Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen aus Riechzellen … · 2005. 8. 30. ·...
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Isolierung und Charakterisierung
von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte
Nicole Ungerer
Heidelberg, August 2005
Isolierung und Charakterisierung
von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte
Nicole Ungerer
Heidelberg, August 2005
Diplomarbeit im Fachbereich Biologie
an der Fakultät für Biowissenschaften
der Ruprecht-Karls-Universität
Heidelberg
Isolierung und Charakterisierung
von Membranproteinen aus Riechzellen der Ratte
Vorgelegt von Nicole Ungerer
Heidelberg, August 2005
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Zoologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
in der Zeit vom 7. Dezember 2004 bis 7. August 2005 unter Anleitung von Prof. Dr. Stephan Frings
und Dr. Frank Möhrlen angefertigt.
Referent: Prof. Dr. Stephan Frings
Korreferent: PD Dr. Harald Herrmann-Lerdon
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig angefertigt und keine anderen als
die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe.
Heidelberg, den 07. August 2005
________________________________________
Nicole Ungerer
Danksagung
Diese Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Physiologie am Institut für Zoologie der
Universität Heidelberg angefertigt. An dieser Stelle möchte ich mich bei allen für die
freundschaftliche Atmosphäre innerhalb der Arbeitsgruppe bedanken, die sehr zum Erfolg dieser
Arbeit beigetragen hat.
Mein besonderer Dank gilt:
• Prof. Dr. Stephan Frings für die Überlassung des Themas und für das große Interesse an
dieser Arbeit
• Priv.-Doz. Dr. Harald Herrmann-Lerdon (DKFZ, Heidelberg) für die Übernahme des
Korreferats
• Dr. Frank Möhrlen für die tadellose Betreuung und Beratung bei der Durchführung
biochemischer Experimente
• Dipl.-Biol. Ulrich Mayer für die gute Zusammenarbeit und seine Diskussionsbereitschaft
• Dipl.-Biol. Daniel Klimmeck für viele kreative Ideen und Korrekturlesearbeiten
• Dr. Uwe Warnken (DKFZ, Heidelberg) für die Durchführung der ESI-Massenspektrometrie
und die große Hilfsbereitschaft
• Dr. Tore Kempf (DKFZ, Heidelberg) für die praktische Hilfestellung beim Protein-Verdau
und für viele nützliche Ratschläge
• Dr. Martina Schnölzer (DKFZ, Heidelberg) für das große Interesse an diesem Projekt
• Priv.-Doz. Dr. Ingrid Boekhoff für ihre nützlichen Tipps bei der Cilien-Präparation
• Meinem Lebensgefährten Thomas und meinen Kindern Sebastian und Valerian für ihre
große Geduld und ihr humorvolles Wesen.
Inhaltsverzeichnis
i
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis………………………………………………………………………………i
Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………………....I
1 Einleitung .......................................................................................................................... 1
1.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels............................................................................ 1
1.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade ................................................................... 3
1.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion........................................... 5
1.4 Protein-Analytik ......................................................................................................... 6
1.4.1 Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese ............................. 7
1.4.2 Massenspektrometrie.......................................................................................... 8
1.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik.............. 8
1.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung ....................... 10
1.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF ............................... 12
1.5 Ziel dieser Arbeit...................................................................................................... 15
2 Material und Methoden ................................................................................................. 16
2.1 Chemikalien und Material ........................................................................................ 16
2.2 Lösungen .................................................................................................................. 17
2.2.1 Lösungen für die Präparation ........................................................................... 17
2.2.1.1 Lösungen für die Cilien-Präparation ............................................................ 17
2.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel............................ 17
2.2.1.3 Verwendete Protease-Inhibitoren................................................................. 18
2.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode ................................... 19
2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase ................................... 20
2.2.4 Lösungen für die SDS PAGE........................................................................... 20
2.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE ....................................................... 21
2.2.6 Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung ............................................. 22
2.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung............................................. 22
2.2.8 Lösungen für die Western Blot-Analyse .......................................................... 23
2.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine.......................................... 23
2.3 Größenstandards und Antikörper ............................................................................. 24
2.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese ..................................................... 24
Inhaltsverzeichnis
ii
2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGE............................................................. 24
2.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE............... 25
2.3.2 Antikörper für die Western Blot-Analyse ........................................................ 26
2.3.2.1 Primäre Antikörper....................................................................................... 26
2.3.2.2 Sekundäre Antikörper .................................................................................. 26
2.4 Tiere ......................................................................................................................... 27
2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel ........................................................ 27
2.5.1 Präparation und Isolierung des Gesamtepithels ............................................... 27
2.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode ................................. 28
2.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999) ........................... 30
2.6 PNGaseF-und Benzonase-Behandlung .................................................................... 30
2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-Methode................ 31
2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese................................................... 32
2.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli
(1970)….. ......................................................................................................................... 32
2.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (verändert
nach Navarre et al, 2002) ................................................................................................. 33
2.8.2.1 Vorbereitung der Gele.................................................................................. 33
2.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGE........................................................................ 34
2.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGE ............................................................................ 35
2.9 Färbung der Proteine im Gel .................................................................................... 35
2.9.1 Reversible MS-kompatible Silberfärbung........................................................ 35
2.9.2 Colloidale Coomassie-Färbung ........................................................................ 36
2.10 Western Blot-Analyse .............................................................................................. 36
2.10.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen .................................................. 36
2.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-
Aktivität............................................................................................................................ 36
2.11 Massenspektrometrie................................................................................................ 38
2.11.1 Ausschneiden der Proteine ............................................................................... 38
2.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“) ............................. 39
2.11.3 Nano-LC und interne Kalibrierung .................................................................. 40
2.11.4 Extraktion der Proben....................................................................................... 41
Inhaltsverzeichnis
iii
3 Ergebnisse ....................................................................................................................... 42
3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen ........................... 42
3.2 Qualitative Analyse der Präparation ........................................................................ 44
3.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE .................. 44
3.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse..... 45
3.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals ....................... 45
3.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III) ...................... 46
3.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins
(Gα olf)….. ..................................................................................................................... 47
3.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse ............ 47
3.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen Trennverfahrens................... 49
3.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese............................................................................................................. 49
3.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung ......................... 50
3.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung 51
3.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis cilien-spezifischer
Markerproteine ..................................................................................................................... 53
3.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit ................... 53
3.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von Gα olf.............................................. 54
3.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der Proteine ........ 55
3.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus Datenbanken .. 56
3.5.2 Tabellarische Auflistung der Resultate ............................................................ 60
4 Diskussion ....................................................................................................................... 64
5 Zusammenfassung.......................................................................................................... 73
6 Literaturverzeichnis....................................................................................................... 74
A Anhang ............................................................................................................................ 83
Abkürzungsverzeichnis
I
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung Erklärung
α anti-
AC III Adenylatcyclase Typ III
AMP Adenosin-5'-monophosphat
API atmospheric pressure ionization
ATP Adenosin-5'-Triphosphat
APS Ammoniumpersulfat
BAC Benzyldimethylhexadecyl-ammonium chlorid
CaBP calcium binding protein
cAMP zyklisches AMP
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propan-
sulfonat
cm Zentimeter
CNG cyclic nucleotide gated channel
CTAB Cetidyltrimethylammoniumbromid
D dimensional
Da Dalton
DTT Dithiothreithol
ECL enhanced chemiluminescence
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraessig-
säure
ER Endoplasmatisches reticulum
ESI electrospray ionization
eV Elektronenvolt
Fa Firma
FAB fast atom bombardment
FAD Flavinadenindinucleotid
Gαolf α-Untereinheit des olfaktorisches G-Protein
Glu Glutamat
gt goat
GTP Guanosin-5'-Triphosphat
Abkürzungsverzeichnis
II
h Stunde
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethan-Sulfonsäure
HPLC High Pressure Liquid Chromatography
HRP horseradish-peroxidase
IEF isoelektrische Fokussierung
IgG Immunglobulin G
InsP3 Inositol 1,4,5-trisphosphat
IP isoelektrischer Punkt
kDa Kilodalton
kHz Kilohertz
kV Kilovolt
LC Liquid Chromatography
LP Lamina propria
M Molar
mA Milliampère
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
MHz Megahertz
ml Milliliter
mm Millimeter
mM milli-Molar
Mr relative Molekülmasse
ms milli-Sekunde
MS Massenspektrometrie
m/ z Masse über Ladung
nL Nanoliter
OD Optische Dichte
OE Olfaktorisches Epithel
ORN Olfaktorische Rezeptor-Neurone
p probability
p.a pro analysi
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS phosphate buffered saline
PHB Prohibitin
PI isoelektrischer Punkt
Abkürzungsverzeichnis
III
PMF Peptidmassen-Fingerprint
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PLC-β2 Phospholipase C-β2
PVDF Polyvinylidenfluorid
Q Quadrupol
rb rabbit
rpm rounds per minute
rt rat
SDS Sodium-Dodecylsulfat
SH- Sulfhydryl-
ToF Time of flight
Tris 2-Amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
TRPC transient receptor potential channel
u Unit
UDP Uridin-Diphosphat
µg Microgramm
µl Microliter
µm Micrometer
v/ v volume per volume
w/ v weight per volume
1 Einleitung
1
1 Einleitung
Membranproteine verleihen den Membranen von Zellen ihre charakteristischen Eigenschaften
und gestatten den Zellen eine gewisse Dynamik. Sie ermöglichen den Transport von
Substanzen über die Membran, wirken katalytisch, z.B. bei der ATP-Synthese, oder haben
strukturelle Funktionen, indem sie das Cytoskelett der Zelle mit der extrazellulären Matrix
oder mit benachbarten Zellen verknüpfen. Als Rezeptoren dienen sie der Weitergabe von
Signalen aus der Umgebung in die Zelle. In Riechsinneszellen verwandeln Membranproteine
chemische Signale in elektrische Signale, ein Vorgang, den man als chemoelektrische
Transduktion bezeichnet.
1.1 Aufbau des olfaktorischen Epithels
Das Riechepithel der Landwirbeltiere liegt als Verbund einzelner Zellschichten in der
Nasenhöhle. Es besteht aus Riechsinneszellen (Riechzellen, olfaktorische Rezeptor-Neurone,
ORN), Stützzellen, Basalzellen und in geringerem Umfang aus Phospholipase C-β2 positiven
Zellen (PLC-β2-Zellen; Anholt, 1993; Elsässer et al., 2005). Seine Oberfläche wird von einer
dünnen wässrigen Schleimschicht, dem Mukus, feucht gehalten und geschützt.
Abb. 1.1 Schematische Darstellung des olfaktorischen Epithels. OE:
Olfaktorisches Epithel; LP: Lamina propria; C: Cilien der
Riechsinneszellen; MV: Mikrovilli der Stützzellen und PLC-β2
positiven Zellen; SZ: Stützzellen; RZ: Riechsinneszellen; BZ:
Basalzellen; BD: Bowman-Drüsen (verändert nach Anholt, 1993).
1 Einleitung
2
Der Mukus wird von unterhalb des Epithels liegenden Drüsenzellen, den Bowman-Drüsen,
sezerniert. Er enthält die für den Riechvorgang notwendigen Elektrolyte und hydrophile,
olfaktorische Bindeproteine (Pelosi, 1994), die die Diffusion der überwiegend hydrophoben
Duftmoleküle zu den Riechsinneszellen erleichtern (Ache und Restrepo, 2000).
Die Lebensdauer von Riechzellen ist auf etwa 4 Wochen begrenzt (Breipohl et al., 1986;
Farbman, 1990). Basalzellen, die unterhalb der Stützzellen liegen, dienen als Stammzellen,
aus denen zeitlebens neue Riechzellen hervorgehen (Breipohl et al, 1986; Carr und Farbman,
1993). Olfaktorische Neurone liefern somit ein Beispiel für die adulte Neurogenese von
Stammzellen, ein interessantes, aber noch wenig erforschtes Gebiet.
Die palisadenartig angeordneten Stützzellen halten die Neurone in einer stabilen Position und
begrenzen das Riechepithel zur Nasenhöhle hin. Die lateralen Membranen der am apikalen
Pol gelegenen Mikrovilli sind durch tight junctions mit den Membranen der Cilienknöpfe
verknüpft und verhindern so eine Durchmischung des Mukus mit der interstitiellen
Flüssigkeit. Stützzellen besitzen ähnliche Eigenschaften wie die Gliazellen des
Zentralnervensystems (ZNS). Sie phagozytieren abgestorbene olfaktorische Neurone, puffern
das extrazelluläre Milieu (Trotier, 1998; Getchell und Mellert, 1991; Getchell und Getchell,
1982) und besitzen elektrische Eigenschaften, messbar als Ionenstrom über der Membran
(Vogalis et al., 2004).
Bei den PLC-β2-Zellen handelt es sich vermutlich um einen zweiten Typ chemosensorischer
Zellen, dessen Existenz und Beteiligung am olfaktorischen Prozess bereits 1975 durch F.
Jourdan postuliert wurde. Morphologisch ähneln diese Zellen, die zu etwa 5% zum
Abb. 1.2 Isolierte
Riechzelle aus Rana
pipiens. Differential-
Interferenz Kontrast-
bild 1:100; (S.J.Kleene,
R.C. Gesteland, 1981).
Riechzellen sind primäre, bipolare Neurone. Vom Zellkörper
ausgehend entsenden sie einen Dendriten zur Oberfläche des
olfaktorischen Epithels. Die Axone der Riechzellen münden
gebündelt im Riechkolben (Bulbus olfactorius), der ersten
Station zentralnervöser Verarbeitung. Jeder Dendrit ist an
seinem apikalen Ende knopfartig erweitert und trägt 10-20
Cilien (Menco, 1983), eine Struktur, die man als dendritischen
Knopf bezeichnet. Die Cilien der Säuger besitzen eine Länge
von etwa 50µm (Finger et al., 2000). Ihre Membranen sind die
Träger der Duftstoff-Rezeptoren und bilden im Mukus eine
große chemosensorische Fläche (Menco, 1980; Buck und Axel,
1991).
1 Einleitung
3
Riechepithel beitragen, mehr den Stützzellen. Möglicherweise handelt es sich aber um
sekundäre bipolare Neurone (Elsässer et al., 2005), deren Axone wahrscheinlich über
afferente Neurone mit dem Gehirn in Verbindung stehen. Die PLC-β2-Zellen münden an
ihrem anterioren Ende in einem Mikrovilli-Saum mit Rezeptoren für Geruchsstoffe, die einen
zum kanonischen Signalweg der Riechzellen alternativen Mechanismus in Gang setzen (Sklar
et al., 1986; Boekhoff et al., 1990; Ronnett et al., 1993; Elsässer et al., 2005).
1.2 Die olfaktorische Transduktionskaskade
Die olfaktorische Transduktionskaskade (Abb. 1.3) beginnt, wenn Geruchsstoffe aus der
Atemluft an die Duftstoff-Rezeptoren der Cilienmembranen binden (Buck und Axel, 1991;
Breer et al., 1994; Zufall et al., 1994; Freitag et al., 1998; Schild und Restrepo, 1998). Bei
Säugern repräsentieren die Duftstoff-Rezeptoren mit etwa 1000 Vertretern die größte Familie
der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Firestein, 2001). Die nach Aktivierung des
olfaktorischen G-Proteins (Golf; Jones und Reed, 1989) dissoziierte α-Untereinheit stimuliert
eine membranständige Typ III-Adenylatzyklase (AC III; Pace et al., 1985; Pfeuffer et al.,
1989; Bakalyar und Reed, 1990). Diese verstärkt das Signal, indem sie die Produktion von
cyclischem AMP (cAMP) aus ATP katalysiert. Durch den schnellen Anstieg der
intrazellulären cAMP-Konzentration (Sklar et al., 1986; Breer et al., 1990; Lowe und Gold,
1993) öffnen cyclisch-Nukleotid gesteuerte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) in der
Plasmamembran (Nakamura und Gold, 1987; Firestein et al., 1991; Frings et al., 1992) und
leiten neben Natrium-Ionen verstärkt Calcium-Ionen in das ciliäre Lumen (Dzeja et al., 1999).
Die höhere Leitfähigkeit des CNG-Kanals spielt eine untergeordnete Rolle bei der
Depolarisierung der Membran, entscheidender ist der resultierende Anstieg der intrazellulären
Calcium-Konzentration [Ca2+
]i. Im mikromolaren Bereich bewirkt dieser die Öffnung Ca2+
-
aktivierter Chlorid-Kanäle (Kleene und Gestland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi und Yau,
1993; Hallani et al., 1998) und den Ausstrom von Chlorid-Ionen. In isolierten ORNs trägt
dieser Auswärtsstrom bis zu 80% des Rezeptor-Potentials (Lowe und Gold, 1993; Kleene,
1997). Dies ist insofern ungewöhnlich, da Chlorid-Kanäle normalerweise in Nervenzellen
durch Einstrom von Cl- inhibitorisch wirken. Die Ursache für den ungewöhnlichen Cl
--Efflux
in ORNs liegt in der hohen intrazellulären Cl--Konzentration im Bereich der Cilien (Reuter et
al., 1998). Die Depolarsierung der Cilienmembran durch das Öffnen der CNG-Kanäle wird
also zusätzlich durch den Ausstrom von Chlorid verstärkt und führt schließlich zur Auslösung
von Aktionspotentialen (Kawai et al., 1997; Duchamp-Viret et al., 1999).
1 Einleitung
4
Bei der Abschaltung des Signals erfüllt Ca2+
erneut mehrere Funktionen: Im Komplex mit
Calmodulin inhibiert Ca2+
die Signalkaskade durch negative Rückkopplung, indem es den
Abbau von cAMP durch die Aktivierung der Ca2+
/ Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase
(PDE) stimuliert (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995). Zusätzlich führt die Aktivierung der
CaM-Kinase II zur Phosphorylierung der Adenylatzyklase, die dadurch inaktiviert wird
(Wayman et al., 1995; Wei et al., 1998). Ca2+
/ Calmodulin bindet außerdem mit hoher
Affinität an Calmodulin-Bindestellen der CNG-Kanäle, deren Empfindlichkeit für cAMP
dadurch um ein Vielfaches reduziert wird (Chen und Yau, 1994; Liu et al., 1994;
Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004). Überschüssiges Ca2+
wird durch Na+/ Ca
2+-Austauscher entfernt. Das Zusammenwirken dieser Mechanismen
bewirkt zunächst eine Adaption der Riechzelle, bis anschließend das Ruhepotential
wiederhergestellt ist.
In dem zur olfaktorischen Signaltransduktion der Cilien alternativen Mechanismus der
PLC-β2-Zellen wird kein Anstieg der intrazellulären cAMP-Konzentration beobachtet (Sklar
et al., 1986). Stattdessen steigt die Konzentration an Inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP3) stark
Abb. 1.3 Schematische Darstellung der Signaltransduktion in olfaktorischen
Rezeptor-Neuronen der Maus. (R): G-Protein gekoppelter Riechrezeptor;
(Golf): olfaktorisches G-Protein; (CaMK): CaM-Kinase II; (AC):
Adenylatzyklase Typ III; (A2, A4, B1b): Kanalproteine des CNG-Kanals;
(grün): Ca2+
-gesteuerter Cl--Kanal; (PDE): Phosphodiesterase; (grüne
Pfeile): excitatorische Wege; (rote Pfeile): inhibitorische Wege (siehe Text);
(NKCC1): Chloridionen-Transporter; (NCX): Ca2+
/Na+-Antiporter; (siehe
Text; verändert nach: Frings, 2001).
1 Einleitung
5
an (Restrepo et al., 1990; Fadool und Ache, 1992; Schild et al., 1995; Bruch, 1996;
Kashiwayanagi et al., 1996; Kaur et al., 2001; Spehr et al., 2002). Es konnten verschiedene
Proteine des InsP3-vermittelten Signalwegs in den Mikrovilli-tragenden Zellen innerhalb der
Stützzellschicht kolokalisiert werden. Dazu gehören die Phospholipase C (PLC-β2), der
InsP3-Rezeptor Typ III (InsP3R-III) und ein TRP-Kanal (TRPC6, transient receptor potential
channel 6). Der Anstieg von [Ca2+
]i nach Bindung von Duftstoffen an die Rezeptoren in den
Mikrovilli-Membranen wurde durch Ca2+
-Imaging gezeigt. Es ist bisher noch nicht geklärt, ob
bestimmte Duftstoffe nur durch diesen Signalweg rezipiert werden oder ob diese so genannten
PLC-β2-Zellen modulatorisch wirken (Elsässer et al., 2005).
1.3 Charakterisierung von Proteinen der Signaltransduktion
Molekulare Details und funktionelle Zusammenhänge, die in der Vergangenheit zum
Verständnis zellphysiologischer Abläufe beim Riechvorgang beigetragen haben, stammen
hauptsächlich aus elektrophysiologischen und molekularbiologischen Untersuchungen. Die
Entdeckung, dass Geruchsstoffe cAMP-vermittelte Signalwege in Gang setzen (Pace et al.,
1985), lenkte die Aufmerksamkeit auf das olfaktorische System. Homologe Sequenzen zu den
molekularen Komponenten dieses Transduktionsweges waren für die Durchmusterung von
cDNA-Banken längst verfügbar. Golf, AC III und die CNG A2-Untereinheit des CNG-Kanals
konnten mit dieser Strategie erfolgreich kloniert werden (Jones und Reed, 1989; Bakalyar und
Reed, 1990; Dhallan et al., 1990). Analog wurden 1991 die Gene der Geruchsrezeptoren
durch Linda Buck und Richard Axel kloniert, wofür beide 2004 mit dem Nobel-Preis
ausgezeichnet wurden.
