Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten ...

Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten:Immunzytochemische Charakterisierung

des Phänotypsim zeitlichen Verlauf der Kultur

Gerhard Dyckhoff

Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten:Immunzytochemische Charakterisierung des Phänotyps

im zeitlichen Verlauf der Kultur

Der Medizinischen Fakultätder Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

vorgelegte Dissertation zur Erlangung des akademischen Gradeseines Doktors der Medizin

von

Gerhard Dyckhoffaus

Aachen

Meinen Eltern

in Liebe und Dankbarkeit gewidmet

I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

1.1 Knorpelzellkultur

1.1.1 Chondrozyten und hyaliner Knorpel

1.1.2 Das Problem der Entdifferenzierung

1.1.3 Zellkulturmodelle

1.1.4 Klassische histochemische Färbungen

1.2 Immunzytochemie

1.2.1 Grundlagen der Immunzytochemie

1.2.3 Kollagene

1.2.4 S-100-Protein

1.3 Zielsetzung

II

2 Material und Methoden


2.1.1 Bovine Chondrozyten in Monolayerkultur (P0-P6)

2.1.2 Biologische Kontrolle: Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur (P0-P2)

2.1.3 In-situ-Kontrolle: Gewebeschnitte

2.1.4 Prä-kulturelle Kontrolle: Ausstriche frisch isolierter Zellen

2.1.5 Zusatzversuche

1.) Perkonfluenzstudie

2.) Trypsinstudie

3.) P0-Metachromasiestudie

2.1.6 Histochemische Referenzfärbungen

2.2 Immunzytochemie

2.2.1 Indirekte-Immunperoxidase-Methode

III

3 Ergebnisse

3.1 Orientierende histochemische Darstellung

3.1.1 Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie

3.1.2 Basophilie und Metachromasie

3.2 Immunzytochemische Charakterisierung

3.2.1 Kollagen-Typ I und II

3.2.2 Kollagen-Typ III und V

3.2.3 S-100, S-100-α, S-100-β

3.3 Fibroblasten als biologische Kontrolle

3.3.1 Histochemische Darstellung

1.) Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie

2.) Basophilie und Metachromasie

3.3.2 Immunzytochemische Charakterisierung

1.) Kollagen Typ I und II

2.) Kollagen Typ III und V

3.) S-100, S-100-α, S-100-β

3.4 Synoptische Darstellung der Ergebnisse

IV

4 Diskussion







4.2.3 S-100, S-100-α, S-100-β


4.4 Synoptische Auswertung

5 Zusammenfassung

6 Literaturverzeichnis

7 Danksagung

8 Lebenslauf

1

1 Einleitung

Ziel der experimentellen Pathologie ist es, Ätiologie und Pathogenese von

Krankheiten und Syndromen aufzuklären. Deren Kenntnis ist eine wesentliche

Grundlage, um durch Prävention Krankheiten zu vermeiden oder aber in

Krankheitsabläufe kausal einzugreifen und so eine Heilung zu ermöglichen.

Solche Erfolge stehen bis heute beispielsweise in der Rheumatologie noch aus. So

ist die Therapie etwa der Rheumatoiden Arthritis weitgehend symptomatisch

(Entzündungshemmung mit nicht-steroidalen Antirheumatika oder

Glukokortikosteroiden) oder in der sogenannten Basistherapie (Chloroquin,

Goldsalze, Penicillamin u.a.) überwiegend empirisch begründet (194, 203). Erst

eine kausale Therapie wird eine wirkliche Heilung erlauben.

Ein Ansatz der experimentellen Pathologie ist es, solche Krankheiten im Modell

nachzuvollziehen. So wurden zur Erforschung der Rheumatoiden Arthritis und

anderer Gelenkkrankheiten Zellkulturmodelle von Knorpelzellen eingesetzt.

2


1910 unternahm Alexis Carrel als erster den Versuch, Knorpelgewebe „außerhalb

des Körpers“ zu kultivieren (196). Für Knorpelzellen versuchte A. Fischer 1922

erstmalig eine „Reinkultur“ anzulegen (54) und beobachtete dabei zugleich als erster

eine „Transformation der Zellen“, die in der späteren Geschichte der

Knorpelzellkultur als Entdifferenzierung bezeichnet wurde (s.u.).

Als herausragend sind die Pionierarbeiten von H.B. Fell anzusehen. In

ausführlichen Studien an Organkulturmodellen von Extremitätenknospen von

Hühnerembryonen beschrieb sie 1925 die Chondrogenese, d.h. die embryonale

Entwicklung des Knorpelgewebes, sowie das Knochenwachstum der

Extremitätenknochen (51). Der entscheidende Durchbruch in der Knorpelzellkultur

gelang A. Moscana erst knapp 30 Jahre später: er entdeckte 1952 die Möglichkeit,

lebensfähige Knorpelzellen durch enzymatische Andauung mit Trypsin aus dem sie

umgebenden embryonalen Gewebe herauszulösen (196). Doch aufgrund des hohen

Kollagenfaseranteils in erwachsenem hyalinen Knorpel war diese Methodik nur auf

embryonalen Knorpel anwendbar. Nahezu gleichzeitig setzten hier die beiden

Arbeitsgruppen um Smith und Kawiak den nächsten Meilenstein. 1965 gelang es

ihnen unter zusätzlicher Verwendung von Clostridien-Kollagenase, Chondrozyten

aus ausgewachsenem Knorpelgewebe zu isolieren (97, 196, 197). Darauf basierend

etablierten Manning und Bonner 1967 die erste echte Zellkultur von menschlichen

Gelenkknorpelzellen (137). Von diesem Zeitpunkt an stand der Forschung eine

neuartige Technologie zur Verfügung, die sich in zahlreichen Anwendungen

weltweit bewährt hat.

