Isolierung und Charakterisierung von bakteriellen ......Isolierung und Charakterisierung von...

Isolierung und Charakterisierung von bakteriellen extrazellulären polymeren Substanzen aus

Biofilmen

Von der Fakultät für Naturwissenschaften

der Universität Duisburg-Essen

(Campus Duisburg)

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

genehmigte Dissertation

von

Alexander Rode

aus Tokio

Referent: Prof. Dr. H.-C. Flemming Korreferent: Prof. Dr. C. Mayer Tag der mündlichen Prüfung: 08.09.2004

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hans-Curt Flemming für die

Überlassung dieses überaus interessanten und schier unerschöpflichen Themas,

die Betreuung dieser Arbeit und sein Enthusiasmus für die EPS-Analytik.

Dr. Jost Wingender möchte ich ganz besonders danken für seine unermüdliche

Hilfsbereitschaft und die fachliche Unterstützung.

Herrn Prof. Dr. Christian Mayer danke ich für die freundliche Übernahme des

Korreferats.

Herrn Dr. Andrew Leis danke ich für die Aufnahme der IR-Spektren.

Sabine Dietl und Astrid Dannehl danke ich für die Bearbeitung zahlreicher

Umweltbiofilme und die unendliche Geduld.

Ich danke allen anderen ehemaligen und jetzigen Mitarbeitern des Fachgebiets

Aquatische Mikrobiologie an der Universität Duisburg-Essen für die gute

Zusammenarbeit und die freundliche Atmosphäre.

Nicht zuletzt danke ich meiner lieben Tanja und meinen Eltern für die

Aufmunterung und die ständige Unterstützung in jeder Hinsicht.

Inhalt Abkürzungsverzeichnis ...............................................................................................1

Zusammenfassung......................................................................................................3

1 Einleitung...............................................................................................................4

1.1 Eigenschaften von Biofilmen ....................................................................4

1.2 Extrazelluläre polymere Substanzen im Biofilm........................................6

1.3 Extrazelluläre Polysaccharide.................................................................10

1.4 Extrazelluläre Proteine ...........................................................................15

1.5 Weitere EPS-Komponenten....................................................................18

1.6 Ökologische Funktion der EPS...............................................................21

1.7 Isolierung und Analytik von EPS.............................................................24

1.8 Ziele dieser Arbeit...................................................................................29

2 Material................................................................................................................30

2.1 Bakterienstämme....................................................................................30

2.2 Nährmedien ............................................................................................31

2.3 Lösungen und Puffer ..............................................................................32

2.4 Substanzen.............................................................................................34

2.4.1 Polysaccharide .......................................................................................34

2.4.2 Monosaccharide und Oligosaccharide....................................................34

2.4.3 Chemikalien und Reagenzien.................................................................34

2.5 Geräte.....................................................................................................35

3 Methoden ............................................................................................................37

3.1 Anzucht von Reinkulturbiofilmen ............................................................37

3.2 Probenahme von Umweltbiofilmen .........................................................37

3.3 Bestimmung von Trockenrückstand, Wassergehalt und Glühverlust......38

3.4 Bestimmung der Zellzahl in der Biofilmsuspension ................................40

3.5 Bestimmung der Koloniezahl („heterotrophic plate count“, HPC) ...........41

3.6 Isolierung von EPS .................................................................................41

3.6.1 Isolierung von EPS aus Reinkulturbiofilmen ...........................................41

3.6.2 Isolierung von EPS aus Umweltproben mittels Zentrifugation ................41

3.6.3 Isolierung von EPS mit Kationenaustauscherharz nach Frølund et

al. (1996) ................................................................................................42

3.6.4 Isolierung von EPS mit Formaldehyd .....................................................43

3.6.5 Isolierung von EPS mit Formaldehyd und NaOH....................................43

3.6.6 Isolierung von EPS mit Kronenether.......................................................43

3.7 Isolierung und Reinigung des Polysaccharids Alginat ............................44

3.8 Reinigung der kommerziell erhältlichen Polysaccharide Dextran und

Xanthan ..................................................................................................45

3.9 Extraktion von Rhamnolipiden aus den EPS ..........................................45

3.10 Biochemisch-analytische Methoden .......................................................45

3.10.1 Bestimmung der Nachweisgrenze ..........................................................45

3.10.2 Bestimmung des Kohlenhydratgehalts nach Dubois et al. (1956) ..........46

3.10.3 Bestimmung des Uronsäuregehalts........................................................46

3.10.3.1 Bestimmung Uronsäuregehalts nach Blumenkrantz und Asboe-

Hansen (1973)........................................................................................46

3.10.3.2 Bestimmung des Uronsäuregehalts nach Filisetti-Cozzi und Carpita

(1991) .....................................................................................................47

3.10.4 Bestimmung des Proteingehalts und Huminstoffgehalts ........................48

3.10.4.1 Bestimmung des Proteingehalts nach Lowry (Sigma) ............................48

3.10.4.2 Bestimmung des Proteingehalts nach Lowry (modifiziert nach

Frølund et al. (1996)) ..............................................................................49

3.10.4.3 Kombinierte Bestimmung des Protein- und Huminstoffgehalts nach

Frølund et al. (1996) ...............................................................................49

3.10.5 Bestimmung des DNA-Gehalts mit DAPI (modifiziert nach Brunk

(1979)) ....................................................................................................51

3.10.6 Bestimmung des Acetylgruppengehalts (modifiziert nach Hestrin

(1949)) ....................................................................................................52

3.10.7 Bestimmung des Rhamnolipidgehalts ....................................................53

3.10.8 Bestimmung der Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

(modifiziert nach Ng und Dawes (1973)) ................................................54

3.10.9 Enzym-gekoppelter Lektin-Bindungs-Assay ...........................................54

3.11 Chromatographische Methoden für die Polysaccharidanalytik ...............55

3.11.1 Hydrolyse von Polysacchariden..............................................................55

3.11.1.1 Hydrolyse von uronsäurehaltigen Polysacchariden (modifiziert nach

Haug und Larsen (1962))........................................................................55

II


Anzai et al. (1990)) .................................................................................55

3.11.1.3 Hydrolyse von neutralen Polysacchariden mit Trifluoressigsäure

(modifiziert nach De Swaaf et al. (2001))................................................56

3.11.1.4 Hydrolyse von Polysacchariden mit Salzsäure .......................................56

3.11.2 Dünnschichtchromatographie .................................................................56

3.11.2.1 Dünnschichtchromatographie von Neutralzuckern (modifiziert nach

Batisse et al. (1992)) ..............................................................................56

3.11.2.2 Dünnschichtchromatographie von Uronsäuren (modifiziert nach

Wingender und Winkler (1984))..............................................................57

3.11.2.3 Dünnschichtchromatographie von Rhamnolipiden (modifiziert nach

Syldatk et al. (1985b)) ............................................................................58

3.11.3 Säulenchromatographie .........................................................................58

3.11.3.1 Gelfiltration .............................................................................................58

3.11.3.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose CL-6B ..........59

3.11.3.3 Affinitätschromatographie an ConA-Sepharose......................................60

3.12 Infrarot-Spektroskopie ............................................................................61

3.13 Eindimensionale Gelelektrophorese .......................................................62

4 Ergebnisse ..........................................................................................................63

4.1 Charakterisierung der Biofilme aus Reinkulturen von Pseudomonas

aeruginosa..............................................................................................63

4.1.1 Quantitative Zusammensetzung des Biofilms und der EPS....................63

4.1.2 Zeitliche Dynamik der EPS-Zusammensetzung bei P. aeruginosa

Biofilmen.................................................................................................64

4.1.3 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von den

Nährstoffbedingungen ............................................................................67

4.1.4 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von der

Isolierungsmethode ................................................................................68

4.1.5 Zuckeranalytik der EPS von P. aeruginosa ............................................71

4.1.6 Säulenchromatographische Auftrennung und Charakterisierung der

Polysaccharid-Fraktionen der EPS von P. aeruginosa ...........................73

4.1.7 Nachweis von Rhamnolipiden in P. aeruginosa SG81 Biofilmen............83

III

4.2 Untersuchung der EPS aus Biofilmen von Pseudomonas

fluorescens .............................................................................................86

4.3 Zusammensetzung der Biofilme und EPS aus Umweltproben ...............90

4.3.1 Biofilme und EPS von Schlammproben aus der

Abwasserbehandlung .............................................................................92

4.3.2 Zusammensetzung der Biofilme und EPS aus Flusswasserbiofilmen ....96

4.3.3 Zusammensetzung von Biofilmen und EPS aus

Trinkwasserverteilungssystemen............................................................99

4.3.4 Gelelektrophoretische Analyse der extrazellulären Proteine ................100

5 Diskussion .........................................................................................................103

5.1 Modellorganismen in der Biofilmforschung...........................................103

5.1.1 Bewertung von Pseudomonas aeruginosa als Modellorganismus........104

5.1.2 Biofilme von P. aeruginosa auf Agarnährmedien als Modellsystem .....105

5.1.3 Isolierung der EPS durch Homogenisation und Zentrifugation .............106

5.1.4 Biochemische Assays zur Quantifizierung der EPS-Bestandteile.........108

5.1.5 Zeitliche Dynamik der EPS-Zusammensetzung von P. aeruginosa......113

5.1.6 Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa Biofilmen in

Abhängigkeit von den Nährstoffbedingungen.......................................114

5.1.7 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von der

Isolierungsmethode ..............................................................................116

5.1.8 Untersuchung der Polysaccharide in den EPS von P. aeruginosa .......117

5.1.8.1 Isolierung und Reinigung von Alginat ...................................................117

5.1.8.2 Bestimmung der Zuckerzusammensetzung in den EPS von

P. aeruginosa .......................................................................................118

5.1.8.3 Auftrennung der Polysaccharid-Fraktionen nach Molekülgröße ...........119

5.1.8.4 Auftrennung der Polysaccharid-Fraktion nach Ladung.........................121

5.1.8.5 Affinität der Polysaccharid-Fraktionen zum Lektin Concanavalin A......121

5.1.9 Nachweis von Rhamnolipiden in den EPS von P. aeruginosa..............122

5.2 Zusammensetzung der EPS von P. fluorescens Biofilmen in der

Literatur ................................................................................................124

5.2.1 Quantitative Zusammensetzung der EPS von P. fluorescens 6/4

Biofilmen...............................................................................................126

IV

5.2.2 Bestimmung der Zuckerzusammensetzung der EPS von

P. fluorescens Biofilmen .......................................................................127

5.3 Umweltbiofilme aus aquatischen Systemen .........................................128

5.3.1 Isolierung der EPS aus Umweltproben.................................................128

5.3.2 Zusammensetzung der EPS aus aquatischen Biofilmen ......................129

5.4 Fazit......................................................................................................133

5.5 Ausblick ................................................................................................134

6 Literaturverzeichnis ...........................................................................................136

V

Abkürzungsverzeichnis

A Absorption

ABTS 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

APM Alginate Promoting Medium

BCA Bicinchoninsäure

BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin)

CaPIA Pseudomonas Isolierungs-Agar mit Ca-Zugabe

CF Cystische Fibrose

Da Dalton (atomare Masseneinheit)

DAPI 4’, 6-Diamidino-2-phenylindol

DC Dünnschichtchromatographie

DEAE Diethylaminoethyl

DNA Desoxyribonucleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ELLA Enzym-gekoppelter Lektin-Bindungs-Assay („enzyme

linked lectin-sorbent assay“)

EPS extrazelluläre polymere Substanzen

FM Feuchtmasse

Gal Galactose

Glc Glucose

GlcA Glucuronsäure

GulA Guluronat

G6PDH Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

HPTLC Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie („high

performance thin layer chromatography“)

HPC Koloniezahlbestimmung („heterotrophic plate count“)

KDO 2-Keto-3-deoxyoctonat

konz. konzentriert

Lsg. Lösung

Man Mannose

ManA Mannuronat

MG Molekulargewicht

1

n. b. nicht bestimmt

n. n. nicht nachgewiesen

NA Nähr-Agar

p. A. per Analysi

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PIA Pseudomonas Isolierungs-Agar

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

P. fluorescens Pseudomonas fluorescens

RL Rhamnolipid

SDS Sodium dodecyl sulfate (Dodecylsulfat Natriumsalz)

TM Trockenmasse

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Umdrehungen

UDP Uridindiphosphat

DTP Uridintriphosphat

VBMA Vogel-Bonner Minimal-Agar

2

Zusammenfassung

Zusammenfassung

Die Mikroorganismen im Biofilm werden von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) zusammengehalten. Die EPS sind die Schlüsselmoleküle für Struktur, Funktion und Organisation von Biofilmen. Für die quantitative Abtrennung der EPS vom Biofilm kommen chemische und/ oder physikalische Isolierungsmethoden zum Einsatz. Die Ausbeute an EPS ist abhängig von der Isolierungsmethode. In dieser Arbeit wurden vier unterschiedliche Methoden der EPS-Isolierung (Ablösung durch Rühren und Zentrifugieren, Einsatz von Kationenaustauscherharz, Extraktion mit Formaldehyd und Extraktion mit Formaldehyd und NaOH) an Reinkulturbiofilmen von Pseudomonas aeruginosa und Biofilmen aus der Abwasserbehandlung angewandt. Für die Reinkulturbiofilme war die Isolierung von EPS durch Rühren und Zentrifugieren geeignet. Bei Anwesenheit von Calcium im Nährmedium reichte das Rühren und Zentrifugieren allein nicht aus. Die Isolierung der EPS gelang mit der Kationenaustauscher-Methode. Bei den Umweltbiofilmen erwies sich die Isolierung von EPS mittels Kationenaustauscher als Methode der Wahl. Die EPS aus Reinkulturbiofilmen von P. aeruginosa und P. fluorescens bestanden nicht nur aus Polysacchariden, sondern auch aus bedeutenden Mengen an Proteinen. In den Umweltbiofilmen wurden zusätzlich zu den Polysacchariden und Proteinen auch Huminstoffe und DNA nachgewiesen. Eingehende Untersuchungen der EPS von P. aeruginosa ergaben, dass die EPS zu 70 Gew.-% aus Alginat bestehen. Das Alginat wies eine starke Heterogenität bezüglich der Ladung (acetylierte und nicht acetylierte Fraktion) und Molmasse auf. Neutrale Kohlenhydrate konnten durch Totalhydrolyse und anschließender Dünnschichtchromatographie in den EPS nicht nachgewiesen werden. Proteine machten ca. 28 Gew.-% der EPS aus. Es ist denkbar, dass es sich dabei nicht nur um Enzyme, sondern auch um Strukturproteine (z. B. Lektine) handelt. Auch Rhamnolipide (vor allem Di-Rhamnolipid) wurden in den EPS nachgewiesen (geringer Anteil von 1 Gew.-%); diese dürften für die Strukturbildung von Biofilmen eine wichtige Rolle spielen. Bei Zunahme der Dauer der Anzucht produzierte P. aeruginosa (auf die Zellen bezogen) mehr EPS (v. a. Alginat). Die Zusammensetzung der EPS war abhängig vom Nährmedium. In synthetischen Nährmedien wurden hohe Polysaccharid-Gehalte und fast keine Proteine (im Gegensatz zu Vollmedien) in den EPS nachgewiesen. Reinkulturbiofilme von P. fluorescens enthielten Kohlenhydrate (57 Gew.-%) und Proteine (28 Gew.-%) in den EPS. Es wurden Acetylgruppen (5 Gew.-%) und nach Hydrolyse durch Dünnschichtchromatographie Glucose und Galactose in den EPS nachgewiesen. Möglicherweise handelt es sich bei dem Polysaccharid von P. fluorescens um ein acetyliertes Galactoglucan. In Schlämmen aus der Abwasserbehandlung bildeten die Proteine gefolgt von den Kohlenhydraten die Hauptkomponente der EPS. Huminstoffe und in kleineren Mengen auch DNA konnten in diesen EPS nachgewiesen werden. Die EPS von natürlichen aquatischen Biofilmen enthielten große Mengen an Huminstoffen. Uronsäuren konnten in keinem Umweltbiofilm nachgewiesen werden. Dadurch spielen in diesen Biofilmen saure Polysaccharide keine Rolle bei der Stabilisierung des Biofilms durch Vernetzung der EPS über mehrwertige Kationen. Huminstoffe, Nucleinsäuren und saure Proteine könnten dafür verantwortlich sein.

3

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Eigenschaften von Biofilmen

Mehr als 99 % aller Mikroorganismen der Erde leben in Zellaggregaten

(Costerton et al., 1987) und nicht in suspendierter Form, wie sie in der

Mikrobiologie bevorzugt untersucht werden. Solche Aggregate können als Filme

an Grenzflächen („Biofilme“ im engeren Sinne) und auch als Flocken

(„schwebende Biofilme“), sowie in Schlamm vorkommen (Wimpenny et al., 2000).

Alle diese Vorkommensweisen von Mikroorganismen werden unter dem Begriff

„Biofilm“ zusammengefasst und haben als Gemeinsamkeit, dass die Organismen

in einer hydratisierten Matrix von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS)

eingebettet sind (Flemming und Wingender, 2003b). Die Bedeutung von

Mikroorganismen an Grenzflächen wurde schon relativ früh erkannt (Zobell, 1943).

Die Beschreibung von Biofilmen erfolgte aber erst wesentlich später (Costerton et

al., 1987).

Der wesentliche Bestandteil von Biofilmen sind die Mikroorganismen. Dazu

gehören vor allem Bakterien, aber auch Eukaryonten wie Protozoen, Mikroalgen

und Mikropilze. Die Mikroorganismen sind im Biofilm von einer Matrix aus

extrazellulären polymeren Substanzen umgeben. Sie können etwa 70 bis 95 %

der Trockenmasse von Biofilmen ausmachen. Biogene Partikel, wie Zellreste und

Detritus und anorganische Partikel, Sand oder Korrosionsprodukte, können in den

Biofilm eingelagert oder sorbiert werden (Flemming, 1995; Flemming und Leis,

2002). Zu den Bestandteilen des Biofilms gehören auch gelöste organische

Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren, Zucker und aromatische Verbindungen,

sowie anorganische Ionen, wie z. B. Ca2+, Mg2+, SO42- und Fe3+. Nicht zuletzt

bildet freies und gebundenes Wasser mit 70 bis 95 % des Feuchtgewichts den

größten Anteil des Biofilms.

Biofilme liegen in der Natur in vielen verschiedenen Formen vor (Flocken,

epilithische Biofilme, Sedimentbiofilme, als biologischer Rasen in

Tropfkörperanlagen u. v. a.). Üblicherweise bestehen sie aus gemischten

Bakterienpopulationen, aber sie sind häufig auch Habitate für einzellige

eukaryotische Organismen, wie Mikropilze, Mikroalgen und Protozoen wie

Flagellaten, Ciliaten und Amoeben (Wingender und Flemming, 1999). Biofilme in

4

Einleitung

nährstoffreicher und aerober Umgebung (z. B. Tropfkörperanlagen) können auch

von Metazoen wie Rotatorien, Nematoden, Anneliden, Insektenlarven oder

Schnecken besiedelt sein, die sich von den Biofilmorganismen ernähren und damit

helfen, die Biofilmdicke zu kontrollieren (Bitton, 1994). Heterotrophe Polymer-

abbauende Mikroorganismen überwiegen häufig zahlenmäßig, aber autotrophe

Organismen wie Nitrifikanten (Nitrobacter, Nitrosomonas) oder photosynthetisch

aktive Bakterien (Cyanobakterien) und Algen können in bedeutenden Mengen in

Abhängigkeit von den umgebenden physikochemischen Bedingungen vorhanden

sein (Lemmer et al., 1994; Geesey et al., 2000). Die Konzentration der

Mikroorganismen in Flocken und Biofilmen übersteigt die in der Wasserphase um

mehrere Größenordnungen (Geesey et al., 1978; Caron et al., 1982; Lewis und

Gattie, 1990).

Modellbiofilme sind meistens Biofilme, welche im Labor angezüchtet werden

und von nur einer ganz bestimmten Bakterienart stammen. Sie werden unter

genau definierten Bedingungen angezüchtet, wie Temperatur, Bebrütungsdauer,

Nährstoffzusammensetzung, pH-Wert und Feuchtigkeit. Dies geschieht auf festen

Nährmedien oder in Flüssigkulturen und außerdem auch in Fließzellen. Es

existiert kein Biofilm-Bakterium schlechthin, das als Modellorganismus für alle

Untersuchungen an Umweltbiofilmen herangezogen werden kann.

Ein häufiger Modellorganismus in der Biofilmforschung ist Pseudomonas

aeruginosa. Dieser Organismus bildet rasch Biofilme auf Agarnährmedien in

Laborversuchen. Er ist sowohl in technischen Systemen (Grobe et al., 1995) als

auch im medizinischen Bereich (Costerton et al., 1999) von großer Bedeutung.

Die Bakterienart Pseudomonas aeruginosa gehört der Familie der

Pseudomonaceae an und wird der γ-Gruppe der Protobakterien zugeordnet

(Schlegel, 1992). Vertreter dieser Familie sind Gram-negative, stäbchenförmige

Bakterien. P. aeruginosa ist ein polar monotrich begeißeltes und nicht

sporenbildendes Stäbchen (Palleroni, 1984; Schlegel, 1992). Diese Bakterienart

bildet nach Phillips (1969) verschiedene stammspezifische Kolonietypen aus:

klassisch, Coliformen-ähnlich, rauh, runzelig, mucoid und winzig. Der mucoide

Kolonietyp beschränkt sich nur auf solche Stämme, die nach Übernachtkultur auf

Standard-Agarnährmedien ein wässriges, schleimiges Aussehen besitzen, das auf

5

Einleitung

die Überproduktion des extrazellulären Polysaccharids Alginat zurückzuführen ist

(Phillips, 1969; Govan, 1990). P. aeruginosa ist ein anspruchsloses,

chemoorganotrophes Bakterium, das seine Energie durch aerobe Atmung

gewinnt. Unter anaeroben Bedingungen wird Nitrat als terminaler

Elektronenakzeptor (Denitrifikation) verwendet (Schlegel, 1992). Es ist ein

mesophiles Bakterium, dessen Wachstumsoptimum bei 37 °C liegt, und das nicht

in der Lage ist, im sauren pH-Bereich < 4,5 zu wachsen (Palleroni, 1984; Schlegel,

1992). P. aeruginosa zeichnet sich durch die Synthese zahlreicher extrazellulärer

Substanzen wie Exoenzyme (z. B. Lipasen und Proteasen), extrazelluläre

Polysaccharide (z. B. Alginat) und Glycolipide (z. B. Rhamnolipide) mit

oberflächenaktiven Eigenschaften aus (Brown et al., 1969; Wingender und

Winkler, 1984; Ross et al., 1991; Marty et al., 1992; Maier und Soberon-Chavez,

2000). Aufgrund seiner geringen Ansprüche an Nährstoffbedingungen ist

P. aeruginosa in der Lage zahlreiche oligotrophe aquatische und terrestrische

Standorte in der Umwelt bzw. feuchte technische Standorte zu besiedeln (Döring,

1991; Shoreit und Soltan, 1992; Botzenhart und Döring, 1993; Grobe et al., 1995).

Als opportunistischer Krankheitserreger ist P. aeruginosa häufig Verursacher von

nosokomialen (in einem Krankenhaus erfolgenden) Infektionen (Botzenhart und

Döring, 1993; Costerton et al., 1999; Deretic, 2000).

1.2 Extrazelluläre polymere Substanzen im Biofilm

Mikrobielle extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) sind verschiedene

Klassen von biologischen Makromolekülen wie Polysaccharide, Proteine,

Nucleinsäuren, Lipide und Huminstoffe (Tabelle 1). Geesey (1982) hat die EPS als

extrazelluläre polymere Substanzen mikrobiellen Ursprungs, die an dem Aufbau

mikrobieller Aggregate beteiligt sind, bezeichnet. Eine weitere Definition für EPS

wurde von Characklis und Wilderer (1989) gegeben, die EPS als organische

Polymere mikrobiellen Ursprungs, die in Biofilm-Systemen häufig für die Bindung

der Zellen oder partikulärem Material aneinander (Kohäsion) und zum Substratum

(Adhäsion) bezeichnen. In einer kritischen Bewertung von Methoden zur EPS-

Isolierung haben Gehr und Henry (1983) extrazelluläre Substanzen als Material

beschrieben, das von den Mikroorganismen (insbesondere Bakterien) entfernt

6

Einleitung

werden kann, ohne die Zellen zu schädigen und, ohne das die Mikroorganismen

immer noch lebensfähig sind. Diese Definition von EPS impliziert, dass EPS keine

essentiellen Bestandteile der Biofilmorganismen sind, weil der Verlust an EPS

nicht das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Zellen in Laborkulturen

beeinflusst. In natürlicher Umgebung scheint die Bildung von EPS jedoch ein

wichtiger Faktor für die Überlebensfähigkeit der Bakterien in mikrobiellen

Aggregaten zu sein, deren Struktur und Funktion entscheidend vom

Vorhandensein der EPS abhängt (Flemming und Wingender, 2003a). Die

Abkürzung EPS wurde spezifisch für extrazelluläre Polysaccharide und

Exopolysaccharide benutzt oder auch genereller für exopolymere Substanzen,

Exopolymere, extrazelluläre polymere Sekrete und extrazelluläre polymere

Substanzen. Die Bezeichnung Exopolysaccharide geht zurück auf die Anfänge der

Biofilmforschung, wo sie als Hauptkomponente mikrobieller Aggregate vermutet

(Costerton et al., 1981) und in zahlreichen Biofilmen auch nachgewiesen wurden

(Sutherland, 1999a; Sutherland, 2001b). Andere EPS-Komponenten wie z. B.

Proteine kommen jedoch in erheblichen Mengen in Biofilmen vor oder bilden sogar

die Hauptkomponente der EPS.

In dieser Arbeit wird die Abkürzung EPS benutzt für extrazelluläre polymere

Substanzen als allgemeiner und umfassender Begriff für verschiedene Klassen

von organischen Makromolekülen wie Polysaccharide, Proteine, Nucleinsäuren,

Lipide und Phospholipide oder Huminstoffe, die als Bestandteile der EPS in

mikrobiellen Aggregaten nachgewiesen worden sind (Tabelle 1). Häufig dominieren Polysaccharide und Proteine in den EPS, aber auch andere

Komponenten, wie Nucleinsäuren und Lipide sind im Biofilm vorhanden. In

Abwasserbiofilmen wird ein hoher Anteil an Huminstoffen gefunden (Nielsen und

Jahn, 1999). Die EPS selbst werden von den Biofilmorganismen gebildet und/

oder vom Biofilm sorbiert, vor allem die Huminstoffe. Die EPS füllen und formen

die extrazelluläre Matrix mikrobieller Aggregate (z. B. von Biofilmen und

Schlammflocken) (Wingender et al., 1999b). Die EPS bestimmen die physikalisch-

chemischen Eigenschaften von Biofilmen. Sie sind verantwortlich für die

Architektur und Morphologie der Biofilme, in denen die Zellen leben (Flemming

und Wingender, 2002a). Außerdem ermöglichen die EPS den Zusammenhalt von

7

Einleitung

Zellen und anderem partikulären Material im Biofilm (Kohäsion) und zum

Substratum (Adhäsion) (Flemming und Wingender, 2003a).

Die mechanische Stabilität des Biofilms wird durch reversible

Wechselwirkungen der EPS-Bestandteile von drei Arten nicht-kovalenter

Bindungen vermittelt (Mayer et al., 1999). Die drei wichtigsten nicht-kovalenten

Bindungstypen sind elektrostatische Bindungen, Wasserstoffbrücken und van-der-

Waals-Bindungen, die sich voneinander in ihrer räumlichen Struktur,

Bindungsstärke und Spezifität unterscheiden. Außerdem werden diese

Bindungstypen durch Wasser in unterschiedlicher Weise beeinflusst (Stryer,

1996).

Elektrostatische Bindungen kommen durch entgegengesetzt geladene ionische

Gruppen der EPS-Moleküle zustande (wie z. B. Carboxylat-, Phosphat-, Sulfat-,

Sulfhydryl-, oder Aminogruppen), wie sie in Proteinen und Polysacchariden

vorkommen. Extrazelluläre Polysaccharide enthalten oft Carboxylat-Gruppen

durch Uronsäure-Bausteine. Diese können durch zweiwertige Ionen wie Ca2+ oder

Mg2+ oder dreiwertigen Ionen wie Fe3+ verknüpft werden (Bruus et al., 1992;

Körstgens et al., 2001). Die Bindungsenergie beträgt hier 12-29 kJ/mol bei einem

Abstand von ca. 0,3 nm. Die Bindungsstärke kann durch Änderungen im pH-Wert

und der Ionenkonzentration beeinflusst werden.

Intermolekulare Wasserstoffbrücken entstehen zwischen geladenen als auch

ungeladenen Molekülen, die sich quasi ein Wasserstoffatom teilen. Sie beruhen

auf dem Donor-Akzeptor-Prinzip, wobei der Akzeptor eine partiell negative Ladung

hat, die das Wasserstoffatom anzieht. Donoratom in einer Wasserstoffbrücke in

biologischen Systemen ist ein Sauerstoff- oder ein Stickstoffatom mit kovalent ge-

bundenem Wasserstoff. Als Akzeptor tritt ebenfalls ein Sauerstoff- oder

Stickstoffatom auf. Daher können Wasserstoffbrücken zwischen allen EPS-

Komponenten vorkommen. Ihre Bindungsenergie liegt zwischen 12 und 29 kJ/mol,

je nach Art der Bindung. Sie treten häufig zwischen Polysacchariden und

Proteinen auf. Wasserstoffbrücken können durch chaotrope Reagenzien wie

Guanidiniumchlorid oder Harnstoff aufgehoben werden.

8

Tabelle 1: EPS-Komponenten und deren Bestandteile (nach Wingender et al. (1999b))

Komponente Untereinheiten Bindungstypen Struktur des Grundgerüsts Substituenten

Polysaccharide (neutrale oder geladene Polysaccharide)

Monosaccharide Uronsäuren Aminozucker

Glykosidische Bindung

Linear, verzweigt Organisch: O-acetyl, N-acetyl, Glyceryl-, Hydroxybutyl-, Propionyl-, Succinyl, Pyruvyl Anorganisch: Sulfat, Phosphat

Proteine (Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine)

Aminosäuren Peptidbindung Linear Oligosaccharide(Glycoproteine), Fettsäuren (Lipoproteine)

Nucleinsäuren (DNA, RNA)

Nucleotide Phosphodiester-bindung

Linear -

Lipide (Phospholipide, Glycolipide, neutrale Lipide)

Fettsäuren Glycerin Phosphat Ethanolamin Serin Cholin Zucker

Esterbindung Seitenketten -

Huminstoffe PhenoleAromaten Einfache Zucker Aminosäuren

Etherbindungen C-C-Bindungen Peptidbindungen

Vernetzt -

9

Einleitung

Van-der-Waals-Kräfte (zwischenmolekulare Kräfte) sind unspezifische und

schwächere Bindungskräfte, die aufgrund von nichtionischen, polaren

Molekülgruppen, die sich durch momentane Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, die

Coulombscher Natur sind, anziehen. Die Bindungsenergie von ca. 2,5 kJ/mol ist

am niedrigsten unter den reversiblen Wechselwirkungen. Oberflächenaktive

Substanzen können die reversiblen Wechselwirkungen aufheben. Des Weiteren

gibt es zwischen fädigen Makromolekülen sogenannte Entanglements, also

Verschlaufungen und Verknotungen, die bei hoher Anzahl einen erheblichen

Beitrag zur Stabilisierung der EPS-Matrix liefern (Mayer et al., 1999).

1.3 Extrazelluläre Polysaccharide

Die Polysaccharide als Bestandteile der EPS sind im Vergleich zu anderen

EPS-Komponenten häufig untersucht worden (Christensen, 1989; Gacesa und

Russell, 1990; Sutherland, 1990; Sutherland, 2001a). Wie alle Polysaccharide

kann man auch mikrobielle Polysaccharide in Homo- und Heteropolysaccharide

unterteilen (Christensen und Characklis, 1990). Alle Polysaccharide bestehen aus

Untereinheiten, den Monosacchariden (dazu zählen auch Uronsäuren oder

Aminozucker), die durch organische (z. B. O-Acetyl, N-Acetyl, Succinyl- oder

Pyruvyl-Gruppen) oder anorganische Reste (z. B. Sulfat- oder Phosphat-Gruppen)

substituiert sein können. Die Untereinheiten sind glykosidisch miteinander

verknüpft und das Grundgerüst der Polysaccharide ist linear oder verzweigt und

kann Seitenketten haben (Sutherland, 1990).

Extrazelluläre Polysaccharide werden auf zwei verschiedenen Wegen

produziert: rein extrazellulär oder intrazellulär mit darauf folgender Sekretion und

eventueller Modifikation. Die extrazelluläre Synthese wurde bisher nur bei

Dextran- und Levan- artigen Polymeren beobachtet. Dextrane und Levane werden

durch extrazelluläre Enzyme aus Disacchariden gebildet. Bei der intrazellulären

Synthese werden Zucker-Nukleotide (durch UTP aktivierte UDP-Zucker) für ihre

Produktion benötigt (Sutherland, 1977; Madigan et al., 1997). Diese Nucleotide

sind energiereiche Vorprodukte, die für den Zusammenbau der in den meisten

Polysacchariden vorkommenden und sich wiederholenden Oligosaccharid-

Grundeinheiten gebraucht werden. Sie werden ebenso für die Synthese anderer

10

Einleitung

Kohlenhydrat-Polymere wie Lipopolysaccharide oder Teichon- und

Teichuronsäuren benötigt. Bei Substituenten (Acetat, Pyruvat, Succinat, Sulfat

oder Phosphat) an den Polysacchariden sind diese häufig bereits an den

Vorstufen vorhanden. Es wird vermutet, dass sie von Acetyl-Coenzym A,

Phosphoenolpyruvat und Succinyl-Coenzym A abzuleiten sind (Sutherland,

2001b). Eine niedrige intrazelluläre Konzentration dieser Verbindungen, die z. B.

durch Magnesium-Limitierung verursacht wird, kann zu nicht-acetylierten

Polymeren führen (Sutherland, 1985). Die physiologischen

Wachstumsbedingungen sind somit wichtig für die Verfügbarkeit der

Kohlenhydrat- und Acyl-Vorstufen.

Bei der intrazellulären Synthese der Polysaccharide werden die

Monosaccharide durch an die Cytoplasmamembran gebundene Enzyme

(Polymerasen) zusammengesetzt. Die Polysaccharide können durch Lyasen

terminiert werden und durch Polyisoprenyl-Carrier aktiv durch die

Cytoplasmamembran ins Äußere transportiert werden. Die Mechanismen hierfür

sind bisher nur wenig untersucht worden (Sutherland, 1988). Die häufigsten

Monomere von bakteriellen Polysacchariden sind: D-Glucose, D-Mannose, D-

Galactose, D-Fucose, L-Rhamnose, Aminozucker und Uronsäuren wie D-

Glucuronsäure, D-Galacturonsäure und seltener D-Mannuronsäure sowie L-

Guluronsäure (Christensen, 1989; Decho, 1990; Sutherland, 1994).

Abbildung 1: Struktur von Dextran des Bakterienstamms Leuconostoc mesenteroides B-512F (Robyt, 1998)

11

Einleitung

Homopolysaccharide bestehen aus einheitlichen Monomer-Bausteinen, die

glykosidisch verknüpft sind. Beispiele hierfür sind Cellulose (β-1,4-glykosidisch

verknüpfte Glucose) aus Gluconacetobacter xylinus und anderen Gram-negativen

Bakterien (Römling, 2002), Curdlan (β-1,3-glykosidisch verknüpfte Glucose) aus

Alcaligenes faecalis, Levane (β-2,6-glykosidisch verknüpfte Fructose) aus

Streptococcus mutans und S. salivarius oder Dextran (α-1,6-glykosidisch

verknüpfte Glucose, Abbildung 1) aus Leuconostoc mesenteroides (Sutherland,

1990).

Ein Dextran ist definiert als Glucan, das enzymatisch aus Saccharose

synthetisiert wird und eine fortlaufende Struktur von α-1,6–verknüpften D-

Glucopyranose-Einheiten in der Hauptkette hat (Robyt, 1998). Die Umwandlung

von der Saccharose zum Dextran erfolgt außerhalb der Zelle und wird durch eine

extrazelluläre Hexosyltransferase (Dextransaccharase) katalysiert. Alle bisher

bekannten Dextrane sind verzweigt. Der Verzweigungsgrad und die Art der

Verzweigung sind ein wichtiges Kriterium für die Unterscheidung der

verschiedenen Dextran-Arten. Die Verknüpfungsarten der Seitenketten wurden als

α-1,2, α-1,3 und α-1,4 identifiziert und die Einheiten können einzelne D-Glucose-

Bausteine und/oder Ketten von α-1,6 verknüpften D-Glucose-Einheiten sein. Auch

die Häufigkeit und die Art der Anordnung der Seitenketten führten zu

Unterschieden in der Struktur der Dextrane.

Das Dextran, welches heutzutage das einzige ist, was kommerziell in großem

Maßstab hergestellt wird, stammt vom Bakterium L. mesenteroides B-512F. Es

enthält 95 % α-1,6 Verknüpfungen und 5 % α-1,3 glykosidisch verknüpfte

Seitenketten. Die Verzweigungsketten bestehen aus einzelnen α-1,3 -verknüpften

D-Glucopyranose-Einheiten und langen Ketten von α-1,6 -verknüpften D-

Glucopyranose-Einheiten, die an das Grundgerüst des Polysaccharids durch α-1,3

glykosidische Bindungen verknüpft sind (Robyt, 1998). Für das Dextran von

L. mesenteroides B-512F gibt es eine Reihe von kommerziellen Anwendungen.

Die niedermolekulare Fraktion von 50 000 – 100 000 Da wird als Blutplasma-

Ersatz eingesetzt (de Belder, 1996). Dextran dient auch als Ausgangsmaterial für

12

Einleitung

Epichlorhydrin-quervernetzte Molekularsiebe der Säulenchromatographie, die als

Sephadexe bekannt sind (Robyt, 1998).

Die Karies (Zahnzerstörung) verursachenden Streptokokken, darunter

S. mutans und S. salivarius, scheiden eine Hexosyltransferase aus, die

Saccharose zu Polyfructosen (Levanen) umsetzt (Schlegel, 1992). Die

Polysaccharide sind beteiligt an der Entstehung oraler Biofilme auf

Zahnoberflächen, innerhalb derer sich die sauren Produkte der

Stretptokokkengärung, hauptsächlich Milchsäure, anhäufen und so zur

Zahnzerstörung beitragen. Levane bestehen aus einem Grundgerüst β-2,6 –

verknüpfter D-Fructofuranose-Einheiten. Am Grundgerüst haben Levane β-2,1 -

verknüpfte Seitenketten aus ein bis vier Fructose-Molekülen. Levane sind aus 100

bis 200 D-Fructofuranose-Einheiten zusammengesetzt. Ihr Molekulargewicht liegt

deutlich unter dem von Cellulose oder Stärke oder anderer bakterieller

Polysaccharide wie z. B. Dextran oder Alginat.

Mikrobielle Heteropolysaccharide sind aus sich wiederholenden Einheiten

unterschiedlicher Monosaccharide aufgebaut, deren Größe meist von Disaccharid-

bis Octasaccharid-Resten variiert (Sutherland, 1990). Hierzu gehört Xanthan, das

von dem Bakterium Xanthomonas campestris synthetisiert wird (Abbildung 2). Es

besteht aus einem Grundgerüst aus β-1,4 glykosidisch verknüpften D-Glucose-

Einheiten. An jedem zweiten Rest befindet sich eine Trisaccharid-Seitenkette aus

O-acetylierter D-Mannose, D-Glucuronsäure und mit Pyruvat substituierter D-

Mannose (Sutherland, 1990).

Die Pyruvat-Konzentration kann für verschiede Stämme von X. campestris

signifikant variieren, was zu Xanthan-Lösungen mit unterschiedlicher Viskosität

führt. Die Xanthane mit hohem Pyruvat-Gehalt haben eine hohe Viskosität nach

Zugabe von Kaliumchlorid und eine erhöhte thermische Stabilität (Kang und

Pettitt, 1993). Die Molmasse von Xanthan liegt im Bereich von 3 x 105 bis

8 x 106 Da (Norton et al., 1984). Röntgendiffraktometrie-Messungen ergaben,

dass Xanthan eine helicale Struktur besitzt (Moorhouse et al., 1977). Molecular

Modeling lässt den Schluss zu, dass die verzweigten Trisaccharid-Einheiten

parallel zur Achse der Helix liegen (Moorhouse et al., 1977).

13

Einleitung

Xanthan hat eine Reihe von kommerziellen Anwendungen aufgrund seiner

Emulsions-stabilisierenden und Partikel-suspendierenden Eigenschaften, der

geringen Variation der Viskosität bei Änderung der Temperatur und seiner

Toleranz gegenüber hohen Salzkonzentrationen gefunden. Neben dem Dextran

von Leuconostoc mesenteroides B-512F ist es ein weiteres Polysaccharid,

welches industriell in großem Maßstab hergestellt wird (Kang und Pettitt, 1993).

Glc, Glucose; Man, Mannose; GlcA, Glucuronsäure

Abbildung 2: Ausschnitt aus der Struktur von Xanthan (Christensen und Characklis, 1990)

Ein weiteres Beispiel für ein Heteropolysaccharid ist Alginat, das Salz der

Alginsäure. Es wird außer von Braunalgen auch von Bakterien, wie Pseudomonas

aeruginosa oder Azotobacter vinelandii synthetisiert (Linker und Jones, 1966;

Gacesa, 1998). Sowohl Algenalginate als auch Bakterienalginate sind anionische

Copolymere aus den Uronsäurebausteinen β-D-Mannuronat und dessen C-5-

Epimer α-L-Guluronat, die 1,4-glykosisch miteinander verknüpft sind. Die

Bausteine im Alginat-Molekül sind in Blockstrukturen angeordnet (Gacesa und

Russell, 1990), die homopolymer oder heteropolymer sind. Homopolymere Blöcke

bestehen aus Poly-β-D-Mannuronat (M-Blöcke) oder Poly-α-L-Guluronat (G-

Blöcke). Heteropolymere Regionen (MG-Blöcke) sind sowohl aus β-D-Mannuronat

14

Einleitung

als auch aus α-L-Guluronat aufgebaut. In den heteropolymeren Blöcken kommen

die Uronsäurereste statistisch verteilt vor. Bakterienalginat ist im Gegensatz zu

Algenalginat an β−D-Mannuronat-Bausteinen O-acetyliert. Das von P.aeruginosa-

Stämmen gebildete Alginat ist im Gegensatz zu Azotobacter- und Algenalginat

durch das Fehlen von G-Blöcken gekennzeichnet (Sherbrock-Cox et al., 1984;

Grobe et al., 1995). Ein Ausschnitt aus der Alginat-Struktur zeigt Abbildung 3.

ManA ManA

GulACCH3

O

OOH O

COO-

O

O

OCOO-

OHOHOOH OH

COO-

O

ManA, β-D-Mannuronat; GulA, α-L-Guluronat

Abbildung 3: Ausschnitt aus einem bakteriellen Alginat-Molekül (Christensen, 1999)

1.4 Extrazelluläre Proteine

Die extrazellulären Polysaccharide haben hauptsächlich strukturbildende

Funktionen bei der Etablierung und der mechanischen Stabilisierung der Biofilm-

Matrix (Wingender und Jaeger, 2002). Über die Identität und Funktion

extrazellulärer Proteine im Biofilm ist vergleichsweise wenig bekannt (Burns, 1989;

Lemmer et al., 1994; Frølund et al., 1995; Hoffman und Decho, 1999; Christensen

et al., 2001; Wingender und Jaeger, 2002). Verschiedenste extrazelluläre

Enzymaktivitäten wurden in Biofilmen aus unterschiedlichen Habitaten

nachgewiesen, so dass Enzyme zumindest einen Teil der Proteine in den EPS

darstellen. Heterotrophe Bakterien, aber auch Pilze sind wichtige Produzenten

extrazellulärer Enzyme (Smucker und Kim, 1991; Priest, 1992). Der größte Anteil

der natürlichen organischen Substanz besteht aus polymeren Substanzen mit

hohem Molekulargewicht, die zu groß sind, um durch mikrobielle Membranen in

die Zelle transportiert zu werden (Münster und Chróst, 1990). Eine Hauptfunktion

der extrazellulären Enzyme ist es, diese Verbindungen zu kleineren Molekülen zu

hydrolysieren, welche dann schnell in die Zelle aufgenommen werden können

15

Einleitung

(Hoppe, 1983; Chróst, 1991). Dort dienen sie als Kohlenstoffquelle oder

Energiequelle im mikrobiologischen Metabolismus. Natürliche Substrate von

extrazellulären Enzymen können wasserlösliche Polymere sein (viele

Polysaccharide, Proteine und Nucleinsäuren) und wasserunlösliche Substanzen

(wie z. B. Cellulose, Chitin oder Lipide) sowie biogene Partikel, die im Biofilm

sorbiert wurden (Priest, 1992).

