Mechanismen der Katabolitenregulation in Bacilli

Mechanismen der Katabolitenregulation in Bacilli

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Mareen Sprehe

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg.

Tag der mündlichen Prüfung: 21. September 2007

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves Muller

INHALTSVERZEICHNIS

- I -

1. ZUSAMMENFASSUNG…………………………………………………. 1

1. SUMMARY………………………………………………………………... 2

2. EINLEITUNG.…………………………………………………………….. 3

2.1 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Bacillus subtilis…………………………… 3 2.1.1 Bacillus subtilis - Vorkommen, Lebensweise und Bedeutung…………... 3 2.1.2 Das Phosphotransferasesystem zur Aufnahme von C-Quellen……….... 4 2.1.3 Funktionen einzelner PTS Komponenten in B. subtilis………………....... 5 2.1.4 Kohlenstoffkatabolitenregulation in B. subtilis…………………………….. 6 2.1.5 CcpA – der zentrale Regulator der KKR……………………………………... 7 2.1.6 Niedermolekulare Effektoren von CcpA……………………………………... 9 2.1.7 Die Operatorsequenz cre als Bindestelle für CcpA……………………...… 11

2.2 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Listeria monocytogenes……................... 13 2.2.1 Infektionskrankheiten – ein weltweites Problem…………………………… 13 2.2.2 Listeria monocytogenes – Lebensweise und Pathogenese……………… 13 2.2.2 Die Infektion von Wirtszellen durch L. monocytogenes………...………... 14 2.2.3 PrfA - der zentrale Virulenzregulator in L. monocytogenes…………....... 15 2.2.4 PrfA als Mitglied der Crp/FnR-Familie………………...……………………… 17 2.2.5 Regulation der PrfA Synthese und Aktivität………………...…………........ 18

2.3 Zielsetzungen und Fragestellungen dieser Arbeit………….…………………….. 20

3. MATERIALIEN UND METHODEN.……………...……………………. 21

3.1 Materialien………………………………………………………………………………... 21 3.2 Bakterienstämme………...…….……………………………...................................... 26 3.3 Plasmide……………...…………………………………………………………………... 27 3.4 Puffer und Medien………………………………………………………………………. 28

3.4.1 Allgemeine Puffer und Lösungen………………………………………...…… 28 3.4.2 DNA Gelelektrophorese…………………………………………………………. 28 3.4.3 Protein Gelektrophorese………………………………………………...……… 28 3.4.4 Proteinaufreinigung……………………………………………………………… 29 3.4.5 Bakteriennährmedien und Medienzusätze…………………………………... 29

3.5 Methoden…………………………………………………………………………………. 30 3.5.1 Allgemeine Methoden………………………………………………………........ 30 3.5.2 Anzucht von Bakterien……………………………...…………………………... 31

INHALTSVERZEICHNIS

- II -

3.5.3 Transformation von E. coli………………………………………...…………… 31 3.5.4 Transformation von B. subtilis………………………………………………… 31

3.5.4.1 Herstellung von natürlich kompetenten Zellen und Transformation…… 31

3.5.4.2 Herstellung von elektrokompetenten Zellen und Elektroporation……... 31

3.5.5 Konservierung von B. subtilis Stämmen…………………………………….. 32 3.5.6 Methoden mit Desoxyribonukleinsäuren…………...……………………….. 32

3.5.6.1 DNA-modifizierende Enzyme…………………………..………………….. 32

3.5.6.2 Elution von DNA aus Agarosegelen……….……………………………... 32

3.5.6.3 Isolierung von Plasmid DNA………………………..……………………… 32

3.5.6.4 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis………………...…... 32

3.5.6.5 Sequenzierung von DNA………………………..………………………..... 32

3.5.6.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)……………………………………..…... 33

3.5.6.7 Ethanol Fällung von DNA……………………….…………………………. 33

3.5.6.8 PEG Fällung von DNA………………………………..…………………..... 33

3.5.7 α-Amylase Expressionstests…………………………………………………... 34

3.5.8 β-Galaktosidase Aktivitätstest mittels Agarplatten………………………… 34

3.5.9 Bestimmung der β-Galaktosidase Aktivität…………………………………. 34

3.5.10 Immunoblot…………………………………………………………………….... 34 3.5.11 Überexpression und Aufreinigung von CcpA, HPr, HPr-Ser46-P……… 35

3.5.11.1 Anzucht von Bakterien und Überexpression........................................ 35

3.5.11.2 Zellauschluss mittels Ultraschall……………………..………………….. 35

3.5.11.3 Präparation von HPr-Kinaseextrakt……………………………………… 35

3.5.11.4 Phosphorylierung von HPr……………………………………………….. 35

3.5.11.5 Aufreinigung von HPr bzw. HPr-Ser46-P...…………...………………... 36

3.5.11.6 Aufreinigung von CcpA His6-tag.………………………………………… 36

3.6 Verwendete Internetangebote und Computerprogramme………....................... 37

4. ERGEBNISSE……………………………………...……………............. 38

4.1 in vivo Charakterisierung von CcpA Mutanten in Bacillus subtilis………….... 38 4.1.1 in vivo Expressionssystem zur Charakterisierung von CcpA Mutanten 40 4.1.2 in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten………………………………………. 41

4.1.2.1 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR, ackA und alsS……………. 42

4.1.2.2 CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger Regulation……………….... 44

4.1.2.3 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR und alsS, aber Aktivierung

von ackA……………………………………………………………………...

46

4.1.2.4 CcpA Mutanten mit eingeschränkter KKR von gntR…………………..... 48

INHALTSVERZEICHNIS

- III -

4.1.3 Expression von CcpA Mutanten im Vergleich zu Wildtyp CcpA………… 50 4.1.4 CcpA Mutanten mit dem Phänotyp des Wildtyps………………………...... 51 4.1.5 Möglichkeit der Heterooligomerisierung von CcpA-HPr-Ser46-P-cre….. 53 4.1.6 Zusammenhang zwischen cre Elementen und differenzieller

Regulation…………………………………………………………………………. 56

4.1.6.1 Austausch der ackA cre2 gegen die xynP cre im ackA Promotor……... 57

4.1.6.2 Austausch der xynP cre gegen die ackA cre2 im xynP Promotor……... 60

4.2 PrfA abhängige Regulation von Virulenzgenen aus L. monocytogenes in B. subtilis…………..……….....................................................................................

62

4.2.1 Konstruktion eines Expressionssystems zur Charakterisierung der PrfA abhängigen Virulenzgenregulation in B. subtilis………………….…

62

4.2.1.1 Konstruktionen von Indikatorstämmen…………..……………………….. 63

4.2.1.2 Konstruktion eines Vektors mit prfA unter Kontrolle von PccpA…………. 64

4.2.1.3 in vivo Expressionssystem (PccpA-prfA)……………..……………………. 65

4.2.1.4 Konstruktion eines Vektors zur Regulation der PrfA Konzentration

mittels des Tetrazyklinrepressors……………..…………………………..

67

4.2.1.5 Heterologes in vivo Expressionssystem (Pxyl/tet-prfA)………………….... 69

4.2.1.6 Einfluss von steigenden atc Konzentrationen auf die PrfA Expression.. 70

4.2.1.7 Einfluss von steigenden PrfA Konzentrationen auf die actA und

hly’::’lacZ Expression……………………….…………………...................

70

4.2.1.8 Auswahl eines geeigneten in vivo Expressionssystems………….…….. 72

4.2.1.9 Einfluss von unterschiedlichen PrfA Konzentrationen auf das

Wuchsverhalten von WH621 (actA’::’lacZ)………………...……………..

73

4.2.3 Einfluss von unterschiedlichen Kohlenstoffquellen auf die PrfA abhängige Regulation der Virulenzgenexpression..……….......................

74

4.2.3.1 Expression von PrfA in unterschiedlichen Wachstumsphasen………… 74

4.2.3.2 Einfluss von Glukose und Cellobiose auf die zweistufige Regulation

der Virulenzgenexpression……………..…………………………............

75

4.2.3.3 Einfluss von unterschiedlichen C-Quellen auf die PrfA abhängige actA

Expression…………………………………………………………………...

76

4.2.3.4 PrfA Expression in Anwesenheit von unterschiedlichen C-Quellen....... 77

4.2.4 Einfluss von Deletionen bzw. Mutationen in ptsH, crh, ccpA und ptsG auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression…………………………….

78

4.2.4.1 Optimierung der Konstruktion von Indikatorstämmen………...…..……. 78

4.2.4.2 Einfluss der ccpA Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgen-

expression……………………………………………………......................

79

INHALTSVERZEICHNIS

- IV -

4.2.4.3 Einfluss der ptsH1 Mutation bzw. ptsH Deletion auf die PrfA

abhängige Virulenzgenexpression...………………………………………

82

4.2.4.4 Einfluss der crh Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgen-

expression……………………………………………………......................

84

4.2.4.5 Einfluss der ptsG Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgen-

expression……………………………………………………......................

85

4.2.4.6 Vergleich der PrfA Expression von KKR- und PTS-defizienten

Mutanten mit dem Wildtyp……………………………………………….....

87

5. DISKUSSION……………….…………………………………………..... 88

5.1 Der Transkriptionsregulator CcpA - ein Multistratege mit Raffinesse.............. 88 5.1.1 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR, ackA und alsS……………... 88 5.1.2 CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger Regulation……………….….. 90 5.1.3 CcpA Mutanten mit Verlust der Regulation von gntR, xynP und alsS,

aber Aktivierung von ackA…………...………………………………………… 92

5.1.3.1 Glukose vermittelte Aktivierung von ackA ……………………………….. 93

5.1.3.2 Differenzielle Regulation als Folge unterschiedlicher Wirkmodi von

CcpA………………………………………………………………………….

94

5.1.4 CcpA Mutanten mit eingeschränkter KKR von gntR, aber KKR von xynP, alsS und ackA….…………………………………………………............

96

5.2 PrfA abhängige Aktivierung der Virulenzgenexpression aus L. monocytogenes in B. subtilis……………….…………………………………......

98

5.2.1 Ein System zur Untersuchung der PrfA vermittelten Aktivierung der Virulenzgenexpression in B. subtilis………………….………………………

98

5.2.2 PrfA vermittelte Aktivierung der Virulenzgenexpression in B. subtilis in zwei Stufen……………………………………………………………………...

99

5.2.3 Repression der PrfA vermittelten Virulenzgenexpression durch Kohlenstoffquellen in Abhängigkeit von der PrfA Konzentration…….…

103

5.2.4 Interferenz von KKR/PTS Komponenten mit der Allosterie von PrfA….. 104

6. LITERATURVERZEICHNIS…….………………………..…..………..... 107

7. ANHANG………………………………………………………………….. 121

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

- V -

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

Amp Ampicillin

APS Ammoniumperoxodisulfat

ATP Adenosintriphosphat

Ax Absorption bei x nm

bp Basenpaar

°C Grad Celsius

Cm Chloramphenicol

Da Dalton

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ErmR Erythromycinresistenz

EtOH Ethanol

EtBr Ethidiumbromid

FBP Fruktose-1,6-bisphosphat

g Gramm

G6P Glukose-6-Phosphat

h Stunde

Kap. Kapitel

l Liter

LB Luria Bertani

M molar (mol/l)

min Minute

nm Nanometer

oDx optische Dichte bei x nm

ONPG ortho-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid

ori Replikationsursprung

PAA Polyacrylamid

PCR Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

RT Raumtemperatur

sec Sekunde

SDS Natriumdodecylsulfat

Tab. Tabelle

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

- VI -

Tc Tetrazyclin

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

rpm Umdrehungen / Minute

ÜNK über Nacht-Kultur

ÜTK über Tag-Kultur

% (v/v) Volumenprozent

% (w/v) Gewichtsprozent

W Watt

WT Wildtyp Vorsätze Nucleotide

k kilo (103) A Adenosin

m milli (10-3) C Cytidin

µ mikro (10-6) G Guanosin

n nano (10-9) T Thymidin

p piko (10-12) N A,C,G oder T Aminosäure-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarungen (1969) A Ala Alanin M Met Methionin

C Cys Cystein N Asn Asparagin

D Asp Asparaginsäure P Pro Prolin

E Glu Glutaminsäure Q Gln Glutamin

F Phe Phenylalanin R Arg Arginin

G Gly Glycin S Ser Serin

H His Histidin T Thr Threonin

I Ile Isoleucin V Val Valin

K Lys Lysin W Trp Tryptophan

L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin

ZUSAMMENFASSUNG

- 1 -

1. Zusammenfassung

In Bacillus subtilis werden nahezu 10% aller Gene durch das Katabolit Kontroll Protein A (CcpA) reguliert. Im Zuge der Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR) dienen glykolytische Intermediate und die Phosphoproteine HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P als Koeffektoren für CcpA. Die aus dieser Interaktion resultierenden allosterischen Veränderungen im Protein führen zur Bindung an sogenannte cre Elemente. Zu Beginn dieser Arbeit waren die CcpA-HPr-Ser46-P-cre bzw. CcpA-Crh-Ser46-P-cre Strukturen aus Bacillus megaterium noch unbekannt.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Effekte von Punktmutationen in funktional unterschiedlichen Domänen von CcpA auf die Regulation von verschiedenen B. subtilis Promotoren untersucht. Für die Charakterisierung der Repression durch CcpA dienten PxynP und PgntR, welche in der Anzahl, Position und Sequenz der cre Elemente variieren. Für die mechanistisch unbekannte (in)direkte Aktivierung durch CcpA wurden PalsS ohne cre Element und PackA mit zwei stromaufwärts lokalisierten cre Motiven verwendet. Nach der Etablierung der in vivo Untersuchungssysteme ergaben sich CcpA Varianten mit differenziellen Aktivitäten. Erstens zeigen CcpA Mutanten (A300W, A302W, L306W, K308W) keine KKR aller Gene. Deren Aminosäurenreste befinden sich in der Korepressorbinderegion, sind aber nicht am allosterischen Schaltmechanismus beteiligt. Dieser Phänotyp resultiert daher aus dem Verlust der Koeffektorbindung. Andere CcpA Varianten (R54W, V301W, R304W) aktivieren ackA, sind aber zur KKR von gntR, xynP und alsS unbefähigt. Deren Aminosäurenreste sind in der Scharnierhelix und der Korepressorbinderegion lokalisiert und direkt in den allosterischen Schaltmechansimus involviert. Daher existieren als Folge unterschiedlicher Signaltransduktionswege multiple allosterische Mechanismen, welche durch eine veränderte Koeffektorbindung ausgelöst werden. CcpA Mutanten (+1W, I4W, M17R, M89W, N93W), deren Aminosäurenreste in der DBD oder Dimerisierungsebene lokalisiert sind, weisen KKR Defizienz von gntR, aber intakte KKR von ackA, alsS bzw. xynP auf. Dies könnte durch unterschiedliche Bindeaffinitäten von CcpA zu cre Elementen hervorgerufen werden. Zuletzt wurden CcpA Mutanten (T307W, D276A) mit Glukose unabhängiger Regulation erstmals auch von ackA identifiziert, deren Aminosäurenreste sich in der Korepressorbinderegion und im Effektorenbindespalt befinden. Dies ist auf eine verbesserte, vom Koeffektor unabhängige cre Bindung zurückzuführen, da diese Mutationen die DNA bindende Konformation von CcpA stabilisieren.

Diese Mutationsanalysen bekräftigen die Strukturkomplexe aus B. megaterium, untermauern die Bedeutung vieler Aminosäuren für die KKR durch CcpA und liefern erste Ursachen für die differenziellen Aktivitäten der CcpA Mutanten. Die erhaltenen Daten unterstreichen daher die raffinierten multiplen Strategien eines einzigartigen LacI/GalR-Familien Mitglieds.

Die Virulenzgenexpression wird in Listeria monocytogenes, einem zu B. subtilis hochverwandten

Bakterium, auf komplexe Weise durch den Transkriptionsaktivator PrfA kontrolliert. Dieser bindet an sogenannte PrfA Boxen in Virulenzgenpromotoren, wodurch ein für Crp/FnR-Mitglieder typischer allosterischer Schaltmechanismus ausgelöst wird. Dabei kontaktiert PrfA die RNAP. Zu den am intrazellulären Infektionszyklus beteiligten Virulenzgenen zählen u. a. plcA, actA und hly.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein heterologes in vivo Expressionssystem zur Untersuchung der PrfA vermittelten Virulenzgenregulation aus L. monocytogenes in B. subtilis etabliert. In diesem liegen die Virulenzgenpromotor-lacZ Fusionen chromosomal vor, während die Transkription von prfA durch den Tet Repressor episomal gesteuert wird. Das führt zu unterschiedlich starker Aktivierung von actA, hly bzw. plcA in Abhängigkeit von der PrfA Box Konservierung. Die kontinuierliche Erhöhung der PrfA Dosis reguliert die Expression von actA bzw. hly in zwei Stufen. Während die erste Stufe auf die Aktivierung durch WT PrfA zurückzuführen ist, resultiert die maximale Virulenzgenexpression aus der verstärkten Bindung von allosterisch verändertem PrfA an die PrfA Box. In Anwesenheit von Glukose wurde eine Wuchsphasen unabhängige PrfA vermittelte Virulenzgenrepression in Abhängigkeit von der PrfA Konzentration erzielt. Durch ptsH1 und ptsG Mutanten, welche kein HPr-Ser46-P bzw. Enzym IIA des Phosphotransferasesystems (PTS) exprimieren, kommt es mit Glukose zur PrfA Dosis abhängigen Derepression von actA, hly und plcA. Dagegen weisen crh bzw. ccpA Deletionsmutanten den Phänotyp des WTs bzw. eine schwach eingeschränkte Virulenzgenrepression auf. Dadurch ist eindeutig demonstriert, dass KKR/PTS Komponenten (in)direkt mit der Allosterie von PrfA interferieren, indem sie lediglich WT PrfA beeinflussen. Da es durch ptsH Mutanten zu abgeschwächter Expression von hly, actA und plcA unabhängig von der Anwesenheit von Glukose kommt, bedingt die vollständige PrfA Aktivität zudem ein intaktes PTS.

Die zweistufige PrfA vermittelte Aktivierung der Virulenzgenexpression ermöglicht Listerien die optimale Anpassung an die Situation innerhalb und außerhalb der Wirtszelle. Das erfordert komplexe Kontrollmechanismen, für welche die PrfA Boxen, die PrfA Konzentration, die PrfA Aktivität und die gezielte (in)direkte Steuerung durch Komponenten der KKR/PTS von Bedeutung sind.

ZUSAMMENFASSUNG

- 2 -

1. Summary

The catabolite control protein A (CcpA) regulates approximately 10% of the genes in Bacillus subtilis. Glycolytic intermediates and the phosphoproteins HPr-Ser46-P or Crh-Ser46-P serve as coeffectors for CcpA during carbon catabolite regulation (CCR). The interaction resulting in an allosteric switch of the protein leads to binding of so-called cre elements. At the beginning of this work the CcpA-HPr-Ser46-P-cre and CcpA-Crh-Ser46-P-cre structures of Bacillus megaterium were unknown.

In the first part of this work the effects of point mutations in different functional domains of CcpA were analyzed on the regulation of various B. subtilis promoters. For the repression by CcpA, PxynP and PgntR were used, thereby varying in number, position and sequence of the cre elements. For the mechanistic unknown (in)direct activation by CcpA, PalsS without a cre element and PackA with two upstream localized cre motifs were used. After the establishment of the in vivo investigation systems, CcpA mutants with differential activities were identified. First, CcpA variants (A300W, A302W, L306W, K308W) mutated at residues in the corepressor binding region without allosteric functions are inactive which is due to the loss of coeffector binding. Other CcpA variants (R54W, V301W, R304W) with alterations in the hinge helix and the corepressor binding region which change their conformation upon coeffector binding regulate only ackA. Thus, multiple allosteric switch mechanisms may exist as a result of different signal transduction pathways caused by different coeffector binding. Furthermore, CcpA mutants (+1W, I4W, M17R, M89W, N93W) mutated at residues in the DBD and the dimerization interface exhibit CCR deficiency of gntR, but intact CCR of ackA, alsS and xynP. This might be due to different binding affinities of CcpA to cre. Last, the first CcpA mutants (T307W, D276A) with glucose independent regulation of ackA were identified, with their residues located in the corepressor binding region and the effector binding cleft. This is caused by altered coeffector independent cre binding, because these mutations stabilize the DNA binding conformation of CcpA.

These mutation analyses confirm the structure complexes of B. megaterium, show the importance of several amino-acids for CcpA dependent CCR and provide first reasons for the different activities of CcpA mutants. Hence, the obtained data underline the sophisticated multiple strategies of a unique LacI/GalR-family member.

The transcription activator PrfA controls virulence gene expression in Listeria

monocytogenes, a near relative to B. subtilis, via complex mechanisms. PrfA binds to the so called PrfA boxes in virulence gene promoters leading to an allosteric change which is typical for Crp/FnR members thereby contacting the RNAP. The virulence genes involved in the intracellular infection cycle include among others actA, hly and plcA.

In the second part of this work a heterologous in vivo expression system was established allowing investigation of PrfA mediated virulence gene expression of L. monocytogenes in B. subtilis. This system contains the virulence gene promoter-lacZ fusions chromosomally, while the transcription of prfA is episomally controlled via the Tet repressor. This leads to activation of actA, hly and plcA with different strength dependent on the PrfA box conservation. The continuous increase of the PrfA concentration regulates the expression of actA in two steps. The first step is due to the activation by WT PrfA, while the maximal virulence gene expression results of the altered binding of allosteric changed PrfA to the PrfA box. The presence of glucose leads to a growth phase independent PrfA mediated virulence gene repression dependent on the PrfA concentration. ptsH1 and ptsG mutants, lacking HPr-Ser46-P and EIIA of the phosphotransferasesystem (PTS), respectively, show PrfA dosis dependent derepression of actA, hly and plcA in the presence of glucose. crh and ccpA deletion mutants exhibit the phenotype of the WT or slightly decreased virulence gene repression. Hence, it is clearly demonstrated that components of the CCR/PTS interfere (in)directly with the allostery of PrfA by affecting only WT PrfA. Since a ptsH mutant decreases expression of actA, hly and plcA independently of the presence of glucose, the full PrfA activity seems to require also an intact PTS.

The two step PrfA mediated activation of the virulence gene expression allows Listeria the optimal adaptation on the situation inside and outside the host cell. This requires a complex control via the PrfA box, PrfA concentration, PrfA activity and specific (in)direct regulation by components of the CCR/PTS.

EINLEITUNG

- 3 -

2. Einleitung

2.1 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Bacillus subtilis 2.1.1 Bacillus subtilis - Vorkommen, Lebensweise und Bedeutung

Bacillus subtilis ist ein Gram-positives, stäbchenförmiges, nicht pathogenes,

endosporenbildendes Bakterium mit niedrigem GC-Gehalt, das vor allem in oberen

Bodenschichten, im Wasser und der Luft vorkommt (Stülke and Hillen, 2000). Die

phylogenetische Nähe zu Pathogenen wie Staphylokokken, Listerien und Mykoplasmen

macht B. subtilis für die molekularbiologische und medizinische Forschung besonders

interessant.

Da B. subtilis ubiquitär verbreitet ist und deshalb häufig Stress- und Hungersituationen

ausgesetzt ist (Bandow and Hecker, 2007; Claverys et al., 2006), kann er sich an

wechselnde Umweltveränderungen anpassen, indem er die Proteinausstattung der Zelle und

damit die Genexpression variiert (Stülke and Hillen, 2000). Zu diesen Anpassungsvorgängen

zählen unter anderem die Sporenbildung zum Überleben von Trockenheit, Hitze oder

Nährstoffmangel (Driks, 2002; Losick et al., 1986; Piggot and Hilbert, 2004; Setlow and

Setlow, 1995; Setlow, 1995; Shafikhani and Leighton, 2004), die Produktion antibiotisch

wirksamer Peptide (Banerjee and Hansen, 1988; Kleerebezem, 2004; Kleerebezem et al.,

2004; Stein, 2005; Tsuge et al., 2001) und die Fähigkeit Exoenzyme zu sekretieren (Priest,

1977; Stülke and Hillen, 2000). Eine andere Möglichkeit der Adaptation ist die differenzielle

Expression von katabolen Enzymen je nach vorhandenen Nährstoffen, was auch als

Kohlenstoffkatabolitenregulation (KKR) bezeichnet wird (Brückner and Titgemeyer, 2002;

Deutscher et al., 2006; Gunnewijk et al., 2001; Stülke and Hillen, 1999, 2000; Warner and

Lolkema, 2003). Dieser Anpassungsvorgang reicht von der Initiation der Transkription bis zur

Termination der Translation (Stülke and Hillen, 2000). Am häufigsten existiert die Regulation

jedoch auf der Ebene der Transkriptionsinitiation, welche durch Sigmafaktoren (Gruber and

Gross, 2003; Haldenwang, 1995; van Schaik and Abee, 2005) oder andere regulatorisch

wirksame Proteine (Aktivatoren, Repressoren) (Vicente et al., 1999) erfolgen kann. Letztere

binden an spezifische DNA Sequenzen (Operatoren), wodurch entweder ein Gen bzw.

Operon (lokale Kontrolle) oder ein ganzes Netzwerk von Genen (globale Kontrolle) reguliert

wird (Henkin, 1996; Sonenshein, 2005; Stülke and Hillen, 2000).

Auf den Mechanismus der KKR und der daran beteiligten Komponenten wird in den

nächsten Abschnitten näher eingegangen.

EINLEITUNG

- 4 -

2.1.2 Das Phosphotransferasesystem zur Aufnahme von C-Quellen

Um eine effiziente Handhabung vorhandener C-Quellen im Sinne der KKR zu gewährleisten,

müssen Rezeptoren und Signalwege vorhanden sein, welche die Umweltbedingungen

erkennen und die Information an die eigentlichen Regulatorproteine weiterleiten. In B. subtilis

dient der Phosphorylierungszustand von Komponenten des Phosphotransferasesystems

(PTS) als Informationsgeber für die KKR. Das PTS erlaubt die Aufnahme von Zuckern bei

gleichzeitiger Phosphorylierung (Deutscher et al., 2005; Deutscher et al., 2006; Paulsen et

al., 2000; Postma et al., 1993; Saier Jr. and Reizer, 1994; Saier, 2001; Titgemeyer and

Hillen, 2002). Der Aufbau des PTS zur Aufnahme von Glukose ist in Abb. 2.1 graphisch

dargestellt.

Pyruvat

PEP

HPr

EI

EI

P

CBA

HPr-His15

Glukose

Glukose-6-P

außeninnen

CMGlykolyse

P

P P

PP

EIIGlk

Pyruvat

PEP

HPrHPr

EI

EI

P

CBA

HPr-His15

Glukose

Glukose-6-P

außeninnen

CMGlykolyse

PP

PP PP

PPPP

EIIGlk

Abb. 2.1: Schematische Darstellung des PTS zur Aufnahme von Glukose Phosphorylgruppentransfer von Phosphoenolpyruvat (PEP) über Enzym I (EI), HPr und die Domänen von Enzym II (EII) auf Glukose, die dann unter Phosphorylierung als Glukose-6-P in die Zelle aufgenommen wird.

Der Phosphatrest, der auf die C-Quelle übertragen wird, stammt von Phosphoenolpyruvat

und wird von den generellen zytoplasmatischen PTS Komponenten Enzym I (EI) und dem

Histidin tragenden Protein (HPr) auf die zuckerspezifische Aufnahmekomponente, das

Enzym II (EII), transferiert. EII Komplexe bestehen aus drei bis vier Domänen, wobei EIIA

und EIIB im Zytoplasma vorliegen und die Domänen C bzw. D, falls vorhanden,

membranständig sind (Postma et al., 1993; Saier and Reizer, 1992). In B. subtilis wurden

spezifische EII Komplexe für die Mono- und Disaccharide Glukose, Fruktose, Mannose,

Trehalose und Saccharose sowie für das Zuckerderivat Glukosamin und den Zuckeralkohol

Mannitol gefunden (Reizer et al., 1999). Während der Zuckeraufnahme liegen EI, HPr und

die zuckerspezifischen Komponenten EIIA und EIIB vorwiegend unphosphoryliert vor.

Deshalb ist der Phosphorylierungszustand der PTS Komponenten direkt mit der

Nährstoffsituation verbunden (Saier, 1989).

EINLEITUNG

- 5 -

2.1.3 Funktionen einzelner PTS Komponenten in B. subtilis Neben der Aufgabe des Zuckertransports sind die einzelnen Komponenten des PTS auch in

verschiedene Regulationsvorgänge involviert (Deutscher et al., 2006). Die regulatorischen

Funktionen einzelner PTS Komponenten sind in Abb. 2.2 zusammengefasst.

Pyruvat

PEP

HPr

EI

EI

P

CBA

HPr-His15

Glukose

Glc-6-P

außeninnenCM

P

P P

P

P

EIIGlk

CheACheA

P

-Chemotaxis

LicT, LevR, SacT

PRD I

PRD IIPP

GlpK

P

HPrK/PHPr

Ser46

P

CcpA

KKR

ProteinPhosphorylierung

Zuckeraufnahme

++

--

PP

SacY, GlcT

Pyruvat

PEP

HPrHPr

EI

EI

P

CBA

HPr-His15

Glukose

Glc-6-P

außeninnenCM

PP

PP PP

PP

PP

EIIGlk

CheACheA

P

-Chemotaxis

LicT, LevR, SacT

PRD I

PRD IIPP

GlpK

PP

HPrK/PHPr

Ser46

PP

CcpA

KKR

ProteinPhosphorylierung

Zuckeraufnahme

++

--

PP

SacY, GlcT

Abb. 2.2: Regulatorische Funktionen einzelner PTS Komponenten in B. subtilis Die Abb. zeigt schematisch die Funktionen einzelner PTS Komponenten. Die Zuckeraufnahme ist in grün dargestellt (Abschnitt 2.1.2), die Chemotaxis in rot, unterschiedliche Protein Phosphorylierungen in gelb und die KKR in blau (Abschnitt 2.1.4). Erläuterungen sind dem Text zu entnehmen.

Das phosphorylierte EI spielt eine wichtige Rolle bei der Chemotaxis, indem es die

Autophosphorylierung von CheA inhibiert (Garrity et al., 1998). Des Weiteren wird die

Phosphatgruppe von HPr-His15-P auf unterschiedliche Transkriptionsregulatoren über-

tragen, wodurch deren Aktivität beeinflusst wird (Deutscher et al., 2006; Stülke, 1998).

Beispielsweise wird die Aktivität der Glyzerinkinase GlpK durch Phosphorylierung um den

Faktor 200-fach gesteigert (Darbon et al., 2002). Daher entsteht in Anwesenheit von PTS

Substraten kein Glyzerin-3-P, welches als Induktor des glpFK Operons dient. Das verhindert

die Aufnahme von Glyzerin und somit dessen Verstoffwechselung (Darbon et al., 1999;

Darbon et al., 2002).

Die Aktivität von Transkriptionsregulatoren wird nicht nur durch die generellen PTS

Komponenten, sondern auch durch die zuckerspezifischen Permeasen beeinflusst.

Beispielsweise werden Regulatoren, welche oftmals zwei PTS Regulations Domänen (PRD)

EINLEITUNG

- 6 -

tragen, in komplexer Weise EII und HPr abhängig phosphoryliert, was zur Repression ihrer

eigenen Operons führt (Stülke et al., 1998). Zu diesen zählen die Transkriptionsaktivatoren

LevR (Débarbouillé et al., 1991a; Débarbouillé et al., 1991b) und LicR (Tobisch et al., 1997;

Tobisch et al., 1999a) sowie die Antiterminatoren GlcT (Schmalisch et al., 2003; Stülke et al.,

1997), SacY (Crutz et al., 1990; Steinmetz et al., 1989), SacT (Débarbouillé et al., 1990) und

LicT (Deutscher et al., 1997; Schnetz et al., 1996). Beispielsweise inhibiert phosphoryliertes

EIIB die PRD-vermittelte Phosphorylierung von GlcT bzw. SacY (Bachem and Stülke, 1998;

Deutscher et al., 2006; Schmalisch et al., 2003). Ist dagegen ein geeignetes Substrat

vorhanden, binden die unphosphorylierten Proteine an sogenannte RAT Sequenzen der

mRNA, wodurch die Ausbildung einer Terminatorstruktur verhindert wird und die

Genexpression induziert wird (Langbein et al., 1999; Schilling et al., 2004; Schilling et al.,

2006).

2.1.4 Kohlenstoffkatabolitenregulation in B. subtilis

In Anwesenheit mehrerer Kohlenstoffquellen bewirkt die KKR, dass zuerst die

energiereichste und am schnellsten metabolisierbare C-Quelle verwertet wird, während die

Expression der Gene deren Genprodukte die Verstoffwechselung anderer C-Quellen

katalysieren, reprimiert wird (Brückner and Titgemeyer, 2002; Deutscher et al., 2006; Stülke

and Hillen, 2000; Titgemeyer and Hillen, 2002; Warner and Lolkema, 2003). In B. subtilis

erfordert die KKR einen zentralen Regulator, das Katabolit Kontroll Protein A (CcpA)

(Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000; Titgemeyer and Hillen, 2002). CcpA

vermittelt die Aktivierung und Repression von ca. 10% aller Gene in B. subtilis (Blencke et

al., 2003; Lorca et al., 2005; Lulko et al., 2007; Moreno et al., 2001; Tobisch et al., 1999b).

Katabole Gene, welcher unter der Kontrolle von CcpA stehen, sind in wichtige

Stoffwechselwege wie der Glykolyse (citB, citZ, gap) (Kim et al., 2002; Ludwig et al., 2002),

der Ammoniumassimilation (gltAB) (Faires et al., 1999; Wacker et al., 2003), der Exkretion

von überflüssigen C-Quellen und der Fermentation involviert (Stülke and Hillen, 2000). Ist

eine bevorzugte C-Quelle vorhanden, wird die HPr Kinase/Phosphorylase (HPrK/P) zur ATP

oder Pyrophosphat abhängigen Phosphorylierung von HPr bzw. Crh (catabolite repression

HPr) (Favier et al., 2002) am Ser46 stimuliert (Galinier et al., 1998; Lavergne et al., 2002;

Mijakovic et al., 2002; Nessler et al., 2003; Poncet et al., 2004; Reizer et al., 1998). Die

resultierenden phosphorylierten Proteine, HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P, bilden zusammen

mit CcpA einen Komplex, welcher anschließend an spezifische Operatorsequenzen, die cre

Elemente (catabolite responsive elements), bindet (Aung-Hilbrich et al., 2002; Schumacher

EINLEITUNG

- 7 -

et al., 2004; Schumacher et al., 2006; Seidel et al., 2005) und die Transkription des

nachfolgenden katabolen Genes reguliert (Stülke and Hillen, 2000) (Abb. 2.3).

G6P

Glukose

Pyruvat

EI

PEP

FBP

Glykolyse

HPrK/P+

CcpA

HPr-Ser46-PCrh-Ser46-P

CM C

BA

cre

P P

HPr

EI

HPrATP

P

P

PP

ADP

katabole Gene

EII

G6P

Glukose

Pyruvat

EI

PEP

FBP

Glykolyse

HPrK/P+

CcpA

HPr-Ser46-PCrh-Ser46-P

CM C

BA

cre

PPP PP

HPr

EI

HPrATP

P

P

PPPP

ADP

katabole Gene

EII

Abb. 2.3: Schematische Darstellung der KKR in B. subtilis Das CcpA Dimer bildet mit den Koeffektoren HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P einen Komplex, welcher an die cre Sequenz kataboler Gene bindet und deren Expression reguliert. HPr stellt dabei eine Verbindung zwischen dem PTS und der KKR her. Im PTS ist HPr am Phosphorylgruppentransfer von PEP auf den Zucker beteiligt. In der KKR werden HPr bzw. Crh durch die durch FBP stimulierbare HPrK/P ATP-abhängig am Ser46 phosphoryliert und sind somit Koeffektoren für CcpA.

2.1.5 CcpA – der zentrale Regulator der KKR

Die Kristallstrukturen der ternären Komplexe (CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.), (Abb. 2.4), bzw.

CcpA-Crh-Ser46-P-cre (opt.) aus B. megaterium) wurden bereits beschrieben (Schumacher

et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Als Mitglied der LacI/GalR-Familie bildet CcpA in

seiner aktiven Form ein Dimer (Weickert and Adhya, 1992). Ein CcpA Monomer gliedert sich

in die DNA Bindedomäne (DBD) und den Proteinkern, welcher wiederum in die N- und C-

terminale Subdomäne (NSD bzw. CSD) unterteilt ist.

Die in der LacI/GalR-Familie hoch konservierte DBD (Bell and Lewis, 2000, 2001; Lewis et

al., 1996; Schumacher et al., 1994; Schumacher et al., 1995) besteht aus 60 Aminosäuren

und weist vier α-Helices auf. Aminosäurenreste aus α-Helix 1 und 2 bilden das Helix-Turn-

Helix Motiv (HTH), welches mit einzelnen Basen der cre Sequenz und dem

Phosphatrückgrat der großen Furche der DNA interagiert. In der DNA-gebundenen Form

EINLEITUNG

- 8 -

kommt es als Folge einer allosterischen Veränderung durch die Bindung der Korepressoren

zur Ausbildung der Scharnierhelices (α-Helix 4), welche für die Positionierung der DBD

verantwortlich sind. An Position 55 der Scharnierhelix befindet sich ein innerhalb LacI/GalR-

Mitgliedern hoch konservierter Leucinrest (Lewis et al., 1996; Schumacher et al., 1994;

Schumacher et al., 1995; Schumacher et al., 1997), der durch Interaktion mit dem zentralen

CG-Paar der cre Sequenz über die kleine Furche der DNA zum Abknicken und einer

Aufweitung des DNA Stranges beiträgt. Da das HTH von CcpA extreme Flexibilität aufweist,

ist CcpA in der Lage viele unterschiedliche cre Sequenzen zu erkennen (Hueck et al., 1994;

Miwa et al., 2000; Miwa and Fujita, 2001; Weickert and Chambliss, 1989).

Die mit der DBD frei beweglich verbundene NSD ist für die Bindung der Korepressoren HPr-

Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P notwendig, wobei die cre Bindung von CcpA als bisher einziges

LacI/GalR-Mitglied durch ein weiteres Protein als Interaktionspartner stimuliert wird

(Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006; Seidel et al., 2005). Die ionische und

hydrophobe Bindung der Korepressoren wird durch Aminosäurenreste der Helices I und IX

von CcpA vermittelt. Diese führt im Zuge einer allosterischen Konformationsänderung des

Proteins von der DNA-ungebundenen Form in den DNA-gebundenen Zustand (Schumacher

et al., 2004; Schumacher et al., 2006).

NSD

CSD

Proteinkern

DBD

Scharnierhelix

CcpA CcpA

HPr-Ser46-P

HPr-Ser46-P

cre DNA

HTH

α4

α1α2

α3

αIαIX

HPr-Ser46-PBinderegion

NSD

CSD

Proteinkern

DBD

Scharnierhelix

CcpA CcpA

HPr-Ser46-P

HPr-Ser46-P

cre DNA

HTH

α4

α1α2

α3

αIαIX

HPr-Ser46-PBinderegion

Abb. 2.4: Struktur vom ternären CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex (B. megaterium) Die Abbildung zeigt den CcpA-HPr-Ser46-P-Komplex (Schumacher et al., 2004) gebunden an die optimierte cre. Die CcpA Monomere sind in grau und dunkelblau, die HPr-Ser46-P-Moleküle in türkis bzw. grün und die cre DNA in hellgrau dargestellt. Die α-Helices α1 - α4 (DBD) sowie αI und αIX (NSD) sind farbig hervorgehoben. CSD: C-terminale Subdomäne; NSD: N-terminale Subdomäne; DBD: DNA Bindedomäne; HTH: Helix-Turn-Helix Motiv

EINLEITUNG

- 9 -

Im Zuge des lokalen allosterischen Schaltmechanismus (Schumacher et al., 2004) (Abb. 2.5)

führt die Bindung von HPr-Ser46-P zu einer Rotation der Argininseitenkette von R303 (B.

megaterium). Das bewirkt eine Verschiebung des Proteinrückgrates im Bereich der

Aminosäuren 90-92. Dabei wird die im freien Zustand vorhandene Wasserstoffbrücke

zwischen T306 und Y91 aufgebrochen. Daraus resultiert eine Rotation von Y91 in Richtung

der Kontaktfläche der CcpA Monomere, wodurch es zu einer Neuorientierung von T61

kommt, was die Ausbildung und Interaktion der Scharnierhelices und somit die DNA Bindung

erlaubt.

2.1.6 Niedermolekulare Effektoren von CcpA

Neben den Korepressoren HPr-Ser46-P und Crh-Ser46-P wurden auch niedermolekulare

Effektoren gefunden, welche die CcpA Bindung beeinflussen (Deutscher et al., 1995; Seidel

et al., 2005). Eine spezifische Stimulation der Bindung von HPr-Ser46-P an CcpA durch

Fruktose-1,6-Bisphosphat (FBP) und Glukose-6-Phosphat (G6P) wurde bereits demonstriert

(Seidel, 2005). Die Strukturen von trunkiertem CcpA und HPr-Ser46-P mit FBP bzw. G6P

(Schumacher et al., 2007) zeigen, dass die niedermolekularen Effektoren im Bindespalt

zwischen der CSD und NSD von CcpA binden (Abb. 2.6). Die Bindung der

niedermolekularen Effektoren unterstützt die DNA-bindende Konformation, welche durch die

HPr-Ser46-P Bindung hervorgerufen wird (Schumacher et al., 2007). Des Weiteren werden

durch die gebundenen Koeffektoren die Interdomänenkontakte zwischen dem HPr-Ser46-P

Y89

T306 R303

T61

Y91S46P

Scharnierhelices

Y89

T306 R303

T61

Y91S46P

Scharnierhelices

Abb. 2.5: Lokale Strukturänderungen durch die HPr-Ser46-P Bindung Überlagerung der Strukturen des CcpA Kernproteins (türkis) und des ternären CcpA-HPr-Ser46-P-cre Komplexes (rot). Ein Ausschnitt von HPr-Ser46-P, der die NSD von CcpA bindet, ist in pink gezeigt. In den allosterischen Schaltmechanismus involvierte Aminosäuren in CcpA und HPr-Ser46-P sind als Stabmodell hervorgehoben. Die Wasser-stoffbrückenbindung (schwarze gestrichelte Linie) zwischen Y91 und T306 in der Struktur des Kernproteins ist hervorgehoben. Die gezeigten Positionen beziehen sich auf CcpA in B. megaterium. Die Abb. wurde nach Schumacher et al. (2004) modifiziert.

