Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik

Teil 1: Grundlagen, Präanalytik

http://www.mh-hannover.de/Lichtinghagen.html

Lichtinghagen.Ralf@mh-hannover.de

Prof. Dr. Ralf LichtinghagenMedizinische Hochschule Hannover

Institut für Klinische ChemieTel.: 0511-532-3940

LaboratoriumsmedizinDisziplinen

• Immunologie• Immunhämatologie• Hämatologie• Hämostaseologie (Gerinnung)• Klinische Chemie• Molekularbiologie, Genetik• Mikrobiologie• Virologie

Vorlesungsthemen

• Grundlagen, Präanalytik, Analytik• Leber, Pankreas• Kardiale Marker• Diabetes mellitus• Fettstoffwechsel• Nierendiagnostik• Elektrolyt- und Wasserhaushalt• Säure-/ Basenhaushalt• Entzündungs- und Tumordiagnostik• Immunhämatologie (Blutgruppen)• Hämostaseologie• Molekularbiologische Diagnostik

Der Weg zum Laborbefund

Untersuchungs- und Beurteilungsablauf ausmehreren Teilschritten:

Präanalytische, analytische und postanalytische Phase

Einsender (Arzt, Station):Vorbereitung des Patienten zur Probennahme, Probennahme, TransportLabor:Lagerung, Aufarbeitung zur Analytik

Fehler in der Präanalytik (>60%) sind die häufigste Ursache für unplausible Laborbefunde!!!

Diagnose, Prognose

Technische Ebene

Biologische Ebene

Nosologische Ebene

Analysenergebnis

Befund

Interpretierter Befund

PlausibilitätskontrolleLongitudinalbeurteilungTransversalbeurteilungBeurteilung von Einflussgrößen

QualitätskontrolleAnalytische BeurteilungBeurteilung von Störfaktoren

Zuordnung zum MorbusDiff.-diagnostische BeurteilungBewertung von EinflussgrößenPathophysiologische Beurteilung

Der Weg zum Laborbefund

Messgröße

Einflussgrößen und Störfaktoren

Einflussgröße: führt in vivo zu Veränderungen an der Konzentration der zu bestimmenden Messgröße (vor Probennahme, Ausnahme: in vitro-Einflussgröße), sie ist unabhängig vom Analysenverfahren.

Störfaktor: bewirkt in vitro (nach und während der Probennahme) eine Veränderung des Messergebnisses, er ist nicht immer unabhängig vom Analysenverfahren.Unterscheidung zwischen :

körpereigene Störfaktorenkörperfremde Störfaktoren

Einflussgrößen

Durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen

Diabetes mellitus: C-(Kapillar)-GlucoseP-(Plasma)-GlucoseS-(Serum)-Glucose

Niereninsuffizienz: S-HarnstoffS-KreatininS-Kalium

Pankreatitis: S-α−AmylaseU-(Urin)-α−AmylaseS-Lipase

Einschub: Systembezeichnungen

Serum SSerumwasser S(W)Plasma PPlasmawasser P(W)Blut BBlutwasser B(W)Kapillarblut CArterielles Blut Avenöses Blut VErythrozyten ERCUrin ULiquor LFaeces FKonkrement KSchweiss SUSpeichel SPSonst. Material Y

Einflussgrößen

durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen

durch diagnostische und therapeutische Maßnahmen

i.m. Injektion, Muskelbiopsie: S-Creatinkinase (CK)S-Myoglobin

Prostata-Palpation: S-PSA(prostataspezifisches Antigen)

Gabe vieler Medikamente: diverse Messgrößen

Einflussgrößendurch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen

durch diagnostische und therapeutische Maßnahmen

Alter, Geschlecht, Rasse,genetische Unterschiede

Für viele Messgrößen gelten eigene Referenzbereiche für Frauen und Männer!

♀ ♂

Altersabhängigkeit diverser Messgrößen

Für viele Messgrößen sind alterabhängige Referenzbereiche wünschenswert!

