LABORWELT 02/2011

DNA-Technologien Technologie: Klinisch relevante Mutationsanalyse mittels compact sequencing

Paper des Monats: Leukämie-Überwachung durch RNA-Sequenzierung

Spin-off: Zellspezifischer Knock-down mit Hilfe Intelligenter siRNA

Marktübersicht:

Lab Automation

Nr. 2 / 2011 – 12. Jahrgang

laborwelt

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Editorial | InhaltEditorial | Inhalt

LABORWELT 12. Jahrgang | Nr. 2/2011 | 3

Marktübersicht: Lab Automation

Zum letzten Mal trafen sich Automationspezialisten im Januar am Veranstaltungsort Palm Springs bei frühlingshaft warmen Temperaturen zur Lab Automation, um die neuesten Produkte und Trends im Automationsmarkt für die Life Sciences zu diskutieren. Was sie in ihrem Produktportfolio hatten und diesen Sommer auf der European Lab Automation in Hamburg zeigen werden, lesen Sie in unserer Marktübersicht „Lab Automation“. Altbewährtes und belastbare Informationen zu neuen Systemen finden Sie ab Seite 36.

In diesem Heft

Analysetechniken für DNA & mehr Angefangen hat alles vor sechs Jahren mit dem ersten Next Genera-tion Sequencer. In nur einem halben Jahrzehnt hat die neue Technik zu diversen Großprojekten geführt, von denen zuvor niemand auch nur zu träumen wagte. Neben der DNA, ist es das Methylom, das im Human Epigenome Project untersucht wird. Bei den laufenden Untersuchungen des Internationalen Krebsgenomprojektes, an dem auch deutsche Gruppen mitwirken (vgl. Seite 19), geht es neben ge-nomischen Aberrationen auch um mRNA- und miRNA-Expression, die Untersuchung struktureller Aberrationen und vieles mehr. Den ersten Nutzen des rasant billiger werdenden Next-Generation-Sequencings versprechen sich Leukämie-Experten, die die individuellen krebsiniti- ierenden Mutationen in aktiv transkribierten Genen aufgespürt haben, von der sequenzierungsbasierten Verlaufskontrolle (vgl. Seite 4). Längst eingezogen in die Patientenstratifizierung vor der Behandlung von Krebspatienten mit Biologika ist die Ermittlung des Mutationsstatus und des damit verbunden Therapieansprechens (vgl. Seite 13). Um den immensen Technologiefortschritt nach der Einführung der ultraschnel-len Sequenzierung, die rasch über die DNA-Analyse hinausgewachsen ist, geht es in dieser Themenausgabe von LABORWELT.

Damit sich der Blick jedoch nicht zu starr auf die Nukleinsäureebene richtet, stellen wir Ihnen auch Werkzeuge zur anspruchsvolleren Funk-tionsanalyse vor, wie sie etwa ein in Gründung befindliches Spin-off der Universität Jena entwickelt hat (vgl. Seite 6), oder eine Technologie, mit der sich jedes x-beliebige Tier mit Knock-in- und Knock-out-Mutationen designen lässt – zur Funktionsvalidierung in vivo (vgl. Seite 17). Gerade diesem Feld wäre eine Publikationswelle zu wünschen, wie sie die Next-Generation-Sequencer sie bereits aktuell auslösen.

Thomas Gabrielczyk

Titel: DNA-TechnologienPseudocolorierte Chromosomen

Foto: Sebastian Kaulitzki, fotolia.de

Inhalt

Paperwelt Highlight des Monats4 mRNA-Sequenzierung eröffnet neue Einblicke in die AML

Philipp Greif et al., Klinikum Großhadern, München

Report RNA-Interferenz6 Zellspezifischer Knock-down von Zielgenen mit „intelligenter siRNA“ Tobias Pöhlmann, Colette Friedrich, Mirko Ludwig, Universität Jena, Gründungsprojekt BianoScience

Blitzlicht Systembiologie10 Komplex und flexibel – die Regulation der kardialen Genexpression

Jenny Schlesinger, Markus Schueler und Silke Sperling, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Blitzlicht Sequenzierung14 Klinisch relevante Mutationsanalyse mittels compact sequencing

Sabine Eisenberger et al., Anagnostics Bioanalysis GmbH, St. Valentin, Austria

Blitzlicht Gene Editing17 Tiermodelle: Zinkfinger-Nukleasen eröffnen neue Horizonte Rainer Ebel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Wissenschaft Biomarker19 Genomsequenzierung von Prostatatumoren

Daniela Wuttig, Holger Sültmann, DKFZ und NCT, Heidelberg

Blitzlicht Kongressreport21 Funktionelle Genomik der nächsten Generation

Robert Wild, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Blitzlicht PCR25 Sicherer Nachweis von Influenza-Subtypen mit real-time qPCR

Burkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Blitzlicht Kongressreport28 Forum Life Science

Philipp Graf, biotechnologie.de

Marktübersicht Zellbasierte Assays32 Identifizierung von Regulatoren der Zellmigration

Dominique Fauvin et al., AMS Biotechnology, Abingdon, UK

35 Labormarkt im Umbruch

40 Karrierewelt: Kein Fachkräftemangel in den Life Sciences

41 Stellenmarkt

46 Verbände

47 Produktwelt

49 Termine

50 Ausblick / Impressum

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Paperwelt Highlight des Monats

4 | 12. Jahrgang | Nr. 2/2011 LABORWELT

Prof. Dr. Stefan Bohlander leitet mit drei Kollegen das Labor für Leukämiediag-nostik. Er ist Sprecher des SFB 684 „Mo-lekulare Mechanismen der normalen und malginen Hämatopoese“ am Klinikum Großhadern. Nach Medizinstudium in Freiburg und sieben Forscherjahren an der University of Chicago im Labor von Prof. Janet D. Rowley mit Spezialgebiet mole-kulare Tumorgenetik arbeitete Bohlander von 1996-2000 in der Humangenetik der Universität Göttingen, wo er sich 1999 habilitierte. Seit Anfang 2001 forscht er am Klinikum der Universität München-Großhadern und ist stellvertretender Leiter der Gruppe „Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie“ am Helmholtz-Zentrum München. Sein wissenschaftlicher Schwerpunkt liegt in der Identifizierung genetischer Läsionen bei Leukämien.

LABORWELT:Was war das Ziel Ihrer Arbeit?

Bohlander:Wir haben mit Hilfe des Next Generation Se-quencing nach Mutationen in den aktiv tran-skribierten Genen einer Patientin mit akuter myeloischer Leukämie (AML) gesucht. AML ist genetisch sehr heterogen. Die ungefähr 50% der AMLs, bei denen man keine chromosomalen Auffälligkeiten findet, werden durch Punktmu-tationen verursacht, die zu mehr als 80% bis 90% unbekannt sind. Auch in den AMLs mit bekannten balancierten Translokationen ist das Mutationsspektum noch nicht genau bekannt. Deshalb haben wir die transkribierten Gene mit Hochdurchsatz-Sequenzierung nach aktivieren-den onkogenen Mutationen durchgemustert. Unsere Überlegung war dabei: Gene, die mutiert sind und durch diese Mutation zu Onkogenen werden, müssen exprimiert werden. Um solche Mutationen zu identifizieren, muss man vom gleichen Patienten ein Transkriptom von Normal-gewebe mit ähnlichem Expressionsmuster wie dem der malignen Zelle sequenzieren. Deshalb haben wir von derselben AML-Patientin RNA aus dem Knochenmark in Remission untersucht. Der Vorteil der Identifikation aktivierender Mutatio-nen besteht darin, dass diese bessere therapeuti-scheTargets sind als Tumorsuppressorgene.

LABORWELT:Das heißt, die Methode ist mit Blick auf die Klinik entwickelt worden?

Bohlander:Es muss betont werden, dass es immer ein sehr langer Weg ist von der Mutationsanalyse zum Verständnis der Krankheit, und noch länger dau-ert, bis eine spezifische Therapie entwickelt ist. Von der Entdeckung des Philadelphia-Chromo-

mindestens den Faktor 20. Das wird auch in einen bezahlbaren Bereich kommen – vielleicht nicht übernächstes Jahr, aber in fünf Jahren. Was man aktuell schon vertreten könnte für insge-samt rund 2.000 Euro, wäre eine Gesamtexom-Sequenzierung, wobei ca. 50 Mbp an Sequenzen gecaptured werden müssen, die auf einer Spur eines Illumina GA-II sequenziert werden können. Die gesamte gesamte konventionelle Diagnostik einer AML kostet im Moment schon zwischen 1.000 und 2.000 Euro, das heißt, wenn das Exom noch dazusequenziert würde, wäre das keine Verzehnfachung, sondern lediglich eine Verdoppelung der Kosten. Das geht schon in den Bereich des Machbaren. Erstattet werden die Kosten des Next Generation Sequencing von den Krankenkassen im Moment noch nicht. Wenn man allerdings bedenkt, dass im Moment die Sanger-Sequenzierung von einem einzigen Gen wie etwa BRCA1 mit bis zu 2.000 Euro erstattet wird und man mit der gleichen Summe schon jetzt alle Gene (ein Exom) sequenzieren kann, wird sich dies wohl bald ändern.

Künftig wollen wir das Next Generation Se-quencing breiter einsetzen und eventuell sogar eine experimentelle Routinediagnostik daraus machen. Da es relativ schwierig ist, mit RNA zu arbeiten, fokussieren wir uns im Moment auf das Exon-Capturing.

mRNAseq eröffnet neue Einblicke in die AMLPhilipp. A. Greif, Sebastian H. Eck, Nikola P. Konstandin, Anna Benet-Pagès, Bianca Ksienzyk, Annika Dufour, Anna T. Vetter, Henning D .Popp, Bettina Lorenz-Depiereux, Thomas Meitinger, Stefan K.Bohlander SK, Tim M. Strom. Identification of recurring tumor-specific somatic mutations in acute myeloid leukemia by transcriptome sequencing, Leukemia doi:10.1038/leu.2011.19

Die RNA-Sequenzierung kann bei der individuellen Verlaufsbeobachtung von Patienten mit der genetisch hochgradig heterogenen akuten myeloischen Leukämie (AML) helfen. Beim Vergleich der somatischen Mutationen im Transkriptom von Blasten aus dem Knochenmark einer AML-Patientin mit der Sequenz von Knochenmarkproben, in denen nach Chemotherapie kein Krebs detektiert wer-den konnte, identifizierten Greif et al. mit Hilfe des Next-Generation-Sequencing fünf nicht-synonyme tumorspezifische somatische Mutationen. Neben bekannten Onkogenen wie RUNX1, fanden die Gruppen vom Klinikum Großhadern und dem Helmholtz-Zentrum München auch bisher unbekannte aktivierende Mutationen, zum Beispiel in TLE4 und SHKBP1. Das Sequenzierungsverfahren eröffnet durch die Identifizierung krebsspezifischer Mutationen die Möglichkeit, Patienten-spezifische MRD (minimal residual disease)-Verfahren zu etablieren und damit schneller Rückfälle zu erkennen.

soms bis zur Zulassung von Imatinib hat es zum Beispiel ganze 40 Jahre gedauert. Der schnellste klinische Tunraround wird sein, dass man mit der Transkriptom-Sequenzierungsmethode Mutationen findet, die sich als MRD-Marker eignen, also als Verlaufsmarker, die mit dem Wie-derauftauchen eines Leukämieklons verbunden sind. Diese Verlaufsbeobachtung wird durch die Identifikation von Mutationen unmittelbar er-leichtert. Da sich für jeden Patienten individuelle Marker identifizieren lassen, handelt es sich hier um eine sehr personalisierte Medizin.

LABORWELT:Was sind Ihre wichtigsten Ergebnisse?

Bohlander:Die Anzahl der Mutationen hält sich in Grenzen. Wir haben fünf gefunden. Das Überraschende war, dass man, wenn man nach missense- oder nonsense-Mutationen sucht, bei AML relativ wenige Mutationen dieser Art findet. Und diese Mutationen haben direkte funktionelle Auswir-kungen. Bei Brustkrebs haben Arbeitsgruppen am Sanger-Center zum Beispiel -zig mutierte Gene gefunden. Bei soliden Tumoren ist es so-mit viel schwieriger, die funktionell relevanten Mutationen zu identifizieren. Allerdings sehen wir in verschiedenen AML-Patienten auch ganz unterschiedliche Mutationen, jeder hat also seine ganz individuelle Leukämie.

LABORWELT:Was heißt das für die Zukunft?

Bohlander:Letztendlich läuft es darauf hinaus, dass man bei jedem Tumor das ganze Genom sequenziert. Im Moment reduziert sich durch die Fokussierung auf ausschließlich aktiv transkribierte Bereiche das erforderliche Sequenzierungvolumen um

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Report RNA-Interferenz

Zellspezifischer Knock-down von Zielgenen mit Intelligenter siRNATobias Pöhlmann, Colette Friedrich, Mirko Ludwig Gründungsprojekt „Intelligente siRNA“, Friedrich-Schiller-Universität Jena

Therapien auf Basis der RNA-Interferenz (RNAi) haben enormes Potential für die Behandlung derzeit nur unbefriedigend oder gar nicht therapierbarer Krankheiten. Allerdings steht die bisher unzureichende Zellspezifität der small interferring RNAs (siRNAs) ihrer breiten therapeutischen Anwendung im Wege. Die von uns entwickelte Technologie der „Intelligenten siRNA“ bietet einen innovativen Lösungsansatz. Dabei werden herkömmliche siRNA-Moleküle mit einem Schlüssel-Schloss-Prinzip ausgestattet. Ausschließlich in den Zielzellen befindet sich der Schlüssel, und die siRNA wird nur dort aktiv. Durch die damit erreichte Zielzellspezifität kann siRNA erstmals auch als reines Toxin für Tumorzellen verwendet werden.

In den Biowissenschaften wird der Mechanis-mus genutzt, um die Expression von Genen und damit die Produktion von Proteinen in der Zelle in vitro und in vivo zu unterdrücken. Besonders im therapeutischen Bereich haben siRNA-Moleküle ein großes Potential. Sie beeinflussen nicht das gesamte Genom und sind sowohl einfach handhabbar, synthetisch herstellbar als auch hocheffektiv. Im Labor konnte bereits gezeigt werden, dass sich Tu-morzellen nach Behandlung mit bestimmten siRNA-Molekülen langsamer teilen und we-niger invasiv wachsen. Dies beflügelt die Er - forschung neuer Therapieformen auf RNAi-Ba-sis und gibt Patienten mit Tumoren, die bisher nicht oder nur unzureichend therapierbar wa-ren, neue Hoffnung. Auch für die Behandlung von Virusinfektionen stellt die Therapie auf siRNA-Basis ein vielversprechendes Konzept dar. Ein gutes Dutzend Firmen arbeitet bereits

Derzeit bauen wir unsere Plattformtechnologie zum zielzellspezifischen Stummschalten von Genen an der Friedrich-Schiller-Universität Jena aus. Die Technologie beruht auf der RNA-Interferenz, kurz RNAi. Unter RNAi versteht man einen Mechanismus in Zellen, mit dem durch Wechselwirkung von kurzen, interferierenden RNA-Molekülen (engl. short interferring RNA: kurz siRNA) mit der mRNA einzelner Gene ein Enzymkomplex aktiviert wird, durch den genau diese mRNA abgebaut wird. Dadurch wird die Expression von Proteinen verhindert, ohne die Erbinformation der Zellen zu beeinflussen. Die US-Wissenschaftler Fire und Mello erhielten für diese Entdeckung 2006 den Nobelpreis für Medizin. Seither ist das Interesse an RNAi ex-plosionsartig gestiegen, denn die Nutzung des Mechanismus in den Biowissenschaften und der Pharmaforschung eröffnet völlig neuartige Anwendungen und Therapieperspektiven.

an der therapeutischen Umsetzung dieser Idee.Allerdings stoßen alle Forschungsbemü-hungen für den therapeutischen Einsatz von siRNA auf das gleiche Problem: siRNA-Molekü-le wirken per se nicht zielzellspezifisch. Daher wurden bereits Strategien zur Modifikation von siRNA-Molekülen entwickelt, die eine Zell-spezifität vermitteln sollen – allerdings bisher mit eher mäßigem Erfolg.

Intelligente siRNA

An diesem Punkt setzt nun die Innovation der „Intelligenten siRNA“ an. Unser Forscherteam verfolgt die neue Strategie, siRNA-Moleküle zunächst zu inhibieren und unter Anwen-dung des Schlüssel-Schloss-Prinzips nach Transporter-vermitteltem Import (Polythey-lenimine oder Nanocarrier) ausschließlich in den Zielzellen aktiv werden zu lassen. Spe-zifische Peptide, die an die siRNA gebunden werden, unterbinden zunächst – ähnlich wie Handschellen – die biologische Aktivität der siRNA. Die gebundenen Peptide enthalten jedoch nahe der Bindungsstelle für siRNAs Zielsequenzen für Peptidasen, die nur in den Zielzellen in aktiver Form vorhanden sind. Diese Peptidasen sind der Schlüssel für die Handschellen, sie spalten die hemmenden Peptide ab und reaktivieren dadurch die siRNA. In Nicht-Zielzellen kommen die spezifischen Peptidasen nicht vor, die „Intelligente siRNA“ verbleibt dort inaktiv (Abb. 1).

Aufgrund der chemischen Struktur der siRNA können bis zu vier verschiedene Pep-tide, spezifisch für vier verschiedene Pepti-dasen, gebunden werden. Hierdurch kann die Spezifität enorm erhöht werden, denn die siRNA wird erst dann aktiv, wenn in den Zielzellen alle vier Peptidasen vorhanden sind. Durch den beschriebenen Mechanismus werden somit an eine herkömmliche siRNA bis zu vier spezifische „Schlösser“ angefügt,

Abb. 1: Mechanismus der „Intelligenten siRNA“. An die intelligenten siRNA-Moleküle ist mindestens ein inhibierendes Peptid gebunden, welches durch ein in den Zielzellen aktives Enzym erkannt und abgespalten werden kann. Diese Abspaltung führt zur Aktivierung der siRNA, wel-che nun die Expression von Genen unterdrücken kann. In Nicht-Zielzellen ist das entsprechende Enzym nicht vorhanden, die Aktivierung der „Intelligenten siRNA“ bleibt dort deshalb aus.

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Report RNA-Interferenz

die durch vier verschiedene „Schlüssel“ (Pep-tidasen) geöffnet werden können.

Wir haben diese peptidgebundene siRNA „Intelligente siRNA“ genannt, da sie zu „wissen“ scheint, in welchen Zellen sie wirken soll – vor allem aber, in welchen Zellen sie nicht zur Wirkung kommen darf. Die damit erreichte Zellspezifität wird dieser Technologie den Weg für die therapeutische Anwendung von siRNA ebnen.

Therapeutische Anwendungsfelder

Besonders attraktiv ist die Technologie zur Behandlung von Tumoren und Virusinfekti-onen. Durch die Möglichkeit, ganz spezifisch bestimmte Zellen mit siRNA beeinflussen zu können, kann siRNA erstmals auch zum the-rapeutisch erwünschten selektiven Abtöten von Zellen benutzt werden. Dazu entwickelt unser Team derzeit eine „Intelligente siRNA“, welche zellspezifisch sogenannte Off-Target-Effekte auslöst und damit die Zielzellen so stresst, dass diese abstirbt. Damit wird siRNA nicht mehr nur zum „Stummschalten“ von Genen, sondern als zellspezifisches Toxin für Tumorzellen verwendet.

Weiteren Wert könnte die „Intelligente siRNA“ bei der Behandlung von Virusinfek-tionen zeigen. Während aktuelle Strategien oft Virus-Protease-Inhibitoren einsetzen und Mutationen der Viren zu Resistenzen gegen das Medikament führen, würde der kombina-torische Einsatz dieser Inhibitoren zusammen

mit „Intelligenter siRNA“ genau die Vermeh-rung dieser „Escape“-Mutationen verhindern (Abb. 2). Dabei würde (1) die entsprechende Virus-eigene Protease

entweder durch den eingesetzten Protease-Inhibitor gehemmt und das Virus kann sich nicht replizieren oder würde

(2) bei einer Escape-Mutation die entsprechen-de Protease wieder aktiv, was dann aber zur Aktivierung einer „Intelligenten siRNA“ führt. Diese aktivierte siRNA tötet dann die Wirts-zelle zusammen mit dem Virus ab. Damit ist ein zweiter Verteidigungswall zur Verhinde-rung dieser Mutationen geschaffen, und die Wirksamkeit etablierter Medikamente kann langfristig erhalten werden. Da die siRNA erst aktiviert wird, wenn Escape-Mutanten gegen den Protease-Inhibitor entstanden sind, wird außerdem die Resistenzbildung gegen die siRNA extrem erschwert.

Ausblick

Wie soll die Entwicklung „Intelligenter siRNA“ weitergehen? Wir möchten die Technologie für zahlreiche weitere Anwendungen etablieren. Zum Einen ist unsere Technologie für den phar-mazeutischen Markt interessant, aber auch Grundlagenwissenschaftler können von der Verwendung „Intelligenter siRNA“ profitieren. Beispielsweise ließen sich bestimmte Gene ganz gezielt in einer Zellpopulation innerhalb eines Zellgemisches ausschalten, beispielswei-se in T-Zellen im Gemisch von Immunzellen.

Hier besteht ein enormes Einsparpotential an Zeit und Kosten. Zum Anderen könnte man in Versuchstieren, beispielsweise Mäusen, or-ganspezifisch Gene ausschalten. Dies ist zwar technologisch auch heute schon möglich, dazu ist aber neben hohen Investitionen und einem hohen Zeitaufwand vor allem eine große An-zahl von Versuchstieren notwendig, um ent-sprechende Mausstämme zu züchten. Durch den Einsatz „Intelligenter siRNA“ ließe sich hier der Einsatz von Versuchstieren drastisch reduzieren. Für die erwähnten Anwendungen entwickeln wir aktuell Kits für den Forschungs-markt, mit denen solche zellspezifische An-wendungen ermöglicht werden.

Für therapeutische Anwendungen wird der-zeit eine „Intelligente siRNA“ entwickelt, die für Mammakarzinom-Zellen spezifisch ist. Erste in vivo-Studien zeigten eine hohe Wirksamkeit und eine gute Verträglichkeit der „Intelligenten siRNA“-Moleküle. Für die nächsten Schritte – die abschließende Kandidatenfindung und die Durchführung präklinischer Studien – wurde eine Förderung im Rahmen des GoBio-Program-mes des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) beantragt; für die Kommerzi-alisierung der Technologie auf dem Forschungs-markt ist die Gründung der Firma „BianoScience“ (www.Biano Science.com) im Mai diesen Jahres geplant. Die derzeitigen Entwicklungen wurden durch das EXIST-Forschungstransfer-Programm des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie (BMWi) unterstützt und im Rahmen eines Gründungsprojektes durchgeführt. Wir haben unsere Forschungstätigkeiten bereits frühzeitig auf eine Vermarktung der Resultate ausgerichtet. Dies ist auch ein Grund dafür, weshalb bereits sechs Patente angemeldet wurden, eines davon ist in der EU bereits erteilt. Ein Businessplan und eine Marktstrategie für die Kommerzialisierung der Technologie sind bereits erstellt. Bei den therapeutischen Anwendun-gen der Technologie wird auch der Kontakt zu Pharmaunternehmen notwendig, die zum einen die Kompetenzen zur Durchführung von klini-schen Studien und die benötigten finanziellen Ressourcen mitbringen, zum anderen aber auch über Marktzugänge verfügen und in der Lage sind, entsprechende Produkte Ärzten und Pati-enten zugänglich zu machen. Unsere Vision ist, dass sich „Intelligente siRNA“ im Pharmamarkt und im grundlagenwissenschaftlichen Markt zu einer Schlüsseltechnologie entwickelt.