EINLEITUNG

- 10 -

Rest R17 und D69 und D99 (B. megaterium) des anderen CcpA Monomers verstärkt

(Schumacher et al., 2007).

NSD

CSDCcpA

HPr-Ser46-P

NSD

CSDCcpA

HPr-Ser46-P

Q100

D275

F74

Y221

N72

Y75

T247E249

Q100

D275

F74

Y221

N72

Y75

T247E249

NSD

CSDCcpA

HPr-Ser46-P

NSD

CSDCcpA

HPr-Ser46-PQ100

D275

F74

Y221

N72

Y75

T247

E249

K196D248

Q100

D275

F74

Y221

N72

Y75

T247

E249

K196D248

Abb. 2.6: Struktur des ΔCcpA-HPr-Ser46-P Komplexes mit FBP bzw. G6P (B. megaterium) Die Abbildungen zeigen die ΔCcpA-HPr-Ser46-P-FBP (Abb. A, B) bzw. ΔCcpA-HPr-Ser46-P-G6P (Abb. C, D) Komplexe (Schumacher et al., 2007). CcpA und HPr-Ser46-P sind in dunkelblau und grün dargestellt. FBP bzw. G6P sind als Strichmodell gezeigt. Abb. B zeigt eine Vergrößerung von Abb. A. Aminosäuren (AS), welche in die FBP Interaktion involviert sind, sind hellblau (CSD) bzw. gelb (NSD) hervorgehoben. Abb. D zeigt eine Vergrößerung von Abb. C. AS, welche an der G6P Interaktion beteiligt sind, sind hellblau (CSD) bzw. gelb (NSD) gezeigt. AS, die über Wassermoleküle mit G6P interagieren sind in bordeaux hevorgehoben. CSD: C-terminale Subdomäne; NSD: N-terminale Subdomäne

Außerdem wurden die glykolytischen Intermediate Citrat, cis-Aconitat, α-Ketoglutarat und

Succinat mittels SPR Messungen als neue Koeffektoren identifiziert, welche die CcpA-HPr-

A B

C D

EINLEITUNG

- 11 -

Ser46-P Bindung spezifisch beeinflussen (N. Horstmann, persönliche Mitteilung). Im

Gegensatz dazu üben Malat, Oxalacetat, Isocitrat und Pyruvat keinerlei Effekte auf die CcpA

Bindung aus (N. Horstmann, persönliche Mitteilung). Bisher wurden keine niedermolekularen

Effektoren gefunden, welche die CcpA-Crh-Ser46-P Bindung spezifisch verstärken.

Die Stimulation der cre Bindung durch niedermolekulare Effektoren wird derzeitig kontrovers

diskutiert. G6P erhöht die kooperative Bindung von CcpA an multiple cre Elemente des xyl

und gnt Operons (Gösseringer et al., 1997; Miwa et al., 1997). Dagegen erfordert die

Stimulation der Bindung von CcpA an amyO, xylA oder xynP durch FBP die Anwesenheit

von HPr-Ser46-P (Galinier et al., 1997; Kim et al., 1998; Seidel et al., 2005).

2.1.7 Die Operatorsequenz cre als Bindestelle für CcpA

Durch Mutationsanalysen (Weickert and Chambliss, 1989) und Sequenzvergleiche von cre

Elementen verschiedener Gene wurde eine Konsensussequenz mit einer Länge von 14 Bp

abgeleitet (Hueck et al., 1994). Durch computergestützte Genomanalysen wurde ein

weiteres Konsensusmotiv postuliert, welches die Konsensus cre um jeweils zwei Bp auf

jeder Seite erweitert (Miwa et al., 2000). Ein Vergleich der cre Konsensussequenzen ist in

Tab. 2.1 dargestellt.

Tab. 2.1: Vergleich verschiedener cre Konsensussequenzen

Konsensussequenz (5’→3’) Referenz

T G W N A N C G N T N W C A (Weickert and Chambliss, 1989) W G N A A S C G N W W N C A (Hueck et al., 1994) W W T G N A A R C G N W W W C A W W (Miwa et al., 2000) W T G A A A R C G Y T T W W N (Miwa and Fujita, 2001)

Konservierte Regionen sind fett geduckt. W: A oder T; R: G oder A; S: C oder G; Y: C oder T; N: A, C, G oder T

Die Repression durch CcpA erfordert cre Elemente, welche stromabwärts des Promotors

oder in der kodierenden Region des Strukturgens lokalisiert sind, wie zum Beispiel bei xynP

und gntR (Galinier et al., 1999; Miwa et al., 1997). Andererseits befinden sich die cre

Sequenzen bei der CcpA vermittelten Aktivierung stromaufwärts des Promotors, wie zum

Beispiel bei ackA (Henkin, 1996; Moir-Blais et al., 2001) oder pta (Presecan-Siedel et al.,

1999). Das ackA Gen kodiert für die Acetatkinase, welche die Reaktion von Acetyl-Phosphat

zu Acetat katalysiert, und somit am Überflussmetabolimus beteiligt ist (Grundy et al., 1993;

Grundy et al., 1994; Henkin, 1996). Häufig existiert auch mehr als ein cre Motiv, wie im Falle

EINLEITUNG

- 12 -

von ackA, hut und gntR (Miwa et al., 1997; Moir-Blais et al., 2001; Wray et al., 1994). Die

Regulation über die cre Elemente von gntR ist nicht äquivalent, da die Repression der creup

HPr-Ser46-P unabhängig ist, während die der credown durch HPr-Ser46-P vermittelt wird

(Miwa et al., 1997). Ein Vergleich von verschiedenen cre Sequenzen mit der Konsensus cre

ist in Tab. 2.2 gezeigt.

Tab. 2.2: Vergleich von verschiedenen cre Elementen mit der Konsensussequenz

cre Sequenz (5’→3’) W T G A A A R C G Y T T W W N Konsensus cre T G A A A G C G C T T T T A xynP cre T G T A A G C G T T C A T C A ackA cre1 T G T A A G C G T T A T C A ackA cre2 T G A A A G T G T T T G C A gntR creup T G A A A G C G G T A C C A gntR credown

Abweichungen von der Konsensus cre Sequenz (Miwa and Fujita, 2001) sind grau markiert. Das zentrale CG-Paar ist fett gedruckt. W: A oder T; R: G oder A; Y: C oder T; N: A, C, G oder T

Außerdem stehen mehrere Gene und Operons unter indirekter Kontrolle durch CcpA

(Blencke et al., 2003; Lorca et al., 2005; Lulko et al., 2007; Moreno et al., 2001). Zu diesen

zählt das alsSD Operon, dessen Transkription durch den Transkriptionsaktivator AlsR

kontrolliert wird (Renna et al., 1993). Das alsSD Operon kodiert für die Acetolaktatsynthase

und die Acetolaktatdehydrogenase, welche am Überflussstoffwechsel partizipieren und mit

der Verstoffwechselung von überflüssigem Pyruvat zu Acetoin den intrazellulären pH Wert

aufrechterhalten (Renna et al., 1993). Da weder das alsR Gen noch das alsSD Operon eine

cre Sequenz aufweisen (Renna et al., 1993), ist der molekulare Mechanismus der durch

CcpA indirekt vermittelten Aktivierung noch unbekannt.

EINLEITUNG

- 13 -

2.2 Kohlenstoffkatabolitenregulation in Listeria monocytogenes 2.2.1 Infektionskrankheiten – ein weltweites Problem Laut der Weltgesundheitsorganisation WHO konnten über 30% aller 52 Millionen Todesfälle

im Jahr 1997 auf Infektionskrankheiten zurückgeführt werden. In den vergangenen Jahren

wurden durch die Entdeckung und Entwicklung von Impfstrategien und Antibiotika

herausragende Erfolge bei deren Bekämpfung erzielt. Das größte Problem der Verbreitung

von Infektionskrankheiten ist die zunehmende Resistenz von Bakterien gegenüber

Antibiotika. Daher ist das detaillierte Verständnis der Mechanismen von Infektionskrank-

heiten und der darin involvierten Pathogenitätsfaktoren essentiell für die Entwicklung neuer

Strategien. Im Rahmen dieser Arbeit sollte deshalb ein Pathogenitätsfaktor aus Listeria

monocytogenes näher untersucht werden.

2.2.2 Listeria monocytogenes – Lebensweise und Pathogenese

Listeria monocytogenes ist ein Gram-positives, nicht sporulierendes, fakultativ intrazelluläres,

stäbchenförmiges, pathogenes Bakterium mit niedrigem GC-Gehalt (Cossart and Bierne,

2001; Cossart, 2002; Kreft and Vázquez-Boland, 2001; Vázquez-Boland et al., 2001).

Listerien sind in der Natur nahezu ubiquitär verbreitet. Man trifft sie sowohl auf pflanzlichen

Materialien als auch im Darmtrakt von Mensch und Tier. Bei Tieren erfolgt die Infektion durch

Aufnahme von kontaminiertem Futter, beim Menschen durch den Verzehr von nicht

sachgerecht hergestellten Lebensmitteln (Cossart, 2002). Da sich Listerien an extreme

Umweltbedingungen, wie hohe Salzkonzentrationen, niedrigen pH Wert und breite

Temperaturbereiche anpassen, können sie Prozesse zur Nahrungsmittelkonservierung

überleben (Junttila et al., 1988; Lou and Yousef, 1997).

Obwohl es sechs verschiedene Arten der Gattung Listeria gibt, ist lediglich

L. monocytogenes humanpathogen (Rocourt and Catimel, 1985; Tham et al., 1999). Diese

können eine Infektion, die Listeriose (Marget and Seeliger, 1988), verursachen, welche bei

gesunden Menschen meist harmlos verläuft und selten bemerkt wird, da ausreichend

Neutrophile und Makrophagen die Erreger phagozytieren und enzymatisch abbauen und

somit die Infektion in der Leber überwunden wird. Allerdings können Kleinkinder,

Schwangere und immungeschwächte Menschen schwer erkranken (Blutvergiftungen,

Hirnhautentzündungen). Listeriose kann häufig mit Antibiotika wie Ampicillin oder Amoxicillin

behandelt werden, aber dennoch in 30% der Fälle zum Tod führen (Brosch et al., 1992).

EINLEITUNG

- 14 -

2.2.2 Die Infektion von Wirtszellen durch L. monocytogenes

L. monocytogenes durchläuft einen charakteristischen intrazellulären Infektionszyklus,

welcher erstmals von Tilney und Portnoy (1989) beschrieben wurde und in Abb. 2.7

schematisch dargestellt ist.

Phagosomlyse

Phagosomlyse

Phagosom

PhagosomActA

ActA

LLOPC-PLC

LLOPI-PLC

Mpl

InlA InlBInvasion

Motilität

Vermehrung

1 2

3

4

5 8

9

10

76

11

Phagosomlyse

Phagosomlyse

Phagosom

PhagosomActA

ActA

LLOPC-PLC

LLOPI-PLC

Mpl

InlA InlBInvasion

Motilität

Vermehrung

1 2

3

4

5 8

9

10

76

Phagosomlyse

Phagosomlyse

Phagosom

PhagosomActA

ActA

LLOPC-PLC

LLOPI-PLC

Mpl

InlA InlBInvasion

Motilität

Vermehrung

1 2

3

4

5 8

9

10

76

11

Abb. 2.7: Schematische Darstellung des intrazellulären Infektionsweges von L. monocytogenes Infektionsweg von L. monocytogenes (türkis) innerhalb benachbarter Darmepithelzellen und der daran beteiligten Virulenzfaktoren. Die Schritte 1 - 11 sind dem Text zu entnehmen. Die Abb. wurde nach Tilney und Portney (1989) modifiziert.

Nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel, beginnt die Infektion des Wirtes durch die

Aufnahme von L. monocytogenes über Darmepithelzellen. Die Invasion der Listerie wird

abhängig vom Zelltyp durch verschiedene homologe Invasionsproteine, die Internaline,

vermittelt (Abb. 2.7, Schritt 1 und 2). Das Oberflächenprotein Internalin A (InlA) bindet auf

der Oberfläche von Epithelzellen (Gaillard et al., 1991), während Internalin B (InlB) dagegen

zur Invasion in Hepatozyten und Endothelzellen beiträgt (Dramsi et al., 1993; Gaillard et al.,

1991; Lingnau et al., 1995). Eine Anhaftung der Listerien an die Wirtszelle wird zusätzlich

durch das bakterielle Protein p60 erleichtert (Bubert et al., 1997). Nach der Phagozytose

befindet sich das Bakterium im Zytoplasma innerhalb einer primären Vakuole (Schritt 3), die

zu einem Phagosom heranreift. Phagosomen eliminieren die Bakterien oftmals durch die

Absenkung des pH Wertes und die Anreicherung reaktiver Sauerstoffmetabolite.

EINLEITUNG

- 15 -

L. monocytogenes gelangt durch die Lyse der phagosomalen Membran mittels dem

Listeriolysin (LLO) und der Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase C (PI-PLC)

(Camilli et al., 1993; Leimeister-Wachter et al., 1992) (Schritt 4) jedoch rechtzeitig ins

Zytoplasma, wo es sich vermehrt (Schritt 5). Dort kommt es nach der Neubildung von

Aktinfilamenten durch das Oberflächenprotein ActA (Schritt 6) zur Ausbildung von

Aktinschweifen, mit Hilfe derer sich L. monocytogenes in der Wirtszelle fortbewegt (Cameron

et al., 1999; Cossart and Kocks, 1994; Domann et al., 1992) (Schritt 7). Dadurch gelangen

die Bakterien an die Plasmamembran, wo sie charakteristische Membranausstülpungen

(Pseudopodien) verursachen (Schritt 8), die mit darin vorhandenen Bakterien phagozytiert

werden (Schritt 9). Dort liegen die Bakterien in Vakuolen vor, die von zwei Membranen

umgeben sind, welche durch LLO und die Phosphatidylcholin-spezifische Phopholipase

(Lecithinase) aufgelöst werden (Gedde et al., 2000; Smith et al., 1995) (Schritt 10), bevor der

Zyklus von Neuem beginnt (Schritt 11). Mit dieser Strategie können benachbarte Zellen

infiziert werden, ohne dass das Bakterium dem extrazellulären Raum und der humoralen

Antwort (Antikörper, Komplementsystem, neutrophile Granulozyten) des Wirtes ausgesetzt

ist. Folglich ist die Abwehr der Infektion nur durch die zellvermittelte Immunantwort möglich

(Cossart and Bierne, 2001; Edelson and Unanue, 2002; Finelli et al., 1999).

2.2.3 PrfA - der zentrale Virulenzregulator in L. monocytogenes Die meisten am Infektionszyklus beteiligten Gene sind in einem neun kb großen

Virulenzgencluster auf dem Chromosom von L. monocytogenes angeordnet, welches auch

als Listeria Pathogenitätsinsel I (LIPI-1) bezeichnet wird (Vázquez-Boland et al., 2001). Dies

beinhaltet die Gene der Virulenzfaktoren PI-PLC (plcA), Lecithinase (plcB), LLO (hly),

Metalloprotease (mpl) und ActA (actA) (Kreft and Vázquez-Boland, 2001; Portnoy et al.,

1992). Auch das Gen des positiv regulierenden Transkriptionsfaktors PrfA (prfA) ist auf dem

Virulenzgencluster lokalsiert und für die Transkription aller Gene von LIPI-1 essentiell

(Vázquez-Boland et al., 2001). PrfA ist somit der einzige listerielle Transkriptionsfaktor, für

den eine direkte Beteiligung an der Virulenzgenregulation demonstriert wurde. Die

Transkription der Gene des Virulenzgenclusters ist auf mehreren Ebenen organisiert

(Vázquez-Boland et al., 2001). Neben den Genen von LIPI-1 werden auch die davon isoliert

liegenden Gene inlC (Engelbrecht et al., 1996; Lingnau et al., 1996; Luo et al., 2004), hpt

(Chico-Calero et al., 2002) und bsh (Dussurget et al., 2002) durch PrfA reguliert. Diese

kodieren für das Invasionsprotein InlC, den Hexose Phosphat Transporter Hpt und die

Gallensäure Hydrolase BSH (Chico-Calero et al., 2002; Dussurget et al., 2002). Dabei ist Hpt

für eine effiziente Replikation im Zytosol der infizierten Wirtszelle (Chico-Calero et al., 2002)

EINLEITUNG

- 16 -

und BSH für den Schutz verantwortlich (Dussurget et al., 2002). Auch die von LIPI-1 isoliert

liegenden Gene inlA und inlB, welche für die Invasionsproteine InlA und InlB kodieren, und

ein Operon bilden, stehen zumindest parziell unter Kontrolle von PrfA (Dramsi et al., 1993;

Lingnau et al., 1995). Das PrfA Regulon ist in Abb. 2.8 dargestellt.

prfA plcA actAhly mpl plcB

LIPI-1

hptinlA inlBinlC

PrfA+ + +

3‘

- - +

++ +

bsH

+

prfA plcA actAhly mpl plcB

LIPI-1

hptinlA inlBinlC

PrfA+ + +

3‘

- - +

++ +

bsHbsH

+

Abb. 2.8: PrfA Regulon aus L. monocytogenes Schematische Anordnung einiger durch PrfA regulierter Virulenzgene. Die PrfA Boxen sind als rote Boxen dargestellt. Die Gene prfA, plcA, hly, mpl, actA und plcA sind auf dem zentralen Virulenzgen-cluster LIPI-1 angeordnet. Die Pfeile zeigen die Promotoren, wobei mit einem „+“ oder „–„ markierte Pfeile anzeigen, ob das Gen durch PrfA aktiviert oder reprimiert wird. Die Transkripte sind über den Genen als Pfeile mit gebrochenen Linien gezeigt. prfA: Gen für den Regulator PrfA; plcA, plcB: Gene für Phospholipasen (PI-PLC; PC-PLC); hly: Gen für Listeriolysin (LLO); mpl: Gen für Metalloprotease (Mpl); actA: Gen für ActA zur Polymerisierung von Aktin; inlA,B,C: Gene für Internaline; hpt: Gen für den Hexose Phosphat Transporter (Hpt); bsh: Gen für Gallensäure Hydrolase (BSH) Jeder Promotor, der durch PrfA reguliert wird, enthält eine 14 Bp große palindromische

Sequenz, die PrfA Box, die -58 bis -33 relativ zum Startkodon lokalisiert ist (Freitag et al.,

1993). In Tab. 2.3 ist ein Sequenzvergleich von unterschiedlichen PrfA Boxen gezeigt.

AATTGTNNACAATTKonsensussequenz

PrfA Box (5‘ → 3‘)Promotor

AATTGTTTACAATTplcA

inlC

hly

actA

AATTGTTCGCAATT

AATTGTAAACAATT

GATTGTAAACAATT

AATTGTNNACAATTKonsensussequenz

PrfA Box (5‘ → 3‘)Promotor

AATTGTTTACAATTplcA

inlC

hly

actA

AATTGTTCGCAATT

AATTGTAAACAATT

GATTGTAAACAATT

Tab. 2.3: Sequenzvergleich ver-schiedener PrfA Boxen zur Konsensussequenz N: A, C, G oder T Abweichungen von der Konsensus-sequenz sind grau markiert

Die PrfA Boxen von plcA und hly entsprechen der Konsensussequenz, während die von actA

bzw. inlC eine bzw. zwei Mutationen aufweisen. Außerdem wird die Synthese einiger

Virulenzfaktoren durch die PrfA Konzentration reguliert. Virulenzgene mit perfekt

aufgebauten PrfA Boxen werden bereits bei geringfügig erhöhten PrfA Konzentration

EINLEITUNG

- 17 -

transkribiert, während für die Transkription von actA und inlC eine höhere PrfA Dosis

benötigt wird (Bohne et al., 1994; Bubert et al., 1997).

2.2.4 PrfA als Mitglied der Crp/FnR-Familie PrfA besteht aus 237 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 27,3 kDa

(Leimeister-Wachter et al., 1992; Mengaud et al., 1991). Aufgrund von 20%

Aminosäureidentität zum cAMP Rezeptor Protein Crp aus E. coli, wird PrfA zur Familie der

Crp/FnR Transkriptionsregulatoren gezählt (Lampidis et al., 1994). Ein schematischer und

struktureller Vergleich von Crp und PrfA ist in Abb. 2.9 graphisch dargestellt.

β-Fass αC αD CNCrp HTH207 AS

β-Fass αC αD CN HTH273 AS PrfA αG1,2,3



β-Fass αC αD CN HTH273 AS PrfA αG1,2,3β-Fass αC αD CN HTH273 AS PrfA αG1,2,3

Abb. 2.9: Schematischer und struktureller Vergleich von PrfA und Crp A: Schematischer Vergleich von PrfA und Crp. Die unterschiedlichen Domänen sind farbig dargestellt. Die Buchstaben geben die α-Helices an. Die Abb. wurde nach Scortti et al. (2007) modifiziert. B: Struktureller Vergleich von PrfA (Eiting et al., 2005) und Crp (Passner et al., 2000). Die Farben funktional wichtiger Bereiche sind von Abb. A übernommen. Zyklisches AMP (cAMP) ist in grau dargestellt. Die Abb. stammt aus Scortti et al. (2007).

PrfA weist wie Crp in der C-terminalen Region ein Helix-Turn-Helix Motiv (HTH) auf, welches

die DNA Bindung vermittelt (Eiting et al., 2005; Sheehan et al., 1996). Eine weitere

A B

EINLEITUNG

- 18 -

Ähnlichkeit ist die Bildung von antiparallelen β-Strängen, welche sich zu einer sogenannten

„β-Fass“ Struktur falten. In CRP formt das β-Fass die Bindetasche für den Kofaktor

zyklisches AMP (cAMP) (Kolb et al., 1993). Durch dessen Bindung kommt es zu einer

allosterischen Konformationsänderung in Crp, wodurch die Affinität des Proteins zur DNA

erhöht wird. Aminosäurenaustausche in α-Helix D von Crp führen zu einer

Konformationsänderung in Abwesenheit eines Kofaktors (Ripio et al., 1997). Auch in PrfA

konnte ein Aminosäureaustausch in α-Helix D (G145S) gefunden werden, welcher zu einer

erhöhten Bindeaffinität von PrfA zur DNA führt (Mauder et al., 2006; Ripio et al., 1997). Die

Struktur dieser konstitutiven G145S PrfA Mutante zeigt im Vergleich zur WT PrfA Struktur

eine typische allosterische Veränderung (Eiting et al., 2005). Bisher konnte kein

niedermolekularer Effektor für PrfA identifiziert werden.

2.2.5 Regulation der PrfA Synthese und Aktivität

Für die Synthese und Aktivität von PrfA sind komplexe Regulationsmechanismen auf

transkriptioneller und translationaler Ebene von Bedeutung.

Auf der Ebene der Transkription wird die Expression von PrfA durch drei Promotoren

kontrolliert, wobei sich zwei Promotoren (P1 und P2) unmittelbar vor prfA befinden. Das führt

zu monocistronischen Transkripten (Freitag et al., 1993; Freitag and Portnoy, 1994;

Mengaud et al., 1991; Renzoni et al., 1999). Des weiteren kann prfA zusammen mit plcA von

einem vor plcA liegenden Promotor kotranskribiert werden, was folglich zu einem

bicistronischen Transkript führt (Camilli et al., 1993; Freitag et al., 1993; Freitag and Portnoy,

1994; Mengaud et al., 1991) (Abb. 2.10 A).

Auf posttranskriptioneller Ebene kommt es in der untranslatierten 5’-Region (UTR) von prfA

zu einer Thermoregulation, indem die UTR bei niedrigen Temperaturen eine

Sekundärstruktur ausbildet. Dadurch wird die Shine-Dalgarno Sequenz verdeckt, weshalb

die Translation und folglich auch die Expression von PrfA verhindert wird (Johansson et al.,

2002) (Abb. 2.10 B).

Da in Anwesenheit von Glukose oder Cellobiose die Expression sämtlicher Virulenzgene

parziell reprimiert wird, scheint die Aktivität von PrfA auch auf posttranslationaler Ebene

beeinflusst zu werden (Klarsfeld et al., 1994; Milenbachs et al., 1997; Renzoni et al., 1997;

Renzoni et al., 1999).

Außerdem wird die Expression der Virulenzgene auch durch hohe Eisenkonzentrationen

begünstigt (Conte et al., 1996). Es bleibt allerdings offen, ob PrfA dabei modifiziert oder

inaktiviert wird. Außerdem besteht die Möglichkeit, dass weitere bisher unbekannte Faktoren

zusammen mit PrfA die Virulenzgenexpression beeinflussen.

EINLEITUNG

- 19 -

P1P2 P

prfA plcA

P1P2 P

prfA plcA

prfA

SD

prfA-mRNA

Ribosomen

PrfA

X

prfA

SD

prfA-mRNA

prfA prfA-mRNA

PrfA

Hohe Temperatur

Niedrige Temperatur

VirulenzgenPrfA Box

prfA

SD

prfA-mRNA

Ribosomen

PrfA

X

prfA

SD

prfA-mRNA

prfA prfA-mRNA

PrfA

Hohe Temperatur

Niedrige Temperatur

VirulenzgenPrfA Box

Abb. 2.10: Regulation der PrfA Expression A: Schematischer Überblick über die prfA Region. In der logarithmischen Phase wird prfA hauptsächlich vom Promotor P als bicistronisches plcA-prfA Produkt transkribiert. In der Stationärphase liegt prfA von den Promotoren P1 und P2 transkribiert wird. B: Mechanismus der PrfA Expression mittels Thermoregulation. Bei geringen Temperaturen (bis zu 30°C) bildet sich im 5’-untranslatierten Bereich von prfA eine Sekundärstruktur aus, welche die Ribosomenbindung an die Shine-Dalgarno Sequenz (SD) und folglich auch die Expression von PrfA verhindert. Bei hohen Temperaturen (mindestens 37°C) wird die Bindung der Ribosomen an die SD und folglich die Expression von PrfA ermöglicht, wodurch dieses an die PrfA Boxen unterschiedlicher Virulenzgenpromotoren binden kann und die Transkription des Virulenzgenes induziert. Die Abb. wurde modifiziert nach Johansson et al. (2002).

A

B

EINLEITUNG

- 20 -

2.3 Zielsetzungen und Fragestellungen dieser Arbeit

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Projekte bearbeitet und dabei zwei Hauptziele

verfolgt.

Das Ziel des ersten Projektes war es, die Effekte funktional unterschiedlicher Domänen von

CcpA, auf die Aktivierung bzw. Repression von durch CcpA regulierten Genen aus B. subtilis

zu analysieren. Dafür wurden CcpA Mutanten ausgewählt, deren Aminosäuren in

unterschiedlichen Domänen (DNA Bindung, Dimerisierung, Koeffektor Erkennung) lokalisiert

sind. Die Auswirkungen dieser Aminosäurenaustausche in CcpA sollten dann auf die

Regulation von Genen mit unterschiedlicher Lage der cre Sequenzen bezüglich des

Transkriptionsstartes bestimmt werden.

Dabei sollten folgende Fragestellungen bearbeitet werden:

Gibt es CcpA Mutanten mit unterschiedlichen Aktivitäten bezüglich durch CcpA reprimierter

und aktivierter Gene?

Existieren mögliche Hinweise zum Mechanismus der Aktivierung von ackA?

Das Ziel des zweiten Projektes war es ein in vivo Expressionssystem zur Charakterisierung

der PrfA abhängigen Virulenzgenexpression aus L. monocytogenes in B. subtilis zu

etablieren. Anschließend sollte nach potenziellen Faktoren aus der KKR gesucht werden,

welche die PrfA Aktivität aktivieren oder reprimieren.

Dabei sollten folgende Fragestellungen bearbeitet werden:

Ist die Analyse der PrfA abhängigen Virulenzgenexpression aus L. monocytogenes auch im

nicht pathogenen Modellorganismus B. subtilis möglich?

Steht die Virulenzgenexpression unter globaler Kontrolle durch die KKR und kann dies in

B. subtilis untersucht werden?

Gibt es Komponenten der KKR, welche die PrfA Aktivität (in)direkt beeinflussen?

Welche Rolle spielen dabei die PrfA Konzentrationen, unterschiedliche C-Quellen und die

Wuchsphasen? Gibt es dabei einen möglichen Zusammenhang?

MATERIALIEN UND METHODEN

- 21 -

3. Materialien und Methoden 3.1 Materialien Die wichtigsten verwendeten Chemikalien sind in Tab. 3.1 aufgeführt. Alle übrigen Chemikalien wurden von Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe) oder Sigma (München) in p. A. Qualität bezogen. Verwendete Hilfsmittel und Geräte sind in Tab. 3.2 und 3.3 aufgeführt. Käuflich erwerbbare Reagenzienansätze sind in Tab. 3.4 aufgelistet. Verwendete Proteine und Enzyme in Tab. 3.5 und Oligonukleotide in Tab. 3.6 zusammengefasst. Tab. 3.1: Chemikalien

Chemikalie Bezugsquelle

Antibiotic Medium 3 (AB3) Difco, Detroit (USA) Adenosintriphosphat (ATP) Boehringer, Mannheim Agar Oxoid, Heidelberg Agarose Biozym, Hessisch Oldendorf Ammoniumeisen(III)-citrat (CAF) Sigma, München Ammoniumperoxidisulfat (APS) Sigma, München Ampicillin (Amp) Roth, Karlsruhe Anhydrotetrazyklin (atc) Acros, Geel, Belgien Borsäure Merck, Darmstadt 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) PeqLap, Erlangen Bromphenolblau Roth, Karlsruhe Calciumchlorid Sigma, München Casein, säurehydrolysiert (CAA) Sigma, München Cellobiose Sigma, München Chloramphenicol (Cm) Roth, Karlsruhe Chloroform Roth, Karlsruhe Coomassie Brilliant Blue Gibco BRL, Gaithersburg D(+)-Xylose (Xyl) Roth, Karlsruhe desoxy-Nukleotid-Triphosphate (dNTPs) PeqLap, Erlangen di-Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt di-Kaliumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe N,N-Dimethylformamid (DMF) Sigma, München Di-Methyl-Sulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt Dithiothreitol (DTT) Roth, Karlsruhe Erythromycin (Erm) Sigma, München Essigsäure Roth, Karlsruhe Ethanol, absolut (EtOH) Roth, Karlsruhe Ethanol, technisch Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Roth, Karlsruhe Formamid Sigma, Heidelberg Glukose (Glk) Roth, Karlsruhe L-Glutaminsäure Roth, Karlsruhe Glyzerin Roth, Karlsruhe Glycin Roth, Karlsruhe Hefeextrakt Oxoid, Heidelberg I-BlockTM Applied Biosystems (Tropix), USA Isopropanol Roth, Karlsruhe Isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) PeqLab, Erlangen Kaliumchlorid Roth, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Kalium-Glukonat Merck, Darmstadt Kanamycin (Km) Sigma, Heidelberg


- 22 -

Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe Maltose Roth, Karlsruhe Methanol (MetOH) Roth, Karlsruhe β-Mercaptoethanol (β-ME) Merck, Darmstadt Natriumacetat Roth, Karlsruhe Natriumcarbonat Roth, Karlsruhe Natriumchlorid Merck, Darmstadt Natriumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg Natriumsuccinat Roth, Karlsruhe o-Nitrophenyl-β-D-Galacto-Pyranosid (ONPG) Applichem, Darmstadt Phenol (TE gesättigt) Roth, Karlsruhe Polyethylenglycol 6000 (PEG 6000) Roth, Karlsruhe Polyethylenglycol 8000 (PEG 8000) Roth, Karlsruhe Saccharose Sigma, München Salzsäure Roth, Karlsruhe Stickstoff (flüssig) Linde, Höllkriegelskreuth Succinat Merck, Darmstadt N,N,N`,N‘-Tetramethylendiamin (TEMED) Merck, Darmstadt Tetrazyclin (Tc) Fluka, München Trehalose Sigma, München Tris(hydroxymethyl)aminomethan Roth, Karlsruhe Triton X-100 Serva, Heidelberg Trypton Oxoid, Heidelberg L-Tryptophan Merck, Darmstadt Tween 20 Serva, Heidelberg Xylencyanol Roth, Karlsruhe

Tab. 3.2: Hilfsmittel

Hilfsmittel Bezugsquelle

Einmalspritzen Becton Dickinson, Irland Elektroporationsküvetten PeqLab, Erlangen Entwickler und Fixierer für Röntgenfilme Tetenal, Norderstedt Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml und 2 ml Greiner, Nürtingen Erlenmeyerkolben Schott, Mainz Flourotrans PVDF-Membran Pall, Großbritannien Glaspipetten Brand, Wertheim Glasschraubflaschen Schott, Mainz Greinerröhrchen (15 und 50 ml) Greiner, Nürtingen Halbmikroküvetten, Kunststoff Greiner, Nürtingen Mikroliterpipetten (20 µl, 200 µl, 1000 µl) Gilson, Düsseldorf Neutralit® pH-Indikatorstäbchen Merck, Darmstadt PCR-Reaktionsgefäße Micro Amp 0,2 ml PeqLab, Erlangen Petrischalen Greiner, Nürtingen Pipettenspitzen Greiner, Nürtingen Quarzküvetten Hellma, Mühlheim Röntgenfilm X-AR-5 GE Healthcare, Buckinghamshire, UK Schikanekolben Schott, Mainz Sterilfilter (0,2 µM Porengröße) Sarstedt, Nümbrecht Whatman Papier Maidstone, GB Zentrifugenbecher Beckmann, München Zentrifugenröhrchen 12 bzw. 50 ml Greiner, Nürtingen


- 23 -

Tab. 3.3: Geräte

Geräte Bezugsquelle

ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Weiterstadt Äkta FPLC Pharmacia Biotech, Freiburg Äkta Prime Pharmacia Biotech, Freiburg Autoklav Systec 5075 EL Systec GmbH, Wettenberg Biocad Vision Workstation Applied Biosystems, Weiterstadt Biofuge fresco, pico oder primo R Heraeus Christ, Osterode Elektrophoreseapparaturen für Agarosegele M. Müller, FAU Elektroporationsgerät Gene Pulser Bio-RAD, München Feinwaage Sartorius Analytic Sartorius, Göttingen FL 322 Fluorolog 3 Spex Instruments S.A., München Heizblock Dri Block DB3 Techne, GB Horizontalschüttler New Brunswick, Neu Isenburg Kühlzentrifuge Avanti J-25 Beckmann, München Kulturschüttler Mod G25 New Brunswick, Neu Isenburg Magnet-Heizrührer IKA RCT Basic IKA Labortechnik, Staufen Megafuge 1.0R (Tischzentrifuge) Heraeus Christ, Osterode Mikroprozessor pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin Spannungsquelle TN 300-120 Heinzinger, Rosenheim Speed-Vac Vakuumzentrifuge Bachofer, Reutlingen Spektralphotometer Novaspec II Pharmacia Biotech, Freiburg Spektralphotometer Ultrospec 3000 Pharmacia Biotech, Freiburg Thermocycler Gene Amp PCR-System 2400 Perkin Elmer, Weiterstadt Ultraschallgerät Branson Sonic Sonifier B12 Braun, Melsungen Ultraspec 3000 Photometer Pharmacia, Freiburg UV-Schirm 254 nm und 366nm Vetter, Wiesloch Vertikalgelelektrophoreseapparatur Mini V8.10 Gibco, USA Videodokumentationssystem PeqLab, Erlangen Vortexer IKA Labortechnik, Staufen Waage, universal Sartorious, Göttingen Wasserthermostat Braun, Melsungen Wasservollentsalzungsanlage Milli-Q© PF Plus Millipore, Frankreich

Tab. 3.4: Reagenzienansätze

Reagenzienansatz Anwendung Hersteller

Big Dye® Terminator Mix Sequenzierung von DNA Applied Biosystems, Weiterstadt

Bio-Rad Protein Assay Bestimmung von Proteinkonzentrationen Bio-Rad, München ECL+Plus Western Blotting Detection System Western Blot Analysen GE Healthcare,

Buckinghamshire, UK GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit

DNA Reinigung und Elution aus Agarosegelen

GE Healthcare, Buckinghamshire, UK

Nucleobond® AX100 und AX500 Plasmidpräparationen Macherey-Nagel,

Düren

NucleoSpin® Plasmid Plasmidpräparationen Macherey-Nagel, Düren

NucleoSpin® II DNA Reinigung und Elution aus Agarosegelen

Macherey-Nagel, Düren

PhastGel® Blue R Färbung von denaturierenden PAA Gelen

Pharmacia Biotech, Freiburg

QIAamp® DNA Mini Kit Präparation von genomischer DNA Qiagen, Hilden PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR Beads in a plate PCR Pharmacia Biotech,

Freiburg


- 24 -

Tab. 3.5: Enzyme und Proteine

Enzym, Protein Hersteller

Anti-CcpA Antikörper (Küster et al., 1996) Anti-PrfA Antikörper Dr. S. Müller-Altrock, Universität Würzburg Lysozym Merck, Darmstadt PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerase NEB, Schwalbach PrfA Dr. S. Müller-Altrock, Universität Würzburg Proteinase K Stratagene, Heidelberg Pwo DNA Polymerase PeqLab, Erlangen Restriktionsendonukleasen NEB, Schwalbach, MBI Fermentas, St. Leon-Rot Ribonuclease A (RNaseA) Sigma, München Taq DNA Polymerase NEB, Schwalbach Shrimps Alkalische Phosphatase (SAP) Roche, Penzberg T4 DNA Ligase NEB, Schwalbach Vent DNA Polymerase NEB, Schwalbach

Enzymstammlösungen

Lysozym 100 mg/ml in Tris/HCl, pH 7,5

RNaseA 20 mg/ml in 1,5 M Natriumacetatlösung, pH 5. Zur Inaktivierung der DNasen wurde die Lösung 10 min bei 100°C inkubiert. Nach Abkühlung auf RT wurde die RNase A aliquotiert und bei -20°C aufbewahrt.

Tab. 3.6: Oligonukleotide

Oligonukleotid Sequenz (von 5´ nach 3´) Verwendung

ackA1+2 ATAATAATAGAATTCAACACAAAATACA GAGGG

Klonierung von pWH556, Sequenzierung

ackABam ATAATAATAGGATCCTTCGAAAAGCTGA AATTTC


actABam ATAATAATAGGATCCTTCTTCCCATTCA TCTGTG

Klonierung von pWH892, PCR Analyse, Sequenzierung

actAEco ATAATAATAGAATTCACCGATGCGAAAA AAGCG


MS_amyE_fwd GAAGTAAGTCTTCAAAAAATC PCR Analyse MS_amyE_back TGGTTTCTTTCGGTAAGTC PCR Analyse

aroApsc CGGAATCAGAACATATGAAA PCR Analyse ccpA Deletion, Sequenzierung

ccpA3’ TCAAAACGTTTCATCATTTCT Sequenzierung von ccpA

ccpA-mut1 ATAATATCTAGAACCAAGTATACGTTTTC ATC Sequenzierung von ccpA

dccpA3 ATAATAATAGCGGCCGCTGAAGCACTGC AGCATCTGATG Sequenzierung von ccpA

dccpA4 TATTATTATGGTACCTTTTCGGTGCCGT TCCTCC Sequenzierung von ccpA

DP3 ATTTCTGCGCAATAATGC Sequenzierung von tetR DP4 CGGTCGGTCAGGGCGGC Sequenzierung von tetR DP6 GGTAACCAAGATGTCGAG Sequenzierung von tetR

hlyBam ATAATAATAGGATCCCTTAGGACTTGCA GGCG


hlyEco ATAATAATAGAATTCAAGTATAAAATAAA ACAGAGTAA



- 25 -

inlCBam3 ATAATAATAGGATCCTGTACTCCAGATA GTTCCT


inlCEco ATAATAATAGAATTCAAAATTGCAAATAA ATAGAAAAAA


pCPBsrGI AAAAAATAATGTACACTACTGAC Klonierung pWH302

plcABam ATAATAATAGGATCCGACATCCATTGTT TTGTAGT


plcAEco ATAATAATAGAATTCAAATACCGTTTGC CACCC


prfAccpAlink TTCTTCTGCTTGAGCGTTCATCCTAAAA CCACTCCTTTTAC Klonierung von pWH302

prfAendKpnI ATAATAATAGGTACCTAAGTTCTTTATTC GAATAAAAT

Klonierung von pWH302, pWH1018

MS-ackAmutxynP TTCTTATTGAAAGCGCTTTTATAACG Klonierung von pWH556 MS-KmR-fwd- EcoRI

ATAATAATAGAATTCGTTAACCCCAGCG AACC

Klonierung von pWH1332, pWH1333, pWH1334

MS-KmR-rev-BglII ATAATAATAAGATCTAGAGCTCTTTAGA CATCTAA

Klonierung von pWH1332, pWH1333, pWH1334

MS_prfAfwdSacI ATAATAATAGAGCTCAAAGGAGTGGTTT TAGGATGA ACGCTCAAGCAGAA


MS_TetfwdSacI ATAATAATAGAGCTCGATCCTCTAGAGT CGACC


MS_TetrevEcoRI ATAATAATAGAATTCTCTCCTCAGACTAT TTGCAACA


MS_ccpAE327R _Rev TCTAAGCCGTATACGGTGCG Klonierung von pWH1541-

E327R MS_ccpAK330E_ NotI_Rev

ATAATAATAGCGGCCGCTTATTATGACT TGGTTGACTCTCTA

Klonierung von pWH1541- K330E

MS_ccpAK333E_ NotI_Rev

ATAATAATAGCGGCCGCTTATTATGACT CGGTTGACTTTCTA

Klonierung von pWH1541-K333E

MS_ccpAK333E/ K330E_NotI_Rev

ATAATAATAGCGGCCGCTTATTATGACT CGGTTGACTCTCTA

Klonierung von pWH1541- K330E/K333E

MS_ccpANotI _Rev

ATAATAATAGCGGCCGCTTATTATGACT TGGTTGACTTTC

Konierung von pWH1541 Derivaten

MS_ccpAPstI _Fwd GAAGCACTGCAGCATCTG Konierung von pWH1541

Derivaten

MS-xynPBam-rev ATAATAATAGGATCCAGACGCATATCCA ACT


MS-xynPEco-fwd ATAATAATAGAATTCGTTCTTTCAATTCA TGACCG


MS-xynPmutackA cre2-fwd

CACTGTTTTGTAAGCGTTATCATAA Klonierung von pWH557

pRev19 TCGTATGTTGTGTGGAATTG PCR Analyse, Sequenzierung von pHT304 Derivaten

pUP19 ATTAAGTTGGGTAACGCCAG PCR Analyse, Sequenzierung von pHT304 Derivaten

ytxDpsc CATGCCGGAGCGAATTC PCR Analyse ccpA Deletion, Sequenzierung

Die verwendeten Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (Ebersberg) bezogen.