Einflussgrößendurch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungen

durch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede

Nahrungsaufnahme, Diät,Rauchen, Genussgifte

Manche Referenzbereiche (z.B. für P-Glucose) gelten nur für 12stündige Nahrungskarenz

Einfluss von Alkohol(C2-toxisch)

Einfluss des Rauchens

Andere Entscheidungsgrenzen für Raucher bei diversen Markern?(z.B. S-CEA)

S-γGT: klassischer (wenn auch unspezifischer) Surrogatmarkerbei chronischem Alkoholabusus

Nahrungsaufnahme, Diät, Rauchen, Genussgifte

Einflussgrößen

circadiane Rhythmik

Bei vielen Messgrößen ist die Tageszeit der Blutentnahme entscheidend für eine bessere Vergleichbarkeit von Messwerten

durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungendurch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede

Nahrungsaufnahme, Diät, Rauchen, Genussgifte

Einflussgrößen

circadiane Rhythmik

durch Krankheiten /Defekte bedingte Änderungendurch diagnostische und therapeutische MaßnahmenAlter, Geschlecht, Rasse, genetische Unterschiede

Stauen der Vene, Einfluss der Körperlage

Anreicherung hochmolekularer bzw.daran gebundener Substanzen, deshalb Stauzeit < 2 min.

Änderung der Körperlage:Anstieg der Plasma-konzentration vom Wechsel von der liegenden in die aufrechte Position.

Unterschiede abhängig von der Konstitution des Patienten,verstärkt bei Patienten mit Herzinsuffizienz.

In vitro-EinflussgrößenVeränderung durch Lagerung, Metabolismus der Blutzellen

4°C

23°C

30°C

4°C

23°C

30°C

Substanzen, die in Leukozyten in hoher Konzentration vorhanden sind, werden falsch-hoch gemessen (z.B. Kalium)

Der Metabolismus von Blutzellen führt zu veränderten Plasma-konzentrationen von Messgrößen (z.B. Glucose)

StörfaktorenBei der Blutentnahme:•Falsche Monovette•Blut ist mit Infusionslösung vermischt (Elektrolyte, Glucose, Proteine, Lipide)•Zu starke Aspiration: Hämolyse (Zerstörung der Erythrozyten, Freisetzung von Hämoglobin)

Störfaktoren aus Patienten:

•Patienten mit einer Hämolyse (erhöhtes P-Hämoglobin, rote Farbe des Serums)

•Patienten mit einer Lipämie (erhöhte-Blut-Fettwerte, milchiges Serum)•Patienten mit Ikterus (erhöhtes Bilirubin färbt Serum bräunlich)

Bsp.: Eine Monovette enthält K2-EDTA zur klinisch-chemischen AnalytikFehlermöglichkeiten u.a.: S-Kalium falsch-hoch (Werte >9,5 mmol/l

sind nicht mit dem Leben vereinbar)S-Calcium, S-Magnesium falsch niedrig (Komplexbildung)

Interferenzen bei diversen Messmethoden

Einschub: Monovetten-TypenZusatz Einsatzbereich

Serum: Kaolin Klinische Chemie (KC)(als Gerinnungsaktivator)

Plasma: Lithium-Heparin KCAmmonium-Heparin KCKalium-EDTA HämatologieNatrium-Citrat Gerinnung

(als Antikoagulanzen)Natrium-Fluorid KC

(als Glykolyse-Hemmer)

Die Verwendung ungeeigneter Monovetten kann zu extremen Abweichungen bei verschie-denen Messgrößen führen.

Bei der Wahl verschiedener Probenmaterialien (Serum vs. Plasma) resultieren bei manchen Messgrößen unterschiedliche Referenzbereiche.

Referenzintervall

2,5. – 97.5. Perzentileeines gesunden Kontrollkollektives bezogen auf die Werteverteilung bei einer Messgröße.

Es ist das Intervall zwischen zwei Referenzgrenzen und schließt diese Grenze mit ein.

5% der Gesunden sind definitionsgemäß oberhalb (2,5%) bzw. unterhalb (2,5%) des Intervalles und haben somit einen pathologischen Messwert.

Keine Normalverteilung

Transversalbeurteilung

Vergleich eines Messwertes mit dem entsprechenden Referenzintervall:

Referenzbereich

S-Bilirubin [µmol/l]: 25 + bis 17 S-Protein [g/l]: 15 - 65-80

Longitudinalbeurteilung

Wichtiger Bestandteil einer Plausibilitätskontrolle.

