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Praktikumsanleitung

Klinische Laboratoriumsdiagnostik

Organfunktionsproben

Prof. Dr. M. SernetzDr. C. Giese, Dr. U. Hauptmann, D. Hild

Institut für Biochemie und EndokrinologieFachbereich Veterinärmedizin

Justus-Liebig-Universität Gießen

Gießen, 13. Auflage 2000

INHALTSVERZEICHNIS

AUFGABE 1: Bestimmung des Proteingehalts der Körperflüssigkeiten mittels Biuretreaktion;Photometrische Halbmikromethode .........................................................................................................1

AUFGABE 2: Enzymaktivitätsbestimmung in Serum und Plasma LDH, GOT, CK, γ-GT und ChE für dieLeberfunktionsdiagnostik..........................................................................................................................7

AUFGABE 3: Enzymatische Substratbestimmungen .........................................................................................................15

AUFGABE 4: Immunoassays.................................................................................................................................................21

AUFGABE 5: Immunologische Nachweise von Choriongonadotropin (HCG); Schwangerschaftstests,Trächtigkeitsnachweis .............................................................................................................................27

AUFGABE 6: Immunologische Bestimmung von IgG; Trübungsmessung, kinetischeSubstratbestimmung.................................................................................................................................29

AUFGABE 7: Blutglucosespiegel: Resorption, Elimination und Insulin-Regulation; EnzymatischeGlucosebestimmung (GOD-POD) ...........................................................................................................33

AUFGABE 8: Funktionstest exokrines Pankreas; Chymotrypsin-Aktivitätsbestimmung mitp-Aminobenzoesäure (PABA)................................................................................................................37

AUFGABE 9: Blutalkoholspiegel: Alkohol-Elimination als Leberfunktionstest; EnzymatischeBlutalkoholbestimmung (ADH) ..............................................................................................................41

AUFGABE 10: Endogene Kreatinin-Clearance als Nierenfunktionsprüfung .............................................................45

AUFGABE 11: Endogene Harnstoff-Clearance als Nierenfunktionsprüfung.............................................................49

AUFGABE 12: Inulin- und PAH-Clearance als Nierenfunktionsprobe; Begriff der totalen Clearance..................51

AUFGABE 13: Hämoglobin, fetales Hämoglobin, Bilirubin, Eisen...............................................................................59

AUFGABE 14: Blutgerinnungsanalyse, Gerinnung als enzymatische Reaktion: Vergleich derFibrinogen-Gerinnungszeitmessung mit der Umsatzmessung chromogenerThrombinsubstrate ...................................................................................................................................65

AUFGABE 15: Elektrolyte der Körperflüssigkeiten........................................................................................................77

AUFGABE 16: Qualitative und halbquantitative Schnelltests, Teststreifen oder Teststäbchen zumNachweis von Harn- und Blutbestandteilen.........................................................................................83

Wir danken folgenden Firmen für die freundliche Unterstützung:• Roche Diagnostics GmbH, Mannheim• Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen

0. Mikromethoden / Proteinbestimmung

1

AUFGABE 1: Bestimmung des Proteingehalts der Körperflüssigkeiten mittelsBiuretreaktion; Photometrische Halbmikromethode

A) Lernziel

Die erste Aufgabe des Praktikums dient dazu, am Beispiel der schon aus dem Biochemischen Praktikum bekanntenBiuretreaktion zur Proteinbestimmung folgendes kennenzulernen:

1. die Besonderheiten klinisch-chemischer Routine-Arbeitstechniken, insbesondere der Mikromethoden

2. die ständige Ausrüstung der Arbeitsplätze und die korrekte Handhabung der Geräte

3. die Bedingungen für den Umgang mit potentiell pathologischen, infektiösen Proben

4. die Beurteilung der Zuverlässigkeit und Qualität der Bestimmungen

5. die Verbindlichkeit des Befundes und die Verantwortlichkeit aus der Diagnose gegenüber dem Patienten.

B) Arbeitsplätze

Alle Aufgaben des Praktikums sind als Mikro- oder Halbmikroverfahren ausgelegt (sog. Mikroliter-Methoden),d.h. der Reaktionsansatz hat ein maximales Volumen von 1,0 bis 1,5 ml, die Volumina der Proben betragen meistweniger als 0,1 ml. Für exaktes Arbeiten mit solch kleinen Mengen ist die korrekte Handhabung der GeräteVoraussetzung.

In den meisten Fällen wird aus technischen und hygienischen Gründen mit Einmal-Plastikware (Reaktionsgefäße,Pipettenspitzen) gearbeitet. Die angebotenen diagnostischen Methoden sind aus didaktischen Gründen gewählt,nicht unbedingt nach dem sogenannten praktischen, klinischen Bedarf. Sie sind zum Teil sehr teuer, im Umgangmit dem Material und den Geräten wird daher an die Vernunft der Studenten appelliert.

Mikroliterpipetten

Zu jedem Arbeitsplatz gehört ein Satz Mikroliterpipetten zu 1000, 500, 200 µl (blaue Markierung) und 100, 50, 20 µl(gelbe Markierung) mit auswechselbaren, ebenfalls blauen und gelben Pipettenspitzen. Nur diese kommen mit derFlüssigkeit in Berührung, der Kolben der Pipette selbst muß stets trocken bleiben. Das deklarierte Pipetten-volumen wird durch einen oberen und mittleren (!) Anschlag definiert, zwischen denen die Kolbenhubfeder mitdem Daumen langsam (!) geführt wird, damit die aufzusaugende Flüssigkeit nicht in den Kolben spritzt oderschäumt. Zum Pipettieren wird die Pipettenspitze direkt angesetzt und immer an der Wand des Reaktionsgefäßesgeführt, damit die Flüssigkeit frei abläuft und nicht tropft. Zum Entfernen eines verbleibenden Flüssigkeitsrestes,und nur dazu, kann der Kolben noch über den mittleren Anschlag hinaus zu einem unteren Anschlag bewegtwerden. Die Pipetten sind stets senkrecht zu halten oder in den Ständern unterzubringen, nicht flach auf denTisch zu legen.

Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen

Sie werden nur nach Bedarf aus den Originalpackungen und Dispensern entnommen und nach Benutzungweggeworfen. Auf dem Tisch liegendes Material gilt als verworfen. Reaktionsgefäße sind dem jeweiligen Versuchentsprechend zu beschriften und in die Ständer zu stellen.

Dispensetten

Sie dienen zum wiederholten Abmessen derselben Lösung bei frei einstellbarem Flüssigkeitsvolumen (1 - 5 mlbzw. 2 - 10 ml). Vor Beginn ist das Pipettenvolumen der auf der Vorratsflasche aufgesetzten Dosierpipetteblasenfrei zu füllen.

Allgemeine Regel für Spritzflaschen und Dispensetten: Nicht öffnen! Werden genaue Volumina von z.B. Wasserbenötigt, ist zunächst eine hinreichende Menge in ein Gefäß vorzulegen und erst daraus das benötigte Volumenzu pipettieren!

Versuchsansätze

Die Tabellen für die Versuchsansätze enthalten zeilenweise die Arbeitsschritte und im allgemeinen jeweils eineSpalte für einen Leerwert, Standard und weitere Spalten für die Proben. Da deren Anzahl variieren kann, sindgegebenenfalls weitere Spalten anzufügen. Üblicherweise sind die Proben in 1,5ml-Reaktionsgefäßen anzusetzen.Ausnahmen davon werden angegeben.


2

Rüttler

Die Reaktionslösungen sind in den geschlossenen Reaktionsgefäßen gut zu mischen, und zwar entweder vonHand durch Überkopfwenden oder mittels eines Rüttlers. Schaumbildung ist zu vermeiden. Beim Herstellen vonVerdünnungsreihen (s. Versuche 1 - 3) kann fortlaufend mit einer Pipettenspitze durch mehrfaches, langsamesAnsaugen mit der Mikroliterpipette gemischt werden (oberer und mittlerer Anschlag).

Zentrifugen (s. auch Abb. 1.1, S. 6)

Es stehen hochtourige Tischzentrifugen zur Verfügung (17000 g). Die geschlossenen Reaktionsgefäße sind paar-weise und symmetrisch (!) einzusetzen, um Unwucht zu vermeiden, die die Lager ruiniert. Darauf ist gerade beiZusammenarbeit mit anderen Arbeitsgruppen zu achten. Die Zentrifugen sind mit Zeitschalter und automatischerVerriegelung versehen. Sie lassen sich nur eingeschaltet bei Stillstand des Rotors öffnen (bitte KEINE Gewaltanwenden !!).

Wasserbäder

Je nach Versuchsanordnung werden die Reaktionsgefäße in den Ständern in den Wasserbädern thermostatisiert.

Durchflußküvetten

Die photometrischen Messungen erfolgen in Halbmikro-Durchflußküvetten (Schichtdicke 1 cm, Breite 4 mm). DieLösungen werden normalerweise mit einer 1000 µl-Pipette (min. 500 µl) aus dem Reaktionsgefäß in die Küvettepipettiert. Gegebenenfalls werden die Proben direkt in den Küvetten angesetzt (Hinweise beachten). Die Küvettenmüssen korrekt im Strahlengang der Meßblende eingerastet sein. Die Außenwände müssen trocken sein,Luftblasen in der Küvette sind zu vermeiden. Bei Versuchsreihen ist möglichst in der Reihenfolge steigender oderfallender Extinktionen zu messen, um Verschleppungsfehler klein zu halten (nicht zwischenspülen). DieDurchflußküvetten werden durch mehrfaches kurzes Einschalten der Absaugvorrichtung entleert.

Die Eichung der Meßskala des Photometers erfolgt gegen eine Null-Lösung in der Durchflußküvette, gegebenen-falls gegen Luft, nicht aber gegen eine leere Küvette.

Photometer

Die Grundlagen der Photometrie und die Bautypen der ausgestellten Filterphotometer sind bereits vom biochemi-schen Praktikum bekannt. Zusätzlich stehen Spektralphotometer zur Verfügung, bei denen die Wellenlängenkontinuierlich eingestellt werden können.

C) Proteinbestimmung im Serum, Biuret-Methode

Prinzip

In der alkalischen Biuretlösung liegt Cu2+ als blauer Tartrat-Komplex vor. Proteine bilden in alkalischer Lösung mitCu2+ einen violettgefärbten Komplex, dessen Konzentration photometrisch gemessen wird (Wellenlängen:Filterphotometer λ = 578 nm, Spektralphotometer λ = 520 nm).

Serum enthält etwa 70 g/l Eiweiß.

Reagentien

1. Biuretlösung, 45 g K-Na-Tartrat, 3 g CuSO4·5 H2O, 5 g KJ, 0,2 N NaOH ad 1000 ml

2. Protein-Standard: Rinderserumalbumin 60 g/l

3. PB-Lösung: 1 Teil Protein-Standard + 9 Teile Biuret-Lösung

Geräte

Mikropipetten, Reaktionsgefäße, Polyethylen (PE)-Gefäße, Photometer, Halbmikrodurchflußküvetten


3

Versuchsansätze 1 und 4 in Reaktionsgefäßen, 2 und 3 in PE-Gefäßen (4 ml) ansetzen.

Leerwert für alle ist die Probe 6 des ersten Ansatzes.

Versuchsansatz 1Herstellen einer linearen Verdünnungsreihe der PB-Lösung

Probe 1 2 3 4 5 6

PB-Lösung (µl) 1000 800 600 400 200 0

0,2 N NaOH (µl) 0 200 400 600 800 1000

Konzentration 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

E 0,000

Versuchsansatz 2Herstellen einer geometrischen Verdünnungsreihe der PB-Lösung, Verdünnung 1:2n

Probe 1 2 3 4 5 6

PB-Lösung

0,2 N NaOH

(µl)

(µl)

1000

1000 }1000

1000 }1000

1000 }1000

1000 }1000

1000 }1000

1000

Konzentration 2-1 2-2 2-3 2-4 2-5 2-6

E

Versuchsansatz 3Herstellen einer geometrischen Verdünnungsreihe der PB-Lösung, Verdünnung 1:10n und 0,3 : 10n

Probe 1 2 3 4 5 6 7

PB-Lösung

0,2 N NaOH

(µl)

(µl)

2000

0 }500

1000

200

1800 }500

1000

200

1800 }500

1000

200

1800

Volumen (µl) 1300 1500 1300 1500 1300 1500 2000

Konzentration 1 3,3x10-1 10-1 3,3x10-2 10-2 3,3x10-3 10-3

E

Auswertung Versuche 1 - 3

Darstellung Extinktion gegen Konzentration auf Millimeterpapier und auf Doppelt-Logarithmen-Papier undZeichnung der Regressionsgeraden


4

Versuchsansatz 4Proteinbestimmung in Serum und hämolytischem Serum

(Normalserum hat bei 520/578 nm keine eigene Extinktion, nur Hb. Die Proteinkonzentration ändert sich durch dieHämolyse vernachlässigbar gering.)

Biuret-Leerwert

Albumin-Standard

Plasma hämolyt. Serum Hb-Leerwert

1 2 3 4 5 6

Probe bzw. Standard (µl) — 20 20 20 20 —

Biuretlösung (µl) 1000 1000 1000 1000 — —

0,2 N NaOH (µl) — — — — 1000 1000

E (Protein) 0,000 — —

E (Hb) — — — — 0,000

∆E (Hb) E4-E5 — — — — —

Protein (g/l) — 60 — —

Inkubation 30 min, Berechnung:

cE

EcProbe

Probe

StandardStandard= ⋅

Wenn die Biuretlösung geeicht ist, kann auch ein Umrechnungsfaktor F angegeben werden:

E · F[g/l] = c[g/l]

D) Diskussionsvorschläge

1. Welche diagnostische Bedeutung hat die Proteinbestimmung im Plasma oder Serum?

2. Welche diagnostische Bedeutung hat die Bestimmung der Hämolyse im Serum?

3. Diagnostische Anwendungsbeispiele von geometrischen Verdünnungsreihen mit Faktor 2 (Versuchsansatz2): "Titer"-Bestimmungen bei Antigen-Antikörper-Reaktionen (Schwangerschaftstest, Serologie). Wie wirktsich ein Fehler in der Verdünnungsreihe auf den "Titer" des Patienten aus?

4. Therapeutische Anwendungsbeispiele von geometrischen Verdünnungsreihen mit Faktor 10(Versuchsansatz 3) in der Homöopathie (Beispiele). Wie wirkt sich ebenfalls hier ein Fehler in derVerdünnungsreihe auf die Dosierung eines Medikaments aus? Wie sinnvoll sind homöopathischeDosierungen mit den sogenannten dekadischen Verdünnungen D von z.B. D20, D30?

5. SI-Einheiten im klinischen Labor

6. Grundlagen Photometrie

7. Fehlerdiskussion, Qualitätskontrolle, Ringversuche, Pipettierfehler, Verschleppungsfehler

8. Bestimmung der Beschleunigung von Zentrifugen (s. Abb. 1.1, S. 6)

9. Definieren von Lösungen, Ansatz von Verdünnungen in bestimmten Verhältnissen


5

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2

3

5

7

4

6

8910

10

2

3

5

7

4

6

89

10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2

3

5

7

4

6

8910

10

2

3

5

7

4

6

8910


6

r = 12

5

20

1015

G

ωω [1/min]

5·103

5·103

5·102

5·104

5·104

5·105

102

103

103

104

104

105

105

106

Abb. 1.1: Ermittlung der Beschleunigung von Zentrifugen in Vielfachen G der Erdbeschleunigung g (9,81 m/s2)in Abhängigkeit vom Radius r [cm] und der Umdrehungsgeschwindigkeit ω [1/min]o.: mittels Nomogrammu.: nach der Zentrifugengleichung:

G1g

r 2= ⋅ ⋅ω

7

AUFGABE 2: Enzymaktivitätsbestimmung in Serum und PlasmaLDH, GOT, CK, γ-GT und ChE für die Leberfunktionsdiagnostik

A) Pathophysiologisches Lernziel

Die Enzyme des Plasmas lassen sich hinsichtlich Funktion und Herkunft in drei Gruppen einteilen:

1. Die plasmaspezifischen Enzyme: Hierzu gehören das System der Blutgerinnung, z.B. Prothrombin -Thrombin, und die Cholinesterase. Ihr normaler Wirkungsort ist das Plasma, bei Schädigung ihrer Herkunfts-organe sinkt daher ihre Aktivität im Plasma. Bei Vergiftung mit organischen Phosphorverbindungen(Pflanzenschutzmittel) nimmt die Aktivität der Cholinesterase ab. Die Untersuchung der Enzyme der Blut-gerinnung (z.B. Aktivität des Thrombins) wird wegen einiger methodischer und enzymkinetischer Besonder-heiten der Meßtechnik (Gerinnungszeitmessung) in einem eigenen Kapitel Blutgerinnung (Kap. 9) behandelt.

2. Die Sekret-Enzyme: Beispiele hierfür sind die Pankreas-Amylase und Prostata-Phosphatase, die bei derSezernierung durch die exokrinen Drüsen auch in das Blut übertreten, dort aber keine Funktion haben.

3. Die zell- und organspezifischen Enzyme: Dies sind Enzyme des Zellstoffwechsels, die bei einer Zell-schädigung austreten und daher dann vermehrt im Plasma auftreten. Soweit sie nicht als Hauptkettenenzymeallen Zellen gemeinsam sind, können sie organspezifisch sein. Ihr Nachweis im Plasma erlaubt somit Rück-schlüsse auf das Herkunftsorgan. Im Plasma sind sie ebenfalls funktionslos, da hier ihre normalen Substrateund Cosubstrate fehlen. Die absoluten Konzentrationen der Enzyme im Plasma sind sehr gering (10-4 g/lgegenüber 70 g/l Gesamtprotein), so daß sie nur als Aktivitäten über die Geschwindigkeit ihres Substrat-umsatzes bestimmt werden können.

In dieser Aufgabe werden zunächst nur Beispiele der dritten Gruppe mehr oder weniger organspezifischer Enzymebehandelt. Ihre Auswahl erfolgte einerseits im Hinblick auf ihre klinisch-diagnostische Bedeutung, andererseitsunter didaktischen Gesichtspunkten zum Erlernen des Meßprinzips und der Beurteilung der Ergebnisse nachmethodischen und physiologischen Kriterien.

1. Lactat-Dehydrogenase (LDH) kommt in allen Zellen vor, d.h. sie ist nicht organspezifisch. Erhöhungen derLDH-Aktivität sind deshalb bei zahlreichen lokalisierten und Allgemeinerkrankungen zu finden. LDH tritt alstetrameres Enzym in fünf Isomeren aus den Monomeren H und M auf; aus der zusätzlichen Bestimmung derAnteile der Isoenzyme mittels Elektrophorese kann auf eine vorwiegende Beteiligung vonLeber/Skelettmuskel oder Herzmuskel/Niere geschlossen werden. Erythrozyten enthalten hohe LDH-Aktivitäten, daher ist eine Messung bei hämolytischen Seren illusorisch. Auch Thrombozyten setzen bei derGerinnung LDH frei, so daß Serum stets eine höhere LDH-Aktivität als Plasma aufweist. Beim Rind ist dieLDH-Aktivität im Serum besonders hoch.

2. Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) ist zwar in allen Geweben vertreten, jedoch hat insbesondere derHerzmuskel höhere Aktivitäten als die Leber. Somit dient GOT zusammen mit GPT (s.u.) speziell in derHumanmedizin zur Differentialdiagnose einer akuten Herzmuskelschädigung (Infarkt) gegenüber Leber-erkrankungen, bei denen beide Aktivitäten proportional verlaufen (vgl. Diskussion Enzymmuster, Enzym-quotienten, vgl. Biochemisches Praktikum Transaminierung).

3. Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) ist ein relativ leberspezifisches Enzym, die Erhöhung ihrer Aktivitätz.B. bei Hepatitiden ist unterschiedlichster Genese. Herz, Muskel, Niere und Erythrozyten haben vergleichs-weise geringe Aktivitäten und beeinträchtigen daher die Diagnose wenig.

4. Creatin-Kinase (CK) kommt vorwiegend in Herz- und Skelettmuskulatur vor. Erhöhungen im Serum könnendaher bei Herzmuskelerkrankungen (Infarkt) oder ausgedehnten systemischen Skelettmuskelerkrankungenauftreten (Muskeldystrophie, Myositis, Vitamin E-Mangel).

5. γ-Glutamyl-Transferase (γ-Transpeptidase, γ-GT) ist ein leberspezifisches Enzym, das besonders in den Epi-thelien der intrahepatischen Gallenwege vorkommt. Auffällige Erhöhung findet man bei alkoholtoxischerLeberschädigung und bei posthepatischem Ikterus (Cholestase), bei denen die Transaminasen nicht imgleichen Maß erhöht zu sein brauchen (γ-GT/GOT-Quotient; vgl. Aufgabe 12: Blutalkohol, Ethanol-Elimina-tion, sowie Vorlesung Pharmakologie, Toxikologie des Ethanols).