- 26 -

3.2 Bakterienstämme Tab. 3.7: Bakterienstämme

Stamm genetische Marker Referenz

B. megaterium WH419 lac, gdh2Φ, xylA-spoVG-lacZ, ΔccpA (Wagner et al., 2000)

B. subtilis 168 trpC2 Bacillus Genetic Stock Center

B. subtilis MZ303 trpC2, ∆ptsH, cat (Arnaud et al., 1992)

B. subtilis QB5223 trpC2, ptsH1 (Martin-Verstraete et al., 1995)

B. subtilis QB5435 trpC2, ΔptsG, cat (Stülke et al., 1997) B. subtilis QB7096 trpC2, Δcrh, aphA3 (Galinier et al., 1999) B. subtilis QB7144 trpC2, amyE::(xynC’::’lacZ, cat) (Galinier et al., 1999) B. subtilis WH479 YF283 Derivat, ΔccpA, aphA3 (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH482 trpC2, amyE::(ackA’::’lacZ, cat) (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH483 WH482 Derivat, ΔccpA, aphA3 (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH486 trpC2, amyE::(alsS’::’lacZ, cat) (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH487 WH486 Derivat, ΔccpA, aphA3 (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH490 QB7144 Derivat, ΔccpA, aphA3 (Sprehe et al., 2007) B. subtilis WH592 trpC2, amyE::(ackA(xynP cre)’::’lacZ, cat) Diese Arbeit

B. subtilis WH593 trpC2, amyE::(ackA(xynP cre)’::’lacZ, cat), ΔccpA, aphA3 Diese Arbeit

B. subtilis WH594 trpC2, amyE::(xynP(ackA cre2)’::’lacZ, cat) Diese Arbeit

B. subtilis WH595 trpC2, amyE::(xynP(ackA cre2)’::’lacZ, cat), ΔccpA, aphA3 Diese Arbeit

B. subtilis WH596 QB5435 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH597 QB5435 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH598 QB5435 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH621 trpC2, amyE::(actA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH622 trpC2, amyE::(hly’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH623 trpC2, amyE::(plcA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH626 trpC2, amyE::(inlC3’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH627 QB7096 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH628 QB7096 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH629 QB7096 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH632 QB7096 Derivat, amyE::(inlC3’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH633 WH649 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH634 WH649 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH635 WH649 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH638 WH649 Derivat, amyE::(inlC3’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH643 trpC2, amyE::(actA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH644 trpC2, amyE::(hly’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH645 trpC2, amyE::(plcA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH648 trpC2, amyE::(inlC3’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH649 trpC2, ∆ccpA, aphA3 Diese Arbeit B. subtilis WH650 MZ303 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH651 MZ303 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH652 MZ303 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit B. subtilis WH653 QB5223 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH654 QB5223 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, cat) Diese Arbeit B. subtilis WH655 QB5223 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit

B. subtilis YF283 gntR43L trpC2 metC7 amyE::(PgntgntR’::’lacZ, cat) (Miwa et al., 1997)

E. coli DH5α recA1 endA1 gyrA96 relA1 hsdR17(rK

-mK+)

supE44 thi Φ80 ΔlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169

(Hanahan, 1985)

E. coli FT1 BL21 (DE3) ΔptsHIcrr/pLysS, aphA3, cat (Parche et al., 1999)


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3.3 Plasmide Tab. 3.8: Plasmide Plasmid genetische Marker Referenz

pAC6 cat, bla, amyE Integrationsvektor für B. subtilis amyE (Stülke et al., 1997)

p4813 bla, ptsK (Reizer et al., 1998) pHT304 bla, erm, lacZ'

Shuttlevektor für B. subtilis und E. coli (Arantes and Lereclus, 1991)

pWH144 pWH1541, si (stabilisierendes Insert) (Horstmann et al., 2007) pWH144-E327R pWH144 Derivat, ccpA E327R Diese Arbeit pWH144-K330E pWH144 Derivat, ccpA K330E Diese Arbeit pWH144-K333E pWH144 Derivat, ccpA K333E Diese Arbeit pWH144-E327R/K330E pWH144 Derivat, ccpA E327R/K330E Diese Arbeit

pWH144-E327R/K333E pWH144 Derivat, ccpA E327R/K333E Diese Arbeit

pWH144-K330E/K333E pWH144 Derivat, ccpA K330E/K333E Diese Arbeit

pWH144-E327R/ K330E/K333E pWH144 Derivat, ccpA E327R/K330E/K333E Diese Arbeit

pWH302 pHT304 Derivat, PccpA-prfA Diese Arbeit pWH334 pAC6 Derivat, amyE::(ackA’::’lacZ, cat) (Sprehe et al., 2007) pWH335 pAC6 Derivat, amyE::(ackA(cre2*)’::’lacZ, cat) (Sprehe et al., 2007) pWH336 pAC6 Derivat, amyE::(alsS’::’lacZ, cat) (Sprehe et al., 2007) pWH338 pWH618 Derivat, ΔccpA, aphA3 (Sprehe et al., 2007) pWH466 pET3c Derivat, ptsH (B. subtilis) (Seidel et al., 2005) pWH518 pAC6 Derivat, amyE::(xynP’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH556 pAC6 Derivat, amyE::(ackA(xynP cre)’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH557 pAC6 Derivat, amyE::(xynP(ackA cre2’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH653 pET3c Derivat, ccpA his-tag (Seidel, 2005) pWH697 pWH1541 Derivat, ccpA M89W (Sprehe et al., 2007) pWH698 pWH1541 Derivat, ccpA Y90W (Sprehe et al., 2007) pWH699 pWH1541 Derivat, ccpA N93W (Sprehe et al., 2007) pWH892 pAC6 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH893 pAC6 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH894 pAC6 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH897 pAC6 Derivat, amyE::(inlC3’::’lacZ, cat) Diese Arbeit pWH916 pWH1541 Derivat, ccpA A300W (Sprehe et al., 2007) pWH917 pWH1541 Derivat, ccpA V301W (Sprehe et al., 2007) pWH918 pWH1541 Derivat, ccpA A302W (Sprehe et al., 2007) pWH919 pWH1541 Derivat, ccpA M303W (Sprehe et al., 2007) pWH920 pWH1541 Derivat, ccpA R304W (Sprehe et al., 2007) pWH921 pWH1541 Derivat, ccpA L305W (Diel, 2005) pWH922 pWH1541 Derivat, ccpA L306W (Sprehe et al., 2007) pWH981 pWH1541 Derivat, ccpA T307W (Sprehe et al., 2007) pWH982 pWH1541 Derivat, ccpA K308W (Sprehe et al., 2007) pWH983 pWH1541 Derivat, ccpA I309W (Diel, 2005) pWH984 pWH1541 Derivat, ccpA M310W (Diel, 2005) pWH985 pWH1541 Derivat, ccpA N311W (Diel, 2005) pWH986 pWH1541 Derivat, ccpA K312W (Diel, 2005) pWH987 pWH1541 Derivat, ccpA E313W (Diel, 2005)

pWH1017 pHT304 Derivat, tet-Regulationsregion aus pWH1935-1a Diese Arbeit

pWH1018 pWH1017 Derivat, Pxyl/tet-prfA Diese Arbeit pWH1332 pWH892 Derivat, amyE::(actA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit pWH1333 pWH893 Derivat, amyE::(hly’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit pWH1334 pWH894 Derivat, amyE::(plcA’::’lacZ, aphA3) Diese Arbeit


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pWH1541 pHT304 ccpA his (Seidel et al., 2005) pWH1541-M17R pWH1541 Derivat, ccpA M17R (Sprehe et al., 2007) pWH1541-R54W pWH1541 Derivat, ccpA R54W (Sprehe et al., 2007) pWH1541-V149W pWH1541 Derivat, ccpA V149W Diel, unv. pWH1541-D276A pWH1541 Derivat, ccpA D276A (Sprehe et al., 2007) pWH1542 pWH1541 Derivat, ccpA +1W (Seidel et al., 2005) pWH1543 pWH1520 Derivat, ccpA his-tag (B. subtilis) (Aung-Hilbrich et al.,

2002) pWH1545 pWH1541 Derivat, ccpA I4W (Sprehe et al., 2007) pWH1546 pWH1541 Derivat, ccpA I128W Diel, unv. pWH1547 pWH1541 Derivat, ccpA V315W Diel, unv. pWH1935-1a pUC19 Derivat, aphA3, bla, InsTetG+1 (Bertram et al., 2005)

3.4 Puffer und Medien Puffer, Medien und Lösungen wurden mit Millipore Wasser bzw. deionisiertem Wasser angesetzt und 25 min bei 121°C autoklaviert. Lösungen thermolabiler Verbindungen wurden sterilfiltriert und autoklavierten Medien nach dem Abkühlen auf ca. 50°C zugesetzt. 3.4.1 Allgemeine Puffer und Lösungen

TE 10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8 (HCl) SBT 50 mM Tris/HCl, 200 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol SET 75 mM NaCl, 25 mM EDTA, 20 mM Tris TENS 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, 0,1 M NaOH, 0,5% (v/v) SDS

3.4.2 DNA Gelelektrophorese

20 x TAE 800 mM Tris, 600 mM NaOAc, 25 mM EDTA, pH 8,3 (Eisessig) DNA Farbmarker

0,05% (w/v) Bromphenolblau, 0,05% (w/v) Xylencyanol, 2% (w/v) SDS, 1 mM EDTA, 50% (v/v) Glyzerin, 5% (v/v) 20 x TAE

Agarose Gel 0,8 – 2% (w/v) Agarose in 1 x TAE Größenstandard: PeqLab DNA Leitermix: 10 / 8 / 6 / 5 / 4 / 3,5 / 3 / 2,5 / 2 / 1,5 / 1,2 / 1,03 / 0,9 / 0,8 / 0,7 / 0,6 / 0,5 / 0,4 / 0,3 / 0,2 / 0,1 kbp

3.4.3 Protein Gelektrophorese

10 x Proteinlaufpuffer (SDS) 1,92 M Glycin, 0,5 M Tris, 1% (w/v) SDS, pH 8,8 5 x Proteinauftragepuffer (SDS)

15% (v/v) β-Mercaptoethanol, 15% (v/v) SDS, 1,5% (w/v) Bromphenolblau, 50% (v/v) Glyzerin

10 x Proteinlaufpuffer (nativ) 1,92 M Glycin, 0,5 M Tris, pH 8,8 5 x Proteinauftragepuffer (nativ)

15% (v/v) β-Mercaptoethanol, 1,5% (w/v) Bromphenolblau, 50% (v/v) Glyzerin

Waschlösung 45% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure Färbelösung 0,5% Coomassie Brilliant Blue, 10% (v/v) Essigsäure Entfärbelösung 10% (v/v) Essigsäure


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Sammelgel (SDS) 4% (v/v) Acrylamid (39:1), 85 mM Tris/HCl pH 6,8, 0,1% (v/v) SDS, mit Millipore H2O ad 9,95 ml, 200 µl 10% (v/v) APS, 10 µl TEMED

Trenngel (SDS) 10 - 15% (v/v) Acrylamid (39:1), 85 mM Tris/HCl pH 8,8, 100 mM Tris Borsäure pH 8,8, 0,1% (v/v) SDS, mit Millipore H2O ad 9,8 ml, 200 µl 10% (v/v) APS, 5 µl TEMED

PAA Gel (nativ) 8 -12% Acrylamid (39:1), 85 mM Tris/HCl pH 8,8, 100 mM Tris Borsäure pH 8,8, mit Millipore H2O ad 9,8 ml, 200 µl 10% (v/v) APS, 10 µl TEMED

Größenstandards: PeqGOLD Protein-Marker II: 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200 kDa PeqGOLD Protein-Marker IV (Prestained): 10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 100, 130, 170 kDa 3.4.4 Proteinaufreinigung Anionenaustausch, Sepharose QFF (HPr, HPr-Ser46-P):

Puffer A 10 mM Tris/HCl pH 7,5, (2 mM DTT) Puffer B 10 mM Tris/HCl pH 7,5, (2 mM DTT) Regeneration mit 2 M NaCl, 1M NaOH und 30% (v/v) Isopropanol

Nickelaffinitätschromatographie (CcpA His-tag):

HisA 50 mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10 mM Imidazol HisB 50 mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 500 mM Imidazol Regeneration mit 100 mM EDTA, 100 mM NiSO4, 300 mM NaCl

Gelfiltration (HPr, HPr-Ser46-P, CcpA His-tag):

HBSE Puffer 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA Regeneration mit 0,5 M NaOH

Herstellung von HPr-Kinaseextrakt:

DTT Waschpuffer 20 mM Tris HCl, pH 7,6, 3 mM DTT, sterilfiltriert DTT Aufschlusspuffer 2 mM Tris HCl, pH 7,6, 0,3 mM DTT, 0,5 mM PMSF

3.4.5 Bakteriennährmedien und Medienzusätze

LB-Medium 1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 1% (w/v) NaCl Stärkeplatten 1,5% (w/v) Nutrient Broth, 1% (w/v) Stärke, 1,5% (w/v) Agar

CSK-Medium 1 x C-Salze, 0,2% (w/v) Natriumsuccinat, 0,8% (w/v) K-Glutamat, 50 µg/ml L-Tryptophan, 1 x CAF, 1 x III‘-Salze

MNGE-Medium 1 x MN-Medium, 1% (w/v) Glukose, 0,2% (w/v) K-Glutamat, 50 µg/ml L-Tryptophan, 1 x CAF, 3 µM MgSO4


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Stammlösungen für Minimalmedien:

100 x III'-Salze 50 mM MgSO4, 1 mM MnSO4

10 x MN-Medium 440 mM KH2PO4, 600 mM K2HPO4, 30 mM Natriumcitrat, 150 mM (NH4)2SO4

40% K-Glutamat 40% (w/v) L-Glutaminsäure, KOH Plätzchen zum Lösen 100 x CAF 2,2 mg/ml Ammoniumeisen(III)citrat 10 x C-Salze 250 mM (NH4)2SO4, 700 mM K2HPO4, 260 mM KH2PO4

Medienzusätze: Agar: Zur Herstellung von LB-Festmedien wurde dem Flüssigmedium vor dem Autoklavieren 1,5% Agar zugesetzt. Bei Minimalmediumplatten wurden zunächst 1,5% Agar und Wasser autoklaviert, bevor Nährsalze/andere Komponenten bei ca. 50°C steril dazugegeben wurden.

Antibiotika: Antibiotika wurden zunächst als Stammlösungen angesetzt. Chloramphenicol, Tetrazyklin und Erythromycin wurden in 70% Ethanol gelöst, während Ampicillin und Kanamycin in Wasser aufgenommen und anschließend sterilfiltriert wurden. Die Antibiotika wurden in folgenden Konzentrationen zur Selektion verwendet:

Antibiotikum Endkonzentration Anwendung Ampicillin 100 mg/l E. coli Chloramphenicol 5 mg/l B. subtilis Erythromycin 2,5 mg/l B. subtilis Kanamycin 5 – 70 mg/l B. subtilis Kanamycin 60 mg/l E. coli Tetrazyklin 10 mg/l B. subtilis

X-Gal: X-Gal wurde als Stammlösung in N,N'-Dimethylformamid angesetzt und dem Medium zur Herstellung von Farbtestplatten in einer Endkonzentration von 40 mg/l zugesetzt.

IPTG: IPTG wurde als 1 M Stammlösung in Millipore H2O angesetzt, sterilfiltriert und dem Medium in einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt.

Zucker: Glukose, Maltose, Trehalose, Saccharose und Cellobiose wurden als 10 bzw. 20%ige Stammlösungen in Millipore H2O angesetzt, sterilfiltriert und dem Medium in einer Endkonzentration von 0,2 - 1% zugesetzt.

3.5 Methoden 3.5.1 Allgemeine Methoden Tab. 3.9: Allgemeine Methoden

Methode Referenz Absorptionsmessung von DNA Lösungen (Ausubel et al., 1987) Bestimmung von β-Galaktosidase Aktivitäten (Miller, 1972) Ethidiumbromidfärbung von DNA (Sambrook et al., 1989) Gelelektrophorese von DNA (Sambrook et al., 1989) Gelelektrophorese von Proteinen (Laemmli, 1970) Herstellung CaCl2 kompetenter Zellen von E. coli (Ausubel et al., 1987) Ligation von DNA Fragmenten (Sambrook et al., 1989) Polymerasekettenreaktion (PCR) (Sambrook et al., 1989) Präzipitation von DNA (Sambrook et al., 1989) Sequenzierung von DNA nach der Kettenabbruchmethode (Sambrook et al., 1989)


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3.5.2 Anzucht von Bakterien

Bakterien wurden im gewünschten Volumen LB-Medium bis zur erforderlichen Zelldichte bei 37°C auf einem Rundschüttler in Reagenzgläsern oder Schikanekolben inkubiert (150 – 200 rpm). Übernachtkulturen (ÜNK) wurden 10 – 16 h wachsen gelassen. 3.5.3 Transformation von E. coli Die kompetenten Zellen wurden auf Eis aufgetaut und anschließend 200 µl mit 100 ng DNA oder einem Ligationsansatz für 60 min auf Eis inkubiert. Nach einer Hitzebehandlung von 3 min bei 42°C wurden die Ansätze für 15 min auf Eis gestellt. Danach wurden sie mit 1 ml LB-Medium versetzt und für eine Stunde bei 37°C geschüttelt. Auf entsprechenden Selektionsplatten wurden von den Transformationsansätzen je 100, 200 µl und der im Rücklauf resuspendierte Rest ausplattiert. 3.5.4 Transformation von B. subtilis 3.5.4.1 Herstellung von natürlich kompetenten Zellen und Transformation 10 ml MNGE-Medium (+ 0,1% CAA) wurden mit einer ÜNK auf eine oD600 von ~ 0,1 eingestellt und bis zu einer oD600 von ~ 1,3 bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Danach wurde der Kultur dasselbe Volumen MNGE-Medium ohne CAA zugegeben und die Zellen für eine weitere Stunde bei 37°C geschüttelt. Die Zellen wurden entweder sofort zur Transformation eingesetzt oder durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 min bei 4°C geerntet. Die Zellpellets wurden mit dem ursprünglichen Medium in 1/8 des Kulturvolumens resuspendiert, auf 10% Glyzerin eingestellt und nach Schockfrosten mit flüssigem Stickstoff bei -70°C gelagert. Zur Transformation von B. subtilis wurden entweder 400 µl frische kompetente Zellen oder folgende Mixtur erwendet:

300 µl aufgetaute kompetente Zellen 1,7 ml 1 x MN 43 µl 20% (w/v) Glukose 34 µl 1M MgSO4

Nach der Zugabe von ca. 1 µg DNA wurden die Ansätze 30 min bei 37°C geschüttelt. Anschließend wurden 100 µl Expressionsmix (250 µl Millipore Wasser, 500 µl 5% (w/v) Hefeextrakt, 250 µl 10% (w/v) CAA, 50 µl 5 mg/ml Tryptophan) zugegeben. Nach weiteren 60 min Inkubation bei 37°C unter Schütteln wurde der Transformationsansatz auf Selektionsplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. 3.5.4.2 Herstellung von elektrokompetenten Zellen und Elektroporation 200 ml LB-Medium (+ Antibiotikum) wurden mit 2 ml einer ÜNK von B. subtilis in LB + AB angeimpft und bei 37°C auf dem Kulturschüttler bis zu einer oD600 von ~ 1,5 wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (4°C, 10 min, 5000 rpm), dreimal mit absteigenden Mengen sterilem Millipore Wasser (4°C) (100 ml; 50 ml; 30 ml) gewaschen und letztlich in 2 ml 30% PEG 8000 resuspendiert. Aliquots wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert. Ca. 500 - 1000 ng Plasmid DNA wurden mit 100 - 400 µl aufgetauten elektrokompetenten Zellen gemischt und in eine auf 4°C vorgekühlte Elektroporationsküvette überführt. Die Zellen wurden mit folgenden Parametern elektroporiert:

Spannung 2,5 kV Kapazität 25 µF Widerstand 200 Ω Pulszeit 3,8 - 4,6 ms


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Die Zellsuspension wurde unmittelbar danach 2 x mit 1 ml SOC-Medium (37°C) aus der Küvette herausgespült und für 90 min bei 37°C geschüttelt. Danach wurde der Transformationsansatz auf Selektionsplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

SOB-Medium 20 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 8,5 mM NaCl, 2 mM KCl SOC-Medium 1 l SOB-Medium, 4 g/l Glukose, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4

3.5.5 Konservierung von B. subtilis Stämmen Um von B. subtilis Stämmen Dauerkulturen anzufertigen, wurden 900 µl einer LB ÜNK mit 100 µl DMSO versetzt, mit flüssigem N2 schockgefroren und bei -70°C gelagert.

3.5.6 Methoden mit Desoxyribonukleinsäuren 3.5.6.1 DNA-modifizierende Enzyme

Enzyme zur Modifizierung von DNA wie z. B. Restriktionsenzyme und Ligase wurden in den von den Herstellern gelieferten Puffersystemen und nach deren Empfehlungen verwendet.

3.5.6.2 Elution von DNA aus Agarosegelen Die Elution von DNA Fragmenten wurde aus 1 - 2%igen (w/v) Agarosegelen mittels NucleoSpin® II Kit oder GFXTM-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die gewünschte DNA Bande wurde mit einem sterilen Skalpell unter möglichst kurzzeitiger UV-Bestrahlung (366 nm) aus dem Gel ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die DNA Elution erfolgte entsprechend der Anleitung des Herstellers. Im letzten Schritt wurde die DNA zweimal mit je 25 - 50 µl TE, pH 8, von der Säule eluiert. Die erhaltenen DNA Fragmente wurden anschließend auf Agarosegelen überprüft.

3.5.6.3 Isolierung von Plasmid DNA Alternativ zu Plasmid Minipräparationen mit dem NucleoSpin Plasmid Kit wurden 2 x 1,5 ml einer 4 ml ÜNK in LB-Medium abzentrifugiert (13000 rpm, 1 min, 4°C) und die sedimentierten Zellen in 300 µl TENS Puffer resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension mit 300 µl S2-Puffer versetzt, 5 min bei RT inkubiert, danach 300 µl S3 Puffer zugegeben und nochmals 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (13000 rpm, 20 min, 4°C) wurde der lösliche Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt, mit 750 µl Isopropanol versetzt und 10 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation (13000 rpm, 30 min, 4°C) wurde die präzipitierte DNA mit 70% Ethanol gewaschen, in der Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in 35 µl TE, pH 8, aufgenommen.

Plasmid DNA aus B. subtilis wurde nach dem gleichen Protokoll der TENS Lyse wie aus E. coli isoliert. Der Zentrifugationsschritt nach dem S3 Puffer wurde verlängert.

3.5.6.4 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis Chromosomale DNA wurde mittels QIAamp® DNA Mini Kit nach Vorschrift der Hersteller isoliert und in 30 bis 200 µl TE Puffer aufgenommen.

3.5.6.5 Sequenzierung von DNA

Grundlage des angewendeten Verfahrens war die Kettenabbruchmethode nach Sanger (Sanger et al., 1977). Als Terminatoren der Sequenzierreaktion dienten unterschiedlich


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fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide, die als vorgefertigtes Reagenz bezogen wurden (Big Dye® Terminator Mix). Die Durchführung der Sequenzierreaktion erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers. Analysiert wurden die Produkte der Sequenzierreaktion mit dem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer.

3.5.6.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) Mit Hilfe einer thermostabilen DNA Polymerase und freien Desoxynukleotiden wird ein DNA Fragment zwischen zwei definierten, an Strang und Gegenstrang hybridisierenden Oligonukleotiden vervielfältigt. Die Reaktionsfolge besteht aus wiederholter, hitzeinduzierter Strangtrennung des DNA Doppelstrangs, Oligonukleotidhybridisierung und der DNA Polymerisierung. In dieser Arbeit wurden die Pwo Polymerase, die Phusion Polymerase und die Vent Polymerase gewählt um DNA Bereiche möglichst fehlerfrei zu amplifizieren. Für PCR Reaktionen, bei denen die Genauigkeit eine untergeordnete Rolle spielte (z. B. PCR Analysen/ PCR Auswahlverfahren) wurde die Taq Polymerase verwendet. Für eine PCR unter Standardbedingungen wurde folgendes Programm verwendet:

1 x 96°C 5 min 96°C (Denaturierung) 30 sec entsprechende Annealingtemperatur 30 sec - 3 min 25-35 x 72°C (Polymerisierung) 7 min

1 x 72°C 10 min

Die Ansätze wurden nach Abschluss des Programms auf 4°C abgekühlt.

Für analytische Zwecke wurde die Taq Polymerase in Form von Ready-To-GoTM PCR Beads nach den Empfehlungen des Herstellers verwendet. Für einen 25 µl Ansatz wurden eingesetzt:

10-100 ng Matrizen DNA 25 pmol jeweiliges 5' bzw. 3'-Oligonukleotid ad 25 µl Millipore H20

Zur Überprüfung von Klonierungen in E. coli bzw. Integrationen in B. subtilis wurde eine PCR Analyse durchgeführt. Anstatt aufgereinigter Matrizen DNA wurde hierbei direkt eine Kolonie von einer Kulturplatte mit einem sterilen Zahnstocher in das Reaktionsgefäß überführt.

3.5.6.7 Ethanol Fällung von DNA Die DNA Lösung wurde auf 0,3 M Natriumacetat (pH 5,2) eingestellt. Danach wurden zwei Volumina eiskalter Ethanol zugegeben und der Ansatz für mindestens 10 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (13000 rpm, 15 min, 4°C) wurde der Überstand abgezogen und verworfen, das Präzipitat mit dem halben Volumen 70%igem Ethanol gewaschen und erneut wie zuvor zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand wiederum abgenommen und verworfen. Die sedimentierte DNA wurde in der Vakuumzentrifuge ca. 15 min getrocknet und im benötigten Puffer aufgenommen.

3.5.6.8 PEG Fällung von DNA Zur Entsalzung von DNA wurde die DNA Lösung mit dem halben Volumen 30%igem PEG 6000 in 1,5 M NaCl versetzt. Der Ansatz wurde mindestens 30 min in Eiswasser oder über Nacht im Kühlschrank inkubiert und anschließend zentrifugiert (13000 rpm, 15 min, 4°C). Nach Abziehen des Überstandes wurde die pelletierte DNA mit dem halben Volumen eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das DNA Pellet für 15 min in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Danach wurde die DNA im benötigten Puffer aufgenommen.


- 34 -

3.5.7 α-Amylase Expressionstests Im α-Amylase Expressionstest wird getestet, ob ein Stamm zur Stärkeverwertung befähigt ist. Das amyE Gen kodiert für die α-Amylase, welche den Stärkeabbau vermittelt. Streicht man einen B. subtilis Stamm auf Stärkeplatten aus, kann nach Inkubation über Nacht bei 37°C die Platte mit Lugolscher Lösung gefärbt werden. Bakterien mit intaktem amyE verwerten Stärke und zeigen daher eindeutige Hofbildung.

3.5.8 β-Galaktosidase Aktivitätstest mittels Agarplatten Im „Blau-Weiß-Screen“ wird getestet, ob in einem bestimmten Stamm das lacZ Gen transkribiert wird. Dieses Gen kodiert für die β-Galaktosidase, welches das Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid) spalten kann, wodurch der blaue Farbkomplex 5-Brom-4-chlor-indigo entsteht. Bakterien, die eine transkriptionelle lacZ Fusion besitzen, bilden auf CSK bzw. LB Platten mit X-Gal blaue Kolonien, sofern das lacZ Gen transkribiert wird. Wird die β-Galaktosidase nicht gebildet, z. B. bei intakter KKR, wachsen die Kolonien auf X-Gal Platten weiß.

3.5.9 Bestimmung der β-Galaktosidase Aktivität Jeweils drei Kolonien der zu untersuchenden B. subtilis Stämme wurden über Nacht in 4 ml LB- bzw. CSK-Medium bei 37°C angezogen. Am folgenden Tag wurden je 4 ml Medium (+/- C-Quellen) mit 50 - 250 µl der ÜNKs beimpft. Die Kulturen wurden bei 37°C bis zur notwendigen oD600 angezogen, danach mindestens 30 min auf Eis gestellt und anschließend die exakte oD600 gemessen. Zur Bestimmung der β-Galaktosidase Aktivität wurden 10 - 100 µl Zellsuspension in 900 - 990 µl Z-Puffer gegeben und die Zellen durch Zugabe von 10 µl Lysozym Lösung (20 min Inkubation bei 28°C) und einem Tropfen Triton X-100 (10 min Inkubation bei 28°C) aufgeschlossen. Die Farbreaktion wurde durch Zufügen von 200 µl ONPG Lösung gestartet und der Ansatz anschließend weiter bei 28°C inkubiert. Sobald eine Gelbfärbung der Lösung zu beobachten war, wurde die Reaktion durch die Zugabe von 500 µl 1 M Na2CO3 Lösung gestoppt, und die Absorption bei 420 nm bzw. 550 nm bestimmt. Die Berechnung der spezifischen Aktivität erfolgte nach Miller, bezogen auf die Zelldichte der jeweils eingesetzten Kultur:

1 U = [(oD420 - 1,75 x oD550) x 1000] / [oD600 x V x t] oD420: Absorption von o-Nitrophenol

oD550: Absorption der Zelltrümmer

oD600: Zelldichte der Kultur

V: Probenvolumen in ml

t: Reaktionsdauer in min

1 x Z-Puffer 60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM β-ME, pH 7

Lysozym Lösung 10 mg/ml in 1 x Z-Puffer ONPG Lösung 4 mg/ml in 1 x Z-Puffer

3.5.10 Immunoblot Um die Expression von CcpA bzw. PrfA zu überprüfen, wurden die Zellen zunächst unter den erforderlichen Bedingungen angezogen und geerntet. Anschließend wurden die Pellets in 500 µl SBT-Puffer resuspendiert und mittels Ultraschallsonde aufgeschlossen. Danach wurden die Proben mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Elektroblot in Transferpuffer in


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der Mini V8-10 Kammer auf eine PVDF Membran über Nacht übertragen (4°C, 110 mA). Zuvor wurde das PAA-Gel 30 min in Transferpuffer gewaschen. Die PVDF Membran wurde gleichzeitig für 15 min mit Methanol und anschließend für 15 min mit Transferpuffer gewaschen. Zum Nachweis der primären Antikörper wurde das ECL+Plus Chemolumineszenz System gewählt. Die Transfermembranen wurden nach dem Blotvorgang bei RT mit je 30 - 50 ml folgender Lösungen behandelt:

3 x 10 min Waschpuffer mindestens 1 h Blockierlösung 1 h anti-CcpA bzw. anti-PrfA 1:10000 in einer 1:1 Mischung aus Blockier-

und Waschlösung 3 x 10 min Waschlösung 1 h anti-Kaninchen-IgG-AP-Konjugat (ECL+PlusTM) 1:10000 in einer 1:1

Mischung aus Blockier- und Wachlösung 3 x 10 min Waschlösung 1 min ECL+Plus-Kit-Lösung (975 µl Reagenz A, 25 µl Reagenz B)

Nach der Inkubation der PVDF Membran mit der ECL+Plus-Kit-Lösung wurde auf die Membranen ein Röntgenfilm aufgelegt und dieser nach unterschiedlicher Belichtungszeit entwickelt.

10 x PBS 0,58 M Na2HPO4, 0,17 M NaH2PO4, 0,68 M NaCl, pH 7,4 Waschpuffer 1 x PBS, 0,1% (v/v) Tween 20 Blockierlösung 0,2% (w/v) I-Block, 1 x PBS, 0,1% (v/v) Tween 20 Waschlösung Blockierlösung : Waschpuffer = 2 : 1 Transferpuffer 10 mM NaHCO3, 3 mM Na2CO3, 20% (v/v) Methanol

3.5.11 Überexpression und Aufreinigung von CcpA, HPr, HPr-Ser46-P 3.5.11.1 Anzucht von Bakterien und Überexpression Für die Überexpression von HPr bzw. CcpA-His6 wurde mindestens 1 l LB 1:100 mit der entsprechenden ÜNK von E. coli bzw. B. megaterium beimpft und bei 37°C auf einem Rundschüttler bis zum Erreichen einer oD600 von 0,4 - 0,6 inkubiert. Die Induktion der Überexpression erfolgte durch die Zugabe von 1 mM IPTG (pET3c: T7 Promotor) bzw. 0,5% Xylose (pWH1520: PxylA), gefolgt von weiterer vierstündiger Inkubation bei 37°C. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet. 3.5.11.2 Zellauschluss mittels Ultraschall Die entsprechenden Zellpellets wurden im benötigten Puffer (HisA, PufferA) aufgenommen und resuspendiert. Die Ultraschallstöße wurden auf ein Intervall von 9/10 s mit 1/10s Pausen eingestellt. Abhängig vom Probenvolumen wurden Dauer und Intensität der Behandlung variiert. 3.5.11.3 Präparation von HPr-Kinaseextrakt E. coli DH5α/p4813 wurde in 100 ml LB bis zu einer oD600 von 2,0 - 2,5 angezogen und anschließend durch Zentrifugation (5000 rpm, 5 min, 4°C) geerntet. Danach wurde das Pellet mit 40 ml DTT Waschpuffer gewaschen, zentrifugiert und in 10 ml DTT Zellauschlusspuffer


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resuspendiert. Nach dem Zellauschluss mittels Ultraschallsonde wurde das Lysat aliquotiert und in 10% Glyzerin bei -20°C aufbewahrt. 3.5.11.4 Phosphorylierung von HPr Die Phosphorylierung von HPr am Ser46 erfolgte direkt vor dem Anionenaustausch. Die Phosphorylierungsreaktion wurde für 20 min bei 37°C unter Verwendung des folgenden Ansatzes durchgeführt:

5 mM ATP 10 mM FBP 1,4 ml Kinase Extrakt 1 x R-Mix (1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 20 mM Tris/HCl, pH 7,5) ad 32 ml HPr Zelllysat

3.5.11.5 Aufreinigung von HPr bzw. HPr-Ser46-P

Zur Aufreinigung von HPr bzw. HPr-Ser46-P wurde HPr mittels E. coli FT1/pLysS/pWH466 gemäß Abschnitt 3.5.11.1 überexprimiert. Ein Zellpellet aus 1 l Überexpressionskultur wurde in 25 ml Puffer A resuspendiert und mittels Ultraschallsonde aufgeschlossen. Nach Abtrennung der unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation (2000 rpm, 1 h, 4°C) erfolgte eine Vorreinigung durch Hitzedenaturierung (70°C, 20 min). Denaturiertes Protein wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Zur Aufreinigung von HPr-Ser46-P erfolgte die Phosphorylierung unter Verwendung eines HPr Kinasextraktes (Abschnitt 3.5.11.4). Das Lysat bzw. der Phosphorylierungsansatz wurde anschließend auf eine mit Puffer A äquilibrierte 10 ml Sepharose QFF aufgetragen und zunächst mit 100 ml Puffer A gespült. Anschließend erfolgte die Elution durch einen linearen Gradienten (0% - 30% Puffer B, 350 ml), gefolgt von einer Stoßelution (100% Puffer B, 20 ml). Entsprechend reine Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, vereinigt und mittels Druckfiltration eingeengt. Anschließend folgte eine Größenausschlusschromatographie (Superdex G75) in HBSE Puffer. Entsprechend reine Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, vereinigt und durch Filtron Konzentratoren eingeengt. HPr bzw. HPr-Ser46-P wurden in HBSE Puffer bei 4°C gelagert.

3.5.11.6 Aufreinigung von CcpA His6-tag Zur Aufreinigung von CcpA His6-tag wurde CcpA mittels E. coli FT1/pLysS/pWH653 oder B. megaterium WH419/pWH1543 gemäß Abschnitt 3.5.11.1 überexprimiert. Ein Zellpellet aus 1 l Überexpressionskultur wurde in 25 ml HisA resuspendiert und auf 0,5 mM PMSF (Zugabe von Lysozym bei B. megaterium) eingestellt. Nach dem Zellaufschluss mittels Ultraschallsonde wurde das Lysat nach der Zugabe von 10 µg/ml DNaseI und 5 µg/ml RNaseA für 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Lysat durch Zentrifugation (20000 rpm, 1 h, 4°C) von unlöslichen Zellbestandteilen befreit und auf eine mit Ni2+

beladene und mit HisA äquilibrierte 11 ml Poros MC20-Säule einer BioCad Vision Workstation aufgetragen. Nach dem Spülen der Säule (200 ml HisA) erfolgte die Elution mit einem linearen Gradienten (0% - 100% HisB, 50 ml) gefolgt von einer Stoßelution (100% HisB, 30 ml). Reine Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und einer Größenaus-schlusschromatographie unterzogen. Hierfür wurden bis zu 7,5 ml des eingeengten Proteins auf eine mit HBSE äquilibrierte Superdex G200 Säule aufgetragen. Reine Fraktionen wurden mittels SDS PAGE identifiziert, vereinigt und durch Filtron Konzentratoren eingeengt. CcpA His-tag wurde in HBSE Puffer (+ 50% Glyzerin) bei -20°C aufbewahrt.


- 37 -

3.6 Verwendete Internetangebote und Computerprogramme Für die Durchführung und Erstellung dieser Arbeit wurden die in den Tabellen 3.10 und 3.11 aufgelisteten Internetangebote und Computerprogramme genutzt. Unerwähnt bleiben die zahlreichen Internetangebote oder Fachzeitschriften. Tab. 3.10: Internetangebote URL Anbieter Anwendung

http://genolist.pasteur.fr/SubtiList Institut Pasteur, Paris Sequenzrecherche im Genom von

B. subtilis

http://genolist.pasteur.fr/ListiList Institut Pasteur, Paris Sequenzrecherche im Genom von

L. monocytogenes

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ National Institutes of

Health, USA Literaturrecherche

Tab. 3.11: Software Programm Hersteller Anwendung

Adobe Acrobat 6.0 Pro Adobe Systems Inc., USA Erstellung von PDF Dokumenten

Adobe Photoshop 9.0 Adobe Systems Inc., USA Bildbearbeitung

Adobe ImageReady 9.0 Adobe Systems Inc., USA Bildbearbeitung

Clone Manager 5.1 Scientific & Educational

Software, USA

Planung von

Klonierungsstrategien

Endnote 8.0 Niles Software Inc., USA Literaturrecherche/verwaltung

Microsoft Office XP Microsoft Inc., USA Text- und Datenverarbeitung

Plasmid Map Enhancer 3 Scientific & Educational

Software, USA Erstellen von Plasmidkarten

PyMolTM 2006 DeLano Scientific LLC 3D Strukturanalyse, Filme SeqMan II 4.00 DNASTAR Inc., USA Auswerten von Sequenzierdaten

Sigmaplot 8.00 – 9.00 SPSS Inc., USA Auswerten und graphische

Darstellung von Daten

ERGEBNISSE

- 38 -

4. Ergebnisse

4.1 in vivo Charakterisierung von CcpA Mutanten in Bacillus subtilis

In dieser Arbeit sollten die Effekte von Punktmutationen in funktional unterschiedlichen

Domänen von CcpA, wie Koeffektor Erkennung, DNA Bindung und Dimerisierung, auf die

Regulation von verschiedenen Bacillus subtilis Promotoren untersucht werden.

Für die Charakterisierung der Repression durch CcpA dienten der xynP (Galinier et al.,

1999) und der gntR Promotor (Miwa et al., 1997) (vgl. Anhang, Abb. 7.1), welche sich

sowohl in der Anzahl und Position der cre Elemente relativ zum Transkriptionsstart als auch

in der Expressionsstärke unterscheiden. PxynP besitzt eine cre Sequenz in der nicht

kodierenden Region, welche an einer Position von der Konsensus cre (Miwa et al., 2000)

abweicht. Im Gegensatz dazu weist PgntR zwei cre Motive auf, welche beide für die

vollständige KKR des Operons vorhanden sein müssen (Miwa et al., 1997). Sowohl die ptsH

unabhängige gntR creup als auch die ptsH abhängige gntR credown befinden sich in der nicht

kodierenden Region und entsprechen nicht dem Konsensus Motiv (Miwa et al., 1997).

Für die Charakterisierung von CcpA Mutanten bezüglich der mechanistisch unbekannten

Aktivierung durch CcpA wurden der ackA (Grundy et al., 1994) und der alsS Promotor

(Renna et al., 1993) ausgewählt (vgl. Anhang, Abb. 7.1). PackA zeichnet sich durch zwei

stromaufwärts lokalisierte cre Elemente aus und steht unter direktem Einfluss von CcpA.

Während die ackA cre2 dem Motiv der Konsensus cre (Miwa et al., 2000) entspricht, weicht

die ackA cre1 vom Konsensus Motiv ab (Grundy et al., 1994). Eine direkte Beteiligung der

ackA cre2 an der CcpA vermittelten Aktivierung von ackA wurde bereits gezeigt, während die

ackA cre1 nicht essentiell ist (Turinsky et al., 1998). Im Gegensatz dazu weist PalsS keine cre

Sequenz auf und ist für die indirekte Aktivierung durch CcpA von Bedeutung. Das alsSD

Operon steht unter Kontrolle des Transkriptionsaktivators AlsR, welcher durch das zu alsSD

divergent angeordnete alsR Gen kodiert wird und nicht unter direktem Einfluss von CcpA

steht (Renna et al., 1993).

Zu Beginn dieser Arbeit waren die Kristallstrukturen von CcpA mit HPr-Ser46-P bzw. Crh-

Ser46-P und cre noch nicht gelöst. Deshalb wurden parziell vorhandene CcpA Mutanten aus

unterschiedlichen Domänen ausgewählt (Abb. 4.1). Die Aminosäuren sind in der DNA

Bindedomäne (+1W, I4, M17), in der Scharnierhelix (R54), in der Dimerisierungsebene der

N-terminalen Subdomäne (N93) und im Effektorbindespalt für niedermolekulare Effektoren

(D276) lokalisiert. Weitere Punktmutationen befinden sich in der N-terminalen Subdomäne

(I128, V149), in der HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P Binderegion (M89, Y90; α-Helix IX:

A300, V301, A302, M303, R304, L305, L306, T307, K308, I309, M310; N311, K312, K313,

V315) und in der C-terminalen Subdomäne (E327, K330, K333).