Es scheint, als seien die Hauptkomponenten der olfaktorischen Transduktionskaskade
identifiziert und durch Anwendung der Patch-Clamp-Technik (Hamill et al., 1981) an
isolierten ORNs konnten bereits viele Eigenschaften der beteiligten Kanalproteine studiert
werden. Eine Reihe ungeklärter Fragen bleibt dennoch bestehen und Erkenntnisse werfen
erneut Fragen auf. Zum Beispiel ist es auf Grund fehlender Homologien noch nicht gelungen,
eine Aussage über die molekulare Struktur des Ca2+
-gesteuerten Cl--Kanals zu treffen (Frings,
1999; Eggermont, 2003). Auch die räumliche Anordnung aller Interaktionspartner entlang der
Cilienmembran ist nur ansatzweise geklärt (Reisert et al., 2003). Regulatorische Prozesse und
die beteiligten Proteine, die bei der Adaptation eine Rolle spielen, sind ebenfalls nur teilweise
bekannt. Über die Beteiligung alternativer Transduktionsmechanismen am Riechprozess kann
bisher nur auf Grund lückenhafter Identifikation vorhandener Proteine gemutmaßt werden
(Boekhoff et al., 1990; Steinlen et al., 1990; Breer und Boekhoff, 1991; Fülle et al., 1995;
1 Einleitung
6
Schild et al., 1995; Leinders-Zufall et al., 1996; Juilfs et al., 1997; Gold, 1999; Lischka et al.,
1999; Meyer et al., 2000; Elsässer et al., 2005; eine Übersicht gibt Frings, 2001).
Die Durchführung einer umfassenden Proteom-Studie, die auch die Identifizierung
unbekannter Proteine ermöglicht, kann viel dazu beitragen, fehlende Glieder der
Signaltransduktionskette aufzuspüren und ein detaillierteres Bild aller beteiligten Prozesse zu
entwerfen.
1.4 Protein-Analytik
Die massenspektrometrische Identifizierung (MS) von Proteinen, die zuvor durch ein- oder
zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt wurden, ist mittlerweile eine etablierte
Vorgehensweise in Proteom-Studien. Dabei werden die Proteine zunächst im Gel
proteolytisch gespalten und die daraus eluierten Peptide anschließend massenspektrometrisch
analysiert. Abbildung 1.4 zeigt im Überblick die unterschiedlichen MS-Strategien, die zur
Identifizierung und Charakterisierung der Proteine eingesetzt werden.
1 Einleitung
7
Analyse-Zeiten konnten im Vergleich zur davor üblicherweise durchgeführten Edman-
Sequenzierung (Edman, 1967), bei der Proteine schrittweise durch Modifikation und
Abspaltung der N-terminalen Aminosäure abgebaut und die einzelnen Aminosäuren
schließlich chromatographisch analysiert werden, erheblich verkürzt werden.
1.4.1 Trennung von Membranproteinen durch Gelelektrophorese
Aufgrund der besseren Auflösung sind zweidimensionale Verfahren bei der
gelelektrophoretischen Auftrennung komplexer Proteingemische zu bevorzugen. Die
klassische Methode der isoelektrischen Fokussierung (IEF), bei der Proteine in der ersten
Dimension entlang eines pH-Gradienten bis zur Stelle ihres isoelektrischen Punktes (IP)
wandern (O´Farrell, 1975), ist jedoch zur Analyse von Membranproteinen meistens nicht
geeignet (Hartinger et al., 1996; Santoni et al., 2000; Navarre et al., 2002; Rais et al., 2004).
Ursache dafür ist, dass viele Membranproteine aufgrund der Hydrophobizität ihrer trans-
membranen Regionen nur schwer löslich sind und deshalb insbesondere bei ihrem IP
präzipitieren. Eine Möglichkeit, Membranproteine dennoch quantitativ im Gel darzustellen,
eröffnet sich durch die Wahl geeigneter Detergenzien. Im denaturierenden System hat sich
besonders der Einsatz kationischer Detergenzien in saurem Milieu bewährt (Macfarlane,
1983; Macfarlane, 1989; Hartinger et al., 1996; Navarre et al., 2002). Auf Grund des sauren
pH-Wertes (pH 3 - 4) werden einige lösliche Proteine noch im Probenpuffer gefällt und
Membranproteine können neben ihrer verbesserten Löslichkeit angereichert werden.
Im nativen System kann die Auftrennung ganzer Proteinkomplexe, inklusive aller
Interaktionspartner, durch Einsatz nichtionischer Detergenzien erreicht werden (Hames,
1990). Schägger und Jagow konnten diese Methode auch erfolgreich für die Aufreinigung von
Membranprotein-Komplexen etablieren (Schägger und Jagow, 1991; Schägger, 2003). Bei
dieser Methode ist zu berücksichtigen, dass der Trennerfolg wesentlich von der Art des
Detergenz und dem Detergenz-zu-Protein-Verhältnis abhängt und nicht für alle Komplexe
eines Proteingemischs eine Wahl gleichermaßen geeignet ist.
Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Proteinidentifizierung
(Erläuterungen im Text).
1 Einleitung
8
1.4.2 Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren zur Detektion von Molekülmassen im
Hochvakuum. Im Massenspektrometer werden die zu analysierenden Probe-Moleküle durch
Ionisierung geladen und in einem Massenanalysator gemäß ihres Quotienten aus Masse zu
Ladung aufgetrennt. Der Detektor verstärkt in der Regel das Signal und liefert ein
Massenspektrum, das die Massen der unterschiedlichen Ionen abbildet. Abbildung 1.5 zeigt
die grundlegenden Funktionseinheiten eines Massenspektrometers.
1.4.2.1 Etablierung geeigneter Ionisierungsverfahren für die Bio-Analytik
J.J. Thomson hat nach seiner Entdeckung des Elekrons, Voraussetzung für die Anwendung
der Elektronenstoß-Technik, bereits 1899 den ersten Massenspektrometer entwickelt. Es
handelt sich also um ein recht altes Verfahren. Die Analyse von Makromolekülen, zu denen
auch die Proteine gehören, gelang allerdings erst ab 1976 nach Einführung
massenspektrometrischer Desorptionsmethoden (MacFarlane, Torgerson, 1976), bei denen
Analyte schonender durch Beschuss mit beschleunigten Primärteilchen (z.Bsp Cäsium-Ionen,
Argon, Photonen) ionisiert werden. Vorher standen keine geeigneten Ionisierungstechniken
zur Verfügung. Die Chemische- oder Elektronenstoß-Ionisation konnte erfolgreich nur auf
Moleküle bis 400Da angewendet werden, Makromoleküle jedoch zerfielen unter diesen
Bedingungen.
Mit der Einführung der Fast Atom Bombardment-Technik (FAB, Barber, 1981) wurden bei
der Ionisation erstmals Matrizes in kristalliner oder schwerflüchtiger flüssiger Form
Abb. 1.5 Funktionseinheiten eines Massenspektrometers mit Anwendungsmöglichkeiten
(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).
1 Einleitung
9
eingesetzt. Die Proben werden mit einer Matrix-Substanz (z. B. Glycerin,
4-Nitrobenzylalkohol) gemischt. Die hohe kinetische Energie beim Beschuss dieser Mischung
mit Primärteilchen führt zu einer Kollisionskaskade der Moleküle. Dabei werden
Sekundärpartikel erzeugt, die in die Gasphase diffundieren. Unter diesen Sekundärpartikeln
befinden sich unter anderem Protonen und die zu analysierenden Probe-Ionen. Die Matrix
unterstützt bei diesem Vorgang einerseits die effektive Energieübertragung und stellt die zur
Ionisierung notwendigen Protonen zur Verfügung, andererseits absorbiert sie einen Großteil
der kinetischen Energie der Primärpartikel und verhindert dadurch die Zersetzung der Probe.
Ihren Höhepunkt fand diese Art der schonenden Ionisierungstechnik mit der Etablierung der
Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI, Abb. 1.6) 1988 durch Tanaka und
gleichzeitig unabhängig durch Karas und Hillenkamp.
MALDI bildete zusammen mit der durch Fenn et al. 1989 eingeführten Electrospray
Ionisation (ESI) großer Biomoleküle die Voraussetzung für die Etablierung der
Massenspektrometrie als eine der wichtigsten Analyse-Methoden in der Peptid- und
Proteinanalytik.
Bei der ESI (Abb. 1.7), der zur Zeit mildesten Ionisierungstechnik (Cole, 1997), können
Analyte bis 100kDa ionisiert werden. Die sanfte Ionisierung konnte besonders deutlich bei
der Detektion nichtkovalenter Wechselwirkungen durch Ganem, 1991 und Katta, 1991
demonstriert werden. Die Methode zeichnet sich durch eine erhöhte Sensitivität aus, da im
Gegensatz zu MALDI keine einfach, sondern mehrfach geladenen Ionen erzeugt werden, die
Abb. 1.6 Schematische Darstellung der MALDI-Technik, bei
der die Probemoleküle fest in das Kristallgitter der Matrix
integriert werden. Durch die Energie eines gepulsten Lasers
werden Matrix- und Probemoleküle in die Gasphase überführt,
in der schließlich die Ionisation stattfindet.
1 Einleitung
10
leichter analysiert werden können (Westermeier, 2002). Substanzen können auch aus
komplexen Gemischen in sehr geringer Konzentration nachgewiesen werden.
Bei der Ionisierung befindet sich die gelöste Probe in einer wenige µm dicken Kapillare. Die
Ionenbildung erfolgt bei Atmosphärendruck direkt aus der Lösung. Dazu wird zwischen der
Spitze der Kapillare und dem Eingang zum Massenanalysator eine Hochspannung von etwa
3,5 kV angelegt. Gelangt die Analyt-Lösung in dieses starke elektrische Feld, dispergiert sie
in kleine geladene Tröpfchen, ein Vorgang, der durch einen scherenden Gasstrom aus
Stickstoff oder synthetischer Luft, der kontinuierlich aus einer koaxialen Stahlkapillare
austritt, zusätzlich unterstützt wird. Ein zweiter wärmender Gasstrom, meist Stickstoff, dient
als Trocknungsgas. Um die Spitze der Kapillare beobachtet man einen konusförmig
erweiterten Teilchenstrom, eine Erscheinung, die "Taylor cone" bezeichnet wird. Die
eigentliche Ionenbildung ist noch nicht vollständig verstanden und beginnt, wenn die
geladenen Tröpfchen des Aerosols auf dem Weg zum Massenanalysator durch Verdampfung
des Lösemittels zunehmend an Größe verlieren. Dadurch steigt die Ladungsdichte an der
Oberfläche. Die abstoßenden Coulomb-Kräfte zwischen gleichnamigen Ladungen bewirken
den Zusammenbruch der Oberflächenspannung. Dieser explosionsartige Prozeß führt dazu,
dass Ionen austreten.
1.4.2.2 Massen-Analyse und Strategien der Protein-Identifizierung
Als besonders schnell und weitgehend automatisierbar hat sich der heute häufig gebrauchte
"Peptidmassen-Fingerprint" (PMF) herausgestellt (Henzel et al.,1993; Mann et al., 1993;
Yates et al., 1993). Nach dem tryptischen Verdau werden die erhaltenen Peptide durch
Abb. 1.7 Vereinfachte Darstellung der Ionenbildung durch die Electrospray-Methode
(ESI). Die Ionisierung erfolgt bei Atmosphärendruck ("atmospheric pressure
ionization", API), die Massenanalyse im Vakuum. Detailierte Beschreibung, der
Abläufe: siehe Text.
1 Einleitung
11
Uezvm ⋅⋅=⋅⋅2
2
1∩
T
Lv =
z
m
Ue
LT ⋅
⋅⋅
=
2
2
eFlugstreckL
unggungsspannBeschleuniU
adungElementarle
LadungIonenz
gkeitGeschwindiv
Massem
=
=
=
−=
=
=
MALDI-MS analysiert. Die experimentell ermittelten Massen werden dann mit den
theoretischen Massen tryptischer Fragmente von Proteinen aus Datenbanken verglichen.
Allerdings können nur bekannte Proteine mit dieser Methode zuverlässig identifiziert werden.
Ein weiterer Nachteil ist, dass möglichst viele Peptide eines Proteins analysiert werden
müssen, um eine genügend hohe Treffsicherheit bei der Datenbank-Recherche zu
gewährleisten. Dies setzt voraus, dass die Probe möglichst rein und nicht zu komplex ist, da in
einem Gemisch mengenmäßig unterrepräsentierte Proteine hinter den starken Signalen
prominenter Proteine verschwinden. MALDI-Ionenquellen sind mehrheitlich an Time of
Flight (ToF) Analysatoren (Stephens, 1946) gekoppelt. Die Ionen werden durch Anlegen
einer Hochspannung in den Massenanalysator beschleunigt. Die Geschwindigkeit eines Ions
bei einer konstanten Beschleunigungsspannung ist umgekehrt proportional zu der Masse des
Ions. Die Flugzeit T ergibt sich aus dem einfachen Zusammenhang:
Die Ursache für die vergleichsweise geringe Sensitivität bei der ToF-Analyse liegt in der
geringen Ladung der Fragmente (vgl. 1.4.3.1) und in der beschränkten Detektionskapazität
aller gleichzeitig eintreffenden Signale.
Wie in Abbildung 1.5 bereits angedeutet, werden nicht nur Flugzeit-Analysatoren zur
Ionentrennung verwendet. Auch Massenfilter, so genannte Quadrupole (Paul, Steinwedel,
1953) können eingesetzt werden. Ein Quadrupol (Q) besteht aus vier parallelen, zylindrischen
Metallstäben (Abb. 1.8a). An den Stäben liegt eine Gleichspannung und eine
Wechselspannung im Hochfrequenz-Bereich (3kHz- 300MHz) an, wobei gegenüberliegende
Stäbe die gleiche Polarität der Gleichspannung und die gleiche Phase der Wechselspannung
besitzen. Ionen gleicher Masse und gleicher Ladung, so genannte resonante Ionen,
beschreiben auf der feldfreien z-Achse eine komplizierte oszillatorische Flugbahn und
passieren die Öffnung der Quadrupollinse. Nichtresonante Ionen dagegen kollidieren mit den
Quadrupol-Stäben. Ob ein Ion resonant oder nichtresonant ist, hängt von seiner Masse und
von der angelegten Gleich- und Wechselspannung ab. Durch Variation der Wechsel-
Spannung können verschiedene Ionen auf die richtige Flugbahn in Richtung Detektor
1 Einleitung
12
Abb. 1.8a Darstellung eines Quadrupol-Massenanalysators mit der Flugbahn eines resonanten und nichtre-
sonanten Ions. Resonante Ionen passieren die Quadrupollinse (blau) und werden detektiert.
Abb. 1.8b Betriebsmodi eines Quadrupols: Im mass scanning-Modus wird das ganze Ionenspektrum
(verschiedenfarbig) dargestellt. Im single mass transmission-Modus erreicht nur ein Ionen-Typ (mint) den
Detektor.
gebracht werden. Je nach Betriebsmodus (Abb. 1.8b) können diese Ionen gleicher oder
verschiedener Massen sein.
Kombiniert mit ToF-Analysatoren werden Quadrupole zusammen mit ESI-Quellen zur
Sequenzierung von Proteinen genutzt. Die Ionenbildung aus der Lösung (1.4.3.1) ermöglicht
zudem eine Vortrennung durch HPLC (High Performance oder High Pressure Liquid
Chromatography). Kapitel 1.4.3.3 beschreibt eine besonders effiziente massenspektro-
metrische Methode, die es ermöglicht, unbekannte Proteine auch in geringen Mengen aus
komplexen Gemischen zu identifizieren.
1.4.3.1 Sequenz-Analyse durch Nano-LC ESI MS/ MS QToF
Bei der Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Analyse wird die gelöste Probe bei besonders niedrigen
Flussraten im Nanoliter-Bereich (20 -250nL/ min) der Ionenquelle zugeführt, man spricht
deshalb auch von Nanospray-Ionisation (Wilm, Mann, 1996). Durch die verlängerte Messzeit
können Probenmengen im µl-Bereich analysiert werden. Auch Proteine, die nur in geringen
Mengen im Gemisch vertreten sind, werden durch Streckung des Messvolumens in einem
ausreichend großen Zeitfenster erfasst. Die Sensitivität der Messung ist im Vergleich zur
Peptidmassen-Fingerprint-Methode deutlich erhöht (Emmett, Caprioli, 1994).
Die niedrigen Flussraten werden durch das Pumpensystem einer vorgeschalteten HPLC-
Anlage gewährleistet (Nano-LC). Zur Vortrennung der Protein-Gemische werden Reverse
Phase-Säulen mit apolarem Füllmaterial benutzt. Das Füllmaterial, die so genannte stationäre
a b
1 Einleitung
13
Phase, besteht üblicherweise aus porösen Silica-Kugeln (Silicagele), die an ihrer Oberfläche
aliphatische C18-Ketten tragen und deren Porenweite zur Protein-Aufreinigung idealerweise
30nm beträgt. Das Lösemittel der Probe wird bei chromatographischen Trennverfahren als
mobile Phase bezeichnet. Üblich sind Wasser/ Acetonitril-Gradienten mit steigender
Hydrophobizität. Zu Beginn werden also apolare Proteine von der stationären Phase
zurückgehalten, während polare Proteine in der mobilen Phase verbleiben. Ein Anstieg der
Hydrophobizität in der mobilen Phase bewirkt, dass zunehmend hydrophobe Proteine von der
Säule eluiert werden, so dass apolare Proteine zuletzt den Massenspektrometer erreichen.
Die Sequenzierung von Proteinen kann nur in so genannten Tandem-Massenspektrometern
durchgeführt werden. Solche Massenspektrometer besitzen mehrere Analysatoren und eine
interponierte Kollisionszelle, die mit einem inerten Stoß-Gas, meist Argon, befüllt ist.
Abbildung 1.9 zeigt den Aufbau des Tandem-Massenspektrometers, wie er in dieser Arbeit
zur Protein-Identifizierung verwendet wurde.
Abb. 1.9 Schematische Darstellung des Nano-LC ESI MS/ MS QToF-Spektrometers. Die Ionen
werden zur Kathode am Eingang des Spektrometers beschleunigt und gelangen in den
Massenanalysator Q0 und dann in Q1, wo bestimmte Ionen herausgefiltert werden, die dann in der
Kollissionszelle Q2 fragmentiert werden. Die Fragmente werden erneut beschleunigt und treten
durch eine Quadrupollinse in den ToF-Analysator ein, der mit einem Reflektor ausgestattet ist und
die Ionen vor der Detektion umlenkt (Erläuterung: Text). L/s: Sog-Leistung der Vakuum-Pumpe;
(verändert nach Waters, Massachusetts, USA; www.waters.com).
1 Einleitung
14
Die Ionen gelangen aus der ESI-Quelle durch eine Öffnung im Zentrum der Gegenelektrode
in den Analysatorteil des Massenspektrometers. Durch Q0, der ausschließlich im mass
scanning-Modus (Abb 1.8b) arbeitet, werden die Ionen kollisionsfrei auf die richtige Bahn
zum eigentlichen Massenfilter Q1 weitergeleitet. Q1 filtert im single mass transmission-
Modus Ionen mit einem konstanten Masse zu Ladungs-Quotienten heraus. Nur diese
Vorläufer-Ionen ("Precursor") werden zu einem bestimmten Zeitpunkt in die Kollisionszelle
beschleunigt, wo sie durch Kollision mit Argon-Atomen in viele verschiedene "Tochter-
Ionen" fragmentiert werden (Abb. 1.10).
Bei einer Kollisions-Energie von 10 - 100eV dissoziieren die Vorläufer-Ionen vorrangig
zwischen Carbonyl-Kohlenstoff und Amid-Stickstoff entlang des Peptidrückgrats und bilden
sequenzspezifische Ionenserien (Roepstorff und Fohlman 1984).
Die meisten Ionen sind vom b-oder y-Typ. Verbleibt nach der Spaltung die Ladung am N-
terminalen Ende des Fragmentions, entsteht ein b-Typ Ion. Verbleibt sie am C-Terminus,
wird ein y-Typ Ion gebildet.
Die so gebildeten Fragment-Ionen werden erneut beschleunigt und gelangen in den vertikal
zur Kollisionszelle angeordneten ToF-Analysator, wo sie durch ein elektrisches Pulsfeld
umgelenkt werden. Da die Ionen nicht auf gleicher Höhe in den Analysator gelangen, werden
sie nach halber Flugstrecke von einem Reflektor (Abb. 1.9) gespiegelt, der als
„Ionensammler“ dient, so dass Fragmente gleichen Typs von dort aus zur gleichen Zeit in
Richtung Detektor aufbrechen und gemäß ihres Masse zu Ladungs-Quotienten auch zur
gleichen Zeit dort eintreffen. Durch diese Fokussierung wird die Auflösung des
Abb. 1.10 Mögliche Bruchstellen des Peptid-Rückgrats
der Precursor-Ionen; (rot) am häufigsten betroffen, es
resultieren Ionen des b-oder y-Typs; (a, c, x, z) Ionen-
typen, die seltener entstehen (verändert nach:
www.matrixscience.com).
1 Einleitung
15
ToF-Analysators deutlich verbessert und dadurch auch die Genauigkeit der Messung, da sogar
gleiche Ionen verschiedener Isotope im Spektrum durch einen separaten Peak dargestellt
werden. Die Genauigkeit der Messung liegt im Bereich von +/- 0,1 Da.
Zur Detektion wird ein Mehrkanal-Detektor verwendet. Beim Auftreffen geladener Teilchen
auf die unter Hochspannung stehenden Platten des Detektors werden Elektronenströme
erzeugt, die sich lokal fortpflanzen und das Signal verstärken.
1.5 Ziel dieser Arbeit
Das Ziel dieser Arbeit ist die Isolierung ciliärer Membranen vom olfaktorischen
Gesamtepithel der Ratte und die Etablierung einer gelelektrophoretischen Trennmethode um
die dort lokalisierten Membranproteine vollständig und in hoher Auflösung darzustellen. Mit
dieser Methode soll es im Anschluss durch MS-Analyse möglich sein, unbekannte Proteine zu
identifizieren und dadurch ein verfeinertes Bild aller beteiligten Prozesse der
Signaltransduktionskaskade zu entwerfen.
2 Material und Methoden
16
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien und Material
Die Chemikalien wurden, sofern nicht anders angegeben, in p.a.-Qualität von den Firmen
Amersham Biosciences (Freiburg), AppliChem (Darmstadt), Carl Roth GmbH (Karlsruhe),
Fluka Chemie GmbH (Buchs, CH), Grüssing (Filsum), J.T. Baker (Deventer, NL), MBI
Fermentas GmbH (St. Leon-Rot), Merck KGaA (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), Serva
Electrophoresis GmbH (Heidelberg) und Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) bezogen.
Zum Ansetzen der Lösungen wurde ausschließlich Wasser aus der Milli-Q UF Plus-Anlage
der Fa. Millipore verwendet, für die nano-HPLC und Massenspektrometrie Wasser in HPLC-
Qualität.