Zunächst erlaubt die Kultur wie hier z.B. von Knorpelzellen die Erforschung ihres

physiologischen Stoffwechsels. So wurden in großem Umfang die Wirkungen

untersucht von Wachstumsfaktoren (37, 40, 72, 95, 96, 90, 108, 135, 172, 211,

213), Hormonen (70, 76, 149, 195) und Vitaminen (46, 114), wobei meist der

Einfluß auf den Kollagen- bzw. Proteoglykanstoffwechsel und die

Proliferationsrate der Chondrozyten beurteilt wurde. Die Kenntnis des

physiologischen Stoffwechsels auch unter verschiedenen Einflüssen ist

Grundvoraussetzung für das Verstehen jeglicher pathologischer Prozesse (16).

Sodann lassen sich auch Teilschritte komplexer Krankheitsabläufe in vitro

nachvollziehen. Zahlreiche Studien an Zellkulturmodellen haben uns beispielsweise

Einblick verschafft, welche Faktoren bei der Rheumatoiden Arthritis zur

Gelenkzerstörung führen. Einerseits kommt es zu einer direkten enzymatischen

Knorpelzerstörung durch das Pannusgewebe (hyperplastische Synovialmembran

mit lymphoplasmazellulären Infiltraten) sowie durch Granulozyten und

Makrophagen aus der Synovialflüssigkeit (49, 55, 112, 117, 151, 181, 187).

3

Andererseits stehen die Entzündungszellen untereinander durch Botenstoffe

(Zytokine) in Verbindung. Durch diese aktivieren und stimulieren sie sich nicht nur

gegenseitig, sondern regen in gleicher Weise auch die Knorpelzellen an, das von

ihnen selbst gebildete Knorpelgewebe zu zerstören (44, 48, 52, 60, 61, 85, 100,

109, 110, 111, 145, 169, 171, 178, 183). Erst bei Kenntnis dieser

Pathomechanismen kann zielgerichtet in den Krankheitsablauf eingegriffen werden.

Zur Entwicklung kausaler Therapieansätze ist es von ebenso großem Interesse,

nicht nur den Krankheitsablauf zu verstehen, sondern auch die Ursache bzw.

Auslöser der Erkrankung zu erforschen. Hypothesen über die Ätiologie und

Pathogenese lassen sich am Zellkulturmodell prüfen. In verschiedenen Ansätzen hat

man versucht, die Rheumatoide Arthritis im Modell nachzuvollziehen (125, 168,

202, 203, 209).

Die Bedeutung der Zellkultur für die Erforschung von Gelenkkrankheiten, wie sie

sich exemplarisch an der Rheumatoiden Arthritis darstellen läßt, gilt in gleicher

Weise auch für viele weitere Erkrankungen, die den Gelenkknorpel betreffen, auch

wenn nicht alle in gleichem Ausmaß Gegenstand der wissenschaftlichen Forschung

sind: Osteoarthrose (24, 75, 88, 143, 150, 153, 166, 193), Gelenkveränderungen

bei der Vitamin-A-Hypervitaminose (10, 32, 47, 53, 130, 199, 210),

Chondrokalzinose (197), ochronotische Arthropathie (121, 106), Hämophilie-

Arthropathie (105), Gichtarthritis (104) u.a.m. Nicht nur bei degenerativen und

entzündlichen Gelenkerkrankungen spielt die Zellkultur eine große Rolle. Sie dient

ebenso der Erforschung der Molekularpathologie der angeborenen Kollagen-

Stoffwechselkrankheiten wie Ehlers-Danlos-Syndrom Typen I-VIII, Osteogenesis

imperfecta Typen I-IV, Marfan-Syndrom, Cutis laxa, Epidermolysis bullosa und

anderen (28, 31, 56, 113, 177, 184).

Es liegt nahe, auf dem gleichen Wege, wie man die Krankheiten erforscht, auch

deren Therapie zu prüfen. So gibt es unzählige Untersuchungen über die

Wirksamkeit sowie die unerwünschten Wirkungen von Pharmaka wie Gluko-

kortikosteroiden und nicht-steroidalen Antirheumatika (22, 24, 38, 69, 80, 98, 122,

128, 165, 166, 170, 202, 203, 215, u.v.a.), antimikrotubulären Wirkstoffen wie

Colchizin und Vinblastin (50, 89, 127, 152, 206), sogenannten Basistherapeutika

wie D-Penicillamin (86, 158, 177), Chloroquin und Goldsalzen (202, 203) sowie

den Präparationen von Knorpelbestandteilen wie Rumalon und Arteparon (11,

134, 155, 198, 214).

Durch die Verwendung der Zellkulturtechnologie konnte auf eine Großzahl von

Tierversuchen verzichtet werden.

