entfalten.

4.3. Vorschlage fur weitergehende Forschungsanstrengung 82

Eine neuere Studie fand erhohte Spiegel des antiinflammatorischen Rezeptors

sTREM-2 im Liquor, dessen membrangebundene Form auf CD14+CD16+ Ma-

krophagen im Liquor gefunden wurde. Die Autoren schlussfolgerten, dass die

losliche Form des Rezeptors die antientzundliche Funktion der Monozyten ne-

gativ beeinflusst (Piccio u. a. 2008). Die mogliche protektive Rolle der CD14+-

CD16+ Monozyten und ihre erniedrigte Haufigkeit im Liquor beim CIS sollte

in weiterfuhrenden Studien evaluiert werden.

Neben CD14 und CD16 zeigen Monozyten eine uberdurchschnittlich starke

Expression von Klasse II Antigenen auf der Zelloberflache (Ziegler-Heitbrock

u. a. 1993). Angesichts der wichtigen Rolle von MHC-II bei der Antigenprasen-

tation konnten diese Zellen eine entscheidende Funktion in der Immunmodulati-

on bei MS einnehmen. Es fand sich daruberhinaus auch eine erhohte Expression

von Oberflachenmolekulen fur die Integrin-assoziierte Zellmigration wie CD11a,

CD11c, CD18 und VLA-4 (Ziegler-Heitbrock u. a. 1993). Der schon in den Ab-

schnitten 4.2.3 und 4.2.2 auf Seite 68 ff diskutierte mogliche Erklarungsansatz

konnte also in ahnlicher Weise auch fur Monozyten gelten.

Wie bei den meisten anderen Farbungen erbrachte die ROC stratifiziert nach

Lasionslast die besten Ergebnisse. Mit einer signifikanten guten AUC von 0,78

und Sensitivitat und Spezifitat um 0,73 kann moglicherweise die durchflusszy-

tometrische Untersuchung der CD14+C16+ Monozyten diagnostisch eingesetzt

werden.

Die Korrelationsanalyse erbrachte fur keine der untersuchten Populationen

eine signifikante oder relevante Korrelation des Quotienten mit der Lasionslast.

Die Auspragung des Quotienten mit veranderter Homoostase scheint also in

keinem direkten Zusammenhang mit der Entzundungsaktivitat zu stehen. Ver-

gleichende Studien zur Korrelation von Monozyten mit MRT-Befunden bei Pa-

tienten mit CIS oder MS wurden nicht gefunden.

4.3. Vorschlage fur weitergehende Forschungsanstrengung

In jungerer Vergangenheit ist eine Weiterdifferenzierung der regulatorischen T-

Zellen ins Zentrum der Aufmerksamkeit geruckt, da auch aktivierte (CD25med)

und nicht nur regulatorische T-Zellen CD25 in unterschiedlich starker Aus-

pragung exprimieren konnen. Obwohl die CD25high-Population relativ homo-

gen zu sein scheint, finden sich aber auch regulatorische Zellen in der CD25med-

Population (Venken u. a. 2010). Die Messung des intrazellularen Transkripti-

onsfaktors FoxP3 auf T-Zellen erlaubt z. B. eine akkurate Untersuchung der


Haufigkeiten bei Patienten und Gesunden und das fur FoxP3 kodierende Gen

konnte als essentiell in der Entwicklung der TREG dargestellt werden. Vermin-

derte Expression von FoxP3 auf zellularer Ebene korrelierte mit der beschrie-

benen Dysfunktion regulatorischer Zellen bei Patienten mit RR-MS. Im Ge-

gensatz dazu konnte bei SP-MS Patienten keine verminderte Expression mehr

festgestellt werden; diese Beobachtung unterstutzt erneut die Hypothese einer

Rekonvaleszenz der Suppressorfunktion im fortgeschrittenen Krankheitsverlauf

(Venken u. a. 2008a). Eine noch bessere Differenzierung konnte unlangst durch

den Einsatz von anti-CD127 AK erreicht werden. Die niedrige Expression von

CD127 auf CD4+ CD25high Zellen scheint besser zur Definition der TREG ge-

eignet zu sein als die Expression von FoxP3, da dieses als intrazellulares Protein

der forkhead Familie fur die Purifikation der Zellen im Labor aus technischen

Grunden nur bedingt geeignet ist. CD4+ CD25high CD127low zeigen eine hoch-

gradige suppressive Kapazitat (Seddiki u. a. 2006).

Folgerichtig sollte die Untersuchung der Liquorzytologie bei Patienten mit CIS

in Zukunft dem aktuellen Stand der Forschung folgen, um Populationen inner-

halb der TREG identifizieren zu konnen, die moglicherweise noch besser als

diagnostisches Hilfsmittel in Bezug auf Sensitivitat und Spezifitat geeignet sind

als die bloße Charakterisierung durch CD25high.

Desweiteren existiert eine Reihe anderer regulatorischer Zellen, die eine Rolle

in der Pathogenese des CIS oder der MS einnehmen konnten (siehe Tabelle 4.4

auf Seite 84), auf die hier aber nicht weiter eingegangen werden soll. Dennoch

bieten sie Potential fur zukunftige Forschungsanstrengungen:

Das Datenmaterial der vorliegenden Studie liefert einen guten Ausgangspunkt

fur eine Langzeitbeobachtung der Patienten, um das gesamte Spektrum der

Entwicklung der Liquorzytologie vom CIS bis zur SP-MS erfassen zu konnen.