Unabhängig von ihrer letztendlichen Lokalisierung im Biofilm können

extrazelluläre Enzyme im Biofilm von unterschiedlicher Herkunft sein. Sie werden

entweder von intakten Zellen im Biofilm synthetisiert, oder sie können passiv von

geschädigten oder lysierten Zellen freigesetzt werden, oder sie werden aus der

Umgebung durch Sorption aufgenommen. Die Synthese der Enzyme erfolgt in der

Zelle an den Ribosomen, die meist direkt an die Cytoplasmamembran gebunden

sind. Die Sekretion der Enzyme umfasst den Transport dieser Proteine durch die

Cytoplasmamembran von Gram-positiven Bakterien oder durch die innere und

äußere Membran von Gram-negativen Bakterien. Bisher wurden hauptsächlich

planktonische Kulturen von ausgewählten Bakterienarten verwendet, um die

Expression der Exoenzyme zu studieren (Binet et al., 1997; Filloux et al., 1998;

Hueck, 1998; Russel, 1998; Koster et al., 2000). Es ist relativ wenig unternommen

worden, um die Sekretion von Enzymen in Biofilmen zu untersuchen (Wingender

und Jaeger, 2002). Die Aktivitäten der extrazellulären Enzyme alkalische

Phosphatase (Huang et al., 1998; Xu et al., 1998), Protease (Ross et al., 1991)

und Lipase (Wingender und Winkler, 1984) wurden in P. aeruginosa Biofilmen

nachgewiesen. Manche Mikroorganismen wie P. aeruginosa können mehrere

Sekretionswege für die Freisetzung von Exoenzymen benutzen. Es wird zwischen

spezifischen Sekretionsmechanismen wie z. B. bei den Enzymen Elastase B

(LasB), Lipase oder Esterase (EstA) (Wingender und Jaeger, 2002) und

unspezifischer Sekretion durch Membranvesikel (Beveridge, 1999) unterschieden.

Die Ausschleusung von Enzymen über die Cytoplasmamembran und äußere

Membran erfolgt durch unterschiedliche spezifische Sekretionswege.

Die unspezifische Sekretion von Enzymen über Membranvesikel wird häufig bei

Gram-negativen Bakterien beobachtet (Li et al., 1998; Beveridge, 1999) und

wurde besonders intensiv bei P. aeruginosa untersucht (Kadurugamuwa und

Beveridge, 1995; Beveridge et al., 1997). Die Vesikel werden aus einem Teil der

16

Einleitung

äußeren Membran gebildet und bestehen somit aus einer Doppelschicht aus

Phospholipiden, Lipopolysacchariden und Proteinen der äußeren Membran. Sie

können zelluläre Makromoleküle, periplasmatische Verbindungen und Membran-

Bestandteile beinhalten, und diese Verbindungen in den extrazellulären Raum

transportieren. Bei P. aeruginosa wurden deutliche Mengen an Phospholipase C-,

alkalische Phosphatase- und Protease-Aktivität in den Membranvesikeln

nachgewiesen (Kadurugamuwa und Beveridge, 1995). Mittels

Transmissionselektronen-Mikroskopie wurden Membranvesikel in

Reinkulturbiofilmen von P. aeruginosa (Beveridge et al., 1997) und in natürlichen

Frischwasserbiofilmen (Beveridge, 1999) visualisiert. Wenn hydrolytische Enzyme

(wie z. B. Peptidoglycanhydrolasen) in die Membranvesikel gepackt werden,

können diese Enzyme die Zellen von anderen Bakterienarten im Biofilm abbauen

(räuberische Vesikel), und somit Nährstoffe für die Vesikel-produzierenden

Organismen freisetzen (Li et al., 1998). Beveridge et al. (1999) vermuten, dass

Membranvesikel eine alternative Rolle bei der gezielten Freisetzung von

Virulenzfaktoren (Phospholipase C, Protease, Elastase oder Hämolysine) bei

humanen Infektionen durch P. aeruginosa, Proteus mirabilis und Serratia

marcescens spielen können.

Extrazelluläre Proteine liegen auch als Fimbrien, Pili oder andere funktionelle

Gebilde für die spezifische Adhäsion von Biofilmen an Oberflächen vor.

Proteine können auch als Strukturproteine dienen und so zur Biofilmarchitektur

stabilisierend beitragen. Lektine werden als Strukturproteine im Biofilm

angenommen (Higgins und Novak, 1997). Lektine (lat. leggere: wählen, nehmen)

sind ubiquitäre Proteine oder Glykoproteine, die spezifisch und reversibel (meist

über Wasserstoffbrückenbindungen) an Kohlenhydrate binden. Sie können

Enzymaktivitäten an Molekülen und in Zellen regulieren, die diese spezifischen

Kohlenhydrate beinhalten (wie z. B. der Schutz der Zellen, Nahrungsaufnahme,

Besiedlung oder das Absterben der Zellen). Meist sind Lektine aus zwei bis sechs

Untereinheiten aufgebaut, die über Disulfidbrücken, Wasserstoffbrückenbindungen

oder hydrophoben Wechselwirkungen miteinander verbunden sind.

Lektine spielen eine wichtige Rolle bei der Anheftung und Besiedlung von

Bakterien in Tieren und Pflanzen. Es wurde gezeigt, dass Lektine einen Einfluss

auf die Coaggregation von aquatischen Bakterien während der Wachstumsphase

17

Einleitung

des Biofilms haben (Rickard et al., 2000). Lektine werden auch von einer Reihe

anderer Mikroorganismen, Pflanzen und Viren produziert (Mirelman und Ofek,

1986). Lektine sind bei den Bakterien häufig an Anhängseln wie Pili und Fimbrien

lokalisiert.

1.5 Weitere EPS-Komponenten

Der Gehalt an Nucleinsäuren in Biofilmen wird häufig zur Bestimmung der

Anzahl an Bakterien in Abwassersystemen und in aquatischen Systemen und

Sedimenten herangezogen (Hattingh und Siebert, 1967; Thomanetz, 1982;

Maruyama et al., 1993; Liebeskind und Dohmann, 1994; Sandaa et al., 1998).

Einige Untersuchungen führten den Nachweis von extrazellulärer DNA auf

Zelllysis zurück (Vallom und McLoughlin, 1984), oder als Parameter für die

Bestimmung der Biomasse (Liebeskind und Dohmann, 1994). Seit langem ist

bekannt, dass manche Bakterien, darunter P. aeruginosa erhebliche Mengen an

extrazellulärer DNA durch einen Mechanismus freisetzen, der unabhängig ist von

der Zelllysis und anscheinend auf der Freisetzung kleiner Vesikel aus der äußeren

Membran beruht (Muto und Goto, 1986; Kadurugamuwa und Beveridge, 1995).

Neuere Untersuchungen zeigen, dass große Mengen an DNA in der EPS-

Matrix von Belebtschlammflocken vorkommen (Urbain et al., 1993; Frølund et al.,

1996). Es wurde gezeigt, dass größere Mengen an DNA auch in den Flocken

akkumuliert werden können (Palmgren und Nielsen, 1996). Der DNA-Gehalt

korrelierte nicht mit der Zellzahl im Biofilm. Für das Vorkommen von DNA in den

EPS können folgende Gründe vorliegen: es sind keine DNA abbauenden Enzyme

(DNasen) vorhanden, DNasen werden durch Huminstoffe inhibiert, DNA wird

durch Adsorption an Metallionen geschützt oder die Umsatzrate an DNA ist sehr

hoch.

Whitchurch et al. (2002) haben gezeigt, dass extrazelluläre DNA zumindest in

der Anfangsphase des Biofilmwachstums von P. aeruginosa benötigt wird.

Vermutlich spielt extrazelluläre DNA auch bei der Bildung anderer Biofilme, in

denen Bakterien DNA gezielt freisetzen, eine wichtige Rolle.

Lipide und Phospholipide wurden als EPS-Bestandteile nachgewiesen

(Goodwin und Forster, 1985; Gehrke et al., 1998; Gehrke et al., 2001). Lipide

18

Einleitung

wurden in Biofilmen von Thiobacillus ferrooxidans als Hauptkomponente

identifiziert (Gehrke et al., 1998).

Zur Gruppe der Glycolipide werden die Rhamnolipide gezählt. Sie sind aus

einem oder zwei hydrophilen Rhamnosemolekülen und einem lipophilen

Fettsäurerest (β-Hydroxydecansäure) zusammengesetzt. Bei P. aeruginosa

wurden bisher sechs verschiedene Rhamnolipide identifiziert (Abbildung 4).

Aufgrund ihres amphiphilen Charakters haben Rhamnolipide Tensideigenschaften.

Daher werden sie in technischen Systemen u. a. für die Öltankerreinigung, die

biologische Kontrolle der zoosporen Pflanzenpathogene und v. a. in der

Bodensanierung eingesetzt (Maier und Soberon-Chavez, 2000). Die

physiologische Bedeutung von Rhamnolipiden für die Mikroorganismen liegt in der

Bereitstellung wasserunlöslicher Substrate als Nährstoffe (Zhang und Miller, 1992)

durch die Herabsetzung der Grenzflächenspannung. Rhamnolipide können auf

andere Mikroorganismen eine antibakterielle Wirkung haben (Haba et al., 2003).

O

CH

CH

(CH2)6 CH3

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

O

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OHOH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

O

CH3

OHOH

OHO

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

CH2 COOH

(CH2)6

CH3

O

CH3

OHOH

OH O CHO

CH3

OHOH

OHO

CH2

CH3

O

CH3

OH

OH O CH

(CH2)6

COOH

O

CH3

OOH

OHO

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

O

CH

CH

(CH2)6 CH3

Rhamnolipid 1 Rhamnolipid 2

Rhamnolipid 4Rhamnolipid 3

Rhamnolipid BRhamnolipid A

Abbildung 4: Rhamnolipide von P. aeruginosa (nach Lang und Wullbrandt (1999))

19

Einleitung

Die Rolle der Rhamnolipide im Biofilm ist erst vor kurzem erkannt worden.

Davey et al. (2003) haben gezeigt, dass Rhamnolipide benötigt werden, um die

Biofilmarchitektur aufrecht zu erhalten (Bildung von Makrokolonien, Poren und

Kanälen). Bei P. aeruginosa haben sie die Funktion der Aufhebung der Zell-Zell-

Wechselwirkung (Adhäsion) und stören die Anheftung an Oberflächen

(Detachment).

Huminstoffe sind natürliche organische Substanzen und entstehen als

Abbauprodukte abgestorbener Biomasse (Detritus). An dem Abbauprozess der

Biomasse in der Umwelt sind auch die Mikroorganismen beteiligt. Als logische

Konsequenz können Huminstoffe auch in Umweltbiofilmen vorkommen. Manche

Arbeitsgruppen zählen die Huminstoffe zu den Bestandteilen der EPS von in

Böden und aquatischen Systemen vorkommenden Biofilmen (Burns, 1989;

Nielsen et al., 1997; Jahn und Nielsen, 1998). Die Zusammensetzung der

Huminstoffe ist uneinheitlich und hängt ab von der Art der Phenol- und

Aminogruppen-haltigen Vorprodukte (Stevenson, 1982). Die Polymerisation der

Huminstoffe verläuft radikal über chinoide und semichinoide Zwischenprodukte.

Einfachere Huminstoffe können synthetisch aus Polyphenolen unter Einwirkung

von Enzymen (Phenoloxidasen, etc.) gebildet werden. Der wasserlösliche Anteil

der Huminstoffe hat in der Regel eine relativ hohe molare Masse (bis zu einigen

Tausend g/mol) und besteht zu etwa 50 Gewichtsprozenten aus Kohlenstoff

(Frimmel und Christman, 1988).

Extrazelluläre Enzyme können stabile Komplexe mit Huminstoffen bilden

(Burns, 1989). In Biofilmen in Böden können Komplexe von Enzymen mit

Huminstoffen und Tonpartikeln, unabhängig von der vorhandenen Mikroflora,

einen bedeutenden Beitrag zur gesamten enzymatischen Aktivität im Boden

leisten. Diese Enzym-Huminstoff-Komplexe sind sehr beständig gegen thermische

Denaturierung, Dehydratation und Protolyse (Burns, 1989). Die Bildung von

Komplexen der Enzyme mit polyphenolischen Verbindungen kann die

Enzymaktivität teilweise oder komplett reversibel inaktivieren (Wetzel, 1991). Es

wird vermutet, dass die Enzyme in diesen Komplexen vor der Umgebung

geschützt gespeichert werden können. In einer gehemmten, aber chemisch

aktiven Form, können sie wieder an gleicher oder anderer Stelle mit ihrer vollen

20

Einleitung

enzymatischen Aktivität freigesetzt werden (Wetzel, 1991). Somit kann die

potentielle enzymatische Aktivität in Biofilmen, die Huminstoffe enthalten, weitaus

höher sein als sie üblicherweise gemessen wird.

1.6 Ökologische Funktion der EPS

Der Hauptvorteil der Lebensweise in Biofilmen für Mikroorganismen ist die

Bildung einer EPS-Matrix, in der sie relativ lange immobilisiert sind im Vergleich

zum Leben in der planktonischen Phase (Überblick über die ökologischen Vorteile

in Tabelle 2). Durch die hohe Zelldichte im Biofilm gegenüber der planktonischen

Phase können die Mikroorganismen über einen längeren Zeitraum synergistische

Konsortien bilden (Flemming und Wingender, 2002a). Dies ermöglicht den

Mikroorganismen eine sequentielle Verwertung von (schwer abbaubaren)

Substraten. Ein Beispiel hierfür ist die Nitrifikation in Biofilmen, bei der

Ammoniumoxidierer (Nitrosomonas sp.) und Nitritoxidierer (Nitrobacter sp.,

Nitrococcus sp.) zusammenwirken (Stehr et al., 1995). Die heterogene Anordnung

der Mikroorganismen im Biofilm führt zur Ausbildung von Gradienten der

Konzentration an Protonen (pH -Wert), Sauerstoff u. a. Elektronenakzeptoren,

sowie von Substraten und Stoffwechselprodukten (Wimpenny und Kinniment,

1995). Es entstehen hierdurch aerobe und anaerobe Habitate in unmittelbarer

Umgebung im Biofilm. Dies erlaubt die Ausbildung einer großen Artendiversität im

Biofilm. Die verschiedenen Mikroorganismenarten bewegen sich in einer Matrix

von EPS mit hoher Zelldichte, wodurch ein Zell-Zell-Kontakt viel wahrscheinlicher

ist als in der Wasserphase. Zumindest indirekt ist die EPS dafür verantwortlich,

dass die Zellen im Biofilm genetisches Material untereinander austauschen

können (Trevors et al., 1987; Lorenz et al., 1988; Lorenz und Wackernagel, 1994;

Lebaron et al., 1997).

Die EPS können eine wichtige Rolle bei der primären Adhäsion der

Mikroorganismen an Oberflächen spielen (Vandevivere und Kirchman, 1993). Sie

sind auch an der Erhaltung der strukturellen Integrität des Biofilms beteiligt

(Costerton et al., 1981; Marshall, 1984; Costerton et al., 1987) und somit für die

gesamte Stabilität der Biofilm-Biozönose (Uhlinger und White, 1983)

verantwortlich. Die mechanische Stabilität des Biofilms wird durch nicht-kovalente

21

Einleitung

Bindungsarten der EPS-Bestandteile hervorgerufen. Dazu zählen elektrostatische

Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und van-der-Waals-

Wechselwirkungen (Mayer et al., 1999; Flemming et al., 2000). Diese

Kohäsionskräfte sind im Vergleich zu kovalenten Bindungen sehr klein, aber durch

die große Anzahl an Bindungsstellen der Makromoleküle addieren sie sich zu

einer Gesamtbindungsstärke, die beispielsweise die von kovalenten Einfach-

Bindungen (140-595 kJ/mol) bei Weitem übersteigt (Mayer et al., 1999).

Es wird vermutet, dass die EPS selbst auch als Nährstoffreserve für die

Mikroorganismen im Biofilm dienen können (Patel und Gerson, 1974). Obayashi

und Gaudy (1973) haben gezeigt, dass manche Bakterien die Polymere von

anderen Bakterienarten anaerob abbauen können und somit die Möglichkeit von

„cross-feeding“ besteht. Sutherland (1995; 1999b; 1999c) hat eine Übersicht über

Polysaccharid-Lyasen zusammengestellt, die in der Lage sind glykosidische

Bindungen durch β-Elimination zu spalten. Vermutlich werden die extrazellulären

Polysaccharide nicht von den Mikroorganismen abgebaut, die sie produziert

haben (Sutherland, 1999b). Dennoch müssen die EPS früher oder später

biologisch abbaubar sein, sonst würden sie ewig bestehen bleiben. Die

Polysaccharide sind anscheinend weitaus stabiler in der Matrix und werden im

Gegensatz zu den Proteinen nicht nach kurzer Zeit abgebaut (Flemming und

Wingender, 2002a).

Es bleibt zu klären, ob die EPS-Matrix als Diffusionsbarriere agieren kann. Die

Hauptkomponente im Biofilm ist Wasser. Mittels NMR-Untersuchungen konnte

gezeigt werden, dass der Diffusionskoeffizient von Wasser im Biofilm praktisch

gleich groß wie in freiem Wasser ist (Vogt et al., 2000). Nur ein Bruchteil des

Wassers (0,1 %) hat einen geringeren Diffusionskoeffizient. Die Ergebnisse lassen

vermuten, dass sich kleinere Moleküle quasi ungehindert im Biofilm bewegen

können.

Mikroorganismen können Feststoffe durch die Besiedlung des Materials und

darauf folgender Ausscheidung von extrazellulären Enzymen abbauen. Die EPS-

Matrix verhindert den Verlust der Enzyme an die Wasserphase (Wetzel, 1991;

Hoffman und Decho, 1999). Wingender et al. (1999a) haben gezeigt, dass Alginat

mit extrazellulärer Lipase wechselwirkt und somit in der EPS-Matrix festgehalten

wird.

22

Einleitung

Aufgrund der Rückhaltung von Wasser im Biofilm entsteht ein Schutz vor

Austrocknung bei Wassermangel (Ophir und Gutnick, 1994). Dies führt aber im

Gegenzug zu Problemen bei der Entwässerung von Klärschlammen aus der

Abwasserbehandlung.

Tabelle 2: Ökologische Funktion der EPS-Matrix

Vorteil Literatur Bildung von Mikrokonsortien - Immobilisierung der Zellen

- synergistische Gemeinschaften Lam et al. (1980); Stehr et al. (1995); O’Toole et al. (2000); Flemming und Wingender (2001)

Biodiversität - Konzentrationsgradienten (z. B. von O2) führen zu anaeroben Bereichen im Biofilm

- Heterogenität

Costerton et al. (1987); De Beer et al.(1994); Wimpenny und Kinniment (1995)

Bewegung in einer Matrix - hohe Zelldichte - Zell-Zell-Kontakt - erhöhter Gentransfer

Trevors et al. (1987); Lorenz et al. (1988); Vandevivere und Kirchman (1993); Lorenz und Wackernagel (1994); Lebaron et al. (1997); Kolenbrander et al. (2002)

Aufrechterhaltung der Stabilität des Biofilms

- EPS-Matrix schützt Biofilm vor Abbau

- mechan. Stabilität durch nicht-kovalente Bindungskräfte

Costerton et al. (1981); Uhlinger und White (1983); Marshall (1984); Vandevivere und Kirchman (1993); Mayer et al. (1999); Flemming et al. (2000)

EPS als Kohlenstoffquelle - Nährstoffreserve - „cross-feeding“

Patel und Gerson (1974); Obayashi und Gaudy (1973) Decho (1990); Sutherland et al. (1999b); Wolfaardt et al. (1999)

Diffusionsbarriere nach außen, ungehinderte Diffusion in der Matrix

- Diffusionskoeffizienten von Wasser und kl. Molekülen in der Matrix wie bei „freiem Wasser“

Vogt et al. (2000)

Retention und Stabilisierung von Enzymen

- Lokalisierung von Enzymen an Polysacchariden/Lektinen

- Bindung an Huminstoffe, Tonmineralien und Partikel

Wetzel (1991); Hoffman und Decho (1999); Wingender et al. (1999a); Wingender und Jaeger (2002)

Retention von Wasser - Schutz vor Austrocknung Ophir und Gutnick (1994) Retention von Nucleinsäuren - Komplexierung von DNA mit

Mineralien und Huminstoffen - Schutz vor DNasen

Lorenz und Wackernagel (1994)

Sorption von Nährstoffen - Überlebensmechanismus in oligotropher Umgebung

Marshall (1985); Decho (1990; 2000); Fletcher (1991); Wolfaardt et al. (1999)

Schutz vor Bioziden - Schutz vor Chlor LeChevallier et al. (1988); Morton et al. (1998); Costerton et al. (1999); Schulte et al. (2003)

23

Einleitung

Genetisches Material wird in der EPS-Matrix konserviert (z. B. durch

Komplexierung von DNA mit Huminstoffen und Mineralien) und kann von den

Mikroorganismen leichter aufgenommen werden als in der planktonischen Phase

(Lorenz und Wackernagel, 1994). Die Mikroorganismen befinden sich im Biofilm in

räumlicher Nähe und können sich darin bis zu einem gewissen Grad bewegen.

Dadurch wird ihnen der Genaustausch ermöglicht (Wolfaardt et al., 1999).

Durch die Struktur der EPS als Gelmatrix können Nährstoffe aus der

umgebenden Wasserphase akkumuliert werden (Decho, 1990). Dies kann durch

Sorption gelöster und partikulärer Stoffe aus der umgebenden Phase geschehen

(Flemming, 1995). Es wird als Überlebensmechanismus für Mikroorganismen in

Biofilmen besonders in oligotropher Umgebung angesehen (Marshall, 1996). Die

EPS können auch eine Schutzbarriere bilden und führen somit zu einer Resistenz

der Mikroorganismen gegenüber Bioziden, wie dem Desinfektionsmittel Chlor

(Grobe et al., 2001) oder Antibiotika (Costerton et al., 1999).

1.7 Isolierung und Analytik von EPS

Es existiert keine universelle Methode für die quantitative Abtrennung der EPS

von den Zellen im Biofilm (Nielsen und Jahn, 1999). Eine optimale

Isolierungsmethode sollte zu einer größtmöglichen Ausbeute an EPS ohne Lysis

der Zellen im Biofilm oder Veränderung der Biopolymeren führen (Gehr und

Henry, 1983). Die Zusammensetzung von Biofilmproben kann sehr unterschiedlich

sein und somit auch die Bindungskräfte (mechanische Stabilität, Kohäsionskräfte),

die bei der Isolierung der EPS zu überwinden sind. Die Hauptbindungskräfte, die

die Polymeren im Biofilm zusammenhalten sind Van-der-Waals-Kräfte,

elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und

hydrophobe Wechselwirkungen. Zudem können zwei- und höherwertige Kationen,

wie Ca2+ oder Mg2+, die EPS-Matrix z. B. durch Verbrückung von Polysaccharid-

Ketten oder anderer negativ geladener EPS-Bestandteile (z. B. saure Proteine,

Nucleinsäuren) stabilisieren (Bruus et al., 1992).

24

25

Tabelle 3: Methoden der Isolierung und Herkunft von EPS aus Reinkulturen (nach Nielsen und Jahn (1999), ergänzt)

Reinkultur Methode Zelllysis LiteraturAzosporillum brasilense Zentrifugation (5 000 – 10 000 x g) n. b. Troch et al. (1992) Bacteroides sp. Ethanol/Hochgeschwindigkeitszentrifugation n. b. Streeter et al. (1994) Clostridium acetobutylicum NaCl/ EDTA/ Mischen n. b. Junelles et al. (1989)

Pyridinacetat n. b. Pelkonen et al. (1988) Hexadecyltrimethylammoniumbromid/Erhitzen n. b. Schmidt und Jann (1982) NaOH n. b. Sato und Ose (1984)

Escherichia coli

Hexadecyltrimethylammoniumbromid/Erhitzen n. b. Jann et al. (1980) Dampf (Autoklavieren) DNA Azeredo et al. (1999) Ultraschall Protein Rudd et al (1982)

Klebsiella aerogenes

Ultraschall; Hochgeschwindigkeitszentrifugation Protein/DNA Brown und Lester (1980) Zentrifugation (5 000 – 13 000 x g) n. b. Conti et al. (1994) P. putida/ fluorescens NaCl n. b. Read und Costerton (1987)

Proteus vulgaris Erhitzen/Kochen n. b. Schmidt und Ahring (1994) Hochgeschwindigkeitszentrifugation (40 000 x g) G6PDH Wingender et al. (2001) NaCl n. b. May und Chakrabarty (1994) Hochgeschwindigkeitszentrifugation (20 000 – 48 000 x g) n. b. Buckmire (1984)

Pseudomonas aeruginosa

Hochgeschwindigkeitszentrifugation (20 000 – 48 000 x g) n. b. Pavoni et al. (1972) Pseudomonas alcaligenes Zentrifugation (5 000 – 13 000 x g) n. b. Titus et al. (1995) Pseudomonas putida Behandlung mit Ionenaustauscherharz (Dowex) G6PDH Jahn und Nielsen (1995) Pseudomonas sp. (Meer) Ultrazentrifugation (113 000 x g) n. b. Wrangstadh et al. (1986) Pseudomonas sp. NCMB 2021 NaCl n. b. Christensen et al. (1985) Pseudomonas sp. Enzym (dispergierend)/ NaOH n. b. Tago und Aida (1977) Rhizobacteria NaOH/Erhitzen n. b. Hebbar et al. (1992) Rhizobium trifolii NaOH/Erhitzen n. b. Breeveld et al. (1990) Rhodopseudomonas capsulata Ultra Turrax (20 000 U/min, 60 s);

Cetyltrimethylammoniumbromid/ Erhitzen; NaCl/Erhitzen n. b. Omar et al. (1983)

Sedimentbakterium EDTA/Mischen G6PDH Platt et al. (1985) Sphaerotilus natans Deionat/ Mischen n. b. Gaudy und Wolfe (1962) Sphingomonas paucimobilis Ultraschall; Dampf (Autoklavieren); Glutaraldehyd; K2HPO4;

Tris/HCl; Dowex/Rühren DNA Azeredo et al. (1999)

Staphylococcus epidermidis NaCl/Ultraschall n. b. Evans et al. (1994) Versch. Reinkulturen Hochgeschwindigkeitszentrifugation (20 000 – 48 000 x g) n. b. Pavoni et al. (1972) Zoogloea K2HPO4/Mischen n. b. Farrah und Unz (1976)

n. b., nicht bestimmt, G6PDH, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

26

Tabelle 4: Methoden der Isolierung und Herkunft von EPS aus Umweltproben (nach Nielsen und Jahn (1999), ergänzt)

Art des Biofilms Methode Zelllysis Literatur Abwasserbiofilm Dowex/Rühren G6PDH Jahn und Nielsen (1995) Abwasserschlamm Phenol Protein/PS-Verhältnis Karapanagiotis et al. (1989)

Kronenether G6PDH Wuertz et al. (2001) Tris/HCl; Glutaraldehyd; K2HPO4; Ultraschall; Ethanol/Hochgeschwindigkeitszentrifugation

DNA Azeredo et al. (1999)

Ethanol/Hochgeschwindigkeitszentrifugation G6PDH Frølund et al. (1996) Ultraschall DNA/Zellzahl Jorand et al. (1995) Ultraschall n. b. Quarmby und Forster (1995) Ultraschall n. b. Urbain et al. (1993) Ultraschall n. b. King und Forster (1990) Erhitzen/Kochen n. b. Morgan et al. (1990) Dampf (Autoklavieren) Protein/PS-Verhältnis Karapanagiotis et al. (1989) Filtration; Dampf (Autoklavieren) n. b. Hejzlar und Chudoba (1986) Ethanol-Ausfällung n. b. Forster und Clarke (1983) Zentrifugation (5 000 – 13 000 x g); K2HPO4 DNA Gehr und Henry, (1983) Dowex/Formaldehyd n. b. Rudd et al. (1983) Erhitzen/Kochen n. b. Beccari et al. (1980) Dampf (Autoklavieren); NaOH; Ultraschall Protein/DNA Brown und Lester (1980)

Belebtschlamm

NaOH; NH4OH/EDTA n. b. Sato und Ose (1984) Eulitorale Sedimente NaCl, EDTA/Mischen n. b. Underwood et al. (1995)

Hochgeschwindigkeitszentrifugation (20 000 – 48 000 x g); Formaldehyd; Formaldehyd/NaOH; Dowex/Rühren; EDTA/Mischen; Formaldehyd/Ultraschall

DNA Liu und Fang (2002) Faul-/Belebtschlamm

Erhitzen/Kochen n. b. Forster und Quarmby (1995) NaCl/Formaldehyd/ Ultraschall n. b. Jia et al. (1996) Faulschlamm Erhitzen/Kochen n. b. Horan und Eccles (1986)

Faulschlamm/Granula Erhitzen/Kochen Protein/DNA Brown und Lester (1980) Frischwasser/Meer-Isolate Hochgeschwindigkeitszentrifugation (20 000 – 48 000 x g) n. b. Kennedy und Sutherland

(1987) Klärschlamm Dowex; NaOH Protein/PS-Verhältnis Karapanagiotis et al. (1989) Marine Bakterien EDTA n. b. Labare et al. (1989) Methanogene Granula Phenol/Ultraschall n. b. Veiga et al. (1997) UASB Granulat Ultraschall n. b. Rahman et al. (1997)

n. b., nicht bestimmt, G6PDH, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, PS, Polysaccharid, UASB, aufwärts durchströmter Klärschlammreaktor

Einleitung

Physikalische, chemische und kombinierte physikalische und chemische

Methoden wurden auf Reinkulturen und Biofilmen aus technischen Systemen und

Umweltproben angewandt (Tabelle 3 und Tabelle 4). Bei den physikalischen

Methoden wurden Scherkräfte durch Zentrifugation, Mischen, Ultraschall oder

Erhitzen auf die Proben ausgeübt, um die Biofilmstruktur aufzubrechen und

nachfolgend die EPS abzutrennen.

Das Ausmaß der Zellschädigung durch die Isolierungsmethoden wurde nur in

wenigen Untersuchungen überprüft (DNA-Freisetzung, Freisetzung intrazellulärer

Enzyme wie Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase). EPS aus Reinkulturen wurden

häufig durch Zentrifugation von den Zellen abgetrennt (Tabelle 3).

Bei den chemischen Isolierungsmethoden werden Substanzen der Probe

hinzugegeben, die die Bindungskräfte der EPS-Matrix spezifisch stören sollen, um

somit die EPS in die umgebende Wasserphase freizusetzen. Die Vielfalt der

verwendeten Substanzen reicht von NaOH, NaCl über organische Lösemittel wie

Formaldehyd, Phenol oder Pyridin bis zu Komplexbildnern wie EDTA oder

Kronenethern. Die Behandlung mit NaOH kann zur alkalischen Hydrolyse der

Polysaccharide führen (Hancock und Poxton, 1988). Die Entfernung von

zweiwertigen Kationen gelang durch Komplexbildner wie EDTA oder Kronenethern

(Platt et al., 1985; Labare et al., 1989; Wuertz et al., 2001). Die Kombination von

physikalischen und chemischen Methoden wurde häufig bei Schlammproben

untersucht (Tabelle 4).

Hierbei hat sich die Anwendung eines Ionenaustauscherharzes (Dowex) in

Kombination mit Scherkräften durch Rühren als schonend sowohl auf die Integrität

der Zellen und der Stabilität der Makromoleküle als auch in Bezug auf die

Ausbeute an EPS erwiesen (Platt et al., 1985; Karapanagiotis et al., 1989; Frølund

et al., 1996).

Die EPS werden qualitativ durch chromatographische (Ionenaustausch-

Chromatographie, Gaschromatographie und Hochleistungsflüssigkeits-

chromatographie) oder elektrophoretische (Gelelektrophorese) Methoden

untersucht. So wurden beispielsweise Aminozucker von Polysacchariden aus

Belebtschlämmen von Hejzlar und Chudoba (1986) mit der

Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt und identifiziert. Zinkevich et al.

(1996) und Samain et al. (1997) haben die qualitative Analyse von

27

Einleitung

Polysacchariden aus Bakterienisolaten mariner Herkunft mittels

Gaschromatographie beschrieben. Zinkevich et al. (1996) zeigten weiterhin die

Auftrennung der EPS mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Dignac et al.

(1998) bestimmten mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Proteine und

mit der Gaschromatographie Lipide aus Belebtschlammproben. Es wurde von

Raunkjær et al. (1994) die Untersuchung von Lipiden aus Abwasserbiofilmen

mittels Infrarotspektroskopie beschrieben.

Zur Quantifizierung von EPS-Komponenten werden üblicherweise

colorimetrische (photometrische) Bestimmungsmethoden eingesetzt. In Tabelle 5

sind die typischen EPS-Komponenten mit ihrem nachgewiesenen

Konzentrationsbereich aufgeführt.

Tabelle 5: Zusammensetzung isolierter EPS und Konzentrationsbereich der jeweiligen Komponente (Flemming und Wingender, 2002a)

EPS Bestandteil Gehalt in den EPS

Polysaccharide 40 - 95 %

Proteine <1 – 60 %

Nucleinsäuren <1 – 10 %

Lipide <1 – 40 %

Quantitative Untersuchungen von Proteinen in mikrobiellen Aggregaten sind

bisher relativ häufig im Abwasserbereich, in Biofilmen aus Abwasserleitungen

(Jahn und Nielsen, 1998) oder im Belebtschlamm aus

Abwasserreinigungsanlagen (Raunkjær et al., 1994; Frølund et al., 1996)

durchgeführt worden.

28

Einleitung

1.8 Ziele dieser Arbeit

• Entwicklung und Anpassung von Methoden der Isolierung von EPS unter

Berücksichtigung der Herkunft der Biofilme:

a) Reinkulturen: P. aeruginosa, P. fluorescens

b) Biofilme aus der Abwasserbehandlung

c) Sediment-Biofilme

• Biochemische Analyse der EPS-Bestandteile (quantitativ und qualitativ):

- Kohlenhydrate

- Uronsäuren

- Proteine

- Huminstoffe

- Nucleinsäuren

- Glycolipide (Rhamnolipide)

• Reinigung, Auftrennung und Monomer-Zusammensetzung der Kohlenhydrate

in den EPS

• Einfluss der Nährstoffbedingungen auf die Zusammensetzung der EPS

29

Material

2 Material

2.1 Bakterienstämme

Pseudomonas aeruginosa SG81

Für alle Untersuchungen wurde der mucoide Stamm Pseudomonas

aeruginosa SG81 verwendet. Er wurde ursprünglich aus dem Aufwuchs in einem

Abfluss einer Hausinstallation eines Fleischzerlegebetriebs isoliert (Grobe et al.,

1995). Die Stammhaltung erfolgte auf Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA) bei

36 °C. Nach jeweils bis zu vier Wochen wurden die Bakterien auf PIA überimpft

(24 h, 36 °C), und die Platten wurden bei 4 °C aufbewahrt.

Pseudomonas fluorescens 6/4

Der schleimbildende Stamm Pseudomonas fluorescens 6/4 wurde verwendet.

Er wurde aus einem Biofilm eines PVC-Trinkwasserrohres isoliert (Wingender et

al., 2003). Die Stammhaltung erfolgte auf Pseudomonas Agar F. Nach jeweils bis

zu vier Wochen wurden frische Einzelkolonieausstriche bei 36 °C für 24 h

bebrütet, und die Platten wurden bei 4 °C aufbewahrt.

Zur Überprüfung der Identität wurden die in dieser Arbeit verwendeten

Bakterien in das kommerziell erhältliche api 20NE System (Fa. BioMérieux)

eingesetzt. Ausgehend von Einzelkolonieausstrichen auf den jeweiligen

Nährmedien wurden die Teststreifen den Herstellerangaben entsprechend beimpft

und 24 h bzw. 48 h bei 30 °C bebrütet. Die Auswertung erfolgte nach Angaben

des Herstellers. Zusätzlich wurde die Cytochromoxidase-Reaktion mittels eines

kommerziellen Oxidase-Tests (Bactident-Oxidase, Fa. Merck) ermittelt. Die

Identifizierung der Isolate erfolgte durch Auswertung der ermittelten

Reaktionsprofile mit Hilfe der Software apiLAB Plus.

30

Material

2.2 Nährmedien

Alginate-Promoting-Medium (APM):

21,81 g Natrium-D-gluconat (100 mM; Fa. Fluka), 16,91 g Natriumglutamat

(100 mM; Fa. Sigma), 2,46 g MgSO4 x 7H2O (10 mM), 1,03 g NaH2PO4 x H2O

(7,5 mM), 2,93 g K2HPO4 (16,8 mM) und 15 g Agar ad 1000 ml Deionat.

Ammonium-Agar:

3,0 g Ammoniumsulfat, 2,0 g K2HPO4 x 3H2O, 1,2 g KH2PO4, 0,5 g

MgSO4 x 7H2O, 5,0 g Natriumcitrat-dihydrat, 0,05 g CaCl2 x H2O, 0,0005 g

FeSO4 x 7H2O und 15 g Agar ad 1000 ml Deionat.

Nähr-Agar (NA, Fa. Difco, Art.-Nr. 000117):

Zusammensetzung:

3 g/l Fleischextrakt, 5 g/l Pepton, 15 g/l Agar.

31 g Bacto Nutrient Agar (Fa. Difco) ad 1000 ml Deionat.

Nitrat-Agar:

3,0 g Natriumnitrat, 2,0 g K2HPO4 x 3H2O, 1,2 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 x 7H2O,

5,0 g Natriumcitrat-dihydrat, 0,05 g CaCl2 x H2O, 0,0005 g FeSO4 x 7H2O und 15 g

Agar ad 1000 ml Deionat.

Pseudomonas-Agar F (Fa. Merck, Art.-Nr. 1.10983)

Zusammensetzung:

10,0 g/l Pepton aus Casein, 10,0 g/l Pepton aus Fleisch, 1,5 g/l Magnesiumsulfat,

1,5 g/l di-Kaliumhydrogenphosphat, 12,0 g/l Agar.

25 g PAF und 10 ml Glycerin (Fa. Merck) ad 1000 ml Deionat.

Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA, Fa. Difco, Art.-Nr. 0927171)

Zusammensetzung:

20 g/l Bacto-Pepton, 1,4 g/l MgCl2, 10 g/l K2SO4, 0,025 g/l Irgasan DP-300 (Fa.

Ciba-Geigy), 13,6 g/l Agar.

45 g PIA und 20 ml Glycerin (Fa. Merck) ad 980 ml Deionat.

31

Material

Pseudomonas Isolierungs-Agar mit 0,1 M Calcium (CaPIA)

Zusammensetzung:

20 g/l Bacto-Pepton, 1,4 g/l MgCl2, 10 g K2SO4, 0,025 g/l Irgasan DP-300 (Fa.

Ciba-Geigy), 13,6 g/l Agar.

45 g PIA und 20 ml Glycerin (Fa. Merck) ad 980 ml Deionat.

14,7 g CaCl2 x 2H2O separat in 50 ml Deionat lösen, separat autoklavieren, und

nach dem Autoklavieren dem Nährmedium hinzugeben.

R2A Agar (Fa. Difco, Art. –Nr. 218263)

Zusammensetzung:

0,5 g/l Hefeextrakt, 0,5 g/l Protease-Pepton Nr. 3, 0,5 g/l Caseinhydrolysat, 0,5 g/l

Dextrose, 0,5 g/l lösliche Stärke, 0,3 g/l Natriumpyruvat, 0,3 g/l di-Kaliumphosphat,

0,05 g/l Magnesiumsulfat, 15,0 g/l Agar.

18,2 g Agar ad 1000 ml Deionat.

Vogel-Bonner Minimalmedium Agar (VBMA):

0,2 g MgSO4 x 7H2O, 2 g Zitronensäure-monohydrat, 3,5 g NaNH4HPO4 x 4H2O,

10 g K2HPO4 und 15 g Agar ad 990 ml Deionat. Separat: 10 ml D-Glucose

(50 % w/v) autoklavieren, dann hinzugeben.

Die Nährmedien wurden 20 min bei 120 °C autoklaviert und zu je 25 ml in

Petrischalen mit Nocken (ausreichende Sauerstoffzufuhr) gegeben und bei 4 °C

maximal vier Wochen im Kühlschrank aufbewahrt.

2.3 Lösungen und Puffer

0,14 M NaCl 0,14 M NaCl in Deionat

Isolierungspuffer

(Dowex-Methode)

2 mM Na3PO4, 4 mM NaH2PO4, 9 mM NaCl und 1 mM

KCl, pH 7

Tris/HCl-Puffer

(Kronenether-Methode)

50 mM Tris, pH 8

32

Material

Tris/HCl-Puffer

(Alginatreinigung)

50 mM Tris, 2 mM MgCl2, pH 7,5

Tris/HCl-Puffer

(DNA-Bestimmung)

14 mM Tris, 13 mM NaCl, 14 mM EDTA, pH 7

Natriumacetat-Puffer

(Acetylgruppenbest.)

1 mM Natriumacetat, pH 4,5

Tris/HCl-Puffer

(Gelfiltration)

50 mM Tris, 0,2 M NaCl, pH 8;

50 mM Tris, 0,2 M NaCl, 0,02 % (w/v) NaN3, pH 8

Tris/HCl-Puffer

(Ionenaustausch-

chromatographie)

50 mM Tris, pH 7,5;

50 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,5;

50 mM Tris, 2 M NaCl, pH 7,5;

50 mM Tris, 0,02 % (w/v) NaN3, pH 7,5

Phosphat-Puffer (PP) 2 mM KH2PO4, 8 mM Na2HPO4 x 2H2O, pH 7,5

Phosphat-Puffer

(Affinitätschroma-

tographie)

Bindungs-Puffer: PP, pH 7,5;

Elutions-Puffer 1: PP, 0,5 M NaCl, pH 7,5

Elutions-Puffer 2: (nicht autoklaviert): PP, 0,5 M NaCl,

0,2 M Methyl-D-mannosid, pH 7,5

Regenerierungs-Puffer 1: PP, 0,5 M NaCl, pH 8,5

Regenerierungs-Puffer 2: PP, 0,5 M NaCl, pH 4,5

Konservierungs-Puffer: PP, 0,5 M NaCl, 0,01 % (w/v)

Thimerosal, pH 7,5

Phosphat-Puffer

(ELLA)

Phosphat-Puffer, 0,05 % (v/v) Tween 20, pH 7,5

Alle Lösungen und Puffer wurden vor dem Gebrauch im Autoklaven für 20 min

bei 121 °C sterilisiert.

33

Material

2.4 Substanzen

2.4.1 Polysaccharide

Algenalginat, Manucol LHF, Fa. Kelco

Dextran (aus Leuconostoc mesenteroides B-512), 2 x 106 Da, Fa. Sigma, Art.-

Nr. D-5376

Xanthan (Gum Xanthan), Fa. Sigma, Art.-Nr. G-1253

2.4.2 Monosaccharide und Oligosaccharide

N-Acetyl-D-glucosamin, min. 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-8625

N-Acety-D-mannosamin, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-8176

N-Acetyl-D-galactosamin, approx. 98 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-2795

D-(-)-Arabinose, min. 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-6085

2-Deoxy-D-ribose, min. 98 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. D-2751

L-(-)-Fucose, min. 99 %, Fa. Serva, Art.-Nr. 21930.02

D-(+)-Galactose, min. 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. G-6404

D-Galacturonsäure-monohydrat, min. 98 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. G-2125

D-Glucose-monohydrat, 99,5 % (GC), Fa. Sigma, Art.-Nr. G-7528

D-Glucuronsäure, min. 98 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. G-5269

D-(+)-Maltose-monohydrat, ≥ 99 % (HPLC), Fa. Fluka, Art.-Nr. 63418

Maltotriose, min. 95 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. M-8378

D-(+)-Mannose, min. 98 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. M-4625

D-Mannuronsäure-γ-lacton, > 95 %, Fa. Dextra, Art.-Nr. M110

L-Rhamnose-monohydrat, min. 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. R-3875

D-(-)-Ribose, min. 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. R-7500

D-(+)-Xylose, 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. X-3877

2.4.3 Chemikalien und Reagenzien

Acetylcholinchlorid, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-6625

Benzonase, Reinheitsgrad 1, aus Serratia marcescens, Fa. Merck, Art.-Nr.