Von ganz besonderer Bedeutung ist die Knorpelzellkultur bei einem völlig anderen

Therapieansatz bei Gelenkknorpelschäden: der Knorpeltransplantation (5, 62, 157,

186).

4

1.1.1 Chondrozyten und hyaliner Knorpel

Von besonderem Interesse bei der Erforschung von Gelenkkrankheiten sind

Kulturmodelle der Zellen von hyalinem Gelenkknorpel. Dabei interessieren nicht

nur menschliche Knorpelzellen, sondern auch Chondrozyten etwa von Kaninchen,

Hühnern oder Rindern. Mit der Anzahl der Kulturmodelle, für die sich ein

Sachverhalt schlüssig nachvollziehen läßt, erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, daß

vergleichbare Verhältnisse auch in situ vorliegen.

Hyaliner Knorpel bedeckt die Fläche der Gelenke und ermöglicht so deren

reibungsarme Beweglichkeit und eine optimale Übertragung und Verteilung der

mechanischen Druckkräfte auf den Knochen. Gewährleistet wird die dazu

erforderliche elastische Verformbarkeit bei gleichzeitig enormer Festigkeit durch

eine Extrazellulärmatrix, deren Trockensubstanz im wesentlichen aus Kollagen und

Proteoglykanen besteht (zusammen etwa 95%) (84, 121). Die poly-anionischen

Proteoglykane vermitteln durch ihre außergewöhnlich hohe Wasserbindung die

Elastizität und Tragkraft des Knorpels (8, 91, 166). Ein feines Netzwerk aus

Kollagenfasern ist verantwortlich für die Aufnahme von Scherkräften und vermittelt

so die Verbiegungsbelastbarkeit des Knorpels. Die gesamte Extrazellulärmatrix wird

von den darin verstreut liegenden Chondrozyten gebildet. Dabei liegen die

Knorpelzellen, die jeweils mitotisch aus einer Mutterzelle hervorgegangen sind, in

sogenannten isogenen Gruppen von 2-4 (-8) Chondrozyten in einer Knorpelhöhle.

Umgeben wird die die Höhle abschließende Knorpelkapsel von einem Knorpelhof

mit einem besonders hohen Glykosaminoglykananteil. Knorpelhöhle und

Knorpelhof bilden gemeinsam ein Chondron, welches auch als Territorium

bezeichnet wird. Getrennt werden die Territorien durch Interterritorien aus

Extrazellulärmatrix, die nicht nur von den Chondrozyten gebildet, sondern auch

ständig in einem Fließgleichgewicht zwischen Auf- und Abbau aufrechterhalten

wird (8, 91, 142, 175). Trotz dieser hohen Stoffwechselleistung genügt den

Knorpelzellen ein weitgehend anaerober glykolytischer Stoffwechsel (91, 138, 142,

167). Sie sind auf eine Ernährung durch Diffusion aus der Synovialflüssigkeit und

den Kapillaren der umgebenden Gewebe angewiesen, da der hyaline Gelenkknorpel

selbst physiologischerweise völlig frei von Gefäßen sowie auch von Nerven ist (62,

64, 91, 124, 142, 167, 191, 198).

Das wiederum läßt Chondrozyten als besonders geeignet für die Zellkultur

erscheinen. Eine Ernährung durch Diffusion läßt sich angemessen durch

entsprechendes Nährmedium simulieren. Neben der Linse des Auges ist hyaliner

Knorpel überdies das einzige Gewebe des Körpers, das nur von einer einzigen

Zellart gebildet wird (64, 124, 198). Somit könnte eine Reinkultur von

Knorpelzellen ein adäquates Modell für hyalinen Knorpel darstellen.

5

1.1.2 Das Problem der Entdifferenzierung

Problematisch bei der Knorpelzellkultur ist der bereits in ihren Anfängen

beschriebene Verlust der charakteristischen phänotypischen Eigenschaften der

Chondrozyten, wenn sie in Monolayerkultur gehalten werden.

Der Phänotyp einer Zelle läßt sich definieren als die Gesamtheit ihrer äußeren

Erscheinungsmerkmale und ihrer funktionellen Eigenschaften. Jede Zellart

exprimiert einen für sie charakteristischen Phänotyp.

So ist die typische Knorpelzelle morphologisch

- regelmäßig rund bis polygonal geformt (3, 11, 12, 58, 101, 140, 160,

186, 188),

- größenmäßig zwischen Lymphozyt und Fibroblast beziehungsweise

Endothelzelle einzuordnen (54),

- in situ in einer Höhle gelegen, umgeben von durch sie selbst gebildete

Extrazellulärmatrix, in vitro epithelähnlich pflastersteinartig wachsend, ortsständig

(3, 11, 12, 137, 139, 188, 216),

- durch eine Neigung zur Aneinanderlagerung (Kohäsion) und

entsprechender Zellhaufenbildung gekennzeichnet (3, 64, 118, 160, 186),

- durch ein stark granuläres Zytoplasma charakterisiert, dem elektronen-

mikroskopisch ein Reichtum an rauhem endoplasmatischen Retikulum und ein

ausgeprägter Golgiapparat entsprechen als morphologisches Korrelat einer hohen

biosynthetischen Stoffwechselaktivität (3, 30).