Korrespondenzadresse

Dr. Tobias PöhlmannGründungsprojekt „Intelligente siRNA“Universitätsklinikum JenaFriedrich-Schiller-Universität JenaKahlaische Straße 107743 JenaTel./ Fax: +49-(0)3641-930850/-930852Tobias.Poehlmann@Intelligent-siRNA.comwww.intelligent-sirna.com

Abb. 2: Konzept für die Anwendung „Intelligenter siRNA“ zur Bekämpfung von Virus-Infekti-onen und zur Verhinderung von Escape-Mutationen. Eine „Intelligente siRNA“, welche durch eine viruseigene Protease aktiviert wird, soll in Kombination mit einem etablier-ten Proteaseinhibitor verabreicht werden, der die Replikation des Virus unterbindet. Im Falle des Auftretens von Escape-Mutationen hemmt der Inhibitor nicht mehr wirk-sam die Protease, und eine Virusreplikation kann wieder stattfinden. In diesem Fall wird aber zeitgleich eine „Intelligente siRNA“ durch genau diese Protease aktiviert und tötet die Wirtszelle zusammen mit dem Virus ab. Dies erschwert das Entstehen von Escape-Mutanten und deren Vermehrung.

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Blitzlicht Systembiologie

Komplex und flexibel – die Regulation der kardialen GenexpressionJenny Schlesinger, Markus Schueler und Prof. Dr. Silke R. Sperling; AG Kardiovaskuläre Genetik, Abt. zur Analyse des Vertebratengenoms, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Im Verlauf der embryonalen Entwicklung entsteht das Herz als erstes funktionsfähiges Organ. Damit dies fehlerfrei abläuft, müssen zahlreiche DNA-Transkriptionsfaktoren zum richtigen Zeitpunkt die richtigen Gene an- und abschalten können. Dieser Prozess ist sehr komplex und lässt sich als Transkriptionsnetzwerk zusammenfassen. Die vier DNA-Tran-skriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf spielen speziell für die Herzentwicklung eine enorm wichtige Rolle1-4. Die Fähigkeit dieser Faktoren, an die DNA zu binden, ist dabei stark von der Zugänglichkeit des Chromatins abhängig. Epigenetische Mechanismen, wie die posttranslationalen Modifikationen von Histonen – kleine basische Proteine, um die die DNA gewickelt ist – beeinflussen diese Zugänglichkeit, indem sie die Struktur des Chromatins verändern und selbst Bindestellen für regulierende Transkriptionsfaktoren bereitstellen5. Damit das Transkriptionsprodukt, die Proteine, im korrekten Mengenverhältnis vorliegen, bedarf es eines gewissen Maßes an Fine-Tuning in der Zelle. In den vergangenen Jahren stellte sich heraus, dass microRNAs einen Teil dieser Aufgabe übernehmen. Diese kleinen, etwa 21 Basenpaar langen intrazellulären einzelsträngigen RNA-Moleküle regulieren die Transkriptionsmaschinerie, indem sie entweder die mRNA abbauen oder deren Transla-tion verhindern6. Viele bisherige Studien untersuchten die verschiedenen Mechanismen zur Regulation der Transkription im Detail; doch nur wenig ist darüber bekannt, wie stark diese Mechanismen zusammenarbeiten. Das Ziel unserer Arbeit7 war es, herauszufinden, wie die verschiedenen genetischen, epigenetischen und posttranskriptionellen Ebenen der herzspezifischen Genregulation miteinander verknüpft sind.

besitzen8-9. Jedoch war bisher unklar, wie oft solch eine gemeinsame Regulation von Zielgenen stattfindet. Unsere Untersuchung von gemeinsamen DNA-Bindestellen ergab, dass Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf sehr oft an ein- und dieselben Zielgene binden (Abb. 1). Allein 91 Zielgene werden von allen vier Transkriptionsfaktoren gebunden. Dies deutet darauf hin, dass bei der Regulation von Herz- und Muskelgenen ein komplexes Zusammenspiel der Transkriptionsfaktoren stattfindet.

Die Bindung eines Transkriptionsfaktors an ein Zielgen lässt jedoch noch keine Rück-schlüsse über dessen Einfluss und vor allem die Art der funktionellen Regulation zu, also ob ein Gen an- oder abgeschaltet wird. Aus diesem Grund untersuchten wir im nächsten Schritt die funktionellen Konsequenzen des Knock-downs der einzelnen Transkriptions-faktoren mittels siRNA-Technik, die zu einer signifikanten Reduktion der Expression auch auf Proteinebene führte. Die daraus resul-tierenden Effekte auf mRNA-Ebene wurden mit genomweiten Expressions-Arrays ge-messen. Im Einklang mit einer überwiegend aktivierenden Funktion der untersuchten Transkriptionsfaktoren waren die meisten der deregulierten Gene inhibiert. Wie schon bei der Untersuchung von gemeinsamen DNA-Bindestellen stellte sich heraus, dass alle vier Transkriptionsfaktoren sich einen großen Teil der deregulierten Gene teilen. Interessanterweise waren genau die Gene, die von mehreren Transkriptionsfaktoren gebunden wurden, am seltensten im jewei-ligen Knock-down dereguliert. Dies gibt uns einen Hinweis auf einen Puffereffekt durch kombinatorische Bindung an Zielgene. Dabei können Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf die Gen expression auch beim Abhandenkom-

Im ersten Schritt untersuchten wir direkte Zielgene der herzspezifischen Transkriptions-faktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf in der Herzmuskelzelllinie HL-1 mittels Chromatin-Immunopräzipitation und anschließender Array-Analyse (ChIP-chip). Dabei konnten mehrere hundert DNA-Bindestellen für jeden Transkriptionsfaktor identifiziert werden,

die überwiegend in regulatorischen Berei-chen herz- und muskelspezifischer Gene liegen. Allein Srf bindet an mehr als 1.300 verschiedenen Stellen der DNA und kann die Ableserate von mehr als 1.000 Genen beein-flussen. Es ist bekannt, dass Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf miteinander interagieren kön-nen und auch gemeinsam regulierte Gene

Abb. 1: Die Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf besitzen zu-sammen 1.600 Zielgene, von denen 498 Zielgene (30%) gemeinsam durch zwei oder mehrere der unter-suchten Faktoren reguliert werden.

Abb. 2: Die Expression von Gata4- und Srf-Zielgenen korreliert mit H3ac. A. ChIP-chip-identi-fizierte DNA-Bindestellen der vier Transkriptionsfaktoren wurden in zwei Kategorien eingeteilt: Zielgene mit (+) und ohne (–) zusätzlicher H3ac. Im Gegensatz zu Mef2a- und Nkx2.5 ist die Expression von Gata4- und Srf-Zielgenen nur bei zusätzlicher H3ac signifikant erhöht. B. Vergleichbare Resultate für Srf erhielten wir mit ChIP-seq (links), wobei im Knock-down von Srf (rechts) Zielgene mit zusätzlicher H3ac weniger stark herunterreguliert waren. Signifikanz p=0.001 (***), p=0.01 (**) und p=0.05 (*). www.laborwelt.de

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Sequencing

























Sequencing

























Blitzlicht Systembiologie

men oder Ausfall eines einzelnen Transkrip-tionsfaktors weiter aufrechterhalten. Für diesen Puffereffekt durch kombinatorische Bindung spricht zudem, dass nur ein geringer Teil der direkten Zielgene (ca. 10%) auch im jeweiligen Knock-down der Transkriptions-faktoren dereguliert war. Hinzu kommt, dass Transkriptionsfaktoren, die viele gemeinsa-me Zielgene besitzen, nur eine geringe Men-ge an gemeinsamen deregulierten Genen aufwiesen und umgekehrt.

Epigenetische Regulation

Um besser zu verstehen, inwieweit epi-genetische Regulationsmechanismen für die Genak tivität im Herzen eine Rolle spielen, untersuchten wir den Einfluss von vier aktivierenden Histon-Modifikationen: der Histon H3-Acetylierung (H3ac), Histon H4-Acetylierung (H4ac), Histon H3-Lysin 4-Dimethylierung (H3K4me2) und der Histon H3-Lysin 4-Trimethylierung (H3K4me3).

Durch erneute ChIP-chip-Experimente wur-de das gemeinsame Auftreten dieser Histon-Modifikationen und Transkriptionsfaktor-Bindestellen an Zielgenen analysiert. Mehr als 80% der identifizierten Transkriptionsfaktor-Bindestellen zeigten eine oder mehrere dieser Histon-Modifikationen. Schließlich untersuch-ten wir, ob das Auftreten von Histon-Modifi-kationen auch mit einer höheren Expression von direkten Zielgenen korreliert. Dabei zeigte sich, dass das aktivierende Potential von Gata4 und Srf auf die Expression ihrer Zielgene vom gleichzeitigen Auftreten von H3ac abhängt

Abb. 3: Indirekte Regulation durch miRNAs. A. Es konnten 42 differenziell exprimierte miRNAs im Srf-Knock-down quantifiziert werden, wovon 78% herunterreguliert waren. miRNA -Bindestellenvorhersagen identifizierten 192 potentielle miRNA-Zielgene, wovon wiederum im Knock-down 57% hochreguliert waren. B. Nur weni-ge differenziell exprimierte Gene im Knock-down werden direkt von Srf gebunden. Jedoch können 45% durch den Einfluss von differenziell exprimierten miRNAs erklärt werden.

(Abb. 2a). Für Mef2a und Nkx2.5 konnte dieser Zusammenhang nicht gezeigt werden; ihre Zielgene sind unabhängig von einer Acety-lierung von Histon 3 höher exprimiert als ungebundene Gene.

Weitergehende ChIP-Experimente mit an-schließender Next-Generation-Sequenzierung (ChIP-seq) für Srf und H3ac untermauerten die Ergebnisse und deuteten darüber hinaus einen Puffereffekt der H3ac auf die Expressi-on von Srf-Zielgenen in dessen Knock-down an (Abb. 2b). Zur Bestätigung dieser Ergeb-nisse aus der Herzzelllinie, führten wir eine Zeitreihen analyse in Mäuse herzen verschie-dener Entwicklungsstadien durch. Zusam-mengenommen zeigten unsere Ergebnisse den Einfluss des Zusammenspiels von H3ac und Srf auf die Genexpression während der Herzentwicklung.

Posttranskriptionale Regulation

Abschließend wurde der Einfluss von micro-RNAs (miRNAs) als indirekte posttranskrip-tionelle Regulationsebene von kardialen Transkriptionsnetzwerken untersucht. Es ist bekannt, dass Srf für die Regulation von herz-spezifischen miRNAs verantwortlich ist und auch selbst durch miRNAs reguliert wird10. Mit Hilfe unserer Daten identifizierten wir 22 miRNAs mit einer Srf-Bindestelle, darunter viele bereits bekannte Srf-regulierte mi RNAs, wie miR-1 und miR-13310. Quantitative Sequen-zierung von miRNAs (small RNA-seq) nach siRNA-vermitteltem Knock-down von Srf, ergab 42 differenziell exprimierte mi RNAs,

von denen 78% herunterreguliert waren (Abb. 3a). Durch miRNA-Bindestellenvorhersage in 3’UTR-Bereichen konnten 192 miRNA-Zielgene identifiziert werden, wovon 57% im Knock-down von Srf hochreguliert waren. Wie anfangs erwähnt, ist nur ein kleiner Teil von direkt gebunden Zielgenen auch gleichzeitig im Srf-Knock-down differenziell exprimiert. Unsere Untersuchung hinsichtlich des Ein-flusses von miRNAs ergab, dass bis zu 45% aller differenziell exprimiertenGene durch miRNAs erklärt werden können (Abb. 3b). Sie sind damit vielversprechende Kandidaten für die Regulation von indirekten Zielgenen.

Fazit

Unsere Analysen der Regulation kardialer Transkriptionsnetzwerke ergaben ein hohes Maß an Komplexität und Flexibilität, wobei die verschiedenen genetischen, epigenti-schen und post-transkriptionellen Regulati-onsebenen vielfach miteinander verknüpft sind und wechselwirken. Damit erweitern unsere Daten das Wissen über Genexpres-sionsregulation im Herzen und tragen ein weiteres Puzzleteil zum Verständnis gene-tisch bedingter Herzerkrankungen, wie zum Beispiel angeborene Herzfehler, bei.

Literatur

[1] Molkentin, J.D., Lin, Q., Duncan, S.A. & Olson, E.N. (1997). Genes Dev 11: 1061-1072.

[2] Lyons, I., Parsons, L.M., Hartley, L. et al. (1995). Genes Dev 9: 1654-1666.

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[4] Niu, Z., Yu, W., Zhang, S.X. et al. (2005). The Journal of biologi-cal chemistry 280: 32531-32538.

[5] Kouzarides, T. (2007). Cell 128: 693-705.[6] Sevignani, C., Calin, G.A., Siracusa, L.D. & Croce, C.M. (2006).

Mamm Genome 17: 189-202.[7] Schlesinger, J., Schueler, M., Grunert, M. et al. (2011). PLoS

Genet 7: e1001313.[8] Clark, K.L., Yutzey, K.E. & Benson, D.W. (2006). Annual Review

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tics 107: 252-268.[10] Chen, J.F., Mandel, E.M., Thomson, J.M. et al. (2006). Nat

Genet 38: 228-233.

Diese Arbeit wurde finanziert durch das Euro-pean Community’s Sixth Framework Program (‘‘HeartRepair’’) LSHM-CT-2005-018630 und durch das Seven Framework Program (‘‘Cardi-oGeNet’’) 2009-223463.


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LABORWELT

Klinisch relevante Mutationsanalyse mittels compact sequencing Dr. Sabine Eisenberger, Dr. Bernhard Ronacher, Anagnostics Bioanalyis GmbH, St. Valentin, Österreich

Darm- und Lungenkrebs sowie das Pankreaskarzinom führen die Liste der krebsbedingten Todes-fälle sowohl bei männlichen als auch weiblichen Krebspatienten in Europa und in den Vereinigten Staaten an1-2. Ein gemeinsames Merkmal sind die häufig auftretenden Mutationen des KRAS-Gens (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)3. Das KRAS-Gen kodiert eine kleine GTPase, die verantwortlich für die Transduktion mitogener Signale ist, ausgelöst durch extrazelluläre Sub-stanzen wie Wachstumshormone, Zytokine und Hormone. Somatische Punktmutationen führen zu konstitutiver Proteinaktivität und zu onkogenem Potential. Mit der Medikamentenzulassung therapeutischer Antikörper wie Erbitux® und Vectibix® haben die Zulassungsbehörden erstmals ein molekulardiagnostisches Verfahren zur Bestimmung des KRAS-Mutationsstatus mit einer Therapie verbunden, um jene Patienten zu identifizieren, die von einer Anti-EGFR-Behandlung profitieren4.5. Die zunehmende Bedeutung der Diagnostik von Punktmutationen in der klinischen Praxis hat das derzeit rege Interesse an Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation (next generation sequencing) zur Folge. Aus Sicht von Anagnostics sind diese Technologien aber für den Routineeinsatz zu komplex und aufwändig und hinsichtlich der Aussagen zu wenig auf die therapeutische Konsequenz fokussiert. Mit compact sequencing hat Anagnostics eine auf die klinische Routine abgestimmte Technologie entwickelt.

die Grundsätze dieser Technologie beschrieben, bevor auf die Methode des compact sequencing und den KRAS-Test eingegangen wird.

Die Basis – multiplexe hybcell Technologie

Anagnostics‘ patentierte hybcell-Technologie beruht auf dem Microarray-Prinzip, der Detekti-on von molekularen Interaktionen. Ausgewählte Detektormoleküle werden auf einer Oberfläche immobilisiert – im einfachsten Fall auf einem Objektträger. Diese Detektormoleküle interagie-ren mit den dazu passenden Molekülen aus der Probe. Ein Lesegerät macht die Ergebnisse dieser Interaktionen sichtbar. Die Auswertung des Detektionsvorgangs durch eine Software erlaubt Rückschlüsse auf die ursprüngliche Zusammensetzung der Probe (Krankheitserre-ger, genetische Merkmale, Immunstatus etc.). Microarrays werden seit den frühen 90er Jahren in der Forschung eingesetzt. Sie analysieren simultan bis zu mehrere tausend verschiedene Merkmale in einer Probe.

Im Gegensatz zu herkömmlichen flachen Microarrays verwendet die patentierte hybcell Technologie zwei konzentrische Zylinder, wobei die Detektormoleküle auf der äußeren Man-telfläche des inneren Zylinders platziert sind (Abb. 1). Dieser innere Zylinder befindet sich in einem transparenten Gefäß (zweiter Zylinder). Beide Zylinder formen gemeinsam mit einer Haltevorrichtung die hybcell. In dieser Form

Das Ziel von compact sequencing und dem ersten klinischen Produkt – dem KRAS-Test – ist es, eine hochempfindliche und selektive Mutationsdiagnostik zur Verfügung zu stellen. Gleichzeitig sollte die Komplexität und „Hands-on-Time“ im Vergleich zu anderen Testmetho-den bedeutend reduziert werden. Ein weiterer Aspekt ist die Bereitstellung eindeutiger Ergeb-nisse in Form eines automatisch generierten Testberichtes unter Vermeidung zeitraubender Datenanalysen, die zudem spezielles Know-how und/oder Erfahrung des Bedienpersonals erfordern.

Da die Technologie auf Anagnostics‘ proprie-tärer hybcell-Technologie basiert, werden zuerst

Abb. 1: Innerer Zylinder der hybcell mit ge-spotteten Substanzen (Original ca. 2 x 1 cm) und komplette hybcell.

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Blitzlicht Sequenzierung

Abb. 3: Funktionsprinzip der compact sequencing-Technologie

ist die hybcell das weltweit erste zylindrische Microarray (Abb. 1).

Bei den Vorbereitungen zur Messung wird zunächst die flüssige Probe durch einen zent-ralen Kanal von oben in die hybcell eingebracht. Die Probe sinkt auf den Boden, ohne dabei eine Reaktion auszulösen. Die hybcell wird mit einem gummiartigen Deckel verschlossen und dem Analysegerät (hyborg) übergeben.

Der hyborg (Abb. 2) übernimmt von diesem Zeitpunkt an alle notwendigen Prozesse vollau-tomatisch. Dies gewährleistet eine hohe Repro-duzierbarkeit und durchgängige elektronische Dokumentation. Die hybcells werden zunächst aus einem Rack (beinhaltet 8 hybcells) in das

Innere des Gerätes gebracht. Erst mit dem voll-ständigen Absetzen des inneren Zylinders durch den hyborg wird ein Reaktionsraum (Ringspalt) zwischen den beiden konzentrischen Zylindern erzeugt, der sich mit der am Boden befindlichen Probe füllt. Der innere Zylinder wird nun relativ zum äußeren Zylinder (der fixiert ist) in Rotation versetzt. Dadurch wird die Probe in Bewegung versetzt und durchmischt. Von diesem defi-nierten Zeitpunkt an findet die Interaktion zwischen Detektor- und Probenmolekülen statt. Zur Auswertung der Interaktionen wird die Oberfläche des inneren Zylinders mit Hilfe eines Fluoreszenz-Lesegerätes bei konstanter Rotation gescannt. Dieser Vorgang kann be-

Abb. 2: hyborg System mit hybcell-Test Kit und hybcells. Das hyborg-System automatisiert Probenwechsel, Inkubation, Thermocycling (Primer Extension), Waschschritte sowie Detektion und Auswertung.

liebig oft wiederholt werden, was kinetische Messungen ermöglicht.

Die generellen technischen Vorteile des zy-lindrischen Formats liegen in der: | Reproduzierbarkeit durch Homogenisierung

der Probe: Die Rotation des Zylinders und die dabei auftretenden Scherkräfte führen zu einer konstanten Durchmischung der Probe. Ungleichmäßige Temperatur- oder Konzen-trationsverteilungen werden ausgeglichen und eine homogene Flüssigkeit erzeugt. Unerwünschte Schwankungen innerhalb der einzelnen Messpunkte eines Microarrays und zwischen aufeinanderfolgenden Microarrays (Tests) werden minimiert. Interferenzen wie Luftblasen oder Partikel beeinflussen die Messung nicht, da diese durch die Rotation in Bereiche transportiert werden, die bei der Messung nicht berücksichtigt werden.| Drastische Verkürzung der Prozesszeiten:

Gleichzeitig wird durch die Rotation die Pro-benflüssigkeit aktiv über die Oberfläche mit den Detektormolekülen geführt. Die aktive

Aminosäure Basenänderung

Gly12Ala GGT>GCT

Gly12Val GGT>GTT

Gly12Asp GGT>GAT

Gly12Arg GGT>CGT

Gly12Cys GGT>TGT

Gly12Ser GGT>AGT

Gly13Asp GGC>GAC

Tab. 1: Nachweis der aktivierenden Mutationen.

Diffusion reduziert die Hybridisierungszeit (Interaktion der Moleküle) auf einen Bruch-teil (Faktor 10 bis 100). Die Testdauer wird so von mehreren Stunden auf wenige Minuten reduziert.| Einfachste Handhabung durch Integration

und Automation: Der Zeitaufwand des Bedie-ners für eine hybcell (Probe) beschränkt sich auf etwa eine Minute. Da es sich beim hyborg um ein vollintegriertes und automatisiertes Gerät handelt, ist die Bedienung in der Regel auf das Einfüllen der Probe in die hybcell und das Einlesen des Barcodes beschränkt.

Das Prinzip – compact sequencing

Die compact sequencing-Technologie erlaubt eine schnelle und einfache Detektion von Punktmutationen in bestimmten ausgewähl-ten Genen. Eine Analyse ist ausgehend von extrahierter DNA in weniger als drei Stunden abgeschlossen. Das Ergebnis wird in einem eindeutigen Report automatisch erstellt. Die prozentuellen Anteile der jeweiligen Mutation werden tabellarisch ausgegeben. Prinzipiell handelt es sich um einen zweistufigen Prozess.


LABORWEL

Zunächst wird der ausgewählte DNA-Abschnitt in einer vorgeschalteten PCR-Reaktion amplifiziert und gleichzeitig einer der beiden DNA-Stränge mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Anregung 635nm) markiert. Die quali-tative und semi-quantitative Analyse erfolgt in einem zweiten Schritt in der hybcell (Abb. 3). Die Amplifikate binden an immobilisierte Primer, die mittels Polymerase hochspezifisch verlängert werden (Primer Extension). Diese fluoreszierenden Amplifikate bleiben aufgrund der verlängerten Primer auch bei hohen Temperaturen assoziiert. Amplifikate, die nicht verlängert wurden, werden beim nachfolgenden Reinigungsschritt weggewaschen. Damit ergibt sich ein mutations spezifisches Fluoreszenz-Signal, das durch den hyborg (Gerät) ausgelesen und ausgewertet wird.

Der Test – hybcell Onco plexA (KRAS)

Der Test dient dem Nachweis aktivierender Mutationen in Codon 12 und 13 des humanen KRAS-Gens (Tab. 1). Als Probe wird genomische DNA aus frisch gewonnenen, eingefrorenen oder in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) humanen Geweben verwendet. Dabei können zwischen 50 und 500 ng DNA eingesetzt werden. In diesem Arbeitsbereich können weniger als ein Prozent an mutierter DNA mit einer Punktmutation im Codon 12/13 des KRAS-Gens im Vergleich zur Wildtyp DNA nachgewiesen werden. Nach der Primer Extension werden die Fluoreszenzsignale der einzelnen Spots gemessen. Anhand der Rela-tion der Signalintensitäten aller Kriterien einer Gruppe (Wildtyp-Sequenz und drei zugehörige Mutanten-Sequenzen) werden die vorliegenden Mengenanteile bestimmt. Wildtyp-DNA-Menge und DNA-Menge der Mutante werden zueinander ins Verhältnis gesetzt und der prozentuelle Wert der Mutante angegeben.