Mithilfe serieller MRT-Untersuchungen und moglicherweise Liquorpunktionen

konnten folgende Fragen erortert werden:

� Die Effektorfunktion der TREG scheint sich im naturlich Verlauf zur SP-

MS zu rehabilitieren (s. o.). Eine Arbeitshypothese konnte sein, dass auch

das quantitative Ungleichgewicht der Zellen sich normalisieren kann und

bei Patienten mit CIS am starksten im Vergleich zu spateren Krankheits-

stadien gestort ist. Wie stellt sich der Quotient bei vom CIS zur MS

konvertierten Patienten dar? Unterscheidet sich die Effektorfunktion der

TREG bei Patienten mit CIS im Vergleich zu RR-MS, gemessen am se-

zernierten Zytokinprofil (s. o.)?


Tabelle 4.4.:

Subpopulationen humaner regulatorischer T-Zellen. Wissenschaftliches und medizi-

nisches Interesse an den Mechanismen der Immuntoleranz fuhrte zur Entdeckung zahlreicher

immunregulatorischer Zellen mit jeweils eigenen suppressiven Mechanismen, die Aktivitat

autoreaktiver T-Zellen zu supprimieren. NKZ = naturliche Killerzellen, med. = mittelgradig,

TR1v=vTyp I regulatorische T-Zelle, TH3 =vT-Helfer 3 Zelle, RTE = recent thymus emi-

grant. Auszug, in Anlehnung an Venken u. a. (2010).

Regulatorische

Zellen

Phanotyp Ursprung moglicher

Suppressionsmechanismus

TREG CD4+CD25high FoxP3+ Thymus,

Peripherie

Zell-Zell Kontakt, IL-10,

TGF-β, IL-35,

Perforin oder Granzyme

NKZ CD4/8+, DN,

TCR: Vα24Jα18-Vβ11

Thymus IL-4, IFN-γ, IL-10 oder

Zytotoxizitat

TR1 CD4+CD25med Peripherie IL-10

TH3 CD4+CD25med Peripherie TGF-β

RTE–TREG CD4+ CD25high

CD45RA+CD45RO-

Thymus ??

� Welchen Wert haben die Quotienten im Rahmen einer Therapieentschei-

dung? Lasst sich, eventuell in Kombination mit magnetresonaztomografi-

schen Parametern, ein zuverlassigeres Urteil fallen, welche Patienten von

einer immmunmodulatorischen Therapie profitieren konnten?

� Welchen pradiktiven Wert haben die Quotienten in Bezug auf Schubfre-

quenz, Schwere der Schube, klinische Beeintrachtigung, Entwicklung des

EDSS oder Zunahme der kranialen Lasionslast?

� Welche Krankheitsprogression lasst sich bei den in dieser Studie erfassten

Patienten mit CIS feststellen? Stratifiziert nach der Entwicklung von kei-

ner MS, RR-MS und SP-MS, gibt es retrospektiv unterschiede der Quoti-

enten, die moglicherweise pradiktiven Wert fur den Konversionszeitraum-

und Typ darstellen?

� Profitieren Patienten mit extremen Auspragungen der Quotienten, z. B.

fur Plasmazellen oder reife B-Zellen in besonderem Masse von einer im-

munmodulatorischen Therapie (z. B. senkt Natalizumab erwiesenermas-

sen die Haufigkeiten bestimmter B-Zell Subtypen im CSF (Stuve u. a.

2006))?

� Jungere Hypothesen gehen von einer gestorten Effektorfunktion der Zel-

4.4. Kritische Wurdigung und Grenzen der Studie 85

len schon in einem sehr fruhen Entwicklungsstadium, der RTE–TREG,

aus (siehe Abschnitt 4.2.8 auf Seite 79). Lassen sich Unterschiede der

Haufigkeiten der RTE–TREG bei Patienten mit CIS feststellen, d. h. liegt

dem qualitativen Defekt moglicherweise auch ein quantitativer Defekt zu-

grunde?

� Die vorliegende Studie fand eine Dysbalance CD14+ CD16+ Zellen mit

reduzierten Haufigkeiten im Patientenliquor. Dies ist moglicherweise ein

Hinweis auf eine protektive Rolle dieser Monozytenpopulation, die auf-

grund der gestorten Homoostase nur eingeschrankt wahrgenommen wer-

den kann. Hinweise auf mogliche antiinflammatorischen Effekte sind in

der Literatur beschrieben (Piccio u. a. 2008; Ozenci u. a. 2000) und soll-

ten weiterfuhrend erortert werden.

Desweiteren sollte die Forschung auf dem Gebiet der Adhasionsmolekule in-

tensiviert werden (siehe Tabelle 4.3 auf Seite 70), um ein besseres Verstandnis

zugrundeliegender pathophysiologischer Mechanismen zu ermoglichen. Wenn es

gelange, Storungen auf molekularer oder genetischer Ebene zu identifizieren,

konnten gezielte Therapien z. B. in Form monoklonaler Antikorper entwickelt

werden. Protektiven Zellen konnte ein anderer Weg der Diapedese geschaffen

werden und proinflammatorische Zellen am Ubertritt gehindert werden, wie es

zum Teil in Form von Natalizumab in der Eskalationstherapie schon angewen-

det wird (Stuve u. a. 2006). So deuten jungere Forschungsanstrengungen z. B.

auf einen moglichen SNP (single nucleotide polymorphism) im fur die α-Kette

des IL-2 Rezeptors (CD25) kodierenden Gens und anderen Loci hin, die fur die

Aktivierung und Homoostase der T- und B-Zellen eine wichtige Rolle spielen

(Hafler u. a. 2007).