6. Cholinesterase (ChE) spaltet verschiedene Ester des Cholins. Da sie ein plasmaspezifisches Enzym ist, sinktihre Aktivität bei Schädigung des Herkunftsorgans, der Leber, bei Hepatitiden oder Vergiftung.

Für die klinisch-diagnostische Bewertung von Enzymaktivitätsmessungen sind allgemein folgende Punkte zuberücksichtigen:

2. Enzymaktivitäten, Leberstatus

8

1. Die biologische Verteilung, d.h. die physiologische Streubreite ist in den meisten Fällen sehr groß. Die Inter-pretation als pathologische Abweichung sollte immer im Zusammenhang mit anderen klinischen Daten erfol-gen. Zur Diagnostik trägt besonders die Beurteilung von Enzymmustern und Enzymquotienten bei (s. Abb.2.2, S. 13).

2. Enzymaktivitäten sind nicht normalverteilt, sondern log-normalverteilt, d.h. schief und sehr breit. Die häufiganzutreffende Angabe von Mittelwerten und Streuungen nach einer Normalverteilung ist unsinnig. Richtigerals Streuungsmaß ist die Angabe eines Streufaktors. Wegen der breiten Verteilung ist auch erst fürAbweichungen um ein Vielfaches des Mittelwertes eindeutig die Interpretation als pathologisch erlaubt (vgl.Diskussion log-Normalverteilung).

3. In vivo werden die Enzyme im Plasma nach einer Reaktion 1. Ordnung, d.h. exponentiell eliminiert, dieHalbwertszeiten liegen im Bereich von 2 - 12 Stunden. Diese an sich schnelle Elimination ermöglicht dieBeurteilung eines Heilungsprozesses aus dem Abklingen der Aktivität. Aktivitäten im Serum beschreibensomit immer ein aktuelles Bild.

4. In vitro ist andererseits die Erhaltung der Aktivität im Serum damit nicht gleichlaufend und meist nicht sokritisch, wie daraus zu erwarten wäre. Aktivitätsmessungen können daher bei richtiger Probenbehandlung(z.B. kühlen oder einfrieren) meist ohne wesentlichen Verlust innerhalb 24 Stunden ausgeführt werden.

B) Methodisches Lernziel

Klinisch-diagnostische photometrische Enzymaktivitätsbestimmungen(vgl. Vorlesung Biochemie, Enzymkinetik; vgl. enzymatische Substratbestimmung, Enzyme der Blutgerinnung).

Die katalytische Aktivität ist ein Maß für die Leistung eines Enzyms, stellvertretend für die sonst nicht meßbareStoffmenge des Enzyms. Die alte Einheit U (= unit) der Aktivität ist der Umsatz von 1 µmol Substrat pro Minuteunter definierten Bedingungen (1 U = 1 µmol/min). Nach dem SI-Einheitensystem gilt jedoch als Einheit katal(1 kat = 1mol/s).

Der Proportionalitätsfaktor zwischen katalytischer Aktivität A und Stoffmenge M eines Enzyms ist dieWechselzahl W.

[ ]Amol(Substrat)

sW

mol(Substrat)mol(Enzym) s

M mol(Enzym)

=⋅

⋅

Die bisher gebräuchliche Wechselzahl wird ersetzt durch die auf Enzymmenge (mol) bezogene, molare katalytischeAktivität (kat/mol).

Als Enzymkonzentrationsangabe bezieht man die Aktivität auf das Volumen Flüssigkeit (Plasma, Serum), für dasdie Bestimmung erfolgt. Hierfür galt bisher der Ausdruck "Volumenaktivität" U/l (µmol(Substrat)/(min·l)).Entsprechend gilt nach dem SI-System als Konzentrationsangabe der katalytischen Aktivität kat/l(mol(Substrat)/(s·l)). Fälschlich wird in der Medizin häufig der Ausdruck "Aktivität" und "Volumenaktivität" fürdie Konzentration synonym gebraucht.

Notwendige Voraussetzungen für sinnvolle Aktivitätsangaben sind folgende Bedingungen:

1. Substrat- und Cosubstratsättigung, d.h. deren Konzentration darf die Geschwindigkeit des Umsatzes nichtlimitieren (für S >> KM wird v ∝ E).

2. Definierte, gegebenenfalls optimale Konzentration von Aktivatoren

3. Bei Folgereaktionen (sog. zusammengesetzte Tests) muß die eigentliche Meßreaktion der geschwindigkeits-bestimmende Schritt sein.

4. Die Messung muß im linearen Teil der Umsatzkurve, d.h. unter "Anfangsbedingungen" erfolgen.

5. Allgemein ist als Bezugstemperatur 25°C festgelegt worden. Andere Meßtemperaturen müssen angegebenwerden (z.B. Aldolase bei 37°C).


9

Da im Praktikum nicht mit thermostatisierten Küvetten und Photometern gemessen werden kann, ergebensich Aktivitätsangaben für Raumtemperatur. Sie können nur unter der Bedingung, daß der Temperatur-koeffizient der Reaktion bekannt ist und in einem nicht zu großen Temperaturbereich gemessen wird, auf eineBezugstemperatur umgerechnet werden. Der Temperaturkoeffizient Q10 ist das Verhältnis der Reaktions-geschwindigkeiten bei 10 Grad Temperaturunterschied. Für Q10 = 2 ergibt sich daraus die Formel

A A 2 A 1,0725 T

TT

TT= ⋅ ≈ ⋅

∆ ∆

und in vereinfachter Form

A A (1 0,1 T)25 T= ⋅ + ∆

wobei AT die bei der Temperatur T gemessene Aktivität und ∆T die Temperaturdifferenz gegen die Soll-temperatur 25°C sind.

Hier im Praktikum dient diese Abschätzung nur dazu, das Ausmaß eines Temperaturfehlers zu erfassen.Selbstverständlich ist unter korrekten Routinebedingungen eines klinischen Labors für Aktivitäts-bestimmungen mit einem thermostatisierten Photometer bei der Solltemperatur zu arbeiten. Aus derbeschriebenen Temperaturabhängigkeit der Reaktion ergibt sich für ± 1°C Abweichung ein Fehler von ca. ±10 %

6. Definierte, jedoch nicht notwendigerweise "optimale" Werte für pH, Pufferkonzentration und Kapazität.

7. Im Testansatz muß die Enzymkonzentration genügend gering sein, damit die gemessene Umsatzgeschwin-digkeit der Aktivität noch proportional ist. Hierzu ist die Probe evtl. zu verdünnen, wenn der Meßbereich desTests überschritten wird.

8. Die Umrechnung der gemessenen (konzentrations-proportionalen) Extinktionsänderung ∆E/∆t in die(massen-proportionale) Aktivität ∆S/∆t erfolgt unter Berücksichtigung des Testvolumens und des molarenExtinktionskoeffizienten des chromogenen (Co)-Substrates, z.B.

ε340 nm ε365 nm l / (mol · cm)

NADH 6,3 3,4 · 103

NADPH 6,3 3,5 · 103

Durch Bezug auf das eingesetzte Enzymvolumen (Serum, Plasma) erhält man die eigentliche Volumen-aktivität. Für die standardisierten, kommerziellen Tests sind diese Werte in dem sog. "Umrechnungsfaktor" Fzusammengefaßt.

Act

E ft d

moll s

Et

F= =⋅

⋅ ⋅ ⋅

= ⋅∆∆

∆∆

∆∆ε

f = Verdünnungsfaktor der Probe im Ansatz; F = Gesamt-Umrechnungsfaktor

Bei den standardisierten optischen Verfahren wird die Reaktionsfolge so geführt, daß die Messung an Verbrauchoder Bildung eines geeigneten chromogenen (Co)-Substrates oder Produkts erfolgt. Natürliches chromogenesSubstrat von Dehydrogenasen ist z.B. das System NAD+ / NADH. Chromogene Substrate für Phosphatasen (vgl.Biochemisches Praktikum), Esterasen, Transpeptidasen (vgl. γ-GT) sind z.B. p-Nitrophenylester, für Peroxidasenz.B. ABTS, Dianisidin, Benzidin (vgl. enzymatische Cholesterolbestimmung).

Daraus ergibt sich zwanglos die Reihenfolge der hier aufgeführten Tests:

1. LDHEinfacher Test, Messung im UV

Pyruvat + NADH + H+ LDHLactat + NAD+

Messung des NADH-Verbrauchs aus der Extinktionsabnahme bei 340 nm (Absorptionsmaximum) oder 365 nm(Hg-Linie).


10

2. GPTZwei Folgereaktionen, zusammengesetzter Test

a) L-Ala- + αKG GPT

Pyruvat + L-Glu (Meßreaktion)

b) Pyruvat + NADH + H+ LDH

Lactat + NAD+ (Indikatorreaktion)

3. GOT (AST)

a) L-Asp + α-Oxoglutarat GOT

Oxalacetat + L-Glu

b) Oxalacetat + NADH + H+ MDH

Malat + NAD+

4. CKDrei Folgereaktionen, Messung der NADPH-Bildung aus der Extinktionszunahme, ADP wird in der zweitenReaktion regeneriert.

a) Creatinphosphat + ADP CK

Creatin + ATP

b) ATP + D-Glucose HK

ADP + G6P

c) G6P + NAD G6P-DH

6-Phosphogluconat + NADH

5. γ5. γ-GT

Einfacher Farbtest, Messung im sichtbaren Bereich (405 nm)

γ-Glu-Carboxy-Nitroanilid + Gly-Gly-NH2-GTγ

Amino-Nitrobenzoat + Glu-Gly-NH2

6. ChE

Zwei Folgereaktionen; die zweite Reaktion ist eine nicht-enzymatische und nicht-limitierende chromogeneReaktion

a) Butyrylthiocholin + H2O ChE

Thiocholin + Butyrat

b) Thiocholin + Dithio-nitrobenzoesäure 5-Thio-2-Nitrobenzoesäure

Reaktionsgemischeliegen fertig vor, angegebene Konzentrationen beziehen sich auf den Meßansatz

1. LDH: Reag. A: Phosphatpuffer pH 7.5, 50 mmol/l; NADH 0,18 mmol/lReag. B: Pyruvat 0,60 mmol/lB + A = 1 + 25

2. GOT: 0,18 mmol NADH, 12 mmol/l α-Oxoglutarat, 200 mmol/l L-Aspartat, 1,2 kU/l LDH, 0,6 kU/l MDH, 80mmol/l Phosphatpuffer pH 7,4

3. CK: Creatinphosphat 30 mmol/l, ADP 2 mmol/l, AMP 5 mmol/l, NAD 2 mmol/l, N-Acetyl-L-Cystein 20mmol/l, HK 3000 U/l, G6PDH 2000 U/l, Mg2+ 10 mmol/l, D-Glucose 20 mmol/l, Di(adenosin5')pentaphosphat 10 µmol/l, EDTA 2 mmol/l, Puffer pH 6,7, 0,05% NaN3, Stabilisatoren, Füllstoffe

4. γ-GT: 4,36 mmol/l L-γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid, 60 mmol/l Glycylglycin, 0,05% NaN3, Puffer, Füllstoffe

5. ChE: Puffer, pH 7,2, 0,25 mmol/l 5,5'-Dithio-bis-nitrobenzoesäure, 5 mmol/l Butyryl-thiocholinjodid

Geräte

Mikroliterpipetten, Halbmikro-Durchflußküvette, Photometer


11

VersuchsansätzePhotometer auf einen mittleren Extinktionswert, etwa 0,3 einstellen.

LDH GOT CK γ-GT ChE

Reaktions-Gemisch (µl) 1000 1000 1000 1000 1000

Probe (µl) 50 100 20 100 20

mischen, messen nach

30 s sofort 3 min 1 min 30 s

Wellenlänge (nm) 365 365 365 405 405

Messung E ∆E E ∆E E ∆E E ∆E E ∆E

t (∆t = 30 s) E0

E1

E2

E3

E4

∆E/min (Mittel)

Testgrenze*(∆E/min)

≥ 0,050 ≥ 0,080 ≥ 0,140 ≥ 0,270≥ 1,87

(≅7000 U/l)

Faktor (µmol/l) 6176 3235 15000 2210 3750

Aktivität (U/l)

(kat/l)

Temperatur (°C)

Korr. Aktivität A25

Obergrenze Normalwerte (U/l) Bereich

Rind 1500 80 40 27 —

Pferd 400 220 50 15 2500-4000

* Bei Überschreiten der angegebenen Umsatzraten (∆E/min) bzw. Aktivitäten sind die Proben zu verdünnenund die Meßergebnisse für die verdünnten Proben mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren.


12

Beurteilung der Verteilung von Enzymaktivitäten

In der Klinik spielt die Beurteilung von Laborwerten individueller Patienten eine wichtige Rolle. Um Laborwertesinnvoll für die Diagnostik nutzen zu können, müssen zunächst aus einer möglichst großen Population gesunderbzw. eindeutig erkrankter Tiere die Art der Verteilungen, Mittelwerte und Streuungen bekannt sein, um zwischen"normal" und "pathologisch" entscheiden zu können. In Überschneidungsbereichen müssen die Grenzendefiniert werden, da dort hohe Irrtumswahrscheinlichkeiten für "falsch positiv" und "falsch negativ" vorliegen,die den Wert des diagnostischen Parameters begrenzen.

Biologische Verteilungen sind in vielen Fällen, wie hier am Beispiel von Enzymaktivitäten gezeigt, nicht symme-trisch (d.h. nicht normal-verteilt). Oft können sie durch Logarithmieren des Merkmals symmetrisch gemachtwerden (log-normalverteilt).

Schiefe Verteilungen (hier Enzymaktivitäten im Serum) ergeben sich im Blut durch das wechselnde Fließgleich-gewicht zwischen Zufluß (aus den Zellen) und Abfluß (Abbau, Ausscheidung).

Das Problem der korrekten Behandlung schiefer Verteilungen stellt sich häufig bei der Erstellung sogenannterNormalwerte für die Klinik, bei der Auswertung von Tierversuchen oder bei Dissertationen.

Um in der klinischen Diagnostik die Angabe von "Normalwerten" oder "Normalbereichen" von Enzymaktivitätenund ihren Änderungen z.B. im Verlauf einer Erkrankung als signifikant oder nicht-signifikant einschätzen zulernen, sollen am Beispiel der GOT die Eigenschaften log-normaler Verteilungen aufgezeigt werden.

1. Bilden Sie in den Wertetabellen die prozentualen Häufigkeiten (%) und die Summenhäufigkeiten (Σ%) durchAufsummieren aller relativen Häufigkeiten von Zeile zu Zeile bis 100 %.

2. Tragen Sie die Summenhäufigkeiten und die relativen Häufigkeiten auf Einfach-Logarithmenpapier auf (log-Normalverteilungen werden so symmetrisch dargestellt).

3. Tragen Sie die Summenhäufigkeiten und die relativen Häufigkeiten jeweils auf linearem und logarithmischemWahrscheinlichkeitsnetz auf (log-Normalverteilungen ergeben eine Gerade im logarithmischen Netz).

4. Diskutieren Sie anhand dieser vier Darstellungen die Eigenschaften der log-Normalverteilung im Vergleichzur Normalverteilung (Mittelwerte, Streuungsmaße).

5. Diskutieren Sie die diagnostische Bewertung von Enzymaktivitätsbestimmungen, Enzymmustern, Enzym-quotienten.

GOT Frauen

Aktivität [U/l]

An

zah

l

0100200300400500600

4 8 12 16 20 24 28

GOT Männer

Aktivität [U/l]

An

zah

l

0100200300400500600

4 8 12 16 20 24 28

Abb. 2.1: schiefe Verteilungen der GOT-Aktivitäten imSerum gesunder Frauen und Männer

GOT Frauen Männer

Klasse N % Σ% N % Σ%

4 30 15

6 210 150

8 340 335

10 450 580

12 285 510

14 125 330

16 50 200

18 15 100

20 10 50

22 5 25

24 20

26 10

28 5

30

Σ 1520 100 2330 100


13

10

1

100

1000

gesunde Leber akute Hepatitis Leber-Carcinom

1 2 3 4 5 6

10

1

100

1000

1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6U/l

Enzyme:

1 GOT

2 GPT

3 GLDH

4 LDH

5 GGTP

6 CHE

Abb. 2.2: "Spektren" von Enzymaktivitäten bei verschiedenen Lebererkrankungen gegenüber gesunder Leber.(Beachte die logarithmische Auftragung der Aktivitäten!)

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

15

AUFGABE 3: Enzymatische Substratbestimmungen

A) Lipide (Cholesterol, Triglyceride, Glycerol)

Die Serum-Lipide, ihre klinische Bedeutung und ihre enzymatischen Bestimmungsmethoden weisen gegenüberden anderen klinisch-chemischen, hier im Praktikum besprochenen Parametern und Methoden einigeBesonderheiten auf.

1. Die Zusammensetzung der Lipidfraktion des Blutes ist sehr viel stärker ernährungsabhängig und kann somitkurzzeitig über einen breiten Bereich wechseln.

2. Da die Lipide des Plasmas praktisch nicht wasserlöslich sind, erfolgt ihre Lösungsvermittlung einerseits inden Chylomikronen über die Phosphatide und Lipoide, andererseits durch die Bindung an Proteine.

3. Erst in den letzten Jahren konnten auch für diese nicht-wasserlöslichen Fraktionen enzymatischeBestimmungsmethoden eingeführt werden, die die Analytik auf eine bessere Basis stellten.

Von praktischer Bedeutung sind die Bestimmungen von Cholesterol und von Neutralfett (Triglyceride), für diehier die enzymatischen Bestimmungsverfahren vorgestellt werden. Als Anwendungsbeispiel werden dieÄnderungen der Lipidzusammensetzung des Serums und der Glucosekonzentration zu verschiedenen Zeiten derBlutentnahme nach einer fettreichen Fütterung beim Hund untersucht.

Enzymatische Bestimmung des Gesamtcholesterols

Cholesterol liegt im Plasma frei und als Fettsäureester vor. Bestimmt wird das Gesamtcholesterol nach enzyma-tischer Hydrolyse der Ester. Die Reaktion besteht aus drei Folgereaktionen:

1. Cholesterolester + H2OCholesterolesterase

Cholesterol + Fettsäure

2. Cholesterol + O2Cholesteroloxidase

∆4-Cholestenon + H2O2

3. 2 H2O2 + DH2Peroxidase

2 H2O + D

In der ersten Reaktion wird der Anteil Cholesterolester durch eine bakterielle Cholesterolesterase hydrolysiert.

In der zweiten Reaktion erfolgt eine Oxidation des gesamten Cholesterols über eine bakterielle Cholesteroloxidasezu ∆4-Cholestenon. Diese Oxidase bedingt die Spezifität der Reaktion. Die Übertragung des Wasserstoffs erfolgtbei diesem bakteriellen Enzym direkt auf gelösten Sauerstoff unter Bildung von H2O2.

In der dritten Reaktion erfolgt die Bestimmung des H2O2 durch Peroxidase mittels eines der üblichen chromogenenRedox-Substrate (D = Donator; vgl. Analogie zur Blutglucosebestimmung).

Enzymatische Bestimmung der Triglyceride (Neutralfett)

Sie ist der Cholesterolbestimmung völlig analog.

1. Triglycerid ("Glycerolester") + 3 H2O Esterase / Lipase Glycerol + 3 Fettsäuren

2a. Glycerol + ATP Glycerokinase Glycerol-1-Phosphat + ADP

2b. ADP + PEP Pyruvatkinase ATP + Pyruvat

3. Pyruvat + NADH + H+ LDH Lactat + NAD+

In der ersten Reaktion werden durch eine Lipase die durch Chylomikronen und Lipoproteide emulgierten Tri-glyceride hydrolysiert zu freiem Glycerol und freien Fettsäuren.

Der zweite Schritt besteht darin, Glycerol durch das System Glycerokinase-Pyruvatkinase über eine Kreislauf-reaktion ADP-ATP an PEP zu koppeln, wobei Pyruvat entsteht, ATP wird regeneriert.

3. Cholesterol, Triglyceride, Lipidstatus

16

Pyruvat dient in der dritten Reaktion als Substrat für LDH und liefert die übliche NADH-abhängige,photometrisch faßbare Reaktion (vgl. hierzu Aufgabe 3: LDH-Enzymaktivitätsbestimmung, CK hinsichtlichRegeneration von ADP-ATP; Cholesterol hinsichtlich Reaktionsführung).

Es entsteht ein mol NAD pro mol Glycerol bzw. pro mol Triglycerid. Es kann daher die molare Triglycerid-konzentration errechnet werden. Trotzdem wird heute noch die Neutralfettkonzentration unter Zuhilfenahme einesmittleren Mol-Gewichts in g/l angegeben (vgl. Diskussion Fettsäurezusammensetzung).