ERGEBNISSE

- 39 -

HPr-Ser46-P HPr-Ser46-P CcpA Kernprotein

DNA Bindedomäne

cre DNA

Scharnierhelices

C-terminaleSubdomäne

N-terminaleSubdomäne

HTH Motiv

HPr-Ser46-P HPr-Ser46-P CcpA Kernprotein

DNA Bindedomäne

cre DNA

Scharnierhelices

C-terminaleSubdomäne

N-terminaleSubdomäne

HTH Motiv

Y90T307

R304

S46P

K308

αI

αIXHPr

CcpA

CB

T62

T62‘

R54‘R54

α4‘

α4

Y90T307

R304

S46P

K308

αI

αIXHPr

CcpA

Y90T307

R304

S46P

K308

αI

αIXHPr

CcpA

Y90T307

R304

S46P

K308

αI

αIXHPr

CcpA

CB

T62

T62‘

R54‘R54

α4‘

α4

T62

T62‘

R54‘R54

α4‘

α4

Abb. 4.1: Struktur des HPr-Ser46-P-CcpA-cre Komplexes und Darstellung ausgewählter Aminosäuren A: Struktur des HPr-Ser46-P-CcpA-cre Komplexes aus B. megaterium (Schumacher et al., 2004). Ein CcpA Monomer ist in dunkelgrau dargestellt, die beiden HPr-Ser46-P Moleküle in türkis und grün und die cre DNA in hellgrau. Die Subdomänen des zweiten CcpA Monomers sind hervorgehoben (DNA Bindedomäne: gelb; N-terminale Subdomäne: blau; C-terminale Subdomäne: rot). B: Asymmetrie des Aminosäurerests R54 (Scharnierhelix). R54 (rot) des CcpA Monomers 1 bildet einen Kontakt zur cre Sequenz (gelb), aber nicht zur allosterischen Position T62 (hellblau) des gleichen Monomers. R54’ (rot) des CcpA Monomers 2 interagiert mit T62’ (hellblau) des gleichen Monomers, aber nicht mit der cre DNA. C: Beteiligung der CcpA Aminosäurenreste Y90, R304 und K308 eines CcpA Monomers an der HPr-Ser46-P Bindung. HPr ist in grün dargestellt, CcpA αI in blau und CcpA αIX in hellgrau. HPr-Ser46-P (gelb) bildet direkte Kontakte (grüne unterbrochene Linien) zu den Seitenketten von K308 (rot) und R304 (hellblau). Die Seitenkette von Y90 bildet eine Wasserstoffbrücke zu R304.

A

ERGEBNISSE

- 40 -

4.1.1 in vivo Expressionssystem zur Charakterisierung von CcpA Mutanten

Für die in vivo Charakterisierung von CcpA Varianten wurden ccpA Deletionsmutanten mit

unterschiedlichen transkriptionellen lacZ Fusionen mit episomal kodierten CcpA Mutanten

komplementiert.

Alle Reporterstämme wurden bereits in meiner Diplomarbeit konstruiert und verifiziert. Die

ccpA Deletionsmutanten WH479 (gntR’::’lacZ), WH483 (ackA’::’lacZ) und WH487

(alsS’::’lacZ) wurden als Kontrolle entweder mit pHT304 oder pWH1541 (Diel, 2005)

transformiert. Der Vektor pWH1541 kodiert für CcpA mit WT-Sequenz, an dessen C-

Terminus über einen Linker das Hexahistidinanhängsel fusioniert ist. Dabei steht ccpA unter

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

cre ackA‘ ‘lacZxynP‘cre ‘lacZ

alsS‘ ‘lacZ

Bacillus subtilis

ChromosomccpAmut

bla

ermori 1030

pWH1541-mut

ori pBR

aphA3

ChromosomPccpA

amyE‘ ‘amyE

PackA, PalsS, PgntR, PxynP

cat

ytxDaroA

‘lacZ

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

cre ackA‘ ‘lacZxynP‘cre ‘lacZ

alsS‘ ‘lacZ

Bacillus subtilis

ChromosomccpAmut

bla

ermori 1030

pWH1541-mut

ori pBR

aphA3

ChromosomPccpA

amyE‘ ‘amyE

PackA, PalsS, PgntR, PxynP

cat

ytxDaroA

‘lacZ

Abb. 4.2: in vivo Expressionssystem zur Charakterisierung von CcpA Mutanten Die xynP’::’lacZ, gntR’::’lacZ, ackA’::’lacZ und alsS’::’lacZ Fusionen liegen als singuläre Kopien im amyE-Lokus des B. subtilis Chromosoms vor. ccpA wurde gegen aphA3 substituiert und steht unter PccpA Kontrolle. Die ccpA Deletionsmutanten wurden mit episomal kodierten CcpA Mutanten (pWH1541-mut) komplementiert. amyE: Gen für α-Amylase; cat: Gen für Chloramphenicolacetyltransferase; cre: catabolite responsive element; xynP: Gen für H+-Symporter; gntR: Gen für Glukonatrepressor; ackA: Gen für Acetatkinase; alsS: Gen für α-Acetolaktatsynthase; lacZ: Gen für β-Galaktosidase; aroA, ytxD: homologe Sequenzen für Integration; aphA3: Gen für Kanamycinresistenz; ori1030: Replikationsursprung für B. subtilis; oripBR: Replikationsursprung für E. coli; erm: Gen für Erythromycinresistenz; bla: Gen für β-Laktamase;

ERGEBNISSE

- 41 -

Kontrolle des eigenen Promotors. Des Weiteren wurden die Indikatorstämme mit pWH1541-

mut Derivaten (Diel, 2005; Seidel, 2005) bzw. pWH144-mut Derivaten transformiert, welche

für die ausgewählten CcpA Mutanten kodieren (Abb. 4.2). Die Anwesenheit aller Plasmide

wurde mittels PCR Analyse überprüft, wofür die Oligonukleotide pUP19 und pRev19

eingesetzt wurden, welche flankierend zu ccpA hybridisieren.

4.1.2 in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten

Mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen wurde die Regulation von gntR, ackA bzw. alsS

durch verschiedene CcpA Mutanten überprüft. Die Ergebnisse wurden mit den Daten

bezüglich der KKR der xynP’::’lacZ Fusion durch jene CcpA Varianten verglichen (Diel, 2005;

Seidel, 2005)1. Hierbei ergaben sich sechs Gruppen von CcpA Mutanten mit

unterschiedlichen Phänotypen.

• Die erste Gruppe beinhaltet CcpA Mutanten, die nicht mehr dazu befähigt sind xynP,

gntR, ackA und alsS zu regulieren. Hierzu zählen die CcpA Varianten A300W, A302W,

L306W und K308W.

• Die CcpA Mutanten Y90W und M303W gehören zur zweiten Gruppe und weisen

Glukose unabhängige Regulation von xynP auf, aber vollkommene Glukose abhängige

Aktivierung von ackA.

• Die dritte Gruppe schließt die CcpA Varianten D276A und T307W ein, durch welche es

zu Glukose unabhängiger Regulation von xynP und ackA kommt.

• CcpA Mutanten der vierten Gruppe zeigen Glukose abhängige Aktivierung von ackA,

aber keine KKR von xynP, gntR und alsS. Dazu gehören die CcpA Varianten R54W,

V301W und R304W.

• Zur fünften Gruppe zählen die CcpA Mutanten +1W, I4W, M17R, M89W und N93W,

welche Regulation von xynP, ackA und alsS wie der WT zeigen, aber keine KKR von

gntR.

• Zur sechsten Gruppe gehören CcpA Varianten, welche den Phänotyp des Wildtyps

aufweisen, wie I128W, V149W, L305W, I309W, M310W, N311W, K312W, E313W,

V315W, E327R, K330E und K333E.

Alle sechs Gruppen werden in den nachfolgenden Kapiteln erläutert.

1 Die Werte an xynP’::’lacZ sind zu Vergleichszwecken aufgeführt. Die meisten Mutanten wurden von M. Diel (2005) an xynP vermessen. CcpA M17R, R54W und D276A wurden von G. Seidel (2005) an xynP’::’lacZ charakterisiert.

ERGEBNISSE

- 42 -

4.1.2.1 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR, ackA und alsS

Die Aminosäuren A300, A302, L306 und K308 sind in der CcpA spezifisch konservierten α-

Helix IX von CcpA lokalisiert, welche direkte Kontakte zu HPr-Ser46-P und Crh-Ser46-P in

den entsprechenden Kristallstrukturen zeigt (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al.,

2006). Während A300 an hydrophoben Kontakten zu den HPr-Ser46-P Resten I47, M48 und

M51 beteiligt ist, sind die Seitenketten von A302 und L306 in das Proteininnere gerichtet. Der

Aminosäurerest K308 bildet eine Wasserstoffbrücke zu einem Sauerstoffatom der

Phosphorylgruppe von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P (vgl. Abb. 4.1C).

Mittels β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen wurde die Repression von gntR durch die CcpA

Mutanten A300W, A302W, L306W und K308W überprüft. Die Ergebnisse sind in Abb. 4.3

dargestellt. Das gnt Operon steht unter Kontrolle des Glukonatrepressors (GntR), wobei

Glukonat als Induktor die Dissoziation von GntR vom Operator bewirkt. Die hier

charakterisierten Stämme tragen eine gntR43L Mutation, was den Verlust der

Operatorbindung von GntR zur Folge hat (Miwa et al., 1997). Alle Stämme wurden in LB-

Medium ohne zusätzliche C-Quellen, mit Glukonat und unter katabolitreprimierten

Bedingungen in Anwesenheit von Glukonat und Glukose angezogen. Wie erwartet, gab es

keine signifikanten Unterschiede in β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen zwischen

Stämmen, welche mit und ohne Glukonat gewachsen waren. Deshalb sind in allen Graphen,

welche Messungen von Stämmen mit der gntR’::’lacZ Fusion repräsentieren, die Werte ohne

Glukonat zugunsten der Übersicht nicht aufgeführt. Durch die CcpA Mutanten A300W,

L306W und K308W zeigt sich wie bei der ccpA Deletionsmutante WH479 (± pHT304) keine

Glukoserepression von gntR. Auch die CcpA Variante A302W ist nicht mehr dazu befähigt

gntR zu regulieren, wobei sie zusätzlich nur noch 50% der WT β-Galaktosidase Aktivität im

induzierten Zustand aufweist.

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

Abb. 4.3: Derepression von gntR durch die CcpA Mutanten A300W, A302W, L306W und K308W Die β-Gal Aktivitäten an gntR’::’lacZ sind in % angegeben. WH479/pHT304 wurde in Anwesen-heit von Glukonat gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardab-weichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht der gntR’::’lacZ Fusion dar. Die Stämme wurden unter zwei unterschied-lichen Wuchsbedingungen angezogen (mit Glukonat: schwarze Balken; mit Glukonat und Glukose: gestreifte Balken). YF283: WT; WH479: ΔccpA Mutante; pWH1541: WH479/pWH1541 (WT ccpA); pHT304: WH479/ pHT304 (- ccpA)

ERGEBNISSE

- 43 -

Folglich sind die Aminosäuren A300, A302, L306 und K308 nicht nur für die Glukose

abhängige Repression von xynP (Diel, 2005), sondern auch für die von gntR von immenser

Bedeutung.

Da sich die Glukose abhängige Aktivierung von ackA in der Stationärphase am deutlichsten

zeigt (Abb. 4.4), wurden alle Charakterisierungen von CcpA Mutanten an der ackA’::’lacZ

Fusion nach 480 min in der Stationärphase durchgeführt.

T1 T2 T3 T4

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Zeit [min]

0 60 120

180

240

300

360

420

480

540

600

oD [6

00 n

m]

0,1

1

101,2 x 2,3 x 4,2 x 17 x

T1 T2 T3 T4

1ackA‘ ‘lacZcre

2

T1 T2 T3 T4

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Zeit [min]

0 60 120

180

240

300

360

420

480

540

600

oD [6

00 n

m]

0,1

1

101,2 x 2,3 x 4,2 x 17 x

T1 T2 T3 T4

1ackA‘ ‘lacZcre

2

Abb. 4.4: Zusammenhang zwischen ackA Expression und Wachstumsphase Die obere Abbildung repräsentiert schematisch die ackA’::’lacZ Fusion von WH482 (WT). Der linke Graph zeigt das Wuchsverhalten von WH482 in LB-Medium mit (weiße Dreiecke) und ohne Glukose (schwarze Kreise). Die optische Dichte (oD) bei 600 nm wurde gegen die Zeit in min aufgetragen. Der rechte Graph zeigt die β-Gal Aktivitäten von WH482 unter zwei verschiedenen Wuchsbedingungen (schwarze Balken: ohne Glukose; gestreifte Balken: mit Glukose). Die β-Gal Aktivitäten in Miller Units wurden an vier definierten Zeitpunkten (T1, T2, T3, T4) bestimmt. Jeder Wert repräsentiert den reproduzierten Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Der Aktivierungsfaktor während des Wachstums in glukosehaltigem LB-Medium ist über dem Graph angegeben. β-Galaktosidase Aktivitäten von Stämmen, welche die alsS’::’lacZ Fusion tragen, wurden

ebenfalls in der Stationärphase ermittelt.

Die CcpA Mutanten A300W, A302W, L306W und K308W wurden bezüglich der Aktivierung

von ackA und alsS charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Abb. 4.5 dargestellt. Die Varianten

A300W und A302W weisen bezüglich der Aktivierung der ackA’::’lacZ Fusion den Phänotyp

der ccpA Deletionsmutante WH483 (± pHT304) auf. In Anwesenheit von Glukose zeigt sich

an der ackA’::’lacZ Fusion nur noch 25% der WT Aktivität durch die Mutationen L306W und

ERGEBNISSE

- 44 -

K308W. Alle vier CcpA Mutanten sind wie die ccpA Deletionsmutante WH487 (± pHT304) zu

keiner Glukose abhängigen Aktivierung der alsS’::’lacZ Fusion befähigt.

Folglich spielen die Aminosäurenreste A300, A302, L306 und K308 für die KKR von xynP

(Diel, 2005), gntR, ackA und alsS eine wichtige Rolle. Alle Aminosäuren befinden sich zwar

in der HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P Binderegion, sind aber nicht in den allosterischen

Schaltmechanismus verwickelt.

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

ackA‘ ‘lacZcre

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

ackA‘ ‘lacZcre

WH486

WH487

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

01

20406080

100

alsS‘ ‘lacZ

WH486

WH487

pWH1541

pHT304

A300W

A302W

L306W

K308W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

01

20406080

100

alsS‘ ‘lacZ

Abb. 4.5: Deaktivierung von ackA und alsS durch die CcpA Mutanten A300W, A302W, L306W und K308W Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben, wobei die Zellen entweder mit (gestreifte Balken) oder ohne Glukose (schwarze Balken) angezogen wurden. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht des jeweiligen Indikatorgens dar. Der linke Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an ackA’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH483/pWH1541 wurde mit Glukose gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. Der rechte Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an alsS’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH486/pWH1541 wurde mit Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. WH482: WT; WH483: ΔccpA; pWH1541 (linker Graph): WH483/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (linker Graph): WH483/pHT304 (- ccpA); WH486: WT; WH487: ΔccpA; pWH1541 (rechter Graph): WH487/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (rechter Graph): WH487/pHT304 (- ccpA)

4.1.2.2 CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger Regulation Y90 und M303 beeinflussen Aminosäuren in der Korepressor Binderegion, welche am

allosterischen Schaltmechanismus beteiligt sind. Y90 bildet eine Wasserstoffbrücke zu R304,

wodurch die Interaktion von R304 mit HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P unterstützt wird

(Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Die Seitenkette von M303 befindet sich

in unmittelbarer Nähe zur Schlüsselposition T62, welche die Ausbildung der Scharnierhelices

und anschließende cre Erkennung nach der HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P Bindung

ermöglicht. Die Aminosäure D276 ist in der Bindetasche für niedermolekulare Effektoren

ERGEBNISSE

- 45 -

lokalisiert (Schumacher et al., 2007) (Abb. 2.6). T307 bildet in der DNA ungebundenen

Konformation eine Wasserstoffbrücke zu Y92, welche aber durch die Interaktion von CcpA

mit HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P verloren geht (Schumacher et al., 2004; Schumacher et

al., 2006) (Abb. 2.5).

Mittels β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen wurde das Regulationsmuster von gntR,

ackA und alsS durch die CcpA Varianten Y90W, D276A, M303W und T307W überprüft. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 4.1 und 4.2 zusammengefasst. Dies zeigt, dass zwei Gruppen

von CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger Regulation existieren.

Die CcpA Varianten Y90W und M303W der ersten Gruppe weisen Glukose unabhängige

Regulation von xynP (Diel, 2005), aber vollständige Glukose abhängige Aktivierung von

ackA auf. Daher müssen xynP und ackA mittels unterschiedlicher Mechanismen reguliert

werden. Ein deutlicher Unterschied besteht in der Regulation von alsS. Während Y90W alsS

Glukose abhängig aktiviert, kommt es durch M303W zu keiner Expression der alsS’::’lacZ

Fusion. Das deutet auf unterschiedliche Regulationsmechanismen von ackA und alsS hin.

Y90W zeigt neben eingeschränkter KKR von gntR eine auf 57% verringerte β-Galaktosidase

Aktivität im induzierten Zustand. Durch M303W kommt es zum Verlust der KKR von gntR.

Folglich weisen die regulatorischen Aktivitäten von Y90W und M303W darauf hin, dass sich

der allosterische Schaltmechanismus bei diesen Mutanten unterscheidet. Tab. 4.1: CcpA Mutanten mit eingeschränkter KKR von gntR

gntR’::’lacZ

β-Gal Aktivität [%] a

Genotyp + Gnt + Gnt / + Glk Repressionsfaktor b

YF283 (WT) 96 ± 10 8,4 ± 0,4 11 WH479 (∆ccpA) 100 ± 17 98 ± 19 1,0 WH479/pWH1541 95 ± 5 14 ± 1 6,8 WH479/pHT304 100 ± 16 96 ± 6 1,0 Y90W 57 ± 4 36 ± 2 1,6 D276A c 44 ± 1 16 ± 2 2,8 M303W 86 ± 1 76 ± 4 1,1 T307W 98 ± 5 26 ± 2 3,8 Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. WH479/pHT304 wurde in Anwesenheit von Glukonat (Gnt) gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. b Repressionsfakoren geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität unter induzierten und katabolitreprimierten Bedingungen an. c CcpA D276A wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und dient dem Vergleich. pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

ERGEBNISSE

- 46 -

Durch die Varianten D276A und T307W der anderen Gruppe kommt es zu Glukose

unabhängiger Regulation von xynP und ackA. Somit konnten diese als erste Varianten mit

Glukose unabhängiger Aktivierung von ackA identifiziert werden, wobei dieser Effekt für

T307W geringfügig stärker ausgeprägt ist als für D276A. Allerdings zeigen diese CcpA

Mutanten Glukose abhängige Aktivierung der alsS’::’lacZ Fusion. Das bedeutet, dass alsS

und ackA durch verschiedene Mechanismen aktiviert werden. Durch D276A und T307W ist

die KKR von gntR vermindert, wobei D276A zusätzlich nur noch 44% β-Galaktosidase

Aktivität unter induzierten Bedingungen aufweist.

Eine Verbindung zwischen diesen Mutationen könnte der HPr-Ser46-P spezifische Effekt der

niedermolekularen Effektoren Glukose-6-P (G6P) und Fruktose-1,6-Bisphosphat (FBP) sein.

Tab. 4.2: CcpA Mutanten mit unterschiedlichen Aktivitäten

ackA’::’lacZ

alsS’::’lacZ

β-Gal Aktivität [%] a β-Gal Aktivität [%] c

Genotyp - Glk + Glk Af b - Glk + Glk Af b

WT 4,7 ± 0,4 96 ± 3 20 0,11 ± 0,04 100 ± 7 910 ∆ccpA 1,03 ± 0,04 7,1 ± 0,6 6,9 0,11 ± 0,02 0,31 ± 0,03 2,8 ∆ccpA/pWH1541 7,7 ± 0,8 100 ± 7 13 0,21 ± 0,01 100 ± 5 480 ∆ccpA/pHT304 1,3 ± 0,1 7,8 ± 0,1 6.0 0,065 ± 0,002 0,42 ± 0,03 6,5 Y90W 8,5 ± 1,4 77 ± 8 9,1 0,19 ± 0,01 100 ± 3 530 D276A d 18 ± 2 100 ± 1 5,6 0,17 ± 0,02 99 ± 6 580 M303W 6,5 ± 0,7 69 ± 1 11 0,201 ± 0,003 3,0 ± 0,2 15 T307W 33 ± 3 86 ± 5 2,6 0,21 ± 0,02 96 ± 2 460 Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose (Glk) gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. b Aktivierungsfaktoren (Af) geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität in An- und Abwesenheit von Glukose an. c Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. d CcpA D276A wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und dient dem Vergleich. WT: WH482 (ackA’::lacZ), WH486 (alsS’::’lacZ) ΔccpA: WH483 (ackA’::’lacZ), WH487 (alsS’::’lacZ) pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

4.1.2.3 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR und alsS, aber

Aktivierung von ackA Der Aminosäurerest R54 ist in der Scharnierhelix lokalisiert, welche nur in der DNA

bindenden Konformation ausgebildet ist (Schumacher et al., 2004). Die Seitenkette von R54

des einen CcpA Monomers bildet eine Wasserstoffbrücke zur cre Sequenz, aber nicht zu

ERGEBNISSE

- 47 -

T62 (Abb. 4.1B). Allerdings besteht zwischen der Seitenkette von R54’ des anderen CcpA

Monomers und T62, welche eine Schlüsselposition im allosterischen Schaltmechanismus

(Abb. 2.5) spielt, ein direkter Kontakt, aber nicht zur DNA. Neben dieser strukturellen

Asymmetrie von R54 deutet der Kontakt zwischen T62 und R54 auf eine Beteiligung an der

Orientierung der DNA Bindedomänen und im allosterischen Schaltmechanismus hin. Der

Aminosäurerest V301 befindet sich in α-Helix IX, welcher R304 durch Kontakte zum

Rückgrad stabilisiert. R304 bildet zwei Wasserstoffbrücken zu zwei Sauerstoffatomen der

Phosphorylgruppe von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P (Abb. 4.1C). Die Rotation der R304

Seitenkette ist während der Korepressorbindung essentiell für den allosterischen

Schaltmechanismus. Dadurch wird die Position von Y90 so verändert, dass die anderen in

die lokalen Strukturveränderungen verwickelten Aminosäurenreste Y92, T307 und T62 in die

DNA bindende Konformation gelangen (Schumacher et al., 2004).

Anhand von β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen wurden die CcpA Mutanten R54W,

V301W und R304W bezüglich der Repression von gntR charakterisiert. Die Resultate sind in

Abb. 4.6 dargestellt. Alle CcpA Varianten zeigen keine (R54W, V301W) oder eingeschränkte

(R304W) KKR von gntR. Deshalb sind die Aminosäurenreste R54, V301 und R304 für die

KKR von xynP (Diel, 2005; Seidel, 2005) und gntR von Bedeutung.

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

Abb. 4.6: Derepression von gntR durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W Die β-Gal Aktivitäten an gntR’::’lacZ sind in % angegeben. WH479/pHT304 wurde in Anwesen-heit von Glukonat gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardab-weichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht der gntR’::’lacZ Fusion dar. Die Stämme wurden unter zwei unterschied-lichen Wuchsbedingungen angezogen (mit Glukonat: schwarze Balken; mit Glukonat und Glukose: gestreifte Balken). CcpA R54W wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und ist zu Vergleichszwecken aufgeführt. YF283: WT; WH479: ΔccpA Mutante; pWH1541: WH479/pWH1541 (WT ccpA); pHT304: WH479/ pHT304 (- ccpA)

Um zu überprüfen, ob diese Mutationen auch die direkte und indirekte Aktivierung von ackA

und alsS beeinflussen, wurden β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen durchgeführt. Die

Ergebnisse sind in Abb. 4.7 dargestellt. In Anwesenheit von Glukose kommt es durch alle

Mutanten zu WT ähnlicher Aktivierung der ackA’::’lacZ Fusion. Im Gegensatz dazu sind die

CcpA Varianten R54W, V301W und R304W nicht mehr in der Lage alsS zu regulieren.

ERGEBNISSE

- 48 -

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

ackA‘ ‘lacZcre

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

ackA‘ ‘lacZcre

WH486

WH487

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20406080

100120

alsS‘ ‘lacZ

WH486

WH487

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20406080

100120

alsS‘ ‘lacZ

Abb. 4.7: Differenzielle Regulation von ackA und alsS durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben, wobei die Zellen entweder mit (gestreifte Balken) oder ohne Glukose (schwarze Balken) angezogen wurden. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht des jeweiligen Indikatorgens dar. Der linke Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an ackA’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH483/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. Der rechte Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an alsS’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH486/pWH1541 wurde mit Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. CcpA R54W wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und dient dem Vergleich. WH482: WT; WH483: ΔccpA; pWH1541 (linker Graph): WH483/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (linker Graph): WH483/pHT304 (- ccpA); WH486: WT; WH487: ΔccpA; pWH1541 (rechter Graph): WH487/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (rechter Graph): WH487/pHT304 (- ccpA)

Folglich zeigen die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W differenzielle Regulation.

Damit ist eindeutig demonstriert, dass diese CcpA kontrollierten Gene mittels

unterschiedlicher Mechanismen reguliert werden, da CcpA Mutanten existieren, welche

zwischen diesen diskriminieren. Dieser Phänotyp konnte nur bei Austauschen von

Aminosäuren in der Scharnierhelix (R54) und der Korepressor Bindedomäne (V301, R304)

von CcpA festgestellt werden, welche am allosterischen Schaltmechanismus beteiligt sind.

Deshalb sind strukturelle Veränderungen durch die R304-HPr-Ser46-P bzw. R304-Crh-

Ser46-P Interaktion für die Regulation von xynP, gntR und alsS wichtiger als für die von

ackA. Außerdem scheint die Aktivierung von ackA generell nicht vom allosterischen

Schaltmechanismus abhängig zu sein.

4.1.2.4 CcpA Mutanten mit eingeschränkter KKR von gntR Die Aminosäure I4 befindet sich im N-Terminus von CcpA vor α-Helix 1, während M17 Teil

der α-Helix 2 des Helix-Turn-Helix Motivs ist und einen Kontakt zur cre Sequenz bildet. Die

Aminosäure M89 ist in α-Helix I der N-terminalen Subdomäne des CcpA Kernproteins

ERGEBNISSE

- 49 -

lokalisiert. Deshalb befindet sich M89 in unmittelbarer Nähe zur allosterischen Position Y90,

ist aber selbst nicht in diese strukturellen Veränderungen involviert. N93 ist in der

Dimerisierungsebene der N-terminalen Subdomäne, nahe I94 und L96, lokalisiert. Letztere

wirken an der HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P induzierten β-Faltblatt Verschiebung der N-

terminalen Subdomänen mit, die letztendlich zur Stabilisierung der Dimerisierung von CcpA

führt (Schumacher et al., 2004).

Zunächst wurden die Auswirkungen der Aminosäurenaustausche +1W2, I4W, M17R, M89W

und N93W auf die Repression von gntR in vivo analysiert (Abb. 4.8). Die CcpA Varianten

+1W und I4W zeigen wie die ccpA Deletionsmutante keine KKR von gntR. CcpA M17R und

M89W sind nur noch zu eingeschränkter KKR von gntR befähigt, während es durch die CcpA

Mutante N93W zum Verlust der KKR von gntR kommt, wobei lediglich 40% der β-

Galaktosidase Aktivität im induzierten Zustand erreicht werden. Da diese Mutanten KKR von

xynP wie der WT zeigen (Diel, 2005; Seidel, 2005), sind dies die ersten Mutanten mit einer

Diskriminierung von xynP und gntR.

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

YF283

WH479

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

020406080

100120

gntR‘

cre

‘lacZ

cre

Abb. 4.8: Derepression oder eingeschränkte KKR von gntR durch die CcpA Mutanten +1W, I4W, M17R, M89W und N93W Die β-Gal Aktivitäten an der gntR’::’lacZ Fusion sind in % angegeben. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht der gntR’::’lacZ Fusion dar. WH479/pHT304 wurde in An-wesenheit von Glukonat gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. Dabei wurden die Stämme unter zwei unterschiedlichen Wuchsbedingungen angezogen (mit Glukonat: schwarze Balken; mit Glukonat und Glukose: gestreifte Balken). CcpA M17R wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und dient dem Vergleich. YF283: WT; WH479: ΔccpA Mutante; pWH1541: WH479/pWH1541 (WT ccpA); pHT304: WH479/ pHT304 (- ccpA)

Daraufhin wurde untersucht, ob durch diese CcpA Mutanten auch die Aktivierung von ackA

und alsS beeinflusst wird. Die Resultate sind in Abb. 4.9 dargestellt. Durch die CcpA

Varianten +1W, I4W und M17R kommt es zu Glukose abhängiger Aktivierung der

ackA’::’lacZ Fusion. CcpA M89W und N93W zeigen mit fast 80% β-Galaktosidase Aktivität in

Anwesenheit von Glukose nahezu vollständige Aktivierung von ackA. Auch an der

alsS’::’lacZ Fusion weisen diese CcpA Mutanten den Phänotyp des Wildtyps auf, mit

2 Die CcpA Variante +1W trägt einen zusätzlichen Tryptophanrest am N-Terminus von CcpA.

ERGEBNISSE

- 50 -

Ausnahme der Mutation M17R. Diese Variante zeigt mit 55% β-Galaktosidase Aktivität in

Anwesenheit von Glukose eine leicht eingeschränkte Aktivierung der alsS’::’lacZ Fusion.

Folglich wurden CcpA Mutanten gefunden, welche eine spezifische KKR Defizienz von gntR

aufweisen. Diesen Phänotyp zeigen lediglich Mutanten, deren Aminosäuren-Austausche in

der DNA Bindedomäne (+1, I4, M17) und in der N-terminalen Subdomäne (M89, N93) von

CcpA lokalisiert sind. Alle CcpA Varianten, deren Mutationen sich in α-Helix IX der HPr-

Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P Binderegion befinden, weisen keine Diskriminierung zwischen

gntR und xynP auf.

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

ackA‘ ‘lacZcre

WH482

WH483

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

ackA‘ ‘lacZcre

WH48

6

WH487

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

01

20406080

100120

alsS‘ ‘lacZ

WH486

WH487

pWH1541

pHT304

+1W I4WM17

RM89

WN93

W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

01

20406080

100120

alsS‘ ‘lacZ

Abb. 4.9: Aktivierung von ackA und alsS durch die CcpA Mutanten +1W, I4W, M17R, M89W und N93W Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben, wobei die Zellen entweder mit (gestreifte Balken) oder ohne Glukose (schwarze Balken) angezogen wurden. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die obere Abbildung stellt eine schematische Übersicht des jeweiligen Indikatorgens dar. Der linke Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an ackA’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH483/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. Der rechte Graph zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten an alsS’::’lacZ. Die β-Gal Aktivität von WH486/pWH1541 wurde mit Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. CcpA M17R wurde in meiner Diplomarbeit vermessen und dient dem Vergleich. WH482: WT; WH483: ΔccpA; pWH1541 (linker Graph): WH483/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (linker Graph): WH483/pHT304 (- ccpA); WH486: WT; WH487: ΔccpA; pWH1541 (rechter Graph): WH487/pWH1541 (WT ccpA); pHT304 (rechter Graph): WH487/pHT304 (- ccpA)

4.1.3 Expression von CcpA Mutanten im Vergleich zu Wildtyp CcpA

Um die Expression episomal kodierter CcpA Mutanten im Vergleich zum WT zu analysieren,

wurden Immunoblots gemäß Abschnitt 3.5.10 durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit

polyklonalen Antikörpern aus B. megaterium (Küster et al., 1996). Als Kontrollen wurden

aufgereinigtes CcpA mit His6-tag, der Wildtypstamm WH482, die ccpA Deletionsmutante

WH483 und WH483/pWH1541 (WT CcpA) mitgeführt. Die Aufreinigung von CcpA mit His6-

tag wurde mit Hilfe des Stammes B. megaterium WH419/pWH1543 gemäß Abschnitt

ERGEBNISSE

- 51 -

3.5.11.6 durchgeführt. Der Immunoblot in Abb. 4.10 zeigt, dass alle episomal kodierten CcpA

Mutanten keine gravierenden Expressionsunterschiede im Vergleich zu plasmidständig

kodiertem WT CcpA aufweisen. Im Gegensatz dazu wird chromosomal kodiertes WT CcpA

auf geringerem Niveau exprimiert. Deshalb können differenzielle Effekte in β-Galaktosidase

Aktivitätsbestimmungen nicht auf unterschiedliche Proteinmengen der CcpA Mutanten

zurückgeführt werden, sondern sind Eigenschaften der Mutantenproteine.

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

+1W

I4W

M17

R

M89

W

Y90W

N93

W

D27

6A

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

A30

0W

A30

2W

M30

3W

L306

W

T307

W

K30

8W

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

pHT3

04

R54

W

V30

1W

R30

4W

Ccp

A

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

+1W

I4W

M17

R

M89

W

Y90W

N93

W

D27

6A

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

+1W

I4W

M17

R

M89

W

Y90W

N93

W

D27

6A

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

+1W

I4W

M17

R

M89

W

Y90W

N93

W

D27

6A

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

A30

0W

A30

2W

M30

3W

L306

W

T307

W

K30

8W

Ccp

A

WT

∆ccp

A

pWH

1541

pHT3

04

R54

W

V30

1W

R30

4W

Ccp

A

Abb. 4.10: Expression von CcpA Mutanten im Vergleich zu Wildtyp CcpA Immunoblots von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt von verschiedenen B. subtilis Stämmen. Die verwendeten Stämme sind über den Spuren angegeben. WT: Wildtyp (WH482) CcpA: 100 ng aufgereinigtes CcpA mit His6-tag ∆ccpA: ccpA Deletionsmutante (WH483) pWH1541: WH483/ pWH1541 (WT ccpA) pHT304: WH483/ pHT304 (- ccpA)

4.1.4 CcpA Mutanten mit dem Phänotyp des Wildtyps

Die Aminosäuren I128 und V149 befinden sich in der N-terminalen Subdomäne zwischen β-

Faltblatt B und α-Helix III (I128) und zwischen β-Faltblatt D und Helix IV (V149). Im

Gegensatz dazu liegen L305, I309 und M310 in α-Helix IX, welche die Hauptrolle in der HPr-

Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P Interaktion spielt. N311, K312, K313 und V315 sind zwischen α-

Helix IX und β-Faltblatt K lokalisiert.

Die Auswirkungen der Aminosäuren Austausche gegen Tryptophan wurden in vivo

analysiert. Die Ergebnisse sind in Tab. 4.3 und 4.4 zusammengefasst. Die CcpA Mutanten

I128W, V149W, L305W, I309W, M310W, N311W, K312W und V315W zeigen Regulation der

gntR’, ackA’ und alsS’::’lacZ Fusion wie der WT. Effiziente KKR von xynP durch diese CcpA

Varianten wurde ebenfalls festgestellt (Diel, 2005).

Eine Beteiligung dieser solvensexponierten Gruppen an der Interaktion mit HPr-Ser46-P

bzw. Crh-Ser46-P kann somit ausgeschlossen werden.

ERGEBNISSE

- 52 -

Tab. 4.3: in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten mit KKR von gntR

gntR’::’lacZ β-Gal Aktivität [%] a

Genotyp + Gnt + Gnt / + Glk Repressionsfaktor b

YF283 (WT) 96 ± 10 8,4 ± 0,4 11 WH479 (∆ccpA) 100 ± 17 98 ± 19 1,0 WH479/pWH1541 95 ± 5 14 ± 1 6,8 WH479/pHT304 100 ± 16 96 ± 6 1,0 I128W 97 ± 3 15 ± 2 6,5 V149W 92 ± 5 9,2 ± 0,1 10 L305W 93 ± 6 20 ± 2 4,7 I309W 89 ± 7 12 ± 2 7,4 M310W 91 ± 4 13 ± 2 7,0 N311W 99 ± 3 8,2 ± 1,1 12 K312W 92 ± 1 7,4 ± 0,9 12 E313W 93 ± 9 15 ± 2 6,2 V315W 98 ± 7 14 ± 2 7,0 Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. WH479/pHT304 wurde in Anwesenheit von Glukonat (Gnt) gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. b Repressionsfaktoren geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität unter induzierten und katabolitreprimierten Bedingungen an. pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

Tab. 4.4: in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten mit Aktivierung von ackA und alsS

ackA’::’lacZ alsS’::’lacZ β-Gal Aktivität [%] a β-Gal Aktivität [%] c


WT 4,7 ± 0,4 96 ± 3 20 0,11 ± 0,04 100 ± 7 910 ∆ccpA 1,03 ± 0,04 7,1 ± 0,6 6,9 0,11 ± 0,02 0,31 ± 0,03 2,8 ∆ccpA/pWH1541 7,7 ± 0,8 100 ± 7 13 0,21 ± 0,01 100 ± 5 480 ∆ccpA/pHT304 1,3 ± 0,1 7,8 ± 0,1 6,0 0,065 ± 0,002 0,42 ± 0,03 6,5 I128W 9,7 ± 0,8 89 ± 2 9,2 0,23 ± 0,02 105 ± 6 460 V149W 9,34 ± 0,02 66 ± 5 7,1 0,255 ± 0,003 104 ± 7 410 L305W 7,9 ± 0,9 96 ± 4 12 0,19 ± 0,03 104 ± 10 550 I309W 8,7 ± 1,0 106 ± 6 12 0,18 ± 0,01 80 ± 6 440 M310W 9,4 ± 0,8 94 ± 3 10 0,22 ± 0,03 95 ± 4 430 N311W 12 ± 1 97 ± 8 8,1 0,47 ± 0,05 110 ± 10 230 K312W 9,3 ± 0,9 92 ± 8 9,9 0,31 ± 0,01 93 ± 5 300 E313W 10 ± 1 101 ± 8 10 0,41 ± 0,01 89 ± 5 220 V315W 11 ± 1 100 ± 7 9,1 0,417 ± 0,004 104 ± 3 250

Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose (Glk) gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. b Aktivierungsfaktoren (Af) geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität mit und ohne Glukose an. c Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH1541 wurde in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. WT: WH482 (ackA’::lacZ), WH486 (alsS’::’lacZ); ΔccpA: WH483 (ackA’::’lacZ), WH487 (alsS’::’lacZ) pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

ERGEBNISSE

- 53 -

4.1.5 Möglichkeit der Heterooligomerisierung von CcpA-HPr-Ser46-P-cre

Der Lac Repressor (LacI) kann als Tetramer simultan an zwei distal gelegene Operatoren

binden, was die Schleifenbildung des dazwischen liegenden DNA Abschnitts induziert (Lewis

et al., 1996; Semsey et al., 2002). In B. subtilis existieren Promotoren, welche zwei cre

Elemente in geeigneter Distanz besitzen. Daher könnte die Möglichkeit bestehen, dass der

Komplex aus HPr-Ser46-P-CcpA-cre mit einem äquivalenten Komplex interagiert, was eine

Schleifenbildung der DNA aufgrund von kooperativer cre Bindung zur Folge haben könnte.

Kristallstrukturanalysen lieferten erste Hinweise, dass es zur Heterooligomerisierung über die

Dimerisierung von zwei HPr-Ser46-P Molekülen kommen könnte (Abb. 4.11).

Zu dessen Überprüfung wurden Aminosäuren Austausche an den vermuteten Positionen

(E327, K330, K333) im C-Terminus von CcpA eingeführt. Anschließend sollte der Einfluss

dieser Mutationen auf die Regulation von durch CcpA kontrollierten Genen mit Varianz in der

Anzahl der cre Elemente analysiert werden. Dafür wurden zunächst die CcpA Mutanten

K333

K333

CcpA

CcpA

HPr

HPr

330

K333

K333

CcpA

CcpA

HPr

HPr

K333

K333

K333

K333

K333K333

K333

CcpA

CcpA

HPr

HPr

330

4.11: Struktur des potenziellen cre-CcpA-(HPr-Ser46-P)-(HPr-Ser46-P)-CcpA-cre Looping Komplexes A: Ribbon Diagramm von zwei HPr-Ser46-P-CcpA Komplexen gebunden an zwei cre Sequenzen, welche über einen modellierte DNA Schleife (grau) miteinander verbunden sind. Die cre DNA ist in gelb gezeigt, die HPr-Ser46-P Moleküle in dunkelblau und türkis und die CcpA Monomere in grün und rot. B: Vergrößerung der Abb. A. Die Farben der Untereinheiten wurden von Abb. A übernommen. Die Seitenketten der Aminosäuren (B. subtilis), welche Kontakte bei der Protein-Protein Interaktion vermitteln, sind angezeigt. Die Abb. wurde freundlicherweise von Dr. M. A. Schumacher zur Verfügung gestellt, wurde aber modifiziert.

A B

ERGEBNISSE

- 54 -

E327R, K330E und K333E, die Doppelmutanten E327R/K330E, E327R/K333E und

K330E/K333E sowie die Dreifachmutante E327R/K330E/K333E konstruiert. Die

Klonierungsstrategie ist in Abb. 4.12 dargestellt. Durch den Primer am C-Terminus wurden

neben der Mutation zwei Stoppkodons und eine NotI Schnittstelle eingeführt. Die beiden

Stoppkodons sollten dafür sorgen, dass alle CcpA Mutanten ohne Hexahistidinanhängsel

exprimiert werden, um eine potenzielle sterische Behinderung der Heterooligomerisierung zu

vermeiden. Anschließend wurden alle PCR Fragmente mittels NotI und PstI in den Vektor

pWH144 kloniert. Die Nukleotidsequenz von Gen und Promotor wurde mittels

Sequenzierung bestätigt. Die entstandenen Plasmide wurden pWH144-E327R, pWH144-

K330E, pWH144-K333E, pWH144-E327R/K330E, pWH144-E327R/K333E, pWH144-

K330E/K333E und pWH144-E327R/K330E/K333E genannt.