Funktionell charakteristisch ist die Biosynthese von

- Kollagen-Typ II (6, 11,12, 19, 43, 58, 60, 66, 101, 115, 133, 136, 139,

140, 160, 186, 188, 189, 197, 207, 216)

- knorpelspezifischen, besonders hochmolekularen und große Aggretgate

bildenden Proteoglykanen (CS-PG) (11, 12, 46, 59, 79, 129, 131, 133, 136, 139,

207, 208)

- einer typischen Glykosaminoglykan-Zusammensetzung (viel sulfatiertes

Chondroitinsulfat, wenig Hyaluronsäure, nur geringe Anteile an Dermatan- und

Keratansulfat) (46, 101, 129, 139, 188, 189, 208)

- großen Mengen an sulfatierten Glykosaminoglykanen, die zu einer meta-

chromatischen Anfärbung führen (3, 66, 81, 82, 101, 137, 139, 186, 197, 216).

6

Die klassische Definition nach Holtzer (1960) beschreibt nun alterierte oder

entdifferenzierte Knorpelzellen als Abkömmlinge von Chondrozyten, die, obwohl

sie sich unter Kulturbedingungen vermehren, die die Knorpelentstehung erlauben,

kein Chondroitinsulfat synthetisieren (3, 81, 82).

Als entscheidend für die Expression des charakteristischen Phänotyps wurde

anfangs also die Chondroitinsulfatsynthese angesehen. Diese ließ sich durch die

metachromatische Anfärbung mit Toluidinblau oder Methionin nachweisen. Auf

Dauer kamen andere Kriterien hinzu.

Die typische entdifferenzierte Knorpelzelle ist morphologisch gekennzeichnet durch

- eine unregelmäßige abgeflachte, bipolar spindelähnliche Form mit langen

Zytoplasmaausläufern (3, 58, 66, 140, 160, 188)

- Zytoplasmavermehrung mit einer Größenzunahme um etwa das 3-10fache

(3, 82)

- amöboide Beweglichkeit und fischzugartiges Wachstum (3, 96, 140, 160,

188, 189)

- Neigung zur Haftung an Oberflächen (Adhäsion) (64, 82)

- elektronenmikroskopisch drastische Verarmung an rauhem

endoplasmatischem Retikulum und Golgiapparat, jedoch mit einer großen Anzahl an

zytoplasmatischen Filamenten, wie sie für amöboid bewegliche Zellen typisch sind

(3, 82).

Funktionell charakteristisch ist die Biosynthese von

- Kollagen-Typ I an der Stelle von Kollagen-Typ II (6, 19, 43, 58, 60, 66,

133, 140, 160, 188, 189, 197)

- hydrodynamisch kleineren und nicht-aggregierenden Proteoglykanen (46,

115, 129, 131, 133, 139, 208)

- mit geringeren Anteilen an sulfatiertem Chondroitinsulfat und größeren

Anteilen an Hyaluronsäure sowie Keratan- und Dermatansulfat in der Glykosamino-

glykanzusammensetzung (46, 129, 139, 188, 208)

- vor allem aber insgesamt wesentlich geringeren Mengen an Glykosamino-

glykanen (3, 46, 66, 81, 82, 160, 197).

7

Sowohl über die Ursachen der Entdifferenzierung als auch deren Zeitpunkt im

Verlauf der Kultur gehen die Vorstellungen der Autoren weit auseinander. Es

herrscht sogar Uneinigkeit darüber, ob es sich tatsächlich um eine echte

Entdifferenzierung handelt, d.h. um den echten Verlust der Synthesefähigkeit

bestimmter Stoffwechselprodukte (3, 81, 82, Abbott et al.[1966], Shulman et al.

[1968], Prockop et al. [1964] in 198), oder etwa lediglich um eine reversible

Modulation von nahe verwandten Zellen (204, Hall [1970] in 198).

Die Validität eines Zellkulturmodells für hyalinen Knorpel hängt aber davon ab, daß

es sich bei den gezüchteten Zellen wirklich um Chondrozyten handelt, und seine

Reliabilität ist abhängig von der Konstanz der Expression des charakteristischen

Phänotyps. Entsprechend hat man sich bemüht, Zellkulturverfahren zu entwickeln,

die den charakteristischen Phänotyp aufrechterhalten oder sogar wiederherstellen.

8

1.1.3 Zellkulturmodelle

Im Rahmen jeder Versuchsplanung in der Zellkultur sollte an erster Stelle die

Überlegung stehen, welches Modell den entsprechenden Anforderungen am besten

genügt.

Prinzipiell hat man die Wahl zwischen Organkultur, Monolayerkultur und

Suspensionskultur (142, 103). Die Organkultur als Zellkultur im weiteren Sinne

bietet den Vorteil, daß die Zellen in ihre Extrazellulärmatrix eingebettet bleiben.

