MikroRNA-21 als Regulator der PI3K/AKT-Signalkaskade im ... · Aus der Klinik und Poliklinik für...

Aus der Klinik und Poliklinik für Gynäkologie

(Univ.-Prof. Dr. med. Marek Zygmunt)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

MikroRNA-21 als Regulator der PI3K/AKT-Signalkaskade

im Endometriumkarzinom

Inaugural - Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der Universitätsmedizin

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2017

vorgelegt von: Tobias Stiefel

geb. am: 06.11.1990

in: Bretten

Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur

1. Gutachter: Prof. Dr. A. Mustea

2. Gutachter: Frau PD Dr. I. Braicu

Ort, Raum: Greifswald, Seminarraum P01.37

Tag der Disputation: 20.03.2019

Meiner Schwester und meiner Tante Lydia

Inhaltsverzeichnis

II

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................... IV

1 Einleitung .......................................................................................................... 1

1.1 Das Endometriumkarzinom – Einordnung in den klinischen Kontext .......... 1

1.2 PI3-Kinase/AKT-Signalkaskade .................................................................. 5

1.3 MikroRNA-21 als Regulator der PI3K/AKT-Signalkaskade.......................... 8

1.4 Zielsetzung ................................................................................................ 11

2 Material und Methoden .................................................................................. 12

2.1 Chemikalien und kommerzielle Lösungen ................................................. 12

2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien ............................................................ 14

2.3 Puffer und Lösungen ................................................................................. 16

2.4 Antikörper .................................................................................................. 17

2.5 Enzyme ..................................................................................................... 17

2.6 Vektoren .................................................................................................... 17

2.7 Zelllinien .................................................................................................... 18

2.8 Zellkulturmedien, -lösungen und -zusätze ................................................. 18

2.9 Software .................................................................................................... 18

2.10 Zellbiologische Methoden .......................................................................... 19

2.10.1 Kultivierung und Passagieren von Zellen ............................................ 19

2.10.2 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen ....................................... 19

2.10.3 Bestimmung der Zellanzahl ................................................................. 20

2.10.4 Transiente Transfektion ....................................................................... 21

2.10.5 Bestimmung der Zellmobilität per Scratch Assay ................................ 21

2.11 Biochemische Methoden ........................................................................... 22

2.11.1 Proteinisolierung .................................................................................. 22

Inhaltsverzeichnis

III

2.11.2 Western Blot ........................................................................................ 22

2.12 Molekularbiologische Methoden ................................................................ 24

2.12.1 RNA-Isolierung .................................................................................... 24

2.12.2 RNA-Konzentrationsbestimmung ........................................................ 24

2.12.3 Reverse Transkription ......................................................................... 24

2.12.4 Quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR) .............. 25

3 Ergebnisse ...................................................................................................... 27

3.1 Charakterisierung der Endometriumkarzinom-Zelllinien MFE-296 und

MFE-280 hinsichtlich ihrer Proliferation und Migration .............................. 27

3.2 Basalexpression von miR-21 und den Proteinen PTEN, AKT,

PI3K p110α/β/γ in den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280 ................... 29

3.3 Etablierung der transienten Transfektion der EC-Zelllinien MFE-296 und

MFE-280 zur Überexpression von miR-21 ................................................ 31

3.4 Detektion der Auswirkungen auf den proliferativen Pathway auf Protein-

Ebene nach miR-21-Überexpression......................................................... 32

3.4.1 PTEN-Expression und Phosphorylierung nach miR-21-

Überexpression in den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280 ............. 33

3.4.2 PI3K-p110α/β/γ-Expression nach miR-21-Überexpression in den

EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280 .................................................. 35

3.4.3 AKT-Expression und Phosphorylierung nach miR-21

Überexpression in den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280 ............. 37

4 Diskussion ...................................................................................................... 41

Zusammenfassung ................................................................................................. 52

Literaturverzeichnis................................................................................................ 53

Abkürzungsverzeichnis

IV


Abkürzung

Erklärung

Abb Abbildung

AGO Arbeitsgemeinschaft für Gynäkologische Onkologie

APS Ammoniumperoxodisulfat

AS

BMI

Aminosäure

Body-Mass-Index

BSA Bovine serum albumin

cDNA complementary DNA (engl. für komplementäre DNA)

CO2 Kohlenstoffdioxid

DNA Deoxyribonucleic acid (engl. für Desoxyribonukleinsäure)

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

DTT Dithiothreitol

EC Endometrial cancer (engl. für Endometriumkarzinom)

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FBS Fetal Bovine Serum (engl. für fötales Rinderserum)

FIGO Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique

(franz. für Internationale Vereinigung für Gynäkologie und

Geburtskunde)

h.i. FBS

ICD

heat inactivated FBS (engl. für durch Hitze inaktiviertes FBS)

International Classification of Diseases (engl. für

Internationale Klassifikation der Krankheiten)

IST-G Insulin-Transferrin-Selenium Gibco®

KCI Kaliumchlorid


V

kDa

KI

Kilodalton

Konfidenzintervall

M Mol

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minute

miR-21 MikroRNA-21

MS(I) Mikrosatelliten(instabilität)

NaCl Natriumchlorid

NFκB

nt

Nukleärer Faktor κB

Nukleotid

PBS Phosphate-buffered Saline (engl. für phosphatgepufferte

Salzlösung)

PCR Polymerase chain reaction (engl. für Polymerase-

kettenreaktion)

PI3K Phosphoinositid-3-Kinase

PIP2 Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphat

PIP3 Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphat

PSA Prostataspezifisches Antigen

PTEN

P-PTEN

Phosphatase and Tensin homolog

phosphoryliertes PTEN

qRT-PCR real-time quantitative PCR (engl. für quantitative

Echtzeit-PCR)

rcf Relative Zentrifugalkraft

RR Relatives Risiko

RNA Ribonucleic acid (engl. für Ribonukleinsäure)

RT Raumtemperatur

SD Standard deviation (engl. für Standardabweichung)


VI

SDS Natrium-Dodecylsulfat

SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Ser Serin

t time (engl. für Zeit)

TBS

TBS-T

Tris-buffered saline

TBS mit 0,1 % Tween 20

TEMED Tetramethylethylendiamin

Thr Threonin

Ub

UICC

UTR

Ubiquitiniert

Union internationale contre le cancer (franz. für Internationale

Vereinigung gegen Krebs)

untranslated region (engl. für untranslatierter Bereich)

WB

x g

Western Blot

Vielfaches der Erdbeschleunigung

Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Das Endometriumkarzinom – Einordnung in den klinischen Kontext

Das Endometriumkarzinom (EC) (ICD-10-GM: C54.1) ist in Deutschland mit einer

Inzidenz von 210,8 / 100.000 Einwohnern im Jahre 2013 die häufigste bösartige

gynäkologische Neubildung und mit einem Anteil von 4,9 % aller Karzinome der

vierthäufigste Tumor der Frau. Die 5-Jahres-Prävalenz beträgt 857,1 / 100.000 bei

einer Mortalität von 44,7 / 100.000 Einwohnern. Daraus resultiert eine Letalität von

21,1 %.1 In der altersbezogenen Häufigkeitsverteilung sind 90 % der Patientinnen bei

Diagnose älter als 50 Jahre, bei einem medianen Erstdiagnosealter von 63 Jahren.

Lediglich 4 % erkranken im Alter von unter 40 Jahren.2

Für die Prognose können histologisch zwei EC-Typen unterschieden werden. Der

prognostisch günstige Typ I (5-Jahres-Überlebensrate 80-85 %) liegt in 60-80 % der

Fälle vor, wohingegen der prognostisch ungünstige Typ II (5-Jahres-Überlebensrate

30-70 %) in 20-40 % der Fälle diagnostiziert wird (s. Tabelle 1).2-5

Tabelle 1: Duale Klassifikation des Endometriumkarzinoms nach Bokhman (1983).5

Typ I Typ II

Klinische, endokrinologische und morphologische Eigenschaften.

Verteilung

60-70 %

30-40 %

Fertilität verringert keine

Beeinträchtigung

Beginn der Menopause > 50 Jahre < 50 Jahre

Bisheriges Endometrium Hyperplasie Atrophie

Östrogen assoziiert Ja Nein

Assoziiert mit Adipositas, Hyperlipidämie und

Diabetes mellitus

Ja Nein

Tumor Grading niedrig (G1-2) hoch (G3)

Myometriuminfiltration oberflächig tief

Einleitung

2

Potential lymphogen zu Metastasieren niedrig hoch

Prognose günstig ungünstig

Sensitivität zu Gestagen hoch niedrig

5-Jahres-Überlebensrate 86 % 59 %

Klinisch-pathologische und molekulare Charakteristika

Prototypischer Histologischer-Typ

Endometrioid

Serös

Östrogen- oder Progesteronrezeptor

Expression

hoch niedrig

Diagnosestadium früh (FIGO I-II) fortgeschritten

(FIGO III-IV)

Gewöhnliche genetische Veränderungen

PTEN Mutation

52-78 %

1-11 %

PIK3CA Mutation 36-52 % 24-42 %

TP53 Mutation 9-12 % 60-91 %

Mikrosateliteninstabilität 28-40 % 0-2 %

Der Hormonrezeptor-positive Typ I, häufig ein endometrioides Adenokarzinom, ist

gekennzeichnet durch ein östrogenabhängiges Wachstum und entwickelt sich aus

einer atypischen Hyperplasie oder einer endometrialen intraepithelialen Neoplasie.

Als hauptsächlicher Risikofaktor gilt die Exposition von endogenem sowie exogenem

Östrogen.6 Die alleinige Östrogentherapie über 5 Jahre ohne Gestagenschutz erhöht

das Risiko eines EC um das 10-30-Fache.7,8 Aufgrund des östrogenabhängigen

Wachstums gilt das Metabolische Syndrom und hierbei vor allem die Fettleibigkeit

(vermehrte Östrogensynthese durch Adipozyten) als wesentlicher Risikofaktor. Ein

hoher Body-Mass-Index (BMI) unter Fettleibigkeit erhöht mit einem relativen Risiko

(RR) von 2,54 (95%-KI 2.11-3.06) die Wahrscheinlichkeit einer EC-Erkrankung.

Desweiteren gelten Hypertension, Diabetes mellitus Typ 2 sowie Nulliparität,

Einleitung

3

Infertilität und das polyzystische Ovar als Risikofaktoren.2,9 Eine frühe Menarche und

späte Menopause verdoppeln das Risiko.10

Das Hormonrezeptor-negative EC vom Typ II entwickelt sich hauptsächlich ab einem

Alter von 65 Jahren. Prototypen sind das seröse und das klarzellige Karzinom. Zu

den Vorstufen des Typ-II-EC gehören das endometriale intraepitheliale Karzinom und

das atrophe Endometrium, wie es beispielsweise nach Bestrahlung auftritt.4

Als protektiver Faktor bezüglich beider Typen ist die medikamentöse Therapie mit

kombinierten oralen Kontrazeptiva bekannt. Eine signifikant geringere Inzidenz des

EC korreliert dabei mit der Dauer der Einnahme.2

Neben der histologischen Unterteilung in zwei Typen wird das EC zur individuellen

Prognose mit Hilfe der Tumor-Nodus-Metastasen-Klassifikation (TNM-Klassifikation

der UICC) in vier Grade unterteilt. Diese variiert von T1 (Tumorausdehnung auf das

Organ begrenzt) bis hin zu T4 (Tumor in die umliegenden Organe infiltrierend). Des

Weiteren werden der Lymphknotenstatus sowie der Metastasierungsgrad

beschrieben. Die histopathologische Einteilung erfolgt entsprechend dem

Zelldifferenzierungsgrad (engl. Grading). Die Tumorzellen können von G1

(hochdifferenziert) bis G3 (undifferenziert) eingeteilt werden. Gynäkologische Tumore

werden in der Klinik zusätzlich anhand der FIGO-Stadien eingestuft (s. Tabelle 2).

Tabelle 2: FIGO-Stadien des Endometriumkarzinoms der Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie 2014.11

FIGO-Stadien Kriterien

I

Tumor begrenzt auf Corpus uteri

Ia

Ib

Keine Invasion oder Invasion < 50 % des Myometriums Invasion ≥50 % des Myometriums

II

Tumor infiltriert das Stroma der Cervix uteri, breitet sich aber nicht jenseits des Uterus aus

III

Lokale und/oder regionale Ausbreitung des Tumors über den Uterus hinaus

IIIa Tumor greift auf die Serosa des Corpus uteri und/oder die Adnexe über

Einleitung

4

IIIb Vaginaler und/oder parametraner Befall

IIIc Metastasen in den pelvinen und/oder paraaortalen Lymphknoten

IIIc1 Positive pelvine Lymphknoten

IIIc2 Positive paraaortale Lymphknoten mit oder ohne positive pelvine Lymphknoten

IV IVa

Tumoreinbruch in Harnblase und/oder Darm (Schleimhautbefall) (Ein bullöses Ödem der Schleimhaut reicht nicht aus, damit der Tumor als Stadium IVa klassifiziert wird)

IVb Fernmetastasen einschließlich intraabdominaler Metastasen

und/oder inguinaler Lymphknotenmetastasen

Screening Methoden wie der Transvaginale Ultraschall (TVU) zeigen bei

symptomfreien Frauen keine ausreichend hohe Sensitivität (37,5 %), sodass aktuell

kein allgemeines Screening etabliert ist.6,12 Aufgrund der klassischen Frühsymptome

kann das EC dennoch in einem frühen Stadium erkannt werden. Zu diesen zählen

die postmenopausale vaginale Blutung, prämenopausale Meno- oder Metrorrhagie

und abnormer Fluor.2 Goldstandard zur Sicherung der Diagnose ist eine Kürettage

unter Hysteroskopie.6 Ein in diesem Stadium diagnostiziertes EC besitzt eine gute

Prognose. Bei 25 % der Patientinnen wird der Tumor erst im metastasierten Stadium

diagnostiziert, und die Überlebenschancen der Patientinnen sinken auf weniger als

20 %.13-15 Daher liegt der Schwerpunkt bei der Behandlung des EC in einer möglichst

frühzeitigen Diagnose, um somit Therapieansprache und eine gute Prognose zu

erreichen.