Die Gelelektrophorese wurde in den Kammern PerfectBlueTM
Vertical Electrophoresis
System, Model Twin S und Twin M der Fa. peqLab Biotechnologie GmbH (Erlangen)
durchgeführt. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren mit der Blot-Apparatur SV20-
SDB der Fa. Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim) auf porablot®
PVDF-Membranen mit einer
Porengröße von 0,2µm der Fa. MACHEREY-NAGEL (Düren).
Die Aktivität der Meerrettich-Peroxidase wurde durch EClTM
Plus detektiert und die Filme
(HyperfilmTM
ECl TM
) im HyperprocessorTM
Automatic Film Processor, sofern nicht anders
angegeben, entwickelt. Das Detektionssystem, die Filme und die Entwickler-Maschine
stammen von der Fa. Amersham Biosciences (Freiburg).
2 Material und Methoden
17
2.2 Lösungen
2.2.1 Lösungen für die Präparation
2.2.1.1 Lösungen für die Cilien-Präparation
Stamm-Lösung P 120mM NaCl
5mM KCl
1,6mM K2HPO4
25mM NaHCO3
7,5mM D-Glucose
pH 7,4
Calciumchlorid-Stammlösung 2M CaCl2 x 2H2O
Lösung A Protease Inhibitor M (Tab. 2.1):
1/ 100 des Gesamtvolumens in Stamm-Lösung P
kurz vor Gebrauch angesetzt
Lösung B 10mM CaCl2 x 2H2O in Lösung A
kurz vor Gebrauch angesetzt
Saccharose-Lösung 45% (w/ v) Saccharose
2.2.1.2 Lösungen für die Protein-Präparation aus Gesamtepithel
Puffer A 20mM NaCl
1mM EDTA
0,1mM EGTA
1mM DTT
20mM HEPES
pH 7,4
Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)
1Tablette/ 50ml
0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin
2 Material und Methoden
18
Puffer B 500mM NaCl
1mM EDTA
0,1mM EGTA
1mM DTT
20mM HEPES
pH 7,4
Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)
1Tablette/ 50ml
0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin
Puffer C (M) 150mM NaCl
1mM EDTA
0,1mM EGTA
1mM DTT
20mM HEPES
pH 7,4
Complete Protease Inhibitor Cocktail (Tab. 2.2)
1Tablette/ 50ml
0,02% (w/ v) o-Phenanthrolin
2.2.1.3 Verwendete Protease-Inhibitoren
Die bei den Präparationen verwendeten Lösungen (2.2.1.1 und 2.2.1.2) enthielten Protease-
Inhibitoren um den proteolytischen Abbau von Proteinen durch freiwerdende endogene
Proteasen zu verhindern.
Bei der Cilienpräparation wurde der EDTA- und EGTA-freie Protease-Inhibitor Mix M
(Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Tab. 2.1) verwendet um die Chelatierung von
Calcium-Ionen auszuschließen. Der Complete Protease Inhibitor Cocktail in Tablettenform
stammte von der Fa. Roche Diagnostics (Penzberg). Metalloproteasen wurden zusätzlich
durch o-Phenanthrolin gehemmt, das bevorzugt bivalente Schwermetall-Ionen (u.a. Zn2+
)
komplexiert.
2 Material und Methoden
19
Inhibitor Zielproteasen
AEBSF-HCl viele Serin-Proteasen (u.a. Thrombin)
Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)
Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)
E-64 Papain (Cystein-Protease)
Leupeptin u.a. Phospholipase D
Pepstatin A Aspartat-Proteasen (u.a. Pepsin, Renin)
Tab. 2.1 Inhibitoren und Zielproteasen des Protease Inhibitor Mix M (Serva Electrophoresis GmbH,
Heidelberg).
Inhibitor Zielproteasen
APMSF-HCl Serin-Proteasen (u.a. Trypsin)
Aprotinin viele Serin-Proteasen (u.a. Trypsin, Urokinase)
Bestatin-HCl viele Metalloproteasen (u.a. Aminopeptidase B)
3,4-Dichloroisocumarin viele Serin-Proteasen (u.a. Elastase)
E-64 Papain (Cystein-Protease)
Leupeptin u.a. PhospholipaseD
Pefabloc SC Serin-Proteasen (u.a. Thrombin)
Phosphoramidon Thermolysin, Collagenase
Tab. 2.2 Inhibitoren und Zielproteasen des Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics, Penzberg).
2.2.2 Proteinbestimmung nach der Amidoschwarz-Methode
Tris/ SDS-Lösung 1M Tris/ HCl
pH 7,5
1% (w/ v) SDS
Färbe-Lösung 0,5% (w/ v) Amidoschwarz B10
45% (v/ v) Methanol
10% (v/ v) Essigsäure
Entfärbe-Lösung 90% (v/ v) Methanol
2% (v/ v) Essigsäure
Elutions-Lösung 50% (v/ v) Ethanol
25mM NaOH
50µl EDTA
2 Material und Methoden
20
2.2.3 Lösungen für den Verdau mit PNGase und Benzonase
PB-Puffer 10mM Tris
100µM PMSF
10mM β-Mercaptoethanol
3mM MgCl2 x 6H2O
pH 8,0
Puffer C 10mM Tris
3mM MgCl2 x 6H2O
2mM EGTA
pH 7,4
2.2.4 Lösungen für die SDS PAGE
5x-Probenpuffer 10% (v/v) Glycerol
2% (w/v) SDS
0,01% (w/v) Bromphenolblau
62,6mM Tris pH6.8
20x DTT 2M DTT
Lagerung: -20°C
Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-
Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1
Sammelgelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 6,8
Trenngelpuffer 1M Tris/ HCl, pH 8.8
SDS-Lösung 10% (w/v) SDS
APS-Lösung 10% (w/v) Ammoniumperoxodisulfat
Gebrauchsfertige 99% Tetramethylendiamin-Lösung (TEMED)
10x Elektrodenpuffer 0,25M Tris
1,92M Glycin
2% (w/v) SDS
pH 8.3
2 Material und Methoden
21
2.2.5 Lösungen für die 2D-CTAB/ SDS-PAGE
2x Probenpuffer 6M Harnstoff
0,2% (w/v) CTAB
10% (v/v) Glycerol
75mM DTT
0,05% (w/v) PyroninY
kurz vor Gebrauch angesetzt
Gebrauchsfertige, gasstabilisierte, wässrige, 30%ige Acrylamidstammlösung mit 0,8% N,N´-
Methylenbisacrylamid im Verhältnis 37,5:1
Stabilisierte, gebrauchsfertige, 2%ige N,N´-Methylenbisacrylamid-Stammlösung
Sammelgelpuffer 0,3M KH2PO4
pH 4.1
Trenngelpuffer 0,3M KH2PO4
pH 2.1
Ascorbinsäure-Lösung 80mM Ascorbinsäure
kurz vor Gebrauch angesetzt
CTAB-Lösung 250mM CTAB
kurz vor Gebrauch angesetzt
Eisensulfat-Lösung 25mM Fe(II)SO4 x 7H2O
kurz vor Gebrauch angesetzt
H2O2-Lösung 0,03% (v/v) Wasserstoffperoxid
1x Elektrodenpuffer (CTAB) 150mM Glycin
0,1% (w/v) CTAB
50mM H3PO4
SDS-Lyse-Puffer 1/ 5 des Endvolumens 5x Probenpuffer (2.2.3)
37,5mM DTT
1mM PMSF
18mM Tris, pH 6.8
kurz vor Gebrauch angesetzt
2 Material und Methoden
22
SDS-PAGE-Lösungen (siehe 2.2.3)
2.2.6 Lösungen für die MS-kompatible Silberfärbung
Fixier-Lösung 30% (v/v) Ethanol
10% (v/v) Essigsäure
Sensitisationslösung 9,9mM K2O6S4
0,5M Kaliumacetat
30% (v/v) Ethanol
Silbernitrat-Lösung 11,8mM AgNO3
Entwickler-Lösung 0,22M K2CO3
5µM Na2S2O3 x 5H2O
0,011% (v/ v) Formaldehyd
Stopp-Lösung 0,33M Tris
2% (v/ v) Essigsäure
2.2.7 Lösungen für die colloidale Coomassie-Färbung
Fixier-Lösung 50% (v/v) Methanol
2% (v/v) Essigsäure
Inkubationslösung 34% (v/v) Methanol
2% (v/v) H3PO4
17% (w/v) (NH4)2SO4
Färbe-Lösung 34% (v/v) Methanol
2% (v/v) H3PO4
17% (w/v) (NH4)2SO4
0,066% (w/v) Coomassie G-250
2 Material und Methoden
23
2.2.8 Lösungen für die Western Blot-Analyse
Transferpuffer 25mM Tris
0,19M Glycin
20% (v/v) Methanol
pH 8,3 - 8,4
1x PBS 8,1mM Na2HPO4 x 2H2O
1,9mM NaH2PO4 x H2O
0,13M NaCl
pH 7,4
Milchpulver-Blocklösung 5% (w/v) Milchpulver
in 1x PBS
Lagerung: 4 - 8°C; 0,02% NaN3
Milchpulver-Verdünnungslösung 1% (w/v) Milchpulver
in 1x PBS
kurz vor Gebrauch angesetzt
Wasch-Puffer 0,1% (v/v) Triton X-100
in 1x PBS
ECL-Plus Detektionslösung Lösung A zu Lösung B im Verhältnis 40:1
kurz vor Gebrauch angesetzt,
lichtempfindlich
2.2.9 Lösungen für den tryptischen Verdau der Proteine
Acetonitril/ H2O 50% (v/v) Acetonitril
Bicarbonat-Puffer 40mM NH4HCO3
DTT 10mM DTT
Iodacetamid 55mM Iodacetamid
in Bicarbonat-Puffer
kurz vor Gebrauch angesetzt,
lichtempfindlich
2 Material und Methoden
24
Trypsin-Stocklösung Lyophilisat + 40µl 1mM HCl
1Woche bei -20°C haltbar
Trypsin-Gebrauchslösung 10µl Trypsin-Stocklösung
290µl Bicarbonat-Puffer
2.3 Größenstandards und Antikörper
2.3.1 Größenstandards für die Gelelektrophorese
2.3.1.1 Größenstandard für die SDS-PAGE
Für Gele der Größe 5,5 x 8,5cm wurde ein Volumen von 5µl eingesetzt, 7µl bei einer
Gelgröße von 11 x 14cm. Die Dicke der Gele in beiden Kammersystemen TwinS und TwinM
(2.1) betrug 1,5mm.
Sowohl für die eindimensionale als auch für die zweite Dimension
der zweidimensionalen Gelelektrophorese dienten rekombinante, in
E.coli exprimierte Farbstoff-gekoppelte Proteine des PageRulerTM
Protein Ladder (ready to use) SM0671 mit Molekulargewichten von
~ 10 000 bis 180 000Da (Dalton) der MBI Fermentas GmbH (St.
Leon-Rot). Die Konzentrationen der einzelnen Proteine liegen
zwischen 0,1 - 0,2mg/ ml.
Abb. 2.1 SM0671
2 Material und Methoden
25
2.3.1.2 Größenstandard für die erste Dimension der CTAB/ SDS-PAGE
Für die CTAB-PAGE wurde der „High MolecularWeight Marker“ (HMW-Größenstandard)
SDS-6H der Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet. Die Proteine des
Lyophilisats wurden in 0,75ml H2O gelöst und mit 0,75ml 2x Probenpuffer (2.2.4) versetzt.
Die Gesamtkonzentration der Lösung betrug 2mg/ ml.
Molekulargewicht (Da) Protein
205 000 Myosin
116 000 beta-Galactosidase
97 000 Phosphorylase B
66 000 Rinderserum Albumin
45 000 Ovalbumin
29 000 Carboanhydrase
Tab. 2.3 Proteine und Molekulargewichte HMW-Größenstandards SDS-6H.
Vor dem Einsatz wurde der Marker 5min bei 70°C im Heizblock erwärmt, gevortext und mit
13.000g zentrifugiert. Ein Volumen von 8µl aus dem Überstand pipettiert erwies sich als ideal
bei einer Gelgröße von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm.
2 Material und Methoden
26
2.3.2 Antikörper für die Western Blot-Analyse
Die verwendeten Antikörper dienten ausschließlich dem immunologischen Nachweis von
Markerproteinen („Präparationsmarkern“) bei der Western Blot-Analyse (2.10).
2.3.2.1 Primäre Antikörper
Name Antigen Größe Spender Isotyp Spezifität Hersteller
α- ACIII
C-Terminus
Adenylatcyclase
III der Ratte
128,9kDa
Glykosylierung
möglich
Kaninchen
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
rt, ms,
hm
Santa Cruz
Biotechn.
Inc.,Heidelberg
α-CNG
A2
C-terminal
R643-660
CNG- A2 der
Ratte
76,2kDa
Glykosylierung
möglich
Kaninchen
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
rb, ms, rb
Sigma-Aldrich
Chemie GmbH,
Steinheim
α-CNG
A4
C-Terminus
CNG- A4 der
Ratte
65,6kDa Maus Monoklonal rt
California
Institute of
Technology,
Pasadena
α-Gα s/ olf
C-Terminus
αs-UE
olfaktorisches
G- Protein der
Ratte
44,2kDa Kaninchen
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
rt, ms,
hm
Santa Cruz
Biotechn.
Inc.,Heidelberg
α-
Occludin
N-Terminus
Occludin des
Menschen
65kDa
Phosphorylierung
möglich
Ziege
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
rt, ms,
hm
Santa Cruz
Biotechnologies
Inc., heidelberg
α-
Prohibitin
Mitochondriales
Gesamtprotein
der Ratte
~30kDa Kaninchen Polyklonale IgG
rt, ms,
pg, ch,
hm
Abcam
Limited,
Cambridge
Tab. 2.4 Spezifikation der Erst- Antikörper für die Western Blot-Analyse.
2.3.2.2 Sekundäre Antikörper
Die Antigen-Antikörper Komplexe wurden mit Zweit-Antikörpern nachgewiesen, die an
Meerrettich-Peroxidase gekoppelt waren.
Name Antigen Spender Isotyp Spezifität Hersteller
α-rb IgG
HRP
konjugiert
Kaninchen
IgG Ziege
Polyklonale
IgG,gereinigt durch
Ionenaustausch-
Chromatographie
Kaninchen
IgG
Sigma-Aldrich
Chemie GmbH,
Steinheim
α-gt IgG
HRP
konjugiert
Ziegen IgG Kaninchen
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
Ziege IgG
Sigma-Aldrich
Chemie GmbH,
Steinheim
α-ms IgG
HRP
konjugiert
Maus IgG Ziege
Polyklonale,
affinitätsgereinigte
IgG
Maus IgG
Sigma-Aldrich
Chemie GmbH,
Steinheim
Tab. 2.4 Spezifikation der Meerrrettich-Peroxidase konjugierten Zweit-Antikörper für die Western Blot-
Analyse.
2 Material und Methoden
27
2.4 Tiere
Für die Präparation des olfaktorischen Epithels wurden 8 - 12 Wochen alte weibliche Wistar-
Ratten (Rattus norvegicus) verwendet. Die Ratten stammten aus dem Zentralen Tierlabor
(ZTL) der Universität Heidelberg, wo sie unter standardisierten Bedingungen bei einem
künstlichen Tag-Nacht-Rhytmus gehalten werden. Lieferant des ZTL ist die Fa. Charles River
Laboratories Inc. (Bad Königshofen).
2.5 Cilien-Präparation aus olfaktorischem Epithel
Die in der nachfolgend beschriebenen Methode verwendeten Lösungen und Gefäße wurden
stets eisgekühlt oder vor Beginn der Präparation im Kühlraum bereitgestellt.
2.5.1 Präparation und Isolierung des Gesamtepithels
Zur Charakterisierung ciliärer Proteine musste zunächst das Gesamtepithel isoliert werden.
Dazu wurden die Ratten in CO2 getötet und anschließend dekapitiert.
Die Köpfe wurden kurz in eiskalter Stamm-Lösung P gekühlt und von Blut befreit. Das Fell
wurde mit der Präparier-Schere entfernt. Durch das Hinterhauptsloch wurde entlang der
koronalen Naht ein Schnitt vom posterioren Ende nach anterior (Abb. 2.2) bis knapp vor das
Stirnbein geführt und die Nase sagittal in der Ebene des Septums aufgebrochen.
Das Riechepithel liegt scheibchenförmig im Dach der Nasenhöhle und hebt sich auf Grund
seiner gelbbraunen Pigmentierung und seiner stapelartigen Anordnung in den Konchen gut
Abb. 2.2 Schädel der Ratte. Mit der Präparier-Schere
wurde ein Schnitt entlang der koronalen Naht geführt.
2 Material und Methoden
28
von seiner Umgebung ab (Abb. 2.3). Die Scheibchen wurden direkt mit einer feinen Pinzette
entnommen, in Stamm-Lösung P durch kurzes Eintauchen gewaschen und so von eventuell
noch anhaftenden Haaren und Blutresten befreit. Dann wurden sie in ein 8ml Schnappdeckel-
Glas (neoLab, Heidelberg) mit Lösung A überführt.
2.5.2 Isolation der Cilien nach der Calcium-Schock Methode
Die Decilierung der Riechzellen wurde durch die Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967)
erreicht. Der Calcium-Schock ist eine von mehreren Methoden (Sandoz, 1988), die durch
mechanischen Stress die Abschnürung ciliärer Membranen verursacht. Es ist unbekannt, ob
der Einfluss von Calcium-Ionen den Zusammenbruch der Cilienstruktur direkt durch
Depolymerisation der Mikrotubuli bewirkt. Möglich ist auch die Aktivierung spezifischer
Proteasen, die durch Hydrolyse Bestandteile des tubulären Systems destabilisieren (Sandoz,
1988).
Pro Schnappdeckel-Glas wurden die Epithelien von fünf Ratten in 3ml Lösung A gewaschen.
Der Überstand wurde vorsichtig und möglichst vollständig mit einer 5ml Gilson-Pipette
abgenommen und das Epithel in 4ml Lösung B, die 10mM Calcium-Ionen enthält,
aufgenommen. Die Herstellung von Lösung B gehört zu einem der kritischen Schritte der
Präparation: Die Zugabe der Calcium-Stammlösung zu einem Teil von Lösung A sollte sehr
langsam und unter heftigem Rühren erfolgen, da sonst schwerlösliches (Ca)3(PO4)2
präzipitiert und freies Ca2+
nicht mehr für den Calcium-Schock zur Verfügung steht.
Abb. 2.3 Sagittalschnitt durch den Kopf der Ratte. Das
olfaktorische Epithel (OE) hebt sich mit seiner gelb-
bräunlichen Pigmentierung deutlich von der Umgebung
ab. Rechts davon befinden sich Bulbus olfactorius (BO)
und Siebbein (SB). Davor respiratorisches Epithel (RE).
2 Material und Methoden
29
Anschließend wurde 30min bei 4°C und Stufe 4 (IKAMAG RH, Janke und Kunkel KG,
Staufen) Rührfisch, Grösse 12 x 5mm (neoLab, Heidelberg) gerührt (Abb. 2.4).
Danach wurde der gesamte Ansatz in ein 10ml Schraubdeckel-Zentrifugenröhrchen (neoLab)
überführt und mit 7700g 5min bei 4°C zentrifugiert (Hermle-Kühlzentrifuge, HERMLE-
Labortechnik, Wehingen). Der Überstand mit den Cilien wurde in ein 15ml Falcon-Röhrchen
überführt und das Pellet erneut in 2ml Lösung B resuspendiert und mit 7700g 5min bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Überstand der vorherigen Zentrifugation vereint.
Der letzte Zentrifugationsschritt wurde noch einmal wiederholt, die Gewebepellets wurden
bei -20°C gelagert.
Die vereinten Überstände wurden in einem 12ml Ultrazentrifugen-Röhrchen (Beckman
Coulter GmbH, Krefeld) auf 4ml 45% Saccharose-Lösung geschichtet und mit 100 000g
30min bei 4°C ultrazentrifugiert (Beckman L-70 Ultra-Zentrifuge, SW40 Ti-Rotor).
Abb. 2.4 Calcium-Schock der Olfaktorischen
Epithelien unter Rühren im Schnappdeckel-Glas.
Die Cilienbande befindet sich nach der Ultrazentrifugation sichtbar als
dichter, dunkler Nebel auf der Saccharose des Stufengradienten.
Abb. 2.5 Die dunkle Cilienbande befindet sich auf der Saccharose des
Stufengradienten.
2 Material und Methoden
30
Die Cilienbande wurde mit der 1ml Gilson-Pipette abgenommen und im UZ-Röhrchen mit
dem zehnfachen Volumen Lösung B verdünnt und erneut 30min bei 100 000g und 4°C
ultrazentrifugiert. Das als weisser Fleck mit gelblichem Ring deutlich sichtbare Cilienpellet
wurde bei -20°C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Die Grösse des Pellets und somit die
Ausbeute an Protein richtet sich nach dem Alter der Ratten. Ratten im Alter von acht Wochen
erzielen nur 50% der Proteinausbeute 12-wöchiger Ratten.
2.5.3 Protein-Präparation aus Gesamtepithel (nach Meyer, 1999)
Die Isolation des Gesamtepithels entspricht der in 2.5.1 beschriebenen Vorgehensweise. Die
Riechepithelien von 2 Ratten wurden in einem 15ml Falcon-Röhrchen in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Nach dem Auftauen wurde das Gewebe in einen 20ml Glashomogenisator
überführt und in 10ml Puffer A (hypoton) homogenisiert. Anschließend wurde mit 300g 5min
bei 4°C in der Hermle-Kühlzentrifuge (2.5.2) zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 10ml
UZ-Röhrchen überführt und 30min bei 100 000g (Beckman L-70 Ultrazentrifuge, SW40 Ti-
Rotor) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10ml Puffer A resuspendiert und erneut 30min bei
100 000g (SW40 Ti) zentrifugiert. Anschließend wurde das Pellet in 10ml Puffer B
(hyperton) resuspendiert und nochmals unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Das
Protein-Pellet aus Gesamtgewebe wurde in 100µl Puffer C(M) aufgenommen.
2.6 PNGaseF- und Benzonase-Behandlung
Zur Entfernung von N-Glykosiden wurde PNGaseF (500Units/ml, Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, Steinheim) verwendet. Benzonase®
(25000Units/ml, Merck KgaA, Darmstadt) ist eine
rekombinant in E.coli exprimierte Endonuklease aus Serratia marcescens, die alle Formen
von Nukleinsäuren abbaut.
