Kursplan Praktikum PflanzenphysiologieWintersemester-p-2560.pdf · Die Pflanzen mit geschlossenen...

Kursplan und Skript zum Prakti-kum Pflanzenphysiologie

Wintersemester 2018/19

Lehramt

1

Seiten 1. EINFÜHRUNG IN ARBEITSTECHNIKEN UND VERSUCHE ZUM THEMA BEWEGUNGSPHYSIOLOGIE 24.10.2018 5 0. Allgemeine Einführung (Pipettieren, Wiegen, Zentrifugieren, Spektrome-ter) 1.1 Thermonastische/Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen 1.2 Krümmung der Sprossachse durch Wuchsstoff 1.3 Negativer und positiver Gravitropismus 1.4 Phototropismus 2. WASSERHAUSHALT DER ZELLE 07.11.2018 8 2.1 Saugwirkung eines Zweiges 2.2 Transpiration 2.3 Guttation 2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme 3. PHYSIKOCHEMIE DER ZELLE 14.11.2018 13 3.1 Diffusionsgeschwindigkeit von Elektrolyten 3.2 Quellungsdruck 3.3 Traubesche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle 3.4 Modellversuch zur Osmose 3.5 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration 4. WACHSTUM UND ENTWICKLUNG 21.11.2018 18 4.1 Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls 4.2 Einfluss von Licht auf das Wachstum (Biostatistik)

4.3 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure 4.4 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum 5. MINERALSTOFFWECHSEL 28.11.2018 23 5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests 5.2 Nachweis von Nitrat 5.3 Nachweis von Eisen 5.4 Nachweis von Phosphat 6. KEIMUNG 05.12.2018 29 6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Phytochrom-Einfluss auf die Keimung – ein klassischer Modellversuch 6.4 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflanzen 6.5 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung

2

6.6 Etiolement 7. BODEN UND PFLANZE 12.12.2018 34 7.1 Bestimmung der Wasserkapazität 7.2 Kapillare Steighöhe 7.3 Bestimmung der Bodenazidität 7.4 Bestimmung des Kalkgehaltes 7.5 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide 8. CHLOROPLASTENPIGMENTE 19.12.2018 38 8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente 8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes 8.3 Abbau des Chlorophylls (Effekte auf Farbe und Fluoreszenz) 8.4 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) 8.5 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten 9. PHOTOSYNTHESE 09.01.2019 43 9.1 Nachweis der O2-Abgabe (Indigomethode) 9.2 C3- und C4-Pflanzen 9.3 Einfluss der Lichtintensität auf die Hill-Aktivität 9.4 Regulation der Stomata 10. ENZYMOLOGIE 16.01.2019 48 10.1 α-Glucosidase und ihre Regulation 10.2 Nachweis von α- und ß-Amylase-Aktivität 10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität 11. ATMUNG UND GÄRUNG 23.01.2019 53 11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung 11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate 11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung) 12. SÄUREN UND SEKUNDÄRE PFLANZENSTOFFE 30.01.2019 55 12.1 Bestimmung der Azidität in Wein 12.2 Nachweis von Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten 12.3 Nachweis von Sekundärcarotinoiden 12.4 Nachweis von Aesculin und Fraxin 12.5 Bestimmung von pflanzlichen Terpenen durch Geruchstest 12.6 Chemiewaffen im Pflanzenreich (Allelopathie)? 13. Abschlussklausur am 20.02.2019 10:00Uhr Gr. Hörsaal Dornburgerstr. 159 14. Nachklausur am 13.03.2019 10:00Uhr Gr. Hörsaal Dornburgerstr. 159

3

t-Tabelle und probit-Transformation 63 Zusatzblatt zum Eisennachweis 64 Liste einiger im Pflanzenphysiologischen Praktikum verwendeter Pflanzen 65 Periodensystem 67

4

Allgemeine Literatur-Hinweise KUTSCHERA, U.: Grundpraktikum zur Pflanzenphysiologie, Quelle & Meyer, Wiesbaden, 1998. *) KUTSCHERA, U.: Prinzipien der Pflanzenphysiologie. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2002. NULTSCH, W.: Allgemeine Botanik. 11. Aufl., Thieme, Stuttgart 2001. *) SCHOPFER, P und A. BRENNICKE: Lehrbuch der Pflanzenphysiologie. 7. Aufl., Spektrum 2010. RICHTER, S.: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen. 6. Aufl., Thieme, Stuttgart 1998. SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Methoden. Band I. Springer-Verlag, Berlin 1986.

*SCHOPFER, P.: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Einführung in die Anwen-

dung. Band II. Springer-Verlag, Berlin 1989. STRASBURGER. Lehrbuch der Botanik. 35. Aufl., Neubearb. P. SITTE, E. W. WEILER, J. W. KADEREIT, A. BRESINSKY und C. KÖRNER. Spektrum Akade-mischer Verlag 2002. Lincoln TAIZ, Eduardo ZEIGER. Plant Physiology. 4th Edition. Spektrum Aka-demischer Verlag, 2007. *) Besonders zu empfehlen

http://www.amazon.de/exec/obidos/ASIN/0878938230/qid=1090056981/sr=1-1/ref=sr_1_10_1/028-7955766-8425319

5

1. KURS: BEWEGUNG 24.10.2018

0. Allgemeine Einführung (Pipettieren, Wiegen, Zentrifugieren, Spektrometer) 1.1 Thermonastische/ Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen (Demonstrationsversuch) 1.2 Krümmung der Sprossachse durch Wuchsstoff 1.3 Negativer und positiver Gravitropismus 1.4 Phototropismus --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

0. Allgemeine Einführung

Mit einem „Stationsbetrieb“ möchten wir Ihnen eine Einführung in unerlässliche Techniken und Geräte der experimentellen Botanik ermöglichen. Es geht um den Umgang mit Waagen, Pipetten, Zentrifugen und verschiedenen Spektrophotome-tern. Zur Übung sollen Sie eine Standardkurve erstellen. Dazu wird eine trübe Lö-sung benötigt (Betreuer).

Versuchszeit: ca. 1,5 h

1.1 Thermonastische/ Photonastische Öffnungs- und Schließbewegungen

Allgemeines: Bei diesem Versuch handelt es sich um einen Demonstrationsver-such, der von einem Betreuer vorgeführt wird. Bitte protokollieren Sie diesen Ver-such. Das Anliegen besteht darin, Temperatur als Reiz für Nastien zu erkennen. Bei vielen Blütenpflanzen beobachtet man für das Wachstum der Innen- und Au-ßenseiten der Blütenblätter unterschiedliche Temperaturoptima. Daher lösen Temperaturveränderungen oft thermonastische Bewegungen aus. Pflanzen kön-nen teilweise auf sehr geringe Temperaturdifferenzen reagieren, die Perigonblätter von Crocus z.B. noch auf 0,2oC.

Literatur: Schopfer&Brennicke oder Kutschera (Prinzipien)

Materialien: Maßliebchen (Bellis perennis) ist ein nahezu

ideales Objekt für diesen Versuch. Es wird im Gewächshaus vorkultiviert. Die Blüten sollten geschlossen sein und dazu vorher in kaltem Wasser oder Kühlschrank aufbewahrt wer-den.

Chemikalien: keine

Geräte: 1. Zwei Bechergläser als Blumenvasen. 2. Kühlschrank.

Fertig hergestellte Lösungen: Leitungswasser mit Kühlschrank-temperatur

Durchführung: Die Pflanzen mit geschlossenen Blüten werden ins Praktikum (Zimmertemperatur) gebracht. Es ist darauf zu achten, dass das Wasser im Becherglas dann ebenfalls Raumtemperatur hat. Sind die Blüten bereits geöffnet, so kann man sie bei 4oC in einen Kühlschrank stellen. Experimentell einfacher ist es, sie in ein Becherglas mit gekühltem Wasser zu stellen. Es wird das Öffnen oder Schließen der Blüten beo-bachtet.

Versuchszeit: ca. 5 min zum Ansetzen, Ergebnis im Verlauf der Praktikumszeit.

Auswertung: Verlauf und zeitliche Dauer der Öffnungs- bzw. Schließbewegungen von Blütenblättern sind zu beobachten und zu protokollieren.

6

1.2 Krümmung der Sprossachse durch Wuchsstoff

Allgemeines: In diesem Versuch soll die Wirkung des Phytohormons Auxin beo-bachtet werden.

Literatur: Schopfer&Brennicke oder Kutschera (Prinzipien); Für Spezis: Taiz/ Zei-ger.

Materialien: Pro Gruppe 2 gut gegossene

Coleuspflanzen. Holzstäbchen zum Bestreichen der Sprossach-sen, z. B. Streichhölzer.

Chemikalien: keine außer den Pasten (s. u.)

Geräte: keine Fertig angesetzte „Lösungen“: Wuchs-

stoffpaste und Wasserpaste.

Durchführung:

An unverholzten Sprossachsenabschnitten gut gegossener Coleuspflanzen wird auf ein Internodium Wuchsstoffpaste einseitig aufgetragen. Am einfachsten ver-wendet man dazu ein Streichholz. Zur Kontrolle wird Wasserpaste bei einer ande-ren Pflanze aufgetragen. Danach werden die Pflanzen frisch gegossen und im Gewächshaus weiterkultiviert.

Versuchszeit: etwa 10 min

Auswertung: Die beobachteten Effekte sollen eigenverantwortlich nach einer Wo-che (30.10.) protokolliert und ausgewertet werden.

Hinweis: Die Wuchsstoffpaste besteht aus einer Salbenbasis mit 0.5% IAA = In-dolylessigsäure, die Wasserpaste enthält keinen Wuchsstoff. Die Pasten wurden im Mörser durch Vermischen gleicher Teile von (wasserfreiem) Wollfett (in der Apotheke als Cera lanae) und Wasser bzw. wässriger IAA-Lösung hergestellt. Lö-sungen bzw. Suspensionen mit 0.5% IAA oder IBS (Indolylbuttersäure) wurden un-ter Vermittlung von wenigen Tropfen Ethanol bereitet.

1.3 Negativer und positiver Gravitropismus

Allgemeines: Auch Geo- bzw. Gravitropismus beruht auf unterschiedlichen Wachs-tumsgeschwindigkeiten, diesmal von Ober- und Unterseiten.

Literatur: Kutschera (Prinzipien), Kutschera (Grundpraktikum), aber auch Schopfer & Brennicke.

Materialien: Pro Gruppe einen Erbsenkeim-

ling (ca. 1 cm groß), etwa 5 Tage nach der Aus-saat in Vermiculit (Gewächshaus) Filterpapier zum Auslegen des Glasgefäßes.

Chemikalien: keine

Geräte: Glasgefäß

10 cm-lange Glasröhren (eine pro Gruppe); Styropor-Platte mit Löchern zur Aufnahme der Glasröhren. Binokular Skalpell Nadel

Fertig angesetzte Lösungen: keine

Durchführung: Der Keimling wird so in die Glasröhre gesteckt, dass sich die Wurzeln auf der ei-nen und der Spross auf der anderen Seite befinden. Die Glasröhre wird dicht über dem Wasser in die Styropor-Platte gesteckt. Ein Glasgefäß wird mit Filterpapier

7

ausgekleidet, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. Es wird Wasser mit einer Füll-standshöhe von 2 – 3 cm eingefüllt und die Styropor-Platte mit den Glasröhrchen eingesetzt. Die geschlossene Kammer wird auf eine Fensterbank ins Licht gestellt, mögliche Effekte durch Phototropismus (was ist das?) stören nicht. Eine Gruppe schneidet die Wurzelhaube bei Versuchsbeginn ab. Achten Sie bitte auf Unter-schiede zu den anderen Pflanzen.

Versuchszeit: ca. 15 min

Auswertung: Skizze des Ergebnisses nach einer Woche (30.10.) und Beschrei-bung der Ergebnisse.

1.4 Phototropismus

Allgemeines: Das einseitig gerichtete Wachstum unter dem Einfluss von Licht be-ruht letztlich auf dem polaren Auxintransport.

Literatur: Besonders gut verständlich in Kutschera (Prinzipien), aber auch Schop-fer & Brennicke.

Materialien: Pro Gruppe 2 - 3 Sonnenblu-

menkeimlinge (oder Erbse), ca. eine Woche nach Aussaat in Vermiculit. 250 ml-Plastikbecher pro Gruppe

Chemikalien: keine

Geräte: „Phototropismuskäfig“ – muss meist neu aus einem Karton konstruiert werden. Es wird also ein Karton benötigt (Versuchsbetreuer).


Durchführung: Ein Keimling wird in ein Plastikbecherglas mit Vermiculit gesetzt. Das Vermiculit wird gut gewässert (nicht mehr als ein Drittel stehendes Wasser). Das Becherglas wird in den „Phototropismuskäfig“ gesetzt und so geschlossen, dass Licht nur ein-seitig einfallen kann.


Auswertung: Nach einer Woche (30.10.) ist das Ergebnis zu skizzieren und zu pro-tokollieren.

8

2. KURS: WASSERHAUSHALT DER ZELLE 07.11.2018

2.1 Saugwirkung eines Zweiges 2.2 Transpiration 2.3 Guttation (Demonstrationsversuch) 2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

2.1 Saugwirkung eines Zweiges

Allgemein: Bitte nutzen Sie die Stichworte Transpiration, Einflüsse auf die Transpiration

und physikalische Aspekte der Transpiration zu Ihrer Vorbereitung.

Materialien: Zweige der Eibe (Taxus). Auch andere Zweige sind möglich.

Chemikalien: keine

Geräte: - kleines Becherglas - Fotoschale oder Eimer - dünner Schlauch - 1 ml Messpipette - Stativ - Stativmaterial - Gartenschere

Fertig angesetzte Lösungen: Tinte in Glycerol

Durchführung:

Vor Versuchsbeginn wird der Taxus-Zweig unter Wasser schräg abgeschnitten

und ebenso unter Wasser durch einen wassergefüllten Schlauch mit einer wasser-

gefüllten 1 ml Glaspipette verbunden. Dabei ist darauf zu achten, dass diese Ver-

bindung luftblasenfrei ist! Die Pipette wird mit ihrem spitzen Ende in die gefärbte

Sudan-Lösung gebracht. Dieses Konstrukt aus Zweig, Schlauch und Pipette wird

über Stativmaterial an einem Stativ befestigt.

Nach ca. 15 min nehmen Sie nun etwa 10 Minuten lang den Wasseranstieg an-

hand des Standes der Farblösung in der Pipette wahr. Notieren Sie in geeigneten

Zeitintervallen (Sekunden- bzw. Minutenbereich) den Anstieg.


Auswertung: Stellen sie in einem Zeit-Volumen-Diagrammen den Wasseranstieg

dar. Die Transpirationsrate ist durch eine Regressionsrechnung (lineare Regressi-

on) zu ermitteln.

Hinweis: Die nichtwässrige Farbstofflösung dient als Ersatz für Quecksilber.

9

2.2 Transpiration

Versuchsteil A: Transpiration

Materialien: Topfpflanzen von Solanum lyco-

persicum (gut gegossen und für mehrere Tage trocken gestellt)

Chemikalien: keine

Geräte: - Waage - kl. Plastiktüten - Lampe


Durchführung:

Eine trocken gestellt und eine gut gegossene Topfpflanze mit etwa gleich großer

Blattfläche werden ausgewählt. Die Töpfe werden mit Plastiktüten umhüllt, dann

werden die Pflanzen gewogen und ihr Gewicht wird notiert. Für zwei Stunden wer-

den die Pflanzen im Kursraum ans Fenster oder ins Gewächshaus (Licht!) gestellt,

anschließend wird erneut das Gewicht der Pflanze gemessen und protokolliert.

Auswertung:

a) Protokollieren Sie die Versuchsergebnisse in der Tabelle

Trocken gestellte Pflanze Gut gewässerte Pflanze

Gewicht zu Kursbeginn

Gewicht nach 2h

Gewichtsdifferenz

b) Stellen Sie fest, ob sich das Gewicht der untersuchten Pflanzen während

des Versuchs geändert hat. Erklären Sie die Ergebnisse. Weshalb wurden

die Töpfe der Pflanze während dieses Versuches mit Plastiktüten umhüllt?

Welche anderen Prozesse in der Pflanze könnten ihr Gewicht ebenfalls be-

einflusst und die Versuchsergebnisse ggf. verfälscht haben? Schätzen Sie

ab, wie viele ml Wasser eine Tomatenpflanze pro Stunde durch Transpira-

tion verliert.

Versuchszeit: ca. 10 min.

Versuchsteil B: Qualitativer Nachweis

Literatur: Kutschera, Schopfer & Brennicke

Materialien: Mais (2-wöchige Vorkultur).

Blätter von zwei weiteren Arten, z. B. Tra-descantia, Coleus oder Wasserhyazinthe (Bot. Garten).

Blätter nach dem Abschneiden sofort in Wasser stellen

Chemikalien: keine

Geräte: - Waage, Wägschälchen und Spatel - rundes Filterpapier - 100 ml Becherglas

Fertig angesetzte Lösungen: Für die Vorbereitung des Versuches wird eine 5 %-ige CoCl2 Lösung hergestellt. Mit dieser wer-den Filterpapierscheiben getränkt und diese

10

- Wärmeschrank - Glasplatten - Wäscheklammern

dann im Wärmeschrank getrocknet. Der Farb-wechsel von Rot nach Blau zeigt deren Trock-nung an. Die Filterpapierscheiben werden fol-gend in einem Exsikkator maximal 1 Monat aufbewahrt. Falls notwendig, noch einmal vor Praktikumsbeginn im Trockenschrank trocknen.

Durchführung:

Von Pflanzen zweier oben angegebener Arten und zusätzlich von Mais wird je ein

Blatt abgetrennt. Jedes Blatt muss sofort zwischen zwei der trockenen Cobalt-

Papiere gelegt und mit zwei Glasscheiben abgedeckt werden (Stiel muss heraus-

ragen). Achten Sie darauf, dass die Blätter nicht gequetscht werden! Beide Glas-

scheiben werden mit Wäscheklammern befestigt.

Schematischer Aufbau:

Auswertung: Skizzieren/Fotografieren und beschreiben Sie die Transpiration

anhand der Farbveränderung des Cobalt-Papieres nach etwa 30 Minuten.


Versuchsteil C: Quantitativer Nachweis

Materialien: Blätter wie bei Teil A Chemikalien: Vaseline (nicht zu alt, in der Apotheke erhältlich)

Geräte: - Feinwaage - Draht


Durchführung:

Zwei gleichgroße Blätter einer Art werden nach Abtrennung von der Pflanze am

Blattstiel mit Vaseline abgedichtet. Eines der beiden Blätter wird auf der Blattun-

terseite dünn mit Vaseline eingestrichen, das andere nicht. Von beiden Blättern

wird unverzüglich das Gewicht bestimmt. Führen Sie drei weitere Wägungen in

Abständen von 10 Minuten durch.

Führen Sie anhand Ihrer Messungen die Anteile kutikulärer und stomatärer Trans-

piration zur Gesamttranspiration in Prozent auf. Diskutieren Sie Ihre Ergebnisse

anhand der Literatur.


Glasplatte

Co-Papier

z.B. Mais-

blatt

Wäsche-

klammern

11

2.3 Guttation (Demonstrationsversuch)

Literatur: Kutschera, Schopfer

Materialien: Pflanzen (ca. 15 – 20 cm groß)

von Hordeum vulgare und Zea mays Chemikalien: -

Geräte: - Glasglocke (großes Becherglas zum

Überstülpen) - Filterpapier

Fertig angesetzte Lösungen: -

Durchführung:

Beobachten Sie die Guttation stark gewässerter Keimpflanzen, welche sich in ei-

ner wasserdampfgesättigten Atmosphäre in einer Glasglocke auf Filterpapier be-

finden.