Der Test beinhaltet mehrere Kontrollen. Die DNA Quality Control prüft, ob das humane Gen für HBD (Hämoglobin delta) in ausreichender Kopien-zahl und Qualität in der Probe enthalten war. Fällt diese Kontrolle negativ aus, ist die Probe von unzureichender Qualität. Die Primer Extension Control zeigt, ob die Primer Extension auf der hybcell funktioniert hat. Daneben sichern interne Kontrollen die Funktion und ordnungsgemäße Produktion der hybcell.

Ausblick – Erweiterung des Testspektrums

Mit der compact sequencing-Technologie und dem hybcell Onco plexA- Test ist eine sehr empfindliche, schnelle, einfache und kostengünstige Methode der Detektion von KRAS-Mutationen verfügbar. Damit bietet sich eine Alternative zu Methoden wie der Real-time PCR oder zu anderen Se-quenziermethoden. Die Stärken der Technologie liegen in der kompakten Abarbeitung, dem sensitiven Nachweis und den Erweiterungsmöglichkei-ten (Microarray-Prinzip) bei gleichem Aufbau. Daher ist eine erweiterte Version des Tests (KRAS Codon 61,146 und BRAF-Mutation) bereits für Tester verfügbar und die Analyse weiterer relevanter Mutationen für die Onkologie und genetische Testung in Entwicklung.

Literatur

[1] American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2010. Atlanta: American Cancer Society; 2010.[2] http://eu-cancer.iarc.fr/country-930--european-union-27.html,en[3] Riely, G., Ladanyi, M., J.Mol. Diagn.10 (2008), 493-495. [4] Karapetis, C.S. et al. New England J. Med. 359 (2008), 1757-1765.[5] Amado, R.G. et al., J. Clin. Oncol. 26 /2008), 1626-1634


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Blitzlicht Gene Editing

ZFNs: neuer Weg für das Gene Editing und für das Design von TiermodellenDr. Rainer Ebel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen

Einer wachsenden Flut von Sequenzierungsdaten steht ein akuter Mangel an Tools für die Funktionsvalidierung putativer Gene, regulatorischer ncRNAs, SNPs etc. gegenüber. Mit Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) steht Wissenschaftlern jetzt ein Werkzeug zur Verfügung, das das gezielte Ausschalten oder Verändern jedes humanen Gens und seiner regulatorischen Bereiche, das Generieren von Tiermodellen verschiedenster Spezies mit definierten Knock-ins und Knock-outs sowie das ortsspezifische Einschleusen humaner Gene in das Modell gestattet. Aufgrund der Schnelligkeit, Effizienz und Selektivität des Gene Editing mit ZFNs bietet das Verfahren vielfältige Anwendungen. Neben der Optimierung von Produktionszelllinien und der Targetvalidierung eröffnen predesignte ZFNs für jedes proteincodierende humane Gen zahlreiche Möglichkeiten in der Grundlagenforschung.

zieltes Verbinden mehrerer Zinkfinger entsteht ein DNA-bindendes Zinkfingerprotein, dessen Spezifität durch die Anzahl der Zinkfingerpep-tide bestimmt wird. So können zum Beispiel vier Zinkfinger zu einem Zinkfingerprotein zusammengebaut werden, das eine definierte Gensequenz von 12 Basen erkennt.

Durch Kopplung eines solchen genspezifi-schen Zinkfingerproteins an die katalytische Domäne der Fok1-Endonuklease, der ihre native Bindedomäne fehlt, entsteht eine Zinkfinger-Nuklease (ZFN). Da Fok1 nur schneidet, wenn es als Dimer an die doppelsträngige DNA bindet, müssen Zinkfinger-Nukleasen immer als Paar entworfen werden. Dies gewährleistet, dass das Restriktionsenzym einen doppelsträngigen Strangbruch bewirkt (Abb. 1).

Die von den Zinkfinger-Nukleasen be-wirkten Doppelstrangbrüche können durch

Genspezifische Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) als Werkzeug für das gezielte Genomeditieren sind erst seit kurzem verfügbar. Gleichwohl werden sie breit angenommen1-9. Zahlreiche Publikationen zur Erzeugung transgener Ratten, Zebrafische, Kaninchen, Schweine, Borstenwürmer und Seidenraupen sind derzeit in Vorbereitung.

ZFNs: Flexible Tools für das gezielte Gene Editing

Zinkfinger-Nukleasen bestehen aus einer hochspezifischen DNA-Bindedomäne und der katalytischen Domäne einer Restriktionsendo-nuklease. Die DNA-Bindedomäne besteht aus Zinkfingerpeptiden, die jeweils ein definiertes Basentriplett auf der DNA binden. Durch ge-

„nonhomologous end joining“ (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) repariert werden. Bei der NHEJ treten häufig Fehler an der Bruchstelle auf, wie etwa Deletionen und/oder Insertionen von wenigen bis sehr vielen Basen. Diese ziehen oft eine Verschie-bung des Leserahmens und damit einen Knock-out des entsprechenden Proteins nach sich (Abb. 1).

Der zweite Reparaturmechanismus, mit dem ein Doppelstrangbruch repariert wird, ist die homologe Rekombination. Cotransfi-ziert man die Zinkfinger-Nuklease mit einem Donorvektor, der homologe Sequenzen zur Zinkfinger-Nuklease-Bindestelle aufweist, so eröffnet dies den präzisen Austausch von Genen sowie die gezielte Insertion oder eine Deletion von Genen (Abb. 1).

Zinkfinger-Nukleasen ermöglichen die ge-zielte und schnelle Modifikation von Genen. Im Bereich um den ZFN-vermittelten Doppel-strangbruch ist die Rate der DNA-Reparatur um mehrere Größenordnungen erhöht (auf bis zu 10-2). Dieser hohe Anstieg der Effektivität ermöglicht das direkte Screening von klonalen Zellen auf Mutationen, ohne dass Selektions-marker eingesetzt werden müssen.

Predesigned ZNFs: Gezielter Knockout jedes humanen Gens

Zinkfinger-Nukleasen ermöglichen den schnel-len und effizienten Knock-out definierter Gene. Sie wurden beispielsweise verwendet, um das pro-apoptotische Bcl-2–assoziierte X-Protein (BAX)1 oder die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) in CHO-Zellen auszuschalten2. BAX ist in diesen Zellen haploid, DHFR diploid vertre-ten. Der komplette Knock-out wurde mittels NHEJ erzielt und hatte Frequenzen von mehr als 1%. Somit konnte selektionsmarkerfrei gearbeitet werden. Auch war ein Knock-out von drei verschiedenen Genen in CHO-Zellen mit drei verschiedenen Zinkfinger-Nukleasen möglich3.

Auch Polypoidie stellt keine Hürde für Zinkfinger-Nukleasen dar. Wissenschaft-lern von Sigma-Aldrich ist es gelungen, das in der humanen Bronchialkarzinomlinie A549 tetraploid vertretene BAX-Gen mittels Zinkfinger-Nukleasen auszuknocken. Durch nur eine Transfektion der ZFN-mRNA gegen BAX wurden bei 8% aller untersuchten Zellen Mutationen in mindestens einem Allel des BAX-Gens erreicht. Einige Zellen wiesen auch auf allen vier Allelen Frameshift-relevante Knock-out-Mutationen auf.

Ganz neue Möglichkeiten, die hohe Knock-out-Effizienz der ZFNs zu nutzen, bieten sich durch eine neue „humane ready-to-use Knock-out ZFN Library“ von Sigma Aldrich. Mit derzeit lancierten Bibliothek stehen Wissenschaft-lern ab sofort vordesignte und -validierte Zinkfinger-Nukleasen gegen jedes kodierende humane Gen zur Verfügung.

Abb. 1: Die ZFN-vermittelte Genomeditierung findet im Zellkern statt. Hierzu muss ein Paar der genspezifischen Zinkfinger-Nukleasen in die Zelle transfiziert oder injiziert werden. Der Knock-out wird dann durch non-homologous end joining bzw. der Knock-in durch homologe Rekombination unter Cotransfektion eines Donor konstruktes erreicht.

b)

a)

break

FOKI FokI

FokI

a)

ZFN Pair Delivered into Cell byTransfection orElectroporation

d)

b)

c)

FokI

FokI

OR

d) GOI

c) �

Nucleus

ZFN Pair Makes Double Strand Break and dissociates from DNA

REPAIR TEMPLATE co-transfected with ZFN Pair:1-20% of cells contain Gene Integration in Target Site.

Cellular Process Used: Homologous Recombination

NO REPAIR TEMPLATE co-transfected with ZFN Pair: 1-20% of cells are mis-repaired resulting in a Gene Deletion.

Cellular Process Used: Non-Homologous End Joining

ZFN Pair Recognizes and Heterodimerizes around Target Site

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Blitzlicht Gene Editing

Knock-out-Tiere: Beyond the mouse model

Zinkfinger-Nukleasen sind derzeit im Begriff, die Herstellung von Knock-out-Tieren zu revolutionieren. Denn die neue Technologie überwindet die bisherige Beschränkung auf das Modellsystem Maus, dauert nur Wochen und eröffnet durch Einbringen humaner Gene zudem die Humanisierung der Modelle. Neben der routinemäßigen Erzeugung von Knock-out-Ratten sowie von Knock-out-Kaninchen oder -Zebrafischen berichten Kunden bereits von Anwendungen bei Nutztieren wie Schafen, Kühne, Ziegen und Hühnern. Das Erzeugen einer Knockout-Ratte ist denkbar einfach. Die mRNA einer Zinkfinger-Nuklease gegen ein interessierendes Gen wird in den Pronukleus von Einzelzell-Embryonen injiziert, und diese in Muttertiere implantiert. Bis zu 20% aller geborenen Ratten zeigen eine Mu-tation im Zielgen auf mindestens einem Allel4. Sämtliche geborenen Tiere sind nicht chimär. Entsprechend können Knock-out-Tiere mit der Zinkfinger-Nuklease-Technik in wenigen Wochen generiert werden. Die Herstellung von Knock-out-Mäusen mittels ZFN gelingt innerhalb von nur zehn Wochen.

Der ZFN-vermittelte Knock-out erfordert keine Etablierung einer ES-Zellkultur. Die Isolie-rung der Einzelzell-Embryonen, die pronukleäre Mikroinjektion sowie die Implantation der Em-bryonen sollten jedoch gut etabliert sein.

Gezielte Gen-Integration mittels Zinkfinger-Nukleasen

Durch ZFN-vermittelte Gen-Integration besteht die Möglichkeit, ein Transgen in eine definierte Genomsequenz zu integrieren. Diese Option ermöglicht völlig neue Ansatzpunkte zur ge-nauen Analyse von Genen. So können Gene endogen getaggt werden, ganze Promotoren oder regulatorische Elemente verändert, komplett ausgetauscht oder komplett neue Splicevarianten des Gens generiert werden.

Ebenso lassen sich tierische Zellen durch ge-zielte Integration eines humanen Gens in den Lokus des korrespondierenden tierischen Gens schnell und einfach humanisieren. Eine kleine Auswahl der Möglichkeiten ist in Abbildung 2 dargestellt.

Die Effizienzen der ZFN-vermittelten Gen-Integration sind sehr hoch. So konnten gezielt Gene mit einer Länge von 8 kb und einer Effizi-enz von annähernd 10% integriert werden. Die Länge der homologen Arme des Donorvektors war in diesem Falle 750 bp6. Wissenschafl-ter von Sigma-Aldrich haben diese Technik unter anderem genutzt, um neue Arten von Reporterzellen zu generieren. Hierbei wurden verschiedenste Gene (unter anderem TUBA1B, ACTB, LMNB1) in der humanen Osteosarkom-Zelllinie U2OS mit dem Grün Fluoreszierenden Protein (GFP) und dem Rot Fluoreszierenden Protein (RFP) endogen getaggt. Diese Repor-terzelllinien sind kommerziell erhältlich.

Zinkfinger-Nukleasen ermöglichen auch eine zielgenaue, spezifische endogene Mu-tagenese einzelner Basen. Die Durchführung solcher Mutationen ermöglicht eine genauere Untersuchung von SNPs. ZFN-vermittelte Mu-tationen von einzelnen Basenpaaren wurden an verschiedenen Gen-Loci durchgeführt, in-dem Zinkfinger-Nukleasen in Verbindung mit mutierter Donor-DNA verwendet wurden7.

Fazit

Zinkfinger-Nukleasen eignen sich hervorra-gend für die gezielte endogene Editierung von Genen. Gerade im Hinblick auf die wachsende Menge veröffentlichter neuer Sequenzdaten ergeben sich immer mehr Einsatzmöglich-keiten. Auch die sind die Möglichkeiten, die Technik bei der Herstellung von Knock-out- oder transgenen Tieren einzusetzen, immens. Dadurch das die Wissenschaft nun nicht mehr auf wenige Tierstämme beschränkt ist, kann

für alle Fragestellungen das optimale Tiermo-dell gewählt werden.

Mit der CompoZr™ Zinc Finger Nucleases-Technologie ermöglicht es Sigma-Aldrich, sehr schnell und einfach gezielte Änderungen im Genom herbeizuführen. Durch die ständige Erweiterung des Portfolios – von kundenspezi-fischen Zinkfinger-Nukleasen bis Ready-to-Use Zinkfinger-Nukleasen; von fertigen Knock-out-Rattenmodellen bis zum kundenspezifischen Tiermodell – können neue wissenschaftliche Fragestellungen effektiv und schnell beant-wortet werden.

Literatur

[1] Cost GJ et al., BAK and BAX deletion using zinc-finger nucleases yields apoptosis- resistant CHO cells. Biotechnol. Bioeng. 105:330 (2009)

[2] Santiago, Y. et al, 2008, Targeted gene knockout in mammalian cells using engineered zinc finger nucleases. PNAS, 105(15): 5809-14

[3] Liu P., et al, Generation of a triple-gene knockout mam-malian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol Bioeng. 2010 May 1;106(1):97-105

[4] Geurts, A. M., et al., Knockout rats via embryo microin-jection of zinc-finger nucleases. Science 325 (2009), 433

[5] Mashimo T, et al., Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases. PLoS One 5 (2010):e8870

[6] Moehle, EA. et al, Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. PNAS. 104(9) 2008: 3055-60

[7] Urnov, F. D., et al., Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 435 (2005), 646–651

[8] Hockemeyer, D. et al. 2009. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 27(4): 851-7

[9] DeKelver R.C. et al. 2010, Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic set-tings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 2010 Aug;20(8):1133-42


Dr. Rainer EbelSigma-Aldrich Chemie GmbHEschenstr. 5, 82024 TaufkirchenTel.: +49(0)[email protected]/life-science

Abb. 2: Eine Auswahl der Möglichkeiten, welche Wissenschaftler mit Zinkfinger-Nukleasen umsetzen können.

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Wissenschaft Biomarker

Genomsequenzierung von Prostatatumoren Dr. Daniela Wuttig, PD Dr. Holger Sültmann, Arbeitsgruppe Krebsgenomforschung, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) und Nationales Zentrum für Tumorerkrankungen (NCT), Heidelberg; et al.

Das Prostatakarzinom ist der häufigste maligne Tumor und die zweithäufigste krebsbedingte To-desursache bei Männern. Allein in Deutschland werden jährlich mehr als 60.000 Prostatakarzinome diagnostiziert. Durch die sich verändernde Altersstruktur unserer Bevölkerung wird sich die Inzidenz dieses Tumors in den nächsten 20 Jahren etwa verdoppeln. Das Prostatakarzinom ist wie andere Tumoren durch zahlreiche genetische und epigenetische Veränderungen gekennzeichnet. Nur einige dieser Aberrationen sind jedoch echte „Treibermutationen“, die ursächlich für die Entstehung und Progression des Tumors sind. Die Kenntnis solcher Aberrationen ist eine Grundvoraussetzung, um die Biologie des Prostatakarzinoms und anderer Tumoren besser zu verstehen und in eine optimale Behandlung der Patienten umzusetzen.

finanzielle Ressourcen optimal genutzt, hohe und einheitliche Qualitätsstandards durchge-setzt und keine redundanten Fragestellun-gen bearbeitet werden. Das Know-how der einzelnen Projektpartner, beispielsweise im Bereich der Datenintegration, kann effizient verbreitet und gemeinsam genutzt werden. Ein standardisiertes Vorgehen gewährleis-tet auch die Vergleichbarkeit der Daten für weiterführende Analysen. Ein wichtiges Anliegen des ICGC ist es, die Ergebnisse schnellstmöglich der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung zu stellen, um die Tumorforschung voranzubringen und die Resultate in die klinische Anwendung zu überführen. Derzeit sind im ICGC 35 Projekte aus 12 Ländern vertreten, die Tumoren aus 17 verschiedenen Organen sequenzieren (Abb. 1). Deutschland ist mit drei Projekten vertreten, der Sequenzierung kindlicher Hirntumoren, maligner Lymphome und früh auftretender Prostatakarzinome.

Fokus auf Prostatakarzinome des frühen Alters

Obwohl das Prostatakarzinom ein Tumor äl-terer Männer ist, tritt er bei einigen Patienten bereits im Alter von 50 Jahren oder früher auf. Wir widmen uns seit November 2010 im Projekt „The genomes of early onset prostate cancer“ genau diesen frühen Tumoren, da ihnen möglicherweise eine Schlüsselrolle im Verständnis der Biologie des Prostatakarzi-noms zukommt:| Sie tragen wahrscheinlich eine geringere

Zahl nicht-tumorassoziierter (passenger) Aberrationen, so dass hier eine höhere Wahrscheinlichkeit besteht, Treibermuta-tionen zu identifizieren.

Next generation sequencing (NGS)-Techno-logien machen Sequenzierungen vollstän-diger Genome seit kurzem technisch und finanziell in großem Umfang möglich. Die ersten NGS-Studien an Lungen- und Pros-tatatumoren zeigen, dass viele genetische Aberrationen mit herkömmlichen Methoden bisher nicht identifiziert wurden. Aufgrund ihrer Heterogenität muss eine Vielzahl von Tumorgenomen analysiert werden, damit zuverlässige Ergebnisse erhalten werden. Um Mutationen zu identifizieren, die in mindestens 3 % einer Tumorentität auftreten, ist zum Beispiel die Sequenzierung von 500 Genomen dieser Entität nötig. Ein Vorhaben dieser Größenordnung ist nur durch die inter-disziplinäre Zusammenarbeit von führenden Wissenschaftlern der verschiedensten Fach-

richtungen – wie etwa von Ärzten, Biologen und Informatikern – auf internationaler Ebene durchführbar. Vor diesem Hintergrund wurde im Oktober 2007 das International Cancer Genome Consortium (ICGC; www.icgc.org) ins Leben gerufen. Dieses Konsor-tium hat das ehrgeizige Ziel, die Genome, die transkriptionellen Veränderungen und epigenetische Marker von 50 Tumorentitäten mit weltweit klinischer und gesellschaftlicher Bedeutung vollständig zu katalogisieren. Dazu zählen neben Prostata- auch Lungen-, Kolon- und Brusttumoren, an denen weltweit jährlich nahezu drei Millionen Menschen versterben. Der Zusammenschluss zu einem internationalen Konsortium ermöglicht ein koordiniertes und standardisiertes Vorgehen der Projektpartner, so dass technische und

Die an dem Prostatakrebs-Genomprojekt be-teiligten Gruppen arbeiten bereits seit 2008 innerhalb des Nationalen Genomforschungs-projektes zusammen und sind entsprechend gut eingespielt. Die Gewebeentnahme, Kryokonservierung, das Biobanking und die Nukleinsäureextraktion innerhalb des neuen Projektes übernehmen die Gruppen von Pro-jekt-Mitkoordinator Prof. Guido Sauter (Institut für Pathologie) und PD Dr. Thorsten Schlomm vom Prostatakarzinomzentrum (Martini-Klinik) am Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf. Die Sequenzierungsarbeit teilen sich fünf weitere Gruppen: Prof. Hans Lehrach, Dr. Marie-Laure Yaspo und Dr. Marc Sultan vom Berliner MPI für molekulare Genetik konzentrieren sich auf die Sequenzierung der genomischen DNA und werden dabei unter-

stützt von der Core Facility des DKFZ Heidelberg unter Leitung von Dr. Stephan Wolf. Während Prof. Christoph Plass, Dr. Clarissa Gerhäuser und Dr. Dieter Weichenhan (Abt. Epigenomik und Krebsrisikofaktoren) vom DKFZ die Analyse der DNA-Methylierung übernehmen, bearbeiten die mRNA- und miRNA-Analyse zwei Gruppen am DKFZ und NCT: PD Dr. Holger Sültmann, Dr. Daniela Wuttig (AG Krebsgenomforschung) und Prof. Christof von Kalle (Abt. Translationale Onkologie). DNA-Strukturänderungen nimmt Dr. Jan Korbel vom Heidelberger EMBL mittels paired end-Sequenzierung unter die Lupe, und die Speicherung und Analyse der im Zuge der Sequenzierung entstehenden riesigen Da-tenmengen übernehmen Prof. Roland Eils, Dr. Benedikt Brors und Dr. Christian Lawerenz (Abt. Theoretische Bioinformatik) am DKFZ.

Laborwelt Hintergrund

Prostatagenomprojekt – acht Gruppen bringen Expertise ein


Wissenschaft Biomarker

| Sie besitzenVeränderungen, diemögli-cherweise fürdie früheDiagnose klassi-scherProstatakarzinomenützlichsind.

| IhremolekularenVeränderungenkönnenzur Entwicklung neuer zielgerichteterTherapeutikagenutztwerden,die insbe-sonderewichtigfürdiejüngerenPatientensind.

| Sieweisenmöglicherweise erblicheAb-errationen auf und können durch denVergleichmitProstatakarzinomenklassi-scherAltersstrukturHinweiseaufdieEnt-stehunghereditärer Prostatakarzinomeliefern.