Behandelt wurden die Cilien-Präparationen, deren Proteine für Gele mit anschließender
Massenspektrometrie (2.10) verwendet wurden. Je nach Größe des Cilienpellets wurde dieses
mit Hilfe des Ultraschallbades (Transsonic 460, neoLab, Heidelberg) in einem Volumen von
120-300µl PB-Puffer resuspendiert und mit jeweils 4µl PNGaseF und 4µl Benzonase versetzt,
gemischt und 30min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in ein
UZ-Röhrchen überführt, mit Puffer C auf 10ml aufgefüllt und 30min bei 100 000g und 4°C
pelletiert. Das Pellet wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C gelagert.
2 Material und Methoden
31
2.7 Bestimmung der Proteinkonzentration mit der Amidoschwarz-
Methode
Die Amidoschwarz-Methode, auch Schaffner/ Weissman-Methode (Schaffner und Weissman,
1973) genannt, zeichnet sich gegenüber gängigen Methoden der Protein-Bestimmung dadurch
aus, dass gelöstes Protein durch Zugabe von Säure ausgefällt und das Präzipitat mit dem
Farbstoff Amidoschwarz angefärbt wird. Dies hat den Vorteil, dass Störsubstanzen, wie
Detergenzien oder Lipide, durch die Säurefällung entfernt werden und macht die Methode in
zweierlei Hinsicht besonders für die Bestimmung der Konzentration von Membranproteinen
wertvoll: Zum einen enthalten Lösungen von Membranproteinen stets Lipide der
Herkunftsmembranen. Da diese außerdem auf Grund ihrer oftmals ausgedehnten
hydrophoben Bereiche nur schwerlöslich sind, ist der Einsatz von Detergenzien unverzichtbar
um Membranproteine möglichst quantitativ in Lösung zu bringen.
Als Proteinstandard wurde 1mg/ ml BSA in 0,02M Na3PO4-Puffer verwendet. Die für die
Gelelektrophorese (2.8) in Puffer C (2.2.3) aufgenommenen Proben und die Standards (1 -
10µg) wurden mit H2O auf ein Endvolumen von 200µl gebracht, mit 20µl 10% (w/ v) SDS
versetzt und gründlich gemischt um die Proteine zu solubilisieren. Anschließend wurden 30µl
1M Tris/ HCl mit 1% SDS zugegeben. Nach dem Mischen wurden die Proteine durch Zugabe
von je 60µl 100% (w/ v) TCA gefällt. Dazu wurden die Proben 30min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einen Membranfilter (Nitrocellulose,
Porengröße 0,45µm, Millipore, Schwalbach) aufgetragen, der zuvor mit 3ml 6% (w/ v) TCA
gewaschen worden war. Der Membranfilter befindet sich dazu auf einer speziellen Filterfritte
(Millipore), die über einen Gummikonus auf einer Saugflasche sitzt, so dass während des
Auftragens mit Hilfe des Vakuums eine zu starke Dispersion der Probe vermieden werden
kann. Der Filter wurde anschließend 3min in eine 9cm Petrischale mit Färbe-Lösung gelegt,
danach kurz mit H2O gespült und schließlich dreimal je 2min mit Entfärbe-Lösung behandelt.
Der Filter wurde an der Luft getrocknet, die gefärbten Bereiche ausgeschnitten und in ein 2ml
Eppendorf-Gefäß, das 1ml Elutions-Lösung enthält, gegeben. Anschließend wurde 20min bei
Raumtemperatur zur Elution der gefärbten Proben rotiert. Dazu wurde ein mechanischer
Rührer, wie er in der präparativen Chemie verwendet wird, vertikal an einem Stativ
angebracht. An dessen Drehrührer wurde ein Ständer für Eppendorf-Gefäße befestigt. Nach
der Elution wurde die optische Dichte bei λ=630nm (OD630) gemessen. Im linearen Bereich
der Eichkurve (1 - 10µg) entspricht eine OD630 von 0,03 etwa 1µg Protein.
2 Material und Methoden
32
2.8 Trennung von Proteinen durch Gelelektrophorese
Proteine wurden durch ein- und zweidimensionale Gelektrophorese getrennt. Je nach Größe
des Pellets wurden die Cilienmembranen vor der Elektrophorese in 120 - 300µl Puffer C
(2.2.3) aufgenommen.
2.8.1 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli
(1970)
Zur Identifikation ciliärer Markerproteine, zur Durchführung der Negativkontrollen
(Ausschluss von Proteinen des decilierten olfaktorischen Restepithels) und zur Darstellung
verschiedener Bandenmuster wurde in modifizierter Form das klassische eindimensionale
System nach Laemmli verwendet. Anstelle von β-Meraptoethanol als Reduktionsmittel im 5x
Probenpuffer wurde 2M Dithiotreithol (2M) eingesetzt. Als Kammersystem diente das Modell
Twin S (2.1) mit einer Gelgröße von 5,5 x 8,5cm und einer Geldicke von 1,5mm. Es wurden
10%ige Trenn- und 3,8%ige Sammelgele verwendet.
Bei der Probenvorbereitung wurde das entsprechende Volumen von 10µg Probe mit 1/ 5 des
Endvolumens 5x Probenpuffer und 1/ 20 des Endvolumens 20x DTT versetzt. Nach dem
Mischen wurden die Proben 10min bei 90°C im Heizblock erhitzt, anschließend gründlich
gevortext und 1min bei 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge (Modell 5415D, Eppendorf
AG, Wesseling-Berzdorf) zentrifugiert. Die Proben wurden aus dem Überstand pipettiert. Die
bei der Präparation der Cilien nach der sequentiellen Zentrifugation anfallenden
Gewebepellets wurden in 0,5ml Puffer C auf Eis homogenisiert, bei 13 000g und 4°C 5min in
der Hermle-Kühlzentrifuge abzentrifugiert und das entsprechende Volumen des protein-
haltigen Überstands analog mit Probenpuffer versetzt und weiterbehandelt.
Zur Durchführung der Negativkontrollen diente als positive Referenz die Protein-Präparation
aus Gesamtgewebe (2.5.3). Ein entsprechendes Volumen, das 10µg Protein entspricht, wurde
analog behandelt. Bei einer Stromstärke von 20mA im Sammel- und 35mA im Trenngel
betrug die Elektrophoresedauer etwa 3h. Die Gele wurden anschließend geblottet (2.9). Zur
Darstellung colloidal Coomassie-gefärbter Cilienproteine im Gel wurde das Kammersystem
Twin M (2.1), mit einer Gelgrösse von 11 x 14cm und einer Geldicke von 1,5mm, verwendet.
Dazu wurden etwa 80µg Protein wie oben beschrieben behandelt.
2 Material und Methoden
33
2.8.2 Zweidimensionale CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(verändert nach Navarre et al, 2002)
Um im Gel eine bessere Auflösung zu erzielen, wurde insbesondere im Hinblick auf die
massenspektrometrische Analyse (2.11) zusätzlich ein zweidimensionales Trennverfahren
eingesetzt. Für beide Dimensionen wurden 1,5mm dicke Gele der Grösse 11 x 14cm und das
Kammersystem Twin M verwendet. Um eine zu starke seitliche Diffusion der Proben im Gel
zu vermeiden, wurde sowohl in der ersten als auch in der zweiten Dimension bei 18°C
gekühlt. Arbeitsflächen, Glasplatten, Spacer, Probenkämme und Glasgeräte zum Ansetzen der
Gel-Lösungen beider Dimensionen wurden mit Aceton und 1% (w/ v) SDS vorgereinigt um
Fette und Protein-Verunreinigungen, wie Keratine, die auf Grund ihrer Menge in der
Massenspektrometrie (2.10) andere Proteine vollständig überlagern können, zu entfernen.
2.8.2.1 Vorbereitung der Gele
Bei der Vorbereitung der Gel-Lösungen für das Sammel- und Trenngel der CTAB-PAGE
(Tab.2.5) wurde zuerst Harnstoff in der angegebenen Menge H2O gelöst. Um Luftblasen im
Gel zu vermeiden, wurde im Exsikkator mit einer Vakuumpumpe (Vacuubrand PC101,
Brandtech Scientific, Essex, USA) entgast. 25mM FeSO4 x 7H2O und 0,03% H2O2 wurden
erst nach dem Entgasen, kurz vor dem Gießen zugegeben, da diese Substanzen den
Polymerisationsvorgang einleiten. Die Polymerisationsdauer betrug 16h.
Sammelgel (8%) Trenngel (8%)
Harnstoff
Acrylamid/ Bisacrylamid (30/0,8)
Bisacrylamid (2%)
300mM KH2PO4 pH 2.1
300mM KH2PO4 pH 4.1
80mM Ascorbinsäure
250mM CTAB
H2O
1,66M
5,34ml
1,87ml
-
8,30ml
1,00ml
0,22ml
3,27ml
3M
10,68ml
434µl
10ml
-
2,00ml
0,45ml
14,80ml
ENTGASEN
25mM FeSO4 x 7H2O
0,03% (v/ v) H2O2
Gesamtvolumen
0,01ml
0,80ml
20,00ml
0,02ml
1,60ml
40,00ml
Tab. 2.5 Zusammensetzung des Trenn- und Sammelgels der CTAB-PAGE.
2 Material und Methoden
34
In der zweiten Dimension wurden die in 2.8.1 beschriebenen 10%igen Trenn- und 3,8%igen
Sammelgele verwendet. Im Sammelgel wurde anstelle des Probenkamms ein speziell
angefertigter Präparativer Kamm (Abb. 2.6 ), dessen große Tasche in der Breite der Gel-
Länge von 11cm entspricht, verwendet. Zu beiden Seiten der grossen Tasche befinden sich
für den Marker (2.3.1) noch zwei kleinere Taschen von 5mm Breite.
2.8.2.2 1. Dimension: CTAB-PAGE
Bei der Probenvorbereitung für die erste Dimension wurde ein Volumen das etwa 150µg
Protein entspricht mit dem gleichen Volumen 2x Probenpuffer versetzt. Der 2x Probenpuffer
wurde zunächst ohne Harnstoff hergestellt, da das anschließende Erhitzen der Probe in
Anwesenheit von Harnstoff zur Carbamoylierung von Lysinen führt, die als Schnittstelle von
Trypsin dienen. Die Maskierung würde den vollständigen tryptischen Verdau der Proteine für
die massenspektrometrische Analyse verhindern.
Die Proben wurden 15min bei 70°C im Heizblock erhitzt. Währenddessen wurde in separate
Eppendorf-Gefäße, die dem Probevolumen entsprechende Menge Harnstoff (3M) eingewogen
und im 30°C Wasserbad erwärmt. Anschließend wurden die Proben gevortext und quantitativ
in das Eppendorf-Gefäß mit dem Harnstoff überführt. Harnstoff erhöht die Löslichkeit von
Proteinen. Die Proben wurden nach Zugabe erneut gründlich gevortext und dann für 5min bei
30°C im Heizbad belassen, 1min mit 13 000g in der Eppendorf-Tischzentrifuge zentrifugiert
und aus dem Überstand pipettiert. Überschritt das Probevolumen inklusive 2x Probenpuffer
die Menge von 150µl, musste die Probentasche des Sammelgels mit einem Micro-Spatel
trichterförmig erweitert werden (Abb. 2.7).
Bei einer Stromstärke von 25mA im Sammel- und 45mA im Trenngel dauerte die
Elektrophorese etwa 6,5h. Die Elektroden wurden so gepolt, dass die Elektrophorese in
Richtung Kathode abläuft, da CTAB als kationisches Detergenz den Proteinen eine positive
Ladung verleiht.
Abb. 2.6 Präparativer Kamm. In die lange Tasche wird
nach der ersten Dimension der Gelstreifen geschoben.
2 Material und Methoden
35
Nach der ersten Dimension wurde das Sammelgel entfernt und das Gelstück mit der Probe
und die Markerbanden als ca 1,5cm breiter Streifen mit dem Skalpell ausgeschnitten. Der
Gelstreifen wurde 4 x 5min in H2O gewaschen und 4 x 15min in SDS-Lyse-Puffer
äquilibriert. Die Markerbanden wurden in Fixier-Lösung (2.2.6 und 2.2.7) überführt.
2.8.2.3 2.Dimension: SDS-PAGE
Der Gelstreifen wurde nach der Äquilibrierung in die Aussparung des Sammelgels geschoben.
Ein Teil der zweiten Dimension wurde über Nacht bei einer Stromstärke von 10mA
durchgeführt. Erst nach etwa 11h passierten die Proben die Trenngelgrenze. Am nächsten Tag
konnte die Stromstärke deshalb im Trenngel auf 45mA erhöht werden. Insgesamt dauerte die
Elektrophorese etwa 16h.
2.9 Färbung der Proteine im Gel
Es wurden reversible Färbeverfahren mit möglichst niedriger Nachweisgrenze gewählt.
2.9.1 Reversible MS-kompatible Silberfärbung
Arbeitsschritt Lösung (2.2.6) Dauer
Fixierung
Sensitisation
Wässerung
Imprägnation
Spülen
Entwicklung
Stoppen
Waschen
Fixier-Lösung
Sensitisationslösung
Bidest
Silbernitrat-Lösung
Bidest
Entwickler-Lösung
Stopp-Lösung
Bidest
1 - 3d
45min
6x 10min
1 - 2h
max 15s
5 - 40min
45min
2x 30min
Tab. 2.6 Protokoll für die reversible, MS-kompatible Sillberfärbung.
Abb. 2.7 Elektrophoresekammer "Twin M", wie sie zur Durchführung der
Gelelektrophorese verwendet wurde. Die Probentasche wurde mit dem
Mikrospatel trichterförmig erweitert (siehe Text).
2 Material und Methoden
36
2.9.2 Colloidale Coomassie-Färbung
Arbeitsschritt Lösung (2.2.7) Dauer
Fixierung
Wässerung
Inkubation
Färbung
Entfärbung
Fixier-Lösung
Bidest
Inkubationslösung
Färbe-Lösung
Bidest
1 - 3d
3x 30min
60min
3 - 5d
6h - 3d
Tab. 2.6 Protokoll für die colloidale Coomassie-Färbung.
2.10 Western Blot-Analyse
2.10.1 Transfer und Immobilisierung von Proteinen
Die Proteine wurden eindimensional durch SDS-PAGE (2.8.1) und zweidimensional durch
CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) aufgetrennt und in Anlehnung an Towbin et al. (1979) auf PVDF-
Membranen (2.1) transferiert. Geblottet wurde nach dem Semi Dry-Verfahren.
Dazu wurden pro Gel 16 Whatman®
-Papiere (3mm Chromatography paper, Whatman®
International Ltd.,Brentford, UK) und eine Membran auf die Größe des Trenngels
zugeschnitten. Das Gel und die Whatman®
-Papiere wurden 5min in Transfer-Puffer
äquilibriert. Die PVDF-Membran wurde zunächst 5min in Methanol aktiviert, anschließend
ebenfalls in Transfer-Puffer äquilibriert. Auf die Anode der Blot-Apparatur (2.1) wurden dann
8 Filterpapiere, die Membran, das Gel und abschließend 8 Filterpapiere in dieser Reihenfolge,
blasenfrei, zum sogenannten „Blot-Sandwich“ aufgetürmt. Für einen optimalen Stromfluss
wurde die Anodenplatte um das Sandwich getrocknet.
Pro cm2 Gelfläche wurde mit 2,0mA, jedoch insgesamt mit nicht mehr als 450mA, 90min
geblottet.
2.10.2 Immunologischer Nachweis und Detektion der Meerretttich-Peroxidase-
Aktivität
Nach dem Transfer wurden zunächst unspezifische Bindestellen auf der Membran durch
Inkubaton mit Milchpulver-Blocklösung besetzt. Geblockt wurde über Nacht bei 4°C oder
60min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde 90min mit Erst-Antikörper (2.3.2.1) in
Milchpulver-Verdünnungslösung inkubiert. Für Blots von Gelen der Größe 5,5 x 8,5cm waren
2ml Antikörper-Verdünnung ausreichend, wohingegen für Blots der Größe 11 x 14cm 4ml
Lösung benötigt wurden. Die Inkubation erfolgte in 15ml bzw 50ml Falcon-Röhrchen, die mit
2 Material und Methoden
37
dem Falcon-Ständer an einem mechanischen Rührer, wie er in der präparativen Chemie
verwendet wird, angebracht wurden. Der Rührer wurde vertikal an einem Stativ befestigt.
Danach wurden die Membranen 3 x 5min auf dem Schüttler mit Wasch-Puffer und 1 x 5min
mit 1x PBS gewaschen. Die Inkubation mit Zweit-Antikörper (2.3.2.2) erfolgte 60min in
10ml Antikörper-Verdünnung mittels der gleichen apparativen Vorrichtung. Dann wurde
wieder 3 x 5min in Wasch-Puffer gewaschen, dann 1 x 5min mit Wasser. Die Membranen
wurden anschließend in einer Film-Entwicklerkassette (Hypercassette™, Amersham
Biosciences, Freiburg) in feuchte Frischhalte-Folie eingeschlagen.
Die Aktivität der Zweit-Antikörper-gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP) wurde mit
dem EClTM
Plus-System (Amersham Biosciences, Freiburg) detektiert. Das Detektions-
reagenz enthält zyklisches Diacylhydrazid (Lumigen PS-2), das in Gegenwart von
Wasserstoffperoxid (H2O2) und mit Hilfe der Meerrettich-Peroxidase, die als Katalysator der
Reaktion fungiert, zu einem Acridinium Ester umgesetzt wird (Abb. 2.9). Durch die weitere
Umsetzung des Esters (Oxidation) werden Teilchen energetisch angeregt, die eine Weile auf
höheren Energie-Niveaus verweilen und schließlich ihre Energie durch Abgabe von
Lichtquanten (Photonen) verlieren. Man bezeichnet diesen Vorgang als Chemilumineszenz.
Im Falle des EClTM
Plus-Systems dient der Acridinium Ester als eine Art „Lichtspeicher“ und
so können Lichtquanten noch 24 Stunden nach Beginn der Reaktion detektiert werden.
Abb. 2.9 Oxidation von Lumigen PS-2. Die Reaktion wird von der
an Zweit-Antikörper gekoppelten Meerrettich-Peroxidase (HRP)
katalysiert.
2 Material und Methoden
38
Pro cm2 Membran wurden 40µl Detektionsreagenz angesetzt. Dazu wurden die Reagenzien A
(enthält Lumigen PS-2) und B (enthält H2O2) des EClTM
Plus- Systems im Verhältnis 40 : 1
(A : B) gemischt. Die Membranen wurden dünn betropft und danach 5min im Dunkeln
inkubiert. Die Lösung wurde anschließend vom Rand der Membranen mit einem Papiertuch
weggesaugt. Die Frischhalte-Folie wurde faltenfrei eingeschlagen, die Filme (2.1) bei
geeignetem Rotlicht auf den Blots platziert und die Entwicklerkassette geschlossen.
Anschließend wurden die exponierten Filme in der Entwickler-Maschine (2.1) entwickelt.
2.11 Massenspektrometrie
Proteine, die massenspektrometrisch analysiert wurden, wurden zuvor durch
zweidimensionale CTAB/ SDS-PAGE (2.8.2) getrennt und anschließend colloidal
Coomassie-gefärbt (2.9.2). Für die Protein-Identifizierung wurde der Massenspektrometer Q-
Tof Ultima API der Firma Waters (Massachusetts, USA) verwendet. Das Gerät ist
standardmäßig mit einer HPLC-Anlage ausgestattet. Es wurde die Kapillarsäule Modell
„Atlantis“ der Firma Waters benutzt, mit den Maßen 150mm (Länge) x 75µm (Durchmesser).
Der Durchmesser der Silica-Kugeln betrug 3µm, die Porengröße 300Å (30nm). Der Aufbau
(Abb. 1.9) und das Funktionsprinzip des ESI-Tandem-Massenspektrometers wurde
ausführlich in Kapitel 1.4.3.3 beschrieben. Für die Datenbank-Recherche wurde das
Programm "MASCOT" von www.matrixscience.com verwendet.
Die Probenvorbereitung wurde unter einer Plexiglas-Scheibe durchgeführt um Ver-
unreinigungen, insbesondere durch Keratine, zu vermeiden.
2.11.1 Ausschneiden der Proteine
Die gefärbten proteinhaltigen Bereiche wurden mit dem Skalpell ausgeschnitten, in kleine
Stücke zerteilt und die Gelstückchen anschließend in ein 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt.
Dazu wurde das Gel auf einer Glasplatte platziert. Auf Papier wurde ein Raster angefertigt
und unter die Glasplatte gelegt. Unter dieser Anordnung befand sich eine Leuchtplatte, so
dass das Raster deutlich durch das Gel hindurch zu erkennen war (Abb. 2.10). Den
ausgeschnittenen Gelstückchen konnten deshalb eindeutige Nummern zugeteilt werden, die
den Tetragonen des Rasters entsprachen.
2 Material und Methoden
39
2.11.2 Trypsin-Spaltung in Coomassie-Gelen („im-Gel Verdau“)
Vor der massenspektrometrischen Analyse müssen die Proteine entfärbt und proteolytisch
gespalten werden. Als Protease wurde Trypsin verwendet, das Proteine C-Terminal hinter
Lysin (K) und Arginin (R) hydrolysiert, sofern es sich bei der darauf folgenden Aminosäure
nicht um Prolin (P) handelt. Die meisten Proteine besitzen genügend Spaltstellen, so dass die
tryptischen Fragmente eine optimale Größe aufweisen. Ein weiterer Vorteil bei der
Verwendung von Trypsin ist, dass alle Autolyse-Produkte bekannt sind und bei der
MS-Analyse deshalb von vornherein ausgeschlossen werden können.
Die Gelstückchen wurden nach dem Auftauen mit 400µl H2O versetzt und 5min bei 37°C und
600rpm im Thermomixer (Modell Compact, Eppendorf AG, Wesseling-Berzdorf) inkubiert.