Auswertung:

Beschreiben, skizzieren und diskutieren Sie ihre Beobachtungen.

Versuchszeit: ca. 5 min, Ergebnis im Verlauf der Praktikumszeit.

2.4 Einfluss von Streusalz auf die Wasseraufnahme

Allgemeines:

- Die Auswertung muss auch am 2. Tag nach Versuchansatz erfolgen!

Literatur: Tafelwerk

Materialien: Blätter vom Alpenveilchen Chemikalien: - Rapsöl

Geräte: - Reagenzglasständer - Reagenzgläser - Tropfpipette - Folienstift - Messer / Rasierklinge - Lineal

Fertig angesetzte Lösungen: - 10 %-ige NaCl-Stammlösung

Durchführung:

Vorbereitend wird eine Konzentrationsreihe hergestellt, dies kann von einer Grup-

pe für alle Gruppen durchgeführt werden. Herzustellen sind NaCl-

Konzentrationsstufen von 0 %, 1 %, 2.5 %, 5 % und 10 %; V=10ml.

Messen Sie den Innendurchmesser der von Ihnen verwendeten Reagenzgläser

aus. Je eine Konzentrationsstufe ist in je ein Reagenzglas zu geben. Beschriften

Sie die Reaktionsgefäße. In jedes Gefäß wird je ein Blatt mit einer Blattstiellänge

von etwa 5 cm gestellt. Suchen Sie Blätter mit etwa gleicher Größe aus und ach-

ten Sie darauf, dass die Blätter sofort nach dem Schnitt in die Lösung gebracht

werden. Der Blattstiel sollte etwa 3 cm in die Lösung ragen. Überschichten Sie nun

die Lösung, in der das Blatt steht mittels einer Tropfpipette vorsichtig mit etwa 0,5

12

ml Paraffinöl oder Rapsöl. Dies soll eine Verdunstung der NaCl-Lösung während

des Versuchzeitraumes verhindern. Der Stand der NaCl-Lösung wird mit einem

Folienstift am Glas markiert und notiert.

Auswertung:

Ermitteln sie nach 2 (09.11.) und nach 7 Tagen (14.11.) die aufgenommene Was-

sermenge in Milliliter. Messen sie dazu die Verringerung des Lösungsstandes und

ermitteln Sie das Volumen nach der Volumenformel für Zylinder.

Skizzieren, beschreiben und bewerten Sie das äußere Erscheinungsbild der

Blätter.

13

3. KURS: PHYSIKOCHEMIE DER ZELLE 14.11.2018

3.1 Diffusionsgeschwindigkeit von Elektrolyten 3.2 Quellungsdruck 3.3 Traubesche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle 3.4 Modellversuch zur Osmose 3.5 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

3.1 Diffusionsgeschwindigkeit von Elektrolyten

Allgemeines: In diesem Versuch sollen die Diffusionsgeschwindigkeiten verschie-dener Elektrolyte miteinander verglichen werden.

Literatur: Strasburger; Schopfer & Brennicke, Richter.

Materialien: - 250 ml Bechergläser - Reagenzgläser (6 pro Gruppe) und -ständer - Glaspipetten (5 ml, 2 ml), Saugvorrichtung - Parafilm

Chemikalien: - Agar

Geräte: - keine

Fertig angesetzte Lösungen: - 0.1 M AgNO3-Lösung für den „Silberagar“: Der „Lösungsmacher „stellt diesen vor dem Praktikum her. Die Röhrchen müssen dunkel aufbewahrt werden.

- 1 M Lösungen folgender Salze: LiCl, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, BaCl2

Durchführung: In die mit Silbernitrat-Agar gefüllten 6 Reagenzgläser werden je 1 ml folgender 1 M Lösungen überführt: LiCl, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, BaCl2. Die Position der Agaroberfläche wird (z.B. mit einem Edding-Stift) markiert. Die Röhrchen werden mit Zellstoffstopfen (wenn verfügbar, besser Parafilm) ver-schlossen und im Dunkeln (z.B. unter dem Abzug) aufgestellt.

Auswertung: Die Auswertung erfolgt nach 2 Tagen (16.11.) und nach 7 Tagen (21.11.). Die Diffusionsstrecken werden dazu gemessen (Zeiten und Diffusions-strecken protokollieren!). Die Diffusionsgeschwindigkeit wird berechnet und an-hand der Kationeneigenschaften eine Begründung für die Resultate gegeben.

Versuchszeit: ca. 10 min zum Ansetzen.

3.2 Quellungsdruck

Allgemeines: Die Quellung ist ein rein physikalischer Prozess, bei dem durch Flüs-sigkeits- oder Dampfaufnahme eine Volumenvergrößerung des Quellkörpers er-folgt. Die Wasseraufnahme (z.B. während der Samenkeimung) erfolgt bis zur Sät-tigung des Wasserpotentials.


Materialien: - Erbsensamen, Weizenkaryopsen - Filterpapier - Petrischalen - Trichter

Chemikalien: - Gips

Geräte: Gipsbecher (Gummi), Spachtel Fertig angesetzte Lösungen: -

14

Durchführung: Zwei Trichter werden mit Filterpapier ausgelegt und zur Hälfte mit Gipsbrei be-schickt. Bitte seien Sie zurückhaltend beim Anrühren, da der Brei schnell aushär-ten kann. Nachdem man die Oberfläche mit reichlich trockenen Erbsensamen bzw. Weizenkaryopsen bestreut hat (die Ränder vermeiden), werden die Trichter mit Gipsbrei vollständig aufgefüllt und angepresst. Nach dem Erstarren (trocknen) werden die Gipskegel herausgenommen und in eine Schale (Petrischale) mit ge-nügend Wasser gestellt (am Ende des Kurses). Der Druck der quellenden Samen bzw. Früchte zersprengt die Kegel.

Versuchsdauer: etwa 10 min; am Ende des Kurses die Beobachtung.

Auswertung: Diskussion der Abhängigkeit des Quellungsgrades bzw. Quel-lungsdrucks vom Proteingehalt des Quellkörpers. Die Auswertung muss nach etwa 2 Tagen erfolgen (16.11.)!

3.3 Traubesche Zelle als Modell einer Pflanzenzelle

Allgemeines: In diesem Versuch ist die Ausbildung einer „TRAUBEschen Zelle“ zu beobachten und zu diskutieren.

Materialien: - Erlenmeyerkolben (100 ml oder 250 ml)

Chemikalien: - Kaliumhexacyanoferrat(II), grobkristallin

Geräte: keine Fertig angesetzte Lösungen: - Kupfersulfat (4 % m/v)

Durchführung: Ein größeres Kristall Kaliumhexacyanoferrat (II): K4 [ Fe(CN)6 ] wird einer 4 %igen CuSO4-Lösung zugesetzt. Das osmotisch bedingte "Wachstum" der semiperme-ablen Niederschlagsmembran ist etwa 30 Minuten zu verfolgen.

Eine Sonderaufgabe für eine interessierte Gruppe: Vergleichen Sie den Reaktionsablauf des oben beschriebenen Versuches mit ei-ner Art von Umkehr. Stellen Sie eine 4 %ige Lösung von Kaliumhexacyanoferrat (II) her und legen Sie einen Kupfersulfat-Kristall in diese Lösung.

Versuchsdauer: 30 min

Auswertung: Kurze vergleichende Betrachtung des benutzten Modells mit der in-takten Pflanzenzelle und mit der Pfefferschen Zelle (Unterschiede und Gemein-samkeiten).

3.4 Modellversuch zur Osmose

Allgemeines: Unter Osmose versteht man die Diffusion von Stoffen durch eine semipermeable Membran. Berechnen Sie vor Praktikumsbeginn die molare Kon-zentration der 3 Lösungen. Was ist ein Dalton?


Materialien: - Klammern - 100 ml-Becherglas - 250 ml-Bechergläser (Plastik) - 10 ml-Messzylinder - Trichter - Dialyseschläuche (am Vortag eingequollen), je Gruppe 3 Stücke ca. 15 cm

Chemikalien: -

15

Geräte: keine Fertig angesetzte Lösungen: - 10 %ige Lösung Polyethylenglycol (m/v) - Dextranblaulösung (3 mg/ 5 ml) - 0,01 %ige Methylenblaulösung (m/v)

Durchführung: a) 25 cm eines vorgequollenen Dialyseschlauchs werden mit 5 ml einer 10 %igen Lösung von Polyethylenglycol (Molekulargewicht etwa 20 000 Dalton) gefüllt und so in ein 100 ml-Becherglas mit Reinstwasser getaucht, dass beide Enden am Be-cherrand befestigt werden können. Messgröße ist das Volumen der Lösung im Dialyseschlauch, das nach 2 h Dialysezeit ermittelt wird (10 ml-Standzylinder, Trichter).

b) In einen weiteren Dialyseschlauch werden 5 ml einer wässrigen Dextranblaulö-sung (3 mg/ 5 ml; Molekulargewicht etwa 2 000 000 Dalton) gefüllt und wie unter a) weiter verfahren. Eine Verunreinigung der äußeren Schlauchoberfläche mit der Farbstofflösung ist zu vermeiden. Beobachtungsgröße ist zusätzlich zum Volumen der Innenlösung die Farbe der Außenlösung.

c) In einen weiteren Dialyseschlauch werden 5 ml einer 0,01 %igen Methylenblau -Lösung (Molekulargewicht 291 Dalton) gefüllt. Ansonsten gelten die unter b) gege-benen Hinweise.

Versuchsdauer: 30 min; Auswertung nach etwa 2 h.

Auswertung: Messung der Veränderungen der in den Dialyseschläuchen einge-schlossenen Lösungen und Diskussion der Effekte. Zur Diskussion der Ergebnis-se müssen Sie die molaren Konzentrationen der osmotischen Substanzen berech-nen. Wir stehen bei Problemen gerne beratend zur Verfügung!

3.5 Abhängigkeit der Quellung von pH-Wert und Salzkonzentration

Literaturhinweis: (Überprüft am 17.09.2015) www.herbstreith-fox.de/fileadmin/tmpl/pdf/broschueren/Naturprodukt_deutsch.pdf

Allgemeines: Quellkörper, wie z.B. Proteine, besitzen aufgrund ihrer chemischen Struktur Partialladungen, die auf die Dissoziation von funktionellen Gruppen zu-rückgehen. Die Gesamtladung eines Quellkörpers wird dabei von den jeweiligen überwiegenden Partialladungen bestimmt. Für die Quellung spielen intern einan-der kompensierende Partialladungen keine Rolle; Hydrathüllen werden nur um überschüssige Ladungen gebildet. Das Dissoziationsverhalten funktioneller Grup-pen hängt in entscheidendem Maße vom pH-Wert des umgebenden Mediums ab. So können Proteine in Abhängigkeit vom pH-Wert des Mediums in drei Ladungs-zuständen vorliegen:

Sauer: -NH3+, -COOH, Kation

Isoelektrischer Punkt: -NH3+, -COO-, Zwitterion

Basisch: -NH2, -COO-, Anion

Die Dissoziation der –COOH-Gruppen wird mit steigender Azidität der Lösung zu-rückgedrängt, die Ausbildung der NH3+-Gruppen hingegen gefördert. Bei steigen-der Basizität tritt der umgekehrte Vorgang ein. Zwischen den Extremzuständen liegt ein für jedes Protein charakteristischer, enger Bereich, in dem beide Gruppen gleichzeitig dissoziiert sind und sich gegenseitig die Waage halten. Der pH-Wert, bei dem dieser Zustand erreicht wird und das Molekül als elektroneutrales „Zwitte-rion“ vorliegt, wird als isoelektrischer Punkt (IEP) des Proteins bezeichnet.

16

Da sowohl NH3+- als auch COO--Gruppen Wasserdipole anlagern können, quellen

die Proteine sowohl im sauren als auch im basischen Milieu, nur dann kann ein Protein aktiv sein. Am isoelektrischen Punkt ist die Quellung eines Proteins am geringsten.

Gegenüber reinem Wasser fällt die Quellung in Elektrolytlösung stets schwächer aus; man spricht von einer relativ (bezogen aus Aqua dest.) entquellenden Wir-kung. In welchem Umfang es durch Elektrolytlösungen zum Entquellen kommt, hängt von mehreren Faktoren ab: - von der Nettoladung des Quellkörpers - von der Größe und Ladung der Ionen und deren Möglichkeit zum Eintritt in den Quellkörper.

Werden Ionen durch eine semipermeable Membran von einem Eintritt in den Quellkörper abgehalten, spricht man von einem indirekten Ioneneffekt. Hierbei kommt es zur Konkurrenz zwischen Kolloid und den in der Außenlösung vorlie-genden Ionen um hydratisierendes Wasser. Bei Abwesenheit einer semipermeablen Membran können überschüssige Partial-ladungen im Kolloid und Ionen mit entgegengesetzter Ladung direkt in Wechsel-wirkung treten. Man spricht von einem direkten Ioneneffekt. Dabei verliert das Ion bzw. die Festladung einen Teil der Hydrathülle. Der Verlust wird umso geringer ausfallen, je schwächer die elektrischen Wechselwirkungen sind. Die Größe der Hydrathülle der in der Lösung befindlichen Ionen entscheidet, wie stark ein Kolloid hydratisiert wird bzw. wie hoch die Konkurrenz um freies Wasser bei nicht permeierenden Ionen ausfällt. Die Größe der Hydrathülle wird durch die Ladungsdichte an der Oberfläche des Ions bestimmt: Bei gleicher Wertigkeit hat ein kleineres Ion gegenüber einem größeren stets eine höhere Ladungsdichte und damit eine größere Hydrathülle. Die Proteine des Protoplasmas besitzen bei den in den Zellen vorliegenden pH-Werten einen Überschuss an negativen Ladungen, deren Anzahl den Hydratati-onsgrad des Plasmas bestimmt. Kationen wirken entladend und damit entquellend. Besondere Bedeutung für den Quellungszustand des Plasmas haben K+ und Ca2+. Wird ein adsorbiertes K+ gegen Ca2+ ausgetauscht, nimmt die Quellung des Plas-mas ab. Umgekehrt bewirkt ein Austausch von K+ gegen Ca2+ eine Zunahme des Quellungszustandes, da Ca2+ aufgrund seiner größeren Ladung stärker entquel-lend wirkt als K+ (K+/Ca2+-Antagonismus). Voraussetzung für die Demonstration dieses Effektes ist die Verwendung von iso-tonischen K- und Ca-Lösungen, daher wird in dem Versuch KNO3 als 1 M Lösung, Ca(NO3)2 aber nur in einer Konzentration von 0,7 M angeboten. Begründen Sie diese Konzentrationen!

Literatur: Schopfer/Brennike. Diesen Versuch haben wir aus dem Pflanzenphysiologischen Praktikum an der Universität Halle entnommen. Die ursprüngliche Idee soll aus der „Sendung mit der Maus“ stammen.

Materialien: - Quellkörper aus Gelatine - 100 ml-Erlenmeyerkolben - Pipetten - Pinzetten - Zellstoff

Chemikalien: -

Geräte: - pH-Meter (Der Versuchsbetreuer muss zuvor das pH-Meter mit Eichpuffern eingestellt haben)

Fertig angesetzte Lösungen: 0,1 M Natriumacetat (2 L) 0,1 M Essigsäure (1 L)

17

- Waage 0,7 M Ca(NO3)2 1 M KNO3 Die Herstellung der Pufferlösungen sollte durch die Studenten erfolgen.

Durchführung: a) Abhängigkeit der Quellung vom pH-Wert

In Bechergläsern werden Lösungen von jeweils 50 ml verschiedener pH-Stufen unter Verwendung von Acetatpuffern hergestellt. Dazu sind für jede pH-Stufe 0,1 M Essigsäure und 0,1 M Natriumacetatlösung entsprechend den Angaben der nachstehenden Tabelle zu mischen: pH-Wert 0,1 M Essigsäure (ml) 0,1 M Na-Acetat (ml)

3,8 44,5 5,5

4,2 33,5 16,5

4,7 25,0 25,0

5,2 10,0 40,0

5,6 5,5 44,5

Mit Hilfe eines pH-Meters ist der aktuelle pH-Wert zu kontrollieren und gegebenen-falls durch Zugabe von NaOH bzw. Essigsäure zu korrigieren. Für jede pH-Stufe 5 Quellkörper abwiegen und in die Lösung geben. Nach 1 - 2 Stunden die Quellkörper den Lösungen entnehmen, sorgfältig trocken tupfen und erneut wiegen.

Auswertung: Aus den Ausgangs- und Endgewichten ist die prozentuale Gewichts-zunahme der Quellkörper in jeder Lösung zu ermitteln. Stellen Sie die Ergebnisse tabellarisch und grafisch dar. Der pH-Wert, bei dem die geringste Quellung erfolgt, gibt den isoelektrischen Punkt an. Geben Sie eine Definition für diesen Begriff.

b) Wirkung von K+ und Ca2+ auf die Quellung Je ein Becherglas mit 50 ml 1 M KNO3- bzw. 0.7 M Ca(NO3)2-Lösung bzw. Reinstwasser füllen, dreimal 5 Quellkörper abwiegen und in die Lösungen geben. Nach 1 - 2 Stunden die Quellkörper den Lösungen entnehmen, sorgfältig trocken tupfen und erneut wiegen.

Auswertung: Aus den Ausgangs- und Endgewichten ist die prozentuale Gewichts-zunahme der Quellkörper in jeder Lösung zu ermitteln. Um die Quellung in den Salzlösungen mit der in Reinstwasser vergleichen zu können, wird die Quellung in Reinstwasser = 100 % gesetzt und die Quellung in den Salzlösungen darauf be-zogen.

Versuchsdauer: ca. 1 Stunde

Hinweis: Versuch 2 und auszugsweise Versuch 5 sind für Schülerversuche gut geeignet.

18

4. KURS: WACHSTUM UND ENTWICKLUNG 21.11.2018

4.1 Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls 4.2 Einfluss von Licht auf das Wachstum (Biostatistik) 4.3 Selektive Herbizidwirkung

4.4 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäure 4.5 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum ------------------------------------------------------------------------------------------------------

4.1 Bildung von Adventivwurzeln und Verhinderung des Blattabfalls

Allgemeines: In diesem Versuch wird die Wirkung des Phytohormons Indolyles-sigsäure (IAA = Auxin) auf weitere physiologische Prozesse untersucht.

Literatur: Schopfer & Brennicke; Kutschera, Schopfer.

Materialien: 3 Coleus-Topfpflanzen für jede Gruppe

Chemikalien: keine

Geräte: keine

Fertig angesetzte „Lösungen“: 1.Wuchsstoffpaste (IAA) 2.Wasserpaste (Kontrolle) Zum Ansetzen löst man die erforderliche Menge IAA in etwas 96 %igem Alkohol und verdünnt mit H2O (0,5 % IAA). 5 g Wollfett (Lanolin, was-serfrei) wird dann mit 5 ml Lösung im Mörser so lange gerieben, bis das Fett die Lösung aufge-nommen hat. Für die Wasserpaste wird statt Wuchsstofflösung Wasser verwendet. Aufbe-wahrung im Kühlschrank.