101694

Desoxyribonucleinsäure (aus Kalbsthymus), Fa. Merck, Art.-Nr. 1.24013

34

Material

Dicyclohexano-18-krone 6, Fa. Fluka, Art.-Nr. 36665

Dowex 50 X 8, Na+-Form, stark sauer, Teilchengröße 20 – 50 mesh, Fa. Fluka,

Art.-Nr. 44445

Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat, Fa. Merck, Art.-Nr. 103943

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Fa. Merck, Art.-Nr. 108417

Folin & Ciocalteus Phenolreagenz, Fa. Sigma, Art.-Nr. F-9252

Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz, Fa. Merck, Art.-Nr. 1.09001

Formaldehydlösung, 37 %ig, p. A., Fa. J. T. Baker, Art.-Nr. 7040

Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, aus Leuconostoc mesenteroides, Fa.

Sigma, Art.-Nr. G-8529

Glycerin, p. A., Fa. Fluka, Art.-Nr. 49770

m-Hydroxybiphenyl (3-Phenylphenol), 90%ig, Fa. Sigma, Art.-Nr. H-6527

2-Keto-3-deoxyoctonat (KDO), ≥ 99 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. K-2755

Lowry Reagent modified, Fa. Sigma, Art.-Nr. L-1013

Natrium-D-gluconat, Fa. Fluka, Art.-Nr. 71550

Natriumglutamat, Fa. Sigma, Art.-Nr. G-1626)

McFarland Standard, Fa. BioMérieux, Art.-Nr. 70900

Peroxidase-ConA, Fa. Sigma, Art.-Nr. L-6397

Proteinase K, aus Tritirachium album, Fa. Sigma, Art.-Nr. P-6556

Rinderserumalbumin, Fraktion V, min. 96 %, Fa. Sigma, Art.-Nr. A-4503

Sulfaminsäure (Amidoschwefelsäure), ACS, Fa. Sigma, Art.-Nr. S-6771

2.5 Geräte

Analysenwaage Typ BP 210 S, Fa. Sartorius

Autoklav Varioklav Dampfsterilisator, Fa. H & P

Laborbedarf

DC-Plattenheizer Typ 022.3306 CAMAG DC-Plattenheizer III, Fa.

CAMAG

Fluorimeter Typ SFM 25, Fa. Kontron

FTIR-Spektrometer Typ IFS 88, Fa. Bruker

35

Material

Gefriertrocknung Typ ALPHA 1-2, Fa. Christ

Leitfähigkeitsmessgerät Messzelle Typ LDM Nr. 00120001, Messgerät

Typ MultiLab 540, Fa. WTW

Mikroskop Typ Laborlux S, Fa. Leitz

Mikrotiterplatten-Reader Typ MRX Microplate Reader, Fa. Dynex

pH-Meter Typ MultiCal pH 540 GLP, Fa. WTW

Reagenzglasschüttler Typ Vortex Genie 2, Fa. Scientific Industries

Rotations-

Vakuumkonzentrator

Typ RVC 2-25 mit Kühlfalle Typ CT 02-50, Fa.

Christ

Rührwerk Typ RW 20 DZM.n, Fa. IKA

Säulenchromatographie Pumpe Typ P-1, Gradientenmischer Typ GM-1,

Fraktionssammler Typ FRAC-100, Fa. Amersham

Pharmacia Biotech

UV/VIS-Photometer Typ Spectronic 601, Fa. Milton Roy Company

Typ UV-1202, Fa. Shimadzu

Typ Cary 50 Bio, Fa. Varian

Zentrifugen Typ RC 26 plus, Fa. Sorvall

Typ Biofuge fresco, Fa. Eppendorf

36

Methoden

3 Methoden

3.1 Anzucht von Reinkulturbiofilmen

Ausgehend von einer Stammplatte wurde ein Einzelkolonieausstrich auf

Agarnährmedium angelegt. Bei P. aeruginosa wurde Pseudomonas Isolierungs-

Agar (PIA) und bei P. fluorescens Pseudomonas Agar F verwendet. Die Platten

wurden 24 h bei 36 °C für P. aeruginosa oder bei 30 °C für P. fluorescens

bebrütet. Es bildeten sich bei beiden Bakterienstämmen mucoide Kolonien aus.

Es wurde eine schwach getrübte Suspension der Bakterienmasse in 10 ml

steriler, 0,14 M NaCl-Lösung hergestellt. Die Trübung entsprach dem McFarland-

Standard 2 (entsprechend etwa 6 x 108 Zellen pro ml). Von dieser Suspension

wurden jeweils 0,1 ml auf Agarplatten ausplattiert. Die Bebrütung der Platten

erfolgte bei 36 °C für 24 h bei P. aeruginosa oder bei 30 °C für 48 h bei

P. fluorescens. Ein konfluenter schleimiger Bakterienbewuchs bildete sich auf der

gesamten Agaroberfläche aus.

3.2 Probenahme von Umweltbiofilmen

Flussbiofilme und Flusssedimente

Es wurden insgesamt 8 Sedimentproben und epilithische Biofilme aus der Ruhr

und dem Rhein entnommen und deren EPS extrahiert und biochemisch

untersucht. Die Herkunft und Art der Proben ist in Tabelle 13 (Abschnitt 4.3.2,

S. 96) aufgeführt.

Belebtschlammproben

Die Schlammproben stammten aus Versuchsreaktoren zur

Abwasserbehandlung und aus kommunalen sowie industriellen Kläranlagen

(Herkunft siehe Tabelle 11, S. 93). Die Probenahmen erfolgten durch die

Projektpartner an der Universität Darmstadt und an der Universität Stuttgart. Die

Proben wurden gekühlt erhalten.

37

Methoden

3.3 Bestimmung von Trockenrückstand, Wassergehalt und Glühverlust

Die Bestimmungen erfolgten nach DIN EN 12879:2000 und DIN EN 12880:2000. Begriffe:

Trockenmasse:

Die nach dem festgelegten Trocknungsverfahren erhaltene Masse an fester

Substanz. Sie wird in Gramm oder Kilogramm angegeben (DIN EN 12880).

Trockenrückstand:

Der nach dem festgelegten Trocknungsverfahren erhaltene Massenanteil an

fester Substanz in einem Schlamm. Er wird in Prozent oder in Gramm je

Kilogramm angegeben (DIN EN 12880).

Wassergehalt:

Massenanteil des Wassers im Schlamm. Er wird als Massenverlust unter

definierten Bedingungen nach dem festgelegten Trocknungsverfahren bestimmt.

Er wird in Prozent oder in Gramm je Kilogramm angegeben (DIN EN 12880).

Glühverlust:

Massenanteil, der beim Glühen der Trockenmasse eines Schlamms unter

festgelegten Bedingungen als Gas entweicht. Er wird auf die Trockenmasse

bezogen und in Prozent angegeben (DIN EN 12879).

Glührückstand:

Massenanteil des Rückstands nach dem Glühen der Trockenmasse eines

Schlamms unter festgelegten Bedingungen. Er wird aus die Trockenmasse

bezogen und in Prozent angegeben (DIN EN 12879).

Durchführung:

Trockenrückstand und Wassergehalt

Ein leerer Porzellantiegel wurde in den Trockenschrank gestellt und

mindestens 30 min bei 105 °C (i. d. R. einen Tag) erwärmt. Nach dem Abkühlen

im Exsikkator (mit Phosphorpentoxid als Trockenmittel) auf Raumtemperatur

38

Methoden

wurde die Schale auf 1 mg gewogen (ma). Bei anschließender Bestimmung des

Glühverlustes wurde derselbe Tiegel für 30 min auf 550 °C vorerhitzt und auf 1 mg

gewogen, ma. Es wurde soviel des homogenisierten Schlamms in den Tiegel

eingewogen (mb), dass die erhaltene Trockenmasse mindestens 0,5 g betrug (ca.

10 g). Der Tiegel wurde mit der Probe über Nacht im Trockenschrank bei 105 °C

erhitzt, bis der Rückstand trocken erschien. Nach dem Abkühlen im Exsikkator

wurde der Tiegel mit dem Inhalt zum ersten Mal gewogen (mc). Die Masse des

Trockenrückstands (mc - ma) wurde als konstant angesehen, wenn die Masse

nach einer weiteren einstündigen Trocknung nicht um mehr als 0,5 % oder 2 mg

vom vorhergehenden Wert abwich. Andernfalls wurde die einstündige Trocknung

noch ein weiteres Mal wiederholt. Wenn kein konstanter Wert erreicht wurde, war

der Wert anzugeben, der nach mindestens 12 h bestimmt wurde; dies wurde im

Laborjournal vermerkt.

Glühverlust

Die Bestimmung des Glühverlustes erfolgte im Anschluss an die Bestimmung

des Trockenrückstands und Wassergehalts. Der Tiegel musste vor der

Bestimmung des Trockenrückstands geglüht und ausgewogen werden (s. o.). Im

Porzellantiegel wurde der getrocknete Schlamm im Muffelofen auf 550 °C erhitzt

und mindestens 60 min geglüht. Der heiße Tiegel wurde zum Abkühlen in den

Exsikkator gesetzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur im Exsikkator wurde der

Tiegel zum ersten Mal auf 1 mg ausgewogen (md). Es war sicherzustellen, dass

die Wägung unmittelbar nach der Entnahme des Tiegels aus dem Exsikkator

erfolgte und dass der Wägevorgang schnellstmöglich beendet wurde. Die Masse

des Glührückstandes und folglich der Glühverlust waren als konstant anzusehen,

wenn die Masse nach einer weiteren halbstündigen Glühdauer bei 550 °C im

vorgeheizten Ofen, (md – ma), um nicht mehr als 0,5 % oder 2 mg vom

vorhergehenden Wert abwich. Andernfalls war das Glühen zu wiederholen, bis

Massenkonstanz erreicht wurde. Wenn selbst nach dem dritten Erwärmen auf

550 °C keine Massenkonstanz erreicht werden konnte, war der Mittelwert der

letzten drei Wiederholungsprüfungen, die nach einer Stunde Aufbewahrung im

Exsikkator gemessen wurden, aufzuzeichnen. Dies wurde zusammen mit den

Ergebnissen angegeben.

39

Methoden

Auswertung:

Trockenrückstand (wdr)

( )( ) f

mmmmw

ab

acdr ×

−−

= [% (f=100) oder g/kg (f=1000)]

Wassergehalt (ww)

( )( ) f

mmmmw

ab

cbw ×

−−

= [% (f=100) oder g/kg (f=1000)]

Glühverlust (wv)

( )( ) 100×

−−

=ac

dcv mm

mmw [%]

Glührückstand (wr)

vr ww −=100 [%]

ma die Masse des leeren Tiegels, in Gramm;

mb die Masse des Tiegels mit der Schlammprobe, in Gramm;

mc die Masse des Tiegels mit der Trockenmasse des Schlamms, in Gramm;

md die Masse des Tiegels mit der geglühten Trockenmasse, in Gramm.

f der Umrechnungsfaktor, f =100 für die Angabe der Ergebnisse in % und f

=1000 für die Angabe in Gramm je Kilogramm.

ma bis md wurden jeweils auf 1 mg genau eingewogen.

Die Werte (wdr, ww, wv und wr) waren auf 0,1 % bzw. auf 1 g/kg zu runden.

3.4 Bestimmung der Zellzahl in der Biofilmsuspension

Für die Zellzahlbestimmung wurden 0,1 ml der Bakteriensuspension in 0,14 M

NaCl-Lösung im Volumenverhältnis 1:25 verdünnt. Die Auszählung der Zellen

erfolgte im Phasenkontrast-Mikroskop bei 400facher Vergrößerung in einer

Thoma-Zählkammer. Zur Ermittlung der Zellzahl pro ml wurden 20 Kleinquadrate

ausgezählt, der arithmetische Mittelwert gebildet und dieser mit dem

Kammerfaktor (4 x 106) multipliziert (Süßmuth et al., 1987).

40

Methoden

3.5 Bestimmung der Koloniezahl („heterotrophic plate count“, HPC)

Auf R2A-Platten (Fa. Difco) wurden jeweils 0,1 ml der Probe (unverdünnt bzw.

dezimale Verdünnungsreihe in Deionat) auf 2 – 3 Platten ausplattiert. Ziel war es,

Platten mit auswertbarem Bewuchs von 20 – 300 KBE pro Platte zu erhalten.

Hierfür mussten dementsprechend eine dezimale Verdünnungsreihe in Deionat

angesetzt werden. Die Platten wurden anschließend für 7 d bei 20 °C bebrütet.

Die Auszählung der Platten erfolgte bei 6 - 8facher Lupenvergrößerung, und das

Ergebnis wurde in KBE/ml oder KBE/cm2 angegeben. Für die Auswertung wurden

nur die Agarplatten mit 20 – 300 KBE berücksichtigt.

3.6 Isolierung von EPS

3.6.1 Isolierung von EPS aus Reinkulturbiofilmen

Der konfluente Bakterienrasen (siehe 3.1) wurde vorsichtig mit einem sterilen

Metallspatel abgeschabt und in steriler 0,14 M NaCl-Lösung im Gewichtsverhältnis

1:16 suspendiert. Die Suspension wurde für 30 min bei Raumtemperatur auf

einem Magnetrührer homogenisiert.

Zur Isolierung der EPS wurde die Bakteriensuspension 2 h bei 10 °C und

40 000 x g zentrifugiert. Danach wurde der Überstand durch Membranfilter aus

Celluloseacetat (0,20 µm Porenweite, Fa. Sartorius, Minisart) sterilfiltriert. Die

sterilfiltrierte Lösung (EPS-haltig) wurde dialysiert, um niedermolekulare

Verbindungen zu entfernen. Für die Dialyse wurde der Dialyseschlauch

(regenerierte Cellulose, Porenweite 25 Å, Ausschlussvolumen 12 000 –

14 000 g/mol, Fa. Serva, Visking dialysis tubing 20/32, Art.-Nr. 44110.02) durch

Kochen in Deionat vorbehandelt. Der sterilfiltrierte Überstand wurde über Nacht

gegen 2 x 5 l Deionat dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Volumen des

Dialysats bestimmt. Ein Teil des Dialysats wurde über Nacht gefriergetrocknet.

3.6.2 Isolierung von EPS aus Umweltproben mittels Zentrifugation

Die Probe wurde vor der Isolierung mindestens 30 min lang auf einem

Magnetrührer homogenisiert. Anschließend wurde die Suspension 20 min bei

41

Methoden

20 000 x g und 10 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde zur Entfernung restlicher

Mikroorganismen durch sterile Membranfilter (0,20 µm Porenweite) aus

Celluloseacetat filtriert. Die Lösung wurde dann gegen 2 x 5 l Deionat dialysiert.

3.6.3 Isolierung von EPS mit Kationenaustauscherharz nach Frølund et al.

(1996)

Vorbehandlung des Harzes:

Das Kationenaustauscherharz (Dowex 50 X 8, Na+-Form, stark sauer,

Teilchengröße 20 – 50 mesh, Fa. Fluka, Art.-Nr. 44445) wurde zur

Vorbehandlung eine Stunde lang in Isolierungspuffer (2 mM Na3PO4, 4 mM

NaH2PO4, 9 mM NaCl und 1 mM KCl, pH 7) gewaschen. Der Isolierungspuffer

wurde dekantiert und das feuchte Harz für die EPS-Isolierung verwendet.

Vorbereitung der Schlammproben:

Die Schlammprobe wurde für 1,5 h bei 4 °C (Eis-Wasser-Bad) zur

Sedimentation stehen gelassen. Zur Entfernung von Abwasserinhaltsstoffen

wurde ein Waschschritt durchgeführt. Der abgesetzte Belebtschlamm wurde

15 min bei 15 000 x g und 4 °C zentrifugiert. Die Probe wurde mit Isolierungspuffer

bis zum Originalvolumen resuspendiert.

EPS-Isolierung:

Etwa 300 ml Schlammprobe bzw. Biofilmsuspension wurden in ein 1 l

Becherglas (niedere Form) gegeben und 70 g Dowex /g TM zugegeben. Die

Suspension wurde bei 900 U/min und 4 °C für 2 h mit einem Rührwerk mit

Propellerrührer gerührt. Um das Kationenaustauscherharz zu entfernen, wurde die

Suspension 1 min bei 12 000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend

zweimal bei 12 000 x g und 4 °C für 15 min zentrifugiert, um Flockenbestandteile

zu entfernen.

Der so erhaltene flockenfreie Überstand (EPS-haltiges Extrakt) wurde

membranfiltriert (0,2 µm Porenweite) und ein Teil der Probe gefriergetrocknet.

42

Methoden

3.6.4 Isolierung von EPS mit Formaldehyd

Die Probe wurde vor der Extraktion auf einem Magnetrührer homogenisiert. Die

Endkonzentration der Probe wurde auf etwa 8 g/l TM eingestellt. 100 ml hiervon

wurden mit 0,6 ml Formaldehyd (37 %ig, Fa. J. T. Baker) bei 4 °C für 1 h gerührt.

Die Probe wurde bei 20 000 x g und 10 °C für 20 min zentrifugiert. Anschließend

wurde die Probe durch sterile Filter (0,20 µm Porenweite) aus Celluloseacetat

membranfiltriert. Niedermolekulare Bestandteile wurden durch Dialyse gegen 2 x

5 l Deionat entfernt.

3.6.5 Isolierung von EPS mit Formaldehyd und NaOH

Die Probe wurde vor der Extraktion auf einem Magnetrührer homogenisiert. Die

Konzentration der Probe wurde auf etwa 8 g/l TM eingestellt. 100 ml hiervon

wurden mit 0,6 ml Formaldehyd (37 %ig, Fa. J. T. Baker) bei 4 °C für 1 h gerührt.

Danach wurden 4 ml 1 N NaOH hinzugegeben und es wurde für weitere 3 h bei

4 °C gerührt. Die Probe wurde bei 20 000 x g und 10 °C für 20 min zentrifugiert.

Anschließend wurde die Probe durch sterile Filter (0,20 µm Porenweite) aus

Celluloseacetat membranfiltriert. Niedermolekulare Bestandteile wurden durch

Dialyse gegen 2 x 5 l Deionat entfernt.

3.6.6 Isolierung von EPS mit Kronenether

Die Probe wurde in Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 8) bis zu einer

Konzentration von 8 g/l TM verdünnt. Anschließend wurden 30 mM Kronenether

(Dicyclohexano-18-krone 6, Fa. Fluka) in Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 8)

hinzugegeben und 2 h bei 400 U/min auf einem Magnetrührer gerührt. Die

Suspension wurde für 20 min bei 20 000 x g und 10 °C zentrifugiert. Anschließend

wurde der Überstand membranfiltriert (Celluloseacetat, 0,2 µm Porenweite).

Niedermolekulare Bestandteile wurden durch Dialyse gegen 2 x 5 l Deionat

entfernt.

43

Methoden

3.7 Isolierung und Reinigung des Polysaccharids Alginat

Die Reinigung des Polysaccharids Alginat von P. aeruginosa SG81 erfolgte

modifiziert nach Wingender et al. (2001). Hierzu wurde die Bakteriensuspension

aus einer Vorkultur (24 h auf PIA, 36 °C) in 0,14 M NaCl-Lösung suspendiert. Die

Zellzahl wurde durch Vergleich mit dem McFarland Standard 1 (ca. 2 x 108

Zellen/ml) eingestellt. Jeweils 0,1 ml dieser Suspension wurden auf PIA-Platten

(25 ml Agar/Platte, Petrischalen mit Nocken) ausplattiert und 24 h bei 36 °C

bebrütet. Der konfluente Bakterienrasen wurde vorsichtig mit einem sterilen

Metallspatel abgeschabt und in ein Becherglas gegeben. Der Biofilm wurde im

Massenverhältnis 1:16 in steriler 0,14 M NaCl-Lösung suspendiert und unter

starkem Rühren (Magnetrührer, 1300 U/min) bei Raumtemperatur für mindestens

30 min homogenisiert. Die Biofilmsuspension wurde anschließend bei 40 000 x g,

10 °C für 2 h zentrifugiert. Restliche Zellen wurden durch Membranfiltration

(Celluloseacetat, 0,2 µm Porenweite) abgetrennt. Die so erhaltene EPS-Lösung

wurde in einem Eisbad langsam gerührt und die dreifache Menge an eiskaltem

vergälltem Ethanol zugegeben und 30 min gerührt. Das ausgefallene Präzipitat

wurde auf einer Filternutsche (Porosität 3, Schott) gesammelt und der Alkohol

abfiltriert. Dann wurde das Präzipitat auf der Nutsche zweimal mit eiskaltem

vergälltem Ethanol und einmal mit absolutem Ethanol gewaschen und im

Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet.

Das getrocknete Rohalginat wurde ausgewogen und zu 2,5 mg/ml in Tris/HCl-

Puffer (50 mM Tris, 2 mM MgCl2, pH 7,5) gelöst und anschließend mit 5 U/ml

(Endkonzentration) Benzonase (Fa. Merck) versetzt und bei 36 °C für 4 h

inkubiert. Hiernach wurde Proteinase K (Fa. Sigma) frisch in Tris/HCl-Puffer

angesetzt, sterilfiltriert und zu 5 µg/ml (Endkonzentration) der Rohalginat-Lösung

hinzugegeben und der Ansatz wurde 24 h bei 36 °C inkubiert.

Die Lösung wurde nach der abgeschlossenen Enzymbehandlung für 15 min bei

80 °C im Wasserbad erhitzt. Die erhaltene klare Lösung wurde einmal für 1 h und

dann über Nacht gegen 5 l Deionat dialysiert (Visking Dialyseschlauch, MWCO

12 000 – 14 000 Da, Fa. Serva) und letztlich gefriergetrocknet.

44

Methoden

3.8 Reinigung der kommerziell erhältlichen Polysaccharide Dextran und

Xanthan

Zur Reinigung der kommerziellen Polysaccharide wurden 2 g Polysaccharid in

100 ml Deionat gelöst und 30 min bei 40 000 x g zentrifugiert. Der Überstand

wurde nochmals 30 min bei 40 000 x g zentrifugiert und der dabei erhaltene

Überstand wurde zuerst für 1 h und dann über Nacht gegen 5 l Deionat dialysiert

(Visking Dialyseschlauch, MWCO 12 000 -14 000 Da, Serva) und anschließend

gefriergetrocknet.

3.9 Extraktion von Rhamnolipiden aus den EPS

Zur Extraktion der Rhamnolipide aus den EPS von P. aeruginosa wurden ca.

20 mg gefriergetrocknete EPS (Abschnitt 3.6.1) in ein Reaktionsgefäß aus

Kunststoff (Fa. Eppendorf) eingewogen und in 2 ml Deionat gelöst. Die Löslichkeit

der EPS konnte durch kurzzeitiges Erhitzen auf 60 °C im Wasserbad erhöht

werden. Von der Lösung wurden 300 µl in ein Reaktionsgefäß pipettiert, 600 µl

Diethylether wurden hinzugegeben und der Ansatz wurde kräftig geschüttelt. Die

Phasentrennung wurde durch einminütiges Zentrifugieren auf 13 000 x g

erleichtert. Danach wurde die etherische Phase vorsichtig mit einer Eppendorf-

Pipette abgenommen und in ein leeres Reaktionsgefäß pipettiert. Diese Extraktion

wurde mit weiteren 600 µl Diethylether wiederholt. Die vereinigten etherischen

Phasen wurden im Vakuum-Konzentrator bis zur Trockne eingeengt (für ca.

45 min bei etwa 40 °C).

3.10 Biochemisch-analytische Methoden

3.10.1 Bestimmung der Nachweisgrenze

Es wurden 20 Blindwerte (Deionat), die in der jeweiligen Bestimmungsmethode

wie die Proben behandelt wurden, gegen Deionat im Photometer gemessen. Aus

den gemessenen Absorptionen wurde der arithmetische Mittelwert berechnet und

auf die jeweilige Kalibriergerade bezogen. Der Messwert plus dreifache

Standardabweichung davon stellt den Wert der Nachweisgrenze dar (Kunze,

1990).

45

Methoden

3.10.2 Bestimmung des Kohlenhydratgehalts nach Dubois et al. (1956)

Reagenzien:

konz. Schwefelsäure

Phenol-Lösung: 5 % (w/v) Phenol in Deionat

Stammlösungen:

100 µg Dextran ml-1 Deionat

200 µg Alginat ml-1 Deionat

Durchführung:

Zu 0,5 ml Probe bzw. Deionat (Blindwert) wurden 0,5 ml Phenol-Lösung

gegeben und auf einem Reagenzglasschüttler gemischt. Dann wurden 2,5 ml

konz. Schwefelsäure hinzugegeben und wiederum gemischt. Es wurden jeweils

drei Ansätze hintereinander behandelt, da Phenol-Lösung und Schwefelsäure

möglichst schnell hintereinander zugegeben werden sollten. Die Ansätze wurden

nach 10 min bei Raumtemperatur für 15 min im Wasserbad bei 30 °C inkubiert.

Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden die Absorptionen aller Proben im

Photometer bei 480 nm (saure Polysaccharide, z.B. Alginat) oder 490 nm

(neutrale Polysaccharide, z. B. Dextran) gemessen. Die Proben wurden dreifach

angesetzt.

3.10.3 Bestimmung des Uronsäuregehalts

3.10.3.1 Bestimmung Uronsäuregehalts nach Blumenkrantz und Asboe-Hansen

(1973)

Reagenzien:

Lösung 1: 0,0125 M Natriumtetraborat-Decahydrat in konz. Schwefelsäure

Lösung 2: 0,15 % (w/v) m-Hydroxybiphenyl in 0,5 % (w/v) NaOH in Deionat

46

Methoden

Stammlösungen:

100 µg D-Glucuronsäure ml-1 Deionat


Durchführung:

Zu 0,2 ml Probe bzw. Deionat (Blindwert) wurden jeweils 1,2 ml Lösung 1 im

Eisbad zugegeben. Nach 10 min im Eisbad wurden die Ansätze auf dem

Reagenzglasschüttler gemischt und für 5 min bei 100 °C im Wasserbad erhitzt.

Dann wurden die Proben für 5 min im Eisbad abgekühlt und nachfolgend 20 µl der

Lösung 2 hinzugegeben. Die Proben wurden auf einem Reagenzglasschüttler

gemischt und nach 5 min bei Raumtemperatur wurde die Absorption aller Ansätze

bei 520 nm im Photometer gegen Deionat gemessen. Die Proben wurden dreifach

angesetzt.

3.10.3.2 Bestimmung des Uronsäuregehalts nach Filisetti-Cozzi und Carpita

(1991)

Reagenzien:

Lösung 1: 4 M Sulfaminsäure in Deionat mit gesättigter KOH-Lösung

(0,792 g ml-1 (w/v) Deionat) auf pH 1,6 eingestellt

Lösung 2: 0,075 M Natriumtetraborat-Decahydrat in konz. Schwefelsäure

Lösung 3: 0,15 % (w/v) m-Hydroxybiphenyl in 0,5 %iger (w/v) NaOH-Lösung

Stammlösungen:

100 µg D-Glucuronsäure ml-1 Deionat


Durchführung:

Zu 0,4 ml Probe bzw. Deionat (Blindwert) wurden jeweils 40 µl Lösung 1

pipettiert und auf dem Reagenzglasschüttler gemischt. Dann wurden 2,4 ml

Lösung 2 zugegeben und auf einem Reagenzglasschüttler gemischt.

Anschließend wurden die Ansätze für 20 min bei 100 °C im Wasserbad erhitzt.

Dann wurden die Proben für 5 min im Eisbad abgekühlt und es wurden 80 µl

47

Methoden

Lösung 3 hinzugegeben. Die Proben wurden auf dem Reagenzglasschüttler

gemischt und nach 10 min bei Raumtemperatur wurde die Absorption aller

Ansätze bei 525 nm im Photometer gegen Deionat gemessen. Die Proben wurden

dreifach angesetzt.

3.10.4 Bestimmung des Proteingehalts und Huminstoffgehalts

3.10.4.1 Bestimmung des Proteingehalts nach Lowry (Sigma)

Reagenzien:

Lösung 1: In 40 ml Deionat wurde der Inhalt des Lowry-Reagenzes (Fa. Sigma)

gelöst.

Lösung 2: Der Inhalt der Flasche Folin & Ciocalteus Phenolreagenz (V = 18 ml,

Fa. Sigma) wurde in eine braune Flasche (Arbeitslösung) überführt.

Die Flasche Folin & Ciocalteus Phenolreagenz wurde mit 10 ml

Deionat gespült und der Arbeitslösung hinzugegeben. Weitere 80 ml

Deionat wurden der Arbeitslösung hinzugegeben und gut gemischt.

Die so hergestellte Arbeitslösung Folin & Ciocalteus Phenolreagenz

wurde bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Stammlösung:

200 µg Rinderserumalbumin (Fa. Sigma) ml-1 Deionat

Durchführung:

Zu 1 ml Probe bzw. Deionat (Blindwert) wurde 1 ml Lösung 1 gegeben und es

wurde gut gemischt. Nach 20 min bei Raumtemperatur wurden 0,5 ml Lösung 2

hinzugegeben und sofort gemischt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die

Absorption aller Ansätze bei 750 nm im Photometer gemessen. Die Proben

wurden dreifach angesetzt.

48

Methoden

3.10.4.2 Bestimmung des Proteingehalts nach Lowry (modifiziert nach Frølund et

al. (1996))

Reagenzien:

Lösung 1: 0,143 M NaOH und 0,270 M Na2CO3 in Deionat

Lösung 2: 0,057 M Kupfersulfat (wasserfrei) in Deionat

Lösung 3: 0,124 M Natriumtartrat-Dihydrat in Deionat

Lowry-Reagenz: Lösung 1, 2 und 3 wurden im Volumenverhältnis 100:1:1

gemischt. Das Lowry-Reagenz wurde vor dem Gebrauch

jeweils frisch angesetzt

Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz: 2,5 ml des Folin-Ciocalteu-Phenolreagenzes

(Fa. Merck) wurden in 3 ml Deionat verdünnt.

Stammlösung:

100 µg Rinderserumalbumin (Fa. Sigma) ml-1 Deionat

Durchführung:

Zu 0,5 ml Probe bzw. 1 % (w/v) SDS-Lösung in Deionat (Blindwert) wurden

0,7 ml Lowry-Reagenz gegeben und auf einem Reagenzglasschüttler gemischt.

Nach 10 min bei Raumtemperatur wurden 0,1 ml Folin-Ciocalteus-Phenolreagenz

hinzugegeben und sofort gemischt. Nach 45 min bei Raumtemperatur wurde die

Absorption aller Ansätze bei 750 nm im Photometer gemessen. Die Proben

wurden dreifach angesetzt.

3.10.4.3 Kombinierte Bestimmung des Protein- und Huminstoffgehalts nach

Frølund et al. (1996)

Reagenzien:

Lösung A: 0,143 M NaOH und 0,270 M Na2CO3 in Deionat

Lösung B: 0,057 M Kupfersulfat-Pentanhydrat in Deionat

Lösung C: 0,124 M di-Natriumtartrat-dihydrat in Deionat

Lösung D: Deionat

49

Methoden

Arbeitsreagenz Proteinbestimmung (Lowry-Reagenz):

Lösung A, B und C im Verhältnis 100:1:1 (v/v/v, z. B. 40 ml + 0,4 ml + 0,4 ml)

mischen (vor Gebrauch frisch angesetzt).

Arbeitsreagenz Huminstoff-Bestimmung:

Lösung A, C und D im Verhältnis 100:1:1 (v/v/v, z. B. 40 ml + 0,4 ml + 0,4 ml)

mischen (vor Gebrauch frisch angesetzt).

Phenolreagenz:

5 ml Folin Ciocalteus Phenolreagenz (Fa. Merck) in 6 ml Deionat gelöst (im

Dunkeln aufbewahrt).

Stammlösungen:

- 100 µg BSA ml-1 1% SDS in Deionat (Dreipunktkalib.: 20/40/60 µg ml-1)

- 100 µg Huminsäure ml-1 Deionat (Dreipunktkalib.: 20/40/60 µg ml-1)

Durchführung der Proteinbestimmung:

Alle Proben wurden mit 1 % (w/v) SDS (Endkonzentration) versetzt.

Zu 0,5 ml Probe bzw. Deionat (mit 1 % (w/v) SDS) wurden 0,7 ml des

Arbeitsreagenzes (Proteinbest.) gegeben und vorsichtig gemischt. 20 min nach

der Zugabe des Lowry-Reagenzes zur ersten Probe wurden bei Raumtemperatur

0,1 ml Phenolreagenz hinzugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die

Absorption aller Ansätze bei 750 nm im Photometer gemessen. Alle Messungen

erfolgten jeweils gegen Deionat und alle Ansätze wurden dreifach bestimmt und

durch ihren Mittelwert angeben.

Durchführung der Huminstoff-Bestimmung:

Zu 0,5 ml Probe bzw. Deionat wurden 0,7 ml des Arbeitsreagenzes

(Huminstoffbest.) gegeben und vorsichtig gemischt. 20 min nach der Zugabe des

Arbeitsreagenzes (Huminstoffbest.) zur ersten Probe wurden bei Raumtemperatur

0,1 ml Phenolreagenz hinzugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde die




50

Methoden

Auswertung:

( )HuminProteinProtein AA1,25*A −×=

*A0,2A*A ProteinHuminHumin ×−=

A Protein*, korrigierte Protein-Absorption, A Humin*, korrigierte Huminstoff-Absorption

3.10.5 Bestimmung des DNA-Gehalts mit DAPI (modifiziert nach Brunk (1979))

Reagenzien:

DAPI-Stammlösung:

55 µg ml-1 4’, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in sterilfiltriertem (0,20 µm)

Deionat gelöst (vor Licht geschützt im Kühlschrank aufbewahrt).

DAPI-Arbeitslösung:

5,5 µg ml-1 DAPI-Stammlösung wurden in Tris/HCl-Puffer gelöst.

Tris/HCl-Puffer:

1,566 g NaCl, 0,818 g EDTA (Fa. Merck) und 0,339 g Tris wurden in etwa

180 ml Deionat gelöst und mit 4 M HCl wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

Die Lösung wurde mit Deionat auf 200 ml aufgefüllt und im Kühlschrank

gelagert.

DNA-Stammlösung:

Etwa 200 µg ml-1 DNA (Fa. Merck) wurden in Deionat (sterilfiltriert) gelöst.

DNA-Arbeitslösung:

DNA-Stammlösung wurde 1:10 (v/v) in sterilfiltriertem Deionat verdünnt

Durchführung:

Am Fluorimeter wurden folgende Parameter eingestellt:

λex = 360 nm (Anregungswellenlänge)

λem = 450 nm (Emissionswellenlänge).

Reagenzgläser aus Kunststoff, die mit Alufolie umwickelt sind, wurden für alle

Lösungen verwendet.

51

Methoden

Zur Einstellung der relativen Fluoreszenz („relative fluorescence“) am

Fluorimeter wurden 2,25 ml Tris/HCl-Puffer, 0,3 ml DAPI-Arbeitslösung, 0,45 ml

Deionat, 75 µl Probenlösung und 75 µl DNA-Arbeitslösung gemischt und in einer

Vollküvette ins Fluorimeter gegeben. Die relative Fluoreszenz dieser Probe wurde

am Fluorimeter auf den Wert 150 gesetzt.

2,25 ml Tris/HCl-Puffer, 0,3 ml DAPI-Arbeitslösung und 0,45 ml Deionat wurden

in einer Vollküvette vorgelegt. Die Blindwertkorrektur („autoblank“) wurde am

Fluorimeter vorgenommen. 15 µl der Probenlösung wurden zugegeben, die

Lösung durch mehrmaliges Aufziehen und Auslassen einer 1 ml Kolbenhubpipette

gemischt und die Fluoreszenzintensität gemessen. Weitere 4 Aliquote (je 15 µl)

der Probenlösung wurden wie oben beschrieben hinzugegeben und jeweils die

Fluoreszenzintensität gemessen. Dann wurden 4 Aliquote (je 15 µl) der DNA-

Arbeitslösung wie oben beschrieben zugegeben und jeweils die

Fluoreszenzintensität nach Zugabe gemessen.

Die Eigenfluoreszenz der Proben wurde ohne DAPI-Arbeitslösung gemessen.

Hierzu wurden zu 2,25 ml Tris/HCl-Puffer 0,75 ml Deionat gegeben. Nach der

Blindwertkorrektur wurden nacheinander jeweils 15 µl Aliquote der Probe

hinzugegeben und die Fluoreszenzintensität bestimmt.

Aus den Messpunkten ergaben sich durch lineare Regression drei Geraden

(Eigenfluoreszenz, Probe, DNA-Standard), durch deren Steigung die unbekannte

Nucleinsäure-Konzentration der Probe berechnet wurde.

3.10.6 Bestimmung des Acetylgruppengehalts (modifiziert nach Hestrin (1949))

Reagenzien:

Lösung 1:

1 Volumen 2 M Hydroxylamin in Deionat gelöst wurde mit 1 Volumen 3,5 M

NaOH gemischt (vor Gebrauch frisch angesetzt).

Lösung 2:

12,5 % (v/v) HCl wurden in Deionat gelöst.

Lösung 3:

0,37 M FeCl3 x 6H2O (Fa. Merck) wurden in HCl (0,1 M) gelöst.

52

Methoden

Stammlösung:

5 mM Acetylcholinchlorid (Fa. Sigma) wurden in Natriumacetat-Puffer (1 mM

Natriumacetat, pH 4,5; Verdünnungsreihe: 0 /1,25 /2,5 /5 mM) gelöst.

Durchführung:

0,5 ml Probe (2 mg/ml Alginat; gelöst in 1 mM Natriumacetat-Puffer, pH 4,5)

bzw. Deionat (Blindwert) wurde mit 1 ml der Lösung 1 vermischt. Nach 1 min

Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die Zugabe von 0,5 ml Lösung 2. Nach

kurzem Durchmischen wurden 0,5 ml Lösung 3 zugegeben und sofort die




3.10.7 Bestimmung des Rhamnolipidgehalts

Der Rhamnolipidgehalt in den gefriergetrockneten EPS wurde mit der Orcinol-

Methode modifiziert nach Chandrasekaran und BeMiller (1980) bestimmt. Hierzu

wurden die Rhamnolipide vorher mit Diethylether extrahiert (Abschnitt 3.9).

Danach wurden 100 µl Deionat, 100 µl Orcinol-Lösung (1,6 % w/v in Deionat) und

800 µl Schwefelsäure-Lösung (60 % v/v) hinzugegeben und gründlich gemischt.

Nach 30 min Inkubation bei 80 °C und weiteren 10 min bei Raumtemperatur wurde

die Absorption aller Proben bei 421 nm im Photometer gemessen. Die

Rhamnolipid-Konzentration wurde durch Vergleich mit einer Rhamnose-

Standardreihe und der Umrechnung auf den Rhamnolipid-Anteil bestimmt (1 mg

Rhamnose ≅ 2,5 ± 0,5 mg Rhamnolipid).

53

Methoden

3.10.8 Bestimmung der Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

(modifiziert nach Ng und Dawes (1973))

Reagenzien:

Substratlösung:

0,5 ml 120 mM Tris/HCl-Puffer (pH 8,6), 0,375 ml frisch hergestellte 20 mM

Glucose-6-phosphat-Lösung, 0,25 ml 10 mM β-NADP-Lösung, 0,09 ml 250 mM

MgCl2-Lösung und 0,235 ml Deionat wurden gelöst.

Durchführung:

Es wurden 50 µl Probelösung und 1,45 ml Substratlösung gemischt und bis zu

60 min bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Während dieser Zeit wurde die

Zunahme der Absorption bei 340 nm alle 15 min gemessen. Eine kommerzielle

Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroides, Fa.

Sigma) wurde zu 1 µg/ml in Deionat gelöst und als Positivkontrolle parallel in

gleicher Weise behandelt.

3.10.9 Enzym-gekoppelter Lektin-Bindungs-Assay

Die Bindung des Lektins ConA an Alginat wurde mit Hilfe eines Enzym-

gekoppelten Lektin-Bindungs-Assays modifiziert nach Leriche et al. (2000)

untersucht. Dazu wurden Serienverdünnungen von 100 µl Alginatlösungen in

0,14 M NaCl-Lösung von 1 mg/ml bis zu 0,0036 mg/ml in die Vertiefungen von

sterilen Mikrotiterplatten mit 96 Kavitäten (Polystyrol, Fa. Nalgene Nunc) gefüllt

und für 20 h bei 36 °C inkubiert. Es wurden mindestens Dreifachbestimmungen

durchgeführt. Anschließend wurden die Vertiefungen mit 200 µl Deionat gespült

und es wurden 100 µl Peroxidase-ConA-Lösung (10 µg/ml in 10 mM Phosphat-

Puffer, pH 7,5 mit 0,05 % (v/v) Tween 20) zugegeben. Vertiefungen ohne Probe

wurden in gleicher Weise behandelt, um unspezifische Lektin-Bindungen an die

Mikrotiterplatten zu bestimmen. Nach Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur

wurden die Platten nacheinander dreimal mit 100 µl Phosphat-Puffer gewaschen.

Das gebundene Lektin wurde durch Bestimmung der Peroxidase-Aktivität

quantifiziert. Dazu wurden 100 µl 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-

54

Methoden

sulfonsäure)-Substratlösung (ABTS, Fa. Sigma) in die Vertiefungen gegeben.

Nach Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln wurde die Reaktion

durch Zugabe von 100 µl Natriumdodecylsulfat-Lösung (1 % w/v) gestoppt und die

Absorption bei 405 nm in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bestimmt. Proben

ohne Lektinzugabe wurden in gleicher Weise behandelt, um die intrinsische

Peroxidase-Aktivität der Proben zu berücksichtigen.

3.11 Chromatographische Methoden für die Polysaccharidanalytik

3.11.1 Hydrolyse von Polysacchariden


Haug und Larsen (1962))

Es wurden 25 mg des zu untersuchenden Polysaccharids in gefriergetrockneter

Form mit 0,347 ml H2SO4 (80 %ig) in einer Glasampulle (im Eisbad) versetzt und

anschließend 18 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach der Zugabe von

4,64 ml Deionat (im Eisbad zugeben; c(H2SO4) = 2 N) wurde die zugeschmolzene

Ampulle 5 h im Wasserbad gekocht. Die Lösung wurde mit festem CaCO3

neutralisiert und über einen Papierfilter filtriert. Durch Membranfiltration (0,2 µm

Porenweite) konnten restliche Partikel entfernt werden. Das Hydrolysat wurde im

Kühlschrank aufbewahrt.


Anzai et al. (1990))

Es wurden 10 mg des uronsäurehaltigen Polysaccharids in 0,5 ml kalter

80 %iger H2SO4 gelöst und die Lösung wurde 30 min in einem Eisbad leicht

geschüttelt. Dann wurde die Lösung für 3 h bei 30 °C inkubiert. Nach der Zugabe

von 6,5 ml kaltem Deionat (Verdünnung der Lösung auf 2 N H2SO4) wurde 2 h im

Wasserbad gekocht. Die Neutralisation des Hydrolysats wurde mit

Bariumhydroxid-Lösung (2,6 g auf 45 ml) vorgenommen und der Niederschlag

über eine Filternutsche abfiltriert. Durch Membranfiltration (0,2 µm Porenweite)

55

Methoden

konnten restliche Partikel entfernt werden. Der pH-Wert der Lösung wurde

neutralisiert.

3.11.1.3 Hydrolyse von neutralen Polysacchariden mit Trifluoressigsäure

(modifiziert nach De Swaaf et al. (2001))

Für die Hydrolyse wurden 3 mg gefriergetrocknete Polysaccharide mit 1 ml 2 M

Trifluoressigsäure versetzt und die Suspension wurde bei 100 °C für 2 h im

Wasserbad gekocht. Bei 40 °C im Wasserstrahlvakuum wurden die Proben bis zur

Trockne eingeengt und anschließend mit 0,5 ml 1 M NH4OH-Lsg. gewaschen. Die

Proben wurden wiederum getrocknet und in 1 ml Deionat aufgenommen. Die

neutralisierten Hydrolysate wurden im Kühlschrank aufbewahrt.