B) Enzymatische Glucose-Bestimmung (GOD-POD)

Der Blutglucosespiegel stellt die Gleichgewichtskonzentration der Glucose im Blut dar, die sich aus der simultanenWirkung von Resorption aus der Nahrung und Metabolisierung nach Phosphorylierung über die Glycolyse mitSpeicherung als Glycogen ergibt. Regulatorisch kommen die Eliminationsschwelle der Niere (vgl. S. 48, Abb. 10.1)sowie die steuernde Funktion des Insulins hinzu.

Von den enzymatischen klinischen Methoden liegt der Typ der Substratbestimmungen als sog."Endpunktmethode" vor als Beispiel für einen Test mit gekoppelten Reaktionen: substratspezifische ersteenzymatische Reaktion, deren Endprodukt wiederum Substrat einer evtl. unspezifischen, jedoch meßtechnischbrauchbaren enzymatischen Reaktion ist.

Bei allen Metabolit-(Substrat)-Bestimmungen ist die sofortige Enteiweißung der Probe (Blut, Plasma) mitPerchlorsäure oder Trichloressigsäure (TCA) notwendig, um den enzymatischen Abbau bzw. eine Umverteilungaus den Zellen zu vermeiden.

Bei der enzymatischen Bestimmung der Glucoseoxidase (GOD) und Peroxidase (POD) laufen folgende Reaktionenab:

1. βD-Glucose + O2 GOD-FAD

Gluconolacton + H2O2

2. H2O2 + DH2 POD

2 H2O + D

In der ersten, glucose-spezifischen Reaktion oxidiert GOD-FAD die β-Glucose zu Gluconolacton und der Wasser-stoff wird vom FAD-H2-Enzym direkt auf gelösten Luftsauerstoff übertragen unter Bildung von H2O2. βD-Glucosesteht mit αD-Glucose im Gleichgewicht.

In der zweiten, der Indikatorreaktion überträgt Peroxidase Wasserstoff von einem Redoxindikatorfarbstoff DH2 alsDonator auf H2O2 unter Bildung von Wasser. Die Oxidation des zunächst farblosen Indikators DH2 (ABTS) istphotometrisch meßbar. Bei Überschuß von GOD, POD und DH2 ist die Indikatorbildung proportional derumgesetzten Glucosemenge.

Reagentien

- für die Triglycerid-Bestimmung

Reagenz A:(Substratlösung)

1. ATP 0,4 mmol/l2. LDH 3000 U/l3. Lipase 30000 U/l4. NADH 0,27 mmol/l

5. PEP 0,5 mmol/l6. PK 2000 U/l7. Puffer pH 7,28. nicht reaktive Stabilisatoren und Füllstoffe

Reagenz B: 1. GK 16000 U/l 2. nicht reaktive Stabilisatoren und Füllstoffe

Reaktionsgemisch: 1 Teil Reagenz A + 0,025 Teile Reagenz B

- für die Cholesterol-Bestimmung (Endkonzentrationen im Test)

Reaktionsgemisch: Puffer, pH 6,54-Aminoantipyrin 0,3 mmol/lp-Hydroxybenzolsulfonsäure 30 mmol/lStabilisatorenFüllstoffe

Cholesterol-Esterase ≥ 100 U/lCholesterol-Oxidase ≥ 300 U/lPeroxidase ≥ 1000 U/l

Standard 2 g/l (= 5,18 mmol/l)


17

- für die Glucose-Bestimmung

Perchlorsäure 0,33 mol/l (HClO4): Die Enteiweißung erfolgt im Verdünnungsverhältnis 1:11

Glucose-Standardlösung 91 mg/l (entspricht 100 mg C6H12O6·1H2O/l = 0,51 mmol/l)

"Glucose-Reagens" GOD-POD-ABTS-Lösung: POD > 0,8 kU/l, GOD > 10 kU/l, 1,0 g/l ABTS in 0,1 mol/lPhosphatpuffer pH 7,0 (ABTS = 2,2'Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)

Geräte

Mikroliterpipetten, Reaktionsgefäße, Zentrifuge, Rüttler, Photometer

Leerwert und Proben sind gegen Wasser als Nullwert zu messen.

Versuchsansatz Triglyceride

Leerwert Proben

Blutentnahme (min) — nüchtern

Reaktionsgefäß Nr.

Reaktionsgemisch (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Plasma (µl) — 20 20 20 20 20

H2O (µl) 20 — — — — —

Mischen und ca. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren

E365 nm (gegen H2O)

ELeerwert - EProbe —

cTriglyceride (g/l) —

Berechnung der Konzentration aus der Extinktionsdifferenz: x 7,26. Bei Konzentrationen über 5 g/l ist die Probe 1:2(d.h. 1 Teil Probe + 1 Teil Lösungsmittel) mit isotonischer Kochsalzlösung zu verdünnen und die Bestimmung zuwiederholen; für die Berechnung ist der Verdünnungsfaktor zu beachten.

Trübe, stark hämolytische oder ikterische Proben täuschen niedrige Triglycerid-Werte vor. Für sie ist einProbenleerwert zu bestimmen (vgl. Aufg. 1). Dazu wird zu einer Probe isotonische Kochsalzlösung anstelle desReaktionsgemisches gegeben und der erhaltene Leerwert zum Extinktionswert addiert.


18

Versuchsansatz Gesamtcholesterol

Leerwert Standard Proben

Blutentnahme (min) — — nüchtern


Reaktionsgemisch (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Standard — 20 — — — — —

Plasma (µl) — — 20 20 20 20 20

H2O (µl) 20 — — — — — —

Mischen, 10 min bei Raumtemperatur (5 min 37°C) inkubieren,innerhalb 30 min messen

∆E500nm (Spektral)∆E546nm (Filter)

0,000

c (g/l) 2,0

Berechnung: cE

EcProbe

Probe


Proben mit Konz. > 6 g/l werden 1:2 mit isotonischer NaCl verdünnt erneut gemessen, Ergebnis x 2

Versuchsansatz Glucose (vgl. auch Aufgabe 7)

Leerwert StandardProben

Blutentnahme (min) — — nüchtern


Glucose-Reagens (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

enteiw. Überstand (µl) — — 100 100 100 100 100

Glucose-Standard (µl) — 100 — — — — —

H2O (µl) 100 — — — — — —

Mischen, 20 min bei Raumtemperatur (15 min bei 37°C) inkubieren,kein direktes Sonnenlicht

E578nm 0,0

cGlucose (mmol/l) — 0,51

Berechnung: cE

Ec VerdünnungsfaktorProbe

Probe

StandardStandard= ⋅ ⋅ Verdünnung 1:11 (durch Enteiweißung)


19

Auswertung

Tragen Sie den zeitlichen Verlauf der Triglycerid-, Cholesterol- und Glucosekonzentration auf mm-Papier auf.

C) Diskussionsvorschläge

1. Klinisch-diagnostische Bedeutung Cholesterol, Triglyceride, Glucose

2. Fettverdauung im Darm, Resorption, Lipidtransport

3. Emulgation, Lösungsvermittlung

4. "Normalwerte", physiologische Schwankungsbreite, Speziesunterschiede, Abhängigkeit von der Ernährung,ernährungsphysiologische Bedeutung

Normalwerte Mensch

Blutglucose 3,3 - 5,0 mmol/l (1,0-1,2 g/l)

Triglyceride 0,5 - 1,1 mmol/l

Cholesterol 2,8 - 7,8 mmol/l

21

AUFGABE 4: Immunoassays

A) Methodisches Lernziel

Prinzip und Methodik von Immunoassays

Das Prinzip der Immunoassays beruht auf der kompetitiven und kooperativen Wechselwirkung eines markiertenund daher meßbaren Liganden (L*) und eines nichtmarkierten Liganden (L), nämlich der gesuchten Verbindung,mit derselben Bindungsstelle eines Proteinmoleküls (P).

nL + mP LnPm

nL* + mP L*nPm

Nach dem Massenwirkungsgesetz ergibt sich die Konzentration des Komplexes [LP] als Funktion der Ligand-konzentration [L] zu:

L PL P L

K Ln m

n m max

b

b=⋅

+

Dieser Zusammenhang entspricht der kooperativen Enzymkinetik (Hill-Gleichung), so daß von hier alle bereitsbekannten Vorstellungen analog übernommen werden können (Ligand ≅ Substrat, Protein ≅ Enzym, LP ≅ ES ∝ v,L* = kompetitives Substrat, b = Hill-Exponent; vgl. Biochemisches Praktikum, Forth). Immunoassays sind durchdie hohe Spezifität und damit Nachweisempfindlichkeit von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungenausgezeichnet.

Beim Radioimmunoassay (RIA) dient die kompetitive Verdrängung des radioaktiv markierten, in definierter Mengevorgegebenen Antigens (*Hormon) aus einer definierten und limitierten Anzahl von Bindungsstellen des(Hormon-) Antikörpers durch das unmarkierte Antigen (Hormon) zu dessen Bestimmung. Gemessen wird dieKonzentration des markierten Komplexes (Abb. 4., S. 24). Z.B. werden in einem Radioimmunoassay fürProgesteron bekannte Mengen Antikörper und markiertes Hormon zur Gleichgewichtseinstellung so vorgelegt,daß etwa 50 % der Radioaktivität als Antikörperkomplex vorliegt. Zugabe von unmarkiertem Hormon verdrängtmarkiertes Hormon, so daß weniger markierter Komplex entsteht.

Progesteron + Antiserum Progesteron-Antikörper-Komplex

125J-Progesteron + Antiserum 125J-Progesteron-Antikörper-Komplex

Nach Einstellung des Gleichgewichts wird das verbleibende freie 125J-Progesteron an Aktivkohle adsorbiert, nachZentrifugation der in Lösung verbleibende 125J-Progesteron-Antikörper-Komplex dekantiert und die Aktivität desaktivkohlegebundenen freien 125J-Progesterons im Sediment mit einem Gamma-Zähler gemessen.

Immunoassays sind für sehr viele Hormone verfügbar (z.B. ChGT, Östrogene, Testosteron, Corticosteroide,Insulin, STH, T4, TSH) und zwar sowohl für Proteohormone als auch für die niedermolekularen Hormone, da auchgegen diese als Haptene Antikörper erzeugt werden können.

Radioimmunoassays stellen unter den Immunoassays eigentlich nur einen meßtechnischen Sonderfall dar. Es gibteine Vielzahl klinischer, mikrobiologischer, serologischer, gynäkologischer oder pharmakologischerTestverfahren, die alle auf demselben Prinzip der kompetitiven immunologischen Wechselwirkung beruhen. Alleinwegen der unterschiedlichen Terminologie in den verschiedenen medizinischen Disziplinen ist jedoch der Studenthäufig gezwungen, unnötigerweise denselben Zusammenhang unbewußt mehrfach zu lernen (vgl. Diskussion).

Bei den Enzymimmunoassays (EIA) ist das Hormon des Testsystems durch ein Enzym markiert. Dessen Aktivitätals Maß für die Bindung bzw. Verdrängung des enzymmarkierten Hormons kann photometrisch am Umsatz eineschromogenen Substrats gemessen werden (vgl. Aufgabe 3, Enzymaktivitäten). Hierbei gibt es zwei Varianten:

1. EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique): Das Enzym, mit dem das Hormon des Testsystemsmarkiert ist, wird entweder inaktiviert, wenn eine Bindung an den Hormon-Antikörper erfolgt, oder, wie beidem unten genannten T4-Test, gerade durch die Bindung an den Antikörper aktiviert. Für die Messung ist indiesem Fall keine zusätzliche Trennung des gebundenen vom freien Hormon notwendig.

4. Immunoassays, Phenobarbital

22

2. ELISA (Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay): Das markierte Enzym-Hormon ist sowohl in freier Form alsauch im Hormon-Antikörper-Komplex aktiv. Zur Messung des gebundenen Anteils muß also eine Phasen-trennung erfolgen. Dies wird ermöglicht durch Immobilisierung des Hormonantikörpers an Partikeln oder andie Gefäßoberfläche (solid phase immunoassay). Die Trennung von freier und gebundener Enzymaktivitäterfolgt dann je nach Test durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Waschen.

Enzym-Immunoassays sind sowohl für den Nachweis von Pharmaka (Drogen, Antiepileptica, Narkotica, Digoxin)als auch für Hormone (T3, T4) verfügbar.

Reaktionsschema der Thyroxin (T4)-Bestimmung als Beispiel eines Enzym-Immunoassaysnach dem EMIT-Prinzip

1. T4-Freisetzung im Serum:

Protein-T4 + Detergens T4 + Protein-Detergens

2. Immunreaktion:

T4 + Ak T4-Ak-Komplex

3. Kompetitives Testsystem mit Malatdehydrogenase (MDH)

T4-MDH (inaktiv) + Ak MDH-T4-Ak-Komplex (aktiv)

4. Meßreaktion:

Malat + NAD+ MDH Oxalacetat + NADH

Gemessen wird die Umsatzgeschwindigkeit von NAD+ aus der Zunahme der Extinktion bei 340 (365) nm inAnalogie zu den auf NAD+ als chromogenes Substrat ausgelegten klinischen Enzymaktivitätsbestimmungen (vgl.Aufgabe 3 sowie Biochemisches Praktikum).

Durchführung eines Immunoassays am Beispiel der Bestimmung von Phenobarbital

Phenobarbital gehört zu den Barbituraten, die therapeutisch als Schlafmittel, Sedativa, Narkotica, Antikonvulsivaund Antiepileptica eingesetzt werden. In der Tiermedizin wird Phenobarbital (Ph) hauptsächlich als Sedativumund Antiepilepticum angewendet. Seine Halbwertszeit beträgt 3 - 4 Tage.

Reaktionsschema

1. Immunreaktion:Ph + Ak Ph-Ak-Komplex

2. Kompetitives Testsystem:G6PDH·Ph (aktiv) + Ak G6PDH·Ph-Ak-Komplex (inaktiv)

3. Meßreaktion:

G6P + NAD+ G6PDH·Ph6-Phosphogluconat + NADH + H+

Es handelt sich hierbei um einen homogenen Enzymimmunoassay (EIA). Gemessen wird die Umsatz-geschwindigkeit des NAD+ als chromogenes Cosubstrat aus der Änderung der Extinktion bei 340 (365) nm. DieMeßreaktion entspricht derjenigen der Kreatinkinasebestimmung (vgl. Aufgabe 3). Im Unterschied dazu inter-feriert jedoch hier die endogene G6PDH des Serums (mit NADP als Cosubstrat) nicht mit dem EIA, da hier dasCosubstrat NAD+ nur mit der im Test verwendeten bakteriellen G6PDH reagiert.

Reagentien (VORSICHT! Alle Lösungen enthalten 0,05 % Na-Azid!)

1. Lösung A: Antikörper/Substratreagens, verdünnt 1:6 mit Tris-Puffer

2. Lösung B: Enzymreagens, verdünnt 1:6 mit Tris-Puffer

3. Standards in den Konzentrationen 0, 10, 20, 40, 80 mg/l, verdünnt 1:6 mit Tris-Puffer

4. Verdünnungspuffer: Tris-Puffer

5. Probe: Kontrollserum


23

Versuchsansatz (im Reaktionsgefäß)

Standards Probe

Standard bzw. Probe (µl) 100 100 100 100 100

Puffer (µl) 500 500 500 500 500

von hier an alle Proben einzeln weiterbehandeln:200 µl der angesetzten Verdünnung (Probe/Standard) mit 200 µl Lösung A mischen, 200 µlLösung B zugeben, mischen, Mischung in die Küvette überführen. Messung bei 340 (365) nm: E1

sofort, E2 nach 30 s ⇒ ∆E

E1

E2

∆E/min

c (mg/l)

Auswertung

Bestimmung von cProbe aus der Eichkurve ∆E gegen cStandard auf mm-Papier

Abb. 4.1: ELISA mit Kompetition um Festphasenanalyt (nach Roche Diagnostics GmbH)

Abb. 4.2: ELISA mit Sandwichprinzip (nach Roche Diagnostics GmbH)


24

100 200 300 4000

50

100

%

[H ·K]*

H*

g/l Hµµ

0

50

100

50 100 500

[H ·K]*

%

10

g/l Hµµ

99

95

90

70

50

30

10

5

1

-4

-2

0

2

4

10 50 100 500

logit %

[H ·K]*

logit p =p

1 - pln

g/l Hµµ

Abb. 4.3: Kennlinien und Auswertungen von Immunoassays, Beispiel RIAo.: Auftragung des freien (H*) und des komplexgebundenen markierten Hormons ([H*·K]) in

Abhängigkeit von der Konzentration des nichtmarkierten Hormons H.links u.: Relative Bindung (%[H*·K]) als Funktion des Logarithmus der Konzentration von H.rechts u.: Linearisierung von Bindungskurven durch logit-log-Transformation.

B) Diskussionsvorschläge

1. Analogie zur kompetitiven Hemmung bei enzymatischen Reaktionen, graphische Auswerteverfahren undTransformationen, Kooperative Enzym-Wechselwirkung, Hill-Gleichung

2. Weitere Immunbindungstests: Schwangerschaftstests, Choriongonadotropinbestimmung, Hämagglutina-tions-(Hemmungs)tests, Solid-phase-Immunoassays, Enzymimmunoassays

3. Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung, Dosis-Wirkungs-Beziehung in der Pharmakologie

4. Nachweisempfindlichkeit von Immunoassays


25

27

AUFGABE 5: Immunologische Nachweise von Choriongonadotropin (HCG);Schwangerschaftstests, Trächtigkeitsnachweis

A) Physiologisches Lernziel

Choriongonadotropin wird in den Langerhans-Zellen der Chorionzotten der Plazenta gebildet und hat dieAufgabe, das zyklische Corpus luteum in ein Corpus luteum graviditatis zu überführen. Es ist ein Proteohormonmit einem Molekulargewicht von 60 - 80 kD und artspezifischen Unterschieden. HCG ist im Blut und Harn etwazwei Wochen nach der Konzeption bzw. bereits nach etwa 8 Tagen nach dem Ausbleiben der Menstruation beider Frau nachweisbar.

Bei der Stute kann ein Trächtigkeits-Gonadotropin im Serum u.a. mittels Hämagglutinationshemmungstest nach-gewiesen werden. Es erreicht seine höchste Konzentration etwa 2 Monate nach dem Decken, fällt dann wieder abund ist ab etwa 4 Monaten nicht mehr nachzuweisen.

Abb. 5.1: Verlauf der HCG-Konzentration bei der Frau nach der Empfängnis (aus Laurell et al. 1980)


Die Agglutinations- und Agglutinationshemmungstests beruhen ebenso wie die Radioimmunoassays undEnzymimmunoassays auf der kompetitiven Wechselwirkung des gesuchten Hormons mit einem Antigen-Antikörper-Testsystem. Der Unterschied liegt nur in der Markierung und damit in der Meßreaktion. Im Gegensatzzur Isotopen- oder Enzym-Markierung ist hier das Hormon des Testsystems "Partikel-markiert", d.h. es ist angroße Partikel (Erythrozyten, Latexkugeln) gebunden. Man unterscheidet:

a) Hämagglutinations(hemmungs)tests

b) Latexagglutinations(hemmungs)tests

Das zu bestimmende freie Hormon besetzt kompetitiv die Bindungsstellen des partikelgebundenen Hormons andem Hormonantikörper des Testsystems (B-Test, MIP-Test). Diese Wechselwirkung führt zu einer Vernetzung derPartikel durch die Antikörper und ist als Agglutination visuell leicht erkennbar. Bei Schwangerschaftstests ist dieAgglutination im Sinne einer Ja-Nein-Entscheidung zu beurteilen.

Die Komponenten eines Hämagglutinin-Hemmungstests (z.B. Anti-HCG-Serum und HCG-beladene, Tannin-stabilisierte Erythrozyten) sind so dosiert (vgl. Prinzip RIA, Aufgabe 5), daß die Reaktion zwischen Anti-HCG-

5. Schwangerschaftstests

28

Serum und HCG-Erythrozyten zu einer Agglutination führt, die die Erythrozyten diffus in Suspension erhält, bzw.diffus sedimentieren läßt: negatives Ergebnis.

Setzt man aber HCG-haltigen Schwangerenharn zu, so wird der HCG-Antikörper vom Harn-HCG gebunden. Durchdiese kompetitive Verdrängung können die HCG-Erythrozyten nicht mehr reagieren, sie bleiben isoliert, d.h.unagglutiniert, und sedimentieren zu einem deutlichen, scharf abgesetzten, rotbraunen Ring oder Knopf amBoden des Reagensglases: Positives Ergebnis.

Auch Latex-Tests können sowohl als Agglutinationstests (Rapitex) als auch als Agglutinationshemmungstests(Gravindex) ausgelegt sein.

