Mikrobiologie C3

für Molekulare Biotechnologen

Skript WS 2010/2011

Inhaltsverzeichnis

Inhalt

ALLGEMEINES ...................................................................................................................... 3

Anmerkungen zur Protokollführung ................................................................................................... 3 Regeln für das mikrobiologische Arbeiten und Verhalten im Praktikum........................................... 3 Beschriftung von Kulturgefäßen ......................................................................................................... 4 Verdünnungsreihe ............................................................................................................................... 4

TAG 1: Allgemeine Techniken in der Mikrobiologie ........................................................... 5

Versuch 1: Bedienung der Gilson-Pipette........................................................................................... 5 Versuch 2: Herstellen von Bakterienmedien, Autoklav...................................................................... 6 Versuch 3: Impftechniken................................................................................................................... 8 Versuch 4: Lichtmikroskop und Zählkammer .................................................................................. 10

TAG 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen ....................................... 12

Versuch 5: Bestimmung der Kontaminationsgefahr ......................................................................... 12 Versuch 6: Platte von zu Hause ........................................................................................................ 13 Versuch 7: Keimzahlbestimmung des Hackfleischs ......................................................................... 13 Versuch 8: Keimzahlbestimmung einer Bodenprobe........................................................................ 14 Versuch 9: Isolierung von Chromo-/ Janthinobakterien aus der Erde .............................................. 14 Versuch 10: Keimzahlbestimmung der Milch .................................................................................. 15

TAG 3: Physiologische Tests zur Identifizierung von Bakterien....................................... 16

Versuch 11: Gelatineabbau ............................................................................................................... 17 Versuch 12: Katalase-Test ................................................................................................................ 17 Versuch 13: Citratverwertung........................................................................................................... 17 Versuch 14: Stärkeabbau .................................................................................................................. 17 Charakterisierung bakterieller Zellwände ......................................................................................... 18 Versuch 15: KOH-Test ..................................................................................................................... 18 Versuch 16: Gram-Färbung .............................................................................................................. 19

TAG 4: Hemmen des bakteriellen Wachstums ................................................................... 20 Versuch 17: Nachweis der Wirkung von Antibiotika - Der Hemmhoftest ....................................... 20 Versuch 18: UV-Bestrahlung............................................................................................................ 21 Versuch 19: Nachweis von Bakteriophagen ..................................................................................... 22

ANHANG ................................................................................................................................ 23

Rezepte für Medien........................................................................................................................... 23 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................................... 24 Literatur............................................................................................................................................. 25

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Allgemeines

ALLGEMEINES Anmerkungen zur Protokollführung Über die Versuche ist genau Protokoll zu führen. Das Protokoll soll nicht im Stil einer wissenschaftlichen Veröffentlichung geschrieben werden, da hier die Methoden meist sehr kurz abgehandelt werden, ein Laborprotokoll muss aber gerade hinsichtlich der Methoden sehr präzise sein. Lediglich bei Tabellen, Abbildungen und Zitaten soll man sich an Formatvorgaben aus wissenschaftlichen Veröffentlichungen halten.

Genaues Beschreiben der Durchführung: d.h. der Versuch muss jederzeit von jedermann wiederholt werden können. Bleiben hier Fragen offen oder entstehen Unklarheiten, werden diese mit Punktabzügen geahndet. Genaue Beobachtung und Bewertung der Ergebnisse: Die Ergebnisse sollen übersichtlich (wenn angebracht mit Fotos bzw. in Tabellenform) dargestellt werden und in der Diskussion mit früheren Ergebnissen aus gleichen oder ähnlichen Versuchen (= Literaturrecherche) verglichen werden. Knappe, eindeutige Aussagen sind hier erwünscht. Einhalten bestimmter Formatvorgaben: Tabellen und Abbildungen müssen nummeriert werden. Sie besitzen eine Über- bzw. Unterschrift und einen kurzen begleitenden Text (Versuchsnummer reicht nicht!). Aussagen, die sich nicht aus den eigenen Ergebnissen ableiten, müssen korrekt zitiert werden, d.h. Angabe der Quelle in Klammern direkt hinter der Aussage. Zur Veranschaulichung dieser Konzepte lesen Sie bitte folgende Veröffentlichung von Prof. Wink:

http://www.uni-heidelberg.de/institute/fak14/ipmb/phazb/pubwink/2005/34a.2005.pdf • Das Protokoll soll mit einem Textprogramm geschrieben werden. Es darf 12 DIN A4 Seiten nicht

überschreiten! • Auf dem Deckblatt sind Kursbezeichnung, Datum und Autoren mit Matrikelnummer anzugeben. • Inhalts- und Literaturverzeichnis nicht vergessen! • Das Protokoll soll ausgedruckt und in einem Ordner abgegeben werden. Nach der Korrektur erhalten

Sie das Dokument zurück. • Alle Protokolle eines Jahrgangs sollen zusätzlich auf einer CD zusammengefasst, abgegeben und als

Leistungsnachweis an der Uni aufbewahrt werden. Regeln für das mikrobiologische Arbeiten und Verhalten im Praktikum Informieren Sie sich über die Definitionen und typische Vertreter der verschiedenen Risikogruppen von Mikroorganismen unter:

http://www.zuv.uni-heidelberg.de/sw/info.htm Suchen Sie unter „Gentechnik“ nach „Internationale Einstufungen von Organismen in Risikogruppen (EU, USA, Canada,

Australien)“ • In den Praktikumsräumen ist das Rauchen, Essen und Trinken verboten! • Mitzubringen sind: Arbeitskittel, Spatel, wasserfester Filzstift (Edding), Taschenrechner, Zahn-

stocher, Wattestäbchen, Schere, Digitalkamera. • Spitzenkästen - wenn leer - wieder mit Pipettenspitzen auffüllen! Dazu Handschuhe tragen! • Vor dem Verlassen des Praktikums prinzipiell Hände waschen! Nach direktem Kontakt mit

Mikroorganismen Hände desinfizieren! • Arbeitsplatz täglich mit 70% Alkohol desinfizieren! • Platten und Lösungen, die nicht mehr gebraucht werden (auf den Regalen, im Wärmeschrank etc.)

sofort entsorgen! Gebrauchte Glaswaren spülen und zum Trocknen aufhängen! • Geräte dürfen erst nach Einweisung benutzt werden! Werden Geräte ohne Einweisung bedient,

haftet der Student für eventuelle Schäden! • Abfälle (Pipettenspitzen, Eppis, Platten, Kolben) sammeln und zum Autoklavieren bringen!

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Allgemeines

Beschriftung von Kulturgefäßen Vor dem Beimpfen muss jedes Kulturgefäß und jede Platte genau beschriftet werden. Dabei wird auf den Plattenboden geschrieben, um einer Verwechslung durch Vertauschen der Plattendeckel vorzubeugen.

Wichtige Angaben sind:

Nährmedium Name (und keine Nummer!) des Mikroorganismus Datum Bezeichnung (und keine Nummer!) des Versuchs Name oder Gruppennummer

Bei den Petrischalen soll die Beschriftung möglichst klein am Rand des Bodens erfolgen, da es bei einigen Versuchen wichtig ist, die Platte durch den Boden im Gegenlicht betrachten zu können. Verdünnungsreihe Vor Versuchsantritt und später im Protokoll muss jede Verdünnungsreihe durch ein Pipettierschema dargestellt werden (Abb. 1). Um zum Beispiel eine 1:1000 Verdünnung zu erzeugen, stellen wir eine Serie von drei 1:10 Einzelverdünnungen her: zu 900 µl eines Puffers werden 100 µl der Mikroorganismensuspension pipettiert. Dabei muss anschließend gut gemischt werden. Beim Pipettieren ist darauf zu achten, dass die Pipettenspitze außen mit der Bakteriensuspension möglichst wenig benetzt ist, da man sonst eine zusätzliche, nicht kontrollierbare Zahl an Mikroorganismen in die folgende Verdünnung einbringt. Daher sollte die Pipettenspitze beim Entnehmen aus der vorigen, selbstverständlich gut gemischten Suspension nicht zu tief eintauchen. Für jeden Verdünnungsschritt muss eine neue Pipettenspitze verwendet werden. Die Gesamtverdünnung einer Reihe ergibt sich durch die Multiplikation der einzelnen Verdünnungs-schritte (Addition der Hochzahlen), z.B.: 1:10, 1:10, 1:10 ergibt 1:1000 (10-1, 10-1, 10-1 ergibt 10-3). Durch das anschließende Ausplattieren von 100 µl auf den Nährboden muss zusätzlich ein Faktor 10 berücksichtigt werden, um auf den richtigen Titer in Mikroorganismen pro ml zu kommen.