IndeminterdisziplinärenProjektarbeiteneineReihevonGruppenzusammen(sieheKasten),die Expertisen imBereichderBearbeitunghumanerGewebeproben,derSequenzierungundderbioinformatischenDatenauswertungbesitzensowieüberumfassendetechnischeRessourcenfürdieSequenzierungverfügen(Abb. 2). Innerhalbdernächsten fünf Jahresollen dieGenome,Methylomeund Tran-skriptome von 250 chirurgisch entferntenProstatakarzinomensequenziertwerden.ZurKorrektur erblicherVeränderungenwerdendiegenomischenSequenzdatenmitdenenautologerBlutzellenverglichen.EineigensfürdiesesProjektentwickeltes

Dissektionsschema erlaubt die Kryokon-servierung der gesamten Prostata undgewährleistet einedifferenziertehistologi-scheBegutachtungundArealauswahl.Auseinemder insgesamtetwa 100Areale, das(ggf. nachMakro- bzw.Mikrodissektion)mindestens60%viableTumorzellenenthält,könnendie für die verschiedenenSequen-zierungennötigenMengenvonetwa25µghochmolekularerDNAundca.10µgintakterRNAgewonnenwerden. FürdieGenomse-quenzierungwerdenmittelsmatepair-bzw.pairedend-SequenzierungunterVerwendungverschiedener Insertgrößen sowohl kleineDNA-Aberrationenalsauchgrößerestruktu-relleVeränderungendetektiert.Umzwischen

rungwährenddesgesamtenProjektseinerständigenOptimierung.DasManagement der großen Daten-

mengen sowie ihre bioinformatischeAus-wertung stellendie Informatiker vor neueHerausforderungen. Allein ein einzelnesGenombenötigt einen Speicherplatz vonmindestens400GByte.HierfürwurdeamBioQuant-ZentrumderUniversitätHeidel-bergeinesdergrößtenDatenspeicherzentreninganz Europamitmehr als 5 PByte Spei-cherkapazitätangelegt.ZudemwirdimICGCein Franchise-Datenbanksystemgenutzt,wobei jedes ICGC-Projekt Informationenwie Qualitätsparameter, klinische DatenunddieErgebnissederSequenzierungenineinereigenensolchenDatenbankspeichert.Datenabfragenerfolgenüber eine zentraleEingabemaskedesICGC.Die engeZusammenarbeitund ständige

KommunikationmitanderenArbeitsgruppenindenUSAundKanada,dieProstatakarzino-meklassischerAltersstruktursequenzieren,fördert effiziente Problemlösungen undDatenvergleiche.InsgesamtwirddasICGCindennächsten

JahrennebenfundamentalenErkenntnissenin der Tumorbiologie auchneuemethodi-scheEntwicklungen liefern.Die Ergebnissebilden einewichtige Basis für dieweitereErforschungderTumorursachenundwerdenauch neue diagnostische und therapeuti-scheOptionen aufzeigen.WahrscheinlichlegtdasICGCdamitdenGrundsteinfürdenbishergrößtenSchritt zurpersonalisiertenMedizin.


PDDr.HolgerSültmannAGKrebsgenomforschungDKFZundNCTImNeuenheimerFeld46069120Heidelbergh.sueltmann@dkfz-heidelberg.dewww.dkfz.de

Abb. 2: Struktur des ICGC-Projekts „The genomes of early onset prostate cancer“.

echtenMutationen und Polymorphismenbzw. Sequenzierfehlern zuunterscheiden,isteinemindestens30-facheAbdeckungdesGenomsnotwendig.ParalleldazuwerdenandenselbenTumorprobenundnichtmalignemProstatagewebe als ReferenzMethylom-,mRNAom- und smallRNAom-Sequenzie-rungen vorgenommen.Da eine kompletteSequenzierung bisulfitkonvertierter DNAnochzukostenintensiv ist,wirddiemethy-lierteDNAmittelsMethyl-CpG-Immunprä-zipitation angereichert und anschließendsequenziert.Mit diesemVorgehen könnenwir nebenVeränderungenaufDNA-EbeneauchdifferenzielleMethylierungunddere-gulierteExpressionnachweisenundzudemneueTranskripteodertranskribierteFusions-genedetektieren.IntegrativeDatenanalysenwerdendieZusammenhängedereinzelnenEbenenoffenlegenundetwaInformationenzurallelspezifischenGenexpression liefern.Für die Sequenzierungenwerden die LifeTechnologies(SOLiD)undIllumina(GenomeAnalyzer)-Technologie verwendet.Dadieseständigweiterentwickeltwerden,unterliegtauchdieProbenbearbeitungundSequenzie-

Abb. 1: Derzeit laufende Projekte im Gesamtkontext des ICGC (http://www.icgc.org).


Blitzlicht Tagung

Funktionelle Genomik der nächsten GenerationRobert Wild, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin

Mit dem neuen Namen „Functional Genomics – Next Generation Applications & Technologies“ und thematisch erweitert um das brandaktuelle Thema „Second-generation Sequencing“ präsentierte sich Anfang Februar die ehemalige DECHEMA-Chip-Tagung 180 Experten und 20 Ausstellern. Ne-ben den Chiptechnologien gab es in Frankfurt (Main) einen regen Erfahrungsaustausch über die beiden großen Themen Genome-wide association studies (GWAS) und Sequenziertechniken. Im Rahmen der Tagung wurde klar, dass dabei der Trend zur personalisierten Medizin die Dynamik der Technologieentwicklung antreibt. Neben den 22 Vorträgen und 52 Postern konnten sich die Besucher der Konferenz während der Pausen über die neuesten Produkte der Firmen in diesem Feld informieren.

darstellen? Eine mögliche Lösung stellte Dr. Jörg Bernhardt von der Universität Greifswald vor. Mit seiner Variante der sogenannten „Vor-onoi treemaps“ (Abb. 1) ist es möglich, die Da-ten hierarchisch und in Gruppen anzuordnen. Der große Vorteil gegenüber herkömmlichen Treemaps ist die deutlich verbesserte Über-sichtlichkeit von mehreren 1.000 Datenpunk-ten in einer Karte.

Mit dem Thema „Analyse und Auswertung von Rohdaten“ beschäftigt sich die Firma

Seit der Lancierung des ersten Next Gene-ration Sequencers vor sechs Jahren hat die Technologie immer mehr an Bedeutung gewonnen und dabei andere Techniken wie DNA-Microarrays in vielen Gebieten ver-drängt. Ein Problem ist aber gleich geblieben: die Analyse und Auswertung der gewonnenen Datenmengen und die Interpretation der Ergebnisse.

Wie lässt sich die Fülle der gewonnenen Expressionsdaten sinnvoll und übersichtlich

Micro Discovery aus Berlin. Wie kann man anhand der Sequenzdaten eine Bindestelle für Enzyme oder eine potentielle Phosphory-lierungsstelle ausmachen? Die Antwort ist so einfach wie möglich und so komplex wie nötig: statistische Datenanalyse. Vorgeführt wurde das Ganze mit Daten aus einer Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP), gefolgt von Next Generation Sequencing, wobei die Daten zugleich mit Expressionsdaten verglichen wurden. Die Analyse bietet nicht nur eine hohe Trefferquote, sondern liefert auch wenig falsch-positive Ergebnisse.

Mit einer Podiumsdiskussion zum Thema „Genomweite Sequenzierung – Sinn und Nutzen in der heutigen Medizin“ nahmen die Organisatoren eine aktuelle Entwicklung auf, die im Entwicklungsportfolio der großen Sequencer-Anbieter Illumina, Life Techno-logies und Roche Applied Science derzeit intensiv geprüft wird. Tatsächlich erscheinen die research-only-Anwendungen der Sequen-ziermaschinen zunehmend diagnostisch, und einige diagnostische Tests sind bereits in der Entwicklungspipeline und werden von 2012 an lanciert werden. Roche arbeitet zum Beispiel an HLA-Typisierungen und der HIV-Resistenztypentestung. Aber auch zahlreiche Krebsprognose- und Verlaufsmonitoringtests sind in Entwicklung.

Inwieweit können Krankheiten über Mutati-onen im Genom identifiziert werden und diese

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Blitzlicht Tagung

Information zur Behandlung der betroffenen Patienten verwendet werden, war eine Frage auf dem Podium. Ein wichtiges Kriterium dabei ist der Umfang der Patientengruppe die zur Verfügung steht und damit direkt auch die Häufigkeit der Erkrankung. Trotz modernster Techniken werde es noch einige Jahre dau-ern, bis genug Daten zur Verfügung stehen. Ein Faktor der dabei bisher unberücksichtigt bleibt, ist die Kausalität der Mutation. Ist die Mutation verantwortlich oder steht in direkten Zusammenhang mit einer bestimmten Erkran-kung, oder ist die Mutation eine Ursache der Erkrankung?

Die Idealvorstellung ist, dass der Arzt bei jedem Patienten mit Verdacht auf Krebs durch die Sequenzierung seines Genoms feststellen kann, welches Muster an Mutationen der Patient aufweist und möglicherweise, an welchem Krebs der Patient leidet. Dies funk-tioniert jedoch nur, wenn gesunde und kranke Patienten gleichermaßen sequenziert werden, da man zufällig auftretende Mutationen bei gesunden Menschen ausschließen muss. Eine solche Datenbank muss dementsprechend möglichst viele Personen enthalten um aus-sagekräftig zu sein. Das DKFZ in Heidelberg hat ein entsprechendes Projekt begonnen bei dem sämtliche Patienten sequenziert werden um eine solche Datenbank aufzubauen.

Dieses Thema gab Anstoß zu wissenschaft-lichen Diskussionenund warf auch ethische Abb. 2: Schematische Darstellung der Funktionsweise eines DNA to Protein Arrays

© Dr. Dipl.-Phys. Dipl.-Biochem. Günter Roth, Universität Freiburg

Abb. 1: Genexpressionsmuster (mRNA) von Bacillus subtilis 168, 30 Minuten nach Glukose-Limitierung. Gene sind nach ihrer Abhängigkeit zu verschiedenen Regulatoren ange-ordnet. Blau kodiert für runterregulierte Gene, Orange für hochregulierte Gene.

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Fragestellungen auf. Wichtige Fragen sind zum Beispiel, wer diese Daten erheben und sammeln darf, wem diese Daten zugänglich sind, welchen Anspruch auf Richtigkeit die Datenbank bei seltenen Krankheiten hat und wie zuverlässig die Sequenzierung an sich ist. Da gerade ethische Aspekte international unterschiedlich wahrgenommen werden,

besteht noch weiterer Diskussionsbedarf für ein einheitliches Meinungsbild.

Die Zukunft in der Medizin nennt sich personalisiert

In Wissenschaft und Forschung werden zu den verschiedensten klinischen Fragestellun-gen Experimente durchgeführt und Daten generiert. Doch nicht alle dieser Daten sind für jeden Patienten und/oder Mediziner zu-gänglich und verständlich. Im Gegensatz zu Wissenschaftlern, die basierend auf den Daten neue Experimente designen, benötigen Me-diziner einheitliche und eindeutige Entschei-dungshilfen für eine Diagnose und mögliche Therapie. Eine Menge Zeit und Energie wird in die Weiterentwicklung von alten Techniken und die Etablierung neuer Techniken gesteckt, während der Zugang zu bereits bestehenden Datensets auf der Strecke bleibt. Diesem Problem widmet sich Professor Anthony J. Brooks von der Universität Lei cester. Derzeit sind alle Informationen quer über verschiedene Datenbanken zerstreut und die Rohdaten sind auf den ersten Blick schwer zu verknüpfen und zu deuten. Sein Vorschlag umfasst die Standardisierung der Datenerfassung bzw. Datenspeicherung in einem übersichtlicheren Format in einer dezentralen Plattform. Der erste Schritt in diese Richtung ist, seiner Mei-nung nach, die Generierung einer sogenannten „virtuellen Persönlichkeit“. Diese ist einzigartig, wird bei jeder Veröffentlichung angegeben und ermöglicht somit das Zurückverfolgen der Personen sowie ihrer Arbeiten auch bei einem Wechsel des Arbeitgebers und -ortes. Doch nicht nur für Wissenschaftler könnte dies ein Durchbruch sein, sondern auch für Patienten, deren virtuelle Persönlichkeit für jeden Arzt zu-gänglich ist und somit alle krankheitsrelevan-

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LABORWELT

ten Informationen enthält und damit Diagnose und Behandlung deutlich einfacher gestaltet. Eingebaute Rückkopplungsschleifen garantieren die Richtigkeit der Informationen und sind somit fester Bestandteil der „I-Health-Informatics“. Neben der praktischen Umsetzung eines solchen Konzepts sind die ethischen und juristischen Implikationen einer solchen internationalen Plattform nicht zu unterschätzen.

DNA-Methylierungs-Assay

Immer mehr an Bedeutung gewinnt auch die Analyse der DNA-Methy-lierung, vor allem in der Diagnostik zur Früherkennung von Krebs. Die DNA-Veränderungen sind früh zu finden und gelten als vielversprechen-de Marker. Matthias Wielscher vom Austrian Institute of Technology in Wien stellte einen Ansatz vor, bei dem auf eine Biopsie verzichtet werden kann. Aus 72 von 82 Serumproben konnte DNA angereichert werden und durch ein Screening zwischen gesunden und kranken Patienten unterschieden werden. Dafür wurden 360 ausgewählte DNA-Sequenzen auf einem DNA-Microarray hybridisiert. Die Daten konnten mittels qPCR evaluiert werden.

Plattform: Microarrays

Beeindruckend war unter anderem eine neue Form der Protein-Microar-rays, welche von Jürgen Burger, Institut für Mikrotechnik und Informa-tionstechnik der Hahn-Schickard-Gesellschaft, vorgestellt wurde. Mit dem „DNA Array to Protein Array”-System ist eine Transkription und Translation auf dem Chip möglich. Dabei werden zwei verschiedene Chips verwendet. Auf dem einen befindet sich die DNA, während auf dem anderen die Oberfläche zur Immobilisierung der neusynthetisierten Proteine angebracht ist. Der einzige Kontakt zwischen den beiden Platt-formen stellt die in vitro-Transkriptions-/Translationslösung dar (Abb. 2). Durch Zugabe dieser Lösung können die verschiedenen Prozesse gezielt gesteuert werden, während nach der Reaktion beide Seiten (DNA und Protein) für weitere Analysen zur Verfügung stehen.

Ein weiteres, interessantes Einsatzgebiet für Microarrays präsentierte Dr. Hendrik Schröder von der Universität Dortmund. Dieses beinhaltet eine gerichtete Immobilisierung von Antikörpern mittels DNA, welche anschließend selektiv Zellen binden können. Die Zellen können für mehrere Tage auf dem Array für diverse Tests kultiviert werden.

Auch in diesem Jahr wurden die besten Poster gekürt – eigentlich hätten alle einen Preis verdient. Gerade die Postersessions bieten eine gute Gelegenheit, sich über den neuesten Stand der einzelnen Arbei-ten zu informieren und darüber hinaus auch die Möglichkeit, mit den Verfassern ins Gespräch zu kommen, Erfahrungen auszutauschen und neue Kontakte zu knüpfen.

Das 13. Statusseminar war eine gelungene Veranstaltung, um neue Ideen und Methoden vorzustellen und interdisziplinär zu diskutieren. Die Erweiterung um Sequenziertechniken ist eine Bereicherung, und somit ist der Kongress einer der wenigen, bei dem DNA-, RNA- und Protein-basierte Ergebnisse gleichberechtigt vorgestellt werden. Gut gelungen ist den Veranstaltern das Beibehalten des roten Fadens, so dass sowohl neue Besucher als auch solche, die schon länger dabei sind, auf ihre Kosten kommen. Besonders jungen Wissenschaftlern bietet sich hier eine Plattform, ihre Arbeiten zu präsentieren und ihre Erfahrungen mit anderen zu teilen.


Robert WildMax-Planck-Institut für molekulare GenetikAbteilung Vertebrate GenomicsArbeitsgruppe Dr. Harald SeitzIhnestraße 63–73, 14195 Berlin

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Blitzlicht PCR

Sicherer Nachweis von Influenza-Virussubtypen mit real-time qPCRBurkhard Ziebolz, Roche Applied Science, Penzberg

Obgleich die Weltgesundheitsorganisation WHO in dieser Grippesaison keine Influenza-Pande-miewarnung aussprach, trat der vor zwei Jahren erstmals weltweit detektierte A(H1N1)2009-Virussubtyp laut der amtlichen WHO-Statistik in immerhin 61 Staaten auf (vgl. Abb. 1). Um Verbreitungsmuster einzelner Virussubtypen, wie das des Erregers der „Mexikanischen Grippe“ rasch erkennen und das Virus verlässlich von anderen Virussubtypen unterscheiden zu können, sind validierte analytische Methoden erforderlich. Reverse Transcription quantitative PCR-Verfahren (RT-qPCR) bieten gegenüber der klassischen Viruskultur oder antigenbasierten Nach-weisen den Vorteil, virale Erreger schneller, sensitiver und spezifischer zu detektieren. In einer der ersten systematischen Studien weltweit haben Wenzel et al.1 unlängst die Leistungsfähigkeit eines RT-qPCR-Tests zum Nachweis des A(H1N1)2009-Virussubtyp validiert. In Tests an 359 als sicher A(H1N1)2009-positiv bzw. -negativ eingestuften Nasenabstrich- und Nasenspülproben detektierte das RealTime ready Influenza A/H1N1 Detection Set (Roche Applied Science) mit 100% Spezifität kleinste Mengen (<50 RNA-Kopien) des A(H1N1)2009-Virusgenoms. Der Test, der die für Influenza A-Nachweise typische Sensitivität (88%) zeigt, ermöglichte eine sichere Unterscheidung dieses Virussubtyps vom saisonalen Virus und anderen Pathogenen und ist für Überwachungszwecke sowie den raschen Virusnachweis geeignet.

Das Influenza A(H1N1)-Virus war im April 2009 erstmals als Erreger einer Influenza mit untypischem Verlauf im Menschen identifiziert worden2-3. Dieser Virussubtyp ist durch eine schnelle Übertragung auf gesunde Kinder und Jugendliche gekennzeichnet und zeigt – verglichen mit bis dato bekannten Virussubtypen – eine erhöhte Mortalitätsrate bei jungen Erwachsenen. Für den schnellen Nachweis des A(H1N1)2009-Virussubtyps

hatte das CDC den ersten RT-qPCR-Assay entwickelt4. Zahlreiche ähnliche Nachweise wurden in der Folge entwickelt, ihre Leis-tungsfähigkeit aber bislang nur unzureichend in systematischen Studien validiert1,5-8. Für das RealTime ready Influenza A/H1N1 Detec-tion Set (Roche Applied Science, Penzberg) bestimmten Wenzel et al. unlängst die Test-spezifität, -sensitivität und Nachweisgrenze, bei der mit 95%iger Wahrscheinlichkeit das

H1N1/2009-Virus nachgewiesen wird (95%-LOD) im Vergleich mit anderen Assays.

Material und Methoden

Um die Leistungsfähigkeit des RealTime ready Influenza A/H1N1 Detection Set auf dem Light Cycler® 2.0 Instrument zu ermitteln, wurden definitiv positiv oder negativ (mit dem CDC RT-qPCR-Protokoll) vorgetestete Proben un-tersucht, darunter 125 Nasenabstriche, die vom Northshore University HealthSystem (Evanston, USA) zur Verfügung gestellt wur-den. Des weiteren 126 Virus-positive bzw. -negative Nasenspülungsproben aus Houston (USA) sowie 55 Nasenabstriche aus Mexiko.

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I PandemischenH1/N1(2009)-Virusproben(A/Hamburg/05/09), diemitNasenspül-bzw.Nasenabstrichlösungverdünntwor-denundmitdemInfA/H1-Assayuntersuchtwurden.

I analog verdünnten pandemischenH1/N1(2009)-Virusproben(A/Hamburg/05/09),diemit dem InfA-M2-Assay untersuchtwurden,sowie

I ProbendessaisonalenInfluenza-A-Virus(A/Brisbane/59/07-like),dieanalogverdünntundmit dem InfA-M2-Assayuntersuchtwurden.

DiestatistischeAuswertungpositivgeteste-terProbenerfolgtemitdemSASSoftwarepa-ket,Version9.1(SASInstituteInc.).Unstimmige Testresultate der RT-qPCR

wurdenzurKontrollemittelsSequenzierungüberprüft.

Analytische Leistungsfähigkeit

Die 95%-LODs für den InfA-H1- und denInfA-M2-Assay ergaben sichwie folgt (vgl.Tabelle1):I derInfA/H1-AssaydetektierteproRT-qPCR-ReaktionaufdemLightcycler54,4Kopiendes inNasenabstrich-LösungverdünntenH1/N1(2009)-Virusund39,0Kopien,wennmitNasenspüllösunggespiktwordenwar.

Alle Probenwurden auf Anwesenheit dessaisonalenInfluenzaA-Virusunddespande-mischenA(H1N1)2009-Subtypsgetestet.Um die analytische Leistungsfähigkeit

des RT-qPCR-Tests zu ermitteln, wurdengespikteProbenausKulturüberständendessaisonalenGrippevirus (A/Brisbane/59/07-like(H1N1)unddespandemischenInfluenzaA-Virus (A/Hamburg/05/09(H1N1) erstellt.UmdieProbenhomogenisierungzuerleich-tern, wurde eine Spiking-Lösung (Sw1-1,InA1-1) aus unverdünntemKulturmediumhergestellt,indem200µljedesKulturüber-standsmitje300µlsterilerphysiologischerNaCl-Lösungvermischtwurden.Von500µldieserSpikinglösungwurden50µlzu450µlgepoolterNasenspülungslösungausgesun-denProbandengegeben(Sw1-2,InfA1-2).50µldieserLösungwurdenwiederumin1:10-Ver-dünnungenmit450µlNasenspülungslösung(Sw1-3 und -1-4, InfA1-3 und -1-4) versetzt.Analogwurde eineNasenabstrich-Lösunghergestellt,indemdieWattestäbchenin1mlphysiologischeNaCl-Lösung resuspendiertwurden. Beide Lösungenwaren vor demSpiken aufAbwesenheit von InfluenzaA-,-BundInfluenzaA(H1N1)2009mitRT-qPCRgetestetworden.DieGesamt-DNAausdengespiktenund

den voruntersuchtenVirus-positivenbzw.-negativenProbenwurdenachHerstelleran-

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gabenmitdemMagNAPureLCTotalNucleicAcidIsolationKit-HighPerfomance(Roche)aufgereinigt.UmdieVirus-RNA indenge-spikten Lösungen zu bestimmen,wurden200µlderLösungenSw-1-1,-2,-3undInfA1-1,-2,-3mit300µlLysepufferversetztundnachautomatischerAufreinigungin100µlEluti-onspufferwiederaufgelöst.DieRNA-MengeindenEluatenwurdengemäß[9]und[6]mitRT-qPCRbestimmt.OligonukleotidefürdieRT-qPCRdesInflu-

enzaAH1N1(2009)-Virus-Hämagglutinin-Gen(H1;NachweismitInA/H1Assay)wurdenwiebeschriebenentworfen13. PubliziertePrimerdiedasMatrix-Gen (M,NachweismitdemInfA/M2 Assay) nachweisen,wurden fürden allegemeinen RT-qPCR-Nachweis vonInfluenzaA-Vireneingesetzt.UmdieNachweisgrenzedesAssays(95%-

LOD)zuermitteln,wurdendieVirus-Stamm-lösungen SW1-4 und InfA1-4 1:1, 1:5, 1:10,1:50, und 1:100mit Nasenspülungs- bzw.Nasenabstrich-Lösung verdünnt.Die LODswurden in 21Wiederholungen jedes Ver-dünnungsschrittes von 5 unabhängigenNukleinsäure-Isolierungen und PCR-Runsermittelt,undzwarmit:

Abb. 2: WHO-Daten zur Verbreitung von Influenza-Virussubtypen weltweit (Stand: 25. Februar 2011). In Nordamerika und Kanada bietet sich nach Analysen der Subspezies in den 20% der positiv getesteten Influenza A- und B-Fälle ein völlig anderes Bild als in Europa. Bei den Influen-za-A-Fällen in den USA, die 67% aller Influenza-Infektionen ausmachten, fand sich bei 19% das als Mexikogrippe bekannte A(H1N1)2009-Virus und in 81% der A(H3N2)-Virussubtyp. In Kanada lag die Infektionsrate mit dem Influenza A-Virus mit 90% noch höher, der Anteil des A(H1N1)2009-Virus aber mit 12% niedriger. Die meisten der 8,9% Todesfälle trat in der Gruppe der über 65-Jährigen auf. Anders stellte sich die Situation in Europa dar, wo die nach nicht näher quantifizierten WHO-Angaben „oft in der Altergruppe von 15-64-Jährigen“ auf-getretenen Todesfälle in diesem Jahr nicht erfasst werden. Von den 44% der positiv Getesteten trugen 48% Influenza B-Viren, 44% das A(H1N1)2009-Virus und nur 3% den A(H3N2)-Virussubtyp in sich.