Durchführung: Der Wuchsstoff IAA wird wie unter Teil a und Teil b beschrieben als Paste appli-ziert.

a) Junge Internodien einer Coleus-Pflanze werden gleichmäßig mit Wuchs-stoffpaste bzw. Wasserpaste bestrichen (d. h. 2 Pflanzen: IAA und Kontrol-le). Ein etwa 1 cm breiter Streifen wird dazu um den ganzen Stängel gezo-gen.

Versuchzeit: etwa 10 min

Auswertung: Die beiden Pflanzen werden im Gewächshaus weiterkultiviert und nach 3 Wochen (12.12.) das Ergebnis protokolliert.

b) An einer weiteren Topfpflanze von Coleus werden die Blätter wie folgt behandelt:

- Abtrennung einer ganzen Blattspreite - Abschneiden einer Blattspreite zu 4/5 (d.h. nur 1/5 bleibt stehen) - Abschneiden einer ganzen Blattspreite und zusätzlich Auftragen der Wuchsstoff-paste auf die Schnittfläche des Blattstieles.

Versuchzeit: etwa 15 min

Auswertung: Die Pflanze wird im Gewächshaus weiter kultiviert, nach einer Woche (28.11.) die Ergebnisse protokolliert.

19

4.2 Einfluss von Licht auf das Wachstum (Biostatistik)

Allgemeines: Mit diesem Versuch sollen Sie einen praktischen Zugang zum Kapitel Biostatistik erhalten. Bei der Auswertung und Protokollführung sollen Sie diese Methoden anwenden. Dieser Versuch ist nach Möglichkeit von allen Gruppen durchzuführen. Auf Anfrage bieten wir gerne ein Seminar zu Grundfragen der Sta-tistik an. Wichtige Tabellen sind am Ende der Anleitung angegeben.

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band I; Band II; Kutsche-ra.

Materialien:

- etiolierte und grüne, 6 Tage alte Keimpflanzen von Kresse

- 5 15 cm großes Millimeterpapier - Pinzette - Probittabelle (Anhang)

Chemikalien: keine

Geräte: keine Fertig angesetzte Lösungen: keine

Durchführung:

Jede Gruppe untersucht das Wachstum einer Schale grüner, etiolierter und im dunkelrot Licht angezogener Keimlinge. Dazu werden 140 zufällig gewählte Keim-linge vorsichtig vom Keimpapier abgenommen und auf 0,5 mm genau vermessen (z.B. 7,5 mm). Man hält dabei den Keimling mit einer Hand auf der Messplatte fest, greift die Kotyledonen mit einer Pinzette und zieht den Hypokotylhaken gerade (ohne ihn abzubrechen).

Auswertung: (siehe Schopfer, Band I, S. 14; Band II, S. 272)

Die Messwerte x werden untereinander in die Spalte einer Tabelle eingetragen, die Platz für weitere Berechnungen enthalten muss. Diese Messwerte müssen im Pro-tokoll natürlich angegeben werden. Arbeiten Sie mit einer zweiten Gruppe zusam-men, die die jeweils andere Keimlingsart (etioliert oder grün) untersucht hat und verwenden Sie diese Daten unter Angabe der Quelle für den t-Test.

(1) Test auf Normalverteilung:

Prüfen Sie zunächst mittels Probittransformation die Normalverteilung.

1.1 Dazu müssen die Hypokotyllängen in Klassen eingeteilt werden. Die Breite (b) der Klasse lässt sich wie folgt abschätzen:

Dabei sind xmin und xmax die jeweiligen Extremwerte der ermittelten Hypoko-tyllängen und N die Anzahl der untersuchten Pflanzen (N = 140). Beide Stichproben (etioliert und grün) sollten in die gleiche Anzahl von Klassen geteilt werden. Bei „nur“ 140 Meßwerten führt obige Folrmel aber meist zu einer zu großen Zahl von Klassen. Mehr als 10 Klassen pro Stichprobe ha-ben sich nicht bewährt.

1.2 Stellen Sie die Häufigkeitsverteilung als Treppenpolygon dar, indem Sie die Häufigkeit, der in einzelne Klassen eingeteilten Längenwerte (Ordinate) ge-gen die entsprechenden Klassen (Abszisse) auftragen.

20

1.3 Ermitteln Sie die Summenhäufigkeitsverteilung, indem Sie die Häufigkeiten Klasse für Klasse schrittweise aufaddieren (P1, P1 + P2, ..., P1 + P2 + P3 + ...+P10) und zeichnen Sie die (sigmoidale) Verteilung als Treppenpolygon. Geben Sie die Werte auch in Prozent an, um sie mit Hilfe einer Probittabelle in Probits zu übertragen. Liegen die Werte in der graphischen Darstellung in guter Näherung auf einer Geraden, können die Messwerte der untersuchten Population als Normalverteilung angesehen werden.

(2) Test auf signifikante Unterschiede der Mittelwerte

2.1 Berechnen Sie dann die Mittelwerte und die mittleren Fehler der Mittelwerte und vergleichen Sie von beiden Kulturen die Mittelwerte der Hypokotyllän-gen durch den t-Test.

4.3 Zwergmutanten der Erbse und ihre Normalisierung durch Gibberellinsäu-re

Allgemeines: In diesem Versuch wird eine Hauptwirkung des Phytohormons Gibberellin (Gib-berellinsäure, GA3) untersucht.

Literatur: Kutschera (beide Bücher), für echte Spezis: Taiz/ Zeiger

Materialien: Keimlinge von Pisum sativum "Zwerg-Mark-erbsen" Sorte "Wunder von Kelvedon", 2 Wo-chen im Gewächshaus vorkultiviert. Pro Gruppe 3 Töpfe mit jeweils ca. 10 Pflanzen.

Chemikalien: keine

Geräte: Standzylinder und Plastikbecher zum Herstellen der GA3-Verdünnungen. Sprüher für GA3-Lösung.

Fertig angesetzte Lösungen: Wässrige Tween 20-Lösung (0.1 %) 200 ml, GA3-Stammlösung (2 mM) Die GA3-Lösung ist im Kühlschrank aufzube-wahren und wird im Praktikum verdünnt.

Durchführung: Zunächst müssen folgende Lösungen zur Behandlung der Pflanzen aus der Stammlösung hergestellt werden: a) 0.2 mM GA3, mit 0.1%iger Tween 20 für den Teil (i), b) 0.2 mM GA3, ohne Tween 20 für die Teile (ii) und (iii).

Die vorkultivierten Erbsen werden am Praktikumstag (i) mit ca. 10 ml GA3 Lösung besprüht, (ii) mit ca. 10 ml GA3 gegossen bzw. (iii) nicht behandelt (Kontrolle), mit Wasser gießen. Bei Materialmangel können verschiedene Gruppen Kontrollpflanzen gemeinsam verwenden.

Alle Töpfe sind im Gewächshaus aufzubewahren und hinreichend während der Woche zu wässern.

Versuchzeit: etwa 20 min Auswertung: erfolgt nach einer Woche (28.11.). Die Länge der Sprosse bis zur Apikalknospe und die Anzahl der Internodien ist von allen 10 Pflanzen pro Topf zu bestimmen. Mittelwerte und Standardfehler (nicht Standardabweichung!) sind zu berechnen.

21

Hinweis: Pro Topf werden nach Möglichkeit 10 Pflanzen benötigt (Statistik). Ent-fernen Sie bei Versuchsbeginn alle Pflanzen aus den Töpfen, die Sie nicht benöti-gen.

4.4 Einfluss von Antibiotika auf Keimung und Wachstum

Allgemeines: Chloramphenicol blockiert die prokaryotische Proteinbiosynthese, also in Chloroplasten und Mitochondrien. Die Wirkung soll auf Keimung und Keim-lingsentwicklung beobachtet werden.

Materialien: - Weizenkaryopsen - Handschuhe - autoklaviertes Wasser - Falcon Tubes - 2 Petrischalen (Plastik) pro Gruppe - Filterpapier (autoklavieren!) - Stempel und Stempelkissen - Parafilm - Schere

- 10 ml-Standzylinder

Chemikalien: Chavell-Wasser (Drogerie)

Geräte: -

Fertig angesetzte Lösungen: - 0.025% (w/v) Chloramphenicol- Lösung, 200 ml

- Autoclaviertes Wasser

Durchführung: Weizenkaryopsen werden zunächst in 10%igem Chavell-Wasser sterilisiert und danach mit autoclaviertem Wasser abgespült. Je 50 Weizen-Karyopsen werden auf Filterpapier (2 Lagen) in Petrischalen mit 8 ml Wasser bzw. 8 ml einer Chloramphenicol-Lösung zur Keimung ausgelegt. Ein Stempelabdruck erleichtert das Auslegen und die spätere Auszählung. Ober- und Unterseiten der Petrischalen werden außen sparsam mit Parafilm verbunden.


Auswertung: Nach 7 Tagen (28.11.17) werden die Keimprozente und die durch-schnittlichen Koleoptillängen ermittelt sowie der Durchbruch des Primärblattes durch die Koleoptile registriert.

22

5. KURS: MINERALSTOFFWECHSEL 28.11.2018

5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests 5.2 Nachweis von Nitrat 5.3 Nachweis von Eisen 5.4 Nachweis von Phosphat --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

5.1 Mangelkulturen als Beispiel für Biotests

Allgemeines: Dieser Versuch hat eine über die mineralische Ernährung weit hin-ausgehende Bedeutung. Die Versuchpflanzen (Wasserlinsengewächse = Lem-naceae, besonders Lemna minor) werden als Biotestsysteme zur Routineüberprü-fung von Wasserqualität eingesetzt (vgl. www.lemnatec.de (überprüft 31. 08. 2012) oder http://www.mobot.org/jwcross/duckweed/duckweed-charms.htm (überprüft 17.09.2015)). Diese durch eine ISO-Vorschrift festgelegten Biotests sollten eigent-lich unter axenischen Bedingungen durchgeführt werden, was aber in diesem Praktikum nicht möglich ist. Der Versuch sollte von allen Gruppen durchgeführt werden. Versuche dieser Art sind ausgezeichnet als Schülerversuche geeignet, auch zum Test giftiger Substanzen aller Art oder von Haushaltschemikalien.

Literatur: Schopfer & Brennicke

Materialien: - Pipetten - beschriftete Standzylinder - beschriftete Plastikbecher (100 ml) - Erlenmeyerkolben (100 ml), 3 Stück pro Gruppe, sterilisiert! - Wattestopfen - Wasserlinsengewächse, z.B.

Spirodela polyrhiza oder eine Lemna-Art (minor, gibba, aequinoctialis) - Glasstab - Kanister für Reinstwasser (Vorrat)

Chemikalien: - Spiritus für den Brenner

Geräte: - pH-Messgerät - Spiritus-Brenner - Impfösen

Fertig angesetzte Lösungen: Stammlösungen: - 100 mM KH2PO4 - 0.2 M Ca(NO3)2 - 1.6 M KNO3 - 0.2 M MgSO4 - 1 mM H3BO3; 2.6 mM MnCl2; 80 µM Na2MoO4 - 5 mM Fe(III)EDTA - 1.6 M KCl - 0.2 M CaCl2

- 1 M MgCl2 - 0.15 M NaH2PO4 - 1 M NaNO3 - 0.2 M Na2SO4 - 5 mM Na2EDTA

Der Versuch stellt Grundanforderungen an Ihre Kenntnisse zu Stöchiometrie und Statistik (Fehlerrechnung, t-Test).

23

Durchführung: Pipettier-Schema für das Vollmedium und Mangelvarianten (Angaben in ml; Gesamtvolumen 500 ml): M a n g e l m e d i e n

Vollmedium Mangelmedien

NO3- PO4

3- SO42- K+ Mg2+ Fe3+ Ca2+

Nr. Stammlösungen

1 100 mM KH2PO4 2,5 2,5 - 2,5 - 2,5 2,5 2,5

2 0.2 M Ca(NO3)2 2,5 - 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 -

3 1.6 M KNO3 2,5 - 2,5 2,5 - 2,5 2,5 2,5

4 0.2 M MgSO4 2,5 2,5 2,5 - 2,5 - 2,5 2,5

5 1 mM H3BO3; 2.6 mM MnCl2; 80 µM Na2MoO4

2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

6 5 mM Fe(III)EDTA 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 - 2,5 Ersatzlösungen 7 1.6 M KCl - ? ? - - - - -

8 0.2 M CaCl2 - ? - - - - - -

9 1 M MgCl2 - - - 0,5 - - - -

10 0.15 M NaH2PO4 - - - - ? - - -

11 1 M NaNO3 - - - - ? - - ?

12 0.2 M Na2SO4 - - - - - ? - -

13 5 mM Na2EDTA - - - - - - ? -

In der obigen Tabelle finden Sie in den Spalten die notwendigen Volumina für die Herstellung der acht verschiedenen Medien. Bitte legen Sie für jedes Medium zu-nächst ca. 450 ml Reinstwasser in einem Plastikzylinder vor und pipettieren Sie in der angegebenen Reihenfolge die 6 Lösungen, für welche Sie in der Tabelle Vo-lumenangaben finden. Nach Zugabe der Komponenten bitte mit einem Glasstab umrühren, am Schluss auf 500 ml mit Reinstwasser auffüllen.

Zur Vorbereitung auf das Praktikum berechnen Sie bitte die „?“ in der Tabelle. Bitte geben Sie im Protokoll an, was Sie für „?“ ausgerechnet haben. Dies soll Ihnen helfen Ihre Kenntnisse in Stöchiometrie zu prüfen. Die Konzentrationen der Lö-sungen [1M = 1mol/l] sind ihnen in der Tabelle angegeben und das Volumen, wel-ches Sie an Stammlösung eingesetzt hätten, beträgt immer 2,5ml. Beachten Sie beim Rechnen stets, dass sie die Standardeinheiten (mol, Liter, ect.) verwenden.

Beispiel: Zur Herstellung eines Sulfat-Mangelmediums werden die Stammlösun-gen 1, 2, 3, 5 und 6 zu je 2,5ml pipettiert. Um die Stammlösung 4 (diese enthält Sulfat) zu ersetzen, verwendet man die Ersatzlösung 9. In Lösung 4 und 9 sind Magnesium-Ionen enthalten. Da nicht gleichzeitig auch auf Magnesiummangel getestet werden soll, sondern der alleinige Effekt von fehlendem Phosphat beo-bachtet werden soll, müssen die Magnesium-Ionen in der gleichen Stoffmenge (Teilchenanzahl) zugeführt werden.

0.2 M MgSO4 soll durch 1 M MgCl2 ersetzt werden. Da die Stoffmenge an Magne-sium in der Stammlösung 4 genau so groß wie in der Ersatzlösung 9 sein soll, gilt n (Stammlösung 4) = n (Ersatzlösung 9). Damit lässt sich aufgrund n = c*V folgen-de Rechnung für das benötige Volumen der Lösung 9 aufstellen:

=

Jede Gruppe sollte eine Mangelvariante plus die Kontrolle ansetzen. Hier ist eine Hilfe für Sie zur Aufteilung auf die Gruppen:

24

Gruppe Vollmedium -N -P -S -K -Mg -Fe -Ca

1 X X

2 X X

3 X X

4 X X

5 X X

6 X X

7 X X

8 X

9 X

10 X

Überführen Sie von jedem Ansatz 3 x 75 ml in 100 ml Erlenmeyerkolben. Der zweite Teil der Nährlösung kann von einer anderen Gruppe verwendet werden. Am gleichen Tag wird noch jeweils ein Triplett von Spirodela polyrhiza (oder eine andere Wasserlinse) eingeimpft. Da wir nicht axenisch arbeiten, kann dies im Praktikumsraum ohne Sicherheitswerkbank erfolgen. Die Pflanzen werden (im Hörsaalvorbereitungsraum oder im Gewächshaus) 3 Wochen kultiviert.

Zum Ansetzen des Versuches: Nach dem Überimpfen wird die Anzahl der Sprosse bestimmt, da es meist nur schwer möglich ist, genau ein Triplett einzuimpfen (Üb-rigens: Was sind Turionen?). Ausgangs-pH-Wert in einem der Kolben messen (pH-Elektrode).

Versuchszeit: 1.0 – 1.5 Stunden

Zur Auswertung während des Praktikums: Bitte beobachten Sie die Entwicklung Ihrer Pflanzen. Die Sprosszahl ist wöchentlich (05.12.; 12.12.; 19.12.) zu bestim-men – solange die Zahl nicht soweit ansteigt, dass eine Bestimmung ohne Öffnen des Kolbens nicht mehr möglich ist (in einigen Varianten vielleicht nach 3 Wo-chen?). Bitte diskutieren Sie mit dem Versuchsbetreuer bevor Sie eine Messung entfallen lassen.

Zur Auswertung nach 3 Wochen: Es sind erneut der pH-Wert, letztmalig die Sprosszahl pro Kolben (genau!), sowie zum Abschluss das Frischgewicht zu mes-sen. Zum Zählen ist es vermutlich günstig, den Kolbeninhalt in eine Glasschale zu schütten. Sollten sich Turionen gebildet haben, so ist die Zahl zu bestimmen. Ebenfalls soll eine Bonitierung (lat. Bonitas = gute Beschaffenheit, Güte) stattfin-den, wobei besonders der Chlorophyllgehalt und der Anthozyangehalt einzuschät-zen sind.

Zur schriftlichen Auswertung: Alle numerischen Daten sowie die Bonitierungser-gebnisse sind anzugeben (Originaldaten). Mittelwerte und Fehler (mittlerer Fehler des Mittelwertes) sind zu berechnen. Aus den Sprosszahlen (Z1, Z2) über die Zeit (t1, t2) werden die Wachstumsraten (WR) und die Verdoppelungszeit (Td) nach

Kolonie von Lemna minor, be-stehend aus Mutterspross (M) und zwei Tochtersprossen (D1 und D2).

25

folgenden Formeln berechnet: WR = (lnZ2 – lnZ1)/(t2 - t1) Td = ln2/WR (Dimension Tage, falls t1 und t2 in Tagen verwendet wurden). Mittels t-Test ist zu entscheiden, ob die Wachstumsraten oder die Verdoppelungs-zeiten der Mangelvarianten signifikant von den Kontrollen verschieden sind. Bitte verwenden Sie dazu nicht die Sprosszahlen. Warum sind diese nicht akzeptabel?

Hinweis: Die Betreuer des Versuches sollten am Schluß die Zusammenfassung der Daten aller Gruppen organisieren, damit eine Übersicht erhalten wird.

5.2 Nachweis von Nitrat

Allgemeines: In diesem Versuch soll der Nitratgehalt im Pflanzensaft nachgewie-sen werden.

Literatur: Schopfer/Brennicke

Materialien: - Objektträger - Tropfpipette - Zea mays, auf Vermiculit angezogen (deshalb N-Mangel) und auf Boden an-gezogen. Brennnesseln, Hirtentäschel-kraut.

Chemikalien: -

Geräte: - Auflichtmikroskop

Fertig angesetzte Lösungen: Diphenylamin-Schwefelsäure

Durchführung: a. Von basalen Stengelteilen einer Ruderalpflanze (z. B. Urtica dioica, auch

andere Pflanzen sind verwendbar: Capsella bursa-pastoris, Lamium album, Chenopodium bonus-henricus bzw. Ch. album, Solanum nigrum) fertigt man einen Querschnitt an, legt ihn auf einen Objektträger und betropft ihn mit Diphenylamin-Schwefelsäure. Beobachtung mit einem Auflichtmikro-skop: Blaufärbung der Gewebe gilt als NO3

--Nachweis. Als Kontrolle dient Pflanzenmaterial mit geringem NO3

--Gehalt (Zea mays vergleichsweise auf Vermiculit und Boden angezogen).


b. Von einer Ruderalpflanze (s.o.) wird etwas Pflanzensaft auf einen Objekt-träger gegeben und mit 2 Tropfen Diphenylamin-Schwefelsäure versetzt. Bei Anwesenheit von Nitrat entsteht eine tiefblaue bis violette Färbung.