Tipp: Die 900 µl Puffer zum Verdünnen können jederzeit, z.B. gleich zu Versuchsbeginn oder sobald 1000 µl Pipette verfügbar in allen Eppis vorgelegt werden.

100 µl

100 µl100 µl100 µl

Bakterien in Flüssigkultur

900 µl Puffer

900 µl Puffer

900 µl Puffer

Agarplatte

10-310-210-1 10-4

Abb. 1. Pipettierschema für eine Verdünnungsreihe. Eine Ausgangskultur in einem Erlenmeyerkolben wird in 1:10 Verdünnungsschritten in Eppis verdünnt, bis eine zählbare Menge an Bakterien ausplattiert und kultiviert werden kann. Angegeben sind die zu pipettierenden Volumina und die Verdünnungsstufen der einzelnen Gefäße.

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Tag 1: Allgemeine Techniken in der Mikrobiologie TAG 1: Allgemeine Techniken in der Mikrobiologie __________________________________________________________________________________ Am ersten Tag sollen folgende Techniken und die Bedienung der zugehörigen Geräte erlernt werden:

• Gilson-Pipette und Verdünnungsreihe • Nährmedien und Autoklav • Impföse und fraktionierter Ausstrich • Lichtmikroskop und Zählkammer

Versuch 1: Bedienung der Gilson-Pipette In nur einem Mikroliter (1 µl) Flüssigkeit können sich bereits eine Million Bakterien befinden, daher ist es notwendig, zunächst den Umgang mit solch geringen Flüssigkeitsmengen zu üben. Neben dem Erlernen der handwerklichen Fähigkeit, sollen Sie in diesem Versuch die Genauigkeit der Pipetten bestimmen.

Beim Umgang mit den (200 €) teuren Gilson-Pipetten gilt: Gilson-Pipetten dürfen nur mit entsprechender Plastikspitze verwendet werden! Gilson-Pipetten können variable Volumina im Mikroliterbereich pipettieren, niemals jedoch über dem Maximum (steht oben auf der Pipette) oder unterhalb 10% des angegebenen Maximums! Bei Unsicherheit bitte unbedingt die freundlichen Assis fragen! Sie verfügen über zwei Anschläge: Man drückt mit dem Daumen bis zum ersten Anschlag, wobei Luft aus der Pipette verdrängt wird. Man taucht die Spitze in die Flüssigkeit ein (nur knapp unter die Oberfläche, denn sonst bleiben Tropfen an der Außenseite der Pipette hängen und verfälschen das Volumen!), man lässt den Daumen langsam wieder los, und Flüssigkeit saugt sich in der Spitze hoch, um das entstandene Vakuum zu ersetzen. Man überführt die Flüssigkeit in ein neues Gefäß, indem man bis zum ersten Anschlag drückt und feststellt, dass noch ein Rest in der Spitze verbleibt. Um diesen zu entfernen, drückt man bis zum zweiten Anschlag durch. Pipetten anderer Hersteller können noch über einen dritten Anschlag verfügen, mit dem man die Spitze abwerfen kann...

Lesen Sie die ersten 11 Seiten der Bedienungsanleitung! http://www.gilson.com/Resources/LT801521_a_eng_030209%20BD.pdf

Informieren Sie sich über die Bedienung von „air-displacement pipettes“ im „forward mode“ (ab Seite 8) und über Präzision und Genauigkeit der Pipette (ab Seite 44)

http://www.gilson.com/Resources/Guide%20to%20Pipetting.pdf

1) Welche Volumina können Sie mit den Pipetten P2, P20, P100, P200, P1000 minimal und maximal pipettieren?

2) Welche Zahlenfolge müssen Sie im Sichtfenster einstellen, wenn Sie 100 µl mit P100 bzw. 900 µl mit P1000 pipettieren möchten?

Durchführung:

Jede Gruppe soll vor der Verwendung in weiteren Versuchen überprüfen: eine P200, gelbe Gilson-Pipette für 200 µl eine P1000, blaue Gilson-Pipette für 200 µl und 1000 µl

Notieren Sie die Pipettenummern! Legen Sie den Boden einer Petrischale auf eine Analysewaage und tarieren Sie sie auf Null! Pipettieren Sie 10 Mal das gewünschte Volumen Wasser in die Petrischale und notieren Sie die Werte! Auswertung:

1. Mit welchem Pipettierfehler müssen Sie für die folgenden Versuche rechnen? Halten Sie den Fehler für akzeptabel? Argumentieren Sie mit Genauigkeit (accuracy) und Präzision (precision)!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 2: Herstellen von Bakterienmedien, Autoklav Unter einer Bakterienkultur versteht man die Vermehrung von Bakterien in einem geeigneten Nähr-substrat. Bakterien benötigen gewöhnlich nur ein Minimum an Nährstoffen. Aus einigen Salzen, einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und Wasser sind viele Wildformen (= wildtype) in der Lage, alle für ihren Stoffwechsel erforderlichen Moleküle zu synthetisieren. Statt eines solchen Minimalmediums verwenden wir im Praktikum hauptsächlich LB-Medium (Luria-Bertani-Medium). LB-Medium ist ein Komplexmedium, das bereits Aminosäuren, Zucker, Vitamine, etc. enthält, deren Synthese sich die Bakterien durch Abschalten der entsprechenden Stoffwechselwege ersparen können. Infolgedessen wachsen sie auf LB-Medium erheblich schneller als auf Minimalmedium. In manchen Fällen nutzen wir im Praktikum auch Selektivmedien, die nur bestimmten Bakterienarten ein Wachstum ermöglichen, bzw. Indikatormedien, die Stoffwechselleistungen (z.B. Veränderung des pH-Werts) anzeigen können. Agar – ein Polysaccharidgemisch aus Rotalgen – wird Nährmedien zum Verfestigen zugesetzt. Durch Erhitzen löst sich der Agar und bleibt beim Abkühlen auf ca. 45 °C flüssig, so dass das Medium leicht in sterile Petrischalen gegossen werden kann, und man erhält nach weiterem Abkühlen einen festen Nährboden. Da Agar von den meisten Mikroorganismen nicht abgebaut werden kann, bleibt der feste Nährboden auch nach der Kultivierung von Bakterien erhalten.

Sie brauchen hier „nur“ die Themen zu Energie– und C-Quellen, Sauerstoff und Temperatur zu verinnerlichen! http://textbookofbacteriology.net/nutgro.html

Informieren Sie sich über Sterilisationsmethoden! (Antibiotika sind erst für einen späteren Versuchstag vorzubereiten!) http://textbookofbacteriology.net/control.html

Fragen (Hausaufgabe vor Betreten des Labors):

1) Nennen Sie verschiedene Energie- und Kohlenstoffquellen, die sich Bakterien zu Nutze machen! 2) Wie verhalten sich Mikroorganismen gegenüber Sauerstoff? Welche Enzyme sind dafür

verantwortlich? 3) Welche Fachbegriffe beschreiben das Verhältnis von Mikroorganismen zur Temperatur? 4) Nennen Sie verschiedene Sterilisationsmethoden!

Durchführung: Für die Versuche im Praktikum benötigt werden: steriles Wasser, flüssiges und festes LB-Medium und sterile Wattestäbchen. A) Jede Gruppe hat folgende Aufgaben:

1. Etwa 100 ml destilliertes Wasser in einen Erlenmeyerkolben füllen, mit Alufolie verschließen, auf der Alufolie mit H2O und Gruppennummer beschriften.