Blitzlicht PCR

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I der InfA/M2-AssayerfassteproRT-qPCR-Reaktion174,5KopiendesinNasenabstrich-LösungverdünntenH1/N1(2009)-Virusund116,8Kopien,wennmitNasenspüllösungverdünntwordenwar.

I der InfA/M2-AssayerfassteproRT-qPCR-Reaktion33,0KopiendesinNasenabstrich-LösungverdünntensaisonalenH1/N1-Virusund 127,3Kopien,wennmitNasenspüllö-sungverdünntwordenwar.

DieanalytischeSpezifitätdesInfA/H1-Assaysund die analytische Inklusivität des InfA/M2-TestswurdendurchTestsanvorcharak-terisierten InfluenzaA-Kulturprobenevalu-iert.Dabeiwurden keineKreuzreaktionenmit Influenza-A-Virenbeobachtet. ProbensaisonalerH1N1- undH2N3-Virussubtypenwurdennichtamplifiziert.DieszeigtdiehoheSpezifitätdesInfA/H1-Assaysfürdenpande-mischenH1N1(2009)-Virussubtyp.MitdemInfA/M2-Test konnten erwartungsgemäßalleanalysiertenInfluenza-A-Virendetektiertwerden,sogardasvormehralsdreißigJahrenaufgetreteneH7N7-Virus.

Validierung

DiemitdemRocheRealTimereadyInfluenzaA/H1N1DetectionSeterzieltenErgebnisseanvoruntersuchten359ProbenvonpotentiellinfiziertenPersonen(114H1/N1(2009)-positiveProben, 76 saisonaleH1/N1-positiveProbenund169-InfluenzaA-negativeProben)ausdenUSAundMexikosteheningutemEinklangmitErgebnissen,diemitdemRT-qPCR-AssayderCDCbestimmtwurden.BeimH1/N1(2009)-NachweisergabsicheineÜbereinstimmungvon98%, fürdenNachweisdes saisonalenH1N1-Virusvon99%.DieÜbereinstimmungbei denVirus-negativen Proben lag – ver-gleichbarmitallenbekanntenAssays–bei88%.Das Roche RealTime ready Influenza

A/H1N1DetectionSeteignetsichsomitzurschnellen,empfindlichenundsicherenIden-tifikationunddasMonitoringdespandemi-schenH1N1(2009)-Influenzavirus.

Literatur

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Tab. 1: Leistungsfähigkeit des RealTime ready Influenza A/H1N1 515 Detection Sets bei der Untersuchung von Nasenspül- und Nasenabstrichproben, die aus den USA und Mexi-ko bereitgestellt wurden. Alternative Assays: H1N1(2009)-rRT-PCR-Nachweis des CDC oder Focus 516 Diagnostics H1N1(2009)-Real-Time RT-PCR Assay.

PT-qPCR Assays

Pandemic(H1N1)2009

Positive

SeasonalInfluenza

APositive Negative Total

Pandemic(H1N1) 2009Positive

112 0 7 11988 % AgreementNegatives95% CI (76% – 90%)

SeasonalInfluenza APositive

2 75 13 90

99 % AgreementSeasonalInfluenza A95% CI (93% – 100%)

Negative 0 1 149 150

98 % AgreementPandemic (H1N1)200995% CI (94% – 100%)

Total 114 76 169 359

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Kongressreport Forum Life Science

Hunger auf innovative Lebensmittelvon Philipp Graf, Redaktion biotechnologie.de

Ob Chemie aus Stroh, Stammzellen von der Stange oder Speiseeis aus Lupinen: Die siebte Ausga-be des Forum Life Science an der Technischen Universität München in Garching offenbarte eine breite Vielfalt an Forschungs- und Entwicklungstrends in Wissenschaft und Wirtschaft in den Life Sciences. Die Veranstalter vermeldeten einen Besucherrekord: Mehr als 1.000 Teilnehmer – darunter hundert Aussteller – waren vom 23. bis 24. März 2011 zum Kongress in die Gebäude der Fakultät für Maschinenbau gekommen. Spürbaren Erkenntnishunger zeigten die Kongress-besucher bei Vorträgen zu Themen der Ernährungsforschung und innovativen Lebensmitteln mit Zusatznutzen. Auf dem Garchinger Campus wurde zudem das funkelnagelneue Technikum des Forschungszentrums für Weiße Biotechnologie eingeweiht.

Alle zwei Jahre wird der Forschungs-Campus der TU München in Garching zum internationa-len Treffpunkt von Akteuren aus Biotechnolo-gie, Chemie, Pharma und Ernährungsindustrie. Ausgerichtet wird das Forum Life Science von Bayern Innovativ, der vom Freistaat Bayern finanzierten Gesellschaft für Innovation und Wissenstransfer, die damit das Netzwerken von Wissenschaft und Wirtschaft weiter ankur-beln möchte. Wie die Rote, Grüne und Weiße Biotechnologie dabei als Schrittmacher für ein biobasiertes Wirtschaften (Bioökonomie) wir-ken können, war dabei ein Leitmotiv der mehr als 60 Vorträge. Auf reges Interesse stieß der zweitägige Vortragsblock zum Thema „Food and Nutrition“, der sinnfälligerweise in einem Hörsaal direkt über der Mensa der Fakultät für Maschinenwesen über die Bühne ging. Werner Klaffke vom Konsumgüter-Riesen Unilever wies darauf hin, dass die meisten Lebensmittel mit beworbenem gesundheitlichen Zusatznutzen (Health Claim) in der Prüfung durch EU-Behör-den bisher enttäuscht hätten. Sowohl die EFSA als auch die Produktentwickler hätten sich dabei an einem zu engen Gesundheitsbegriff

Körper verfolgen. So konnten die Forscher den Effekt von grünem Tee-Extrakt bei Fahrradfah-rern im Vergleich zu ruhenden Personen genau vermessen. Nicht nur in Klaffkes Vortrag wurde deutlich, dass die systematische Erforschung von Stoffwechselwegen ein zunehmend ge-fragtes Forschungsfeld ist. Die Ernährungsphy-siologin Hannelore Daniel von der TU München zeigte sich im Verlauf ihrer Moderation eines Vortragsblocks begeistert: „Da geht einem das Herz auf, die biochemischen Stoffwechselpfade kommen zurück.“ Lange Zeit hätten diese als angestaubtes Forschungsgebiet gegolten.

Lupinen-Eis: Nascherei mit viel Omega-Fettsäuren

Auf der Suche nach Biomarkern für die Früh-erkennung einer Diabetes-Erkrankung ist wie-derum die Firma Metanomics Health in Berlin. Die „Profiler“ durchsuchten Blutproben aus der Biobank des Bayerischen Roten Kreuzes retros-pektiv nach biochemischen Anzeigern für die Entwicklung der Zuckerkrankheit. Neben Wer-ten für Glucose und Mannose liefern demnach offenbar auch Anhydrosorbitol und Glyoxylat verräterische Anzeichen für eine entstehende Diabetes-Erkrankung. In weiteren Beiträgen beim Forum Life Science ging es darum, wie sich solche Erkenntnisse in Form von innovati-ven Lebensmittel mit gesundheitsförderlichen Inhaltsstoffen umsetzen lassen. Besonders beliebt bei den Kongressteilnehmern: Der Ausstellungsstand des Fraunhofer-Instituts für Verfahrenstechnik und Verpackung (IVV). Die Forscher hatten eine kleine Eisbar aufgebaut, an der man neuartige Eiskreationen mit Vanil-le- oder Schokoladengeschmack testen konnte. Die neue Eiscreme besteht aus rein pflanzlichen Inhaltstoffen, nämlich Rapsöl und einem Pro-teingemisch, das aus den Samen von Lupinen gewonnen wird. „Dieses Eis ist eine Nascherei frei von Cholesterin und Lactose und ist reich an Omega-3-Fettsäuren“, sagt Katrin Hasenkopf, die sich beim IVV mit bioaktiven Lupinen-Inhalts-

aus der pharmazeutischen Industrie orientiert, der der Wirkung von Lebensmitteln im Körper nicht gerecht werde.

Neuer Gesundheitsbegriff für die Biomarkerforschung

„Gesundheit ist nicht nur Abwesenheit von Krankheit, wie müssen auch die Vorstufen und die Wege in die Krankheit quantifizierbar und beweisbar machen“, sagte Klaffke, der bei Uni-lever Direktor für Forschung und Entwicklung im Bereich Biosciences, Nutrition und Health ist. Dazu gelte es, spezielle Stoffwechselprodukte als Biomarker, also verlässliche „Frühwarnsys-teme“, zu identifizieren. Welche Technologien den Ernährungsforschern dabei inzwischen helfen können, zeigte Klaffke am Beispiel von grünem Tee, der zur Produktpalette des niederländisch-britischen Konzerns gehört. Mit der Kombination von Flüssigchromatographie sowie NMR- und Massenspektrometrie-Metho-den können die Forscher mittlerweile mehr als 200 Metabolit-Veränderungen gleichzeitig im

Abb. 1: Mit einem abwechslungsreichen Vortragsprogramm konnten die Veranstalter des Forum Life Science mehr als tausend Teilnehmer nach Garching locken, darunter Prominenz aus Wissenschaft, Wirtschaft und Politik.

LABORWELT

stoffen beschäftigt. Die Fraunhofer-Forscher haben zusammen mit der ausgegründeten Pro-lupin GmbH in Neubrandenburg am Geschmack und weiteren sensorischen Eigenschaften ihrer Schleckerei getüftelt. Mit nicht nur schmeck-barem Erfolg: von Mai dieses Jahres an wird die Eiscreme in Edeka-Märkten erhältlich sein.

Stammzelltherapie in klinischer Phase

Ein weiterer großer Vortragsblock des Kongresses beschäftigte sich mit dem Trend hin zu einer per-sonalisierten Medizin. Einen Fokus hatten die Or-ganisatoren dabei auf die Stammzellforschung und die Regenerative Medizin gelegt. Ralf Huss vom Roche-Forschungsstandort in Penzberg be-richtete über die Strategien des Pharmakonzerns mit Blick auf den Einsatz von adulten Stammzel-len. „Wir setzen dabei langfristig auf körperfrem-de Stammzellpräparate von der Stange (off-the shelf).“ Dabei wies Huss auf die Schwierigkeiten hin, ein standardisiertes Zellprodukt zu ent-wickeln, für das man auch einen signifikanten Patientennutzen nachweisen müsse. Einen Schritt weiter in Richtung klinischer Anwendung von Stammzelltherapien ist bereits die 2007 gegründete Firma Apceth aus München. Deren Vorstandsvorsitzende Christine Günther stellte

Abb. 3: Neben den Vorträgen nutzten die Kongress-Teilnehmer die mehr als 100 Aussteller-stände, um sich über neue Produkte und Dienstleistungen zu informieren.

in Garching vor, wie das Biotech-Unternehmen Patienten mit Gefäßverschlusserkrankungen mittels einer Stammzelltherapie helfen will. Da-bei sollen Patienten etwa mit einem Beininfarkt mit Hilfe von aufbereiteten Stammzellen aus dem eigenen Knochenmark behandelt werden. „Eine erste klinische Studie ist vor wenigen Tagen gestartet“, berichtete Günther.

Auch die Industrielle Biotechnologie konn-te beim Kongress mit sichtbaren Erfolgen aufwarten: So wurde auf dem Garchinger Forschungscampus der TU München das Technikum des Forschungszentrums für Weiße Biotechnologie eingeweiht. Für 4 Mio. Euro ist im ehemaligen Gebäude der Techni-schen Chemie ein einzigartiger Anlagenpark entstanden, mit dem nun im Pilotmaßstab Biokatalysatoren produziert werden können. Prunkstück der Anlage ist ein Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 1.000 Litern.

Die Veranstalter des Forum Life Science werteten den Kongress nicht nur mit dem Blick auf die Rekordteilnehmerzahl als Erfolg. „Unsere Erfahrung hat gezeigt, dass es sieben Jahre braucht, bis man tragfähige internatio-nale Netzwerke etabliert hat“, sagte Bayern Innovativ-Geschäftsführer Josef Nassauer. Schon bald sollen die Vorbereitungen für die achte Ausgabe im Jahr 2013 beginnen.

Abb. 2: Bayern Innovativ-Geschäftsführer Josef Nassauer (links) zeigte sich zufrieden über die hohe Teilnehmerzahl. Der bayerische Wissenschaftsminister Wolfgang Heubisch (rechts) sprach per Videoaufzeichnung über politische Rahmenbedingungen für Forschung und Innovationen.

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Report Institut für Molekulare Biologie

Universität Mainz mit IMB auf Elite-Kursvon Sandra Wirsching, Redaktion biotechnologie.de

Wo vor 15 Monaten noch ein Parkplatz existierte, wurde Mitte März das Institut für Molekulare Biologie (IMB) der Universität Mainz eröffnet. Die Baukosten des 6.000-Quadratermeter-Gebäudes in Höhe von 45,5 Millionen Euro hat das Land Rheinland-Pfalz übernommen, für die Forschung steht ein Startkapital von 100 Millionen Euro zur Verfügung. Diese Summe hatte die Boehringer Ingelheim Stiftung 2010 aus Anlass des 125-jährigen Firmenjubiläums des gleichnamigen Pharma-konzerns gespendet. Mit dem IMB will die Universität Mainz im Exzellenz-Wettbewerb punkten. Unter die ersten sechs ist sie bereits gekommen. Der neue Hausherr des IMB, Prof. Christof Niehrs, ist nun vor allem damit beschäftigt, neues Personal anzuwerben. Locken will er unter anderem mit flexiblen Gehältern.

Es ist ein ganz besonderer Tag für Christof Niehrs: Endlich kann sich der IMB-Chef auch Hausherr nennen. Seine erste Amtshandlung: Hände schütteln. Denn etliche Vertreter aus Politik und Wirtschaft lassen es sich nicht nehmen, bei der offiziellen Eröffnung des IMB am 11. März höchstpersönlich zu gratulieren. Kurt Beck, Ministerpräsident von Rheinland-Pfalz und Kultusministerin Doris Ahnen sind gekommen, aber auch Andreas Barner, Sprecher der Unternehmensleitung von Boehringer In-gelheim, sowie etliche Mitglieder der Familien, die zum Gesellschafterkreis von Boehringer Ingelheim gehören.

Gründung als Geschenk zum Firmenjubiläum

Ohne den Pharmakonzern gäbe es das IMB nicht. 2010 feierte Boehringer Ingelheim seinen 125. Geburtstag. Dieses Jubliäum nahm die 1977 durch Hubertus Liebrecht – einem ehemaligen

durchgesetzt. Darüber hinaus darf die Universi-tät auf Geld für drei Exzellenzcluster in den Na-turwissenschaften hoffen. Im Juni 2012 fällt die endgültige Entscheidung. Um das IMB auf die internationale Forschungslandkarte zu setzen, hat sich Niehrs die Themen Entwicklungsbiolo-gie, Epigenetik und DNA-Reparatur ausgesucht. „Ich wollte hier Gebiete etablieren, die ich selbst übersehen kann, die aufstrebend sind und die über Schnittstellen verfügen, die noch nicht aus-gereizt sind“, so Niehrs, der für seine Forschun-gen in der Entwicklungsbiologie 2003 mit dem Leibniz-Preis ausgezeichnet wurde. Gerade in der Kombination Epigenetik und DNA-Reparatur steckt für ihn großes Potential. Noch haben sich nicht viele auf die DNA-Reparatur gestürzt. Niehrs will das ändern. Es sei inzwischen klar, dass die DNA-Reparaturmechanismen nicht nur dafür da sind, die genomische Integrität bei Schäden wie Oxidation oder UV-Strahlung auf-recht zu erhalten. „Sie spielen offenbar auch in der Genregulation eine Rolle, indem sie die DNA chemisch verändern – nur in welchem Umfang, das ist noch offen“, erläutert Niehrs und verweist damit bereits auf künftige Forschungsthemen des IMB, in die auch Kollegen der Universität miteingebunden werden sollen.

„Beim Thema DNA-Reparatur gibt es bereits eine kritische Masse in Mainz, an die wir an-knüpfen können.“ In der Entwicklungsbiologie will sich Niehrs auf Differenzierungsprozesse bei Stammzellen konzentrieren: „Wir wollen uns nicht an den Karren derjenigen dranhän-gen, die Reprogrammierungstechniken ent-wickeln. Unser Fokus soll die Erforschung der Genregulation von pluripotenten Stammzellen sein.“ Er wünscht sich deshalb künftig Forscher, die mit neurobiologischen Modellen arbeiten – dann ließen sich hier auch hier Synergien mit den bestehenden biologischen Fakultäten der Universität herstellen.

Personalsuche: IMB wirbt mit guten Gehältern

Die Personalsuche steht für Niehrs, der zuvor am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg gearbeitet hat, deshalb ganz oben auf der Agenda. Insgesamt zwölf Gruppen sollen einmal am IMB forschen. Ein Coup ist ihm bereits gelungen: Christoph Cremer, langjähriger Experte für lichtbasierte Nanomikroskopie und gerade an der Universität Heidelberg als Professor emeritiert, wird am IMB eine Forschungsgruppe einrichten. Eine Gruppe soll zudem am DKFZ bleiben, um dort Koopera-tionsmöglichkeiten zu erleichtern.

Erste Angebote an Nachwuchsgruppenleiter sind ebenfalls gemacht. Werben will Niehrs vor allem damit, dass er als gGmbH viel flexi-bler als der öffentliche Dienst sein kann. „Wir können bessere Gehälter zahlen und nicht nur Nachwuchsgruppenleitern, sondern auch Seniorforschern ein gutes Angebot machen“, sagt Niehrs nicht ohne Stolz.

Mitglied der Gesellschafterfamilie von Boehrin-ger Ingelheim – gegründete, gemeinnützige Boehringer Ingelheim Stiftung zum Anlass, der Universität Mainz 100 Millionen Euro für ein neues Exzellenzzentrum in den Lebenswissen-schaften zu spenden. „Die Generation meiner Eltern ist in Mainz zur Schule gegangen“, sagte Otto Boehringer, Vorstandsvorsitzender der Stiftung und Nachfahre des Firmengründers, bei der Eröffnung. „Mit dem Institut wollen wir, ganz im Sinne des Stiftungsgründers, etwas an die Region, an unsere Heimat und die hiesige Universität zurückgeben.“

Das gestiftete Geld kommt nur der Forschung zugute. Die Baukosten in Höhe von 45,5 Mil-lionen Euro wurden von der Landesregierung Rheinland-Pfalz übernommen, das Grundstück von der Universität gestellt. Rechtlich ist das IMB als An-Institut und gGmbH an die Universität angedockt. Mit dem IMB rechnet sich Mainz auch gute Chancen im Exzellenz-Wettbewerb des Bundes aus. Anfang März hat man sich für die Runde der letzten sechs Elite-Uni-Kandidaten

Abb. 1: Professor Christof Niehrs (3.v.r.) und seine Gratulanten bei der offiziellen Eröffnung des Instituts für Molekulare Biologie an der Universität Mainz (v.l.): Georg Krausch, Kurt Beck, Doris Ahnen, Otto Boehringer und Andreas Barner.

Karrierewelt Fortbildung


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Report Zellmigrations-Assays

Identifizierung von Regulatoren der ZellmigrationIman van den Bout, Inositide Laboratory, Paterson Institute for Cancer Research, Manchester, GB; Dominique Fauvin, AMS Biotechnology, Abingdon, GB

Zu den wesentlichen Charakteristika von Krebserkrankungen gehört die Bildung von Metasta-sen. Die Zellmigration spielt bei der Metastasierung eine wichtige Rolle und ist ein komplexer Prozess, bei dem fokale Adhäsionsstellen, das Aktin-Zytoskelett und die Zellpolarität eine Rolle spielen. Phosphoinositide sind Inositol-Lipide, die als Signalmoleküle an diesen Prozessen mitwirken können und durch Lipid-Kinasen und Phosphatasen reguliert werden. Während manche dieser Regulatoren, wie etwa die Phosphatidylinositol-3-Kinasen (PI3K) bereits aus-giebig charakterisiert wurden, sind die Funktionen vieler dieser Proteine noch unbekannt. Zur Identifikation neuer Migrationsmodulatoren werden deshalb vielfach Serien von Subs-tanzbibliotheken durchsucht. Dabei spielen die Charakteristika der eingesetzten Migrations-Assays eine wesentliche Rolle. Boyden-Chamber-Assays haben den Nachteil, dass die Zellen während des Experiments nicht in Echtzeit beobachtet werden können. Beim Scratch-Assay variieren die Wundgrößen. Zudem können die Ergebnisse sowohl von Stoffen beeinflusst werden, die beschädigte Zellen freisetzen, als auch durch Schäden, die an der extrazellulären Matrix entstehen. Daher besteht ein erheblicher Bedarf an deutlich verbesserten Migrations-Assay-Alternativen. Die OrisTM Zell-Migrations-Assays weisen gegenüber den traditionellen Migrations-Assays gewisse Vorteile auf, wie etwa ihre Fähigkeit, die Migration in Echtzeit zu messen. Mit Hilfe von siRNAs und des OrisTM Zell-Migrations-Assays identifizieren wir hier neue Zellmigrationsregulatoren aus der Gruppe der Phosphoinositide.

Entfernen des Stöpsels beziehungsweise Auflösen des Gels wird der Erfassungsbe-reich – ein unbesiedelter Bereich mit einem Durchmesser von 2 mm in der Mitte jeder Wachstumsfläche – freigelegt, in den die umgebenden Zellen dann einwandern kön-nen (Abb. 1).

Dieses Assay-Format erlaubt es, die Zellmo-tilität während des gesamten Experimentes ungehindert zu verfolgen und gestattet die Nutzung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe zur phänotypischen Analyse der Zellen. Die Daten können mit Hilfe von Fluoreszenz-Mik-rotiterplatten-Readern, inversen Mikroskopen oder High Content Screening-/High Content Imaging Analysis (HCS/HCI)-Systemen quan-tifiziert werden.

Die Oris™ und Oris™ PRO-Kits sind im 96-Well-Format bzw. 96- oder 384-Well-Format lieferbar und haben entweder eine Standard-Gewebekultur-Oberfläche oder sind „TriCoated“ auf einer Platte beschichtet mit Basalmembranextrakt, Kollagen I und Fi-bronectin. Im Vergleich zur Boyden-Chamber oder zu Scratch-Assays erlauben es die Oris™ und Oris™ PRO Assays, aus jedem Assay-Well erheblich mehr Information zu gewinnen (Mi-grationsmodulation, Zellmorphologie, Anfär-bung subzellulärer Strukturen, Multiplexing von Farbmarkern, Toxizität und Zellvitalität), so dass Daten über die Zellform, Geschwindig-keit, Distanz und die Richtung der Migration gesammelt werden können.

Materialien und Methoden

Eine siRNA-Bibliothek gegen 90 Phospho-inositid-Modulatoren wurde von Sigma-Aldrich erstellt. NTER-Transfektionsreagenz, siRNA-Negativkontrolle und Rac-siRNA-Posi-tivkontrolle wurden von Sigma, DiI-C16 von Molecular Probes bezogen. MCF-10A-Zellen wurden in DMEM/F12 mit L-Glutamin, 5% Pferdeserum, 20 ng/ml EGF, 0,5µg/ml Hyd-rocortison, 100 ng/ml Choleratoxin, 10 µg/ml Insulin und Pen/Strep angezogen.