3.11.1.4 Hydrolyse von Polysacchariden mit Salzsäure

Für die Hydrolyse von neutralen Polysacchariden wurde mit 0,1 M HCl bei

100 °C für 48 h hydrolysiert. Aminozucker enthaltende Polysaccharide wurden mit

4 M HCl bei 100 °C 16 h lang hydrolysiert.

3.11.2 Dünnschichtchromatographie

3.11.2.1 Dünnschichtchromatographie von Neutralzuckern (modifiziert nach

Batisse et al. (1992))

Das Laufmittel (Acetonitril: Amylalkohol: Wasser, 60: 20: 20, v/v/v) wurde

mindestens 1 h vor dem Lauf in die Chromatographie-Kammer gegeben. Ein

Stück Whatman-Papier wurde zur Unterstützung der Sättigung in die Kammer

gestellt. Es wurden 2- 15 µl der Proben, gelöst in Deionat oder Ethanol, auf die

DC-Platte 1,5 cm vom unteren Rand und 1,0 cm zueinander entfernt aufgetragen.

Die Platte (Kieselgel60 HPTLC Platten 10 x 10 cm, Fa. Merck) wurde vorsichtig in

die Kammer gestellt und dreimal für ca. 30- 40 min entwickelt. Zwischen den

Läufen wurde die Platte jedes Mal mindestens 15 min lang luftgetrocknet. Nach

der dritten Trocknung der DC-Platte wurde diese mit dem Derivatisierungs-

Reagenz (30 mg N-(-1-Naphthyl)ethylendiamin-dihydrochlorid in 10 ml 5 %iger

56

Methoden

Schwefelsäure (v/v in Methanol) vorsichtig aus ca. 40 cm Entfernung besprüht.

Dabei war darauf zu achten, dass nur feinste Tröpfchen auf die Platte gelangten

und keine Durchnässung der Platte erfolgte. Die Platte wurde anschließend für

10 min bei 100 °C auf einem DC-Plattenheizer (Fa. Camag) unter dem Abzug

getrocknet.

Die DC-Platte wurde vor dem Verblassen der Spots mittels Flachbettscanner zur

Dokumentation eingescannt.

3.11.2.2 Dünnschichtchromatographie von Uronsäuren (modifiziert nach

Wingender und Winkler (1984))

Das Laufmittel (Ethylacetat: Essigsäure: Pyridin: Wasser, 5:1:5:3, v/v/v/v) wurde

mindestens 1 h vor dem Lauf in die DC-Kammer gegeben. Ein Stück Whatman-

Papier wurde zur Unterstützung der Sättigung in die Kammer gestellt.

Es wurden 5 - 15 µl der Proben (gelöst in Deionat oder Ethanol) auf die DC-Platte

(Kieselgel60 HPTLC Platten 10 x 10 cm, Fa. Merck) 1,5 cm vom unteren Rand und

1,0 cm zueinander entfernt aufgetragen. Die Platte wurde vorsichtig in die

Kammer gestellt und dreimal für ca. 60 min jeweils bis 0,5 cm vom oberen Rand

der Platte entwickelt. Zwischen den Läufen wurde die Platte jedes Mal mindestens

15 min lang luftgetrocknet. Nach der dritten Trocknung der DC-Platte wurde diese

mit dem Derivatisierungs-Reagenz (1 % v/v p-Anisidiniumchlorid in 1-Butanol)

vorsichtig aus ca. 40 cm Entfernung besprüht. Dabei war darauf zu achten, dass

nur feinste Tröpfchen auf die Platte gelangten und keine Durchnässung der Platte

erfolgte. Die Platte wurde anschließend für 10 min bei 130 °C auf dem DC-

Plattenheizer unter dem Abzug getrocknet.

Die DC-Platte wurde vor dem Verblassen der Spots mittels Flachbettscanner zur

Dokumentation eingescannt.

57

Methoden

3.11.2.3 Dünnschichtchromatographie von Rhamnolipiden (modifiziert nach

Syldatk et al. (1985b))

Das Laufmittel (Chloroform: Methanol: Essigsäure, 65: 15: 2, v/v/v) wurde

mindestens 1 h vor dem Lauf zur in die DC-Kammer gegeben. Ein Stück

Whatman-Papier wurde zur Unterstützung der Sättigung in die Kammer gestellt.

Alle zuvor mit Diethylether extrahierten Proben werden mit jeweils 15 µl

Chloroform aufgenommen und auf die DC-Platte aufgetragen.

Die Platte (Kieselgel60 HPTLC Platten 20 x 20 cm, Fa. Merck) wurde vorsichtig in

die Kammer gestellt und für ca. 40 min einmal entwickelt. Nach der Trocknung der

DC-Platte wurde diese mit dem Derivatisierungs-Reagenz (75 mg Orcinol, 21 ml

Deionat, 4,2 ml Schwefelsäure, konz.) vorsichtig aus ca. 40 cm Entfernung

besprüht. Dabei war darauf zu achten, dass nur feinste Tröpfchen auf die Platte

gelangten und keine Durchnässung der Platte erfolgte. Die Platte wurde

anschließend für 10 min bei 110 °C auf dem DC-Plattenheizer unter dem Abzug

getrocknet.

Die DC-Platte wurde vor dem Verblassen der braunen Rhamnolipid-Spots

mittels Flachbettscanner zur Dokumentation eingescannt.

3.11.3 Säulenchromatographie

3.11.3.1 Gelfiltration

Vorgequollenes Sephacryl S-500 HR (Fa. Amersham Pharmacia) wurde als

Gelmaterial für die Gelfiltration eingesetzt. Das Gelmaterial wurde in Tris/HCl-

Puffer (50 mM Tris, 0,2 M NaCl, pH 8,0) im Volumenverhältnis 1:3 suspendiert und

am Wasserstrahlvakuum entgast.

• Packen der Säule

Das Packen der Säule (0,8 cm x 40 cm) erfolgte nach der Anleitung des

Herstellers. Hierbei wurde das Gelmaterial bei den Säulen mit einem Durchmesser

von 0,8 cm wurde für 2 h bei 12 ml/h und dann 1 h lang mit einer Flussrate von

18 ml/h gepackt. Die Gelbetthöhe betrug anschließend etwa 40 cm.

58

Methoden

• Elution

Das Gelmaterial wurde vor dem Lauf mit ca. 60 ml Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris,

0,2 M NaCl, pH 8) äquilibriert. Im vorliegenden Fall wurden jeweils 1 ml Probe (ca.

1 mg/ml) auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Tris/HCl-Puffer (50 mM

Tris, 0,2 M NaCl, pH 8) bei einer Flussrate von 6 ml/h eluiert. In allen Fraktionen

(V = 0,8 ml) wurde der Kohlenhydratgehalt (3.10.2) bestimmt. Das

Ausschlussvolumen der Säule wurde mit hochmolekularem Dextran (5 – 40 x

106 Da, Fa. Sigma) bestimmt.

• Konservierung der Säule

Um eine Verkeimung der Säule zu verhindern, wurde das Gelmaterial nach

jedem Lauf mit dem zweifachen Säulenvolumen an Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris,

0,2 M NaCl, 0,02 % (w/v) NaN3, pH 8) gespült und darin aufbewahrt.

3.11.3.2 Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose CL-6B

Vorgequollene DEAE-Sepharose CL-6B (Fa. Amersham Pharmacia) wurde als

Gelmaterial für die Anionenaustauschchromatographie eingesetzt. Das

Gelmaterial wurde in Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5) im Volumenverhältnis

1:3 suspendiert und am Wasserstrahlvakuum entgast.


Das Packen der Säule (1,6 cm x 40 cm) mit DEAE-Sepharose CL-6B erfolgte

nach der Anleitung des Herstellers. Die Gelbetthöhe betrug 31 cm bei einem

Säulendurchmesser von 1,6 cm.

• Elution

Der Anionenaustauscher wurde vor dem Lauf mit ca. 100 ml Tris/HCl-Puffer

(50 mM Tris, pH 7,5) bei einer Flussrate von 20 ml/h äquilibriert. Im vorliegenden

Fall wurden 20 ml EPS (51 mg) auf die Säule aufgetragen. Das Fraktionsvolumen

betrug 5 ml. Die Säule wurde zuerst mit 50 ml Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5)

59

Methoden

und anschließend mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 – 1 M NaCl

in 400 ml Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris, pH 7,5) eluiert. In allen Fraktionen wurden

die Leitfähigkeit und der Kohlenhydratgehalt (3.10.2) bestimmt.



jedem Lauf mit dem zweifachen Säulenvolumen an Tris/HCl-Puffer (50 mM Tris,

0,02 % (w/v) NaN3, pH 7,5) gespült und darin aufbewahrt.

3.11.3.3 Affinitätschromatographie an ConA-Sepharose

Eine Affinitätschromatographie von gereinigtem Bakterienalginat wurde an dem

an Sepharose 4B gebundenen Lektin Concanavalin A (ConA) durchgeführt (ConA-

Sepharose, Fa. Amersham Pharmacia). Das Gelmaterial wurde in Elutionspuffer 1

(50 mM Phosphat-Puffer, 0,5 M NaCl, pH 7,5) im Volumenverhältnis 1:3

suspendiert und am Wasserstrahlvakuum entgast.

Folgende Pufferlösungen wurden verwendet:

- Bindungs-Puffer: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5);

- Elutions-Puffer 1: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit 0,5 M NaCl;

- Elutions-Puffer 2: (nicht autoklaviert): 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit

0,5 M NaCl und 0,2 M Methyl-D-mannosid;

- Regenerierungs-Puffer 1: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 8,5) mit 0,5 M NaCl;

- Regenerierungs-Puffer 2: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 4,5) mit 0,5 M NaCl;

- Konservierungs-Puffer: 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5) mit 0,5 M NaCl und

0,01 % (w/v) Thimerosal.


Das vorgequollene Gelmaterial wurde 10-mal mit je einem Säulenvolumen des

Bindungs-Puffers gewaschen und das Gel/Puffer-Verhältnis anschließend auf ca.

3:1 eingestellt und die Gelsuspension am Wasserstrahlvakuum entgast. Die so

vorbereitete Gelsuspension wurde unter Verwendung eines Packreservoirs in eine

60

Methoden

Säule mit 10 mm Durchmesser gefüllt. Das Packen erfolgte mit 120 ml Bindungs-

Puffer bei einer Flussrate von 60 ml/h. Anschließend wurde mit 80 ml Bindungs-

Puffer bei 40 ml/h äquilibriert. Das fertige Gelbett hatte eine Höhe von 8 cm und

ein Volumen von 6,3 ml.

• Elution

Vor der Probenaufgabe wurde die Säule zunächst mit 15 ml Bindungs-Puffer

bei 40 ml/h äquilibriert. Etwa 10 mg des zu untersuchenden Polysaccharids

wurden im Bindungs-Puffer gelöst (max. 2,5 mg/ml) und direkt auf das Gel

gegeben und einsickern lassen. Nachher wurde mit 15 ml Bindungs-Puffer bei

40 ml/h eluiert. Fraktionen mit einem Volumen von je 1 ml wurden gesammelt.

Die Elution erfolgte mit 15 ml Elutions-Puffer 1 und 15 ml Elutions-Puffer 2,

jeweils bei 40 ml/h Flussrate. In den einzelnen Fraktionen wurde der

Kohlenhydratgehalt bestimmt (3.10.2). Für Fraktionen, die mit dem Methyl-D-

mannosid-haltigem Puffer eluiert wurden, erfolgte die Kohlenhydratbestimmung

nach Dialyse (Visking Dialyseschlauch, MWCO 12 000 – 14 000 Da, Fa. Serva)

der Fraktionen gegen zuerst 1 l und über Nacht jeweils gegen 5 l Deionat.

Nach jedem Lauf erfolgte eine Regenerierung des Säulenmaterials durch

abwechselndes Waschen (bei 40 ml/h) mit jeweils dreimal 15 ml Regenerierungs-

Puffer 1 und dreimal 15 ml Regenerierungs-Puffer 2. Abschließend wurde das

Gelmaterial mit 30 ml Bindungs-Puffer gespült.



erfolgter Regenerierung mit 10 ml Konservierungs- Puffer bei einer Flussrate von

40 ml/h gespült und darin aufbewahrt.

3.12 Infrarot-Spektroskopie

Die Infrarot-Spektroskopie wurde im Transmissions-Modus von

gefriergetrockneter EPS auf gepressten klaren Scheiben aus Zinkselenid

durchgeführt. Hierfür wurden IR-durchlässige Scheiben aus etwa 100 mg ZnSe mit

einem Überdruck von 70 – 100 MPa gepresst. Von einer Lösung aus 1-2 mg

61

Methoden

gefriergetrockneter EPS in Deionat wurden 35 µl auf die Scheibe aufgetragen und

im Vakuum zu einem transparenten Film getrocknet. Anschließend wurde der

Probenträger in einer KBr-Scheibe verschlossen und in das IR-Spektrometer

eingeführt. Die Aufnahme der Infrarot-Spektren der getrockneten EPS-Proben

erfolgte im Wellenzahlbereich von 4000 cm-1 bis 500 cm-1 mit einer Auflösung von

1,9 cm-1. Von jeder Probe wurden drei Parallelmessungen mit jeweils 64

koaddierten Scans durchgeführt. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit dem

Softwareprogramm OPUS (Version 2.0, Fa. Bruker).

3.13 Eindimensionale Gelelektrophorese

Die elektrophoretische Analyse von Proteinen erfolgte unter denaturierenden

Bedingungen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

(SDS-PAGE) unter Verwendung des diskontinuierlichen Puffersystems nach

Laemmli (1970). Es wurden Tris-Glycin-Gele (8 cm x 8 cm) mit 12 % (w/v)

Acrylamid/ 2,6 % (w/v) Bisacrylamid und Gradientengele mit 4 % bis 20 % (w/v)

Acrylamid verwendet. Die Proben wurden in Probenpuffer mit 2 % (w/v) SDS in

An- oder Abwesenheit von 50 mM Dithiotreitol für 5 min bei 85 °C vorbehandelt.

Die SDS-PAGE erfolgte bei einer konstanten Spannung von 125 V. Die

Visualisierung der Proteine erfolgte mittels Silberfärbung (SilverXpress Silver

Staining Kit, Fa. Novex) nach Anleitung des Herstellers.

62

Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1 Charakterisierung der Biofilme aus Reinkulturen von Pseudomonas

aeruginosa

Es wurde der mucoide Stamm P. aeruginosa SG81 verwendet, von dem bereits

bekannt ist, dass er Alginat-haltigen Schleim produziert (Grobe et al., 1995). Die

Anzucht der Modellbiofilme von P. aeruginosa SG81 erfolgte auf Oberflächen von

Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA; s. Abschn. 3.1 und 3.6.1). Es bildete sich ein

konfluenter Bakterienrasen bereits nach einer Bebrütungsdauer von 24 h an der

Grenzfläche Agarmedium – Luft aus („ungesättigter“ Biofilm, Wingender et al.,

2001; Steinberger et al., 2002). Der Biofilm wurde vorsichtig von der Agar-

oberfläche abgenommen und in NaCl-Lösung homogenisiert. Die Abtrennung der

Bakterien von den EPS erfolgte durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation und

anschließender Sterilfiltration der Überstände (EPS-haltige Lösungen). Eine Lysis

der Zellen, durch diese Methode hervorgerufen, konnte ausgeschlossen werden.

Die Aktivität des strikt intrazellulären Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase

(3.10.8) konnte in der EPS-Lösung nicht nachgewiesen werden. Die Analyse der

isolierten EPS wurde mit biochemischen Quantifizierungsmethoden und

säulenchromatographischen Methoden durchgeführt.

4.1.1 Quantitative Zusammensetzung des Biofilms und der EPS

Die EPS-Komponenten wurden nach der Dialyse gegen Deionat in Lösung

gemessen und auf die Trockenmasse im Biofilm bezogen (Tabelle 6). Für die

Bestimmung der prozentualen Anteile (% (w/w)) der EPS-Bestandteile wurden die

Proben dialysiert und Lösungen aus zuvor gefriergetrockneter EPS angesetzt.

Zum Nachweis von Kohlenhydraten, Uronsäuren, Proteinen und Acetylgruppen

wurden photometrische Methoden bzw. eine fluorimetrische Methode für den

Nachweis von Nucleinsäuren (DNA) verwendet. Huminstoffe wurden in den EPS-

Proben von P. aeruginosa nicht bestimmt, da es sich um Reinkulturen aus dem

Labor handelt, und somit keine Huminstoffe in den Proben zu erwarten sind. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Vergleichend wurde der Gehalt im Biofilm

und in den EPS angegeben.

63

Ergebnisse

Im Biofilm und in den EPS bilden die Kohlenhydrate den größten Anteil an den

Biopolymeren. Die Uronsäuren sind eine Teilmenge der Kohlenhydrate. Die aus

Biofilmen auf PIA isolierten EPS bestehen zu 73 % (w/w) aus Kohlenhydraten,

davon sind anteilsmäßig ca. 84 % Uronsäuren (Alginat; Grobe et al. 1995). Die

Proteine haben einen Anteil von 29 % (w/w) an den EPS. Nucleinsäuren konnten

nicht in den EPS nachgewiesen werden. Der Acetylgehalt, der auf Acetylgruppen

an Mannuronat-Einheiten des Alginats zurückzuführen ist, lag bei 7 % (w/w).

Tabelle 6: Zusammensetzung des Biofilms und der EPS von P. aeruginosa SG81 nach

Kultivierung auf PIA für 24 h bei 36 °C

Kohlenhydrate Uronsäuren Proteine Nucleinsäuren Acetylgehalt (mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) Biofilm 367,6 ± 12,5 241,7 ± 2,9 343,6 ± 55,5 n. b. n. b.

263,8 ± 15,1 220,3 ± 14,8 99,1 ± 0,9 25,2 ± 1,1 EPS

69,8 % (w/w) 60,8 % (w/w) 28,6 % (w/w) n. n.

7,0 % (w/w) TM, Trockenmasse des Biofilms; % (w/w), Gewichtsprozent im Lyophilisat; n. b., nicht bestimmt; n. n., nicht nachgewiesen. Die Quantifizierung der einzelnen Bestandteile erfolgte mit photometrischen bzw. fluorimetrischen Assays; für die Analytik der Proteine wurde der Lowry-Assay (3.10.4.1) verwendet (n = 3).

4.1.2 Zeitliche Dynamik der EPS-Zusammensetzung bei P. aeruginosa

Biofilmen

Die zeitliche Dynamik der EPS-Zusammensetzung wurde ebenfalls an den

Modellbiofilmen von P. aeruginosa SG81 untersucht. Hierfür wurden die Biofilme

von P. aeruginosa bis zu 7 d bei 36 °C auf Pseudomonas Isolierungs-Agar

angezüchtet (3.1). Die Zellzahl im Biofilm wurde durch Partikelzählung in der

Thoma-Zählkammer ermittelt. Die Bestimmung der EPS-Bestandteile wurde in

zellfreien dialysierten Lösungen durchgeführt.

Nach einer Anzuchtdauer von 24 h betrug die Zellzahl im Biofilm den Wert 3,0 x

1011 Zellen/ g TM (Abbildung 5, links). Die Zellzahl nahm bei längerer Bebrütung

des Biofilms auf 2,5 x 1011 Zellen/ g TM bei 48 h, 1,8 x 1011 Zellen/ g TM bei 72 h

und dann auf 5,4 x 1010 Zellen/ g TM bei 7 d ab. Die Trockenmasse im Biofilm

nahm hingegen mit zunehmender Dauer der Anzucht des Biofilms zu (Abbildung

5, rechts). Nach 24 h Bebrütungsdauer betrug die Trockenmasse 4,4 % TM/ g

64

Ergebnisse

Feuchtmasse (FM) im Biofilm. Sie nahm zu auf 5,2 % TM/ g FM bei 48 h und

5,3 % TM/ g FM bei 72 h und nach 7 d Anzucht nahm sie auf 6,3 % TM/ g FM zu.

Die zeitliche Entwicklung der Trockenmasse im Biofilm (Abbildung 5 rechts)

könnte daran liegen, dass der Wassergehalt im Biofilm aufgrund der relativ langen

Bebrütungsdauer durch Verdunstung etwas abnimmt. Es ist aber auch möglich,

dass die Zunahme an Trockenmasse auf die vermehrte EPS-Bildung

zurückzuführen ist.

Trockenmasse

0

1

2

3

4

5

6

7

24 h 48 h 72 h 168 h

% T

M/ g

FM

Zellzahl

0

5

10

15

20

25

30

35

24 h 48 h 72 h 168 h

x 10

10 Z

elle

n/g

TM

Abbildung 5: Zeitlicher Verlauf der Zellzahl und der Trockenmasse im Biofilm von P. aeruginosa während der Kultivierung auf PIA bei 36 °C.

Die Zusammensetzung von Biofilm und EPS mit zunehmender Dauer der

Anzucht der Biofilme ist in Abbildung 6 bezogen auf die Trockenmasse im Biofilm

dargestellt. Im Biofilm ist für den Kohlenhydrat- und Uronsäuregehalt ein

uneinheitlicher Trend zu beobachten. Nach 7 Tagen Bebrütung hat sich die

Konzentration der Kohlenhydrate im Biofilm kaum verändert. In den EPS nimmt

die Konzentration der Kohlenhydrate und Uronsäuren mit zunehmender

Bebrütungsdauer zu (Abbildung 6 rechts). Für die Proteine hingegen wurde eine

Abnahme der Konzentration sowohl im Biofilm, als auch in den EPS

nachgewiesen. Somit wird im Biofilm bei länger werdender Bebrütung mehr

Alginat produziert. Vermutlich könnte dies eine Auswirkung von zunehmendem

Nährstoffmangel im Agarnährmedium, besonders nach 7 Tagen Bebrütung, sein.

65

Ergebnisse

Abbildung 6: Zeitlicher Verlauf der Zusammensetzung des Biofilms und der EPS von P. aeruginosa bezogen auf die Trockenmasse im Biofilm. Die Kultivierung der Bakterien erfolgte auf PIA bei 36 °C.

EPS

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

24 h 48 h 72 h 168 h

Kohlenhydrate UronsäurenProteine

Biofilm

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

24 h 48 h 72 h 168 h

EPS-

Kom

pone

nte

(µg/

109 Z

elle

n)

Abbildung 7: Zeitlicher Verlauf der Zusammensetzung des Biofilms und der EPS von P. aeruginosa bezogen auf die Zellzahl im Biofilm. Die Kultivierung der Bakterien erfolgte auf PIA bei 36 °C.

Bezogen auf die Zellzahl im Biofilm nehmen die Konzentrationen an Kohlenhy-

draten, Proteinen und Uronsäuren im Biofilm mit zunehmender Bebrütungsdauer

zu (Abbildung 7). Nach 7 Tagen Bebrütungsdauer ist eine starke Zunahme der

Polysaccharide im Biofilm deutlicher erkennbar, wobei für die Proteinkonzentration

EPS

0

50

100

150

200

250

300

350

400

24 h 48 h 72 h 168 h

Zeit (h)

Kohlenhydrate Uronsäuren

Proteine

Biofilm

0

50

100

150

200

250

300

350

400

24 h 48 h 72 h 168 h

Zeit (h)

EPS-

Kom

pone

nte

(mg/

g TM

)

66

Ergebnisse

die Zunahme nach 7 Tagen Bebrütung nur sehr gering ausfällt. Es liegt vermutlich

eine erhöhte Exopolysaccharid-Bildung aufgrund von Nährstoffmangel im

Agarnährmedium vor. Evans und Linker (1973) haben für klinische Stämme von

P. aeruginosa beschrieben, dass bei einem bestimmten C / N -Verhältnis im

Nährmedium (hohe Kohlenstoff- und niedrige Stickstoffkonzentration) die

Produktion von Alginat hoch ist.

4.1.3 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von den Nährstoffbedingungen

Es wurde untersucht, ob die Zusammensetzung der EPS des P. aeruginosa-

Biofilms von der Zusammensetzung des Nährmediums abhängt. Das Nährmedium

Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA) wurde mit Alginate Promoting Medium

(APM), Nähr-Agar (NA), Ammonium-Agar und Nitrat-Agar verglichen

(Zusammensetzung der Nährmedien in Abschnitt 2.2). Die Anzucht erfolgte auf

den verschiedenen Nährmedien unter gleichen Bebrütungsbedingungen für 24 h

bei 36 °C. Die Biofilme wurden von der Agaroberfläche abgetrennt und nach einer

Homogenisation in NaCl-Lösung wurde die EPS durch Zentrifugation bei

40 000 x g von den Zellen abgetrennt (3.6.1). Die Bestimmungen der EPS-

Bestandteile Kohlenhydrate, Uronsäuren und Proteine wurden in sterilfiltrierten

und dialysierten Lösungen durchgeführt. In Abbildung 8 sind die

Zusammensetzungen der Biofilme und EPS dargestellt. Es sind deutliche

Unterschiede in der Zusammensetzung der Kohlenhydrate, Uronsäuren und

Proteine sowohl im Biofilm als auch in den EPS erkennbar. Das Massen-

Verhältnis Kohlenhydratgehalt / Proteingehalt im Biofilm ist bei PIA, APM,

Ammonium-Agar und NA etwa 1:1, bei Nitrat-Agar beträgt es 3:2. In den EPS sind

die Kohlenhydrat-Protein-Verhältnisse uneinheitlich. Bei der Anzucht auf PIA ist

der Proteingehalt in den EPS am höchsten. In den EPS auf APM, Ammonium- und

Nitrat-Agar sind fast keine Proteine nachweisbar. Der Uronsäuregehalt war bei der

Anzucht auf Nitrat-Agar am höchsten und auf Nähr-Agar am niedrigsten. Die

Verhältnisse der Konzentrationen in den EPS (Kohlenhydrate / Uronsäuren:

Proteine) bezogen auf die Trockenmasse im Biofilm variierten in Abhängigkeit vom

Agarnährmedium.

67

Ergebnisse

0

100

200

300

400

500

600

Biofilm EPS Biofilm EPS Biofilm EPS Biofilm EPS Biofilm EPS

PIA APM Ammonium-Agar Nähr-Agar Nitrat-Agar

EPS-

Kom

pone

nte

(mg/

g T

M)

Kohlenhydrate

Uronsäuren

Proteine

Abbildung 8: Zusammensetzung von Biofilm und EPS von P. aeruginosa bei Anzucht auf verschiedenen Nährmedien (PIA Pseudomonas Isolierungs-Agar, APM Alginate Promoting Medium) für 24 h bei 36 °C.

Die Effizienz der Isolierung der EPS von P. aeruginosa wurde mit dem

Uronsäuregehalt als Indikator berechnet, wenn berücksichtigt wird, dass die

Uronsäuren (Alginat) fast ausschließlich extrazellulär vorhanden sind (Fazio et al.,

1982; Rehm und Valla, 1997; Gacesa, 1998). Durch das Verhältnis der Gehalte an

Uronsäuren in den EPS mit dem im Biofilm wurde die Ausbeute der Isolierung

berechnet. Die höchste Ausbeute ergab sich für die Anzucht auf PIA (96 %) und

APM (99%) sowie im Nähr-Agar. Für Ammonium-Agar und Nitrat-Agar wurden

89 % bzw. 66 % der EPS isoliert.

4.1.4 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von der Isolierungsmethode

Es wurde überprüft, welchen Einfluss die Methode der Isolierung von EPS auf

die Zusammensetzung der EPS hat. Hierzu wurden fünf verschiedene

Isolierungsmethoden auf dieselbe Probe, ungesättigte Biofilme von 24 h-Kulturen

von P. aeruginosa auf PIA (36 °C), angewandt. Es handelte sich um die Isolierung

durch Zentrifugation, Dowex Ionenaustauscher-Methode, Isolierung mit

68

Ergebnisse

Kronenether, Extraktion mit Formaldehyd und die kombinierte Extraktion mit

Formaldehyd und NaOH (beschrieben in Abschnitt 3.6.2 bis 3.6.6). Die

Modellbiofilme wurden auf PIA und PIA mit 0,1 M Calcium-Zusatz (CaPIA)

angezüchtet.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Biofilm Zentrifugation Dowex-Methode Kronenether-Methode

Formaldehyd Formaldehyd /NaOH

EP

S-K

ompo

nent

e (m

g/g

TM)

Kohlenhydrate

Uronsäuren

Proteine

EPSBiofilm

Abbildung 9: Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa aus Biofilmen auf PIA in Abhängigkeit von der Isolierungsmethode. Die Kultivierung erfolgte für 24 h bei 36 °C.

Die Gehalte an Kohlenhydraten, Uronsäuren und Proteinen wurden in den

isolierten, sterilfiltrierten und dialysierten EPS-Lösungen quantifiziert. Die

Ergebnisse der quantitativen Zusammensetzung der EPS aus Biofilmen auf PIA

sind in Abbildung 9 dargestellt. Kohlenhydrate bzw. Uronsäuren in den EPS von

Biofilmen auf PIA werden mit der Zentrifugation, Dowex-Methode und der

Kronenether-Methode am effektivsten isoliert.

Die Ergebnisse der quantitativen Zusammensetzung der EPS aus Biofilmen auf

CaPIA sind in Abbildung 10 dargestellt. Für die EPS von Biofilmen, die auf CaPIA

angezüchtet wurden, ist die Effektivität der Isolierung der EPS durch die

Zentrifugations-Methode, Kronenether-Methode und die Formaldehyd-Methode

69

Ergebnisse

sehr gering. Die Dowex-Methode ist am effektivsten für die Isolierung von EPS

von P. aeruginosa Biofilmen, die auf CaPIA angezüchtet wurden.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Biofilm Zentrifugation Dowex-Methode Kronenether-Methode

Formaldehyd Formaldehyd /NaOH

EP

S-K

ompo

nent

e (m

g/g

TM)

Kohlenhydrate

Uronsäuren

Proteine

EPSBiofilm

Abbildung 10: Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa aus Biofilmen auf PIA mit 0,1 M Calcium-Zusatz (CaPIA) in Abhängigkeit von der Isolierungsmethode. Die Kultivierung erfolgte für 24 h bei 36 °C.

Zur Kontrolle einer eventuellen Schädigung der Zellen, die durch die

Isolierungsmethode hervorgerufen worden sein konnte, wurde die Aktivität des

strikt intrazellulären Enzyms Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) in

EPS-Lösung bestimmt (3.10.8, S. 54). Eine Zunahme der Aktivität der G6PDH

wurde in keiner der untersuchten EPS-Proben gemessen (Tabelle 7). Somit ist

eine Schädigung der Zellen, durch die Isolierung der EPS mittels Zentrifugation,

Dowex-Methode, Kronenether-Methode, Formaldehyd- bzw. Formaldehyd/NaOH-

Behandlung auszuschließen.

70

Ergebnisse

Tabelle 7: Bestimmung der Aktivität von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in EPS von P. aeruginosa SG81 nach Kultivierung auf PIA bzw. PIA mit Calcium-Zusatz (CaPIA) für 24 h bei 36 °C in Abhängigkeit von der Isolierungsmethode

Probe Nährmedium Isolierungsmethode Aktivität von G6PDH EPS PIA Zentrifugation n. n. EPS CaPIA Zentrifugation n. n. EPS PIA Dowex n. n. EPS CaPIA Dowex n. n. EPS PIA Kronenether n. n. EPS CaPIA Kronenether n. n. EPS PIA Formaldehyd n. n. EPS CaPIA Formaldehyd n. n. EPS PIA Formaldehyd/NaOH n. n. EPS CaPIA Formaldehyd/NaOH n. n.

Standard - - + n. n., nicht nachgewiesen.

4.1.5 Zuckeranalytik der EPS von P. aeruginosa

Für die Zuckeranalytik wurden die EPS oder gereinigte Polysaccharid-

Fraktionen in ihre Monomer-Bausteine durch saure Totalhydrolyse zerlegt. Die

Hydrolyse erfolgte mit organischen oder anorganischen Säuren im Wasserbad bei

festgelegter Temperatur und Dauer. Uronsäurehaltige Polysaccharide in den EPS

wurden mit 80 %iger Schwefelsäure hydrolysiert und anschließend mit

Bariumhydroxid-Lösung neutralisiert (3.11.1.2). Neutrale Polysaccharide in den

EPS wurden mit Trifluoressigsäure hydrolysiert und anschließend mit

Ammoniumhydroxid-Lösung neutralisiert (3.11.1.3).

Die Auftrennung der Monosaccharide nach der Hydrolyse der Polysaccharide

erfolgte durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel-HPTLC-Platten. Für die

Auftrennung von neutralen Monosacchariden und Uronsäuren haben sich zwei

Dünnschichtchromatographie-Systeme mit unterschiedlichen Laufmittelgemischen

und zur Anfärbung verschiedene Derivatisierungsreagenzien als geeignet

erwiesen. Die neutralen Polysaccharid-Hydrolysate wurden in einem

Laufmittelgemisch aus Acetonitril, Amylalkohol und Wasser (3:1:1, v/v/v)

entwickelt. Die Visualisierung der Spots auf der Dünnschicht erfolgte durch

Derivatisierung mit N-(-1-Naphthyl)ethylendiamin-dihydrochlorid-Reagenz

71

Ergebnisse

(3.11.2.1). Die Auftrennung der neutralen Zuckerbausteine der EPS von

P. aeruginosa ist in Spur b) der Abbildung 11 (I) gezeigt. Spur c) bis e) zeigt die

Auftrennung von Monosacchariden als Standardgemische. Die Referenzzucker

wurden ausgewählt, weil sie in der Literatur als Bestandteile für Polysaccharide

anderer P. aeruginosa-Stämme beschrieben wurden (Marty et al., 1992). Mit

dieser Methode waren keine neutralen Zucker in den EPS von P. aeruginosa

nachweisbar. Als Kontrolle, dass neutrale Polysaccharide unter diesen

Bedingungen hydrolysiert wurden, diente Dextran. Beim Dextran-Hydrolysat wurde

Glucose auf der Dünnschicht-Platte nachgewiesen (Spur a) in Abbildung 11 (I)).

Für die uronsäurehaltigen Polysaccharid-Hydrolysate wurde ein Laufmittelge-

misch aus Ethylacetat, Essigsäure, Pyridin und Wasser verwendet. Dieses

Laufmittelgemisch hat sich bei der papierchromatographischen Trennung von

Uronsäuren als geeignet erwiesen (Fischer und Dörfel, 1955). Die Derivatisierung

der Spots auf der Dünnschicht erfolgte mit einem Reagenz aus p-Anisi-

diniumchlorid in n-Butanol (3.11.2.2). Die Auftrennung der Uronsäuren der EPS

von P. aeruginosa ist in Spur c) der Abbildung 11 (II) gezeigt. Die Monosaccharide

L-Guluronat und D-Mannuronat können den Referenzsubstanzen in Spur a) und b)

zugeordnet werden. Es wurden keine weiteren Uronsäuren in den EPS von

P. aeruginosa nachgewiesen. D-Mannuronsäure-γ-lacton ist im EPS-Hydrolysat in

Spur c) im oberen Spot nachweisbar (Referenz hier nicht abgebildet).

Tabelle 8: Referenzsubstanzen und ihre berechneten Rf -Werte der Dünnschichtchromatogramme von Abbildung 11

I. Neutralzucker Rf II. Uronsäuren Rf

D-Galactose (Gal) 0,55 L-Guluronat (GulA) 0,53

D-Mannose (Man) 0,57 D-Mannuronat (ManA) 0,58

D-Glucose (Glc) 0,60 D-Mannuronsäure-γ-lacton (ManL) 0,82

2-Keto-3-deoxyoctonat (KDO) 0,65

D-Xylose (Xyl) 0,74

L-Rhamnose (Rha) 0,80

D-Mannuronsäure-γ-lacton (ManL) 0,83

72

Ergebnisse

I II

ManL ManL Rha Xyl

KDO

GulA ManA Glc

Man

Gal

Abbildung 11: Dünnschichtchromatogramme von Hydrolysaten der EPS von P. aeruginosa SG81:

I. Neutralzucker: a) Dextran-Hydrolysat b) EPS-Hydrolysat c) D-Glucose (Glc), D-Mannuronsäure-γ-lacton (ManL) d) D-Galactose (Gal), L-Rhamnose (Rha) e) D-Mannose (Man), 2-Keto-3-deoxyoctonat (KDO), D-Xylose (Xyl)

II. Uronsäuren: a) L-Guluronat (GulA) b) D-Mannuronat (ManA) c) EPS-Hydrolysat.

a b c a b c d e

4.1.6 Säulenchromatographische Auftrennung und Charakterisierung der

Polysaccharid-Fraktionen der EPS von P. aeruginosa

Eine genauere Untersuchung der Polysaccharid-Fraktionen der EPS oder

gereinigtem Alginat von P. aeruginosa wurde durch Auftrennung mit

säulenchromatographischen Methoden erzielt. Mit der Gelfiltration wurden die

EPS nach ihrer Molmasse getrennt (3.11.3.1). Als Gelmaterial diente Sephacryl S-

500 HR (Fa. Amersham Biosciences), weil für dieses Material die Trennleistung im

Bereich hochmolekularer Polysaccharide liegt (Fraktionierbereich für Dextrane: 4 x

104 – 2 x 107 g/mol, Herstellerangaben, Fa. Amersham Biosciences). In allen

Fraktionen wurden der Kohlenhydratgehalt und der Proteingehalt bestimmt. Das

Elutionsdiagramm für EPS von P. aeruginosa SG81 ist in Abbildung 12 dargestellt.

73

Ergebnisse

Proteine und Kohlenhydrate in den EPS von P. aeruginosa zeigen ein

heterogenes Elutionsprofil bei der Gelfiltration. Aufgrund ihrer höheren Molmasse

eluieren die Polysaccharide vor den Proteinen von der Säule. Beide Peaks

überlappten und hatten eine unsymmetrische Form („tailing“). Dies deutet auf eine

Coelution der Polysaccharide und Proteine hin, die vermutlich auf

Wechselwirkungen der beiden EPS-Bestandteile beruhen kann.

0,0

0,1

0,1

0,2

0,2

0,3

0,3

0,4

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Elutionsvolumen (ml)

Koh

lenh

ydra

te (A

480)

0,015

0,025

0,035

0,045

0,055

0,065

0,075

0,085

Prot

eine

(A28

0)

A480A280

V0

669 kDa (Thyroglobulin)440 kDa (Ferritin)

232 kDa (Aldolase)

158 kDa (Catalase)

25 kDa (Chymotrypsinogen A)

Abbildung 12: Gelfiltration von EPS von P. aeruginosa SG81 an Sephacryl S-500 HR. Gelbettvolumen 0,8 x 40 cm, Elutionsmittel: 50 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,2 M NaCl (pH 8), Flussrate: 6 ml/h, Fraktionsvolumen 0,8 ml, Detektion: Kohlenhydrate, Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956), Proteine, A280.

Die Gewinnung von gereinigtem Alginat aus den EPS von P. aeruginosa

erfolgte durch Präzipitation der EPS-Lösung mit Ethanol und darauf folgender

Enzymbehandlung mit DNA- und Protein-abbauenden Enzymen (3.7).

In Abbildung 13 ist das IR-Spektrum von unbehandeltem Alginat und Alginat

nach der Enzymbehandlung gezeigt. Mittels IR-Spektroskopie ist erkennbar, dass

das Rohalginat (vor der Enzymbehandlung) mit DNA verunreinigt ist (Abbildung

13). Bei 1086 cm-1 liegt die stärkste Bande für die DNA-Absorption. Eine

Verunreinigung mit Proteinen kann nur schwer ausgemacht werden, da die Amid I

und Amid II Banden mit der stärksten Alginat-Bande bei 1614 cm-1 überlappen.

74

Ergebnisse

Dennoch ist es wahrscheinlich, dass Proteine durch die Enzymbehandlung

entfernt wurden, weil im gereinigten Alginat bei 1527 cm-1 eine Bande auftritt, die

im Rohalginat vermutlich durch die Amid II Bande (1550 cm-1) verdeckt wurde.

30003500

500100015002000250030003500

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

.15

0.20

Abso

rban

ce U

nits

BRUKER

Abbildung 13: IR-Spektren von Roha

Die Absorptionsspektren von

der Zentrifugation von P. aeru

konnte gezeigt werden, dass

Enzymbehandlung effektiv ent

Alginat von P. aeruginosa wi

Bereich von 260 nm und 280 nm

Rohalginat Alginat

5001000150020002500Wavenumber cm-1

0.00

0.05

0.10

0

lginat und gereinigtem Alginat von P. aeruginosa

EPS, gereinigtem Alginat und dem Zellpellet nach

ginosa EPS sind in Abbildung 14 aufgeführt. Es

die Proteine und DNA in den EPS durch die

fernt werden können (Abbildung 14). Gereinigtes

es im Absorptionspektrum keine Absorption im

auf.

75

Ergebnisse

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Wellenlänge (nm)

Abso

rptio

n

EPSAlginat (gereinigt)Zellen (nach Zentrifugation)

Abbildung 14: Absorptionspektren der EPS, gereinigtem Alginat und der Zellen (nach der Zentrifugation der Biofilmsuspension) von P. aeruginosa SG81

Das Chromatogramm für die Trennung von gereinigtem Alginat aus den EPS

von P. aeruginosa ist in Abbildung 15 gezeigt. Der Peak von Alginat zeigt eine

einheitlichere Form im Vergleich zu den EPS in Abbildung 12. Das Peakmaximum

liegt mit 16 ml Elutionsvolumen knapp hinter dem Ausschlussvolumen (V0 =

15,2 ml), welches mit hochmolekularem Dextran (5 – 40 x 106 Da, Fa. Sigma)

bestimmt wurde. Dies deutet auf eine relativ hohe Molmasse des Alginats im

Bereich von 106 g/mol hin.

76

Ergebnisse

Ve= 16 ml

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Koh

lenh

ydra

te (µ

g/m

l)

V0= 15,2 ml

Abbildung 15: Gelfiltration von gereinigtem Bakterienalginat von P. aeruginosa SG81 an Sephacryl S-500 HR. Gelbettvolumen 0,8 x 40 cm, Elutionsmittel: 50 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,2 M NaCl (pH 8), Flussrate: 6 ml/h, Fraktionsvolumen 0,8 ml, Detektion: Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956).

Vorgequollene DEAE-Sepharose CL-6B (Fa. Amersham Pharmacia) wurde als

Gelmaterial für die Anionenaustauschchromatographie eingesetzt. Die Säule

wurde zuerst mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 und anschließend mit einem linea-

ren Natriumchloridgradienten von 0 bis 1 M NaCl eluiert (3.11.3.2). In allen

Fraktionen wurde die Leitfähigkeit, der Kohlenhydratgehalt, Uronsäuregehalt und

Proteingehalt bestimmt. Abbildung 16 zeigt das Elutionsdiagramm für die

Trennung der EPS von P. aeruginosa. Die Proteine eluierten als breiter Peak von

der Anionenaustauschersäule ab einem Elutionsvolumen von Ve = 50 ml. Ab einer

NaCl-Konzentration von 0,2 M nahm die Proteinkonzentration stetig ab. Bereits bei

der Elution nur mit Puffer ist die Elution von Kohlenhydraten festzustellen. Dieser

könnte entweder von neutralen oder positiv geladenen Kohlenhydraten

hervorgerufen worden sein. Negativ geladene Polysaccharide, wie Alginat wurden

reversibel an den Anionenaustauscher gebunden und erst ab einer

Natriumchloridkonzentration von 0,44 M von der Säule eluiert. Dies zeigt ein

77

Ergebnisse

deutlicher Peak sowohl in der Kohlenhydrat- als auch Uronsäure-Bestimmung der

Fraktionen. Nach dem Peak wurde eine inhomogene Absorption von

Kohlenhydraten und Uronsäuren ohne deutliche Absorptionsmaxima beobachtet.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450


Abs

orpt

ion

(A48

0/A52

5/A28

0)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

c(N

aCl)

mol

l-1

Kohlenhydrate Uronsäuren Proteine Leitfähigkeit

0,44 M NaCl

Abbildung 16: Elutionsdiagramm von EPS aus Biofilmen von P. aeruginosa SG81 mittels Anionenaustauscher DEAE-Sepharose CL-6B. Gelbettvolumen 1,6 x 31 cm, Elutionsmittel: 50 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) und 400 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) mit 0 - 1 M NaCl, Flussrate: 20 ml/h, Fraktionsvolumen 5 ml, Detektion: Leitfähigkeit, Kohlenhydrate, Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956), Uronsäuren, Sulfamat-Biphenyl-Assay (Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991), Proteine, A280.