Abb. 4.12: Konstruktion von pWH144-mut A Die Austausche K330E, K333E und K330E/K333E wurden über einstufige PCR eingeführt, wobei chromosomale DNA (B. subtilis 168) als Matrize diente. Dabei führte der Primer am C-Terminus von CcpA zwei Stoppkodons (SS), eine NotI Schnittstelle und die Mutation(en) ein. Der zweite Primer hybridisierte an der PstI Schnittstelle, welche in ccpA singulär vorhanden ist. B Die Austausche CcpA E327R, E327R/K330E, E327R/K333E und E327R/K330E/K333E wurden über zweistufige PCR eingeführt, wobei chromosomale DNA (B. subtilis 168) als Templat diente. In der ersten Stufe führte der Primer den Austausch E327R ein. Der zweite Primer hybridisierte an der PstI Schnittstelle. In der zweiten PCR wurden das erste PCR Fragment und der Mutageneseprimer eingesetzt, welcher neben der Mutation K330E und/oder K333E zwei Stoppkodons und die NotI Schnittestelle einführte. C Die PCR Fragmente wurden über PstI/NotI in pWH144 kloniert, woraus pWH144-mut resultierte. lacZ: Gen für β-Galaktosidase; oripBR322: Replikationsursprung für E. coli; ori1030: Replikationsursprung für B. subtilis; erm: Gen für Erythromycinresistenz; bla: Gen für β-Laktamase; si: 1000 bp aus pWH1520 zur Stabilisierung von pWH144

SS

NotI PstIccpA

pWH144

BamHI

XbaI

SphI

lacZ‘ hisccpA

si

ori pBR322 bla

erm

ori 1030

NotI PstI

C

pWH144 - mut

lacZ‘ his ccpA

ori pBR322 bla

erm

ori 1030

NotI PstI

si

NotI

SS

PstI ccpA

A PstIccpA

SS

NotI PstIccpA

1. PCR

2. PCR

B

PstI/NotI

ERGEBNISSE

- 55 -

Anschließend wurden alle ccpA Deletionsmutanten mit pWH144 und den jeweiligen

pWH144-mut Derivaten transformiert. Die Anwesenheit der Plasmide wurde mittels PCR

Analyse unter Verwendung der Oligonukleotide pUP19 und pRev19 überprüft. Da WT CcpA,

welches von pWH144 kodiert wird auf geringerem Niveau exprimiert wird als WT CcpA,

welches von pWH1541 kodiert wird (Seidel, 2005), wurde für die folgenden Messungen

pWH144 als Kontrolle für episomal kodiertes WT CcpA mitgeführt. Sodann wurden die

Auswirkungen der Mutationen auf die Regulation von xynP, gntR, ackA und alsS in vivo

analysiert. Stämme, welche die xynP’::’lacZ Fusion tragen, wurden für β-Galaktosidase

Aktivitätsbestimmungen in CSK-Minimalmedium ohne C-Quellen, mit Xylose zur Induktion

oder unter katabolitreprimierten Bedingungen in Anwesenheit von Xylose und Glukose

angezogen (Galinier et al., 1999). Die in vivo Aktivitäten sind in Tab. 4.5 und 4.6

zusammengefasst. Tab. 4.5: in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten mit KKR von xynP und gntR

xynP’::’lacZ gntR’::’lacZ β-Gal Aktivität [%] a β-Gal Aktivität [%] c

Genotyp + Xyl + Xyl / + Glk Rf b + Gnt + Gnt / + Glk Rf b

WT 44 ± 1 0,10 ± 0,10 440 96 ± 10 8,4 ± 0,4 11 ∆ccpA 95 ± 5 83 ± 6 1,1 100 ± 17 98 ± 19 1,0 ∆ccpA/pHT304 100 ± 2 85 ± 4 1,2 100 ± 16 96 ± 6 1,0 ∆ccpA/pWH144 51 ± 5 0,89 ± 0,02 57 99 ± 5 9,2 ± 0,6 11 E327R 55 ± 1 0,70 ± 0,02 79 89 ± 4 14 ± 3 6,4 K330E 47 ± 5 0,91 ± 0,08 52 94 ± 5 16 ± 1 5,9 K333E 50 ± 3 0,82 ± 0,14 61 93 ± 9 13 ± 2 7,2 E327R/K330E 57 ± 5 0,64 ± 0,03 89 88 ± 5 12 ± 1 7,3 E327R/K333E 66 ± 1 1,4 ± 0,2 47 91 ± 4 17 ± 2 5,4 E327R/K330E/ K333E 63 ± 3 0,70 ± 0,12 90 90 ± 2 15 ± 2 6,0

K330E/K333E 56 ± 2 0,73 ± 0,09 77 95 ± 11 16 ± 2 5,9

Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pHT304 wurde in Anwesenheit von Xylose (Xyl) gleich 100% (1200 Miller Units) gesetzt. b Repressionsfaktoren (Rf) geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität unter induzierten und katabolitreprimierten Bedingungen an. c Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. WH479/pHT304 wurde in Anwesenheit von Glukonat (Gnt) gleich 100% (100 Miller Units) gesetzt. WT: QB7144 (xynP’::lacZ), YF283 (gntR’::’lacZ); ΔccpA: WH490 (xynP’::’lacZ), WH479 (gntR’::’lacZ); pWH144: WT ccpA; pHT304: - ccpA

Hierbei zeigt sich durch die CcpA Mutanten E327R, K330E, K333E, E327R/K330E,

E327R/K333E, K330E/K333E und E327R/K330E/K333E eine Regulation von xynP, gntR,

ackA und alsS wie durch WT CcpA. Folglich kann davon ausgegangen werden, dass

Dimerisierung über zwei HPr-Ser46-P Moleküle und daraus resultierende Hetero-

oligomerisierung über die Positionen E327, K330, K333 wahrscheinlich nicht erfolgt.

ERGEBNISSE

- 56 -

Tab. 4.6: in vivo Aktivitäten von CcpA Mutanten mit Aktivierung von ackA und alsS

ackA’::’lacZ alsS’::’lacZ β-Gal Aktivität [%] a β-Gal Aktivität [%] c


WT 4,7 ± 0,4 96 ± 3 20 0,11 ± 0,04 100 ± 7 910 ∆ccpA 1,03 ± 0,04 7,1 ± 0,6 6,9 0,11 ± 0,02 0,31 ± 0,03 2,8 ∆ccpA/pHT304 1,3 ± 0,1 7,8 ± 0,1 6,0 0,065 ± 0,002 0,42 ± 0,03 6,5 ∆ccpA/pWH144 9,5 ± 0,4 100 ± 7 11 0,201 ± 0,009 100 ± 7 500 E327R 9,2 ± 0,4 110 ± 1 12 0,108 ± 0,006 103 ± 3 950 K330E 9,14 ± 0,08 104 ± 4 11 0,41 ± 0,06 93 ± 6 230 K333E 10,1 ± 0,4 105 ± 7 10 0,35 ± 0,01 93 ± 1 270 E327R/K330E 10,4 ± 0,8 102 ± 1 10 0,111 ± 0,007 108 ± 3 970 E327R/K333E 7,6 ± 0,7 85 ± 6 11 0,11 ± 0,01 85 ± 6 770 E327R/K330E/ K333E 10,8 ± 0,3 90 ± 8 8,3 0,121 ± 0,002 107 ± 6 880

K330E/K333E 7,6 ± 0,7 92 ± 5 12 0,133 ± 0,003 103 ± 3 770 Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden reproduziert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. a Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH144 wurde in Anwesenheit von Glukose (Glk) gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. b Aktivierungsfaktoren (Af) geben das Verhältnis der β-Gal Aktivität mit und ohne Glukose an. c Die β-Gal Aktivitäten wurden normiert. ∆ccpA/pWH144 wurde in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (3300 Miller Units) gesetzt. WT: WH482 (ackA’::lacZ); WH486 (alsS’::’lacZ); ΔccpA: WH483 (ackA’::’lacZ); WH487 (alsS’::’lacZ); pWH144: WT ccpA; pHT304: - ccpA

4.1.6 Zusammenhang zwischen cre Elementen und differenzieller Regulation

Ein Vergleich der xynP cre zur Konsensus cre (Miwa et al., 2000) ergab eine Abweichung an

einer Position, während die ackA cre2 dem Konsensus Motiv entspricht. Allerdings

unterscheiden sich die xynP cre und die ackA cre2 an vier Positionen. Ein Vergleich der zwei

cre Elemente zur Konsensus cre ist in Abb. 4.13 gezeigt.

T

T

W WCNNWNGCNAANGTKonsensus cre (Miwa et al., 2000)

ACTATTGCGAATGTackA cre2

ATTTTCGCGAAAGTxynP cre T

T

W WCNNWNGCNAANGTKonsensus cre (Miwa et al., 2000)

ACTATTGCGAATGTackA cre2

ATTTTCGCGAAAGTxynP cre Abb. 4.13: Vergleich der Konsensus cre zur ackA cre2 und xynP cre Die Abbildung zeigt die Konsensus cre (Miwa et al., 2000) im Vergleich zur ackA cre2 und xynP cre. Die Abweichung der xynP cre von der Konsensus cre ist in grau gestreift hervorgehoben. Die Unterschiede zwischen der ackA cre2 und der xynP cre sind grau markiert. W: A oder T; N: A, C, G oder T

ERGEBNISSE

- 57 -

Daher stellte sich die Frage, ob differenzielle Regulation die Folge unterschiedlicher DNA

Bindung aufgrund von variablen cre Sequenzen ist. Deshalb wurden zwei neue

Reporterstämme konstruiert. Während der erste Stamm die xynP’::’lacZ Fusion mit der ackA

cre2 anstelle der xynP cre trägt, enthält der zweite Stamm die ackA’::’lacZ Fusion mit der

xynP cre anstelle der ackA cre2. Anschließend sollte der Einfluss auf die Regulation dieser

Promotoren durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W bestimmt werden. Alle

drei CcpA Varianten zeigen mit Glukose abhängiger Aktivierung von ackA und dem Verlust

zur KKR von xynP, differenzielle Regulation (Abschnitt 4.1.2.3). Des Weiteren sollte geklärt

werden, ob dies sowohl die Aktivierung als auch die Repression durch WT CcpA und

ausgewählte CcpA Varianten beeinflusst.

4.1.6.1 Austausch der ackA cre2 gegen die xynP cre im ackA Promotor

Das ackA Promotorfragment mit der xynP cre anstelle der ackA cre2 wurde mittels

zweistufiger PCR Mutagenese hergestellt. Für die erste Stufe wurden die Oligonukleotide

MS-ackAmutxynP und ackABam verwendet, wobei pWH334 (ackA’::’lacZ) als Matrize diente.

Dabei führte der Mutageneseprimer MS-ackAmutxynP die Basenpaarsubstitutionen in die

ackA cre2 ein, sodass daraus die xynP cre resultierte. In der zweiten Stufe wurden das

Produkt der ersten PCR und das Oligonukleotid ackA1+2 verwendet, wobei pWH334 als

Matrizen DNA diente. Die Primer ackA1+2 und ackABam führten die für die Klonierung

benötigten Restriktionsendonuklease Schnittstellen BamHI und EcoRI ein, über die das

Promotorfragment stromaufwärts von lacZ in den Integrationsvektor pAC6 kloniert wurde.

Dieses Plasmid enthält einen Replikationsursprung für E. coli sowie ein Ampicillinresistenz-

gen zur Selektion in diesem Organismus. Weiterhin sind auf pAC6 ein promotorloses lacZ

Gen und eine Chloramphenicolresistenzkassette zur Selektion in B. subtilis kodiert, welche

von Fragmenten des amyE Gens aus B. subtilis flankiert werden (Abb. 4.14). Die korrekte

Nukleotidsequenz vom Promotor wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das resultierende

Plasmid bekam den Namen pWH556 (ackA(xynP cre)’::’lacZ).

Nach der Linearisierung von pWH556 mit der Restriktionsendonuklease ScaI wurden der WT

B. subtilis 168 und die ccpA Deletionsmutante WH479 transformiert, wodurch die ackA(xynP

cre)’::’lacZ Fusion und die Chloramphenicolresistenzkassette über doppelt homologe

Rekombination in den amyE-Lokus dieser Stämme integriert wurden. Das Rekombinations-

ereignis wurde durch Selektion auf Chloramphenicol, α-Amylaseinaktivitätstests,

genomischer PCR Analyse und Sequenzierung überprüft. Die Stämme wurden WH592 (WT;

ackA(xynP cre)’::’lacZ) und WH593 (∆ccpA; ackA(xynP cre)’::’lacZ) genannt (Abb. 4.15).

ERGEBNISSE

- 58 -

‘amyEcatamyE‘1

xynP cre

- 35 - 10

ackA‘ ‘lacZ

cre

PackA

‘amyEcatamyE‘1

xynP cre

- 35 - 10

ackA‘ ‘lacZ

cre

PackA

Abb. 4.15: Genetische Situation der amyE-Loki von WH592 und WH593 (schematisch) Nach der Integration von pWH556 über doppelt homologe Rekombination in das B. subtilis Chromosom, liegen die Chloramphenicolresistenzkassette und die ackA’(xynP cre)’::’lacZ Fusion im amyE-Lokus vor. In PackA wurden die ackA cre1 (weiße mit „1“ gekennzeichnete Box) und die -10 und -35 Regionen (quergestreifte Boxen) erhalten, während die ackA cre2 gegen die xynP cre (längsgestreifte Box mit schwarzem Stern) ausgetauscht wurde. cat: Gen für Chloramphenicolacetyltransferase; amyE: Gen für α-Amylase; ackA: Gen für Acetatkinase; lacZ: Gen für β-Galaktosidase

WH593 wurde mit pHT304, pWH1541 und mit den pWH1541-mut Derivaten, welche für die

CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W kodieren, transformiert. Die Anwesenheit der

bla

pWH556

BamHI EcoRI

bla

’amyE

lacZ cat

ori pBR322

pAC6

BamHI EcoRI

’amyE

lacZ

cat

ori pBR322

amyE’

amyE’

BamHI/EcoRI

1.PCR

2.PCR

Abb. 4.14: Konstruktion von pWH556 Das ackA Promotorfragment mit der xynP cre anstelle der ackA cre2 wurde über zweistufige PCR Mutagenese hergestellt. Das PCR Fragment und der Vektor pAC6 wurden mit BamHI und EcoRI restringiert und anschließend ligiert. bla: Gen für β-Laktamase (E. coli) cat: Gen für Chloramphenicolacetyl-transferase (B. subtilis) lacZ: Gen für β-Galaktosidase ori pBR322: Replikationsursprung für E. coli amyE: Gen für α-Amylase

cre2 -35 -10

PackA

2

cre1 cre2 -35 -10

PackA

BamHI

EcoRI

BamHI

PackA

ERGEBNISSE

- 59 -

Plasmide wurde mittels PCR Analyse unter Verwendung der Oligonukleotide pUP19 und

pRev19 überprüft. Mittels anschließender β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen (Abb.

4.16) wurde die Aktivierung der ackA’ bzw. der ackA(xynP cre)’::’lacZ Fusion durch WT CcpA

und CcpA Mutanten verglichen. WH592 (ackA(xynP cre)’::’lacZ), welcher chromosomal

kodiertes WT CcpA exprimiert, und WH593 (ackA(xynP cre)’::’lacZ)/pWH1541, welcher CcpA

episomal kodiert, zeigen ähnliche β-Galaktosidase Aktivitäten. Letztere weisen auch im

Vergleich zu den Wildtypstämmen WH482 (ackA’::’lacZ) und WH483/pWH1541 keine

signifikanten Unterschiede auf. Deshalb ist die Effizienz der Aktivierung von ackA durch WT

CcpA nicht durch die Unterschiede zwischen der xynP cre und der ackA cre2 vermindert.

Allerdings weisen die drei CcpA Varianten nur noch 51% (R54W), 45% (V301W) und 57%

(R304W) der WT Aktivität an ackA(xynP cre)’::’lacZ in Anwesenheit von Glukose auf.

Folglich wird die Aktivierung durch die drei CcpA Mutanten durch den Austausch der ackA

cre2 gegen die xynP cre vermindert. Das zeigt, dass Punktmutationen in ccpA die

Aktivierung von ackA über die Erkennung der ackA cre2 beeinflussen.

WH482

WH483

pWH1541

-

pHT304-

R54W-

V301W

-

R304W

-

WH592

WH593

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

120

ackA‘ ‘lacZ

cre1

xynP creackA‘ ‘lacZ

2cre

1

WH483 WH593

WH482

WH483

pWH1541

-

pHT304-

R54W-

V301W

-

R304W

-

WH592

WH593

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

120

ackA‘ ‘lacZ

cre1

xynP creackA‘ ‘lacZ

2cre

1

WH483WH483 WH593WH593 Abb. 4.16: Verminderung der Aktivierung der ackA(xynP cre)’::’lacZ Fusion durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W Die Abb. zeigt die Aktivitäten der CcpA Mutanten unter zwei verschiedenen Wuchsbedingungen (ohne Glukose: schwarze Balken; mit Glukose: gestreifte Balken). Die reproduzierten β-Gal Aktivitäten der entsprechenden Stämme sind in % angegeben. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die linke Seite des Graphs zeigt die β-Gal Aktivitäten an ackA’::’lacZ, während die rechte Seite die β-Gal Aktivitäten an ackA(xynP cre)’::’lacZ darstellt. Über jeder Seite des Graphs ist eine schematische Übersicht des jeweiligen Indikatorgens wiedergegeben. WH483/pWH1541 bzw. WH593/pWH1541 wurden in Anwesenheit von Glukose gleich 100% (850 Miller Units) gesetzt. WT: WH482, WH592; ΔccpA: WH483, WH593; pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

ERGEBNISSE

- 60 -

4.1.6.2 Austausch der xynP cre gegen die ackA cre2 im xynP Promotor

Da der Austausch der ackA cre2 gegen die xynP cre im ackA Promotor bereits die

Aktivierung durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W beeinflusst hat, wurde

zunächst bestimmt, ob der Austausch der xynP cre gegen die ackA cre2 im xynP Promotor

die Repression von xynP durch die CcpA Mutanten parziell wiederherstellt.

Das xynP Promotorfragment wurde mittels PCR mit Hilfe der Oligonukleotide MS-xynPEco-

fwd und MS-xynPBam-rev amplifiziert und über die Schnittstellen BamHI und EcoRI in den

Vektor pAC6 kloniert (vgl. Abb. 4.14). Das Plasmid bekam den Namen pWH518

(xynP’::’lacZ). Die Klonierung erfolgte angelehnt an die Konstruktion von pRC21

(xynP’::’lacZ), welches für die Herstellung von QB7144 (xynP’::’lacZ) benötigt wurde (Galinier

et al., 1999). Für den Austausch der xynP cre gegen die ackA cre2 im xynP Promotor wurde

das entsprechende Fragment mittels zweistufiger PCR Mutagenese amplifiziert. Für die erste

Stufe wurden die Oligonukleotide MS-xynPBam-rev and MS-xynPmutackAcre2-fwd

verwendet, wobei pWH518 als Templat diente. Die zweite Stufe der PCR wurde mit dem

PCR Fragment der ersten Stufe und dem Primer MS-xynPEco-fwd durchgeführt, wobei

pWH518 als DNA Matrize fungierte. Das resultierende Amplifikat wurde über EcoRI und

BamHI in pAC6 kloniert, wodurch das Plasmid pWH557 (xynP(ackA cre2)’::’lacZ) entstand.

Nach der Linearisierung von pWH557 (xynP(ackA cre2)’::’lacZ) mit der Restriktions-

endonuklease ScaI wurden der WT B. subtilis 168 und die ccpA Deletionsmutante WH479

transformiert. Dadurch wurden die xynP(ackA cre2)’::’lacZ Fusion und die Chloramphenicol-

resistenzkassette über doppelt homologe Rekombination in den amyE-Lokus von B. subtilis

168 und WH479 integriert. Das Rekombinationsereignis wurde durch Selektion auf

Chloramphenicol, α-Amylaseinaktivitätstests, genomischer PCR Analyse und Sequenzierung

überprüft. Die Stämme wurden WH594 (WT; xynP(ackA cre2)’::’lacZ) und WH595 (∆ccpA;

xynP(ackA cre2)’::’lacZ) genannt (Abb. 4.17).

‘amyEcatamyE‘

ackA cre2

- 35 - 10

xynP‘ ‘lacZ

cre

PxynP

‘amyEcatamyE‘

ackA cre2

- 35 - 10

xynP‘ ‘lacZ

cre

PxynP

Abb. 4.17: Genetische Situation der amyE-Loki von WH594 und WH595 (schematisch) Nach der Integration von pWH557 über doppelt homologe Rekombination in das B. subtilis Chromosom, liegen die Chloramphenicolresistenzkassette und die xynP’(ackA cre2)’::’lacZ Fusion im amyE-Lokus vor. In PxynP wurden die -10 und -35 Regionen (quergestreifte Boxen) erhalten, während die xynP cre gegen die ackA cre2 (längsgestreifte Box mit schwarzem Stern) ausgetauscht wurde. cat: Gen für Chloramphenicolacetyltransferase; amyE: Gen für die α-Amylase; xynP: Gen für H+-Symporter; lacZ: Gen für β-Galaktosidase

ERGEBNISSE

- 61 -

Anschließend wurde WH595 mit pHT304, pWH1541 bzw. den pWH1541 Derivaten, welche

für die CcpA Varianten R54W, V301W und R304W kodieren, transformiert. Die Anwesenheit

der Plasmide wurde mittels PCR Auswahlverfahren überprüft, wofür die Oligonukleotide

pUP19 und pRev19 eingesetzt wurden.

β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen (Abb. 4.18) zeigen, dass die KKR der xynP(ackA

cre2)’::’lacZ Fusion durch WT CcpA keinen signifikanten Unterschied zur WT xynP’::’lacZ

Fusion aufweist. Durch alle drei CcpA Varianten kommt es zu keiner bzw. eingeschränkter

KKR der xynP(ackA cre2)’::’lacZ und der xynP’::’lacZ Fusionen, aber zu voller intakter

Repression durch WT CcpA. Deshalb ist die Repression durch WT CcpA an xynP durch den

Austausch der xynP cre gegen die ackA cre2 unbeeinflusst. Des Weiteren liegt nach dem cre

Austausch keine intakte KKR durch die CcpA Mutanten R54W, V301W und R304W vor. Das

zeigt, dass Punktmutationen in ccpA die Aktivierung von ackA über die Erkennung der ackA

cre2 beeinflussen. Da es durch den Austausch der ackA cre2 gegen die xynP cre im ackA

Promotor allerdings nicht zum vollkommenen Verlust der Aktivierung durch die CcpA

Mutanten R54W, V301W und R304 kommt, müssen folglich noch andere bisher unbekannte

Faktoren für die differenzielle Regulation von Bedeutung sein.

QB7144

WH490

pWH1541

-

pHT304-

R54W-

V301W

-

R304W

-

WH594

WH595

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20

40

60

80

100

xynP‘ ‘lacZ

cre

ackA cre2xynP‘ ‘lacZ

cre

WH490 WH595

QB7144

WH490

pWH1541

-

pHT304-

R54W-

V301W

-

R304W

-

WH594

WH595

pWH1541

pHT304

R54W

V301W

R304W

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20

40

60

80

100

xynP‘ ‘lacZ

cre


cre

xynP‘ ‘lacZ

cre


cre

WH490WH490 WH595WH595 Abb. 4.18: CcpA_R54W, V301W und R304W mit Derepression der xynP’::’lacZ und xynP(ackA cre2)’::’lacZ Fusion Die Abb. zeigt die normierten β-Gal Aktivitäten der CcpA Mutanten unter zwei verschiedenen Wuchsbedingungen (mit Xylose: schwarze Balken; mit Xylose und Glukose: gestreifte Balken) in %. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die linke Seite des Graphs zeigt die Aktivitäten an xynP’::’lacZ, während die rechte Seite die Aktivitäten an xynP(ackA cre2)’::’lacZ darstellt. Über jeder Seite des Graphs ist eine schematische Übersicht des Indikatorgens wiedergegeben. WH490/pHT304 bzw. WH595/pHT304 wurden in Anwesenheit von Xylose gleich 100% (1200 Miller Units) gesetzt. WT: QB7144, WH594; ΔccpA: WH490, WH595; pWH1541: WT ccpA; pHT304: - ccpA

ERGEBNISSE

- 62 -

4.2 PrfA abhängige Regulation von Virulenzgenen aus L. monocytogenes in B. subtilis

Diverse Kohlenstoffquellen beeinflussen die PrfA abhängige Regulation der Virulenzgene in

L. monocytogenes (Brehm et al., 1996; Gilbreth et al., 2004; Milenbachs et al., 1997),

weshalb vermutet wird, dass diese durch Komponenten der KKR beeinträchtigt wird.

Das Ziel war es nun Faktoren zu identifizieren, welche die PrfA Aktivität reprimieren oder

aktivieren. Dafür wurde das heterologe apathogene Wirtsbakterium B. subtilis ausgewählt,

da in diesem der Mechanismus der KKR (Stülke and Hillen, 2000) und der darin involvierten

Komponenten besser untersucht ist als in L. monocytogenes. Beide Organismen stehen sich

phylogenetisch nahe und alle generellen KKR und PTS Komponenten wie HPrK/P, CcpA

und HPr sind auch in L. monocytogenes vorhanden (Behari and Youngman, 1998;

Christensen et al., 1998; Christensen et al., 1999; Mertins et al., 2007), mit Ausnahme von

Crh (Prof. Dr. W. Goebel, persönliche Mitteilung). Außerdem wurde bereits gezeigt, dass

PrfA in B. subtilis exprimiert werden kann (Freitag et al., 1992).

4.2.1 Konstruktion eines Expressionssystems zur Charakterisierung der PrfA abhängigen Virulenzgenregulation in B. subtilis

Zunächst wurde ein System etabliert, welches die in vivo Charakterisierung der PrfA

abhängigen Virulenzgenregulation aus L. monocytogenes im Untersuchungsorganismus

B. subtilis ermöglicht. Hierfür wurden lacZ Fusionen mit Virulenzgenpromotoren aus

L. monocytogenes als singuläre Kopien in den amyE-Lokus des B. subtilis Chromosoms

integriert. Um Varianz zu gewährleisten, wurden vier Virulenzgenpromotoren ausgewählt.

Anschließend wurden verschiedene Vektoren konstruiert, welche die Expression von PrfA

auf unterschiedlichen Niveaus im heterologen Wirt B. subtilis erlauben.

Sodann wurde der Einfluss von unterschiedlichen PrfA Konzentrationen auf die

Virulenzgenexpression und das Wuchsverhalten untersucht. Außerdem wurden die

Auswirkungen von verschiedenen C-Quellen auf die Virulenzgenexpression in variablen

Phasen unter Zugabe von hohen und niedrigen PrfA Mengen analysiert.

Danach wurden KKR und PTS defiziente Mutanten mit Virulenzgenpromotor-lacZ Fusionen

konstruiert und die Auswirkungen dieser Mutationen auf die PrfA Aktivität bestimmt.

ERGEBNISSE

- 63 -

4.2.1.1 Konstruktionen von Indikatorstämmen Für die Konstruktionen von Indikatorstämmen wurden die vier Virulenzgenpromotoren PactA,

Phly, PplcA und PinlC aus L. monocytogenes ausgewählt. Die Promotorfragmente actA, hly, plcA

und inlC wurden mittels PCR amplifiziert, wobei chromosomale DNA aus L. monocytogenes

EGDe als Templat diente. Dafür wurden die für den Virulenzgenpromotor spezifischen

Oligonukleotidpaare actABam und actAEco, hlyBam und hlyEco, plcABam und plcAEco

sowie inlCBam3 und inlCEco verwendet. Die Primer führten die für die Klonierung benötigten

Restriktionsendonuklease Schnittstellen BamHI und EcoRI ein, über welche die

promotortragenden Fragmente stromaufwärts des lacZ Gens in den Integrationsvektor pAC6

kloniert wurden3. Die Nukleotidsequenz der Virulenzgenpromotoren wurde durch

Sequenzierung bestätigt. Die resultierenden Plasmide wurden pWH892 (actA’::’lacZ),

pWH893 (hly’::’lacZ), pWH894 (plcA’::’lacZ) bzw. pWH897 (inlC3’::’lacZ) genannt. Nach

deren Linearisierung mit der Restriktionsendonuklease ScaI wurde der WT B. subtilis 168

transformiert, wodurch die transkriptionellen lacZ Fusionen und die Chloramphenicol-

resistenzkassette über doppelt homologe Rekombination in den amyE-Lokus des B. subtilis

168 Chromosoms integriert wurden. Die Überprüfung der Rekombinationsereignisse erfolgte

durch Selektion auf Chloramphenicol, eine darauf folgende Auswahl auf α-Amylase-

inaktivität mittels Stärkeplatten, genomischer PCR Analyse und Sequenzierung. Die Stämme

wurden WH621 (actA’::’lacZ), WH622 (hly’::’lacZ), WH623 (plcA’::’lacZ) bzw. WH626

(inlC3’::’lacZ) genannt (Abb. 4.19).

3 Die Klonierung erfolgte analog wie in Kapitel 4.1.6.1 beschrieben (vgl. Abb. 4.14).

Abb. 4.19: Genetische Organisation der amyE-Loki der vier Indikatorstämme Nach der Integration von pWH892 (actA’::’lacZ), pWH893 (hly’::’lacZ), pWH894 (plcA’::’lacZ) bzw. pWH897 (inlC3’::’lacZ) in das B. subtilis Chromosom, liegen die Chloramphenicolresistenzkassette und die Promotor-lacZ Fusionen im amyE-Lokus vor. Während Phly und PplcA eine perfekt palindromische PrfA Box (weiße Box) aufweisen, besitzen die PrfA Bindestellen von PactA und PinlC eine bzw. zwei Basenpaarsubstitutionen (schwarze Sterne). amyE: Gen für α-Amylase; cat: Gen für Chloramphenicolacetyltransferase; lacZ: Gen für β-Galaktosidase; actA: Gen für ActA Protein; hly: Gen für Listeriolysin O; plcA: Gen für Phospholipase C; inlC: Gen für Internalin C

WH621 WH622 WH623 WH626

actA‘ ‘lacZPactAcatamyE‘ ‘amyE

catamyE‘ ‘amyE

catamyE‘ ‘amyE

hly‘ ‘lacZPhly

plcA‘ ‘lacZPplcA

catamyE‘ ‘amyEinlC3‘ ‘lacZPinlC

actA‘ ‘lacZPactAcatamyE‘ ‘amyE

catamyE‘ ‘amyE

catamyE‘ ‘amyE

hly‘ ‘lacZPhly

plcA‘ ‘lacZPplcA

catamyE‘ ‘amyEinlC3‘ ‘lacZPinlC

ERGEBNISSE

- 64 -

4.2.1.2 Konstruktion eines Vektors mit prfA unter Kontrolle von PccpA

Zur Expression von PrfA in B. subtilis, wurde zunächst das Plasmid pWH302 kloniert,

welches prfA unter Kontrolle des konstitutiven ccpA Promotors trägt (Abb. 4.20). Das prfA

Gen wurde mittels überlappender PCR an PccpA fusioniert, sodass prfA über die

Ribosomenbindestelle von ccpA translatiert wird. In der ersten Stufe der PCR wurde mit

chromosomaler DNA aus B. subtilis 168 als DNA Matrize und mittels der Oligonukleotide

pCPBsrGI und prfAccpAlink ein Teil von PccpA amplifiziert und eine Restriktionsendonuklease

Schnittstelle für BsrGI eingeführt. Im zweiten Schritt der PCR wurde prfA einschließlich

Terminator amplifiziert, wofür das erste PCR Produkt und der Primer prfAendKpnI eingesetzt

wurden. Chromosomale DNA aus L. monocytogenes EGDe diente dabei als DNA Matrize.

Das Oligonukleotid prfAendKpnI fügte eine Restriktionsendonuklease Schnittstelle für KpnI

ein. Anschließend wurde das PCR Fragment über BsrGI und KpnI in pHT304 (Abb. 4.20)

kloniert. Die Nukleotidsequenz von PccpA-prfA wurde mittels Sequenzierung bestätigt und das

resultierende Plasmid wurde pWH302 genannt.

chrom. DNA B. subtilis 1681. PCR PccpA ccpA

prfAccpAlink

pCPBsrGIBsrGI

2. PCR

1. PCR ProduktPccpA

prfA

prfAendKpnI

chrom. DNA L. monocytogenes EGDe

KpnI

BsrGI

pWH302prfA

erm blaoriColE1 ori1030

PccpA KpnIBsrGI

pHT304erm bla

oriColE1

ori1030

BsrGI KpnI BsrGI/KpnI

2. PCR ProduktPccpA prfA

KpnIBsrGI

C

A

B

chrom. DNA B. subtilis 1681. PCR PccpA ccpA

prfAccpAlink

pCPBsrGIBsrGI

2. PCR

1. PCR ProduktPccpA

prfA

prfAendKpnI


KpnI

BsrGI

2. PCR

1. PCR ProduktPccpA

1. PCR ProduktPccpA

prfA

prfAendKpnI


KpnI

BsrGI

pWH302prfA


PccpA KpnIBsrGI

pHT304erm bla

oriColE1

ori1030



KpnIBsrGI

C

pWH302prfA


PccpA KpnIBsrGI

pWH302prfA


PccpA KpnIBsrGI

pHT304erm bla

oriColE1

ori1030

BsrGI KpnI

pHT304erm bla

oriColE1

ori1030 pHT304erm bla

oriColE1

ori1030



KpnIBsrGI

PccpA prfA

KpnIBsrGI

C

A

B

Abb. 4.20: Konstruktion von pWH302 (PccpA-prfA) A 1. PCR zur Amplifikation von PccpA mittels der Oligonukleotide pCPBsrGI und prfAccpAlink und chromosomaler DNA aus B. subtilis 168 als Matrizen DNA. pCPBsrGI führte eine BsrGI Schnittstelle ein, während prfAccpAlink prfA an PccpA

fusionierte. B 2. PCR zur Amplifikation von prfA samt Terminator (gestielter Kreis) mit dem 1. PCR Produkt und dem Primer prfAendKpnI und chromosomaler DNA aus L. monocytogenes EGDe als Matrizen DNA. prfAendKpnI führte die Schnittstelle KpnI ein. C Klonierung des PCR Fragments über BsrGI/KpnI in pHT304, woraus pWH302 resultierte. bla: Gen für β-Laktamase; erm: Gen für Erythromycinresistenz; ori1030: Replikationsursprung für B. subtilis; oriColE1: Replikationsursprung für E. coli

ERGEBNISSE

- 65 -

4.2.1.3 in vivo Expressionssystem (PccpA-prfA) WH621 (actA’::’lacZ), WH622 (hly’::’lacZ), WH623 (plcA’::’lacZ) bzw. WH626 (inlC3’::’lacZ)

wurden entweder mit pHT304 (- prfA) oder mit pWH302 (PccpA-prfA) transformiert. Dabei

diente pHT304 als Kontrolle um sekundäre Effekte auszuschließen und äquivalente

Messbedingungen zu gewährleisten. Die Anwesenheit der Plasmide wurde mittels PCR

Auswahlverfahren unter Verwendung der Oligonukleotide pUP19 und pRev19 überprüft. Das

in vivo Expressionssystem ist in Abb. 4.21 dargestellt.

Bacillus subtilis

Chromosom

Pvir

‘lacZamyE‘ ‘amyEcat

pWH302prfA


PccpA

PrfA

PrfABox

Bacillus subtilis

Chromosom

Pvir


pWH302prfA


PccpA

PrfA

PrfABox

Abb.: 4.21: Heterologes in vivo Expressionssystem (PccpA-prfA) Die Virulenzgenpromotoren (Pvir) wurden an ein promotorloses lacZ Gen fusioniert und über doppelt homologe Rekombination in den amyE-Lokus des B. subtilis Chromosoms integriert. Das Plasmid pWH302 exprimiert PrfA, wobei prfA unter Kontrolle des konstitutiven ccpA Promotors (PccpA) steht. PrfA bindet an die PrfA Box von Pvir, was zur Transkription von lacZ führt. amyE: Gen für α-Amylase; lacZ: Gen für β-Galaktosidase; cat: Gen für Chloramphenicol-acetyltransferase; bla: Gen für β-Laktamase; erm: Gen für Erythromycinresistenz; ori1030: Replikationsursprung für B. subtilis; oriColE1: Replikationsursprung für E. coli

Anschließend wurde mittels Immunoblot überprüft, ob PrfA in diesen Stämmen exprimiert

wird. Die Detektion von PrfA erfolgte mit polyklonalen Antikörpern aus L. monocytogenes4

und die weitere Durchführung gemäß Abschnitt 3.5.10. Als Kontrollen wurden aufgereinigtes

PrfA und die B. subtilis Stämme verwendet, welche mit pHT304 transformiert wurden. In

allen Stämmen, welche mit pWH302 transformiert wurden, wird PrfA exprimiert (Abb. 4.22).

Anschließend wurden β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen (Abb. 4.22) durchgeführt. In

allen Indikatorstämmen, welche nur mit pHT304 transformiert wurden, ist nahezu keine β-

Galaktosidase Aktivität feststellbar. Im Gegensatz dazu zeigen alle Reporterstämme, welche

mit pWH302 transformiert wurden, eine Aktivierung der entsprechenden Promotor-lacZ

Fusion, die allerdings unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Die höchste Aktivierung wird an

ERGEBNISSE

- 66 -

der plcA’ und der hly’::’lacZ Fusion erzielt, was auf die perfekt palindromisch aufgebauten

PrfA Boxen zurückgeführt werden kann. An der actA’::’lacZ Fusion zeigt sich eine geringere

PrfA abhängige Aktivierung, da sich eine Mutation in der PrfA Bindestelle befindet. Eine

deutlich schwächere Aktivierung zeigt sich bezüglich der Expression der inlC3’::’lacZ Fusion,

was auf die beiden Basenpaarsubstitutionen im PrfA Bindemotiv zurückzuführen ist. Folglich

ist das heterologe Expressionssystem funktional.

plcA hly actA inlC

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

01020

50010001500200025003000

β-G

alA

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

WH623 WH622 WH621 WH626

‘lacZPactA actA‘

‘lacZPinlC inlC‘

‘lacZPhly hly‘

‘lacZPplcA plcA‘

plcA hly actA inlC

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

01020

50010001500200025003000

β-G

alA

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

WH623 WH622 WH621 WH626 plcA hly actA inlC

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

01020

50010001500200025003000

β-G

alA

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

plcA hly actA inlC

β-G

al A

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

01020

50010001500200025003000

β-G

alA

ktiv

ität [

Mill

er U

nits

]

WH623 WH622 WH621 WH626

‘lacZPactA actA‘ ‘lacZPactA actA‘

‘lacZPinlC inlC‘ ‘lacZPinlC inlC‘

‘lacZPhly hly‘ ‘lacZPhly hly‘

‘lacZPplcA plcA‘

PrfA - - + + - - + +

WH6

23

WH6

23

WH6

22

WH6

22W

H621

WH6

21

WH6

26

WH6

26

PrfAPrfA - - + + - - + +

WH6

23

WH6

23

WH6

22

WH6

22W

H621

WH6

21

WH6

26

WH6

26

PrfA

Abb. 4.22: in vivo Aktivitäten von WH621, WH622, WH623 und WH626 und deren Expression von PrfA A: β-Galaktosidase Aktivitäten von WH621, WH622, WH623 und WH626 transformiert mit pHT304 (weiße Balken) oder mit pWH302 (PccpA-prfA) (schwarze Balken) in der logarithmischen Phase. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. B: Immunoblot zur Überprüfung der PrfA Expression in der logarithmischen Phase; In den Spuren 2 - 9 wurden je 0,1 oD600 Äquivalente Proteinrohextrakt der Stämme WH621, WH622, WH623 und WH626 transformiert mit pHT304 (- prfA; gekennzeichnet mit „-“) oder mit pWH302 (PccpA-prfA; gekennzeichnet mit „+“) aufgetragen. 100 ng aufgereinigtes PrfA in Spur 1 diente als Kontrolle.

4 freundlicherweise von Dr. S. Müller-Altrock, Universität Würzburg, zur Verfügung gestellt

A

B

ERGEBNISSE

- 67 -

4.2.1.4 Konstruktion eines Vektors zur Regulation der PrfA Konzentration mittels des Tetrazyklinrepressors

Um die PrfA Konzentration in B. subtilis variieren zu können, sollte die Transkription von prfA

durch den Tetrazyklinrepressor (TetR) kontrolliert werden. TetR vermittelte Genregulation

wurde bereits erfolgreich in B. subtilis eingesetzt (Bertram et al., 2005; Kamionka et al.,

2005). Für die Konstruktion wurde als Basis das Plasmid pWH1935-1a (Bertram et al., 2005)

verwendet, auf dem das Integrationselement InsTetG+1a lokalisiert ist. Dieser Vektor trägt

das tetR Gen der Klasse BD unter P* Kontrolle mit einer tet Operator (tetO) Sequenz. Dabei

ist die Expression von TetR autoreguliert. Weiterhin enthält pWH1935-1a den auswärts

gerichteten Pxyl/tet mit zwei tetO Sequenzen. Um eine dichtere PrfA Regulation zu

ermöglichen, wurde das Plasmid mit zwei tetO Boxen verwendet, da durch die Anwesenheit

von einem tetO Motiv lediglich eine erhöhte Induktion bei gleichzeitig unvollständiger

Repression erzielt wird (Bertram et al., 2005). Der tet-regulatorische Bereich aus pWH1935-

1a, welcher das tetR Gen unter P* Kontrolle und den auswärts gerichteten Pxyl/tet einschließt,

wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide MS_TetfwdSacI und

MS_TetrevEcoRI amplifiziert. Die Primer führten die für die Klonierung benötigten

Restriktionsendonuklease Schnittstellen SacI und EcoRI ein, über die das PCR Fragment in

pHT304 kloniert wurde. Dieser Vektor liegt in B. subtilis in niedriger Kopienzahl vor und hat

sich zuvor bereits als geeignet erwiesen. Das resultierende Plasmid wurde pWH1017

genannt und für spätere Messungen als Kontrolle mitgeführt. Im nächsten Schritt wurde prfA

einschließlich Terminator mittels PCR amplifiziert, wofür die Oligonukleotide

MS_prfAfwdSacI und prfAendKpnI verwendet wurden. Dabei diente chromosomale DNA aus

L. monocytogenes EGDe als Matrizen DNA. Der Primer MS_prfAfwdSacI führte neben der

SacI Schnittestelle die Shine-Dalgarno Sequenz von PccpA sowie acht Basenpaare vor dem

prfA Startkodon ein. Diese ist im Vergleich zu anderen Shine-Dalgarno Sequenzen in

B. subtilis weniger konserviert, was eine schwächere TetR vermittelte Induktion zur Folge

haben sollte. Die prfA eigene Ribosomenbindestelle wurde nicht verwendet, da die PrfA

Expression im Promotor stromaufwärts von prfA thermoreguliert ist (Johansson et al., 2002).