Überprüft die zeitliche Folge von Ergebnissen aus Primärproben desselben Patienten.

Aus biologischen Halbwertszeiten und Erkenntnissen über typische Veränderungen der Messgröße bei definierten Erkrankungen kann die Plausibilität solcher Zeitreihen beurteiltwerden.

BeispielTag 1 Tag 2 Tag 3 Ref.bereich

S-Kalium [mmol/l] 4,4 7,8 4,6 3,6-5,4

Diagnostische Wertigkeit von Markern

Gesund KrankMarkerkonzentration

Häu

figke

it

„Idealer Test“

Keine falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnisse

Positives Ergebnis beweisend für gesuchte Erkrankung

„Realer Test“

Diagnostische Sensitivität und Spezifität <100%

Prävalenz der Erkrankung muss berücksichtigt werden

cut-off-Wert

Konzentration des Markers

Häu

figke

it

richtig negativ

Patient hat nicht die Erkrankung,die der Marker nachweisen soll

Cut o

ff-W

ert

fp

fn

Patient hat die Erkrankung,die der Marker nachweisen soll

richtig positiv

Eine Entscheidungsgrenze dient zur Diskriminierung zweier verschiedener Kollektive mit Hilfe eines entsprechenden (geeigneten) Markers.

Diagnostische Sensitivität und Spezifitätbessere bessereSensitivität Spezifität

Ents

chei

dung

sgre

nze

KonzentrationMarker

Diagnostische Sensitivität und Spezifität eines Markers in Bezug auf den Nachweis einer Erkrankung sind über die Festlegung einer Entscheidungsgrenzemiteinander verbunden!

Diagnostische Wertigkeit von Markern

Sicherheit, mit der Kranke erkannt werden

Sicherheit, mit der Nicht-Kranke ausgeschlossen werden

Wahrscheinlichkeit für Nicht-Krankheit bei normalem Messwert(Zunahme mit Zahl der Nicht-Kranken)

Wahrscheinlichkeit für Krankheit bei pathologischem Messwert(Zunahme mit Krankheitsprävalenz)

Diagnostische Wertigkeit von Markern

Rechenbeispiel:

50 Kranke auf 100.000 Personen (Prävalenz 0,05%)

Testeigenschaften: Sensitivität 50%Spezifität 95%

Restresultat: 25 Kranke entdeckt25 Kranke übersehen

5000 Gesunde mit Verdacht auf Erkrankung!

Weitere Diagnostik bei 5% der Patienten (Faktor 100:1)

Diagnostische Wertigkeit von Markern

Blutnachweis im Stuhl / Colon-Ca

Prävalenz Colon-Ca 0,72%Diagn. Sensitivität 80%Diagn. Spezifität 98%

Bei n=10.00058 Kranke Test-positiv, 14 Kranke Test-negativ200 Gesunde Test-positiv (falsch-positiv)

Pos. prädiktiver Wert 22,5%Neg. prädiktiver Wert 99,9%

Weitere Diagnostik bei 2,6% der Patienten (Faktor 3:1Gesund/Krank))

Quantitative Messung: Einheiten, SI-Konformität

Stoffmenge: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse bekannt ist, in mol beziffert.

Substanzkonzentration: mol/l, mmol/l, µmol/l…

1 Mol jedes Stoffes enthält 6,023 x 1023 Teilchen (Avogadro-Konstante)Beispiel: 1 Mol Wasser sind 18 g (1x16 (O) + 2x1 (H))

Substanzmasse: wird bei Substanzen, deren relative Molekülmasse unbekannt ist, in kg (bzw. abgeleiteten Größen) beziffert.