In diesem Zusammenhang erlangen molekulare Tumormarker eine zunehmende

Bedeutung im klinischen Alltag. Ein biologischer Marker ist definiert als ein Kennwert,

welcher in vivo Veränderungen anzeigt. Er ist als Indikator geeignet gesunde

biologische Prozesse, pathologische Prozesse oder pharmakologische Antworten auf

eine therapeutische Intervention zu beurteilen. Er dient der Diagnostik, dem Staging,

der Prognostik, sowie der Bewertung des Therapieerfolgs und ermöglicht eine

individualisierte Medizin.16-18

Tumormarker benötigen eine möglichst hohe Spezifität und Sensitivität, um im

klinischen Alltag als wirksames Werkzeug angewandt zu werden. Hierbei werden

Einleitung

5

hohe Anforderungen an den Marker gestellt, der häufig in mehreren Geweben

exprimiert wird. Den ersten Schritt zur Marker-Identifizierung bilden zumeist

histologische Untersuchungen, aber auch grundlegende molekulare Analysen in

Zellkultur- oder Tiermodellen.

Neben der Rolle der Tumormarker rückt die zielgerichtete Therapie (engl. targeted

therapy) - insbesondere unter Berücksichtigung zunehmender Resistenzbildungen -

zunehmend in den Fokus. In der bis Anfang 2012 gültigen Leitlinie der

Arbeitsgemeinschaft der Wissenschaftlichen Medizinischen Fachgesellschaften e. V.

(AWMF) lag das Hauptaugenmerk der Behandlung in einer frühzeitigen radikalen

Operation und gegebenenfalls zusätzlicher Bestrahlung. Chemotherapeutika wurden

nur in einem fortgeschrittenem und aggressivem Stadium empfohlen.18,19

Einer der Gründe für die niedrige Relevanz der systemischen Chemotherapie sind

starke Nebenwirkungen und Resistenzen. Phosphatase and Tensin homolog (PTEN)

ist häufig beim EC mutiert und vermittelt dadurch Resistenzen gegenüber

beispielsweise den selektiven p110β-Inhibitoren GSK2636771 und AZD6482.20-26

Desweiteren zeigt sich eine Cisplatin-Resistenz aufgrund von AKT- und DNA-

polymerase-ε-Mutationen.27,28 Neben der Umgehung von Resistenzen ermöglicht

eine targeted therapy eine gewebeschonendere Therapie. Proliferative

Signalkaskaden bzw. ihre Modulatoren eignen sich hierbei als Angriffspunkt. Bis dato

wird auf eine überarbeitete Fassung der AWMF-Leitlinie gewartet; diese beinhaltet

dann möglichweise neue Therapieoptionen. Die Phosphoinositid-3-Kinase/AKT-

(PI3K/AKT-)Signalkaskade gilt als eine der wichtigsten Kaskaden in der

Tumorgenese.29

1.2 PI3-Kinase/AKT-Signalkaskade

Die PI3K/AKT-Signalkaskade ist ein wichtiger zellulärer Regulationsmechanismus für

Proliferation und Zellmigration. Im gesunden Gewebe liegt in dieser Signalkaskade

ein Gleichgewicht zwischen wachstumsfördernden und -hemmenden Faktoren vor.

Während der Tumorgenese verschiebt sich dieses und zeigt im klinischen Kontext

ein erhöhtes Zellwachstum und eine erhöhte Metastasierungsrate. In vielen

Tumorentitäten wurden hierbei Mutationen nachgewiesen und mögliche Faktoren für

eine zielgerichtete Therapie detektiert.

Einleitung

6

AKT ist der Endpunkt der Signalkaskade und greift über mehrere Mechanismen in

den Zellzyklus ein. Die phosphorylierte Form von AKT (P-AKT) stellt die aktive Form

des Proteins dar und begünstigt das Überleben von Zellen.30,31 Im Falle von

malignen Entartungen kommt es zu einem Übergewicht des aktivierten AKT, welches

prognostisch ungünstig ist. Das Inhibieren der Apoptose führt zum Überleben von

geschädigten Zellen, die sich daraufhin weiter teilen. P-AKT induziert über

Mediatoren Zellüberleben, Proliferation und Migration. Außerdem werden über die

Aktivierung der NF-κB-Signalkaskade Angiogenese, Tumorinvasivität und

Chemoresistenz verstärkt.14,32 Diese Wirkmechanismen führen zu einem

gesteigerten Tumorwachstum und einer erhöhten Neigung zur

Metastasenbildung.29,33-35

Die kontrollierte Aktivierung von AKT ist Funktion der Signalkaskade. AKT wird über

Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphat (PIP3) aktiviert, welches die aktive Form

des Substrats darstellt.36,37 PIP3 wird über eine Dephosphorylierung zu

Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphat (PIP2) inaktiviert.38-40 AKT wird durch ein

Gleichgewicht zwischen dem aktivierenden PIP3 und der inaktiven Form PIP2

moduliert (s. Abb. 1).

Aktiviert wird PIP2 vorwiegend über die PI3K-Klasse I, welche PIP2

phosphoryliert.35,40-43 Strukturell setzt sie sich aus einer katalytischen und einer

regulatorischen Untereinheit zusammen (s. Tabelle 3). Die katalytischen

Untereinheiten haben eine Größe von 110 kDa.

Abbildung 1: PI3K/AKT-Signalkaskade. miR-21 hemmt PTEN posttranskriptionell, das Protein selbst dephosphoryliert PIP3 im aktiven Zustand. Die PI3K fungiert als Gegenspieler von PTEN und aktiviert PIP2. Endpunkt der Signalkaskade stellt AKT dar, welches über PIP3 aktiviert wird. Die Folge sind eine erhöhte Proliferation und Zellbeweglichkeit.

Einleitung

7

Tabelle 3: PI3K Klasse IA und IB - Zusammensetzung der katalytischen und regulatorischen Untereinheiten. 41,44,45

katalytische Untereinheit

regulatorische Untereinheit

Klasse IA

p110α, p110β, p110δ

p85α, p85β, p55α, p55γ, p50α

Klasse IB

p110γ

p101, p84, p87

Die regulatorischen Untereinheiten stabilisieren die katalytischen Untereinheiten.

Ungebundene katalytische Untereinheiten sind instabil und werden rasch abgebaut

(s. Abb. 2).46

Die Phosphatase PTEN ist der inhibitorische Regulator der proliferativen PI3K/AKT-

Signalkaskade. Das Protein ist in seiner Funktion der Gegenspieler von PI3K und

dephosphoryliert PIP3.38,39 Die Aktivität wird über den Phosphorylierungs-Status

reguliert und ist im dephosphorylierten Zustand aktiv.47 Hohe PTEN-Expressionen

senken Proliferation und Migration über eine geringere Aktivierung von AKT.38,40 Die

Phosphatase scheint in diesem Pathway eine Schlüsselrolle einzunehmen. Sie wird

im EC signifikant vermindert exprimiert und verliert ihre Funktion als

Tumorsuppressor.48-50 Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kommt der

MikroRNA-21 (miR-21), einem Hauptregulator von PTEN, eine große Bedeutung zu.

Die MikroRNA (miR) greift via PTEN-Regulation direkt in die PI3K/AKT-

Signalkaskade ein. miR-21 bindet am 3‘-Ende des untranslatierten Bereichs hinter

dem Stopcodon (3'-UTR-Ende) der PTEN-mRNA und hemmt deren Translation auf

Abbildung 2: Interaktion zwischen regulatorischer und katalytischer PI3K-Untereinheit. Gebundene Dimere aus regulatorischer und katalytischer Untereinheit bilden eine stabile Einheit. Sobald der katalytischen Untereinheit ihr Bindungspartner fehlt, wird sie abgebaut.

Einleitung

8

posttranskriptioneller Ebene.38,48,49,51,52 Es werden die tumorsuppressiven

Eigenschaften von PTEN aufgehoben und der Zellzyklus enthemmt.

1.3 MikroRNA-21 als Regulator der PI3K/AKT-Signalkaskade

MikroRNAs sind kurze, 20-23 Nukleotide (nt) umfassende, nicht kodierende

Einzelstrang-RNA-Moleküle.53-56 1993 wurde von Lee et al. die erste MikroRNA, lin-4,

in dem Fadenwurm Caenorhabditis elegans nachgewiesen.57 Seitdem wurden

mehrere Tausend weitere im Menschen und in anderen Spezies entdeckt.

Dysregulierte miR-Level können pathologische Prozesse initiieren. Diese betreffen

beispielsweise neurodegenerative, immunologische und rheumatische

Funktionsstörungen.58 Bei der Karzinogenese spielen miR eine entscheidende Rolle,

da sie als Suppressor oder Induktor von Proteinen wirken können.59

Das Gen der miR ist im Genom entweder auf einem Exon, Intron oder einer

intergenischen Region lokalisiert. Die ca. 1.000 nt umfassende pri-miR wird von der

RNA-Polymerase II transkribiert.60,61 Das Transkript enthält, wie die mRNA, eine

5'-Kappen-Struktur und am 3’-Ende eine Polyadenylierung.62,63 Bevor die reife miR in

den Zellzyklus eingreifen kann, wird sie zweimal prozessiert.

Im Zellkern wird die pri-miR über Drosha, eine RNase III, zur pre-miR prozessiert.

Die RNase besitzt zwei Bindungsstellen für die Mikroprozessor-Untereinheit DGCR8

(DiGeorge Syndrome Critical Region 8), wodurch Drosha stabilisiert wird und

gleichzeitig die Prozessieraktivität und -effizienz verbessert.61,64 Der Enzymkomplex

schneidet aus der pri-miR eine ca. 70 nt große Haarnadel-Vorläufer-miR

(pre-miR).62,65 Diese verlässt den Zellkern via Exportin 5. Das vom G-Protein Ras

(engl. Rat sarcoma) abhängige Nukleotid-Protein reguliert den Export über die

Hydrolyse von Guanosintriphosphat (Ran-GTP).61

Im Zytosol wird die pre-miR über eine weitere RNase III (Dicer) zur reifen miR

prozessiert. Dicer schneidet hierbei die reife miR (20-23 nt) aus der Haarnadel-

Vorläufer-miR (pre-miR) (s. Abb. 3).58,62,66,67

Einleitung

9

Der größte Anteil der reifen miR liegt im RNA-induced silencing complex (RISC) und

übt von dort ausgehend die hauptsächliche Wirkung aus.68 Das Argonauten-Protein

bildet den Kern des Komplexes, in welchem die miR die höchste Stabilität besitzt.61

miR wirken ausgehend vom RISC über Bindung am 3'-UTR-Ende der Ziel-mRNA.62

Jede miR kann zwischen 100 und 1.000 mRNA binden.69 Über

Transkript-Destabilisation und/oder Translationshemmung kommt es zur

posttranskriptionellen Hemmung des Protein kodierenden Abschnitts.70 Hierüber

werden Zellwachstum, die Gewebedifferenzierung und Apoptose moduliert.54,55,71

miR-21 ist in vielen Tumorentitäten - die gynäkologischen Karzinome

eingeschlossen - als krebsfördernde Oncomir bekannt, und eine erhöhte Expression

ist mit einem kürzeren Überleben der Patientinnen assoziiert.54,72-74

Die Primärstruktur von miR-21 bildet sich in der Nukleinsäuresequenz

Abbildung 3: miR-Pozessierung nach Hebert et al.57 Die miR wird von der RNA-Polymerase II oder III transkribiert. Es ensteht die ca. 1.000 nt große pri-miRNA mit der 5‘ Kappe und einer Polyadenylierung am 3‘-Ende. Über Drosha (RNase III), welche mit DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8) assoziiert ist, wird die haarnadelstrukturförmige pre-miRNA prozessiert. Diese verlässt über das Ran-GTP abhängige Protein, Exportin 5, den Zellkern. Im Zytosol schneidet eine weitere RNase III (Dicer) die reife miR aus der Haarnadelstruktur.

Einleitung

10

5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3‘ ab. Lokalisiert ist miR-21 hauptsächlich im

RISC. Freie miR-21 liegt in der Sekundärstruktur und niedrigen Konzentrationen in

Haarnadelform und bei höheren Konzentrationen als Homodimer vor. Neue Studien

zeigen weitergehende Wirkung der freien Haarnadel-Struktur von miR, welche

Ähnlichkeiten mit einem Aptamer aufweist.55 Dies zeigt, dass der RISC-Komplex

lediglich einen Teil der Wirkungsweise von miR repräsentiert.

miR-21 wird über verschiedene Wege induziert. NF-κB-Aktivierung, Zigarettenrauch

bei Bronchialkarzinom sowie entzündliche und degenerative Prozesse induzieren

eine erhöhte miR-21-Konzentration.48,75

Die konkrete Rolle von miR-21 im EC ist bisher nicht bekannt, jedoch scheint diese

MikroRNA ein entscheidender Faktor für die Initiierung und Progression des

Karzinoms zu sein.