2. 500 ml LB-Medium ansetzen (Rezepte ab S. 23.) Davon etwa 50 ml in einen Erlenmeyerkolben überführen, mit Alufolie verschließen, auf der Alufolie mit "LB" und Gruppennummer beschriften. Die restlichen etwa 450 ml mit 1,5% w/v Agar versetzen, mit Alufolie verschließen, auf der Alufolie mit "LB" und Gruppennummer beschriften (Pro Flasche einen Rührfisch zugeben!)

B) Sterilisieren im Autoklav

Alle Nährmedien, das Wasser und die Wattestäbchen müssen durch Autoklavieren sterilisiert werden. Die (meisten) Mikroorganismen werden unter gesättigtem Wasserdampf bei 121 °C, 1,5 bar Überdruck 15 min lang inaktiviert. Alle Güter werden gemeinsam unter Anleitung der Assistenten autoklaviert.

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen C) Ausgießen von Nähragar in Petrischalen:

Beim Ausgießen von frisch sterilisiertem Nähragar ist zu beachten, dass dieser auf eine Temperatur von etwa 60-50 °C abgekühlt und der Agar aufgerührt werden muss (vorsichtig rühren!!! ohne dabei Luftbläschen zu erzeugen). Gießt man bei zu hohen Temperaturen aus, so sammelt sich in der Petrischale viel lästiges Kondenswasser, das nur langsam austrocknet und die ganze Agaroberfläche "unter Wasser setzen" kann. Rührt man den Agar nicht auf, so werden manche Platten sehr fest, während andere fast flüssig und daher unbrauchbar werden. Das Ausgießen erfolgt unter einer Sterilbank, die zunächst mit Desinfektionsmittel gereinigt wird. Die sterilen Petrischalen werden in zwei Stapeln zu neun Platten aufgestellt (Abb. 2). Der Agar wird etwa 5 mm hoch in jede Schale eingegossen (ca. 25 ml). Man beginnt mit dem Gießen bei der untersten Platte im Stapel, die darauf stehenden Platten werden vorsichtig mit dem Deckel der Platte angehoben und so der Stapel von unten nach oben gefüllt. Bis zum Erstarren des Agars nicht mehr bewegen! Abb. 2. Gießen von Agarplatten. Leere Petrischalen werden zunächst

gestapelt und danach mit (noch) flüssigem Medium befüllt. Man beginnt mit der untersten Platte und hebt dabei mit deren Deckel alle anderen Platten des Stapels mit ein wenig Balancegefühl ebenfalls hoch. (verändert nach Steinbüchel, Oppermann-Sanio, Mikrobiologisches Praktikum)

Nach Erstarren des Agars läßt man die Platten ca. 2 Tage - Deckel nach unten - trocknen. Danach können die Platten in Plastiktüten eingepackt werden, um sie so vor dem kompletten Austrocknen zu schützen. Eingepackt und bei 4 °C sind sie mindestens vier Wochen haltbar. Kontaminierte Platten sofort aussortieren und zum Autoklavieren geben. Auswertung: Versuch 2 dient lediglich dazu die Materialien für andere Versuche bereitzustellen und soll im Protokoll gar nicht erwähnt werden.

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 3: Impftechniken "Impfen" oder „Animpfen“ bedeutet in der Mikrobiologie das Einbringen von Mikroorganismen in ein Milieu (Medium), in dem diese zuvor nicht enthalten waren. Mögliche Impfinstrumente sind Impf-ösen, Drigalski-Spatel, Pipetten, Spritzen und ähnliches. Die Sterilisation der Impfgeräte erfolgt durch Eintauchen in 70% Alkohol und anschließendes kurzes Abflammen (Drigalski-Spatel), bzw. durch Ausglühen in der Flamme des Bunsenbrenners (Impföse). Mit dem sterilen Impfgerät wird eine kleine Probe einer Mikroorganismenkultur aufgenommen und auf den sterilen Nährboden (Nährmedium) übertragen. Impfen mit Drigalski-Spatel:

Zum gleichmäßigen Verteilen einer Bakteriensuspension auf einem festen Nährboden: Vor und nach dem Impfvorgang wird der Drigalski-Spatel in 70% Ethanol getaucht. Mit einer Pipette wird ein bestimmtes Flüssigkeitsvolumen (50-200 µl) aufgenommen und an mehreren Stellen auf den Nährboden getropft. Vom Drigalski-Spatel wird nun der Alkohol abgeflammt, indem der Spatel kurz durch die Bunsenbrennerflamme (oder Feuerzeug) gezogen wird. Den Spatel nur Feuer fangen lassen, nicht grillen! - denn sonst wird er zu heiß, und die Bakterien, die man ausplattieren möchte, mögen Schaden nehmen! Nach Erlöschen der Flamme Spatel kurz abkühlen lassen und die Flüssigkeit gleichmäßig auf dem Agar verteilen. Impfen mit der Impföse:

Zum Anlegen einer Flüssigkultur bzw. zur Vereinzelung von Bakterien auf festem Nährboden: Vor und nach dem Impfvorgang (Ausstrich) wird die Impföse im heißen Kegel der Flamme ausgeglüht (Abb. 3). Der Schaft der Impföse muss mindestens soweit ausgeglüht werden, wie er mit dem Kulturgefäß in Berührung kommt! Nach dem Ausglühen kühlt man die Öse an der Luft ab und/oder indem man sie in den sterilen Agar am Plattenrand einsticht. Danach berührt man die Kultur, von der abgeimpft werden soll, (wenig abnehmen!!! ein stecknadelkopfgroßes Stück einer Bakterienkolonie enthält bereits 106-107 Bakterien!), und streicht das abgenommene Material auf einer frischen Platte aus. Abb. 3. Ausglühen einer Impföse. (aus Steinbüchel, Oppermann-Sanio,

Mikrobiologisches Praktikum) Anlegen einer Flüssigkultur von Bakterien:

Ausgangsmaterial für viele Experimente ist die sogenannte Übernachtkultur (ÜNK). Darunter ver-steht man eine Flüssigkultur mit Bakterien, die ausgewachsen sind, sich also in der stationären Phase befinden (Titer ≈ 109 cfu/ml bei E. coli). Um eine ÜNK anzulegen, impft man in der Regel mit der Impföse eine Einzelkolonie von einer Agarplatte ab, verteilt sie in wenigen Millilitern Medium und lässt sie über Nacht - daher der Name - unter Schütteln (120-160 rpm) auswachsen. Von dieser Übernachtkultur impft man dann bei Bedarf neues Medium im Volumenverhältnis 1:100 oder 1:50 an und läßt bis zur gewünschten Bakteriendichte wachsen. Bei der Zucht von Bakterien unter aeroben Bedingungen gilt die Faustregel: maximal 20% des Kulturgefäßes (Erlenmeyerkolben) mit Medium füllen!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Fraktionierter Ausstrich zur Erzeugung von Einzelkolonien:

In flüssigem Medium verteilen sich die Bakterien und trüben es; mit bloßem Auge kann man hier nicht entscheiden, ob es sich um eine Reinkultur oder ein Gemisch von Bakterien handelt. Verteilt man einen geringen Teil der Flüssigkultur auf Agar, so bilden sich Kolonien, die aus je einem einzigen Organismus entspringen. Bei Vorkommen von Kolonien mit verschiedener Morphologie (Farbe, Form, Größe) kann die Flüssigkultur keine Reinkultur darstellen. Außerdem erlauben die speziellen Wuchsformen dem Erfahrenen eine vorläufige Einordnung der Mikroorganismen. Das übliche Verfahren zur Gewinnung von Einzelkolonien ist das fraktionierte Beimpfen einer Nähragarplatte. Durch Anwenden dieser Technik kann man sicher sein, dass in einem der Sektoren Einzelkolonien vorliegen.

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/microbiology/streakplate.html Durchführung: Pro Person sollen ausgehend von einer flüssigen E. coli ÜNK mittels fraktioniertem Ausstrich auf einer LB-Agarplatte Einzelkolonien erzeugt werden.