Massenkonzentration: kg/l, g/l, mg/l…

Katalytische Aktivität eines Enzyms: U/l1 Unit (U) ist die Enzymmenge, die 1 µmol Substrat pro Minute bei gegebener Temperatur und Reaktionsbedingungen umsetzen kann.

nicht SI-konform (SI: Système internationale d‘ Unités)

Analytik im Überblick

Nachweisgrenze: Mindestkonzentration eines Analyten, die sicher von Null unterschieden werden kann

Mehrfachmessung analytfreier Probe: Nachweisgrenze = Mittelwert + 3 x SD

Linearitätsgrenze: Messbereich zwischen Nachweisgrenze und Linearitätsgrenze (Verdünnungsgrenze)

Analytische Sensitivität: Maß für Nachweisvermögen einer Methode.Bedeutet auch die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereichs, die sicher unterschieden werden kann.Kritische Differenz = 3 x SD (der Methode)

Analytische Spezifität: das Vermögen des analytischen Verfahrens in der Probe nur die gesuchte Messgröße zu erfassen

SD: Standardabweichung

Qualitätskontrolle im Überblick

Ziele:Kontrolle der zufälligen Fehler.Kontrolle der systematischen Fehler über den gesamten klinisch-relevanten Messbereich.Kontrolle jeder Analysenserie (umfasst längstens acht Stunden).Anwendbarkeit in allen Laboratorien.

Vorschriften zur Durchführung der Qualitätskontrolle in med. Laboratorien und Anforderungen bzgl. Güte der Messungen für 87 Messgrößen festgelegt in Richtlinien der Bundesärztekammer (RILIBÄK): Maximal zulässige Unpräzision(Anlage 1, Spalte 5), Maximal zulässige Unrichtigkeit (Anlage 1, Spalte 6), Maximal zulässige Abweichung des Einzelwertes (Anlage 1, Spalte 7)

Qualitätskontrolle im Überblick

Richtigkeitskontrolle: Abweichungen von einem definierten Zielwert, lässt systematische Fehler erkennen (Unrichtigkeit).

Präzisionskontrolle: Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Messung, Erkennung grober und zufälliger Fehler.Auch mittels Labor-EDV errechenbar aus RichtigkeitskontolldatenMittelwert, Standardabweichung, Variationskoeffizient (VK)

Ringversuche: externe Richtigkeitskontrolle, zentral durch Ringversuchsleiter (Referenzinstitition der DGKL, INSTANT...), Erlangung von RV-Zertifikaten.

Qualitätskontrolle im Überblick

Kontrollen: Es werden zur Überwachung von Richtigkeit und Präzision ausschließlich Richtigkeitskontrollen verwendet.

Kalibratoren:primärer Standard: Kalibrationsstandard aus abgewogener (ideal) Reinsubstanz gelöst in reinem Lösungsmittel.

Material soll keine Komponenten enthalten,die einen unspezifischen Beitrag zum Messsignalliefern.

sekundärer Standard: Masse kann nur indirekt durch chem. Analyse ermittelt werden, wenn exakte Einwaage nichtmöglich ist (z.B. bei konstanter Restfeuchte (Albumin))Matrixhaltig: enthält die gleichen Haupt- und Nebenbestandteile wie die Patientenproben

Dokumentation laborinterner Qualitätskontrolle

(105,6-103) : 3 = 0,87 = 1SDSDx100/103 = 0,84 = %VK max. Impräzision: Mittelwert + 3 SD

Dokumentation externer Qualitätskontrolle

YOUDEN-Diagramm zur Darstellung aller Teilnehmerergebnisse.Zielwerte im Zentrum des Diagramms.Quadrat zeigt die Bewertungsgrenzen nach RILIBÄK an.Zertifikate der Referenzinstitution nur für Teilnehmer innerhalb dieses Quadrates.

RV nicht bestanden?Überprüfung der Berechnung/ProtokolleÜberprüfung der internen Qualitätskontr.Abschätzung des Fehlertyps(grob/systematisch aus graphischer Auswertung)Vergleich mit anderen TeilnehmernDurchführung verstärkter interner Qualitätskontrolle

Zum Nachdenken

z.B. S-ChloridWert [mmol/l]

Tag 1 100

Tag 2a 102Tag 2b 105

Max. Impräzision der Methode beträgt 2,5%

Anstieg des S-Chloridoder nicht im Fall a oder b?