Auswertung: Bedeutung des Stickstoffs für die Pflanze (aber bitte nicht ins Proto-koll).

Hinweis: Herstellung von Diphenylamin-Schwefelsäure durch die studentische Hilfskraft: 0.2 g Diphenylamin in 4 ml Reinstwasser suspendieren und darauf vor-sichtig 20 ml konzentrierte Schwefelsäure geben!! Starke Säure!!.

26

5.3 Nachweis von Eisen

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist der Nachweis von Eisen im Prokambium des Senfembryos. Siehe auch Hinweise auf Seite 64


Materialien: - Senfsamen (24 Stunden in 1%iger

K4[Fe(CN)6] vorgequollen) Versuchsbetreuer!

Chemikalien: ------

Geräte: - Auflicht-Mikroskop (Bei Verwendung eines Durchlichtmikroskops müssen die Schnitte sehr dünn sein) - Präparationsbesteck, von den Studenten mit-zubringen (Pinzette, Skalpell, Messer)

Fertig angesetzte Lösungen: - 1% K4[Fe(CN)6] - 5% Salzsäure

Durchführung: Die Samenschale wird entfernt und der Embryo mit 5%iger Salzsäure versetzt. Unter dem Mikroskop beobachtet man die Blaufärbung der Prokambiumstränge (Berliner Blau-Reaktion).


Auswertung: Skizze.

5.4 Nachweis von Phosphat

Allgemeines: Es soll der Phosphatgehalt in Blattstielen der Rosskastanie bestimmt werden.

Literatur: Bergmann, Kutschera, Strasburger, Mengel

Materialien: - 10 Blattstiele der Rosskastanie - Trichter und Rundfilter - Küvetten - Reagenzgläser, Stän-der - Eichkurve zur Phos-phatbestimmung

Chemikalien: - HCl zum Herstellen einer sehr verdünnten Lösung

(0,1%).

Geräte: - Waage - pH-Meter - Spektralphotometer - Spatel - Wasserbad - Pinzette -kl. Gläser

Fertig angesetzte Lösungen: - Molybdat-Reagenzlösung: 13 g Ammoniummolybdat (NH4)6Mo7O24 x 4H2O in 100 ml Wasser lösen + 300 ml Schwefelsäure II (zur Herstellung: - Schwe-felsäure II: 150 ml Wasser + 150 ml konz. Schwefelsäu-re)

+ 0.35 g Kaliumantimon (III)-oxidtartrat in 100 ml Wasser gelöst und gut mischen.

(Reagenzloesung ist mindestens 2 Monate haltbar) - Ascorbinsäurelösung (im Kühlschrank mehrere Wochen haltbar)

10 g Ascorbinsäure in 100 ml Wasser

Durchführung: Drei bis vier Blattstiele (Gewicht bestimmen) der Rosskastanie werden in ca. 3 cm

27

lange Stücke geschnitten und in einem Reagenzglas in 10 ml Reinstwasser ge-kocht (15min) und anschließend dekantiert. Der erkaltete Überstand (= „Abko-chung“) wird kurz filtriert (Trichter und Rundfilter), mit einem pH-Meter vermessen und der pH-Wert mit sehr stark verdünnter HCl auf den Bereich pH = 3.0 - 4.0 ein-gestellt. Schutzbrillen benutzen! Die colorimetrische Reaktion wird wie folgt ausgelöst (gut mischen): 0.7 ml Probelösung (Abkochung, s.o.) + 0.1 ml Ascorbinsäurelösung + 0.2 ml Molybdat-Reagenzlösung Leerwert: Die Probelösung wird durch Reinstwasser ersetzt. Vermessung bei 880 nm im Spektralphotometer frühestens nach 10 min, spätes-tens nach 30 min.


Auswertung: Bitte schätzen Sie die Menge Phosphat ab, die durch das Kochen pro Gramm Frischgewicht extrahiert wurde. Zur Berechnung ist folgende Formel zu verwenden: Phosphat [µmol/l] = 56.0 x E880 Gegebenenfalls muss mit Wasser verdünnt werden, was bei der Berechnung na-türlich berücksichtigt werden muss. Bedeutung des Phosphors für die Pflanze (bitte nicht ins Protokoll, nur zum Nach-denken).

Eine mögliche Erweiterung: Verwendung von Cola (vorher mit Aktivkohle entfär-ben, da man sonst die Absorption nicht messen kann) oder Waschpulver zur Phosphatbestimmung – obwohl das nicht exakt Pflanzenphysiologie ist, wohl aber für den Schulunterricht interessant sein könnte.

28

6. KURS: KEIMUNG 05.12.2018

6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung 6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest) 6.3 Phytochrom-Einfluss auf die Keimung – ein klassischer Modellversuch 6.4 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflanzen 6.5 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung 6.6 Etiolement --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

6.1 Einfluss von Abscisinsäure (ABA) auf die Samenkeimung

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist es, das Keimverhalten von Samen in Abhän-gigkeit von verschiedenen Abscisinsäure-Konzentrationen zu ermitteln.


Materialien: - Kresse Samen - Petrischalen autoklaviert - Rundfilterpapier autoklaviert - 10 ml-Standzylinder (4 Stück) - Tomatensaft

Chemikalien: ------

Geräte: ------

Fertig angesetzte Lösungen: - Lösungen von ABA: 10-3 M, 10-4 M 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, jeweils 100 ml -Pufferlösung (MES) mit Tomatensaft pH

Durchführung: Die Petrischalen werden mit 3 Lagen Filterpapier belegt und jeweils mit 25 Samen beschickt. 5 ml der verschiedenen ABA-Lösungen, Tomatensaft bzw. Pufferlö-sung/Wasser (Kontrollen) werden vorsichtig eingefüllt, sodass die Samen nicht weggespült werden. Die Petrischalen werden mit einem Oberteil verschlossen und im Gewächshaus aufgestellt. Zum Verschließen sollte Parafilm verwendet werden.


Auswertung: Die Auswertung erfolgt nach 7 Tagen (12.12.). Tragen Sie die Anzahl gekeimter und ungekeimter Samen in die unten stehende Tabelle ein. Die Keim-prozente sind zu bestimmen und gegen die Konzentration von ABA halb-logarithmisch aufzutragen Das bedeutet: x-Achse log-Darstellung, y-Achse lineare Darstellung.

H2O Tomatensaft Puffer ABA 10-3

ABA 10-4

ABA 10-5

ABA 10-6

ABA 10-7

Kresse

Informieren Sie sich über die Wirkung von ABA (aber bitte nicht ins Protokoll schreiben).

29

6.2 Keimfähigkeitsprüfung (Schnelltest)

Allgemeines: Wenn ein Landwirt Mais-Saatgut einkauft, möchte er gerne wissen, ob die Karyopsen keimfähig sind. Dazu wurde schon frühzeitig ein Schnelltest entwickelt.


Materialien: - Mais, 2 Tage vorgequollen - Apfelsamen - Plastik-Petrischalen

Chemikalien: ------

Geräte: - Präparierbesteck (Studenten sollten das mitbringen) - Reagenzglas -Holzklammer -Streichhölzer

Fertig angesetzte Lö-sungen: -0.1% (w/v) 2.3.5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Lösung = TTC (im Kühlschrank dunkel eini-ge Tage haltbar)

Durchführung: 3 vorgequollene Mais-Karyopsen werden längs gespalten. Die Schnittrichtung ist dabei wichtig, der Embryo muss angeschnitten werden. Aus 3 weiteren Karyopsen werden die Embryonen isoliert. Nun übertragen Sie das Testmaterial in eine flache Schicht einer Lösung von TTC und lassen die Petrischale bei Zimmertemperatur im Dunkeln stehen. Die Schnittflächen müssen in der Lösung sein.

Erweiterung: Mindestens eine Gruppe sollte diesen Versuch mit Apfelsamen ausprobieren. Wer kann einen Apfel zur Verfügung stellen? Auch vorgequollene Erbsen oder Bohnen können für diesen Versuch erfolgreich verwendet werden.


Auswertung: Nach ca. 1 h sind Spross und Wurzelanlage gerötet, wenn der Same keimfähig ist. Skizze und Diskussion des TTC-Effektes.

Erweiterung: Die vorgequollenen Samen werden kurz vor Praktikumsbeginn oder im Praktikum gekocht. Was erwarten Sie als Versuchsergebnis?

6.3 Phytochrom-Einfluss auf die Keimung – ein klassischer Modellver-such

Allgemeines: Der Versuch soll demonstrieren, dass das Auskeimen von Salatsa-men auf die Anwesenheit der aktiven Form des Phytochromsystems (Pfr) ange-wiesen ist. Wir werden ihn nach Möglichkeit auch im nachfolgenden Kurs noch einmal anbieten.

Literatur: Schopfer/Brennicke, Kutschera.

Materialien: - Petrischalen (Plastik oder autoklaviert aus Glas) - Filterpapier - Lactuca-Achänen, Sorte Grand rapid (!) - Aluminium-Folie oder schwarze Plastik Taschen

- Karton zum Aufbewahren

Chemikalien: ------

30

Geräte: - Diaprojektoren mit Farbglasfilter

Fertig angesetzte Lösungen: -

Durchführung: 1. Je 50 Achänen auf feuchtes Filterpapier innerhalb einer Petrischale ausle-

gen. 2. Während der Quellungsphase (mind. 1 h) in Alu-Folie oderschwarze Plastik

Taschen einpacken. Dies muss sofort nach dem Auslegen erfolgen, bevor die Achänen lichtempfindlich werden.

3. Bestrahlung (Programm siehe unten) 4. Nach der Bestrahlung wieder in Alu-Folie oder schwarze Plastik Taschen

einpacken, um zusätzliche Lichtwirkungen zu vermeiden. 5. Auszählung der Keimung in den 5 Petrischalen nach 7 Tagen (12.12.).

Je eine der Petrischalen ist wie folgt zu bestrahlen:

1. Bestrahlung mit Hellrot (2 min) 2. Bestrahlung mit Dunkelrot (5 min) 3. Bestrahlung mit Hellrot (2 min), nachfolgend Dunkelrot (5 min) 4. Dunkelkontrolle (Umhüllung mit Alu-Folie oder schwarze Plastik Ta-

schen) 5. Tageslichtkontrolle (wahlweise Dauerlicht oder nur 5 min)

Die Bestrahlung mit Licht eines bestimmten Spektralbereiches beruht darauf, dass aus dem Weißlicht alle anderen Spektralbereiche herausgefiltert werden. (Aus Si-cherheitsgründen muss die Bestrahlung in Anwesenheit des Versuchsbetreuers ausgeführt werden).

Versuchszeit: Ansetzen ca. 20 min, Bestrahlung ca. 30 min.

Auswertung: Die Keimprozente sind nach der Auszählung zu berechnen und ta-bellarisch darzustellen.

6.4 Einfluss des Umweltfaktors Wasser auf die Entwicklung von Keimpflan-zen

Allgemeines: Mit diesem Versuch soll demonstriert werden, welche Rolle Wasser für die Keimung von Samen besitzt.

Literatur: Schopfer/Brennicke, Kutschera

Materialien: - 4 Petrischalen pro Gruppe - Rundfilter - 10 ml-Standzylinder - Lepidium sativum-Samen - Parafilm - Schere

Chemikalien: keine

Geräte: keine


Durchführung: Die 4 Petrischalen werden mit je 1-3 Rundfiltern (je nach Papierart) ausgelegt, welche mit unterschiedlichen Wassermengen zu befeuchten sind: 1. Schale 1 ml Wasser 2. Schale 2 ml Wasser

31

3. Schale 6 ml Wasser 4. Schale 18 ml Wasser In jede Schale werden 12 Samen von Lepidium ausgelegt. Die Petrischalen wer-den mit Parafilm (bitte aus finanziellen Gründen sparsam damit umgehen) ver-schlossen, um ein Austrocknen zu vermeiden. Nach einwöchigem Wachstum (12.12.) unter physiologischen Bedingungen (Temperatur und Lichtverhältnisse beachten!) erfolgt die Auswertung. Die Petrischalen sollen im Gewächshaus oder im Fenster des Hörsaalvorbereitungsraumes aufgestellt werden.


Auswertung: für das Protokoll: - Messung von Spross- und Wurzellänge (quantitativ) - Wurzelhaarbildung (qualitativ) - Keimungsrate (quantitativ) - Ausbildung der Keimblätter (qualitativ)

6.5 Einfluss endogener Abscisinsäure auf Keimung

Vorbemerkung: Es soll der Hypothese nachgegangen werden, dass das En-dosperm von Apfelsamen Abscisinsäure enthält und deshalb die Keimung frisch isolierter „Apfelkerne“ gehemmt ist. Wir bitten die Studenten einige nicht zu alte Apfel- oder Birnenkerne mitzubringen.

Materialien:

- 3 Petrischalen pro Gruppe - Filterpapier - Parafilm - Schere

- 10 ml-Standzylinder - Präparationsbesteck - Unterlage aus Glas

Chemikalien: keine

Geräte:

Fertig angesetzte Lösungen:

keine

Durchführung: Wir bitten möglichst alle Gruppen eine Birne oder einen Apfel mitzubringen. Wir brauchen im Praktikum nur den Samen (15 pro Gruppe). Von jeweils 5 Samen werden - Testa entfernt - Testa und Endosperm entfernt - komplette Samen (Kontrolle) verwendet . Die Samen bzw. –teile werden auf feuchtem Filterpapier in Petrischa-len gelegt (siehe andere Versuchsanleitungen) und mit Parafilm verschlossen. Die drei Schalen werden ins Gewächshaus gestellt und nach einer Woche (12.12.) ausgewertet.


Auswertung: Geben Sie die Keimprozente an und erklären Sie das Ergebnis.

Hinweis zum Kurs 6: Überprüfen Sie Ihre Kenntnisse zum Phytochromsystem! Die Versuche 1, 4 und 6 sind als Schülerversuche gut geeignet.

32

6.6 Etiolement

Allgemeines: Es werden im Dunkeln und im Licht kultivierte Pflanzen verglichen.


Materialien: 2 Tomatenkeimlinge (Wildtyp und die Phy-tochrom-Mutanten phyA und phyB1B2), 10 Tage im Dunkeln bzw. im Licht vorkultiviert.

Chemikalien: keine

Geräte: keine


Durchführung: Vergleichende Betrachtungen von etiolierten und grünen Pflanzen am Beispiel von Arabidopsis thaliana (diese Pflanzenart hat in der modernen Pflanzenphysio-logie enorme Bedeutung als Modellobjekt gewonnen). Besondere Beachtung ver-dienen Internodienlänge und Laminafläche. Ähnliche Betrachtungen sollen an einer Rosopsida-Pflanze (Tomate) erfolgen.

Auswertung: Alle Gruppen sollten diesen „Versuch“ einbeziehen. Die Anfertigung eines Protokolls ist nicht erforderlich, wohl aber die Unterschrift auf der Karte. Bitte festigen Sie stattdessen Ihre Kenntnisse zu den Themen „Photomorphogenese“ und „Phytochrom“.

Hinweis zur Vorbereitung des Versuches: Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) wird in je 2 Kulturgefäßen zur Keimung gebracht; ein Topf jeder Art wird von Anbeginn im Dunkeln gehalten. Der andere wird zum Vergleich im Licht kultiviert. Kultivierungsdauer etwa 10 Tage. In ähnli-cher Weise werden Tomatenkeimlinge (Lycopersicum esculentum, Wildtyp und wenn verfügbar auch Mutanten) vorbereitet.

33

7. KURS: BODEN UND PFLANZE 12.12.2018

7.1 Bestimmung der Wasserkapazität 7.2 Kapillare Steighöhe 7.3 Bestimmung der Bodenazidität 7.4 Bestimmung des Kalkgehaltes 7.5 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

7.1 Bestimmung der Wasserkapazität

Allgemeines: Das Adsorptionswasser wird durch starke Bindungskräfte an der Oberfläche von Kolloiden und Ionen festgehalten (Hydratationswasser). Je mehr Ton und Humuskolloide ein Boden enthält, desto höher ist der Anteil des Adsorpti-onswassers. Aus dem Kapillar- und Adsorptionswasser ergibt sich die Wasserka-pazität eines Bodens. Die Wasserkapazität ist das Fassungsvermögen des Bodens nach vollständiger Sättigung mit Wasser. Sie wird in Prozenten vom Gewicht des trockenen Bodens ausgedrückt.

Materialien: Lufttrockener Boden verschiedener Herkunft

Chemikalien: keine

Geräte: Trichter, Filterpapier, Erlenmeyerkolben, 100 ml-Standzylinder, Waage.


Durchführung: 20 g Bodenprobe (oder geringere Mengen, bei Moos nur etwa 3 g) werden in ei-nen Glastrichter mit feuchtem Filterpapier eingefüllt. Auf die Bodenprobe werden mindestens 50 ml Wasser gegeben. Das Wasser wird im Erlenmeyerkolben aufge-fangen und mehrmals durch die Bodenprobe gegossen. Wenn die durchlaufende Wassermenge konstant bleibt, ermittelt man die vom Boden festgehaltene Was-sermenge.

Versuchsdauer: etwa 40 min. Hinweis: Bei einigen Böden beginnt der Anstieg der Wassersäule später. Bitte bei den Messzeiten berücksichtigen.

Auswertung: Die ermittelte Wasseraufnahme in Prozent ergibt die Wasserkapazi-tät. Verschiedene Böden binden unterschiedliche Wassermengen: Sandboden ~20 % Lehmboden ~50 % Moosboden ~250 % Diskussion der unterschiedlichen Wasserkapazitäten der verschiedenen Boden-proben.

7.2 Kapillare Steighöhe

Allgemeines: Die kapillare Steighöhe entspricht der Wassermenge pro Zeiteinheit, die aus dem Grundwasser durch Kapillarkräfte entgegen der Schwerkraft in den Wurzelraum nachgeliefert wird. Es gibt keine eindeutige Korrelation zwischen Wasserbindekapazität und kapillarer Steighöhe.

Materialien: - verschiedene Böden

- 2 x 25 cm lange Glasrohre, 1 cm - Mullgewebe und Gummibänder - 2 Bechergläser

Chemikalien: keine

34

Geräte: - 1 Stativ und 2 Stativklemmen


Durchführung: Jede Gruppe untersucht 2 verschiedene Bodenarten. Die 2 Glasrohre werden von einer Seite mit Mull verbunden. Beide Glasrohre werden dicht, ca. 15 cm, mit einer der Bodenarten gefüllt (bitte nicht mit Moosboden!) und mit Hilfe der Stativklem-men so am Stativ befestigt, dass sie ca. 5 mm in ein mit Leitungswasser gefülltes Becherglas eintauchen.

Auswertung: Die Aufstiegshöhe des Wassers in den Boden wird nach 5, 10, 30 und 60 min gemessen und grafisch dargestellt.

Versuchsdauer: insgesamt ca. 75 min, davon ca. 15 min Vorbereitung und 60 min Messzeit

7.3 Bestimmung der Bodenazidität

Allgemeines: Die Bodenazidität bzw. der pH-Wert des Bodens bestimmt u. a. die Nährstoffverfügbarkeit, das Schadstoffbindevermögen, den Ablauf von Redoxreak-tionen, die biologische Aktivität, die Verwitterung und Mineralisierung. Die pH-Werte in Böden liegen meist zwischen 3 und 8.