Impföse wenige Sekunden in der Flamme eines Bunsenbrenners bis zum Glühen sterilisieren und ca. 30 Sekunden lang abkühlen lassen.

A) Ausgehend von Stammplatte: Stammplatte mit der Mikroorganismenkultur umgedreht auf dem Tisch ablegen. Boden der Petrischale mit der Mikroorganismenkultur anheben. Öse in einem nicht bewachsenen Bereich der Agaroberfläche abkühlen. Eine Einzelkolonie von der Stammplatte abnehmen. Boden sofort wieder auf den Deckel legen.

B) Ausgehend von Flüssigkultur: Impföse einfach in die Kultur eintauchen.

Den fraktionierten Ausstrich nach Abb. 4 ausführen. Die Impföse dabei flach und nicht verkrampft halten (nicht in den Agar einritzen!). Am Boden beschriftete Platte über Nacht im 37 °C-Brutschrank umgedreht inkubieren. Auswertung:

1. Ist die Ausgangskultur tatsächlich eine Reinkultur von E. coli? 2. Welche Farbe und Kolonieform bildet E. coli aus? 3. Belegen Sie Ihre Aussagen anhand eines Fotos!

1 2 3 4

5 6 7 8

12 11 10 9 13

Abb. 4. Fraktionierter Ausstrich. Boden anheben, mit der Bakterienkolonie an der Öse Striche 1-4 durchführen, Boden auflegen, dann Öse ausglühen und kurz auskühlen lassen. Keine neue Kolonie abimpfen! Striche 5-8 durchführen , danach erneut ausglühen, auskühlen lassen. (Strich 5 geht über Striche 1-4, Strich 6 nur noch über Striche 2-4, ...). Striche 9-12 durchführen, danach erneut ausglühen, auskühlen lassen. Und als letztes Strich 13! Auch danach die Öse ausglühen!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 4: Lichtmikroskop und Zählkammer Zum Auszählen von Mikroorganismen sind im Handel verschiedene Zählkammern erhältlich, die sich in ihrer Netzeinteilung und ihrer Kammertiefe unterscheiden. Durch Aufbringen eines optisch plan geschliffenen Deckglases wird über der Bodenfläche ein definierter Raum (Volumen) abgegrenzt, in dem die Partikel unter dem Mikroskop ausgezählt werden. Wir verwenden eine Neubauer-Zählkammer (Abb. 5) zur Bestimmung von Größen verschiedener Zell-typen und eine Thoma-Zählkammer (Abb. 6) zur Bestimmung des Bakterientiters einer E. coli ÜNK.

http://www.zaehlkammer.de/pdf/info_zaehlkammern.pdf

Abb. 5. Prinzip der Neubauer improved-Zählkammer. Mit der Kammertiefe von 0,1 mm eignet sich diese Kammer für das Auszählen eukaryotischer Zellen. Das große Quadrat in der Mitte ist unterteilt in 5x5 Gruppenquadrate mit einer Seitenlänge von je 0,2 mm und einem Flächeninhalt von je 0,04 mm². Die Gruppenquadrate sind wiederum in 16 Kleinstquadrate von je 0,0025 mm² unterteilt. Für die Keimzählung werden die Gruppenquadrate verwendet, die allseitig dreifache Grenzlinien aufweisen, von denen die mittlere (!) Linie als die eigentliche Maßlinie anzusehen ist. (Verändert nach http://www.zaehlkammer.de/pdf/info_zaehlkammern.pdf).

Abb. 6. Prinzip der Thoma-Zählkammer. Wegen der Kammertiefe von nur 0,02 mm verwenden wir diese Kammer zum Auszählen von prokarytischen Zellen. Das große Quadrat in der Mitte ist unterteilt in 4x4 Gruppenquadrate mit einer Seitenlänge von je 0,2 mm und einem Flächeninhalt von je 0,04 mm². Die Gruppenquadrate sind wiederum in 16 Kleinstquadrate von je 0,0025 mm² unterteilt. Für die Keimzählung werden die Gruppenquadrate verwendet, die allseitig dreifache Grenzlinien aufweisen, von denen die innere (!) Linie als die eigentliche Maßlinie anzusehen ist. Zellen, die auf den Grenzlinien liegen, werden auf zwei aneinander liegenden Seiten (in L-Form) mit-gezählt, aber die an den beiden gegenüber liegenden Seiten (anderes ‚L’) nicht. (Verändert nach http://www.zaehlkammer.de/pdf/info_zaehlkammern.pdf).

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Fragen (Hausaufgabe vor Betreten des Labors):

1. Machen Sie sich mit der Bedienung eines Lichtmikroskops vertraut!

http://www.sinnesphysiologie.de/methoden/mikros/mikroin.htm

http://www.biology.ualberta.ca/facilities/multimedia/index.php?Page=271 vorletzte Animation

2. Bedienen Sie dieses virtuelle Mikroskop! Wie sehen Sie den Buchstaben „E“ unter dem

Mikroskop (E, ∃, e oder ə)? http://www.udel.edu/Biology/ketcham/microscope/

Durchführung: Die zum Befestigen des Deckglases vorgesehenen plan geschliffenen Glasflächen der Kammer durch Anhauchen leicht anfeuchten und das Deckglas so von der Seite her aufschieben, dass auf den beiden Außenstegen NEWTON'sche Ringe sichtbar werden. Deckglas nie in der Mitte drücken, nur über den Außenstegen Druck ausüben! Dadurch ist gewährleistet, dass sich das Deckglas in reproduzier-barem Abstand vom Boden der Kammer befindet. Nun wird die Bakterien-/Zellsuspension am Rand zwischen Deckglas und Kammer aufgetragen, so dass sich die Flüssigkeit unter das Deckglas saugt und die Kammer vollständig befüllt ist. Durch die Wärme des Mikroskopenlichts kann die Flüssigkeit mit der Zeit am Rand langsam verdampfen, wodurch sich die Partikel in der Mitte der Zählkammer aufkonzentrieren. In diesem Fall müssen Sie die andere Kammerhälfte frisch befüllen und diese aus-zählen! Oder Zählkammer putzen und mit der ganzen Prozedur neu anfangen… 1) Stellen Sie eine geeignete Verdünnung der E. coli ÜNK her! Tragen Sie nun davon ein kleines Volumen (ca. 2 µl) mit einer Pipette auf die Thoma-Zählkammer (Tiefe 0,02 mm) auf und zählen Sie fünf „Gruppenquadrate“ aus!

2) Von den Assistenten bekommen Sie eine Mischung von Bakteriophage λ, E. coli, Saccharomyces cerevisiae und menschlichen Zellen aus einer Zellkultur. Befüllen Sie die eine Kammerhälfte einer Neubauer improved Zählkammer (Tiefe 0,1 mm) mit dieser Mischung (ca. 10 µl)! Beobachten und skizzieren Sie die verschiedenen Zelltypen und ihre Größen! Zählkammern und Deckgläschen mit 70% Ethanol reinigen und vorsichtig abtrocknen! Auswertung:

1. Wie viele Zellen (Keimzahl/ml) enthält diese ÜNK von E. coli? Literaturvergleich! 2. Welchen ungefähren Durchmesser haben die verschiedenen Zelltypen? Fertigen Sie dazu eine

beschriftete Skizze an! Vergleichen Sie tabellarisch Ihre selbst bestimmten Werte mit Literatur-daten!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen TAG 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen __________________________________________________________________________________ An diesem Versuchstag sollen Mikroorganismen aus der Umwelt isoliert und quantifiziert werden:

• Im Labor • Vom Daumen • Zu Hause • Aus Hackfleisch • Aus Erde • Aus Milch

Versuch 5: Bestimmung der Kontaminationsgefahr Weder der Raum, in dem wir arbeiten, noch der Mensch selbst ist keimfrei. Aus diesem Grund möchten wir Art und Menge an Keimen aus A) der Umgebungsluft des Raumes und B) an den Händen bestimmen.