4.4. Kritische Wurdigung und Grenzen der Studie

Methodologische Probleme ergeben sich moglicherweise aus der Durchfuhrung

mehrerer Farbungen bei relativ geringem Zellmaterial im FACS. Durchschnitt-

lich werden bei Lumbalpunktion ca. 15 ml Liquor entnommen. Technisch be-

dingt ist dies jedoch nicht immer bei allen Patienten moglich und gerade bei

Materialgewinnung in der Kontrollgruppe mit (definitionsgemass) weniger als

sechs Zellen pro Mikroliter Liquor kann dies bei Aufteilung auf mehrere wells

zu statistischen Problemem in der Auswertung fuhren. Je mehr verschiedene

Antikorper bei der Farbung eingesetzt werden und je hoher eine spezifische

Zellpopulation differenziert wird, desto weniger Zellen gehen anschliessend in

4.4. Kritische Wurdigung und Grenzen der Studie 86

die Berechnung ein. Trotzallem wurde die Durchflusszytometrie in der Vergan-

genheit erfolgreich fur die Liquoranalyse auch mit geringem Zellanteil eingesetzt

(Kleine u. a. 1999). In dieser Studie wurde, wann immer moglich, die Mindest-

menge von ca. 5000 Lymphozyten pro Messung fur ein statistisch verwertbares

Ergebnis berucksichtigt (Tackenberg u. a. 2007).

Mogliche Strukturungleichheiten der Kohorten CIS und KONTROLLE wur-

den in dieser Arbeit zugunsten hoherer Fallzahlen in Kauf genommen. So wurde

z. B. auf ein Alters- und Geschlechtsmatching verzichtet. Auch bestand unsere

Kontrollkohorte nicht aus vollig gesunden Personen, sondern streng genommen

aus Personen mit”anderen neurologischen Krankheiten nicht-inflammatorischer

oder zentralnervoser Natur“. Dies liegt in der Gewinnung des Liquors begrundet,

da keine Lumbalpunktionen aus rein wissenschaftlicher Indikation an gesunden

Freiwilligen durchgefuhrt wurden. Dieses Vorgehen findet sich ebenfalls in der

Literatur, so z. B. bei Venken u. a. (2008a) und Jensen u. a. (2004).

Die volumetrische Analyse der kranialen Lasionslast birgt ein gewisses Maß an

Subjektivitat, da manuell einzelne Lasionen am Computer eingegrenzt werden

und sich inter- und auch intraindividuelle Schwankungen in Bezug auf die be-

stimmte (Lasions-)Flache ergeben konnen; fur diese Arbeit stehen bis jetzt noch

keine automatisierten und standardisierten Programmroutinen zur Verfugung.

Das gleiche trifft prinzipiell auch fur die Durchflusszytometrie zu, da hier Lym-

phozytenpopulationen mit einem gewissen Grad an Willkur gegeneinander gra-

fisch abgegrenzt werden und somit die Interrater-Variabilitat dementsprechend

zu erwarten ist. Leider konnten zu diesem Thema keine passenden Studien ge-

funden werden.

Als TREG vor ein paar Jahren ins Zentrum der Aufmerksamkeit immuno-

logischer Forschung ruckten und auch die ersten Patienten fur diese Studie

rekrutiert wurden, war die Charakterisierung allein durch die hohe Expression

vom CD25 standard. Heutzutage existieren weitere Marker wie FoxP3 sowie

andere regulatorische Subpopulationen (siehe Abschnit 4.3 auf Seite 82). Dar-

aus ergeben sich moglicherweise Abweichungen zu spateren Studien, die andere

Marker in der zytologischen Farbung verwendet haben. Studien uber humane

TREG konnen ausserdem durch die Tatsache divergieren, dass moglicherweise

nicht nur TREG, sondern auch andere aktivierte Effektor-T-Zellen bei alleini-

ger Differenzierung mit CD25 und FoxP3 erfasst werden. Aus diesem Grund

wird immer mehr CD127low als zusatzlicher Marker zur Identifikation humaner

TREG genutzt (Liu u. a. 2006). Dies sollte fur zukunftige durchflusszytometri-

sche Studien an TREG berucksichtigt werden.

5. Zusammenfassung/Summary

Einleitung Das Klinisch-Isolierte-Syndrom (CIS) bezeichnet das Auftreten

eines ersten fokal-neurologischen Defizits uber mindestens 24 Stunden und ist

verdachtig fur die Entwicklung einer Multiplen Sklerose (Kappos u. a. 2006).

Neben autoreaktiven, proinflammatorischen T-Zellen (Bhat, Steinman 2009)

spielen auch andere Komponenten des zellularen Immunsystems wie B-Zellen,

Plasmazellen, Monozyten und Makrophagen eine wichtige Rolle in der Patho-

genese (Schneider-Hohendorf u. a. 2010; Kuenz u. a. 2008; Walter u. a. 2006).

Insbesondere CD25high regulatorische T-Zellen sind aufgrund einer gestorten

Effektorfunktion bei der MS involviert (Venken u. a. 2010). Daruberhinaus exis-

tieren Hinweise auf eine Verminderung von VLA-4, ein Protein fur die Diape-

dese uber die Blut-Hirn-Schranke, auf TREG des peripheren Blutes von Pati-

enten mit RR-MS (Stenner u. a. 2008). Somit ist die Aufrechterhaltung einer

Immunhomoostase uber die humoralen Kompartimente von großer Wichtigkeit

fur Initiierung und Kontrolle der entzundlichen Reaktion im ZNS, dabei wird

die Quantifizierung von Leukozyten im Blut und Liquor bei Patienten mit MS

und CIS zur Charakterisierung einer moglichen Dysbalance eingesetzt (Engel-

hardt, Ransohoff 2005; Feger u. a. 2007a). Sowohl als Prediktor in Bezug auf

Haufigkeit und Schwere konsekutiver Schube als auch fur den spateren Grad der

Behinderung haben sich magnetresonanztomografische Befunde etabliert (Brex

u. a. 2002; Kappos u. a. 2006). Die vorliegende Arbeit untersucht die Fragestel-

lung, ob eine Dysbalance zwischen Blut- und Liquorkompartiment bestimmter

Immunzelltypen bei Patienten mit CIS besteht und ob das Ausmaß mit dem

Grad der zentralnervosen Entzundung, gemessen anhand der Lasionslast im

cMRT, korreliert. Material Blut- und Liquorproben von 64 unbehandelten

Patienten mit CIS, 18 mit MS und 43 mit anderen, nicht-entzundlichen neuro-

logischen Krankheiten (ANK) wurden mit Antikorpern gegen CD3, CD4, CD8,

CD14, CD16, CD19, CD20, CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD49d, CD62L und