Um organische Verunreinigungen zu entfernen, wurde 5min bei 600rpm und 37°C in 50%
(v/ v) Acetonitril gewaschen. Zur Reduktion der Disulfidbrücken wurden die Gelstückchen
mit 250µl 10mM DTT 1 Stunde bei 56°C und 600rpm behandelt. Anschließend wurde 5min
auf einem zweiten Thermomixer bei 600rpm und 25°C mit 400µl H2O gewaschen. Danach
wurden die Proben mit etwa 250µl 55mM Iodacetamid versetzt und 30min bei 600rpm
inkubiert. Iodacetamid maskiert durch Alkylierung die nach der Reduktion freiwerdenden
SH-Gruppen der Cysteine und verhindert so deren erneute Oxidation. Um die zusätzliche
Alkylierung der Methionine zu verhindern, sollte diese Reaktion unbedingt im Dunkeln und
bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Anschließend wurde im Wechsel je dreimal 10min
bei 37°C und 600rpm mit 400µl H2O und 50% (v/ v) Acetonitril gewaschen. Die ersten
beiden Male wurden die Proben dabei abgedunkelt. Die Gelstückchen wurden dann zweimal
mit jeweils 400µl 100% Acetonitril bei Raumtemperatur etwa 1min dehydratisiert. Der
Endpunkt dieses Vorgangs ist deutlich erkennbar, da die Gelstückchen nach Abschluss eine
Abb. 2.10 Anordnung beim Ausschneiden der gefärbten Bereiche des Gels. Das
Raster (vergrößert dargestellt) wurde in 3 Bereiche A, B, C untergliedert, die
Tetragone des Rasters durchnummeriert (nicht dargestellt). Auf dem Raster
befindet sich eine Glasplatte (dunkelblau) auf der das Gel (türkis) liegt.
2 Material und Methoden
40
schneeweiße Farbe annehmen. Das Acetonitril wurde anschließend abgenommen und die
Gelstücke bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurde zunächst in je 20µl
Trypsin-Gebrauchslösung verdaut. Die Proben wurden dazu etwa 10min bei 37°C inkubiert.
Dabei quellen die Gelstückchen auf. Teilweise sind diese nicht mehr bedeckt und fehlendes
Volumen wurde deshalb durch die erneute Zugabe von etwa 10µl Trypsin-Gebrauchslösung
ergänzt. Nach weiteren 10min wurden die Proben ein zweites Mal überprüft und eventuell
durch die Zugabe von Bicarbonat-Puffer vollständig bedeckt. Danach wurden sie über Nacht
im Inkubator bei 37°C verdaut.
2.11.3 Nano-LC und interne Kalibrierung
Die Peptid-Proben befinden sich nach dem Verdau in der Flüssigkeit, die die Gelstückchen
umgibt. Die Injektion der Proben erfolgte automatisiert über eine Dosierschleife, die das
reproduzierbare Einbringen von definierten Injektionsvolumina in das HPLC-System
ermöglicht. Kleinste Mengen der Proben (20nl/ min) wurden so in den konstanten
Volumenstrom (5µl/ min) der mobile Phase (1.4.3.3) gebracht. Als mobile Phase wurde ein
konvexer Hochdruck-Gradient aus H2O/ Acetonitril (Tab. 2.7) verwendet. Der Pumpendruck
betrug 3600psi („parts per square inch“, entspricht 248,2bar).
Zeit (min) H2O (%) Acetonitril (%) Fließgeschwindigkeit
(µl/ min)
0,01 95 5 5
5,00 95 5 5
10,00 85 15 5
35,00 60 40 5
45,00 40 60 5
50,00 5 95 5
55,00 5 95 5
56,00 95 5 5
Tab. 2.7 Zeitprofil des konvexen Gradienten der mobilen Phase.
Für die Kalibrierung des Massenspektrometers wurde der Fibrinogen B [Glu1]-Standard der
Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim) verwendet.
2 Material und Methoden
41
2.11.4 Extraktion der Proben
Proben, die sich nach der Analyse im Spektrum als sehr komplex herausgestellt hatten,
wurden ein zweites Mal gemessen. Dazu mussten die Peptide aus den Gelstückchen extrahiert
werden. Mit Acetonitril wurden die Gelstückchen erneut dehydratisiert. Die austretende
Flüssigkeit wurde abgenommen, in ein neues 0,5ml Eppendorf-Gefäß überführt und in der
Savant SpeedVac™ (Selby Biolab, Australien) eingeengt. Das resultierende Volumen wurde
in 15µl Bicarbonat-Puffer aufgenommen, 5µl wurden für die Analyse verwendet, das restliche
Volumen bei -20°C gelagert.
3 Ergebnisse
42
3 Ergebnisse
In dieser Arbeit sollten ciliäre Membranproteine aus dem Riechepithel der Ratte isoliert und
in hoher Auflösung durch 2D-Gelelektrophorese dargestellt werden. Das Ziel war dabei die
Etablierung einer Methode, die die massenspektrometrische Analyse des gesamten ciliären
Proteoms ermöglicht.
Der folgende Ergebnisteil gliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 3.1 beschreibt die
Isolation ciliärer Membranen aus dem Riechepithel der Ratte. Der immunologische Nachweis
von Markerproteinen, die Aufschluss über die Qualität der Präparation geben, ist Bestandteil
von Abschnitt 3.2. Die zweidimensionale gelelektrophoretische Trennmethode der
solubilisierten Membranproteine ist in Abschnitt 3.3 beschrieben und deren qualitative
Analyse in Abschnitt 3.4. Abschließend werden die Ergebnisse der massenspektrometrischen
Analyse in Abschnitt 3.5 vorgestellt.
3.1 Entwicklung einer Methode zur Präparation ciliärer Membranen
Die Präparation von Cilien-Membranen wurde bereits von mehreren Autoren beschrieben
(z.B. Bönigk et al., 1999; Delgado et al., 2002; Washburn et al., 2002). Die dort
beschriebenen Vorgehensweisen lieferten, bezogen auf die Reinheit und Protein-Ausbeute,
jedoch keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Es war deshalb zunächst notwendig, diese
Präparationstechniken im Hinblick auf die 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie
zu optimieren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun eine Präparation ausgearbeitet werden,
die durch die Kombination der verschiedenen Beschreibungen eine neue Methode darstellt,
die diesen Anforderungen genügt.
Dazu wurde das Riechepithel aus jeweils 15-20 Ratten präpariert. Für den nachfolgenden
Calcium-Schock zur Ablösung der Cilien vom Epithel erwies sich das 30minütige Rühren im
Schnappdeckel-Glas gegenüber dem Taumeln im 15ml Falcon-Röhrchen als viel effektiver,
so dass die Ausbeute an Cilien-Membranen wesentlich gesteigert werden konnte.
Bei 7700g bewirkte die Anwendung der sequenziellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen
Zentrifugationsschrittes eine zusätzliche Anreicherung ciliärer Membranen. Dabei erscheinen
die Cilien nach dem ersten Zentrifugationsschritt noch als gelber Ring (Abb. 3.1, links) um
das decilierte Restepithel, der im Zuge der folgenden Zentrifugationsschritte verschwindet.
Zur besseren Abtrennung gelöster Proteine und nicht-ciliärer Membranen anderer Organellen,
wie von Mitochondrien oder Zellkernen, wurde zudem ein Saccharose-Stufengradient
3 Ergebnisse
43
eingeführt. Die Cilienbande erscheint nach der Ultrazentrifugation deutlich sichtbar als
dunkler Nebel an der Phasengrenze des Gradienten (Abb. 2.5).
Die Ausbeute an isolierten Membranen wurde für jeden Reinigungsschritt indirekt über die
Proteinmenge bestimmt. Da Membranproteine für eine quantitative Bestimmung zunächst aus
der Membran gelöst und solubilisiert werden müssen, ist der Einsatz von Detergenzien
unumgänglich. Die Bestimmung der Proteinmenge musste deshalb über die Amidoschwarz-
Methode erfolgen.
Die Abbildung 3.1 (rechts) zeigt das Cilienpellet nach der zweiten Ultrazentrifugation am
Ende der Präparation. Die hier etablierte Methode lieferte jetzt im Vergleich eine deutlich
höhere Ausbeute.
Abb. 3.1 Links dargestellt ist das Pellet der Riechepithelien von 5
Ratten nach der ersten Zentrifugation bei 7700g. Der gelbliche Rand
(Pfeil) um das decilierte Restepithel besteht aus den Cilien der ORNs.
Rechts: Membranpellet am Ende der Präparation.
3 Ergebnisse
44
3.2 Qualitative Analyse der Präparation
Kennzeichnend für die hohe Qualität der Präparation ist die vorherrschende Präsenz ciliärer
Proteine. Für die Praxis bedeutet dies, dass analysiert werden muss, ob folgende
Voraussetzungen erfüllt sind:
� Der gelelektrophoretische Vergleich der Cilienproteine mit den Proteinen des
olfaktorischen Gesamtepithels zeigt, dass cilienspezifische Proteine angereichert
werden
� In der Präparation können ciliäre Markerproteine nachgewiesen werden
� Epitheliale oder mitochondriale Markerproteine werden nicht oder in geringer Menge
in der Cilienpräparation nachgewiesen
3.2.1 Vergleich von Protein-Banden durch denaturierende SDS-PAGE
Um sich einen groben Überblick zu verschaffen, ob bestimmte Proteine in der Präparation
besonders stark angereichert werden, wurden etwa gleiche Mengen der Cilienproteine und des
olfaktorischen Gesamtepithels (OE; 2.5.3) durch denaturierende SDS-PAGE (2.8.1) getrennt
und anschließend colloidal Coomassie (2.9.2) gefärbt.
Abb. 3.2 Vergleich des
Bandenmusters ciliärer
Proteine mit dem von
Proteinen des decilierten
Restepithels.
Links im Bild: Molekular-
gewichte in kDa. (I): 20µg
Cilienproteine; (II): 20µg
Proteine des olfaktorischen
Gesamtepithels.
Abbildung 3.2 zeigt das Ergebnis der Färbung: In der
Tat scheinen einige Proteine durch die Präparation stark
angereichert zu werden. Besonders deutlich ist dies etwa
im Bereich von 55kDa zu erkennen. Im oberen Drittel
sind im Größenbereich zwischen 70 und 120kDa viele
Banden erst nach der Anreicherung erkennbar.
Möglicherweise handelt es sich um cilienspezifische
Proteine, die in der großen Proteinvielfalt des gesamten
olfaktorischen Epithels nicht als Banden sichtbar
werden. Insgesamt ist die Auflösung der Banden viel zu
gering um die Komplexität der Präparation vollständig
zu erfassen. In einer Bande können zahlreiche Proteine
enthalten sein.
3 Ergebnisse
45
Ersichtlich ist, dass es sich bei den Proteinen der Präparation um ein komplexes Gemisch
handelt. Ob es sich dabei ausschließlich um ciliäre Proteine handelt, kann erst beurteilt
werden, nachdem die Anwesenheit anderer Proteine experimentell widerlegt wurde und
Cilienproteine nachgewiesen wurden.
3.2.2 Nachweis cilienspezifischer Markerproteine durch Western Blot-Analyse
Adenylatcyclase Typ III (AC III), das olfaktorische G-Protein (Golf) und die Untereinheiten
des cyclisch-Nukleotid gesteuerten Kationenkanals (CNG-Kanal) sind heute anerkannte
cilienspezifische Markerproteine, für die Antikörper für immunologische Nachweis-
Verfahren im Handel erhältlich sind.
Cilienproteine, Proteine des decilierten Restepithels und des olfaktorischen Gesamtepithels
wurden nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen immobilisiert. Zum immunologischen
Nachweis der Markerproteine wurden Antikörper gegen die A2-Untereinheit des CNG-
Kanals (α-CNG-A2), gegen die A4-Untereinheit des CNG-Kanals (α-CNG-A4), gegen AC III
(α-AC III) und gegen die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (α-Gαs/olf) verwendet.
3.2.2.1 Western Blot-Analyse der Untereinheiten des CNG-Kanals
Abbildung 3.3 zeigt den immunologischen Nachweis von CNG-A4 (linker Blot) und CNG-
A2 (rechter Blot). Beide Untereinheiten wurden in der Cilien-Präparation (I) nachgewiesen,
aber nicht im decilierten Restepithel (II) und nicht im olfaktorischen Gesamtepithel (III).
Deutlich sichtbar ist bei CNG-A2 nur die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa. Die
unscharfe Bande lässt auf unterschiedliche Glykosylierungszustände schließen, die
überwiegend während der Präparation entstehen. Die nicht glykosylierte Variante bei 76kDa
ist nur sehr schwach erkennbar, möglicherweise deutet dies auf ein schonendes
Präparationsverfahren hin, da das Protein überwiegend in seiner höhermolekularen Form
auftritt und das, obwohl große Proteine im Vergleich zu kleineren erfahrungsgemäß schwerer
auf Membranen zu transferieren sind. Bei etwa 58kDa ist schwach ein wiederholt auftretendes
Abbauprodukt der CNG-A2 Untereinheit zu erkennen.
3 Ergebnisse
46
Die CNG-A4 (linker Blot) Untereinheit ist ebenso wie CNG-A2 nur in den Cilien
nachweisbar. Sie ist nicht glykosyliert und erscheint in nur einer Variante bei 66kDa.
Da beide Untereinheiten nicht im decilierten Restepithel nachgewiesen werden, ist eine hohe
Ausbeute an Cilienmembranen bei der Präparation anzunehmen. Der Anteil an CNG-
Proteinen bezogen auf die gesamte Protein-Vielfalt des olfaktorische Epithels ist zu gering um
CNG-A2 und CNG-A4 in den aufgetragenen Mengen noch nachweisen zu können. Beide
Untereinheiten werden demnach stark bei der Präparation angereichert.
3.2.2.2 Western Blot-Analyse der Typ III Adenylatcyclase (AC III)
Bei der Analyse der AC III (Abb. 3.4) wurden nicht nur in der Cilienpräparation (I) Signale
detektiert, sondern schwach auch im decilierten Restepithel (II) und im olfaktorischen
Gesamtepithel (III). Prominent ist auch hier die glykosylierte Form des Proteins, die
typischerweise bei etwa 220kDa erscheint. Ein Abbauprodukt, das häufig detektiert wird,
erscheint in mittlerer Intensität in der Cilien- Präparation bei etwa 72kDa (zum Vergleich
siehe Bönigk et al., 1999).
Abb. 3.3 Western Blot-Analyse von CNG-A4 (linker Blot)
und CNG-A2 (rechter Blot). Pro Spur wurde 10µg Protein
aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. (I):
Cilien; (II): deciliertes Restepithel; (III): OE; Verdünnungen
der Antikörper: α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; α-
CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der
Membranen: 12min.
3 Ergebnisse
47
3.2.2.3 Western Blot-Analyse der α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins (Gα olf)
3.2.3 Ausschluss epithelialer Markerproteine durch Western Blot-Analyse
Die Reinheit der Präparation wurde durch Ausschluss mitochondrialer und epithelialer
Markerproteine überprüft. Als Marker dienten Occludin der tight junctions und Prohibitin, das
in der inneren Mitochondrien-Membran lokalisiert ist.
AC III scheint sehr stark in den ORNs exprimiert zu werden und
ist deshalb auch im decilierten Restepithel noch schwach
nachweisbar. Ersichtlich ist aber, dass AC III, ebenso wie die
CNG-Untereinheiten, durch die angewandte Präparationstechnik
deutlich angereichert wird.
Abb. 3.4 Western Blot-Analyse der AC III. (Zahlen): Molekulargewichte in
kDa. Pro Spur wurde 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes
Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-AC III, 1: 200; α-rb
IgG, 1: 80000; Exposition: 3min.
Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins besitzt eine
Größe von 44,2kDa und wird in allen Spuren sehr stark detektiert,
jedoch besteht immer noch eine Tendenz zur Anreicherung in der
Cilien- Präparation (I), wohingegen im decilierten Restepithel (II)
eine Abreicherung zu beobachten ist. Möglicherweise bestehen
die Signale aus zwei Banden, da häufig auch die etwas kleinere
Spleiß-Variante α2 (40kDa) detektiert wird.
Abb. 3.5 Western Blot- Analyse von Gα olf. (Zahlen): Molekulargewichte in
kDa. Pro Spur wurden 10µg Protein aufgetragen. (I): Cilien; (II): deciliertes
Restepithel; (III): OE; Verdünnungen der Antikörper: α-Gα olf, 1: 2000; α-rb
IgG, 1: 80000; Exposition: 20s.
3 Ergebnisse
48
Zur Durchführung der Kontrollen wurden die Cilienproteine und die Proteine des
olfaktorischen Gesamtepithels nach der SDS-PAGE auf PVDF-Membranen transferiert und
mit Antikörpern gegen Occludin (α-Ocn) und Prohibitin (α-PHB) behandelt.
Die Markerproteine Occludin (linker Blot) und Prohibitin (rechter Blot) wurden sowohl in der
Präparation der Cilien (Spur I) als auch im olfaktorischen Gesamtepithel nachgewiesen (Spur
II). Auffällig ist, dass die nicht phosphorylierte Variante von Occludin (65kDa) nur in Spur I
detektiert wird. Möglicherweise wird diese Form auf Grund ihrer schlechteren Löslichkeit am
Ende der Präparation mit den Cilienmembranen pelletiert. In der Proteinpräparation des OE
kann man erkennen, dass diese Variante bezogen auf das Gesamtepithel eher eine
untergeordnete Rolle spielt. Prominent ist hier die phosphorylierte Form bei etwa 82kDa, die
in den Cilien wesentlich schwächer detektiert wurde. Das mitochondriale Markerprotein
Prohibitin liefert ein eindeutiges Signal im OE (30kDa) und ist ebenso wie Occludin in der
Cilienpräparation mengenmäßig stark reduziert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle verwendeten ciliären Markerproteine in der
Präparation nachgewiesen und angereichert wurden. In Bezug auf die Signalstärken wird
deutlich, dass AC III und Golf im Vergleich mit den CNG-Untereinheiten mengenmäßig in der
Präparation überwiegen, was auf eine stärkere Expression schließen lässt, da diese auch im
olfaktorischen Gesamtepithel und decilierten Restepithel noch nachweisbar sind. Die nicht-
Abb. 3.6 Western Blot-Analyse von Occludin (links)
und Prohibitin (rechts). (Zahlen): Molekulargewichte in
kDa. Pro Spur wurden 20µg Protein aufgetragen. (I):
Cilien-Proteine; (II): OE; Verdünnungen der Antikörper:
α-Ocn, 1: 200; α-rb IgG, 1: 30000; α-PHB, 1: 200; α-rb
IgG, 1: 30000; Exposition: jeweils 30s.
3 Ergebnisse
49
ciliären Proteine Occludin und Prohibitin hingegen wurden in der Cilienpräparation in
deutlich geringerer Menge als im olfaktorischen Epithel nachgewiesen.
3.3 Etablierung eines geeigneten gelelektrophoretischen
Trennverfahrens
In Abschnitt 3.2.1 wurde gezeigt, dass es sich bei den Proteinen der Cilien-Präparation um ein
sehr komplexes Gemisch handelt. Die Kontrollen bewiesen zudem, dass darin auch nicht-
ciliäre Proteine, zwar in einem geringeren Umfang, aber dennoch enthalten sind. Es war
deshalb notwendig, ein gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren zu etablieren, das gegenüber
der klassischen, eindimensionalen SDS-PAGE eine höhere Auflösung der Proteine erzielt.
Diese Methode sollte darauf ausgelegt sein, die schlecht löslichen und im Gegensatz zu den
löslichen Proteinen in wesentlich geringerer Konzentration in der Zelle vorhandenen
Membranproteine quantitativ darzustellen.
3.3.1 Trennung ciliärer Proteine durch 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese
Bei der 2D-CTAB/ SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-CTAB/ SDS-PAGE) werden
Proteine in beiden Dimensionen nach ihren Molekulargewichten getrennt. Die Verwendung
der CTAB-PAGE in der ersten Dimension erwies sich in vielfacher Hinsicht als sehr
vorteilhaft: Das kationische Detergenz Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) stabilisiert
die positiven Ladungen der außerhalb der hydrophoben Regionen überwiegend basischen
Membranproteine, erhöht somit deren Löslichkeit und verdrängt gleichzeitig die benachbarten
Phospholipide. Der saure pH-Wert unterstützt diesen Prozess durch Bereitstellung von
Protonen und sorgt dafür, dass lösliches Protein noch vor dem Auftragen der Probe teilweise
gefällt wird. Eine zweite Methode, die nach den gleichen Prinzipien die Trennung von
Membranproteinen ermöglicht, ist die häufiger angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE, die im
Rahmen dieser Arbeit ebenfalls getestet wurde (nicht dargestellt), aber vergleichsweise eine
schlechte Auflösung erzielte.
In der zweiten Dimension wurden die Proteine durch klassische SDS-PAGE getrennt. Dazu
wurde der Gelstreifen mit der Probe ausgeschnitten und in SDS-Lyse-Puffer äquilibriert. Die
Proteine erhalten durch das anionische Detergenz SDS eine negative Ladung.
3 Ergebnisse
50
3.3.1.1 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung
Zunächst wurden Cilienproteine und olfaktorisches Gesamtepithel getrennt und anschließend
durch Silberfärbung im Gel dargestellt (Abb. 3.7). Im Hinblick auf die massenspektro-
metrische Analyse wurde die MS-kompatible Variante der Silberfärbung mit einer
Nachweisgrenze von 2ng Protein verwendet.
Abb. 3.7 Ergebnis der Silberfärbung der durch 2D-CTAB/ SDS-PAGE getrennten Cilienproteine (links) und der
Proteine des OE (rechts). Es wurde jeweils 80µg Protein verwendet. (1D, 2D): Die Richtung der ersten und
zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa. In beiden Dimen-
sionen wurden die Proteine gemäß ihrer Masse getrennt.
Erwartungsgemäß ist auch hier das Proteinmuster der Cilienproteine weniger komplex als das
der Proteine des OE. Die starke Abweichung der Proteine von der Diagonalen ist ein
erwünschter Effekt, da Proteine mit ähnlichen Molekulargewichten andernfalls in der zweiten
Dimension genauso weit wie in der ersten Dimension wandern würden und deshalb keine
zusätzliche Trennung zu beobachten wäre. Der zusätzliche Trenneffekt in der Horizontalen
wird hauptsächlich durch das unterschiedliche Detergenz-zu-Protein-Verhältnis in beiden
Dimensionen verursacht. Dasselbe Protein wird von etwas mehr CTAB-Molekülen besetzt als
von SDS-Molekülen und wandert in der ersten Dimension etwas weiter. Unterstützt wird
dieser Effekt durch unterschiedliche Acrylamid-Konzentrationen in den Gelen.