Für die Anwendung verschiedener kommerzieller Festphasen-(Latex-, Erythrozyten-)Immunoassays wird daraufaufmerksam gemacht, daß das Ergebnis "Agglutination" unterschiedliche Bedeutung "positiv" oder "negativ"haben kann, je nachdem, ob (z.B. aus patentrechtlichen Gründen bei verschiedenen Herstellern) das Hormonselbst oder sein Antikörper an die Partikeln (Latex, Erythrozyten) gebunden wurde: Agglutinationstest (Aggl. =pos.) bzw. Agglutinationshemmungstest (Aggl. = neg.).

Latexagglutinationstestzum Nachweis von PMSG im Serum trächtiger Stuten (PMSG = pregnant mare's serum gonadotropin)

Im Gegensatz zu den vorigen Beispielen dienen hier Polystyrol-Latex-Partikeln (statt Erythrozyten) zur Erkennungder Agglutinationsreaktion. Die Latexpartikel werden hier mit einem PMSG-Antikörper markiert (statt mit demHormon selbst). Dadurch erfolgt die Agglutination in Gegenwart des nachzuweisenden PMSG im Stutenserum.Antikörper gegen PMSG werden durch Immunisierung von Kaninchen hergestellt. Gereinigter PMSG-Antikörperwird an Polystyrol-Latexpartikeln gebunden.

Testprinzip

Mischen der PMSG-Antikörper-Latexsuspension mit PMSG-haltigem Stutenserum führt zur Agglutination.Unspezifische Immunreaktionen des Serums werden durch vorherigen Zusatz einer Antikörperlösung("Absorptionslösung") abgefangen.

Testansatz

1 Tropfen (20 µl) unverdünntes Serum auf Testplatte geben

1 Tropfen (20 µl) Absorptionslösung zugeben

1 Tropfen PMSG-Antikörper-Latexsuspension (20 µl) zugeben, mischen (mit der Pipettenspitze flächig verrühren),Platte 1 min langsam rotierend bewegen

Auswertung: Agglutination bei PMSG-Gehalt > 2 IU/ml, Ergebnis innerhalb von 5 min ablesen


1. Diskutieren Sie Titrationsdarstellungen (Agglutination als Funktion der Verdünnung) im Vergleich mitpharmakologischen Dosiswirkungskurven.

2. Verlauf des HCG während der Schwangerschaft, Beurteilung der Titer

3. Pathophysiologie des Choriongonadotropins, Artspezifität und Kreuzreaktion von Proteohormonen,Plazentationsunterschiede

29

AUFGABE 6: Immunologische Bestimmung von IgG;Trübungsmessung, kinetische Substratbestimmung


Immunglobuline G stellen den Hauptteil der Immunglobuline des Serums dar. In der Elektrophorese entsprichtihnen die γ-Globulin-Fraktion (vgl. Biochemisches Praktikum). IgG werden mit hoher Affinität gegen Protein- undVirusantigen gebildet, sie können die Plazentaschranke zwischen Mutter und Fetus durchdringen und dienen derpassiven Immunisierung des Embryo. Ihre Konzentration im Blutplasma gibt Auskunft sowohl über dieAuseinandersetzung des Organismus mit Antigenen als auch über die Aktivität des Systems der Immunglobulinbildenden Zellen.

Die quantitative Bestimmung monoklonaler Immunglobuline ergänzt die Serum- und Immunelektrophorese bei derDiagnose und Verlaufskontrolle akuter und chronischer infektiöser Prozesse und Paraproteinämien.


Trübungs- und Streulichtmessung

Die Antigen-Antikörper-Reaktion führt zur Bildung von Immunaggregaten, die nach Größe und Anzahl Lichtstreuen und bei höheren, ausgeglichenen Konzentrationen von Antigen und Antikörper präzipitieren (vgl. Titer-bestimmung, Serologie).

Als Maß der Aggregatbildung kann man

1. die Trübung der Lösung im durchfallenden Licht (Turbidimetrie, Trübungsmessung) analog der Absorp-tionsphotometrie messen, oder

2. die Intensität des Streulichts unter einem bestimmten Winkel zur Einfallsrichtung des Lichts (Nephelometrie,Streulichtmessung) analog zur Fluorometrie.

Die Intensität des Streulichts und die Trübung nehmen nach kurzen Wellenlängen hin zu. Für nicht zu hoheKonzentrationen ist die Trübung T (gemessen als scheinbare Extinktion E') der Konzentration der Aggregateproportional (analog dem Lambert-Beer'schen Gesetz):

T = E'= ' ·c · dε

Kinetische Substratbestimmung

Für die quantitative Messung der Antigen-Antikörper-Reaktion gibt es zwei prinzipielle Methoden:

1. Statische Methode: Es wird die Konzentration c (hier des Komplexes) aus dem Endwert der Reaktion nachEinstellen des Gleichgewichts gemessen. Dies erfordert bei Antigen-Antikörper-Reaktionen eine längereInkubationszeit (1 - 2 h). Dieses Verfahren entspricht den Endwert-Methoden bei den enzymatischenSubstratbestimmungen (vgl. Aufgaben Glucose, Ethanol, Triglyceride) sowie bei einigen Immunoassays(vgl. RIA, EMIT).

2. Kinetische Methode: Hierbei kann die gesuchte Konzentration c (des Endprodukts) vor Einstellung desGleichgewichts, d.h. vor Erreichen des Endpunktes, aus der Geschwindigkeit der Reaktion dc/dt gemessenwerden, wenn die Bedingungen dafür so gehalten werden, daß die Reaktion hinsichtlich des gesuchtenProdukts c nach einer Reaktion 1. Ordnung verläuft.

dcdt

= k · c

3. Die Geschwindigkeit bimolekularer Reaktionen ist aber von den Konzentrationen beider Reaktionspartner c1

und c2 abhängig (Enzym-Substrat, Antigen-Antikörper) nach einer Reaktion 2. Ordnung

dcdt

= k · c c1 2⋅

6. Immunglobuline

30

4. Wählt man jedoch die Konzentration eines Reaktionspartners c2 so hoch, daß seineKonzentrationsänderung während der Meßzeit und gegenüber dem Gleichgewicht keine Rolle spielt, dannerhält man einen Reaktionsverlauf pseudo 1. Ordnung, und damit einen linearen Zusammenhang zwischender Reaktionsgeschwindigkeit und der Konzentration c1

dcdt

= k' c k' = k c1 2⋅ ⋅, mit .

5. Diese "kinetische" oder "fixed time"-Methode wird hier am Beispiel der Antigen-Antikörper-Reaktiondemonstriert anhand der Messung der Geschwindigkeit der Trübungs- oder Streulichtzunahme als Maß derIgG-Konzentration. Dieses Prinzip liegt auch einigen Enzymimmunoassays zugrunde (vgl. T4-EMIT), beidenen ebenfalls nicht der Endwert nach Einstellung des Gleichgewichts abgewartet werden muß, sondernsofort die Geschwindigkeit der Reaktion nach Mischen der Komponenten gemessen werden kann. Diekinetischen Methoden bringen daher einen beträchtlichen Zeitgewinn. Auch eine Reihe von enzymatischenSubstratbestimmungen erfolgen nach demselben Prinzip. Die Bedingung für den Test ist KM >> (S), so daßbei langsamer Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes nur eine geringe Änderung der Substrat-Konzentration erfolgt.

c

t

C1

C = 2 C2 1

∆c1

∆t

∆c2

∆t∆c1

∆ t= 2

Abb. 6.1: Entsprechung zwischen der Konzentration c des Endproduktes und der Anfangsgeschwindigkeitdc/dt bei den kinetischen Methoden zur Substratbestimmung

IgG-Bestimmung in Human-Serum (kinetische Methode)

Reagentien

1. Human-IgG-Standards, deklarierte Konzentrationen

2. NaCl-Lösung 9 g/l

3. Anti-IgG-Reaktionsgem.: Anti-Human-IgG-Ziegenserum/Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 20 mmol/l, pH 8 /NaCl 100 mmol/l

Geräte

Photometer (λ = 570 - 800 nm), Halbmikroküvetten

6. Immunglobuline

31

Versuchsansatz

Alle Ansätze sind nacheinander durchzuführen.

Standards Probe

1 2 3 4

Anti-IgG-Reaktionsgemisch 1000 1000 1000 1000

IgG-Standard I (µl) 20 — — —

IgG-Standard II (µl) — 20 — —

IgG-Standard III (µl) — — 20 —

Probe (µl) — — — 20

Mischen

E1' (sofort)

E2' (nach 2 min)

∆E'

Konzentration (g/l)

Auswertung:

∆E' auf mm-Papier gegen die Standardkonzentration [g/l] auftragen und Bezugskurve für die Ermittlung derProbenkonzentration zeichnen.


1. Immunglobuline

2. Kinetische Substratbestimmung

3. Antigen-Antikörper-Reaktion, Heidelberger-Kendall-Kurve (Abb. 6.2.)

4. log-logistische Funktionen und allosterische, kooperative Wechselwirkung

6. Immunglobuline

32

0

2

4

6

8

10

12

14

1 10 100 1000 10000 100000 1000000

Antigenkonzentration [Ferritin, µg/l]

Str

eulic

htin

ten

sitä

t [re

l. E

inh

eite

n]

Antikörperüberschuß Äquivalenzbereich Antigenüberschuß

Abb. 6.2: Heidelberger-Kendall-KurveZur Demonstration der Abhängigkeit der Agglutination vom KonzentrationsverhältnisAntigen/Antikörper (Beispiel: Anti-Human-Ferritin IgG aus Kaninchen mit konstanter und Human-Ferritin als Antigen mit steigender Konzentration)Verfahren: in-vitro-Test N Latex Ferritin und Nephelometer Analyzer II, Behringwerke AG, Marburg(nach D. Greis, Diplomarbeit FH Giessen, 1996)

33

AUFGABE 7: Blutglucosespiegel: Resorption, Elimination und Insulin-Regulation; Enzymatische Glucosebestimmung (GOD-POD)


Der Blutglucosespiegel stellt die Gleichgewichtskonzentration der Glucose im Blut dar, die sich aus der simultanenWirkung von Resorption aus der Nahrung und Metabolisierung nach Phosphorylierung über die Glycolyse mitSpeicherung als Glycogen ergibt. Regulatorisch kommen die Eliminationsschwelle der Niere sowie die steuerndeFunktion des Insulins hinzu.

Die folgende Aufgabe besteht in der Untersuchung des zeitlichen Verlaufs des Blutglucosespiegels nach einerexperimentellen diagnostischen, d.h. definierten Störung des Systems. Die intravenöse Injektion einerGlucoselösung dient zur Untersuchung des nicht-reaktiven, d.h. nicht insulinabhängigen Verhaltens("Glucosetoleranztest"). Das Verfahren ermöglicht die Bestimmung der Eliminationskonstanten (hier:Assimilationskonstante) für den Patienten. Bei oraler Belastung führt die längeranhaltende Resorption zu einerErhöhung des Blutglucosespiegels und läßt die reaktive Gegensteuerung des langsamer regulierenden Insulin-Systems zum Tragen kommen. Dies kann dann eine Absenkung des Glucosespiegels unter den Ausgangswert zurFolge haben.

B) Methodisches Lernziel (vgl. Aufgabe 3)

Der Versuch besteht aus folgenden Schritten:

1. i.v. Injektion (0,25 g Glucose/kg KG, 50 % Infusionslösung) beim Hund (wurde bereits in der Klinik durch-geführt)

2. Blutentnahme nach Zeitplan (z.B. 0, 3, 6, 12, 20, 30, 45, 60, 90, 120 min)

3. Sofortige Enteiweißung der Blutproben und Zentrifugieren wurden bereits in der Klinik durchgeführt

4. Photometrische Glucosebestimmung im enteiweißten Überstand

Reagentien

1. Perchlorsäure 0,33 mol/l

2. Glucose-Standardlösung 0,51 mmol/l

3. Glucose-Reagens = GOD-POD-ABTS-Lösung: POD > 0,8 kU/l, GOD > 10 kU/l, 1,0 g/l ABTS in 0,1 mol/lPhosphatpuffer pH 7,0

Geräte


7. Blutglucose, Insulin

34

VersuchsansatzDie ausgegebenen Proben sind bereits enteiweißt und zentrifugiert! Blutentnahmezeiten eintragen.

Leer-wert

Stan-dard

Proben

Probennummer — — 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Blutentnahme-zeiten

(min) — —nüch-tern

Enteiweißung der Blutproben 1 + 10 in 0,33 mol/l Perchlorsäure,Zentrifugieren f. 2 min b. 17000 g (wurde bereits durchgeführt!)


Glucose-Reagens (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

enteiw. Überstand (ml) — — 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Glucosestandard (ml) — 0,1 — — — — — — — — — —

H2O (ml) 0,1 — — — — — — — — — — —

mischen, 20 min bei Raumtemperatur (15 min bei 37°C) inkubieren(kein direktes Sonnenlicht!), Messung bei 578 nm

E578nm 0,00

cGlucose (mg/l) — 91

cGlucose (mmol/l) — 0,51

cProbe - cnüchtern (mmol/l) — — —

Berechnung: cE

Ec Verdünnung der ProbeProbe

Probe

StandardStandard= ⋅ ⋅

[ ]c mg /E

E91

mgProbe

Standard

ll

= ⋅ ⋅11 Verdünnung 1:11

[ ]c mmol /E

E0,51Probe

Standard

ll

= ⋅ ⋅mmol

11

Auswertung

1. Auftragung des Blutspiegels gegen die Zeit

2. Halblogarithmische Auftragung der Differenz zum Nüchternblutspiegel (cProbe - cnüchtern) gegen die Zeit undBestimmung der Halbwertszeit t (t1/2) bzw. Assimilationskonstanten k (k = ln 2 / t1/2) der Glucose

3. Bestimmung des Verteilungsvolumens V (V = Dosis / c0) der Glucose durch Extrapolation auf die Zeit t = 0und des Verteilungskoeffizienten V' (V' = V/KG)

C) Diskussionsvorschläge1. Pathophysiologie, Aussagekraft des Blutzuckerspiegels, Diabetes-Diagnostik, Insulin-Immunoassay

2. Was bedeuten Assimilations- und Eliminationskonstanten, Nierenschwelle der Glucose (vgl. Abb. 10.1, S.48)

3. Nachweis der Insulinwirkung aus dem Verlauf der Elimination

7. Blutglucose, Insulin

35

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

37

AUFGABE 8: Funktionstest exokrines Pankreas; Chymotrypsin-Aktivitätsbestimmung mit p-Aminobenzoesäure (PABA)


Für die Funktionsuntersuchung des exokrinen Pankreas, besonders bei der Diagnose der chronischen Insuffizienzoder der akuten Pankreatitis, kann die Untersuchung des durch Duodenalsondierung gewonnenenPankreassekrets dienen. Wegen der Schwierigkeit der Duodenalsondierung beim Hund ist man aber auf indirekteMethoden zur Bestimmung der Enzymsekretion des Pankreas angewiesen.

Geeignete Verfahren sind

a) bei akuter Pankreatitis die Bestimmung der

Lipase-Aktivität im Serum (Latex-Immunoassay) und/oder der

Amylase-Aktivität im Serum mit p-Nitrophenyl-maltoheptaosid als Substrat, d.h. p-Nitrophenol als Produkt

b) bei chronischer Insuffizienz die Bestimmung der

Chymotrypsin- und Trypsin-Aktivität mit chromogenem Substrat im Kot (Screening Test),

Carboxyl-Esterase-Aktivität mit chromogenem Substrat,

Lipase-(Esterase)-Aktivität mit Fluorescein-dilaurat als fluorogenem Substrat. Messung der Fluorescein-Resorption in Serum und Ausscheidung im Harn nach Spaltung des Esters im Dünndarm und/oder der

Chymotrypsin-Aktivität mit N-Benzoyl-L-Tyrosyl-p-Aminobenzoat als chromogenem Peptid-Substrat.Messung der Resorption der abgespaltenen p-Aminobenzoesäure (PABA) im Serum und der Ausscheidungim Harn nach Spaltung des Peptides im Dünndarm. Der Nachweis erfolgt mittels einer Diazo-Farbreaktion.


Der nüchterne Hund (Rasse, Geschlecht, kg KG) erhält 15 mg/kg KG des Substrats in Futter dispergiert. Vor derVerabreichung wird eine Blutprobe (Citratblut) als Nüchternwert genommen, danach werden Blutproben zurVerlaufsmessung im Blut über etwa drei Stunden gewonnen. Zusätzlich kann der Verlauf der Ausscheidung imHarn durch Harnsammlung mittels Katheter bzw. Gesamtausscheidung mittels quantitativer Harnsammlunggemessen werden.

Reagentien (vgl. PAH-Nachweis, Aufgabe 12)

1. Natriumcitrat (5-hydrat) 3,8 %

2. Natriumnitrit 0,1 %,

3. N-(1-Naphthyl)-Ethylendiammoniumdichlorid (NNAD) 0,1 % in 10 % Methanol, jeweils frisch ansetzen(Diazo-Kupplungsreagenz)

4. Ammoniumamidosulfonat (Sulfamat) 0,5 %

5. Trichloressigsäure (TCA) 10 %

6. PABA-Standard 6 mg/l in 10 % TCA

Geräte

Mikropipetten, Reaktionsgefäße, Rüttler, Zentrifuge, Photometer

8. Exokrines Pankreas, PABA-Test

38

Versuchsansatz

Leer-wert

Stan-dard

Proben

Probe Nr. — — 1 2 3 4 5 6 7 8

Blutentnahme-zeiten

(min) — —nüch-tern

Gewinnung des Citratplasmas (1 + 9) und Enteiweißung mit TCA (1 + 2)wurde bereits in der Klinik durchgeführt.

Reihenfolge der Lösungen unbedingt einhalten!Nach jedem Schritt mischen, messen nach 10 min.


Überstand (ml) — — 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Standard (ml) — 0,2 — — — — — — — —

TCA (ml) 0,2 — — — — — — — — —

NaNO2 (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Sulfamat (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

NNAD (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

E546 nm (Filter)E500 nm (Spektral)

0,00

cPABA (mg/l) — 6,0

Berechnung:

EE

cc

Verdünnung cE

EcProbe

Standard

Probe

StandardProbe

Probe

StandardStandard= ⋅ ⇒ = ⋅ ⋅ 3 33,

Normalwert (Hund): > 3 mg/l 90 min nach Applikation

Harnproben (1:100 verdünnt) werden genauso behandelt wie Plasmaproben. Über das während der einzelnenSammelperioden erhaltene Harnvolumen (Blutproben sind in der Mitte der Sammelperioden zu nehmen) kann dieAusscheidung der absoluten PABA-Menge ermittelt werden.

Auswertung

Auftragung des Konzentrationsverlaufs im Plasma über der Zeit.


1. Kombination mit Xylose-Resorptionstest zur Kontrolle der Resorptionsfähigkeit des Darms (Malabsorption).Bei Schäferhunden erbliche Disposition zu Insuffizienz.

8. Exokrines Pankreas, PABA-Test

39

41

AUFGABE 9: Blutalkoholspiegel: Alkohol-Elimination als Leberfunktionstest;Enzymatische Blutalkoholbestimmung (ADH)

Die Blutethanolbestimmung hat in der Veterinärmedizin verständlicherweise keine klinische Bedeutung. Für denTierarzt, der in seiner Berufsausübung in der Praxis in erheblichem Maß an das Autofahren gebunden ist, istjedoch der Grundsatz "kein Alkohol am Steuer" von besonderer Bedeutung. Im Ernstfall kann für ihn eineBlutalkoholbestimmung existenzentscheidend sein. Als Arzt sollte er sowohl mit der Pathophysiologie undToxikologie als auch mit dem Prinzip der Messung und den für die Forensik geltenden Annahmen vertraut sein.


In pathophysiologischer Hinsicht stellt die Elimination der Droge "Alkohol" durch die Leber beim Menschen dasBeispiel eines enzym-limitierten Sonderfalles (Leber-ADH) dar (im Gegensatz zu anderen nicht limitierendenLeberfunktionen, z.B. Glucosemetabolismus). Sie repräsentiert eine Abbau-Kapazität der Leber und ist insofern als"Leberfunktionstest" zu betrachten (dasselbe gilt auch für die eigentlichen Leberfunktionstests, wie Bilirubin-Glucuronierung, Galactosebelastung, Bromsulfophthalein-Test). Dieses Verhalten erklärt auch die Eigenart undGefährlichkeit der Dosierung von Alkohol im pharmakologischen Sinn. Die Gültigkeit einer konstanten Elimina-tionsrate bietet die Grundlage für die forensische Rückrechnung von Blutalkoholkonzentrationen (vgl.Diskussionsvorschläge).


Enzymatische Blutethanolbestimmung mittels ADH

Prinzip

Ethanol wird in der durch Alkoholdehydrogenase (ADH) katalysierten Reaktion durch NAD+ zu Acetaldehydoxidiert.