Zum Nachschlagen (wird nicht abgefragt)! http://textbookofbacteriology.net/normalflora.html

Durchführung: Luft: Stellen Sie eine LB-Platte für eine von ihnen bestimmte Zeit offen im Labor aus! Inkubieren Sie die Platte bei RT! Wachsen u.a. kleine gelbe Kolonien heran?

Auswertung:

1. Dokumentieren Sie das Wachstum mit Fotos nach 3 oder 4 Tagen. 2. Beschreiben Sie die Vielfalt der Mikroorganismen anhand Form, Größe und Farbe der Kolonien! 3. Warum findet man in der Luft oft pigmentierte Bakterien?

Durchführung: Hand: Vierteln Sie eine LB-Platte auf der Unterseite mit einem Edding! Zwei Personen einer Gruppe möchten zart einen Daumen in je einem Viertel auflegen, danach die Hände ordentlich mit Seife oder 70% Ethanol waschen (besonders den Daumen) und erneut in den zwei noch freien Vierteln auflegen. Die Platte wird bei 37 °C inkubiert. Auswertung:

1. Dokumentieren Sie das Ergebnis mit einem Foto! 2. Diskutieren Sie ausführlich die Ergebnisse gewaschener/ungewaschener Daumen!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 6: Platte von zu Hause Freiwillig! Durchführung: Pro Person eine LB-Platte mit Parafilm versiegeln (einen schmalen Streifen durch Ziehen am Rand herum wickeln) und mit nach Hause nehmen! Dort mit einem Wattestäbchen eine geeignete Probe nehmen (bloß keine Krankheitskeime!) und ausstreichen oder den Hamster zart auf die Platte drücken oder ähnliches..... (Vor der Probenentnahme mit einem Wattestäbchen, dieses zunächst auf einem Viertel der Platte ausstreichen als Nullkontrolle) Platten versiegeln und am nächsten Tag wieder mitbringen!!! Danach 4 Tage umgedreht bei RT bebrüten! Versuch 6 braucht im Protokoll nicht aufgeführt werden! Er wird nicht bewertet!

______________________ Versuch 7: Keimzahlbestimmung des Hackfleischs Durchführung: Mitzubringen sind etwa 40 g Hackfleisch (am besten vom Rind). Das reicht für alle 26 Gruppen! 1 g Hackfleisch in 10 ml sterilem Wasser 10 min schütteln. Vom Überstand eine 1:10 und eine 1:1000 Verdünnung mit sterilem Wasser herstellen. Je 100 µl auf je einer LB-Platte ausplattieren. Die Platten über Nacht umgedreht bei 37 °C inkubieren. Auswertung:

1. Beschreiben Sie die Vielfalt der gewachsenen Mikroorganismen (Fotobeleg)! 2. Skizzieren Sie die Verdünnungsreihe und geben Sie für jede Verdünnungsstufe die Keimzahl pro

ml (bzw. pro g) an! 3. Berechnen und diskutieren (Grenzwertbestimmungen, z.B. der Europäischen Union!) Sie die

Keimzahl in cfu/g Hackfleisch! Mittelwert der beiden Platten angeben!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 8: Keimzahlbestimmung einer Bodenprobe Durchführung: 0,1 g Bodenprobe in 10 ml sterilem Wasser 10 min schütteln. Vom Überstand eine 1:10 und 1:1000 Verdünnung mit sterilem Wasser herstellen. Jeweils 100 µl auf je einer LB-Platte ausplattieren. Die Platten für 4-8 Tage bei RT umgedreht inkubieren. Auswertung:

1. Beschreiben Sie die Vielfalt der gewachsenen Mikroorganismen (Fotobeleg)! 2. Skizzieren Sie die Verdünnungsreihe und geben Sie für jede Verdünnungsstufe die Keimzahl pro

ml (bzw. pro g) an! 3. Berechnen und diskutieren Sie die Keimzahl in cfu/g Boden! Mittelwert der beiden Platten angeben!

______________________ Versuch 9: Isolierung von Chromo-/ Janthinobakterien aus der Erde Freiwillig! Auf sterilisierten Reiskörnern lassen sich aus einer Bodenprobe relativ leicht Bakterien anreichern, die violett gefärbte Kolonien bilden. Es handelt sich hierbei meist um Gram-negative, der Gruppe der β-Proteobakterien zugehörige Bakterien der Gattungen Chromobacterium und Janthinobacterium. In dem folgendem Versuch sollen Vertreter dieser Gattungen angereichert werden, die in Gegenwart von Tryptophan violett bis dunkelblau erscheinende Kolonien bilden. Die Färbung ist auf das wasser-unlösliche Pigment Violacein zurückzuführen. Durchführung: Erde in eine Petrischale füllen. 10-20 Reiskörner auf die Oberfläche streuen. Erde mit Leitungswasser benetzen, bis sie gut angefeuchtet ist. Petrischale mit Deckel bei RT inkubieren. Untersuchen Sie täglich die Oberfläche der Reiskörner auf violette Verfärbung! Versuch 15 soll im Protokoll nicht aufgeführt werden! Er wird nicht bewertet!

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Tag 2: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen Versuch 10: Keimzahlbestimmung der Milch In die Milch können während des Melkvorganges zwei Gruppen von Bakterien gelangen: Milchsäure-bakterien aus dem Strichkanal der Zitze und Schmutzkeime aus der Umgebung. Bis zur Weiterverarbeitung in der Molkerei können sich die Keime in der Rohmilch vermehren und müssen daher z. B. durch Kurzzeiterhitzung (45 sec auf 70-74 °C) oder durch Hocherhitzung (15 sec auf 85-95 °C) für eine längere Haltbarkeit wieder reduziert werden.

Der Chinablaulactose-Agar dient zur Keimzahlbestimmung und Differenzierung von Bakterien aus Milch. Er enthält Laktose, deren Abbau zu Milchsäure vom pH-Indikator Chinablau durch einen Farbumschlag nach Dunkelblau angezeigt wird. Milchsäurebakterien bilden auf Chinablaulactose-Agar dunkelblaue Kolonien, oft mit einem dunkelblauem Hof umgeben. Die beiden häufigsten Gattun-gen sind Streptococcus und Lactobacillus. Ihre Kolonien sind sehr klein, stecknadelspitzengroß (sehr langsam wachsend), und auf Nährböden ohne blauen Indikator weiß. Die Nichtmilchsäurebildner wachsen auf Chinablaulactose-Agar in Form weißer Kolonien, ohne den Nährboden tiefblau zu ver-färben. Oft entfärben sie sogar das Medium durch Ausscheidung alkalischer Stoffwechselprodukte.

http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C11/C11Links/www.bact.wisc.edu/microtextbook/metabolism/Fermentation.html Fragen (Hausaufgabe vor Betreten des Labors): 1) Welche Endprodukte liefern die homo- und die heterofermentative Milchsäuregärung?

(mit Strukturformeln!)

2) Bilanzieren Sie Vor- und Nachteile der Gärung im Vergleich zur Atmung! Durchführung: Mitzubringen sind 20 ml Rohmilch. Das reicht für alle 26 Gruppen! 500 µl Rohmilch in ein steriles Eppi abfüllen. Je 100 µl unverdünnter, 1:10 verdünnter und 1:100 verdünnter Rohmilch auf zwei Chinablau-Lactose-Agarplatten ausplattieren. Restliche Rohmilch für 30-60 sec in ein 70 °C warmes Wasserbad tauchen (pasteurisieren). Davon wiederum unverdünnt bzw. 1:10 bzw. 1:100 verdünnt jeweils 100 µl auf zwei Chinablau-Lactose-Agarplatten ausplattieren. Platten umgedreht über Nacht bei 37 °C bebrüten. Auswertung:

1. Beschreiben Sie die Vielfalt der gewachsenen Mikroorganismen (Fotobeleg)! 2. Skizzieren Sie die Verdünnungsreihe und geben Sie für jede Verdünnungsstufe die Keimzahl pro

ml an! 3. Berechnen und diskutieren Sie die Keimzahl in cfu/ml Milch vor und nach der Hitzebehandlung!