Materialien: - Humusboden - kalkhaltiger Boden - Torfboden - Pikiererde - Sieb - 2 Wägschälchen und Spatel - 4 Erlenmeyerkolben - 50 ml Messzylinder - 2 Trichter mit Rundfiltern - Unitestpapier oder Stuphanpapier (Roth) Hinweis an den Betreuer: die Bodenproben müssen zuvor gesiebt werden.

Chemikalien: -

Geräte: - Glas-Pipette (5 ml) - Waage - pH-Meter

Fertig angesetzte Lösungen: 100 ml 400 mM CaCl2

Durchführung: Jede Gruppe soll 2 verschiedene Bodenarten untersuchen. Es werden 80 g des jeweiligen Bodens abgewogen und in einem Erlenmeyer-Kolben mit 200 ml H2O sorgfältig aufgeschlämmt. Dazu werden 5 ml der 400 mM CaCl2-Lösung gegeben und geschüttelt (Eine Gruppe sollte versuchsweise CaCl2 weglassen und sehen, ob das einen Einfluss hat). Nach 5 min wird die Bodenlösung zunächst zur Entfer-nung grober Partikel gesiebt und danach in einen neuen Erlenmeyerkolben filtriert. Der pH-Wert mit Hilfe von Unitestpapier und eines pH-Meters bestimmt. Beide Werte sollen miteinander verglichen werden. Das Filtrat wird beschriftet und weiteren Gruppen zur Verfügung gestellt.

Auswertung: Tabellarische Darstellung

Versuchsdauer: ca. 30 min

7.4 Bestimmung des Kalkgehaltes

In diesem Versuch wird innerhalb des Praktikums mit einer Eichkurve gearbeitet. Zu Ihrer Vorbereitung: Wie stellt man eine Eichkurve her und wie geht man mit ihr

35

um? Wie berechnet man eine Ausgleichsgerade? Was versteht man unter linearer Regression? Siehe auch Versuchstag 1!

Allgemeines: Der Kalkgehalt steht in engem Zusammenhang mit dem pH-Wert und dem Puffergeschehen im Boden. In diesem Versuch reagiert im Boden enthalte-nes Calciumcarbonat mit zugesetzter Salzsäure zu Calciumchlorid, Kohlendioxid und Wasser.

CaCO3 + 2 HCl → CaCl2 + CO2 + H2O Das entweichende Kohlendioxid lässt sich durch sichtbares und/oder hörbares Aufbrausen ermitteln. Eine einfache Methode (Feldversuch) zur Kalkbestimmung von Böden finden Sie im Versuchsteil A. Zur genauen Bestimmung des Kalkgehal-tes wird eine definierte Bodenmenge mit einem Überschuss an Salzsäure versetzt und das entweichende Kohlendioxid gasvolumetrisch bestimmt (Versuchsteil B).

Materialien: - verschieden Böden - 4 Petrischalen - 1 Tropfpipette aus Plastik - 4 Wägschälchen, Spatel - 10 ml Messzylinder - 1 U-Rohr-Apparatur - 1l Rundkolben - Säureabfall mit Trichter - 2 Klemmen - Parafilm - Blu tack oder ähnliches

Chemikalien: - CaCO3

Geräte: - keine

Fertig angesetzte Lösungen: - 10 % (v/v) HCl

Durchführung: Versuchsteil A: Die verschiedenen Bodenproben werden in Petrischalen gefüllt und mit einigen Tropfen 10 % (v/v) HCl versetzt. Die Dauer und Stärke des Aufschäumens ist ein Maß für den im Boden vorliegenden Kalkgehalt. Reaktion Kalk

kein sichtbares und hörbares Aufbrausen kein Kalk

kein sichtbares Aufbrausen, aber hörbares Zischen

unter 1 % Kalk

schwaches, nicht anhaltendes Aufbrausen 1 % - 2 % Kalk

deutliches, nicht anhaltendes Aufbrausen 2 % - 4 % Kalk

starkes, lang anhaltendes Aufbrausen über 5 % Kalk

Auswertung: Tabellarische Darstellung der Beobachtungen


Durchführung: Versuchsteil B: Jeweils 500 mg lufttrockener Boden (von kalkarmen Böden, wie z. B. Sand: 1 g und von kalkreichen Böden, wie Muschelkalk entsprechend weniger: 100 mg) wer-den in eine 1 l-Rundkolben gefüllt. Anschließend wird ein Reagenzglas mit 10 ml der 10 % (v/v) HCl vorsichtig eingesetzt und die Flasche mit einem Deckel ver-schlossen. Beim Kippen der Flasche treibt die ausgeflossene HCl das CO2 des Bodens heraus, das mit Hilfe des U-Rohrs (mit H2O gefüllt) volumetrisch bestimmt werden kann. Vor der Messung wird eine Eichung mit 20, 50, 100 und 150 mg

36

CaCO3 vorgenommen, die Menge des entweichenden CO2 am U-Rohr mit einem Stift markiert und in mm abgemessen.

Auswertung: Grafische Darstellung der Messungen und der Eichkurve.


7.5 Adsorption saurer und basischer Farbstoffe durch Bodenkolloide

Allgemeines: Bodenkolloide sind Bodenpartikel mit einem Teilchendurchmesser < 2 µm. Die wichtigsten Bodenkolloide sind Schichtsilikate, amorphe Minerale, Huminstoffe und Fe-, Mn- und Al-Oxide (bzw. Hydroxide). Wegen ihrer geringen Größe haben die Bodenkolloide im Verhältnis zu ihrer Masse eine große Oberflä-che. Diese Oberflächen tragen meist negative Ladungen, Ausnahmen sind jedoch möglich. Die Ladungen können mit chemischen Stoffen nachgewiesen werden.

Materialien: - feuchte gesiebte Pikiererde - angefeuchteter Quarzsand

Chemikalien: keine

Geräte: - Reagenzglasständer und 4 Reagenzgläser - 4 Trichter und Rundfilter - 2 Pasteurpipetten - Spatel

Fertig angesetzte Lösungen: - 0,01 % (w/v) Methylenblau - 0,01 % (w/v) Eosin

Durchführung: Die mit Filterpapier ausgelegten Trichter werden zur Hälfte mit den jeweiligen Bo-denproben (mit Wasser angefeuchtet) gefüllt. Es werden zwei Trichter (d.h. zwei Ansätze) pro Bodenprobe vorbereitet. Der erste Ansatz wird mit etwa einem Volu-men der basischen, positiv geladenen Methylenblau-Lösung versetzt und der an-dere Ansatz mit etwa einem Volumen der sauren, negativ geladenen Eosin-Lösung. Die Filtrate werden in Reagenzgläsern aufgefangen. Die Farbtiefe des Bodenfiltrates ist ein Maß für die Adsorption des jeweiligen Farbstoffes. Ist der Durchlauf ungefärbt, hat eine vollständige Adsorption des Farbstoffes stattgefun-den.

Auswertung: Diskutieren Sie die Bedeutung kolloidaler Bodenteile für die Pflanze.


Methylenblau Eosin

37

8. KURS: CHLOROPLASTENPIGMENTE 19.12.2018

8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente 8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes 8.3 Abbau des Chlorophylls (Effekte auf Farbe und Fluoreszenz) 8.4 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon) 8.5 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten --------------------------------------------------------------------------------------------------------------

8.1 Vorversuch: Extraktion der Pigmente

Alle Gruppen stellen mit diesem Versuch die Pigmentlösung für die Versuche 2 – 5 her. Die Organisation erfolgt durch den Kursleiter.

Allgemeines: Photosynthesepigmente (Chlorophyll a, b, Carotinoide) sind wasser-unlöslich und lassen sich mit Hilfe von organischen Lösungsmitteln leicht extrahie-ren.

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band 2.

Materialien: - Blattmaterial aus dem Gewächshaus - Eisbad - Coleus oder Brennnessel

Chemikalien: - Quarzsand - CaCO3 - Acetongemisch (eisgekühlt)

Geräte: - Waage, Wägschälchen und Spatel - Mörser und Pistill - Trichter und Rundfilterpapier - 10 ml Messzylinder - skaliertes Reagenzröhrchen


Durchführung: Etwa 1g Blattmaterial (Frischgewicht genau protokollieren) werden abgewogen und im Mörser nach Zugabe einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert. Die Ex-traktion der Chloroplastenpigmente erfolgt mit gepuffertem Aceton, d.h. es wird eine Spatelspitze CaCO3 zugesetzt. Dazu werden 7 ml des Lösungsmittels schrittweise dem Homogenat zugegeben. Der Extrakt ist durch Filterpapier in ein skaliertes Reagenzröhrchen zu filtrieren und mit 2 ml Aceton nachzuspülen. Da-nach wird entweder auf 10 ml aufgefüllt oder das vorhandene Volumen genau ab-gelesen. Möglichst alle Schritte auf Eis, schnell und abgedunkelt durchführen, da-mit die Chlorophylle nicht abgebaut werden.


8.2 Bestimmung des Chlorophyllgehaltes

Allgemeines: Bei höheren Pflanzen bildet Chlorophyll a das Hauptphotosynthese-pigment und Chlorophyll b ist nur zu etwa 1/3 der Konzentration des Chlorophylls a vorhanden. Da sich die Absorptionsspektren beider Chlorophylle unterscheiden ist eine quantitative Bestimmung möglich.

Literatur: Schopfer: Experimentelle Pflanzenphysiologie. Band 2.

Materialien: - Pigmentextrakt aus Versuch 1

Chemikalien: - Extraktionsmittel (siehe Versuch1)

Geräte: - Spektrometer und 1cm Plastikküvetten - Pipette (1000 µl, 500 µl, 200 µl)


38

Durchführung: Die Extinktion von 2 ml der Chlorophylllösung aus Versuch 1 wird am Spektrome-ter bei 663 nm und 647 nm gemessen (Bezugsküvette: Extraktionsmittel). Ein Ex-tinktionswert größer 1 liegt außerhalb des linearen Messbereichs des Spektrome-ters. In diesem Fall muss die Chlorophylllösung mit Extraktionsmittel verdünnt (1:2 oder 1:4) und erneut vermessen werden. Dabei ist der Verdünnungsfaktor zu pro-tokollieren und bei der Berechnung des Chlorophyllgehaltes zu berücksichtigen.

Auswertung: Die Berechnung des Chlorophyllgehaltes bei Verwendung dieses Ex-traktionsmittels (Ergebnisse in µg/ml) erfolgt nach folgender Beziehung: (Lichtent-haler, 1948)

Chlorophyll a: Chla = 12.25 E663nm – 2.79 E647nm

Chlorophyll b: Chlb = 21.5 E647nm – 5.1 E663nm

Die Ergebnisse sind im Protokoll jedoch als Chlorophyllgehalt pro g Frischgewicht anzugeben, da physiologische Fragestellungen nur so sinnvoll beantwortet werden können.


8.3 Abbau des Chlorophylls (Effekte auf Farbe und Fluoreszenz)

Allgemeines: Chemische Veränderungen des Chlorophylls durch Basen und Säu-ren können zum Verlust der Fluoreszenz und teilweise auch der grünen Farbe füh-ren. Durch Zugabe von Natronlauge können die Esterbindungen der Chlorophylle verseift werden. Es kommt zur Abspaltung des Phytols vom Chlorophyll und der Bildung von Chlorophyllin a und b, das noch Mg2+ enthält und deshalb grün aus-sieht.

Die Zugabe von Säure löst das zentrale Mg2+ heraus und es entsteht das braune Phaeophytin, Kupferionen können durch Komplexbildung mit dem Porphyrin eine ähnliche grüne Farbe wieder herstellen, jedoch nicht die Fluoreszenz. Zum Chlorophyllabbau liegen im Gegensatz zur Chlorophyllbiosynthese nur weni-ge gesicherte Befunde vor. Gesichert ist, dass eine Chlorophyllase den Phytolrest (OR3) abspaltet, des Weiteren tritt sehr rasch der Mg-Verlust ein und der Ring wird aufgespalten bzw. CH2, CH3 oder C2H5 abgetrennt. Der Chlorophyllabbau erfolgt bis zum Mg-Verlust offenbar in Gegenwart des Apoproteins. Das weitere Schicksal ist ungeklärt. Exogene Faktoren führen häufig zum Mg-Verlust (Phaeophytinbil-dung).

Literatur: Richter: Stoffwechselphysiologie der Pflanzen.

Materialien: - Pigmentextrakt aus Versuch 1

Chemikalien: - Essigsäure (Eisessig)

Geräte: - Reagenzständer und 6 Reagenzröhrchen - Pipetten (1000 µl, 200 µl) - UV-Lampe und Schutzbrille

Fertig angesetzte Lösungen: - 5% (w/v) NaOH - 4% (w/v) CuSO4 - 0,5% (w/v) H2SO3

39

Durchführung: Dem Chlorophyllextrakt (1 + 9 mit Aceton verdünnt) aus Versuch 1 werden Lösun-gen nach folgendem Schema zugegeben.

1. 1 ml Chlorophyllextrakt + 0,2 ml 5% (w/v) NaOH 2. 1 ml Chlorophyllextrakt + 0,2 ml Essigsäure 3. 1 ml Chlorophyllextrakt + 0,2 ml Essigsäure + 0,2 ml 4% (w/v) CuSO4.

Bitte bei 3. Lösungen nacheinander zugeben und die Reaktion be-obachten.

4. 1 ml Chlorophyllextrakt + 0,2 ml 4% (w/v) CuSO4 5. 1 ml Chlorophyllextrakt (= Kontrolle)

Auswertung: Die Farbänderungen und das Fluoreszenzverhalten sind zu protokol-lieren. Die Proben der Ansätze 1. und 2. werden noch für den Versuch 5 benötigt.


Eine mögliche Erweiterung: Von einer Gruppe sollten die Lösungen 1, 2 und 4 auf eine Chromatografieplatte aufgetragen und analog zu den Chloroplastenpigmen-ten aufgetrennt werden.

8.4 Die Wirkung eines Herbizids - SAN 9789 (Norflurazon)

Allgemeines: Einige „Bleichherbizide“ (z. B. Norflurazon) wirken hemmend auf die Bildung von Carotinoiden. In diesem Versuch soll die Bedeutung von Carotinoiden getestet werden.

Literatur: Schopfer oder Kutschera; Schopfer & Brennicke, Strasburger; Richter.

Materialien: - 14 d alte, autotroph vorkultivierte

Sprosse von Lemna gibba

- autoclavierte Kolben

Chemikalien: - keine

Geräte: - Impfnadel

Fertig angesetzte Lösungen: Pro Gruppe - Autotrophe Nährlösung für Lemnaceen

(„N“), 50 ml in 100 ml-Erlenmeyerkölbchen - Autotrophe Nährlösung, die 5 μM des

Herbizids Norflurazon (Sandoz, Basel) enthält, 50 ml in 100 ml-Erlenmeyerkölbchen.

Durchführung: In einen 100 ml-Erlenmeyerkolben mit autotropher Nährlösung wird eine definierte Zahl von Lemna-Sprossen mit einer Impfnadel übertragen (Kontrolle). Die Sicher-heitswerkbank ist für diese Arbeiten nicht erforderlich, da in Abwesenheit von Zu-cker die Sterilitätsanforderungen während einer Woche Kultivierungszeit gering sind (warum?). Eine gleiche Zahl von Sprossen wird in einen Erlenmeyerkolben mit ansonsten identischer Nährlösung übertragen, die jedoch 5 μM des Herbizids Norflurazon enthält. Die Kulturen werden im Gewächshaus weiter kultiviert und die Entwicklung der Sprosse beobachtet. Achtung: mit der Impfnadel kein Norflurazon in das Kontrollmedium verschleppen! Der Versuch ist nach drei Wochen abzubrechen und auszuwerten (09.01.). Bei Interesse kann der Versuch erweitert werden und z.B. die Norflurazon-Konzentration oder Lichtintensität variiert werden.


Die Norflurazonabfälle werden gesondert gesammelt und entsorgt.

40

Auswertung: Interpretation der beobachteten Ergebnisse mit Literaturhilfe.

8.5 Dünnschichtchromatographische Trennung von Chloroplastenpigmenten

Allgemeines: Die Dünnschichtchromatographie („TLC“) ist eine Adsorptionschro-matographie. Die Pigmente reichern sich entsprechend ihrer Affinität zum Adsor-bens (Kieselgel) in räumlich getrennten Bereichen der Platte an. Bei der Dünn-schichtchromatographie wird die unterschiedliche Polarität der Pigmente zu ihrer Auftrennung ausgenutzt. Materialien: - Pigmentextrakt aus Versuch 1 - Pigmentextrakt aus Versuch 3 (Ansatz 1 und 2) - Dünnschichtkieselgelplatten, auf 10x10 cm schneiden - weicher Bleistift und Lineal

Chemikalien: keine

Geräte: - Chromatographiekammer mit Glasdeckel - Kapillaren (10µl) - UV-Lampe und Schutzbrille

Fertig angesetzte Lösungen: - Laufmittel: Benzin (100 - 140oC) : Aceton : Chloroform = 50 : 50 : 40

Durchführung: Das Laufmittel wird ca. 1 cm hoch in die Trennkammer eingefüllt, verschlossen und im Kühlschrank mindestens 30 min vorgekühlt und äquilibriert. Mit einem wei-chen Bleistift wird eine Startlinie 2 cm oberhalb des unteren Randes der Kieselgel-platte markiert. Dabei darf die Trägerschicht nicht beschädigt werden. Entlang die-ser Linie werden im Abstand von 2 cm 3 Auftragszonen markiert. Tropfenweise werden 100 µl der Pigmentlösungen aus den Versuchen 1 und 3 mit einer 100 µl Glaspipette langsam auf jede der Auftragszonen aufgetragen. Das Lösungsmittel der vorausgegangenen Auftragung muss gut eingetrocknet sein, bevor neuer Ex-trakt aufgetropft werden kann (Ventilator betätigen). Dabei soll die Pipettenspitze möglichst nicht in unmittelbaren Kontakt mit dem Kieselgel gelangen, um die Trä-gerschicht nicht zu verletzen. Die Proben aus dem Versuch 1 müssen in deutlichem Abstand von denen aus dem Versuch 3 aufgetragen werden, da die Essigsäure sonst das Laufverhalten der anderen Proben beeinflusst.

Norflurazon (SAN 9789)

41

Die getrocknete Dünnschichtplatte wird senkrecht in die Chromatographiekammer gestellt. Die Startlinie muss oberhalb des Laufmittels liegen. Wenn die Laufmittel-front ca. 2 cm vom oberen Rand der Platte angelangt ist (nach ca. 20 min) wird die Platte aus der Kammer genommen und die Laufmittelfront sofort mit einem Bleistift markiert. Bei der noch feuchten Platte werden unter dem Abzug die Banden mit einem Blei-stift umfahren. Die Platte wird anschließend unter der UV Lampe betrachtet.

Auswertung: Die Farbe der Banden und ihre Fluoreszenz werden protokolliert. Die Entfernung der Banden und der Laufmittelfront wird gemessen und die entspre-chenden Rf-Werte berechnet.