C2H5OH + NAD+ ADHCH3CHO + NADH + H+

Das Gleichgewicht liegt auf der linken Seite; es wird jedoch durch NAD-Überschuß, alkalisches Milieu undAbfangen des Acetaldehyds durch Semicarbazid (Reagens auf Aldehyde und Ketone) als Semicarbazon auf dieSeite des Aldehyds verschoben:

CH3CHO + NH2-NH-CO-NH2 CH3-HC=N-NH-CO-NH2 + H2O

NADH ist Meßgröße und proportional der umgesetzten Ethanolmenge. (Typ des einfachsten, direkten enzyma-tischen UV-Tests mit NADH-abhängigen Dehydrogenasen; vgl. Biochemisches Praktikum).

Versuchsvorbereitung

1. Orale Verabreichung (Magen-Schlundsonde) oder intravenöse Injektion beim Hund von 10 g Ethanol (mitphysiologischer Kochsalzlösung ad 25 ml) pro 25 kg KG. Der Versuch wird in der Klinik vorbereitet, dieentsprechenden Daten werden bekanntgegeben.

2. Erste Blutentnahme vor der Injektion als Nüchternwert, anschließend nach Zeitplan (z.B. 10, 30, 60, 120 min)

3. Sofortiges Enteiweißen der Blutproben in Perchlorsäure (wurde bereits in der Klinik durchgeführt)

4. Ethanolbestimmung im enteiweißten Überstand (Praktikum)

Reagentien

1. Perchlorsäure 0,33 N (= 3,33%)

2. Ethanolstandard 1,4 ‰: 1,4 ml 100 % Ethanol pro 1000 ml Lösung

(entspricht 1,107 g Ethanol, spez. Gew. 0,791 g/ml)

3. Reaktionsgemisch: Puffer (75 mmol/l Pyrophosphat, pH 8,7, 75 mmol/l Semicarbazid, 21 mmol/l Glycin) : NAD(24 mmol/l) : ADH (8000U/ml) = 1 : 0,1 : 0,02

Geräte


9. Blutalkohol

42

Versuchsansatz

Leer-wert

Standards Proben

Probennr. — — — 1 2 3 4 5 6 7 8

Blutentnahme-zeiten (min)— — —

nüch-

tern

Perchlorsäure

Ethanolstandard

(ml)

(ml)

—

—

1,05

0,05

1,0

0,1

Die Enteiweißung der Proben wurde bereits in der Klinikdurchgeführt, für die Standards ist ein entsprechender

Verdünnungsschritt noch vorzunehmen

mischen


Reaktionsgemisch (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

enteiw. Überstand (ml) — — — 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

"enteiw." Standard (ml) — 0,1 0,1 — — — — — — — —

Perchlorsäure (ml) 0,1 — — — — — — — — — —

mischen, 20 min bei 37°C (Wasserbad) inkubieren

E365 nm 0,000

c (‰) — 1,4

(mmol/l)

Auswertung

1. Bestimmung der Alkoholkonzentrationen der Proben mit Hilfe einer Eichgeraden (aus den beiden Standardsund dem Nullpunkt)

2. Auftragen der Blutalkoholkonzentration gegen die Zeit

3. Extrapolation des Blutalkoholspiegels auf Zeit 0, Bestimmung der fiktiven Anfangskonzentration und desVerteilungsvolumens (lineare Regression der Eliminationswerte, Eliminationsrate)

4. Logarithmus der Konzentrationsdifferenzen zwischen der auf die Zeit t = 0 extrapolierten Elimination unddem tatsächlichen Konzentrationsverlauf gegen die Zeit (Verteilungsvolumen, -konstante)


1. Vergleich der Elimination von Ethanol und Glucose (Reaktionsordnung)

2. Vergleich der Elimination von Ethanol bei Hund und Mensch

3. Blutspiegel bei mehrfacher Dosierung von Ethanol, ebenfalls im Vergleich zu Glucose

4. Diskussion der forensischen Bedeutung eingeführter Normalwerte der Eliminationsraten beim Menschen(- 0,15 ‰/h), der Variabilität, Ein-Punkt- und Mehr-Punkt-Messungen

5. Vergleich Leber-ADH und Hefe-ADH, Substrate, Inhibitoren, Pharmakologie

6. Pathophysiologie des Alkohols, Toxizität des Acetaldehyds und Schädigung der Leber

9. Blutalkohol

43

9. Blutalkohol

44

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

Vereinfachtes Schema des Ethanolstoffwechsels:

Ethanol Acetaldehyd Acetat Acetyl CoA CO H OADH ALDH AcCoA Synthetase Citrat Cyclus → → → − → +− −2 2

0 1 2 3 4 5 6

0

2

4

6

8

1 0

E t h a n o l

Eth

an

ol

un

d A

ce

tat

[mM

]

Zei t [h]

Ac

eta

lde

hy

d [µ

M]

A c e t a t

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0In fus ion

Ace ta l dehyd

Abb. 9.1: Stoffwechsel des Alkohols. Blutkonzentrationen von Ethanol, Acetaldehyd und Acetat nachEthanolinfusion für 1 h (Daten aus Kohlenberg-Müller, Diss. Gießen 1989)

45

AUFGABE 10: Endogene Kreatinin-Clearance als Nierenfunktionsprüfung

Kreatinin entsteht im Muskelstoffwechsel irreversibel aus Kreatinphosphat und wird durch die Niereausschließlich glomerulär und ohne tubuläre Sekretion oder Rückresorption ausgeschieden. Die Messung derAusscheidung dieser endogenen Verbindung kann daher zur quantitativen Beschreibung der Nierenfunktionmittels der endogenen Clearance-Bestimmung dienen. Vorteil: der Patient wird nicht durch diagnostische Injektioneiner Teststubstanz belastet, der Körper selbst liefert kontinuierlich endogen die Meßsubstanz (vgl. damitHarnstoff-, Inulin-, PAH-Clearance). Der Kreatinin-Blutspiegel und die Ausseidungsrate sind relativ konstant undernährungsunabhängig.


Definition der Nierenfunktion und Begriff der (renalen) Clearance

Die Leistung eines Organs (hier der Niere) läßt sich beschreiben durch den Flux oder die Geschwindigkeit des"Durchsatzes" einer Substanz (hier des Kreatinin), d.h. durch die Fähigkeit, eine bestimmte Menge (Masse, Mol)pro Zeiteinheit zu verarbeiten oder auszuscheiden (Einheit des Flux mol/l).

Bezieht man diesen Durchsatz auf die Konzentration der Substanz im Plasma (evtl. Blut), aus dem heraus ja dieElimination erfolgen muß, so gilt

1. Definition: Die (renale) Clearance ist der Durchsatz (die Ausscheidungsgeschwindigkeit) (der Niere) bezogenauf die Plasmakonzentration der jeweiligen Substanz (linke Seite der Gleichung).

2. Definition und übliche medizinische Deutung: Die renale Clearance (ml/min) einer Substanz entspricht demfiktiven Plasmavolumen (ml), das pro Zeiteinheit (min) in der Niere von dieser Substanz gereinigt ("gecleart") wird(rechte Seite der Gleichung). Der Begriff der Clearance gilt auch für andere Organe (z.B. Leber), die Clearance kannallgemein substanz- und organunabhängig definiert werden. Für die Niere entspricht die Kreatinin-Clearance demglomerulären Filtratvolumen pro Minute. Manche harnpflichtigen bzw. harnfähigen Substanzen haben variable,konzentrationsabhängige Clearancewerte (vgl. Abb. 10.1, S. 48), wenn aktive Sezernierung (Phenolrot) oderRückresorption (Glucose) bzw. passive Rückdiffusion (Harnstoff) hinzukommen.

Die von der Niere ausgeschiedene Menge läßt sich im Harn einer Sammelperiode aus Konzentration cH undVolumen VH bestimmen:

( )( )

( )( )Clearance

MasseZeit

MasseV

MasseV V

MasseV Zeit

c Vc t

mlmin

Niere

Plasma

HarnHarn

Plasma

H H

P

= =⋅

⋅=

⋅⋅

Damit wird die Bestimmung der Clearance zurückgeführt auf die einfache Messung der Konzentrationen (desKreatinins) im Plasma (cP) und Harn (cH), des Volumens des Sammelharns (VH) und der Zeit (t) der Sammelperiode.Die Differenz zwischen Kreatininclearance, d.h. glomerulärer Filtrationsrate und Urinproduktionsrate ist ein Maßfür die renale Wasser-Resorption (ml/min):

c Vc t

Vt

c cc

Vt

H H

P

H H P

P

H⋅⋅

− =−

⋅

Um Unterschiede zwischen verschieden großen Species und Individuen auszugleichen, ist zusätzlich eineStandardisierung der Clearance notwendig nach dem Gesetz der Stoffwechselreduktion (Abb. 10.2, S. 48, vgl.Vorlesung Physiologie).

ClearanceV

konstant0,75

=

V = Körper-Volumen

In der Medizin wird üblicherweise noch auf die sog. "Körperoberfläche" (nach Rubner) normiert, die sich beimMenschen nach Größe und Gewicht aus entsprechenden Nomogrammen bestimmen läßt. (Zum Gesetz der Stoff-wechselreduktion und den Begriffen "Stoffwechselexponent", "Körperoberfläche" und "Aktive Zellmasse" s.Diskussionsvorschläge).

10. Kreatinin-Clearance

46


Für die Kreatininbestimmung gibt es enzymatische und nichtenzymatische Methoden. Das Prinzip einer enzyma-tischen Kreatininbestimmung sei nur kurz dargestellt. Es werden hierbei vier Enzymreaktionen bis zur Meßreaktiongekoppelt (vgl. Aufg. 3, Enzymaktivitäten).

1. KreatininKinase

Kreatin

2. Kreatin + ATPCK

Kreatinphosphat + ADP

3. PEP + ADPPK

ATP + Pyruvat

4. Pyruvat + NADHLDH

Lactat + NAD+

Die Kreatininbestimmung erfolgt im Praktikum nach einer einfachen, schon relativ alten nichtenzymatischenMethode (Popper 1937): Kreatinin bildet in alkalischer Lösung mit Pikrinsäure (2,4,6-Trinitrophenol) eine orange-rote Verbindung, die photometrisch gemessen werden kann. Als Beispiel einer nichtenzymatischen Methode istsie natürlich nicht so hochspezifisch wie diese; reduzierende Substanzen könnten in hoher Konzentration stören,jedoch z.B. erst ab 3 g/l Glucose oder 100 mg/l Aceton. Wegen der Temperaturabhängigkeit ist auf gleicheBedingungen für Probe und Kontrolle zu achten. Protein der Probe wird durch Trichloressigsäure vorab gefällt, daProtein mit Pikrinsäure selbst reagieren würde. Die meisten gebräuchlichen Antikoagulantien (z.B. EDTA, Oxalat,Citrat) stören den Test, Heparin kann verwendet werden.

Versuchsvorbereitung

1. Nüchterner Patient (Hund), Wasser ad libitum, Körpergewicht wird angegeben

2. Quantitative Harnsammlung mittels Katheter (und Fraktionensammler)

3. Für jede Harnsammelperiode venöse Blutentnahme zur Plasmagewinnung

4. Harn 1:10 mit physiologischer NaCl verdünnen

5. Plasma unverdünnt verwenden

Reagentien

1. Pikratlösung: 1,0 N NaOH und 0,6% Pikrinsäure im Verhältnis 1:6

2. Kreatinin-Standard 176,8 µmol/l (= 20 mg/l)

3. Säurereagens: Mischung aus Schwefelsäure und Essigsäure

Geräte

Mikroliterpipetten, Reaktionsgefäße, Rüttler, Wasserbad, Photometer


47

Versuchsansatz

Leerwert Standard Probe 1 Probe 2 Probe 3Harn Plasma Harn Plasma Harn Plasma

Reakt. Gef. Nr.

Pikratlsg. (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Aqua dest. (ml) 0,1 0,1 — — — — — — — — — — — — — —

Standard (ml) — — 0,1 0,1 — — — — — — — — — — — —

Harn 1:10 (ml) — — — — 0,1 0,1 — — 0,1 0,1 — — 0,1 0,1 — —

Plasma(unverd.)

(ml) — — — — — — 0,1 0,1 — — 0,1 0,1 — — 0,1 0,1

mischen, nach 10 min jeweils einen Ansatz jeder Probe bei Raumtemperatur messen

E1 546 nm 0,0 — — — — — — — —

Säure-Reagens

(ml) — 0,02 — 0,02 — 0,02 — 0,02 — 0,02 — 0,02 — 0,02 — 0,02

mischen, nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur messen

(wenn E < 0, dann E = 0)

E2 546 nm — 0,0 — — — — — — —

E1-E2

c (g/l) 0,0 0,02

VolHarn (ml) - - - - - - - - - -

Sammel-

periode(min) - - - - - - - - - -

Clearance (ml/min) - - - -

Berechnung: c(E - E

(E - E )c Verdünnung (Harn)Probe

2 Probe

1 2 StandardStandard= ⋅ ⋅1 )

Normalwerte (Hund 30 kg): Harnausscheidung = 1g/24h

cPlasma = 25-100 µmol/l = 5-15 mg/l

Kreatinin - Clearancec Vol

c t

ml

minHarn Harn

Plasma

=⋅

⋅

∆

Die Berechnungsfaktoren unterscheiden sich nur um das Verdünnungsverhältnis von Harn und Plasma (hier:10:1). Daher kann die Clearance auch direkt aus diesem Verdünnungsverhältnis und dem Verhältnis derExtinktionen berechnet werden:

Kreatinin - ClearanceE Vol

E tmlmin

Harn Harn

Plasma

=⋅ ⋅

⋅ ⋅

101 ∆

Normalwert (Mensch): 100 - 150 ml/min


48


1. Begriff der Clearance, Vergleich mit anderen Clearance-Methoden und Nierenfunktionsproben.

2. Nierenphysiologie, Pathophysiologie

3. Beurteilung der Ergebnisse der Patienten, Konstanz und Aussagekraft der Kreatininbestimmung, Bezug zumKörpergewicht

4. Standardisierung, Exponent der Lebendmasse Gesetz der Stoffwechselreduktion, Bedeutung der"Körperoberfläche" als Bezugsmaß (vgl. M. Sernetz: Organisms as Open Systems. In Fractals in Biology andMedicine. Nonnenmacher, Loser, Weibel eds., Birkhäuser Basel 1993)

5. Bedeutung von Clearance-Untersuchungen für die experimentelle Medizin, Pharmakologie und Pharmako-kinetik, Versuchstierkunde

6. Interpretation der Clearance als eine Elimination nach einer Reaktion 1. Ordnung (Halbwertszeit, Elimina-tionskonstante), Clearance = Verteilungsvolumen · Eliminationskonstante)

7. Clearance anderer Verbindungen (s. Abb. 10.1), variable, konzentrationsabhängige Clearance, Wasser-Resorptionsrate (vgl. 10 A).

Abb. 10.1: Clearance verschiedener Stoffe in Abhängigkeit von der Plasma-Konzentration (aus Richterich,1971).

Abb. 10.2: Grundumsatz als Funktion der Körpermasse, Gesetz der Stoffwechselreduktion.

49

AUFGABE 11: Endogene Harnstoff-Clearance als Nierenfunktionsprüfung

Die Bestimmung einer endogenen Harnstoffclearance für die Nierenbeurteilung ist ebenso wie beim Kreatininmöglich (sie ist sogar die älteste Methode nach van Slyke), weist jedoch einige Besonderheiten auf, die sie gegen-über dem Grundbeispiel der Kreatinin-Clearance zum Spezialfall macht.


1. Die Bildungsrate von Harnstoff, Endprodukt des Protein-Stickstoff-Stoffwechsels über den Harnstoff-Henseleit-Zyklus, ist nicht gleichermaßen konstant wie die von Kreatinin, die Plasmakonzentration ist viel-mehr besonders ernährungsabhängig (Eiweiß).

2. Die Ausscheidung in der Niere erfolgt nicht allein durch glomeruläre Filtration wie beim Kreatinin, sondernwird von einer tubulären, passiven Rückdiffusion überlagert. Die Ausscheidung ist damit auch nur oberhalbeiner gewissen Urinproduktion von ihr unabhängig (therapeutische Bedeutung, vgl.Diskussionsvorschläge).

Daraus folgt:

1. Wegen der Rückdiffusion ist die Harnstoff-Clearance niedriger als die Kreatinin- oder Inulin-Clearance.

2. Nur bei hinreichend hoher (normaler) Urinbildung führt die übliche Clearance-Formel zur sogenannten"Maximal-Clearance". Bei geringer Urinbildung ist für eine sog. "Standard-Clearance" eine empirischeKorrektur zu berücksichtigen (vgl. Diskussion).


Gekoppelte enzymatische Harnstoffbestimmung mit Urease und Glutamat-Dehydrogenase

Harnstoff wird durch Urease unter Bildung von Ammoniumcarbonat bei pH 8,5 gespalten.

H2N-CO-NH2 + 2 H2O Urease

(NH4)2CO3 2 NH3 + CO2 + H2O

In einer zweiten enzymatischen Reaktion wird 2-Oxoglutarat durch Glutamat-Dehydrogenase (GLDH) zu Glutamataminiert; unter Verbrauch von NADH und des entstandenen Ammoniaks.

2-Oxoglutarat + NH3 + NADH GLDH

Glutamat + NAD + H2O

Der Extinktionsrückgang (340 nm) durch Oxidation des NADH zu NAD ist der Konzentration an Harnstoff direktproportional. Der Nachweis für Ammoniak ist sehr empfindlich (vgl. Probenverdünnung) und durch dievorgeschaltete Urease-Reaktion harnstoffspezifisch.

Versuchsvorbereitungen

S. Aufgabe 10, Kreatinin-Clearance

Reagentien

1. Harnstoffreagens: Urease 50.000 U/l, Glutamat-Dehydrogenase 1.500 U/l, 2-Oxoglutarat, 8 mmol/l, NADH0,25mmol/l, gepuffert auf pH 8,0, Natriumazid 0,05%

2. Harnstoff-Standard 5 mmol/l (0,3 g/l)

11. Harnstoff-Clearance

50

Versuchsansatz

Proben einzeln nacheinander in Reaktionsgefäßen ansetzen, mischen und nach 30 s die erste Extinktion (E1)ablesen. Die Extinktion nimmt im Verlauf der Messung ab, daher das Photometer auf mittlere Extinktion, z.B. 0,3einstellen.

Standard Probe 1 Probe 2 Probe 3Harn Plasma Harn Plasma Harn Plasma


Harnstoffreagens (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Standard (µl) 20 — — — — — —

Harn (1:100) (µl) — 20 — 20 — 20 —

Plasma (µl) — — 20 — 20 — 20

E365 nm E1 (30 s)

E2 (60 s)

E3 (90 s)

E4 (120 s)

∆E/min

c (mmol/l) 5

VolHarn (ml) — — — —

Sammelperiode (min) — — — —

Clearance (ml/min) —

Berechnung: cE / min)

( E / min)cPlasma

Probe


(∆∆

cE / min)

( E / min)c VerdHarn

Probe

StandardStandard Harn= ⋅ ⋅

(∆∆

Harnstoff - Clearancec Vol

c t

ml

min

E Vol

E t

ml

minHarn Harn

Plasma

Harn Harn

Plasma

=⋅

⋅

=⋅ ⋅

⋅

∆ ∆

100

Normalwerte (Mensch): cPlasma = 1,5 - 8,5 mmol/l; cHarn = 300 - 600 mmol/l

Normalwerte Clearance: vgl. Abb.10.1


1. Verhältnis der Kreatinin- zur Harnstoff-Clearance

2. Klin. Aussagekraft von Kreatinin und Harnstoffwerten

3. Beim Menschen ist die Kreatininausscheidung im Harn pro 24 h relativ konstant und kann daher als Bezugs-größe für die Ausscheidung anderer Metabolite (z.B. Harnsäure) oder zur Kontrolle der Gewinnung des 24 h-Harns dienen (Mensch ~2,2 g/24 h).

51

AUFGABE 12: Inulin- und PAH-Clearance als Nierenfunktionsprobe;Begriff der totalen Clearance

Neben den bereits besprochenen endogenen Clearancemessungen für Kreatinin und Harnstoff, die als normaleMetabolite im Fließgleichgewicht in "konstanten" Konzentrationen im Plasma vorliegen, kann auch aus der Elimi-nation geeigneter körperfremder Stoffe nach Injektion eine Clearance bestimmt werden.

Hierfür ist z.B. die simultane Bestimmung der Inulin- und p-Aminohippursäure-Clearance eingeführt. Für Inulinwird rein glomeruläre Filtration und für PAH zusätzlich tubuläre Sekretion angenommen, so daß man zweiverschiedene Kriterien zur Nierenbeurteilung erhält.