CD138 gefarbt und durchflußzytometrisch gemaß publizierter Methoden unter-

sucht (Tackenberg u. a. 2007). Die kumulative T2-hyperintense Lasionslast wur-

de von allen Patienten mit CIS in den Wichtungen sag. T2 FS, ax. T1 SE, ax.

FLAIR, ax. PD und T2, ax. T1 SE + KM bestimmt und mit dem Quotienten der

Haufigkeit bestimmter Leukozytensubpopulationen im Blut- und Liquor korre-

87


liert. Weiterhin wurde der EDSS-Score bei Diagnosestellung erhoben und eine

ROC-Analyse bei divergierenden Quotienten der CIS- und Kontrollprobanden

durchgefuhrt. Bei einer Subgruppe der CIS-Patienten (n = 18) wurde die mitt-

lere Fluoreszenzintensitat (MFI) fur VLA-4 (CD49d) fur verschiedene Expressi-

onsniveaus von CD25 auf CD4+ T-Lymphozyten bestimmt. Ergebnisse Si-

gnifikante Unterschiede der Quotienten fanden sich fur regulatorische T-Zellen,

reife B-Zellen, Memory B-Zellen und CD16+ Monozyten im Vergleich von Pa-

tienten mit CIS und ANK. Bei den selben Zellpopulationen ergab die ROC-

Analyse der Quotienten signifikante Werte und es konnte ein Grenzwert errech-

net werden, um zwischen krank und gesund zu diskriminieren. Eine positive

Korrelation mit der kranialen Lasionslast fand sich fur regulatorische T-Zellen

(r = 0,68) und Plasmazellen (r = 0,55), eine negative Korrelation fur CD4+ Thy-

musemigranten (r = -0,53). Die beste Korrelation wurde meist fur die Stratifi-

zierung nach sehr fruhem CIS erreicht (≤ 6 Lasionen). Die MFI fur VLA-4

auf CD4+ CD25low-high Lymphozyten im PBL und CSF war signifikant hoher

bei Patienten mit ANK als bei CIS. Diskussion Im Gegensatz zu Kontroll-

personen ist bei CIS Patienten der relative Anteil von regulatorischen CD4+

T-Zellen im Liquorkompartiment im Vergleich zum peripheren Blut signifikant

erniedrigt und bei reifen B-Zellen, Memory B-Zellen und CD16+ Monozyten

erhoht. Neben einer exekutiven Dysfunktion fur regulatorische T-Zellen (Ven-

ken u. a. 2006) scheint auch ein quantitativer Defekt vorzuliegen, verantwortlich

ist moglicherweise eine reduzierte Expression des Zelladhasionsmolekul VLA-4

auf Lymphozyten bei Patienten mit CIS. Bei Patienten im fruhen Stadium

haben regulatorische Zellen im Liquor moglicherweise einen antiinflammatori-

schen Effekt und der Quotient kann einen labortechnischen Surrogatparameter

fur Diagnosestellung und Entzundungsaktivitat darstellen. Die Korrelation des

Quotienten fur Plasmazellen mit der Lasionslast ist am ehesten als zufalls-

bedingt zu werten. Aus der Korrelation fur naive Thymusemigranten ergibt

sich eine denkbare Rolle in der fruhen Pathogenese des CIS. Zusammenfassend

scheint eine Dysbalance in der Immunhomoostase verschiedener in die Pathoge-

nese involvierter Zellen beim CIS vorzuliegen, die moglicherweise auf Defekte in

Zelladhasionsmolekulen auf der Oberflache zuruckzufuhren ist. Die Auspragung

des relativen Ungleichgewichts im Blut oder Liquor kann dabei das Ausmaß der

zerebralen Entzundung im kranialen MRT bestimmen und eventuell zur Dia-

gnosestellung benutzt werden.


Introduction The term ‘Clinically Isolated Syndrome’ (CIS) describes a

first focal-neurological, demyelinating event lasting for at least 24 hours and

is equivocal for the development of definitive Multiple Sclerosis (MS) (Kap-

pos et al. 2006). Besides peripherically activated autoreactive T-cells, who re-

encounter their specific antigen within the borders of human CNS and induce

proinflammatory tissue reactions (Bhat, Steinman 2009), other immune cells of

the innate and adaptive immunesystem like B-cells, plasmacells, monocytes and

macrophages play a major role in the pathogenesis of MS (Kuenz et al. 2008;