Kritische Differenz = 2 √2 x SD (3 x SD)

Trennmethoden in der Klinischen ChemieBeispiel Prinzip

Ausfällung Ausfällen von Proteinen Erzeugung von unlöslichen durch Trichloressigsäure Niederschlägen

Sedimentation Abtrennung der Blutkörperchen Höhere rel. Dichte der suspendiertenvom Plasma Teilchen

Zentrifugation Abtrennung der Blutkörperchen Beschleunigung dervom Plasma Sedimentationsgeschwindigkeit (2000g)

UltrazentrifugationTrennung von Zellkomponenten hohe Beschleunigung der Sed.geschw.(z.B. 100.000-500.000 g)

Filtration Klären von trübem Urin Abtrennung von festen Partikelndurch Filter

Ultrafiltration Proteinanreicherung im Urin, Liquor Abtrennung gelöster makromolekul.Stoffe von niedermolekularen

Elektrophorese Trennung von Proteinen Unterschiedliche Wanderungs-geschwindigkeit im elektr. Feld

Chromatographie Auftrennung von Proteinen, Auftrennung von Stoffgemischen durch Pharmaka, Drogen.... unterschiedliche Verteilung in mobiler

und stationärer Phase

Extraktion Abtrennung hydrophober von Löslichkeit in organ. Lösungsmittelnhydrophilen Substanzen

ChromatographieUnterschiedliche Verteilung von Stoffen in zwei verschiedenen Phasen, genauer gesagt an den Phasengrenzflächen dera) stationären (unbeweglichen) Phase, b) mobilen (beweglichen) Phase

Voraussetzung: Beide Phasen sind nicht mischbar

Man unterscheidet zwischen:Dünnschichtchromatographie, PapierchromatographieSäulenchromatographie

Trennprinzipien:• Adsorptionschromatographie• Ionenaustauschchromatographie• Gelchromatographie• Affinitätschromatographie

Rf-Wert:Laufstrecke der Substanz ab StartlinieLaufstrecke der Lösungsmittelfront ab Startlinie

Dünnschichtchromatographie

Stationäre Phase:meist polares Adsorbens in Solvathülle (dünne Wasserschicht)(z.B. Kieselgel, Al2O3)

Mobile Phase (Fließmittel):Gemisch organischer Lösungsmittel

Messgröße zur Auswertung:Retentionswert Rf

SäulenchromatographiePrinzip Ionenaustausch

Man unterscheidet:AnionenaustauscherKationenaustauscher

Stationäre Phase:org. Ionenaustauscherharze, tragen elektrostatisch gebundene OH-- bzw H+-Ionen

Mobile Phase (Fließmittel):Wässrige Lösung, Säure bzw. Lauge zur Regeneration

SäulenchromatographiePrinzip Gelchromatographie

Je größer ein Teilchen ist, umso schneller wandert es bei der Gelchromatographie durch die Säule (umgekehrter Siebeffekt)

Stationäre Phase:Poröse (schwammartige) Trägermaterialien von einheitlichen Durchmesser (z.B. aus Polydextran, Agarose, Polyacrylamid)

Mobile Phase (Fließmittel):z.B. wässriger Puffer

hochmolekulare Substanzen im Ausschussvolumen V0niedermolekulare Substanzen im Totalvolumen Vt

ChromatographieEine Automatisierung chromatographischer Methoden führt generellauch zu einer Ankopplung an ein analytisches Nachweisverfahren hierbei in Form eines entsprechenden Detektorssolche chromatographischen Systeme können folgendermaßen benannt sein:HPLC High Performance Liquid ChromatographyLC Liquid ChromatographyGC Gas ChromatographyBei der Vielzahl möglicher Detektionsformen spielt vor allem die Massenspektroskopie (MS) ein besondere Rolle.In Kombination mit GC: GC-MSDurch Elektronenstoß entstehen bei der MS positiv geladene Fragmente einer Substanz, die in charakteristische Größe und Anzahl auftreten (molek. Fingerabdruck)

Elektrophorese: SerumelektrophoreseWanderung in Lösung befindlicher Teilchen beim Anlegen einer Gleichspannung

Geschwindigkeit der Moleküle ist proportional der Feldstärkeund der Molekülladung und umgekehrt proportional der Molekülgröße