Die horizontale Streifenbildung („Streaking“) ist eine häufige und unerwünschte Erscheinung
zweidimensionaler Trennverfahren. Sie hat vielfältige Ursachen, wie zum Beispiel zu hohe
Salzkonzentrationen (>10mM) in der Probe, Überladung des Gels oder Verunreinigungen mit
Nukleinsäuren. Das vertikale streaking in den höhermolekularen Bereichen des Gels kann ein
Hinweis auf Degradation der Proteine sein.
3 Ergebnisse
51
3.3.1.2 2D-CTAB/ SDS-PAGE mit anschließender colloidal Coomassie-Färbung
Die Gele mussten für die weitere Anwendung optimiert werden: Das streaking sollte
minimiert werden. Ein höherer Kontrast war wünschenswert, nicht zuletzt deshalb um die
später massenspektrometrisch analysierten Proteine besser im Gel zuordnen zu können. Aus
diesem Grund wurden die Gele alternativ colloidal Coomassie gefärbt. Mit dieser
Färbemethode können 5 - 10ng Protein nachgewiesen werden. Trotz der etwas geringeren
Sensitivität hatte dieses Verfahren im Vergleich zur massen-kompatiblen Silberfärbung
mehrere Vorteile: Bei großen Proteinmengen steigt die Intensität der Silberfärbung nur bis zu
einem nicht näher bestimmten Wert an und nimmt danach wieder ab. Bei der colloidal
Coomassie-Färbung hingegen besteht eine größere Linearität zwischen Proteinmenge und
Farbtiefe. Das Stoppen der Entwicklung ist bei der Silberfärbung ein kritischer Schritt, da das
Gel in der Stopp-Lösung noch nachfärbt und es deshalb häufig zu Überfärbungen kam. Ein
Nachfärben der Gele während des Entfärbe-Vorgangs wurde bei der colloidal
Coomassie-Färbung nicht beobachtet. Auch die Hintergrund-Färbung war deutlich reduziert.
Die Cilienproteine wurden zur Reduktion des streakings vor dem Auftragen zudem mit
Benzonase und PNGaseF behandelt. Um die geringere Sensitivität im Vergleich zur Silber-
färbung auszugleichen, wurde etwa die doppelte Menge der Probe aufgetragen.
Abbildung 3.8 zeigt das Ergebnis dieser 2D-CTAB/ SDS-PAGE. Eine gleich behandelte
Probe wurde zusätzlich durch eindimensionale SDS-PAGE getrennt. Bei der Interpretation
der Ergebnisse sollte berücksichtigt werden, dass die Mengenverhältnisse der beiden
Methoden nicht direkt miteinander vergleichbar sind, da bei zweidimensionalen Verfahren
mit Verlusten während der Äquilibrierung und beim Übergang der Probe von der ersten in die
zweite Dimension gerechnet werden muss.
3 Ergebnisse
52
Abb. 3.8 Ergebnis der colloidal Coomassie-Färbug. (Links): Eindimensionales SDS-Gel mit 80µg Cilienprotein;
(Rechts): 2D-CTAB/ SDS-Gel mit 100µg Cilienprotein; (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die
Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.
Die Proteinflecken sind im Vergleich zur Silberfärbung wesentlich schärfer voneinander
abgrenzbar und die Hintergrund-Färbung ist deutlich reduziert. Das vertikale streaking konnte
nicht vollständig unterdrückt werden. Das horizontale streaking wurde erfolgreich reduziert,
allerdings sollte bedacht werden, dass durch colloidal Coomassie möglicherweise schwach
vorhandene Streifen nicht so deutlich dargestellt werden. Vergleicht man hier die
Bandenmuster beider Gele miteinander, so erscheint in der 2D-Gelelektrophorese vor allem
der Bereich von etwa 40 - 70kDa wesentlich besser aufgelöst.
Nachdem für die Darstellung der cilienspezifischen Membranproteine auf dem
eindimensionalen Gel gezeigt werden konnte, dass alle wichtigen Markerproteine
nachweisbar sind, war es nun unerlässlich zu überprüfen, ob diese auch auf dem 2D-Gel
identifiziert werden können. Durch die Anwendung des kationischen Detergenz CTAB
anstelle von SDS in der ersten Dimension könnten nämlich nicht alle Membranproteine
solubilisiert worden sein. Der Nachweis aller Markerproteine erhöht die Wahrscheinlichkeit,
dass die Mehrzahl der Cilienproteine auch durch das 2D-Gel erfasst werden und später
massenspektrometrisch identifiziert werden können.
3 Ergebnisse
53
3.4 Qualitätskontrolle der Trennmethodik durch Nachweis
cilienspezifischer Markerproteine
Zum Nachweis cilienspezifischer Markerproteine wurden die Proben nicht mit PNGaseF
behandelt, um auch die glykosylierten Formen der AC III und CNG-A2-Untereinheit
nachzuweisen. Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE wurden die Proteine auf PVDF-Membranen
transferiert und wie bei der eindimensionalen Gelelektrophorese mit α-CNG-A2, α-CNG-A4,
α-AC III und α-Gαs/ olf (siehe Abschnitt 3.2.2) behandelt.
3.4.1 Western Blot-Analyse der CNG-A2- und CNG-A4-Untereinheit
Abbildung 3.9 zeigt den Nachweis der CNG-A2-Untereinheit (linker Blot) und CNG-A4-
Untereinheit (rechter Blot) des CNG-Kanals. Beim Vergleich mit Abbildung 3.3 fällt auf,
dass nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE auch die unglykosylierte Variante der CNG-A2-
Untereinheit nachgewiesen wurde. Diese wurde deutlich bei 76kDa detektiert. Ein etwas
stärkeres Signal liefert die glykosylierte Variante bei etwa 125kDa, das häufig zu
beobachtende Abbauprodukt von 58kDa wurde nicht nachgewiesen (vgl. Abb. 3.3, rechts).
Das CNG-A4-Signal ist wie im eindimensionalen System deutlich bei 66kDa zu erkennen.
Abb. 3.9 Western Blot-Analyse von CNG-A2 (linker Blot) und CNG-A4 (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-
PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die
Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-
CNG-A2, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-CNG-A4, 1: 20; α-ms IgG, 1: 30000; Expositionsdauer der Mem-
branen: jeweils 15min.
3 Ergebnisse
54
3.4.2 Western Blot-Analyse der AC III und von Gα olf
Beim immunologischen Nachweis der AC III (Abb. 3.10, links) nach der 2D-CTAB/ SDS-
PAGE wurde nur das Abbauprodukt bei etwa 72 kDa detektiert. Möglicherweise ist dies auf
eine Degradation des Proteins zurückzuführen, eine Annahme, die durch die Erscheinung des
vertikalen streakings (3.3.1.1 und 3.3.1.2) bestärkt wird. In Abbildung 3.8 ist deutlich zu
erkennen, dass das streaking hauptsächlich im hochmolekularen Bereich auftritt, also dort, wo
sowohl die glykosylierte (um 212kDa) als auch die deglykosylierte Variante (128kDa) der
AC III im Gel lokalisiert ist.
Abb. 3. 10 Western Blot-Analyse von AC III (linker Blot) und Gα olf (rechter Blot) nach 2D-CTAB/ SDS-
PAGE. Es wurde jeweils 60µg Cilien-Protein aufgetragen. (Zahlen): Molekulargewichte in kDa; (1D, 2D): Die
Richtung der ersten und zweiten Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet. Verdünnungen der Antikörper: α-
AC III, 1: 100; α-rb IgG, 1: 30000; α-Gαs olf, 1: 2000; α-rb IgG, 1: 80000; Expositionsdauer der Membranen:
jeweils 15min.
Die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins wurde klar bei 44kDa nachgewiesen. Die
qualitativen Analysen der Präparation und der Trenntechnik konnten somit als
zufriedenstellend eingestuft werden. Für die massenspektrometrische Identifizierung der
Cilienproteine wurde erneut ein 2D-CTAB/ SDS-Gel angefertigt und anschließend colloidal
Coomassie gefärbt.
3 Ergebnisse
55
3.5 Massenspektrometrische Identifizierung und Charakterisierung der
Proteine
Die Proteine wurden für die massenspektrometrische Analyse mit dem Skalpell
ausgeschnitten. Um möglichst alle Proteine des Gels zu erfassen, wurden nicht einzelne
Proteinflecken ausgewählt, sondern ein Raster angefertigt, dessen Tetragone sich mit allen
gefärbten Bereichen des 2D-Gels deckten. Die Gelstückchen wurden einzeln zerkleinert und
in 0,5ml Eppendorf-Gefäße überführt. Die Proteine wurden anschließend entfärbt, reduziert,
alkyliert und schließlich tryptisch verdaut. Die Peptide befanden sich nach dem Verdau in der
Flüssigkeit, die die Gelstückchen umgibt und wurden bis zur Injektion in das HPLC-System
bei -20°C aufbewahrt. Die Injektion der Proben und die Kalibrierung des
ESI-Tandem-Spektrometers wurde von Herrn Dr. Uwe Warnken, Zentrale Proteinanalytik des
DKFZ (Deutsches Krebsforschungszentrum), Heidelberg durchgeführt. Von der HPLC-
Anlage aus gelangten die Peptide direkt in die ESI-Ionenquelle und von dort ionisiert in den
Analysatorteil des Tandem-Massenspektrometers (Abb. 1.9).
In Abbildung 3.11 ist das Raster auf dem letztlich für die MS-Analyse verwendeten 2D-Gel
dargestellt, das im Rahmen des Projekts von Herrn Ulrich Mayer angefertigt wurde. Das
Raster wurde von links oben nach rechts unten fortlaufend durchnummeriert.
Abb. 3.11 2D-CTAB/ SDS-Gel mit Raster (2D-CTAB/ SDS-Gel:
Ulrich Mayer). Die Tetragone des Rasters wurden nummeriert, um die
analysierten Proben ihrem Herkunftsort im Gel zuordnen zu können.
Es wurden 150µg Cilienproteine aufgetragen. (Zahlen): Molekular-
gewichte in kDa; (1D, 2D): Die Richtung der ersten und zweiten
Dimension ist durch Pfeile gekennzeichnet.
3 Ergebnisse
56
5252/21048/ =+=zm
3.5.1 Korrelation der MS/ MS-Daten mit den Peptidsequenzen aus
Datenbanken
Die Identifizierung der Proteine erfolgte durch den Vergleich der experimentell ermittelten
Peptid-Massen mit theoretischen Massen aus Protein-Datenbanken. Dazu wurde das speziell
auf die Datenbanksuche mit Peptidmassen ausgerichtete Programm „MASCOT“ verwendet.
Die MASCOT-Datenbankrecherche wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Uwe Warnken,
Zentrale Proteinanalytik, DKFZ, durchgeführt.
Die Analyse mit dem Tandem-Massenspektrometer lieferte zunächst zwei Arten von
Massenspektren (Abb. 3.12): Das im ersten Quadrupol des Massenanalysators generierte
Vorläufer-Ionen Spektrum (Precursor Ion Spectrum) eines Peptids und das Fragment-Ionen
Spektrum dieses Peptids.
Die Masse ist mit dem m/z-Quotienten über folgenden Zusammenhang korreliert: Ein
zweifach protoniertes (m=2u) Fragment mit der Masse m=1048u und der positiven Ladung
+2 erscheint im Spektrum bei
ESI-Ionenquellen in Kombination mit Tandem-Massenspektrometern liefern Spektren mit
einer Auflösung von +/- 0,1Da, das heißt selbst unterschiedliche Isotope eines Fragment-Ions
werden dargestellt. Zur Datenbank-Analyse wurde jeweils die monoisotopische Masse eines
Fragment-Ions verwendet (Abb. 3.13). In der Regel wurde diese durch den ersten Peak des
Abb. 3.12 Vorläufer-Ionen Spektrum (A) und zugehöriges Fragment-Ionen Spektrum (B) eines Peptids. (I):
Relative Intensität des Signals in %; die Intensität von 100% entspricht der relativen Intensität des größten
Peaks („Basispeak“); (m/z): Masse zu Ladungs-Quotient; (M+2H)2+
: Masse eines zweifach protonierten
Fragmentions; (y): Signale der y-Typ-Ionen (vgl Abb. 1.10). (verändert nach Chernushevich et al., 2001).
3 Ergebnisse
57
Isotopenspektrums reflektiert, sofern das Rauschen des Detektors (vergrößert dargestellt)
dessen Intensität nicht überdeckte.
Die Intenstät des Detektor-Rauschens ist abhängig von der Sensibilität des Digitalwandlers,
der die Stärke der durch das auftreffende Ion erzeugten Elektronenströme auf der
Mehrkanal-Platte in ein verwertbares digitales Signal verwandelt.
Die über ihren m/z-Wert errechneten monoisotopischen Massen der Fragment-Ionen wurden
direkt durch Verwendung des Programms MASCOT einer Datenbanksuche unterzogen. Das
Erscheinungsbild und Ausgabeformat der Ergebnisse einer solchen Datenbank-Recherche
wird im Folgenden an einem Beispiel erläutert:
Abb. 3.13 Isotopenspektrum eines Fragmentions. Jeder Peak reflektiert die
Masse dieses Fragmentions unter Berücksichtigung verschiedener
Kohlenstoff-Isotope. Zur Bestimmung der monoisotopischen Masse
verwendet man üblicherweise den ersten Peak des Spektrums, sofern dessen
Intensität nicht durch die Intensität des Detektor-Rauschens überdeckt wird.
In diesem Fall würde der größte monoisotopische Peak des Spektrums zur
Massenanalyse verwendet. (verändert nach Chernushevich et al., 2001).
3 Ergebnisse
58
3 Ergebnisse
59
)log(10 PScore ∗−=
Die Kopfzeilen im oberen Drittel des Formblatts enthalten Daten wie Benutzername und
interne Analysennummer, die es dem Anwender des Programms ermöglichen, eine Suche
eindeutig einer analysierten Probe zuzuordnen. Außerdem ist dort die der Suche zu Grunde
liegende Datenbank vermerkt, die der Benutzer bereits in den Voreinstellungen festlegt. In
unserem Fall wurde die Datenbank von NCBI (National Center for Biotechnology
Information, www.ncbi.nlm.nih.gov) verwendet. Im Vorfeld wurden außerdem nur solche
Ergebnisse zugelassen, die gemäß ihrer Herkunft aus der Ratte den Säugetieren zugeordnet
werden konnten (im Formular nicht ersichtlich). Die Option signifikante Treffer bereits in der
Kopfzeile einsehen zu können, wurde ebenfalls in Anspruch genommen.
MS/ MS-Daten liefern eine große Zahl an Spektren, deshalb ist es sinnvoll ein überschaubares
Ausgabeformat zu wählen, das dennoch vollständig ist. Es wurde die tabellarische Auflistung
von maximal 50 („Maximum number of hits“) gefundenen Massen und identifizierten
Peptiden („Peptide Summary Report“) pro Vorläufer-Ion gewählt, die das Programm den
Fragment-Ionen Spektren zuordnen konnte. Der Grad der Übereinstimmung der experimentell
ermittelten Peptidmassen mit den theoretischen Peptidmassen der Datenbank definiert in der
Massenspektrometrie einen als „Score“ bezeichneten Wert, der als Maß der Übereinstimmung
fungiert. Bei der MS/ MS trägt auch die Übereinstimmung des Fragment-Ionen Spektrums
mit dem Muster theoretischer Fragment-Ionen Spektren eines Vorläufer-Peptids gleicher
Masse zum Score der Peptide bei. Ein Score größer 30 (p<0,05) reflektiert mit hoher
Wahrscheinlichkeit die Identität oder starke Homologie des Peptids mit dem
Datenbank-Eintrag. Dieser Wert wurde mathematisch ermittelt und ergibt sich aus dem
einfachen Zusammenhang:
Wobei P die Wahrscheinlichkeit definiert, dass es sich bei der Übereinstimmung der
experimentell ermittelten Massen mit den theoretischen Massen um ein zufälliges Ereignis
handelt.
3 Ergebnisse
60
Im Vorfeld wurde die Option des „Standard-Scorings“ gewählt, das heißt es wurden auch
solche Ergebnisse bei der Ausgabe berücksichtigt, deren Score-Wert kleiner als 30 ist. Es
kann erst nach der Sichtung der tabellarischen Auflistung endgültig entschieden werden, ob
ein identifiziertes Peptid, das einen niedrigen Score erzielt hat, als nicht signifikant bewertet
werden muss.
Das im Beispiel aufgelistete Hitzeschockprotein hat in der Summe seiner Einzelscores einen
hohen Gesamt-Score von 677, obwohl einige der Peptide einen Score<30 erzielten. Die
m/z-Werte sind in der Spalte „observed“ dargestellt, die Spalte Mr (expt) enthält die
experimentell ermittelten Massen, Mr (calc) die theoretischen Massen der Peptide. Eine
Differenz „Delta“ von -0,01 bedeutet, dass die experimentell ermittelte Masse eines Peptids
0,01Da geringer ist als die theoretische Masse dieses Peptids. In der Spalte „Miss“ (missed
cleavage sites) ist die Zahl intakter tryptischer Spaltstellen vermerkt, „Expect“ („expectation“)
bezeichnet einen Erwartungswert der Übereinstimmung mit theoretischen Massen, der vom
generellen Auftreten dieser Aminosäure-Sequenz in Proteinen abhängt. Ein kleiner
„Expect“-Wert reflektiert eine hohe Signifikanz des Score-Werts.
3.5.2 Tabellarische Auflistung der Resultate
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind noch nicht alle 63 Einzel-Proben (Abb. 3.11)
massenspektrometrisch analysiert. Die tabellarische Auflistung der bisherigen Ergebnisse ist
deshalb exemplarisch. Die ermittelten Massen wurden bei der NCBI-Datenbanksuche von
MASCOT den Proteinen zugeordnet, die den signifikantesten Score erzielten.
Informationen, die notwendig waren um die Proteine tabellarisch zu kategorisieren, wurden
der Pfam-Datenbank (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml) und iHOP
(„Information Hyperlinked Over Proteins“, www.pdg.cnb.uam.es/UniPub/iHOP) entnommen.
Die Originaltabellen, wie sie von Herrn Dr. Uwe Warnken, Zentrale Proteinanalytik, DKFZ,
übergeben wurden, sind dem Anhang beigefügt und enthalten weitere Angaben, wie
isoelektrische Punkte (PI), Anzahl der analysierten Fragment-Ionen (n) und score-Werte.
Kategorie 1: Proteine mit Transmembran-Domänen, membran-assoziierte Proteine
Tetragon
Nr.
Protein
Nr.
Identifikations
Nr.
Masse
(Da) Protein-Information
1 3 gi6978743 56645 cytochrome P450, subfamily IIA (pheno-barbital-
inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus
norvegicus]
1 4 gi112467 S 60279 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat
1 13 gi55391497 56857 ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 2
[Mus musculus]
3 Ergebnisse
61
1 14 gi34856646 57538 PREDICTED: similar to Expressed sequence
AI505034 [Rattus norvegicus]
2 7 gi62652134 50688 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus
norvegicus]
2 12 gi60688595 63682 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus]
2 14 gi19924182 57012 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1)
[Rattus norvegicus]
2 15 gi51259250 56480 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus
norvegicus]
2 17 gi57732 49734 potential ligand-binding protein [Rattus rattus]
3 1 gi6978543 114293 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide
[Rattus norvegicus]
3 5 gi|34856103 134442 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus
norvegicus]
3 9 gi9506531 56195 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2
[Rattus norvegicus]
3 12 gi34880876 60761
PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline
monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-
containing
4 10 gi6978671 76584 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus]
4 11 gi30387859 44734 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus
norvegicus]
4 12 gi13928780 77313 P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattus
norvegicus]
4 15 gi16758174 60606 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus
norvegicus]
4 20 gi6978549 35610 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide
[Rattus norvegicus]
4 21 gi62641851 109846 PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alpha
subunit [Rattus norvegicus]
4 22 gi38303937 58150 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus]
4 33 gi38181831 52719 Ephx1 protein [Rattus norvegicus]
4 34 gi71911 Sc 40568 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain,
splice form alpha-2 [validated] - rat
6 2 gi57303 111093 sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattus
norvegicus]
6 3 gi8393755 121369 membrane bound C2 domain containing protein
[Rattus norvegicus]
6 6 gi23397411 59411 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1
[Rattus norvegicus]
6 10 gi4079645 47755 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus]
9 1 gi25282419 67612 calnexin [Rattus norvegicus]
9 5 gi62647031 95860 PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunit
a4 [Rattus norvegicus]
30 1 gi114523 58904 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor
30 2 gi8393322 57010 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus]
30 3 gi56899 62390 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus
norvegicus]
30 9 gi58865414 54468 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus]
30 10 gi23397411 59411 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1
[Rattus norvegicus]
30 14 gi6978813 47853 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus]
30 22 gi13929028 54503 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2
[Rattus norvegicus]
30 23 gi16758758 58206 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus]
30 25 gi220659 47668 dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattus
norvegicus]
30 26 gi55741424 51383 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1,
51kDa [Rattus norvegicus]
30 28 gi62664168 307188 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus
3 Ergebnisse
62
norvegicus]
30 31 gi62664021 86917 PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattus
norvegicus]
31 17 gi1408198 58059 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus]
31 18 gi6978847 60427 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus
norvegicus]
31 22 gi62654875 57215 PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattus
norvegicus]
31 40 gi54792127 56318 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1
complex, beta subunit [Rattus norvegicus]
32 10 gi117206 S 56240 Cytochrome P450 2B1 (CYPIIB1) (P450-B) (P450b)
(P450-PB1 and P450-PB2) (P450-LM2)
35 7 gi51948476 53500 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I
[Rattus norvegicus]
35 11 gi184268 50332 annexin A7 [Rattus norvegicus]
35 12 gi13929186 47543 flotillin 2 [Rattus norvegicus]
35 15 gi57539 47398 ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattus
rattus]
37 10 gi58865476 45207 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)
[Rattus norvegicus]
Tab. 3.1 Tabellarische Liste der bis dato MS-identifizierten Membranproteine. Aufgelistet wurden Proteine,
deren Sequenz mindestens einmal die Membran durchspannt und solche, die mit einem Lipidanker in der
Membran befestigt oder indirekt über nichtkovalente Wechselwirkungen mit anderen Membranproteinen mit der
Membran assoziiert sind.
Kategorie 2: Lösliche Proteine, Proteine des Cytoskeletts und der Extrazellulären
Matrix
Tetragon
Nr.
Protein
Nr.
Identifikations
Nr.