Der Oris™ Zell-Migrations-Assay wurde von AMSBIO bezogen. Assays wurden auf einem POLARstar Omega Multierfassungs-Mikrotiterplatten-Reader mit CO2-Inkubator von BMG Labtech analysiert.

MCF10A-Zellen wurden zu 120.000 Zellen je Assay-Well in 6-Well-Platten eingesät. Am darauffolgenden Tag wurden die Zellen mit 30 nM siRNA pro Assay-Well und NTER-Trans-fektionsreagenz gemäß Herstelleranleitung transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, gewaschen und gezählt. Die Zellen wurden dann auf 240.000 Zellen/ml verdünnt und mit 2,5 µM DiI bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nicht gebundene

Abb. 1: Die vier Hauptschritte beim Oris™ und Oris™ PRO Zell-Migrations-Assay: Um den Erfas-sungsbereich zu schaffen, verwenden die Oris™ Assays Besiedlungsstöpsel; die Ergeb-nisse können mit einem Mikrotiterplatten-Reader analysiert werden. Die Erfassungs-schablone, die am Oris™-Plattenboden befestigt wird, begrenzt den Analysebereich, so dass nur die Zellen gemessen werden, die in die Erfassungsbereich eingewandert sind. Die OrisTM PRO-Assays können automatisiert werden, weil für die Abgrenzung des Erfassungsbereichs selbstauflösendes, biokompatibles Gel benutzt wird. Die Zellmig-ration (Schritt 3 und 4) kann in Echtzeit beobachtet werden.

Die Oris™ Zell-Migrations-Assays sind repro-duzierbare, empfindliche und flexible Assays zur Analyse der Zellmigration. Bei den Assays werden Stöpsel aus medizinischem Silikon

(Oris™) oder nicht toxisches, biokompatibles Gel (BCG, Oris™ PRO) verwendet, um die Zellbesiedlung auf ringförmige Bereiche in den Wells des Assays zu beschränken. Nach

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Report Zellmigrations-Assays

Farbe wurde nach Zentrifugation mit dem Überstand entfernt und die Zellen dann in 600 µl Medium suspendiert. Drei Assay-Wells mit Besiedlungsstöpsel und eines ohne Stöpsel wurden mit 100 µl Zellsuspension besiedelt.

Am darauf folgenden Tag wurden die Inserts entfernt und das Medium heraus-geklopft. Anschließend wurde zu jedem Assay-Well 200µl Medium ohne Phenolrot gegeben. Die Erfassungsschablone wurde am Plattenboden befestigt und die Platte in einen vorgewärmten Platten-Reader mit CO2-Begasung gegeben. Die Fluoreszenz wurde mit einer Anregungswellenlänge von 544 nm bei 590 nm gemessen. Die Messun-gen wurden in 20 Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 24 Stunden durch die Öffnungen der Erfassungsschablone von der Plattenbodenseite vorgenommen.

Ergebnisse

MCF10AZellen wurden mit siRNA gegen 90 Phosphoinositid-Modulatoren transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 2.5µM DiI-C16 inkubiert, und dann in Oris 96-Well-Platten gesät. Um den Einfluss unterschiedlicher Zellanzahlen auf die Messwerte zu kompensieren, wurden für jede siRNA drei Assay-Wells mit Stöpseln und ein Assay-Well ohne Stöpsel verwendet.

Am nachfolgenden Tag wurden die Besied-lungsstöpsel entfernt, die Erfassungsschab-lone am Plattenboden angebracht und die Platte in einem beheizten Mikrotiterplatten-Reader mit CO2-Versorgung inkubiert. Die Fluoreszenz im Erfassungsbereich wurde

24 Stunden lang in 20 Minuten-Intervallen gemessen (Abb. 2).

Die Analyse der Daten wurde mit der von BMG Labtech entwickelten MARS-Analy-sesoftware durchgeführt. Als Kontrolle für die Zelldichte wurden Assay-Wells ohne Be-siedlungsstöpsel verwendet (Abb. 3).

Für alle Assay-Wells mit Stöpseln wurde aus den Werten der Messpunkte 7 bis 9 ein Basispunkt berechnet, der zur Normalisie-rung aller Werte verwendet wurde. Für jede Probe wurde von diesem Basispunkt bis zum Ende des Assays die Fläche unter der Kurve berechnet. Diese Werte wurden durch die Fläche unter der Kurve der Assay-Wells ohne Stöpsel dividiert und damit Durchschnitt und

Abb. 2: Messwerte des Plattenreaders mit Beispielen verschiedener Migrationsraten: Der Kurvenverlauf für jede siRNA zeigt die Fluoreszenzintensität in der Erfassungszone, über einen Zeitraum von 24 Stunden in Intervallen von 20 Minuten.

Standardabweichung aus den jeweils drei einzelnen Messwerten jedes Messpunktes gebildet.

Aus der Bibliothek von 90 Genen konnten zunächst 19 Gene identifiziert werden, deren Knock-down Auswirkungen auf die Zellmi-gration hatte. Für diese 19 Gene wurde der Migrations-Assay wiederholt, um reprodu-zierbare Treffer auszuwählen. Für neun dieser Gene war es uns möglich, eine Auswirkung auf die Migration (Zunahme oder Abnahme) zu belegen.

Zusätzlich wurde für jeden Knock-down die mRNA-Menge der entsprechenden Gene bestimmt, um unspezifische Effekte auszu-schließen.

Weiterhin haben wir für sechs dieser Gene siRNAs mit einer Zielsequenz verwendet, die sich von der ursprünglichen Zielsequenz unterschied, um dadurch die Möglichkeit un-spezifischer Effekte der siRNA zu minimieren. Die damit durchgeführten Migrations-Assays bestätigten, dass ein Knock-down jedes ein-zelnen Gens tatsächlich Auswirkungen auf die Zellmigration hat.

Schlussfolgerung

Mit Hilfe des Oris™ Migrations-Assays haben wir 90 Phosphoinositid-Modulatoren getes-ted, um dabei an der Zellmigration beteiligte Gene zu identifizieren. Bisher haben wir sechs Gene identifiziert, bei deren Knock-down sich die Migration verringert.

Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dass die Oris™-Technologie ein einfaches, robustes, effizientes und kostengünstiges Zellmigrationssystem für Untersuchungen mit hohem Durchsatz darstellt. In unabhän-gigen Vergleichstests konnte zudem gezeigt werden, dass für Experimente mit hohem Durchsatz ORIS-Assays gegenüber traditio-nellen Scratch-Assays bessere quantitative Ergebnisse liefern1. Die Anwendung der Oris™ Technologie verspricht, künftig sowohl ver-einfacht als auch schneller zu Erkenntnissen über die Zellmigration und Zellinvasion zu gelangen.

Literatur

[1] Gough W, Hulkower KI, Lynch R, McGlynn P, Uhlik M, Yan L, Lee JA (2011), A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay, J Biomol Screen. 2011 Feb;16(2):155-63.


Dominique Fauvin AMSBIOTel.: +49-(0)[email protected]

Abb. 3: Berechnung der relativen Zellmigration: Um den Einfluss unterschiedlicher Zellanzahl auf die Messwerte zu kompensieren, wurden AssayWells ohne Stöpsel besiedelt. Die Fluoreszenz dieser AssayWells wurde genutzt, um die Ergebnisse abzugleichen. Das Diagramm zeigt, dass diese Methode für den Abgleich erfolgreich ist.

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Branche Labormarkt im Umbruch

Milliardenschwere Übernahmen sind gang und gäbe im Labormarkt. Grund genug, in dieser LABORWELT-Serie einen Blick auf die wichtigsten Player, ihre Strategien und Deals zu werfen. Klar ist: Elefantenhochzeiten bleiben an der Tagesordnung. Die Preise blieben hoch, genauso wie die Wahrscheinlichkeit, dass der Labormarkt in zehn Jahren völlig anders darstellen wird als heute. Wie das Gesicht von Perkin Elmer in zehn Jahren aussehen wird, das weiß heute niemand. Zwar gilt das Unternehmen als eines der größeren in der Branche. Eine gescheiterte Übernahme in Milliardenhöhe offenbart jedoch die Schwächen des Gemischtwarenladens Perkin Elmer. Eine Analyse.

Perkin Elmer: 25 Cent für den GemischtwarenladenDr. Patrick Dieckhoff, BIOCOM AG

25 Cent haben Robert Friel um den Traum ge-bracht, aus Perkin Elmer einen der ganz großen Spieler der Labor- und Diagnostikbranche zu machen. Damit hätte sich der Firmenchef nach mehr als zehn Jahren in Diensten des ameri-kanischen Analysen- und Diagnostikkonzerns die Krone aufgesetzt. Nur 25 Cent. Bis in die Endrunde hatte es Perkin Elmer im Bieterver-fahren um den US-Konzern Beckman Coulter geschafft, der nach einigen Fehlschlägen (vgl. LBW 1/2011) selbst das „for sale“-Schild aus dem Fenster gehängt hatte. Im Rennen waren – dem Vernehmen nach – einige Investorenkonsortien und der Technologiekonzern Danaher. Der ist im Vergleich zu Perkin Elmer ein Riese. Zwar erwirtschaftete „PKI“, wie die Aktie an der New Yorker Nasdaq unter Händlern genannt wird, im vergangenen Jahr einen Umsatz von 1,7 Mrd. US-$ und steigerte den Gewinn im Vergleich zum Vorjahr sogar um das Vierfache auf 383 Mio. Euro. Gegen Danaher nimmt sich Perkin Elmer jedoch aus wie ein Zwerg. An der Börse wird das Unternehmen mit einem Wert von 2,9 Mrd. US-$ gehandelt – gerade einmal ein Zehntel des Wertes seines übermächtigen Bieterkonkurrenten. Und doch war der David kurz davor Goliath zu besiegen. Mit 83,25 US-$

pro Aktie war das Angebot von Friel & Co. das höchste – gerade einmal einen „Quarter“ über dem von Danaher. Perfekt eigentlich. Wenn es allein danach gegangen wäre, hätte Perkin Elmer den Zuschlag bekommen müssen. Fast 7 Mrd. US-$ – mehr als das Doppelte des eigenen Börsenwertes – hätte Friel aufbringen müssen, um sich den wesentlich größeren Konkurrenten einzuverleiben. Das spricht für seinen Mut – oder seine Verzweiflung. Die Investmentbanker von Goldman Sachs misstrauten dem Finanzie-rungskonzept von Perkin Elmer allerdings. Sie wendeten sich nach Abgabe des Angebotes di-rekt an Danaher und boten dem Unternehmen den Zuschlag an, wenn es 83,50 Euro bietet. Der Technologieriese schlug sofort ein. Beckman Coulter ging an Danaher. Perkin Elmer bekam keine Chance, das eigene Angebot aufzubessern. Die Firmenehe mit dem größeren Partner sei der bessere „Fit“ gewesen hieß es aus Kreisen, die mit dem Bieterprozess vertraut sind.

Breit aufgestelltes Konglomerat

Für Robert Friel fingen die Probleme damit erst an. Die Börse feierte Perkin Elmers Nie-

derlage. Ein Kursanstieg von fast 7% – offen-bar war auch unter Anlegern die Sorge groß, das Unternehmen könne sich verheben. Die Analysten kritisieren Perkin Elmers-Marken-strategie seit langem. Das 1937 gegründete Unternehmen mit Firmensitz in Waltham, Massachusetts, gilt als Gemischtwarenladen. Die umfangreiche Produktpalette umfasst die Bereiche „Human Health“ und „Environmen-tal Health“. Hier finden sich Klinikgeräte zum Screening von Neugeborenen genauso wie Gaschromatographen, Atomabsorptions- und Infrarotspektrometer, LC-Plattformen oder Kapillaren. Kein Wunder, dass rund 3.000 der 6.200 Angestellten damit beschäftigt sind, all die verschiedenen Produkte zu verkaufen.

Bunter Strauß an Übernahmen

Das Unternehmen hat in den vergangenen Jahren zahlreiche Firmen übernommen, darunter auch das Geschäft mit Screening-Automaten von Evotec. Zuletzt kaufte Perkin

Elmer zwei Firmen zu, die Software zum Da-tenmanagement entwickelt haben.

Gleichzeitig soll der Markenzoo aber kleiner werden. Bereits im vergangenen Jahr wurde Perkin Elmers Geschäft mit LEDs, Beleuchtun-gen auf Xenon-Basis und Infrarot-Sensoren für rund 500 Mio. US-$ an eine Beteiligungs-gesellschaft veräußert. Mit diesem Schritt wurde die Beschäftigtenzahl schlagartig um 2.000 Beschäftigte reduziert – rund ein Drit-tel der gesamten Belegschaft. Die Einnahmen sollen in Wachstumsmärkte reinvestiert wer-den. Vor allem das Feld molekulare Diagnostik erscheint dem Management vielversprechend. Ob Perkin Elmer den im Labormarkt ablaufen-den Konsolidierungsprozess als selbständige Firma überstehen wird, ist nicht sicher. Die ersten Gerüchte nach dem fehlgeschlagenen Beckman-Gebot stempelten die Firma zum Übernahmekandidaten. Unternehmenschef Friel ließ sofort dementieren. Die Firma stehe nicht zum Verkauf. Sollte der fehlende Viertel-dollar aber doch das Ende von Perkin Elmers Selbständigkeit eingeläutet haben, wäre die Tragik für Robert Friel komplett.Firmenzentrale von Perkin Elmer in Waltham, Massachusetts/USA

Perkin Elmer in Zahlen:

Umsatz: 1,7 Mrd. US-$Gewinn (EBITDA): 162 Mio. US-$Marge: 10,1%

Börsenwert: 2,9 Mrd. US-$Mitarbeiter: 6.200 CEO: Robert Friel

Umsätze nach Regionen:

– Europa (32%)– Nord- und Südamerika (46%)– Asien-Pazifik (22%)

Produktgruppen:

– Human Health (50%)– Environmental Health (50%)


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Marktübersicht: Lab Automation


Von klinischen Diagnostiklaboren über Service Facilities an Forschungszentren bis zu Screeningabteilungen in der Pharmazeutischen Industrie – Laborautomation ist in vielen Bereichen der Life Science unverzichtbar geworden. Den aktuellen Stand der Technik hat LABORWELT direkt nach der Lab Automation (Palm Springs, USA) bei den Anbietern abgefragt. Die Antworten der Automationsexperten und belastbare Infor-mationen zu ihren neuen Systemen finden Sie in dieser Marktübersicht.

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Karrierewelt Arbeitsmarkt

Life Sciences: Genügend Fachkräfte vorhanden Dieter Lingelbach, Managing Partner, Life Science Consult, München/Frankfurt

Die Life Sciences trotzen der Wirtschaftskrise und erleben in Deutschland einen bemerkenswerten Aufschwung. In der Summe ist die Bedeutung für den deutschen Arbeitsmarkt nicht sehr groß. Für den Moment entscheidender dagegen ist die Qualität der in diesem Industriezweig beschäftigten Mitarbeiter: viele Disziplinen, viele Sprachen, ein eher „buntes“ Publikum mit allerdings herausragen-den Qualifikationen und Spezialkenntnissen. Mehr und mehr gelingt es in Deutschland, nicht nur den Deutschen attraktive Arbeitsstellen anzubieten;immer mehr wird Deutschland auch für Fachkräfte aus dem Ausland hochattraktiv. Trotz von der Politik heraufbeschworener Schreckensszenarien ist keine Unterversorgung mit qualifizierten Mitarbeitern in Deutschland zu befürchten.

In manchen Aufgabenbereichen gibt es welt-weit maximal nur wenige Hundert Experten mit just der benötigten Qualifikation. Als einfa-ches Beispiel sei die Medikamentenzulassung in USA erwähnt, dem mit Abstand größten Markt für neuartige Arzneimittel. Hier ist es für die Unternehmen vorteilhaft, sogenannte „native speaker“ zu beschäftigen, die sich um einiges leichter tun, die jeweiligen bürokra-tischen Hürden der Zulassungbehörden zu überwinden. Zugleich müssen die Mitarbeiter viel Sachkenntnis mitbringen.

In den meisten der fast 650 in Deutschland in den Life Sciences aktiven Unternehmen ist Englisch bereits die Standardsprache. Nur noch in Ausnahmefällen werden Präsentationen intern wie extern in Deutsch verfasst. Zugleich wird mit sogenannten Relocation-Agenturen zusammengearbeitet, die es den „Gästen“ einfacher machen sollen, in Deutschland Fuß zu fassen. In den größeren Städten gibt es im Regelfall internationale Schulen mit Unterricht in Fremdsprachen. Wer sich in der Branche tummelt, unterscheidet nur noch schwerlich zwischen „hier“ und „dort“: Europa, und oft auch transtlantische Kooperationen, sind täglich gelebte Wirklichkeit.

Die häufig in der Öffentlichkeit geäußerte Sorge, es würden hier Arbeitsplätze verloren-gehen, ist vollkommen unbegründet. Tausende Deutscher studieren und arbeiten jeweils für mehrere Jahre im Ausland oder lassen sich dort auf Dauer nieder. Der deutsche Life Sciences-Sektor blickt sehr positiv auf das qualifizierte, spezialisierte und zudem flexible Personalan-gebot – nur finden muss man den passenden Mitarbeiter noch.

Referenzen

[1] www.biotechnologie.de des BMBF und transkript[2] Stichprobe aus interner Life Science Consult Kontaktdatenbank,

entspricht mit etwa 5.000 Kontakten etwa einem Drittel der deutschen akademischen Erwerbstätigen in den dedizierten Biotech-Unternehmen


Dieter LingelbachLife Science Consult Mü[email protected]

Abb. 1: Querschnittstechnologie Life Sciences

Abb. 2: Der deutsche Arbeitsmarkt für Life Sciences – zunehmend attraktiv für Arbeitneh-mer aus dem Ausland, überwiegend mit guten akademischen Abschlüssen

Über die Biotechnologie als Industriezweig, oder neuerdings die „Life Sciences“, wird seit Mitte der siebziger Jahre gesprochen. Dabei werden bis heute oft große Hoffnungen mit dem Gebiet verbunden: neue Therapien für bisher unheilbare Krankheiten, neue Produk-tionsverfahren mit nicht nur besseren Kosten-strukturen, sondern auch mit signifikant weni-ger Umweltbelastungen, neue Frühdiagnostik für bislang schwer erkennbare Krankheiten. In 2009 zählte Deutschlands Life Sciences-Sektor 31.600 Mitarbeiter in 645 Unternehmen1. Dazu kommen noch einmal rund 27.000 in For-schungseinrichtungen; zusammen machen diese allerdings gerade einmal 0,1 Prozent aller Beschäftigten in Deutschland aus. Beachtlich ist allerdings das Wachstum von 5% in einem anerkannten Krisenjahr. Diese Unternehmen präsentieren für die Welt wichtige Neuerun-gen wie etwa einen Früherkennungstest für Darmkrebs (Epigenomics) oder das erste The-rapeutikum gegen die schmerzhafte Bauch-wassersucht (Trion Pharma). Deutschland gilt nach den USA als das führende Land in Sachen industrieller Proteinherstellung für neuartige therapeutische Zwecke. Wichtige Standorte sind hierfür Biberach, Laupheim, Penzberg, Jülich. Auffälliger als die absolute Anzahl der

Beschäftigten ist die Vielfalt der vertretenen Studienrichtungen und der Qualifikationen der Beschäftigten: Nicht nur die erwarteten Fächer Biologie, Chemie und Medizin sind ver-treten, zunehmend auch das Ingenieurwesen, die Biophysik, die Biochemie, die Physikalische Chemie, die Physik, die Tiermedizin und die Lebensmittelwissenschaften (vgl. Abb. 1). Die letztgenannten differenzierenden Fachrichtun-gen stellen bereits 25% der im Industriezweig Beschäftigten. Mehr als 60% der Beschäftigten sprechen mehr als nur Englisch zusätzlich zu ihrer Muttersprache. Fast 20% der Beschäftig-ten kommt aus dem Ausland (Abb. 2), etwa 10% aus Westeuropa, 3% aus den USA, jeweils 2% aus dem Nahen Osten/Indien und Osteuropa2. Es sind mehr als die Hälfte dieser Menschen promoviert, und 45% verfügen über ein Diplom oder einen Master (vgl. Abb. 2). Bemerkenswert ist, dass die Hälfte von ihnen nochmals über Zusatzausbildungen wie etwa den MBA verfü-gen. Fazit: ein hochkarätiges, qualifiziertes und spezialisiertes Personalangebot mit grenzüber-schreitenden persönlichen Erfahrungen.

Nun zu folgern, es müsste in Deutschland besser ausgebildet werden, geht am Thema vorbei. Wie in anderen Disziplinen auch wird zunehmend spezielleres Wissen eingefordert:

40_LW2_11_Lingelbach_tg.indd 40 30.03.2011 14:11:00 Uhr


Service Stellenmarkt

Akademischer Stellenmarkt Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt (auch online), der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu Ihre Anzeige (Ausschreibungstext als Word-Datei, Logo – jpg oder tiff, 300 dpi Auflösung) an [email protected]. Annahmeschluss für die nächste LABorWeLt-Ausgabe „Biomarker-Identifikation“ (erscheinungstermin 09.06.2011) ist der 27. Mai 2011.

Alle Stellenanzeigen finden Sie auch unter:

www.laborwelt.de

The Hannover Medical School, Institute for Molecular and Translational Thera-peutic Strategies (IMTTS) offers a

PHD-STUDENT POSITION (E 13/2, TV-L)

The potential candidate will develop microRNA-based therapeutic strategies for pulmonary diseases (see http://www.mh-hannover.de/imtts.html).

This project is funded by the DFG. Highly motivated individuals with a strong background in molecular and cellular biology, especially siRNA and microRNA-based techniques are encouraged to apply. We implemented multiple microRNA techniques ranging from high-throughput approaches to translational thera-peutic in vivo strategies at IMTTS. MHH has the largest grant funding volume among medical faculties in Germany and is one of the leading research centers in Europe. We offer work in a dedicated research team, state of the art equipment, competitive projects and an overall international and well funded environment. The position is already available.

The IMTTS is an equal opportunity employer; qualified women are explicitly encouraged to apply. Handicapped persons with equal qualifications will be preferred.

Applicants should send a CV, a brief outline of their research experience and interests and two letters of reference by mail or e-mail to:

Prof. Dr. Dr. Thomas Thum · [email protected]

http://www.mh-hannover.de/imtts.html

Hannover Medical School · Institute for Molecular and Translational Therapeutic Strategies (IMTTS) · OE 8886 · Carl-Neuberg-Straße 1 · 30625 Hannover · Germany

Please send your application until 30th April 2011.

Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e. V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality-Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

Das Institut für Entwicklungsgenetik, AG „Neuronale Netzwerke“ (Dr. Andrea Huber Brösamle) sucht zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

Doktorand/in 2011/1028

Ihre Aufgaben

– Untersuchung der Konsequenzen von Verschaltungsdefekten und Verlet-zungen im Nervensystem mittels Verhaltensuntersuchungen, histologischen Analysen und Zellkulturversuchen

Ihre Qualifikationen

– abgeschlossenes Hochschulstudium in Biologie, Chemie oder verwandte Bereiche

– fundierte Kenntnisse in Neurowissenschaften, Molekularbiologie

– hohe Motivation und Teamorientierung

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen

– umfangreiches Fortbildungsangebot

– zunächst für drei Jahre befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Andrea Huber BrösamleE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-4117

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Institut für EntwicklungsgenetikIngolstädter Landstr. 185764 Neuherberg



Karriere beginnt bei uns

Biologie-Laborant(in), Biologisch-Technische(n) Assistent(in),

Chemie-Laborant(in) oder Chemisch-Technische(n) Assistent(in)

Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien

Unser Profil: Im Rahmen unserer Forschungsprojekte entwickeln wir neuarti-ge Strategien zur Synthese von Glykokonjugaten. Im Vordergrund stehen dabei Multi-Enzymsysteme, um auf der Basis chemisch modifizierter Ausgangssub-strate Oligosaccharide zu synthetisieren, zu isolieren sowie chemisch und biochemisch zu charakterisieren. In der Lehre sind wir in den B.Sc./M.Sc. Stu-diengang Angewandte und Molekulare Biotechnologie eingebunden.