Unterscheiden Sie dabei zwischen Säurebildnern und Nichtsäurebildnern!

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Tag 3: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen

TAG 3: Physiologische Tests zur Identifizierung von Bakterien __________________________________________________________________________________ In diesem Abschnitt sollen einige wenige und leicht durchzuführende physiologische Tests sowie zwei Methoden zur Untersuchung der bakteriellen Zellwand erlernt werden. Dazu werden fünf verschiedene Testorganismen mit folgenden Tests untersucht:

• Gelatineabbau • Katalse-Test • Citratverwertung • Stärkeabbau • KOH-Test (zur Charakterisierung der Zellwand) • Gram-Färbung (zur Charakterisierung der Zellwand)

Identifizierung von Bakterien heißt, so wenige Eigenschaften wie möglich und so viele wie nötig zu bestimmen, um einer unbekannten Kultur ihren Platz im Klassifikationssystem zuordnen und sie damit auch benennen zu können. Grundsätzlich können vier Gruppen von Eigenschaften für die Identifizierung herangezogen werden: 1) Morphologische Merkmale einschließlich des Färbeverhaltens werden mit dem Lichtmikroskop festgestellt: Größe, Form und Pseudozellverbände (Abb. 7), Färbeverhalten (gram+/ gram-), Flagellen (Ausbildung, Anordnung), Kapsel (ja, nein), Sporen (Ausbildung, Form).

Kokken Diplokokken Staphylokokken Streptokokken

Stäbchen Spirillen Coryneforme

Abb. 7. Typische bakterielle Wuchsformen

2) Physiologische Merkmale (spezielle Stoffwechselwege, Enzyme, Resistenzen/ Empfindlichkeiten) werden mit Indikatormedien nachgewiesen. Diese zeigen häufig die Änderung des pH-Wertes mit Hilfe von pH-Indikatoren an. 3) Chemische Merkmale werden zur Identifizierung schon lange verwendet, z.B. beim Nachweis der Antigenstruktur. 4) Molekularbiologische Merkmale, z.B. 16S rRNA Sequenz.

Ein online verfügbares Spiel vermittelt recht realistisch das Identifizieren von Krankheitserregern im Diagnoselabor.

Wer möchte, kann sich ein gutes Weilchen damit vergnügen. (kein Zwang!) http://outreach.gtldna.com/outbreak/

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Tag 3: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen

Die fünf Testorganismen: Escherichia coli XL1 blue MRF’ Bacillus subtilis Micrococcus luteus Pseudomonas fluorescens Lactobacillus pentosus

Versuch 11: Gelatineabbau Durchführung: Überführen Sie je 500 µl flüssiges LB-Medium in fünf sterile Eppis! Beschriften Sie die Eppis mit den Namen der Testorganismen und beimpfen Sie per Impföse jedes Eppi mit einem der fünf Bakterien! Inkubieren Sie die Eppis über Nacht bei 37 °C im Brutschrank! Am nächsten Tag tunken Sie einen langen, schmalen Streifen (0,5 cm x 3 cm) von einem belichteten und entwickelten Farbfilm zur Hälfte in die Kulturflüssigkeit! Inkubieren Sie die Eppis 3 h oder über Nacht bei 37 °C! Versuch 12: Katalase-Test Durchführung: Nehmen Sie mit einem Zahnstocher je Bakterienart eine Probe und streichen Sie diese auf einem gemeinsamen Objektträger ab. Geben Sie je einen Tropfen 3% H2O2 auf die Bakterien und notieren Sie Ihre Beobachtungen! Versuch 13: Citratverwertung Durchführung: Unterteilen Sie durch Markierung am Boden eine Citratagar-Platte in fünf Sektoren! Beschriften Sie die Sektoren mit den Namen der Testorganismen und streichen Sie pro Sektor je eine Bakterienart aus (nur ein Strich, Erzeugung von Einzelkolonien nicht nötig!). Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C! Versuch 14: Stärkeabbau Durchführung: Unterteilen Sie durch Markierung am Boden eine Stärkeagar-Platte in fünf Sektoren! Beschriften Sie die Sektoren mit den Namen der Testorganismen und streichen Sie pro Sektor je eine Bakterienart aus! (Nur ein Strich, Erzeugung von Einzelkolonien nicht nötig!) Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 °C! Am nächsten Versuchstag geben Sie einige Tropfen der Lugol'schen Lösung auf die Platte Und notieren Sie die Farbänderung!

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Tag 3: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen

Protokollhinweise zu den Versuchen 5-8:

1. Erklären Sie in der Einleitung, welche Bedeutung die in Versuchen 5-8 nachgewiesenen Enzyme für Bakterien haben!

2. Erklären Sie in der Einleitung, wie der jeweilige Test funktioniert und welche Reaktion Sie beim positiven bzw. negativen Nachweis erwarten! Selbst recherchieren!

3. Die Ergebnisse der Versuche 5-8 (Beobachtungen und Folgerungen) sollen gemeinsam in einer übersichtlichen Tabelle dargestellt werden! Dabei Legende nicht vergessen! Einfach +/- oder positiv/ negativ zu schreiben reicht nicht, wenn nicht im Text oder in der Legende erklärt ist, was damit bei den einzelnen Versuchen gemeint ist!

4. Belegen Sie Ihre Aussagen anhand von Fotos! 5. Vergleichen Sie Ihre Ergebnisse mit der begleitenden im Praktikum ausliegenden Literatur (siehe

Anhang)!

______________________ Charakterisierung bakterieller Zellwände Mit Hilfe differenzierender Färbungen (wie z. B. der Gram-Färbung) lassen sich Bakterien aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung ihrer Zellwände einordnen. Die Gram-Färbung differenziert die Bakterien dadurch, dass ein wasserunlöslicher violetter Farbstoff aus gramnegativen, aber nicht aus grampositiven Bakterien mit Ethanol ausgewaschen werden kann. Diese unterschiedliche Färbbarkeit ist immer noch das wichtigste Kriterium bei der Einordnung eines Bakteriums. Eine schnellere, aller-dings nicht immer so eindeutige Alternative zur Gram-Färbung stellt der KOH-Test dar. Fragen (Hausaufgabe vor Betreten des Labors):

1) Aus welchen Komponenten sind Gram+ und Gram– Zellwände aufgebaut?

2) Neben Bakterien, welche anderen Organismen besitzen ebenfalls Zellwände und woraus bestehen diese?

Versuch 15: KOH-Test Aufgrund des Zellwandaufbaus platzen gramnegative Bakterien in KOH-Lösung und setzen ihre DNA frei, so dass sich mit einem Zahnstocher Fäden (viskose DNA-Lösung) ziehen lassen. Grampositive Bakterien bleiben in der KOH-Lösung intakt und die Lösung zeigt sich homogen trüb. Durchführung: Legen Sie fünf kleine Tropfen 3% KOH-Lösung auf einem Objektträger vor und reiben Sie mit einem Zahnstocher einen Teil einer Bakterienkolonie ein! Testen Sie alle Bakterienarten! Verwenden Sie nur einen Objektträger und spülen Sie diesen nach Ethanol-Behandlung bitte für die nächste Gruppe! Auswertung: Der Versuch soll im Protokoll gemeinsam mit der Gram-Färbung aufgeführt und ausgewertet werden!