Einleitung

11

1.4 Zielsetzung

Die Möglichkeiten der Chemotherapie bei EC sind begrenzt und bislang existieren

neben den klassischen Frühsymptomen keinen zuverlässigen Tumormarker.

MikroRNA gewinnen im Zuge der gezielten Therapie (engl. targeted therapy) einen

wachsenden Einfluss in der aktuellen Forschung. miR-21 ist in vielen

gynäkologischen Karzinomen ein wichtiger Faktor für die Prognose. Ziel dieser Arbeit

ist es, die PI3K/AKT-Signalkaskade und deren Regulation durch miR-21 im EC

darzustellen.

Folgende Punkte stehen im Fokus dieser Forschungsarbeit:

• Der regulatorische Einfluss von miR-21 auf PTEN und die weiteren

nachgeordneten Proteine.

• Charakterisierung der katalytischen Isoformen der PI3K-Klasse 1 im EC.

• Analyse der Daten hinsichtlich der Eignung von miR-21 als EC-Biomarker.

• Potenzielle Mechanismen im miR-21/PI3K/AKT-Signalweg, die für

pharmakologische Eingriffe geeignet sein könnten.

Material und Methoden

12

2 Material und Methoden

2.1 Chemikalien und kommerzielle Lösungen

2-Mercaptoethanol Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Acrylamid 30 % Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Bovine serum albumin (BSA) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Bromphenolblau Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Chameleon Duo Pre-stained

Protein Ladder

LI-COR Biosciences (Lincoln, USA)

Chloroform Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

DEPC-H2O Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Dithiothreitol (DTT) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

dNTP-Mix Thermo Fisher (Waltham, USA)

Ethanol 75 %, unvergällt TH. GEYER (Renningen,

Deutschland)

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Gentamycin Ratiopharm (Ulm, Deutschland)

Glycerol 80 % Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Glycerol-2-Phosphat Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Glycin Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

HEPES Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Igepal CA-630 (NP-40) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Isopropanol Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Insulin-Transferrin-Selenium Gibco® (ITS-G) Thermo Fisher (Waltham, USA)


13

Kaliumchlorid (KCl) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Lipofektamine™ 2000 Invitrogen (Carlsbad, USA)

Magnesiumchlorid (MgCl2) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Methanol Merck (Darmstadt, Deutschland)

Milchpulver Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Natriumchlorid (NaCl) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Natrium-Dodecylsulfat (SDS) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Natriumfluorid (NaF) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Natriumorthovanadat (Na3VO4) Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Odyssey One-Color Protein Molecular

Weight Marker


ortho-Phosphorsäure Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) AppliChem (Darmstadt,

Deutschland)

Phosphate-buffered Saline (PBS) Biochrom (Berlin, Deutschland)

Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)

Salzsäure (HCl) Merck (Darmstadt, Deutschland)

Sensimix SYBR™ Hi-ROX Bioline (Luckenwalde, Deutschland)

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Trizol, peqGOLD Trifast™ Peqlab (Erlangen, Deutschland)

Trypsin Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Tween 20 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)


14

2.2 Geräte und Verbrauchsmaterialien

accu-jet® pro Pipettierhelfer BRAND (Wertheim, Deutschland)

CASY Model TT - Cell counter and Analyzer Roche Diagnostics (Basel, Schweiz)

CFX96™ Real-Time-PCR Detection System Bio-Rad Laboratories (München,

Deutschland)

HERAsafe KS9 - Sicherheitswerkbank Thermo Fisher (Waltham, USA)

Infrarot-Scanner Odyssey Imaging System

ODY-2065


Inkubationsbad 1003 GFL (Burgwedel, Deutschland)

Immobilon-P PVDF-Membran Merck Millipore (Billerica, USA)

Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad Laboratories (München,

Deutschland)

Neubauer-Zählkammer LO-Laboroptik (Lancing, GB)

peqSTAR 96X Universal Peqlab (Erlangen, Deutschland)

pH-Meter AQUALYTIC® (Dortmund,

Deutschland)

Pipettensatz, 0,5 - 1.000 µl Eppendorf (Hamburg, Deutschland)

Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße BD Biosciences (Heidelberg,

Deutschland); Biozym GmbH

(Hessisch Oldendorf, Deutschland);

Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland)

PowerPack™ Stromversorgung Bio-Rad Laboratories (München,

Deutschland)

Präzisionswaage PCB KERN & Sohn (Balingen-Frommern,

Deutschland)

Reinstwassersystem Milli-Q® Merck (Darmstadt, Deutschland)

Schüttelinkubator KS-15 CONTROL Edmund Bühler (Hechingen,

Deutschland)


15

Spektralphotometer Nano-Drop 2000c Thermo Fisher (Waltham, USA)

Thermomixer 5437 Eppendorf (Hamburg, Deutschland)

Tiefkälte-Lagerschrank Kryotec Kryotec-Kryosafe (Hamburg,

Deutschland)

Trans Blot Turbo Bio-Rad Laboratories (München,

Deutschland)

VWR™ Analog Vortex Mixer VWR (Radnor, USA)

Whatman Chromatography Paper Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Zellkulturplastik Sarstedt (Nümbrecht, Deutschland);

Greiner bio-one (Frickenhausen,

Deutschland);

Merck Millipore (Billerica, USA)

Zentrifugen:

5810 R

5415 R

Rotilabo-Mini-Zentrifuge

Eppendorf (Hamburg, Deutschland)

Eppendorf (Hamburg, Deutschland)

Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland)


16

2.3 Puffer und Lösungen

Sofern nicht anders angegeben, wurde vollentsalztes Wasser (lat. Aqua bidestillata)

als Lösungsmittel verwendet.

10 % APS 10 % APS

20x Blotting-Transferpuffer 0,9 M Tris; 0,78 M Glycin; 0,75 % SDS

10x PBS

1,37 M NaCl; 26,8 mM KCl; 17,6 mM KH2PO4;

101,1 mM Na2PO2 x 2 H2O; pH 7,4

10x SDS 0,31 M Tris; 2,4 M Glycin; 43 mM SDS

10x TBS 0,5 M Tris-HCl; 1,5 M NaCl; pH 7,6

5x Ladepuffer Bromphenolblau; 5 % SDS; 6,25 % Glycerol;

3,125 % β-Mercaptoethanol; 156 mM Tris-HCl

2x Lämmli-Puffer 100 mM Tris-HCl pH 6,8; 4 % SDS;

20 % Glycerol; 0,02 % Bromphenolblau

1x Blotting-Transferpuffer 20 % Methanol; 5 % 20x Blotting-Transferpuffer

1x SDS-Laufpuffer 10 % 10x SDS-Laufpuffer

Blockierlösung 5 % Milchpulver in TBS-T

CASYton 0,9 % NaCl; 0,02925 % EDTA

DEPC-behandeltes Wasser 0,1 % DEPC autoklaviert

Lämmli-Puffer

50 % 2x Lämmli; 5 % β-Mercaptoethanol

Lysepuffer 50 mM Tris; 100 mM NaCl; 2 % SDS;

1x Complete; 0,1 mM PMSF; 20 mM NaF;

1 mM Na3VO4; 20 mM 2-Phospho-Glycerat

Poly-L-Lysin-Stammlösung 0,1 % Poly-L-Lysin

Primär-Antikörperpuffer

5 % BSA in TBS-T

Sammelpuffer

0,5 M Tris; pH 6,0

Sekundär-Antikörperpuffer 5 % BSA in TBS-T; 0,01 % SDS


17

Stopplösung 10 % h.i. FBS in PBS

TBS-T

10 % 10x TBS; 0,1 % Tween 20

Trenngelpuffer

1,5 M Tris; pH 8,8

2.4 Antikörper

Tabelle 4: Antikörperliste (AK) - monoklonale Primär-AK und polykonale Sekundär-AK.

Antigen Art.-Nr. / Hersteller Ig-Klasse Gebrauchsverdünnung

α β-Actin #A1978 Sigma-Aldrich mouse * 1:600.000

α PTEN #9188 Cell Signaling rabbit * 1:4.000

α P-PTEN (Ser380/

Thr382/383)

#9549 Cell Signaling

rabbit *

1:1.000

α PI3K p110α #4249 Cell Signaling rabbit * 1:2.000

α PI3K p110β #3011 Cell Signaling rabbit * 1:2.000

α PI3K p110γ #5405 Cell Signaling rabbit * 1:2.000

α Akt #4691 Cell Signaling rabbit * 1:12.000

α P-Akt (Thr308) #13038 Cell Signaling rabbit * 1:1.000

α P-Akt (Ser473) #4060 Cell Signaling rabbit * 1:1.000

α mouse IRDye® 800CW LI-COR goat ** 1:10.000

α rabbit IRDye® 680RD LI-COR goat ** 1:10.000

*monoklonal; **polyklonal

2.5 Enzyme

RiboLock™ RNase-Inhibitor Thermo Fisher (Waltham, USA)

Super Script® Reverse Transkriptase Thermo Fisher (Waltham, USA)

2.6 Vektoren

pSUPERIOR.puro Invitrogen (Carlsbad, USA)

pSUPERIOR.puro-miR-21 M. Stope (Greifswald, Deutschland)


18

2.7 Zelllinien

Tabelle 5: Zelllinien.

Zelllinie

Art.-Nr. / Hersteller

MFE-280

1

#ACC-410 Leibnitz Institut DSMZ (Braunschweig, Deutschland)

MFE-296

#ACC-419 Leibnitz Institut DSMZ (Braunschweig, Deutschland)

2.8 Zellkulturmedien, -lösungen und -zusätze

PBS Biochrom (Berlin, Deutschland)

Vollmedium (RPMI/MEM+/+/+)

40 % RPMI1640; 40 % MEM(Earle’s);

20 % h.i. FBS; 1 % ITS-G;

0,125 % Gentamycin

Einfriermedium 35 % RPMI1640; 35 % MEM(Earle’s);

20 % h.i.FBS; 10 % DMSO

Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrom (Berlin, Deutschland)

Medium 199 MEM (Earle’s)

Biochrom (Berlin, Deutschland)

Medium RPMI 1640 mit Phenolrot Biochrom (Berlin, Deutschland)

Trypsin/EDTA-Lösung (10x) Merck Millipore (Billerica, USA)

0,5 g/l Trypsin; 0,2 g/l EDTA in PBS

Trypsin/EDTA-Lösung (2x)

20 % Trypsin/EDTA (10x) in PBS

2.9 Software

Bio-Rad CFX Manager™ 2.0 Bio-Rad Laboratories (München,

Deutschland)

Image Studio Lite 5.0 LI-COR Biosciences (Lincoln, USA)

Microsoft Excel 2010 Microsoft Corporation (Redmond, USA)

Odyssey 3.0 CLx LI-COR Biosciences (Lincoln, USA)


19

2.10 Zellbiologische Methoden

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei EC-Zelllinien von der Deutschen Sammlung

von Mikroorganismen des Leibniz Instituts Braunschweig verwendet. Bei der Zelllinie

MFE-296 handelt es sich um ein primäres Adenokarzinom des Endometriums

Tumorgrad G2, die Zelllinie MFE-280 entstammt einem rezidivierenden

Adenokarzinom Tumorgrad G3 (s. Tabelle 5).76,77

2.10.1 Kultivierung und Passagieren von Zellen

Die adhärent wachsenden EC-Zellen wurden in einer T75-Flasche bei 37 °C und

einem CO2-Gehalt von 5 % bei gesättigter Luftfeuchtigkeit in Vollmedium inkubiert.

Bei 90 % konfluenten Bewachsen der Zellkulturflasche wurden MFE-280 und

MFE-296 umgesetzt.

Vor dem Passagieren erfolgte die lichtmikroskopische Beurteilung der Zellen.

Zunächst wurde der Zellkulturüberstand am Rand der Flasche abgesaugt, danach

der Zellrasen mit 4 ml PBS gewaschen. Um die adhärenten Zellen vom Boden der

Flasche zu lösen, wurde der Zellrasen mit 2 ml 2x Trypsin/EDTA für 4 min bei 37 °C

inkubiert. Die Reaktion wurde mit 10 ml Stopplösung (10 % h.i. FBS in PBS) beendet.

Daraufhin wurde die Zellkulturflasche gut gespült und das Zelllysat in ein 50-ml-

Reagenzgefäß überführt. Die Zelllösung wurde bei 300 x g zentrifugiert, der

Überstand dekantiert und das Zellpellet mit 1 ml Vollmedium resuspendiert. Aus

dieser Zellsuspension wurde ein Aliquot im Verhältnis von 1:3 bei MFE-280 und 1:6

bei MFE-296 in einer neuen Kulturflasche mit 10 ml frischem Vollmedium vereinzelt

und ausgesät. Überprüft wurde die Zellverteilung unter dem Mikroskop.

2.10.2 Kryokonservierung und Auftauen von Zellen

Zur dauerhaften Lagerung wurden die EC-Zellen in niedriger Passage

kryokonserviert. Die Zellen wurden mittels Trypsinierung vom Boden der

T75-Kulturflasche mobilisiert, in Vollmedium resuspendiert, danach wurde die

Zellsuspension durch Zentrifugierung (100 x g, RT, 5 min) pelletiert. Das Pellet wurde

in 4 ml Einfriermedium resuspendiert, und die Zellanzahl wurde unter der Neubauer-

Zählkammer bestimmt. Es wurden jeweils 3 x 106 Zellen in ein Kryovat gegeben und

für 24 h bei -80 °C und danach in flüssigem Stickstoff bei -190 °C gelagert.