Für die Clearance-Bestimmung bestehen grundsätzlich zwei Möglichkeiten der Messung:

1. Man verfolgt nach einmaliger intravenöser Injektion und Blasenkatheterisierung den Konzentrationsverlaufim Plasma und in den zeitlichen zugehörigen Katheter-Harnvolumina (Fraktionensammler) und berechnet wieüblich für mehrere Wertepaare:

( )( )Cl

c Vc t

mV V

mV t

renHarn Harn

Plasma

Harn Harn

Plasma

=⋅

⋅=

⋅

⋅∆

∆

∆

2. Dieses Verfahren ist gebunden an eine genaue Harngewinnung durch Katheterisierung. DerBlutspiegelverlauf entspricht einer reinen Eliminationskurve 1. Ordnung (vgl. Glucose).

3. Durch Dauerinfusion der Testsubstanzen erzeugt man künstlich einen konstanten Plasmaspiegel. Er wirderreicht, wenn im Fließgleichgewicht die Eliminationsgeschwindigkeit (Ausströmungsgeschwindigkeit)gleich der Infusionsgeschwindigkeit der Substanz wird:

InfusionsgeschwindigkeitPlasmaspiegel

EliminationsgeschwindigkeitPlasmaspiegel

totale Clearance

(renale) Clearance

(extrarenale Clearance)Plasma

=

=

Daher könnte man also auch ganz auf das aufwendige Harnsammeln und Katheterisieren verzichten und wegender rein renalen Elimination des Inulins dessen Clearance ganz analog aus der bekanntenInfusionsgeschwindigkeit (Inulinkonzentration [m/vol] · Pumpgeschwindigkeit [vol/Zeit]) und dem sich dabeieinstellenden Plasmaspiegel CP bestimmen

( )( ) ( )Cl

c Vc t

mV

mV

Vttot

Infusat

Plasma

Infusat

Plasma

Pumpe=

⋅⋅

= ⋅∆∆

∆∆

Die Bezeichnung "totale Clearance" beinhaltet, daß auch andere als renale Eliminationswege zusätzlicheinbezogen sein können. Nur bei rein renaler Elimination, wie hier im Falle des Inulins, ist die totale Clearance derrenalen gleichzusetzen. Dieses Verfahren der Bestimmung einer totalen Clearance (Dost) dient daher allgemein zurCharakterisierung der Elimination von Substanzen aus dem Körper auch durch andere Organe (z.B. Leber).

Wir wollen hier versuchen, die Clearance des PAH auf drei Arten zu bestimmen, und zwar

1. aus der Plasmakonzentration im Gleichgewicht und aus der Infusionsgeschwindigkeit,

2. aus der Plasmakonzentration im Gleichgewicht und der Eliminationsgeschwindigkeit im Harn und

3. nach Absetzen der Infusion aus der Eliminationskonstanten und dem Verteilungsvolumen.

12. Inulin- und PAH-Clearance

52

Abb. 12.1: Technik der Inulin - PAH-Clearance: Dauerinfusion zum Erreichen des Fließgleichgewichts

-0,5 0 1 2 3

Dauerinfusion Harnsammlung

Start Stop

VorphaseAuffüllen

Elimination

t [h]

cIn

cPAH

Abb. 12.2: zeitlicher Verlauf der Inulin - PAH-Konzentration bei einem Clearanceversuch mittels Dauerinfusion(s. Abb. 12.1)


53


1. Inulin: Poly-Fructose, MG ~5000, Stärke-Analoges aus den Wurzelknollen des Topinambur (vgl. Diabetiker-brot). Es verteilt sich allein im Extrazellulärraum und wird (wie Kreatinin) rein glomerulär filtriert. DieBestimmung erfolgt als Fructose entweder über die Anthron-Reaktion (s. Biochemisches Praktikum) oderenzymatisch nach saurer Hydrolyse. Die Bestimmung der Inulin-Clearance wird hier nicht durchgeführt.

2. p-Aminohippursäure (PAH), NH2-C6H4-CONH-CH2-COOH: PAH ist ebenfalls im Extrazellulärraum verteilt, esdringt nicht in die Erythrozyten ein. Man mißt daher die tatsächliche Plasmakonzentration. PAH wird fastausschließlich (> 90 %) in der Niere und zwar durch tubuläre Sekretion aber auch durch glomeruläre Filtrationaus dem Plasma eliminiert. Die Clearance aus dieser kombinierten Elimination repräsentiert somit deneffektiven renalen Plasmafluß (ERPF). Zusammen mit dem Hämatokrit gibt die PAH-Clearance ein Maß für dieNierendurchblutung. Bei niedrigen Plasmaspiegeln wird die Clearance vorwiegend von der tubulärenSekretion beherrscht, bei hohen vorwiegend von der glomerulären Filtration (vgl. Kreatinin, Abb. 10.1, S. 48).Ein geringer Teil wird als extrarenale Clearance über die Leber eliminiert.

3. Der Quotient aus Inulin- und PAH-Clearance (niedrige PAH-Spiegel vorausgesetzt) gibt das Verhältnis desglomerulär filtrierten Primärharns zum renalen Plasmafluß an. Er wird in der Klinik als "Filtrationsfaktor" (FF)bezeichnet.

Versuchsvorbereitungfür eine simultane Inulin- und PAH-Clearancebestimmung mittels Dauerinfusion

1. Patient: Hund, kg KG, nüchtern, Wasser ad libitum, Sedation bzw. Narkose (Daten werden im Praktikumbekanntgegeben)

2. Infusionslösungen:

A B

Sterile Inulinlösung 100 g/l 60 20 ml

Sterile PAH-Lösung 220 g/l 8 2 ml

physiologische NaCl-Lösung 9 g/l ad 200 — ml

Dauerinfusion A:30 g/l Inulin, 8,8 g/l PAH in physiologischer NaCl

3. Dauerinfusion, intravenös mittels peristaltischer Pumpe, zuerst etwa 500 ml physiologische Kochsalzlösung,um die Flüssigkeitsräume aufzufüllen und die Geschwindigkeit der Harnbildung auf einen konstanten Wertzu bringen, danach Lösung A infundieren (2 ml/min). Es sollen Gleichgewichtskonzentrationen von etwa 500mg/l Inulin und 20 mg/l PAH erreicht werden. Bei klinischen Routinebestimmungen der Clearance wird meistper Dauertropf (80/min) infundiert. Dabei wird zunächst die konzentriertere Lösung B während 10 min infun-diert, um die Gleichgewichtseinstellung zu beschleunigen.

4. Blutentnahme ( 2 ml) zunächst alle 10-15 min, im Gleichgewicht später 15-30 min, nach Absetzen der Dauer-infusion nochmals alle 10-15 min zur Ermittlung der Eliminationskonstanten. Sofort mit TCA enteiweißen.

5. Kontinuierliche Harngewinnung am sedierten Tier durch Katheter und Fraktionensammler mit üblichenHarnsammelperioden (vgl. Kreatinin- und Harnstoff-Clearance). Mittlere Harnproduktion beim Hund ~5ml/min.


54

Reagentien (vgl. PABA-Test, Aufgabe 8)

1. Trichloressigsäure (TCA) 10 %

2. Natriumnitrit 0,1 %

3. N-(1-Naphthyl)-Ethylendiammoniumdichlorid (NNAD) 0,1 % (Diazo-Kupplungsreagenz)

4. Ammoniumamidosulfonat (Sulfamat) 0,5 %

5. PAH-Standard 11,2 mg/l in 10 % TCA

Geräte

Peristaltische Pumpe, Fraktionensammler, Mikroliterpipetten, Reaktionsgefäße, Rüttler, Zentrifuge, Photometer

Versuchsansatz PAHStandard zuerst messen

Leer-wert

Stan-dard

Blutproben

Entnahmezeit (min) — —

Eine Enteiweißung 1 + 10 mit 10 % TCA wurde bereits durchgeführt,Die Reihenfolge der Reagentien ist unbedingt einzuhalten!


enteiw. Überstand (ml) — — 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Standard (ml) — 0,2 — — — — — — — — — —

TCA (ml) 0,2 — — — — — — — — — — —

NaNO2 (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Sulfamat (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

NNAD (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Mischen, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.

E546nm 0,00

cPAH (mg/l) — 11,2

Clearance (ml/min) — —

Differenz cmax-c(Probe)

Berechnung:

cE


Probe


Proben-Verdünnung 1:11


55

Leer-wert

Stan-dard

Harnproben


Sammelintervall (min) — —

Vol (ml) — —

Die Harnproben werden wie die Blutproben enteiweißt und anschließend1:1010 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt.

Mischen, zentrifugieren, mit dem Überstand weiterarbeiten.Die Reihenfolge der Reagentien ist unbedingt einzuhalten!


Überstand (ml) — — 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Standard (ml) — 0,2 — — — — — — — — — —

TCA (ml) 0,2 — — — — — — — — — — —

NaNO2 (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Sulfamat (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

NNAD (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Mischen, 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.

E546nm 0,00

cPAH (mg/l) — 11,2

mPAH (mg) — —

ΣPAH (mg) — —

Clearance (ml/min) — —

Berechnung:

cE


Probe


Proben-Verdünnung 1:1010


56

Versuchsauswertung

1. Auftragung der PAH-Konzentration im Blut gegen die Zeit

2. Bestimmung der Halbwertszeit und Eliminationskonstanten aus dem Konzentrationsabfall nach Absetzen derDauerinfusion mittels Auftragen der Logarithmen der Konzentrationen gegen die Zeit

3. Bestimmung der totalen PAH-Clearance aus der Infusion


1. Für welche Stoffe verbietet sich eine Dauerinfusion aus pharmakokinetischen Gründen (Typ der Elimination,vgl. Aufgabe 9 Ethanolelimination)?

2. Konzentrationsabhängige Clearance bzw. "variable Eliminationskonstante" bei kombinierter simultanerElimination (vgl. Abb. 10.1, S. 48)

3. Totale, renale und nicht-renale Clearance, Pathophysiologie der Nieren und Aussagekraft der Clearance-Bestimmung (vgl.: U. Moeferdt, Bestimmung der PAH-Clearance beim Rind, Diss. Gießen 1987; H. J. Rapp,Bestimmung der Inulin- und PAH-Clearance beim Pferd, Diss. Gießen 1985).


57

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

59

AUFGABE 13: Hämoglobin, fetales Hämoglobin, Bilirubin, Eisen


Der Blutfarbstoff und seine Derivate bilden ein mit klinisch-chemischen Nachweismethoden leicht zugänglichesSystem mit einer Vielzahl diagnostischer Aussagemöglichkeiten. Diese beziehen sich auf Eigenschaften

a) des Globins: z.B. Hämoglobin-Arten A, S, F, Immunreaktionen, Elektrophorese, O2-Sättigungsverhalten,Denaturierung

b) des Hämins/Porphyrins: z.B. photometrische Konzentrationsbestimmung, O2-Sättigung, Bilirubin-Nachweis -verfahren, Erythrozyten-Halbwertszeit

c) des Eisens: Wertigkeit, komplexometrische Titration, Proteinbindung des Eisens, Transferrin,Eisenbindungskapazität

Die vorliegenden Aufgaben sind Beispiele dieser Gruppen

1. Gesamthämoglobin als Hämiglobin-Cyanid, photometrische Konzentrationsbestimmung

2. Bilirubin und Bilirubinglucuronide, Leberfunktion

3. Eisenbestimmung mittels FerroZine®

Adultes (HbA) und fetales Hämoglobin (HbF)

Der Fetus bildet ein Hämoglobin HbF, dessen Globinanteil sich von dem HbA des Erwachsenen in derAminosäuresequenz und damit in der Konformation unterscheidet (vgl. Vorlesung Biochemie). Daraus resultierteine höhere Bindungsaffinität zum Sauerstoff, die den Übertritt von O2 aus dem mütterlichen in den fetalenKreislauf begünstigt. Aufgrund eines anderen isoelektrischen Punktes ergibt sich auch eine unterschiedlicheelektrophoretische Beweglichkeit (Nachweis mittels Elektrophorese), es denaturiert bei Hitze schneller, ist jedochgegen Alkali-Denaturierung wesentlich stabiler als HbA (klin. HbF-Nachweis). Nach der Geburt wird nur nochHbA gebildet, es wird also praktisch eine Population von HbF-Erythrozyten gegen HbA-Erythrozytenausgewechselt. Beide sind in den ersten 3 Lebensmonaten nebeneinander nachweisbar.

Der Nachweis von HbF in Erythrozyten beruht auf der unterschiedlichen Löslichkeit und Eluierbarkeit aus denErythrozyten gegenüber HbA. HbA läßt sich aus Erythrozyten luftgetrockneter und ethanolfixierterBlutausstriche mit stark saurem Puffer eluieren, während HbF in den Zellen bleibt. Diese können anschließend miteiner üblichen histologischen Färbereaktion (Hämatoxilin/Erythrosin) gefärbt: die HbF-Erythrozyten sind intensivrot gegenüber den farblosen "ghosts" der HbA-Erythrozyten.

Hämoglobinbestimmung als Hämoglobin-Cyanid (HbIII-CN)

Um die im Blut nebeneinander vorliegenden Hämoglobinverbindungen wie Hämoglobin (Hb II), OxyhämoglobinHbII-O2), Hämiglobin (Hb III), eventuell auch Carboxyhämoglobin (Hb II-CO) gemeinsam als Gesamthämoglobinbestimmen zu können, wird zunächst das gesamte Hämoglobin mit Kaliumhexacyanoferrat(III) zu Hämiglobin(HbIII) oxidiert und anschließend mit KCN in das stabile und spektral eindeutige Hb III-CN überführt, das einbreites, unkritisches Absorptionsmaximum um 540 nm aufweist (Abb. 13.1, S. 61).

Hb-Reagens

Modifizierte Drabkinsche Lösung (braune Flasche mit Dispensette), GIFTIG!

0,75 mmol/l Kaliumcyanid0,6 mmol/l Kaliumhexacyanoferrat III1,0 mmol/l Kaliumhydrogenphosphat, pH < 70,1 g/l Detergens (Saponin für Hämolyse und zur Vermeidung von Trübung)

13. Hämoglobin, Bilirubin, Eisen

60

Versuchsansatz

Leerwert Rind Kalb 1 Kalb 2

Hb-Reagens (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0

Blut (ml) — 0,02 0,02 0,02

Pipettenspitze außenabwischen, durchspülen,

gut mischen, 3 min inkubieren

E546 nm 0,000Normalwerte

(Rind)

cHb (g/l) E · 368 90 - 140 g/l

cFe (mmol/l) E · 22,8 5 - 9 mmol/l

cE

d

V

Vgesamt

Probe

=⋅

⋅ε

[ ]εl

mol cm= Extinktionskoeffizient; d cm = Schichtdicke;

VV

mlml

= VerdünnungProbe

gesamt⋅

Bei der Konzentrationsangabe des Hämoglobins (Hb4) ist folgendes zu beachten: erlaubt sind nach den SI-Einhei-ten die Angaben cHb in [g/l] und in [mol/l]. Das Molekulargewicht des tetrameren Hämoglobins (Hb4) beträgt64458. Man bezieht aber auf das Monomere (Hb1) mit dem Molekulargewicht 16144, also eigentlich auf das Häm-Eisen, das zur Eichung dient. Der hierfür geltende Extinktionskoeffizient hat für die Wellenlängen 540 - 546 nm denWert

[ ]ε540Hb 1 11 mol cm= ⋅ ⋅ ⋅− −11 104, l

Die Faktoren für die Konzentrationen ergeben sich aus den folgenden Ansätzen:

[ ]c

gE 16144

gmol

1,1 10mol cm

1,0 cm

5,020,02

mlml

E 368g

Hb4l l l

=⋅

⋅⋅

⋅

⋅

= ⋅

bzw.

[ ]c

mol E

1,1 10mol cm

1,0 cm

5,02

0,02

ml

mlE 22,8

mmolFe

4l l l

=⋅

⋅

⋅⋅

= ⋅

Bilirubin

Die beiden Metabolite Bilirubin und Bilirubin-di-glucuronid des Hämoglobinabbaus stellen diagnostisch wichtigeund analytisch gut faßbare Komponenten auf dem Weg Erythrozyt ⇒ RES ⇒ Leber ⇒ Galle ⇒ Darm dar.Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen physicochemischen Eigenschaften und ihrer Stellung innerhalb diesesAbbauweges ermöglichen sie differentialdiagnostische Aussagen insbesondere zur Funktion des Leber-Galle-Systems (Abb. 13.2, S. 62).

Freies Bilirubin ist praktisch wasserunlöslich und toxisch. Es wird im Plasma als Bilirubin-Albumin-Komplextransportiert. In dieser Form ist es weder über die Niere noch die Gallenwege ausscheidungsfähig. Überangebotführt zu Anreicherung in der Lipidphase (Subcutis, Conjunctiva, Gehirn) mit dem klinischen Bild des Ikterus.

In der Leber wird Bilirubin durch UDP-Glucuronsäure-Transferase in Bilirubin-di-glucuronid überführt (vgl. Vor-lesung Biochemie/Pharmakologie: Entgiftung durch Glucuronierung). Dieses Konjugat ist gut wasserlöslich, damitgallenfähig und, soweit es von der Leber aus auch wieder in die Blutbahn gelangt (s. Diskussionsvorschläge,Klinik), auch gut nierenfähig.


61

1 = Hämiglobin-Cyanid ; 2 = Oxy-Hämoglobin ; 3 = HämoglobinAbb. 13.1: Absorptionsspektren verschiedener Hämoglobine (logarithmische Auftragung des Extinktions-

koeffizienten ε; nach Aebi 1965).

Der Nachweis erfolgt photometrisch im Plasma, Serum und Harn mittels einer üblichen Diazo-Reaktion:

Sulfanilsäurechlorid + Na-nitrit Diazoniumchlorid

Diazoniumchlorid + Bilirubin(glucuronid) Azofarbstoff

Die Azo-Reaktion kann zunächst nur das wasserlösliche Bilirubinglucuronid erfassen (als sogenanntes "direktesBilirubin" der Kliniker). Um auch das albumingebundene Bilirubin mit derselben Reaktion messen zu können, mußes erst kompetitiv aus der Bindung am Albumin verdrängt werden, durch Zusatz relativ hoher Konzentrationenz.B. von Coffein (s.u. Reagentien). Man ermittelt damit das Gesamtbilirubin. Erst die Differenzmessung liefert dasfreie Bilirubin (als sog. "indirektes Bilirubin" der Kliniker).

Zur kompetitiven Verdrängung des Bilirubins aus dem Albumin-Komplex führen in vivo auch Pharmaka (vgl. Abb.13.2, S. 62 und Diskussionsvorschläge).

Geräte

Photometer, Halbmikro-Durchflußküvetten, Mikropipetten

Reagentien

1. 29,0 mmol/l Sulfanilsäure, 0,17 n HCl

2. 25,0 mmol/l NaNO2

3. 0,26 mol/l Coffein, 0,52 mol/l Na-Benzoat

4. 0,93 mol/l Tartrat, 1,9 n NaOH

5. NaCl 9 g/l


62

Versuchsansatz(Bitte beachten: Gesamtbilirubin und Bilirubinglucuronide sind bei verschiedenen (!) Wellenlängen zu messen)

Gesamtbilirubin Bilirubinglucuronide

Probe Rind Kalb 1 Kalb 2 Rind Kalb 1 Kalb 2


Sulfanilsäure (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

NaNO2 (µl) — 20 — 20 — 20 — 20 — 20 — 20

Coffein/Benzoat (µl) 500 500 500 500 500 500 — — — — — —

NaCl 9 g/l (µl) — — — — — — 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Plasma (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

verschließen, mischen,10-30 min Raumtemperatur

verschließen, mischen,nach genau 5 min messen

Tartrat (µl) 500 500 500 500 500 500

verschließen, mischen,10-20 min Raumtemperatur

E578nm 0,00 0,00 0,00 E546nm 0,00 0,00 0,00

c (µmol/l) E · 185 · 246

c (mg/l) E · 108 · 144

Abb. 13.2: Schema des Bilirubin-Stoffwechsels und verschiedener beeinflussender Faktoren.


63

Serumeisen, Transferrinbindungskapazität

Die Häufigkeit vorbeugender und therapeutischer Eisensubstitution besonders in der Jungtieraufzucht bringt demTierarzt an einem physiologischen Engpaß am auffälligsten die Bedeutung des Eisenstoffwechsels zumBewußtsein. Da sich die Steuerung der Eisenaufnahme ausschließlich nach dem Bedarf (nicht nach demAngebot!) richtet, bildet der Gehalt des Serumeisens ein direktes Maß für den Eisenvorrat und Bedarf desOrganismus, bevor es zur Ausbildung einer manifesten Anämie kommt.

Beim Jungtier ergibt sich eine auffallende Diskrepanz zwischen dem geringen Eisengehalt der Milch und demwachsenden Eisenbedarf für die Blutbildung, die zu den in der Praxis bekannten Unterbilanzen führen kann.