Masse
(Da) Protein-Information
1 1 gi11560133 50788 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus]
1 2 gi21245098 50711 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus]
1 5 gi71620 42066 actin beta - rat
1 7 gi45737866 56079 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor
[Rattus norvegicus]
1 9 gi62645766 36065 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-
like [Rattus norvegicus]
1 16 gi11693172 48137 calreticulin [Rattus norvegicus]
2 6 gi34856626 38067 PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattus
norvegicus]
2 9 gi587518 S 16950 keratin 18 [Rattus norvegicus]
2 18 gi19424338 51667 hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattus
norvegicus]
2 20 gi59808742 46632 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus]
3 3 gi|20302024 111448 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus]
3 5 gi34856103 134442 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus
norvegicus]
3 7 gi62641274 56609 PREDICTED: similar to Tu translation elongation
factor, mitochondrial [Rattus norvegicus]
3 19 gi56605938 47248 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic
reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus]
4 2 gi27465535 50095 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus]
4 14 gi62644345 41430 PREDICTED: similar to secretory protein precursor
[Rattus norvegicus]
4 18 gi|7437838 77149 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat
4 19 gi57012354 65190 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus]
3 Ergebnisse
63
4 27 gi11072106 50173 NEFA precursor [Rattus norvegicus]
4 30 gi420265 S 2891 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat
(fragment)
4 36 gi62660728 46453 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus]
4 37 gi1945471 38660 paraoxonase [Rattus norvegicus]
5 5 gi57114290 69484 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus]
5 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]
6 4 gi12018304 201240 KPL2 protein [Rattus norvegicus]
9 11 gi125296 S 42970 Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain)
(B-CK)
30 6 gi62078513 62399 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus]
30 7 gi6981324 57228 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus
norvegicus]
30 16 gi27465561 64287 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus]
30 18 gi38494348 54994 Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1
[Rattus norvegicus]
30 19 gi18266692 53069 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus]
30 20 gi54261608 32532 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus]
30 33 gi6678471 50612 tubulin, alpha 7 [Mus musculus]
31 11 gi13929028 54503 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2
[Rattus norvegicus]
31 23 gi14485281 55038 aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4
[Rattus norvegicus]
32 8 gi488838 S 47590 CaBP1 [Rattus norvegicus]
34 5 gi15805031 50460 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2
[Rattus norvegicus]
34 7 gi8393057 46602 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H,
member 1 [Rattus norvegicus]
34 11 gi62641274 56609 PREDICTED: similar to Tu translation elongation
factor, mitochondrial [Rattus norvegicus]
34 13 gi62656848 14811 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35
[Rattus norvegicus]
35 13 gi66730294 45666 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus]
35 14 gi62079055 51391 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus]
35 18 gi18543177 52176 citrate synthase [Rattus norvegicus]
37 7 gi58865778 49093 dolichyl-di-phosphooligosaccharide-protein
glycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus]
37 10 gi58865476 45207 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted)
[Rattus norvegicus]
Tab. 3.2 Liste der löslichen, extrazellulären und cytoskelettalen Proteine.
Kategorie 3: Proteine mit unbekannten Funktionen
Tetragon
Nr.
Protein
Nr.
Identifikations
Nr.
Masse
(Da) Protein-Information
1 10 gi38014578 50225 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus
norvegicus]
4 16 gi56737 Sc 95398 unnamed protein product [Rattus norvegicus]
4 29 gi56107 Sc 47428 unnamed protein product [Rattus norvegicus]
30 30 gi56198 61719 unnamed protein product [Rattus norvegicus]
Tab. 3.3 Auflistung von Proteinen, die noch nicht näher beschrieben oder unbekannt sind.
4 Diskussion
64
4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Methoden etabliert, die es in einem hohen Maß
ermöglichen, Membranproteine olfaktorischer Rezeptor-Neurone (ORN) für die
massenspektrometrische Analyse zu gewinnen. Durch die Optimierung bestehender
Protokolle zur Präparation von Cilien-Membranen konnte deren Ausbeute und somit indirekt
die Protein-Ausbeute wesentlich gesteigert werden. Anschließend wurde ein
zweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren angewandt, um die isolierten
Proteine möglichst quantitativ und in hoher Auflösung im Gel darzustellen.
Das Ablösen ciliärer Membranen von den dendritischen Knöpfen der ORNs wurde durch die
etablierte Calcium-Schock Methode (Gibbons, 1967) erreicht. Es ist allerdings bis heute
unbekannt, wie Calcium-Ionen (Ca2+
) den Zusammenbruch des tubulären Systems bewirken.
Es ist ebenfalls umstritten, ob die Anwendung dieses Verfahrens die calcium-sensitiven
Signaltransduktions-Prozesse im Bereich der Cilien wesentlich beeinflusst und deshalb für
physiologische Untersuchungen ungeeignet ist (Washburn et al., 2002). Biochemische
Untersuchungen bleiben durch den Einsatz von Ca2+
jedoch unbeeinflusst.
Für die Isolation ciliärer Membranen mit dem Ziel, Membranproteine für weiterführende
Experimente möglichst quantitativ zu gewinnen, wurde diese Methode in modifizierter Form
mit Erfolg eingesetzt. Die Riechepithelien mussten während des Calcium-Schocks im
Schnappdeckel-Glas gerührt werden. Möglicherweise wirken sich die dabei entstehenden
Scherkräfte positiv auf den Zusammenbruch der ciliären Struktur aus. Bei der sequentiellen
Zentrifugation konnte im Anschluß das Verschwinden der gelblichen Cilien-Membranen am
äußeren Rand des decilierten Epithels beobachtet werden. Durch den Einsatz der
sequentiellen Zentrifugation anstelle eines einzelnen Zentrifugationsschrittes, konnte die
Ausbeute an Cilien-Membranen zwar deutlich gesteigert werden, aber möglicherweise
wurden durch die zweimalige zusätzliche Resuspendierung des Gewebes, neben den
Cilien-Membranen auch andere Membranen, lösliche Proteine oder sogar Organellen in den
Überstand gebracht. Die anschließende Anreicherung der Cilien-Membranen durch
Anwendung des Saccharose-Stufengradienten ist deshalb auch als Reinigungsschritt zu
betrachten.
Die cilien-spezifischen Transduktionsmoleküle AC III, Gαolf , CNG-A2 und CNG-A4 wurden
als Marker verwendet, deren immunologischer Nachweis in der Präparation als positiv
4 Diskussion
65
bezüglich der Isolations-Methode zu bewerten ist. Dazu wurden die Proteine eindimensional
durch SDS-PAGE getrennt und auf PVDF-Membranen transferiert. CNG-A2 und CNG-A4
stellen dabei zwei von insgesamt drei verschiedenen Untereinheiten des CNG-Kanals dar
(Dhallan et al., 1990; Goulding et al., 1992; Bradley et al., 1994, 2001; Liman und Buck,
1994; Sautter et al., 1998; Bönigk et al., 1999; Munger et al., 2001; Zheng et al., 2004), der
als Tetramer, bestehend aus zwei CNG-A2, CNG-A4 und CNG-B1b, in der Cilienmembran
eine zentrale Pore formt, durch die nach Bindung von cAMP hauptsächlich Ca2+
einströmt
(Dzeja et al., 1999). Die Markerproteine eigneten sich in zweifacher Hinsicht zur
Durchführung der Qualitätskontrolle: Sie sind die maßgeblichen Komponenten der
olfaktorischen Signaltransduktion und werden deshalb hauptsächlich in den Cilien exprimiert.
Bei den CNG-Untereinheiten handelt es sich außerdem um Membranproteine, deren
Anwesenheit in der Präparation neben der Proteinbestimmung zusätzlich als Maßstab dafür
diente, ob Membranen beziehungsweise Membranproteine in ausreichender Menge durch die
Methode erfasst werden.
Diese Aussage gilt ensprechend auch für die AC III. Zusätzlich wurde Gαolf als
membran-assoziiertes Protein der Signaltransduktionskaskade nachgewiesen. Damit ist auch
gezeigt, dass unter den gegebenen Präparationsbedingungen Membrankomplexe zunächst
erhalten bleiben.
AC III und Gαolf zeigten an dieser Stelle bei der Western Blot-Analyse allerdings deutlich
stärkere Signale als CNG-A2 und CNG-A4. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen,
dass den Proteinen AC III und Gαolf bei der olfaktorischen Signaltransduktion direkt eine
verstärkende Funktion des Rezeptorsignals zugesprochen wird (Jones und Randall, 1989).
CNG-Kanäle verstärken das Signal nur indirekt über den Anstieg von [Ca2+
]i, welche die
Öffnung Ca2+
-aktivierter Chlorid-Kanäle bewirkt. Sie sind deshalb möglicherweise weniger
stark in Cilien exprimiert als AC III und Gαolf. Möglich ist aber auch die größere Affinität der
Erst-Antikörper gegen AC III und Gαolf im Vergleich zu den CNG-Antikörpern.. Diese Frage
kann jedoch letztlich nur durch eine vergleichende Expressions-Analyse beantwortet werden.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Präparationstechnik wurde mit dem Ziel entwickelt, ciliäre
Membranproteine zweidimensional durch Gelelektrophorese zu trennen. Diese Trenntechnik
sollte so optimiert werden, dass es im Anschluß möglich war, die im 2D-Gel dargestellten
Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Diese Strategie entspricht der heute am
häufigsten angewandten methodischen Vorgehensweise zur Analyse komplexer
Protein-Gemische. Als zweidimensionales Trenn-Verfahren dient üblicherweise die
4 Diskussion
66
isoelektrische Fokussierung (IEF) der Proteine (O´Farrell, 1975) in der ersten Dimension,
gefolgt von der klassischen SDS-PAGE in der zweiten Dimension (IEF/ 2D-SDS-PAGE). Die
Einführung dieser Methode in die Protein-Analytik ermöglichte erstmals die Darstellung von
bis zu 10 000 Proteinen in einem Gel (Übersicht: Westermeier, 2002). Dies entspricht einer
100fach höheren Trenn-Kapazität als bei der eindimensionalen SDS-PAGE, die im Gegensatz
zur IEF/ 2D-SDS-PAGE auch nicht geeignet ist, leicht unterschiedliche Modifikationen eines
Proteins aufzulösen. So kann zum Beispiel in einer vergleichenden Proteom-Studie nur durch
Anwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE das veränderte Expressionsmuster einer krankhaft
veränderten Zelle im Vergleich zu einer gesunden Zelle im Gel dargestellt werden.
Obwohl die IEF/ 2D-SDS-PAGE in weiten Bereichen der Forschung seit Jahren erfolgreich
angewendet wird, ist es trotzdem nie gelungen, diese Technik so zu optimieren, dass auch
Membranproteine zuverlässig dargestellt werden konnten (Rais et al., 2004). Ursache dafür
sind zwei generelle Eigenschaften der Membranproteine: Die Hydrophobizität ihrer
transmembranen Regionen und die Basizität der außerhalb dieser Regionen liegenden
Bereiche (Lehner et al., 2003). Membranproteine lassen sich deshalb nur schwer in gängigen
Puffersystemen lösen und präzipitieren häufig an ihrem isoelektrischen Punkt (Patton, 1999).
Ansätze, die in der Vergangenheit eine verbesserte Löslichkeit der Membranproteine während
der isoelektrischen Fokussierung anstrebten, beruhen hauptsächlich auf der Zugabe
zwitterionischer Detergenzien, wie CHAPS (Chevallet et al., 1998), chaotroper Substanzen,
wie Rhodanidsalz, Harnstoff und Thioharnstoff (Rabilloud, 1996; Rabilloud, 1998) oder
verschiedener anderer Detergenzien. Eine verbesserte Zugänglichkeit der Membranproteine
für die IEF/ 2D-SDS-PAGE konnte nur im Einzelfall erreicht werden und ist nie auf alle
Membranproteine einer Probe gleichermaßen anwendbar. Die Kombination und der Einsatz
dieser Substanzen ist außerdem nur begrenzt möglich, so fallen beispielsweise nicht-ionische
Detergenzien bei Zugabe von Guanidinchlorid aus (Rehm, 2004) oder Membranproteine
werden durch den Einsatz großer Harnstoff/ Thioharnstoff-Mengen irreversibel modifiziert.
Hohe Salzkonzentrationen stören außerdem die Trenn-Eigenschaften des Systems erheblich
und können Proteine stark denaturieren.
Die meisten Membranproteine, insbesondere stark basische, tauchen deshalb nach der
isoelektrischen Fokussierung im 2D-SDS-Gel nicht auf (Rais et al., 2004).
Für die Etablierung einer zweidimensionalen gelelektrophoretischen Methode zur Trennung
der ciliären Membranproteine wurde deshalb die 2D-CTAB/ SDS-PAGE (Navarre et al.,
2002) eingesetzt, ein Verfahren, das sich bezüglich seiner physikalisch-chemischen
4 Diskussion
67
Eigenschaften wesentlich von der IEF/ 2D-SDS-PAGE unterscheidet. Die Proteine werden
bei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE in beiden Dimensionen auf Grund ihrer Molekulargewichte
getrennt. Zwei wichtige Aspekte machen diese Methode besonders geeignet um
Membranproteine darzustellen: Die Verwendung des kationischen Detergenz
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), das auf Grund seiner positiven Ladung die
gleichfalls positiven Ladungen basischer Regionen der Membranproteine stabilisiert, diese
deshalb in Lösung hält und gleichzeitig benachbarte Phospholipide (das ursprüngliche
„Lösemittel“) verdrängt. Außerdem bewirkt der saure pH-Wert des Probenpuffers, dass
lösliche Proteine mit „sauren“ isoelektrischen Punkten, noch vor dem Auftragen der Probe
abgetrennt werden.
Eine Reduktion der Komplexität der Protein-Zusammensetzung war aus mehreren Gründen
wünschenswert. Durch die Präparation allein konnte diese zugunsten der Ausbeute nicht
erreicht werden. Dies wurde durch den eindimensionalen gelelektrophoretischen Vergleich
der Cilienproteine mit Proteinen des olfaktorischen Gesamtepithels gezeigt (Abb. 3.2) und im
Anschluss durch Western Blot-Analyse zum Nachweis nicht-ciliärer Markerproteine bestätigt
(Abb. 3.6). Man konnte also davon ausgehen, dass auch lösliche Proteine in der
Cilien-Präparation noch vorhanden sind. Diese sind im Gegensatz zu den Membranproteinen
besser in pH-neutralen Puffern, wie sie beispielsweise bei der IEF/ 2D-SDS-PAGE eingesetzt
werden, löslich und wandern deshalb zu Beginn der Elektrophorese bevorzugt in das Gel der
ersten Dimension. Die hydrophoben und deshalb schlechter löslichen Membranproteine
hingegen aggregieren und präzipitieren in der Probentasche. Ein weiterer Punkt ist, dass bei
der 2D-CTAB/ SDS-PAGE die Trenn-Kapazität im Vergleich zur IEF/ 2D-SDS-PAGE
deutlich reduziert ist, da die Proteine nur auf einer Diagonalen dargestellt werden können.
Aus diesen Gründen begünstigt das Abtrennen löslicher Proteine bei der
2D-CTAB/ SDS-PAGE die Darstellung von Membranproteinen. Eine andere Methode, die
nach den gleichen Prinzipien die Trennung von Membranproteinen ermöglicht, ist die
ebenfalls angewandte 16-BAC/ SDS-PAGE (Hartinger et al., 1996; Dreger et al., 2005).
Diese wurde im Rahmen dieser Arbeit getestet (nicht dargestellt), erzielte aber im Vergleich
zur 2D-CTAB/ SDS-PAGE eine wesentlich schlechtere Auflösung.
Das 2D-CTAB/ SDS-Gel konnte im weiteren Verlauf dieser Arbeit für die
massenspektrometrische Analyse in mehrerer Hinsicht erfolgreich optimiert werden. Die stark
Hintergrund-lastige Silberfärbung wurde durch die colloidal Coomassie-Färbung ersetzt,
welche zudem für die MS-Analyse besser geeignet ist. Die Proben wurden außerdem zur
4 Diskussion
68
Schärfung des Proteinmusters deglykosyliert und Nuclease-behandelt. Dies erzielte in
Kombination mit einer geeigneten Probenmenge eine optimale Auflösung und das horizontale
streaking, häufig eine Folge von Nukleinsäure-Verunreinigungen oder zu hohen
Probenmengen, konnte reduziert werden.
Die Protein-Identität bei Anwendung dieser Trenn-Technik wurde nachfolgend auf zwei
Ebenen überprüft: Durch Western Blot-Analyse der Markerproteine AC III, Gαolf , CNG-A2
und CNG-A4 und letztlich durch die massenspektrometrische Identifizierung
cilienspezifischer Proteine.
Nach der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten erneut alle ciliären Markerproteine detektiert
werden. Interessant ist hier, dass im Gegensatz zur eindimensionalen SDS-PAGE auch die
unglykosylierte Variante der CNG-A2-Untereinheit bei 76kDa nachgewiesen wurde (Abb.
3.9, links), obwohl die Proben für Gele zur anschließenden Western Blot-Analyse nicht
deglykosyliert wurden. Da Glykoside die Löslichkeit eines Proteins erhöhen, ist die
nicht-glykosylierte Variante mit hoher Wahrscheinlichkeit im SDS-Probenpuffer unlöslich
und kann deshalb nach der 1D-SDS-PAGE nicht detektiert werden.
Im Gegensatz dazu konnte von der AC III nur das häufig auftretende Abbauprodukt (vgl.
Bönigk et al., 1999) bei 72kDa nachgewiesen werden. Hierfür können mehrere Ursachen
verantwortlich sein: Hochmolekulare Varianten der AC III sind im CTAB-Probenpuffer
unlöslich, Degradation durch Proteasen, Verlust des Proteins während der Äquilibrierung im
SDS-Lyse Puffer oder eine mangelhafte Äquilibrierung. Eine Degradation durch Proteasen ist
unwahrscheinlich, da durch den konsequenten Einsatz von Inhibitoren viele Proteasen noch
während der Präparation irreversibel gehemmt wurden und alle anderen Markerproteine
eindeutig detektiert werden konnten. Der Verlust von kleineren Proteinen durch Auswaschen
während der Äquilibrierung ist sowohl bei der 2D-CTAB/ SDS-PAGE als auch bei der
IEF/ 2D-SDS-PAGE möglich (Berkelman et al., 2000), aber bei großen Proteinen wie der
AC III eher unwahrscheinlich. Eine mangelhafte Äquilibrierung deckt sich mit dem Auftreten
des vertikalen streakings im höhermolekularen Bereich des 2D-Gels (Abb. 3.8). Proteine, die
nicht ausreichend äquilibriert werden, tragen entweder einen Überschuß an positiver Ladung
durch das CTAB der ersten Dimension oder werden nur uneinheitlich durch SDS mit einer
negativen Ladung versehen. Ersteres führt dazu, dass die Proteine in der zweiten Dimension
nicht in das Gel, sondern aus ihm heraus in den Elektrodenpuffer wandern. Dies würde
erklären, warum die üblicherweise glykosylierte Variante der AC III nicht nachgewiesen
wurde. Bei ungleicher negativer Ladung wandern gleiche Proteine verschieden weit in das
4 Diskussion
69
Gel und hinterlassen vertikale Spuren, die nach der Färbung sichtbar werden. Die Dauer der
Äquilibrierung kann jedoch nicht beliebig ausgedehnt werden, da kleine Moleküle sonst
ausgewaschen würden. Zusammenfassend lässt sich an dieser Stelle sagen, dass die
Äquilibrierung einen kritischen Schritt zweidimensionaler gelelektrophoretischer
Trenn-Verfahren darstellt, dass dabei aber mögliche Verluste durch die höhere
Trenn-Kapazität toleriert werden können.
Das Ziel bei der Präparation ciliärer Membranen und der Etablierung der
2D-CTAB/ SDS-PAGE war die hochauflösende, aber auch quantitative Darstellung ciliärer
Membranproteine für die massenspektrometrische Analyse. Ob das Detergenz CTAB in
Verbindung mit Harnstoff geeignet ist um hauptsächlich Membranproteine zu lösen und ob
durch die Präparationstechnik überwiegend ciliäre Membranen isoliert werden konnten, kann
schließlich eindeutig nur durch die massenspektrometrische Identifizierung der im 2D-Gel
dargestellten Proteine beantwortet werden.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind etwa ein Viertel der Proben analysiert worden. Die
Diskussion der Ergebnisse muss deshalb exemplarisch bleiben. Die NCBI-Daten wurden mit
Hilfe von Datenbanken zunächst in drei Kategorien eingeteilt. Dabei konnten 50 der 99
Proteine beziehungsweise Protein-Untereinheiten als Membranproteine oder
membranassoziierte Proteine identifiziert werden. Ein nicht unerheblicher Anteil dieser
Proteine besitzt einen theoretisch ermittelten isoelektrischen Punkt (PI, siehe Anhang), der
weit im Basischen liegt. Offensichtlich konnten also durch die 2D-CTAB/ SDS-PAGE auch
stark basische Proteine dargestellt werden. 45 der 99 Proteine konnten löslichen,
cytoskelettalen oder Matrix-Proteinen zugeordnet werden. 4 der 99 Proteine wurden als
unbekannt oder unbenannt deklariert und entsprechend eingeordnet.
Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse zeigen, dass die Trenn-Methodik der
2D-CTAB/ SDS-PAGE in hohem Maße geeignet ist, Membranproteine darzustellen. Über
50% der identifizierten Proteine konnten dieser Kategorie zugeordnet werden. Unter diese
Kategorie fällt auch die α-Untereinheit des olfaktorischen G-Proteins und ihre Spleiß-Variante
α2. Auch die CNG-A2-Untereinheit des CNG-Kanals wurde identifiziert, deren glykosylierte
Variante im analysierten Bereich des A-Feldes (Abb. 3.11) lokalisiert ist. Offensichtlich
konnte durch die PNGaseF-Behandlung der Proben keine vollständige Deglykosylierung
erreicht werden.
CNG-A4 und das Abbauprodukt der AC III liegen im 2D-Gel außerhalb der bisher
analysierten Regionen und wurden deshalb erwartungsgemäß noch nicht nachgewiesen. Dies
4 Diskussion
70
gilt auch für die höhermolekulare Form der AC III. Deren unglykosylierte Variante liegt mit
einem Molekulargewicht von etwa 128kDa allerdings innerhalb der analysierten Region.