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Tag 3: Isolierung und Quantifizierung von Mikroorganismen

Versuch 16: Gram-Färbung

Theorie in bunt: https://www.microbelibrary.org/images/keen/gramstainkeen.htm

Durchführung: Material: Kristallviolett-Lösung, Lugol'sche Lösung, 96% Ethanol, Safranin-Lösung,

verschiedene Bakterien: Escherichia coli, Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Lactobacillus pentosus

Handschuhe tragen! 1) Ausstreichen auf Objektträger

Auf einen sauberen, am Rand markierten Objektträger werden drei kleine Tropfen Aqua dest. gebracht. Mit einer sterilen Impföse/Zahnstocher entnimmt man von einer Kolonie einer Agarplatte eine kleine Menge Bakterien und verreibt sie sorgfältig in dem einen Tropfen Wasser, so dass eine dünne, gleich-mäßige Bakteriensuspension entsteht. Gefärbt werden sollen E. coli, M. luteus und eine Mischung der beiden Bakterienarten (Abb. 8). 2) Hitzefixierung

Der Objektträger wird mit der Schichtseite nach oben mehrmals kurz durch die Flamme eines Bunsen-brenners (gerade entleuchtete Flamme, nicht prasselnd) gezogen, bis die Flüssigkeit verdunstet (nicht kochen!) und das Präparat fixiert ist. Vor dem Färben lässt man den Objektträger abkühlen.

3) Färbung

Auf den Objektträger mit den fixierten Bakterien Kristallviolettlösung auftropfen, 1 min einwirken lassen, danach mit Aqua dest. abspülen. Lugolsche Lösung auftropfen, nach 1 min mit Aqua dest. abspülen. Gründlich mit Ethanol spülen, bis keine Farbwolken mehr vom Präparat abgehen. Mit Aqua dest. spülen. Safraninlösung auftropfen, 1 min einwirken lassen, mit Aqua dest. spülen.

4) Mikroskopieren

Das Präparat kann nun nach Zugabe eines Tropfen Wassers unter einem Deckglas und nach Zugabe von einem Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas – nur unter Verwendung des Immersionsöl-objektives!!!! (100x) – mikroskopiert werden. Dazu am besten geeignet sind Stellen am Rand der Präparate, an denen die Bakterien nicht so dicht aneinander liegen! Nun kann Färbung, Form und Anordnung der Bakterien beobachtet werden. Auswertung:

1. Erklären Sie die Theorie der Gram-Färbung! 2. Fertigen Sie ein Foto vom mikroskopischen Bild der Bakterienmischung an! Beschreiben Sie die

Färbung der Zellen, ihre Form und ihre Anordnung zueinander (Haufen, Ketten...)! 3. Vergleichen Sie Ihre Beobachtungen mit dem KOH-Test und der Literatur (Färbung und Form)!

Ansatzpunkt für Klammer

Abb. 8. Belegungsschema eines Objektträgers für die Gram-Färbung. Drei verschiedene Bakteriensuspensionen können auf einem Objektträger analysiert werden. Lassen Sie links und rechts unbedingt etwa 1,5 cm Rand frei! Greifen Sie den Objektträger an der markierten Seite mit einer Klammer!

E. coli M. luteus E. coli M. luteus

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Tag 4: Hemmen des bakteriellen Wachstums

TAG 4: Hemmen des bakteriellen Wachstums __________________________________________________________________________________ Verschiedene Einflüsse können das Wachstum von Bakterien unterdrücken, z. B.

• Antibiotika • UV-Strahlung • Bakteriophagen

Versuch 17: Nachweis der Wirkung von Antibiotika - Der Hemmhoftest Die ersten Antibiotika wurden rein zufällig an der Bildung von Hemmhöfen entdeckt. Werden auf eine mit Indikatorbakterien beimpften Agarplatte Substanzen aufgetropft, welche antimikrobiell wirksam sind, so entstehen abgegrenzte Bereiche (Hemmhöfe), in denen kein Wachstum möglich ist. So lassen sich bei Verwendung unterschiedlicher Indikatororganismen bzw. Antibiotikakonzentrationen Aus-sagen über das Wirkungsspektrum bzw. die Wirkungsintensität des Antibiotikums machen.

Erarbeiten Sie sich einen Überblick über die verschiedenen bakteriellen Zielstrukturen der Antibiotika http://129.109.115.69/microbook/ch011.htm

Durchführung: Jede Gruppe untersucht Escherichia coli XL1 Blue MRF’ (Stratagene) und Micrococcus luteus auf deren Empfindlichkeit gegen Antibiotika auf insgesamt vier LB-Platten. • 0,1 ml einer flüssigen ÜNK auf LB-Agarplatte gleichmäßig ausstreichen und die Platte zehn min bei

RT inkubieren, bis die Bakteriensuspension vollständig eingezogen ist. • Die Platte auf der Unterseite in vier Sektoren aufteilen und beschriften (Abb. 9). • Filterblättchen mit Locher ausstanzen. • Pinzette in 70% Ethanol tauchen und kurz abflammen. • Filterblättchen mit steriler Pinzette in Antibiotikumlösung tränken und auf saugfähigem Papier

abtupfen. • Je 4 Filterblättchen auf die vorbereiteten Platten legen! • Zwischen zwei Lösungen Pinzette immer wieder säubern und sterilisieren!

2x Platte A: Kanamycin, 0,2 mg/ml Ampicillin, 0,2 mg/ml Lysozym, 1 mg/ml H2Osteril (Kontrolle)

2x Platte B: Kanamycin, 0,6 mg/ml

Ampicillin, 0,6 mg/ml Lysozym, 10 mg/ml H2Osteril (Kontrolle)

• Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten! Nicht umdrehen! Auswertung:

1. Erklären Sie in der Einleitung den Wirkmechanismus der im Versuch verwendeten Antibiotika! 2. Sind Hemmhöfe zu beobachten? Wenn ja, wie verhält sich die Größe der Hemmhöfe zur Art und

Konzentration der Antibiotika? Fotobelege! 3. Erklären Sie kurz, weshalb die Wirksamkeit bei gram + und gram – Bakterien schwanken kann!

Abb. 9. Belegungsschema für Hemmhoftest. Platten werden auf dem Boden in vier Sektoren unterteilt und beschriftet.

Km Amp

Lys H2O

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Tag 4: Hemmen des bakteriellen Wachstums

Versuch 18: UV-Bestrahlung Mutationen sind natürliche, nicht gerichtete Ereignisse, welche die Erbinformation eines Individuums verändern, damit zur Optimierung und Anpassung an sich verändernde Umweltbedingungen beitragen und so die Grundlage der Evolution bilden. Treten Mutationen allerdings gehäuft auf, z.B. durch erhöhte Strahlungsdosen oder bestimmte Chemikalien, so sind diese für einen Organismus oft letal. Durchführung: 1. Schritt: 100 µl einer ÜN-Kultur von E. coli werden mit 9,9 ml LB-Medium in einem Falcon-

Röhrchen verdünnt.

2. Schritt: Es werden ausgehend von dieser Bakteriensuspension fünf Verdünnungsreihen erstellt.

(1) zur t0-Bestimmung (= Bakterienzahl vor der Bestrahlung): Für den t0-Wert verdünnt jede Gruppe in 1:10-Verdünnungsschritten die Bakteriensuspension in Eppis soweit mit LB-Medium, dass eine zählbare Menge von Bakterien (ca. 50-500 Zellen) auf zwei LB-Platten ausplattiert werden kann.

(2-5) zur Bestimmung der Absterberate nach UV-Bestrahlung: Der Rest der 10 ml Bakteriensuspension wird in eine sterile, leere Petrischale gegossen und mit einer UV-Lampe, die Licht der Wellenlänge 254 nm abgibt, für 30, 60, 90 und 120 sec lang bestrahlt. Bei Bestrahlung Petrischalendeckel abnehmen, denn Plastik absorbiert UV-Licht! Ziehen Sie alle 30 Sekunden eine 1 ml Probe und lagern Sie sie in Eppis auf Eis! Verdünnen Sie schließlich die bestrahlten Proben in LB in 10er-Schritten so, dass eine zählbare Menge von Bakterien auf je zwei LB-Platten pro Bestrahlungszeit ausplattiert werden kann. Erfahrungsgemäß sterben nach zwei Minuten Bestrahlung etwa 90% der Bakterien ab.

Alle Platten werden bei 37 °C über Nacht umgedreht inkubiert.