Serumelektrophoreseauf Celluloseacetatfolie als Trägermaterial

Elektrophorese: SDS-PAGE

PAGE: Polyacrylamid-GelelektrophoreseSDS: Natrium-Dodecylsulfat, amphophile Substanz, die sich mit zu untersuchenden Proteinen verbindet, negative Außenladung, Wanderungsgeschwindigkeit nur noch von Molekülmasse abhängig

Analytische Verfahren in der Klinischen Chemie

Beispiel Prinzip

Potentiometrie pH-Messung Potentialmessung

Coulometrie Coulometrische Chlorid-Bestimmung Messung der Strommenge

Kryoskopie Osmolalität von Serum/Urin Gefrierpunktserniedrigung

Optische Messmethoden

Photometrie Protein-Bestimmung mit Messung der Absorbance(Spektrometrie) Biuretreagenz

Flammenphotom. Natrium im Serum/Urin Messung der Lichtemission

Atomabsorptions- Kupfer im Urin Messung der atomarenspektrometrie Absorption

Densitometrie Elektrophoreseauswertung Messung der Lichtdurchlässigkeit

Turbidimetrie Immunglobulin-Bestimmung Trübungsmessung

Nephelometrie Streulichtmessung

Fluorimetrie DNA/RNA-Bestimmung Fluoreszenzmessung

Proteinbindung Tumormarker-Bestimmung Enzymimmunoassay

Empfindlichkeit analytischer Verfahren

Spektroskopie: Photometer (Grundbausteine)

Spektroskopie: (Geräteaufbau eines Einstrahlphotometers)

SpektroskopieLichtquellen

man unterscheidetzwischen:LinienstrahlerKontinuumstrahler

Ziel ist die Generierung monochromatischen Lichtes

Vom Photometer …

…zur modernen Laborstraße

Spektroskopie: Lambert-Beersches Gesetz

Absorbance A hat Messbereich von Null bis UnendlichI = I0 A = 0I = 0 A = Unendlich

Transmission T (I/I0) hat Messbereich von 0 bis 1

log 1/T = A

I = I0 T = 1 (%T = 100)I = 0 T = 0

log Io/I = A = ac x c x d

A: Absorbance (im Deutschen früher Extinktion E)(spektrales dekadisches Absorptionsmaß)

ac: Proportionalitätsfaktor (Extinktionskoeffizient)c: Schichtdicke in cmd: Konzentration in mol/l

Photometrie: Prinzipien

Direkte Photometrie Substanz ist farbig oder absorbiert im UV-Bereich: z.B. Neugeb.-Bilirubin, freies Hb

Indirekte Photometrie Analyt wird in Messreaktion zu photometrisch messbarem Produkt (z.B.enzymatisch) umgewandelt.(Glucose, Lactat, Ethanol...)

Berechnung erfolgt nach Lambert-Beer-Gesetz (ac=A/c x d) mittels Standard mit bekannter Konzentration

c(Probe) = A(Probe)/A(Standard) x c(Standard)

oder aus einer KalibrationskurveCAVE: Gültigkeit nur innerhalb des linearen Messbereichs

Konzentration Extinktion0,4 0,0671,2 0,1982,0 0,3293,2 0,5514,0 0,702

Photometrie: Prinzip

Photometrie: Prinzip

Gültigkeit des Lambert-Beer-Gesetzes nur für stark

verdünnte Lösungen: Keine gegenseitige

Beeinflussung chromo-phorer Gruppen

verschiedener Moleküle

Photometrie: Prinzipien

Indikatorreaktion in diesem Zusammenhang häufig Bildung bzw. Verbrauch von NAD(P)H.Im Gegensatz zu NAD(P)+ hat NADH ein Absorptionsmaximum bei 340 nm

Beispiel: Bestimmung von Glucose mittels Hexokinase-Reaktion:

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP

Indikatorreaktion:

Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Hexokinase

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Absorption bei 340 nm korreliert mit gebildetem NADPH und mit Glucosekonzentration

FlammenphotometrieBestimmung von Natrium, Kalium Calcium, Lithium

Färbung einer nicht leuchtenden Flamme durch Alkali- und Erdalkalisalze aufgrund thermischer Anregung von Valenzelektronen. Freiwerdende Energie als Licht mit elementspezifischen Wellenlängen