Das Auftauen zur weiteren Kultivierung der Zellen erfolgte bei 37 °C. Die

Zellsuspension wurde mit Vollmedium resuspendiert, zentrifugiert


20

(100 x g, RT, 5 min), der Überstand dekantiert und das Pellet erneut in 3 ml

Vollmedium resuspendiert. Anschließend wurde die Suspension mit 17 ml

Vollmedium in eine T75-Zellkulturflasche gegeben, die Zellen vereinzelt und kultiviert.

2.10.3 Bestimmung der Zellanzahl

Die Zellanzahl wurde mit dem CASY Model TT System (Roche) bestimmt. Das

Messprinzip beruht auf der Annahme unterschiedlicher Leitfähigkeit von intakten und

zerstörten Zellmembranen. Mittels dieses Verfahrens können unterschiedliche

Zellvolumina detektiert und es kann zwischen Zelltrümmern, Zellaggregaten und

vitalen Zellen unterschieden werden.

In Vorbereitung auf die Zellzählung wurden die EC-Zellen MFE-296 und MFE-280 auf

einer 96-Well-Platte ausgesät. Um in beiden Zelllinien ähnliche

Wachstumseigenschaften zu gewährleisten, wurde die Platte mit einer 0,1-%-

Poly-L-Lysin-Stammlösung beschichtet. Während des Passagierens wurde 1 ml

Zellsuspension in weiteren 5 ml Vollmedium vollständig resuspendiert. Daraufhin

wurde die Zellanzahl pro ml in der Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Entsprechend

der gewünschten Zellanzahl wurde ein Mastermix angesetzt. Jedem Well wurde eine

definierte Menge von 1 ml (Vollmedium + Zellsuspension) zugeführt. Im ersten

Versuch wurden je 3 x 104 Zellen pro Well von beiden Zelllinien ausgesät. Die

Proliferation wurde über 120 h erfasst. Um die Wachstumsraten über einen längeren

Zeitpunkt beurteilen zu können, wurde die Zellanzahl von MFE-296 entsprechend auf

5 x 10³ angepasst. Während dieser Versuchsreihe wurden die Wachstumskurven

über 288 h detektiert. Nach 192 h erfolgte ein Mediumwechsel.

Um die proliferativen Eigenschaften zu charakterisieren, wurden die Zellen im

Intervall von 24 h geerntet. Zuerst wurde der Überstand dekantiert, danach mit

500 µl PBS je Well gewaschen. Die Zelladhärenz wurde mit 200 µl 2x Trypsin/EDTA

aufgehoben. Die Zelllösung wurde resuspendiert und die vereinzelten Zellen in ein

steriles 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt. Danach wurde das Well nochmals mit

1300 µl PBS gespült und die Lösung ebenfalls in das Reaktionsgefäß überführt.

100 µl der Zellsuspension wurden mit 10 ml CASYton vermischt und im CASY Model

TT System gemessen. Die Messgröße wird im Folgenden als Zellzahl / ml

angegeben.


21

2.10.4 Transiente Transfektion

Für die transiente Transfektion wurde Lipofectamin 2000 als Reagenz ausgewählt.

Lipofectamin ist eine kationische Lipidlösung, welche mit den negativ geladenen

DNA-Molekülen fusioniert und dann im Komplex die negativ geladene Zellmembran

überwindet.78

Zunächst wurde 30 min vor der Transfektion ein Mediumwechsel in der

bewachsenen 6-Well-Platte vorgenommen. Dafür wurde der Zellkulturüberstand

dekantiert und durch 2 ml Basismedium (RPMI/MEM -/-/-) ersetzt. Das Verhältnis von

DNA zu Lipofectamin betrug 1:1,5 [µg DNA / µl Lipofectamin]. Pro Well wurde im 6-

Well-Platten Maßstab 5 µg DNA eingesetzt (s. Tabelle 6).

Tabelle 6: Protokoll Transiente Transfektion im 6-Well-Platten Maßstab.

DNA

Lipofectamin

Medium(-/-/-)

Ansatz A

5 µg

/

500 µl

Ansatz B

/

7,5 µl

500 µl

Ansätze separat 5 min bei Raumtemperatur inkubieren

Mischen von Ansatz A und B

20 min bei Raumtemperatur inkubieren

1.000 µl je Well

2.10.5 Bestimmung der Zellmobilität per Scratch Assay

Für die Quantifizierung der Migration wurden die Zellen zunächst in einer mit Lysin

beschichteten 24-Well-Platte ausgesät. Um 72 h nach Aussaat ein konfluentes

Bewachsen des Zellkulturbodens zu erreichen, wurden 2 x 104 Zellen MFE-296 und

1,5 x 105 Zellen MFE-280 je Well ausgesät. Der Zellrasen wurde mit einer sterilen

Pipettenspitze in einer geraden Linie quer durch den Wellboden verletzt. Danach

wurde die Zellmigration in den verletzten Zellrasen unter dem Observer z1 mit dem

Objekt 10x/0,3DICI beobachtet. Das Videomikroskop erstellte über den Zeitraum von

120 h alle 12 h ein Foto. Quantifiziert wurde das Migrieren der Zellen in die zellfreie

Fläche in Prozent pro 12 h.


22

2.11 Biochemische Methoden

2.11.1 Proteinisolierung

Zur Gesamt-Proteinisolierung aus den EC-Zellen wurde Lämmli-Puffer verwendet.

Die konfluent bewachsene 6-Well-Platte wurde aus dem Brutschrank entnommen

und der Kulturüberstand dekantiert, danach mit 500 µl PBS gewaschen und 180 µl

Lämmli-Puffer je Well hinzugegeben. Die Well-Platte wurde auf Eis gestellt und leicht

geschwenkt, um die gesamte Oberfläche zu benetzen. Die hochviskose

Zellsuspension wurde durch Rühren mit der Pipettenspitze gebunden und danach in

ein steriles 1,5-ml-Reaktionsgefäß überführt. Im Thermomixer wurde die Suspension

bei 95 °C für 5 min aufgeschlossen. Für die weitere Analyse wurde die

Proteinsuspension 2 min auf Eis gestellt oder bei -20 °C gelagert.

2.11.2 Western Blot

Die Proteinproben wurden mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

entsprechend ihrer Größe und Ladung aufgetrennt, im Western Blot (WB) auf eine

Nitrozellulosemembran geblottet und nach Inkubation mit den Antikörpern gescannt

und detektiert.

Für die SDS-PAGE wurde ein 10 %-iges Polyacrylamid-Gel mit 15 Taschen

verwendet, das aus einem Trenngel und einem Sammelgel bestand (s. Tabelle 7). In

jede Tasche wurden 20 µl der Proteinprobe gegeben. Als Quantifizierungsmaßstab

der Proteinbanden wurden je Gel 0,9 µl LI-COR Marker in eine Tasche aufgetragen.

Die Spannung wurde zu Beginn auf 80 V eingestellt und nach 10 min auf 150 V

erhöht. Nach einer Gesamtlaufzeit von 60 min wurde das Gel auf eine

Nitrozellulosemembran geblottet. Dazu wurden im Vorfeld die Filterpapiere und die

Membran erst 30 s mit Methanol, dann 2 min mit Aqua bidestillata und schließlich mit

Transferpuffer inkubiert. Geblottet wurde für 30 min bei 15 V und 2,5 A.

Die unspezifischen Bindungsstellen der Proteine wurden durch 1 h Inkubation bei

Raumtemperatur (RT) mit einer 5 %-igen Pufferlösung aus Milchpulver in TBS-T

blockiert. Vor und nach der Inkubation mit dem primären Antikörper wurde 3x 5 min

unter RT mit 1xTBS-T gewaschen (s. Tabelle 4). Die Membranen wurden über Nacht

bei 4 °C in ständiger Bewegung mit dem primären Antikörper inkubiert. Nach dem

letzten Waschschritt wurde die Membran für 1 h mit dem lichtempfindlichen

sekundären Antikörper inkubiert, nochmals 3x 5 min bei RT mit 1xTBS-T gewaschen,


23

getrocknet und mit dem Infrarot-Scanner Odyssey Imaging System gescannt. Die

Banden wurden mit der Software Image Studio Lite Version 5.0 von LI-COR

detektiert und quantifiziert.

Tabelle 7: Zusammensetzung des Polyacrylamidgels. Mengenangabe entsprechen 2 Gelen.

Reagenzien

10 %-Trenngel

5 %-Sammelgel

A. bidest 4,8 ml 4,2 ml

Trenngelpuffer 3 ml /

Sammelgelpuffer / 0,75 ml

Acrylamid (30 %) 4 ml 1 ml

SDS (10 %) 120 µl 60 µl

APS (10 %) 120 µl 60 µl

TEMED 12 µl 6 µl


24

2.12 Molekularbiologische Methoden

2.12.1 RNA-Isolierung

Die RNA-Präparation aus den EC-Zelllinien erfolgte mittels Einschritt-Flüssigphasen-

Separation durch das Reagenz peqGOLD TriFast™ (Peqlab), welches nach

Herstellerangaben verwendet worden ist. Die Elution des RNA-Pellets erfolgte in

25 µl mit DEPC behandeltem Wasser und wurde anschließend bei -20 °C gelagert.

2.12.2 RNA-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentrationsbestimmung von RNA und MikroRNA erfolgte mittels

photometrischer Messung durch das Spektralphotometer Nano-Drop 2000c (Thermo

Scientific, Peqlab). Gemessen wurde mit einem Probevolumen von 1,5 μl gegen das

Lösungsmittel als Leerwert. Die Reinheit der Proben wurde anhand des Quotienten

Absorption 260 nm / Absorption 280 nm bestimmt, welcher ≥ 1,8 betragen sollte. Somit

konnten Kontaminationen durch beispielweise Proteine oder Phenolreste

ausgeschlossen werden.

2.12.3 Reverse Transkription

Um die RNA durch qRT-PCR zu quantifizieren, musste vorher ein Umschreiben auf

cDNA mittels reverser Transkription erfolgen.

In Abhängigkeit der vorhandenen RNA-Menge wurden zwei Ansätze gewählt. Bei

einer RNA-Konzentration ≥100 ng / µl wurde ein 1 µl RNA-Gemisch und bei einer

RNA-Konzentration zwischen 100< ≥20,4 ng / µl wurde ein 4,9 µl Gemisch mit DEPC

H2O in einem sterilen 0,2-ml-Reaktionsgefäß vorgelegt (s. Tabelle 8). Danach wurde

in Abhängigkeit von der RNA-Konzentration 6,5 µl bzw. 2,6 µl konzentrierter

Mastermix hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 7,5 µl zu erreichen. Durch

kurzes Zentrifugieren wurde das RNA-Mastermix-Sediment auf dem Boden des

Reagenzgefäßes gesammelt. Die Reaktionsgefäße wurden daraufhin in das Gerät

peqSTAR 96X Universal eingesetzt und die Stem-Loop-reverse-Transkription

gestartet. Das Programm kühlt zunächst für 30 min bei 16 °C, synthetisiert daraufhin

die cDNA 30 min bei 42 °C und inaktiviert schließlich die Polymerase über 5 min bei

85 °C. Zuletzt wird der cDNA-Ansatz wieder auf 10 °C heruntergekühlt. Nach

Beendigung des Programms wurden die Proben durch Zugabe von 12,5 µl Millipore-

Wasser auf ein Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Die Proben wurden für die PCR

über Nacht im Kühlschrank bei 8 °C gekühlt bzw. bei -80 °C gelagert.


25

Tabelle 8: Pipettierschema reverse Transkription. Mastermix und konzentrierter Mastermix, je nach RNA-Gehalt der Proben.

Reagenzien

Mastermix

[100 ng RNA / µl]

konz. Mastermix

[20,4 ng RNA / µl]

5x RT Buffer

1,5 µl

1,5 µl

miR-1 SLOOP

1 µl [0,4 µM]

0,2 µl [2 µM]

miR-21 SLOOP

1 µl [0,4 µM]

0,2 µl [2 µM]

U6 SLOOP

1 µl [0,4 µM]

0,2 µl [2 µM]

dNTP

1 µl [0,25 mM]

0,25 µl [1 mM]

RiboLock™ RNase-Inhibitor

0,05 µl

0,05 µl

Super Script® reverse Transkriptase

0,2 µl

0,2 µl

DEPC-H2O

0,7 µl

/

Volumen

6,5 µl

2,6 µl

2.12.4 Quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qRT-PCR)

Die PCR ist ein Verfahren, um spezifische DNA-Abschnitte zu sequenzieren und

quantifizieren.

Das Prinzip beruht dabei auf drei Schritten (s. Tabelle 10, Schritte 2-4), während

derer die DNA-Sequenz verdoppelt wird. Der erste Schritt ist das Denaturieren der

DNA-Doppelstränge, danach folgen das Annealing des Primers an spezifischer

Bindungsstelle am Einzelstrang und schließlich die Strangsynthese. Diese Phasen

werden 45-mal wiederholt. Vor der PCR wurde die 96-Well-Platte entsprechend dem

Pipettierschema von Tabelle 9 vorbereitet.

Im Unterschied zur PCR ermöglicht die qRT-PCR die Beurteilung der DNA-

Amplifizierung in Echtzeit (real-time). Dies kommt zustande durch Interkalieren eines

SYBR-Green-Farbstoffs zwischen die dsDNA-Stränge. Das Fluoreszenzsignal, das


26

nach jedem Elongationsschritt gemessen wurde, stieg dabei mit zunehmender

Menge der PCR-Produkte an.

Zur relativen Quantifizierung und experimentellen

Auswertung der MikroRNA wurde die RNA U6 als

Referenz verwendet, da sie als housekeeping gene

(Haushaltsgen) keiner Regulation unterliegt und somit

als Ladungskontrolle diente. Des Weiteren wurden

hierüber Unterschiede der RNA-Präparation und der

reversen Transkription herausgerechnet. Die Expression

der behandelten Proben wurde auf die U6-Expression

normiert und mit der Software CFX ManagerTM 2.0

(Bio-Rad) ausgewertet.

Es wurden von jedem cDNA-Ansatz Duplikate analysiert.

Der Kontaminationsausschluss erfolgte über Kontroll-

proben, bei denen cDNA durch A. bidest ersetzt wurde.

Tabelle 10: Protokoll einer qRT-PCR.

Amplifikat

cDNA

2 µl

Mastermix

Millipore H2O

5,2 µl

Forward Primer

0,4 µl

Reverse Primer

0,4 µl

Sensimix SYBR

8 µl

PCR-Schritte

Temperatur

Dauer

1. Initiale Denaturierung

95 °C

10 min

2. Denaturierung

95 °C

10 s

3. Primer-Annealing

60 °C

20 s

4. Strangsynthese

72 °C

10 s

44x (Schritt 2-4)

5. Denaturierung

95 °C

10 s

6. Schmelzkurvenanalyse

65 °C - 95 °C; 0,5 °C-Stufen

Tabelle 9: Pipettierschema.

Ergebnisse

27

3 Ergebnisse

3.1 Charakterisierung der Endometriumkarzinom-Zelllinien MFE-296

und MFE-280 hinsichtlich ihrer Proliferation und Migration

Um die Auswirkung von miR-21 auf das EC zu beurteilen, wurden die basale

Proliferation und Migration anhand der beiden exemplarisch gewählten EC-Zelllinien

MFE-296 und MFE-280 verglichen. Zur Charakterisierung wurden sie zunächst

hinsichtlich ihrer Morphologie unter dem Mikroskop beurteilt. Beim Betrachten der

Zellen konnte ein deutlicher Unterschied im Zellwachstum beobachtet werden

(s. Abb. 4). Die Zelllinie MFE-296 wuchs als Monolayer gleichmäßig auf dem Boden

der Zellkulturflasche, während die Zelllinie MFE-280 clusterartig in die Höhe wuchs.

Für den Vergleich des Zellwachstums

beider EC Linien wurden identische

Zellzahlen ausgesät und die

Wachstumsraten verglichen. Es wurden

30.000 Zellen je Well einer 24-Well-

Platte ausgesät und über 120 h

ausgewertet. Es zeigte sich ein

deutlicher Proliferationsunterschied um

ca. den Faktor 3, der sich im

unterschiedlichen Anstieg beider

Wachstumskurven widerspiegelte (s.

Abb. 5). Zur Bestätigung und um die

Abbildung 5: Mikroskopische Analyse der EC-Zelllinien. Die beiden Zelllinien wurden unter gleicher Vergrößerung 84 h nach Aussaat betrachtet. MFE-296 (A) zeigt ein geordnetes Wachstum als Monolayer, MFE-280 (B) hingegen wächst clusterartig.

Abbildung 4: Proliferation bei gleicher Ausgangs-zellanzahl. Auf der 24-Well-Platte wurden je 30.000 Zellen pro Well ausgesät, alle 24 h über 120 h geerntet und im CASY Cell Counter die Zellanzahl bestimmt. ± SD, *≙ Signifikanz.

Ergebnisse

28

Beobachtung über einen längeren Zeitraum zu ermöglichen, wurde die Zellanzahl

von MFE-296 entsprechend auf 5.000 Zellen je Well verringert. Obwohl die

ausgesäte Zellanzahl von MFE-296 auf ein Sechstel des Ausgangswertes reduziert

wurde, zeigte sich eine tendenziell höhere Proliferationsrate im Vergleich zu

MFE-280 (s. Abb. 6).

Neben der Proliferation ist die Zellbeweglichkeit eine der wichtigsten Eigenschaften

von Karzinom-Zellen. Besondere Relevanz hat das Migrationsverhalten, da es

klinisch durch Metastasenbildung den Krankheitsverlauf negativ beeinflusst.

Um nach drei Tagen ein konfluentes Bewachsen der Oberfläche der 24-Well-Platte

zu erzielen, wurden 20.000 Zellen MFE-296 und 150.000 Zellen MFE-280 benötigt.

Der Zellrasen wurde mit einer sterilen Pipettenspitze verletzt, um eine zellfreie Fläche

zu erzeugen. Die Zellmigration in diesem Bereich wurde über 120 h mit dem

Videomikroskop aufgezeichnet. Es zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei der

Proliferationsanalyse. MFE-296-Zellen benötigten 108 h, bis die Zellen wieder

vollständig in die freie Fläche migriert waren. Dahingegen besiedelten MFE-280-

Zellen zum Ende des Versuchs, nach 120 h Inkubationszeit, nur 56 % der ehemals

zellfreien Fläche (s. Abb. 7).

Abbildung 6: Proliferation mit angeglichener Ausgangszellanzahl. In der 24-Well-Platte wurden 30.000 Zellen von der Zelllinie MFE-280 und 5.000 Zellen von der Zelllinie MFE-296 pro Well ausgesät. Diese wurden alle 24 h über 120 h geerntet und daraufhin im CASY Cell Counter die Zellanzahl bestimmt. ± SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

29

Proliferation und Migrationsverhalten beider Zelllinien erwiesen sich als

unterschiedlich und demonstrierten die Heterogenität des EC im Zellkultur-

Modellsystem. Im Folgenden wurden die Zellen auf molekularer Ebene verglichen.

3.2 Basalexpression von miR-21 und den Proteinen PTEN, AKT,

PI3K p110α/β/γ in den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280

In der proliferativen PI3K/AKT-Signalkaskade besitzt

miR-21 eine regulative Funktion. Die MikroRNA hat als

direktes Target die Phosphatase PTEN, welche als

Gegenspieler zur PI3K wirkt. Um die wichtigsten Faktoren

dieses Signalweges zu beurteilen, wurden neben der

miR-21 auch die Proteine PTEN, AKT und PI3K p110α/β/γ

hinsichtlich ihrer Basalexpression charakterisiert.

Mittels RT PCR wurde die basale Expression von miR-21

in den beiden EC-Zelllinien bestimmt. Es zeigte sich eine

8-fach höhere Expression in der Zelllinie MFE-280

verglichen mit MFE-296 (s. Abb. 8).

Anschließend wurden die Proteine, welche in der weiteren

Proliferations-Signalkaskade regulatorische Funktionen

besitzen, mittels WB detektiert und verglichen. Die PTEN-

Expression in MFE-280 war im Vergleich zu der in MFE-296 um den Faktor 3

Abbildung 7: Migrationsverhalten. Nachdem die Zellen konfluent gewachsen waren, wurde ein Scratch gesetzt. Zur Stunde 0 waren keine Zellen innerhalb der gescratchen Fläche. Bei 100 % war die gesamte Fläche wieder vollständig besiedelt. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Abbildung 8: Basale miR-21 Expression. Mittels PCR gemessen in den beiden EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280. + SD. * ≙

Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

30

signifikant erhöht (p=0,0001; s. Abb. 9 A). Bei der AKT-Expression dahingegen

(s. Abb. 9 B) zeigten sich nur leichte Unterschiede ohne Signifikanz (p=0,22).

Es waren alle drei untersuchten Isoformen der p110-Untereinheit der PI3K in den

EC-Zellen nachweisbar (s. Abb. 9 C). Bei den p110-Isoformen α und β zeigten sich

nur geringe Unterschiede zwischen den Zelllinien. Die Expression der Isoform p110γ

war im Gegensatz zu den α- und β-Isoformen in den EC-Zelllinien deutlich erhöht,

wies Unterschiede zwischen MFE-296 und MFE-280 auf und schien jeweils die

dominierende Variante zu sein.

Insbesondere die Basalexpression von miR-21 und dessen posttranskriptionellem

Target PTEN zeigten deutliche Unterschiede in beiden EC-Zelllinien.

Abbildung 9: Basalexpression im Western Blot PTEN, AKT, PI3K p110α/β/γ. (A+D) PTEN-Expression mit signifikanter Überexpression. (B+E) Gering höhere AKT-Expression im Vergleich zu MFE-296. (C+F). Bei den PI3K-Untereinheiten p110 ergibt sich kein signifikanter Unterschied. + SD, *≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

31

3.3 Etablierung der transienten Transfektion der EC-Zelllinien MFE-296

und MFE-280 zur Überexpression von miR-21

Um die Einflüsse von miR-21 auf den PI3K/AKT-Pathway darzustellen, wurden beide

EC-Zelllinien mit dem Vektor pmiR-21 transient transfiziert. In den weiteren Schritten

wurde die Überexpression mit kontroll-transfizierten Zellen (pSuperior.puro)

verglichen.

Zur Bestimmung einer geeigneten DNA-Menge in den Transfektionsansätzen wurde

mit 1,5 µg, 3 µg und 5 µg pmiR-21 transfiziert. In MFE-296-Zellen konnte die

MikroRNA jeweils überexprimiert werden, bei 5 µg um das 6,3-Fache. Mit 1,5 µg und

5 µg pmiR-21 zeigten sich signifikante Unterschiede in der miR-21 Expression.

(5 µg p<0,0001; s. Abb. 10 A). In der Zelllinie MFE-280 wurde ab 3 µg DNA die

miR-21 bis zu 5,6-fach überexprimiert. Im Vergleich zu MFE-296 stellte sich hierbei

keine statistisch signifikante Überexpression dar (s. Abb. 10 B). Für die folgenden

Versuche wurden 5 µg DNA in den Transfektionsansätzen eingesetzt.

Im zeitlichen Verlauf der miR-21-Expression zeigte sich in der Zelllinie MFE-296 nach

12 h eine Tendenz zur Überexpression, welche nach 48 h signifikant wurde

(p<0,0001; s. Abb. 11 A). In MFE-280 war die miR-21 erst ab 48 h deutlich

überexprimiert (4-fach; s. Abb. 11 B). Hierbei konnten im Verlauf von 48 h jedoch

Abbildung 10: Überexpression von miR-21 – Titration. Die beiden Zelllinien wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen pmiR-21 transfiziert, die Überexpression wurde 48 h nach Transfektion mittels RT PCR dargestellt. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. In der Zelllinie MFE-296 (A) zeigte sich ein signifikanter Unterschied bei 1,5 µg und 5 µg. In MFE-280 (B) stellte sich keine Signifikanz dar. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

32

keine statistisch signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe nachgewiesen

werden.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass in den EC-Zellen die miR-21-

Expression nach Transfektion erhöht war. Es dauerte einige Stunden, bis die miR-21

überexprimiert war und weitere Effekte im Downstream des Pathways erwartet

werden konnten. Die Proteine des Pathways wurden per WB detektiert und

verglichen.

3.4 Detektion der Auswirkungen auf den proliferativen Pathway auf

Protein-Ebene nach miR-21-Überexpression

Um die Auswirkungen von miR21 auf den proliferativen PI3K/AKT-Pathway

darzustellen, wurden die Protein-Expressionen zu definierten Zeitpunkten via WB

bestimmt und quantifiziert. Die transfizierten Zellen wurden 6, 24, 48, 72 und 96 h

nach Transfektion geerntet, wobei die miR-21-überexprimierten Zellen mit der auf 1,0

genormten Kontrollgruppe verglichen wurden.

Abbildung 11: Überexpression von miR-21 – zeitlicher Verlauf. Die Zellen wurden mit 5 µg pmiR-21 transfiziert und nach 2, 6, 12 und 48 h geerntet, um die Überexpression zu den gegebenen Zeitpunkten zu bestimmen. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Bei der MFE-296 (A) zeigte sich nach 48 h eine Signifikanz, bei der MFE-280 (B) stellte sich aufgrund der SD nur eine Erhöhung der Überexpression ein. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

33

3.4.1 PTEN-Expression und Phosphorylierung nach miR-21-Überexpression in

den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280

PTEN, das direkte Target von miR21, zeigte in der Zelllinie MFE-296

(s. Abb. 12 A+B) bis 24 h nach Transfektion leichte Abweichungen und ab 48 h einen

signifikanten Expressionsabfall, welcher im Verlauf bis 96 h progredient war. Die

Konzentration von PTEN bezogen auf den Kontrollausgangswert sank in der

Überexpression nach 96 h von 101 % auf 56 % ab. Bezugsgröße war die

Kontrollgruppe, welche mit einem Leervektor transfiziert wurde (pSuperior.puro).

Bei der Zelllinie MFE-280 war eine leicht abfallende Tendenz der PTEN-Expression

zu erkennen (s. Abb. 12 C+D). Die Konzentration der Überexpression startete mit

einem Ausgangswert von 121 % bezogen auf den Kontrollausgangswert und sank

bis 72 h signifikant auf 73 % ab. Nach 96 h erreichte sie wieder Kontrollniveau. Die

Expression von PTEN wurde via WB bestimmt und quantifiziert (s. Abb. 12 B+D).

Neben der Expression wurden außerdem die Veränderungen des

Phosphorylierungs-Status von PTEN untersucht. Dieser gibt Aufschluss über die

Aktivität des Enzyms. Betrachtet wurde die Phosphorylierung von PTEN an den

Abbildung 12: PTEN-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

34

Aminosäuren Serin(380) und Threonin(382/383). Der Quotient von phosphoryliertem

PTEN (inaktiviert) zum gesamt PTEN zeigte sich in beiden Zelllinien über den

Versuchszeitraum relativ konstant.

Die Konzentrationsquotient P-PTEN / PTEN blieb in MFE-296 und MFE-280 nahezu

konstant. Der Quotient stieg bis 48 h an und sank dann nach 96 h wieder auf den

Ausgangswert ab (s. Abb. 13 A+C). Die Expression von P-PTEN wurde via WB

bestimmt und quantifiziert (s. Abb. 13 B+D).

Abbildung 13: P-PTEN-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

35

3.4.2 PI3K-p110α/β/γ-Expression nach miR-21-Überexpression in den

EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280

Bei den drei Isoformen der PI3K-Untereinheit p110α/β/γ zeigte sich ein

unterschiedliches Bild der Expression über 96 h nach Transfektion. Die in der

basalen Expression charakterisierte dominante Isoform p110γ zeigte im Verlauf über

96 h nach Transfektion den deutlichsten Abfall in der Zelllinie MFE-296.

Die PI3K-p110α-Konzentration undulierte in MFE-296 während der ersten 72 h um

die Kontrollgruppe und fiel im Verlauf bis 96 h signifikant auf 71 % ab

(s. Abb. 14 A+B). In MFE-280 (s. Abb. 14 C+D) stellte sich ein ähnliches

undulierendes Bild der PI3K-p110α-Expression nach miR-21 Überexpression dar,

jedoch ohne signifikanten Abfall.

Abbildung 14: PI3K-p110α-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

36

Ausgeprägter zeigte sich die Veränderung der Expression bei der Isoform p110β. In

MFE-296 reduzierte sich die Konzentration der Kinase annähernd linear über den

Verlauf von 96 h. Sie startete mit einem Ausgangswert von 116 % nach 6 h und

verringerte sich, ab 48 h signifikant, auf letztlich 58 % nach 96 h (s. Abb. 15 A+B).

MFE-280 zeigte keine klare Tendenz der PI3K-p110β-Expression. Lediglich nach

72 h sank die Konzentration auf signifikante 75 % ab (p=0,0440; s. Abb. 15 C+D).

Die Expression der PI3K-Untereinheit p110γ zeigte die deutlichste Veränderung in

der Zelllinie MFE-296. Während der ersten 48 h undulierte die Konzentration um den

Kontrollwert. Nach 72 h sank sie auf signifikante 68 % ab und erreichte nach 96 h

einen deutlichen Abfall auf signifikante (p<0,0001) 16 % der p110γ-Konzentration im

Vergleich zur Kontrolle (s. Abb. 16 A+B). Die Zelllinie MFE-280 zeigte ein unduliertes

Bild der p110γ-Konzentration. Über 96 h ließ sich wie in den anderen Isoformen

keine Tendenz bestimmen (s. Abb. 16 C+D).

Abbildung 15: PI3K-p110β-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

37

3.4.3 AKT-Expression und Phosphorylierung nach miR-21 Überexpression in

den EC-Zelllinien MFE-296 und MFE-280

AKT stellt das gemeinsame Target von PTEN und PI3K dar. Zuerst wurden

Expressionsänderungen von AKT, danach Änderungen des Phosphorylierungs-

Status von AKT (P-AKT) an den Aminosäuren Serin(473) und Threonin(308)

untersucht. Die Konzentration von AKT erwies sich als den bisherigen

Protein-Expressionen ähnlich. In der Zelllinie MFE-296 verringerte sich die

Konzentration ab 48 h signifikant (p=0,0073). Nach 96 h erreichte sie signifikante

(p<0,0001) 49 % der Kontrollgruppe (s. Abb. 17 A+B). In der Zelllinie MFE-280 fiel

die AKT-Konzentration 96 h nach Transfektion auf signifikante (p=0,0373) 79 % der

Kontrollgruppe ab (s. Abb. 17 C+D).

Abbildung 16: PI3K-p110γ-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

38

Beim Betrachten des Quotienten von Gesamt-AKT zu phosphoryliertem AKT (P-AKT)

an Ser473 in der Zelllinie MFE-296 zeigte sich ein fast gleichbleibendes Verhältnis.

Lediglich nach 72 h kam es zu einem Abfall auf signifikante (p=0,0024) 62 % im

Vergleich zur Gesamt-AKT-Konzentration (s. Abb. 18 A+B). Die Zelllinie MFE-280

zeigte im WB ein ähnliches Bild in der Expression, jedoch Unterschiede in der

Banden-Darstellung. Hierbei stellten sich im WB Doppelbanden dar. Außerdem

zeigte sich bei der Detektion eine ausgeprägte Variation der phosphorylierten

Expression. Nach 72 h kam es hierbei zum Abfall auf 79 % (s. Abb. 18 C+D).

Daraus folgt, dass es in beiden Zelllinien nach 72 h zu einem Abfall des

phosphorylierten AKT, an der Aminosäure Ser473, im Vergleich zum Gesamt-AKT

kommt. Zu den anderen Zeitpunkten lagen die gemessenen Konzentrationen eng

beieinander.

Abbildung 17: AKT-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B)die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙ Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

39

Die Phosphorylierung an der Aminosäure Thr308 ergab in der Zelllinie MFE-296 ein

ähnliches Bild im Vergleich zu Aminosäure Ser473. Die Expression undulierte über

die ersten 48 h und sank nach 72 h signifikant (p=0,0014) auf 67 % der Gesamt-

AKT-Konzentration ab. Nach 96 h stieg sie wieder auf 118 % signifikant (p=0,0273)

an (s. Abb. 19 A+B). MFE-280 zeigte während der ersten 72 h ein unduliertes Bild

zwischen 158 % und 130 % der gesamt AKT-Konzentration. Nach 96 h kam es dann

zu einer Reduktion auf 53 % (s. Abb. 19 C+D).

Hierbei zeigt sich in den beiden Zelllinien ein unterschiedliches Bild. In der Zelllinie

MFE-296 stellt sich der Quotient von P-AKT Thr308 zu Gesamt-AKT vergleichbar mit

der Phosphorylierung an Ser473 dar. Die Expression in der Zelllinie MFE-280 ergibt

über die ersten 72 h eine deutliche Erhöhung der Gesamt-AKT-Konzentration und

nach 96 h einen deutlichen Abfall von 158 % auf 53 % der Gesamt-AKT-Expression.

Abbildung 18: P-AKT-Serin-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, * ≙

Signifikanz ist gegeben.

Ergebnisse

40

Zusammenfassend stellte sich in beiden EC-Zelllinien nach miR-21-Überexpression

ein unterschiedliches Bild im proliferativen Downstream-Pathway dar. Insbesondere

die PTEN-Konzentration, die Konzentration der PI3K-Untereinheiten p110β+γ, sowie

von AKT wiesen deutliche Differenzen zwischen MFE-296 und MFE-280 auf.

In der Zelllinie MFE-296 zeigte sich ab 48 h nach Transfektion eine ausgeprägte

posttransfektionelle Veränderung in der Proteinexpression. Im Gegensatz dazu

manifestierten sich in der Zelllinie MFE-280 deutlich geringere Veränderungen,

welche zudem erst nach 72 h detektierbar waren.

Abbildung 19: P-AKT-Threonin-Expression nach transienter Transfektion. Die Überexpression wurde mit dem Vektor pmiR-21, die Kontrollzellgruppe mit einem Leervektor transfiziert. Die Kontrolle (pSuperior) wurde auf 1,0 normiert. Geerntet wurde nach 6, 24, 48, 72 und 96 h. (A) Zelllinie MFE-296 und (B) die zugehörigen Banden vom WB. Ebenso (C+D) für die Zelllinie MFE-280. + SD, *≙ Signifikanz ist gegeben.

Diskussion

41

4 Diskussion

Molekulare Parameter haben in der aktuellen Medizin einen zunehmenden Einfluss

auf Diagnostik, Prognose und Nachsorge von Karzinomen. Bei Kenntnis eines

Tumormarkers können je nach Expression spezifische Aussagen über die

Therapieansprache gemacht werden (z. B. das prostataspezifische Antigen (PSA)

bei Prostatakarzinomen). Außerdem könnte nach Identifizierung eines möglichen

Targets eine zielgerichtete Therapie (engl. targeted therapy) durchgeführt werden. In

diesem Zusammenhang steigt die Relevanz proliferativer Signalkaskaden bzw. derer

Hauptmodulatoren. MikroRNAs rücken dabei zunehmend in den Fokus.

miR-21 ist in vielen Tumorentitäten als Oncomir bekannt.72-74 Auch in

gynäkologischen Karzinomen wird über den Einfluss von miR-21 diskutiert. Sowohl

im Mammakarzinom als auch im Zervixkarzinom ist eine erhöhte miR-21-

Konzentration mit einer erhöhten Zellmigration und -invasion verbunden.51,79-81 Die

Folge ist eine meist schlechtere Prognose der 5-Jahres-Überlebensrate.82

Um zu klären, inwieweit diese Ergebnisse auf das EC übertragbar sind, wurden zwei

exemplarisch ausgewählte EC-Zelllinien untersucht, die im Folgenden beschrieben

werden sollen. Bei der Auswahl der Zelllinien wurde auf heterogene Merkmale

hinsichtlich Morphologie, Wachstumsverhalten und Proteinexpression Wert gelegt,

um eine hohe Aussagekraft bezüglich der Entität des EC zu erzielen.

Bei der zellbiologischen Charakterisierung der beiden EC-Zelllinien, MFE-296 und

MFE-280, zeigte sich ein deutlicher Unterschied im Proliferations- und

Migrationsverhalten. MFE-296 hatte eine erhöhte Wachstumsrate und migrierte beim

Motilitätsassay vollständig in die zellfreie Fläche.

Die Zelllinie MFE-280 entstammt dem Endometrium einer 77 Jahre alten Patientin.

Es handelte sich hierbei um ein rezidivierendes, teilweise papillär wachsendes und

undifferenziertes Adenokarzinom (G3) mit ungünstiger Prognose (EC-Typ-II).77 In der

mikroskopischen Beurteilung zeigte sich ein clusterartiges Wachstum mit

polymorphem Aussehen.

Die Zelllinie MFE-296 wurde aus dem Endometrium einer 68-jährigen Frau

gewonnen. Es handelte sich um ein endometrioides, mäßig differenziertes

Adenokarzinom (G2) mit günstigerer Prognose (EC-Typ-I).76 Im Wachstum zeigte

sich eine monomorphe gleichmäßige Proliferation. Neben den zellulären

Diskussion

42

Unterschieden ließen sich im Folgenden auch auf molekularer Ebene Ungleichheiten

nachweisen.

In der maligneren Zelllinie MFE-280 zeigte sich eine 7-fach höhere Basalexpression

von miR-21 im Vergleich zu MFE-296. Gegensätzlich zu diesen Ergebnissen

beobachteten Tsukamoto et al. (2014), dass miR-21 im Blutplasma signifikant höher

in Tumoren des EC im Stadium FIGO Ia (vgl. Tabelle 2) mit dem

Differenzierungsgrad G1 exprimiert war. Karzinome mit höherer Malignität,

Progression und geringer Differenzierung hatten eine verminderte Expression.83

miR-21 scheint im EC eher prognostisch günstig zu sein. In der vorliegenden Arbeit

wurde miR-21 jedoch nicht im Blutplasma, sondern intrazellulär bestimmt.

Desweiteren handelte es sich um ein in vitro Modell, welches von der in vivo

Expression abweichen kann.

Die molekularen Unterschiede konnten in der basalen Proteinexpression dargestellt

werden. Hierbei zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der PTEN-Expression,

einem posttranskriptionellen Target von miR-21, welches suppressiv auf den

proliferativen PI3K/AKT-Pathway wirkt. Weigelt et al. (2013) detektierten in MFE-296-

Zellen zwei PTEN-Mutationen auf Proteinebene. In MFE-280-Zellen konnten

hingegen keine Mutationen nachgewiesen werden.20,84,85 Diese sind verbunden mit

einem Verlust der Proteinfunktion und einer resultierenden Verschiebung des

PTEN/PI3K-Gleichgewichts zugunsten der Kinase.86,87 Eine medikamentöse

Inhibierung der PI3K/AKT-Signalkaskade war bei nicht mutiertem PTEN

erfolgreicher.88

Die PI3K, Gegenspieler von PTEN, zeigte in den beiden Zelllinien eine homogenere

Verteilung. Im Vergleich der einzelnen PI3K-Isoformen dominierte p110γ in beiden

EC-Zelllinien mit höchster basaler Expression unter den Isoformen. Es zeigte sich

außerdem nach transienter Transfektion von miR-21 die deutlichste Modulation der

Expressionsrate. Im Allgemeinen besitzt PIK3CA, das Gen von p110α, häufiger

Mutationen als die Gene der Isoformen p110β und p110γ.21-23,44 p110α ist bei

Mutation von PIK3CA dauerhaft aktiviert. Bei silmutaner PTEN-Mutation wird die

p110α-Aktivität zusätzlich verstärkt.21 Neben den PIK3CA Mutationen sind keine

spezifischen Mutationen in den anderen Isoformen bei Karzinomen bekannt. Die

Isoformen können jedoch onkogene Eigenschaften bekommen, sobald sie

überexprimiert sind.44 In diesem Kontext kann die Isoform p110γ in beiden Zelllinien

Diskussion

43

als Onkogen betrachtet werden. Dieser Ansatz wird auch durch die Arbeit von

Zhao et al. (2008) gestützt, die eine Dominanz der Variante p110γ bei der chronisch

myeloischen Leukämie (CML) nachweisen konnten.44 Des Weiteren verglichen

An et al. (2007) die beiden Isoformen p110α und p110β mittels RT-PCR und zeigten,

dass die Isoform p110β in den EC-Proben überwiegt.89

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die beiden Zelllinien MFE-296 und

MFE-280 deutliche Unterschiede sowohl auf zellulärer, als auch auf

molekularbiologischer Ebene präsentieren. Die beiden Zelllinien lassen sich

vermutlich je einem Typ des EC nach Bokhman (1983) zuordnen (s. Tabelle 1).5

MFE-296 könnte als Hormonrezeptor positiver Typ-I-Tumor klassifiziert werden,

dahingegen könnte MFE-280 dem Hormonrezeptor negativen Typ-II zugeordnet

werden.

Neben der dualen Klassifikation nach Bokhman (1983) gibt es seit 2013 von The

Cancer Genome Atlas (TCGA, 2013) eine Einteilung des EC nach genetischen

Kriterien. Sie teilen das EC nach Mikroarrays und DNA-Sequenzierung auf Basis von

Mutationen, Kopienzahlveränderungen und Mikrosatelliteninstabilität (MSI) in vier

genetische Typen ein (s.Tabelle 11).17,90

Diskussion

44

Tabelle 11: Genetische Einteilung des Endometriumkarzinoms nach TCGA.90 *Die Mutationsrate ist in Mutationen pro Millionen Basen angegeben [Mutation / Mb].

POLE (ultramutiert)

MSI (hypermutiert)

Kopienzahl niedrig

Kopienzahl hoch

Mutationsrate*

232 x 10-6

18 x 10-6

2,9 x 10-6

2,3 x 10-6

Kopienzahl-veränderungen

niedrig

niedrig

niedrig

hoch

MSI / MLH1-Metyhlierung

gemischt

MSI hoch

MS stabil

MS stabil

gewöhnliche Genmutationen

(Prävalenz)

POLE 100 %

PTEN 94 %

PIK3CA 71 %

PIK3R1 65 %

TP53 35 %

PTEN 88 %

PIK3CA 54 %

PIK3R1 40 %

RPL22 37 %

PTEN 77 %

PIK3CA 53 %

PIK3R1 53 %

CTNNB1 52 %

TP53 92 %

PIK3CA 47 %

PPP2R1A 22 %

Histologie

Endometrioid und Gemischt

Endometrioid

Endometrioid

Serös,

Endometrioid,

und Gemischt

Grading

gemisch

gemischt

G1+2

G3

Progressions-freies Überleben

gut

intermediär

intermediär

schlecht

Der prognostisch günstige und ultramutierte Subtyp POLE (das Gen der DNA-

Polymerase Epsilon) zeigt histologisch eine meist endometrioide Differenzierung,

weist eine sehr hohe Mutationsrate und zusätzliche Punktmutationen in der

Exonuklease-Domäne von POLE auf. Die DNA-Polymerase Epsilon ist verantwortlich

für die Synthese des Leitstrangs während der Replikation. Außerdem kontrolliert und

entfernt sie fehlgepaarte Nukleotide durch ihre Korrekturlese-Funktion. POLE-

Mutationen treten vorwiegend bei Patientinnen mittleren Alters auf (durchschnittliches

Alter 54 Jahre).91 Der Tumor infiltriert Lymphozyten und manifestiert sich mit

peritumorale Lymphozyten. Es zeigten sich 190 signifikant mutierte Gene, von denen

häufig die PI3K/AKT-Signalkaskade betroffen ist.17,92 Teilweise zeigte sich innerhalb

von POLE eine Heterogenität, welche aufgrund von sekundären somatischen

Diskussion

45

Mutationen, wie bspw. TP53, erklärt werden kann. Diese verleihen dem Karzinom

einen teilweise serösen, bzw. mehrphasigen Charakter.91

Der Subtyp Mikrosatelliteninstabil (MSI) kennzeichnet sich durch die ausgeprägte

MSI aufgrund von MLH1 Promotor-Methylierungen und durch eine hohe

Mutationsrate. Es zeigten sich 21 signifikant mutierte Gene.17,90,91 Der 3. Subtyp

(Kopienzahl niedrig) weist hingegen stabile Mikrosatelliten auf und ist durch eine

niedrige Kopienzahl charakterisiert.17,92

Der Subtyp Kopienzahl hoch unterscheidet sich histologisch von den anderen drei

Gruppen. Es handelt sich hierbei um ein seröses Karzinom und kennzeichnet sich

durch extensive Kopienzahlveränderungen und niedrige Mutationsraten. Dieser Typ

besitzt mit einer Progressionsfreiheit von 55 % nach 4 Jahren die schlechteste

Prognose.17,90,92

Schwierigkeiten bei der genetischen Typisierung ist die Einschränkung auf

ausschließlich endometrioide, seröse und gemische Karzinome des Uterus. Die

genomische Diversität anderer nicht endometrioider Karzinome wie bspw. das

Karzinosarkom und Klarzellkarzinom muss etabliert werden. Des Weiteren stellt die

Interpretation von immunohistochemischen Expressionsmustern insbesondere bei

Mischtumoren selbst für erfahrene Gynäkologen eine Herausforderung dar.17

MFE-280 und MFE-296 lassen sich neben der dualen Klassifikation auch zwei

unterschiedlichen genetischen Typen zuordnen. Welchen konkreten Typen sich die

beiden Zelllinien zuordnen lassen ist bislang noch nicht untersucht worden und ist für

diese Arbeit von nachrangiger Bedeutung. Entscheidend ist, dass es sich um zwei

unterschiedliche Zelllinien bezüglich Morphologie, Proliferation und

Proteinexpression handelt. Beide eignen sich zur Darstellung der Diversität des EC.

Aus diesen Gründen wurde anhand von MFE-280 und MFE-296 der Einfluss von

miR-21 auf die PI3K/AKT-Signalkaskade dargestellt.

miR-21 greift über eine direkte Hemmung der Phosphatase PTEN in die proliferative

PI3K/AKT-Signalkaskade ein. Die MikroRNA bindet am 3‘-UTR-Ende der

PTEN-mRNA und inhibiert deren Translation posttranskriptionell.38,48,49,51,52 Die

antiproliferativen Eigenschaften von PTEN werden aufgehoben und der Zellzyklus

enthemmt. Die Phosphatase PTEN ist ein inhibitorischer Regulator der proliferativen

Diskussion

46

PI3K/AKT-Signalkaskade und im EC, verglichen mit gesundem und

hyperplastischem Endometriumgewebe, signifikant geringer exprimiert.48-50 Das

Protein wird stärker im Stroma als in glandulären Zellen nachgewiesen und ist in

seiner Funktion der Gegenspieler von PI3K.93 PTEN dephosphoryliert

Phosphatidylinositol (3,4,5)-Trisphosphat (PIP3) zu Phosphatidylinositol (4,5)-

Bisphosphat (PIP2).38-40 Klasse I PI3K phosphorylieren wiederum PIP2 zu PIP3

35,40-43

(s. Abb. 1). Lokalisiert ist die PI3K hauptsächlich in den glandulären bzw. luminalen

Epithelzellen und interstitiellen Zellmembranen, im Zellkern hingegen nur sehr gering.

Des Weiteren ist die PI3K-, AKT- und P-AKT-Expression im dünnen Endometrium

signifikant geringer als im normal (9 mm94)ausgeprägten.95

Die PI3K-Klasse I besteht aus vier katalytischen Untereinheiten, mit einer Größe von

110 kDa., welche jeweils mit einer regulatorischen Untereinheit assoziiert sind

(s. Tabelle 3).41,44,45 Die regulatorischen Untereinheiten stabilisieren die katalytischen

Untereinheiten. Ungebundene katalytische Untereinheiten sind instabil und werden

rasch abgebaut.46

p85α spielt in diesem Zusammenhang eine bedeutende Rolle, da sie neben der

Interaktion mit PI3K ebenfalls die PTEN-Stabilität moduliert. Im physiologischen

Zustand bildet die regulatorische- mit der katalytischen p110-Untereinheit ein stabiles

Heterodimer. Falls überschüssiges p85 vorhanden ist, wirkt dieses zusätzlich über

eine stabilisierende Bindung mit PTEN. P85-PTEN-Dimere bewirken eine Reduktion

der Ubiquitinierung von PTEN und verhindern damit den Abbau. Mutiertes p85 bindet

den Wild-Typ p85. Dies führt zu einer Verringerung von freiem p85 und somit zu

einer geringeren PTEN-Interaktion bzw. zu instabilerem PTEN, welches nach

Ubiquitinierung abgebaut wird.23 Die PI3K-Mutation supprimiert über Destabilisation

die Phosphatase und erreicht darüber eine gesteigerte Wirkung der Kinase. miR-21

hat über diese Kaskade als ein direktes Target PIK3R1, das Gen von p85α, und

greift zum einen in die Expression der PI3K-Untereinheit und zum anderen auch

indirekt auf die PTEN-Stabilität ein (s. Abb. 20).82

Diskussion

47

Sowohl PI3K als auch PTEN stehen in einem sensiblen Gleichgewicht. Ihre Gene

sind bei maligner Entartung häufig von Mutationen betroffen. Im EC ist PTEN in

32 % - 57 % der Fälle mutiert und tritt dann in bis zu 60 % der Fälle mit zusätzlichen

Co-Mutationen, wie beispielsweise einer kombinierten PIK3CA (p110α) Mutation,

auf.20-26,29 p110α ist die katalytische Hauptuntereinheit der PI3K.45 Wenn PTEN

mutiert, ist die Aktivität des Proteins verringert und PIP3, das Produkt der Kinase,

folglich erhöht.48-50 Dieses phosphoryliert wiederum AKT zu P-AKT und aktiviert das

Protein mit seinen zahlreichen wachstumsfördernden Funktionen (vgl. 1.2 PI3-

Kinase/AKT-Signalkaskade).25 Inaktivierende Mutationen in PTEN konnten im

Mausmodell von Berenjeno et al. (2012) durch eine gleichzeitige Inaktivierung der

PI3K-Isoformen p110α und p110β per Knockout kompensiert werden.96 Hohe PTEN-

Expressionen verringerten ebenfalls den P-AKT aktivierten Anteil vom Gesamt-

AKT.38,40

Abbildung 20: miR-21 als direkter PTEN Inhibitor und indirekter Suppressor über p85α. (A) Im physiologischen Zustand bindet p85α vorwiegend an der katalytischen PI3K-Untereinheit. Falls überschüssiges p85α vorhanden ist, bindet dieses an PTEN und bildet ein stabiles Dimer. Die p85α-PTEN-Bindung reduziert die Ubiquitinierung von PTEN. (B) MiR-21 hemmt direkt die PTEN-Expression posttranskriptionell. Über die Hemmung von p85α wird PTEN indirekt destabilisiert, ubiquitiniert und anschließend abgebaut.

Diskussion

48

Diese Signalkaskade konnte im Zellmodell dieser Arbeit nur teilweise dargestellt

werden. Die basalen miR-21 Konzentrationen korrelierten nicht - wie entsprechend

der Signalkaskade zu erwarten war - negativ mit der basalen PTEN-Expression.

Stattdessen korrelierte die miR-21 Expression in der Zelllinie MFE-280 mit einer

signifikant höheren PTEN-Expression im Vergleich zu MFE-296. Mögliche Ursachen

sind der Vergleich zwischen in vitro Zellkulturen mit in vivo Gewebeproben, aber

auch die Heterogenität des EC, welche schon in verschiedenen anderen Arbeiten

bezüglich der miR-21 Korrelation zu PTEN gezeigt wurde. Bei Qin et al. (2012) war in

den untersuchten EC-Patientenproben miR-21 signifikant überexprimiert bei

negativer Korrelation mit der PTEN-Expression.48 Es zeigten sich aber auch in

Gewebeproben anderer Forschungsarbeiten leichte Konzentrationserhöhungen ohne

Signifikanz und negativer Korrelation der PTEN-Expression. Hierbei wurden miR-200

und miR-205 als die hauptsächlichen Regulatoren von PTEN ausgemacht.49,50 Die

Arbeitsgruppe Tsukamoto et al. (2014) konnte dahingegen eine Suppression von

miR-21 im Plasma und Gewebe zeigen, wobei jeweils gesundes und malignes

Gewebe von gleichen Patientinnen untersucht wurde.83

Neben der Expression wurde die Funktion von miR-21 in Bezug auf PTEN und die

weiteren Targets der PI3K/AKT-Signalkaskade untersucht. Die Unterschiede auf

Expressionsebene konnten auch auf funktioneller Ebene in beiden Zelllinien

dargestellt werden. In der Zelllinie MFE-296 zeigte sich nach transienter Transfektion

mit pmiR-21 die zu erwartende regulatorische Funktion von miR-21 durch eine

signifikant supprimierte PTEN-Expression. MFE-280 zeigte hingegen nur eine leichte

PTEN-Suppression nach Transfektion. Eine mögliche Erklärung ist die

unterschiedliche PTEN-Aktivität aufgrund von Mutationen, die nach Weigelt et al.

(2013) bisher ausschließlich in der Zelllinie MFE-296 nachgewiesen wurden.

Außerdem wird PTEN über mehrere unterschiedliche MikroRNAs reguliert, wobei in

den einzelnen Zelllinien die Hauptregulatoren differieren können.49,50

Bei der Betrachtung der PI3K-Expression fiel eine signifkante Expressionsminderung

aller drei Isoformen ausschließlich in der Zelllinie MFE-296 auf. Dies führt zu der

Annahme, dass der führende regulatorische Bindungspartner von p110α und β das

Protein p85α ist, welches ebenfalls von miR-21 gehemmt wird.82 Die gebundenen

Heterodimere bleiben zwar intakt, jedoch fehlen neu synthetisierte katalytische

Untereinheiten der Bindungspartner und die instabilen Monomere werden abgebaut

Diskussion

49

(s. Abb. 2).46,97 In der Zelllinie MFE-280 werden die Bindungspartner p85β, p55α,

p55γ und p50α vermutlich stärker exprimiert oder sie besitzen eine höhere

Bindungsaffinität, da es zu keiner Veränderung der Expression kommt.

Bei der Isoform p110γ ist der signifikante Abfall in der Zelllinie MFE-296 schwieriger

zu erklären. In der Arbeit von Shymanets et al. (2013) wurden die beiden

regulatorischen Untereinheiten p87 und p101 untersucht. Es zeigte sich hierbei, dass

die Untereinheit p87 obligat in allen Geweben exprimiert war und p101 induziert

wurde. Das Heterodimer p101-p110γ stellte sich als die stabilere Bindung und

ebenso als aktiveres Enzym dar.97 Hierbei ist anzunehmen, dass den beiden

Heterodimeren unterschiedliche Signalkaskaden zugrunde liegen. Die Isoform p110γ

benötigt gleichfalls die regulatorische Untereinheit, um stabilisiert zu werden.46

Vermutlich liegt dem Expressionsverlust dieser Isoform ein ähnlicher

Pathomechanismus wie bei den anderen Isoformen zugrunde. Um den genauen

Wirkmechanismus zwischen miR-21 und der Expressionsminderung von p110γ zu

erklären bedarf es jedoch weiterer experimenteller Arbeiten.

Das PI3K-PTEN-Ungleichgewicht ist ein Auslöser für erhöhte Proliferation und

Migration. Häufige Ursachen sind hierbei PTEN-Mutationen, welche mit frühen

Tumorstadien assoziiert sind und eine günstigere Überlebensprognose haben. Die

Ergebnisse dieser Arbeit bestätigten mit der erhöhten Proliferation und Migration der

Zelllinie MFE-296 im Vergleich zu MFE-280 diese Schlussfolgerung. Die PTEN-

Mutation ist außerdem mit dem günstigeren Tumorgrading in der Zelllinie MFE-296

verbunden.

miR-21 scheint unter Betrachtung der PI3K/AKT-Signalkaskade im EC kein allgemein

aussagekräftiger Tumormarker zu sein. Diese Signalkaskade ist im EC vermutlich

nicht das Hauptziel der miR-21 sondern wird von vielen anderen Modulatoren

beeinflusst. In diesem Modell wurde lediglich eine Funktion von miR-21 beleuchtet:

die PTEN-Suppression. Dabei wurden andere Regulationen, welche möglicherweise

eine größere Wirkung bei der Entstehung von EC haben, nicht berücksichtigt.

Beispielsweise werden weitere Tumorsuppressoren wie das programmed cell death

protein 4 (PDCD4) und die Mikrosatelliten MSH2 und MSH6 herunterreguliert, sowie

einige Protoonkogene induziert.51,53,72-74,89,98-100 Neben dem Einfluss auf den

Zellzyklus induziert miR-21 über VEGF die Angiogenese, welche im Tumorwachstum

ab einer Größe von wenigen Millimetern Durchmesser entscheidend ist.75

Diskussion

50

Neben miR-21 wird die PTEN-Expression und Aktivität zusätzlich über weitere

Regulatoren beeinflusst.39 Die Hormone Östrogen und Progesteron üben einen

regulatorischen Effekt auf die Aktivität und Expression von PTEN aus. Östrogen

erhöht kurzfristig die Phosphorylierung von PTEN und sorgt damit für eine höhere

Stabilität bei geringerer Aktivität des Enzyms. Langfristig hat Östrogen keinen

Einfluss auf den P-PTEN-Status und führt zu einer Reduktion der gesamt PTEN-

Expression.35,93 Progesteron senkt kurzfristig im zeitlichen Rahmen von 5-30 min die

PTEN Expression, langfristig wird sie jedoch gesteigert (6-24 h).93 Die beiden

Hormone stehen im Gleichgewicht und es muss postmenopausal darauf geachtet

werden, keine alleinige Östrogengabe zu applizieren.

Abschließend kann festgestellt werden, dass Änderungen der miR-21

Konzentrationen in der Zelllinie MFE-296 zu signifikanten Funktionsänderungen

geführt haben. Die zu erwartenden Veränderungen in der PI3K/AKT-Signalkaskade

nach transienter pmiR-21 Transfektion konnten in dieser Zelllinie dargestellt werden.

In der Zelllinie MFE-280 scheint miR-21 in der Funktion als PTEN-Suppressor im

Vergleich zu MFE-296 eine geringere Rolle zu spielen und möglicherweise eher über

andere Signalkaskaden zu wirken.

Die beiden Zelllinien lassen sich entsprechend ihrer Merkmalen den beiden EC-

Typen nach Bokhman (1983) zuordnen. Möglicherweise kann miR-21 nur für den

Typ I mit besserer Prognose als Biomarker dienen. Dies würde für den klinischen

Alltag bedeuten, dass nach einer genetisch korrekten Diagnose des Karzinomtyps,

miR-21 als Verlaufsparameter oder Prognosefaktor genutzt werden kann. Eine

mögliche therapeutische Konsequenz wurde bereits im Mausmodell getestet. Bei

Typ I Tumoren kann eine Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP) Inhibition eine

Alternative darstellen, falls PTEN mutiert ist. PARP unterliegt nicht den PTEN-

Regulationsmechanismen.101

Die Aussagekraft von miR-21 wird durch die erschwerte Normierung im Endometrium

relativiert. Schon im tumorfreien Stadium gibt es eine Kontroverse um die

Aussagekraft von miR-21. Die Ergebnisse differieren zwischen widererwartend

ausbleibender Veränderung des miR-21 Levels im Plasma nach Hysterektomie83 und

ausgeprägter miR-21 Überexpression unter Endometriose.102

Diskussion

51

Zu berücksichtigen bleibt zudem, dass die Zellkultur von in vivo Versuchen deutlich

abweichen kann. Um die Frage der klinischen Relevanz abschließend zu klären, sind

Arbeiten mit Patientenproben und höheren Fallzahlen erforderlich. Ebenso gibt es

vielfältige Regulationsmechanismen von miR-21 und es besteht die Möglichkeit, dass

die MikroRNA im EC auch maßgeblich über einen anderen Mechanismus wirkt.

Möglicherweise kann miR-21 über diesen als Tumormarker fungieren. Eine mögliche

Messung der miR-21 demonstrierten Zavesky et al. (2016) erfolgreich. Sie zeigten in

einem ersten Versuch eine Erhöhung der miR-21 Konzentration im Urin, welche bei

EC nachweisbar war und eventuell langfristig zur Diagnostik eingesetzt werden

könnte.103

Im Hinblick auf Optionen suppressiver Therapien bietet die proliferative PI3K/AKT-

Signalkaskade verschiedene weitere Ansatzpunkte für die zukünftige Forschung.

93 % aller endometrioiden Karzinome haben Mutationen in der dieser

Signalkaskade.90 miR-21 ist hierbei lediglich ein Faktor. Die PI3K-Inhibition und

Hemmung ihrer Einflussmoleküle sind ebenfalls Gegenstand der aktuellen

Forschung.25,35 Die Angriffspunkte sind vielfältig. Diese Arbeit stellt die

Signalkaskade beginnend von miR-21 bis zum Endpunkt AKT in den Mittelpunkt und

kann als Grundlage für die Charakterisierung von EC herangezogen werden. Die

genauen Mechanismen von miR-21 müssen jedoch im Detail charakterisiert werden.

Insbesondere Unterschiede der beiden EC-Typen bzw. der vier genetischen Typen

sollten herausgestellt werden, bevor die MikroRNA als Marker oder therapeutisches

Target erfolgreich in den klinischen Alltag implementiert werden kann. In zukünftigen

Arbeiten könnten vier Zelllinien den genetischen Typen zugeordnet werden und

hinsichtlich miR-21 verglichen werden.

Eine Integrierung von klinisch-patologischen und molekularen Einteilungen

ermöglicht neben einer genaueren Prognose, eine Verbesserung und

Individualisierung der Therapie.

Zusammenfassung

52

Zusammenfassung

Beim Endometriumkarzinom (EC) bieten sich gemäß aktueller Leitlinie (AWMF)

wenige Möglichkeiten einer Chemotherapie. Tumormarker und targeted therapy

rücken daher in den Fokus. In diesem Zuge erlangen molekulare Signalkaskaden

und deren Modulatoren einen wachsenden Stellenwert. Die PI3-Kinase/AKT-

Signalkaskade mit ihrem Regulator MikroRNA-21 (miR-21) ist in vielen

Tumorentitäten von Mutationen betroffen und bietet dabei verschiedene

Angriffspunkte. Ziel dieser Arbeit war es, die Signalkaskade im EC darzustellen und

die regulatorische Rolle von miR-21 näher zu charakterisieren.

Um eine möglichst umfassende Aussage bezüglich der Tumorentität EC zu treffen,

wurde je eine Zelllinie vom prognostisch günstigen Typ I und ungünstigen Typ II nach

der Klassifikation von Bokhman (1983) ausgewählt. Die Zelllinien wurden hinsichtlich

der Morphologie und ihrer molekularen Eigenschaften charakterisiert. Mittels

Transfektion von pmiR-21 wurde in den EC-Zellen miR-21 überexprimiert und die

Proteinexpressionen der PI3K/AKT-Signalkaskade nach 6-96 h mittels

Gelelektrophorese und anschließendem Western Blot analysiert. In der Zelllinie

MFE-296 kam es zu den erwartenden Veränderungen der Signalkaskade. Die

Expression der Phosphatase PTEN wurde inhibiert und der Zellzyklus enthemmt. Die

Zelllinie MFE-280 zeigte keine Veränderungen nach Transfektion. Ursachen sind

vermutlich die unterschiedliche PTEN-Aktivität aufgrund von Mutationen und andere

Regulationsmechanismen. miR-21 greift neben der direkten Inhibition von PTEN

posttranskriptionell indirekt in die Stabilität des Proteins ein. p85α, die regulatorische

Untereinheit der PI3K, ist ein weiteres Target von miR-21. Neben der Interaktion mit

den katalytischen Untereinheiten kann p85α Dimere mit PTEN bilden und dessen

Ubiquitinierung reduzieren. Die Wirkmechanismen von miR-21 sind vielfältig und die

genauen Zusammenhänge bisher nicht komplett verstanden.

Diese Arbeit stellt die unterschiedliche Gewichtung von miR-21-Modulationen auf die

PI3K/AKT-Signalkaskade in den beiden EC-Typen dar. miR-21 kann im EC-Typ-I als

Marker fungieren. Außerdem wurden einige Möglichkeiten der targeted therapy in der

PI3K/AKT-Signalkaskade angedeutet. Um diese Aussage und die therapeutischen

Konsequenzen in den klinischen Alltag zu integrieren, bedarf es weiterführender

Arbeiten.

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und

keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät und keiner anderen

wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und

dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum Unterschrift

65

Danksagung

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Mustea, stellvertretender Klinikdirektor der Klinik und

Poliklinik für Gynäkologie der Universitätsmedizin, und Frau PD Dr. med. Könsgen-

Mustea danke ich für die Bereitstellung des interessanten Themas und das in mich

gesetzte Vertrauen, die Promotionsarbeit im molekularbiologischen-gynäkologischen

Forschungslabor durchzuführen.

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Zygmunt danke ich für die Bereitstellung der

Räumlichkeiten des gynäkologischen Forschungslabors.

Herrn Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Stope danke ich ganz besonders für die kritischen

Diskussionen und Anregungen. Ohne dich wäre diese Arbeit so nicht möglich

gewesen.

Des Weiteren möchte ich mich bei allen MitarbeiterInnen des gynäkologischen

Forschungslabors und meinen Kommilitonen für die Geduld, die tatkräftige

Unterstützung und die vielen lustigen Stunden bedanken. Namentlich Karo Diesing,

Diana Krüger, Jens Ehrhardt sowie Luise Wiegank, Daria Hettenbach, Emely Kühn,

Wiebke Kempin, Theresa Schaller und Nils Rodenburger. Die Zeit mit euch war

ebenso lehrreich wie bereichernd.

Während der Verfassung dieser Arbeit mussten einige Täler durchschritten werden.

Für die vielen Ermutigungen und die konstruktive Kritik möchte ich mich bei meinen

lieben Freunden, meinen Mitbewohnern und meiner Familie bedanken. Ich bin froh

euch alle an meiner Seite zu wissen.

Abschließend geht der Dank an meine Freundin Laura, die meine Launen

auszuhalten hatte und mich immer unterstützte.

MikroRNA-21 als Regulator der PI3K/AKT-Signalkaskade im ... · Aus der Klinik und Poliklinik für...

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