Bei niedrigen Temperaturen bildet sich in der nicht translatierten Region von prfA eine

Sekundärstruktur aus, welche die Ribosomenbindung und folglich die PrfA Expression

verhindert (Johansson et al., 2002) (Abschnitt 2.2.5, Abb. 2.10). Bei hohen Temperaturen

zeigt sich diese Sekundärstruktur nicht, was die Bindung der Ribosomen an die Shine-

Dalgarno Sequenz und anschließende Expression von PrfA zur Folge hat (Johansson et al.,

2002). Durch den Primer prfAendKpnI wurde die Restriktionsendonuklease Schnittstelle KpnI

angehängt. Das resultierende Amplifikat wurde mit SacI und KpnI restringiert und mit

äquivalent geschnittenem pWH1017 ligiert. Das entstandene Plasmid, dessen

ERGEBNISSE

- 68 -

Nukleotidsequenz mittels Sequenzierung bestätigt wurde, bekam den Namen pWH1018 und

trägt prfA unter Pxyl/tet Kontrolle. Die Klonierungsstrategie ist in Abb. 4.23 dargestellt.

prfA

KpnI

SD

8 BpSacI

PCR

SacI/KpnI

EcoRI/SacI

pHT304erm bla

oriColE1 ori1030

EcoRI SacI KpnI

pWH1018prfAtetR

OO


O

SacI KpnIP* Pxyl/tet

pWH1017tetR

OO


O

EcoRI SacI KpnIP* Pxyl/tet


tetR6671S

aphA3

SacI

EcoRI

PCR

InsTetG+1a (pWH1935-1a)

Pxyl/tet

OOO

P*

prfA

KpnI

SD

8 BpSacI

PCR prfA

KpnI

SD

8 BpSacI

prfA

KpnI

prfAprfA

KpnIKpnI

SD

8 Bp

SD

8 BpSacI

PCR

SacI/KpnI

EcoRI/SacIEcoRI/SacI

pHT304erm bla

oriColE1 ori1030

EcoRI SacI KpnI

pWH1018prfAtetR

OO


O

SacI KpnIP* Pxyl/tet

pWH1017tetR

OO


O

EcoRI SacI KpnIP* Pxyl/tet


tetR6671S

aphA3

SacISacI

EcoRI

PCR

InsTetG+1a (pWH1935-1a)

Pxyl/tet

OOO

P*

Abb. 4.23: Konstruktion eines Plasmids zur Regulation der PrfA Expression mittels TetR Als Basis diente das auf pWH1935-1a lokalisierte InsTetG+1a, welches tetR unter Kontrolle von P*, einen auswärts gerichteten Promotor (Pxyl/tet), ein von loxP Sequenzen (weiße Boxen, die mit 66 und 71 gekennzeichnet sind) flankiertes aphA3 Gen und Terminatoren für Transkription und Translation (S) trägt. Die Mosaikelemente sind als schwarze Dreiecke dargestellt. Mittels PCR wurde tetR unter P* Kontrolle und Pxyl/tet amplifiziert, wobei pWH1935-1a als Templat diente. Die Primer führten Schnittstellen für EcoRI und SacI ein, über die das PCR Fragment in pHT304 kloniert wurde, woraus pWH1017 resultierte. Danach wurde prfA samt Terminator mittels PCR amplifiziert, wobei chromosomale DNA aus L. monocytogenes EGDe als Matrizen DNA fungierte. Während der eine Primer eine KpnI Schnittstelle einführte, fügte der andere neben der SacI Schnittstelle, die Shine-Dalgarno Sequenz (SD) von PccpA und acht Bp vor dem Startkodon von prfA hinzu. Dann wurden das PCR Fragment und pWH1017 mit SacI und KpnI restringiert und anschließend ligiert, wodurch pWH1018 entstand, welcher Pxyl/tet-prfA trägt. tetR: Gen für TetR (BD); bla: Gen für β-Laktamase; erm: Gen für Erythromycinresistenz; ori1030: Replikationsursprung für B. subtilis; oriColE1: Replikationsursprung für E. coli

ERGEBNISSE

- 69 -

4.2.1.5 Heterologes in vivo Expressionssystem (Pxyl/tet-prfA)

Die Indikatorstämme WH621 (actA’::’lacZ), WH622 (hly’::’lacZ), WH623 (plcA’::’lacZ) bzw.

WH626 (inlC3’::’lacZ) wurden mit pWH1017 oder pWH1018 transformiert. Dabei diente

pWH1017 als Kontrolle um sekundäre Effekte auszuschließen und äquivalente

Messbedingungen zu gewährleisten. Mittels PCR Auswahlverfahren wurde die Anwesenheit

der Plasmide überprüft. Dafür wurden die Oligonukleotide pUP19 und pRev19 eingesetzt,

welche flankierend zu tetR in pWH1017 bzw. zu tetR und prfA in pWH1018 hybridisieren.

Das vollständige in vivo Expressionssystem ist in Abb. 4.24 dargestellt. Die jeweiligen

Virulenzgenpromotor-lacZ Fusionen liegen chromosomal im amyE-Lokus vor. PrfA wird

episomal von pWH1018 kodiert und durch TetR reguliert. In Abwesenheit des Induktors

Anhydrotetrazyklin (atc) bindet TetR an tetO in Pxyl/tet und reprimiert die Transkription von

prfA. Nach der Zugabe von atc bindet dieses an TetR, wodurch dieser seine Konformation

ändert und die Affinität zum Operator verliert, was zur Dissoziation von tetO und zur

Transkription von prfA führt. Als Folge davon bindet PrfA an die PrfA Box des

entsprechenden Virulenzgenpromotors, wodurch lacZ transkribiert wird.

Bacillus subtilis

Chromosom

Pvir


pWH1018prfAtetR

OO


O

PrfAatc TetR

Bacillus subtilis

Chromosom

Pvir


pWH1018prfAtetR

OO


O

pWH1018prfAtetR

OO


O

PrfAatcatc TetR

Abb. 4.24: Heterologes in vivo Expressionssystem (Pxyl/tet-prfA) Die Virulenzgenpromotoren (Pvir) wurden an ein promotorloses lacZ Gen fusioniert und über doppelt homologe Rekombination in den amyE-Lokus des B. subtilis Chromosoms integriert. PrfA (weiße Ovale) wird episomal von pWH1018 kodiert. PrfA steht unter Kontrolle von Pxyl/tet, welcher zwei tet Operator Sequenzen (tetO; graue Boxen, die als “O” bezeichnet sind) aufweist und wird durch TetR (graue Ovale) reguliert. TetR wird durch P* autoreguliert, welcher eine tetO Box enthält. In Abwesenheit des Induktors Anhydrotetrazyclin (atc; schwarze Dreiecke) bindet TetR an tetO, wodurch die Transkription von prfA reprimiert wird. Nach Induktion durch atc dissoziiert TetR von tetO, was zur Transkription von prfA führt. PrfA bindet an die PrfA Box (weiß) von Pvir, wodurch lacZ transkribiert wird. amyE: Gen für α-Amylase; lacZ: Gen für β-Galaktosidase; cat: Gen für Chloramphenicol-acetyltransferase; tetR: Gen für TetR (BD); bla: Gen für β-Laktamase; erm: Gen für Erythromycinresistenz; ori 1030: Replikationsursprung für B. subtilis; ori ColE1: Replikationsursprung für E. coli

ERGEBNISSE

- 70 -

4.2.1.6 Einfluss von steigenden atc Konzentrationen auf die PrfA Expression

Mittels Immunoblot wurde überprüft, ob die PrfA Konzentration durch TetR atc abhängig

regulierbar ist. Hierfür wurde der WT WH621 (actA’::’lacZ), welcher zuvor mit pWH1018

(Pxyl/tet-prfA) transformiert wurde, in LB-Medium ohne atc und mit steigenden atc

Konzentrationen von 0,001 µM bis 0,4 µM angezogen. Die Zellen wurden in der

logarithmischen Phase geerntet und nach dem Zellaufschluss auf ein 10%iges SDS-Gel

aufgetragen. Die weitere Durchführung erfolgte gemäß Abschnitt 3.5.10.

Als Kontrollen wurden aufgereinigtes PrfA und der Stamm WH621/pWH1017, welcher kein

PrfA exprimiert, verwendet. Der Immunoblot zur Überprüfung der PrfA Expression in Abb.

4.25 zeigt, dass mit steigenden atc Konzentrationen die Menge an PrfA zunimmt. Allerdings

ist auch ohne den Zusatz von atc ein leichtes Signal auf der Höhe von PrfA erkennbar, was

auf eine unvollständige Repression der Transkription von prfA zurückzuführen ist. Im

Gegensatz dazu ist bei WH621/pWH1017 kein PrfA detektierbar. Folglich ist es möglich die

PrfA Konzentration durch TetR atc abhängig zu regulieren und für spätere Messungen

definierte PrfA Mengen einzusetzen.

PrfA

atc[µM]W

H62

1/pW

H10

17 WH621/pWH1018

0

0,00

1

0,00

2

0,00

5

0,01

0,02

0,05

0,07 0,1

0,4

PrfA

atc[µM]W

H62

1/pW

H10

17 WH621/pWH1018

0

0,00

1

0,00

2

0,00

5

0,01

0,02

0,05

0,07 0,1

0,4

Abb. 4.25: Einfluss von steigenden atc Konzentrationen auf die PrfA Expression Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt der angegebenen Stämme in der logarithmischen Phase. WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) wurde in Anwesenheit von steigenden atc Konzentrationen angezogen. WH621/pWH1017 (- prfA; mit 0,4 µM atc) wurde als Kontrolle in Spur 2 aufgetragen. 60 ng aufgereinigtes PrfA in Spur 1 diente als Kontrolle.

4.2.1.7 Einfluss von steigenden PrfA Konzentrationen auf die actA Expression

Um den Einfluss von unterschiedlichen PrfA Mengen auf die actA’::’lacZ Expression zu

überprüfen, wurden β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen in der logarithmischen

ERGEBNISSE

- 71 -

Wachstumsphase durchgeführt. Hierfür wurde WH621 (actA’::’lacZ), welcher entweder mit

pWH1017 (ohne prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert wurde, in LB-Medium mit

steigenden atc Konzentrationen von 0,001 µM bis 0,4 µM angezogen. Zur Kontrolle wurde

der Stamm ohne atc mitgeführt. In Abb. 4.26 sind die Ergebnisse graphisch dargestellt.

Auch in Abwesenheit von atc zeigt sich mit 14% der durch volle Induktion erzielten β-

Galaktosidase Aktivität eine Aktivierung der actA’::’lacZ Fusion, was auf eine unvollständige

Repression der Transkription von prfA zurückzuführen ist. In Anwesenheit von 0,001 µM bis

0,01 µM atc erhöht sich die β-Galaktosidase Aktivität nur geringfügig bis zu einer ersten

Stufe. Dieses Ergebnis ist unerwartet, da der Immunoblot in Abb. 4.25 zeigt, dass es durch

steigende atc Konzentrationen zu kontinuierlich erhöhten PrfA Mengen kommt. Erst durch

den Zusatz von 0,02 µM atc zeigt sich eine Erhöhung der β-Galaktosidase Aktivität auf ca.

50% der β-Galaktosidase Aktivität. Durch die Zugabe von 0,05 µM atc wird eine maximale

β-Galaktosidase Aktivität erreicht, die auch durch die Erhöhung bis zu 0,4 µM atc nicht mehr

gesteigert werden kann. Somit zeigt sich eine zweistufige PrfA vermittelte Expression der

actA’::’lacZ Fusion in Abhängigkeit von der PrfA Dosis.

atc [µM]

00,001

0,002 0,005 0,01

0,02 0,05

0,07 0,1 0,4

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20

40

60

80

100

actA‘ ‘lacZPactA

atc [µM]

00,001

0,002 0,005 0,01

0,02 0,05

0,07 0,1 0,4

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

1

20

40

60

80

100

actA‘ ‘lacZPactA actA‘ ‘lacZPactA

Abb. 4.26: Einfluss von steigenden PrfA Konzentration auf die actA Expression Die β-Gal Aktivitäten von WH621/pWH1017 (- prfA; weiße Balken) und WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA; schwarze Balken) sind in % angegeben und gegen die atc Konzentration in µM aufgetragen. Die β-Gal Aktivitäten wurden auf WH621/pWH1018 in Anwesenheit von 0,4 µM normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messung wurde reproduziert. Über dem Graph ist schematisch die actA’::’lacZ Fusion von WH621 gezeigt.

ERGEBNISSE

- 72 -

4.2.1.8 Auswahl eines geeigneten in vivo Expressionssystems

Zunächst wurden die beiden in vivo Expressionssysteme einander gegenübergestellt, um ein

geeignetes Messsystem auszuwählen. Ein Vergleich der gebildeten PrfA Mengen mittels

Immunoblot (Abb. 4.27) ergab, dass erheblich mehr PrfA exprimiert wird, wenn die

Transkription von prfA unter der Kontrolle von PccpA steht. Im Gegensatz dazu wird PrfA auf

geringerem Niveau exprimiert, wenn die Transkription von prfA durch Pxyl/tet reguliert wird und

uninduziert bleibt. Allerdings wird PrfA auf ähnlich hohem Niveau exprimiert, wenn die

Transkription von prfA durch PccpA bzw. Pxyl/tet reguliert wird und gleichzeitig durch 0,07 µM

atc induziert wird.

PrfA - Pxyl/tet-prfA PccpA-prfA

- atc + atc

PrfA - Pxyl/tet-prfA PccpA-prfA

- atc + atc

Abb. 4.27: Vergleich der PrfA Expression Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt von WH621 (actA’::’lacZ) und WH622 (hly’::’lacZ), welche entweder mit pWH302 (PccpA-prfA) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert wurden. Beide Stämme wurden in LB-Medium +/- 0,07 µM atc angezogen und in der logarithmischen Phase geerntet. 80 ng aufgereinigtes PrfA in Spur 1 diente als Kontrolle. In Spur 2 ist der Stamm WH621/pHT304 (mit „-“ gekennzeichnet) als Negativkontrolle aufgetragen, welcher kein PrfA exprimiert.

Anschließend wurden die β-Galaktosidase Aktivitäten der beiden Regulationssysteme

miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tab. 4.7 zusammengefasst. Es werden

ähnliche β-Galaktosidase Aktivitäten erzielt, wenn die Transkription von prfA unter Kontrolle

von PccpA oder Pxyl/tet steht und mit mindestens 0,07 µM atc induziert wird. Deshalb wurde für

darauf folgende Messungen lediglich das Pxyl/tet-prfA System verwendet.

Tab. 4.7: Vergleich der β-Galaktosidase Aktivitäten der beiden in vivo Expressionssysteme

PccpA-prfA bzw. Pxyl/tet-prfA / + 0,07 µM atc

Pxyl/tet-prfA / - atc

actA’::’lacZ ~ 500-fache Aktivierung ~ 1000 Miller Units

~ 10-fache Aktivierung ~ 70 Miller Units

hly’::’lacZ ~ 600-fache Aktivierung ~ 2000 Miller Units


plcA’::’lacZ ~ 1000-fache Aktivierung ~ 2800 Miller Units


inlC3’::’lacZ ~ 15-fache Aktivierung

~ 150 Miller Units PrfA unabhängige Regulation

nicht möglich5

5 Die PrfA unabhängige Regulation der inlC3’::’lacZ Fusion unterscheidet sich nicht von der PrfA abhängigen Regulation

ERGEBNISSE

- 73 -

4.2.1.9 Einfluss von unterschiedlichen PrfA Konzentrationen auf das Wuchsverhalten von WH621 (actA’::’lacZ)

In L. monocytogenes wurde festgestellt, dass hohe PrfA Mengen das Wachstum

beeinträchtigen (Marr et al., 2006). Um zu überprüfen, ob auch in B. subtilis hohe PrfA

Konzentrationen einen Wuchsdefekt hervorrufen, wurden Wuchskurven in Anwesenheit von

unterschiedlichen PrfA Mengen aufgenommen (Abb. 4.28). Hierfür wurde WH621

(actA’::’lacZ), welcher entweder mit pWH1017 (- prfA) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA)

transformiert wurde, in LB-Medium mit und ohne 0,005 µM atc bzw. 0,4 µM atc angezogen.

Das Wachstum von WH621 wurde für 720 min verfolgt, wobei alle 60 min die oD600 bestimmt

wurde. Ohne PrfA zeigt sich mit niedrigen und mittleren atc Konzentrationen kein Effekt auf

das Wuchsverhalten. Mit 0,4 µM atc wird eine leichte Verlangsamung des Wachstums

erzielt. In Anwesenheit von niedrigen und mittleren PrfA Konzentrationen weist WH621 keine

Beeinträchtigung des Wachstums auf. Allerdings wird mit hohen PrfA Konzentrationen eine

erhebliche Verlangsamung des Wachstums sichtbar.

Zeit [min]0 120 240 360 480 600 720

oD60

0

0,05

0,1

0,20,3

0,5

1

23

5

- atc + 0,005 µM atc + 0,4 µM atc

Zeit [min]

0 120 240 360 480 600 720

oD60

0

0,05

0,1

0,20,3

0,5

1

23

5

- atc + 0,005 µM atc + 0,4 µM atc

Abb. 4.28: Einfluss von unterschiedlichen PrfA Mengen auf das Wuchsverhalten von B. subtilis WH621 (WT; actA’::’lacZ) Das Wuchsverhalten von WH621 (actA’::’lacZ) wurde in Anwesenheit von unterschiedlichen atc Konzentrationen (- atc: Kreise; + 0,005 µM atc: Dreiecke; + 0,4 µM atc: Quadrate) zu den angegebenen Zeitpunkten durch das Messen der oD600 verfolgt. Der linke Graph zeigt das Wachstum von WH621/pWH1017 (- prfA) und der rechte Graph das Wachstum von WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA). Daher sind nicht nur in L. monocytogenes, sondern auch in B. subtilis Faktoren vorhanden,

welche das Wachstum in Anwesenheit von hohen PrfA Konzentrationen beeinträchtigen.

ERGEBNISSE

- 74 -

4.2.3 Einfluss von unterschiedlichen Kohlenstoffquellen auf die PrfA abhängige Regulation der Virulenzgenexpression

Da Kohlenstoffquellen die PrfA vermittelte Regulation der Virulenzgenexpression in

L. monocytogenes beeinflussen (Brehm et al., 1996; Gilbreth et al., 2004; Milenbachs et al.,

1997), wird vermutet, dass die PrfA Aktivität durch Komponenten der KKR beeinträchtigt

wird. Deshalb stellte sich die Frage, ob KKR auch in B. subtilis einen Einfluss auf die PrfA

Aktivität ausübt und ob deren Analyse auch in diesem Untersuchungsorganismus möglich

ist. Daher wurden zunächst die Auswirkungen von verschiedenen C-Quellen auf die

Virulenzgenexpression in variablen Phasen unter Zugabe von hohen und niedrigen PrfA

Mengen analysiert. Anschließend wurde überprüft, ob das PrfA Expressionsniveau durch

den Zusatz von unterschiedlichen C-Quellen beeinflusst wird.

4.2.3.1 Expression von PrfA in unterschiedlichen Wachstumsphasen

Mittels Immunoblot wurde zunächst untersucht, ob PrfA in der logarithmischen und in der

stationären Wachstumsphase auf gleichem Niveau exprimiert wird. Hierfür wurde der WT

WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) in LB-Medium mit und ohne 0,07 µM atc angezogen, wobei

Proben in der logarithmischen und in der stationären Wachstumsphase genommen wurden.

Die weitere Durchführung erfolgte gemäß Kapitel 3.5.10. Als Kontrollen dienten

aufgereinigtes PrfA und WH621/pWH1017 (- prfA). Der Immunoblot in Abb. 4.29 zeigt, dass

PrfA sowohl ohne als auch mit 0,07 µM atc in der logarithmischen und in der stationären

Wachstumsphase auf ähnlichem Niveau exprimiert wird. Deshalb können mögliche

differenzielle Effekte in beiden Wachstumsphasen nicht auf unterschiedliche PrfA

Konzentrationen zurückgeführt werden.

PrfA WH

621/

pW

H10

17

WH621/ pWH1018

log stat log stat

+ 0,07µM atc - atc

PrfA WH

621/

pW

H10

17

WH621/ pWH1018

log stat log stat

+ 0,07µM atc - atc

Abb. 4.29: PrfA Expression in unterschiedlichen Wuchsphasen Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt von WH621 (actA’::’lacZ), welcher entweder mit pWH1017 (- prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert wurde. Proben wurden in Anwesenheit von unterschiedlichen PrfA Konzentrationen (- atc; + 0,07 µM atc) in der logarithmischen (log) und in der stationären Wachstumsphase (stat) genommen. 80 ng aufgereinigtes PrfA in Spur 1 diente als Kontrolle.

ERGEBNISSE

- 75 -

4.2.3.2 Einfluss von Glukose und Cellobiose auf die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression

In L. monocytogenes EGDe führt die Zugabe von Glukose oder Cellobiose zum

Wachstumsmedium zur Repression der Virulenzgenexpression (Brehm et al., 1996; Gilbreth

et al., 2004; Milenbachs et al., 1997). Zunächst wurde überprüft, ob durch Glukose und

Cellobiose in Anwesenheit variierender PrfA Konzentrationen differenzielle Effekte auf die

actA Expression in unterschiedlichen Wuchsphasen hervorgerufen werden. Hierzu wurden

niedrige (- atc) und hohe PrfA Konzentrationen (0,07 µM atc) eingesetzt. Für β-

Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen wurde der Stamm WH621 (actA’::’lacZ) verwendet,

welcher entweder mit pWH1017 (- prfA) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert wurde.

Zunächst wurde für WH621 eine Wuchskurve in LB-Medium mit und ohne 0,07 µM atc,

Glukose bzw. Cellobiose aufgezeichnet. Anschließend wurde die β-Galaktosidase Aktivität

sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären Wachstumsphase bestimmt. Die

Ergebnisse sind in Tab. 4.8 dargestellt.

In der logarithmischen Phase führen geringe PrfA Mengen zu Glukose abhängiger

Repression von actA. In Anwesenheit von 0,07 µM atc ist die Glukose vermittelte Repression

in der logarithmischen Phase aufgehoben. In der stationären Wachstumsphase kommt es im

Vergleich zur logarithmischen Wachstumsphase in Anwesenheit von geringen PrfA Mengen

zu einer stärkeren Glukose vermittelten Repression von actA. Außerdem wird in

Anwesenheit von hohen PrfA Konzentrationen in der stationären Wachstumsphase der

Effekt durch Glukose wiederum aufgehoben. Folglich ist die Glukose vermittelte Repression

von actA in beiden Wachstumsphasen umso geringer je mehr PrfA vorhanden ist. Da der

Glukoseeffekt nur auf der ersten Stufe der zweistufigen Regulation der

Virulenzgenexpression sichtbar ist, werden für Untersuchungen bezüglich der Repression

durch Glukose geringe PrfA Konzentrationen benötigt.

In der logarithmischen Phase kommt es in Gegenwart von niedrigen PrfA Konzentrationen zu

leichter Cellobiose vermittelter Repression der actA’::’lacZ Fusion, was sich allerdings in

Anwesenheit von 0,07 µM atc kaum noch zeigt. Im Gegensatz dazu ist die Expression von

actA in Anwesenheit von niedrigen PrfA Mengen durch den Zusatz von Cellobiose in der

stationären Wachstumsphase erhöht. Dieser Effekt wird durch hohe PrfA Konzentrationen

nochmals verstärkt. Folglich ist die Cellobiose vermittelte Repression in der logarithmischen

Phase umso geringer je mehr PrfA vorhanden ist. Im Gegensatz dazu ist die Cellobiose

vermittelte Aktivierung der actA Expression in der Stationärphase umso ausgeprägter je

höher die PrfA Konzentration ist. Folglich sind die Effekte durch Cellobiose in beiden

Wachstumsphasen gegensätzlich.

ERGEBNISSE

- 76 -

Daher sind die Effekte, die in Anwesenheit von Glukose und Cellobiose erzielt werden,

differenziell.

Tab. 4.8: Einfluss von Glukose und Cellobiose auf die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression

β-Gal Aktivität [Miller Units]

WH621/pWH1017 (- prfA) WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA)

C-Quelle c [atc] log-

Phase

Stationär-

phase

log-

Phase

Stationär-

phase

- - 0,91 ± 0,21 2,9 ± 0,2 61 ± 3 100 ± 3

- 0,07 µM 0,34 ± 0,07 1,80 ± 0,01 760 ± 72 1300 ± 78

Glukose - 0,32 ± 0,01 0,38 ± 0,04 11 ± 3 15 ± 2

Glukose 0,07 µM 0,24 ± 0,08 0,65 ± 0,03 540 ± 31 880 ± 24

Cellobiose - 0,52 ± 0,07 0,64 ± 0,04 15 ± 3 250 ± 25

Cellobiose 0,07 µM 0,17 ± 0,04 0,56 ± 0,12 480 ± 66 2600 ± 200

Die β-Gal Aktivitäten wurden in Miller Units bestimmt. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messung wurde reproduziert.

4.2.3.3 Einfluss von unterschiedlichen C-Quellen auf die PrfA abhängige actA Expression

Zunächst wurde überprüft, ob neben Cellobiose auch andere Disaccharide wie Maltose,

Trehalose und Saccharose die PrfA vermittelte Expression von actA in der logarithmischen

Phase reprimieren und in der Stationärphase aktivieren. Hierfür wurden WH621/pWH1017 (-

prfA) und WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) in LB-Medium mit und ohne Glukose, Cellobiose,

Maltose, Trehalose und Saccharose in Abwesenheit von atc angezogen. Anschließend

wurde die β-Galaktosidase Aktivität sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären

Wachstumsphase in Anwesenheit von niedrigen PrfA Konzentrationen bestimmt. Die

Ergebnisse sind in Abb. 4.30 dargestellt.

Auch in Anwesenheit von Maltose, Trehalose und Saccharose wird die PrfA abhängige actA

Expression in der logarithmischen Phase leicht reprimiert. Im Gegensatz dazu führt die

Zugabe von Maltose, Trehalose und Saccharose wie bei Cellobiose in der stationären

Wachstumsphase ebenfalls zu einer erhöhten Aktivierung der actA’::’lacZ Fusion, aber zu

Glukose vermittelter Repression.

ERGEBNISSE

- 77 -

- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

15

50

100

150

200

250

300


- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

20

40

60

80

100

- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

15

50

100

150

200

250

300


- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

15

50

100

150

200

250

300

- + G + C + M + T + S

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

0

15

50

100

150

200

250

300


Abb. 4.30: Einfluss von unterschiedlichen C-Quellen auf die PrfA Aktivität in der logarithmischen Phase im Vergleich zur stationären Wachstumsphase Die Abb. zeigt die β-Gal Aktivitätsmessungen von WH621/pWH1017 (- prfA; weiße Balken) und WH621/pWH1018 (Pxyl/tet-prfA, ohne atc; schwarze Balken) in der logarithmischen Phase (linker Graph) im Vergleich zur Stationärphase (rechter Graph). WH621 wurde in LB-Medium mit und ohne Glukose (+ G), Cellobiose (+ C), Maltose (+ M), Trehalose (+ T) oder Saccharose (+ S) in Abwesenheit von atc angezogen. β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden auf den WT WH621/pWH1018 ohne zusätzliche C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messungen wurden reproduziert. Über den Graphen ist schematisch die actA’::’lacZ Fusion von WH621 gezeigt. 4.2.3.4 PrfA Expression in Anwesenheit von unterschiedlichen C-Quellen

Mittels Immunoblot wurde überprüft, ob zusätzliche C-Quellen im Wachstumsmedium die

PrfA Expression beeinflussen. Hierfür wurde der WT WH621 (actA’::’lacZ), welcher entweder

mit pWH1017 (- prfA) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert wurde, in Abwesenheit von

atc mit und ohne Glukose, Cellobiose, Maltose, Trehalose und Saccharose angezogen. Die

Zellernte erfolgte in der logarithmischen Phase und die weitere Durchführung gemäß Kapitel

3.5.10. Als Kontrollen dienten aufgereinigtes PrfA und WH621 transformiert mit pWH1017

bzw. pWH1018, welcher ohne zusätzliche C-Quellen angezogen wurde.

Der Immunoblot in Abb. 4.31 zeigt, dass das Expressionsniveau von PrfA durch die Zugabe

von unterschiedlichen C-Quellen unbeeinflusst bleibt. Folglich sind alle durch variable C-

Quellen hervorgerufenen Effekte nicht auf unterschiedliche PrfA Mengen zurückzuführen.

Daher wird die PrfA abhängige Regulation der Virulenzgenexpression nicht nur in

L. monocytogenes, sondern auch in B. subtilis durch diverse Kohlenstoffquellen beeinflusst.

Folglich ist deren Untersuchung auch in einem heterologen Expressionssystem möglich. Das

eröffnet die Möglichkeit den Einfluss von spezifischen KKR Komponenten auf die PrfA

ERGEBNISSE

- 78 -

vermittelte Virulenzgenexpression zu analysieren. Dies wird in den nachfolgenden Kapiteln

näher betrachtet.

4.2.4 Einfluss von Deletionen bzw. Mutationen in ptsH, crh, ccpA und ptsG auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression

Da vermutet wird, dass die PrfA vermittelte Regulation der Virulenzgenexpression durch

Komponenten der KKR oder des PTS beeinträchtigt wird, sollte nach Faktoren gesucht

werden, welche die PrfA Aktivität reprimieren oder aktivieren. Zu diesem Zweck wurden

Mutantenstämme mit Deletionen bzw. Mutationen in ccpA, ptsH, crh und ptsG, deren

Genprodukte enorme Bedeutungen in der KKR und dem PTS in B. subtilis haben (Stülke and

Hillen, 2000), konstruiert. Anschließend wurden die Auswirkungen der Deletionen bzw.

Mutationen auf die PrfA vermittelte Virulenzgenexpression in vivo analysiert.

4.2.4.1 Optimierung der Konstruktion von Indikatorstämmen Um bei der Konstruktion von Mutanten Flexibilität zu gewährleisten, wurde bei den

Integrationsvektoren pWH892 (actA’::’lacZ), pWH893 (hly’::’lacZ) und pWH894 (plcA’::’lacZ)

die Chloramphenicolresistenzkassette gegen die Kanamycinresistenzkassette ausgetauscht.

Hierfür wurde mittels PCR das aphA3 Gen mit eigenem Promotor unter Verwendung der

Oligonukleotide MS-KmR-fwd-EcoRI und MS-KmR-rev-BglII amplifiziert, wobei pWH1935-1a

(Bertram et al., 2005) als DNA Matrize diente. Die Primer führten die für die Klonierung

benötigten Schnittstellen EcoRI und BglII ein, über die das Fragment in die äquivalent

restringierten Vektoren pWH892, pWH893 und pWH894 kloniert wurde. Daraus resultierten

WH621/pWH1018PrfA PrfA- + G + C + M + T + S W

H62

1/pW

H10

17

WH621/pWH1018WH621/pWH1018PrfA PrfA- + G + C + M + T + S W

H62

1/pW

H10

17

Abb. 4.31: PrfA Expression in Anwesenheit von unterschiedlichen C-Quellen Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt der über den Spuren angegebenen Stämme. WH621/ pWH1017 (- prfA) in Spur 2 diente als Kontrolle. WH621/ pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) wurde in LB-Medium mit und ohne (-), Glukose (+ G), Cellobiose (+ C), Maltose (+ M), Trehalose (+ T) oder Saccharose (+ S) angezogen. 30 ng aufgereinigtes PrfA wurde als Kontrolle in den beiden äußersten Spuren aufgetragen.

ERGEBNISSE

- 79 -

die Plasmide pWH1332 (actA’::’lacZ, aphA3), pWH1333 (hly’::’lacZ, aphA3) und pWH1334

(plcA’::’lacZ, aphA3). Deren korrekte Nukleotidsequenzen wurde mittels Sequenzierungen

bestätigt. Zur Integration der Promotor-lacZ Fusionen in den amyE-Lokus des B. subtilis

Chromosoms, wurde der WT B. subtilis 168 mit den Plasmiden pWH1332, pWH1333 oder

pWH1334 transformiert, welche zuvor mit ScaI linearisiert wurden. Darauf folgende Selektion

auf die erworbene Kanamycinresistenz, α-Amylaseinaktivitätstests, PCR Analysen und

Sequenzierungen bestätigten die korrekte Integration. Die neu konstruierten Stämme wurden

WH643 (actA’::’lacZ, aphA3), WH644 (hly’::’lacZ, aphA3) und WH645 (plcA’::’lacZ, aphA3)

genannt. Nach der Transformation dieser Stämme mit pWH1017 (- prfA) bzw. pWH1018

(Pxyl/tet-prfA) wurde überprüft, ob sich der Austausch der Antibiotikaresistenz auf die in vivo

Aktivität auswirkt. Die Ergebnisse sind in Tab. 4.9 zusammengefasst. Da keine gravierenden

Expressionsunterschiede zu verzeichnen waren, wurden diese als äquivalent betrachtet.

Mit Hilfe der neuen Integrationsplasmide können somit einfach neue Reporterstämme

konstruiert werden.

Tab. 4.9: Vergleich der β-Galaktosidase Aktivitäten von Wildtypstämmen mit gleichen Promotor-lacZ Fusionen, aber unterschiedlichen Antibiotikaresistenzkassetten

β-Galaktosidase Aktivität [Miller Units] pWH1017 (- prfA) pWH1018 (Pxyl/tet-prfA)

WH621 (actA’::’lacZ, cat) 0,91 ± 0,01 72 ± 6 WH643 (actA’::’lacZ, aphA3) 0,94 ± 0,02 75 ± 5 WH622 (hly’::’lacZ, cat) 2,2 ± 0,2 210 ± 12 WH644 (hly’::’lacZ, aphA3) 2,1 ± 0,1 200 ± 10 WH623 (plcA’::’lacZ, cat) 0,62 ± 0,02 550 ± 23 WH645 (plcA’::’lacZ, aphA3) 0,71 ± 0,03 560 ± 30


4.2.4.2 Einfluss der ccpA Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression

Um den Einfluss einer Deletion im ccpA Gen auf die PrfA Aktivität zu überprüfen, wurden

ccpA Deletionsmutanten mit actA’, hly’ bzw. plcA’::’lacZ Fusionen konstruiert. Daher wurden

für die Deletion von ccpA die Wildtypstämme WH621 (actA’::’lacZ), WH622 (hly’::’lacZ) und

WH623 (plcA’::’lacZ) mit dem Integrationsvektor pWH338 (Sprehe, 2003) transformiert,

welcher aphA3 anstelle von ccpA unter PccpA Kontrolle trägt. Darauf folgende Selektion auf

die erworbene Kanamycinresistenz, PCR Analysen mittels der Oligonukleotide ytxDpsc und

ERGEBNISSE

- 80 -

aroApsc sowie Sequenzierungen und Immunoblots bestätigten die korrekte chromosomale

ccpA Deletion. Die Stämme wurden WH633 (∆ccpA; actA’::’lacZ), WH634 (∆ccpA; hly’::’lacZ)

und WH635 (∆ccpA; plcA’::’lacZ) genannt.

Für den Immunoblot zur Überprüfung der CcpA Expression wurden die jeweiligen

Wildtypstämme und ccpA Deletionsmutanten in LB-Medium angezogen und in der

logarithmischen Wachstumsphase geerntet. Die weitere Durchführung erfolgte wie in

Abschnitt 3.5.10 beschrieben. Als Kontrollen dienten aufgereinigtes CcpA, welches gemäß

Abschnitt 3.5.11.6 aufgereinigt wurde, und der ccpA Deletionsstamm WH490 (Sprehe,

2003), der chromosomal die xynP’::’lacZ Fusion im amyE-Lokus trägt. Der Immunoblot in

Abb. 4.32 zeigt, dass alle Wildtypstämme CcpA exprimieren, während in allen ccpA

Deletionsmutanten keine Detektion von CcpA feststellbar ist.

WH

621

(WT)

WH

622

(WT)

WH

623

(WT)

WH

633

(∆cc

pA)

WH

634

(∆cc

pA)

WH

635

(∆cc

pA)

WH

490

(∆cc

pA)

75 n

g C

cpA

75 n

g C

cpA

actA‘::‘lacZhly‘::‘lacZ

plcA‘::‘lacZ

WH

621

(WT)

WH

622

(WT)

WH

623

(WT)

WH

633

(∆cc

pA)

WH

634

(∆cc

pA)

WH

635

(∆cc

pA)

WH

490

(∆cc

pA)

75 n

g C

cpA

75 n

g C

cpA

actA‘::‘lacZhly‘::‘lacZ

plcA‘::‘lacZ

Abb. 4.32: Überprüfung der CcpA Expression Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,05 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt der über den Spuren angegebenen Stämme. 75 ng aufgereinigtes CcpA diente als Kontrolle. WH490 (∆ccpA; xynP’::’lacZ) wurde als Kontrolle in Spur 2 aufgetragen. Unter dem Immunoblot ist die entsprechende Promotor-lacZ Fusion gezeigt.

Sodann wurden die ccpA Deletionsmutanten mit pWH1017 (- prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-

prfA) transformiert, deren Anwesenheit mittels PCR Analyse unter Verwendung der

Oligonukleotide pUP19 und pRev19 bestätigt wurde. Danach wurde die Auswirkung der

ccpA Deletion auf die actA’, hly’ und plcA’::’lacZ Fusion in vivo analysiert. Dafür wurden die

Wildtypstämme und ccpA Deletionsmutanten in LB-Medium mit und ohne Glukose bzw.

Cellobiose in Anwesenheit von hohen und niedrigen PrfA Konzentrationen angezogen und

die β-Galaktosidase Aktivität in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase

vermessen. Die Resultate sind in Abb. 4.33 graphisch dargestellt.

Mit niedrigen PrfA Konzentrationen zeigen sowohl der WT WH621 als auch die ccpA

Deletionsmutante in der logarithmischen Phase Glukose oder Cellobiose vermittelte

Repression der actA’::’lacZ Fusion, wobei der Effekt für Glukose beim WT geringfügig stärker

ausgeprägt ist. Auch in der Stationärphase weisen der WT und die ccpA Deletionsmutante

mit niedrigen PrfA Konzentrationen Glukose vermittelte Repression der actA’::’lacZ Fusion

auf. Im Gegensatz dazu kommt es durch Cellobiose beim WT zu einer erhöhten Aktivierung

von actA. Dieser Effekt ist in der ccpA Deletionsmutante nicht mehr zu verzeichnen.

ERGEBNISSE

- 81 -


WT

WT + G

WT + CM3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

A

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400B

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)


WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

A

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400B

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

50

100

150

200

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

C D

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

WT

WT + G

WT + C

M3 C

M3 + G

M3 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

50

100

150

200

- + G + C - + G + C WT (WH621) ∆ccpA (WH633)

C D

Abb. 4.33: Einfluss der ccpA Deletion auf die PrfA abhängige actA’::’lacZ Expression in Anwesenheit von unterschiedlichen PrfA Mengen in verschiedenen Wuchsphasen Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden jeweils auf den WT WH621 (actA’::’lacZ) ohne C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messung wurde reproduziert. WH621 und WH633 (∆ccpA) transformiert mit pWH1017 (- prfA; weiße Balken) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA; schwarze Balken) wurden in LB-Medium ohne („-“), mit Glukose (+ G) oder mit Cellobiose (+ C) angezogen. Die actA’::’lacZ Fusion von WH621 und WH633 ist schematisch über den Graphen gezeigt. A: logarithmische Phase, geringe PrfA Konzentrationen (- atc); B: Stationärphase, geringe PrfA Konzentrationen (- atc); C: logarithmische Phase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc); D: Stationärphase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc)

Mit hohen PrfA Konzentrationen besteht zwischen dem WT und der ccpA Deletionsmutante

in der logarithmischen Phase kein Unterschied, da beide Stämme keine Glukose bzw.

Cellobiose vermittelte Repression der actA’::’lacZ Fusion zeigen. Folglich ist der

inhibitorische Effekt durch Glukose und Cellobiose abhängig von der PrfA Dosis und lediglich

mit niedrigen PrfA Konzentrationen sichtbar. Auch in der Stationärphase zeigt sich mit hohen

PrfA Konzentrationen kein Glukoseeffekt und somit auch kein Unterschied zwischen WT und

Mutante. Allerdings kommt es in de Stationärphase beim WT zu Cellobiose vermittelter

Aktivierung der actA’::’lacZ Fusion, welche in der ccpA Deletionsmutante aufgehoben ist.

Folglich ist die Cellobiose vermittelte Aktivierung im Gegensatz zur Repression

ERGEBNISSE

- 82 -

wuchsphasenabhängig, aber unabhängig von der PrfA Dosis, allerdings mit hohen PrfA

Konzentrationen stärker ausgeprägt.

Bezüglich der Expression der hly und plcA’::’lacZ Fusion zeigt sich das gleiche Bild (vgl.

Anhang, Tab. 7.1.). Die Ergebnisse deuten daher auf keine direkte Beteiligung von CcpA an

der PrfA vermittelten Virulenzgenrepression hin.

4.2.4.3 Einfluss der ptsH1 Mutation bzw. ptsH Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression

Um Hinweise auf eine mögliche (in)direkte Beteiligung von HPr bzw. HPrSer46-P auf die

Regulation der PrfA Aktivität zu erhalten, wurden B. subtilis ptsH1 und ptsH Mutanten mit

Virulenzgenpromotor-lacZ Fusionen konstruiert. Als Ausgangsstämme dienten MZ303

(Arnaud et al., 1992), in welchem durch eine Chloramphenicolresistenzkassette das ptsH

Gen deletiert wurde, und QB5223 (Martin-Verstraete et al., 1990), welcher chromosomal die

ptsH1 Mutation trägt. Durch die Transformation von MZ303 mit pWH1332 (actA’::’lacZ,

aphA3), pWH1333 (hly’::’lacZ, aphA3) bzw. pWH1334 (plcA’::’lacZ, aphA3) oder von QB5223

mit pWH892 (actA’::’lacZ, cat), pWH893 (hly’::’lacZ, cat) bzw. pWH894 (plcA’::’lacZ, cat)

wurden die jeweiligen Promotor-lacZ Fusionen in den amyE-Lokus der Mutantenstämme

integriert. Die Überprüfung des Rekombinationsereignisses erfolgte mittels Antibiotika-

selektion, α-Amylaseinaktivitätstests, genomischer PCR Analyse und Sequenzierung. Die

resultierenden Stämme wurden WH650 (∆ptsH; actA’::’lacZ, aphA3), WH651 (∆ptsH;

hly’::’lacZ, aphA3), WH652 (∆ptsH; plcA’::’lacZ, aphA3), WH653 (∆ptsH1; actA’::’lacZ, cat),

WH654 (∆ptsH1; hly’::’lacZ, cat) bzw. WH655 (∆ptsH1; plcA’::’lacZ, cat) genannt. Danach

wurden alle Stämme mit pWH1017 (- prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert. Mittels

PCR Analyse wurde die Anwesenheit der Plasmide bestätigt, wofür die Oligonukleotide

pUP19 und pRev19 eingesetzt wurden. Anschließend wurden die Auswirkungen der ptsH

Deletion und der ptsH1 Mutation in vivo analysiert. Hierfür wurden die Stämme in LB-Medium

mit niedriger und hoher PrfA Dosis mit und ohne Glukose oder Cellobiose angezogen und

die β-Galaktosidase Aktivität in der logarithmischen und stationären Wachstumsphase

bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb. 4.34 graphisch dargestellt.