Ihr Profil: Sie haben einen sehr guten Berufsabschluss als Biologie-Laborant(in), Biologisch-Technische(r) Assistent(in), Chemie-Laborant(in)oder Chemisch-Technische(r) Assistent(in). Sie verfügen bereits über praktische Erfahrungen in folgenden Arbeitsgebieten: – Kultivierung von Mikroorganismen – Prote-inaufreinigung (z.B. chromatographische Verfahren, etc.) – Proteinchemische Methoden (z.B. SDS-PAGE, Western-Blot, etc.) – Molekularbiologische Metho-den (z.B. PCR, Plasmidisolierung, etc.) – Instrumentelle Analytik (HPLC, CE) KandidatInnen sollten sehr gute praktische Erfahrungen und Kenntnisse auf dem Gebiet der Molekularbiologie und Proteinreinigung und -charakterisie-rung haben. Erfahrungen in der Enzymtechnologie wären vorteilhaft. Erwartet werden Teamfähigkeit und Interesse, sich mit hohem eigenverantwortlichem Engagement in ein interdisziplinäres Umfeld einzubringen.

Ihre Aufgaben: Das Aufgabengebiet der(s) Mitarbeiterin(s) im Lehr- und For-schungsgebiet Biomaterialien umfasst molekularbiologische Arbeiten sowie die Produktion und Charakterisierung von rekombinanten Enzymen und deren Verwendung in der enzymatischen Synthese von Oligosaccharidliganden.

Unser Angebot: Die Einstellung erfolgt im Beschäftigtenverhältnis. Die persön-lichen Voraussetzungen müssen erfüllt sein. Die Stelle ist zum nächstmögli-chen Zeitpunkt zu besetzen und unbefristet. Es handelt sich um eine Teilzeit-stelle mit der Hälfte der regelmäßigen Wochenarbeitszeit. Die Eingruppierung richtet sich nach dem TV-L. Die RWTH ist als familiengerechte Hochschule zertifiziert. Wir wollen an der RWTH Aachen besonders die Karrieren von Frau-en fördern und freuen uns daher über Bewerberinnen. Frauen werden bei glei-cher Eignung, Befähigung und fachlicher Leistung bevorzugt berücksichtigt, sofern sie in der Organisationseinheit unterrepräsentiert sind und sofern nicht in der Person eines Mitbewerbers liegende Gründe überwiegen.

Bewerbungen geeigneter schwerbehinderter Menschen sind ausdrücklich erwünscht.

Ihr Ansprechpartner:Prof. Dr. Lothar EllingTel.: +49 (0) 241 80 28350 E-Mail: [email protected] www.biotec-biomat.rwth-aachen.de

Ihre Bewerbung richten Sie bitte bis zum 15.04.2011 an: Prof. Dr. Lothar Elling Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien, Institut für Biotechnologie (BioVI) und Helmholtz-Institut für Biomedizinische Technik, Worringer Weg 1,52074 Aachen oder per E-Mail [email protected]

Das Institut für Molekulare Infektionsforschung (Institutsleiter Herr Prof. Dr. Jörg Vogel) der Julius-Maximilians-Universität sucht

2 Technische Assistenten/-innen oder Biologielaboranten/-innen

Bewerber/innen sollten mit Methoden der allgemeinen Molekularbiologie, Mikrobiologie und/oder Zellbiologie vertraut sein. Die Stellen sind in der AG jeweiligen Arbeitsgruppen finden Sie unter: http://www.infektionsforschung.uni-wuerzburg.de.

Die Aufgaben sollen nach Einarbeitung weitgehend selbständig durchgeführt werden. Die Stellen können ab dem 1. Mai 2011 oder nach Absprache besetzt werden und sind zunächst auf 1 Jahr befristet. Die Stellen sind auch in Teilzeit besetzbar.

Die Vergütung erfolgt nach TV-L. Schwerbehinderte Bewerberinnen und Bewerber werden bei ansonsten im Wesentlichen gleicher Eignung bevorzugt eingestellt.

Bewerbungen bitte mit Betreff „TA-Stelle“ schriftlich oder per E-Mail bis 15. April 2011 an:

[email protected] · Institut für Molekulare Infektionsbio-logie · Josef-Schneider-Str. 2 · Bau D15 · 97080 Würzburg

The Division of Molecular and Experimental Surgery is a basic research unit in the Department of Surgery of the Medical Center of the University of Erlangen. In the focus of our research is the regulation of blood vessel function in infectious and inflammatory diseases. We are looking for a

PhD Student (Biology, Biochemistry, Chemistry, Molecular Medicine)

The research topic will be the systematic analysis of patho-functions of Kaposi’ sarcoma-associated human herpesvirus-8 (HHV-8) genes in endothelial cells using systems biology approaches. Required technology such as reversely transfected microarray technology, differential-in-gel 2D chromatography (DIGE) and procedures for gene transduction into primary endothelial cells are well established.

The project will be carried out in collaboration with the Graduiertenkolleg 1071 – Viruses of the Immune System. This program is established in coope-ration with Harvard Medical School. The student will benefit from structured scientific supervision within the Graduiertenkolleg mentoring program and from courses and activities offered by the training program.

The successful applicant should have: (1) a diploma/master in biology, chemistry, biochemistry or molecular medicine, (2) profound knowledge in cell biology and virology, (3) good English language skills, and (4) a friendly and highly motivated attitude.

The position will be for 3 years. Salary will be according to the regulations of the GErnam Research Association (DFG)

Additional information: http://www.grk1071.uni-erlangen.de/home http://www.chirurgie.uk-erlangen.de/e1846/e442/index_ger.html

Please send your application with CV, addresses of two references, and a letter explaining your motivation to join the group before April 15, 2011 to: Prof. Dr. rer. nat. Michael Stürzl · Division for Molecular and Experimental Surgery · Department of Surgery · University Medical Center Erlangen · Schwabachanlage 10 · 91054 Erlangen · Tel.: +49-(0)9131- 8533109 · Fax: +49-(0)9131-8532077 · e-mail: [email protected]



Als europaweit führendes Forschungszentrum mit der Ausrichtung „Environmen-tal Health“ (Verknüpfung von Biomedizin und Umweltforschung) analysieren die Forscherinnen und Forscher des Helmholtz Zentrums München grundlegende Prozesse der Krankheitsentstehung, der Schädigung sowie der Abwehr- und Kompensationsfähigkeit des Organismus.

Wir sind eine Forschungseinrichtung des Bundes und des Freistaats Bayern mit Sitz in Neuherberg, im Norden Münchens, und sind Mitglied der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren e. V., der größten öffentlichen Forschungsorganisation Deutschlands.

Das Helmholtz Zentrum München als Träger des Bayerischen Frauenförderprei-ses sowie des Total E-Quality-Zertifikates strebt eine Erhöhung des Frauenanteils an und fordert deshalb qualifizierte Interessentinnen auf, sich zu bewerben. Schwerbehinderte werden bei gleicher Eignung bevorzugt.

Das Institut für Bioinformatik und Systembiologie sucht innerhalb des vom BMBF geförderten Netzwerks „Systems Biology Consortium on Metabotypes (SysMBo)“ zum nächstmöglichen Zeitpunkt eine/n

Scientific Manager SysMBo (m/w)2011/1010

Ihre Aufgaben

– Verantwortlichkeit für alle Administrations- und Organisationsfragen inklu-sive der Erstellung von Berichten sowie der Organisation von Workshops/Meetings innerhalb des SysMBo-Projektes

– Unterstützung der Koordination des 3-jährigen interdisziplinären Programm-verbundes, welches 9 Gruppen umfasst

– Öffentlichkeitsarbeit in wissenschaftlichen und öffentlichen Medien

Ihre Qualifikationen

– PhD in den Biowissenschaften, vorzugsweise in Biologie/Biochemie

– gründliche Kenntnisse der Forschungsaufgaben in SysMBo

– Erfahrung in Scientific Project Management

– ausgeprägte Team- und Kommunikationsfähigkeit

Unser Angebot

– Tätigkeit in einem innovativen, zukunftsorientierten Unternehmen

– umfangreiches Fortbildungsangebot

– zunächst für 7 Monate befristetes Arbeitsverhältnis und eine Vergütung nach TVöD (EG 13)

Bitte senden Sie Ihre Bewerbung bevorzugt per E-Mail an:Hans-Werner MewesE-Mail: [email protected]: +49-(0)89 3187-3580

Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH)Institut für Bioinformatik und SystembiologieIngolstädter Landstr. 185764 Neuherberg

Die Protagen AG ist ein führender Anbieter von Produkten, Dienstleistungen und Softwarelösungen für die Protein-forschung.

Zur Verstärkung unseres Teams suchen wir baldmöglichst eine(n)

Biologisch-Technische(n) Assistenten/in oder Biologie-Laboranten/in

Ihre Aufgabe

Im Geschäftsbereich Protein Services erwartet Sie eine abwechslungsreiche Tätigkeit im Bereich der Proteinana-lytik. Zu Ihren Aufgaben zählen die Identifi zierung und Cha-rakterisierung von Proteinen unterschiedlichster Herkunft. Hierbei setzen Sie eine große Bandbreite an proteinanaly-tischen Methoden ein und werten die Daten selbstständig aus. In einem Umfeld modernster technischer Ausstattung erfolgt ein Teil der von Ihnen durchgeführten Arbeiten unter GMP.

Ihr Profi l

Sie haben Ihre Ausbildung mit Erfolg abgeschlossen und verfügen über mehrjährige Berufserfahrung im Bereich der Protein- und Peptidanalytik. Die massenspektrometrische Analyse von Biomolekülen sowie die Anwendung der HPLC-Analytik gehören zu Ihrem täglichen Handwerks-zeug.Außerdem besitzen Sie gute Englisch- und fundierte EDV-Kenntnisse. Sie arbeiten zuverlässig und genau und verfü-gen über Ausdauer und Organisationstalent. Engagement und Kundenorientierung zählen zu Ihren Stärken.

Wir bieten Ihnen

Besonderes Augenmerk legen wir auf eine optimale Einar-beitung und die individuelle Personalentwicklung aller Mit-arbeiter entsprechend ihrer Stärken und Potentiale. Unser Miteinander ist geprägt von Offenheit, Wertschätzung, einer lebendigen Feedbackkultur sowie respektvollem Umgang und schafft auf diese Weise ein motivierendes Betriebsklima.

Wir freuen uns auf Ihre vollständigen Bewerbungsunterla-gen per Email oder per Post mit Angabe zum möglichen Eintrittstermin und Ihrer Gehaltsvorstellung.

Protagen AG z. Hd. Dr. Petra WeingartenHead of Human ResourcesOtto-Hahn-Straße 15, 44227 DortmundTel.: 0231/[email protected] · www.protagen.de

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The Friedrich Loeffler Institute of Medical Microbiology at the University Greifswald is looking for a

PhD candidate (Dr. rer. nat.)

We are seeking a highly motivated and skilled candidate with an interest in host-pathogen interactions. The aim of the research is to unravel the bacterial intracellular survival strategies using Burkholderia pseudomallei as a model organism. The main focuses are the intracellular expression of virulence factors and the relation of anaerobic metabolism and virulence. The results of our work should lead to a better understanding of host pathogen interaction and furthermore to better approaches in therapy and vaccination.

The appointee will pioneer work on the anoxic stages of B. pseudomallei and will learn and use different molecular, microbiological, cell biological as well as immu-nological approaches. The state-of-the-art proteome and genome facilities present at the University of Greifswald, will guarantee excellent study conditions.

The University and Hanseatic City of Greifswald is located near the bay of Greifswald, which is part of the Baltic Sea between the islands of Rügen and Usedom and offers great recreational possibilities.

Please note that we cannot refund any travelling and accommodation costs.

Please direct applications (cover letter, CV, publication list) until the 18th April 2011 to:

Prof. Dr. Ivo Steinmetz · Friedrich Loeffler Institute of Medical Microbiology ·

University Medicine Greifswald · Martin-Luther-Str. 6 · 17475 Greifswald · Germany · [email protected]

The PhD Research Training Group (DFG Graduiertenkolleg 1482)

“Interface functions of the intestine between luminal factors and host signals”

established at the Technische Universität München (TUM) offers a distinguished PhD program

for 15 doctoral students starting from May 2011 onwards

The coherent research program spans across issues of Human Nutrition and Physiology, Gastroenterology,

Microbiology, Immunology and Pharmacology.

Project description: The PhD Research Training Group addresses specific intestinal functions in health and disease such as transport of nutrients and non-nutrient components, gut microbial functions with challenges by pathogens and probiotics and the responses of the enteric nervous system, the intestinal and systemic immune systems and the hormonal control circuits that determine overall body homeostasis. Special emphasis is put on the role of environmental factors causing a disbalance of intestinal functions that lead and contribute to the development of chronic inflammatory bowel diseases. The program allows state of the art research in a cross-disciplinary fashion.

All research projects are grouped under three large thematic areas:

Area 1: Interactions of food constituents with the gut microbial ecosystem and epithelial functions of the host.

Area 2: The response of the sub-epithelial cell systems to the luminal chal-lenges.

Area 3: The systemic feedback loops affecting epithelial functions.

Requirements:

– High scored degree in Biology (Molecular Biology, Microbiology and/or Cell Biology), Nutritional Science, Biochemistry, Molecular Biotechnology or related disciplines

– Profound laboratory experience

– Fluency in spoken and written English

– Scientific commitment and creativity

– Excellent communication and teamwork skills

Doctoral students in the 3-year program will receive a monthly grant of € 1,365 plus family and child care allowance, if applicable.

The Technische Universität München is an equal opportunity employer. There-fore women are especially encouraged to apply. Handicapped applicants having equivalent experience will be preferred.

Candidates should send their applications (C.V., copies of all relevant exami-nation certificates and academic testimonials) under specification of their preferred thematic area until April 15, 2011 preferably by E-mail directly to the program coordinator:

Prof. Dr. Hannelore Daniel · Technische Universität München · Wissen-schaftszentrum Weihenstephan · Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie · Gregor-Mendel-Str. 2 · D-85350 Freising-Weihenstephan · Germany · E-Mail: [email protected]

Further information is available at: http://www.grk1482.de

Postdoc Positionon Mouse and Human Pluripotent Germ Stem Cells We invite applications of highly motivated individuals for a postdoc position on mouse and human pluripotent germ stem cells.

The successful applicant will work in an international team and apply standard techniques of cellular reprogramming of both female and male germ stem cell specification and differentiation. Working language is English.

The Institute for Anatomy and Cell Biology studies genetic programs that determine cell identity and developmental potential, with a focus on (i) germ stem cells, (ii) neuronal stem cells and their differentiated progeny, and (iii) stem cell reprogramming and induction of pluripotency.

Qualifications and experience: The successful candidates should have experi-ence with standard techniques in cell biology and cell culture.

Salary will be according to TV-L scale depending on qualification. The po-sition is available immediately and initially funded for 3 years, an extension is possible. The University of Heidelberg is an equal opportunity employer, committed to employ handicapped individuals and to increase the number of female employees.

The applicant is requested to fulfill teachings responsibility on German.

Applications including full CV and contact information of 2 referees should be sent by e-mail to [email protected]

Professor of Anatomy and Cell Biology · Institute for Anatomy and Cell Biology · Im Neuenheimer Feld 307 · 69120 Heidelberg

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Die Arbeitsgruppe von Herrn Dr. Dr. Tomo Šaric am Zentrum für Physiolo-

gie und Pathophysiologie der Uniklinik Köln sucht zum nächstmöglichen

Zeitpunkt in Teilzeit befristet eine/n

naturwissenschaftliche/n Doktorandin/en

Ziel des Projektes ist die Etablierung der Kulturbedingungen für eine

Expansion und kardiale Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in

einem Bioreaktorsystem. Wir bieten ein überaus attraktives und zukunfts-

trächtiges Forschungsthema, eine gute Einarbeitung und Betreuung, ein

breites Methodenspektrum, die Mitarbeit in einem kollegialen Team mit

lokalen, nationalen und internationalen Kooperationspartnern und viele

Möglichkeiten zur eigenen wissenschaftlichen Entfaltung.

Ihr Aufgabengebiet umfasst:

– Planung, Durchführung und Dokumentation experimenteller Arbeiten,

– Zusammenfassung, Präsentation und Interpretation der Ergebnisse,

– Projektberichterstattung,

– Koordinierung des Projektes mit unseren Kooperationspartnern.

Ihre Qualifikationen:

– abgeschlossenes Studium der Naturwissenschaften oder Medizin,

– solide Vorkenntnisse auf dem Gebiet der Biotechnologie und praktische Erfahrung mit Zellkultivierung in einem Bioreaktorsystem,

– ein sehr gutes Diplom bzw. Examen,

– hohe Motivation und überdurchschnittliches Engagement,

– gute Englischkenntnisse und

– die Fähigkeit zur Teamarbeit und zu selbständigem Arbeiten.

Die Vergütung erfolgt im Rahmen eines Promotionsstipendiums.

Für Auskünfte steht Ihnen Herr Dr. Dr. Tomo Saric unter der Rufnummer (0221) 478-86686 oder per e-Mail ([email protected]) zur Ver-fügung.

Haben wir Ihr Interesse geweckt?

Dann richten Sie Ihre aussagekräftige und vollständige Bewerbung bitte bis zum 15.04.2011 per Mail zusammengefasst in einer pdf-Datei an [email protected]

www.uni-koeln.de

16 PhD Fellowships in Life Sciences The International Max Planck Research School – Molecular Biomedicine (IMPRS-MBM) and the Graduate Program Cell Dynamics and Disease (CEDAD) offer 16 PhD Fellowships in Life Sciences.

CEDAD and IMPRS-MBM - jointly run by the University of Münster and the Max Planck Institute for Molecular Biomedicine - offer integrative approaches to biomedical research with a strong emphasis on imaging.

Research areas: Cell and Molecular Biology · Stem Cell Biology · Developmental Biology · Neurobiology · Vascular Biology · Immunology · Microbiology · and more.

Applications for the 3-year PhD program can be submitted from 28 Februa-ry – 13 May 2011. Projects start in October 2011. Applications can only be submitted via our online system.

For online application and further information go to www.cedad.uni-muenster.de.

The program offers excellent scientific and transferable skills training. The program language is English. There are no tuition fees. Successful candidates will receive a competitive tax-free fellowship as well as support with admini-strative matters, accomodation, visas etc. We invite applications from highly qualified and motivated students of any nationality. We are looking forward to your application for a PhD fellowship in Münster, „the world’s most liveable city“ (LivCom Award 2004).

Contact: [email protected]

Postdoc Positionon the Generation of Human Pluripotent Stem Cells by Cellular Reprogramming (iPs Cells)

We invite applications of highly motivated individuals for a postdoc position on mouse and human pluripotent germ stem cells.

The successful applicant will work in an international team and apply standard techniques of cellular reprogramming of both female and male germ stem cell specification and differentiation. Working language is English.

The Institute for Anatomy and Cell Biology studies genetic programs that determine cell identity and developmental potential, with a focus on (i) germ stem cells, (ii) neuronal stem cells and their differentiated progeny, and (iii) stem cell reprogramming and induction of pluripotency.

Qualifications and experience: The successful candidates should have experi-ence with standard techniques in cell biology and cell culture.

The applicant is requested to fulfill teachings responsibility on German.

Salary will be according to TV-L scale depending on qualification. The po-sition is available immediately and initially funded for 3 years, an extension is possible. The University of Heidelberg is an equal opportunity employer, committed to employ handicapped individuals and to increase the number of female employees.

Applications including full CV and contact information of 2 referees should be sent by e-mail to [email protected]

Thomas Skutella · Professor of Anatomy and Cell Biology · Institute for Anatomy and Cell Biology · Im Neuenheimer Feld 307 · 69120 Heidelberg


Service Verbände Seite bitte abtrennen – per Fax an 030-264921-11

Dt. Ver. Gesell. f. Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin e.V. (DGKL)

Geschäftsstelle der DGKLIm Mühlenbach 52 b53127 BonnTel.: +49-(0)-228-92-68-9522Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Proteomforschung

c/o MPI für BiochemieAm Klopferspitz 18a82152 MartinsriedTel.: +49-(0)-89-1897-9007Fax: +49-(0)[email protected]

BIO Deutschland

Tegeler Weg 33/berlinbiotechpark10589 BerlinTel.: +49-(0)-30-3450593-30 Fax: +49-(0)-30-3450593-59 [email protected]

Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM)

c/o Institut für Hygiene und Med. MikrobiologieCarl-Neuberg-Straße 130625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-4655Fax: +49-(0)-511-532-4355www.dghm.org

bts (Biotechnologische Studenteninitiative e.V.)

c/o BIOCOMStralsunder Straße 58–5913355 BerlinTel.: +49-(0)-2649-21-21Fax: +49-(0)-2649-21-11www.btsev.de

Gesellschaft für Genetik

c/o HZM – Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit/Inst. of Develop-mental GeneticsTel.: +49-(0)-89-3187-2610Fax: +49-(0)-89-4620www.gfgenetik.de

Gesellschaft für Signaltransduktion

c/o Prof. Dr. Ralf HassMed. Hochschule HannoverAG Biochemie u. Tumorbiol.30625 HannoverTel.: +49-(0)-511-532-6070Fax: +49-(0)-511-532-6071www.sigtrans.de

Gesellschaft für Pharmakologie und Toxikologie

Geschäftsstelle der DGPTAchenbachstraße 4340237 DüsseldorfTel.: +49-(0)-211-600-692-77Fax: +49-(0)[email protected]online.de

Nationales Genomforschungsnetz

c/o DKFZIm Neuenheimer Feld 58069120 HeidelbergTel.: +49-(0)-6221-424-743Fax: +49-(0)[email protected]

Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik

Institut für Humangenetik Calwer Straße 772076 TübingenTel.: +49-(0)-7071-2977692Fax: +49-(0)-7071-295171peter.bauer@ med.uni-tuebingen.dewww.hihtuebingen.de/dgng/

Netzwerk Nutrigenomik

Netzwerk NutrigenomikArthur-Scheunert-Allee 11414558 NuthetalTel.: +49-(0)-33200-88-301Fax: +49-(0)[email protected]

DiagnostikNetBB

Netzwerk DiagnostikBerlin-Brandenburg e.V.Neundorfstraße 1716761 HenningsdorfTel.: +49-(0)-3302-55-199-14Fax: +49-(0)[email protected]bb.de

Verband der DiagnosticaIndustrie e.V.

