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Listerien in Lebensmitteln in Österreich

Dr. Ariane PietzkaLeiterin Nationales Referenzlabor für ListerienZentrum für lebensmittelbedingte Infektionskrankheiten / Institut für medizinische Mikrobiologie und HygieneListerien-Referenzlabor: Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis?Graz, 19.Oktober 2012

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Was sind Listerien?

•Stäbchenförmige Bakterien•Größe: 0.4 x 1-1.5 µm•Grampositiv•nicht-sporenbildend• fakultativ anaerob•Benannt nach britischem Chirurgen Joseph Lister (1827 –1912)

Bildquellen: Wikimedia Commons

Listeria monocytogenes

Joseph Lister

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Was sind Listerien?•Bekannte Species:

- L. fleischmannii- L. grayi

o L. murrayi- L. innocua- L. ivanovii

o L. ivanovii subspec. ivanoviio L. ivanovii subspec. londoniensis

- L. monocytogenes - pathogen für Mensch und Tiero 13 Serotypen (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, [4ab], 4c, 4d,

4e, 7)3a, 3b, 3c, 4a, 4c ,4d, 4e, 7 sehr selten in LM, selten Listeriose verursachend

- L. marthii- L. rocourtiae - L. seeligeri- L. welshimeri

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Besonderheiten / Eigenschaften von Listerien?• Verursachen Listeriose• Risikogruppen:

- Immunsupprimierte (Vorerkrankungen)- Schwangere- Ältere

• Aufnahme v.a. durch verzehrfertige Produkte – kein Erhitzen vor dem Essen

- z.B.:- Geräucherter Fisch, Meeresfrüchte- Salat (bereits gewaschen / geschnitten)- Käse- Rohwurstprodukte- Speiseeis

• Möglichkeiten der Kontamination des Lebensmittels:- Rohmaterial- Gesamter Herstellungsprozess (Reifung, Schlachtung,

Schneidemaschinen, Gerätschaften,…)- Verpackung des Produkts

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Besonderheiten / Eigenschaften von Listerien?• Sehr anspruchslos

- Sauerstoffanspruch: aerob bis mikroaerophil, Vermehrung unter Vakuum und modifizierter Atmosphäre möglich

- Vermehrung auch bei Kühlschranktemperatur

- Fähigkeit zur Biofilmbildung auf rostfreien Stahloberflächen, Böden, Kühlräumen,…

• Vorkommen: ubiquitär (Boden, Pflanzen, Kompost, Silage, Abwässer, Kot von Haus- und Nutztieren,…)

• Befall führt nicht zum Verderb von Lebensmitteln

- Aussehen und Geruch des Lebensmittels bleibt unverändert

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Lebensmittelsicherheit

Lebensmittelkategorie Grenzwerte Stufe, für die das Kriterium gilt

Verzehrfertige Lebensmittel für Säuglinge oder für med. Zwecke

In 25 g nicht nachweisbar (n=10)

In Verkehr gebrachte Erzeugnissewährend der Haltbarkeitsdauer

Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für Säuglinge und für med. Zwecke), die die Vermehrung von L. monocytogenesbegünstigen können

In 25 g nicht nachweisbar (n=5)

Bevor das Lebensmittel die unmittelbare Kontrolle des Lebensmittelunternehmers (Hersteller) verlassen hat

100 KBE/g (n=5)

In Verkehr gebrachte Erzeugnissewährend der Haltbarkeitsdauer

Andere verzehrfertige Lebensmittel (nicht für Säuglinge und für med. Zwecke), die die Vermehrung von L. monocytogenes nicht begünstigen können

100 KBE/g(n=5)

In Verkehr gebrachte Erzeugnissewährend der Haltbarkeitsdauer

• Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 über mikrobiologische Kriterien für Lebensmittel- gültig für Listeria monocytogenes

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LMSVG Lebensmittelsicherheits-und Verbraucherschutzgesetz

•LMSVG §38 Abs.6 Pflichten der Unternehmer - Im Rahmen der Eigenkontrolle betreffend das Vorliegen

von Zoonosen und Zoonoseerregern…,… die Isolate dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor zu übermittelnoder deren unverzügliche Übermittlung durch das untersuchende Labor zu veranlassen.

• LMSVG §74 Pflichten des Labors- Labors die im Rahmen von §38 Abs.1 Z6 das Vorliegen von

Zoonosen und Zoonosenerregern untersuchen, haben Isolate unverzüglich, längstens jedoch binnen zwei Tagen, dem gemäß §75 zuständigen Referenzlabor anonymisiert und unter Hinweis auf die Produktgruppe zu übermitteln

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LMSVG Lebensmittelsicherheits-und Verbraucherschutzgesetz

•LMSVG §75 Aufgabe des Nationalen Referenzlabors- Koordination der Tätigkeiten der Agentur, der

Untersuchungsanstalten der Länder sowie der gemäß §73 autorisierten Personen

- Durchführung von Laborvergleichstests - Weiterleitung von Informationen des

Gemeinschaftsreferenzlabors (EU-RL) an das BMG, die Agentur, die Untersuchungsanstalten sowie an die gemäß §73 autorisierten Personen

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Einsendeformular für Listeria monocytogenes Isolate

http://www.ages.at/ages/ueber-uns/oeffentliche-gesundheit/referenzzentralen/rl-listerien/

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Listerien in Lebensmitteln

• Betroffene Lebensmittel:- Rohes Fleisch, Rohwurst,

Rohmilch, Käse, (Räucher)-Fisch, Fleisch- und Geflügelerzeugnisse, Frischgemüse, Ready-to-eat Salate,…

• Österreich 2012: 239 Isolate (Zeitraum Juli-September)

- 112 Fleisch/Wurst Isolate- 45 Fisch, Meeresfrüchte,

Umfeldproben Fisch-Schlachtung- 35 Frischkäse, Milch, Schnittkäse,

Käseschmierwasser- 3 Salat, Gemüse (RTE,

Fertigprodukte)- 22 Oberflächen (OLB),

Wischproben- 22 sonstige (Lebensmittel, nicht

genau definiert)

Fleisch, Wurst ~ 47 %

Fisch, Meeresfrüchte~ 19 %

Käse~ 15 %

OLB~ 9 %

Sonstige LM~ 9 %

Salat, Gemüse~ 1 %

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Ablauf am NRL

Als L. monocytogenes identifizierte Isolate:- Serotypisierung (Multiplex-PCR)

o Unterscheidung in 4 Serogruppen- inlB -Typisierung

(High-Resolution Melting (HRM), Sequenzierung)o Weitere Unterscheidung der PCR-Serogruppen

- Goldstandard: Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese (PFGE)

o Weitere Unterscheidung der inlB – Sequenztypen

• Pflege der Daten in einer Datenbank (Bionumerics, Applied Maths)

• Versand von Prüfberichten an einsendende Labors• Stammsammlung

Wachstum von L. mono auf Rapid L´Mono Agar

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Typisierung I

• Serotypisierung mit PCR (Doumith et. al. 2004)- 4 Serogruppen L. monocytogenes (lanes 1-10)

o 1/2a, 3ao 1/2b, 3b, 7o 1/2c, 3co 4b, 4d, 4e

- Listeria species (lanes 11-16)

L. seeligeri

L. ivanovii

L. welshimeri

L. innocua

1/2a 1/2b 1/2c 4b 3a 3b 3c 4d 4e 7 4a 4c

L. monocytogenes

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Serotypisierung (PCR)

Fleisch, Wurst

69%

23%

5% 3%

1/2a, 3a

1/2c, 3c

4b, 4d, 4e

1/2b, 3b, 7

Fisch, Meeresfrüchte

71%2%

20%

7%

1/2a, 3a

1/2c, 3c

4b, 4d, 4e

1/2b, 3b, 7

Käse

18%

82%

1/2a, 3a

1/2b, 3b, 7

Verteilung der PCR-Serogruppen innerhalb verschiedener Produktgruppen:

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Typisierung II:inlB-SequenztypenHigh-Resolution Melting (HRM)

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High-Resolution Melting

• inlB: Genabschnitt mit Serotyp-spezifischen Unterschieden in der DNA-Sequenz

• Unterschiede in der DNA-Sequenz führen zu verschiedenen Schmelzkurven beim High-Resolution-Melting

inlB-F

inlB-R

339

343 351 359

367 371 373 380

386 387 390 393 396 397 398 400

470

457455

466

459441 445 446

421 422 426 427 435 439

401 403 410 411 417

inlB Sequenz (Accession Nr.: NC 012488) L. monocytogenes 4b

Virulenzgen: inlB (Internalin B)

500

bp P

CR

-Pro

duktCodons mit

Punktmutationen (SNP´s)

Forward Primer

Reverse Primer

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High-Resolution Melting

Amplification Curves Melting Curves

Amplification (PCR) High Resolution Melting

Normalized Melting Curves

Normalized and Shifted Melting CurvesNormalized and Temp-Shifted Difference Plot

Temperature-Shift

Difference Plot

Normalization

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High-Resolution Melting

Difference Plot:18 verschiedenen inlB–Sequenztypen (ST) von 192 L. monocytogenes Isolaten Fünf phylogenetische Gruppen (PG) Serotypen: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4d, 4e, und 7Basislinie: inlB ST-2

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High-Resolution Melting

inlB ‐Sequenztypen bei Isolaten aus Fleisch/Wurst

1/2b, 3b, 73%

4b, 4d, 4e5%

1/2c, 3c22%

inlB‐ST 817%

inlB‐ST 714%

inlB‐ST 216%

inlB‐ST 191%

inlB‐ST 164%

inlB‐ST 1519%

inlB‐ST 131% inlB‐ST 12

2% inlB‐ST 96%

1/2a, 3a69%

Verteilung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:

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Typisierung III: Pulsed-Field-Gel-Elektrophorese

•Genetischer Fingerprint•Schnitt des gesamten Genoms mit 2 Restriktionsenzymen

- AscI- ApaI

•Vergleich der Muster mit eigener Datenbank (Bionumerics, Applied Maths)

- Abgleich mit Humanisolaten

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Pulsed-Field Gelelektrophorese

inlB‐ST 164%

inlB‐ST 191% inlB‐ST 21

6%

inlB‐ST 714%

inlB‐ST 817%inlB‐ST 9

6%

inlB‐ST 122%

inlB‐ST 131%

inlB‐ST 1519%

1/2c, 3c22%

4b, 4d, 4e5%

1/2b, 3b, 73%

1/2a, 3a69%

1 PFGE-Muster

9 PFGE-Muster

3 PFGE-Muster

3 PFGE-Muster

4 PFGE-Muster

Unterscheidung der inlB-Sequenztypen bei Fleisch/Wurst-Isolaten:

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Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis?

•„Multinationaler Listerioseausbruch“ 2009/2010Foto: AGES

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Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“

Produktrückruf: 23. Januar 2010

66 L. monocytogenes Isolate aus Quargel untersucht:- Klon 1: 2 Isolate- Klon 2: 64 Isolate

Ende November 2009: Wechsel der Schutzkultur

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Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“

Klon I

PFGE_AscI PFGE_ApaI

PatientenisolatIsolat aus Quargel

Serotyp 1/2ainlB-ST 15

Klon II

PFGE_AscI PFGE_ApaI

PatientenisolatIsolat aus Quargel

Serotyp 1/2ainlB-ST 9

14 Patientenisolate

-12 aus Österreich (davon 3 †)- 2 aus Deutschland (davon 2 †)

20 Patientenisolate

-13 aus Österreich (davon 2 †)- 6 aus Deutschland (davon 1 †)- 1 aus der Tschechischen Republik

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Listerioseausbruch 2009/2010 verursacht durch „Quargel“• Dezember 2009: Kassabons der Patienten werden gesammelt

- Hinweis auf Quargelkauf bei 3 von 7 Patienten- Regelmäßiger Quargelkonsum bei 8 von 9 befragten Patienten- Fall-Kontroll-Studie ergab eindeutigen Zusammenhang

• Molekulare Subtypisierung bestätigt epidemiologische Untersuchungen – liefert Nachweis für Quargel als Verursacher des multinationalen Listerioseausbruchs

• Zusammenhang Klon I/ Klon II identifiziert

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Akademischer Luxus oder Public Health Erfordernis?• Aufgaben des NRL´s:• Abklärung epidemiologischer Fragen auf nationaler /

internationaler Ebene - Datenweitergabe- Seit Januar 2012: Pro Quartal – Abgleich der Typisierungen von

Patientenisolaten mit Lebensmittelisolateno Regelmäßige Überwachung gewährleisteto Schnellere Reaktion im Fall eines Ausbruchs

• Gewährleistung eines raschen Datenaustauschs mit Nachbarländern

• Internationaler Methodenabgleich mit EU-RL• Führen einer Stammsammlung• Nationale Referenzlabor für Listeria monocytogenes Public Health Erfordernis

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Danke!

Core Unit Molekularbiologie WienWerner Ruppitsch Anna Stöger

Lebensmittelmikrobiologie GrazSigrid FleckKathrin Hauser Silke KonrathAndrea Kormann-KlementClaudia SchlagenhaufenHildegard Stangl

Referenzlabor GrazManuela FestChristian Kornschober Anna LennkhBirgit MoikIris Strutz