Gereinigtes Bakterienalginat von P. aeruginosa wurde mittels Anionen-

austauschchromatographie analysiert. Im vorliegenden Fall wurden 20 ml

Alginatlösung (51 mg Alginat) auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde zuerst

mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,5 und anschließend mit einem linearen

Natriumchloridgradienten eluiert. In allen Fraktionen wurde die Leitfähigkeit und

der Kohlenhydratgehalt (3.10.2) bestimmt. In Abbildung 17 ist das

Elutionsdiagramm von gereinigtem Bakterienalginat an DEAE-Sepharose CL-6B

gezeigt. Es wurde in vier Fraktions-Bereiche eingeteilt, je nach gemessener

Natriumchloridkonzentration (Leitfähigkeit). Der Bereich von 0 – 130 ml

Elutionsvolumen, vor dem Natriumchloridgradienten, wurde als Fraktion I

78

Ergebnisse

bezeichnet (kein Salz-Einfluss) und alle Fraktionen in diesem Bereich wurden

gepoolt, dialysiert und lyophilisiert. In der Fraktion I wurden sehr geringe

Kohlenhydratmengen im Phenol-Schwefelsäure-Assay (A490) detektiert. Alle

Fraktionen von 0,39 M NaCl bis 0,48 M NaCl (Peakbereich) wurden gepoolt,

dialysiert und lyophilisiert und als Fraktion II bezeichnet. Ab einer

Natriumchloridkonzentration von 0,39 M und einem Elutionsvolumen von 305 ml

beginnt Fraktion II mit einem deutlichen Absorptionsmaximum bei 0,45 M NaCl im

Kohlenhydrat-Assay. Nach dem Peakbereich wurden alle Fraktionen als

Fraktionsbereich III (Schulter nach dem Peakbereich) bzw. IV (Bereich nach Peak

mit deutlicher Absorption im Kohlenhydrat-Assay) gepoolt, dialysiert und

lyophilisiert (Abbildung 17).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 100 200 300 400 500 600 700


Abs

orpt

ion

(A49

0)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

c (N

aCl)

Kohlenhydrate (A490) c (NaCl)

I

II

III

IV

0,45 M NaCl

Abbildung 17: Elutionsdiagramm von gereinigtem Bakterienalginat aus Biofilmen von P. aeruginosa mittels Anionenaustausch an DEAE-Sepharose CL-6B. Gelbettvolumen 1,6 x 31 cm, Elutionsmittel: 50 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) und 400 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) mit 0 - 1 M NaCl, Flussrate: 20 ml/h, Fraktionsvolumen 5 ml, Detektion: Leitfähigkeit, Kohlenhydrate, Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956).

Die Fraktionen I, II und IV aus der Anionenaustauschchromatographie von

Alginat (Abbildung 17) wurden mit dem Enzym-gekoppelten Lektin-Bindungs-

79

Ergebnisse

Assay (Mikrotiterplatten-Assay) untersucht. Die Analyse von Fraktion III konnte

aus quantitativen Gründen nicht durchgeführt werden. Die Fraktionen wurden

bezüglich ihrer Bindungsspezifität zum Lektin Concanavalin A (ConA) getestet.

Strathmann et al. (2002) haben gefunden, dass Alginat an ConA spezifisch bindet

und sich somit im Biofilm mit fluoreszenzmarkiertem ConA visualisieren lässt. In

Abbildung 18 sind die einzelnen Fraktionen I, II und IV und als Kontrolle Dextran

abgebildet. ConA zeigte keine Bindung an Fraktion I. ConA bindet hingegen

deutlich an die Fraktionen II und IV, wobei ConA an Fraktion II (Peakfraktion aus

Abbildung 17) am stärksten bindet.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000

Konzentration (µg/ml)

Abso

rptio

n (A

405)

Fraktion IFraktion IIFraktion IVDextran

Abbildung 18: Enzym-gekoppelter Lektin-Bindungs-Assay (ELLA) an Alginat-Fraktionen (I, II, IV) aus der Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 17). Gebundenes ConA wurde durch Messung der Peroxidase-Aktivität (A405) im Mikrotiterplatten-Assay (3.10.9) bestimmt.

Die Fraktionen II, III und IV aus der Anionenaustauschchromatographie von

Alginat (Abbildung 17) wurden durch Gelfiltration an Sephacryl S-500 HR auf ihre

Molmassenverteilung untersucht. Die Elutionsdiagramme sind in Abbildung 19

dargestellt. Die Fraktionen II, III und IV eluieren kurz nach dem

Ausschlussvolumen der Säule, welches mit hochmolekularem Dextran (5 – 40 x

106 Da, Fa. Sigma) bestimmt wurde. Die Peakmaxima liegen für Fraktion IV bei

80

Ergebnisse

einem Elutionsvolumen von Ve = 16 ml und für Fraktion III bei Ve = 17,6 ml. Die

Alginat-Fraktionen II und III haben vermutlich eine etwas geringere Molmasse als

Fraktion IV.

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Koh

lenh

ydra

te (µ

g/m

l)

Alginat II

Alginat III

Alginat IV

V0

Abbildung 19: Gelfiltration der Alginat-Fraktionen aus der Anionenaustausch-Chromatographie (siehe Abbildung 17) an Sephacryl S-500 HR. Das Ausschlussvolumen V0 wurde mit hochmolekularem Dextran (5 – 40 x 106 Da) bestimmt. Gelbettvolumen 0,8 x 40 cm, Elutionsmittel: 50 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,2 M NaCl (pH 8), Flussrate: 6 ml/h, Fraktionsvolumen 0,8 ml, Detektion: Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956).

Die Infrarot-Spektroskopie kann eingesetzt werden, um die gesamte EPS zu

charakterisieren und gereinigtes Alginat zu identifizieren (Wingender et al., 2001).

Die breite Absorptionsbande bei 3500 cm-1 bis 3000 cm-1 ist der OH-

Streckschwingung zuzuordnen, wie sie typischerweise in Polysacchariden

vorkommt. Bei 1730 cm-1 und 1250 cm-1 liegen die Banden der Acetylester-

Bindungen der Acetylgruppen am Alginat (Evans und Linker, 1973; Sherbrock-Cox

et al., 1984). Die Absorptionsbande bei 893 cm-1 ist charakteristisch für die IR-

Absorption der β-Verknüpfungen der Monomerbausteine im Alginatgrundgerüst.

Von den Fraktionen II und IV aus der Anionenaustauschchromatographie von

Alginat wurden IR-Spektren aufgenommen (Abbildung 20). Die Acetylester-

81

Ergebnisse

Bindungen der Acetylgruppen von Alginat haben charakteristische IR-Banden bei

1730 cm-1 und 1250 cm-1 (Evans und Linker, 1973; Sherbrock-Cox et al., 1984).

Diese Banden sind im IR-Spektrum (Abbildung 20) mit Ac1 und Ac2

gekennzeichnet. Die Peakfraktion II (aus Abbildung 17) stellt O-acetyliertes Alginat

dar und Fraktion IV stellt nicht oder nur geringfügig acetyliertes Alginat dar.

500100015002000250030003500Wavenumber cm-1

0.00

0.05

0.10

0.15

Abso

rban

ce U

nits

Ac1, Ac2: Acetyl-Banden

Abbildung 20: IR-Spektrum der Alginat-Fraktionen II (obere Kurve) und IV (untere Kurve) aus der Anionenaustausch-Chromatographie

Algenalginat ist im Gegensatz zum bakteriellen Alginat nicht acetyliert. Um das

Verhalten von Algenalginat mit dem von Bakterienalginat auf dem

Ionenaustauscher zu vergleichen, wurde chemisch acetyliertes Algenalginat

(Manucol LHF, Fa. Kelco) mittels Anionenaustauschchromatographie an DEAE-

Sepharose CL-6B getrennt. In allen Fraktionen wurden die Gehalte an

Kohlenhydraten, Uronsäuren und Proteinen bestimmt. Das Elutionsdiagramm von

acetyliertem Algenalginat ist in Abbildung 21 gezeigt. Bei etwa 0,45 M NaCl eluiert

das Alginat von der Anionenaustauscher-Säule. Durch direkten Vergleich mit dem

Elutionsprofil für Bakterienalginat (Abbildung 17) ist erkennbar, dass Algenalginat

als Peak bei nahezu identischer NaCl-Konzentration eluierte, aber im Gegensatz

zum Alginat von P. aeruginosa nur als einzelner einheitlicher Peak von der Säule

Abs

orpt

ion

Ac2

Ac1

Wellenzahl (cm-1)

82

Ergebnisse

eluierte. Nach dem Peak war bei zunehmender Natriumchloridkonzentration fast

keine Absorption von Kohlenhydraten bzw. Uronsäuren detektierbar.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450


Abs

orpt

ion

-0,1

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

c(N

aCl)

mol

l-1

Kohlenhydrate Uronsäuren Proteine Leitfähigkeit

0,45 M NaCl

Abbildung 21: Elutionsdiagramm von acetyliertem Algenalginat (Manucol LHF) mittels Anionenaustausch an DEAE-Sepharose CL-6B. Gelbettvolumen 1,6 x 31 cm, Elutionsmittel: 50 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) und 400 ml 50 mM Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) mit 0 - 1 M NaCl; Flussrate: 20 ml/h, Fraktionsvolumen 5 ml, Detektion: Leitfähigkeit, Kohlenhydrate, Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956), A480, Uronsäuren, Sulfamat-Biphenyl-Assay (Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991), A525, Proteine, A280.

4.1.7 Nachweis von Rhamnolipiden in P. aeruginosa SG81 Biofilmen

Dass P. aeruginosa ist in der Lage ist oberflächenaktive Substanzen, sog.

Rhamnolipide, zu produzieren wurde schon relativ früh erkannt (Jarvis und

Johnson, 1949). Erste Hinweise auf eine Bedeutung der Rhamnolipide für die

Biofilmarchitektur wurden vor kurzem gefunden (Davey et al., 2003). Daher wurde

untersucht, ob Rhamnolipide in den EPS von P. aeruginosa SG81 nachgewiesen

werden können.

In den gefriergetrockneten EPS (nach Dialyse) aus Biofilmen von

P. aeruginosa, (auf PIA bei 36 °C für 24 h angezüchtet) wurden Rhamnolipide mit

83

Ergebnisse

Diethylether extrahiert und bis zur Trockne eingeengt (3.9). Nach der Aufnahme

der Rückstände in Chloroform wurden die Proben auf die Dünnschicht

aufgetragen. Ein qualitativer Nachweis der Rhamnolipide wurde mit

Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel-HPTLC-Platten durchgeführt. Die

Dünnschicht-Platten wurden im Laufmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und

Essigsäure entwickelt und mit einem Derivatisierungs-Reagenz aus Orcinol in

Schwefelsäure sichtbar gemacht (3.11.2.3). In Abbildung 22 ist das

Chromatogramm für die Rhamnolipid-Extrakte aus den EPS bei der Anzucht auf

PIA, APM, NA, Nitrat-Agar und Ammonium-Agar abgebildet. Als

Referenzsubstanzen dienten Rhamnolipide, die aus P. aeruginosa PAO1 isoliert

wurden (Smolski, 2002). Die Isolierung dieses Rhamnolipid-Gemisches ist von

Smolski (2002) beschrieben worden. Zwei charakteristische Spots können im

Chromatogramm identifiziert werden. Deutlich ist in der Bahn 1 der

Referenzsubstanz der Spot für das Mono-Rhamnolipid (Rf = 0,6) erkennbar. Der

unten davon gelegene und deutlich schwächere Fleck ist dem Di-Rhamnolipid

(Rf = 0,2) zuzuordnen. Durch den Vergleich mit einem kommerziell erhältlichen

Gemisch aus Mono- und Di-Rhamnolipiden (99 %ig, Art.-Nr. JBR-599, Fa. Jeneil

Biosurfactant) konnte die Identität der Mono- bzw. Di-Rhamnolipide bestätigt

werden (Abbildung 22, Spur 7). Die eindeutige Zuordnung der Rhamnolipid-Spots

auf den Dünnschichtplatten wurde von Syldatk et al. (1985b) beschrieben. Die

EPS bei Anzucht auf PIA wies den am stärksten angefärbten Spot für das Di-

Rhamnolipid auf. Die Spots des Mono-Rhamnolipids für alle EPS-Proben sind

sehr schwach, aber auf der Dünnschichtplatte direkt noch erkennbar. Bei der EPS-

Probe aus Biofilmen auf APM ist das Di-Rhamnolipid noch deutlich auf der

Dünnschichtplatte erkennbar. Die EPS-Proben von Biofilmen nach Anzucht auf

Nähr-Agar, Nitrat-Agar und Ammonium-Agar zeigten kaum erkennbare Mengen an

Rhamnolipiden (ausführliche Diskussion in Abschnitt 5.1.9, S. 122).

84

Ergebnisse

Abbildung 22: Trennung der Rhamnolipide an EPS von P. aeruginosa SG81 bei der Anzucht auf verschiedenen Nährmedien: Bahn 1 RL-Standard aus P. aeruginosa PAO1 Bahn 2 EPS (PIA) Bahn 3 EPS (APM) Bahn 4 EPS (NA) Bahn 5 EPS (Nitrat-Agar) Bahn 6 EPS (Ammonium-Agar) Bahn 7 RL-Standard (JBR 599, Fa. Jeneil Biosurfactant) auf HPTLC Kieselgel 60 (Fa. Merck). Entwicklung mit Chloroform – Methanol – Essigsäure (65:15:2). Aufnahme mit Flachbettscanner im Weißlicht nach Derivatisierung mit Orcinol-Schwefelsäure-Reagenz.

Die Quantifizierung der Rhamnolipide erfolgte durch den Nachweis von

Rhamnose in den Ether-Extrakten mit dem Orcinol-Assay (3.10.7). Der

Rhamnolipid-Anteil der EPS konnte aus dem Rhamnosegehalt umgerechnet

werden. Der Gehalt an Rhamnolipiden, der mit dem Orcinol-Assay (Abschnitt

3.10.7) bestimmt wurde, betrug im Fall der EPS von P. aeruginosa SG81 auf PIA

1,1 % (w/w) bzw. 12,9 µg/109 Zellen.

In Abbildung 23 ist die Trennung der Rhamnolipide von P. aeruginosa Biofilmen

vor und nach der Dialyse der sterilfiltrierten EPS-Lösungen auf Dünnschicht-

Platten gezeigt. Die Rhamnolipide wurden durch den Vorgang der Dialyse nicht

aus den EPS-Lösungen abgetrennt. Die Unterschiede der Zusammensetzung der

Rhamnolipide nach 24 h, 48 h und 72 h Anzucht waren nur gering. In allen EPS-

1 2 3 4 5 6 7

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OHOH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

Mono-RL

O

CH3

OHOH

OHO

CH2 C O

O

CH CH2

CH3

COOH

CH3

O

CH3

OH

OH O CH

(CH2)6 (CH2)6

Di-RL

85

Ergebnisse

Proben von P. aeruginosa war die Konzentration an Di-Rhamnolipid deutlich höher

als die von Mono-Rhamnolipid. Im Zellpellet nach der Zentrifugation der

Biofilmsuspension (Isolierungsmethode) wurden geringe Mengen an

Rhamnolipiden nachgewiesen. Hierdurch konnten Rhamnolipide erstmals direkt in

den EPS (extrazellulär) nachgewiesen werden.

Abbildung 23: Trennung der Rhamnolipide der EPS von P. aeruginosa SG81 vor und nach Dialyse sterilfiltrierter Überstände bei verschiedener Dauer der Anzucht der Biofilme: Bahn 1 RL-Standard aus P. aeruginosa PAO1 Bahn 2 Zellpellet 24 h Bahn 3 EPS vor Dialyse 24 h Bahn 4 EPS nach Dialyse 24 h Bahn 5 Pellet 48 h Bahn 6 EPS vor Dialyse 48 h Bahn 7 EPS nach Dialyse 48 h Bahn 8 Pellet 72 h Bahn 9 EPS vor Dialyse 72 h Bahn 10 EPS nach Dialyse 72 h auf HPTLC Kieselgel 60 (Fa. Merck) mit Chloroform – Methanol – Essigsäure (65:15:2). Aufnahme mit Flachbettscanner im Weißlicht nach Derivatisierung mit Orcinol-Schwefelsäure-Reagenz.

Mono-RL

Di-RL

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

4.2 Untersuchung der EPS aus Biofilmen von Pseudomonas fluorescens

Um das Spektrum der EPS-Analytik zu erweitern wurden die EPS des

Bakteriums P. fluorescens untersucht. Der Stamm P. fluorescens 6/4 wurde aus

dem Biofilm eines PVC-Trinkwasserrohres isoliert. Die Biofilme von

P. fluorescens 6/4 wurden auf Pseudomonas Agar F für 48 h bei 30 °C

86

Ergebnisse

angezüchtet. Daraus wurden die EPS durch Homogenisation in NaCl-Lösung und

anschließender Homogenisation gewonnen. Die EPS-Komponenten

Kohlenhydrate, Uronsäuren, Proteine sowie der Acetylgehalt wurden nach der

Dialyse gegen Deionat in Lösung bestimmt. Für die Berechnung der prozentualen

Anteile (% (w/w)) der EPS-Bestandteile wurden die zentrifugierten EPS-Lösungen

dialysiert und Lösungen aus zuvor gefriergetrockneter EPS angesetzt. Zum

Nachweis von Kohlenhydraten, Uronsäuren, Proteinen und Acetylgruppen wurden

photometrische Methoden verwendet. Huminstoffe wurden in den EPS-Proben

von P. fluorescens nicht bestimmt, da es sich um Reinkulturen aus dem Labor

handelt, und somit keine Huminstoffe in den Proben zu erwarten sind. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgeführt. Vergleichend wurde der Gehalt im Biofilm

und in den EPS angegeben.

Im Biofilm und in den EPS bildeten die Kohlenhydrate den größten Anteil an

de

Tabelle 9: Zusammensetzung des Biofilms und der EPS von

K Uronsäuren Proteine(mg/ g TM)

Acetylgehalt

n Biopolymeren. Uronsäuren, eine Teilmenge der Kohlenhydrate, wurden in den

EPS von P. fluorescens 6/4 nicht nachgewiesen. Die EPS bestanden zu

56,9 % (w/w) aus Kohlenhydraten und zu 27,6 % (w/w) aus Proteinen.

P. fluorescens 6/4 nach Kultivierung auf Pseudomonas Agar F für 48 h bei 30 °C

ohlenhydrate (mg/ g TM) (mg/ g TM) % (w/w)

Biofilm 3 396,0 ± 6,0 n. n. 43,6 ± 55,5 n. b.

EPS 103,4 ± 4,9 56,9 27,6 % (w/w) n. n. 99,2 ± 0,6

% (w/w) 5,03

TM, T masse; n. n., nicht nachg en; n. mt.

Für die Zuckeranalytik wurde die EPS in ihre Monomer-Bausteine durch

Hy

rocken ewies b., nicht bestim

drolyse zerlegt. Die Hydrolyse erfolgte mit organischen oder anorganischen

Säuren im Wasserbad bei festgelegter Temperatur und Dauer. Zur Untersuchung

auf die Anwesenheit neutraler Zuckerbausteine in den Polysacchariden wurden

die EPS mit Trifluoressigsäure hydrolysiert und mit Ammoniumhydroxid-Lösung

neutralisiert (3.11.1.3).

87

Ergebnisse

Die Auftrennung der Monosaccharide nach der Hydrolyse der Polysaccharide

erfolgte durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel-HPTLC-Platten. Die

neutralen Polysaccharid-Hydrolysate wurden in einem Laufmittelgemisch aus

Acetonitril, Amylalkohol und Wasser entwickelt. Die Visualisierung der Spots auf

der Dünnschicht erfolgte durch Derivatisierung mit N-(-1-Naphthyl)ethylendiamin-

dihydrochlorid-Reagenz (3.11.2.1). Die Auftrennung der neutralen

Zuckerbausteine der EPS von P. fluorescens ist in Spur a) der Abbildung 24

gezeigt. Spur b) und c) zeigen die Auftrennung von Monosacchariden als

Standardgemische. Mit dieser Methode konnten Glucose und Galactose als

Zuckerbausteine in den EPS von P. fluorescens identifiziert werden.

Abbi

D

getr

P. f

lieg

15,2

O

CH2OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

CH2OH

)

O

CH3 OH

OHOH

OH

)

O OH

OH

OH

OHO

O

D-Mannuronsäure-γ-lacton (ManL)

ManL Rha

Glc Gal

a b c

ldung 24: Trennung der Neutralzuc

Bahn a EPS von P. fluoreBahn b D-Glucose und DBahn c D-Galactose undauf HPTLC Kieselgel 60 Aufnahme mit FlachbetNaphthyl)ethylendiamin-d

urch Gelfiltration wurde die

ennt (3.11.3.1). Das Chrom

luorescens ist in Abbildung 25

t bei 16 ml Elutionsvolumen

ml), welches mit hochmolek

D-Glucose (Glc)

ker in Totalhydscens 6/4 -Mannuronsäu L-Rhamnose (Fa. Merck) mtscanner im ihydrochlorid-

EPS von P

atogramm

gezeigt. Da

knapp hin

ularem Dex

D-Galactose (Gal

rolysaten

re-γ-lacto

it AcetonitrWeißlicht Reagenz.

. fluores

für die

s Peakm

ter dem

tran (5

L-Rhamnose (Rha

der EPS von P. fluorescens 6/4:

n

il – Amylalkohol – Wasser (3:1:1). nach Derivatisierung mit N-(-1-

cens nach ihrer Molmasse

Trennung der EPS von

aximum für Kohlenhydrate

Ausschlussvolumen (V0 =

– 40 x 106 Da, Fa. Sigma)

88

Ergebnisse

bestimmt wurde. Dies deutet auf ein hohes Molekulargewicht des Polysaccharids

von P. fluorescens 6/4 im Bereich von 106 Da hin. Die Proteine eluieren insgesamt

als breiter Peak ab einem Volumen von 21,6 ml von der Säule. Der

Molmassenbereich der Proteine erstreckt sich über den gesamten Bereich der

separat bestimmten Elutionsvolumina der bekannten Molmassen der

Referenzproteine von 669 kDa bis 25 kDa.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50


Koh

lenh

ydra

te/P

rote

ine

(A49

0/A28

0)

A490A280

V0

669 kDa (Thyroglobulin)440 kDa (Ferritin)

232 kDa (Aldolase)158 kDa (Catalase)

25 kDa (Chymotrypsinogen A)

Abbildung 25: Gelfiltration der EPS von P. fluorescens 6/4 an Sephacryl S-500 HR. Gelbettvolumen 0,8 x 40 cm, Elutionsmittel: 50 mM Tris/HCl-Puffer mit 0,2 M NaCl (pH 8), Flussrate: 6 ml/h, Fraktionsvolumen 0,8 ml, Detektion: Kohlenhydrate, Phenol-Schwefelsäure-Assay (Dubois et al., 1956), Proteine, A280.

Eine Reinigung der Polysaccharid-Fraktion analog der Reinigung für Alginat von

P. aeruginosa (Abschnitt 3.7, S. 44) wurde unternommen. In Abbildung 26 sind die

Absorptionsspektren vor und nach der Enzymbehandlung mit Benzonase und

Proteinase dargestellt. Nach der Reinigung ist im Absorptionsbereich von 260 nm

und 280 nm keine deutliche Abnahme der Protein- und DNA-Absorption zu

erkennen. Durch Bestimmung des Proteingehalts in den EPS nach der

Enzymbehandlung konnte ebenfalls keine deutliche Abnahme der

Proteinkonzentration festgestellt werden.

89

Ergebnisse

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

200 250 300 350 400 450 500 550 600

Wellenlänge (nm)

Abso

rptio

n

EPSEPS (n. Enzymbeh.)

Abbildung 26: Absorptionsspektren der EPS von P. fluorescens 6/4 vor und nach der Enzymbehandlung mit Benzonase und Protease

4.3 Zusammensetzung der Biofilme und EPS aus Umweltproben

Das Ziel der Untersuchungen war es, die Analytik der EPS in Biofilmen aus

Reinkulturen auf die von Biofilmen aus Mischpopulationen auszudehnen.

Geeignete Methoden zur Isolierung und Analytik der EPS von Umweltproben

wurden ausgewählt und mit denen, die bei den Reinkulturen von P. aeruginosa

und P. fluorescens angewandt wurden, verglichen . Hierzu wurden Biofilme von

natürlichen aquatischen Standorten (Flüsse) und Biofilme aus technischen

Systemen (Trinkwasser, Abwasser) gewonnen und die EPS daraus isoliert. Die

Methoden der Isolierung der EPS aus den verschiedenen Proben ist in einem

Ablaufschema in Abbildung 27 zusammengefasst. Zum Vergleich ist im Schema

die Isolierung der EPS aus Reinkulturen mit aufgeführt. Die EPS aus Biofilmen

von Flüssen und Trinkwassersystemen wurden mittels Homogenisation durch

Rühren und anschließender Zentrifugation isoliert. Bei den Schlämmen aus der

Abwasserbehandlung wurden die EPS durch Rühren mit Dowex-

Ionenaustauscher und darauf folgender Zentrifugation isoliert. Die quantitative

Zusammensetzung der Biofilme und EPS von Schlammproben aus der

90

Ergebnisse

Abwasserbehandlung, Flusssedimenten und epilithischen Biofilmen und aus

Trinkwasserverteilungssystemen wurde untersucht. Der Umfang der untersuchten

Parameter ist in Tabelle 10 dargestellt. Für die Biofilme aus der

Abwasserbehandlung wurden in den EPS die Kohlenhydrate nach der Phenol-

Schwefelsäure-Methode (Abschnitt 3.10.2, S. 46), Uronsäuren nach der Sulfamat-

Biphenyl-Methode (Abschnitt 3.10.3.2, S. 47), DNA mit der DAPI-Methode

(Abschnitt 3.10.5, S. 51) und Proteine sowie Huminstoffe nach einer modifizierten

Lowry-Methode (Abschnitt 3.10.4.3, S. 49) bestimmt. Bei den EPS aus

Flusssedimenten und –biofilmen wurde der DNA-Gehalt nicht bestimmt. Die

Biofilme aus Trinkwassersystemen wurden auf ihre Gehalte an Kohlenhydraten,

Uronsäuren und Proteinen untersucht.

Abbildung 27: Ablaufschema der EPS-Isolierung für Reinkulturbiofilme, Fluss- und Trinkwasserbiofilme (links) und Schlämme aus der Abwasserbehandlung (rechts).

Reinkulturbiofilme, Schlämme aus der Abwasserbehandlung Fluss- und Trinkwasserbiofilme

Rühren

(900 U/min, 4 °C, 2 h)

Sedimentation der Probe P. aeruginosa Biofilm Biofilme aus Mischpopulationen (1 ½ h, 4 °C) (24 h, 36°C, PIA)

(Flüsse, Trinkwassersysteme)

P. fluorescens Biofilm (48 h, 30 °C, PAF)

Sediment + Phosphat-Puffer

+ Kationenaustauscherharz

Überstand

3 x Zentrifugation (20 000 x g, 10 °C, 20 min)

Zentrifugation (40 000 x g, 10 °C, 2 h)

Suspendierung des Biofilms und (Dowex 50 X 8) Homogenisation durch Rühren

Membranfiltration des Überstands (0,20 µm Porenweite)

Dialyse (gegen 2 x 5 L Deionat, 24 h)


Gefriertrocknung Gefriertrocknung

91

Ergebnisse

Tabelle 10: Parameter und Umfang der quantitativen EPS-Analyse (+ analysiert; - nicht analysiert) von Umweltbiofilmen.

Herkunft der Biofilme EPS-Komponente

Reinkultur Abwasser Flüsse Trinkwasser

Kohlenhydrate (Phenol-Schwefelsäure-

Assay) + + + +

Uronsäuren (Sulfamat-Biphenyl-Assay) + + + +

Proteine (Lowry-Assay) + + + +

Nucleinsäuren (DAPI-Methode) - + - -

Huminstoffe (modifizierter Lowry-Assay) - + + -

4.3.1 Biofilme und EPS von Schlammproben aus der Abwasserbehandlung

Es wurde die Untersuchung von Schlammproben aus Versuchsreaktoren und

Anlagen der Abwasserbehandlung durchgeführt. Der Umfang der Untersuchungen

bestand aus einer mikroskopischen Betrachtung der Proben, der Bestimmung von

Trockenrückstand und Wassergehalt, der Isolierung von EPS und der

Quantifizierung der Gehalte an Gesamtkohlenhydrat, Uronsäuren, Proteinen,

Nucleinsäuren und Huminstoffen als typische EPS-Komponenten der Biofilme aus

Belebtschlammflocken. Der Gehalt an Kohlenhydraten (Dubois et al., 1956),

Uronsäuren (Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991), Proteinen (Frølund et al., 1996),

Nucleinsäuren (Brunk et al., 1979) und Huminstoffen (Frølund et al., 1996) wurde

auf die Trockenmasse der Proben bezogen.

Es existiert keine allgemeine Methode zur quantitativen Isolierung von EPS aus Bakterien in Flocken. Zur routinemäßigen Isolierung von EPS aus Schlammproben der Abwasserreinigung wird gegenwärtig der Einsatz von Kationenaustauscherharzen unter standardisierten Rührbedingungen als die Methode der Wahl angesehen (Nielsen und Jahn, 1999). Diese Methodik beruht auf der Entfernung von mehrwertigen Kationen, vor allem Calcium und Magnesium, welche durch Quervernetzungen die EPS-Matrix stabilisieren. Die

92

Ergebnisse

Extraktion dieser Ionen bewirkt somit eine Mobilisierung der EPS, was die Effizienz der Abtrennung der EPS von den Bakterienzellen erhöht. Allerdings muss diese Methodik im Einzelnen auf die jeweilige Beschaffenheit der zu untersuchenden Proben angepasst werden.

Im vorliegenden Fall setzten sich die Schlammflocken in den untersuchten Proben nicht ab, sodass keine einfache Trennung von abgesetzten Flocken und überstehendem Abwasser durch Dekantieren möglich war. Die Schlammproben wurden zur Isolierung der EPS unverändert eingesetzt. Die Isolierung der EPS aus dem flockenhaltigen Material mit einem Dowex-Kationenaustauscherharz (3.6.3) erfolgte in Anlehnung an die Methodik nach Frølund et al. (1996). Bei den Schlammproben handelte es sich um Belebtschlämme, Rücklaufschlämme und einem Schlamm aus der aeroben, thermophilen Schlammstabilisierung (Tabelle 11).

Tabelle 11: Herkunftsbeschreibung der Schlämme aus der Abwasserbehandlung

Art und Herkunft der Probe Ort der Probenahme Nr. Membran-Bioreaktor -Anlage (Deponiesickerwasser)

Billigheim 1

Büsnau 2 Membranbelebungsanlage Stuttgart 3

Gelatinefabrik Eberbach 4 Membranbelebung einer Großwäscherei

Darmstadt 5

Membranbelebung einer Mälzerei Krostitz 6

Belebtschlamm

Membranbelebung einer Papierfabrik Mülhausen 7 kommunale Belebungsanlage Mülhausen 8

Büsnau 1 9 Rücklaufschlamm

Lehr- und Forschungsklärwerk Büsnau 2 10

Überschussschlamm kommunale Belebungsanlage Plieningen 11 Schlamm aerobe, thermophile

Schlammstabilisierung Neckarwestheim 12

Der Wassergehalt der untersuchten Schlämme variierte zwischen 97,3 und

99,2 % (Tabelle 12). Alle untersuchten EPS Bestandteile wie Kohlenhydrate,

Proteine, Nucleinsäuren und Huminstoffe konnten in den Schlammproben

nachgewiesen werden (Abbildung 28 und Abbildung 29). Uronsäuren wurden in

keiner Probe nachgewiesen. Dies konnte auch durch die Aufnahme von

Absorptionsspektren der Reaktionsprodukte im Sulfamat-Biphenyl-Assay bestätigt

werden (Abbildung 30). Exemplarisch ist das Absorptionsspektrum von

bakteriellem Alginat von P. aeruginosa und eines Schlammes aus der

93

Ergebnisse

Abwasserbehandlung gezeigt. Bei der Schlammprobe ist kein

Absorptionsmaximum erkennbar. Bei den Belebtschlammproben und den

Rücklaufschlämmen sowie dem Überschussschlamm (Tabelle 12) bildeten die

Proteine fast ausschließlich die Hauptkomponente der EPS. Die Huminstoffe

waren in den meisten Proben mengenmäßig die zweithäufigste Komponente der

EPS. Nucleinsäuren wurden in den Belebtschlammproben nur in geringen Mengen

nachgewiesen. In den Rücklaufschlämmen (Proben 8-10 und 12) wurden höhere

Gehalte an Nucleinsäuren im Vergleich zu den Belebtschlammproben

nachgewiesen.

Tabelle 12: Zusammensetzung der EPS von Belebtschlämmen, Rücklaufschlämmen und Überschussschlamm aus der Abwasserbehandlung

Nr. Kohlenhydrate Proteine Nuclein-säuren Huminstoffe Trocken-

masse Wasser- gehalt

(mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) (% TM/ g FM) (%) 1 16,2 16,8 5,0 18,3 1,0 99,0 2 4,3 23,2 1,4 9,7 1,7 98,3 3 7,1 37,7 1,6 11,1 0,8 99,2 4 1,7 11,0 1,6 3,4 2,0 98,0 5 3,1 19,0 n. n. 5,2 2,3 97,7 6 6,2 39,6 1,1 22,8 1,9 98,1 7 32,9 34,5 1,0 15,0 1,1 98,9 8 17,7 52,8 9,1 12,2 1,5 98,5 9 17,1 78,9 13,4 19,2 1,0 99,0

10 13,3 41,6 11,3 18,4 1,1 98,9 11 4,0 26,3 1,1 7,7 1,9 98,1 12 14,2 36,2 8,5 3,8 2,7 97,3

TM, Trockenmasse; n. n., nicht nachgewiesen; FM, Feuchtmasse

94

Ergebnisse

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 2 3 4 5 6 7

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

KohlenhydrateProteineDNAHuminstoffe

Proben-Nr.

Abbildung 28: Zusammensetzung der EPS von Belebtschlammproben aus der Abwasserbehandlung

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

8 9 10 11 12

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

KohlenhydrateProteineDNAHuminstoffe

Proben-Nr.

Abbildung 29: Zusammensetzung der EPS von Rücklaufschlämmen und Überschussschlamm aus der Abwasserbehandlung

95

Ergebnisse

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640

Wellenlänge (nm)

Abso

rptio

n

Alginat Schlammprobe

Abbildung 30: Absorptionsspektren der Reaktionsprodukte im Uronsäure-Assay von gereinigtem Alginat von P. aeruginosa und von EPS einer Schlammprobe aus der Abwasserbehandlung.

4.3.2 Zusammensetzung der Biofilme und EPS aus Flusswasserbiofilmen

Kulturelle mikrobiologische Verfahren (Koloniezahlbestimmung) wurden

zusätzlich zu den biochemischen Verfahren durchgeführt. In den untersuchten

Proben aus Flusswassersedimenten und Biofilmen von Steinen (epilithische

Biofilme) wurden die Koloniezahlen von heterotrophen (organische Verbindungen

verwertende) Bakterien (HPC) bestimmt. In der Tabelle 13 sind die

entsprechenden Konzentrationen der Koloniezahlen als Koloniebildende Einheiten

(KBE) pro ml Probenvolumen und als KBE pro g Trockenmasse (TM) angegeben.

Es ist zu beachten, dass es sich bei diesen Werten um die Angabe der mit dem

verwendeten Verfahren (3.5) kultivierbaren (vermehrungsfähigen) Bakterien

handelt. In der Regel werden in Proben von oligotrophen aquatischen Standorten

mit mikrobiologischen Kultivierungsverfahren nur maximal 0,1 bis 1 % der

insgesamt vorhandenen Mikroorganismen nachgewiesen. Somit ist davon

auszugehen, dass in den untersuchten Proben die Gesamtzellzahlen

96

Ergebnisse

entsprechend etwa 2 bis 3 Zehnerpotenzen über den Koloniezahlwerten liegen.

Die Anzahl der insgesamt vorhandenen Bakterien (kultivierbare und nicht-

kultivierbare) lässt sich mit mikroskopischen Methoden zur Bestimmung der

Gesamtzellzahl ermitteln. Die Gesamtzellzahlen konnten allerdings in diesen

Proben nicht bestimmt werden, da durch die Anwesenheit von fluoreszierenden

Partikeln in den Proben das Auszählen der Zellen nicht möglich war.

Wenn man die Werte der auf die Trockenmasse bezogenen Koloniezahlen

vergleicht, so ist festzustellen, dass die Koloniezahlen etwa in der Größenordnung

von 107 bis 108 KBE pro g Trockenmasse schwanken; die Gesamtzellzahlen

würden vermutlich um zwei bis drei Zehnerpotenzen höher liegen. Es handelt sich

um Größenordnungen, die für Schlämme und Gewässersedimente soweit

angegeben auch in der Literatur beschrieben worden sind (Montagna, 1982;

Lemmer et al., 1994; Preuß und Hupfer, 1998).

Tabelle 13: Herkunft und Koloniezahlen der Biofilme von Flusswasser-Sedimenten und epilithischen Biofilmen.

Nr. Ort der Probenahme Art der Probe HPC (KBE/ml)

HPC (KBE/g TM)

1 Ufer, Ruhr, nach Ablauf einer Kläranlage

Sediment 7,03 x 107 1,00 x 108

2 Ufer, Rhein vor Ruhrmündung

Sediment 9,80 x 107 1,98 x 108

3 Ufer, Ruhr, Mülheim, Mendener Brücke

Sediment 1,79 x 107 2,52 x 107

4 Ufer, Ruhr, Mülheim, Mendener Brücke

Biofilm von Steinen 9,95 x 106 2,03 x 108

5 Altarm der Ruhr, Mülheim, Mendener Brücke

Sediment 2,28 x 107 4,11 x 107

6 Niers, hinter Kläranlagenauslauf Mönchengladbach-Neuwerk

Sediment 1,75 x 108 9,26 x 108

7 Niers, Betriebsstelle Langendonk bei Grefrath

Sediment 7,23 x 107 1,62 x 108

8 Niers, kurz vor Kläranlage Wetten bei Geldern

Biofilm von Steinen 5,33 x 107 2,32 x 108

HPC, Koloniezahlbestimmung („heterotrophic plate count“)

97

Ergebnisse

Tabelle 14: Zusammensetzung der Biofilme und EPS aus Flusswasserbiofilmen

Kohlenhydrate Proteine Huminstoffe

Trocken-gewicht

Wasser-gehalt Nr.

(mg/ g TM) (mg/ g TM) (mg/ g TM) (% TM/ g FM) (%)

Biofilm 6,2 5,6 114,2 1 EPS 0,01 0,01 0,17

70,1 29,9

Biofilm 6,4 16,9 112,8 2 EPS 0,005 n. n. 0,13

49,5 50,5

Biofilm 4,08 n. a. n. a. 3 EPS 0,01 0,0 0,02

71,0 29,0

Biofilm 4,83 58,70 9,76 4 EPS 0,62 1,94 2,05

4,9 95,1

Biofilm 1,30 6,75 12,64 5 EPS 0,02 0,01 0,17

55,4 44,6

Biofilm 38,6 23,7 151,5 6 EPS 0,08 0,06 0,26

18,9 81,1

Biofilm 16,7 3,0 54,4 7 EPS 0,05 0,02 0,10

44,5 55,5

Biofilm 10,6 2,6 20,9 8 EPS 0,06 0,05 0,09

23,0 77,0

TM, Trockenmasse; FM, Feuchtmasse; n. n., nicht nachgewiesen; n. a., nicht auswertbar.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Ruhr Rhein

Biofilm

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

Ruhr Rhein

EPS

Kohlenhydrate

Proteine

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Ruhr Rhein

Biofilm

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

Ruhr Rhein

EPS

Kohlenhydrate

Proteine

Abbildung 31: Zusammensetzung des Biofilms und der EPS der Proben 1 und 2 aus Flussbiofilmen (Tabelle 14)

98

Ergebnisse

Von den Proben der Flussbiofilme wurde eine Quantifizierung der

Kohlenhydrate (einschließlich Uronsäuren), Proteine und Huminstoffe der Biofilme

und der EPS durchgeführt. In Tabelle 14 sind die Ergebnisse zusammengefasst.

In allen untersuchten Proben bildeten die Huminstoffe den größten Anteil sowohl

im Biofilm als auch in den EPS. Uronsäuren konnten in keiner Probe

nachgewiesen werden. Abbildung 31 zeigt die Zusammensetzung des Biofilms

und der EPS zweier Proben aus Tabelle 14. Die niedrige Konzentration an

Kohlenhydraten und Proteinen in den EPS ist hier deutlich erkennbar.

4.3.3 Zusammensetzung von Biofilmen und EPS aus Trinkwasserverteilungs-

systemen

Exemplarisch wurden zwei Biofilme aus dem Trinkwasserbereich untersucht. Der

Anlass der Untersuchung war die wiederholte Überschreitung des gesetzlich

festgelegten Grenzwertes (Trinkwasserverordnung, 0/100 ml) für coliforme

Bakterien in Trinkwasserproben aus Nord- und Nordwestdeutschland (Kilb et al.,

2003). Das Vorkommen dieser hygienisch relevanten Bakterien im Trinkwasser

wurde auf die Biofilmbildung auf Gummi-beschichteten Absperrschiebern

zurückgeführt. Die Biofilme und EPS dieser Proben wurden untersucht. Hierzu

wurden der Gehalt an Kohlenhydraten und Proteinen bestimmt und auf die

Trockenmasse im Biofilm bezogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15

zusammengefasst und in Abbildung 32 dargestellt. Kohlenhydrate und Proteine

sind sowohl im Biofilm als auch in den EPS in annähernd gleichen

Massenverhältnissen (1:1) vorhanden. Die Konzentrationen der EPS-

Komponenten sind in den EPS etwa um den Faktor 20x niedriger im Vergleich zu

den gemessenen Konzentrationen im Biofilm. Uronsäuren konnten in keiner Probe

als Bestandteile der EPS nachgewiesen werden.

99

Ergebnisse

0

100

200

300

400

500

600

1 2

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

0

5

10

15

20

25

1 2

KohlenhydrateProteine

Biofilm EPS

0

100

200

300

400

500

600

1 2

Geh

alt a

n B

iopo

lym

eren

(mg/

g T

M B

iofil

m)

0

5

10

15

20

25

1 2

KohlenhydrateProteine

Biofilm EPS

Abbildung 32: Zusammensetzung der Biofilme und EPS von Gummi-beschichteten Absperrschiebern aus Trinkwasserverteilungssystemen

Tabelle 15: Zusammensetzung der Biofilme und EPS von Gummi-beschichteten Absperrschiebern aus Trinkwasserverteilungssystemen

Kohlenhydrate Proteine Trockengewicht Wassergehalt

Nr. (mg/ g TM a)) (mg/ g TM a)) (% TM a)/ g FM c)) (%) Biofilm 408,4 533,7 1 EPS 20,7 18,8

1,1 98,9

Biofilm 123,9 215,7 2 EPS 7,1 11,8

8,5 91,5

a) TM, Trockenmasse; b) n. n., nicht nachgewiesen; c) FM, Feuchtmasse

4.3.4 Gelelektrophoretische Analyse der extrazellulären Proteine

Die Zusammensetzung der EPS-Bestandteile von Reinkulturbiofilmen von

P. aeruginosa und Mischkulturbiofilmen aus der Umwelt zeigte deutliche Anteile

an extrazellulären Proteinen in den EPS. Eine qualitative Analyse der Proteine in

den EPS erfolgte durch Auftrennung der Proteine nach Ladung und Größe im

elektrischen Feld mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Die

elektrophoretische Analyse von Proteinen erfolgte unter denaturierenden

100

Ergebnisse

Bedingungen mittels SDS-PAGE unter Verwendung des diskontinuierlichen

Puffersystems nach Laemmli (1970). Es wurden Tris-Glycin-Gele (8 cm x 8 cm)

mit 12 % (w/v) Acrylamid/2,6 % (w/v) Bisacrylamid und Gradientengele mit 4 % bis

20 % (w/v) Acrylamid verwendet. Die Visualisierung der Proteine erfolgte mit der

Silberfärbung (SilverXpress Silver Staining Kit, Fa. Novex), da diese Methode

wesentlich empfindlicher als die Coomassie-Färbung ist und somit mehr

Proteinbanden in der Probe detektiert werden können.

Abbildung 33: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von EPS aus Rein- und Mischkulturbiofilmen (Silberfärbung)

Im Biofilm eines Absperrschiebers aus einem Trinkwassersystem wurden ca. 20

Proteinbanden im Bereich von 25 bis 220 kDa mittels SDS-PAGE gefunden

(Abbildung 33). In der Belebtschlammprobe sind ca. 30 Banden im Bereich von 10

bis 200 kDa erkennbar. In den Umweltbiofilmen sind weit mehr Proteine zu

kDa kDakDa

180220

98

6068

56

2841

3314

25 23

Trinkwassersystem Reinkultur Abwasserbehandlung (Absperrschieber) (P. aeruginosa) (Schlamm)

101

Ergebnisse

erwarten. Dies könnte an der Beschaffenheit der Probenmatrix liegen, die durch

Maskierung der Proteine diese für eine Auftrennung und Anfärbung auf dem Gel

nicht zugänglich macht.