Verband der Diagnostica-Industrie e.V.Neustädtische Kirchstr. 810117 BerlinTel.: +49-(0)-30-200-599-40 Fax: +49-(0)[email protected]

Österreichische Reinraumgesellschaft (ÖRRG)

ÖRRGNeudorf 41A-8262 Ilz Tel.: +43-(0)-3385-8117 Fax: +43-(0)[email protected] www.oerrg.at

Österreichische Ges. f. Laboratoriums medizin & Klinische Chemie

ÖGLMKC GeschäftsstelleInfomedica-KEG, Xenius BehalTullnertalgasse 72A-1230 WienTel./Fax: +43-(0)-1889-6238 [email protected]

www.oeglmkc.at

Kontakt zu Verbänden Die Mitglieder der nachfolgenden Fachgesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für eine Mitarbeit oder einen Beitritt interessiert, erreicht die Fachgesellschaften unter den folgenden Kontakt daten:

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Service Produktwelt

Hamamatsu Photonics

Kompaktsystem zur Messung absoluter Quantenausbeuten Licht-emittierender Materialien

Standardproben, im Gegensatz zur her-kömmlichen Relativmethode. Die Bedienung ist einfach und intuitiv, von der Auswahl der Anregungswellenlänge über die verschiede-nen Messungen bis hin zur Analyse. Analy-sefunktionen umfassen die Berechnung der Quantenausbeute, ihre Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge, Anregungsspektren und Farbwertberechnung.

Das Quantaurus-QY ist in zwei Versionen erhältlich: Das Standardmodell (C11347- 11) misst in einem Spektralbereich von 300 nm bis 950 nm. Das NIR-Modell (C11347- 12) erlaubt Messungen im Bereich von 400 nm bis 1100 nm.

Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH Eva-Maria TomicArzbergerstraße 1082211 HerrschingTel.: +49-(0)8152-375-139Fax: +49-(0)[email protected] www.hamamatsu.de

Sartorius Stedim Biotech baut sein Portfolio für die Qualitätssicherung im Labor weiter aus. Microsart® @vance® heißt die neue Produktlinie der etablierten Microsart®-Familie, die speziell für die mikrobiologische Qualitätskontrolle in der Pharma- und Bio-pharmaindustrie entwickelt wurde und auf Single-Use-Technologien basiert.

Microsart® @vance® ermöglicht effektive Workflows im Qualitätssicherungslabor und erfüllt höchste Sicherheitsstandards. Damit wird die neue Produktlinie den hohen An-forderungen der Pharmaindustrie mehr als gerecht. Den Auftakt bilden die Single-Use-Filtereinheiten Microsart® @filter 100 und 250. Sie wurden speziell für den quantitativen Nachweis von Mikroorganismen in Pharma-zeutika und Kosmetika entwickelt.

Die Filtereinheiten sind steril verpackt, an-schlussfertig und können sofort eingesetzt werden. Durch das optimierte Design wird die gesamte Probe filtriert, ohne Reste an der Wandung zu hinterlassen. Somit entfällt der Spülvorgang nach der Filtration. Filter und Trichter bilden eine sterile, komplette Einheit und reduzieren dadurch das Risiko von Sekundärkontaminationen auf ein Mi-nimum.

Die Membran aus Cellulosenitrat vereint eine effektive Rückhaltung von Mikroorga-

nismen mit hohen Flussraten und optimalem Koloniewachstum. Das aufgedruckte Gitter-netz erleichtert das Auszählen, speziell bei höheren Keimzahlen und Mikrokolonien. Die transparenten Filtereinheiten mit Graduie-rungen am Trichter lassen Füllmenge und Filtrationsfortschritt leicht erkennen. Der Klick-Fit-Verschluss kann einfach geöffnet und der Trichter schnell entfernt werden. Die Filtermembran ist problemlos zu entnehmen, da die Filterbasis über Aussparungen für die Pinzette verfügt.

Sartorius Corporate Administration GmbHKarin Gaisböck37070 Göttingen Tel.: +49-(0)551-308-3615Fax: +49-(0)551-308-3572karin.gaisboeck@sartorius.comwww.sartorius-stedim.com

Hamamatsu Photonics präsentiert die neue Quantaurus-Serie kompakter Systeme zur Charakterisierung von Licht-emittierenden Materialien, wie fluoreszierenden Farbstof-fen, organischen Metallkomplexen, OLEDs, LED-Phosphoren und Quantendots.

Das Quantaurus-Tau misst Fluoreszenz-lebensdauern bis ca. 100 ps. Das neue Quantaurus-QY basiert auf der bewährten Technologie des C9920- 02g Systems und ist ein Kompaktsystem zur Messung absoluter Quantenausbeuten Licht-emittierender Materialien in Pulverform, dünnem Film oder in Lösung. Flüssige Proben können zu-sätzlich bei -196°C untersucht werden. Das Quantaurus-QY benötigt keine bekannten

Die extratiefe 2 ml-Mikroplatte mit quadra-tischen Vertiefungen von Porvair Sciences Ltd. wurde bei Reinraumbedingungen aus ultrahochreinem Polypropylen hergestellt. Das macht die 96-Well-Platte zur ersten Wahl für die Lagerung, Fraktionierung oder Festphasenextraktion von hochreinen Ver-bindungen.

Die Mikroplatten von Porvair bieten eine hohe Qualität zu einem unschlagbaren Preis. Sie sind exakt auf den ANSI/SBS-Standard abgestimmt und so mit allen automati-sierten Systemen zur Probenverarbeitung, Mikrotestplatten-Readern und Reinigungs-vorrichtungen kompatibel. Durch ihren erhöhten Rand ermöglicht die Mikroplatte eine hochreine thermische Versiegelung und verhindert Kreuzkontaminationen zwischen den Vertiefungen.

Porvair

Erste Wahl für hochreine Verbindungen

Die extratiefe 2ml-Mikroplatte mit quadrati-schen Vertiefungen ist bei Bedarf auch steril und frei von Ribonuklease beziehungsweise Desoxyribonuklease erhältlich. Sie wird in versiegelten Hüllen zu je fünf Platten in Vorratskartons mit 50 Stück geliefert. Die Platten können lange Zeit bei -80 °C gelagert werden, ohne die Leistung bei der Lagerung von Verbindungen zu beeinträchtigen.

Porvair Sciences bietet eine breite Palette von extratiefen Platten mit verschiedenen Volumina und Plattenformaten an. So ver-fügt das Unternehmen über die optimale Lösung für viele Anwendungen bei der Probenvorbereitung, -lagerung und allge-meinen Analyse. Weitere Information oder eine kostenlose Probe können angefordert werden bei Porvair Sciences Ltd.

Porvair Sciences Ltd.Dr. Bill BradburyTel.: +44-(0)[email protected]

Sartorius Stedim Biotech

Quantitativer Nachweis von Mikroorganismen


Service Produktwelt

Ocean Optics

Vielseitiges Nahinfrarot-Spektrometer für Diagnostik und Qualitätssicherung

Bio&Sell

Super-Polymerase: Besonders schnell und genauNeu im Portfolio bei Bio&SELL ist die F&P Su-per-Polymerase. Hier steht F&P für fast&proof, womit die Eigenschaften des artifiziellen Enzyms exakt beschrieben werden. Die F&P Super-Polymerase ist mit ihrer Proofreading-Aktivität hundertmal genauer als herkömm-liche Taq-Polymerase und doppelt so schnell. Und zehnmal genauer als PFU-Polymerase. Auch mit der Fähigkeit, deutlich längere DNA-Fragmente in der PCR zu synthetisieren, ist die F&P Super-Polymerase jeder anderen derzeit am Markt erhältlichen DNA-Polymerase deut-lich überlegen. Mit humaner genomischer DNA werden erfolgreich bis 12KBp-Fragmente, mit Lambda-DNA sogar 15 KBp-Fragmente amplifiziert. Gleichzeitig ist das Enzym in der Lage, die GC-Brücken der DNA zu besetzen und den Schmelzpunkt zu senken. Dadurch eignet es sich besonders zur Amplifikation GC-reicher Sequenzen. Die Fusionierung der Eigenschaften – Proofreading-Aktivität, Amplifikation sehr langer DNA-Fragmente,

Stabilität gegen Inhibitoren und Eignung für GC-reiche DNA-Abschnitte – machen die F&P Super-Polymerase von Bio&SELL zu dem, was sie ist: eine Super-Polymerase. Die F&P Super-Polymerase von Bio&SELL ist recht günstig in zwei Packungsgrößen zu 200 units (Artikel BS 1.19471) oder 1000 units (Artikel BS 1.19515) erhältlich.

Bio&SELL e.K. Uwe Scheiwen Lohweg 27 90537 FeuchtTel.: +49-(0)[email protected]

Dunn Labortechnik

Dispenser für einfachere Protein-Kristallisation

Art Robbins Instruments hat kürzlich sein er-folgreiches Gryphon Dispenser-System um eine weitere optionale modulare Komponente erwei-tert. Durch die Aufrüstung des Gryphon-Systems mit dem neuen innovativen Lipidic Cubic Phase (LCP) Spritzen-Modul wird die Kristallisation von Membranproteinen entscheidend vereinfacht.

Diese Injektionsnadel erlaubt das Dispensieren von bis zu 25 nl einer viskosen Lösung mit einem CV von < 5% in weniger als 90 Sekunden.

Der LCP-Gryphon kann darüber hinaus zu-sätzlich mit einer modularen Nano-Dispenser-Nadel ausgestattet werden, die das präzise Dispensieren von 100 nl bis zu 100 µl ermöglicht. Das Gryphon-System ist damit bestens gerüstet für die automatisierte Kristallisation von Pro-teinen aller Art. Zusätzlich zu den modularen Komponenten verfügt das Basis Gryphon-Gerät über zwei Plattenpositionen, eine Waschstation sowie einen Dispenserkopf mit flexiblen Nadeln für 96-Well- beziehungsweise 384-Well-Platten mit flexiblen Nadeln.

Mit dem LCP-Gryphon-Modul erweitert Art Robbins Instruments die Vielseitigkeit seiner Dispenser-Familie. Neben dem Gryphon sind von Art Robbins noch das größere Phoenix-System sowie das Cobra148-System erhältlich. Das Cobra148-System ermöglicht ein schnelles Dispensieren von 50 nl bis zu 2 ml. Das Phoenix-System verfügt unter anderem über neun Plattenstationen und ist somit ideal für den Hochdurchsatz geeignet.

Der LCP Gryphon wird erstmalig in Europa auf der European Lab Automation (ELA 2011) in Hamburg vom 30. Juni bis 1. Juli und anschließend auf dem XXII IUR (International Union of Crystal-lography) Kongress in Madrid, Spanien, vom 22. bis 29. August ausgestellt.

Dunn Labortechnik GmbHAndy ZöllnerThelenberg 653567 AsbachTel.: +49-(0)2683-430-94Fax: +49-(0)[email protected]

Ocean Optics hat ein neues Spektrometer in sein Programm kompakter Nahinfrarot-Spek-trometer aufgenommen. Das NIRQuest512-2.2 ist ein leistungsstarkes Spektrometer mit einer Empfindlichkeit von 900-2200 nm, das ideal für Feuchtigkeitsnachweise, chemische Analysen, hochauflösende Laser- und opti-sche Glasfasercharakterisierungen ist.

Das NIRQuest512-2.2 verwendet einen hochstabilen 512-Element Hamamatsu Indium-Gallium-Arsenid (InGaAs)-Array-Detektor in einer kompakten optischen Bank mit einem zweistufigen thermoelektrischen Kühler und geräuscharmer Elektronik. Je nach Konfiguration ist eine optische Auflö-sung von ~0,5 nm - 5,0 nm (FWHM) möglich. Höherauflösende Konfigurationen sind insbesondere für die Charakterisierung von Lasern nützlich.

Ex terne Hardwareauslösefunk tionen ermöglichen es, Daten zu erfassen, wenn ein externes Ereignis eintritt, oder nach der Datenerfassung ein Ereignis auszulösen. Die vom Spektrometer verwendete Betriebssoft-ware SpectraSuite ist eine modulare, auf Java basierende Spektroskopieplattform. In Ver-bindung mit dem Remora-Netzwerkadapter von Ocean Optics können mehrere Nutzer über Ethernet oder WiFi-Verbindung auf das Spektrometer zugreifen. Mit dem neuen NIRQuest512-2.2 bietet Ocean Optics jetzt NIR-Spektrometeroptionen mit Spektralem-

pfindlichkeiten von 900-1700 nm, 900-2050 nm, 900-2200 nm und 900-2500 nm an. Mehrere Gitter-, optische Bank- und Zube-höroptionen ermöglichen die Konfiguration des NIRQuest-Systems für eine Vielzahl von Anwendungen in medizinischer Diagnostik, Qualitätssicherung von Lebensmitteln, Ana-lyse von Arzneimitteln oder Umweltüberwa-chung. Weitere Informationen unter www.OceanOptics.eu.

Ocean Optics Jessica van HeckMaybachstraße 11 73760 OstfildernTel.: +49-(0)711 341-696-0 Fax: +49-(0)[email protected] www.oceanoptics.eu

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Service Kalender


12.4.11Functional Food 2.0, BonnInfo: Forschungskreis der Ernährungsindustrie (FEI) (E-Mail: [email protected], Web: www.fei-bonn.de)

12.-13.4.11BioKunststoffe 2011, HannoverInfo: Lucia Femerling, Carl Hanser Verlag GmbH (E-Mail: [email protected],Web: www.hanser-tagungen.de/biokunststoffe)

12.4.111st Well-Characterized Biological Product Day, DortmundInfo: Stella Tundo, Protagen AG(Tel.: +49-231-9742-6300, E-Mail: [email protected], Web: www.protagen.de)

April 2011 – Juni 2011

Veranstaltungskalender8.4.-9.4.11Retinal Degeneration – Vision and Beyond, PotsdamInfo: Barbara Ritzert, ProScience Communication, (E-Mail: [email protected],Web: www.potsdam-meeting.de)

11.-13.4.11Downstream Bioprocessing, BremenInfo: Gesellschaft deutscher Chemiker (E-Mail: [email protected], Web: www.gdch.de/fortbildung)

11.-12.4.11Charité Entrepreneurship Summit 2011, BerlinInfo: Annika Weschler, Stiftung Charité (E-Mail: [email protected],Web: www.charite-summit.de/2011/)

8.-10. Juni 2011, Ulm

7th Bio Production Forum

Das Bio Production Forum der European Compliance Academy (ECA) hat sich inzwi-schen zur Plattform für den Erfahrungsaus-tausch in den Feldern Entwicklung und „Fill and Finish“ von Biopharmazeutika entwi-ckelt. Dieses Jahr lockt zudem eine Besichti-gung bei Boehringer Ingelheim. Info: www.bio-conference.org

24. Mai 2011, München

BioVaria zeigt Innovationen

Zum vierten Mal öffnet der euro-päische Technologietransfer- und Patentpräsentations event Biovaria in München seine Pforten. Wissenschaftler stellen rund 50 Patente vor, aus zehn prä-sentierenden Spin-offs wird der Gewinner des BioVaria-Spin-off-Awards ausgewählt. Erstmals präsentieren in diesem Jahr auch Pharmafirmen ihre Lizenzwünsche. Info und Anmeldung: www.biovaria.org

12. April 2011, Dortmund

Proteincharakterisierung

Der „1st Well-characterized Biological Pro-duct Day“ bringt Experten aus der Bio- analytik zusammen. Erörtert werden Me-thoden und Anwendungen zur Entwick-lung von innovativen Proteintherapeutika. Info: www.protagen.de/news/1st-well- characterized-biological-product-day.html

12.4.11Clustertreffen Nachwachsende Rohstoffe, StraubingInfo: BioCampus Straubing GmbH(Tel.: +49-9421-785161, E-Mail: [email protected], Web: www.biocampus-straubing.de)

14.4.11Einwegsysteme in der (bio)pharmazeutischen Produktion, LaupheimInfo: BioRegion Ulm e. V./BioPharMaXX(Web: www.biopharmaxx.de)

19.4.11CONTACT 2011, HeidelbergInfo: BioContact e.V./DKFZ(E-Mail: [email protected],Web: www.contact2011.info)

3.5-6.5.11Respiratory Drug Delivery Europe 2011, BerlinInfo: Claire Jahan , Valois Pharma(E-Mail: [email protected],Web: www.rddonline.com)

3.5-4.5.114. Bundesalgenstammtisch, HamburgInfo: Andrea Köhl, DECHEMA e.V.(E-Mail: [email protected],Web: www.dechema.de/algen2011)

3.5-5.5.11European Mycoplasma Testing & European Microbiology Conference, Prag (CZ)Info: CONCEPT Heidelberg/European Compliance Academy (E-Mail: [email protected], Web: www.gmp-compliance.org)

4.5.11Risk Management in Life Sciences Companies, Brüssel (B)Info: Uta Holmer, BIOCOM AG(E-Mail: [email protected],Web: www.biocom.de/events)

11.5.117th Biomarker Workshop, ReutlingenInfo: NMI Uni Tübingen(Web: www.nmi.de/biomarker2011)

12.5.11LaborForum 2011, Frankfurt am MainInfo: Industrieverband Spectaris(E-Mail: [email protected],Web: www.spectaris.de)

13.-14.5.11Bio:Fiction, Wien (AT)Info: Albert Beckmann, IDC: Organisation for International Dialogue and Conflict Management, Wien (E-Mail: [email protected],Web: www.bio-fiction.com)

15.-19.5.11IFCC-WorldLab and Euro MedLab, BerlinInfo: MZ Congressi s.r.l.(E-Mail: [email protected],Web: www.berlin2011.org)

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Ausblick

Inserentenverzeichnis

Astra Biotech GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13Beckman Coulter Genomics Inc . . . . . . . . 7BIOCOM AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17Biometra GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5BIO .NRW . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . U3Bio&Sell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27Bio&Sell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Deutsche Messe AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25Donau-Uni Krems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Fluidigm Europe B .V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Hamilton Robotics GmbH . . . . . . . . . . . . . 33IBA GmbH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9Microsynth AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11New England Biolabs GmbH . . . . . . . . . . . U4Porvair Sciences Ltd . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31PROTAGEN AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43Roche Diagnostics GmbH . . . . . . . . . . . . . U2Sartorius Stedim Biotech . . . . . . . . . . . . . . 15SOCOREX ISBA S .A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Ernährungsforscher und -firmen wehren sich von Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT

Seit 2004 überprüft die EU-Behörde EFSA im Auftrag der Europäischen Kommission, ob Behaup-tungen über gesundheitsfördernde Effekte von Lebensmitteln wissenschaftlich gerechtfertigt erscheinen. Der Nachweis ist indes kniffelig, denn um die sogenannten Health Claims zu belegen, dürfen keine klinischen Endpunkte genutzt werden. Statt dessen sind Korrelationen zu möglichst gut validierten Biomarkern gefragt – zum Beispiel dem Cholesterinspiegel als Risikofaktor für Athe-rosklerose oder der Thrombozytenaggregation als Maß für das Risiko, Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu entwickeln. Auf dieser Basis ist von der EFSA nicht weniger gefragt als die Präsentation eines Ursache-Wirkungszusammenhangs. Einen solchen zu belegen, fällt sogar der finanzkräftigen Pharmabranche schwer, in deren Studien die 10- bis 20-fache Zahl an Probanden eingeschlossen wird. Gegen das Vorgehen des zuständigen EFSA-Expertenpanels NDA sowie die der Prüfung zugrundeliegenden Health Claims-Verordnung laufen jetzt Wissenschaftler Sturm, die Probiotika erforschen und entwickeln. Denn trotz in zahlreichen Publikationen belegtem Gesundheitsnutzen der Probiotika haben die EFSA-Gutachter noch keinen einzigen Health Claim zu Probiotika aner-kannt. Ein Zusammenschluss von mehr als 150 Wissenschaftler setzt sich jetzt gegen die Entwertung ihrer Forschungsergebnisse zu Wehr. Die Gruppe um den holländischen Arzt Ger Rijkers fordert eine Änderung der Health Claims-Verordnung und mehr Transparenz darüber, welche Kriterien die EFSA eigentlich anlegt. Denn bisher entzog sich die Behörde konkreten Aussagen mit dem Hinweis, dass jeder Claim individuell geprüft werde und man sich in einem Lernprozess befinde.

„Um eine Wirkung eines Probiotikums gegen Durchfall zu zeigen, ist die Untersuchung an Personen mit Durchfall aus wissenschaftli-cher Sicht am sinnvollsten“, meint Rijkers, der stellvertretend für die Gruppe ein Statement ins Internet gestellt hat und auf EU-Ebene bereits kräftig für eine Änderung der Health Claims-Verordnung wirbt . Diese lässt indes nur Aussagen zu vorbeugenden Effekten von Lebensmitteln zu . Die Heilung – und damit die Untersuchung klinischer Endpunkte – bleibt Medikamenten vorbehalten .

Wirkung belegt

Eine Metaanalyse von 61 klinischen Studien mit mehr als 8 .000 an Durchfall leidenden Probanden der unternehmensunabhängigen Cochrane Collaboration legt indes nahe, dass

LABORWELT (ISSN 1611-0854) erscheint zweimonatlich im Verlag der

BIOCOM Media GmbHStralsunder Straße 58–5913355 Berlin, GermanyTel./Fax: 030/264921-0 / 030/[email protected]

RedaktionDipl.-Biol. Thomas GabrielczykTel.: 030/264921-50

AnzeigenleitungOliver SchnellTel. 030/264921-45, [email protected]

LeserserviceAngelika Werner, Tel. 030/264921-40

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ThemaBiomarkerSowohl die Automationsbranche als auch sämtliche Genomics-, Proteomics- und Metabolomics-Anbieter profitieren vom derzeit stark forcierten Trend zur perso-nalisierten Medizin und Ernährung sowie weltweit angestoßenen Großprojekten . Führende Konsortien und Anbieter stellen im LABORWELT-Themenheft „Biomarker“ die Trends bei der Produkt- und Methoden-entwicklung dar – von Sequencing, GWAS, DNA-Methylierung bis hin zu Arrays, ELISAs und bildgebenden Verfahren .

Marktübersicht: Aufreinigungs-KitsWerbekunden bietet diese Ausgabe eine opti male Plattform für ihre Produkt-und Image anzeigen . Reservieren Sie Ihren Wer-beplatz in der LABORWELT-Themenausgabe bis spätestens zum 27 . Mai 2011 . Ergänzend zum Themenschwerpunkt „Biomarker“ veröffentlichen wir eine Marktübersicht „Nukleinsäure-Aufreinigungskits“ . Infor-mationen zu Ihrer möglichen Teilnahme gibt Oliver Schnell (Tel .: +49-30-264921-45, E-Mail: o .schnell@biocom .de) .

Vorschau Heft 2/2011

die EFSA-Gutachter irren . Denn der statistischen Auswertung der Cochrane-Forscher zufolge helfen die Probiotika gegen akuten Durchfall und verkürzen die Dauer der Durchfälle mit 60-%iger Wahrscheinlichkeit und einen ganzen Tag . Für Rijkers und Kollegen ein Beleg dafür, dass die Evaluierungskriterien des EFSA nicht stimmen . Auch Unternehmen hatten moniert, dass ihre Studien nicht anerkannt werden, obgleich sie in der Regel 200 bis 400 Probanden einschlie-ßen und 300 .000 bis 500 .000 Euro kosten . Im Januar etwa hatte die EFSA den Claim von Marktführer Danone abgewiesen, dass Actimel durch C. difficile bedingtem Durchfall vorbeuge . Ob es einen Schulterschluss von Forschern und Firmen geben wird, ist noch unklar . Vielleicht warten sie darauf, ob die EFSA von allein um-schwenkt . Anfang April will die Behörde neue Bewertungen und Richtlinien veröffentlichen – unter anderem zu Probiotika .

50_LW2_11_Ausblick.indd 50 01.04.2011 11:51:40 Uhr

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LABORWELT 02/2011

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