Dieses Ergebnis deckt sich mit der Hypothese, dass AC III beim Übergang von der ersten in
die zweite Dimension der 2D-CTAB/ SDS-PAGE möglicherweise nur unzureichend
äquilibriert wurde.
Es würde im Rahmen dieser Arbeit zu weit führen, jedes Protein, das massenspektrometrisch
analysiert wurde, im Einzelnen zu diskutieren. Deshalb werden die Ergebnisse im Folgenden
so zusammengefasst, dass eine Aussage über die Qualität der Präparations- und Trenntechnik
getroffen werden kann.
Unter den Proteinen der Kategorie 1 und 2 (vgl. Tab. 1 und 2) befindet sich eine auffallend
hohe Zahl von Enzymen, die am Duftstoffwechsel und an der Verstoffwechslung toxischer
Substanzen beteiligt sind (so genannte xenobiotic metabolizing enzymes). Darunter befinden
sich auch solche, deren verminderte Expression im Alter, mit neurodegenerativen
Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden (siehe z.B. Poon et al., 2005). Einige
dieser Enzyme sind in den ER- oder Mitochondrien-Membranen der Stützzellen lokalisiert.
Andere werden in den olfaktorischen Mukus sezerniert. So wurden beispielsweise unter den
Membranproteinen mehrere Isoformen des Cytochroms P450 identifiziert. Nach der Leber ist
das olfaktorische Epithel das Gewebe mit der zweithöchsten Cytochrom P450-Konzentration
(Hines et al., 2001). Die bräunliche Farbe des Epithels ist somit sicherlich auf die
Häm-Gruppe der Cytochrome zurückzuführen und möglicherweise ist die gelbliche Färbung
des Cilien-Rings (Abb. 3.1) ein Zeichen für Verunreinigungen durch Cytochrom P450-haltige
Membranen.
Andere Enzyme, die massenspektrometrisch identifiziert wurden und zur Gruppe der
xenobiotic metabolizing enzymes gehören, sind: Epoxid-Hydrolase, UDP-
Glucuronyltransferase, Isoformen der Aldehyd-Dehydrogenasen, Isoformen der FAD-
Monooxygenasen und Hydroxyacyl-Dehydrogenase.
Ebenfalls zu Proteinen der Kategorie 1 und 2 gehören Calcium-Bindeproteine, wie Calnexin,
CaBP1 und Calreticulin, das beispielsweise im ER-Lumen lokalisiert ist und
Calcium-abhängige Proteine wie der Nodal modulator 1, Annexin A11 der äußeren Membran
und Annexin A7, eine Calcium-abhängige GTPase.
Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch eine Reihe von
Transportproteinen, wie zum Beispiel die H+-ATPase der Lysosomen und die Na
+/K
+-ATPase
der Plasmamembran. Hierzu zählt auch die ATP-Synthase der inneren
4 Diskussion
71
Mitochondrienmembran, die zusammen mit Ubiquinon zusätzlich als Beispiel für ein Protein
des Energiestoffwechsels dient.
Von den 99 Proteinen wurden vier als unbekannt beziehungsweise unbenannt deklariert.
Durch die Suche nach homologen Sequenzen in Datenbanken konnten drei dieser Proteine mit
hoher Wahrscheinlichkeit identifiziert werden. Es handelt sich dabei um das Tubulin β2
(gi38014578), die α-Kette von Enolase1 (gi56107 Sc) und die Glutamat Dehydrogenase 1
(gi56198). Für das Protein gi56737 konnten keine Homologien zu bekannten Proteinen
gefunden werden. Zukünftige Experimente, wie die heterologe Expression oder die
subzelluläre Lokalisierung durch Antikörper, können helfen, die Funktion dieses Proteins
aufzuklären.
Nach Auswertung aller Daten sollte es im Anschluss möglich sein, weitere Proteine der
Signaltransduktion in den Cilien der olfaktorischen Rezeptor-Neurone zu charakterisieren und
ein verfeinertes Bild dieser Prozesse zu entwerfen. Dies gilt vor allem für den molekular
bisher noch nicht identifizierten Ca2+
-aktivierten Chlorid-Kanal (Frings, 1999; Eggermont,
2003).
Ausgehend von der Tatsache, dass die exemplarische Diskussion der bisherigen MS-Analyse
als repräsentativ für die noch ausstehenden Ergebnisse anzusehen ist, kann an dieser Stelle
abschließend gesagt werden, dass durch die Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE erreicht
wurde, dass mehrheitlich Membranproteine im 2D-Gel dargestellt werden konnten. Eine
solche Dimension konnte durch die Anwendung der IEF/ 2D-SDS-PAGE bisher noch nicht
erreicht werden. Unter den identifizierten Membranproteinen befinden sich auch solche, deren
theoretisch ermittelte isoelektrische Punkte weit im Basischen liegen. Es konnte also ein
zweidimensionales gelelektrophoretisches Trenn-Verfahren etabliert werden, mit dem auch
basische Proteine im Gel dargestellt werden können.
Die Identifikation ciliärer Marker-Proteine beweist zudem, dass die angewandte
Präparationstechnik durchaus geeignet ist um Cilien-Membranen zu gewinnen, allerdings
waren darin auch Proteine anderer Herkunftsmembranen enthalten. Durch
Datenbank-Recherche allein kann jedoch nicht in jedem Fall eine genaue Aussage über die
zelluläre und subzelluläre Herkunft eines Proteins getroffen werden, da sich die
Datenbank-Beschreibungen oft nicht auf Proteine identischer Gewebe beziehen.
Eine Verunreinigung der Präparation durch lösliche oder cytoskelettale Proteine konnte nicht
vollkommen unterdrückt werden. Da Cilien-Strukturen aber im Wesentlichen durch ein
4 Diskussion
72
Mikrotubuli-Gerüst aufrecht erhalten werden, muss die Präsenz tubulärer Proteine immer
toleriert werden.
Eine Verbesserung der Reinheit der Präparation könnte zukünftig durch die zusätzliche
Anwendung eines kontinuierlichen Saccharose-Gradienten erreicht werden. Damit würden
zum Beispiel Mitochondrien, deren Membranen zu einem nicht unerheblichen Anteil für die
Verunreinigung der Präparation verantwortlich sind, im Vorfeld abgetrennt werden. Von
Vorteil wäre außerdem, dass die Komplexität der Probe weiter reduziert werden könnte.
Neuere Untersuchungen zur olfaktorischen Signaltransduktion zeigten, dass die Mehrzahl der
Prozesse von Ca2+
/ Calmodulin vermittelt werden. Dies gilt für die Aktivierung der
Ca2+
/ Calmodulin-abhängigen Phosphodiesterase (Borisy et al., 1992; Yan et al., 1995) und
der CaM-Kinase II und für die Regulation durch Bindung der CNG-Kanäle (Chen und Yau,
1994; Liu et al., 1994; Balasubramanian et al., 1996; Frings et al., 1999; Bradley et al., 2004).
Für den Ca2+
-aktivierten Chlorid-Kanal ist die Ca2+
/ Calmodulin-vermittelte Regulation noch
hypothetisch (Kaneko, H., unveröffentlicht). Ein vielversprechender Ansatz zur spezifischen
Anreicherung von Proteinen der Signaltransduktion ist deshalb eine Vorreinigung durch
Calmodulin-Affinitäts-Chromatographie.
5 Zusammenfassung
73
5 Zusammenfassung
Der Prozess der olfaktorischen Signaltransduktion bei Säugetieren ist in seinen Abläufen
bereits gut verstanden (Firestein, 2001). Dennoch konnten bisher noch nicht alle molekularen
Details der Komponenten identifiziert werden. Dies gilt im Besonderen für den
Ca2+
-aktivierten Chlorid-Kanal, der den Hauptteil der Erregungsbildung in Riechneuronen
trägt. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb ein geeignetes Verfahren zu entwickeln, durch das
neue Kandidaten der Signaltransduktionskaskade massenspektrometrisch identifiziert werden
können. Diese sind hauptsächlich in den Cilienmembranen olfaktorischer Rezeptor-Neurone
lokalisiert und es wurde deshalb eine Präparationstechnik auf Basis der Calcium-
Schock-Methode etabliert, mit der die Cilienmembranen der Riechsinneszellen vom
olfaktorischen Gesamtepithel isoliert werden konnten. Die Präsenz cilien-spezifischer
Markerproteine in der Präparation wurde nach eindimensionaler Gelelektrophorese durch
Western Blot-Analyse bestätigt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Präparationsmethode
geeignet ist um Proteine der Signaltransduktion für zukünftige Experimente zu gewinnen.
Durch Anwendung der 2D-CTAB/ SDS-PAGE konnten die ciliären Membranproteine
anschließend quantitativ und mit guter Auflösung im 2D-Gel dargestellt werden. CTAB ist als
kationisches Detergenz geeignet selbst die hydrophoben und somit schwerlöslichen
Membranproteine zu lösen. Dies wurde durch den immunologischen Nachweis der ciliären
Markerproteine erneut bewiesen und durch die Ergebnisse der MS-Analyse bestätigt.
Für die massenspektrometrische Identifizierung wurde ein Nano-ESI MS/ MS-Gerät mit
vorgeschalteter HPLC-Anlage verwendet. Mit dieser Anordnung konnten aus komplexen
Protein-Proben geringe Mengen eines Proteins analysiert werden. Neben ciliären
Membranproteinen wurden auch Proteine innerer Membranen, lösliche Proteine,
cytoskelettale Proteine und Proteine der extrazellulären Matrix identifiziert. Darunter befindet
sich auch ein Protein, dem bisher noch keine Funktion zugeordnet werden konnte.
Möglicherweise handelt es sich hier um eines der bisher noch nicht näher molekular
charakterisierten Proteine der olfaktorischen Signaltransduktion.
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A Anhang
83
A Anhang
UM1031_1
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 178 62 0 gi|21245098 50711; 4.88 tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 93 23 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 35 44 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 30 35 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 28 1
UM1031_2
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 243 92 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 390 143 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 76 24 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 41 55 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 38 2
UM1031_3
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 321 92 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 158 73 0 gi|20302024 111448 5.11 hypoxia up-regulated 1 [Rattus norvegicus] 133 64 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 86 55 0 gi|34856103 134442 5.73 PREDICTED: similar to Nodal modulator 1 [Rattus norvegicus] 78 46 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 37 27 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 37 28 0 gi|57429 Sc 50387; 4.79 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 28 29 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 82 1
A Anhang
84
UM1031_4
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 876 232 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 591 193 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]430 164 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 421 135 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 390 146 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 331 107 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 257 108 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 237 109 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 234 9
10 0 gi|6978671 76584; 6.25 cyclic nucleotide gated channel 4 [Rattus norvegicus] 192 811 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 154 312 0 gi|13928780 77313; 5.30 P450 (cytochrome) oxidoreductase [Rattus norvegicus] 98 413 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 71 314 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 68 215 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 61 116 0 gi|56737 Sc 95398; 4.83 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 57 217 0 gi|984553 S 38167; 5.47 G protein beta 1 subunit [Rattus norvegicus] 49 218 0 gi|7437838 77149; 7.44 long-chain-fatty-acid-CoA ligase (EC 6.2.1.3) - rat 44 119 0 gi|57012354 65190; 8.00 type II keratin Kb1 [Rattus norvegicus] 39 120 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 39 1
UM1031_4ff
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62641851 109846 5.76 PREDICTED: similar to alpha glucosidase II, alpha subunit [Rattus norvegicus] 35 12 0 gi|38303937 58150; 5.19 Slc3a2 protein [Rattus norvegicus] 31 1
A Anhang
85
UM1031_5
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|62665247 50842; 4.82 PREDICTED: tubulin, beta 3 [Rattus norvegicus] 213 72 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 160 83 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 75 44 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 49 15 0 gi|57114290 69484; 7.58 type II keratin Kb2 [Rattus norvegicus] 40 1
UM1031_6
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978543 114293 5.30 ATPase, Na+/K+ transporting, alpha 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 185 92 0 gi|57303 Sc 111093 5.27 sarcoplasmic reticulum 2+-Ca-ATPase [Rattus norvegicus] 146 73 0 gi|8393755 121369 5.47 membrane bound C2 domain containing protein [Rattus norvegicus] 48 14 0 gi|12018304 201240 5.55 KPL2 protein [Rattus norvegicus] 46 1
UM1031_9
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|25282419 67612; 4.49 calnexin [Rattus norvegicus] 246 132 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 98 33 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 82 24 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 70 65 0 gi|62647031 95860; 5.93 PREDICTED: similar to H-ATPase accessory subunit a4 [Rattus norvegicus] 62 26 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 37 37 0 gi|62644345 41430; 5.79 PREDICTED: similar to secretory protein precursor [Rattus norvegicus] 34 2
A Anhang
86
UM1031_30
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 882 192 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 874 213 0 gi|56899 Sc 62390; 6.34 precursor polypeptide (AA -18 to 547) [Rattus norvegicus] 569 144 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 535 175 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 522 136 0 gi|62078513 62399; 5.90 carboxylesterase-like [Rattus norvegicus] 460 97 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 360 118 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 258 79 0 gi|58865414 54468; 7.53 annexin A11 (predicted) [Rattus norvegicus] 221 5
10 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 209 611 0 gi|16758174 60606; 8.44 flavin containing monooxygenase 3 [Rattus norvegicus] 190 612 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing142 313 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 137 414 0 gi|6978813 47853; 8.62 epoxide hydrolase 1 [Rattus norvegicus] 126 515 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 125 416 0 gi|27465561 64287; 9.26 sphingosine phosphate lyase 1 [Rattus norvegicus] 123 517 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus] 96 418 0 gi|38494348 54994; 7.94 Aldehyde dehydrogenase family 1, member A1 [Rattus norvegicus] 95 219 0 gi|18266692 53069; 6.10 selenium binding protein 2 [Rattus norvegicus] 80 320 0 gi|54261608 32532; 5.92 Ugp2_predicted protein [Rattus norvegicus] 76 2
A Anhang
87
UM1031_30ff
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|55391497 56857; 5.57 ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 2 [Mus musculus] 75 42 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 71 13 0 gi|16758758 58206; 5.92 lectin, mannose-binding, 1 [Rattus norvegicus] 66 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 59 15 0 gi|220659 S 47668; 8.17 dihydrolipoamide succinyltransferase [Rattus norvegicus] 56 16 0 gi|55741424 51383; 8.37 NADH dehydrogenase (ubiquinone) flavoprotein 1, 51kDa [Rattus norvegicus] 47 17 0 gi|11072106 50173; 5.02 NEFA precursor [Rattus norvegicus] 46 18 0 gi|62664168 307188 8.65 PREDICTED: similar to myosin-VIIb [Rattus norvegicus] 42 29 0 gi|60688595 63682; 8.50 HLA-B associated transcript 5 [Rattus norvegicus] 41 1
10 0 gi|56198 Sc 61719; 8.05 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 39 311 0 gi|62664021 86917; 5.54 PREDICTED: similar to collectin placenta 1 [Rattus norvegicus] 37 112 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 36 113 0 gi|6678471 50612; 4.97 tubulin, alpha 7 [Mus musculus] 34 114 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 34 1
A Anhang
88
UM1031_31
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 1090 262 0 gi|6981324 57228; 4.82 prolyl 4-hydroxylase, beta polypeptide [Rattus norvegicus] 988 213 0 gi|114523 S 58904; 9.22 ATP synthase alpha chain, mitochondrial precursor 986 194 0 gi|117148 S 58599; 8.99 Cytochrome P450 1A2 (CYPIA2) (P450-D) (P-448) 689 155 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 623 146 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]561 167 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 560 118 0 gi|34856315 57214; 5.24 PREDICTED: similar to ATPase, H+ transporting, V1 subunit B, isoform 1 [Rattus norvegicus] 497 109 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing481 11
10 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 446 1011 0 gi|13929028 54503; 7.56 aldehyde dehydrogenase family 3, subfamily A2 [Rattus norvegicus] 399 1012 0 gi|56107 Sc 47428; 6.16 unnamed protein product [Rattus norvegicus] 304 613 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 300 614 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 267 815 0 gi|23397411 59411; 8.86 cytochrome P450, family 4, subfamily b, polypeptide 1 [Rattus norvegicus] 252 616 0 gi|8393322 57010; 5.88 glucose regulated protein, 58 kDa [Rattus norvegicus] 248 617 0 gi|1408198 58059; 8.93 cytochrome P450olf3 [Rattus norvegicus] 187 618 0 gi|6978847 60427; 8.66 flavin containing monooxygenase 1 [Rattus norvegicus] 160 419 0 gi|11693172 48137; 4.33 calreticulin [Rattus norvegicus] 95 320 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 93 2
UM1031_ff
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 90 22 0 gi|62654875 57215; 9.31 PREDICTED: similar to MGC68696 protein [Rattus norvegicus] 82 13 0 gi|14485281 55038; 7.10 aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A4 [Rattus norvegicus] 65 14 0 gi|420265 S 2891; 9.41 fatty-acyl-ethyl-ester synthase (EC 3.1.1.67) - rat (fragment) 60 15 0 gi|34856646 57538; 9.11 PREDICTED: similar to Expressed sequence AI505034 [Rattus norvegicus] 53 16 0 gi|51259250 56480; 6.61 Chloride ion pump-associated 55 kDa protein [Rattus norvegicus] 48 17 0 gi|62652134 50688; 8.05 PREDICTED: similar to Cpm protein [Rattus norvegicus] 44 1
A Anhang
89
UM1031_32
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]457 322 0 gi|27465535 50095; 4.78 tubulin, beta 5 [Rattus norvegicus] 314 263 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 242 224 0 gi|54792127 56318; 5.19 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, beta subunit [Rattus norvegicus] 237 215 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 915 226 0 gi|45737866 56079; 6.69 mitochondrial aldehyde dehydrogenase precursor [Rattus norvegicus] 631 137 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 628 198 0 gi|488838 S 47590; 4.95 CaBP1 [Rattus norvegicus] 490 79 0 gi|34880876 60761; 7.10 PREDICTED: similar to Putative dimethylaniline monooxygenase [N-oxide-forming] 6 (Flavin-containing259 6
UM1031_34
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 900 282 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 174 73 0 gi|19424338 51667; 9.50 hydroxyacyl dehydrogenase, subunit B [Rattus norvegicus] 145 74 0 gi|4079645 47755; 6.71 RAREG-2.1 [Rattus norvegicus] 136 55 0 gi|15805031 50460; 9.10 eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2 [Rattus norvegicus] 118 46 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 90 47 0 gi|8393057 46602; 8.88 serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade H, member 1 [Rattus norvegicus] 70 18 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 68 19 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 64 2
10 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 62 411 0 gi|62641274 56609; 8.50 PREDICTED: similar to Tu translation elongation factor, mitochondrial [Rattus norvegicus] 56 412 0 gi|62646586 18334; 8.65 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 42 113 0 gi|62656848 14811; 10.34 PREDICTED: similar to 60S ribosomal protein L35 [Rattus norvegicus] 37 114 0 gi|71911 Sc 40568; 5.69 GTP-binding regulatory protein Go alpha chain, splice form alpha-2 [validated] - rat 28 1
A Anhang
90
UM1031_35
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|38181831 52719; 8.59 Ephx1 protein [Rattus norvegicus] 205 332 0 gi|9506531 56195; 7.70 cytochrome P450, family 2, subfamily f, polypeptide 2 [Rattus norvegicus] 165 253 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 483 144 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]347 105 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 280 106 0 gi|30387859 44734; 6.23 GTP-binding protein Golf alpha subunit [Rattus norvegicus] 242 57 0 gi|51948476 53500; 5.57 ubiquinol-cytochrome c reductase core protein I [Rattus norvegicus] 169 68 0 gi|59808742 46632; 7.07 SEC14-like 2 [Rattus norvegicus] 135 69 0 gi|62645766 36065; 9.16 PREDICTED: similar to Sulfide quinone reductase-like [Rattus norvegicus] 112 3
10 0 gi|6978549 35610; 8.83 ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide [Rattus norvegicus] 98 311 0 gi|18426844 50332; 5.91 annexin A7 [Rattus norvegicus] 85 212 0 gi|13929186 47543; 5.18 flotillin 2 [Rattus norvegicus] 73 313 0 gi|66730294 45666; 8.90 hypothetical protein LOC499913 [Rattus norvegicus] 72 214 0 gi|62079055 51391; 8.88 hypothetical LOC361596 [Rattus norvegicus] 71 115 0 gi|57539 Sc 47398; 8.72 ubiquitous mitochondrial creatine kinase [Rattus rattus] 60 116 0 gi|56605938 47248; 5.09 thioredoxin domain containing 4 (endoplasmic reticulum) (predicted) [Rattus norvegicus] 53 217 0 gi|125296 S 42970; 5.33 Creatine kinase B-type (Creatine kinase, B chain) (B-CK) 50 118 0 gi|18543177 52176; 8.53 citrate synthase [Rattus norvegicus] 40 119 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 35 120 0 gi|112467 S 60279; 9.01 glucuronosyltransferase (EC 2.4.1.17) - rat 31 1
A Anhang
91
UM103_37
Acc. Nr. Mass PI Protein Information Score n1 0 gi|19924182 57012; 8.84 olfactory-specific cytochrome P-450 (P-450olf1) [Rattus norvegicus] 490 182 0 gi|6978743 56645; 9.19 cytochrome P450, subfamily IIA (phenobarbital-inducble)/ (Cytochrome P450 IIA3) [Rattus norvegicus]331 113 0 gi|71620 Sc 42066; 5.29 actin beta - rat 245 84 0 gi|38014578 50225; 4.79 Unknown (protein for MGC:73008) [Rattus norvegicus] 229 85 0 gi|62660728 46453; 5.64 PREDICTED: SEC14-like 3 [Rattus norvegicus] 209 76 0 gi|34856626 38067; 4.67 PREDICTED: similar to reticulocalbin [Rattus norvegicus] 162 67 0 gi|58865778 49093; 5.62 dolichyl-di-phosphooligosaccharide-protein glycotransferase (predicted) [Rattus norvegicus] 153 48 0 gi|11560133 50788; 4.94 tubulin, alpha 1 [Rattus norvegicus] 106 59 0 gi|587518 S 16950; 4.66 keratin 18 [Rattus norvegicus] 89 3
10 0 gi|58865476 45207; 5.66 phosphatidylinositol glycan, class K (predicted) [Rattus norvegicus] 52 211 0 gi|1945471 38660; 5.05 paraoxonase [Rattus norvegicus] 24 1