Im Reinkulturbiofilm von P. aeruginosa sind ca. 30 Banden im Bereich unter

100 kDa deutlich erkennbar. Zusätzlich wurden mittels Analyse durch 2D-

Elektrophorese über 100 Protein-Spots nachgewiesen (Broekman,

unveröffentlicht). Die Anwesenheit von Proteinen in den EPS aus Umweltbiofilmen

und im Reinkulturbiofilm von P. aeruginosa konnte hierdurch zusätzlich bestätigt

werden.

102

Diskussion

5 Diskussion 5.1 Modellorganismen in der Biofilmforschung

In der Biofilmforschung werden häufig Reinkulturen von Mikroorganismen, vor

allem Bakterien, zur Anzucht von Modellbiofilmen herangezogen. Hierbei ist es

entscheidend, dass die Anzucht unter definierten Bedingungen erfolgt und

einheitliche Bezugsgrößen für EPS-Gehalte (z. B. Zellzahl oder Trockenmasse im

Biofilm) gewählt werden, damit vergleichbare Resultate z. B. in der

Zusammensetzung der EPS erzielt werden.

Die isolierten EPS eines Umweltbiofilms stellen ein Gemisch aus Biopolymeren

von verschiedenen Mikroorganismen dar. Um Aussagen über die Herkunft

einzelner Komponenten, wie extrazelluläre Enzyme und Polysaccharide treffen zu

können, müssen die Mikroorganismen im Biofilm einzeln kultiviert und einzeln auf

ihre EPS-Zusammensetzung untersucht werden. Da sich die Kultivierung unter

Laborbedingungen stark von den Bedingungen in der Umwelt unterscheidet, kann

es sein, dass unter Laborbedingungen andere EPS von dem gleichen Organismus

produziert werden. Ein großes Problem stellt auch die Tatsache dar, dass die

Mehrheit der Biofilmorganismen nicht mit klassischen mikrobiologischen Methoden

angezüchtet werden kann (Wagner et al., 1993).

In dieser Arbeit wurden Bakterienstämme von P. aeruginosa und P. fluorescens

verwendet, um Reinkulturbiofilme anzuzüchten. Beide Bakterienarten kommen

ubiquitär in der Umwelt vor (Spiers et al., 2000; Wingender et al., 2003). Bei

P. aeruginosa SG81 handelt es sich um ein Umweltisolat aus dem Biofilm eines

technischen Wassersystems (Grobe et al., 1995). Der Stamm P. fluorescens 6/4

wurde von der Innenoberfläche eines PVC-Rohres eines

Trinkwasserverteilungssystems isoliert (Wingender et al., 2003). Aus Biofilmen

beider Reinkulturen wurden die in 0,14 M NaCl-Lösung gelösten EPS durch

Hochgeschwindigkeitszentrifugation isoliert. Mit dieser Methode zur Trennung der

Zellen von den EPS mittels Zentrifugation und Membranfiltration wurden nur in

Wasser gelöste EPS isoliert. Fest an Zellen gebundene EPS sowie hydrophobe

EPS (z. B. Lipide, Phospholipide) konnten nicht berücksichtigt werden. Die

Integrität der Zellen, und somit eine Schädigung durch Zelllysis und Freisetzung

von intrazellulärem Material, verursacht durch die Isolierungsmethode, konnte

103

Diskussion

durch Bestimmung des strikt intrazellulären Enzyms Glucose-6-phosphat-

Dehydrogenase ausgeschlossen werden.

5.1.1 Bewertung von Pseudomonas aeruginosa als Modellorganismus

Das Bakterium P. aeruginosa ist häufig in anthropogen beeinflussten

Oberflächengewässern nachgewiesen worden (Botzenhart et al., 1975; Schubert,

1975; Shoreit und Soltan, 1992; Reali und Rosati, 1994). Biofilme von

Pseudomonas aeruginosa sind auch in der medizinischen Mikrobiologie

beschrieben und gut untersucht worden (Costerton et al., 1999; Singh et al.,

2000). P. aeruginosa bietet zahlreiche Vorteile als Modellorganismus in der

Biofilmforschung, weil dieses Gram-negative Bakterium gut untersucht worden ist

in Bezug auf Genetik, Biochemie und Physiologie. Des Weiteren ist P. aeruginosa

ein hygienisch relevanter Organismus als opportunistisch pathogener Keim.

P. aeruginosa wurde in Biofilmen unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen:

Umwelt, klinischer Bereich, technische Wassersysteme (z. B. Hausinstallationen).

Biofilme sind ein natürliches Habitat für P. aeruginosa. Diese Bakterienart kann

sich in Biofilme einnisten und dort persistieren, aber auch als Primärbesiedler

Oberflächen kolonisieren und Biofilme bilden (Drenkard und Ausubel, 2002;

Flemming und Wingender, 2002b; Schwenk, 2002).

Biofilme dieser Bakterienart in technischen Wassersystemen, auf medizinischen

Geräten und Implantaten, Kathetern stellen eine Infektionsgefahr für den

Menschen dar (Botzenhart und Döring, 1993; Costerton et al., 1999). Für

Patienten mit Cystischer Fibrose (CF) als Wirt ist die Besiedlung der Lungen mit

Biofilmen von P. aeruginosa die Hauptursache für die hohe Sterblichkeitsrate

(Govan und Deretic, 1996; Smith et al., 1996). Singh et al. (2000) haben

nachgewiesen, dass P. aeruginosa permanent die Lungen von CF-Patienten

besiedelt. Durch Biofilmbildung in der Lunge ist P. aeruginosa in der Lage eine

Behandlung mit Antibiotika zu überleben.

104

Diskussion

5.1.2 Biofilme von P. aeruginosa auf Agarnährmedien als Modellsystem

In der Biofilmforschung werden Reinkulturbiofilme von Modellorganismen,

darunter meist nichtmucoide (nicht schleimbildende) Stämme von P. aeruginosa

(häufig der Stamm P. aeruginosa PAO1) eingesetzt (Muto und Goto, 1986; Singh

et al., 2000; Purevdorj et al., 2002; Davey et al., 2003; Wozniak et al., 2003). Die

mucoiden Varianten von P. aeruginosa zeichnen sich durch eine Überproduktion

des Exopolysaccharids Alginat aus. Sie wurden überwiegend in Biofilmen von

klinischen Stämmen von P. aeruginosa beschrieben (Govan, 1990). Die

Alginatproduktion von P. aeruginosa ist intensiv untersucht worden, seitdem

vermutet wurde, dass die Biosynthese dieses Exopolysaccharids eine

entscheidende Rolle bei Lungeninfektionen von Patienten mit Cystischer Fibrose

spielt (Gacesa und Russell, 1990). Viele Untersuchungen haben wertvolle

Informationen über die Genetik und den Mechanismus der bakteriellen

Alginatproduktion geliefert, obwohl dieser bis heute noch nicht vollständig

aufgeklärt ist (Gacesa, 1998). Die Fähigkeit zur Produktion von bakteriellem

Alginat wurde auch an nicht-pathogenen Mikroorganismen, wie z. B.

P. fluorescens, P. putida, Azotobacter vinelandii untersucht (Horan et al., 1981;

Sengha et al., 1989; Conti et al., 1994; Fett et al., 1995). Diese Arbeiten zeigten,

dass unter geeigneten Anzuchtsbedingungen signifikante Mengen an Alginat in

den EPS nachgewiesen werden konnten.

Da P. aeruginosa unabhängig von seiner Herkunft die Fähigkeit zur

Alginatbiosynthese besitzt und die Alginat-Überproduktion von großer Bedeutung

für das Überleben der Bakterien an aquatischen Standorten ist, kann man davon

ausgehen, dass weit mehr Stämme von P. aeruginosa aus der Umwelt mucoid

sind, als bisher angenommen wird. Dies ist vermutlich auf die Wahl der

Isolierungsmedien zurückzuführen, die aufgrund der Hemmstoffe im Medium zur

Unterdrückung der Begleitflora (Cetrimid, Irgasan) eine geringe Wiederfindung von

mucoiden Kolonietypen zulassen oder im Fall des Cetrimid-Agars diese sogar

komplett verhindern (Grobe et al., 1995).

Ein Ziel dieser Arbeit war eine standardisierte Anzucht von P. aeruginosa

Biofilmen auf Agarnährmedien für die Analyse der von diesem mucoiden Stamm

gebildeten EPS (Fließschema in Abbildung 34, s. u.). P. aeruginosa SG81 bildete

rasch und reproduzierbar einen konfluenten Bakterienrasen auf der Oberfläche

105

Diskussion

von Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA). Die standardisierte Anzucht der

Biofilme auf Membranfiltern diente als Grundlage für mikroskopische

Untersuchungen zur Visualisierung der EPS (Strathmann, 2003).

Die ungesättigten Biofilme haben sich an der Grenzfläche Agarmedium – Luft

ausgebildet. Diese Art der Anzucht wurde in der Literatur für Reinkulturbiofilme

von Staphylococcus epidermidis (Christensen et al., 1990; Drewry et al., 1990),

Pseudomonas putida (Holden et al., 1997; Auerbach et al., 2000), Klebsiella

pneumoniae (Huang et al., 1998) und P. aeruginosa (Marty et al., 1992;

Steinberger et al., 2002) beschrieben.

Einzelkolonieausstrich (PIA, 36 °C, 24h)

Suspension der Bakterien (in 0,14 M NaCl, 108 Zellen pro ml)

Ausplattieren Membranfiltration (0,1 ml auf PIA, 36 °C, 24h) (Cellulosemischester 0,45 µm,

PIA, 36 °C, 24h)

Biofilm Biofilm auf Membranfilter auf Agaroberfläche

Abbildung 34: Fließschema der Anzucht der Modellbiofilme von P. aeruginosa

5.1.3 Isolierung der EPS durch Homogenisation und Zentrifugation

Die Isolierung der EPS aus den Modellbiofilmen von P. aeruginosa erfolgte

durch Homogenisation der Biofilmsuspension in NaCl-Lösung und darauf

folgender Hochgeschwindigkeitszentrifugation zur Abtrennung der EPS von den

106

Diskussion

Zellen (Abbildung 35, s. u.). Durch Membranfiltration wurden die restlichen

Bakterien im Überstand entfernt. Durch Dialyse gegen Deionat wurden

niedermolekulare Bestandteile aus der klaren Lösung entfernt. Diese Lösung oder

das gefriergetrocknete Produkt daraus stellte die gesamten isolierten EPS dar.

Aufgrund der gewählten Methode konnten gelöste wasserlösliche EPS isoliert

werden. Fest an Zellen gebundene EPS oder hydrophobe EPS wurden auf diese

Weise nicht berücksichtigt.

Anzucht der Biofilme (PIA, 36 °C, 24h)

Homogenisation der Biofilmsuspension(0,14 M NaCl, 30 min Rühren)

Zentrifugation (40 000g, 10 °C, 2h)


Dialyse (gegen 2 x 5 l Deionat, 24h)

Gefriertrocknung

Abbildung 35: Fließschema der Isolierung von EPS aus den Modellbiofilmen von P. aeruginosa

Für die Isolierung der EPS aus Biofilmen von P. aeruginosa konnte die Effektivität

der Isolierungs-Methode anhand der Uronsäuregehalte im Biofilm und in den EPS

von P. aeruginosa berechnet werden (Tabelle 6). Uronsäuren können als

extrazellulärer Marker herangezogen werden, wenn berücksichtigt wird, dass die

107

Diskussion

Uronsäuren (Alginat) fast ausschließlich extrazellulär vorhanden sind (Fazio et al.,

1982; Rehm und Valla, 1997; Gacesa, 1998). Bezogen auf die Trockenmasse im

Biofilm konnten somit 91 % der im Biofilm vorhandenen EPS isoliert werden.

5.1.4 Biochemische Assays zur Quantifizierung der EPS-Bestandteile

Für die Bestimmung der quantitativen Zusammensetzung der EPS ist die

Auswahl geeigneter Assays erforderlich. Hierbei war die Störanfälligkeit der

Assays durch andere EPS-Bestandteile besonders zu berücksichtigen. Die EPS-

Komponenten Polysaccharide, Proteine, Huminstoffe, Glycolipide und

Nucleinsäuren wurden mit photometrischen und fluorimetrischen Assays

bestimmt.

Die Konzentration an Polysacchariden in den EPS kann nicht direkt bestimmt

werden, sondern über Reaktionen ihrer Monomerbausteine, den

Monosacchariden, die nach Hydrolyse ihrer glykosidischen Bindungen zugängig

sind. Der Abbau von Kohlenhydraten mit starken Säuren ist bereits seit langem

bekannt. Unter kontrollierten Bedingungen führt die Hydrolyse von

Monosacchariden in wässriger Lösung zur Bildung von Furfural-Derivaten als

Hauptprodukte (Newth, 1951). Die Bildung von Furfural ist eine Säure-katalysierte

Kondensationsreaktion, bei der 3 mol Wasser aus 1 mol Hexose oder Pentose

abgespalten werden. Eine Anzahl von bekannten Farbreaktionen, die spezifisch

für Kohlenhydrate sind, ist abhängig von der Bildung von Furfural-Derivaten durch

Reaktion mit starken Säuren. Das Furfural-Produkt wird mit einer phenolischen

Verbindung oder Arylaminen zu farbigen Verbindungen kondensiert (Übersicht in

Tabelle 16, s u.).

Bereits Molisch (1886) hat beobachtet, dass Zucker, nach der Hydrolyse mit

Schwefelsäure, mit α-Naphthol eine Kondensationsreaktion eingehen. Die

purpurne Farbreaktion wird von fast allen Kohlenhydraten, außer Alditolen und 2-

Amino-2-deoxy-Zuckern gebildet. Die konzentrierte Schwefelsäure hydrolysiert die

glykosidischen Bindungen der Polysaccharide. Die resultierenden

Monosaccharide reagieren dann weiter mit Schwefelsäure zu den Furfural-

Derivaten. Die Furfurale kondensieren dann mit α-Naphthol und bilden purpurn

gefärbte Produkte. Da Ketosen schneller zu den Furfuralen dehydratisieren als die

108

Diskussion

entsprechenden Aldosen, hat Roe (1934) einen spezifischen Seliwanoff-Assay für

Ketosen mit einer milderen Hydrolyse mit 3 M HCl und Resorcin entwickelt. Ein

rotes Präzipitat wird bei Anwesenheit von Ketosen gebildet. Wenn Pentosen mit

konzentrierter (12 M) HCl erhitzt werden, reagieren sie zu blau-grün gefärbten

Produkten mit Orcinol und Eisenionen. Diese Reaktion wird als Bial-Assay

bezeichnet und ist spezifisch für Pentosen (Dische und Schwarz, 1937). Obwohl

Hexosen auch im Bial-Assay reagieren, bilden sie nur eine schwache gelbe

Färbung, die von der blau-grünen Färbung der Pentosen maskiert wird. 2-

Deoxypentosen werden sehr langsam dehydratisiert im Vergleich zu den

Pentosen und reagieren deshalb nicht im Bial-Assay. Somit kann D-Ribose in

Anwesenheit von 2-Deoxy-D-ribose detektiert werden.

Die Reaktion von Kohlenhydraten mit konzentrierter Schwefelsäure und Phenol

wird benutzt, um quantitativ den Gehalt an Kohlenhydraten in Lösung zu

bestimmen. Bei einer Methode von Dreywood (1946) benutzte man Anthron gelöst

in konzentrierter Schwefelsäure. Probleme der Stabilität des Reagenzes und die

relative Unlöslichkeit von Anthron in Wasser haben zum Ersatz der Anthron-

Schwefel-Säure-Methode durch die Phenol-Schwefelsäure-Methode (Dubois et

al., 1956) geführt. Phenol ist löslich in Wasser und muss nicht vor Gebrauch in

Schwefelsäure gelöst werden. Fox und Robyt (1991) haben eine Mikromethode für

die Analyse von 98 Proben in Mikrotiterplatten entwickelt. Eine Überprüfung dieser

Methode ergab, dass die Messwerte zu stark gestreut haben und die Methode

daher für die Bestimmung der Kohlenhydrate in den EPS in dieser Arbeit nicht

geeignet war.

In der Biofilmforschung wird die Phenol-Schwefelsäure-Methode (Dubois et al.,

1956) häufig zur Bestimmung von Kohlenhydraten in den EPS eingesetzt. Die

Anthron-Methode (Dreywood, 1946) hingegen wird seltener verwendet. In dieser

Arbeit wurde ausschließlich die Phenol-Schwefelsäure-Methode (Dubois et al.,

1956) zur Messung des Gehalts an Kohlenhydraten in den EPS aufgrund der o. a.

Probleme mit dem Anthron-Reagenz verwendet.

Die Uronsäuren sind eine Teilmenge der Kohlenhydrate und können von den

entsprechenden Monosacchariden dadurch abgeleitet werden, dass sie am C-6

Atom mit einer Carboxylgruppe substituiert sind. Uronsäuren wurden qualitativ und

quantitativ nach Dische (1947) mit Carbazol anstelle von Phenol als Reagenz

109

Diskussion

bestimmt. Neutrale Hexosen und Pentosen beeinträchtigen den Nachweis von

Uronsäuren im Carbazol-Assay. Blumenkrantz und Asboe-Hansen (1973) haben

eine Methode entwickelt, bei der Uronsäuren mit konzentrierter Schwefelsäure

und Tetraborat behandelt werden, und dann durch Reaktion mit m-

Hydroxybiphenyl nachgewiesen werden. Die Zugabe von m-Hydroxybiphenyl

anstelle von Carbazol hat den Nachweis von Uronsäuren in Anwesenheit von

neutralen Zuckern deutlich verbessert. Dennoch stören größere Mengen an

neutralen Zuckern in diesem Assay. Die Braunfärbung durch neutrale Zucker kann

nach Filisetti-Cozzi und Carpita (1991) durch Zugabe kleiner Mengen an Sulfamat

um den Faktor 20 reduziert werden.

In der Literatur zur EPS-Analytik wurden bisher fast ausschließlich der

Carbazol-Assay (Dische, 1947) oder die Biphenyl-Methode (Blumenkrantz und

Asboe-Hansen, 1973) zur Quantifizierung der Uronsäuren in den EPS

beschrieben. Der Sulfamat-Biphenyl-Assay (Filisetti-Cozzi und Carpita, 1991)

wurde bisher nicht für die Analytik der EPS von P. aeruginosa eingesetzt.

Aufgrund der höheren Spezifität für Uronsäuren und der geringeren

Störanfälligkeit dieses Assays wurde er für die Bestimmung der Uronsäuren in den

EPS in dieser Arbeit ausgewählt.

Der Nachweis von Proteinen in wässriger Lösung erfolgt am einfachsten durch

Messung der Absorption bei 280 nm, die von den aromatischen Aminosäuren

(maßgeblich Tryptophan) hervorgerufen wird. Da die Nucleinsäuren in diesem

Bereich ebenfalls absorbieren, müssen diese durch einen Korrekturfaktor

herausgerechnet werden. Bei kleinen Mengen an Nucleinsäuren können sie

vernachlässigt werden. Eine wesentlich aufwendigere Abschätzung der

Proteinmenge in einer Probe liefert die Bestimmung von Stickstoff nach Kjeldahl

(1883). Hierbei wird Protein-Stickstoff nach Oxidation zu NH3 titrimetrisch

bestimmt.

110

Tabelle 16: Qualitative und quantitative Methoden zur Kohlenhydratbestimmung

Assay Säure Phenolisches

Reagenz Nachweis Typ Nachweis-grenze Farbe (Amax) Literatur

Molisch H2SO4 α-Naphthol alle Kohlenhydrate a) qualitativ 10 µg/ml purpurn Molisch (1886)

Anthron H2SO4 Anthron alle Kohlenhydrate quantitativa) 50 µg/ml blau-grün (600 nm) Dreywood (1946)

Phenol-Schwefelsäure

H2SO4 Phenol alle Kohlenhydrate quantitativ a) 7 µg/ml orange (480 oder 490 nm)

Dubois et al. (1956)

Seliwanoff HCl Resorcin Ketosen qualitativ 25 µg/ml rot Roe (1934)

Bial HCl Orcinol Pentosen b) qual./quant. 20 µg/ml blau-grün (600 nm) Dische und Schwartz (1937)

Dische H2SO4 Carbazol c) Uronsäuren qual./quant. 10 µg/ml purpurn (535 nm) Dische (1947)

Biphenyl H2SO4 mit Tetraborat

m-Hydroxybiphenyl Uronsäuren qual./quant. 2 µg/ml rosa (525 nm) Blumenkrantz und Asboe-Hansen (1973)

Sulfamat-Biphenyl

H2SO4 mit Tetraborat; Sulfamat

m-Hydroxybiphenyl Uronsäuren qual./quant. 4 µg/ml rosa (525 nm) Filisetti-Cozzi und Carpita (1991)

a) alle Kohlenhydrate außer Zuckeralkoholen, 2-Amino und 2-Acetamido-, und 2-Deoxy-Zuckern b) alle Pentosen außer 2-Deoxy-Pentosen c) Carbazol = Dibenzopyrrol

111

Tabelle 17: Qualitative und quantitative Methoden zur Proteinbestimmung

Assay Farbreagenz Nachweis Typ Empfindlichkeit Farbe (Amax) Literatur

UV-Methode - Absorption der aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin

quantitativ 20 µg/ml UV (280 nm) Lottspeich und Zorbas (1998)

Kjeldahl-Methode

- Titrimetrische Best. von Protein-Stickstoff als NH3 nach Oxidation

quantitativ - - Lottspeich und Zorbas (1998)

Ninhydrin Ninhydrin-Reagenz Reaktion von Ninhydrin und freier Aminosäure und Bildung des Farbstoffs „Ruhemans Violett“

qual./quant. 50 pmolAminosäure

purpurblau (570 nm)

Lottspeich und Zorbas (1998)

Biuret Biuret (Carbamoyl-harnstoff)

Reaktion von gel. Biuret und CuSO4 in alkal. wässr. Milieu

qual./quant. 1-10 µg/ml rotviolett (550 nm) Lottspeich und Zorbas (1998)

Lowry Biuret und Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz

Kombination von Biuret-Reaktion mit Folin-Ciocalteu-Phenolreagenz

qual./quant. 0,1-1 µg/ml blau (750 nm) Lowry et al. (1951)

BCA Bicinchoninsäure (BCA)

Kombination der Biuret-Reaktion mit BCA-Komplexierung con Cu+

qual./quant. 0,1-1 µg/ml (562 nm) Smith et al. (1985)

Bradford Coomassie-Brilliantblau G 250

Komplexbildung von Coomassie-Brilliantblau G 250 mit Proteinen

qual./quant. 0,05-0,5 µg/ml rot (595) Bradford (1976)

112

Diskussion

Zur Quantifizierung von Proteinen in EPS werden im Wesentlichen drei

Methoden eingesetzt: Die Protein-Bestimmung nach Lowry et al. (1951), die

Bicinchoninsäure- (BCA) Methode (Smith et al., 1985) und die Farbstoffbindungs-

Methode nach Bradford (1976). Der Lowry- und der BCA-Assay beruhen auf der

Biuret-Reaktion von Peptidbindungen mit Cu2+-Ionen. Der BCA-Assay reagiert

auch mit reduzierenden Zuckern, daher führen Kohlenhydrate (Monosaccharide

und reduzierende Enden von Polysacchariden) zu Störungen im BCA-Assay. Beim

Farbstoffbindungs-Assay nach Bradford sind keine Kupfer-Ionen involviert. Durch

Komplexbildung des Farbstoffs Coomassie Brilliantblau wird im sauren Milieu

dessen Absorptionsmaximum von 465 nm zu 595 nm verschoben. Durch

Proteinbestimmungen nach Bradford in EPS-Lösungen wird der Gehalt an

Proteinen in den EPS von Reinkulturbiofilmen und Belebtschlämmen deutlich

unterschätzt (Frølund et al., 1996; Rode, 1999; Wingender et al., 2001). Der

Farbstoffbindungs-Assay (Bradford, 1976) stellte sich für die EPS-Analytik als

nicht geeignet heraus. Durch Überprüfung der o. a. Methoden zur

Proteinbestimmung auf Störungen anderer EPS-Komponenten ergab sich, dass

die Lowry-Methode (Lowry et al., 1951) am geringsten beeinflusst wurde und sich

somit für die Bestimmung von Proteingehalten in den EPS als geeignet erwies.

Diese Methode ist in der EPS-Analytik am weitesten verbreitet.

Nucleinsäuren (DNA) wurden nur in sehr geringen Mengen (≤ 0,2 µg/ml) in den

EPS von P. aeruginosa mit dem PicoGreen-Assay (Fa. Molecular Probes)

nachgewiesen (Wingender et al., 2001). Für die Bestimmung von DNA in den EPS

von Umweltproben wird häufig die DAPI-Methode (Brunk et al., 1979) eingesetzt.

5.1.5 Zeitliche Dynamik der EPS-Zusammensetzung von P. aeruginosa

Durch Anzucht von P. aeruginosa SG81 bei zunehmender Dauer der Bebrütung

auf Agarnährmedien bei konstanter Temperatur (36 °C) wurde die Veränderung

der EPS-Zusammensetzung mit zunehmendem Alter des Biofilms untersucht. Die

Modellbiofilme wurden exemplarisch als konfluenter Bakterienrasen auf

Pseudomonas Isolierungs-Agar (PIA) für bis zu 7 Tage angezüchtet und die

daraus isolierten EPS biochemisch quantifiziert (Abschnitt 4.1.2, S. 65). Die

Biomasse ist über den untersuchten Zeitraum von bis zu 7 Tagen von 4 % TM/ g

113

Diskussion

FM auf 6 % TM/ g FM zugenommen (Abbildung 5 rechts, S. 65). Gleichzeitig ist

die Zellzahl um den Faktor 6 von 3,0 x 1011 Zellen/ g TM auf 5,0 x 1010 Zellen/ g

TM gesunken (Abbildung 5 links, S. 65). Dies liegt vermutlich daran, dass die

Zellen im Biofilm kontinuierlich mehr EPS produzieren. Bezogen auf die

Trockenmasse im Biofilm entwickeln sich die Gehalte der EPS-Komponenten

unterschiedlich. Kohlenhydrat- und Uronsäuregehalte verändern sich bis zu 72 h

Anzucht und nehmen dann nach 7 d in den EPS um fast 50 % zu. Der

Proteingehalt im Biofilm nimmt kontinuierlich ab, was auf die abnehmende Zellzahl

im Biofilm zurückzuführen ist. Der zeitliche Verlauf der Gehalte der EPS-

Komponenten bezogen auf die Zellzahl im Biofilm zeigt in den EPS bis zu 72 h

keine signifikanten Unterschiede. Nach 7 d ist eine starke Zunahme der

Kohlenhydrat- bzw. Uronsäure-Konzentration zu beobachten.

Auch Marty et al. (1992) haben für mucoide P. aeruginosa-Stämme eine Zunahme

der Alginatproduktion auf PIA bei länger werdender Kultivierung der Biofilme (24

bis 72 h bei 37 °C) beobachtet. Vermutlich ist auch hier die steigende

Alginatproduktion auf den zunehmenden Nährstoffmangel im Nährmedium

zurückzuführen. Ein Grund könnte darin liegen, dass die Bakterien mit

zunehmendem Alter des Biofilms mehr EPS produzieren und diese im Biofilm

akkumulieren, um beispielsweise Hungerperioden zu überstehen. Hentzer et al.

(2001) haben gefunden, dass die Überproduktion von Alginat zu einem strukturell

sehr heterogenen Biofilm führt. Dieser Biofilm ist wesentlich resistenter gegenüber

Antibiotika als der eines nichtmucoiden Stammes. Die EPS können im Biofilm

auch für die Sorption von Nährstoffen aus der Umgebung dienen (Flemming,

1995). Daher ist denkbar, dass ein sehr heterogener Biofilm, mit viel EPS und

einer größeren Oberfläche, mehr Nährstoffe sorbieren kann.

5.1.6 Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa Biofilmen in Abhängigkeit

von den Nährstoffbedingungen

Es ist bekannt, dass die Art und Menge der Polymeren, die von Bakterien

produziert werden, üblicherweise von einer Reihe von Faktoren, wie der Art des

limitierenden Substrats (Elektronendonor und –Akzeptor), Stickstoff- und

Phosphor-Limitierung und Wassergehalt abhängt (Sutherland, 1988; Roberson

114

Diskussion

und Firestone, 1992; Nielsen et al., 1997). Relativ wenig ist über den Einfluss

dieser Faktoren auf Biofilme bekannt. Die Auswirkung von Sauerstoff- und

Kohlenstoff-Limitierung auf Biofilme wurde untersucht (Applegate und Bryers,

1991; Xu et al., 1998; Chandy und Angles, 2001; Allan et al., 2002). Applegate

und Bryers (1991) haben beschrieben, dass der Gehalt an EPS bezogen auf die

Zellzahl bei Kohlenstoff-limitierten Biofilmen größer war, als bei

Sauerstofflimitierung. Weitere wichtige Faktoren sind die Ionenstärke und die

Zusammensetzung der Ionen im Biofilm, die die mikrobielle EPS-

Zusammensetzung beeinflussen (Sutherland, 1988).

In dieser Arbeit wurde die Zusammensetzung der EPS von P. aeruginosa-

Biofilmen nach Anzucht auf verschiedenen Nährmedien untersucht (Abschnitt

4.1.3, S. 67). Die Analyse der EPS-Bestandteile zeigte, dass bei Kultivierung der

Biofilme auf synthetischen Nährmedien mit Natriumcitrat als C-Quelle und Nitrat

als N-Quelle die höchsten Gehalte an Kohlenhydraten und Uronsäuren in den

EPS nachgewiesen wurden (Abbildung 8, S. 68 und Tabelle 18). Proteine in den

EPS waren hingegen bei Anzucht auf den synthetischen Nährmedien (APM,

Ammonium-Agar und Nitrat-Agar) kaum nachweisbar. Nur die auf den

undefinierten Nährmedien PIA (C-Quelle Glycerin und N-Quelle Pepton) und Nähr-

Agar (C- und N-Quelle Fleischextrakt und Pepton) kultivierten Biofilme wiesen

deutliche Anteile an Proteinen in den EPS auf.

Tabelle 18: Bildung von EPS von P. aeruginosa bei Anzucht auf verschiedenen Nährmedien

Kohlenhydrate Proteine Nährmedium Biofilm EPS Biofilm EPS

PIA + + + ++ APM + + + o Ammonium-Agar + + ++ o Nähr-Agar + + ++ + Nitrat-Agar ++ ++ + - EPS-Produktion: ++, viel; +, mittel; o, wenig; -, nicht nachweisbar

Marty et al. (1992) haben klinische Stämme von P. aeruginosa auf

verschiedenen Nährmedien angezüchtet (Alginat Promoting Medium (APM) mit

Gluconat und Glutamat (Ohman und Chakrabarty, 1981), Goto-Murakawa-Medium

115

Diskussion

mit Glucose und Glutamat (Goto et al., 1973), Pseudomonas Isolierungs-Agar

(PIA) mit Glycerin (Fa. Difco), McConkey’s Agar mit Lactose (Fa. BioMérieux),

Nähragar Hefeextrakt mit Glutamat (Fa. Difco), Minimal Medium (MM) mit

verschiedenen C-Quellen (Vogel und Bonner, 1956)) und die Zusammensetzung

der extrazellulären Polysaccharide untersucht. Sie konzentrierten sich dabei

ausschließlich auf die Polysaccharide und deren Isolierung. Sie haben die

Alginatproduktion in Abhängigkeit von der C-Quelle untersucht, wobei Glycerin als

C-Quelle am besten geeignet war. Als Isolierungsmethode für EPS wurde eine

Fällung mit Ethanol vorgenommen. Mit Ethanol werden überwiegend

Polysaccharide selektiv aus den EPS gefällt. Die Gehalte anderer EPS-

Komponenten, wie z. B. Proteine, werden dadurch unterschätzt. Eine mögliche

Zelllysis (beispielsweise mit intrazellulären Markern) wurde von Marty et al. (1992)

nicht überprüft. Durch Lysis der Bakterienzellen gelangen intrazelluläre

Bestandteile, wie Proteine oder Nucleinsäuren, in den extrazellulären Raum. Die

EPS-Gehalte dieser Komponenten werden dadurch überschätzt.

5.1.7 Abhängigkeit der EPS-Zusammensetzung von der Isolierungsmethode

Die Zusammensetzung der EPS-Komponenten wurde in Abhängigkeit von der

Isolierungsmethode der EPS exemplarisch an P. aeruginosa Biofilmen auf

Agarnährmedien mit und ohne Calcium-Zusatz untersucht (Abschnitt 4.1.4, S. 68).

Vier verschiedene Isolierungsmethoden kamen zum Einsatz: Hoch-

geschwindigkeitszentrifugation, Dowex, Kronenether, Formaldehyd und

Formaldehyd mit NaOH. Die Isolierung der EPS auf Agarnährmedium mit

Calcium-Zusatz war nur mit der Dowex- und der Formaldehyd/ NaOH-Methode

effektiv (Tabelle 19). Die höchsten Gehalte an Kohlenhydraten, Uronsäuren und

Proteinen in den EPS bezogen auf die Trockenmasse im Biofilm wurden mit der

Dowex-Methode erzielt. Für die Proteingehalte in den EPS wurden mit der Dowex-

Methode und der Zentrifugation etwa gleich große Mengen isoliert. Die Isolierung

der EPS mit Formaldehyd ist nicht geeignet, um EPS aus Biofilmen von

P. aeruginosa zu extrahieren.

116

Diskussion

Tabelle 19: Ausbeute an EPS in Biofilmen von P. aeruginosa SG81 nach Anzucht auf PIA bzw. PIA mit Calcium-Zusatz (CaPIA) in Abhängigkeit von der Methode der EPS-Isolierung. Die Werte wurden aus den Abbildungen 9 und 10 (S. 69 f.) berechnet und auf die Gehalte im Biofilm bezogen.

Ausbeute in % EPS * PIA CaPIA

Methode der Isolierung

Kohlen-hydrate

Uron-säuren

Proteine Kohlen-hydrate

Uron-säuren

Proteine

Zentrifugation 63 91 39 17 7 22 Dowex 96 99 40 99 99 34 Kronenether 92 99 36 19 3 24 Formaldehyd 47 55 27 8 1 26 Formaldehyd/ NaOH

56 61 27 79 59 27

* bezogen auf die Gehalte im Biofilm

In der Literatur haben Brown und Lester (1980) festgestellt, dass die Isolierung

der EPS für Biofilme von K. aerogenes mittels Hochgeschwindigkeitszentrifugation

am effektivsten ist. Nielsen und Jahn (1999) haben auch die Zentrifugation als

effektive Methode zur Trennung wasserlöslicher EPS von den Bakterienzellen

beschrieben. Bei P. aeruginosa Biofilmen auf Agarnährmedien ohne Calcium-

Zusatz konnte das in dieser Arbeit bestätigt werden. Wenn zum Nährmedium

Calcium hinzugefügt wurde, gelang keine effektive Isolierung der EPS mittels

Zentrifugation. Die Isolierung mit der Dowex-Methode ist hier überlegen, da der

Kationenaustauscher effektiv das Calcium bindet und danach die wasserlöslichen

EPS durch Zentrifugation abgetrennt werden können.

5.1.8 Untersuchung der Polysaccharide in den EPS von P. aeruginosa

5.1.8.1 Isolierung und Reinigung von Alginat

Bei der Isolierung und Reinigung von bakteriellem Alginat wurde beobachtet,

dass nach der Enzymbehandlung für 24 h eine Trübung der Lösung auftrat. Diese

Trübung deutete auf eine Verunreinigung der Probe durch Mikroorganismen hin.

Die Suche nach der Infektionsquelle ergab, dass nur die Enzympräparate für die

Verunreinigung verantwortlich sein können, da ansonsten mit sterilen Lösungen

und unter aseptischen Bedingungen gearbeitet wurde. Eine Bebrütung einer

Lösung des Protease-Präparates zeigte, dass eine Bacillus-Art in der Lösung

vorhanden war. Daraufhin wurde die Reinigungsprozedur für Alginat umgestellt.

117

Diskussion

Die Membranfiltration bei der Alginatreinigung war ein großer und teurer

Umstand. Sie gewährleistete aber, dass letzte Reste von Bakterien entfernt

wurden.

Die Nucleinsäuren in den EPS wurden mit Endonucleasen abgebaut und somit

für die Alginatreinigung aus den EPS entfernt. Benzonase ist eine Endonuclease,

die aus E. coli hergestellt wird. Sie ist unspezifisch und baut alle Formen von DNA

und RNA ab, sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige DNA. Außerdem

handelt es sich um eine Lösung, und war somit leichter zu handhaben als die

Präparate in Pulverform.

Mittels IR-Spektroskopie wurde nachgewiesen, dass das Rohalginat (vor der

Enzymbehandlung) mit DNA verunreinigt ist (Abbildung 13, S. 75). Durch die

Aufnahme von Absorptionsspektren der EPS, gereinigtem Alginat und dem

Zellpellet nach der Zentrifugation wurde gezeigt, dass die Proteine und DNA in

den EPS durch die Enzymbehandlung effektiv entfernt wurden (Abbildung 14, S.

76). Gereinigtes Alginat von P. aeruginosa wies im Absorptionspektrum keine

Absorption im Bereich von 260 nm und 280 nm auf.

Die Methode der Isolierung und Reinigung des Polysaccharids Alginat aus

P. aeruginosa SG81 wurde angepasst und die Effektivität der Reinigung wurde

erfolgreich überprüft.

5.1.8.2 Bestimmung der Zuckerzusammensetzung in den EPS von

P. aeruginosa

Es sollte geklärt werden, ob Alginat tatsächlich das einzige Polysaccharid in

den EPS von P. aeruginosa SG81 ist. Hinweise darauf ergaben sich durch die

Anionenaustauschchromatographie der EPS von P. aeruginosa (Abbildung 16,

S.78). In der Literatur sind neutrale Polysaccharide in Biofilmen von P. aeruginosa

beschrieben worden (Marty et al., 1992).

Durch Totalhydrolyse der EPS wurden die Polysaccharide in ihre monomeren

Bestandteile zerlegt. Mittels Dünschichtchromatographie (DC) an HPTLC-Platten

wurden die Monosaccharide in den sauren Totalhydrolysaten der EPS von

P. aeruginosa aufgetrennt. Bei der für Uronsäuren angepassten DC-Methode

118

Diskussion

(Abbildung 11 II, S. 73) konnten die Bausteine des Alginats, L-Guluronat und D-

Mannuronat zugeordnet werden. Weitere Uronsäuren konnten in der Probe nicht

nachgewiesen werden. Die Dünnschichtchromatographie der Neutralzucker ergab

für das Totalhydrolysat der EPS von P. aeruginosa unter Hydrolysebedingungen

für neutrale Zucker keinen Nachweis von neutralen Zuckern in den EPS von

P. aeruginosa.

Evans und Linker (1973) haben mucoide klinische Stämme von P. aeruginosa

isoliert und deren Biofilme auf Agarnährmedium untersucht. Sie haben ebenso in

der Polysaccharid-Fraktion ausschließlich Guluronat und Mannuronat

nachgewiesen. Die Alginate der verschiedenen klinischen Stämme unterschieden

sich in ihrem Mannuronat- / Guluronat-Verhältnis und in dem Grad der

Acetylierung. Carlson und Matthews (1966) haben mucoide Stämme von

P. aeruginosa aus dem klinischen Bereich isoliert. Die Analyse der Polysaccharide

ergab, dass die Stämme ausschließlich Alginat produzieren und weder neutrale

Zucker noch Hexosamine als Monomer-Bausteine von Polysacchariden

nachgewiesen wurden.

Marty et al. (1992) haben die extrazellulären Polysaccharide von zwei

klinischen Stämmen von P. aeruginosa isoliert. Die Polysaccharid-Fraktion wurde

mittels Gaschromatographie und 1H-NMR Spektroskopie untersucht. Neben einer

Alginatfraktion haben sie noch eine neutrale Polysaccharid-Fraktion

nachgewiesen. Die Analyse der Zusammensetzung der neutralen Fraktion ergab

ein Gemisch aus Glucose, Galactose, Rhamnose und Hexosaminen. Marty et al.

(1992) vermuten, dass diese Monosaccharide von der Seitenkette der

Lipopolysaccharide stammen. Ein neutrales Polysaccharid in den EPS von

mucoiden P. aeruginosa Stämmen wurde nicht nachgewiesen.

5.1.8.3 Auftrennung der Polysaccharid-Fraktionen nach Molekülgröße

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Polysacchariden in den EPS,

die die Bildung einer dreidimensionalen Netzwerkstruktur beeinflussen, hängen

sowohl von der molekularen Struktur, als auch von ihrer Kettenlänge und folglich

ihrer Molmasse ab. Für die säulenchromatographische Analyse von EPS wurden

die Ionenaustauschchromatographie sowie die Gelfiltration eingesetzt (Abschnitt

119

Diskussion

4.1.6, S. 73). Die Auftrennung der EPS nach ihrer molaren Masse erfolgte durch

Gelfiltration an Sephacryl S-500 HR. Die mit der Gelfiltration ermittelte molare

Masse des Alginats liegt im Bereich von 106 g/mol. Grobe et al. (1995) haben

mittels Viskosimetrie (Methode nach (Smidsrød, 1970)) die Molmasse von Alginat

zu 2,37 x 106 g/mol bestimmt. Die Bestimmung der Molmasse von

Bakterienalginat mit der Ultrazentrifuge (Straatmann und Borchard, 2002) ergab

980 000 ± 80 000 g/mol. Durch Messung der statischen Lichtstreuung an Alginat

in NaCl-Lösung wurde eine Molmasse von 1 150 000 ± 60 000 g/mol für

Bakterienalginat von P. aeruginosa SG81 bestimmt (Windhüs, 2002). Windhüs

und Borchard (2003) haben eine Temperaturabhängigkeit für die

Gewichtsmittelwerte der Molmassen von Alginats des mucoiden Stammes

P. aeruginosa FRD1 bestimmt. Bei steigender Temperatur nimmt die Molmasse

des Alginats ab, was ein Indiz für die Aggregation von Alginat-Molekülen ist.

Der größte Teil der Proteine eluierte nach dem Hauptpeak der Uronsäuren,

sodass eine gewisse Fraktionierung von Uronsäuren (Alginat) und Proteinen

mittels der Gelfiltration möglich war. Es konnte keine Auftrennung der Proteine in

distinkte Elutionspeaks erreicht werden. Es könnte sein, dass zahlreiche Proteine

unterschiedlicher Größe in den EPS vorlagen, die durch den Fraktionierbereich

des verwendeten Gelmaterials nicht aufgetrennt werden können. Die

weitergehende Analyse der Proteine in den EPS von P. aeruginosa mittels SDS-

PAGE zeigte distinkte Banden für die extrazellulären Proteine (Abbildung 33, S.

101). Es konnten mindestens 30 getrennte Banden im Bereich von 20 bis 100 kDa

identifiziert werden. Untersuchungen mittels 2D-Gelelektrophorese haben gezeigt,

dass weit mehr als 30 extrazelluläre Proteine in den EPS zu erwarten sind

(Broekman, in Bearbeitung).

Die Coelution der Polysaccharide und Proteine in den EPS von P. aeruginosa

bei der Gelfiltration (Abbildung 19, S. 81) liegt vermutlich an Wechselwirkungen

des Alginats mit extrazellulären Proteinen. Wingender et al. (1999a) haben für

mucoide Stämme von P. aeruginosa eine Stimulation der Expression von

extrazellulärer Lipase im Vergleich zu nichtmucoiden Stämmen beobachtet. Die

Lipase wird durch Interaktion mit extrazellulärem Alginat vor einem proteolytischen

Abbau geschützt. Ferner ist denkbar, dass durch die Wechselwirkung Alginat –

120

Diskussion

Lipase, die extrazelluläre Lipase in räumlicher Nähe zu den Zellen verbleibt und

somit die Zellen länger einen Nutzen von ihr haben.

5.1.8.4 Auftrennung der Polysaccharid-Fraktion nach Ladung

Ionenaustausch erwies sich als geeignete Methode, um geladene

Kohlenhydrate (Alginat) der EPS von den neutralen (anderen Kohlenhydraten)

abzutrennen. Die Ionenaustausch-Chromatographie ist eine Methode der

Adsorptionschromatographie, die auf der Wechselwirkung der gelösten geladenen

Moleküle mit entgegengesetzt geladenen funktionellen Gruppen, die kovalent an

die feste Matrix gebunden sind, beruht. Es tritt eine Konkurrenzreaktion der

Probenmoleküle mit den Salzionen um die geladenen Gruppen auf der

Ionenaustauscher-Matrix auf. Im ersten Schritt bindet das Probenmolekül an die

fixierten Ladungen der stationären Phase, und im zweiten Schritt erfolgt die

Verdrängung und Elution der Probenmoleküle durch eine steigende

Salzkonzentration des Eluenten. Alle geladenen Makromoleküle (Proteine,

Nucleinsäuren und auch Alginat) lassen sich mit der Ionenaustausch-

Chromatographie auftrennen und reinigen.