Der Hauptanteil des Körpereisens liegt in den Porphyrinproteiden Hämoglobin, Myoglobin und den Cytochromenvor. Wegen des schnellen Umsatzes der Erythrozyten (t50 ~ 100 Tage) ist auch im Serum bei an sich geringemEisengehalt (~ 1 mg/l) der Umsatz entsprechend hoch (t50 ~ 100 min). FeIII ist hier an das spezifische Transport-protein Transferrin gebunden, in der Regel bis zu etwa einem Drittel seiner Bindungskapazität. Die Resorption ausdem Dünndarm erfolgt als FeII mit Bindung und Speicherung an Ferritin.

Parenterale Eisengabe erfolgt als FeII-Komplex z.B. mit Gluconat oder Dextran. Bei der Dosierung ist dabei zubeachten, daß freies FeII über die Bindungskapazität des Transferrin hinaus toxisch wirkt.

Der Nachweis des Transferrin-FeIII erfolgt durch komplexometrische photometrische Titration als FeII-Komplex(z.B. mit Bathophenanthrolindisulfonat (B) oder mit Ferrozine, vgl. Anorganisch-chemisches Praktikum).

Transferrin·FeIII Transferrin + FeIII

Ascorbinsäure + FeIII FeII

FeII + 3 B FeIIB3

Da die Bindungskonstante des Bathophenanthrolin für FeII höher ist als die des Transferrin für FeIII, kann durchReduktion z.B. mit Ascorbinsäure oder Na-dithionit die Titration auch ohne vorherige Denaturierung und Ent-eiweißung erfolgen. Unter den gewählten Versuchsbedingungen stört leichte Hämolyse nicht, da das Häm-Eisennicht freigesetzt wird. (Die Bestimmung der Eisenbindungskapazität als Maß für die Transferrinkonzentrationerfolgt in vitro durch Sättigung mit FeCl3 und Rücktitration des Eisenüberschusses.)

Ferrozine®-Methode (Eisenbestimmung ohne Enteiweißung)

Das Farbreagens Ferrozine liefert mit Eisen einen violetten Farbkomplex, dessen Konzentration bei 578 nmgemessen werden kann. Der Reaktionsmechanismus entspricht dem des Bathophenanthrolin. Die Messungerfolgt jeweils gegen den Leerwert der Probe.

Reagentien

Leerwert-Reagens: Ascorbinsäure in 170 mmol/l Natriumacetat (pH 5,5)-Detergenzienmischung

Farb-Reagens: Chromogen FerroZine® 80 mmol/l in Leerwert-Reagens 1:51


64

Versuchsansatz

die Küvette nach jeder Probe mit A. dest. zwischenspülen !

Probe Leerwert Rind Kalb 1

Leerwert-Reagens (µl) 1000 — 1000 — 1000 —

Farb-Reagens (µl) — 1000 — 1000 — 1000

Plasma (µl) — — 200 200 200 200

H2O (µl) 200 200 — — — —

10 min bei Raumtemperatur inkubieren(5 min bei 37°C)

E578nm 0,00 0,00 0,00

∆E = EProbe - ELeerwert —

c (µmol/l) ∆E · 238 —


1. Hämoglobine: Eigenschaften, Sauerstoffbindungskurve (s. Abb.13.3), Spektren, Auftragung lg ε gegen λ (s.Abb. 13.1, S. 61)

2. Bilirubin, Pharmabindung, kompetitive Verdrängung, kooperative Wechselwirkung

3. Diagnostik, prä- und posthepatischer Ikterus, Parenchymikterus, Ikterus neonatorum, Kernikterus (s. Abb.13.2, S. 62)

4. Eisenpräparate, Eisenwertigkeit, Komplexometrie

20 40 60 80 1000

0.25

0.5

0.75

1 Y

p [hPa]

Hämoglobin (h = 2,8)

Myoglobin (h = 1)

Abb. 13.3: Sauerstoffbindungskurven von Hämoglobin und Myoglobin ( h = Hill-Exponent, vgl. van Krogh-Gleichungen S. 67)

65

AUFGABE 14: Blutgerinnungsanalyse, Gerinnung als enzymatische Reaktion:Vergleich der Fibrinogen-Gerinnungszeitmessung mit derUmsatzmessung chromogener Thrombinsubstrate

Die in den gerinnungsphysiologischen klinischen Labors bisher übliche Gerinnungszeitmessung zur Bestimmungvon Gerinnungsfaktoren (Enzyme, Inhibitoren, Aktivatoren) stellt einen methodischen Sonderfall einerenzymatischen Umsatzmessung dar.

Im Gegensatz zu den sonst üblichen Verfahren der Enzymaktivitäts- oder Enzymkonzentrationsmessung war hierbisher die photometrische Umsatzbestimmung eines Substrates (vgl. Aufgabe 3) nicht möglich. Vielmehr ist bisheute die Messung der Zeit bis zum Entstehen eines Fibringerinnsels das einzige geeignete Kriterium zur Bestim-mung einer der Aktivität der Gerinnungsfaktoren entsprechenden Größe. Dies wird hier am Beispiel der Messungder Gerinnungszeit in Abhängigkeit von der Thrombinkonzentration gezeigt.

Die Verfahren der klinischen Blutgerinnungsanalyse sind historisch bedingt leider mit einer denkbar unglück-lichen, typisch "medizinischen" Terminologie und Nomenklatur belastet. Der Prozeß der Gerinnung wird auch inden klinisch-diagnostischen Lehrbüchern meist vernachlässigt oder nur unzureichend interpretiert. Es soll hierversucht werden, vor dem Erlernen der in der Klinik gebräuchlichen Bezeichnungen die Gerinnungsmessung alseinen enzymatischen Prozeß mit der bereits bekannten enzymkinetischen Terminologie zu erklären.

A) Gerinnungsphysiologisches Lernziel

Gerinnungskaskade

Die Gerinnung ist im wesentlichen eine Kaskade von enzymatischen Reaktionen, bei denen jeweils das Substrateines vorhergehenden Reaktionsschrittes das Enzym des nachfolgenden Schrittes liefert.

FibrinogenSubstrat

Reiz

Proenzym 2

Substrat

ProduktEnzym 1Proenzym 1

Substrat

ProduktEnzym 2

ProduktFibrin

14. Blutgerinnung als enzymatischer Prozeß

66

Enzymkinetik

Betrachtet man zunächst allein die letzte, meßtechnisch direkt erfaßte Reaktion

FibrinogenThrombin

Fibrin

so kann man auf sie im einfachsten Fall die Michaelis-Menten-Beziehung anwenden

(1) − =⋅ ⋅

+∆∆S

t

k E S

K SM

S = Fibrinogen; E = Thrombin

Man kann voraussetzen, daß im Blut die jeweiligen Substratkonzentrationen der Blutgerinnung sehr niedrig sind,d.h. [S] < KM. Damit wird:

(2) − = ⋅ ⋅∆∆S

tk

KE S

M

oder umgeformt:

(3) − ⋅ = ⋅∆

∆S

S

K

kE t = konstantM

Diese Umformung beschreibt den bei der Blutgerinnung tatsächlich gemessenen Zusammenhang zwischen derGerinnungszeit ∆t und der Konzentration des Gerinnungsenzymes [E] bzw. des Gerinnungsfaktors. Das Produktaus Gerinnungszeit und Thrombinkonzentration [E] · ∆t ist konstant, da die Messung der Gerinnung bei demkonstanten Wert des relativen Umsatzes ∆[S]/[S] erfolgt (∆[S] << [S]), bei dem ein bestimmter Erfolg, nämlich derEintritt der Gerinnung, als Viskositätserhöhung bzw. Gerinnselbildung eintritt.

Bei Enzymaktivitätsbestimmungen kann man also grundsätzlich zwei Verfahren unterscheiden (Abb. 14.1, S. 67):

1. Messung des Umsatzes ∆[S] als Funktion der Enzymkonzentration [E] bei fest vorgegebener Meßzeit t (Abb.14.1 A; übliche photometrische Aktivitätsbestimmung, vgl. Aufg. 3)

2. Messung der Zeit t (Gerinnungszeit), bis zu der ein fest vorgegebener Umsatz ∆[S] erreicht wird, inAbhängigkeit von der Enzymkonzentrationen [E] (üblich z.B. auch bei der Bestimmung der Aktivität derAmylase, Abb. 14.1 B).

Eigenschaften der Gerinnungskaskade

Für die bisherige Ableitung gilt, daß im Ansatz ein einziges Enzym E1 in konstanter Menge vorliegt und damiteinen Umsatz mit konstanter Geschwindigkeit (Aktivität) katalysiert.

Bei der Blutgerinnung aber nimmt die Enzymkonzentration (z.B. des Thrombins) während der Reaktion (Fibrinogen⇒ Fibrin) zu, da es selbst in einer vorhergehenden enzymatischen Reaktion aus einem Proenzym (Prothrombin)als Produkt gebildet wird. Der zeitliche Verlauf des Umsatzes wird daher nicht mehr linear sein, sondern im Maßder Enzymbildung beschleunigt (Abb. 14.2, S. 67, E1 + E2). Dieser Effekt potenziert sich entsprechend der Anzahl nder auf gleiche Weise übereinandergeschalteten Enzymreaktionen En der Gerinnungskaskade und erklärt diepraktisch schlagartige Gerinnung zu definiert meßbarer Gerinnungszeit (Abb. 14.3, S. 67).

Ein kleiner auslösender Reiz am Anfang der Kette wird in einer solchen Kaskade von Enzymreaktionen von Schrittzu Schritt sehr effektiv verstärkt. (Die Gerinnungskaskade hat ihren Namen anschaulich von der völlig analogenWirkungsweise der Verstärkerkaskade eines Photomultipliers erhalten, sog. Photomultipliermodell. Die Ver-stärkung der Dynoden entspricht den einzelnen enzymatischen Schritten, vgl. Physik-Praktikum.) Bei derGerinnungskaskade wirkt sich ein Einfluß auf irgendeine einzelne enzymatische Stufe der Kaskade (z.B. Mangeleines Gerinnungsfaktors oder Zusatz eines Gerinnungshemmers wie Heparin ) in gleicher Weise auf den Gesamt -effekt aus. Dies ist die Grundlage der bei der Blutgerinnung beobachteten Tatsache, daß Reduktion irgendeinerder Komponenten (Gerinnungsfaktor) der Gerinnungskaskade denselben Einfluß auf die Gerinnungszeit hat. Diesgibt somit auch die Berechtigung und Begründung, bei den klinischen Bestimmungen der Gerinnungsfaktoren, diegemessenen Gerinnungszeiten als Menge des einzelnen Gerinnungsfaktors zu interpretieren.


67

Ein ähnliches System von enzymatischen Kaskadenreaktionen liegt auch dem Komplement-System zugrunde: vanKrogh-Gleichung für den Hämolysegrad y als Funktion der Komplementkonzentration x

yA x

1 A x

n

n= ⋅

+ ⋅

P

t

∆P

∆t

E1

E = 2 E2 1

B

A

00

Abb. 14.1: Messung der Reaktionsgeschwindigkeit einer einstufigen enzymatischen Reaktion zur Bestimmungder Enzymkonzentration bei hohem Substratüberschuß (v = vmax).A: Umsatzmessung bei konstanter Zeit ∆t.B: Zeitmessung bei konstantem Umsatz ∆P

P

t

00

n = 4n = 3

n = 2

n = 1

P

t

∆P

00

B

E > E2 1E > E3 2E

1

∆ t 3 ∆t 2 ∆ t 1

Abb. 14.2: Verlauf der Produktkonzentration inAbhängigkeit von der Anzahl n derenzymatischen Schritte einer Enzymkaskade

Abb. 14.3: Gerinnungszeitmessung bei konstantemUmsatz ∆P bei gegebener Anzahl n derKaskadenschritte in Abhängigkeit von derKonzentration eines Faktors


68

Auswertung

Aus den Gleichungen 1 bis 3 lassen sich die in der Gerinnungsanalyse üblichen graphischen Darstellungen (Abb.14.4 bis 14.6) für die Beziehung zwischen gemessenen Gerinnungszeiten ∆t und der Konzentration der beteiligtenGerinnungsenzyme bzw. -faktoren ableiten.

1. [E] · ∆t = konst.: Bei linearer Auftragung der Gerinnungszeit ∆t gegen die Thrombinkonzentration [E] bildendie Meßwerte eine Hyperbel (vgl. Abb. 14.4 und Versuchsauswertung S. 69).

2. lg [E] + lg ∆t = konst.: Bei doppelt logarithmischer Auftragung (sog. log-log-plot) bilden die Meßwerte eineGerade. Für eine einzelne Enzymreaktion hat die Gerade die Steigung -1, bei einer Enzymkaskade ist dieSteigung ein Maß für die Anzahl n der beteiligten Reaktionen (Abb. 14.5).

3. [E] = k · 1/ ∆t oder ∆t = k · 1/[E]: Die Enzymkonzentration ist der Gerinnungszeit umgekehrt proportional.Auftragung der Gerinnungszeit gegen die Plasmaverdünnung ergibt eine Gerade (Abb. 14.6).

Bei den graphischen Auswertungen der klinischen Gerinnungstests wird die Konzentration eines Gerinnungs-faktors als relativer Wert zu der Konzentration in einem sog. Normalplasma (Poolplasma) in Prozent angegeben.

n = 1

n = 3

0 2 4 6 8 10

E

0

2

4

6

8

10

t∆

n = 1

n = 3

2 10

E

10

t∆

510,50,30,3

0,5

1

2

5

Abb. 14.4: Lineare Auftragungen der Gerinnungszeit ∆t gegen die Konzentration eines Gerinnungsfaktors E inrelativen Einheiten (∆t vs. E)

Abb. 14.5: Doppelt logarithmische Auftragungen der Gerinnungszeit ∆t gegen die Konzentration einesGerinnungsfaktors E in relativen Einheiten (lg ∆t vs. lg E)

1/[E]

0

t∆

11

14

12

34

Abb. 14.6: Auftragung der Gerinnungszeit gegen die Plasmaverdünnung (∆t vs. 1/[E])


69


In zwei Versuchen soll die Wirkung von Thrombin vergleichend erfaßt und analysiert werden, zum einen mit derüblichen Gerinnungszeitmessung mit Fibrinogen und zum anderen als photometrische Reaktion mit einemchromogenen Substrat. Als Thrombinlösung wird entweder ein handelsübliches Thrombinpräparat oderersatzweise frisches, definiertes Citratplasma eingesetzt.

Als Substratlösung dient für die Gerinnungszeitmessung Citratplasma (Fibrinogen) und für die photometrischeUmsatzbestimmung das synthetische Tripeptidderivat Tosyl-Gly-Pro-Arg-p-Nitroanilid. Die Arginylgruppierunggleicht der Spaltstelle im Fibrinogen, das abgespaltene p-Nitroanilin macht die Aktivität des Thrombins direktphotometrisch bestimmbar (λ = 405 nm). Über den Extinktionskoeffizienten des p-Nitroanilin lassen sich damit dieUmsätze in Enzymaktivitätseinheiten (U = µmol Substrat/min bzw. katal = mol/s) angeben und somit die bis herigenNIH-Einheiten* für Thrombin absolut eichen. Es ist zu erwarten, daß die derzeitigen Blutgerinnungsanalysen überGerinnungszeitmessungen zunehmend durch photometrische Aktivitätsbestimmungen verdrängt werden.

* NIH = National Institute of Health, USA; es definiert biologische Einheiten

Versuch 1: Klassische Messung der GerinnungszeitGerinnungszeit als Funktion der Thrombinkonzentration

Reagentien

1. Citratblut bzw. Citratplasma (aus 1 Teil Citratlösung + 9 Teilen Blut), dient als Substrat für die meistenGerinnungstests

2. Citrat-Puffer: 1 Teil Na-Citrat 0,1mol/l + 9 Teile NaCl-Lösung 9 g/l

3. Thrombinlösung mit 5 NIH-E/ml

Geräte

Reaktionsgefäße, Draht, Stoppuhr

Zuerst die Verdünnungsreihe herstellen, dabei werden 500µl aus Reaktionsgefäß Nr. 6 verworfen.

Ansätze einzeln messen, Messung nach 180 s abbrechen

Auswertung (Graphiken ensprechend Abb. 14.4 bis 14.6)

1. Auftragung der Gerinnungszeit t gegen Thrombinkonzentration

2. Auftragung der reziproken Gerinnungszeit gegen Thrombinkonzentration (im gleichen Diagramm wie 1. ,vergl. S. 68, 3.)

3. Auftragung der Gerinnungszeit gegen die Thrombinkonzentration (auf doppelt logarithmischem Papier)

Reaktionsgefäß Nr. 1 2 3 4 5 6

Thrombin-Konz.(gegeben)

(NIH-E/ml)

5,0 2,5 1,25 0,62 0,31 0,155

Thrombinlösung

Citrat-Puffer

(ml)

(ml)

0,5

—

0,5

0,5 }0,5

0,5 }0,5

0,5 }0,5

0,5 }0,5

0,5 }Citratplasma(Fibrinogen)

(ml) je 0,2 (Ansätze einzeln nacheinander messen)

Gerinnungszeit (s)

reziprokeGerinnungszeit

(1/s)


70

Versuch 2: Photometrische Messung der Konzentration eines GerinnungsfaktorsUmsatzgeschwindigkeit eines chromogenen Substrates als Funktion der Thrombinkonzentration

Reagentien

1. Phosphatpuffer 0,15 mol/l Na2HPO4/KH2PO4, pH 8,0

2. Chromogenes Substrat TH (Chromozym TH), 1,5 mmol/l Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·HCl in 53,5 mmol/l Na-Citrat0,1 mol/l (3,8 %), isotonische Lösung als Antikoagulans

3. Thrombinlösungen mit 5, 10 und 15 NIH-E/ml

(nacheinander in Reaktionsgefäßen ansetzen)

Thrombin-Konz. (gegeben) (NIH-E/ml) 5,0 10,0 15,0

Phosphatpuffer (ml) 1,0 1,0 1,0

chromogenes Substrat TH (ml) 0,05 0,05 0,05

1 min warten

Thrombin-Lösung (ml) 0,05 0,05 0,05

Messung alle 30 s E1

λ = 405 nm E2

E3

E4

∆E/min (Mittelwert) x 9680 ⇒ U/l (x 16,7 ⇒ nkat/l)

reziproker Mittelwert

Aktivität (U/l) 1 NIH-E Thrombin = 0,1175 U

Thrombin-Konz. (gefunden) (NIH-E/ml)

Auswertung (Graphiken ensprechend Abb. 14.4 bis 14.6)

1. Bestimmung der Umsatzgeschwindigkeit ∆E/min aus den gemessenen Extinktionen

2. Auftragung des Umsatzes ∆E/min gegen die gegebene Thrombinkonzentration

3. Auftragung des reziproken Umsatzes gegen die gegebene Thrombinkonzentration (auf doppeltlogarithmischem Papier, s. Versuch 1, 3.)

Die meisten klinischen Bestimmungsverfahren und "Phasentests" beruhen auf demselben Prinzip. Zu demGerinnungsansatz werden diejenigen Gerinnungskomponenten, die nicht zur Untersuchung anstehen, definiert imÜberschuß zugesetzt, um sie sicher nicht limitieren zu lassen. Damit wird die Abhängigkeit der Gerinnungszeit vondem oder den verbleibenden limitierenden Faktoren bestimmt.

Solange noch keine absoluten Bestimmungen möglich sind, werden alle Gerinnungszeitanalysen in Prozent einer"Normalgerinnung" eines Mischplasmas aus mehreren gesunden Individuen angegeben.

Als enzymatische Reaktionen erfordern Gerinnungsanalysen eine definierte Reaktionstemperatur. Vorläufig sinddie klinischen Verfahren auf 37°C festgelegt. (Die Praktikumsversuche hier sind auf Durchführung bei Zimmer-temperatur ausgelegt.) Da die Gerinnungsfaktoren z.T. kurze Halbwertszeiten haben, sind die Messungenmöglichst schnell (innerhalb 2 Stunden) durchzuführen.


71

Versuch 3: Bestimmung von Antithrombin III (Heparin-Cofaktor)Beispiel einer photometrischen Gerinnungsfaktorbestimmung mittels chromogener Substrate

Prinzip

Heparin bildet mit dem Heparin-Cofaktor Antithrombin III (ATIII) einen Komplex (Reaktion 1), der seinerseitsThrombin hemmt (Reaktion 2). In einem Testsystem mit Heparin und Thrombin im Überschuß kann der unbe-kannte ATIII-Gehalt eines Patientenplasmas titriert werden aus der Abnahme der Thrombinaktivität des Test-systems (Reaktion 3), und zwar entweder konventionell aus der Gerinnungszeitmessung oder, wie hier, aus demUmsatz eines chromogenen Thrombin-Substrates.

Die Untersuchung auf endogenes oder therapeutisch zugesetztes Heparin erfolgt im Prinzip wie die Bestimmungeines kompetitiven Inhibitors des Thrombins (Anti-Thrombin).