In der logarithmischen Wachstumsphase zeigt der WT WH621 mit geringen PrfA

Konzentrationen Glukose bzw. Cellobiose vermittelte Repression der actA’::’lacZ Fusion.

Dieser Effekt ist bei WH653 (∆ptsH1) aufgehoben. Allerdings weist die ptsH Deletions-

mutante WH650 ohne zusätzliche C-Quellen mit ~20% β-Galaktosidase Aktivität eine

fünffach verringerte Expression von actA’::’lacZ im Vergleich zum WT ohne zusätzliche C-

ERGEBNISSE

- 83 -

Quellen auf. In Anwesenheit von Glukose bzw. Cellobiose kommt es bei WH650 mit 50% β-

Galaktosidase Aktivität zur Derepression der actA’::’lacZ Fusion.

In der Stationärphase führt der Zusatz von geringen PrfA Mengen beim WT zu Glukose

vermittelter Repression der actA’::’lacZ Fusion, aber zu erhöhter Aktivierung mit Cellobiose.

In der ptsH1 Mutante sind diese Effekte nicht mehr zu verzeichnen. Die ptsH Mutante zeigt

eine fünffach verringerte β-Galaktosidase Aktivität ohne C-Quellen, was sich durch die

Zugabe von Glukose bzw. Cellobiose nicht verändert. Folglich ist der Cellobioseeffekt

wuchsphasenabhängig, während der Glukoseeffekt unabhängig von der Wachstumsphase

zu beobachten ist.

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

2454

028

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100

- +G +C - +G +C - +G +C WT ∆ptsH ptsH1

WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400


WH621 WH650 WH653


A B

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

2454

028

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100


WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400


WH621 WH650 WH653


WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

2454

028

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100


WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400


WH621 WH650 WH653


WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

2454

028

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100


WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + CM1 M

Z

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400


WH621 WH650 WH653


A B

WT

WT + G

WT + C

M1 MZ

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100


WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + C

M1 MZ

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

50

100

150

200


WH621 WH650 WH653

C D

WT

WT + G

WT + C

M1 MZ

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20406080

100


WH621 WH650 WH653

WT

WT + G

WT + C

M1 MZ

M1 + G

M1 + C

M2 H

M2 + G

M2 + C

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

50

100

150

200


WH621 WH650 WH653

C D

Abb. 4.34: Einfluss der ptsH Deletion bzw. ptsH1 Mutation auf die actA’::’lacZ Expression mit unterschiedlichen PrfA Konzentrationen in verschiedenen Wuchsphasen Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden jeweils auf den WT WH621 (actA’::’lacZ) ohne C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messung wurde reproduziert. WH621, WH650 (∆ptsH) oder WH653 (ptsH1) transformiert mit pWH1017 (- prfA; weiße Balken) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA; schwarze Balken) wurden in LB-Medium ohne („-“), mit Glukose (+ G) oder mit Cellobiose (+ C) angezogen. Die actA’::’lacZ Fusion von WH621, WH650 und WH653 ist schematisch über den Graphen gezeigt. A: logarithmische Phase, geringe PrfA Konzentrationen (- atc); B: Stationärphase, geringe PrfA Konzentrationen; C: logarithmische Phase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc); D: Stationärphase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc)

ERGEBNISSE

- 84 -

Mit hohen PrfA Konzentrationen besteht in der logarithmischen Wachstumsphase kein

signifikanter Unterschied zwischen dem WT und der ptsH1 Mutante. Die ptsH

Deletionsmutante zeigt 50% der WT β-Galaktosidase Aktivität, unabhängig von der

Anwesenheit zusätzlicher C-Quellen. In der stationären Phase zeigt der WT mit hohen PrfA

Konzentrationen keine Glukose vermittelte Repression, aber eine zweifach erhöhte

Cellobiose vermittelte Aktivierung von actA. Im Gegensatz dazu weist die ptsH1 Mutante

keine erhöhte Aktivierung der actA’::’lacZ Fusion mit Cellobiose auf. Bei der ptsH Deletions-

mutante zeigt sich mit und ohne Glukose oder Cellobiose nur noch ~20% der WT β-

Galaktosidase Aktivität. Folglich wird die maximale Aktivierung der actA’::’lacZ Fusion durch

die ptsH Deletion aufgehoben.

Des Weiteren zeigen sich durch die ptsH Deletion bzw. die ptsH1 Mutation gleiche Effekte

bezüglich der Expression der actA, hly bzw. plcA’::’lacZ Fusionen (vgl. Anhang, Tab. 7.1).

Daher beeinflussen sowohl die ptsH1 Mutation als auch die ptsH Deletion die PrfA Aktivität

mit geringer PrfA Dosis in beiden Wachstumsphasen. Dies deutet auf eine (in)direkte

Beteiligung von HPr, HPr-His15-P bzw. HPr-Ser46-P an der PrfA vermittelten

Virulenzgenrepression in Anwesenheit von C-Quellen hin.

4.2.4.4 Einfluss der crh Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression

Da die Deletion von ptsH und die ptsH1 Mutation bereits einen Effekt auf die PrfA abhängige

Virulenzgenexpression gezeigt haben, wurde zunächst bestimmt, ob auch die Deletion von

crh deren Regulation beeinflusst, obwohl crh in L. monocytogenes nicht vorhanden ist (Prof.

Dr. W. Goebel, persönliche Mitteilung). Deshalb wurden crh Deletionsmutanten mit actA’, hly’

bzw. plcA’::’lacZ Fusionen konstruiert. Als Ausgangsstamm diente QB7096 (Galinier et al.,

1997), in welchem crh deletiert ist. Zur Integration der Promotor-lacZ Fusionen in den amyE-

Lokus von QB7096, wurde dieser mit pWH892 (actA’::’lacZ), pWH893 (hly’::’lacZ) bzw.

pWH894 (plcA’::’lacZ) transformiert, welche zuvor mittels ScaI linearisiert wurden. Die

Überprüfung der korrekten Integration erfolgte durch Selektion auf die erworbene

Chloramphenicolresistenz, α-Amylaseinaktivitätstests, genomischer PCR Analyse und

Sequenzierung. Die resultierenden Stämme wurden WH627 (∆crh; actA’::’lacZ), WH628

(∆crh; hly’::’lacZ) und WH629 (∆crh; plcA’::’lacZ) genannt. Letztere wurden mit pWH1017 (-

prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert, deren Anwesenheit mittels PCR Analyse

unter Verwendung der Oligonukleotide pUP19 und pRev19 bestätigt wurde.

Sodann wurden β-Galaktosidase Aktivitätsbestimmungen in der logarithmischen und

stationären Wachstumsphase durchgeführt. Hierfür wurden der WT und die crh

ERGEBNISSE

- 85 -

Deletionsmutante in LB-Medium mit und ohne Glukose angezogen. Die Ergebnisse sind in

Tab. 4.10 zusammengefasst. Alle crh Deletionsmutanten weisen in beiden Wachstums-

phasen unabhängig von der PrfA Dosis in vivo Aktivitäten wie der WT bezüglich der

actA::’lacZ Expression auf. Es zeigt sich beim WT und der Mutante mit niedriger PrfA Dosis

Glukose vermittelte Repression in beiden Wuchsphasen. Mit hohen PrfA Konzentrationen

kommt es zu keiner Glukose vermittelten Repression der actA’::’lacZ Fusion.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Charakterisierung des Einflusses der crh Deletion auf

die PrfA abhängige hly’ bzw. plcA’::’lacZ Expression erhalten (vgl. Anhang, Tab 7.1). Daher

kann eine Beteiligung von Crh an der PrfA vermittelten actA Expression ausgeschlossen

werden.

Tab. 4.10: Einfluss der crh Deletion auf die PrfA abhängige actA’::’lacZ Expression

β-Galaktosidase Aktivität [Miller Units]

actA’::’lacZ Glukose pWH1017

(- prfA) - atc

pWH1018 (Pxyl/tet-prfA)

- atc

pWH1017 (- prfA)

+ 0,07 µM atc


+ 0,07 µM atc WH621 (WT) log-Phase Stationärphase

- -

0,91 ± 0,21

2,9 ± 0,2

61 ± 3 100 ± 8

0,34 ± 0,07 1,80 ± 0,01

760 ± 72 1300 ± 78

WH621 (WT) log-Phase Stationärphase

+ +

0,32 ± 0,01 0,38 ± 0,04

11 ± 1 15 ± 2

0,24 ± 0,08 0,65 ± 0,03

540 ± 31 880 ± 24

WH627 (∆crh) log-Phase Stationärphase

- -

0,89 ± 0,02

2,3 ± 0,1

65 ± 5 95 ± 4

0,41 ± 0,02 1,72 ± 0,02

780 ± 30 1200 ± 80


+ +

0,79 ± 0,02

2,7 ± 0,1

14 ± 1 13 ± 1

0,26 ± 0,09 0,61 ± 0,01

560 ± 40 950 ± 80


4.2.4.5 Einfluss der ptsG Deletion auf die PrfA abhängige Virulenzgenexpression

Als nächstes wurde der Einfluss einer ptsG Deletion auf die PrfA Aktivität bestimmt. ptsG

kodiert in B. subtilis für EII, welches aus den drei Domänen C, B und A besteht. Die hier

verwendete Mutante QB5435 (Stülke et al., 1997) exprimiert funktionales EIIC und EIIB, aber

kein EIIA. QB5435 wurde mit pWH1332 (actA’::’lacZ, aphA3), pWH1333 (hly’::’lacZ, aphA3)

bzw. pWH1334 (plcA’::’lacZ, aphA3) transformiert, welche zuvor mittels ScaI linearisiert

wurden. Dadurch wurden die Promotor-lacZ Fusionen in den amyE-Lokus von QB5435

integriert, was mittels Selektion auf die erworbene Kanamycinresistenz, α-Amylase-

ERGEBNISSE

- 86 -

inaktivitätstests, PCR Analysen und Sequenzierung überprüft wurde. Die resultierenden

Stämme wurden WH596 (∆ptsG; actA’::’lacZ, aphA3), WH597 (∆ptsG; hly’::’lacZ, aphA3)

bzw. WH598 (∆ptsG; plcA’::’lacZ, aphA3) genannt. Letztere wurden jeweils mit pWH1017 (-

prfA) bzw. pWH1018 (Pxyl/tet-prfA) transformiert, wobei deren Anwesenheit mittels PCR

Analyse unter Verwendung der Oligonukleotide pUP19 und pRev19 bestätigt wurde.

Anschließend wurden alle Stämme in LB-Medium mit und ohne Glukose in Anwesenheit von

hohen und niedrigen PrfA Konzentrationen angezogen und die in vivo Aktivität in der

logarithmischen und stationären Wachstumsphase bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abb.

4.35 dargestellt.


WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G - + G WT (WH621) ∆ptsG (WH596)

A

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400B

- + G - + G WT (WH621) ∆ptsG (WH596)


WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G - + G WT (WH621) ∆ptsG (WH596)

A

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

100

200

300

400B

- + G - + G WT (WH621) ∆ptsG (WH596)

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G - + GWT (WH621) ∆ptsG (WH596)

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

4060

80

100

- + G - + GWT (WH621) ∆ptsG (WH596)

C D

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

40

60

80

100

- + G - + GWT (WH621) ∆ptsG (WH596)

WT

WT + G

M3 C

M3 + G

β-G

al A

ktiv

ität [

%]

02

20

4060

80

100

- + G - + GWT (WH621) ∆ptsG (WH596)

C D

Abb. 4.35: Einfluss der ptsG Deletion auf die actA’::’lacZ Expression mit unterschiedlichen PrfA Konzentrationen in verschiedenen Wuchsphasen Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden jeweils auf den WT WH621 (actA’::’lacZ) ohne C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messung wurde reproduziert. WH621 oder WH596 (∆ptsG) transformiert mit pWH1017 (- prfA; weiße Balken) oder pWH1018 (Pxyl/tet-prfA; schwarze Balken) wurden in LB-Medium ohne („-“) bzw. mit Glukose (+ G) angezogen. Die actA’::’lacZ Fusion von WH621 und WH596 ist schematisch über den Graphen gezeigt. A: logarithmische Phase, geringe PrfA Konzentrationen (- atc); B: Stationärphase, geringe PrfA Konzentrationen; C: logarithmische Phase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc); D: Stationärphase, hohe PrfA Konzentrationen (+ 0,07 µM atc)

ERGEBNISSE

- 87 -

In der logarithmischen Phase zeigt der WT WH621 mit geringer PrfA Dosis Glukose

vermittelte Repression der actA’::’lacZ Fusion. Im Gegensatz dazu kommt es in der Mutante,

welche kein funktionales EIIA exprimiert, zur Derepression von actA in Anwesenheit von

Glukose. Folglich beeinflusst die ptsG Deletion die PrfA abhängige actA Expression.

In der Stationärphase spiegelt sich beim WT mit geringen PrfA Konzentrationen das gleiche

Bild wie in der logarithmischen Phase wieder. Die ptsG Deletionsmutante zeigt wiederum

aufgehobene Glukose vermittelte Repression. Mit hohen PrfA Konzentrationen besteht

zwischen letzteren Stämmen in beiden Wachstumsphasen kein signifikanter Unterschied, da

beide keine Repression der actA’::’lacZ Fusion durch Glukose aufweisen. Folglich ist der

Effekt der ptsG Deletion auf die PrfA abhängige actA Expression abhängig von der PrfA

Konzentration, aber nicht von der Wuchsphase.

Des Weiteren zeigt die ptsG Deletion den gleichen Effekt bezüglich der Expression der hly

bzw. plcA’::’lacZ Fusion (vgl. Anhang, Tab. 7.1). Daher deuten die Ergebnisse auf eine

(in)direkte Rolle von EIIA an der durch C-Quellen vermittelten PrfA abhängigen

Virulenzgenrepression hin. 4.2.4.6 Vergleich der PrfA Expression in KKR und PTS defizienten

Mutanten mit dem Wildtyp Um zu überprüfen, ob PrfA in allen neu konstruierten Stämmen auf gleichem Niveau

exprimiert wird, wurden Immunoblots durchgeführt. Hierfür wurden alle Stämme in LB-

Medium angezogen und Proben in der logarithmischen Wachstumsphase gezogen. Als

Kontrollen wurden aufgereinigtes PrfA und der WT WH621/pWH1017 (- prfA) verwendet. Die

weitere Durchführung erfolgte gemäß Kap. 3.5.10. Der Immunoblot in Abb. 4.36 zeigt, dass

keine gravierenden Unterschiede bezüglich der PrfA Expression in den Mutantenstämmen

im Vergleich zum WT vorliegen. Deshalb können die unterschiedlichen β-Galaktosidase

Aktivitäten nicht auf verschiedene PrfA Expressionsniveaus zurückgeführt werden.

PrfA - +

(WH

621)

WT

WH

653

(pts

H1)

WH

650

(∆pt

sH)

WH

627

(∆cr

h)

WH

596

(∆pt

sG)

WH

633

(∆cc

pA)

PrfA - +

(WH

621)

WT

PrfA - +

(WH

621)

WT

WH

653

(pts

H1)

WH

650

(∆pt

sH)

WH

627

(∆cr

h)

WH

596

(∆pt

sG)

WH

633

(∆cc

pA)

Abb. 4.36: PrfA Expression verschiedener Mutanten im Vergleich zum WT Die Abb. zeigt den Immunoblot von 0,1 oD600 Äquivalenten Proteinrohextrakt der über den Spuren angegebenen Stämme. 200 ng aufgereinigtes PrfA in Spur 1 diente als Kontrolle. WH621 wurde entweder mit pWH1017 (- prfA; Spur 2) oder mit pWH1018 (Pxyl/tet-prfA; Spur 3) transformiert. Alle Mutanten-stämme wurden mit pWH1018 transformiert.

DISKUSSION

- 88 -

5. Diskussion

5.1 Der Transkriptionsregulator CcpA - ein Multistratege mit Raffinesse

Laut globaler Analysen stehen nahezu 10% aller Gene in B. subtilis unter Kontrolle von CcpA

(Blencke et al., 2003; Lorca et al., 2005; Lulko et al., 2007; Moreno et al., 2001; Yoshida et

al., 2001). Einige dieser Gene und Operons werden durch CcpA reprimiert (gntR, xynP)

(Galinier et al., 1999; Miwa et al., 1997) oder aktiviert (ackA) (Henkin, 1996), andere werden

indirekt durch CcpA reguliert (alsS) (Renna et al., 1993). CcpA verwendet dabei nicht nur

verschiedene Korepressoren und niedermolekulare Effektoren, sondern interagiert auch mit

Komponenten der Transkriptionsmaschinerie und erkennt unterschiedliche DNA Bindemotive

(Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000). Eine derartige Vielfalt wurde bisher für

keinen anderen bakteriellen Regulator demonstriert. Insbesondere die Aufklärung der CcpA-

HPr-Ser46-P-cre (opt.), CcpA-Crh-Ser46-P-cre (opt.), ΔCcpA-HPr-Ser46-P-FBP und ΔCcpA-

HPr-Ser46-P-G6P Strukturen aus B. megaterium hat zum Verständnis der CcpA Regulation

beigetragen (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006; Schumacher et al., 2007).

Auch die intensive in vivo und in vitro Analyse von CcpA Mutanten aus B. megaterium und

B. subtilis lieferte Hinweise über die unterschiedlichen Rollen von CcpA (Diel, 2005;

Horstmann, 2006; Kraus et al., 1998; Küster-Schöck et al., 1999; Küster et al., 1999; Seidel,

2005; Turinsky et al., 2000; Wagner, 2002; Wolf, 2005).

In dieser Arbeit wurden zunächst die in vivo Expressionssysteme zur Charakterisierung von

CcpA Mutanten erfolgreich vervollständigt. Anschließend wurden die Auswirkungen von

Mutationen in unterschiedlichen Domänen von CcpA auf die Regulation verschiedener Gene

bestimmt. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass Mutationen in

CcpA differenzielle Wirkung erzielen. In den nächsten Kapiteln werden die unterschiedlichen

Phänotypen von CcpA näher betrachtet.

5.1.1 CcpA Mutanten mit Deregulation von gntR, ackA und alsS

Die CcpA Mutanten A300W, A302W, L306W und K308W zeigen keine Regulation von gntR,

ackA, alsS (Abschnitt 4.1.2.1) bzw. xynP (Diel, 2005), obwohl alle CcpA Varianten auf

ähnlichem Niveau im Vergleich zu episomal kodiertem WT CcpA exprimiert werden

(Abschnitt 4.1.3). Dabei sind die Aminosäurenreste A300, A302, L306 und K308 in α-Helix IX

der NSD des Proteinkerns lokalisiert (Abb. 5.1) (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al.,

2006). Die α-Helices I und IX von CcpA vermitteln die Interaktion mit den Korepressoren

HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Da

DISKUSSION

- 89 -

CcpA der einzige Regulator der LacI/GalR-Familie ist, welcher ein Protein als

Interaktionspartner benötigt, ist die α-Helix IX CcpA spezifisch konserviert (Kraus et al.,

1998; Schumacher et al., 2004). Für die Interaktion von CcpA mit den Korepressoren sind

sowohl ionische als auch hydrophobe Bindungen notwendig (Schumacher et al., 2004;

Schumacher et al., 2006). Die α-Helix IX weist mit Y296, A300, A302 und L305 hydrophobe

Aminosäurenreste auf, welche mit den HPr-Ser46-P Resten I47, M48 und M51 in

Wechselwirkung treten (Schumacher et al., 2004). Die immense Bedeutung des Restes

A300 wird daraus ersichtlich, dass der Austausch A300W zum Verlust der Regulation von

gntR, ackA, und alsS führt (Abschnitt 4.1.2.1). Auch die Austausche A300W und A300E

zeigen eine Aufhebung der KKR von xynP (Diel, 2005; Wagner, 2002). Des Weiteren kommt

es durch den in B. megaterium homologen Aminosäureaustausch A299E zu reduzierter KKR

von xylA und eingeschränkter HPr-Ser46-P Bindung in vitro (Kraus et al., 1998). Folglich

kann dieser Phänotyp auf eine verminderte HPr-Ser46-P Bindung zurückgeführt werden.

HPr-Ser46-PHPr-Ser46-P

CcpA CcpA

cre DNA


CcpA CcpA

cre DNA

HPr

CcpAα-Helix I

α-Helix IX K308 S46-P

A300

A302

L306

HPr

CcpAα-Helix I


A300

A302

L306

HPr

CcpAα-Helix I


A300

A302

L306

Abb. 5.1: Lokalisation und Bedeutung von CcpA A300, A302, L306 und K308 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex A Lokalisation von CcpA A300, A302, L306 und K308 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex (Schumacher et al., 2004). Die CcpA Monomere sind in grau und blau, HPr-Ser46-P in türkis und grün und die cre DNA in hellgrau dargestellt. Die Aminosäuren A300, A302, L306 und K308 (α-Helix IX) sind rot hervorgehoben. Die angegeben Positionen beziehen sich auf CcpA in B. subtilis. B Bedeutung von CcpA A300, A302, L306 und K308 bei der HPr-Ser46-P Bindung. Die Abb. zeigt einen Ausschnitt aus der HPr-Ser46-P Binderegion. CcpA α-Helix I ist in lila und α-Helix IX in grau hervorgehoben. Die Aminosäuren A300, A302, L306 und K308 sind als Stäbchenmodell in rot und S46-P in gelb gezeigt. Alle Positionen sind sensitiv gegenüber Tryptophan Austauschen, sind aber nicht direkt in den allosterischen Schaltmechanismus involviert.

Durch die CcpA Variante K308W kommt es zum kompletten Verlust der Regulation von

gntR, ackA, alsS (Abschnitt 4.1.2.1) bzw. xynP (Diel, 2005). Ionische Wechselwirkungen

A B

DISKUSSION

- 90 -

zwischen CcpA und den Korepressoren werden durch die Aminosäurenreste R304 und K308

der α-Helix IX vermittelt. Dabei bildet die Aminogruppe von K308 eine Wasserstoffbrücke zu

einem Sauerstoffatom der Phosphorylgruppe von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P, während

R304 die anderen beiden Sauerstoffatome kontaktiert (Schumacher et al., 2004;

Schumacher et al., 2006). Durch das Einführen des sperrigen Tryptophanrestes an Position

308 ist die Ausbildung der Wasserstoffbrücke zu HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P aufgrund

von sterischer Behinderung nicht mehr möglich. Auch die CcpA Varianten A302W und

L306W weisen keine Regulation von ackA, alsS, gntR (Abschnitt 4.1.2.1) bzw. xynP (Diel,

2005) auf. Dabei sind die Seitenketten von A302 und L306 ins Proteininnere gerichtet. Eine

mögliche Ursache für diesen Phänotyp, könnte daher die Destabilisierung der α-Helix IX oder

eine sterische Behinderung der Korepressor Bindung sein. Obwohl sich die Aminosäuren

A300, A302, L306 und K308 in der Korepressor Binderegion befinden (Abb. 5.1), sind sie

nicht in den allosterischen Schaltmechanismus (Schumacher et al., 2004) verwickelt. Da

diese vier Austausche aber auch zum Verlust der Glukose abhängigen Aktivierung von ackA

führen (Abschnitt 4.1.2.1), scheint für diese folglich auch die Beteiligung eines

Interaktionspartners notwendig zu sein. Eine Möglichkeit wäre die Interaktion mit den

bekannten Korepressoren HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P. Auch in vivo ist die Aktivierung

von ackA in einer ptsH1/crh Doppelmutante beeinträchtigt, während die Einzelmutanten

keinen Effekt zeigen (Turinsky et al., 1998). Allerdings konnte in vitro keine durch HPr-Ser46-

P verstärkte Bindung von CcpA an die ackA cre2 festgestellt werden (Turinsky et al., 1998).

Daher wird die mögliche Beteiligung der Korepressoren derzeitig kontrovers diskutiert.

Andererseits könnte auch ein weiterer Kofaktor die HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P

Interaktion mit CcpA verändern oder anstelle dieser in der HPr-Ser46-P Binderegion binden.

Diese Möglichkeit wird in Abschnitt 5.1.3 diskutiert.

5.1.2 CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger Regulation

In B. subtilis existieren zwei Gruppen von CcpA Mutanten mit Glukose unabhängiger

Regulation (Abschnitt 4.1.2.2). Die CcpA Varianten Y90W und M303W der ersten Gruppe

weisen Glukose unabhängige Repression von xynP (Diel, 2005) auf, aber Glukose

abhängige Aktivierung von ackA (Abschnitt 4.1.2.2). Im Gegensatz dazu kommt es durch die

Varianten D276A und T307W der anderen Gruppe zu Glukose unabhängiger Regulation von

xynP (Diel, 2005; Seidel, 2005) und ackA (Abschnitt 4.1.2.2).

Glukose unabhängige Regulation ist auf die DNA Bindung durch die entsprechende CcpA

Mutante in Abwesenheit eines Kofaktors wie z. B. HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P

zurückzuführen (Küster-Schöck et al., 1999). Das bedeutet, dass die Mutation entweder die

DISKUSSION

- 91 -

Ausbildung der DNA ungebundenen Konformation verhindert oder die DNA bindende

Konformation stabilisiert. Glukose unabhängige Repression kann durch verschiedene

Austausche in unterschiedlichen Domänen von CcpA erzielt werden. Daher sind alle

Aminosäuren, welche durch einen Aminosäurenaustausch zu Glukose unabhängiger

Repression führen, weit über die Proteinstruktur verteilt. Zu diesen gehören auch die CcpA

Varianten (B. megaterium) E77L (Effektorbindespalt), I227V (CSD), D275G

(Effektorbindespalt), M282V (CSD) und T306I (Korepressor Binderegion) (Küster-Schöck et

al., 1999).

Y90 und M303 beeinflussen Aminosäuren in der Korepressor Binderegion, welche in den

allosterischen Schaltmechanismus involviert sind. Y90 unterstützt durch den Kontakt zu

R304 die Interaktion mit HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P (Schumacher et al., 2004;

Schumacher et al., 2006). Dagegen befindet sich die Seitenkette von M303 in unmittelbarer

Nähe zu T62, welche die Ausbildung der Scharnierhelices und die cre Erkennung nach der

Korepressor Bindung ermöglicht.

Die Aminosäure D276 ist in der Effektorbindetasche lokalisiert und bildet Kontakte zu den

niedermolekularen Faktoren FBP bzw. G6P aus (Schumacher et al., 2007). CcpA D276A

bindet bereits in Abwesenheit von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P stärker an die xylA cre als

WT CcpA. Die Bindung kann durch die Zugabe der Korepressoren und FBP nochmals

verstärkt werden (Seidel, 2005). Es scheint, dass Glukose unabhängige Regulation von xynP

durch CcpA D276A die Folge eines Konformationsunterschiedes ist, der durch diese

Mutation verursacht wird, und nicht durch die Bindung eines niedermolekularen Effektors.

Auch der Aminosäureaustausch D275G an der homologen Position in B. megaterium CcpA

zeigt Glukose unabhängige Repression von xylA (Küster-Schöck et al., 1999).

T307 bildet in der DNA ungebundenden Konformation eine Wasserstoffbrücke zu Y92,

welche aber durch die Interaktion von CcpA mit HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P verloren

geht (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Die strukturelle Ursache der

Konstitutivität der CcpA Mutante T307W könnte daher auf die Verhinderung zur Ausbildung

der DNA ungebundenen Konformation zurückzuführen sein. Das Einfrieren der DNA

bindenden Konformation von CcpA T307W könnte somit die Glukose unabhängige

Regulation als Folge der cre Bindung in Abwesenheit von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P

erklären. Auch der an der homologen Position von B. megaterium eingeführte

Aminosäurenaustausch T306I führt zu Glukose unabhängiger Repression von xylA und zur

xylA cre Bindung in Abwesenheit der Korepressoren (Küster-Schöck et al., 1999). Nach der

Randomisierung der Aminosäure Y92 in CcpA aus B. subtilis zeigen einige Mutanten eine

drastische Beeinflussung der Regulation von xynP bzw. ackA (Wolf, 2005), was somit die

Bedeutung von Y92 am allosterischen Schaltmechanismus unterstreicht.

DISKUSSION

- 92 -

Eine Verbindung zwischen diesen Mutationen könnte daher der Koeffektor spezifische Effekt

der niedermolekularen Effektoren G6P und FBP sein.

5.1.3 CcpA Mutanten mit Verlust der Regulation von gntR, xynP und alsS, aber Aktivierung von ackA

Im Gegensatz zu den CcpA Mutanten mit Regulationsverlust von xynP, gntR, ackA und alsS,

existieren auch CcpA Varianten mit differenziellen Aktivitäten. Zu diesen gehören die CcpA

Mutanten R54W, V301W und R304W, welche ackA nahezu vollständig aktivieren, aber keine

KKR von alsS, gntR (Abschnitt 4.1.2.3) bzw. xynP zeigen (Diel, 2005; Seidel, 2005). Die

Aminosäurenreste R54, V301 und R304 befinden sich in unterschiedlichen Domänen von

CcpA, sind aber alle in den allosterischen Schaltmechanismus involviert (Abb. 5.2)

(Schumacher et al., 2004).


CcpA CcpA

cre DNA

R54

V301

R304HPr-Ser46-PHPr-Ser46-P

CcpA CcpA

cre DNA

R54

V301

R304

K308

R304

S46-P

HPr

α-Helix IX

CcpA

V301

A300

A302

L306

K308

R304

S46-P

HPr

α-Helix IX

CcpA

V301

A300

A302

L306

Abb. 5.2: Lokalisation und Bedeutung von CcpA R54, V301 und R304 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex A Lokalisation von CcpA R54, V301 und R304 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex (Schumacher et al., 2004). Die CcpA Monomere sind in grau und blau, HPr-Ser46-P in türkis und grün und die cre DNA in hellgrau dargestellt. Die Aminosäuren R54 (Scharnierhelix), V301 und R304 (HPr-Ser46-P Binderegion) sind rot hervorgehoben. Die angegeben Positionen beziehen sich auf CcpA in B. subtilis. B Bedeutung von CcpA V301 und R304 bei der HPr-Ser46-P Bindung. Die Abb. zeigt einen Ausschnitt aus der HPr-Ser46-P Binderegion, wobei HPr in grün und CcpA α-Helix IX in blau dargestellt ist. Aminosäuren sind als Stäbchenmodell gezeigt. Rote Aminosäurenreste sind im Gegensatz zu grauen Aminosäurenresten sensitiv gegenüber Tryptophan Austauschen bezüglich der Aktivierung von ackA.

A B

DISKUSSION

- 93 -

5.1.3.1 Glukose vermittelte Aktivierung von ackA

R54 ist in der Scharnierhelix lokalisiert, welche nur in der DNA bindenden Konformation

ausgebildet ist (Schumacher et al., 2004). Alle Aminosäurenreste der Scharnierhelix, welche

Kontakte zur cre Sequenz ausbilden, spielen eine wichtige Rolle für die Regulation von xynP

(Seidel, 2005). Dabei ist R54 die einzige Aminosäure, welche Asymmetrie in der Struktur

zeigt (Abb. 4.1B). Die Seitenkette von R54 bildet eine Wasserstoffbrücke zur cre Sequenz,

aber nicht zu T62, der Schlüsselposition im allosterischen Schaltmechanismus. Allerdings

besteht zwischen der Seitenkette von R54’ und T62 ein direkter Kontakt, aber nicht zur DNA.

Durch die CcpA Mutante T62P kommt es zum Verlust der KKR von xynP (Seidel, 2005), da

durch den Austausch die DNA bindende Konformation gestört wird. Der Kontakt zwischen

T62 und R54 ist somit für die Orientierung der DBDs im allosterischen Schaltmechanismus

wichtig. Der Aminosäurerest V301 befindet sich dagegen in α-Helix IX und stabilisiert die

Interaktion mit den Korepressoren durch hydrophobe Bindungen und den Kontakt zum

Rückgrad von R304 (Schumacher et al., 2004). R304 bildet zwei Wasserstoffbrücken zu

zwei Sauerstoffatomen der Phosphorylgruppe von HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P

(Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Die Rotation der R304 Seitenkette ist

essentiell für den allosterischen Schaltmechanismus, da durch die Veränderung der Position

von Y90 die anderen darin verwickelten Aminosäurenreste Y92, T307 und T62 in die DNA

bindende Konformation gelangen (Schumacher et al., 2004). Diese Positionen sind daher

auch sensitiv gegenüber Mutationen und zeigen eine drastische Beeinflussung der

Repression von xynP bzw. gntR (Abschnitt 4.1.2.3) (Diel, 2005; Seidel, 2005; Wolf, 2005).

Auch die CcpA Mutante R304D weist einen Verlust der KKR von xynP auf (Wagner, 2002).

In CcpA aus B. megaterium kommt es durch den entsprechenden Austausch R303D zur

Aufhebung der KKR von xylA und zur Verhinderung der HPr-Ser46-P Bindung in vitro (Kraus

et al., 1998).

Da die Aminosäuren V301 und R304 in die lokalen Strukturveränderungen involviert sind,

welche durch die HPr-Ser46-P Bindung ausgelöst werden, besteht ein Unterschied zu den

daran nicht beteiligten Positionen A300, A302, L306 und K308. Folglich zeigen die

differenziellen Aktivitäten dieser CcpA Varianten, dass diese Gene mittels unterschiedlicher

Mechanismen reguliert werden. Dabei sind strukturelle Veränderungen durch die CcpA-R304

Interaktion mit einem weiteren Kofaktor für die Regulation von xynP, gntR und alsS wichtiger

als für die von ackA. Im Gegensatz dazu ist die Bindung von CcpA-K308 mit einem Kofaktor

für die Regulation aller vier Gene von Bedeutung.

Weitere Hinweise auf unterschiedliche Mechanismen liefern Mutationsanalysen der

Scharnierhelix. Die CcpA Mutanten V52W und G55W zeigen wie R54W Glukose abhängige

Aktivierung von ackA (Abschnitt 4.1.2.3), aber Derepression von xynP (Seidel, 2005). Im

DISKUSSION

- 94 -

Gegensatz dazu weist die CcpA Mutante L56W keine Glukose abhängige Aktivierung von

ackA auf (Seidel, 2005). Deshalb ist die Ausbildung der Scharnierhelices für die Regulation

von ackA ebenso von Bedeutung, aber wie die Bindung der Korepressoren, andersartig

ausgeprägt.

Des Weiteren wurden neben R54W, G55W, V301W und R304W auch die CcpA Mutanten

A18V und R48C gefunden, welche keine Glukose abhängige Aktivierung von alsS zeigen,

aber Regulation von ackA (Turinsky et al., 2000). Sowohl A18 als auch R48 befinden sich in

der DBD und sind in den allosterischen Schaltmechanismus involviert (Schumacher et al.,

2004). Die Aminosäure A18 liegt in α-Helix 2 des HTH der DBD und bildet in der Struktur

unterschiedliche Kontakte zur cre Sequenz (A18-Thy4’ bzw. A18’-Ade12) (Schumacher et

al., 2004). Daher ist A18 am Ende der Kette des allosterischen Schaltmechanismus in die

DNA Bindung involviert. Die Aminosäure R48 ist zwischen α-Helix 3 und der Scharnierhelix

lokalisiert und spielt durch die Stabilisierung der DNA bindenden Konformation eine ebenfalls

wichtige Rolle im allosterischen Schaltmechanismus (Schumacher et al., 2004). Dies wird

durch den Austausch an der dazu homologen Position in B. megaterium R47S durch den

Verlust zur KKR von xylA, keine DNA Bindung und abgeschwächte HPr-Ser46-P Bindung in

vitro verdeutlicht (Kraus et al., 1998). Das zeigt, dass neben der Korepressor Bindung und

der Ausbildung der Scharnierhelices auch die Formation der DBD für die Aktivierung von

ackA andersartig ausgeprägt ist.

Die differenziellen Aktivitäten der in diesem Abschnitt erläuterten Mutanten A18T, R48C,

R54W, R55W, V301W und R304W zeigen, dass die Aktivierung von ackA nicht vom

bekannten allosterischen Schaltmechanismus abhängig ist. Die Ergebnisse weisen auf

multiple Schaltmechanismen im Zuge verschiedener Signaltransduktionswege hin. Das

könnte auf die unterschiedlichen Regulationsmodi von CcpA zurückzuführen sein, die im

nächsten Abschnitt behandelt werden.

5.1.3.2 Differenzielle Regulation als Folge unterschiedlicher Wirkmodi von CcpA

Für die unterschiedlichen Regulationsmodi von CcpA ist vor allem die Lage der cre

Sequenzen bezüglich des Transkriptionsstartes verantwortlich (Collado-Vides et al., 1991).

Im B. subtilis Genom wurden die cre Sequenzen an unterschiedlichen Positionen gefunden

(Hueck et al., 1994; Miwa et al., 2000; Weickert and Chambliss, 1990). Zum einen liegen die

cre Elemente bei der Aktivierung durch CcpA stromaufwärts des Promotors (ackA) (Henkin,

1996; Presecan-Siedel et al., 1999). Andererseits sind die cre Elemente auch im

DISKUSSION

- 95 -

Promotorbereich oder in der kodierenden Region des Genes oder Operons lokalisiert, was

zur Repression durch CcpA führt (Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000).

Derzeit werden für CcpA kontrollierte Gene unterschiedliche Regulationsmodelle diskutiert.

Einige bekannte Repressoren blockieren die Bindung der RNAP an den Promotor, indem

dieser mit dem Operator überlappt (Bertrand-Burggraf et al., 1987; Hawley et al., 1985; Lloyd

et al., 2001; Schlax et al., 1995). Im Gegensatz dazu erlauben andere Regulatoren die

Bindung der RNAP an den Promotor, verhindern aber spätere Schritte der Transkription

durch die Interaktion mit einer Untereinheit der RNAP (Choy and Adhya, 1996; Monsalve et

al., 1996; Williams et al., 1993). Beispielsweise ist im amyE Promotor die cre Sequenz an

Position +4.5 lokalisiert, wodurch CcpA die Bindung der RNAP an den Promotor zulässt.

Daher wird postuliert, dass die Repression von amyE die Interaktion von CcpA mit der σ-

Untereinheit der RNAP erfordert (Kim et al., 2005). Das wird dadurch gestützt, dass eine

nicht-integrale Insertion von 1,5 bzw. 2,5 Helixwindungen zwischen dem amyE Promotor und

der amyE cre zum Verlust der KKR von amyE führt (Kim et al., 2005). Im Gegensatz dazu

weist das B. subtilis ara Operon zwei cre Sequenzen auf, welche an den Positionen +60

(araA) und +2279 (araB) lokalisiert sind (Inacio et al., 2003). CcpA blockiert durch die

Bindung an die araB cre die Elongation der Transkription des ara Operons (Inacio et al.,

2003). Des Weiteren wurde postuliert, dass nicht nur die Repression, sondern auch die

Aktivierung durch CcpA Kontakte zur RNAP erfordert (Kim et al., 2005). Möglicherweise

könnte die Interaktion von CcpA mit einer oder beider α-Untereinheiten der RNAP zur

Aktivierung von ackA führen. Das wird dadurch gestützt, dass die Bindung von CcpA an die

ackA cre2 von deren Position relativ zur -35 Region abhängig ist, da Insertionen in Form von

nicht-integralen Helixwindungen zum Verlust der Aktivierung von ackA führen (Turinsky et

al., 1998) (Abb. 5.3).

Die Interaktion von CcpA mit der α-CTD wurde bereits mittels SPR-Messungen demonstriert,

wobei die Bindung schwächer als die von CcpA und HPr-Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P ist (N.

Horstmann, persönliche Mitteilung). Die differenziellen Aktivitäten der CcpA Mutanten

R304W und K308W könnten daher auf die Bindung der α-CTD in der HPr-Ser46-P

Binderegion hinweisen, wodurch die Korepressoren ersetzt werden könnten. Die schwächere

Bindung der α-CTD an CcpA könnte die Ursache lediglich eines Kontaktes (CcpA-K308-α-

CTD) sein. Im Gegensatz dazu könnte R304 lediglich Wasserstoffbrückenbindungen zu HPr-

Ser46-P bzw. Crh-Ser46-P, aber nicht zur α-CTD ausbilden.

Außerdem wurde mittels Deletions- und Mutationsanalysen herausgefunden, dass die UAR

(upstream activating region) für die Aktivierung von ackA essentiell ist (Moir-Blais et al.,

2001; Turinsky et al., 1998) (Abb. 5.3). Somit könnte ein bisher unbekannter Faktor an die

UAR binden und ackA aktivieren. Bisher wurde die UAR bei allen durch CcpA aktivierten

Genen identifiziert, welche neben ackA und pta (Henkin, 1996; Presecan-Siedel et al., 1999)

DISKUSSION

- 96 -

auch die potenziell aktivierten Gene yhbI und manR (Lulko et al., 2007) einschließen. Für die

E. coli Promotoren ansB, malK und nir wurde bereits gezeigt, dass die Aktivierung der

Transkription von mehreren Proteinen abhängt (Hochschild and Dove, 1998; Richet and

Sogaard-Andersen, 1994; Scott et al., 1995).

tacaaaacctatagtgaatgtgtctgaaaataacgacttcttat tgtaagcgttatcaa tacgcaagttgacttgaaaagccgacatgacaatgtttaaat

cre2 - 35 - 10UARcre1

IIILinker

tgtaagcgttatcaa tacaaaacctatagtgaatgtgtctgaaaataacgacttcttat tgtaagcgttatcaa tacgcaagttgacttgaaaagccgacatgacaatgtttaaat

cre2 - 35 - 10UARcre1

IIILinker

tgtaagcgttatcaa

Abb. 5.3: Ausschnitt von PackA Die Abb. zeigt einen Sequenzausschnitt des ackA Promotors von der cre1 bis zur -10 Region. Bedeutende Bereiche (cre1, cre2, UAR, -35 und -10 Regionen) sind hervorgehoben. Die mit I und II gekennzeichneten Bereiche der UAR sind essentiell für eine vollständige Aktivierung von ackA. Linkerinsertionen in Form von nicht-integralen Helixwindungen zwischen der cre2 und der -35 Region führen zum Verlust der Aktivierung von ackA. Lediglich die cre2 ist für die Aktivierung von ackA notwendig. Außerdem scheint das Modell des DNA Loopings über Heterooligomerisierung (cre-CcpA-

HPr-Ser46-P-HPrSer46-P-cre) für den ackA Promotor nicht relevant zu sein. Austausche an

den dafür vermuteten Positionen in CcpA E327R, K330E bzw. K333E, die Doppelmutanten

und die Dreifachmutante beeinflussen die Regulation von gntR, xynP, alsS und ackA nicht

(Abschnitt 4.1.5) (Abb. 5.3). Daher wird davon ausgegangen, dass Heterooligomerisierung

über diese Positionen nicht erfolgt. Darüber hinaus ist für die Aktivierung von ackA lediglich

die ackA cre2 erforderlich (Turinsky et al., 1998), weshalb das Modell ohne

Heterooligomerisierung bevorzugt wird.