Selbst die Rezeptoren an der Zelloberfläche werden nicht zerstört. So kann die

wechselseitige Einflußnahme der Zellen untereinander, diejenige mit den

Makromolekülen der Extrazellulärmatrix und die Wechselwirkungen der

Matrixmoleküle untereinander untersucht werden (17, 20, 51, 74, 87, 99, 120,

142, 192). Nachteile sind jedoch lange Diffusionswege, die Komplexität der

Wechselwirkungen sowie die Behinderung durch bereits vorhandene Matrix, die die

Untersuchungen der Synthese und Ablagerung neuer Extrazellulärmatrix nahezu

unmöglich macht.

Für letztgenannte Versuche eignet sich daher besser ein Modell, bei dem die Zellen

komplett aus ihrer Matrix herausgelöst worden sind. In der Literatur werden dafür

die verschiedensten enzymatischen Verfahren beschrieben (Trypsin alleine, nur

ausreichend bei embryonalem Knorpelgewebe [s.o.] [Moscana, 1952, vgl. 102,

196]; Trypsin in Kombination mit Kollagenase sukzessiv [97] oder simultan [39]mit Einwirkzeiten von 10 bis 40 Minuten; ausschließlich Kollagenase, jedoch mit

Einwirkzeiten bis zu 18 Stunden [137, 71] und schließlich sequentielle Enzym-

andauung mit Hyaluronidase, Trypsin oder Pronase und Kollagenase [18, 35 64,

116]). Die Zellen können nach der Befreiung aus ihrer Zwischenzellsubstanz in

Kulturflaschen ausgesät werden, wo sie an der Unterlage anhaften (Adhärenz),

sich ausbreiten (Spreading) und im Verlauf der Kultur eine einfache Zellage

(Monolayer) bilden. Man spricht daher auch von einer Monolayerkultur

(Anwendungsbeispiele: 2, 18, 36, 58, 64, 71, 73, 95, 115, 116, 123, 126, 132,

137, 142, 190, 200, 208). Vorteile dieser Methode: die Zelldichte ist beliebig

variierbar; der Einfluß definierter Substanzen auf den Stoffwechsel und die

Zelldifferenzierung läßt sich gut beurteilen; auch bei kleinsten Zellproben, z.B. zur

Bestimmung von Gendefekten, ist dieses Verfahren anwendbar; die Zellen zeigen

eine ausgeprägte mitotische Aktivität, so daß sich in relativ kurzer Zeit große

Zellmengen gewinnen lassen; die Technik dieser Zellkulturform ist vergleichsweise

leicht praktikabel. Ein großer Nachteil der Monolayerkultur ist jedoch, daß es im

zeitlichen Verlauf der Kultur zu der obengenannten Entdifferenzierung kommt.

9

In zahlreichen Ansätzen hat man versucht dieser Entwicklung entgegenzuwirken.

Den meisten von ihnen ist gemeinsam, daß man anstrebt, die rundliche Form der

Chondrozyten aufrechtzuerhalten, indem man ihre Anheftung an Oberflächen und

das darauf folgende Spreading verhindert. Dazu hält man die Zellen entweder durch

einen Rührmechanismus in Suspension (bewegte Suspensionskultur) (12, 83,

115, 116, 142, 156, 160, 163, 204) oder man bringt sie in einer hoch-

viskösen Flüssigkeit (z.B. Methylzellulose-Lösung) oder in einem Gel (weiches

Agar [83], Agarose [7, 17, 26, 42, 142, 207], Kollagengele [58, 101, 142, 216])in einen unbewegten Schwebezustand (stationäre Suspensionskultur). Vorteile:

neu gebildete Matrixbestandteile können nicht wegdiffundieren, so daß Schritt für

Schritt eine Matrix abgelagert wird, die derjenigen in vivo sehr ähnlich ist; Erhalt

des differenzierten Phänotyps; Möglichkeit der Untersuchung der Matrixsynthese

unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. Nachteile: nur geringe

Zellproliferation, technisch wesentlich aufwendiger als die Monolayerkultur.

Technisch am einfachsten anzuwenden und das wohl am meisten verwandte

Verfahren ist die Monolayerkultur.

Zur Bestimmung der Validität sowie der Reliabilität bedarf jedoch gerade dieses

Zellkulturmodell exakt definierter Parameter, die die phänotypische Expression im

Verlauf der Kultur kontrollieren.

10

1.1.4 Klassische histochemische Färbungen

Zur Charakterisierung des Phänotyps von Zellen bieten sich bei der vorliegenden

Fragestellung - wie unter 1.2 weiter ausgeführt - besonders immunzytochemische

Färbemethoden an. Diese weisen zwar das Vorhandensein und ggfs. die

Lokalisation bestimmter Antigene nach. Doch kommt das Zytoskelett hier meist

nicht befriedigend kontrastreich zur Darstellung. Aus diesem Grunde bietet es sich

an, für alle Präparate zum Vergleich auch histochemische Färbungen

durchzuführen.

Besonders kontrastreich sind sogenannte Mehrfachfärbungen. Sie werden deshalb

auch als Kontrastfärbungen bezeichnet. Ein Beispiel dafür und wohl die

bekannteste Färbung überhaupt ist die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin (HE). Dabei

färbt das basische Hämatoxylin alle selbst sauren und daher basophilen Zell- und

Gewebestrukturen blau und umgekehrt das saure Eosin alle basischen und damit

azidophilen Anteile rot. Hämatoxylin wird häufig auch als Gemisch mit

Natriumjodat und Kaliumalaun verwandt und wird dann als Hämalaun bezeichnet.