Mit Hilfe der folgenden Tabelle können die einzelnen Banden identifiziert werden. Pigment Farbe Fluoreszenz

Front

-Caroten orange -

Phaeophytin a grau bitte prüfen

Phaeophytin b grüngrau bitte prüfen

Chlorophyll a blaugrün rot

Chlorophyll b gelbgrün rot

Lutein gelb -

Violaxanthin gelb -

Neoxanthin gelb -

Start Chlorophyllid/in grün rot

Hinweis: Im Schulversuch kann Tafelkreide als Trägerschicht verwendet werden. Zur Vorbereitung wird die Kreide mehrmals ca. 0,5 cm in Methanol getaucht und zur Aufkonzentrierung zwischendurch getrocknet. Als Laufmittel dient dann Etha-nol. Wir bitten eine Gruppe sich besonders diesem Teil zu widmen und das Protokoll so auszuarbeiten, dass es als Erweiterung in das Pflanzenphysiologische Prakti-kum als Schulversuch aufgenommen werden kann.


Hinweis: Die Versuche 1 und 5 (modifiziert durch Filterpapier bzw. weiße Stras-senkreide) sind als Schulversuch geeignet.

42

9. KURS: PHOTOSYNTHESE 09.01.2019

9.1 Nachweis der O2-Abgabe (Indigomethode) 9.2 C3- und C4-Pflanzen 9.3 Einfluss der Lichtintensität auf die Hill-Aktivität 9.4 Regulation der Stomata

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------9.1 Nachweis der O2 Abgabe (Indigomethode, Glimmspanversuch)

Allgemeines: Ziel des Versuchs ist es, die Sauerstoffproduktion von grünen Pflan-zen im Licht und im Dunkeln zu ermitteln. dazu muss zügig gearbeitet werden.

Literatur: Kutschera, Schopfer/Brennicke, Richter

Materialien: - Wasserpest oder Laubmoos (Leptodi-ctyum riparium) oder Wasserlinsen, z.B. Wolfia arrhiza oder Lemna trisulca. Die Pflanzen sollten einige Stunden in Dunkelheit ste-hen, bevor sie verwendet werden. - Reagenzgläser mit Öl überschichten - Pasteurpipetten (Plastik) - 4 Reagenzglasständer - Waage, Wägeschälchen, Spatel -Streichholz

Chemikalien: Natriumdithionit (= Natriumhydrosulfit)

Dieses Salz muss auch als Festsubstanz im

Kühlschrank aufbewahrt werden.

Geräte: - starke Lichtquelle (Fluoreszenzröhren oder Tageslicht) - etwas zum Dunkelstellen

Fertig angesetzte Lösungen: - Indigokarminlösung (0.02% w/v) - Natriumdithionit-Lösung muss direkt vor Versuchsbeginn von jeder Gruppe frisch bereitet werden (0.1 g / 10 ml).

Durchführung: Ein Reagenzglas wird mit 0,02%iger Lösung von Indigokarmin gefüllt und unter tropfenweiser Zugabe der frisch bereiteter Natriumdithionitlösung gerade ent-färbt (ca. 5 - 10 Tropfen); bei der Zugabe der Tropfen ist mehrmals zu schüt-teln, damit der Umschlag von blau zu farblos erfasst wird. Dann überträgt man je einen möglichst großen Spross Wasserpest und stellt ein Röhrchen ins Dunkle, das andere ins möglichst starke Licht (Weißlicht). Es ist da-rauf zu achten, dass sich im Gefäß zu Beginn keine Luftblasen befinden!

Versuchszeit: ca. 0.5 – 2 Stunden

Auswertung: Die zu beobachtenden Effekte sind zu beschreiben und zu erklären.

43

9.2 C3- und C4-Pflanzen

Allgemeines: In diesem Versuch wird der Stoffwechsel der C3- und C4-Pflanzen beobachtet. Der Versuch wird nach 2 Stunden eigenverantwortlich ausgewertet.

Fragen zu Ihrer Vorbereitung (bitte nicht ins Protokoll): 1. Was ist unter dem Kohlendioxid-Kompensationspunkt zu verstehen? 2. Vergleichen Sie C3-und C4-Pflanzen in struktureller Hinsicht! 3. Vergleichen Sie die Energiebilanz beider Stoffwechseltypen!

Literatur: Schopfer II, Schopfer & Brennicke

Materialien: Aussaat drei Wochen vor Versuch, Emp-fehlung: Zea mays und Phaseolus vulgaris. Pasteurpipette, Folie zum Abwiegen, Spatel, 2 x 500-ml-Bechergläser, Glasstab, 500-ml- Messzylinder, „Dunkel-Kisten“ Pro Gruppe:

- 4 x gut verschließbare Einweckgläser - 4 x kleine Plastikbecher (100 ml)

Chemikalien: -

Geräte: Waage starke Lichtquelle (Halter mit Fluoreszenzröh-ren)

Fertig angesetzte Lösungen: Cresolrot-Indikatorlösung (50 mg in 1 ml Ethanol vorlösen und ad 50 ml mit Wasser). Stammlösungen 1 M KCl und 10 mM NaHCO3

Durchführung: Folgende Lösungen werden vor Versuchsbeginn durch Mischen der beiden Stammlösungen frisch hergestellt: 0,1 mM NaHCO3-Lösung in 0,1 M KCl.

Teil a) Das Becherglas wird zu 4/5 mit Leitungswasser gefüllt und auf den Boden des Einweckglases gestellt. In das Einweckglas wird soviel der NaHCO3-Lösung (mit einigen Tropfen Indikatorlösung versetzt bis Farbe deutlich ist) gegeben, dass die Lösung etwa 1 cm hoch steht. In das Becherglas wird eine der beiden Pflanzen gestellt und entweder in starkes Licht übertragen oder in Dunkelheit 2 h aufbe-wahrt. Daraus ergeben sich vier Varianten: (i) Mais-Pflanze, Dunkelheit, (ii) Mais-Pflanze, Licht, (iii) Bohnenpflanze, Dunkelheit, (iv) Bohnenpflanze, Licht.

Teil b) Theoretischer Teil Was würden Sie erwarten, wenn folgender Versuch ausgeführt würde: Zwei Bechergläser werden in ein Einweckglas gestellt und mit einer Mais-Pflanze und mit einer Bohnenpflanze bestückt. Das gut verschlossene Einweckglas wird ins Tageslicht gestellt und nach einer Woche ausgewertet

Versuchszeit: ca. ½ Stunde (ohne Wartezeit) + 15 min für Auswertung

Auswertung: Teil a) Beobachtung des Farbumschlages in der NaHCO3-Lösung unmittelbar nach Beendigung des Versuchs nach 2 h (praktisch bedeutet das: möglichst lange) starker Belichtung bzw. in Dunkelheit. Teil b) Begutachtung der Pflanzen nach einer Woche. Welche Pflanzenart ist da-nach in einem besseren Zustand? Warum?

9.3 Einfluss der Lichtintensität auf die Hill-Aktivität

Allgemeines: In diesem Versuch wird die Hill-Aktivität von isolierten Chloroplasten als Maß für die Photosyntheseleistung gemessen.

44

Literatur: Kutschera, Schopfer/ Brennicke.

Materialien: - 6 Bündel frische Petersilie - Mull, Schere, 2-3 kleine Trichter,

Glasküvetten für Specol, 1 ml-Pipettman und blaue Plastikspitzen

pro Gruppe - 1 x Mörser und Pistill, etwas Sand - 3 x 1 ml Pipette - 2 x 10 ml Pipette - 3 x Zentrifugationsröhrchen (50 ml-

Plastikröhrchen mit grünen Deckeln) und Ständer

- Eis

- 4 Reagenzgläser und Ständer

Chemikalien: Quarzsand (Seesand)

Geräte: Kühlzentrifuge Spektrometer, z. B. Specol starke Lichtquelle

Fertig angesetzte Lösungen: Isolationsmedium (20 mM K-Phosphat-Puffer pH 7.4, 10 mM NaCl, 1 mM Na2-EDTA, 0.5 M Saccharose); Puffer R (20 mM K-Phosphat-Puffer pH 7.4, 10 mM NaCl); Dichlorphenolindophenol (DCPIP): 24, 4 mg/ 100 ml Reinstwasser.

Durchführung: 1. 3 g (Frischgewicht) Blätter werden mit 2.0 ml Isolationsmedium und einer Prise Quarzsand ca. 1 min homogenisiert (Mörser auf Eis), dann nochmals mit 2.0 ml Isolationsmedium nachgespült. 2. Das Homogenat wird durch 4 Lagen Mull filtriert (zum Abschluss wird der Mull vorsichtig ausgepresst). 3. Die gefilterte Lösung wird 1 min bei 500 rpm in 2 Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit jeweils 1 ml zentrifugiert (im Bodensatz befinden sich Zell-wandbestandteile und im Überstand ein Chloroplasten-Zellbestandteil-Gemisch). 4. Der Überstand wird in ein anderes Zentrifugationsröhrchen („Eppis“) vorsichtig überführt und erneut 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert. 5. Der Bodensatz, welcher die Chloroplasten enthält, wird mit 1 ml Puffer R auf-geschlämmt. 6. Um für alle folgenden 3 Versuchsvarianten eine gleiche Chloroplastendichte zu erhalten, wird die Chloroplastensuspension solange mit Puffer R verdünnt, bis am Spektrometer bei 600 nm eine Extinktion von 0.2 erreicht ist (1 cm–Plastikküvette, Vergleichsküvette: Puffer R). Als Versuchansatz werden in 50 ml-Plastikröhrchen:

- 5 ml Chloroplastensuspension (Extinktion: 0.2) - mit 0.5 ml DCPIP-Lösung vermischt.

Nach Mischen wird die Anfangsextinktion bestimmt. Sie soll etwa E = 0.5 betra-gen. 7. Jetzt werden 3 Eppis mit je 1,5 ml des Versuchsansatzes beschickt. Ein Eppi dient als Dunkelkontrolle (in Alu-Folie abdunkeln). Die restlichen Eppis werden vor einer starken Lichtquelle aufgestellt (dichte Reihe Fluoreszenzröhren, wenn mög-lich direktes Sonnenlicht; keinesfalls darf Erwärmung auftreten) und 5 bzw. 15 min

45

belichtet. Beide Lichtproben werden nach 5 min bzw. 15 min gemessen, die Dun-kelprobe nur am Ende nach ca. 15 min. Die Differenz zwischen Anfangs- und Endextinktion ist ein Maß für die Hill-Aktivität.

Versuchszeit: ca. 2 h (also möglichst lange)

Auswertung: Grafische Darstellung der Ergebnisse.

9.4 Regulation der Stomata

Allgemeines: Stomata bestehen aus zwei chloroplastenführenden Schließzellen, die Idioblasten darstellen, d.h. sie sind in das Epidermisgewebe eingestreute Zel-len mit abweichendem morphologischen und physiologischen Charakter. Die wich-tigsten Reize, auf die Stomata reagieren, sind das Licht, die CO2 Konzentration im Blattgewebe, sowie die Wasserversorgung der Pflanze. Trockenstress führt zur Bildung des Phytohormones ABA in Wurzeln und Blättern. ABA wird über das Xylem in die Schließzellen transportiert und induziert in wenigen Minuten den Spaltenschluss.

Materialien: - Blätter von Vicia faba Pflanzen

Chemikalien: -

Geräte: Evtl. Pflanzenlampe Eppis Karton Rasierklinge Knetmasse

Fertig angesetzte Lösungen: ABA-Lösung 10-3 M pH5-6!

Durchführung: Ein Teil der Versuchspflanzen wird für mehrere Stunden unter eine Pflanzenlampe gestellt („Lichtpflanzen“), der andere Teil wird unter dem Karton für mehrere Stun-den im Dunkeln gehalten („Dunkelpflanzen“). Diese Vorbereitungen des Versuchs wurde von den Betreuern durchgeführt. Tauchen Sie nun ein Blatt von einer intak-ten „Lichtpflanze“ in eine Schale mit Wasser und schneiden Sie den Blattstiel unter Wasser mit einer Rasierklinge ab. Stellen Sie den Blattstiel des abgetrennten Blat-tes dann sofort in ein Eppi, das mit einer ABA-Lösung gefüllt ist und befestigen Sie die Eppis mit Knetmasse auf dem Tisch unter der Pflanzenlampe („ABA-Lichtblatt“). Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche des Blattstiels stets Kontakt zur ABA-Lösung behält und füllen Sie ggf. Lösung nach. Nach ca. 1,5h wird der Versuch ausgewertet. Dazu werden nacheinander a) ein Blatt einer „Lichtpflanze“, b) ein Blatt einer „Dunkelpflanze“ und c) das ABA-Lichtblatt“ als Totalpräparat mik-roskopiert.

Auswertung: Beobachten Sie in jedem der 3 untersuchten Blätter etwa 20 Stoma-ta. Beurteilen Sie deren Öffnungszustand indem Sie ihn als "offen“, „halb geöffnet“ oder „geschlossen“ klassifizieren. Tragen Sie die Werte in die Tabelle ein. Erfra-gen Sie für das Protokoll auch der Werte der anderen Gruppen.

„Lichtpflanze“ „Dunkelpflanze“ „ABA-Lichtblatt“

Offen Halb-offen

Geschlossen Offen Halb-offen

Geschlossen Offen Halb-offen

geschlossen

Anzahl Sto-mata (n=20)

46

Anzahl Sto-mata (n=ca 80; Kurs)

Prozentsatz

Welche Reize bewirken im Versuch ein Öffnen und welche einen Verschluss der Stomata? Wie könnte man sich ein CO2-Mangel im Blatt auf die Stomata auswir-ken und wodurch könnte dieser Mangel hervorgerufen werden? Mutmaßen Sie aufgrund der Versuchsergebnisse, welcher Reiz den Öffnungsgrad der Stomata stärker beeinflusst: das Lichtangebot oder Wassermangel?

Versuchszeit: ca.2h, davon 1,5h Inkubationszeit.

47

10. KURS: ENZYMOLOGIE 16.01.2019

10.1 α- Glucosidase und ihre Regulation 10.2 Nachweis von α- und ß-Amylase-Aktivität 10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität 10.4 Kartoffel-Katalase-Versuch -----------------------------------------------------------

10.1 α- Glucosidase und ihre Regulation

Allgemeines: In diesem Versuch sollen Sie eine Enzymaktivität messen und dabei den Einfluss von Nitrat in vivo bzw. Temperatur in vitro auf die Enzymaktivität der α-Glucosidase testen.

Materialien: - in anorganischer Nährlösung (N) vorkultivierte Spirodela polyrhiza - in N-Nährlösung vorkultivierte Spiro-dela polyrhiza, 5 Tage vor Versuchs-beginn in nitrat-freie Nährlösung über-tragen. - Glaspipetten - Peleusbälle - Küvetten - Mörser und Pistill - Eisbad - Eppendorf Reaktionsgefäße

Chemikalien: - 20 mg Casein pro Pflanzenprobe

- Quarzsand

Geräte: - Spektralphotometer - ungekühlte Tischzentrifuge (Eppendorf) - Wasserbad

Fertig angesetzte Lösungen: - Puffer A (Extraktionspuffer): im Kühlschrank halten

100 mM Zitronensäure/NaOH, pH 7.5;

5 mM Ca-Acetat (39.5 mg/50 ml); 0.5% (v/v) Tween 80 - Puffer B (Nachweis-Puffer): im Kühlschrank halten wie Puffer A, jedoch ohne Tween 80 - Lösung C

10 mM p-Nitrophenol-α-D- glucopyranosid als Teilvolumen bei -20oC aufbewahren

- Lösung D: 10 g/l NaOH

Durchführung: Teil A – Einfluss der Nitratkonzentration in vivo Je 500 mg Frischgewicht (in nitrathaltigen und nitratfreien Nährlösungen vorkulti-vierte Spirodela polyrhiza) werden im Mörser auf einem Eisbad homogenisiert (Grundprinzip bei der Isolierung von Enzymen: schnell und kalt). Dazu werden 4 ml eiskalten Puffer A zugesetzt, 20 mg Casein und eine Spur Quarzsand. Die bei-den Homogenate werden in je 2 x 2 ml Reaktionsgefäße („Eppendorf-Tubes“) aufgeteilt und bei hoher Drehzahl (10.000 Umdrehungen pro Minute, Hermle-Tischzentrifuge) 5 min zentrifugiert. Die Überstände dienen als Enzymquelle (= Enzym-Extrakt).

Durchführung: Teil B – Einfluss der Temperatur in vitro Der Versuch wird im Wesentlichen wie Teil A ausgeführt, jedoch mit folgenden Veränderungen:

48

1. Es werden zwei identische Proben homogenisiert und der Überstand der Zentrifugation vereint.

2. Die Reaktion wird bei 3 unterschiedlichen Temperaturen ausgeführt:

Eisbad (ca. 4oC)

Zimmertemperatur (ca. 23oC)

Wasserbad (ca. 30 - 40oC)

Kontrolle = Ausgangswert vor Inkubation Teil A und Teil B: Zum Aktivitätsnachweis werden die folgenden Volumina nacheinander in Reakti-onsgefäße als Versuchsansatz (insgesamt 1,3 ml) eingefüllt:

…… Probe Vergleichsküvette

(Kontrolle) ______________________________________________ Puffer B …… 0.1 ml 0.1 ml Puffer A …… ---- 0.6 ml Enzym …… 0.6 ml ---- Lösung C …… 0.6 ml 0.6 ml ______________________________________________

Die Reaktion wird durch Zugabe von Lösung C gestartet und läuft bei Raumtempe-ratur ab. In weitere Reaktionsgefäße wird parallel dazu 0.75 ml Lösung D vorge-legt. Zum Zeitpunkt 0 (d.h. direkt nach Zugabe von Lösung C) sowie nach 20 min werden 0.3 ml aus dem Reaktionsgemisch entnommen und in die Röhrchen mit 0.75 ml Lösung D gegeben. Die Reaktion wird dort durch den hohen pH-Wert ab-gestoppt und das Endprodukt so gefärbt, dass die Extinktion bei 405 nm gemes-sen werden kann. Die Messung der Extinktion erfolgt in 1 cm-Küvetten in einem Spektralphotometer bei 405 nm.


Durchführung: Teil B – Einfluss der Temperatur in vitro

Auswertung: Berechnung der Enzymaktivität A von α-Glucosidase 1. Absorption ΔE405 = E405 (t = 20 min) – E405 (t = 0 min) Entstandener Farbstoff nach 20 min

Hinweis zur Eichkurve: Zur Erstellung der Eichkurve wurden von den unterschiedlichen Konzentrationen der Eichlösungen mit p-Nitrophenol (in mM) 0.3 ml entnommen, mit 0.75 ml Lösung D gemischt und bei 405 nm vermessen. Auf der Abszisse stehen die Konzentrationen der Eichlösungen in mM.

2. Konzentration c[mmol/l] (p-NP) = 1,07*10-4 + 0,18796*ΔE405

3. Stoffmenge n[mmol](p-NP)t=c(pNP)t*V n=c*V im Reaktionsansatz (Eppi)

49

4. Stoffmenge im Aufschluss (Spirodela + Puffer) n(p-NP)g =n(p-NP)t * 4ml/0,6ml[mmol] 5. Enzymaktivität Aktivität=n(p-NP)g / FM * t [nmol/g*s] Enzym setzt x mmol /Gramm Frischmasse je Sekunde um.

10.2 Nachweis von - und -Amylase-Aktivität

Allgemeines: Amylasen werden z. B. zur Mobilisierung von gespeicherter Stär-ke benötigt, um nach erfolgter Keimung den Keimling mit Kohlenhydraten zu versorgen bevor die Photosynthese einsetzt. Ein klassischer Fall besteht in der Untersuchung der Stärkemobilisierung bei der Karyopsenkeimung der Cereali-en. Der Versuch ist nach einem Tag auszuwerten.