5.1.4 CcpA Mutanten mit eingeschränkter KKR von gntR, aber KKR von xynP, alsS und ackA

Da die CcpA Mutanten +1W, I4W, M17R, M89W und N93W eine Defizienz in der KKR von

gntR aufweisen, aber ackA, alsS (Abschnitt 4.1.2.4) bzw. xynP (Diel, 2005; Seidel, 2005)

nahezu vollständig regulieren, stellen diese eine neue Klasse von differenziell regulierenden

CcpA Varianten dar. Diesen Phänotyp zeigen lediglich Mutanten, deren Aminosäuren in der

DBD und NSD von CcpA lokalisiert sind (Abb. 5.4). Die Aminosäure I4 befindet sich im N-

Terminus von CcpA vor α-Helix 1, während M17 Teil der α-Helix 2 des HTHs ist und einen

Kontakt zur cre Sequenz bildet. Die Aminosäure M89 ist dagegen in α-Helix I der NSD

lokalisiert, weshalb sie sich in unmittelbarer Nähe zur allosterischen Position Y90 befindet,

DISKUSSION

- 97 -

aber selbst nicht in lokale Strukturänderungen involviert ist. N93 ist in der

Dimerisierungsebene der NSD von CcpA lokalisiert (Schumacher et al., 2004).


CcpA CcpA

cre DNA

M89

N93

M17I4


CcpA CcpA

cre DNA


CcpA CcpA

cre DNA

M89

N93

M17I4

Abb. 5.4: Lokalisation und Bedeutung von CcpA I4, M17, M89 und N93 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex A Lokalisation von CcpA I4, M17, M89 und N93 im CcpA-HPr-Ser46-P-cre (opt.) Komplex (Schumacher et al., 2004). Die CcpA Monomere sind in grau und blau, HPr-Ser46-P in türkis und grün und die cre DNA in hellgrau dargestellt. Die Aminosäuren I4, M17 (DBD) sowie N93 (Dimerisierungsebene) und M89 (NSD) sind rot hervorgehoben. Die angegeben Positionen beziehen sich auf CcpA in B. subtilis.

Aufgrund der Flexibilität des HTHs kann CcpA an unterschiedliche cre Sequenzen binden

(Schumacher et al., 2004) und folglich eine Vielzahl von Genen kontrollieren (Moreno et al.,

2001). Dabei weist CcpA unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen cre Elementen auf,

was auf deren variierende Basenabfolgen zurückgeführt werden kann (Kim et al., 2005).

Auch die gezielte Einführung von Basenpaarsubstitutionen in cre Sequenzen führte in vivo

zum völligen Verlust oder optimierter Regulation des katabolen Genes (Miwa et al., 1997;

Weickert and Chambliss, 1990). Footprint Analysen zeigten, dass CcpA die ackA cre2 und

die amyE cre ähnlich stark bindet (Kim et al., 1995), während die Affinität von CcpA zur

amyE cre um den Faktor 3,5-fach höher war als zur gntR credown (Kim et al., 2005). Folglich

liegt auch eine höhere Bindungsaffinität von CcpA zur ackA cre2 als zur gntR credown vor. Im

Gegensatz dazu wird die gntR creup von CcpA schlechter gebunden als die xynP cre, die

ackA cre2 oder die gntR credown (Diel, 2005), da das zentrale hochkonservierte CG-Paar der

cre Sequenz durch ein TG-Paar ersetzt ist (Miwa et al., 1997; Miwa et al., 2000). Daher

könnten die Affinitätsunterschiede von CcpA zu verschiedenen cre Elementen diese Art der

differenziellen Regulation verursachen.

DISKUSSION

- 98 -

5.2 PrfA abhängige Aktivierung der Virulenzgenexpression aus L. monocytogenes in B. subtilis

In Listeria monocytogenes wird die Expression vieler Virulenzgene wie z. B. actA, plcA, hly

und inlC durch PrfA reguliert (Chakraborty et al., 1992). Jeder Virulenzgenpromotor weist

dabei eine PrfA Box auf, an die PrfA bindet, wodurch die Transkription des Virulenzgenes

aktiviert wird (Kreft and Vázquez-Boland, 2001). Die PrfA Aktivität wird auf komplexe Weise

mittels unterschiedlicher Mechanismen auf der Ebene der Transkription und Translation

beeinflusst (Kreft and Vázquez-Boland, 2001). Unter anderem gibt es Hinweise, dass die

PrfA vermittelte Regulation der Virulenzgenexpression durch Komponenten der KKR

kontrolliert wird (Brehm et al., 1996; Milenbachs et al., 1997). Bevor in dieser Arbeit nach

möglichen Faktoren gesucht werden konnte, wurde zunächst ein System zu deren

Charakterisierung etabliert.

5.2.1 Ein System zur Untersuchung der PrfA vermittelten Aktivierung der Virulenzgenexpression in B. subtilis

L. monocytogenes und B. subtilis stehen sich phylogenetisch nahe. Die einfache

Handhabung und Konstruktion von Mutanten, das hohe Wissen über KKR sowie die

Apathogenität, machen B. subtilis zu einem interessanten Untersuchungsorganismus. Da es

möglich ist, PrfA in B. subtilis zu exprimieren und dies zur Aktivierung von hly führt, eignet

sich dieser zur heterologen Expression (Freitag et al., 1992). Daher wurden auch in dieser

Arbeit die Einflüsse auf die PrfA Aktivität in B. subtilis bestimmt. Zunächst wurden hierfür

zwei neue in vivo Expressionssysteme zur Charakterisierung der PrfA abhängigen

Virulenzgenexpression in B. subtilis etabliert (Abschnitt 4.2.1). Um Varianz zu gewährleisten,

wurden die vier Virulenzgenpromotoren plcA, hly, actA und inlC ausgewählt, welche

unterschiedliche PrfA Boxen besitzen (Kreft and Vázquez-Boland, 2001). In beiden

Systemen liegen die actA’, hly’, plcA’ und inlC’::’lacZ Fusionen im amyE-Lokus des B. subtilis

Chromosoms vor. Im Gegensatz dazu wird PrfA plasmidständig exprimiert, wobei die

Transkription von prfA entweder durch PccpA oder durch Pxyl/tet kontrolliert wird. In früheren

Studien wurde ein System zur Charakterisierung der PrfA Aktivität in B. subtilis etabliert,

welches die Virulenzgenpromotor-lacZ Fusionen ebenfalls im amyE-Lokus enthält (Sheehan

et al., 1995). Allerdings wird in diesem System die Transkription von prfA chromosomal

durch den IPTG induzierbaren Pspac kontrolliert (Sheehan et al., 1995). Immunoblots zeigen,

dass PrfA in den neu konstruierten Systemen unterschiedlich stark exprimiert wird (Abschnitt

4.2.1.8). Steht die Transkription von prfA unter Pxyl/tet Kontrolle und bleibt uninduziert, wird

DISKUSSION

- 99 -

PrfA auf sehr geringem Niveau exprimiert. Wird die Transkription von prfA dagegen durch

PccpA oder Pxyl/tet (+ atc) reguliert, wird PrfA auf hohem Niveau exprimiert. Daher ist es mit

Hilfe des Pxyl/tet Systems möglich die PrfA Menge durch den Zusatz von unterschiedlichen atc

Mengen zu variieren. Das bietet Listerien gegenüber einen großen Vorteil, da somit der

Einfluss von unterschiedlichen PrfA Konzentrationen gezielt untersucht werden kann. In

Listerien sind die zellulären PrfA Mengen sehr unterschiedlich, da die Transkription von prfA

durch mehrere Promotoren reguliert wird (Kreft and Vázquez-Boland, 2001).

β-Galaktosidase Aktivitätsmessungen zeigen, dass die PrfA vermittelte Aktivierung in beiden

Systemen u. a. vom Aufbau der PrfA Box abhängig ist, was mit Daten aus der Literatur

übereinstimmt (Sheehan et al., 1995). Dabei ist dieser Effekt unabhängig von der PrfA

Konzentration. Lediglich die Absolutwerte der β-Galaktosidase Aktivität unterscheiden sich,

wenn die Transkription von prfA durch Pxyl/tet (- atc) bzw. PccpA kontrolliert wird. Die höchste

Aktivierung wurde für PplcA erhalten, was auf die optimal aufgebaute PrfA Box zurückzuführen

ist. Auch die hly’::’lacZ Fusion wird stark durch PrfA aktiviert, wobei die PrfA unabhängige

Regulation im Vergleich zu PplcA erhöht ist. Letzteres wurde auch in Listerien beobachtet

(Mertins et al., 2007). Außerdem zeigt sich eine geringere PrfA vermittelte Aktivierung von

actA, da sich eine Mutation in der PrfA Box befindet. Im Gegensatz dazu wird PinlC wesentlich

schlechter reguliert, was auf die Basenpaarsubstitutionen im PrfA Bindemotiv

zurückzuführen ist. Auch für inlC wurde eine extrem hohe PrfA unabhängige Regulation

festgestellt, was mit Daten aus Listerien übereinstimmt (Luo et al., 2004). Aus diesem Grund

wurden spätere Untersuchungen bezüglich der PrfA Aktivität lediglich mit PplcA, Phly und PactA

durchgeführt. Die erhaltenen Regulationsfaktoren stimmen mit Daten aus der Literatur

überein, wobei lediglich geringe PrfA Konzentrationen getestet wurden (Sheehan et al.,

1995).

Zusammenfassend ist das in dieser Arbeit etablierte heterologe Expressionssystem

funktional und eignet sich für spätere Charakterisierungen der PrfA Aktivität. Dabei bietet das

System den Vorteil, die PrfA Konzentration gezielt durch die Veränderung der atc Mengen

anzupassen und somit den Einfluss unterschiedlicher PrfA Konzentrationen auf die

Virulenzgenexpression zu bestimmen.

5.2.2 PrfA vermittelte Aktivierung der Virulenzgenexpression in B. subtilis in zwei Stufen

Durch steigende PrfA Konzentrationen wird die actA Expression in zwei Stufen aktiviert

(Abschnitt 4.2.1.7), obwohl mittels Immunoblot nachgewiesen wurde, dass die PrfA Menge

kontinuierlich steigt (Abschnitt 4.2.1.6).

DISKUSSION

- 100 -

Die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression könnte auf mehreren Ebenen

kontrolliert werden. Erstens könnte sie durch die PrfA Aktivität beeinflusst werden, da die

strukturell unterschiedlichen Konformationen von PrfA verschiedene Aktivitäten aufweisen

(Mauder et al., 2006). Zweitens könnte die cis-vermittelte Kontrolle durch die Interaktion von

PrfA mit der Transkriptionsmaschinerie eine weitere Rolle für die zweistufige Regulation der

Virulenzgenexpression spielen. Überdies hinaus scheint ein weiterer Faktor mit der

Allosterie/Modulation von PrfA zu interferieren, indem er die allosterische Veränderung von

PrfA unterbindet, solange PrfA in nicht ausreichender Konzentration vorhanden ist. Der

Überschuss von PrfA könnte dann zur vollen Aktivierung des Virulenzgenes führen, indem

der zusätzliche Faktor im Zuge eines Titrationseffektes den allosterischen

Schaltmechanismus von PrfA nicht länger inhibieren kann. Die erste Stufe der zweistufigen

Virulenzgenexpression könnte vom Aufbau der PrfA Boxen abhängig sein.

Der neu postulierte Mechanismus wird anschließend näher erläutert und ist zur

Verdeutlichung schematisch in Abb. 5.5 dargestellt.

PrfA Konzentration

Viru

lenz

gene

xpre

ssio

n

- 35 - 10

PrfARNAP

- 10

RNAPPrfA

- 35

+Kofaktor

-

-Virulenzgenpromotor

Repressor1

2

Konformationsänderung von PrfA

PrfA Konzentration

Viru

lenz

gene

xpre

ssio

n

- 35 - 10

PrfARNAP

- 35 - 10

PrfARNAP

- 10

RNAPPrfA

- 35

+Kofaktor

--

--Virulenzgenpromotor

Repressor1

2

Konformationsänderung von PrfA

Abb. 5.5: Modell für die zweistufige PrfA vermittelte Regulation der Virulenzgenexpression Die Abb. zeigt schematisch die PrfA vermittelte zweistufige Virulenzgenexpression in Abhängigkeit von der PrfA Konzentration. PrfA kommt in strukturell unterschiedlichen Konformationen vor, kann aber in beiden Zuständen mit der RNAP interagieren und die Transkription des entsprechenden Virulenzgenes durch die Bindung an die PrfA Box aktivieren. Die PrfA Box überlappt dabei mit der -35 Region. PrfA wird allosterisch verändert, was zu erhöhter PrfA Box Bindung und Transkriptionsaktivität führt. Die allosterische Konformationsänderung von PrfA wird wahrscheinlich durch einen Kofaktor ausgelöst, dessen Produktion durch einen zusätzlichen Repressor kontrolliert werden könnte. Andererseits könnte der Kofaktor mit dem Repressor um die Bindung an PrfA konkurrieren. Der Repressor könnte dadurch mit der Allosterie von PrfA interferieren und somit die allosterische Veränderung von PrfA inhibieren, solange PrfA in nicht ausreichender Konzentration vorhanden ist. Steigende PrfA Konzentrationen könnten dadurch im Zuge eines Titrationseffektes die Verhinderung der Allosterie durch den Repressor aufheben und die Kofaktorbindung ermöglichen, was letztendlich die vollständige Aktivierung des Virulenzgenes auslösen könnte.

DISKUSSION

- 101 -

Die strukturell unterschiedlichen Konformationen von PrfA, welche im Zuge des

allosterischen Schaltmechanismus auftreten, könnten die signifikante zweite Aktivierungs-

stufe der Virulenzgenexpression verursachen. PrfA wird als Mitglied der Crp/FnR-Familie wie

Crp allosterisch verändert (Eiting et al., 2005). Es wurde bereits die konstitutive PrfA Mutante

G145S gefunden (Ripio et al., 1997), welche diese allosterische Veränderung in der

Kristallstruktur im Vergleich zu WT PrfA zeigt (Eiting et al., 2005). Außerdem wurden neben

PrfA G145S weitere konstitutive PrfA Varianten identifiziert, welche neben erhöhten

Bindeaffinitäten zur PrfA Box (Eiting et al., 2005; Mauder et al., 2006; Ripio et al., 1997;

Vega et al., 2004) auch verstärkte Transkriptionsaktivitäten aufweisen (Ermolaeva et al.,

2004). Bei vielen Mitgliedern der Crp/FnR-Familie, wie Crp, AraC oder CooA, wird der

allosterische Schaltmechanismus durch die Bindung eines Koeffektors ausgelöst (Körner et

al., 2003). Trotz intensiver Suche wurde noch kein niedermolekularer Kofaktor für PrfA

identifiziert. Allerdings wurde in Anwesenheit von Aktivkohle eine erhöhte Aktivierung der

Virulenzgenexpression festgestellt (Ermolaeva et al., 2004; Ripio et al., 1997). Die Bindung

von cAMP an Crp induziert vor allem Konformationsänderungen in der DBD, wodurch sich

die Bindungsaffinität zur DNA mindestens dreifach erhöht und die Bindung spezifischer wird

(Harman et al., 1988). In Crp wurden ebenfalls konstitutive Mutanten an analogen Positionen

zur PrfA gefunden, welche unabhängig von der cAMP Anwesenheit die Kofaktor gebundene

Konformation einnehmen. Auch für CooA und AraC wurden Häm und L-Arabinose als

Kofaktoren identifiziert (Lanzilotta et al., 2000; Soisson et al., 1997a; Soisson et al., 1997b).

Crp, AraC und CooA binden die Kofaktoren in der β-Fass Domäne (Lanzilotta et al., 2000;

Soisson et al., 1997a; Soisson et al., 1997b; Harmann et al., 1988). Die WT PrfA Struktur

weist einen Tunnel zwischen der C-terminalen DBD und der β-Fass Domäne auf, welcher

einen Kofaktor beherbergen könnte (Eiting et al., 2005). Im Gegensatz dazu zeigt die

Struktur der konstitutiven PrfA Mutante G145S keinen derartigen Tunnel (Eiting et al., 2005).

Daher deuten die bisherigen Daten daraufhin, dass auch für PrfA ein Kofaktor existiert,

welcher eine allosterische Veränderung hervorruft, woraus PrfA* resultiert. Da PrfA*

nachweislich eine erhöhte Aktivität im Vergleich zu WT PrfA aufweist, könnten die

unterschiedlichen Konformationen von PrfA den letzten Aktivierungsschritt der

Virulenzgenexpression vermitteln.

Ein weiterer Punkt für die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression sind die aus den

unterschiedlichen allosterischen Konformationen von PrfA resultierenden verschiedenen

Transkriptionskomplexe. Da die -35 Region jedes Virulenzgenpromotors mit der PrfA Box

überlappt, konkurrieren die RNAP und PrfA um die Bindung an den Promotor. Dabei können

sich theoretisch CI (PrfA, RNAP, DNA), CII (RNAP, DNA) und CIII (PrfA, DNA) Komplexe

ausbilden, deren Existenz bereits mehrfach demonstriert wurde (Böckmann et al., 1996;

Böckmann et al., 2000; Dickneite et al., 1998; Mauder et al., 2006; Vega et al., 2004) (Abb.

DISKUSSION

- 102 -

5.6). Die Ausbildung des CI Komplexes (PrfA*, RNAP, DNA) könnte daher die maximale

Aktivierung von actA und hly erzielen. Das wird dadurch bekräftigt, dass PrfA* eine höhere

Transkriptionsaktivität und eine stärkere Bindung an die PrfA Box als WT PrfA aufweist

(Mauder et al., 2006, Eiting et al., 2005). PrfA* geht bevorzugt den CI Komplex ein, während

WT PrfA sowohl CI als auch CIII Komplexe ausbildet (Mauder et al., 2006; Vega et al.,

2004). Dies könnte auf die abgeschwächte Interaktion von WT PrfA mit der RNAP und auf

die verringerte Bindung von WT PrfA an die PrfA Box zurückzuführen sein. Der CI Komplex

(WT PrfA, RNAP, DNA) könnte die erste Stufe der zweistufigen Virulenzgenexpression

erklären, was durch die verringerte Transkriptionsaktivität von WT PrfA im Vergleich zu PrfA*

untermauert wird (Mauder et al., 2006).

C I

- 35 - 10

PrfARNAP

C II

- 35 - 10

RNAP

C III

- 35 - 10

PrfA

C I

- 35 - 10

PrfARNAPC I

- 35 - 10

PrfARNAP

C II

- 35 - 10

RNAPC II

- 35 - 10

RNAP

C III

- 35 - 10

PrfA

C III

- 35 - 10

PrfA

Abb. 5.6: Schematische Darstellung der unterschiedlichen RNAP und PrfA Komplexe mit Virulenzgenpromotoren. Die Abb. zeigt die möglichen Ereignisse, welche sich an einem Virulenzgenpromotor abspielen können. Dabei können sich drei Komplexe ausbilden: CI Komplex: PrfA, RNAP, DNA CII Komplex: RNAP, DNA CIII Komplex: PrfA, DNA Die -35-Region des entsprechenden Virulenz-genpromotors überlappt dabei mit der PrfA Box.

Da die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression von der PrfA Konzentration

abhängig ist, deutet das auf einen Titrationseffekt hin. Somit könnte ein zusätzlicher Faktor

existieren, der den allosterischen Mechanismus von PrfA direkt oder indirekt verhindert.

Einerseits könnte die Bildung des Kofaktors inhibiert werden. Andererseits könnte ein

Repressor direkt mit dem aktivierenden niedermolekularen Effektor um die Bindung an PrfA

konkurrieren. Vor kurzem wurde entdeckt, dass L. monocytogenes eine hydrophobe

Substanz sekretiert, die direkt oder indirekt als Inhibitor von PrfA fungiert (Ermolaeva et al.,

2004). Dieser Inhibitor hat jedoch keinen Einfluss auf die konstitutiv aktive PrfA Variante

G145S (Ermolaeva et al., 2004). Denkbar wäre es auch, dass der listerielle Inhibitor durch

den Wirtszell-Aktivator verdrängt und PrfA dadurch aktiviert würde. Ein Wirts-abhängiger

Kofaktor hätte den Vorteil, dass er eine präzise räumliche und zeitliche Aktivierung von PrfA

erlauben würde und dadurch den Aktivierungsmechanismus ergänzen könnte.

Der erste sehr geringe Aktivierungsschritt ist bezüglich der actA Regulation geringfügig

stärker ausgeprägt als für hly (Daten nicht gezeigt). Da sich diese beiden

DISKUSSION

- 103 -

Virulenzgenpromotoren im Aufbau der PrfA Boxen unterscheiden, könnte dies auf die

unterschiedlichen Affinitäten von PrfA zu den PrfA Bindestellen zurückzuführen sein. Da

vermutet wird, dass die RNAP vor PrfA an den Promotor bindet, könnte es für WT PrfA

schwieriger sein, die optimale Position relativ zur RNAP einzunehmen als für allosterisch

verändertes PrfA. Daher könnte diese kleine Aktivierungsstufe auch für die allosterisch

veränderte Form von PrfA nicht von Bedeutung sein.

Auf biologischer Ebene könnte die zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression eine

Art Adaptationsmechanismus der PrfA Aktivität darstellen, welcher es Listerien ermöglicht

Energie zu sparen. Innerhalb der Wirtszellen zeigen Listerien volle PrfA Aktivität, während

sie außerhalb der Wirtszelle nur schwach aktiv ist (Moors et al., 1999; Shetron-Rama et al.,

2003). Dies könnte auf die durch den Temperaturwechsel hervorgerufene Aktivierung der

PrfA Translation zurückzuführen sein (Johansson et al., 2002). Da allerdings die

Virulenzgenexpression in vitro bei 37°C sehr schwach ist (Ripio et al., 1996), müssen

zusätzliche Mechanismen von PrfA zur Aktivierung der Virulenzgene führen.

5.2.3 Repression der PrfA vermittelten Virulenzgenexpression durch Kohlenstoffquellen in Abhängigkeit von der PrfA Konzentration

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die PrfA kontrollierte Virulenzgenexpression in

L. monocytogenes durch Kohlenstoffquellen wie Glukose, Fruktose und β-Glukoside

reprimiert wird (Brehm et al., 1996; Gilbreth et al., 2004; Herro et al., 2005; Mertins et al.,

2007; Milenbachs et al., 1997). Allerdings sind sowohl der Mechanismus als auch die

physiologische Bedeutung dieser Regulation nur lückenhaft geklärt. Eine erwartete

Konsequenz wäre, dass das Wachstum von L. monocytogenes unter

kohlenstofflimitierenden Bedingungen die Expression von Virulenzgenen unter PrfA

Regulation favorisieren würde. Insbesondere die β-Glukosid vermittelte Repression der

Virulenzgenexpression lässt vermuten, dass diese im Boden vorkommenden

Kohlenstoffquellen dem Bakterium anzeigen, dass es unnötig ist, Virulenzfaktoren zu

exprimieren (Gilbreth et al., 2004).

In dieser Arbeit wurde festgestellt, dass die Anwesenheit von Glukose unabhängig von der

Wuchsphase zur Repression der PrfA vermittelten Expression von actA, hly und plcA in

B. subtilis führt, wenn PrfA auf niedrigem Niveau exprimiert wird (Abschnitt 4.2.3.2). Deshalb

eignet sich B. subtilis zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen der PrfA

vermittelten Virulenzgenexpression und der KKR. Im Gegensatz dazu kommt es in

Anwesenheit von hohen PrfA Konzentrationen zu keiner Repression der Virulenzgen-

expression. Daher ist der Glukoseeffekt von der PrfA Konzentration abhängig und nur auf

DISKUSSION

- 104 -

der ersten Stufe der zweistufigen Virulenzgenexpression nachweisbar. Das deutet auf einen

Faktor aus der KKR oder dem PTS hin, welcher WT PrfA beeinflusst, aber kein allosterisch

verändertes PrfA. Es wurde bereits nachgewiesen, dass L. monocytogenes eine hydrophobe

Substanz sekretiert, die als Inhibitor von PrfA fungiert (Ermolaeva et al., 2004). Dieser

Inhibitor übt lediglich Einfluss auf WT PrfA, aber nicht auf PrfA* aus (Ermolaeva et al., 2004).

Dadurch wird das in Abschnitt 5.2.2 postulierte Modell unterstützt. Einerseits könnte die

Interaktion eines Faktors aus dem PTS oder der KKR an PrfA zum vollkommenen Verlust

oder veränderter Bindung an die PrfA Box führen und somit die Virulenzgenexpression

reprimieren. Andererseits könnte dadurch die Bindung von PrfA und der RNAP verhindert

werden und somit die Virulenzgenexpression inhibieren. Außerdem könnte dieser Faktor

auch die Bindung von PrfA an die PrfA Bindestelle blockieren, indem er mit PrfA um die

Bindung an die PrfA Box konkurriert oder selbst mit der RNAP interagiert. Auch ein indirekter

Effekt auf die PrfA Aktivität wäre denkbar.

Interessanterweise wird in B. subtilis die PrfA abhängige Virulenzgenexpression durch

Cellobiose, Maltose, Saccharose und Trehalose in der logarithmischen Phase reprimiert und

in der Stationärphase aktiviert. Deshalb zeigen sich unterschiedliche Effekte in Anwesenheit

von Glukose und Disacchariden. Darüber hinaus kommt es in L. monocytogenes EGDe

durch alle β-Glukoside zur Repression der Virulenzgenexpression unabhängig von der

Wachstumsphase, weshalb es sich möglicherweise um einen B. subtilis spezifischen Effekt

handelt. Das könnte einerseits daran liegen, dass Bazillen und Listerien C-Quellen

unterschiedlich aufnehmen. Andererseits könnten durch die Verstoffwechselung der C-

Quellen unterschiedliche (Zwischen)produkte entstehen, da sich die Mechanismen zu deren

Metabolisierung unterscheiden.

5.2.4 Interferenz von KKR/PTS Komponenten mit der Allosterie von PrfA

Die Repression der Virulenzgenexpression läuft nicht nach dem bekannten Mechanismus

der KKR in Gram-positiven Bakterien ab, obwohl alle generellen PTS und KKR

Komponenten, wie HPrK/P, CcpA, HPr, EI und EIIA auch in L. monocytogenes vorhanden

sind (Behari and Youngman, 1998; Christensen et al., 1999). Lediglich Crh scheint in

L. monocytogenes zu fehlen (W. Goebel, persönliche Mitteilung).

In dieser Arbeit wurde durch ptsH1 und ptsG Mutanten eine Derepression der PrfA

vermittelten Expression von actA, hly bzw. plcA in Anwesenheit von Glukose und somit eine

Aufhebung des Glukoseeffekts festgestellt (Abschnitt 4.2.4.3). Dieser Effekt ist dabei

unabhängig von der Wuchsphase, aber lediglich mit niedriger PrfA Dosis sichtbar (Abschnitt

4.2.3.4). Dabei treten keine gravierenden PrfA Expressionsunterschiede zwischen WT und

DISKUSSION

- 105 -

Mutanten auf (Abschnitt 4.2.4.6). Auch die hprK Deletion führt unabhängig von der

Wachstumsphase zu Glukose vermittelter Derepression von actA bzw. hly, allerdings nur in

Anwesenheit von geringen PrfA Mengen (Haag, 2005). Im Gegensatz dazu zeigt eine crh

Mutante den Phänotyp des Wildtyps und daher keinen Einfluss auf die PrfA Aktivität

(Abschnitt 4.2.4.4). Daher handelt es sich um einen spezifischen Effekt der ptsH1 Mutante.

Die Effekte durch die ptsG, ptsH1 und hprK Mutanten weisen darauf hin, dass die

zweistufige Regulation der Virulenzgenexpression nur auf der ersten Stufe durch

Komponenten der KKR reprimiert wird und somit von der PrfA Dosis abhängig ist. Daher ist

eindeutig demonstriert, dass Komponenten der KKR/PTS mit der Allosterie von PrfA

interferieren, indem sie die allosterische Veränderung von PrfA (in)direkt verhindern. Dies

könnte durch die Interaktion von einer KKR/PTS Komponente, beispielsweise HPr-Ser46-P,

mit PrfA erzielt werden. Daraus könnte der Verlust der Bindung von PrfA an die PrfA Box

resultieren und die Virulenzgenrepression bedingen. In B. subtilis führt die Bindung des

CcpA-HPr-Ser46-P Komplexes an die cre Sequenz zur KKR des entsprechenden Genes

(Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000). Allerdings wurde eine direkte Interaktion

von PrfA und HPr-Ser46-P durch SPR-Messungen (G. Seidel und S. Müller-Altrock,

persönliche Mitteilung) und kürzlich veröffentlichte Daten über Listerien ptsH Mutanten

(Mertins et al., 2006) ausgeschlossen. Folglich spielt HPr-Ser46-P eine indirekte Rolle bei

der PrfA kontrollierten Virulenzgenexpression. Auch für CcpA konnte keine direkte

Beteiligung an der PrfA vermittelten Virulenzgenregulation demonstriert werden (Abschnitt

4.2.4.1) (Behari and Youngman, 1998; Herro et al., 2005; Mertins et al., 2007).

Darüber hinaus hat HPr-Ser46-P weitere Funktionen in der KKR und Stickstoffregulation,

indem es den Fluss der Phosphatgruppe inmitten der PEP::PTS Phosphorylierungskaskade

verringert (Deutscher et al., 1997; Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000). Das führt

zur Inhibierung der Phosphorylierung von HPr am His15, EIIA oder EIIB (Reizer et al., 1992).

Daher könnten auch ein oder mehrere unphosphorylierte EIIAs oder EIIBs die PrfA Aktivität

inhibieren. Mittels SPR Messungen konnte gezeigt werden, dass es zu einer spezifischen

Bindung zwischen EIIAGlc und PrfA kommt. Allerdings ist diese Interaktion so schwach, dass

sie wohl biologisch irrelevant ist (G. Seidel, persönliche Mitteilung). Es könnte daher auch ein

anderes zuckerspezifisches EIIA mit PrfA interagieren und die PrfA vermittelte

Virulenzgenexpression reprimieren. Beispielsweise interagiert Mlc aus E. coli mit

unphosphoryliertem EIIBGlc, welches mit dem in der Membran lokalisierten EIIC assoziiert ist,

und reprimiert einige Gene, welche in die Verstoffwechselung von C-Quellen involviert sind.

EIIBGlc hält Mlc an der Membran fest und verhindert somit dessen Bindung an die DNA

Zielsequenzen (Lee et al., 2000; Nam et al., 2001; Tanaka et al., 2000).

Durch ptsH Mutanten kommt es im Gegensatz zu ptsH1 Mutanten zu unvollständiger

Aktivierung in Abwesenheit von Glukose (Abschnitt 4.2.4.3). Auch durch ptsI Mutanten wurde

DISKUSSION

- 106 -

die PrfA vermittelte Virulenzgenexpression herabgesetzt (Herro et al., 2006). Daher scheint

die vollständige PrfA vermittelte Aktivierung der Virulenzgenexpression auf ein intaktes PTS

angewiesen zu sein. Deshalb könnte auch die Interaktion von PrfA mit HPr-His15-P, EIIA-P

bzw. EIIB-P oder die Phosphorylierung von PrfA durch diese phosphorylierten PTS

Komponenten die PrfA Aktivität aktivieren. Beispielsweise stimuliert HPr-His15-P die Aktivität

von mehreren Transkriptionsaktivatoren und Antiterminatoren durch die Phosphorylierung an

Histidinresten von PRD Domänen und stellt somit eine Art der CcpA unabhängigen KKR dar

(Deutscher et al., 2006; Stülke and Hillen, 2000). Die Anwesenheit von HPr-Ser46-P führt zu

einer Abschwächung der HPr-His15-P vermittelten Phoshorylierung und Aktivierung von LicT

(Krüger et al., 1996; Lindner et al., 2002). Auch die Glyzerinkinase wird durch die HPr-His15-

P abhängige Phosphorylierung an einem konservierten Histidinrest aktiviert, obwohl diese

keine PRDs aufweist (Charrier et al., 1997). Für PrfA konnte bisher keine Phosphorylierung

nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung).

Zusammenfassend wird für die vollständige PrfA vermittelte Aktivierung der Virulenzgen-

expression ein intaktes PTS benötigt. Außerdem wirken Faktoren aus der KKR/PTS

reprimierend auf die PrfA Aktivität, allerdings nur auf der Ebene von nicht allosterisch

verändertem PrfA.

LITERATURVERZEICHNIS

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ANHANG

- 121 -

7. Anhang

alsR alsS alsD

PalsR PalsSD

creup

gntK gntP gntZgntR

credown

-10-35

gntO

Promotor

P

ackA

PackAcre2cre1

UAR

xynP xynB

P

xylRxylO

cre

alsR alsS alsD

PalsR PalsSD

creup

gntK gntP gntZgntR

credown

-10-35

gntO

Promotor

P

ackA

PackAcre2cre1

UAR

xynP xynB

P

xylRxylO

cre

Abb. 7.1: Genetische Situation verschiedener B. subtilis Operons und Gene A: xyn Operon zur Xyloseverwertung. Die Transkription von xynP und xynB wird durch den von xylR kodierten Xylose Repressor reguliert, welcher in Abwesenheit des Induktors Xylose an den xyl Operator xylO bindet und die Transkription reprimiert. Das xyn Operon wird durch CcpA reprimiert. Die cre Sequenz befindet sich in der Promotorregion. B: gntRKPZ Operon zur Glukonatverstoffwechselung. Der von gntR kodierte Glukonatrepressor GntR reguliert die Transkription, da er in Abwesenheit des Induktors Glukonat an den gnt Operator gntO bindet und die Transkription reprimiert. gntRKPZ wird durch CcpA reprimiert. Die beiden cre Sequenzen liegen in der -35 Region (creup: ptsH unabhängig) und in der kodierenden Region von gntR (credown: ptsH abhängig). C: ackA partizipiert am Überflussmetabolismus: ackA wird durch CcpA aktiviert. Die beiden cre Sequenzen sind stromaufwärts des Promotors lokalisiert. Zwischen diesen befindet sich die UAR (upstream activating region), welche essentiell für die Aktivierung von ackA ist. D: alsSD mit Bedeutung im Überflussstoffwechsel. alsSD steht unter positiver Kontrolle durch den von alsR kodierten Transkriptionsaktivator AlsR und wird indirekt durch CcpA aktiviert. alsS, alsD und alsR weisen keine cre Sequenz auf.

A B C D

ANHANG

- 122 -

Tab. 7.1 A: Einfluss von ptsH, crh, ccpA, ptsH1 und ptsG Deletionen/Mutationen auf die PrfA abhängige hly’::’lacZ Expression

β-Galaktosidase Aktivität [%]

hly’::’lacZ C-Quelle pWH1017

(- prfA) - atc


- atc

pWH1017 (- prfA)

+ 0,07 µM atc



- -

1,5 ± 0,3 1,9 ± 0,1

100 ± 5

100 ± 11

1,5 ± 0,4 1,6 ± 0,2

100 ± 5 100 ± 7


+ G + G

0,52 ± 0,02 0,37 ± 0,18

14 ± 5 9 ± 1

0,53 ± 0,02 0,62 ± 0,01

85 ± 7 91 ± 4


+ C + C

0,85 ± 0,12 0,28 ± 0,01

25 ± 1

360 ± 34

0,82 ± 0,03 0,72 ± 0,06

75 ± 6 390 ± 6


- -

1,6 ± 0,1 1,7 ± 0,2

96 ± 4 98 ± 6

1,7 ± 0,1 1,8 ± 0,1

96 ± 3 101 ± 6


+ G + G

0,61 ± 0,01 0,62 ± 0,01

20 ± 3

8,1 ± 0,1

0,71 ± 0,01 0,56 ± 0,01

87 ± 5 96 ± 3

WH634 (∆ccpA) log-Phase Stationärphase

- -

1,70 ± 0,05 0,95 ± 0,04

96 ± 5 93 ± 4

1,73 ± 0,04 1,72 ± 0,04

96 ± 6 94 ± 6


+ G + G

0,51 ± 0,01 0,68 ± 0,06

13 ± 4 12 ± 4

0,63 ± 0,06 0,68 ± 0,07

81 ± 5 90 ± 6


+ C + C

0,70 ± 0,06 0,58 ± 0,02

23 ± 3 15 ± 3

0,73 ± 0,04 0,76 ± 0,03

79 ± 4 92 ± 4

WH651 (∆ptsH) log-Phase Stationärphase

- -

1,5 ± 0,1

0,42 ± 0,03

18 ± 1 11 ± 1

1,6 ± 0,1

1,62 ± 0,07

50 ± 3 20 ± 1


+ G + G

1,23 ± 0,09 0,44 ± 0,01

51 ± 4

12,9 ± 0,5

1,4 ± 0,1

1,23 ± 0,07

52 ± 4 19 ± 5


+ C + C

0,68 ± 0,06 0,15 ± 0,01

45 ± 3

11,9 ± 0,1

0,72 ± 0,06 0,73 ± 0,07

45 ± 3 18 ± 4

WH654 (ptsH1) log-Phase Stationärphase

- -

1,3 ± 0,1

0,84 ± 0,02

100 ± 2 95 ± 5

1,23 ± 0,05

1,3 ± 0,1

98 ± 3 97 ± 2


+ G + G

0,86 ± 0,10 0,49 ± 0,09

93 ± 5 89 ± 5

0,80 ± 0,09 0,92 ± 0,08

93 ± 5 92 ± 5


+ C + C

0,59 ± 0,03 0,69 ± 0,05

85 ± 6 81 ± 5

0,62 ± 0,03 0,63 ± 0,05

91 ± 5 86 ± 6

WH597 (∆ptsG) log-Phase Stationärphase

- -

1,7 ± 0,1 1,5 ± 0,2

98 ± 4 94 ± 6

1,42 ± 0,02

1,2 ± 0,1

98 ± 3 97 ± 2


+ G + G

0,66 ± 0,01 0,41 ± 0,02

96 ± 5

150 ± 11

0,91± 0,01 0,52 ± 0,02

96 ± 7 110 ± 6

Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden jeweils auf den WT (+ pWH1018) ohne C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messungen wurden reproduziert. + G: in Anwesenheit von Glukose; + C: in Anwesenheit von Cellobiose

ANHANG

- 123 -

Tab. 7.1 B: Einfluss von ptsH, crh, ccpA, ptsH1 und ptsG Deletionen/Mutationen auf die PrfA abhängige plcA’::’lacZ Expression

β-Galaktosidase Aktivität [%]

plcA’::’lacZ C-Quelle pWH1017

(- prfA) - atc


- atc

pWH1017 (- prfA)

+ 0,07 µM atc



- -

1,3 ± 0,1 2,1 ± 0,2

100 ± 7 100 ± 4

1,4 ± 0,1 1,3 ± 0,1

100 ± 3 100 ± 6


+ G + G

0,61 ± 0,01 0,47 ± 0,16

13 ± 2

7,2 ± 0,5

0,62 ± 0,01 0,59 ± 0,01

93 ± 4 89 ± 7


+ C + C

0,81 ± 0,09 0,42 ± 0,01

22 ± 3

390 ± 12

0,78 ± 0,02 0,71 ± 0,07

89 ± 4

420 ± 28 WH629 (∆crh) log-Phase Stationärphase

- -

1,7 ± 0,1 1,5 ± 0,1

94 ± 2 91 ± 3

1,5 ± 0,1 1,4 ± 0,1

89 ± 3 96 ± 4


+ G + G

0,71 ± 0,01 0,69 ± 0,01

18 ± 1

7,9 ± 0,1

0,79 ± 0,09 0,63 ± 0,04

83 ± 3 94 ± 2


- -

1,68 ± 0,03 0,92 ± 0,02

94 ± 3 91 ± 5

1,84 ± 0,08 1,53 ± 0,09

97 ± 3 91 ± 9


+ G + G

0,61 ± 0,03 0,62 ± 0,02

11 ± 2 14 ± 3

0,79 ± 0,02 0,69 ± 0,05

89 ± 7 92 ± 5


+ C + C

0,81 ± 0,03 0,61 ± 0,01

29 ± 4 27 ± 2

0,71 ± 0,02 0,81 ± 0,01

79 ± 4 92 ± 4


- -

1,3 ± 0,1

0,54 ± 0,04

21 ± 1 14 ± 2

1,4 ± 0,1

1,52 ± 0,09

45 ± 2 23 ± 4


+ G + G

1,11 ± 0,07 0,56 ± 0,01

56 ± 4

14,3 ± 0,2

1,2 ± 0,1

1,12 ± 0,08

54 ± 3 19 ± 5


+ C + C

0,71 ± 0,03 0,52 ± 0,01

43 ± 3

14,9 ± 0,1

0,69 ± 0,01 0,68 ± 0,03

45 ± 3 18 ± 4


- -

1,4 ± 0,1

0,91 ± 0,07

96 ± 3 97 ± 8

1,11 ± 0,03

1,2 ± 0,1

96 ± 8 92 ± 7


+ G + G

0,96 ± 0,09 0,54 ± 0,03

89 ± 4 93 ± 3

0,89 ± 0,02 0,72 ± 0,03

89 ± 2 95 ± 3


+ C + C

0,61 ± 0,01 0,62 ± 0,02

87 ± 2 90 ± 3

0,59 ± 0,02 0,53 ± 0,01

92 ± 3 89 ± 4


- -

1,6 ± 0,1 1,3 ± 0,1

104 ± 10

96 ± 2

1,21 ± 0,01 1,11 ± 0,07

100 ± 2 95 ± 6


+ G + G

0,72 ± 0,03 0,52 ± 0,01

92 ± 3 170 ± 9

0,89 ± 0,01 0,63 ± 0,01

98 ± 6

120 ± 11

Die β-Gal Aktivitäten sind in % angegeben und wurden jeweils auf den WT (+ pWH1018) ohne C-Quellen normiert. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert einer Dreifachbestimmung mit Standardabweichung. Die Messungen wurden reproduziert. + G: in Anwesenheit von Glukose; + C: in Anwesenheit von Cellobiose

Mechanismen der Katabolitenregulation in Bacilli

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