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Molekulargenetik - Gentechnik

Organisation von Genen in einem Chromosom und Beispiel für den Aufbau eines Gens bei Wirbeltieren

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Wenige Gene, viele Schalter

Die Anzahl der Gene sagt über die Komplexität eines Tieres wenig aus. Kleine Steuermoleküle namens miRNA, die die Aktivität von Genen an- und abschalten können, scheinen darüber viel bessere Auskunft zu geben.

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Genomische Zuchtwertschätzung

Schema der PCR

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Ergebnis der Gelelektrophorese

Single Nucleotide Polymorphism (SNP) auf DNA-Ebene

Erfassung genetischer Variabilität auf der DNA-Ebene

= genomischer Zuchtwert

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Ein SNP auf DNA-Ebene

S..ingle

N..ucleotide

P..olymorphisms

(Einzelnukleotid-Polymorphismen)

Veränderungen einzelner Basenpaare in in codierten Regionen eines DNA-Strangs begründen genetische Variationen für Leistungs- u. Fitnessmerkmale.

Bsp: Basenfolge AAGCCTA AAGCTTA

Wenn diese Punktmutation eine Keimzelle (Eizelle, Spermium) eines Tieres betrifft, können Nachkommen dieser Tiere diese Mutation erben und der SNP kann sich nach mehreren Generationen in der Popula-tion etablieren.

Jedes Genom besitzt Vielzahl von SNPs.

Beispiele:

Mensch: (= 1 SNP je 1000 Basenpaare (bp) ..>4 Mio SNP bekannt)

Rind: Bei ca. 3 Miard. Basenpaare des Ringergenoms wurden ca. 2,5 Mio. variable ( = polymorphe) Stellen gefunden.

SNPs sind Stellen in der Erbsubstanz, in der die zugehörige Basenfolge in mehr als einer Variante vorkommt.

Interessante Merkmale: Nutzungsdauer, Lebensleistung

SNPs

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Nachweis der Hybridisierung durch Abfangen eines Fluoreszenzsignals.Die Ologonukleotidsonde trägt an ihren Enden zwei Marker. -Einer ist ein Fluoreszenfarbstoff- der andere ist eine „ abfangende

Verbindung“

Hybridisiert die Sonde nun mit der Ziel-DNA (des zu untersuchenden Tieres bzw. Patienten), dann werden die beiden Enden des Oligonukleotides getrennt und der Fluoreszenzfarbstoff emittiert das Signal („molekulares Leuchtfeuer“)

Prinzip der Arbeitsweise mit den DNA-Chips:Links: Ausschnittsvergrößerung des Chips. Die auftragenden Sonden tragen an den Enden die zugehörige Base. Der DNA-Strang des zu untersuchenden Tieres ist rot dargestellt. Falls es sich an die Sonde anlagert (= gelbes Signal); falls nicht: kein Signal (= dunkel, blau).Rechts oben: Die gelben Stellen markie-ren die Anlagerungen (Hybridisierung). Das zu untersu-chende Tier trägt die Base A und G; rechts unten: Nachweis aller DNA-Bereiche, an denen eine Hybridisie-rung stattfand, mittels sogenannter Fluoreszenzmarkierung; automatisch erfassbar über Laser-Scanning-Mikroskopie

Nachweis der Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA (eines Testtieres/ Patienten) mit einer zugehörigen Sonde auf einem DNA-Chip

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Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie

Millionen von DNA-Molekülen(oligos) in einer Zelle, >200.000 Zellen, >20.000 Gene

markierte RNA Fragmente binden spezifisch an DNA Moleküle

Messbares Signal

Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie

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Hybridisierter Mikroarray

Expressionsanalysen: Mikroarray-Technologie

Erfassung genetischer Variabilität auf DNA-Ebene=

genomischer Zuchtwert

Verwendung von DNA-Chips (z.B. 50.000 Marker / Chip) kann 50.000 SNPs erkennen.

Anhand geeigneter Daten aus der Leistungsprüfung von Milchkühen können nun mithilfe von Assoziationsstudien die Effekte einzelner SNPs innerhalb der Population geschätzt werden.

Der genomische ZW = die Summe der geschätzten Effekte aller erfassten SNPs bezüglich eines Merkmals.