Literatur: Schopfer/Brennicke; Schopfer II, S. 53 + 59, S. 246-251

Materialien: - Gerstenkaryopsen oder Weizenkaryo-

psen - am Vortag einquellen - trockene Karyopsen - Stärkeagar, ca. 30 Petrischalen pro

Kurs - kleines Messer oder Rasierklinge - Pinzette - Parafilm

Chemikalien: keine

Geräte: keine

Fertig angesetzte Lösungen: Lugolsche Lösung (Iod-Iodkaliumlösung), 1:10 verdünnt zur Anwendung Lugolsche Lösung: 1 g Kaliumiodid in 5 ml Wasser lösen, dann 1 g Iod zugeben und danach mit Wasser auf 300 ml auffüllen. Stärkeagar: 1% Agar und 0,2% lösliche Stär-ke, in Reinstwasser aufgekocht, in Petrischa-len gegossen.

Durchführung: Eine Petrischale wird mit lufttrockenen, die andere Schale mit vorgequollenen Gerstenkaryopsen folgendermaßen beschickt: die Karyopsen werden längs durch-geschnitten und mit der Schnittfläche auf den Agar gelegt (4 Hälften pro Schale). Nach 2-tägiger Aufbewahrung bei Zimmertemperatur (nicht länger!) entfernt man die Karyopsen und übergießt die Platte mit 1+4 (d.h. 1:5) verdünnter Lugolscher Lösung (18.01.). Beim Anschauen gegen Licht halten.


Auswertung: Die unterschiedlichen Reaktionen auf der Agarplatte sind zu charak-terisieren (Skizze) und den Amylasen zuzuordnen.

50

10.3 In-vivo-Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität

Allgemeines: Pflanzen benötigen für viele wichtige Stoffwechselprozesse u.a. Stickstoff. Dieses Makronährelement wird von den Pflanzen über die Wurzeln in maximal oxidierter Form (NO3

-) aufgenommen. Für die weitere Verwendung im Stoffwechsel müssen diese Nährelemente in ihre maximal reduzierte Form umge-wandelt werden. Die Reduktion erfolgt in mehreren Schritten (siehe Lehrbücher). In diesem Versuch soll die Reduktion von Nitrat - als Maß für die Enzymaktivität - gemessen werden. Information: Der Zusatz von 1-Propanol stört die Intaktheit der Zellmembran und macht sie teilweise für niedermolekulare Stoffe durchlässig. Wofür ist diese Infor-mation wichtig?

Vorbereitung durch den Versuchsbetreuer: Pro Gruppe werden etwa 2 g Frischsubstanz von Lemna gibba oder Lemna aequinoctialis mindestens 30 min vor Versuchsbeginn in ca. 50 ml nitratfreie Nährlösung übertragen, um überschüssiges Nitrat von den Pflanzen zu entfer-nen.

Literatur: Strasburger; Schopfer/Brennicke, Richter, Taiz / Zeiger

Materialien: - Lemna gibba oder Lemna aequinoctialis, nicht L. minor - Wägschälchen und Pinzette - 10 ml Messzylinder - 2 Reagenzgläser - 1 Becherglas - 2 x 25 ml Erlenmeyerkolben - Pipetten/Glaspipetten Siehe auch unter Hinweise!

Chemikalien: keine

Geräte: - Waage, - Spektrometer mit 1 cm Glas-Küvetten

Fertig angesetzte Lösungen: Nitritstammlösung 200 µM, 250 ml Nitratfreie N-Nährlösung, 1 L Reaktionsmedium (mit Nitrat): - 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,5 - 0,02 m KNO3 - 5 % 1-Propanol (= n-Propanol) Kontrollmedium (ohne Nitrat): - 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,5 - 5 % 1-Propanol Nachweisreagenz: - 1 % (w/v) Sulfanilamid in 1.5 M HCl

(SA) - 0,02 % (w/v) α-Naphthylethylendiamin-hydrochlorid in Wasser (NED) Vor Versuchsbeginn 1 + 1 gemischt (= SA-NED-Nachweisreagenz). Versuchsbetreuer

Durchführung:

1. Erstellen einer Eichkurve Ein oder zwei Gruppen sollten zunächst eine Standardkurve erstellen: Ausgehend von der Nitrit-Stammlösung (200 µM) werden durch Verdün-nung die folgenden Konzentrationen hergestellt: 200 µM, 160 µM, 120 µM, 80 µM, 40 µM und Kontrolle (0 µM).

51

Von diesen Konzentrationen werden jeweils 1.6 ml entnommen und 2.4 ml SA-NED-Nachweisreagenz zugegeben. Nach frühestens 10 min, nicht später als nach 1 h, wird die Extinktion im Spektrophotometer bei 540 nm vermessen. Die Extinktion (x-Achse) ist gegen die Konzentration (y-Achse) aufzutragen und der Anstieg ist zu berechnen (lineare Ausgleichrechnung), was zu einer linearen Gleichung der Gestalt: [Nitrit, µM] = a x Ext(540nm) führt. Das Glied a stellt dabei den Anstieg im Diagramm dar und sollte im Bereich von 0.05 liegen.

2. Untersuchung des Pflanzenmaterials Nach Abtropfen des Pflanzenmaterials werden jeweils 1 g in 25 ml Erlen-meyerkolben mit 5 ml Reaktionsmedium bzw. 5 ml Kontrollmedium (ohne KNO3) gegeben und 30-60 min stehen gelassen (Zeit genau notieren!). An-schließend werden die Proben durch leichtes Schwenken durchmischt. Schließlich werden vom Medium jeweils 1,6 ml entnommen und mit 2,4 ml SA-NED-Nachweisreagenz versetzt. Nach 10 min wird der rote Farbkom-plex bei 540 nm am Spektrometer (1 cm-Küvetten) gegen Reinstwasser gemessen. Die Messung der Blindprobe (Kontrolle) erfolgt ebenfalls gegen Reinstwasser. Die erhaltenen Werte werden voneinander subtrahiert (Ex-tinktion Probe – Extinktion Blindwert).

Die Extinktionswerte werden anhand der Eichkurve zunächst in Konzentrationsan-gaben (µM gebildetes Nitrit) umgewandelt und danach in nmol NO2/g Frischsub-stanz * Stunde umgerechnet. Das Ergebnis ist ein Maß für die Nitratreduktaseakti-vität in den lebenden Zellen und wird daher als in vivo-Aktivität bezeichnet.. Hinweis: Nitrit bildet in Verbindung mit Sulfanilamid (SA) und N-Naphthyl-(1)-ethylendiammoniumdichlorid (NED; vgl. Naphthylamin) einen roten Azofarbstoff, der als Maß für die gebildete Menge Nitrit quantitativ im Spektrometer bei 540 nm vermessen werden kann.

Versuchszeit: etwa 90 min

Auswertung: Berechnung der Enzymaktivität pro Gramm Frischgewicht.

NED

SA

Naphthylamin

52

10.4 Kartoffel-Katalase-Versuch

Allgemeines: Das Enzym Katalase kann das Zellgift Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff spalten. Es hat eine sehr hohe Wechselzahl. Auch Kar-toffeln enthalten Katalase. Wenn man die Kartoffeln mit einer Reibe zerkleinert und die Masse auspresst und filtriert, erhält man einen Katalase-Rohextrakt. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Wasserstoffperoxid-Abbaus kann anhand der in einer bestimmten Zeitspanne erzeugten Sauerstoffmenge gemessen werden. Eine elegante Lösung für einen Schülerversuch ist das Messen der Auftauchgeschwindigkeit von in Katalaselösung getauchten Filterpapierstück-chen durch anhaftende Sauerstoffbläschen. Dazu bringt man die Filterpapier-stückchen in ein Gefäß mit einer H2O2-Lösung.

Materialien: - Filterpapier - Trichter - Locher - Kartoffelreibe, Schälmesser - großes Plaste-Becherglas für Kartoffelmasse - 2xBecherglas 250 ml - Messzylinder - 12 Bechergläser 100 ml - 6 Messzylinder 25 ml - 6 Messzylinder 50 ml - Pipetten und Spitzen - Pinzette - Stoppuhr

Chemikalien: - H2O2-Lösung 30% (Achtung, ätzend und bleichend, Kittel und Handschuhe tragen!) - steriles Wasser - Katalase Lösung

Geräte: keine


Durchführung:

Erzeugen Sie mithilfe eines Lochers 60 Filterpapierblättchen.

Herstellung der Katalase-Lösung:

Reiben sie eine Kartoffel (geschält) in einen Messbecher. Schlämmen Sie die Masse mit etwas Wasser (25 ml) auf. Filtrieren Sie die Kartoffelmasse (hierzu eignet sich auch ein Kaffeefilter).

a) Einfluss der Enzymkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit

Stellen Sie folgende Verdünnungen der Katalaselösung in 6 Messzylindern her (Anga-ben in ml):

Messzylinder Nr. 1 2 3 4 5 6

ml Katalaseextrakt 20 12 6 3 1 0

ml dest. Wasser 0 8 14 17 19 20

Füllen Sie je 50 ml 1%-ige H2O2-Lösung in die sechs Bechergläser. Tauchen Sie mit der Pin-zette ein Filterpapierblättchen kurz (1 s) in Messzylinder 1, um es mit Katalaselösung zu benetzen. Lassen Sie es in das erste Becherglas fallen. Messen Sie die Zeitspanne vom

53

Eintauchen bis zum Auftauchen des Blättchens. Wiederholen Sie das Vorgehen für jede Konzentration fünfmal. Spülen Sie die Pinzette vor der nächsten Konzentration kurz in Wasser ab!

Stellen Sie die Mittelwerte der Ergebnisse in einem Liniendiagramm dar! Erläutern Sie den Zusammenhang zwischen der Enzymkonzentration und der Reaktionsgeschwindigkeit anhand der Versuchsergebnisse!

b) Einfluss der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit

Stellen Sie sechs H2O2-Konzentrationen her und befüllen Sie sechs Bechergläser! Be-rechnen Sie die erhaltenen Konzentrationen!

Messzylinder Nr. 7 8 9 10 11 12

ml 30% H2O2-Lösung 8 5 3 2 1 0

ml dest. Wasser 42 45 47 48 49 50

H2O2-Konzentration in %

Verwenden Sie eine der Enzymkonzentrationen aus Versuch a). Wiederholen Sie das Vorgehen aus dem vorigen Versuch für jede H2O2-Konzentration fünfmal.

Stellen Sie die Mittelwerte der Ergebnisse in einem Liniendiagramm dar! Erläutern Sie den Zusammenhang zwischen der Substratkonzentration und der Reaktionsgeschwin-digkeit anhand der Versuchsergebnisse!

Als Hemmstoff kann man CuSO4 ausprobieren!

Versuchszeit: ca. 1 h

54

11. KURS: ATMUNG UND GÄRUNG 23.01.2019

11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung 11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate 11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung) -----------------------------------------------------------------------------------------------------

11.1 Entwicklung von CO2 bei der Atmung und Temperaturabhängigkeit der Atmung

Allgemeines: In diesem Versuch wird die Temperaturabhängigkeit der Atmung bei eingequollenen Samen beobachtet.

Literatur: Schopfer & Brennicke (zu den Prinzipien)

Materialien: Samen von Lepidium sativum oder Linum werden etwa 15 Stunden bei Zimmertempera-tur eingequollen(Vorabend). Versuchsbetreu-er.

- pro Gruppe 4 x 50 ml Erlenmeyerkol-ben mit passenden Gummistopfen (Weithals)

- Filterpapier und Trichter - 4 - 6 Büretten - 4 - 6 250 ml Bechergläser - 4 - 6 x 10 ml Glaspipetten - Mull, Schere - 4 - 6 Pasteur-Pipetten

Chemikalien: keine

Geräte: Trockenschrank Kühlschrank

Fertig angesetzte Lösungen: 50 mM Ba(OH)2 filtriert 100 mM Oxalsäure Phenolphthalein-Lösung (0,1% in 70%igem Ethanol)

Durchführung: Je zwei aus Mull gefertigte Beutel mit jeweils 10 g eingequollenen Samen werden in Erlenmeyerkolben gehängt, die mit 10 ml Ba(OH)2 beschickt sind. Die Samen dürfen nicht in die Lösung eintauchen. Gleichzeitig werden zwei Kolben ohne Sa-men als Blindproben vorbereitet. Die mit Gummistopfen gut geschlossenen Gefä-ße, jeweils mit und ohne Samen, werden 1 Stunde bei verschiedenen Temperatu-ren aufgestellt (Kühlschrank und 30°C Trockenschrank). Nach Abschluss des Versuches wird das Ba(OH)2 mit 1 – 2 Tropfen Phenolphthal-ein-Lösung versetzt und bis zur Entfärbung mit eingestellter Oxalsäure titriert. An gleichzeitig angesetzten Blindproben ermitteln wir den ursprünglichen Titer der Lauge; aus der Abnahme der Laugenmenge berechnen wir die Menge des gebun-denen CO2. Vielleicht können sich mehrere Gruppen absprechen.

Versuchszeit: ca. 2,5 Stunden

Auswertung: Grafische Darstellung (Verhältnis zwischen der Atmung, ausgedrückt als Menge an CO2, und der Temperatur), Interpretation.

Frage zum Nachdenken: Warum wird bei der Rücktitration Oxalsäure und nicht ganz einfach Salzsäure verwendet?

55

11.2 Vergärung verschiedener Kohlenhydrate

Materialien: 2 ml-Pipetten 10 ml-Pipetten 250 ml-Plastikbecher Gärgefäße mit Skala, 7 pro Gruppe Bäckerhefe guter Qualität

Chemikalien: keine

Geräte: Wärmeschrank (30oC) oder Raumtemperatur

Fertig angesetzte Lösungen: je 10%ige Lösungen von Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccha-rose, Lactose, Arabinose, +H2O Blindprobe

Bei diesem Versuch sollten ausnahmsweise immer zwei Gruppen zusammenar-beiten.

Durchführung: Ein Stück Presshefe (nur beste Qualität wird akzeptiert) wird zunächst in Wasser (Endvolumen 200 ml) suspendiert. Von dieser Suspension werden je 2 ml in Gär-gefäße gefüllt. Die Gärgefäße werden danach mit 10 %igen (w/v) Lösungen fol-gender Zucker beschickt: Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Arabinose. Zur Füllhöhe: nur bis unterhalb des Bauches der Gärröhrchen! Die Gärgefäße werden entweder im Wärmeschrank bei 30oC oder bei Raumtem-peratur aufgestellt. Die Ablesung der entwickelten CO2-Mengen erfolgt nach 30 min und nach einer Stunde.

Versuchszeit: etwa 2 Stunden Beobachtung

Auswertung: Tabellarische Darstellung und Diskussion

11.3 Baumannscher Versuch (Eisen-katalysierte Elektronenübertragung)

Literatur: Schopfer II.

Materialien: keine

Chemikalien: Cystein Eisen(III)sulfat Fe2(SO4)3 EDTA-Na2

Geräte: Messzylinder

Fertig angesetzte Lösungen: 0.1 M Acetatpuffer pH 6.6, pro Gruppe 50 ml

Durchführung Eine Cysteinlösung wird frisch hergestellt: 0.25 g in 50 ml Acetatpuffer. Zu dieser Lösung werden 0.21g FeSO4 gegeben und durch Schütteln gelöst. Die Farbreakti-on beim Schütteln und beim nachfolgenden Stehen wird beobachtet. Nach Zugabe einer Spatelspitze EDTA-Na2 verändert sich die Farbreaktion. Anstelle des EDTA-Na2 könnte eine Spatelspitze KCN zum gleichen Zweck verwendet werden – was wir aus Sicherheitsgründen aber besser bleiben lassen.

Versuchszeit: 20 min

Auswertung: Beobachten und interpretieren Sie die Farbänderungen! Stellen Sie eine Reaktionsgleichung unter Einbeziehung von Cystein, Fe3+/Fe2+ und Acetat auf.

56

12. KURS: SÄUREN UND SEKUNDÄRE PFLANZENSTOFFE 30.01.2019

12.1 Bestimmung der Azidität in Wein 12.2 Nachweis von Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten 12.3 Nachweis von Sekundärcarotinoiden 12.4 Nachweis von Aesculin und Fraxin 12.5 Bestimmung von pflanzlichen Terpenen durch Geruchstest 12.6 Chemiewaffen im Pflanzenreich(Allelopathie)? --------------------------------------------------------------------------------------------------------------12.1 Bestimmung der Azidität in Wein

Allgemeines: Es werden potentielle Azidität und aktuelle Azidität in Wein und in Traubensaft bestimmt. Die Ergebnisse sollen interpretiert und zur Qualitätscharak-terisierung herangezogen werden. Wiederholen Sie den Schulstoff über pH-Werte.

Literatur: Schopfer & Brennicke (bezüglich Prinzipien)

Materialien: - Apfelwein; Apfelsaft - Traubensaft, weiß; Weißwein - 4 Büretten und Ständer - 1 x 250 ml Becherglas pro Gruppe - 2 x 250 ml weithals Erlenmeyerkolben pro Gruppe - Pasteur-Pipetten - 2 - 4 x 25 ml- Messzylinder - pH-Indikator (Unitest-Papier), Pinzette

Chemikalien: keine

Geräte: pH-Messgerät

Fertig angesetzte Lösungen: - 0,33 M NaOH - Tashiro-Indikator – für jedes Semester neu ansetzen.

Durchführung: a) Potentielle Azidität (Titrationsazidität) Wein und Saft werden mit 0,33 M NaOH titriert. Dazu werden 20 ml Saft oder Wein 1 + 4 mit 800ml Wasser verdünnt ( bei der Berechnung berücksichtigen!), 25 ml davon in Erlenmeyerkolben eingefüllt und 2 bis 3 Tropfen Tashiro-Indikator dazu gegeben.. Die Bürette wird bis zu einem Eichstrich mit NaOH gefüllt. Die NaOH-Lösung wird tropfenweise in den Saft/ den Wein gegeben, bis der Farbumschlag von rot-violett nach grün erfolgt. Die Anzahl der ml verbrauchter NaOH x 5 gibt die titrierbare Gesamtsäure in g Weinsäure/ l an. b) Aktuelle Azidität In Saft bzw. Wein wird mit pH-Indikator (z. B. Unitest-Papier) und vergleichsweise elektrometrisch die aktuelle Azidität (d. h. der pH-Wert) ermittelt.

Versuchszeit: 1a: 30 min; 1b: 10 min

Auswertung: Interpretation der Befunde

Hinweise: 1. Tashiro-Indikator ist ein Mischindikator, der aus Methylrot : Methylenblau = 4:1 hergestellt wird, jeweils 100 mg in 100 ml Reinstwasser gelöst. 2. Wenn man 0,1 M NaOH statt 0,33 M NaOH verwendet, so muss entsprechend umgerechnet werden. 3. Richtwerte Azidität: 4,5-6,7g/l normal

57

<5g/l gering >7,5g/l stark 12.2 Nachweis der Ascorbinsäure in pflanzlichen Produkten

Allgemeines: In diesem Versuch werden die Presssäfte verschiedener Früchte aufgrund ihres Vitamin C-Gehalts verglichen. Jede Gruppe sollte mindestens eine Frucht mitbringen, an der Interesse besteht. Auch Fruchtsaftgetränke sind möglich.