Schneider-Hohendorf et al. 2010; Walter et al. 2006). In particular, CD25high

regulatory T-cells (TREG) seem to be involved due to a hampered executive

cell function (Venken et al. 2010). In addition, there is mounting evidence

for a decreased cell surface expression of VLA-4 on CD25high TREG in the

blood of patients with RR-MS, a protein responsible for cell diapedesis across

the blood-csf-barriers (Stenner et al. 2008). Maintenance of immunehomeosta-

sis in the humoural compartments peripheral blood (PBL) and cerebrospinal

fluid (CSF) is crucial for initiation and control of inflammatory CNS reactions

and the quantification of leukocytes in peripheral blood and cerebrospinal fluid

in patients with CIS and MS has been used to describe a given dysbalance

(Engelhardt, Ransohoff 2005; Feger et al. 2007a). In the past, MRI findings

have been successfully introduced as a predictor of frequency and gravidity of

subsequent relapses and for the future degree of disability (Brex et al. 2002;

Kappos et al. 2006). The aim of the present study is to investigate if there is

an existing imbalance between leukocytes in PBL and CSF in patients with

CIS compared to controls and if the degree of a given imbalance correlates

with CNS inflammation, measured as T2-hyperintense total lesion volume load

in cranial MRI. Material Venous peripheral blood and cerebrospinal fluid

samples of 64 untreated patients with CIS, 18 patients with MS and 43 pa-

tients with other non-inflammatory neurological deseases (ONID) have been

stained with antibodies against CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD20,

CD25, CD27, CD28, CD45RA, CD49d, CD62L and CD138 and analyzed flow-

cytometrically according to published methods (Tackenberg et al. 2007). MRI

T2-hyperintense total lesion volume of each single patient has been calcu-

lated in a standardized way (‘MS-programme’, sag. T2 FS, ax. T1 SE, ax.

FLAIR, ax. PD und T2, ax. T1 SE + CA) and correlated with the PBL/CSF

ratio of specific immunecell subsets. EDSS-score at desease onset has been

taken and a ROC analysis has been performed in cases of diverging ratios.

In a subgroup of CIS patients (n = 18), mean fluorescence intensity (MFI) for


VLA-4 (CD49d) has been measured for different expression levels of CD25 in

CD4+ lymphocytes. Results Significant differences in CIS PBL/CSF ratios

have been found for regulatory T-cells, CD19+ B-cells and CD16+ monocytes

compared to ONID. ROC analysis for the same subsets revealed significance

and a specific cut-off has been determined to discriminate between ‘ill’ and

‘healthy’. Positive correlation with cranial total volume lesion load has been

found for regulatory T-cells (r = 0,68) and plasmacells (r = 0,55), a negative

correlation for CD4+ thymic emigrants (r = -0,53). Best correlation coefficients

could be achieved for stratification for early CIS (≤ 6 lesions). VLA-4 MFI on

CD4+ CD25low-high lymphocytes in PBL and CSF was significantly higher in

patients with OIND than in CIS. Discussion In contrast to controls, patients

with CIS seem to have a significantly reduced relative proportion of regulatory

T-cells in cerebrospinal fluid compared with peripheral blood and a significantly

higher relative proportion of CD19 B-cells, memory B-cells and CD16+ mono-

cyte. Apart from a known dysfunction in regard to executive features (Venken

et al. 2006), there seems to be a quantitative disorder in regulatory T-cells,

probably due to a reduced cell surface expression of the cell-adhesion molecule

VLA-4 on CD4+ lymphocytes of patients with CIS. In these patients, espe-

cially in an early CIS stage, regulatory T-cells might have an antiinflammatory

effect and the PBL/CSF ratio provides a surrogatemarker fur diagnosis and

desease activity. The correlation of plasmacells with the cranial total lesion

load is most probably considered an incidental result. The negative correlation

of naive thymic emigrants is indicating a possible role in early pathogenesis. In

conclusion, there seems to be a given dysequilibrium in immune homeostasis

of certain leukocytes involved in pathogenesis and pathophysiology of early MS

that is probably the result of a disturbed cell surface adhesion molecule expres-

sion. The numerical quantity of the relative dysbalances in peripheral blood or

cerebrospinal fluid represents cerebral inflammation measured in cranial MRI

and is probably suited as lab marker for diagnosis of CIS.

A. Anhang

Expanded Disability Status Scale Score (EDSS)

Tabelle A.1.:

Expanded Disability Status Scale (EDSS, nach Kurtzke 1983). Acht Funktionssysteme

FS (Optik, Hirnstamm, Motorik, Cerebellum, Sensibilitat, Blasen- und Mastdarmfunktion,

mentaler Status, Gehstrecke) werden untersucht und in Grade unterteilt: Grad 0 = normale

Funktion, Grad 1 = abnorme Funktion ohne Behinderung, Grad 2 = leichte Behinde-

rung, Grad 3-6 = mittelschwere bis schwere Behinderung. Die Werte der Funktionssysteme

werden integriert und ergeben den EDSS.

EDSS Behinderung

0,0 alle FS Grad 0

1,0 keine Behinderung, ein FS Grad 1

1,5 keine Behinderung, mehr als ein FS Grad 1

2,0 leichte Behinderung, ein FS Grad 2, andere 0 oder 1

2,5 leichte Behinderung, zwei FS Grad 2, andere 0 oder 1

3,0 massige Behinderung, ein FS Grad 3, andere 0 oder 1 oder drei oder vier FS Grad

2, Gehfahigkeit uneingeschrankt

3,5 massige Behinderung, ein FS Grad 3 und ein oder zwei FS Grad 2, Gehfahigkeit

uneingeschrankt

4,0 relativ schwere Behinderung, ein FS Grad 4 und andere FS Grad 0 oder 1, Geh-

strecke ohne Hilfe ca 500 m.


strecke ohne Hilfe ca 300 m, voll arbeitsfahig aber evtl. mit geringgradiger Hilfe-

stellung


strecke ohne Hilfe ca 300 m, voll arbeitsfahig aber evtl. mit geringgradiger Hilfe-

stellung

5,0 starke Behinderung, ein FS Grad 5 und andere FS Grad 0 oder 1, Gehstrecke ca.