1. Heparin + ATIII Heparin-ATIII-Komplex

2. Thrombin + Heparin-ATIII-Komplex inaktives Thrombin + restaktives Thrombin

3. FibrinogenThrombin

Fibrin (Gerinnungszeitmessung)

bzw. chromogenes SubstratThrombin

Produkt, pNA (Umsatzmessung)

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1Plasmakonz. ATIII

∆E/min

Abb. 14.7 (links): Bestimmung der Umsatzrate (∆E/min) für Plasma ATIII gegenüber dem Testleerwert.

Abb. 14.8 (rechts): Thrombinhemmung durch Plasma ATIII. Aufgetragen ist die Umsatzgeschwindigkeit (∆E/min) gegen die Plasmakonzentration ATIII, bzw. die Konzentration von restaktivem

Thrombin

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8min

E

Leerwert

Plasmaproben


72

Reagentien

1. Thrombinlösung 0,024 U/l (25 °C) in Tris/HCl 0,1 mol/l, pH 8,1, Heparin 2 USP-U/ml, Aprotinin 6,5 IU/ml, NaCl0,14 mol/l

2. Chromogenes Substrat (Chromozym TH®) Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH 1,9 mmol/l

3. NaCl 9 g/l

4. Probe: Citratplasma-Verdünnungen 1:51, 1:61, 1:71 in NaCl 9 g/l

Versuchsansatz ATIII (alle Ansätze nacheinander durchführen)

Proben Leerwert 1 2 3

gegebeneProbenverdünnung

unverdünnt

1:51 1:61 1:71

Thrombinlösung (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0

NaCl (ml) 0,05 — — —

verd. Plasma (ml) — 0,05 0,05 0,05

mischen

chromogenes Substrat (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1

sofort mischen, innerhalb 30 s erste Extinktionablesen, alle 30 s wiederholen

(λ = 405 nm) E1

E2

E3

E4

∆E/min (Mittelwert)

(∆E/min) Leerwert - Probe — Normalwerte (Mensch)

cATIII(kU/l)

(µkat/l)——

21 ± 4350 ± 70


73

Berechnung:

Ebenso wie bei Enzymaktivitätsbestimmungen wird hier eine Inhibitorkonzentration (IE/ml) durch eine Enzym-aktivitätsänderung ausgedrückt, folglich können auch Inhibitor-Einheiten (IE) in die SI-Einheit katal (kat) über-tragen werden (1 U = 16,7 nkat)

AE

tATIIIATIII=

∆∆

**f

dε

AATIII: Aktivität v, f = Verdünnungsfaktor

Die Gesamtverdünnung ergibt sich aus der Probenverdünnung im Ansatz, der Plasmaverdünnung und derVerdünnung des Blutes bei der Entnahme (Citrat-Blut).

z.B. für Plasmaverdünnung 1:61

ATIIIATIIIA

E 110,4

min cm kU 1cm

[ / ]min min

kU ll

=

⋅

⋅ ⋅

⋅

⋅ ⋅ ⋅

∆ 11

115050

611

109

Auswertung

Auftragung der Umsätze (∆EATIII/min) gegen die Plasmaverdünnung (s. Abb 14.8)


Klinische Blutgerinnungstests

1. Globaltests, differenzieren nicht zwischen den Faktoren:

a) Gesamte endogene Gerinnung einschl. Plättchenfunktion: Gerinnung von Citratblut nach CaCl2-Zusatz: sog.Recalcifizierungszeit

b) Gesamte endogene Gerinnung außer Plättchenfaktor : Blutungszeit

c) Gerinnung von Citratblut nach Zusatz von CaCl2 und PTT-Reagens: sog. partielle Thromboplastinzeit (PTT)

2. Phasen- und Faktorentests:

a) Gerinnungszeit als Funktion der Fibrinogen- (bzw. Antithrombin III- oder Heparin-) Konzentration: sog.Thrombinzeit

b) Gerinnungszeit als Funktion der Faktoren VII, X, V, II, bei Überschuß von III und Ca: sog. Quicktest bzw.Thromboplastinzeit


74


75

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2

3

5

7

4

6

8910

10

2

3

5

7

4

6

89

10

2 3 5 74 6 8 9 1010 2 3 5 74 6 8 9 10 2 3 5 74 6 8 9 10

2

3

5

7

4

6

8910

10

2

3

5

7

4

6

8910

77

AUFGABE 15: Elektrolyte der Körperflüssigkeiten


Für den Wasser- und Elektrolythaushalt unterscheiden wir hinsichtlich der physiologischen Zusammensetzungder Körperflüssigkeiten (vgl. Abb. 15.1) drei Kompartimente:

1. Plasma, Intravasalraum

2. Interstitielle Flüssigkeit }1. Extrazellulärraum

3. Intrazelluläre Flüssigkeit 2. Intrazellulärraum

Der wesentliche Unterschied zwischen Extra- und Intrazellulärraum besteht in der Ionenzusammensetzung,während der Unterschied zwischen intravasaler und interstitieller Flüssigkeit im wesentlichen durch den Protein-gehalt bedingt ist. Die Erhaltung physiologischer Bedingungen im Wasser- und Elektrolythaushalt beruht auf dreigekoppelten Mechanismen:

1. Erhaltung der Säure-Basen-Verhältnisse (Isohydrie)

2. Erhaltung der Ionenzusammensetzung (Isoionie)

3. Erhaltung des osmotischen Drucks (Isotonie)

Die hier auszuführenden Aufgaben dienen im wesentlichen zur Diskussion der physiologischen Werte undpathologischen Abweichungen für Elektrolyte. Sie sind u.a. auch im Zusammenhang mit der Besprechung derNierenfunktionsproben (s. Kapitel Clearance) zu sehen.

Elektrolyt-Analysen wurden bisher in mVal/l angegeben, um die Äquivalenzverhältnisse zwischen den Ionenbeschreiben und mit der Osmolalität in Beziehung setzen zu können (s. Abb. 15.1, S. 81). Gemäß denEmpfehlungen der IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) soll jedoch die "Stoffmenge" Moldie "äquivalente Menge" Val ersetzen, weshalb die angewandte chemische Formel als Basis mitangegebenwerden muß, z.B. Mol (Ca2+)0,5 statt Val Ca2+.

Ausnahmen von den Mol-Angaben betreffen:

1. Eiweiß in g/l, da eine breite Mol.Gew.-Verteilung der Serumproteine vorliegt und der Ionisationsgrad imEinzelfall nicht bekannt ist.

2. Calcium und Magnesium in mg/l, soweit der ionisierte Anteil nicht aus einem Nomogramm bei bekanntemEiweißgehalt bestimmbar ist.

3. Anorganisches Phosphat in mg/l, da die Dissoziation pH-abhängig ist (bei pH 7,0 20 % H2PO4- und 80 %

HPO42-; vgl. Biochemisches Praktikum).


Bei den ausgestellten Proben handelt es sich um normales und hämolytisches Serum bzw. Plasma. FolgendeAufgaben sind damit auszuführen:

1. Bestimmung von Na+ und K+ durch direkte Flammenphotometrie (Für die Flammenphotometrie ist Plasma mitLithium- oder Ammoniumheparinat anzusetzen!)

2. Bestimmung von Cl- durch merkurimetrische Titration

3. Bestimmung von Ca2+ durch photometrische Komplexometrie

15. Elektrolyte

78

Flammenphotometrie

Prinzip

Metalle werden bei Erhitzung zur Emission von Licht angeregt, wobei für die einzelnen Elemente bestimmteWellenlängen charakteristisch sind. Die Intensität I ist der Konzentration c des verdampften Ions im genutztenMeßbereich proportional.

IE = k · c k = Proportionalitätsfaktor [l/mol]

Im Flammenphotometer wird die Elektrolytlösung (Serum, Plasma) im Luftstrom zerstäubt und in einer Gasflamme(Propan oder Acetylen) zur Emission angeregt. Die charakteristische Emissionslinie wird durch Spektralfilter selek-tiert und die Intensität photometrisch gemessen. Die Eichung erfolgt an bekannten Konzentrationen (Eichlösung,Kontrollserum).

Im Praktikum werden nur Na+ und K+ flammenphotometrisch bestimmt. Sie können bereits mit der Propanflammeangeregt werden. Zur Anregung von Ca2+ ist die heißere Acetylenflamme notwendig. Da die Emissionslinie vonCa2+ noch vom Untergrund des Na+ überlagert ist, muß dessen Einfluß auf die Nullpunkteinstellung mit einerKompensationslösung korrigiert werden. Sie hat denselben Na+-Gehalt, der in der Meßlösung erwartet wird(Serum 143 mmol/l Na).

Indirekt können auch Nicht-Metalle flammenphotometrisch bestimmt werden. Da z.B. Cl- nicht angeregt werdenkann, erfolgt seine flammenphotometrische Bestimmung indirekt durch Titration mit AgNO3 im Überschuß(Fällung als AgCl) und Messung des in Lösung verbleibenden anregbaren Ag+.

Reagentien

1. Standardlösungen:a) Na+: 143,5 mmol/lb) K+: 3,84 mmol/l

2. Netzmittellösung: erzeugt die gleiche Zerstäubung wie das Protein im Plasma

Geräte

Mikropipetten, Dispensetten, Plastikgefäße, Flammenphotometer

Für Elektrolytbestimmungen sind Ansätze in Kunststoffgefäßen auszuführen, da Glas Ionen binden oderfreisetzen kann.

Versuchsansatz(Ansätze gut mischen - Standardlösungen stehen am Flammenphotometer aus)

Natrium Kalium

Proben Plasmahämol.Serum

Plasmahämol.Serum

A. dest. (Dispensette) (ml) 10 10 10 10

Probe (µl) 50 50 500 500

Na+ bzw. K+ (mmol/l)

15. Elektrolyte

79

Merkurimetrische Chloridtitration

Ähnlich wie bei der indirekten flammenphotometrischen Chloridbestimmung (s.o.) wird auch hier Chlorid indirektmit Hg titriert. Chloridionen bilden mit den Quecksilber-II-Ionen der Meßlösung undissoziiertes Quecksilber-II-Chlorid.

2 Cl- + Hg2+ HgCl2

Mit dieser Reaktion konkurriert die Indikatorreaktion

Ind + Hg2+ Hg-Ind

Diphenylcarbazon als Indikator ergibt mit Quecksilber-II-Ionen einen violett gefärbten Komplex. Die Bindungs-konstante des Diphenylcarbazons ist wesentlich schwächer als die des Chlorids. Daher wird durch Titration mitHg(NO3)2 zunächst nur Chlorid gebunden. Erst ein Überschuß von freiem Hg2+ reagiert mit dem Indikator unterBildung einer violetten Färbung.

Reagentien

1. 5 mmol/l Hg(NO3)2 (entspricht 0,01 N)

2. 20 mmol/l Diphenylcarbazon in Ethanol (Indikator)

3. 100 mmol/l HCl (Chlorid-Standard)

Geräte

Mikrobürette, Titrationsgefäße (Glas)

Versuchsansatz

Probe Standard Probe

Standard (ml) 0,1 —

Plasma — 0,1

H2O 1,0 1,0

Indikator 0,2 0,2

5 mmol/l Hg(NO3)2 (ml) x 100

Cl- (mmol/l)

1 ml titrierte Hg(NO3)2-Lösung entspricht 0,01 mmol Cl-

Normalbereich Cl-: 95 - 115 mmol/l

15. Elektrolyte

80

Photometrische Ca2+-Bestimmung

Reagentien

1. Ca2+-Standard: 2,0 mmol/l CaCl2

2. Puffer: 2-Amino-2-methyl-1,3-propanediol 500 mmol/l, nicht reaktive Bestandteile und Stabilisatoren

3. Chromogenlösung:o-Kresolphthalein-Komplexon 0,024 % ; 8-Hydroxychinolin 0,25 %

4. Reaktionsgemisch aus 2. und 3. im Verhältnis 1:2 (d.h. 1 Teil Lsg. 2 + 1 Teil Lsg. 3)

Geräte

Filter-Photometer: λ = 578 nm; Spektralphotometer λ = 575 nm

Versuchsansatz (Inkubationszeit bei Raumtemperatur mindestens 5 min, maximal 50 min)

Leerwert Standard Probe

Standard (µl) — 20 —

Plasma (µl) — — 20

Reaktionsgemisch (µl) 1000 1000 1000

E 0,000

C (Ca2+) (mmol/l) — 2,0

Berechnung:

CE

ECProbe

Probe


Hinweis:

Starke Eigenfärbung der Probe stört (Hb > 2 g/l, Bilirubin 0,2 g/l), in diesem Fall ist zusätzlich die Extinktions-differenz zwischen Probe und Leerwert nach Entfärben mit einer konzentrierten EDTA-Lösung zu messen und alsKorrektur abzuziehen (vgl. auch Biuret-Methode, Aufgabe 1).


1. Einfluß von Antikoagulantien auf die Elektrolytbestimmung (z.B. Ammonium- oder Lithium-Heparinat)

2. Unterschiede zwischen Plasma, Serum und hämolytischem Serum für die Diagnostik (Protein, K+, Cl-,Bilirubin, Enzyme etc.)

3. Proteine und Elektrolyte des Serums und Plasmas, Eigenschaften, Pathophysiologie

15. Elektrolyte

81

Abb. 15.1: Ionenzusammensetzung von Plasma, extra- und intrazellulärer Flüssigkeit

83

AUFGABE 16: Qualitative und halbquantitative Schnelltests, Teststreifen oderTeststäbchen sowie mikroskopische Methoden zum Nachweisvon Harn- und Blutbestandteilen

A) Qualitative Teststreifenmethoden

Qualitativen Teststreifenmethoden kommt große Bedeutung in der klinischen Diagnostik zu, bei der in vielenFällen ein qualitativer Nachweis als Suchtest oder als Ja-Nein-Entscheidung genügt. Die meisten der zu bestim-menden Parameter haben ohnehin eine breite (normale oder häufiger log-normale) Verteilung in der gesundenPopulation. Pathologische Abweichungen müssen sich vom Normalbereich hinreichend unterscheiden, Werte imÜbergangsbereich sind immer im Zusammenhang mit anderen Befunden zu interpretieren. Die meistenNachweisreaktionen sind Modifikationen der bereits aus dem biochemischen und klinisch-chemischen Praktikumbekannten quantitativen Verfahren. Ihre Besonderheit liegt darin, daß es gelungen ist, auf einem Träger in einerReaktionszone alle für eine Farbreaktion notwendigen Reagentien in trockener, freier oder gebundener Formunterzubringen, einschließlich der Enzyme. Der Grad der Reaktion ist aus der Farbintensität zu beurteilen. EinBeispiel für die Güte der Korrelierbarkeit zwischen den Farbintensitäten eines Teststreifens und denphotometrisch bestimmten Konzentrationen ist in Abb. 16.1 dargestellt.

Abb. 16.1: Vergleich einer Harnstoffbestimmung mittels Teststreifen mit einer photometrischen Bestimmung(nach Lehmann, Diss. Gießen 1980)

16. Qualitative Schnelltests

84

Simultaner Nachweis verschiedener Parameter im Harn

Durchführung: Auf jedes Testfeld ca. 20 µl mit einer Pipette auftropfen und nach 60 s Farbreaktion mit derFarbskala des Tests vergleichen. Befunde der ausgegebenen Harnproben in die Tabelle eintragen und beurteilen.

Parameter PrinzipNormal-

wertStörungen

Leukozyten Nachweis der Esteraseaktivität der Granulozyten durch Spaltung einesIndoxylesters zu Indoxyl. Indoxyl reagiert mit einem Diazoniumsalz zuviolettem Azo-Farbstoff (vgl. Enzymaktivitätsbestimmungen mitchromogenen Substraten, Aufg. 3, vgl. auch enzym-histochem.Färbeverfahren).

neg. evtl. 120 swarten

Nitrit Diazoreaktion (Grieß'sche Probe) weist Nitrit und damit nitrit-bildendeKeime (Bakterien) nach (nur sinnvoll bei frischem Urin)

neg. Antibiotika,Chemothera-peutika

pH Indikatorgemisch aus Methylrot (pK 5,3, violettrot-gelborange) undBromthymolblau (pK 6,8, gelb-blau)

spezies-abhängig

Eiweiß gebundener pH-Indikator, gepuffert. Der Test beruht auf dem Prinzipdes Eiweißfehlers von pH-Indikatoren.

neg. pH > 8

Glucose GOD-POD, (vgl. Aufgabe 3 bzw. 7) < 0,5 g/l

Keton Legal'sche Probe: Komplex mit Nitroprussid-Na, Glycin,Na-Carbonat-Puffer."Ketonkörper": Aceton, ß-Hydroxybuttersäure, Acetessigsäure

neg.

Urobilinogen reagiert mit Diazoniumsalz zu rotem Azofarbstoff < 10 mg/l hoheBilirubinkonz.

Bilirubin kuppelt mit Diazoniumsalz rosa bis rotbraun neg.

Blut Hämoglobin und Myoglobin wirken als Pseudoperoxidasen, kataly-sieren die Oxidation des Indikators (Guajak-Harz) durch gebundenes,organisches Hydroperoxid. Der Test läßt zwischen Hämoglobin undErythrozyten im Harn unterscheiden (zwei Farbskalen).

neg.

Untersuchung und Auswertung der ausgestellten Proben

Proben Proben

Parameter 1 2 3 4 5 6 Parameter 1 2 3 4 5 6

Leukozyten Keton

Nitrit Urobilinogen

pH Bilirubin

Eiweiß Blut

Glucose

16. Qualitative Schnelltests

85

Glucose-Bestimmung im Blut (Haemo-Glukotest)

Prinzip: s. Aufgabe 3 bzw. 7

Durchführung: 1 Tropfen Blut (ca. 10 µl) auf das Reaktionsfeld des Teststreifens auftropfen, nach einer Minuteabwischen und nach zwei Minuten anhand der Farbskala ablesen.

Konzentration

[mmol/l] [g/l]

Probe 1

Probe 2

B) Mikroskopische Untersuchungsmethoden

Differentialblutbild-Färbung

Die Färbung erfolgt auf gebrauchsfertig farbbeschichteten Objektträgern. Das Farbfeld enthält im standardisiertenkonstanten Verhältnis die Farbstoffe Neu-Methylenblau-N und Cresylviolettacetat zur panchromatischen Blutzell-färbung.

Durchführung: Einen kleinen (!) Bluttropfen (ca. 3 µl) auf ein Deckglas geben und dieses auf das Farbfeld desObjektträgers leicht andrücken, damit sich die Probe verteilt (nicht ausstreichen!). Als Antikoagulans eignen sichEDTA und Citrat, nicht Heparin, Oxalat oder Fluorit. Mikroskopische Auswertung nach 15 min mit Ölimmersioninnerhalb von 4 Stunden.

Neutrophile Granulozyten: zart violett granuliertes Zytoplasma, purpurne Kerne

Eosinophile Granulozyten: große, leuchtend gelbgrüne bis grüne Granula, Kern hellpurpur

Basophile Granulozyten: purpurne bis braune Granula, Kern meist überdeckt

Monozyten: Zytoplasma purpur, Kern purpur und scharf konturiert

Lymphozyten: schmaler purpurner Zytoplasmasaum, Kern purpur mit Nukleolen

Thrombozyten: purpurne Plättchen oder Aggregate

Erythrozyten: gelbbraun, abgerundet

Reticulozyten: Substantia granulo-filamentosa purpur, Zählung und Bezug auf 1000 Erythrozyten

Das Färbeverfahren ist ebenso für Liquorzellen, Karzinomzellen und Spermatozoen geeignet.

Harnsediment

Für die mikroskopische Untersuchung der Bestandteile des Harnsediments eignen sich besonders gut Kammern,die aus einem Objektträger und Deckglas mit zwei Streifen doppelseitigem Klebeband als Abstandhalter (ca. 0,1mm) vorbereitet werden.

Vorteil: Die Harnbestandteile (Zellen, Zylinder, Kristalle) werden nicht durch den Druck des Deckglases beimAntrocknen zerstört.

Eine Harnprobe wird in einem Reaktionsgefäß kurz zentrifugiert und etwa 50 µl des Sediments unter das Deckglasder Kammer pipettiert (Kapillarwirkung). Für die Mikroskopie genügt schwache bis mittlere Vergrößerung. DasVerfahren eignet sich ebenfalls für die Untersuchung von in Suspension gefärbten Zellen gegenüber derAnfärbung im Ausstrich.

Die Untersuchung des Harnsediments wird zum Vergleich mit Hellfeld- und Phasenkontrast-Mikroskop durch-geführt.

86

LITERATUR

Die aktuellen Auflagen sind soweit vorhanden in Klammern angegeben (Stand August 1999).

1. R. RICHTERICH: Klinische Chemie, Theorie und Praxis.Karger, Freiburg (4. Aufl. 1978)

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3. H. AEBI: Einführung in die praktische Biochemie.Karger, Freiburg (3. Aufl. 1982)

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9. Documenta Geigy: Wissenschaftliche Tabellen.J.R. Geigy AG, Basel 1979

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