Die Azan- (Azokarmin-Anilin-Orange-) Färbung nach dem Tübinger Anatom Martin

Heidenhain (1864-1949) macht sich die Erfahrung zunutze, daß sich

Bindegewebsfasern nach Beizung mittels Phosphorwolframsäure mit Anilinblau

besonders intensiv blau darstellen lassen (91). Als weitere typische

Bindegewebsfärbung sei die nach Ladewig genannt.

Gerade für hyalinen Knorpel aber bieten sich spezielle basische Farbstoffe an, die

sich durch eine besondere Eigenschaft auszeichnen: sie färben Strukturen mit einer

sehr hohen Dichte negativer Ladungen in einem anderen Farbton als dem der

angebotenen Farblösung (Metachromasie). So färbt z.B. Toluidinblau solche

Substanzen rot-violett, während es orthochromatische Strukturen blau färbt (173).

Hier ist auch die Färbung nach dem Hamburger Chemiker und Bakteriologen

Gustav Giemsa (1867-1948) einzuordnen. Es ist eine Kontrastfärbung, bei der

basophile Strukturen durch Methylenblau blau und azidophile durch Eosin rot

gefärbt werden. Durch langes Stehen bildet sich in alkalischen

Methylenblaulösungen Azur, ein Farbstoff der Thioninreihe, der Metachromasie

bewirkt. Dieses Azur ist in der Lösung nach Giemsa enthalten und färbt

metachromatische Strukturen leuchtend blau-violett. Sowohl Thionin selbst (81),

Methylenblau (51) als auch sehr häufig Toluidinblau (3, 34, 58, 64, 65, 71, 101,

137, 186, 206, 207, 216) werden wegen ihrer Metachromasie in der Literatur zur

Darstellung der charakteristischen metachromatischen Knorpelmatrix eingesetzt.

Die Giemsa-Färbung bietet diesen Färbungen gegenüber den Vorteil, daß sie die

Vorzüge der Kontrastfärbung mit denen der Metachromasie vereinigt und kann

daher als optimale Referenzfärbung für unsere immunzytochemischen

Untersuchungen an hyalinem Knorpel und Chondrozyten angesehen werden.

11

Ursache für die metachromatische Anfärbbarkeit der Extrazellulärmatrix des

Glasknorpels ist der besonders große Reichtum an Chondroitinsulfat bei den

Glykosaminoglykanen der Proteoglykane. Zum besseren Verständnis sei kurz der

Aufbau der Proteoglykane angerissen, die immerhin neben dem Kollagen den

Hauptbestandteil der Trockensubstanz der Knorpelmatrix ausmachen (etwa

40-45%) (91).

Proteoglykane können definiert werden als Proteine mit kovalent daran

gebundenen sulfatierten Kohlenhydraten, den Glykosaminoglykanen (182). Diese

Zuckerketten, die wie die Borsten einer Flaschenbürste an dem Rückgrat aus Eiweiß

gebunden sind, stellen sich dar als unverzweigte Kettenmoleküle aus 50-100 sich

wiederholenden Disaccharideinheiten. Diese wiederum bestehen jeweils aus einem

N-acetylierten oder N-sulfatierten Aminozucker (daher ihr Name) und einer

Uronsäure bzw. Galaktose (29).

Es werden vier Hauptgruppen von Glykosaminoglykanen unterschieden:

1.) Heparin und Heparansulfat, 2.) Chondroitinsulfat (in den unterschiedlich

sulfatierten Formen C-4-S, C-6-S und C-4-6-S) und Dermatansulfat,

3.) Keratansulfat und 4.) Hyaluronsäure, die als einzige in freier Form, d.h. nicht

an Protein gebunden und unsulfatiert auftritt (29, 182).

An einem Kernprotein (Molekulargewicht: 11-220 000 Dalton) können ein bis

100 Glykosaminoglykanseitenketten gebunden sein (182). An den besonders

großen Proteoglykanen des hyalinen Knorpels wurden sogar bis zu

150 Chondroitinsulfatketten (zu je 1-2 x 104 Dalton), 50 Keratansulfatketten (zu je

5 x 103 Dalton) und zusätzlich etwa 100 N- oder O-glykosidisch gebundene

Oligosaccharide beschrieben (33, 174). Insgesamt ergibt sich so pro

Proteoglykanmonomer ein Molekulargewicht von etwa 2,5 Millionen Dalton. Diese

Monomere aggregieren nun noch zusätzlich mit Hyaluronsäure, und zwar bis zu 100

Proteoglykanmonomere pro Hyaluronsäuremolekül. Eine Stabilisierung der

bindenden Wechselwirkungen erfolgt durch sogenannte Verbindungsproteine (33).

Es wird deutlich, daß die Proteoglykane des Knorpels letztlich riesige Aggregate

bilden, die für sich genommen ein Gel mit einer hohen Dichte fixer negativer

Ladungen darstellen. Über diese treten die Proteoglykane in Form von Ionen-

bindungen mit anderen Makromolekülen, insbesondere den Kollagenen, in

Wechselwirkung. Je stärker sulfatiert und je länger die einzelne Glykosamino-

glykankette ist und je dichter die Ketten wiederum am Proteinrückgrat arrangiert

sind, umso größer ist die Bindungsstärke (182).