Die Anionenaustauschchromatographie von EPS und gereinigtem

Bakterienalginat erfolgte an DEAE Sepharose CL-6B. Durch Trennung von EPS

am Ionenaustauschermaterial (Abbildung 16, S. 78) konnte im Anfangsbereich, wo

nur mit Puffer eluiert wurde, eine deutliche Absorption im Kohlenhydrat-Assay,

jedoch nicht im Uronsäure-Assay beobachtet werden. Dies könnte auf der

Anwesenheit von neutralen oder positiv geladenen Polysacchariden in den EPS

beruhen (Marty et al., 1992).

5.1.8.5 Affinität der Polysaccharid-Fraktionen zum Lektin Concanavalin A

Es wurde untersucht, ob die Heterogenität des Alginats von P. aeruginosa bei

der Anionenaustauschchromatographie (Abbildung 16, S. 78) in Zusammenhang

mit einer unterschiedlichen Affinität der Alginat-Fraktionen zum Lektin

Concanavalin A (ConA) steht. Die Wechselwirkung zwischen EPS sowie

121

Diskussion

Fraktionen von gereinigtem Alginat und dem Lektin ConA wurde in einem

Mikrotiterplatten-Assay ("enzyme-linked lectin-sorbent assay", ELLA) bestimmt.

Lektin-Bindungsversuche von Strathmann et al. (2002) haben gezeigt, dass eine

spezifische Bindung von Alginat an das Lektin ConA auftritt. Concanavalin A sollte

nach Literaturangaben (Goldstein und Hayes, 1978) nur an die spezifischen

Zielzucker Mannose und Glucose binden. Die Untersuchung der Lektin-Affinität

von Alginat-Fraktionen aus der Anionenaustauschchromatographie (Abschnitt

4.1.6, S. 73) ergab, dass die beiden Fraktionen eine Bindung an Concanavalin A

im Enzym-gekoppelten Lektin-Bindungs-Assay zeigten. Der Unterschied zwischen

der Peakfraktion und der breiten Fraktion nach dem Peak war gering (Abbildung

18, S. 80). Die Fraktionen im Bereich vor dem Alginatpeak haben im ELLA keine

Bindungsspezifität an ConA gezeigt. Dies ist ein Hinweis dafür, dass alle

geladenen Fraktionen eine ähnliche Affinität zu ConA haben. Strathmann (2003)

hat gezeigt, dass eine vorhandene oder nicht vorhandene Acetylierung des

Alginats keinen Einfluss auf die Bindungsspezifität von Alginat zu ConA hat. Das

bedeutet, dass es mit ConA nicht möglich war, strukturelle Unterschiede im Alginat

anzuzeigen.

5.1.9 Nachweis von Rhamnolipiden in den EPS von P. aeruginosa

Biotenside, die aus L-Rhamnose und β-Hydroxydecansäure zusammengesetzt

sind, werden als Rhamnolipide bezeichnet. Dass P. aeruginosa ist in der Lage ist,

oberflächenaktive Substanzen, sog. Rhamnolipide, zu produzieren wurde schon

relativ früh erkannt (Jarvis und Johnson, 1949). Erste Hinweise auf eine

Bedeutung der Rhamnolipide für die Biofilmarchitektur wurden vor kurzem erst

beobachtet (Davey et al., 2003). Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob

Rhamnolipide in den EPS von P. aeruginosa SG81 nachgewiesen werden

können.

Es handelt sich bei den Rhamnolipiden um extrazelluläre Glycolipide, die als

sekundäre Metabolite in der stationären Wachstumsphase von den Zellen

produziert werden (Syldatk et al., 1985a). Lang und Wullbrandt (1999) haben die

Strukturen von sechs verschiedenen Rhamnolipiden von P. aeruginosa

beschrieben, die sich in der Anzahl der Rhamnose-Moleküle (1 oder 2) und der

122

Diskussion

Fettsäure-Reste (1, 2 oder 3) voneinander unterscheiden (Strukturformeln in

Abbildung 4, S. 19). Die Menge der synthetisierten Rhamnolipide hängt von den

Umwelt- bzw. Kultivierungsbedingungen, zu denen u. a. die C: N: P-Verhältnisse

sowie Temperatur und pH-Wert gehören, ab (Syldatk et al., 1985a; Ochsner et al.,

1994; Maier und Soberon-Chavez, 2000; Chayabutra und Ju, 2001).

In dieser Arbeit wurden zwei Rhamnolipide in den EPS von P. aeruginosa

nachgewiesen (Abschnitt 4.1.7, S. 83). Sie wurden als Mono- bzw. Di-Rhamnolipid

identifiziert (Abbildung 22, S. 85), wobei das Di-Rhamnolipid in den EPS von

P. aeruginosa Biofilmen mengenmäßig überwog. Die Variation der Anzuchtdauer

der Biofilme (24 h, 48 h und 72 h) zeigte keinen Einfluss auf die Menge und die

Zusammensetzung der Rhamnolipide in den EPS (Abbildung 23, S. 86). Die

Zusammensetzung des Nährmediums jedoch zeigte einen deutlichen Einfluss auf

die Zusammensetzung der Rhamnolipide in den EPS (Abbildung 22, S. 85). Bei

der Kultivierung auf PIA wurden im Vergleich zur Kultivierung auf APM, Nähr-Agar,

Nitrat- und Ammonium-Agar die größten Mengen an Rhamnolipiden in den EPS

nachgewiesen.

Siegmund und Wagner (1991) haben einen Agarplatten-Test zum Nachweis

von Rhamnolipiden entwickelt. Die anionischen Biotenside bilden ein unlösliches

Ionenpaar mit dem kationischen Tensid Cetyltrimethylammoniumbromid und dem

Farbstoff Methylenblau, das im Medium vorhanden war. Hiermit ist ein

unspezifisches Screening großer Menden an Umweltstämmen auf das

Vorkommen von anionischen Biotensiden möglich.

Santos et al. (2002) haben Pseudomonas aeruginosa bei verschiedenen

Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und variierenden C:N-Verhältnissen im

Nährmedium angezüchtet, um eine höhere Ausbeute an Rhamnolipiden zu

bekommen. Es zeigte sich, dass die synthetisierten Mengen an Mono- und Di-

Rhamnolipiden von der Art der C-Quelle abhängig waren. Weiterhin führte die

Variation der Stickstoffquelle zu unterschiedlichen Mengen an Dibenzopyrazinen

und extrazellulären Proteinen. Diese Produkte werden von Santos et al. (2002) als

unerwünschte Virulenzfaktoren bei der Synthese von Rhamnolipiden von

P. aeruginosa angesehen.

Die Bedeutung der Rhamnolipide für die Strukturbildung der Biofilme wurde von

Davey et al. (2003) an Biofilmen von nichtmucoiden Stämmen des Wildtyps

123

Diskussion

P. aeruginosa PAO1 untersucht. Biofilme von Mutanten, die nicht in der Lage

waren Rhamnolipide zu produzieren, konnten nicht die typische Biofilmarchitektur

mit Poren und Kanälen, die sich um Makrokolonien bildeten, aufrechterhalten.

Durch die Produktion von Rhamnolipiden können die Bakterien vermutlich die Zell-

Zell-Wechselwirkung und die Adhäsion der Zellen an Oberflächen aktiv

beeinflussen.

5.2 Zusammensetzung der EPS von P. fluorescens Biofilmen in der Literatur

Read und Costerton (1987) haben die extrazellulären Polysaccharide von

P. putida und P. fluorescens aus epilithischen Frischwasserbiofilmen in ihrer

chemischen Zusammensetzung und Biosynthese untersucht. Die

Exopolysaccharide wurden in allen Wachstumsphasen produziert, wobei nach der

Erschöpfung der C-Quelle im Wachstumsmedium die Synthese der

Polysaccharide aufhörte, während bei Stickstofflimitierung die Synthese noch

einige Zeit weiterlief. Die extrazellulären Polysaccharide beider Bakterienarten

wurden isoliert und gereinigt. P. putida hat ein Polysaccharid aus Glucose,

Galactose und Pyruvat im molaren Verhältnis 1:1:1 synthetisiert. Bei

P. fluorescens enthielt das Polysaccharid ebenfalls Glucose, Galactose und

Pyruvat, aber im molaren Verhältnis 1:1:0,5. Der Acetylierungsgrad beider

Polymere variierte zwischen 0 und 8,8 % (w/w).

Fett et al. (1989) haben untersucht, ob mit Pflanzen vergesellschaftete

Pseudomonaden Alginat produzieren können. Von 20 mucoiden Stämmen waren

6 in der Lage acetyliertes Alginat auf Pseudomonas Isolierungs-Agar oder

Pseudomonas Agar F zu synthetisieren. Es handelte sich um Stämme von

P. aeruginosa, P. viridiflava und P. fluorescens. 12 Stämme von P. fluorescens

produzierten ein neu entdecktes Polysaccharid, welches aus Glucose und

Galactose im molaren Verhältnis 1:1 zusammengesetzt ist. Die Monosaccharide

sind mit Pyruvat und Succinat substituiert und das Polysaccharid wurde als

Marginalan bezeichnet. Zwei weitere Stämme von P. fluorescens produzierten ein

weiteres saures Polysaccharid, welches aus Rhamnose, Glucose und Mannose

1:1:1 zusammengesetzt ist und mit Pyruvat und Acetat substituiert ist. Wenn

Saccharose als primäre C-Quelle vorhanden war, produzierten die mucoiden

124

Diskussion

Stämme bevorzugt Levan anstatt der sauren Polysaccharide. Die Untersuchungen

von Fett et al. (1989) unterstützen die Vermutung, dass fluoreszierende

Pseudomonaden in der Lage sind eine ganze Reihe von strukturell verschiedenen

Exopolysacchariden (außer Alginat) zu produzieren.

Osman et al. (1997) haben ein saures Polysaccharid aus P. fluorescens H13

Biofilmen isoliert. Es handelte sich nicht um Alginat. Das Grundgerüst dieses

Polysaccharids besteht aus einer Trisaccharid-Einheit aus D-Glucose, N-Acetyl-D-

glucosamin und N-Acetyl-D-Mannuronsäure.

Spiers et al. (2003) haben die Biofilmbildung an gasförmig-flüssigen

Grenzflächen untersucht. Das Bakterium P. fluorescens SBW25 wurde isoliert und

das extrazelluläre Polysaccharid charakterisiert. Die chemische Analyse des

extrazellulären Materials ergab partiell acetylierte Cellulose als extrazelluläres

Polysaccharid. Durch Vergleich mit Mutanten, die nicht-acetylierte Cellulose

produzierten, konnte festgestellt werden, dass die Acetylierung der Cellulose

entscheidend für die Besiedlung der Grenzfläche war. Obwohl eine ganze Reihe

von Bakterien (Enterobacteriaceen, Gluconacetobacter xylinus, und

Bodenbakterien) Cellulose produzieren, ist die biologische Funktion der Cellulose

in diesen Biofilmen nicht vollständig geklärt worden (Römling, 2002). Williams und

Cannon (1989) haben gefunden, dass sich Zellen von Gluconacetobacter xylinus

durch Bildung einer Hautschicht aus Cellulose vor UV-Strahlung schützen können.

Römling et al. (2002) vermuten, dass Biofilme aus Cellulose die Bakterien vor

Austrocknung schützen.

Pereira und Vieira (2001) haben die Biozidwirkung von Glutaraldehyd auf

Biofilme von P. fluorescens untersucht. Die EPS wurden mit der Dowex Kationen-

austauscher-Methode isoliert und der Gehalt an Proteinen und Kohlenhydraten

bestimmt. Die Kohlenhydrat- und Proteinmengen waren etwa gleich groß, wobei

die Proteine mengenmäßig in den untersuchten Proben überwogen. Die relativ

hohen Proteingehalte der Biofilme reduzierten die antimikrobielle Wirkung von

Glutaraldehyd. Der Biofilm konnte nicht vollständig von der Oberfläche entfernt

werden. Die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix spielt eine wichtige

Rolle bei der Anwendung von Bioziden.

Conti et al. (1994) haben die Produktion von Alginat durch P. fluorescens und

P. putida in Batch-Kulturen untersucht. Als Kohlenstoffquelle diente Fructose oder

125

Diskussion

Glucose. Beide Bakterienarten produzierten Alginat, welches zu einem hohen

Grad acetyliert war. Die Produktion des Alginats war wachstumsabhängig und

erreichte sein Maximum nach 48 h Anzucht. Die Molmasse des Alginats nahm mit

länger werdender Anzucht ab, was der degradierenden Aktivität von Alginatlyase

zugeschrieben wurde.

5.2.1 Quantitative Zusammensetzung der EPS von P. fluorescens 6/4 Biofilmen

Die quantitative Analyse der EPS-Komponenten Kohlenhydrate, Uronsäuren

und Proteine in den EPS von P. fluorescens 6/4 Biofilmen wurde wie im Abschnitt

3.6.1 (S. 41) beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse (Tabelle 9, S. 87) zeigen,

dass in den EPS keine Uronsäuren nachgewiesen wurden. Die isolierten EPS

bestehen zu 57 % (w/w) aus Kohlenhydraten und zu 28 % (w/w) aus Proteinen.

Eine Reinigung der Polysaccharid-Fraktion analog der Reinigung für Alginat von

P. aeruginosa (Abschnitt 3.7, S. 44) wurde unternommen. In Abbildung 26 (S. 90)

sind die Absorptionsspektren vor und nach der Enzymbehandlung mit Benzonase

und Proteinase dargestellt. Nach der Reinigung war im Absorptionsbereich von

260 nm und 280 nm keine deutliche Abnahme der Protein- und DNA-Absorption

zu erkennen. Durch Bestimmung des Proteingehalts in den EPS nach der

Enzymbehandlung konnte ebenfalls keine deutliche Abnahme der

Proteinkonzentration festgestellt werden. Offensichtlich funktioniert die

Enzymbehandlung zur gezielten Isolierung von Polysacchariden in den EPS bei

dieser Proben-Matrix im Gegensatz zur Alginatreinigung (Abbildung 26, S. 90)

nicht. Dies könnte an der chemischen Zusammensetzung der EPS-Komponenten

liegen, die vermutlich die Enzymaktivität der Benzonase und Protease inhibieren.

Eine weitere Möglichkeit wäre, dass die Proteine so an die Polysaccharide

gebunden sind, dass sie für den Abbau durch die Proteasen nicht zugänglich sind.

Oder die Proteine sind so zusammengesetzt, dass ein proteolytischer Abbau

durch die verwendete Protease (Proteinase K) nicht möglich ist.

126

Diskussion

5.2.2 Bestimmung der Zuckerzusammensetzung der EPS von P. fluorescens

Biofilmen

Die Analyse der Totalhydrolysate der EPS von P. fluorescens 6/4 ergab, dass

Glucose und Galactose als Bestandteile der Polysaccharide identifiziert wurden

(Abschnitt 4.2, S. 86). Der Acetylgehalt in den EPS könnte entweder auf eine

Acetylierung des Polysaccharids oder eventuell andere Substituenten, wie z. B.

Succinat, hinweisen.

Fett et al. (1995) haben die EPS von Pseudomonas Stämmen isoliert und

untersucht, die auf faulenden Hutpilzen (Agaricus bisporus) gewachsen sind. Sie

haben bei saprophytischen mucoiden Stämmen von P. putida und P. fluorescens

ein saures Polysaccharid aus Galactose und Glucose identifiziert, das als

Marginalan bezeichnet wurde. β-D-Glucose ist in Marginalan 1,3-glykosidisch mit

α-D-Galactose verknüpft. Eine genauere Untersuchung der Struktur des

Galactoglucans von Pseudomonas marginalis wurde mittels 1H und 13C-NMR

durchgeführt (Matulová et al., 1996). Sie ergab, dass ein Succinat-Rest ebenso

wie ein Pyruvat-Rest an der Galactose lokalisiert ist. Der Grad der Substitution der

Galactose-Einheiten mit Succinat-Resten war nicht einheitlich bei verschiedenen

Stämmen von Pseudomonaden.

Der Vergleich der Zusammensetzung der EPS von den Bakterienarten

P. aeruginosa (4.1.1, S. 63) und P. fluorescens (4.2, S. 86) zeigt, dass in den

isolierten EPS von P. fluorescens keine Uronsäuren und somit auch kein Alginat

vorhanden ist. Bezogen auf die Trockenmasse im Biofilm war der

Kohlenhydratgehalt der EPS von P. aeruginosa 2,5fach höher als bei der EPS von

P. fluorescens. Der Proteingehalt lag bei beiden EPS etwa gleich hoch. Der

Acetylgruppengehalt lag bei P. aeruginosa etwas höher als bei den EPS von

P. fluorescens.

127

Diskussion

5.3 Umweltbiofilme aus aquatischen Systemen

5.3.1 Isolierung der EPS aus Umweltproben

Es wurden EPS aus Biofilmen von natürlichen aquatischen Standorten

(Flusssedimente und aquatische epilithische Biofilme) und technischen Systemen

(Trinkwasserverteilung, Abwasserbehandlung) mit Methoden zu untersuchen, die

an Reinkulturbiofilmen von P. aeruginosa und P. fluorescens entwickelt und

angewandt wurden.

Es existiert keine universelle Isolierungsmethode, um die EPS quantitativ von

den Mikroorganismen abzutrennen (Nielsen und Jahn, 1999). Eine optimale

Isolierungsmethode führt zu einer maximalen Ausbeute an EPS ohne Lysis der

Mikroorganismenzellen oder Zerstörung der Makromoleküle (Gehr und Henry,

1983). Es existieren verschiedene physikalische und chemische

Isolierungsmethoden und Kombinationen aus beiden Verfahren (Nielsen und

Jahn, 1999).

Abbildung 36: Ablaufschema der Isolierung von EPS aus Umweltproben

Probe 8 g/l der homogenisierten Probe auf Magnetrührer

Kationen- austauscher

Formaldehyd Formaldehyd Zentrifugation + NaOH

Zentrifugation: 20 000 g, 10 °C, 20 min

Harz (70 g/ g SS), 4 °C, 900 U/min, 2 h

100 ml verd. Probe + 100 ml verd. Probe + 0,6 ml Formaldehyd (36,5 %), 0,6 ml Formaldehyd (36,5 %),

4 °C, 1 h Rühren 4 °C, 1 h Rühren

4 ml 1 N NaOH, 4 °C, 3 h

Membranfiltration (0,2 µm, Celluloseacetat)

Dialyse, 2 x 5 l Deionat, 24 h

128

Diskussion

In Abbildung 36 sind vier verschiedene Methoden zur Isolierung von EPS aus

Mischbiofilmen gezeigt. Bei Reinkulturbiofilmen hat sich die Homogenisierung

durch Rühren im wässrigen Medium und Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit

als geeignet erwiesen (Brown und Lester, 1980). Für die Umweltproben genügt

eine Zentrifugation alleine dann nicht, wenn die EPS-Matrix durch zwei- und

höherwertige Ionen stabilisiert wird. Um diese zu entfernen, werden z. B.

Kationenaustauscher für die EPS-Isolierung eingesetzt (Frølund et al., 1996).

5.3.2 Zusammensetzung der EPS aus aquatischen Biofilmen

Das Ziel der Untersuchung war, die EPS aus Biofilmen von natürlichen

aquatischen Standorten (Flusssedimente und aquatische epilithische Biofilme) und

technischen Systemen (Trinkwasserverteilung, Abwasserbehandlung) mit

Methoden zu untersuchen, die an Reinkulturbiofilmen von P. aeruginosa und

P. fluorescens entwickelt und angewandt wurden. Die Analyse der EPS-

Bestandteile ergab, dass extrazelluläre Polysaccharide und Proteine ubiquitär in

den EPS von aquatischen Biofilmen aus Mischpopulationen vorhanden sind

(Ergebnisse in Tabellen 11, 12, 14 und 15, S. 94 f.). Der Gehalt an Proteinen in

den EPS von Umweltproben ist relativ hoch im Vergleich zu den EPS vom

Reinkulturbiofilm von P. aeruginosa. Aquatische Biofilme von natürlichen

Standorten (Fließgewässer) haben zusätzlich deutliche Mengen an Huminstoffen

in den EPS. Uronsäurehaltige Polysaccharide sind keine Bestandteile der hier

untersuchten aquatischen Biofilme. Vermutlich spielen daher saure

Polysaccharide keine Rolle in der Vernetzung der EPS über mehrwertige Kationen

in diesen Biofilmen. Huminstoffe wurden in den Umweltbiofilmen in großen

Mengen nachgewiesen und sind vermutlich strukturbildende Bestandteile dieser

Biofilme. Ebenso können saure Proteine für die Vernetzung und Stabilisierung der

EPS durch zweiwertige Kationen beitragen.

Die chemische Zusammensetzung der EPS beeinflusst die

Oberflächeneigenschaften von Schlammflocken und somit die physikalischen

Eigenschaften von Belebtschlämmen (Späth und Wuertz, 2000). Geladene

129

Diskussion

funktionelle Gruppen der EPS-Komponenten spielen eine wichtige Rolle bei der

Flockung und der Absetzbarkeit des Schlammes (Pavoni et al., 1972; Steiner et

al., 1976; Novak und Haugan, 1981). Morgan et al. (1990) haben eine Korrelation

der Zusammensetzung der EPS und der Oberflächenladung der Flocken beim

Vergleich von aeroben mit anaeroben Schlämmen gefunden. Bei

Belebtschlämmen war das Protein- / Kohlenhydratverhältnis < 1 und bei

anaeroben Schlämmen lag das Verhältnis bei 3: 1. Dies wurde auch von Horan

und Eccles (1986) und Forster und Clarke (1983) für Belebtschlämme und von

Karapanagiotis et al. (1989), Forster (1983) und Ehlinger et al. (1987) für

anaerobe Schlämme analysiert.

Ein Vergleich der Protein- / Kohlenhydrat-Verhältnisse in den EPS von in dieser

Arbeit untersuchten Schlämmen aus der Abwasserbehandlung ist in Tabelle 20

aufgeführt. Die Protein- / Kohlenhydrat-Verhältnisse korrelierten hier nicht mit der

Herkunft des Schlammes. In den meisten Proben war die Proteinkonzentration

deutlich höher als die Kohlenhydratkonzentration in den EPS.

Tabelle 20: Protein / Kohlenhydrat-Massenverhältnisse von EPS aus Schlämmen aus der Abwasserbehandlung. Die Verhältnisse wurden aus den Angaben in Tabelle 12 und 12 berechnet.

Art der Probe Nr. Proteine: Kohlenhydrate

Membran-Bioreaktor -Anlage (Deponiesickerwasser)

1 1,03

2 5,40 Membranbelebungsanlage 3 5,31

Gelatinefabrik 4 6,47 Membranbelebung einer Großwäscherei

5 6,13

Membranbelebung einer Mälzerei 6 6,39

Belebtschlamm

Membranbelebung einer Papierfabrik 7 1,05 kommunale Belebungsanlage 8 2,98

9 4,61 Rücklaufschlamm

Lehr- und Forschungsklärwerk 10 3,13

Überschussschlamm kommunale Belebungsanlage 11 6,58 Schlamm aerobe, thermophile

Schlammstabilisierung 12 2,55

Die Zusammensetzung der EPS in Belebtschlämmen aus der

Abwasserbehandlung ist in Tabelle 12 (S. 94) aufgeführt. Kohlenhydrate, Proteine

und Huminstoffe bildeten die Hauptkomponenten in den EPS. Uronsäuren wurden

130

Diskussion

hingegen nicht in den EPS nachgewiesen. Nucleinsäuren (DNA) wurden

anteilsmäßig nur in geringen Mengen gefunden. In Tabelle 21 ist zum Vergleich

die Zusammensetzung der EPS von Belebtschlammproben aus der Literatur

gezeigt. Auffällig ist, dass in allen untersuchten Proben geringe Mengen an

Uronsäuren nachgewiesen wurden (Urbain et al., 1993; Frølund et al., 1996;

Nielsen et al., 1996; Bura et al., 1998; Späth et al., 1998; Martin-Cereceda et al.,

2001; Liu und Fang, 2002; Wilén et al., 2003). In allen in dieser Arbeit

untersuchten EPS von Schlämmen aus der Abwasserbehandlung wurden keine

Uronsäuren nachgewiesen. Die gemessenen Werte für die EPS-Gehalte von

Belebtschlämmen in Tabelle 12 (S. 94) liegen größenordnungsmäßig im Bereich

der in der Literatur untersuchten Proben. Die Proteine bildeten in den

untersuchten Proben in Tabelle 21 überwiegend die Hauptkomponente in den

EPS. Die Gehalte an Huminstoffen lagen in den untersuchten Proben (Frølund et

al., 1996; Nielsen et al., 1996; Martin-Cereceda et al., 2001; Liu und Fang, 2002;

Wilén et al., 2003) in der Größenordnung der Proteingehalte, wie sie auch in

Tabelle 12 (S. 94) gezeigt sind.

131

Tabelle 21: Zusammensetzung der EPS von Belebtschlämmen mit unterschiedlichen Isolierungsmethoden aus der Literatur

Methode Kohlenhydrate Uronsäuren Proteine DNA Huminstoffe Einheit LiteraturDampfbehandlung (10 min)

15,8 n. b. 77,1 3,7 n. b. mg/ g SS Brown und Lester (1980)

Dampfbehandlung (10 min)

23,9 n. b. 14,07 n. b. n. b. mg/ g SS Morgan et al. (1990)

Ultraschall/ Zentrifugation

89,4 26,8 54,0 9,1 n. b. mg/ l Urbain et al. (1993)

Erhitzen (80 °C) 8 2,2 121 n. b. n. b. mg/ g VS Frølund et al. (1996) NaOH (pH 11) 22 3,1 96 n. b. n. b. mg/ g VS Frølund et al. (1996) Dowex/ Rühren 48 6,1 243 n. b. 126 mg/ g VS Frølund et al. (1996) Dowex/ Rühren 40 12,1 212 16 101 mg/ g VS Nielsen et al. (1996) Dowex/ Rühren 19,2 1,5 75,9 n. b. n. b. mg/ g TM Späth et al. (1998) Kronenether 14,5 0,9 21,3 n. b. n. b. mg/ g TM Späth et al. (1998) EDTA 2,5 0,5 26,1 n. b. n. b. mg/ g TM Späth et al. (1998) Dowex/ Rühren 12,7 4,7 162,0 11,2 n. b. mg/ g VSS Bura et al. (1998) Dampfbehandlung (10 min)

37,5 4,8 294,9 5,3 n. b. mg/ g VSS Bura et al. (1998)

Ultraschall/ Dowex 21 3,8 51 25 18 mg/ g VS Martin-Cereceda et al. (2001)

Formaldehyd/ NaOH 40,5 4,2 54,6 0,35 50,4 mg/ g Liu und Fang (2002) EDTA 12,4 2,1 22,9 0,47 59,2 mg/ g Liu und Fang (2002) Ultraschall/ Formaldehyd

28,9 1,8 20,4 0,13 18,9 mg/ g Liu und Fang (2002)

Dowex/ Rühren 12,7 1,2 17,6 0,14 16,4 mg/ g Liu und Fang (2002) Formaldehyd 7,7 1,1 12,3 0,07 10,9 mg/ g Liu und Fang (2002) Dowex/ Rühren 7 - 66 1 - 6 36 - 78 0 - 48 20 – 86 mg/ g VSS Wilén et al. (2003) Dowex/ Rühren 1,7 – 32,9 n. n. 11,0 – 39,6 0 – 5,0 3,4 – 22,8 mg/ g TM (diese Arbeit) SS, suspended solids; TM, Trockenmasse; VS, volatile solids; VSS, volatile suspended solids

132

Diskussion

5.4 Fazit

Es existiert keine allgemeine Methode für die Isolierung von EPS aus Biofilmen

unterschiedlicher Herkunft. Für die Isolierung von EPS aus Reinkulturbiofilmen

von P. aeruginosa und P. fluorescens hat sich die Methode der Homogenisierung

durch Rühren und Hochgeschwindigkeitszentrifugation als geeignet erwiesen. Die

EPS von Biofilmen aus Umweltproben konnten mit der Kationenaustauscher-

(Dowex) Methode in Kombination mit der Ausübung von Scherkräften durch

Rühren effektiv isoliert werden. Die Methoden zur Bestimmung der biochemischen

Zusammensetzung der EPS-Bestandteile Kohlenhydrate, Uronsäuren, Proteine,

Huminstoffe, Nucleinsäuren (DNA) und Glycolipide (Rhamnolipide) konnten

etabliert werden.

Die Biofilmorganismen bilden und beeinflussen die extrazelluläre Matrix des

Biofilms. Daher ist die Zusammensetzung der EPS von vielen Faktoren abhängig,

wie der Dauer der Anzucht des Biofilms (im Labor) bzw. dem Alter des Biofilms

und der Art der Organismen (im Umweltbiofilm) und den Nährstoffbedingungen.

Ferner bestimmt die Isolierungs- und Nachweismethode das Ergebnis der

Zusammensetzung der EPS-Komponenten. Um vergleichbare Resultate der EPS-

Zusammensetzung zu erhalten, müssen diese Parameter berücksichtigt werden.

Mittels Säulenchromatographie war es möglich die EPS nach ihrer chemischen

Beschaffenheit aufzutrennen. Polysaccharide und Proteine ließen sich nach

Ladung durch die Ionenaustauschchromatographie und nach Größe durch die

Gelfiltration auftrennen und teilweise auch voneinander trennen. Alginat von

P. aeruginosa zeigte im Gegensatz zum Algenalginat eine starke Heterogenität

(Kettenlänge, Acetylierungsgrad), die vermutlich nicht zufällig ist, sondern von der

Zelle gezielt gesteuert wird.

In den EPS von P. aeruginosa wurden Rhamnolipide nachgewiesen, die

vermutlich für die Aufrechterhaltung der dreidimensionalen Struktur im Biofilm eine

wichtige Rolle spielen (Davey et al., 2003). Mittels saurer Hydrolyse und

anschließender Dünnschichtchromatographie wurden die Bausteine der

Polysaccharide in den EPS von P. aeruginosa und P. fluorescens getrennt und

identifiziert. In den EPS von P. aeruginosa wurden außer den Alginatbausteinen

(Mannuronat und Guluronat) keine weiteren Monosaccharide nachgewiesen. Bei

den EPS von P. fluorescens Biofilmen konnten die Monosaccharide Galactose

133

Diskussion

und Glucose nachgewiesen werden, die Bausteine eines acetylierten

Galactoglucans sein könnten.

Polysaccharide und Proteine sind ubiquitär in den EPS der untersuchten

aquatischen Biofilme aus Mischpopulationen vorhanden. Sie bilden meist die

Hauptkomponente dieser Biofilme. Der Gehalt an Proteinen in den EPS von

Umweltproben ist relativ hoch im Vergleich zu der EPS-Zusammensetzung von

Reinkulturbiofilmen wie beispielsweise von P. aeruginosa. Aquatische Biofilme

enthielten zusätzlich bedeutende Mengen an Huminstoffen in den EPS. Die Rolle

der Huminstoffe als Bestandteile von aquatischen Biofilmen ist noch ungeklärt.

Vermutlich haben sie auch eine wichtige Rolle als strukturbildende Komponenten

dieser Biofilme. Uronsäurehaltige Polysaccharide scheinen keine wesentlichen

Bestandteile von aquatischen Biofilmen zu sein. Dadurch spielen saure

Polysaccharide keine Rolle in der Vernetzung der EPS über mehrwertige Kationen

in diesen Biofilmen.

Die Isolierungsmethode muss an die Art und Herkunft des Biofilms angepasst

sein. Reinkulturbiofilme können zusätzlich zu Polysacchariden und Proteinen noch

anorganische und organische Partikel sowie deutliche Mengen an Huminstoffen in

den EPS enthalten.

5.5 Ausblick

Eine weitergehende Analyse der extrazellulären Polysaccharide aus Biofilmen

von Umweltproben und Reinkulturbiofilmen mit der Aufklärung der Bindungsart der

Bausteine und der Struktur der Polysaccharide ist wünschenswert. Sie könnte

einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der mechanischen Stabilität von

Biofilmen aus Mischpopulationen liefern. Hierfür könnten zusätzlich gezielt

Biofilme aus Reinkulturen untersucht werden, die entweder nur neutrale

Polysaccharide oder neutrale und geladenen Polysaccharide mit unterschiedlichen

Substituenten oder solche die erheblich mehr Proteine als Polysaccharide in den

EPS enthalten. Von diesen Organismen könnten auch Mutanten abgeleitet

werden, die keine Substituenten an den Polysacchariden haben, um den Einfluss

der Substituenten auf die Biofilmstruktur und –Stabilität zu untersuchen.

134

Diskussion

Die Rolle der Rhamnolipide in den EPS und ihre Wechselwirkung mit

extrazellulären Polysacchariden ist noch nicht geklärt. Der mögliche Einfluss der

Rhamnolipide auf die Biofilmarchitektur und die Zell-Zell-Wechselwirkung könnte

einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Bildung und des Abbaus von

Biofilmen liefern.

Die Darstellung des gesamten extrazellulären Proteoms (mittels 2D-

Elektrophorese) von P. aeruginosa Biofilmen (in Bearbeitung, Sascha Broekman)

bringt Aufschluss über die genaue Zusammensetzung der extrazellulären

Proteine. Bisher wurde lediglich das extrazelluläre Proteom von P. aeruginosa

PAO1 (nichtmucoid) aus Flüssigkulturen untersucht (Nouwens et al., 2002; 2003).

Ein Vergleich der Muster der extrazellulären Proteome von verschiedenen

Umweltbiofilmen und dem der Reinkulturbiofilme könnte vermutlich auch das

Vorhandensein von sauren Proteinen und ihre mögliche Rolle als strukturbildende

Komponente in den EPS aufklären.

Biofilme von P. fluorescens 6/4 können als Modellbiofilme für Reinkulturen

herangezogen werden, die kein Alginat produzieren. Die Struktur des

Polysaccharids in den EPS von P. fluorescens bleibt aufzuklären, um Aussagen

über die Bindungsarten und letztlich auch über die mechanische Stabilität dieser

Biofilme treffen zu können. Die Biofilmarchitektur könnte nach Anfärbung mit

Fluoreszenzfarbstoffen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie visualisiert

werden. Somit könnten auch die Methoden, die für P. aeruginosa-Biofilme etabliert

wurden, an diesem Modellbiofilm verifiziert werden.

Eine weitere, sich aus dieser Arbeit ergebende Fragestellung ist, ob andere

EPS-Komponenten eventuell an der Stabilisierung der EPS-Matrix durch

Verbrückung mit zweiwertigen Kationen beteiligt sind. Saure Proteine,

Nucleinsäuren und Huminstoffe, die schon in den EPS nachgewiesen wurden,

könnten hierfür eine Rolle spielen.

135

Literaturverzeichnis

6 Literaturverzeichnis

Allan, V. J. M., Callow, M. E., Macaskie, L. E., Paterson-Beedle, M. (2002): Effect of nutrient limitation on biofilm formation and phosphatase activity of a Citrobacter sp. Microbiology 148, 277-288

Anzai, H., Uchida, N., Nishide, E. (1990): Determination of D-mannuronic to L-guluronic acids ratio in acid hydrolysis of alginate under improved conditions. Nippon Suisan Gakkaishi 56, 73-81

Applegate, D. H., Bryers, J. D. (1991): Effects of carbon and oxygen limitations and calcium concentrations on biofilm removal processes. Biotechn. Bioeng. 37, 17-25

Auerbach, I. D., Sorensen, C., Hansma, H. G., Holden, P. A. (2000): Physical morphology and surface properties of unsaturated Pseudomonas putida biofilms. J. Bacteriol. 182, 3809-3815

Azeredo, L., Lazarova, V., Oliveira, R. (1999): Methods to extract the exopolymeric matrix from biofilms: a comparative study. Wat. Sci. Tech. 39, 243-250

Batisse, C., Daurade, M. H., Bounais, M. (1992): TLC separation and spectrodensitometric quantitation of cell wall neutral sugars. J. Planar Chromatogr. 5, 131-133

Beccari, M., Mappelli, P., Tandoi, V. (1980): Relationship between bulking and physicochemical-biological properties of activated sludge. Biotechn. Bioeng. 12, 969-979

Beveridge, T. J., Makin, S. A., Kadurugamuwa, J. L., Li, Z. (1997): Interactions between biofilms and the environment. FEMS Microbiol. Rev. 20, 291-303

Beveridge, T. J. (1999): Structures of Gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733

Binet, R., Letoffe, S., Ghigo, J. M., Delepelaire, P., Wandersman, C. (1997): Protein secretion by Gram-negative bacterial ABC exporters - A review. Gene 192, 7-11

Bitton, G. (1994): Wastewater Microbiology. Wiley-Liss, New York.

Blumenkrantz, N., Asboe-Hansen, G. (1973): New method for quantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem. 54, 484-489

Botzenhart, K., Wolf, R., Thorfen, E. (1975): Das Verhalten von Pseudomonas aeruginosa in Oberflächenwasser, Kühlwasser und Abwasser. Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 161, 72-83

Botzenhart, K., Döring, G. (1993): Pseudomonas aeruginosa as an opportunistic pathogen. Plenum Press, New York.

136


Bradford, M. M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254

Breeveld, M. W., Zevenhuizen, T. M., Zehnder, A. J. B. (1990): Osmotically induced oligo- and polysaccharide synthesis by Rhizobium meliloti Su47. J. Gen. Microbiol. 136, 2511-2519

Brown, M. J., Lester, J. N. (1980): Comparison of bacterial extracellular polymer extraction methods. Appl. Environ. Microbiol. 40, 179-185

Brown, M. R., Foster, J. H., Clamp, J. R. (1969): Composition of Pseudomonas aeruginosa slime. Biochem. J. 112, 521-525

Brunk, C., Jones, K. C., James, T. W. (1979): Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenates. Anal. Biochem. 92, 497-500

Bruus, J. H., Nielsen, P. H., Keiding, K. (1992): On the stability of activated sludge flocs with implications to dewatering. Wat. Res. 26, 1597-1604

Buckmire, F. L. A. (1984): Influence of nutrient media on the characteristics of the exopolysaccharide produced by three mucoid Pseudomonas aeruginosa strains. Microbios 41, 49-63

Bura, R., Cheung, M., Liao, B., Finlayson, J., Lee, B. C., Droppo, I. G., Leppard, G. G., Liss, S. N. (1998): Composition of extracellular polymeric substances in the activated sludge floc matrix. Wat. Sci. Tech. 37, 325-333

Burns, R. G. (1989): Microbial and enzymic activities in soil biofilms. In: Characklis, W. G., Wilderer, P. A. (Hrsg.): Structure and function of biofilms, S. 333-349, John Wiley & Sons, Inc., Chichester.

Carlson, D. M., Matthews, L. W. (1966): Polyuronic acids produced by Pseudomonas aeruginosa. Biochemistry 5, 2817-2822

Caron, D. A., Davis, P. G., Madin, L. P., Sieburth, J. M. (1982): Heterotrophic bacteria and bacteriovorous protozoa in oceanic macroaggregates. Science 218, 795-797

Chandrasekaran, E. V., BeMiller, J. N. (1980): Constituent analysis of glycosaminoglycans. In: Whistler, R. L., BeMiller, J. N. (Hrsg.): Methods in Carbohydrate Chemistry, VIII, S. 89-96, Academic Press, New York.

Chandy, J. P., Angles, M. L. (2001): Determination of nutrients limiting biofilm formation and the subsequent impact on disinfectant decay. Wat. Res. 35, 2677-2682

Characklis, W. G., Wilderer, P. A. (1989): Structure and function of biofilms. John Wiley & Sons, Inc., Chichester.

137


Chayabutra, C., Ju, L. K. (2001): Polyhydroxyalkanoic acids and rhamnolipids are synthesized sequentially in hexadecane fermentation by Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145. Biotechnol. Prog. 17, 419-423

Christensen, B. E., Kjosbakken, J., Smidsrød, O. (1985): Partial chemical and physical characterization of two extracellular polysaccharides produced by marine, periphytic Pseudomonas sp. strain NCMB 2021. Appl. Environ. Microbiol. 50, 837-845

Christensen, B. E. (1989): The role of extracellular polysaccharide biofilms. J. Biotechnol. 10, 181-202

Christensen, B. E., Characklis, W. G. (1990): Physical and chemical properties of biofilms. In: Characklis, W. G., Marshall, K. C. (Hrsg.): Biofilms, S. 93-130, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Christensen, B. E. (1999): Physical and chemical properties of extracellular polysaccharides associated with biofilms and related substances. In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 143-154, Springer Verlag, Berlin.

Christensen, B. E., Ertesvag, H., Beyenal, H., Lewandowski, Z. (2001): Resistance of biofilms containing alginate-producing bacteria to disintegration by an alginate degrading enzyme (Alg L). Biofouling 17, 203-210

Christensen, G. D., Baddour, L. M., Madison, B. M., Parisi, J. T., Abraham, S. N., Hasty, D. L., Lowrance, J. H., Josephs, J. A., Simpson, W. A. (1990): Colonial morphology of Staphylococci on memphis agar: phase variation of slime production, resistance to β-lactam antibiotics, and virulence. J. Infect. Dis. 161, 1153-1169

Chróst, R. J. (1991): Environmental control of the synthesis and activity of aquatic microbial ectoenzymes. In: Chróst, R. J. (Hrsg.): Microbial enzymes in aquatic environments, S. 29-59, Springer Verlag, New York.

Conti, E., Flaibani, A., O'Regan, M., Sutherland, I. W. (1994): Alginate from Pseudomonas fluorescens and P. putida: production and properties. Microbiology 140, 1125-1132

Costerton, J. W., Marrie, T. J., Cheng, K. J. (1981): The bacterial glycocalyx in nature and disease. Annu. Rev. Microbiol. 35, 299-324

Costerton, J. W., Cheng, K.-J., Geesey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dagsputa, M., Marrie, T. J. (1987): Bacterial biofilms in nature and disease. Annu. Rev. Microbiol. 41, 435-464

Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. (1999): Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322

138


Davey, M. E., Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. (2003): Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAO1. J. Bacteriol. 185, 1027-1036

de Beer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. (1994): Liquid flow in heterogeneous biofilms. Biotech. Bioeng. 44, 636-641

de Belder, A. N. (1996): Medical applications of dextran and its derivatives. In: Dumitriu, S. (Hrsg.): Polysaccharides in medicinal applications, S. 505–524, Marcel Dekker, New York.

de Swaaf, M. E., Grobben, G. J., Eggink, G., de Rijk, T. C., van der Meer, P., Sijtsma, L. (2001): Characterisation of extracellular polysaccharides produced by Crypthecodinium cohnii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57, 395-400

Decho, A. W. (1990): Microbial exopolymer secretions in ocean environments: Their role(s) in food webs and marine processes. Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. 280, 73-153

Decho, A. W. (2000): Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Continental shelf research 20, 1257-1273

Deretic, V. (2000): Pseudomonas aeruginosa infections. In: Nataro, J. P., Blaser, M. J., Cunningham-Runddles, S. (Hrsg.): Persistent bacterial infections, S. 305-326, ASM Press, Washington D. C.