Literatur: Schopfer & Brennicke (Prinzipien)

Materialien: - verschiedene Früchte, keine Kiwi - Nachweispapier (Tillman´s Reagenz) - Pasteur-Pipetten (4 - 6) - 9 Reagenzgläser mit Ständer - 3 x 1 ml Glaspipette

- 3 x 10 ml Glaspipette

Chemikalien: keine

Geräte: - Eppi-Ständer - Eppis - Zitronenpresse

Fertig angesetzte Lösungen: Ascorbinsäure-Stammlösung

Durchführung: Die Presssäfte verschiedener Früchte (auch Paprika aus Versuch 12.3 kann ver-wendet werden) werden in einer Tischzentrifuge in einem Reaktionsgefäß (1.5 ml) über 1 min bei 13.000 U min-1 abzentrifugiert. Der Überstand wird tropfenweise (kleine Tropfen und möglichst gleiche Mengen) auf das Nachweispapier aufge-bracht. Bei Vorhandensein von Ascorbinsäure bilden sich Entfärbungszonen. Ist hingegen die Probe lediglich sauer, so entstehen rosa Flecke. Zur Abschätzung der Ascorbinsäure-Konzentration können gleich große Tropfen einer Ascorbinsäure-Konzentrationsreihe (1:10, 1:100) auf das Indikatorpapier ge-bracht werden.

Versuchszeit: 30 min

Hinweise: 1. Der Nachweis erfolgt mit dem blauem Farbstoff 2,6-Dichlorphenol-Indophenol, das zur (gelben) Leukoform reduziert wird (Tillman´s Reagenz). Zur Herstellung desselben werden 5 mg 2,6-Dichlorphenol-Indophenol in 5 ml Reinstwasser unter Erwärmen gelöst. Mit diesem Reagenz werden dann Streifen von Chromatogra-phie-Papier getränkt, die nach dem Trocknen kühl, trocken und dunkel aufzube-wahren sind. 2. Die Ascorbinsäure-Stammlösung hat folgende Zusammensetzung: 50 mg As-corbinsäure werden in 10 ml einer 2%igen Phosphorsäure gelöst, sodass 1 ml 5 mg (5000 µg) enthält.

58

12.3 Nachweis von Sekundärcarotenoiden

Allgemeines: Carotenoide werden den sekundären Pflanzenwirkstoffen zugerech-net und kommen in vielen Pflanzen vor. Charakteristisch für die Carotenoide sind zahlreiche konjugierte Doppelbindungen, die den Verbindungen eine gelbe – rote

Farbe verleihen. Zu den Carotinoiden zählen z. B. das -Caroten (oranger Farb-stoff der Möhre) oder Lycopin (roter Farbstoff der Tomate). Sie sind aber auch in Spinat, Broccoli, Salat, Bohnen oder Orangen anzutreffen. Die Färbung von reifem Paprika basiert auf einem Carotenoid- - u. Ze-axanthin, Lutein u. Capsorubin bis zu 35% Capsanthin enthalten sind.

Carotenoide lassen sich aus biologischem Material durch Extraktion mit unpolaren Lösungsmitteln gewinnen. Die Wellenlänge der Absorptionsmaxima hängt von der Länge der absorbierenden Chromophoren, d. h. der Anzahl der konjugierten Dop-pelbindungen ab.

Materialien: - Reaktionsgefäße („Epis“) - verschieden gefärbte Paprika - Dünnschichtkieselgelplatten - weicher Bleistift und Lineal - Eis

Chemikalien: - Quarzsand - Chloroform zur Extraktion

Geräte: - Messer - Wägschälchen - Mörser und Pistill - Kühlschrank - 10 ml Messzylinder - Trichter und Rundfilter -Reagenzröhrchenständer und Reagenzröhrchen - Pipetten (1000 µl, 50 µl); Kapillarröhrchen - Chromatographiekammer mit Glasdeckel - Chromatographieplaten, 10x10 cm - 20 ml Becherglas

Fertig angesetzte Lösungen: - Laufmittel: Aceton : Benzin (100-140oC) : Chloroform = 50:50:40

Durchführung: 10 g Paprika werden mit einem Messer in kleine Stücke geteilt und im Mörser un-ter Zugabe einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert (auf Eis). Die Extraktion der Carotenoide erfolgt mit 10 ml Chloroform. Dazu wird das Lösungsmittel schrittweise zum Homogenat gegeben und der Extrakt durch Filterpapier in ein Reagenzröhrchen filtriert Wir verwenden probeweise einmal beide Laufmittel in diesem Praktikum. Das Laufmittel wird ca. 1 cm hoch in die Trennkammer eingefüllt, verschlossen und für mindestens 30 min äquilibriert. Mit einem weichen Bleistift wird eine Startlinie 2 cm oberhalb des unteren Randes der Kieselgelplatte markiert. Dabei darf die Träger-schicht nicht beschädigt werden. Entlang dieser Linie werden tropfenweise neben-

59

einander die Extrakte verschiedener Paprika aufgetragen. Die Kapillarröhrchen sollten beim Auftragen die Trägerschicht nicht zu verletzen. Die getrocknete Dünnschichtplatte wird senkrecht in die Chromatographiekammer gestellt. Die Startlinie muss oberhalb des Laufmittels liegen.

Auswertung: Geben Sie den Rf-Wert (vgl. Versuch 8.5. Dünnschichtchromatogra-phie von Chloroplastenpigmenten) und die Absorptionskurve eines der Hauptcaro-tinoide an.

Versuchsdauer: ca. 50 min: 30 min Extraktion und Messung und 20 min Chroma-tographie.

12.4 Nachweis von Aesculin und Fraxin

Allgemeines: Cumarin-Derivate zeigen eine starke Fluoreszenz. Solche Verbin-dungen, die auch „Schillerstoffe“ genannt wurden, kommen beispielsweise in der Rinde der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum) und der Esche (Fraxinus excelsior) vor. Aesculin ist das Glykosid aus Aesculetin und Glucose. Es fluores-ziert blau. Fraxin, das vor allem in der Esche vorkommt, besitzt einen ähnlichen Aufbau, fluoresziert aber grünlich.

Literatur: Tausch & Paterkiewicz: "Fluoreszenz und Phosphoreszenz"; Praxis der Naturwissenschaften (Chemie), 39 (1988)

Materialien: - Rindenstücke (kleine Äste gehen auch) der Esche und Rosskastanie (Ahorn geht nicht!)

Chemikalien: keine

Geräte: - 2 x 250 ml Bechergläser - UV-Lampe und Schutzbrille


Durchführung: In jeweils mit Leitungswasser gefüllte Bechergläser werden Rindenstücke von et-wa zweijährigen Eschen- und Rosskastanienzweigen gebracht und mit UV-Licht bestrahlt.

Auswertung: Bei diesem Versuch ist kein schriftliches Protokoll erforderlich.


Aesculin

60

12.5 Bestimmung von pflanzlichen Terpenen durch Geruchstest

Allgemeines: Viele Pflanzen bilden hohe Konzentrationen von Terpenen, die auch Isoprenoide genannt werden und mit über 30.000 Substanzen die größte Klassen der pflanzlichen Sekundärstoffe bilden. Jede Pflanze bildet eine charakteristische Mischung von Terpenen, die entweder in der Pflanze gespeichert werden oder aufgrund der Flüchtigkeit als Duft in den umgebenden Raum abgegeben werden. Dadurch sind Terpene die Hauptbestandteile von Essenzen, ätherischen Ölen und Blütendüften. Ätherische Öle sind komplexe Mischungen acyclischer, alicyclischer, aromatischer und seltener auch heterocyclischer Verbindungen. In diesem Versuch sollen Sie die Hauptkomponenten der ätherischen Öle einiger Pflanzen identifizieren, indem Sie den Duft einzelner Terpene mit dem der ätheri-schen Öle vergleichen. Zu einigen Formeln siehe getrennte Seite. Der Geruch von Kaffebohnen eignet sich nach unseren Erfahrungen gut zur Neut-ralisierung des Geruchs zwischen Proben.

Materialien: Orange, Zitrone, Salbei, Minze, Nadelgehölz

Chemikalien: - ätherische Öle (Kiefer, Minze, Orange, Rose, Salbei, Zitrone) - Terpene (Borneoyl-Acetat, Camphor, Citral, R-Limonen, S-Limonen, Linalool, Menthon Myrcen, Nerolidol, Pinen, (+)-Pulegon)

Geräte: Marmeladengläser


Durchführung: Bitte ordnen Sie den Terpenen die entsprechenden ätherischen Öle zu.

Auswertung: Tabellarische Darstellung der Ergebnisse und Beantwortung der fol-genden Fragen. Was ist die Funktion der Terpene in den verschiedenen Pflanzen? Warum werden die Enantiomere von Limonen als verschiedene Düfte wahrge-nommen? Warum werden manche Terpene überwiegend in der Pflanze gespeichert und an-dere als Duftstoffe abgegeben? Vergleichen Sie die Morphologie und Funktion der Terpene produzierenden Drü-sen in Minze, Orange und Nadelbäumen!


Terpene atherische Öle Borneoyl-Acetat Kiefer Camphor Minze Citral Orange R-Limonen Rose S-Limonen Salbei Linalool Zitrone Menthon Myrcen Nerolidol Pinen (+)-Pulegon

62

12.6 Chemiewaffen im Pflanzenreich (Allelopathie)?

Allgemeines: Die Blätter des Walnussbaums enthalten u.a. folgende lnhaltsstoffe: Juglon, α- und β-Hydrojuglon, Juglandin, Quercetin, Quercetrin, Sakuranetin, Gerbstoffe, Serotonin und Inosit. In diesem Versuch soll der Einfluss von Extrakten aus Walnussblättern auf (1.) die Keimung und (2.) das Wachstum von Kresse un-tersucht werden.

Materialien: - 5 g Walnussblätter - ca. 60 Kressesamen - Schere - Handschuhe - Wägschälchen, Spatel - Mörser und Pistill - Trichter und Rundfilter, Petrischalen - 250 ml Becherglas

- 2 500 Bechergläser - 6 Lagen Filterpapier

Chemikalien: - Quarzsand

Geräte: keine


Durchführung: Zur Gewinnung des Walnussbaum-Blattextraktes werden ca. 5 g Fiederblätter oh-ne deren Mittelrippe so fein wie möglich mit der Schere zerkleinert und anschlie-ßend im Mörser unter Zusatz einer Spatelspitze Quarzsand homogenisiert. Bitte Handschuhe tragen. Dazu kommen 25 ml Leitungswasser. Mit der erhaltenen graugrünen Suspension kann das eigentliche Experiment beginnen. In jedes der beiden 1000 (oder 500) ml Bechergläser werden je nach Papierdicke 2 – 3 Lagen Filterpapier gelegt. In das erste Glas wird Leitungswasser gegeben, sodass sich etwas Wasser ansammelt, wenn man das Glas schräg hält. Das ande-re Glas wird dementsprechend mit dem Blattextrakt behandelt. Nun werden in je-des Glas etwa 30 Kressesamen gelegt. Die Gläser werden verschlossen und ins Gewächshaus gebracht.

Auswertung: Die Keimungsrate der Kresse, d. h. gekeimte Samen in Bezug zur Gesamtanzahl an Samen, wird nach 24 h bestimmt und in Prozent angegeben. Die Längen von Wurzeln und Sprossen werden nach 7 Tagen, also in der folgen-den Praktikumswoche, gemessen. Die Ergebnisse sind grafisch darzustellen. Die Spross- und Wurzellängen sind als Mittelwerte mit Standardfehlern auszuwerten. Die Wurzelhaarbildung ist zu vergleichen.

Versuchsdauer: ca. 60 min, davon 30 min Vorbereitung und 30 min Auswertung

Hinweis: Die Versuche 2, 4 und 5 sind als Schulversuche gut geeignet.

63

Summen-

häufigkeit

[%]

Probit

Summen-

häufigkeit

[%]

Probit

Summen-

häufigkeit

[%]

Probit

Summen-

häufigkeit

[%]

Probit

1 26 4,36 51 5,03 76 5,71 2 2,67 27 4,39 52 5,05 77 5,74

3 2,95 28 4,42 53 5,08 78 5,77

4 3,12 29 4,45 54 5,10 79 5,81 5 3,25 30 4,48 55 5,13 80 5,84

6 3,36 31 4,50 56 5,15 81 5,88 7 3,45 32 4,53 57 5,18 82 5,92

8 3,52 33 4,56 58 5,20 83 5,95 9 3,59 34 4,59 59 5,23 84 5,99

10 3,66 35 4,61 60 5,25 85 6,04

11 3,72 36 4,64 61 5,28 86 6,08 12 3,77 37 4,67 62 5,31 87 6,13

13 3,83 38 4,69 63 5,33 88 6,18 14 3,87 39 4,72 64 5,36 89 6,23

15 3,92 40 4,75 65 5,39 90 6,28

16 3,96 41 4,77 66 5,41 91 6,34 17 4,01 42 4,80 67 5,44 92 6,41

18 4,05 43 4,82 68 5,47 93 6,48 19 4,08 44 4,85 69 5,50 94 6,55

20 4,12 45 4,87 70 5,52 95 6,64 21 4,16 46 4,90 71 5,55 96 6,75

22 4,23 47 4,92 72 5,58 97 6,88

23 4,26 48 4,95 73 5,61 98 7,05 24 4,29 49 4,97 74 5,64 99 7,33

25 4,33 50 5,00 75 5,67 100

Freiheits-

grad

α =

5%

α =

1%

Freiheits-

grad

α =

5%

α =

1%

Freiheits-

grad

α =

5%

α =

1%

1 12,71 63,66 18 2,10 2,88 60 2,00 2,66

2 4,30 9,92 19 2,09 2,86 70 1,99 2,65 3 3,18 5,84 20 2,09 2,85 80 1,99 2,64

4 2,78 4,60 21 2,08 2,83 90 1,99 2,63 5 2,57 4,03 22 2,07 2,82 100 1,98 2,63

6 2,45 3,71 23 2,07 2,81 120 1,98 2,62

7 2,36 3,50 24 2,06 2,80 140 1,98 2,61 8 2,31 3,36 25 2,06 2,79 160 1,97 2,61

9 2,26 3,25 26 2,06 2,78 180 1,97 2,60 10 2,23 3,17 27 2,05 2,77 200 1,97 2,60

11 2,20 3,11 28 2,05 2,76 300 1,97 2,59

12 2,18 3,05 29 2,05 2,76 400 1,97 2,59 13 2,16 3,01 30 2,04 2,75 500 1,97 2,59

14 2,14 2,98 35 2,03 2,72 1000 1,96 2,58 15 2,13 2,95 40 2,02 2,70 +INF 1,96 2,58

16 2,12 2,92 45 2,01 2,69 17 2,11 2,90 50 2,01 2,68

64

Eisennachweis im Senfembryo mit Berliner Blau

Die Berliner-Blau-Reaktion ist ein histochemisches Verfahren zum Nachweis von Eisen im

Gewebe, das auch bei tierischen Geweben verwendet wird. Eisen(III)-Ionen lassen sich im

sauren Milieu mit gelbem Blutlaugensalz [= Kaliumhexacyanoferrat (II)] nachweisen, wo-

bei ein Eisen(III)-Eisen(II)-Komplex entsteht, der tiefblau gefärbt ist.

Die Senfsamen wurden für 24 h in eine Lösung aus Kaliumhexacyanoferrat eingelegt. Im

Praktikum wird die Samenschale entfernt, und Salzsäure (5%) wird auf den nun freiliegen-

den Embryo getropft. Das Eisen im Embryo wird durch die Salzsäure ionisiert. Es hat nun

eine hohe Affinität zum Ferrocyanid und verdrängt das Kalium. Es bildet sich Ferriferrocy-

anid, das als Berliner Blau (Englisch: prussian blue) bezeichnet wird.

4Fe3+ + 3 K4[FeII(CN)6 (aq) FeIII4[FeII(CN)6]3 + 12 K+

Eisen(III)-Ionen reagieren mit Kaliumhexacyanoferrat(II) zu einem Eisenhexacyanoferratkomplex

und Kaliumionen.

Eisen wird im Arabidopsis

-Embryo in der Endodermis gespeichert (Roschzttardtz et al. 2009, Plant Phys. 151:1329–

1338; Grillet et al. 2014, Front. Plant Sci. 4:535; siehe Abbildung unten). Senf (Sinapis al-

ba) gehört zur gleichen Pflanzenfamilie wie Arabidopsis. Welche Strukturen werden hier

durch die Färbung sichtbar? Was können wir daraus schließen?

A: Im Reiskorn findet man die höchste Konzentration von Fe in der Aleuronschicht, dem Inte-gument und dem Scutellum. Im stärkereichen Endosperm ist der Eisengehalt niedrig. B: In Arabidopsissamen findet man Eisen hauptsächlich in den Vakuolen der Endodermiszellen um die provaskulären Gewebe. Quelle: Grillet et al. 2014: Iron in seeds – loading pathways and subcellular localization. Front. Plant Sci. 4:535.

65

Liste einiger im Pflanzenphysiologischen Praktikum

verwendeter Pflanzen

Aesculus hippocastanum Gemeine Ross-Kastanie

Amaranthus caudatus Garten-Fuchsschwanz

Arabidopsis thaliana .. Ackerschmalwand

Avena sativa ......... Saat-Hafer

Bellis perennis ......... Maßliebchen, Gänseblümchen

Brassica napus ......... Raps

Cerasus avium ......... Süßkirsche

Cerasus vulgaris ........ Sauerkirsche

Chenopodium bonus-henricus Dorf-Gänsefuß, Guter Heinrich

Chenopodium album . Weißer Gänsefuß

Coleus blumeii ......... Buntnessel, Ziernessel

Cyclamen persicum. .. Alpenveilchen

Fuchsia X hybridia. .... Fuchsie

Ginkgo biloba ......... Ginkgo

Hedera helix ......... Gemeiner Efeu

Helianthus annuus ..... Gemeine Sonnenblume

Hordeum vulgare ....... Mehrzeilige Gerste

Lactuca sativa, var. capitata, cv. Grand rapid Grüner Salat

Lamium album ......... Weiße Taubnessel

Lemna gibba ......... Bucklige Wasserlinse

Lemna minor ......... Kleine Wasserlinse

Lemna trisulca ......... Dreifurchige Wasserlinse

Lepidium sativa ......... Garten-Kresse

Linum usitatissimum .. Saat-Lein, Flachs

Lycopersicum esculentum Tomate

Ocimum basilicum ..... Basilikum

Phaseolus vulgaris .... Garten-Bohne

Pisum sativum ......... Garten-Erbse

Prunus domesticus .... Pflaume

66

Rhoeo discolor (= R. spathacea) Zweifarbige Rhoeo

Secale sereale ......... Saat-Roggen

Sinapis alba ......... Weißer Senf

Solanum lycopersicum Tomate

Solanum tuberosum .. Kartoffel

Spinacia oleracea ...... Gemüse-Spinat

Spirodela polyrhiza .... Vielwurzelige Teichlinse

Syringia vulgaris ......... Gemeiner Flieder

Taraxacum officinale . Löwenzahn

Taxus baccata ......... Beeren-Eibe

Tilia ......... Linde

Tradescantia Andersoniana-Hybriden Dreimasterblume

Trifolium album ......... Weißer Klee

Triticum aestivum ...... Saat-Weizen

Urtica dioica ......... Große Brennnessel

Vicia faba ......... Acker-, Sau-, Pferde-, Puffbohne

Wolffia arrhiza ......... Wurzellose Wasserlinse

Zea mays ......... Getreide-Mais

Kursplan Praktikum PflanzenphysiologieWintersemester-p-2560.pdf · Die Pflanzen mit geschlossenen...

Documents

Transcript of Kursplan Praktikum PflanzenphysiologieWintersemester-p-2560.pdf · Die Pflanzen mit geschlossenen...