200 m

5,5 starke Behinderung, ein FS Grad 5 und andere FS Grad 0 oder 1, Gehstrecke ca.

100 m

6,0 Gehhilfe notig um 100 m weit zu gehen

6,5 Gehhilfe beidseits notig, um 20 m ohne Pause zu gehen

7,0 Gehstrecke unter 5 m selbst mit Hilfe, sitzt ca. 12 Stunden pro Tag im Rollstuhl,

Transfer und Fortbewegung im Rollstuhl selbstandig

91

A. Anhang 92

Tabelle A.1.: Fortsetzung

EDSS Behinderung

7,0 Gehstrecke mit Hilfe nur ein paar Schritte, benotigt Hilfe beim Rollstuhltransfer,

fahrt selbst

8,0 uberwiegend auf Bett beschrankt, Armfunktion zur Korperpflege weitgehend er-

halten, kann auch ausserhalb des Bettes sitzen

8,5 uberwiegend Bettlagerig, einge Funktionen der Arme erhalten

9,0 bettlagerig und hilflos, essen und kommunizieren moglich

9,5 bettlagerig und vollkommen hilflos, essen und kommunizieren nur schlecht mog-

lich, unfahig zu schlucken

10,0 Tod durch MS

EDSS-Dokumentation

Eine Kopie der in dieser Arbeit benutzten EDSS-Dokumenation nach L. Kap-

pos, Department of Neurology, University Hospitals, CH-4031 Basel, Version

11/99 findet sich auf Seite 97 f.

Quelle: http://www.neurostatus.net/scoring/index.php

Diagnosekriterien nach McDonald

Am Ende des Schemas sollen sich die moglichen Diagnosen MS, keine MS und

mogliche MS formulieren lassen. Die Diagnose kann weiterhin allein aufgrund

objektivierbarer klinischer Befunde gestellt werden, der Nachweis zeitlicher und

topischer Dissemination ist zentraler Bestandteil. Paraklinische Befunde wie

das MRT, die Liquoranalyse sowie Elektrophysiologie gehen erganzend in die

Diagnoseroutine ein.

Tabelle A.2.:

MS-Diagnosekriterien nach McDonald et al. (McDonald u. a. 2001), in Anlehnung

an R. M. Schmidt (2006)

klinische Befunde weitere notwendige Befunde

2+ Schube und klinisch objektivier-

ter Nachweis von 2x Lasionen

keine

2+ Schube und klinisch objektivier-

ter Nachweis einer Lasion

durch MRT belegte topische Dissemination

oder

http://www.neurostatus.net/scoring/index.php

A. Anhang 93


klinische Befunde weitere notwendige Befunde

im MRT 2+ characteristische Lasionen und posi-

tiver Liquor

oder

erneuter klinischer Schub mit anderem Lasionsort

Ein Schub und klinisch objektivier-

ter Nachweis von 2+ Lasionen

duch MRT belegte zeitliche Dissemination

oder

zweiter klinische Schub

Ein Schub und klinisch objektivier-

ter Nachweis einer Lasion (CIS)

durch MRT belegte topische Dissemination

oder

2+ charateristische Lasionen im MRT und positi-

ver Liquor

und

durch MRT belegte zeitliche Dissemination

oder

zweiter klinischer Schub

seit Beginn schleichend progredien-

te neurologische Ausfalle, verdach-

tig auf MS

positiver Liquor

und

topische Dissemination im MRT, belegt durch 9+

T2 Lasionen im Gehirn oder 2+ Lasionen im

Ruckenmark oder 4-8 Lasionen im Gehirn und ei-

ne Lasin im Ruckenmark

oder

pathologischem VEP kombiniert mit 4-8 Lasionen

im Gehirn oder < 4 Lasionen im Gehirn und einer

spinalen Lasion im MRT

durch MRT belegte zeitliche Dissemination oder

anhaltende Progression uber ein Jahr

A. Anhang 94

Gerate und Verbrauchsmaterialien

Die verwendeten Gerate, Verbrauchsmaterialien und eingesetzten Computer-

programme sind in untenstehender Tabelle aufgefuhrt.

Tabelle A.3.: Liste der verwendeten Gerate und Verbrauchsmaterialien

Mikroskope

Axio Scope Zeiss Germany

Kuhlschranke

Gefrierschrank -20°C Liebherr (Ochsenhausen)

Gefrierschrank -78°C Heraeus Instruments (Hanau)

Gefrierschrank -136°C Nunc (Roskilde, Danemark)

Kuhlschrank 4°C Liebherr (Ochsenhausen)

Zentrifugen

Centrifuge 5415 D Eppendorf (Wesseling-Berzdorf)

Megafuge 1.0 Heraeus Instruments (Hanau)

Sterilbank (Bench)

Clean Bench Hera Safe Heraeus Instruments (Hanau)

FACS

FACSCalibur BD Pharmingen (Heidelberg)

Sonstige Gerate und Verbrauchsmaterialien

50 ml Rohrchen Greiner Bio-one (Frickhausen)

Deckglaschen Menzel (Braunschweig)

Einfrierboxen Nunc (Roskilde, Danemark)

Einmalpipetten Greiner Bio-one (Frickhausen)

Einmalspritzen Greiner Bio-one (Frickhausen)

Erlenmeyerkolben Kobe (Marburg)

Falcon-Rohrchen BD Pharmingen (Heidelberg)

Kolbenhubpipetten Eppendorf (Wesseling-Berzdorf)

Kryorohrchen Nunc (Roskilde, Danemark)

Neubauer-Zahlkammer Superior - Paul Marienfeld (Lauda-

Konigshofen)