Verwendung des Prinzips rückläufig im Vergleich zur Potentiometrie

a: Lösungsmittel verdampftorg. Verbindungen verbrennend: Zerfall von NaCl in freie Atome,die thermisch angeregt werden

Je mehr Atome in der Flamme vorhanden sind, umso intensiver ist die Flammenfärbung und damit die Emissionsstrahlung

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)Bestimmung von z.B. Kupfer, Selen, Zink, Schwermetalle

Hohlkathodenlampen (gibt es für ca. 60 Elemente) erzeugen elementspezifisches Licht

Atomisiertes Probenmaterial (aus Flamme, Graphitrohr)absorbiert monochromatisches für das zu bestimmende Element spezifisches Licht

Absorption als Maß für die Konzentration des entsprechenden Elementes in der Messlösung

PotentiometrieBeispiel der Glaselektrode zur pH-Messung

Messanordnung für Potentiometrie

(Ionen-sensitiv)

Messung eines Potentials erfolgt fast stromlosals Potentialdifferenz bezogen auf das Potential einer ReferenzelektrodePotentiometrische Messung erfordert somit:Messelektrode und Referenzelektrode mit ionenselektiver Membran.

Einstab-Glaselektrodemit H+-sensitiver Glasmembran

PotentiometrieDie ISE-Einheit zur Bestimmung von Natrium, Kalium und Chlorid

In nahezu jedem klinisch-chemischen Analysengerät befindet sich eine sogenannte ISE-Einheit.Diese Elektroden können aufgrund z.B. der Beschaffenheit ihrer Membran spezifisch die Ionenaktivität von Ionen wie Kalium, Natrium, Chlorid und im Bedarfsfall auch Calciummessen. Wichtigste Methode zur Bestimmung dieser Messgrößen.

z.B. Kalium-Elektrode mit spezieller ionenselektiver Kunstoffmembran, in welche das Antibiotikum Valinomycin eingebettet ist (bindet spezifisch Kalium-Ionen).

Indirekte ISE: Probe wird zuerst pipettiert und vorverdünnt (z.B. 1:20) in der ISE-Einheit gemessen.

Direkte ISE:Anwendung in Blutgasgeräten zurMessung aus Vollblut, keine Vorverdünnung

ISE- Chipmodul

Immunologische VerfahrenAntikörper

80%)

IgG IgM IgA IgD IgEProzent. Anteil am Serum Ig-Pool 70-75 10 15-20 <1 SpurenMolekulargewicht (x1000) 150 970 385(Dimer)

SerumelektrophoreseInformation aus densitometrischer Auswertung

polyklonal

monoklonal

IgG, IgA und IgM mit unterschiedlicher Verteilung

Immunologische VerfahrenImmunelektrophorese/ Immunfixation

Qualitative Methodezum Nachweis vonmonoklonalenImmunglobulinen

mittels monospezifischenAntiseren gegen

Anti-IgGAnti-IgAAnti-IgMAnti-KappaAnti-Lambda

Immunologische VerfahrenNephelometrie/ Turbidimetrie

Bei diesen immunchemischen Verfahren wird durch Antikörper-Antigen-Aggregate das Licht gestreut. Anwendung beim Nachweis vieler Serumproteine (Albumin, Immunglobuline, Akute-Phase-Proteine, Speicher- und Transportproteine) und Urinproteine (Albumin, α1-Mikroglobulin).

Nephelometrie: Messung eines Anteils des gestreuten Lichtes (A)

Turbidimetrie: Messung der Abschwächung der Lichtintensität (B)

(A) (B)

Immunologische VerfahrenHeidelberger-Kurve als Grundlage bei Trübungs- und Streulichtmessungen

Antigenüberschuss:Aggregate werden wieder kleiner und somit besser löslich. Zahl der AK reicht nicht aus alle AG zu verküpfen.

Antikörperüberschuss:Jede Steigerung der AG-Menge führt zu weiter Vernetzung, die im Äquivalenzbereich am stärksten ist.