Bevor Sie mit dem Versuch anfangen, legen Sie ihre Verdünnungsreihen bei einem Assistenten vor! Nach dem Versuch entleeren Sie die Petrischale in einem Abfallbehälter (Erlenmyerkolben) und geben Sie sie zum Autoklavieren. Das Falconröhrchen kommt auch in den Autoklaviermüll! Auswertung:

1. Erklären Sie in der Einleitung den molekularen Wirkmechanismus von UV-Licht! 2. Entwerfen Sie eine Skizze, die alle experimentellen Schritte darstellt! 3. Berechnen Sie den Mittelwert der beiden Platten für t0 und t30-t120 und berechnen Sie damit den

Prozentsatz überlebender Bakterien zu allen Bestrahlungszeiten! Fassen Sie Ihre Ergebnisse (Rohdaten und ausgewertete Daten) in einer übersichtlichen Tabelle zusammen!

4. Zeichnen und erläutern Sie die Absterbekurve (Prozent lebender Bakterien gegen Bestrahlungsdauer)!

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Tag 4: Hemmen des bakteriellen Wachstums

Versuch 19: Nachweis von Bakteriophagen Bakterienzellen können von Bakteriophagen (Viren) befallen werden. Sind E. coli Bakterien von einem Phagen (gr. phagein = essen) infiziert, so kann sich der Phage im Bakterium vermehren und anschließend seine Wirtszelle auflösen (lysieren). Dabei werden 20 bis 400 neue Phagen freigesetzt, welche wiederum andere Bakterien infizieren können und den Vermehrungszyklus wiederholen. Bakteriophagen werden mit der Weichagar-Schichtmethode indirekt durch die Bildung von Plaques (hellen Löchern im Weichagar) in einem trüben Bakterienrasen nachgewiesen. Der Durchmesser eines Plaques kann je nach Phagentyp zwischen 0,2 und 10 mm betragen; außerdem erscheinen sie verschieden transparent. Es gibt klare Plaques, die durch vollständige Lyse der Bakte-rien entstehen und trübe Plaques, die immer dann auftreten, wenn sich innerhalb des Plaques Bakterien befinden, die nicht lysiert wurden. Da bei der Bestimmung des Phagentiters in der Regel 108 Bakterien mit maximal 103 - 104 Phagen infiziert werden, entspricht die Anzahl der Plaques direkt der Anzahl infektiöser Phagenpartikel.

http://www.blackwellpublishing.com/trun/artwork/Animations/Lambda/lambda.html Durchführung: • Eine LB-Agarplatte auf 37 °C vorwärmen und beschriften. • 4 ml Weichagar (0,7% Agar in LB-Medium) auf 48 °C vorwärmen (gibt’s beim Assi!). • 1 µl einer λ-Phagensuspension (λ Fix II, Stratagene) an den Rand knapp über den Boden eines 1,5

ml Eppendorfgefäß pipettieren. • 200 µl einer E. coli XL1 Blue MRF’ Flüssigkultur in logarithmischer Wachstumsphase (gibt’s auch

beim Assi!) zugeben und mischen. • 15 min bei 37 °C inkubieren. • Vorgewärmte LB-Platte bereitstellen. • Bakterien-Phagengemisch komplett zu Weichagar pipettieren. • Sofort ausgießen auf LB-Platte, und durch vorsichtiges Kippen gleichmäßig verteilen. • Platte bis zum Erstarren (3 min) nicht mehr bewegen. • Umgedreht bei 37 °C über Nacht inkubieren. Auswertung:

1. Beschreiben Sie die Morphologie und Anzahl von aufgetretenen Plaques! Fotobeleg! 2. Berechnen Sie den Phagentiter in pfu/ml! 3. Wie lassen sich „trübe“ Plaques erklären?

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Anhang

ANHANG __________________________________________________________________________________ Rezepte für Medien Chinablau-Laktose-Agar Zubereitung: 35,5 g Chinablau-Laktose-Fertigmedium werden unter Schwenken in 1 l Aqua dest. suspendiert. Danach autoklavieren und Platten gießen. Der pH-Wert des gebrauchsfertigen Nährbodens liegt bei 25 °C bei 7,0 ± 0,2. Der hemmstofffreie Nährboden enthält Lactose als Reaktionskörper, deren Abbau zu Säure vom pH-Indikator Chinablau durch einen Farbumschlag nach dunkelblau angezeigt wird.

Zusammensetzung: Fleischextrakt 3,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l Lactose 10,0 g/l Natriumchlorid 5,0 g/l Chinablau 0,375 g/l Agar 12,0 g/l

Citratagar Zubereitung: 22,5 g Fertigmedium werden in 1 l Aqua dest. suspendiert und unter häufigem Um-schütteln schonend bis zum Kochen erhitzt. Der Kochvorgang wird bis zum vollständigen Auflösen fortgesetzt. Danach autoklavieren und Platten gießen. Der pH-Wert des gebrauchsfertigen Nährbodens liegt bei 25 °C bei 6,6 ± 0,2. Wichtig: Platten dürfen nicht kälter als RT gelagert werden!

Zusammensetzung: NH4H2PO4 1,0 g/l K2HPO4 1,0 g/l NaCl 5,0 g/l Na-citrat 2,0 g/l MgSO4 0,2 g/l Bromthymolblau 0,08 g/l Agar 13,0 g/l

LB-Medium (Luria-Bertani) – für 1 Liter

Zusammensetzung: Bacto-Tryptone 10 g Bacto-Yeast Extrakt 5 g NaCl 10 g 2 M NaOH 1 ml ad 1 l destilliertes Wasser

Autoklavieren und Platten gießen. LB-Platten: dem flüssigen LB-Medium müssen vor dem Autoklavieren noch 1,5% w/v Agar zugegeben werden.

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Anhang

LB-Weichagar 100 ml flüssiges LB-Medium in einem Erlenmeyerkolben werden mit 0,7% w/v Agar versetzt und in der Mikrowelle aufgekocht, vorsichtig geschüttelt (Siedeverzug!), bis keine Schlieren mehr zu sehen sind. Danach wird das noch flüssige Medium mit einer Glaspipette auf 25 Reagenzgläser verteilt: je 4 ml Weichagar/Reagenzglas. Reagenzgläser mit Alukappen verschließen, autoklavieren. Nach dem Autoklavieren mit Parafilm versiegeln und bei 55 °C aufbewahren! Saccharose-Agar

Zusammensetzung: Trypton 10 g/l Hefeextrakt 5 g/l Saccharose 50 g/l Gelatine 10 g/l K2HPO4 3 g/l Agar 20 g/l

ad 1 l destilliertes Wasser Autoklavieren und Platten gießen. Stärkeagar

Zusammensetzung: Lösliche Stärke 3,0 g Hefeextrakt 0,2 g Pepton aus Casein 0,3 g KH2PO4 0,5 g MgSO4 x 7H2O 0,2 g Agar 15,0 g ad 1 l destilliertes Wasser

Autoklavieren und Platten gießen.

______________________ Abkürzungsverzeichnis

cfu colony forming units DNA Desoxyribonukleinsäure GZZ Gesamtzellzahl LB ' Luria-Bertani ' Nährmedium LZZ Lebendzellzahl pfu plaque forming units rpm rounds per minute RT Raumtemperatur üN über Nacht ÜNK Übernachtkultur

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Anhang

Literatur Lehrbücher zur allgemeinen Mikrobiologie:

Madigan/ Martinko, Brock Biology of Microorganisms 11th edition (2006), Prentice-Hall Tortora/ Funke/ Case Microbiolgy 9th edition (2006), Pearson Schlegel Allgemeine Mikrobiologie 7. Auflage (1992), Thieme Verlag

In folgenden Büchern finden Sie versuchsbegleitende Informationen. Diese Bücher werden für Sie im Praktikum bereitgelegt!

Alexander/ Strete Mikrobiologisches Grundpraktikum – Ein Farbatlas 1. Auflage, 2001, Pearson Studium

Steinbüchel/ Oppermann-Sanio Mikrobiologisches Praktikum 1. Auflage, 2003, Springer Verlag Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Editors Don J. Brenner, Noel R. Krieg, James T. Staley 2nd ed., volumes 2A, 2B , 2C , 2005, Springer Verlag

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