Prazisionspipette Accu Jet Brand (Wertheim)

Prazisionspipette Finnpipette Thermo Labsystems (Vantaa, Finnland)

A. Anhang 95


Chemikalien

Aqua dest. Braun (Melsungen)

DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma (Steinkirchen)

EDTA Promega (Madison, WI, USA)

FCS (fetal calf serum) Biochrom (Berlin)

FICOLL Biochrom (Berlin)

Tryptanblau 4 % Gibco Invitrogen (Karlsruhe)

Zellkulturmedien

RPMI 1640 Gibco Invitrogen (Karlsruhe)

Puffer und Losungen

FACSFlow BD Pharmingen (Heidelberg)

FACSSafe BD Pharmingen (Heidelberg)

FACSRinse BD Pharmingen (Heidelberg)

CellWash BD Pharmingen (Heidelberg)

PBS (phosphate buffered sa-

line)

Gibco Invitrogen (Karlsruhe)

PharMingenLyse (NH4Cl-

Losung)

BD Pharmingen (Heidelberg)

TBE-Puffer 1x Gibco Invitrogen (Karlsruhe)

FACS-Antikorper

anti-CD3 PerCP Klon SK-7 (BD Pharmingen)

anti-CD4 APC Klon RPA-T4 (BD Pharmingen)

anti-CD4 FITC Klon RPA-T4 (BD Pharmingen)


anti-CD8 APC Klon RPA-T8 (BD Pharmingen)

anti-CD8 FITC Klon LT-3 (Immunotools)


anti-CD14 FITC Klon 18-D11 (Immunotools)

anti-CD16 PE Klon 3-G8 (BD Pharmingen)

anti-CD19 APC Klon HIB-19 (BD Pharmingen)

anti-CD20 APC Klon LT-20 (Immunotools)

anti-CD25 FITC Klon M-A251 (BD Pharmingen)

anti-CD25 PE Klon M-A251 (BD Pharmingen)

A. Anhang 96


anti-CD27 FITC Klon M-T271 (BD Pharmingen)

anti-CD28 PE Klon M-A251 (BD Pharmingen)

anti-CD45RA PE Klon MEM-56 (Immunotools)

anti-CD49d FITC Klon BU-49 (Immunotools)

anti-CD49d PE Klon 9F-10 (BD Pharmingen)

anti-CD62L FITC Klon LT-TD 180 (Immunotools)

anti-CD138 PE Klon DL-101 (Ebioscience)

Magnetresonanztomografie

Signa Horizon 1,5 Tesla GE Healthcare (United Kingdom)

Software

CellQuest 4.0.2 BD Pharmingen (Heidelberg)

Advantage Workstation

AW4.0 06

GE Healthcare (United Kingdom)

SPSS 16.0 SPSS (Chicago, Illinois, USA)

MS Excel 2010 Microsoft

MS Word 2010 Microsoft

LATEX Miktex 2.9 open source

1. VISUAL ( OPTIC ) FUNCTIONS

OPTIC FUNCTIONS

Visual acuity (corrected)

Visual fields

2. BRAINSTEM FUNCTIONS

CRANIAL NERVE EXAMINATION

Extraocular movements (EOM) impairment

Nystagmus

Trigeminal damage

Facial weakness

3. PYRAMIDAL FUNCTIONS

REFLEXES R > < L

Biceps

Triceps

Brachioradialis

Knee

Ankle

Plantar response

Cutaneous reflexes

* Palmomental reflex

LIMB STRENGTH R L

Deltoids

Biceps

Triceps

Wrist/finger flexors

Wrist/finger extensors

Hip flexors

* = optional1 = converted FS Score

Scotoma

* Disc pallor

FUNCTIONAL SYSTEM SCORE

Hearing loss

Dysarthria

Dysphagia

Other cranial nerve functions


Knee flexors

Knee extensors

Plantar flexion (feet/toes)

Dorsiflexion (feet/toes)

* Position test UE, pronation

* Position test UE, downward drift

* Position test LE, sinking

Able to lift only one leg at a time (grade in °)

* Walking on heels

* Walking on toes

* Hopping on one foot

SPASTICITY

Arms

Legs

Gait


OD OS

1. Visual 1

2. Brainstem

3. Pyramidal

4. Cerebellar

5. Sensory

6. Bowel/Bladder1

7. Cerebral

1 = converted FS Score

1

SYNOPSIS OF FS SCORES

PERSONAL INFORMATION

Patient

Date of Birth (04-Jun-1980)

Centre Nr/Country

Name of EDSS rater

Date of Examination

EDSS Step Signature

° °

2 0

--

--

STUDY NAME

Scoring Sheet for a standardised, quantified neurological examination and assessment of Kurtzke’s Functional Systems and Expanded Disability Status Scale in Multiple Sclerosis

SPECIMEN

A. Anhang 97

4. CEREBELLAR FUNCTIONS

CEREBELLAR EXAMINATION

Head tremor

Truncal ataxia

R L

Tremor/dysmetria UE

Tremor/dysmetria LE

5. SENSORY FUNCTIONS

SENSORY EXAMINATION

Superficial sensation UE

Superficial sensation trunk

Superficial sensation LE

Vibration sense UE

Vibration sense LE

6. BOWEL/ BLADDER FUNCTIONS

Urinary hesitancy/retention

Urinary urgency/incontinence

Bladder catheterisation

7. CEREBRAL FUNCTIONS

MENTAL STATUS EXAMINATION

+ Depression

+ Euphoria

8. AMBULATION

Walking range as reported (without help or sticks )

meters

in min

Distance able to walk without rest or assistance

≥ 100 meters, but < 200 meters



≥ 500 meters but not unrestricted

Unrestricted

Actual distance (obligatory up to 500 m if possible)

meters

* = optional 1 = converted FS Score+ Because depression, euphoria and fatigue are difficult to evaluate objectively, in some studies it does not contribute to the Cerebral FS score or EDSS step. Please adhere to the study’s specific instructions.