Dignac, M.-F., Urbain, V., Rybacki, D., Bruchet, A., Snidaro, D., Scribe, P. (1998): Chemical description of extracellular polymers: implication on activated sludge floc structure. Wat. Sci. Tech. 38, 45-53

Dische, Z., Schwarz, K. (1937): Mikromethode zur Bestimmung verschiedener Pentosen nebeneinander bei Gegenwart von Hexosen. Mikrochim. Acta 2, 13-18

Dische, Z. (1947): A new specific color reaction of hexuronic acids. J. Biol. Chem. 167, 189-198

Döring, G. (1991): Pseudomonas-Epidemiologie. Mucoviscidose Aktuell 1, 15-18

Drenkard, E., Ausubel, F. M. (2002): Pseudomonas biofilm formation and antibiotic resistance are linked to phenotypic variation. Nature 416, 740-743

Drewry, D. T., Galbraith, L., Wilkinson, B. J., Wilkinson, S. G. (1990): Staphylococcal slime: a cautionary tale. J. Clin. Microbiol. 28, 1292-1296

Dreywood, R. (1946): Qualitative test for carbohydrate material. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 18, 499-501

139


Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. (1956): Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28, 350-356

Ehlinger, F., Audic, J. M., Verrier, D., Fauq, G. M. (1987): The influence of carbon source on clogging in an anaerobic filter. Wat. Sci. Tech. 19, 261-273

Evans, E., Brown, M. R. W., Gilbert, P. (1994): Iron chelator, exopolysaccharide and protease production in Staphylococcus epidermidis: a comparative study of the effects of specific growth rate in biofilm and planktonic culture. Microbiology 140, 153-157

Evans, L. R., Linker, A. (1973): Production and characterization of the slime polysaccharide of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 116, 915-924

Farrah, S. R., Unz, R. F. (1976): Isolation of exocellular polymer from Zoogloea strains MP6 and 106 and from activated sludge. Appl. Environ. Microbiol. 32, 33-37

Fazio, S. A., Uhlinger, D. J., Parker, J. H., White, D. C. (1982): Estimations of uronic acids as quantitative measures of extracellular and cell wall polysaccharide polymers from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 43, 1151-1159

Fett, W. F., Osman, S. F., Dunn, M. F. (1989): Characterization of exopolysaccharides produced by plant-associated fluorescent Pseudomonads. Appl. Environ. Microbiol. 55, 579-583

Fett, W. F., Wells, J. M., Cescutti, P., Wijey, C. (1995): Identification of exopolysaccharides produced by fluorescent Pseudomonads associated with commercial mushroom (Agaricus bisporus) production. Appl. Environ. Microbiol. 61, 513-517

Filisetti-Cozzi, T., Carpita, N. C. (1991): Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars. Anal. Biochem. 197, 157-162

Filloux, A., Michel, G., Bally, M. (1998): GSP-dependent protein secretion in Gram-negative bacteria: the Xcp system of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Rev. 22, 177-198

Fischer, F. G., Dörfel, H. (1955): Die papierchromatographische Trennung und Bestimmung der Uronsäuren. Z. Physiol. Chem. 301, 224-234

Flemming, H.-C. (1995): Sorption sites in biofilms. Wat. Sci. Tech. 32, 27-33

Flemming, H.-C., Wingender, J., Mayer, C., Körstgens, V., Borchard, W. (2000): Cohesiveness in biofilm matrix polymers. In: Allison, D. G., Gilbert, P., Lappin-Scott, H. M., Wilson, M. (Hrsg.): Community Structure and Cooperation in Biofilms, S. 87-105, Cambridge University Press, Cambridge.

140


Flemming, H.-C., Wingender, J. (2001): Relevance of microbial extracellular polymeric substances (EPSs) - part I: structural and ecological aspects. Wat. Sci. Tech. 43, 1-8

Flemming, H.-C., Leis, A. (2002): Sorption properties of biofilms. In: Bitton, G. (Hrsg.): Encyclopedia of Environmental Microbiology, Bd. 5, S. 2958-2967, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Flemming, H.-C., Wingender, J. (2002a): Extracellular polymeric substances (EPS): Structural, ecological and technical aspects. In: Bitton, G. (Hrsg.): Encyclopedia of Environmental Microbiology, Bd. 4, S. 1223-1231, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Flemming, H.-C., Wingender, J. (2002b): Erfassung des Kontaminationspotenzials von Biofilmen in der Trinkwasserverteilung. bbr 53, 30-34

Flemming, H.-C., Wingender, J. (2003a): The crucial role of extracellular polymeric substances in biofilms. In: Wuertz, S., Bishop, P. L., Wilderer, P. A. (Hrsg.): Biofilms in wastewater treatment - An interdisciplinary approach, S. 178-210, IWA Publishing, London.

Flemming, H.-C., Wingender, J. (2003b): Biofilms. In: Steinbüchel, A. (Hrsg.): Biopolymers, 10, S. 209-245, Wiley-VCH, Weinheim.

Fletcher, M. M. (1991): The physiological activity of bacteria attached to solid surfaces. Adv. Microb. Physiol. 32, 53-85

Forster, C. F., Clarke, A. R. (1983): The production of polymer from activated sludge by ethanolic extraction and its relation to treatment plant operation. Wat. Pollut. Control 82, 430-433

Forster, C. F., Quarmby, J. (1995): The physical characteristics of anaerobic granular sludges in relation to their internal architecture. Ant. v. Leeuwenhoek 67, 103-110

Fox, J. D., Robyt, J. F. (1991): Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader. Anal. Biochem. 195, 93-96

Frimmel, F. H., Christman, R. F. (1988): Humic substances and their role in the environment. John Wiley & Sons, Inc., Chichester.

Frølund, B., Griebe, T., Nielsen, P. H. (1995): Enzymatic activity in the activated-sludge floc matrix. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 755-761

Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. (1996): Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Wat. Res. 30, 1749-1758

Gacesa, P., Russell, N. J. (1990): The structure and properties of alginate. In: Gacesa, P., Russell, N. J. (Hrsg.): Pseudomonas infection and alginates, S. 29-49, Chapman and Hall, London.

141


Gacesa, P. (1998): Bacterial alginate biosynthesis - recent progress and future prospects (review). Microbiology 144, 1133-1143

Gaudy, E., Wolfe, R. S. (1962): Composition of an extracellular polysaccharide produced by Sphaerotilus natans. Appl. Microbiol. 10, 200-205

Geesey, G. G., Mutch, R., Costerton, J. W., Green, R. B. (1978): Sessile bacteria: an important component of the microbial population in small mountain streams. Limnol. Oceanogr. 23, 1214-1223

Geesey, G. G. (1982): Microbial exopolymers: ecological and economic considerations. ASM News 48, 9-14

Geesey, G. G., Wigglesworth-Cooksey, B., Cooksey, K. E. (2000): Influence of calcium and other cations on surface adhesion of bacteria and diatoms: a review. Biofouling 15, 195-205

Gehr, R., Henry, J. G. (1983): Removal of extracellular material: techniques and pitfalls. Wat. Res. 12, 1743-1748

Gehrke, T., Telegdi, J., Thierry, D., Sand, W. (1998): Importance of extracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2743-2747

Gehrke, T., Hallmann, R., Kinzler, K., Sand, W. (2001): The EPS of Acidithiobacillus ferrooxidans - a model for structure-function relationships of attached bacteria and their physiology. Wat. Sci. Tech. 43, 159-167

Goldstein, I. J., Hayes, C. E. (1978): The lectins: carbohydrate-binding proteins of plants and animals. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 35, 127-340

Goodwin, J. A. S., Forster, C. F. (1985): A further examination into the composition of activated sludge surfaces in relation to their settlement characteristics. Wat. Res. 19, 527-533

Goto, S., Murakawa, T., Kuwahara, S. (1973): Slime production by Pseudomonas aeruginosa. II. A new synthetic medium and cultural conditions suitable for slime production by Pseudomonas aeruginosa. Jpn. J. Microbiol. 17, 45-51

Govan, J. R. W. (1990): Characteristics of mucoid Pseudomonas aeruginosa in vitro and in vivo. In: Gacesa, P., Russell, N. J. (Hrsg.): Pseudomonas infection and alginates, S. 50-75, Chapman and Hall, London.

Govan, J. R. W., Deretic, V. (1996): Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574

Grobe, S., Wingender, J., Trüper, H. G. (1995): Characterization of mucoid Pseudomonas aeruginosa strains isolated from technical water systems. J. Appl. Bacteriol. 79, 94-102

142


Grobe, S., Wingender, J., Flemming, H.-C. (2001): Capability of mucoid Pseudomonas aeruginosa to survive in chlorinated water. Int. J. Hyg. Environ. Health 204, 139-142

Haba, E., Pinazo, A., Jauregui, O., Espuny, M. J., Infante, M. R., Manresa, A. (2003): Physicochemical characterization and antimicrobial properties of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCBIM 40044. Biotechnol. Bioeng. 81, 316-322

Hancock, I., Poxton, I. (1988): Bacterial cell surface techniques. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Hattingh, W. H. J., Siebert, M. L. (1967): Determination of deoxyribonucleic acid (DNA) content of aerobic sludge. Wat. Res. 1, 197-203

Haug, A., Larsen, B. (1962): Quantitative determination of the uronic acid composition of alginates. Acta Chem. Scand. 16, 1908-1918

Hebbar, K. P., Gueniot, B., Heyraud, A., Colin-Morel, P., Heulin, T., Blandreau, J., Rinaudo, M. (1992): Characterization of exopolysaccharides produced by Rhizobacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 248-253

Hejzlar, J., Chudoba, J. (1986): Microbial polymers in the aquatic environment - I: production by activated sludge microorganisms under different conditions. Wat. Res. 20, 1209-1216

Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. (2001): Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. J. Bacteriol. 183, 5395-401

Hestrin, S. (1949): The reaction of acetylcholine and other carboxylic derivatives with hydroxylamine, and its analytical application. J. Biol. Chem. 180, 249-261

Higgins, M. J., Novak, J. T. (1997): Characterization of exocellular protein and its role in bioflocculation. J. Environ. Eng. 123, 479-485

Hoffman, M., Decho, A. W. (1999): Extracellular enzymes within microbial biofilms and the role of the extracellular polymer matrix. In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 217-230, Springer Verlag, Berlin.

Holden, P. A., Hunt, J. R., Firestone, M. K. (1997): Toluene diffusion and reaction in unsaturated Pseudomonas putida biofilms. Biotechn. Bioeng. 56, 656-670

Hoppe, H. G. (1983): Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl substrates. Marine Ecology Progress Series 11, 299-308

143


Horan, N. J., Jarman, T. R., Dawes, E. A. (1981): Effects of the carbon source and inorganic phosphate concentration on the production of alginic acid by a mutant of Azotobacter vinelandii and the enzymes involved in this biosynthesis. J. Gen. Microbiol. 127, 185-191

Horan, N. J., Eccles, C. R. (1986): Purification and characterization of extracellular polysaccharide from activated sludges. Wat. Res. 20, 1427-1432

Huang, C. T., Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. (1998): Spatial patterns of alkaline phosphatase expression within bacterial colonies and biofilms in response to phosphate starvation. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1526-1531

Hueck, C. J. (1998): Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 379-433

Jahn, A., Nielsen, P. H. (1995): Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from biofilms using a cation exchange resin. Wat. Sci. Tech. 32, 157-164

Jahn, A., Nielsen, P. H. (1998): Cell biomass and exopolymer composition in sewer biofilms. Wat. Sci. Tech. 37, 17-24

Jann, K., Jann, B., Schmidt, M. A., Vann, W. F. (1980): Structure of the Escherichia coli K2 capsular antigen, a teichoic acid-like polymer. J. Bacteriol. 143, 1108-1115

Jarvis, F. G., Johnson, M. J. (1949): A glyco-lipide produced by Pseudomonas aeruginosa. J. Am. Chem. Soc. 71, 4124-4126

Jia, X. S., Furumai, H., Fang, H. H. P. (1996): Yields of biomass and extracellular polymers in four aerobic sludges. Environ. Technol. 17, 283-291

Jorand, F., Zartarian, F., Thomas, F., Block, J. C., Bottero, J. Y., Villemin, G., Urbain, V., Manem, J. (1995): Chemical and structural (2D) linkage between bacteria within activated sludge flocs. Wat. Res. 29, 1639-1647

Junelles, A. M., Kanouni, A. E., Petitdemange, H., Gay, R. (1989): Influence of acetic and butyric acid addition on polysaccharide formation by Clostridium acetobutylicum. J. Ind. Microbiol. 4, 121-125

Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. (1995): Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamycin: a novel mechanism of enzyme secretion. J. Bacteriol. 177, 3998-4008

Kang, K. S., Pettitt, D. J. (1993): Xanthan, Gellan, Welan, and Rhamsan. In: Whistler, R. L., BeMiller, J. N. (Hrsg.): Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives, 3. Ausg., S. 341-397, Academic Press, San Diego.

144


Karapanagiotis, N. K., Rudd, T., Sterritt, R. M., Lester, J. N. (1989): Extraction and characterisation of extracellular polymers in digested sewage sludge. J. Chem. Technol. Biotechnol. 44, 107-120

Kennedy, A. F., Sutherland, I. W. (1987): Analysis of bacterial exopolysaccharides. Biotechnol. Appl. Biochem. 9, 12-19

Kilb, B., Lange, B., Schaule, G., Flemming, H.-C., Wingender, J. (2003): Contamination of drinking water by coliforms from biofilms grown on rubber-coated valves. Int. J. Hyg. Environ. Health 206, 563-573

King, R. O., Forster, C. F. (1990): Effects of sonication on activated sludge. Enz. Microbiol. Technol. 12, 109-115

Kjeldahl, J. (1883): Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern. Z. Anal. Chem. 22, 366-382

Kolenbrander, P. E., Andersen, R. N., Blehert, D. S., Egland, P. E., Foster, J. S., Palmer, R. J. (2002): Communication among oral bacteria. Microb. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505

Körstgens, V., Flemming, H.-C., Wingender, J., Borchard, W. (2001): Influence of calcium ions on the mechanical properties of a model biofilm of mucoid Pseudomonas aeruginosa. Wat. Sci. Tech. 43, 49-57

Koster, M., Bitter, W., Tommassen, J. (2000): Protein secretion mechanisms in Gram-negative bacteria. Int. J. Med. Microbiol. 290, 325-331

Kunze, U. R. (1990): Nachweis- und Erfassungsgrenze. In: Kunze, U. R., Schwedt, G. (Hrsg.): Grundlagen der quantitativen Analyse, 3. Aufl., S. 8-9, Georg Thieme Verlag, Stuttgart.

Labare, M. P., Guthrie, K., Weiner, R. M. (1989): Polysaccharide exopolymer adhesives from periphytic marine bacteria. J. Adhesion Sci. Technol. 3, 213-223

Laemmli, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685

Lam, J., Chan, R., Lam, K., Costerton, J. W. (1980): Production of mucoid microcolonies by Pseudomonas aeruginosa within infected lungs in cystic fibrosis. Infect. Immun. 28, 546-556

Lang, S., Wullbrandt, D. (1999): Rhamnose lipids - biosynthesis, microbial production and application potential. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 22-32

Lebaron, P., Bauda, P., Lett, M. C., Duval-Iflah, Y., Simonet, P., Jacq, E., Frank, N., Roux, B., Baleux, B., Faurie, G., Hubert, J. C., Normand, P., Prieur, D., Schmitt, S., Block, J. C. (1997): Recombinant plasmid mobilization between E. coli strains in seven sterile microcosms. Can. J. Microbiol. 43, 534-540

145


LeChevalier, M. W., Cawthon, C. D., Lee, R. G. (1988): Inactivation of biofilm bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2492-2499

Lemmer, H., Roth, D., Schade, M. (1994): Population density and enzyme activities of heterotrophic bacteria in sewer biofilms and activated sludge. Wat. Res. 28, 1341-1346

Leriche, V., Sibille, P., Carpentier, B. (2000): Use of an enzyme-linked lectinsorbent assay to monitor the shift in polysaccharide composition in bacterial biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 1851 - 1856

Lewis, D. L., Gattie, D. K. (1990): Effects of cellular aggregation on the ecology of microorganisms. ASM News 56, 263-268

Li, Z. S., Clarke, A. J., Beveridge, T. J. (1998): Gram-negative bacteria produce membrane vesicles which are capable of killing other bacteria. J. Bacteriol. 180, 5478-5483

Liebeskind, M., Dohmann, M. (1994): Improved method of activated sludge biomass determination. Wat. Sci. Tech. 29, 7-13

Linker, A., Jones, R. S. (1966): A new polysaccharide resembling alginic acid isolated from Pseudomonads. J. Biol. Chem. 241, 3845-3851

Liu, H., Fang, H. H. (2002): Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256

Lorenz, M. G., Aardema, B. W., Wackernagel, W. (1988): Highly efficient genetic transformation of Bacillus subtilis attached to sand grains. J. Gen. Microbiol. 134, 107-112

Lorenz, M. G., Wackernagel, W. (1994): Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev. 58, 563-602

Lottspeich, F., Zorbas, H. (1998): Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

Lowry, O. H., Rosenbrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. (1951): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275

Madigan, M. T., Matinko, J. M., Parker, J. (1997): Brock biology of microorganisms (8th ed.). Prentice-Hall International (UK) Limited, London.

Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. (2000): Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 625-633

Marshall, K. C. (1984): Microbial adhesion and aggregation. Springer Verlag, Berlin.

146


Marshall, K. C. (1985): Microbial adhesion in oligotrophic habitats. Microb. Sci. 2, 321-326

Marshall, K. C. (1996): Adhesion as a strategy for access to nutrients. In: Fletcher, M. M. (Hrsg.): Bacterial adhesion, S. 59-87, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Martin-Cereceda, M., Jorand, F., Guinea, A., Block, J. C. (2001): Characterization of extracellular polymeric substances in rotating biological contractors and activated sludge flocs. Environ. Technol. 22, 951-959

Marty, N., Dournes, J. L., Chabanon, G., Montrozier, H. (1992): Influence of nutrient media on the chemical composition of the exopolysaccharide from mucoid and non-mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Lett. 98, 35-44

Maruyama, A., Oda, M., Higashihara, T. (1993): Abundance of virus-sized non-DNase-digestible DNA (coated DNA) in eutrophic seawater. Appl. Environ. Microbiol. 59, 712-717

Matulová, M., Navarini, L., Osman, S. F., Fett, W. F. (1996): NMR analysis of galactoglucan from Pseudomonas marginalis: assignment of the 1H and 13C NMR spectra and location of succinate groups. Carbohydr. Res. 283, 195-205

May, T. B., Chakrabarty, A. M. (1994): Isolation and assay of Pseudomonas aeruginosa alginate. Meth. Enzymol. 235, 295-304

Mayer, C., Moritz, R., Kirschner, C., Borchard, W., Maibaum, R., Wingender, J., Flemming, H.-C. (1999): The role of intermolecular interactions studies on model systems for bacterial biofilms. Int. J. Biol. Macromol. 26, 3-16

Mirelman, D., Ofek, I. (1986): Introduction to microbial lectins and agglutinins. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Molisch, H. (1886): Zwei neue Zuckerreactionen. Monatsschr. Chem. 7, 108-111

Montagna, P. A. (1982): Sampling design and enumeration statistics for bacteria extracted from marine sediments. Appl. Environ. Microbiol. 42, 1366–1372

Moorhouse, R., Walkinshaw, M. D., Arnott, S. (1977): Xanthan gum - molecular conformation and interactions. In: Stanford, P. A., Laskin, A. (Hrsg.): Extracellular microbial polysaccharides, Vol. 45, S. 90-102, ACS Symposium Series, Washington, D. C.

Morgan, J. W., Forster, C. F., Evison, L. (1990): A comparative study of the nature of biopolymers extracted from anaerobic and activated sludges. Wat. Res. 24, 743-750

147


Morton, L. H. G., Greenway, D. L. A., Gaylarde, C. C., Surman, S. B. (1998): Consideration of some implications of the resistance of biofilms to biocides. Int. Biodeterior. Biodegr. 41, 247 - 259

Münster, U., Chróst, R. J. (1990): Origin, composition and microbial utilization of dissolved organic matter. In: Overbeck, J., Chróst, R. J. (Hrsg.): Aquatic microbial ecology: Biochemical and molecular approaches, S. 8-46, Springer Verlag, New York.

Muto, Y., Goto, S. (1986): Transformation by extracellular DNA produced by Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 30, 621-628

Newth, F. H. (1951): The formation of furan compounds from hexoses. Adv. Carbohydr. Chem. 6, 83-106

Ng, F. M.-W., Dawes, E. A. (1973): Chemostat studies on the regulation of glucose metabolism in Pseudomonas aeruginosa by citrate. Biochem. J. 132, 129-140

Nielsen, P. H., Frølund, B., Keiding, K. (1996): Changes in the composition of extracellular polymeric substances in activated sludge during anaerobic storage. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 823-830

Nielsen, P. H., Jahn, A., Palmgren, R. (1997): Conceptual model for production and composition of exopolymers in biofilms. Wat. Sci. Tech. 36, 11-19

Nielsen, P. H., Jahn, A. (1999): Extraction of EPS. In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 49-72, Springer Verlag, Berlin.

Norton, I. T., Goodall, D. M., Frangou, S. A., Morris, E. R., Rees, D. A. (1984): Mechanism and dynamics of conformational ordering in xanthan polysaccharide. J. Mol. Biol. 175, 371-394

Nouwens, A. S., Willcox, M. D., Walsh, B. J., Cordwell, S. J. (2002): Proteomic comparison of membrane and extracellular proteins from invasive (PAO1) and cytotoxic (6206) strains of Pseudomonas aeruginosa. Proteomics 2, 1325-1346

Nouwens, A. S., Beatson, S. A., Whitchurch, C. B., Walsh, B. J., Schweizer, H. P., Mattick, J. S., Cordwell, S. J. (2003): Proteome analysis of extracellular proteins regulated by the las and rhl quorum sensing systems in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Microbiology 149, 1311-1322

Novak, J. T., Haugan, B. E. (1981): Polymer extraction from the activated sludge. J. Wat. Pollut. Control Fed. 53, 1420-1424

Obayashi, A. W., Gaudy, A. F. (1973): Aerobic digestion of extracellular microbial polysaccharides. J. Wat. Pollut. Control Fed. 45, 1584-1594

148


Ochsner, U. A., Fiechter, A., Reiser, J. (1994): Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the Pseudomonas aeruginosa rhlAB genes encoding a rhamnosyltransferase involved in rhamnolipid biosurfactant synthesis. J. Biol. Chem. 269, 19787-19795

Ohman, D. E., Chakrabarty, A. M. (1981): Genetic mapping of chromosomal determinants for the production of the exopolysaccharide alginate in a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolate. Infect. Immun. 33, 142-148

Omar, A. S., Weckesser, J., Mayer, H. (1983): Different polysaccharides in the external layers (capsule and slime) of the cell envelope of Rhodopseudomonas capsulata Sp11. Arch. Microbiol. 136, 291-296

Ophir, T., Gutnick, D. L. (1994): A role for exopolysaccharides in the protection of microorganisms from desiccation. Appl. Environ. Microbiol. 60, 740-745

Osman, S. F., Fett, W. F., Irwin, P., Cescutti, P., Brouillette, J. N., O´Connor, J. V. (1997): The structure of the exopolysaccharide of Pseudomonas fluorescens strain H13. Carbohydr. Res. 300, 323-327

O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. (2000): Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79

Palleroni, N. J. (1984): Pseudomonas aeruginosa. In: Krieg, N. R. (Hrsg.): Bergey's manual of systematic bacteriology, Vol. 1, S. 164-165, Williams and Wilkins Co., Baltimore.

Palmgren, R., Nielsen, P. H. (1996): Accumulation of DNA in the exopolymeric matrix of activated sludge and bacterial cultures. Wat. Sci. Tech. 34, 233-240

Patel, J. J., Gerson, T. (1974): Formation and utilization of carbon reserves by Rhizobium. Arch. Microbiol. 101, 211-220

Pavoni, J. L., Tenney, M. W., Echelberger, W. F. (1972): Bacterial exocellular polymers and biological flocculation. J. Wat. Pollut. Control Fed. 44, 414-431

Pelkonen, S., Häyrinen, J., Finne, J. (1988): Polyacrylamide gel electrophoresis of capsular polysaccharides of Escherichia coli and other bacteria. J. Bacteriol. 170, 2646-2653

Pereira, M. O., Vieira, M. J. (2001): Effects of the Interactions between glutaraldehyde and the polymeric matrix on the efficacy of the biocide against Pseudomonas fluorescens biofilms. Biofouling 17, 93-101

Phillips, I. (1969): Identification of Pseudomonas aeruginosa in the clinical laboratory. J. Med. Microbiol. 2, 9-16

149


Platt, R. M., Geesey, G. G., Davis, J. D., White, D. C. (1985): Isolation and partial chemical analysis of firmly bound exopolysaccharide from adherent cells of a freshwater sediment bacterium. Can. J. Microbiol. 31, 675-680

Preuß, G., Hupfer, M. (1998): Ermittlung von Bakterienzahlen in aquatischen Sedimenten. In: VAAM (Hrsg.): Mikrobiologische Charakterisierung aquatischer Sedimente, S. 1-34, R. Oldenbourg Verlag, München.

Priest, F. G. (1992): Enzymes, extracellular. In: Lederberg, J. (Hrsg.): Encyclopedia of microbiology, S. 81-93, Academic Press, San Diego.

Purevdorj, B., Costerton, J. W., Stoodley, P. (2002): Influence of hydrodynamics and cell signaling on the structure and behavior of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4457-4464

Quarmby, J., Forster, C. F. (1995): An examination of the structure of UASB granules. Wat. Res. 11, 2449-2454

Rahman, M. M., Guard-Petter, J., Asokan, K., Carlson, R. W. (1997): The structure of the capsular polysaccharide from a swarming strain of pathogenic Proteus vulgaris. Carbohydr. Res. 301, 213-220

Raunkjær, K., Hvitved-Jacobsen, T., Nielsen, P. H. (1994): Measurement of pools of protein, carbohydrate and lipid in domestic wastewater. Wat. Res. 28, 251-262

Read, R. R., Costerton, J. W. (1987): Purification and characterization of adhesive exopolysaccharides from Pseudomonas putida and Pseudomonas fluorescens. Can. J. Microbiol. 33, 1080-1090

Reali, D., Rosati, S. (1994): Antibiotic susceptibility and serotyping of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from surface waters, thermomineral waters and clinical specimens. Zbl. Hyg. 196, 75-80

Rehm, B. H. A., Valla, S. (1997): Bacterial alginates: biosynthesis and applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 281-288

Rickard, A. H., Leach, S. A., Buswell, C. M., High, N. J., Handley, P. S. (2000): Coaggregation between aquatic bacteria is mediated by specific growth phase dependent lectin saccharide interactions. Appl. Environ. Microbiol. 66, 431-434

Roberson, E. B., Firestone, M. K. (1992): Relationship between desiccation and exopolysaccharide production in a soil Pseudomonas sp. Appl. Environ. Microbiol. 58, 1284-1291

Robyt, J. F. (1998): Essentials of carbohydrate chemistry. Springer Verlag, New York.

150


Rode, A. (1999): Anwendung biochemischer Methoden zur Charakterisierung von bakteriellen extrazellulären polymeren Substanzen (EPS). Diplomarbeit, Gerhard-Mercator-Universität Duisburg.

Roe, J. H. (1934): A Colorimetric method for the determination of fructose in blood and urine. J. Biol. Chem. 107, 15-22

Römling, U. (2002): Molecular biology of cellulose production in bacteria. Res. Microbiol. 153, 205-212

Ross, N. W., Levitan, R., Labelle, J., Schneider, H. (1991): Protein and other compositional differences of the extracellular material from slimy and non-slimy colonies of non-mucoid Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Lett. 81, 257-260

Rudd, T., Sterritt, R. M., Lester, J. (1982): The use of extraction methods for the quantification of extracellular polymer production by Klebsiella aerogenes under varying cultural conditions. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 16, 23-27

Rudd, T., Sterritt, R. M., Lester, J. N. (1983): Extraction of extracellular polymers from activated sludge. Biotechnol. Lett. 5, 327-332

Russel, M. (1998): Macromolecular assembly and secretion across the bacterial cell envelope: type II protein secretion systems. J. Mol. Biol. 279, 485-499

Samain, E., Milas, M., Bozzi, L., Dubreucq, G., Rinaudo, M. (1997): Simultaneous production of two different gelforming exopolysaccharides by an Alteromonas strain originating from deep sea hydrothermal vents. Carbohydr. Polym. 34, 235-241

Sandaa, R.-A., Enger, O., Torsvik, V. (1998): Rapid method for fluorimetric quantification of DNA in soil. Soil Biol. Biochem. 30, 265-268

Santos, A. S., Sampaio, A. P., Vasquez, G. S., Santa Anna, L. M., Pereira, N., Jr., Freire, D. M. (2002): Evaluation of different carbon and nitrogen sources in production of rhamnolipids by a strain of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Biochem. Biotechnol. 98, 1025-1035

Sato, T., Ose, Y. (1984): Floc-forming substances extracted from activated sludge with ammonium hydroxide and EDTA solutions. Wat. Sci. Tech. 17, 517-528

Schlegel, H. G. (1992): Allgemeine Mikrobiologie. Thieme Verlag, Stuttgart.

Schmidt, J. E., Ahring, B. K. (1994): Extracellular polymers in granular sludge from different upflow anaerobic sludge blanket (UASB) reactors. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 457-462

151


Schmidt, M. A., Jann, K. (1982): Phospholipid substitution of capsular (K) polysaccharide antigens from Escherichia coli causing extraintestinal infections. FEMS Microbiol. Lett. 14, 69-74

Schubert, R. (1975): Das Vorkommen von Pseudomonas aeruginosa in Grundwasser, Oberflächenwasser und in Wasserversorgungsleitungen in tropischen Gebieten. gwf-Wasser/Abwasser 116, 413-414

Schulte, S., Wingender, J., Flemming, H.-C. (2003): Effect of biocides on biofilms. In: Paulus, W. (Hrsg.): Directory of microbicides for the protection of materials and processes, Kapitel 5, Kluwer Academic Publishers, Dodrecht.

Schwenk, R. (2002): Pseudomonas aeruginosa in einem Trinkwassernetz. Epidemiologisches Bulletin 40, 337-338

Sengha, S. S., Anderson, A. J., Hacking, A. J., Dawes, E. A. (1989): The production of alginate by Pseudomonas mendocina in batch and continuous culture. J. Gen. Microbiol. 135, 759-804

Sherbrock-Cox, V., Russell, N. J., Gacesa, P. (1984): The purification and chemical characterisation of the alginate present in extracellular material produced by mucoid strains of Pseudomonas aeruginosa. Carbohydr. Res. 135, 147-154

Shoreit, A. A. M., Soltan, E.-S. (1992): Selective isolation of fluorescent and nonfluorescent Pseudomonas species from Sohag governorate (upper Egypt). J. Basic Microbiol. 32, 397-403

Siegmund, I., Wagner, F. (1991): New method for detecting rhamnolipids excreted by Pseudomonas species during growth on mineral agar. Biotechnol. Tech. 5, 265-268

Singh, P. K., Schaefer, A. L., Parsek, M. R., Moninger, T. O., Welsh, M. J., Greenberg, E. P. (2000): Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms. Nature 407, 762-764

Smidsrød, O. (1970): Solution properties of alginate. Carbohydr. Res. 13, 359-372

Smith, J. J., Travis, S. M., Greenberg, E. P., Welsh, M. J. (1996): Cystic fibrosis airway epithelia fail to kill bacteria because of abnormal airway surface fluid. Cell 85, 229-236

Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., Klenk, D. C. (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85

Smolski, A. (2002): Einfluss des lipolytischen Systems auf die Produktion von Rhamnolipid in Pseudomonas aeruginosa. Diplomarbeit, Ruhr-Universität Bochum.

152


Smucker, R. A., Kim, C. K. (1991): Chitinase activity in Estuarine waters. In: Chróst, R. J. (Hrsg.): Microbial enzymes in aquatic environments, Kap. 16, S. 249-269, Springer Verlag, New York.

Späth, R., Flemming, H.-C., Wuertz, S. (1998): Sorption properties of biofilms. Wat. Sci. Tech. 37, 207-210

Späth, R., Wuertz, S. (2000): Extraction and quantification of extracellular polymeric substances from wastewater. In: Flemming, H.-C., Szewzyk, U., Griebe, T. (Hrsg.): Biofilms - Investigative Methods & Applications, S. 51-68, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster.

Spiers, A. J., Buckling, A. B., Rainey, P. B. (2000): The causes of Pseudomonas diversity. Microbiology 146, 2345-2350

Spiers, A. J., Bohannon, J., Gehrig, S. M., Rainey, P. B. (2003): Biofilm formation at the air–liquid interface by the Pseudomonas fluorescens SBW25 wrinkly spreader requires an acetylated form of cellulose. Mol. Microbiol. 50, 15-27

Stehr, G., Zorner, S., Bottcher, B., Koops, H. P. (1995): Exopolymers - an ecological characteristic of a floc-attached, ammonia-oxidizing bacterium. Microb. Ecol. 30, 115-126

Steinberger, R. E., Allen, A. R., Hansma, H. G., Holden, P. A. (2002): Elongation correlates with nutrient deprivation in Pseudomonas aeruginosa-unsaturated biofilms. Microb. Ecol. 43, 416-423

Steiner, A. E., McLarsen, D. A., Forster, C. F. (1976): The nature of activated sludge flocs. Wat. Res. 10, 25-30

Stevenson, F. J. (1982): Humus chemistry - genesis, composition, reactions. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Straatmann, A., Borchard, W. (2002): Determination of thermodynamic properties of sodium alginate from bacteria and seaweeds in aqueous solutions. Progr. Colloid Polym. Sci. 119, 64-69

Strathmann, M., Wingender, J., Flemming, H.-C. (2002): Application of fluorescently labelled lectins for the visualization and biochemical characterization of polysaccharides in biofilms of Pseudomonas aeruginosa. J. Microbiol. Methods 50, 237-248

Strathmann, M. (2003): Visualisierung und Charakterisieung von extrazellulären polymeren Substanzen. Dissertation, Universität Duisburg-Essen.

Streeter, J. G., Salminen, S. O., Beuerlein, J. E., Schmidt, W. H. (1994): Factors influencing the synthesis of polysaccharides by Bradirhizobium japonicum bacteroids in field-grown soybean nodules. Appl. Environ. Microbiol. 60, 2939-2943

153


Stryer, L. (1996): Biochemie (4. Aufl.). Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg.

Süßmuth, R., Eberspächer, J., Haag, R., Springer, W. (1987): Bestimmung der Keimzahl. In: Süßmuth, R., Eberspächer, J., Haag, R., Springer, W. (Hrsg.): Biochemisch-mikrobiologisches Praktikum, S. 21-30, Georg Thieme Verlag, Stuttgart.

Sutherland, I. W. (1977): Surface carbohydrates of the procaryotic cell. In: Sutherland, I. W. (Hrsg.): Surface carbohydrates of the procaryotic cell, S. 27-96, Academic Press, New York.

Sutherland, I. W. (1985): Biosynthesis and composition of Gram-negative bacterial extracellular and wall polysaccharides. Annu. Rev. Microbiol. 39, 243-270

Sutherland, I. W. (1988): Bacterial surface polysaccharides: structure and function. Int. Rev. Cytol. 113, 187-231

Sutherland, I. W. (1990): Exopolysaccharide structure. In: Sutherland, I. W. (Hrsg.): Biotechnology of microbial exopolysaccharides, 9, S. 20-37, Cambridge University Press, Cambridge.

Sutherland, I. W. (1994): Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides. Biotech. Adv. 12, 393-448

Sutherland, I. W. (1995): Polysaccharide lyases. FEMS Microbiol. Rev. 16, 323-347

Sutherland, I. W. (1999a): Microbial polysaccharide products. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16, 217-229

Sutherland, I. W. (1999b): Polysaccharases for microbial exopolysaccharides. Carbohydr. Polym. 38, 319-328

Sutherland, I. W. (1999c): Polysaccharases in biofilms - sources - action - consequences! In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 201-216, Springer Verlag, Berlin.

Sutherland, I. W. (2001a): Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology 147, 3-9

Sutherland, I. W. (2001b): Exopolysaccharides in biofilms, flocs and related structures. Wat. Sci. Tech. 43, 77-86

Syldatk, C., Lang, S., Matulovic, U., Wagner, F. (1985a): Production of four interfacial active rhamnolipids from n-alkanes or glycerol by resting cells of Pseudomonas species DSM 2874. Z. Naturforsch. [C] 40, 61-67

154


Syldatk, C., Lang, S., Wagner, F., Wray, V., Witte, L. (1985b): Chemical and physical characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec. DSM 2874 grown on n-alkanes. Z. Naturforsch. [C] 40, 51-60

Tago, Y., Aida, K. (1977): Exocellular mucopolysaccharide closely related to bacterial floc formation. Appl. Environ. Microbiol. 34, 306-314

Thomanetz, E. (1982): Untersuchungen zur Charakterisierung und quantitativen Erfassung der Biomasse von belebten Schlämmen. R. Oldenbourg, München.

Titus, S., Gaonkar, S. N., Srivastava, R. B., Karande, A. A. (1995): Exopolymer production by a fouling marine bacterium Pseudomonas alcaligenes. Indian Journal of Marine Sciences 24, 45-48

Trevors, J. T., Barkay, T., Bourquin, W. (1987): Gene transfer among bacteria in soils and aquatic environments: a review. Can. J. Microbiol. 33, 191-198

Troch, P., Philip-Hollingworth, S., Orgambide, G., Dazzo, F. B., Vanderleyden, J. (1992): Analysis of extracellular polysaccharides isolated from Azospirillum brasilense wild type and mutant strains. Symbiosis 13, 229-241

Uhlinger, D. J., White, D. C. (1983): Relationship between physiological status and formation of extracellular polysaccharide glycocalyx in Pseudomonas atlantica. Appl. Environ. Microbiol. 45, 64-70

Underwood, G. J. C., Paterson, D. M., Parkes, R. J. (1995): The measurement of microbial carbohydrate exopolymers from intertidal sediments. Limnol. Oceanogr. 40, 1243-1253

Urbain, V., Block, J. C., Manem, J. (1993): Bioflocculation in activated sludge: an analytic approach. Wat. Res. 27, 829-838

Vallom, J. K., McLoughlin, A. J. (1984): Lysis as a factor in sludge flocculation. Wat. Res. 18, 1523-1528

Vandevivere, P., Kirchman, D. L. (1993): Attachment stimulates exopolysaccharide synthesis by a bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 59, 3280-3286

Veiga, M. C., Mahendra, K. J., Wu, W.-M., Hollingsworth, R. I., Zeikus, J. G. (1997): Composition and role of extracellular polymers in methanogenic granules. Appl. Environ. Microbiol. 63, 403-407

Vogel, H. J., Bonner, D. M. (1956): Acetylornithinase of Escherichia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218, 97-106

Vogt, M., Flemming, H.-C., Veeman, W. S. (2000): Diffusion in Pseudomonas aeruginosa biofilms: a pulsed field gradient NMR study. J. Biotechnol. 77, 137-146

155


Wagner, M., Amann, R. J., Lemmer, H., Schleifer, K.-H. (1993): Probing activated sludge with proteobacteria-specific oligonucleotides: inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1520-1525

Wetzel, R. G. (1991): Extracellular enzymatic interactions: storage, redistribution, and interspecific communication. In: Chróst, R. J. (Hrsg.): Microbial enzymes in aquatic environments, S. 6-28, Springer Verlag, Berlin.

Whitchurch, C. B., Tolker-Nielsen, T., Ragas, P. C., Mattick, J. S. (2002): Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation. Science 295, 1487

Wilén, B.-M., Jin, B., Lant, P. (2003): Relationship between flocculation of activated sludge and composition of extracellular polymeric substances. Wat. Sci. Tech. 47, 95-103

Williams, W. S., Cannon, R. E. (1989): Alternative environmental roles for cellulose produced by Acetobacter xylinum. Appl. Environ. Microbiol. 55, 2448-2452

Wimpenny, J., Manz, W., Szewzyk, U. (2000): Heterogeneity in biofilms. FEMS Microbiol. Rev. 24, 661 - 671

Wimpenny, J. T. W., Kinniment, S. L. (1995): Biochemical reactions and the establishment of gradients within biofilms. Cambridge University Press, New York.

Windhüs, T. (2002): Physikalisch-chemische Charakterisierung von extrazellulären polymeren Substanzen und deren Alginatkomponenten mit Streulichtmethoden. Dissertation, Gerhard-Mercator-Universität Duisburg.

Windhüs, T., Borchard, W. (2003): Effect of acetylation on physico-chemical properties of bacterial and algal alginates in physiological sodium chloride solutions investigated with light scattering techniques. Carbohydr. Polym. 52, 47-52

Wingender, J., Winkler, U. K. (1984): A novel biological function of alginate in Pseudomonas aeruginosa and its mucoid mutants: stimulation of exolipase. FEMS Microbiol. Lett. 21, 63-69

Wingender, J., Flemming, H.-C. (1999): Autoaggregation of microorganisms. In: Rehm, H.-J., Reed, G. (Hrsg.): Biotechnology, 11a, S. 65-83, Wiley-VCH, Weinheim.

Wingender, J., Jaeger, K.-E., Flemming, H.-C. (1999a): Interaction between extracellular polysaccharides and enzymes. In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 231-251, Springer Verlag, Berlin.

156


Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (1999b): What are bacterial extracellular polymeric substances? In: Wingender, J., Neu, T., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 1-19, Springer Verlag, Berlin.

Wingender, J., Strathmann, M., Rode, A., Leis, A., Flemming, H.-C. (2001): Isolation and biochemical characterization of extracellular polymeric substances from Pseudomonas aeruginosa. Meth. Enzymol. 336, 302-314

Wingender, J., Jaeger, K.-E. (2002): Extracellular enzymes in biofilms. In: Bitton, G. (Hrsg.): Encyclopedia of environmental microbiology, Bd. 3, S. 1207-1223, John Wiley & Sons, Inc., New York.

Wingender, J., Dannehl, A., Bressler, D., Flemming, H.-C. (2003): Charakterisierung von Biofilmen in Trinkwasserverteilungssystemen. In: Flemming, H.-C. (Hrsg.): Erfassung des Kontaminationspotentials von Biofilmen in der Verteilung von Trinkwasser, Berichte aus dem IWW, Bd. 36, S. 27-85, Print Service, Mülheim an der Ruhr.

Wolfaardt, G. M., Lawrence, J. R., Korber, D. R. (1999): Function of EPS. In: Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H.-C. (Hrsg.): Microbial extracellular polymeric substances, S. 171-200, Springer Verlag, Berlin.

Wozniak, D. J., Wyckoff, T. J., Starkey, M., Keyser, R., Azadi, P., O'Toole, G. A., Parsek, M. R. (2003): Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 7907-7912

Wrangstadh, M., Conway, P. L., Kjelleberg, S. (1986): The production and release of an extracellular polysaccharide during starvation of a marine Pseudomonas sp. and the effect thereof on adhesion. Arch. Microbiol. 145, 220-227

Wuertz, S., Spaeth, R., Hinderberger, A., Griebe, T., Flemming, H.-C., Wilderer, P. A. (2001): A new method for extraction of extracellular polymeric substances from biofilms and activated sludge suitable for direct quantification of sorbed metals. Wat. Sci. Tech. 43, 25-31

Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. (1998): Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039

Zhang, Y., Miller, R. M. (1992): Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Appl. Environ. Microbiol. 58, 3276-3282

Zinkevich, V., Bogdarina, I., Kang, H., Hill, M. A. W., Tapper, R., Beech, I. B. (1996): Characterisation of exopolymers produced by different isolates of marine sulphate-reducing bacteria. Int. Biodeterior. Biodeg. 37, 163-172

157


Zobell, C. E. (1943): The effect of solid surfaces upon bacterial activity. J. Bacteriol. 46, 39-56

158

Lebenslauf Name Alexander Rode Anschrift Stresemannstr. 81 47051 Duisburg Deutschland Geburtsdatum 18.12.1972 Geburtsort Tokio, Japan Familienstand unverheiratet Staatsangehörigkeit deutsch Schulbildung / Studium 1979 – 1985 Deutsche Schule Alexander von Humboldt Mexiko-Stadt, Mexiko

1985 – 1992 Staatl. Friedrich-Wilhelm-Gymnasium Trier, Abitur (Note 2,9)

1992 – 1994 Studium der Chemie an der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

1994 – 1999 Fortsetzung des Chemie-Studiums an der Gerhard-Mercator-Universität Duisburg, Diplom (Note 1,8)

2000 – 2004 Promotionsstudium an der Gerhard-Mercator-Universität Duisburg

Praktika 5 Wochen Entwicklung Bioanalytika, Boehringer Mannheim, Penzberg

8 Wochen Trainingsprogramm für die chemisch-pharmazeutische Industrie, Farmacéuticos Lakeside, Toluca, Mexiko

6 Wochen Therapeutika Biotech Produktion/Analytik, Boehringer Mannheim, Penzberg

Besondere Kenntnisse Fremdsprachen Englisch und Spanisch fließend in Wort und Schrift, Französisch

Seminare Industrielles Projektmanagement

Sachkenntnisprüfung nach § 5 Chemikalien-Verbotsverordnung

2-D Elektrophorese

EDV Prüfung Netzwerk-Grundlagen, Prometric Testing Center Microsoft Office und Windows

Duisburg, 14.05.04

Isolierung und Charakterisierung von bakteriellen ......Isolierung und Charakterisierung von...

Documents

Transcript of Isolierung und Charakterisierung von bakteriellen ......Isolierung und Charakterisierung von...