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Ableitung der SNP-Effekte

• Voruntersuchungen: Schätzung der Effekte der 50.000 SNPs auf ein Merkmal (Milchleistung) entspricht dem Vergleich der Tiere untereinander (Gruppe A zu Gruppe B).

• Vergleichgruppe (Bsp.: Referenzgruppe = Gruppe A) mit sicheren Zuchtwerten (> 90% Sicherh.) ca. 3000 Bullen

• Typisierung der Referenzbullen zwecks Ableitung von Beziehungen zwischen genet. Buchstaben (SNPs) und Merkmalen……= Effekt der SNPs auf das Merkmal!

Schritte in der Genomanalyse

1. Genkartierung Erstellung eines Orientierungsrasters zur Lokalisation von Genen auf den Chromosomen mithilfe von genetischen Markern

2. Kopplungsanalyse Herstellung von Beziehungen zwischen Merkmalen und DNA-Markern

3. Einzelgencharakterisierung Aufklärung der Genstruktur bis zur DNA-Sequenz für ein definiertes Merkmal

4. Gendiagnose Erkennung von Genvarianten, die Erbmerkmale beeinflussen

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dGW ZW

• Vollgeschwister haben identisches Pedigree• ZW von Vollgeschwister basiert auf den Ergebnissen der

Eigen- und Nachkommenleistung• Beim dGW fließen die Buchstaben des Tieres ein!• Identische dGWs sind nur bei eineiigen Zwillingen (Klone)

möglich!•• Vollgeschwister haben unterschiedliche SNP-Situationen

deshalb auch unterschiedliche dGWs.• dGWs erreichen Sicherheit von 40 – 60% (abh. von h2)• Vergleich der Sicherheiten des dGW und des ZW

Kuh-ZW hat niedrige Sicherheit, Bullen ZW hat hohe Sicherheit!

dGW ZW

• Basis für dGW ist Blutprobe• Sicherheit für Kalb ist höher als ZW (Pedigree)

Züchter kann mit dGW beste Jungtiere genauer auswählen.

• Eigen- und Nachkommenleistung gehen nicht in dGW ein!

• Bei Vorliegen von Nachkommenleistung ist ZW genauer als dGW! Kombination von dGW + ZW

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Genomische Selektion

Konventionelle Zuchtwertschätzung

ZW

Genomische Zuchtwertschätzung

dGW

gZW

genomisch unterstützter Zuchtwert

Kombination des rein genomischen Zuchtwertes (dGW) mit dem Zuchtwert der bisherigen Zuchtwertschätzung (ZW) zu einem genomisch unterstützten Zuchtwert (gZW)

Kombination dGW & ZW gZW

• Unterschiedliche Sicherheiten der Ausgangszuchtwerte (ZW bzw. dGW) beeinflussen Sicherheit des gZW!

Steigende Anzahl Töchter

Einfluss des dGW

Einfluss des ZW

Ab Sicherheit von 90% des ZW wird gZW fast ausschließlich von ZW bestimmt!

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Verlauf der Sicherheit des genomisch unterstützten Zuchtwertes (gZW) der Merkmale Milchmenge bzw. Nutzungsdauer eines Besamungsbullen bzw. einer Kuh.

Die Sicherheit des rein genomischen Zuchtwertes (gZW) wurde aus Gründen der Vereinfachung im zeitlichen Verlauf konstant gehalten.

Genetische KopplungsanalyseAufzeigen des Abstandes zwischen zwei Genorten

Grundlage der Kopplungsanalyse ist der Genaustausch (Crossing over) und damit der Rekombinationsfrequenz.

Kopplungsanalysen beruhen auf Testkreuzungen von Doppel-, dreifach-der Mehrfachheterozygoten.

Häufigkeit beobachteter „Crossing over“ zw. zwei untersuchtehn „Loci“

=

Maß für die Entfernung zwischen den „Loci“

Je enger die Kopplung, desto geringer der Anteil an Neukombinationen Genorte liegen enger zusammen

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Kopplungsstärke Austauschwert (AW)

Zahl der Neukombinationen

Gesamtanzahl der Kombinationen

Maßstab in Genkarten, die auf Kopplungsanalyse beruhen ist

„Centi Morgan“ (cM)

1 cM

=Chance von 1 %, dass in der natürlichen Rekombination während eines Gene-rationswechsels ein bestimmter Genort von einem anderen getrennt wird.

=

Abstand wischen zwei Loci mit einem Austauschwert von 1%

= map unit (Karteneinheit)

1 cM entspricht 1 Million Basenpaare

pr vg

11,0 cM

Genort für Augenfarbe

Genort für Flügelform

Austauschwert nach Kopplung von Doppelheterozygoter (Drosophila)

Bm ep ru

6,3 2,7

10,5

Austauschwert nach Kreuzung von Dreifachheterozygoten

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Kopplung (Linkage)

Zustand in dem von zwei Allelpaaren auf autosomalen Genorten jeweils zwei Allele, die an verschiedenen Loci sitzen, in den Gameten mit größerer Häufigkeit als erwartet gemeinsam vorkommen.

Zwischen den Allelpaaren Aa und Bb besteht Kopplung, wenn A und B bzw. a und b oder A und b bzw. a und B gehäuft in den Gameten auftreten.

Maßstab der Kopplung:

Die Stärke der Kopplung wird quantitativ mit der Rekombinationsrate (r) bestimmt.

0 < r < 0,5

Wert 0: sehr enge Kopplung

Wert 0,5: sehr lockere Kopplung

Doppeltausch

Doppel – crossover

Mehrfachtausch

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Gesetzmäßigkeit der Kopplungsvorgänge

Freie Kombination Kopplung

P: AABB x aabb (AB) (AB) x (ab) (ab)

F1 AaBb (AB) (ab)

Gameten: AB, Ab

aB, ab

(AB), (ab)

F2 A- B- aaB- aabb

9 3 3 1

(AB)(AB) (AB)(ab) (ab)(ab)

1 2 1

Gruppierung der Gene in der Nomenkladur für humane Gene:

• Enzyme und Proteine

• Vererbte klinische Störungen

• Blutgruppen

• Zelloberflächenantigene

• DNA-Segmente

• Virus-assoziierte Marker

• Marker mit noch unbekannter Funktion

• fragile Genbereiche

• mitochrondriale Gene

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Chromosom 1 Chromosom 2

Marker

unbekanntes Gen für Hornlosigkeit

Das Erbgut des Rindes ist auf 29 verschiedenen Chromosomen und den Geschlechtschromosomen X und Y angeordnet. Dort befinden sich 50.000 verschiedene Gene. Davon kennt man jedoch nur für etwa 200 Gene die Lage auf dem Chromosom.

Dagegen sind derzeit weit mehr als 1.000 Marker auf der genetischen Karte be-kannt, die über alle Chromosomen ver-teilt sind. Diese können verwendet wer-den, um unbekannte Gene bestimmten Chromosomenregionen zuzuordnen.

Auf dem Chromosom 1, in der Nähe der Marker B, C, D und E befindet sich z.B. das Gen für die Hornlosigkeit.

A B C D E

Das Schweinegenome

• Jedes Schwein hat:– 38 Chromosome

– 23,000 bis 30,000 Gene

• Gene mapping– Kandidategene

• Speziell bekannte Gene mit großen Effekten

– QTL (Quantity trait loci)• Gebite auf dem Chromosom, die mit einer

Leistung assiziieren.

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Kandidatengene beim Schwein

IGF2 (Ch 2) Muskelgewebe, FettFUT1 (Ch 6) KrankheitsresitenzH-FABP (Ch 6) Wachstum, FettRYR1 (Ch 6) Stress, PSEPRKAG3 (Ch 15) RN/Hampshire Gen,

Rendement Napole Gen(Wasserbindungsvermögen, pH-Wert im Muskel)...Hampshire-Faktor

Genetische Marker

…..sind polymorphe DNA-Sequenzen. Sie stellen Referenzpunkte im Genom dar und deren Lokalisation ist auf dem Chromosom bekannt.

Molekulare Marker sind hoch polymorph und leicht zu charakterisieren. Sie dienen der Schätzung von

-Diversitäten

-Differenzierungen von Rassen

-genetischen Distanzen zwischen Rassen

-Identitäts- und Abstammungskontrollen

-Identifizierungen von Genorten für Merkmale

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Beispiel für Lokalisation eines Gens bei verschiedenen Spezies

Spezies Lokalisation

Rind Chromosom 4

Schwein Chromosom 18

Mensch Chromosom 7, Region q 31.3

ob-Gen

Ort für die Bildung des Hormons Leptin in den Zellen des Fettgewebes (Adipozyten). Beim Fehlen dieses Gens wird kein Leptin gebildet, es tritt

Fettleibigkeit (ob -Obesitas) auf.

Metabolische Vermittlerfunktion zwischen Fettgewebe und Gehirn (Beeinflussung des Stoffwechsels (Kohlehydrate) und der Produktion von

Fortpflanzungs- und Wachstumshormonen)

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Erbdefektez. B. CD18, ASS, UMPS, GAA, TG, EPB3,

FECH, MANA, MANB, PYGM, PRNP,CHS, PRG

Wachstumz. B. MH

Milchleistung/Milcheigenschaften

z. B. CASK, PRL, LGB

Rotfaktorz. B. MC1R

Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Merkmale beim Rind für die gendiagnostische Tests verfügbar sind

Erbdefektez. B. RYR1, LDLR,

ARVWF, GULO

Wachstumz.B. MC4R

Fleischqualität/Stressanfälligkeitz. B. RYR1, HFABP, FABP4, RN

Gesundheitz. B. FUT1

Hautfarbez. B. KIT, MC1R

Futteraufnahmez.B. MC4R

Fruchtbarkeitz. B. RARG, FSHB, RBP4,

ESR, PRLP

Schlachtkörper-zusammensetzung

z.B. MC4R, IGF2

Genetische Loci mit signifikantem Einfluss auf phänotypische Leistungen beim Schwein für die gendiagnostische Tests verfügbar sind

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1. Polymorphismus2. Assoziation3.Funktionelle

Analyse

direkte Kandidatengene: biologische Funktion eines Genprodukts

QTL-Analysen: Beobachtung der Ko-Segregation von Markern und Merkmal in spez.Familien

funktionelle Kandidaten:Genaktivität in bestimmten Geweben, Phänotypen, Entwicklungsstadien oder Umwelten

positionelleKandidaten

positionelleKandidaten

Genotypi-sierung

RNA Proteine Intermed-därer Phänotyp

Tier

Black BoxGenotypi-

sierung SNPPhänotypi-

sierungLP

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Genom Genotyp

GenvariatenTranskriptom Proteom Struktur

Metabolom

DNA RNA Proteine Intermediäre Phänotypen

Tier

Hochauflösende Phänotypisierung, molekulare Phänotypen, ‚omics‘-techniken

Genotyp – Phänotyp - Abbildung

Bedeutung der Leistungsprüfung

(Phänotypisierung) mit Hilfe causalerMerkmale

d.h. weitgehender Ausschluss vom Umweltfaktoren

Fruchtbarkeit (geb. Ferkel/S. & J)………………Ovulationsrate

305-Tage-Milchleistung……………………Sekretionsleistung der Milchdrüse

Langlebigkeit/Nutzungsdauer……………….Resistenz, etc. etc.

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Genotyp Phänotyp

QTL-AnalysenGenomweite Assoziationsanalysen (GWA)

Genomische Selektion

DNA RNA Protein intermediärePhänotypen

Tier

Genotypisierung

Leistungs-prüfung

& Metabolomics, Histologie, Labormed…

Marker60k SNP-Chip

Phänotypisierung

Produktionsmerkmale:Mast- und Schlachtleistung

Funktionale Merkmale:Adaptabilität, Gesundheit

Produktqualität

Rep

rodu

ktio

n

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Reproduktion ist als biologischer Vorgang essentiell für die Arterhaltung und –entwicklung Fitness

In der Tierzüchtung ist Fortpflanzung essentiell zur Bestandsergänzung und Bereitstellung von Jungtieren für die verschiedenen Nutzungsformen ökonomisch wichtiges Produktionsmerkmal

Reproduktion umfasst eine Reihe physiologischer Vorgänge

paternal maternal embryonal/fötalgenetische Einflüsse:

Umweltabhängigkeit

Fruchtbarkeit – ein komplexes MerkmalErblichkeit

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Merkmale der Reproduktionsleistung - Schwein

Anzahl Ferkel/Sau/Jahr

Aufgezogene Ferkelje Wurf

Würfe/Sau/JahrWurfabstand

Säugedauer GüstzeitAufzucht-verluste

Lebende-geborene

Ferkel

Ovulations-rate

Befruch-tungs-rate

Fötale Sterb-lichkeit

Intervall Absetzen-Brunst

Konzenp-tions-rate

Libido, Spermaqualität♂

Anzahl Nachkommen je Geburt

Reproduktionsfrequenz

Heritabilität der Reproduktionsmerkmale

Rind Schwein

Rastzeit/Güstzeit sehr geringTrächtigkeitsrate sehr geringBesamungsindex sehr geringSchwergeburten moderatTrächtigkeitsdauer moderatGeschlechtsreife moderatZwillingsrate/Ovulationsrate gering moderatWurfgröße geringSpermaqualität moderat

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Einsatz von Reproduktionsbiotechnologie und Molekulargenetik

Reproduktionsbiotechnologie Modifikation von Ablauf und biologischer Effizient der Fortpflanzungs-vorgänge; Erhöhung der Reproduktionsrate selektierter Individuen

Molekulargenetik Identifizierung von Genen mit Einfluss auf die Fruchtbarkeit; Selektion zur nachhaltigen genetischen Verbesserung der Reproduktionsleistung

Hypothalamus

GnRH

Hypophyse

Milchdrüse

Ovar

LH FSH Prolactin

ActivinInhibinÖstrogenProgesteronAndrogen Uterus}

}

Direkte Kandidatengene abgeleitet von der hormonellen Steuerung der

Reproduktionsvorgänge

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Kandidatengene für männliche Fruchtbarkeit Gen Biologische Funktion

GnRHR …vermittelt die Wirkung des Signals vom Hypothalamus andie Hypophyse (Wise et al., 1984)

FSH-β …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst dieHodenmorphologie und -funktion (Zanella et al., 1999;Li et al., 1998)

PRLR …stimuliert die Spermatogenese und beeinflusst dieHodenmorphologie und -funktion (Hondo et al., 1995)

RLN Relaxin-Konzentration in der Samenflüssigkeit ist korreliertmit der Motilität der Spermien (Sasaki et al., 2001)

AR …vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone

Androgenrezeptor (AR)

AR ist ein Kandidatengen für Reproduktionsmerkmale:

vermittelt die hormonale Antwort auf Androgene und reguliert die Expression des Zielgens; beeinflusst Zellvermehrung und Differenzierung im Zielgewebe

1. AR vorhanden in Hoden und Ovar (Kimura et al., 1993; Pelletier et al., 2000; Duffy et al.,1999)

2. positive Korrelation zwischen AR mRNA Expressionen und Granulosa-Zelldifferenzierung (Weil et al., 1998)3. AR fördert das Follikelwachstum und die Östrogensynthese durch die Verstärkung des Effekts des Follikel- stimulierenden-Hormons, FSH (Keith et al., 1998; Weil et al., 1999)

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Genomic hat zum Ziel die Feststellung des Status quo zwecks

Nutzung für züchterische Selektion!

Es ist keine genetische

Manipulation!

AndrogenrezeptorSequenzanalyse: cDNA: 3.554 bp

Promotor: 2.459 bpPolymorphismen: SNPs in Promotor und cDNA

INDEL in Promotor und Exon 1(CCTTT)n im 5´-UTR

Frühreife: Chi-square = 48.840; (p< 0.001)Zitzenzahl: Chi-square = 38.311 ; (p=0.032)Assoziationen:

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Genorten für produktionsrelevante Merkmale bei Nutztieren

Tierart Merkmal Chromosom

Rind Doppellender 2

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Kerntransfervorgang in einer vorher enukleierten Empfängerzygote. Im Anschluss an den Transfererfolgt die Fusion beider Anteile

Zygote nach einer Zentrifugation und während der Injektion in den Vorkern

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Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in Schweinezygoten. Die Zygoten sind zentrifugiert worden, um die Vorkerne sichtbar zu machen. Es werden 1 - 2 pl (10-12) in einen Vorkern injiziert.

Effizienz der Mirkoinjektion zur Erstellung transgener Tiere

Injizierte Zygoten

Nachkommen /Feten

n %Transgene

n %

Rind 15.019 432 /4269 10,1 26 0,2

Schaf 7.552 955 12,6 55 0,7

Schwein 13.988 1.264/13.446 9,4 93 0,7

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Was kostet ein transgenes

Tier ?

Maus..................80 €

Schwein......20.000 €

Schaf...........48.000 €

Rind...........420.000 €

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