Rapid alternating movements UE impairment

Rapid alternating movements LE impairment

Tandem walking

Gait ataxia

Romberg test

Other, e. g. rebound


Position sense UE

Position sense LE

* Lhermitte’s sign

* Paraesthesiae UE

* Paraesthesiae trunk

* Paraesthesiae LE


Bowel dysfunction

* Sexual dysfunction


Decrease in mentation

+ Fatigue


Requires constant assistance to walk 100 meters

Unilateral assistance (in meters)

Cane/crutch

Other

Bilateral assistance (in meters)

Canes/crutches

Other

Assistance by another person (in meters)

LR

Standardised Neurological Examination and Assessment of Kurtzke’s Functional Systems and Expanded Disability Status Scale

Slightly modified from J.F. Kurtzke, Neurology 1983:33,1444-52

©2009 Ludwig Kappos, MD, Professor and Chair, Neurology, University Hospital Basel, 4031 Basel, Switzerland; Version 09/08

1

SPECIMEN

A. Anhang 98

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Curriculum Vitae (entfernt)

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Verzeichnis der akademischen Lehrer

Meine akademischen Lehrerinnen und Lehrer an der Philipps-Universitat Mar-

burg waren in alphabetischer Reihenfolge die Damen und Herren:

Adamkiewicz, Basler, Baum, Czubayko, Dabrock, Daut, Feuser, Gerdes, Gress,

Grundmann, Grzeschik, Herrmann-Lingen, Hertl, Hilt, Jungclas, Koolmann,

Krieg, Kutschenreuter, Lang, Leonhardt, Lill, Lohoff, Luers, Maier, Mandrek,

Moll, Mueller, Muller, Mutters, Oertel, Opitz, Plant, Renz, Richter, Riße, Ro-

ehm, Roper, Schafer, Schofer, Schrader, Tackenberg, Tibesku, Vogelmeier, Wag-

ner, Werner, Westermann, Wulf

Danksagung

An dieser Stelle mochte ich mich herzlich bei allen Menschen bedanken, die

mich in der Zeit meiner Dissertation mit Wort und Tat unterstutzt haben:

Bei PD Dr. Bjorn Tackenberg, meinem ehemaligen Betreuer und jetzigem

Doktorvater, fur die Uberlassung des Themas und die exzellente Betreuung

wahrend der Datenerhebung. Auch fur die konstruktive Kritik und stetigen

Verbesserungsvorschlage bei der Verschriftlichung bin ich dankbar. Ich habe

dadurch sowie wahrend des praktischen Jahres in der Klinik fur Neurologie ei-

ne Menge positive Erfahrung im Patientenumgang und in wissenschaftlichem

Arbeiten sammeln konnen. Genaugenommen kreuzten sich unsere Wege schon

wahrend meines Zivildienstes in Marburg und Herr Tackenberg hat meine Ent-

scheidung zum Medizinstudium damals schon unterstutzt und gefordert (-:

Herrn Prof. Dr. Wolfgang H. Oertel, Direktor der Klinik fur Neurologie des

Universitatsklinikums Marburg und Gießen, Standort Marburg, danke ich fur

die Bereitstellung des Arbeitsplatzes, der Laboreinrichtungen sowie der notigen

infrastrukturellen Vorraussetzungen.

Meinen Freunden und Komillitonen Axel John und Hannes Kenji Kubo

danke ich fur zahlreiche laienpsychologische Gesprache bei Kaffee und Kuchen

und fachmannischen Rat bei der Umsetzung der Verschriftlichung und nicht

zuletzt fur eine unvergessliche Zeit wahrend des Studiums. Wer weiss, wieviele

von uns ohne gegenseitige Unterstutzung die Flinte ins Korn geworfen hatten...

Meinen Freunden Philipp Rieß und Mirco Schulze danke ich fur unzahlige

technische Hilfestellungen bei der Erstellung der Verschriftlichung und fur den

selbstlosen Einsatz im Copyshop an den Druckmaschinen.

Bei Kerstin Schlegel und Michael Happel mochte ich mich ganz besonders

fur die nimmermude Unterstutzung am FACS bedanken. Ohne sie ware diese

Arbeit niemals in diesem Umfang moglich gewesen.

Allen sonstigen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der AG Neuroimmunolo-

gie sei an dieser Stelle fur die hervorragende Arbeitsatmosphare und hilfreichen

Tipps gedankt: Rosi Burmester, Christian Eienbroker, Annette Hehenkamp (gut

Pfad!), Christine Hoft, Dr. Michael Putz, Florian Seitz, und Susanne Stei.

Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Poliklinik, ganz besonders Ba-

bette von Hagen und Ines Jackel fur Rat und Tat bei der Organisation der

Datenerhebung und Patientenuntersuchung.

Ich danke den Patienten fur ihre geduldige Mitarbeit und ihre Zeit bei der

Erhebung des EDSS Scores.

Mein großter Dank gilt meiner Familie und meiner Freundin. Ohne standigen

Zuspruch und Bekraftigungen, das stetige Vertrauen sowie die seelische und

materielle Unterstutzung ware mir dieses Studium und auch diese Arbeit nie

moglich gewesen.

Hamburg, den 17. Februar 2012

Johannes Till Elzer

Ehrenwortliche Erklarung (entfernt)

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Immunzytologie bei Patienten mit Klinisch Isoliertem Syndrom · Aus der Klinik fur Neurologie...

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