12

Eine besonders hohe Bindungsstärke zeichnet die knorpelspezifischen

Chondroitinsulfatproteoglykane des hyalinen Knorpels aus. In freier Lösung

nähmen diese Proteoglykane das fünffache Volumen von dem ein, was sie

tatsächlich in dem dreidimensionalen Netzwerk aus Kollagenfasern

zusammengedrängt einnehmen können (79). So verleiht letztlich das

Kollagenfasernetzwerk dem hyalinen Knorpel seine Festigkeit. Durch ihren hohen

Kohlenhydratanteil und die hohe Ladungsdichte bedingen die Proteoglykane die

enorm hohe Wasserbindungskapazitiät der Extrazellulärmatrix. Diese ist

verantwortlich für die federnde Druckelastizität des hyalinen Knorpels.

Die hohe Dichte negativer Ladungen, insbesondere der reichlich sulfatierten

Chondroitinsulfatseitenketten der knorpelspezifischen Proteoglykane (CS-PG),

verursacht bei der klassischen histochemischen Färbung nach Giemsa die

Metachromasie und bei denjenigen mit Hämalaun eine ausgeprägte Basophilie. In

dieser Arbeit sollen sie als Referenzfärbemethoden zur Anwendung kommen.

Die eigentliche phänotypische Charakterisierung der Chondrozyten erfolgt durch

immunzytochemische Färbungen mit monospezifischen Antikörpern gegen

Kollagene und ein spezielles Glykoprotein.

13

1.2 Immunzytochemie

Der Phänotyp einer Zelle ist definiert als Gesamtheit ihrer äußeren

Erscheinungsmerkmale und ihrer funktionellen Eigenschaften (vgl. 1.1.2).

Grundsätzlich ergeben sich daher zwei Ansätze zur Bestimmung des Phänotyps:

1.) Untersuchung und Beschreibung der äußeren Erscheinungsform

2.) Bestimmung von Stoffwechselleistungen etwa durch die qualitative und

quantitative Analyse der Stoffwechselprodukte.

Der morphologische Ansatz bietet keine ausreichende Spezifität. Die

Unterscheidung etwa zwischen differenzierten polygonalen und entdifferenzierten

fibroblastenartigen Knorpelzellen ist nicht eindeutig. Es werden Übergangsformen

beschrieben (34). Werden dagegen vom funktionellen Ansatz her die

Stoffwechselprodukte einer gesamten Zellkultur bestimmt - seien es diejenigen, die

in das Kulturmedium abgegeben, oder diejenigen, die in der Zell-Matrix-Lage

abgelagert werden -, so ist eine Zuordnung der Syntheseprodukte zu den einzelnen

Zellen nicht mehr möglich (vgl. 45). Insbesondere bei Mischkulturen aus noch

differenzierten und schon entdifferenzierten Zellen ist somit eine eindeutige

Bestimmung des Differenzierungsgrades der einzelnen Zelle anhand der

Stoffwechselprodukte nicht möglich.

In dieser Situation bietet die Immunzytochemie als Bindeglied zwischen Morphe

und Funktion enorme Vorteile. Die gewünschten Stoffwechselprodukte lassen sich

als Antigene durch spezifische Antikörper auf der jeweiligen Zelle oder in ihrer

Umgebung nachweisen. Somit wird eine topographische Zuordnung der

Syntheseprodukte zu den einzelnen Zellen möglich. Es läßt sich z.B. darstellen,

inwiefern eine Zelle, die ihrer Form nach bereits entdifferenziert ist, von ihrer

Funktion her noch den differenzierten Phänotyp zeigt (136, 140)

Die Immunzytochemie als Bindeglied zwischen morphologischem und

funktionellem Ansatz könnte also die Spezifität bei der Bestimmung des

Differenzierungsgrades einer Zellpopulation sowie der Einzelzelle entscheidend

erhöhen.

14

1.2.1 Grundlagen der Immunzytochemie

In der Immunzytochemie gibt es verschiedene Techniken, mit Hilfe von

Antikörpern entsprechende Epitope in einem Präparat sichtbar zu machen. Dazu

wird ein chromogener Komplex entweder direkt an den Erstantikörper gebunden

(z.B. direkte-Peroxidase-Methode) oder aber über einen oder mehrere

Brückenantikörper (z.B. indirekte-Peroxidase-Methode, Peroxidase-

Antiperoxidase-Methode). Der chromogene Komplex selbst kann z.B. ein

radioaktives Isotop, ein fluoreszierender Farbstoff oder - wie in den genannten

Methoden - ein Enzym sein, das dann ein entsprechendes chromogenes Substrat

umsetzt (180).

Die Immunzytochemie, bzw. - entsprechend auf Gewebe angewandt - die

Immunhistochemie, hat inzwischen einen unbestrittenen Stellenwert in der

experimentellen wie aber auch in der diagnostischen Pathologie gewonnen. So kann

sie z.B. Hinweise auf den Ursprung von Metastasen geben, deren Primarius (noch)

nicht bekannt ist, kann Hormonrezeptoren nachweisen oder der Klassifikation von

Lymphomen dienen.