Immunologische VerfahrenImmunoassay zur Messung zahlreicher Analyten (Proteine, Pharmaka...)

z.B. ELISAEnzyme linked immuno-adsorbent assay(photometrisches Detektionsprinzip)

Alternative Detektionsprinzipen(z.T. deutlich sensitiver als der enzymatische Substratumsatz):z.B.FluoreszenzChemiluminiszenz (LIA)Elektrochemiluminiszenz (ECLIA)

Immunologische VerfahrenSandwich-Assay

Einsatz eines „Capture“-Antikörpers und eines markierten ZweitantikörpersArt der Markierung legt Detektionsprinzip fest (ELISA, RIA, LIA, ECLIA...)

Immunologische Verfahrenkompetitiver ELISA

Ein Indikator (Tracer, Label, Konjugat) konkurriert mit der Probe um BindungsstellenArt der Markierung gibt Detektionsprinzip vor

EnzymkinetikAnwendung in der Diagnostik von Erkrankungen

von Leber, Herz, Pankreas...

Für die Diagnostik und Verlaufskontrolle zahlreicher Erkrankungen werden in der Klinischen Chemie Aktivitätsbestimmungen von zahlreichen Enzymen durchgeführt.

Biochemische GrundlageEnzyme erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit einer Reaktion durch Herabsetzung der Aktivierungsenergie. Ohne Enzyme würden biochemische Reaktionen im Organismus nicht in nennenswertem Umfang ablaufen.

E + S ES E + P

Enzyme verlassen die katalysierte Reaktion unverändert.

Für den Einsatz in der Labordiagnostik ist weniger die biochemische Grundlage von Bedeutung als vielmehr der Bildungsort im Organismus und innerhalb der einzelnen Zelle und damit die Art der Freisetzung eines Enzyms.

Kinetischer TestErfassung der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Umwandlung zur Bestimmung der Enzymaktivität. Messung der Enzymaktivität in U/l.

k1

k2

k3

Bedingungen für enzymatische Tests

Damit enzymatische Bestimmungen auch von Labor zu Labor verglichen werden können (Standardisierung), sind u.a. die Einhaltung folgender Rahmenbedingungen unbedingt erforderlich

Optimale SubstratkonzentrationOptimaler pH-WertOptimale CoenzymkonzentrationOptimale Konzentration von Aktivatoren

Definierte Temperatur (37°C)

Veränderung der Temperatur um 1° C verändert das Ergebnis eines enzymatischen Tests um ca. 10%

Zusammenhang zwischen Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit

Enzymkinetik nach Michaelis-Menten

Michaeliskonstante1)

2)

3)

Mit steigender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) zu1) Wenig Substrat, Enzymmoleküle vorwiegend noch frei2) Zunahme des Substrats, Hälfte der Enzyme frei, halbmaximale v3) Hohe Substratkonzentration, kein Enzym mehr zur Verfügung, maximale v.

weitere Substratzugabe erhöht v nicht

Messung der Enzymaktivität

Aufnahme einer Absorptions-Zeit-Kurve in einem vorgegebenen Messintervall zur Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit

Beispiel: Bestimmung der Aktivität der Lactatdehydrogenase (LDH)

Lactat + NAD+ Pyruvat + NADH + H+

Messung der Absorptionszunahme (∆A) pro Zeiteinheit bei 340 nm (Zunahme der NADH-Konzentration)

LDH

Besonderheiten enzym. Tests

Der optische Test nach Warburg beruht auf der Oxidation von NADH bzw. der Reduktion von NAD+

Man unterscheidet: Einfacher optischer Test: z.B. LDH-Bestimmung

Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion:Direkte Messung der enzymatischen Reaktion ist nicht möglich(z.B. ALT)

L-Alanin + α-Ketoglutarat L-Glutamat + Pyruvat

Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD+

Messung der Absorptionsabnahme bei 340 nm (Abnahme von NADH)

LDH

ALT

Besonderheiten enzym. Tests

Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und Indikatorreaktion:Direkte Kopplung von enzymatischer Reaktion und Indikatorreaktion nicht möglich (z.B. Creatinkinase (CK))

Creatinphosphat + ADP Creatin + ATP

Hilfsreaktion

Glucose + ATP Glucose-6-Phosphat + ADP

Indikatorreaktion

Glucose-6-Phosphat + NADP+ 6-Phosphogluconat + NADPH + H+

Messung der Absorptionszunahme bei 340 nm (Zunahme von NADPH)

CK

Hexokinase

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase