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STICHWORTLISTE (Zu diesen Stichworten sollen Sie sich vor dem Praktikum belesen) Entstehen des Membranpotentials

Funktionen des Membranpotentials

Diffusionspotential

Gleichgewichtspotential

Aktionspotential

Refraktärperiode

Ruhepotential

Depolarisation

Hyperpolarisation

chemische Triebkraft

elektrische Triebkraft

Nernst-Gleichung

Leitfähigkeit/Permeabilität

Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung

Na+-K+-ATPase

Ionenkanäle

Spannungsabhängigkeit von Ionenkanälen

Kotransport/Antiport

intra-/extrazelluläre Ionenverteilung

aktiver Transport

sekundär-aktiver Transport

passiver Transport

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EINLEITUNG

Jede lebende tierische Zelle hat ein Membranpotential. Es ist Voraussetzung für viele physiologische

Prozesse in den verschiedenen Zelltypen. Sehr offensichtlich ist seine Bedeutung für die Signalübertragung im

Nervensystem oder für die Erregung der Skelettmuskulatur. Aber auch die Funktion der Darmepithel- oder

Nierenepithelzellen (Resorption, Sekretion) ist von deren Membranpotential abhängig. Ebenso wird die

Sekretion des Pankreashormons Insulin über das Membranpotential der ß-Zellen gesteuert. (Zur Therapie des

Diabetes mellitus eingesetzte Pharmaka beeinflussen dementsprechend das Membranpotential der ß-Zellen.)

Umgekehrt können Störungen der Prozesse, die am Entstehen und Regulieren des Membranpotentials

beteiligt sind, zu schweren Krankheitsbildern führen. Ohne auf Details einzugehen, seien folgende Beispiele

genannt: Herzrhythmusstörungen, Myasthenia gravis (Störung der neuro-muskulären Erregungsübertragung),

Epilepsie, Myotonien (Muskelerkrankungen, denen Fehlfunktionen von Natriumkanälen in Skelettmuskelzellen

zugrunde liegen), Mukoviszidose (= Zystische Fibrose; häufigste Erbkrankheit, bei der ein defekter Chloridkanal

in Epithelzellen u.a. zu schwersten Lungenfunktionsstörungen führt), Diarrhoe (Aktivierung der

Chloridleitfähigkeit im Darmepithel). Darüberhinaus wirken viele Pharmaka und natürlich vorkommende Gifte

spezifisch auf Ionenkanäle (Lokalanästhetika, Calcium-Antagonisten; Botulinus-Toxin; Curare).

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Im Rahmen dieses Praktikums wollen wir uns mit den theoretischen Grundlagen der Entstehung des

Membranpotentials beschäftigen:

I) Eine K+-Elektrode wird als Modell für eine Zelle und ihr Membranpotential angenommen,

und es wird die Entstehung eines Diffusionspotentials erklärt.

II) In einem Demonstrationsversuch wird das Membranpotential einer

lebenden Froscheizelle gemessen.

I. ENTSTEHUNG EINES DIFFUSIONSPOTENTIALS

Theoretische Grundlagen

Um ein Diffusionspotential zu erzeugen, genügt es, zwei Salzlösungen durch eine selektiv permeable

Membran zu trennen. Wir stellen uns folgenden Modellversuch vor:

+_ K - selektive Membran

+

A B

undurchlässige Membran

A BK =

+

Cl =-

Abb. 1: Modellversuch zur Entstehung eines Diffusionspotentials über einer K+-selektiven Membran

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Eine Kammer ist in zwei Kompartimente unterteilt. In Kompartiment A befindet sich eine Lösung mit

100 mmol/l KCl und in Kompartiment B eine mit 10 mmol/l KCl. Positiv geladene K+- und negativ geladene

Cl--Ionen sind in den Lösungen völlig ungeordnet, solange beide Kompartimente durch die undurchlässige

Trennwand voneinander abgeteilt sind. Es kann keine Potentialdifferenz gemessen werden (Abb. 1, links).

Das ändert sich, wenn die Trennwand durch eine K+-selektive Membran ersetzt wird (Abb. 1, rechts).

Der Konzentrationsgradient liefert jetzt die chemische Triebkraft für die Diffusion der K+-Ionen. Diese

diffundieren entlang des Konzentrationsgradienten

(= chemischer Gradient) durch die Membran. Allerdings wird die Diffusion wegen der elektrischen Ladung der

K+-Ionen bald limitiert. Das “erste” K+-Ion erfährt nur die Triebkraft des chemischen Gradienten. Es läßt jedoch

ein negativ geladenes Cl--Ion zurück, so daß bereits eine gewisse Ladungstrennung eintritt und dadurch eine

elektrische Triebkraft entsteht, die der chemischen entgegengesetzt ist. Das “zweite” K+-Ion erfährt zwar die

chemische Triebkraft wie Nr. 1, es muß aber die elektrische Anziehungskraft des vorher zurückgebliebenen Cl--

Ions überwinden und kann deshalb die Membran nicht mehr so leicht passieren wie Nr. 1. Nachdem einige K+-

Ionen nach B diffundiert sind, üben die zurückgebliebenen Cl--Ionen eine so starke Anziehungskraft aus, bzw.

ist die elektrische Triebkraft so groß, daß keine weiteren K+-Ionen das Kompartiment A verlassen können.

Chemische und elektrische Triebkraft halten sich die Waage, wir haben das Gleichgewicht erreicht.

Entsprechend mißt man jetzt das Gleichgewichtspotential. Da sich das Gleichgewichtspotential auf Grund der

Diffusion der K+-Ionen von A nach B aufgebaut hat, handelt es sich hierbei um ein Diffusionspotential. (Das

Diffusionspotential ist übrigens immer so gerichtet, daß es die Diffusion des besser permeablen Ions, hier K+,

verlangsamt.)

Wichtig ist, daß sich die K+-Konzentrationen in A und B im Gleichgewichtszustand nicht meßbar von

denen im Ausgangszustand unterscheiden, und es zu keinem Konzentrationsausgleich für K+-Ionen kommt.

Es kommt also nur zu einer Ladungstrennung in unmittelbarer Nähe der Membran, so daß die Membran als eine

Art Plattenkondensator aufgefaßt werden kann, dessen Platten ihre an die Kompartimente A und B grenzenden

Flächen sind. Da diese Membran sehr dünn ist, genügen schon geringe Ladungsunterschiede, um eine Spannung

aufzubauen.

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Die Größe des D i f f u s i o n s p o t e n t i a l s läßt sich mit der Nernst-Gleichung berechnen:

R • T CA

E = _ _____ . ln __ z • F CB Es bedeuten: E = Gleichgewichtspotential [mV]

T = absolute Temperatur; 310 K(elvin) bei Körpertemperatur,

293 K bei 20°C

F = Faraday-Konstante = 9,65 • 104 A•s•mol-1

R = allgemeine Gaskonstante = 8,31 J•K-1 •mol-1

z = Wertigkeit des Ions

CA = Konzentration in A

CB = Konzentration in B

R•T Für einwertige Ionen kann für -----unter Einbeziehung einer Umwandlung vom natürlichen- z•F

(ln) zum dekadischen Logarithmus (lg) eine Konstante 61 mV eingesetzt werden.

Für unser Beispiel ergibt sich demnach bei 37°C ein Diffusionspotential von:

100 mmol/1 E = -61 mV • lg ----------------- = -61 mV 10 mmol/1

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Das Diffusionspotential hängt also ausschließlich von der Größe des Konzentrationsgradienten für

das betreffende Ion ab, in unserem Beispiel für K+.

Diese theoretischen Überlegungen sollen nun experimentell mit einer K+-selektiven Elektrode nachvollzogen

werden (siehe Abb. 2).

+ + + + + + + + + +

- - - - - - - - - - - - K

+

Cl-

K -Elektrode+

Referenz-Elektrode

chlorierterSilber-draht

K -selektive Membran+

K+

Cl-

K+

Cl-

Na+

Cl-Cl

-

Na+

Cl-

Na+

K+

Cl-

Abb. 2: Schematischer Aufbau einer K+-selektiven Elektrode

Das Kernstück dieser Elektrode ist eine Membran, die ausschließlich für K+-Ionen permeabel ist.

Gefüllt ist das Innere der Elektrode mit einer 3 M KCl-Lösung, in der ein chlorierter Silberdraht steckt, der die

Verbindung zum Verstärker herstellt. Taucht man die Elektrode nun in KCl-haltige Lösungen, hat man die

gleiche Situation wie im oben beschriebenen Modellversuch. Entlang des chemischen Gradienten für K+ über

der K+-selektiven Membran der Elektrode baut sich ein Diffusionspotential auf, das von der Größe des

Konzentrationsgradienten abhängt.

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Versuch

Ziel dieses Versuchs ist es, das Diffusionspotential für K+ zu bestimmen, das sich zwischen Ringer-

Lösungen mit unterschiedlichen K+-Konzentrationen ausbildet. Dazu sind Ihnen eine Modellösung für das

Zytoplasma (“Innen”) und fünf verschiedene Modellösungen für den Extrazellulärraum (“Außen”) vorgegeben.

1. Aufgabe: Bestimmung der K+-Konzentration in der Zytoplasmalösung (“Innen”)

Praktischer Versuchsablauf: Wie in Abb. 2 schematisch gezeigt, tauchen Sie K+-Elektrode und

Referenzelektrode in ein Becherglas, das zunächst die “Außenlösung” mit 5 mmol/1 K+ enthält, bis Sie ein

stabiles Potential am Verstärker ablesen können (E außen). Anschließend wiederholen Sie diese Messung mit der

“Innenlösung” (E innen). Bilden Sie die Potentialdifferenz Eaußen - Einnen und setzen Sie diesen Wert in die

Nernst-Gleichung zur Berechnung der K+-Konzentration der “Innenlösung” ein.

[K+]innen

EK = Eaußen - Einnen = slope • lg -------------

[K+]außen

Der “slope” gibt das Antwortverhalten der K+-Elektrode wieder. Er wird bei der Eichung der Elektrode

bestimmt. Unter idealen Bedingungen beträgt er (bei Raumtemperatur) -59 mV, wenn die Konzentration des

Meßions (hier K+) um den Faktor 10 verändert wird. Warum? (Die Eichung wird vor dem Praktikum von den

Kursbetreuern durchgeführt.)

2. Aufgabe: Bestimmung der K+-Konzentrationen der verbleibenden “Außenlösungen”.

Gehen Sie in der gleichen Weise vor wie in Aufgabe 1 und verwenden Sie den dabei bestimmten Wert

für die K+-Konzentration der “Innenlösung”.

Kaußen1 = ..........mmol/l

Kaußen2 = ..........mmol/l

Kaußen3 = ..........mmol/l

Kaußen4 = ..........mmol/l

Tragen Sie Ihre Werte auch in das Diagramm (Abb. 3, halb-logarithmisches Papier) ein. Was für eine Kurve

erwarten Sie? Warum?

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Abb. 3 zeigt die Abhängigkeit der Ruhemembranpotentiale einer Herzmuskelzelle von der extrazellulären K+-

Konzentration [K+]a. Dabei wurde mit einer Mikroelektrode (s.u.) in die Zelle eingestochen und schrittweise die

[K+]a variiert.

-20 -

0 -

-40 -

-60 -

-80 -

-100 -

-120 -1 3 10 30 100

Mem

bran

pote

ntia

l (m

V)

Meßwerte

Nernstbeziehungfür [K ]

+

K -Außenkonzentration (mmol/l)

+

-------

Abb. 3: Ruhemembranpotentiale einer Herzmuskelzelle

Vergleichen Sie Ihre Kurve auf dem halblogarithmischen Papier mit der aus Abb. 3! Wieso ist der Kurvenverlauf

bei Herzmuskelzellen nicht linear?

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Fragen

Wie sind die intra- und extrazellularen Konzentrationen von K+, Na+, Cl-, Ca2+ in mmol/l? - Berechnen Sie die

jeweiligen Gleichgewichtspotentiale! - Vergleichen Sie diese Gleichgewichtspotentiale mit dem

Ruhemembranpotential einer Nervenzelle von -80 mV! - Wie groß sind die Triebkräfte für die jeweiligen Ionen

über die Zellmembran? - Wie kann eine Zelle den großen elektrochemischen Gradienten für Na+ und Ca2+

aufrechterhalten? - Was ist der grundlegende Unterschied zwischen der Diffusion geladener Teilchen wie z.B.

K+-Ionen und der Diffusion ungeladener Teilchen wie z.B. Harnstoff?

II. Demonstrationsversuch

Im ersten Teil des Praktikums wurden am Beispiel einer K+-Elektrode die theoretischen Grundlagen

des Membranpotentials besprochen.

In diesem Demonstrationsversuch soll das Membranpotential einer lebenden Zelle, nämlich einer

Froschoozyte, gemessen werden. Auf Grund ihrer enormen Größe (Durchmesser ca. 1,2 mm; vergleiche

Erythrozyt: 0,007 mm) sind Froschoozyten sehr gut für solche Messungen geeignet.

Bei der Besprechung des Diffusionspotentials hatten Sie die Nernst-Gleichung kennengelernt. Mit ihr

lassen sich Diffusionspotentiale für jeweils eine Ionenart berechnen. Wie bereits erwähnt, wird das

Membranpotential jedoch nicht nur durch eine Ionenart, sondern durch mehrere bestimmt. Zur Berechnung des

Membranpotentials Em einer Zelle wurde die Nernst-Gleichung daher zur Goldmann-Hodgkin-Katz-

Gleichung erweitert:

RT PK[K+] i + P Na[Na+]i + PCl[Cl-]a

E = –– —— • ln —————————————————

F P K [K+]a + PNa[Na+ ]a + PCl [ Cl-]i

P = Permeabilität der Zellmembran jeweils für Kalium, Natrium oder Chlorid

Indices a und i = Bezeichnung für Extra- und Intrazellulärraum

Die Aussage dieser Gleichung ist, daß das Membranpotential einer Zelle vom

Konzentrationsgradienten und der Leitfähigkeit der K+-, Na+- und Cl--Ionen abhängt. Wäre z.B. eine

Zellmembran für Cl- impermeabel, also PCl = 0, so werden die Produkte

PCl[Cl-]i und PCl[Cl-]a in der Goldmann-Hodgkin-Katz-Gleichung ebenfalls Null. Die intra- und extrazellulären

Chloridkonzentrationen hätten daher in diesem Beispiel keinen Einfluß auf das Membranpotential. Umgekehrt

wirken sich Änderungen des Konzentrationsgradienten eines Ions um so stärker auf das Membranpotential aus,

je höher seine Permeabilität ist.

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In dem Demonstrationsversuch sollen diese Überlegungen am Beispiel von K+-Ionen veranschaulicht werden.

Wir untersuchen die Abhängigkeit des Membranpotentials von Froschoozyten vom Konzentrationsgradienten

für Kaliumionen und von der Permeabilität der Zellmembran für Kaliumionen. Den

Konzentrationsgradienten für K+-Ionen verändern wir, indem wir die K+-Konzentration im Extrazellulärraum

anheben (Hyperkaliämie). Die K+-Permeabilität der Oozytenmembran verändern wir durch die Gabe eines K+-

Kanalblockers. Wir verwenden hier Barium als wirksamen K+-Kanalblocker.

Versuchsaufbau

Der Versuchsaufbau ist schematisch in Abb. 4 gezeigt.

Oozyt

Ringer-lösung

Mikro-elektrode

Verstärker

Referenz-elektrode

Abb. 4: Versuchsaufbau zum Messen des Membranpotentials von Froschoozyten

Die Oozyten liegen in Vertiefungen in einer Experimentierkammer und werden kontinuierlich mit

Ringer-Lösung überströmt. Ihr Membranpotential wird mit Mikroelektroden gemessen. Mikroelektroden sind

fein ausgezogene Glaskapillaren, deren Öffnungen an der Spitze einen Durchmesser von < 1 µm haben und mit

denen man durch die Zellmembran ins Zytoplasma der Oozyten sticht. Eine Elektrolyt-Lösung im Innern der

Mikroelektroden sorgt für die elektrische Verbindung zwischen Zytoplasma und Verstärker.

Obwohl Oozyten im Vergleich zu anderen Zellen riesige Ausmaße haben (s.o.), sind sie immer noch zu

klein, um sie ohne Hilfsmittel mit einer Mikroelektrode zu punktieren. Daher werden alle Experimente unter

einem Stereomikroskop (max. 160fache Vergrößerung) durchgeführt, und die Mikroelektrode wird mit einem

Mikromanipulator bewegt.

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Das Membranpotential der Oozyten wird unter vier verschiedenen Bedingungen gemessen:

Em(mV)

1) Kontrolle ([K+]a = 3 mmol/l)

___________________________________________________________________________

2) Leichte Hyperkaliämie ([K+]a = 6 mmol/l)

___________________________________________________________________________

3) Schwere Hyperkaliämie ([K+]a = 30 mmol/l)

___________________________________________________________________________

4) Blockade der K+-Kanäle mit Bariumionen

___________________________________________________________________________

Fragen

Erklären Sie die beobachteten Veränderungen des Membranpotentials! - Erwarten Sie außer für K+ noch

Permeabilitäten für andere Ionen, z.B. Na+, Cl-? Warum? - Wieviel mV Spannungsänderung beim Wechsel von

3 auf 30 mmol/l K+ hätten Sie mit einer K+-Elektrode gemessen? - Was erwarten Sie, wenn [Cl-]a erniedrigt

wird? - Was erwarten Sie bei einer Gabe von Na+-Kanalblockern? - Wozu braucht die Zelle ein

Membranpotential? - Was hält das Membranpotential aufrecht? - Was ist ein Gleichgewichtspotential?