In der vorliegenden Arbeit soll die Immunzytochemie die phänotypische Expression

von Chondrozyten im Verlauf der Kultur kontrollieren. Sie soll damit anzeigen,

inwieweit und ab wann die Validität und Reliabilität des Zellkulturmodells nicht

mehr in ausreichendem Maße gegeben ist. Entscheidend ist hierbei die Wahl solcher

Syntheseprodukte als Antigene, die den charakteristischen Phänotyp von hyalinen

Knorpelzellen repräsentativ beschreiben.

Chondrozyten synthetisieren physiologischerweise vor allem zwei große Klassen

von Matrixbestandteilen: Proteoglykane und Kollagene. Als knorpelspezifisch wird

klassischerweise ein außergewöhnlich großes komplexebildendes Proteoglykan

angesehen, das sogenannte CS-PG (cartilage-specific proteoglycan) (vgl. 1.1.2).

Es wurden monospezifische Antikörper gegen seinen Proteinanteil hergestellt und

zur Charakterisierung von Knorpelzellen angewandt (12, 101, 136, 139).

Herkömmlicherweise wurden die Knorpelproteoglykane bzw.

-glykosaminoglykane durch die metachromatische Anfärbbarkeit mit Toluidinblau

(65, 71, 137, 206), Methylenblau (51), Thionin (81), Safranin O (64) und anderen

Farbstoffen nachgewiesen. Immunzytochemische Färbemethoden wurden jedoch

als vergleichsweise spezifischer angesehen (1).

Unter den Kollagenen haben bisher Antikörper gegen die Typen I und II eine

herausragende Rolle gespielt: Anti-Kollagen-Typ II sollte hyalinen Knorpel

spezifisch nachweisen, Anti-Kollagen-Typ I reagierte typischerweise mit fibro-

blastenartig veränderten Chondrozyten sowie mit Fibroblasten selbst (vgl. 1.1.2).

15

In der vorliegenden Arbeit kommt eine Kombination von klassischerweise

verwendeten mit bisher im Zusammenhang mit der phänotypischen

Charakterisierung noch nie benutzten Antikörpern zur Anwendung.

16

1.2.3 Kollagene

Unter Kollagenen versteht man extrazelluläre Strukturproteine, deren funktionelle

Eigenschaften wesentlich von einer Tripelhelixdomäne abhängen (28, vgl. auch 144,

176). Bisher sind 14 verschiedene Kollagentypen (als Typen I-XIV bekannt)

in unterschiedlichem Ausmaß beschrieben und charakterisiert worden. Die fünf

„klassischen“ Kollagenmoleküle bestehen aus drei spiralförmigen Polypeptid-

ketten, bezeichnet als α-Ketten, die miteinander wiederum spiralförmig in Form

einer Tripelsuperhelix verwunden sind. Durch Aneinanderlagerung der Moleküle

entstehen Faserstrukturen, die charakterisiert sind durch eine gegenseitige

Versetzung der Moleküle um ein Viertel ihrer Länge („quarter-stagger“). Dies

erscheint elektronenmikroskopisch als Querstreifung (28, 121, 144, 158, 176,

177). Kollagene mit dieser typischen Viertelstaffelung sind die Typen I, II, III, V

und XI. Sie werden von verschiedenen Autoren zu den Kollagenen der Gruppe I

zusammengefaßt (28, 147). Ihnen gemeinsam ist ein Molekulargewicht von

mindestens 95.000 Dalton und insbesondere eine etwa 300 nm lange

ununterbrochene helikale Domäne. Die Helixstruktur entsteht durch eine

charakteristische Aminosäurenfolge, bei der jede erste einer Dreiergruppe ein

Glycinrest ist. Man spricht von Gly-X-Y-Tripletts. Dabei sind 30% von X und Y

durch Prolin und Hydroxyprolin besetzt. Nur die Tatsache dieser jeweils von

Glycin angeführten Dreierfolge von Aminosäuren erlaubt, daß sich die drei links-

drehenden Polypeptidspiralen der α-Ketten zu einer rechts-drehenden Superhelix

umeinanderwinden in der Art, daß jeweils ein Glycinrest in der Mitte der Spirale

liegt, während die sterisch eher hindernden X- und Y-Reste nach außen weisen

(176). Die Regelmäßigkeit der Anordnung bedingt die hohe Stabilität der

Tripelhelixkonformation und damit die hohe Reißfestigkeit der Kollagenfasern.

Die α-Ketten der Gruppe-I-Kollagene sind zwar nicht identisch, jedoch bezüglich

ihrer Länge und Ladungsverteilung derart gleichartig aufgebaut, daß die einzelnen

Kollagenfasern aus verschiedenen Kollagentypen aufgebaut sein können. So

bestehen Cornea-Bindegewebsfasern aus den Kollagentypen I und V und die der

Haut aus den Typen I, III und V. Durch Veränderung der Zusammensetzungs-

verhältnisse variieren die Fasereigenschaften, so daß die Fasern je nach Gewebeart

und dem jeweiligen ontogenetischen Entwicklungsstand des Gewebes den

unterschiedlichen Erfordernissen optimal angepaßt sind (28, 176).

17

Die übrigen Kollagene werden von den verschiedenen Autoren je nach

zugrundeliegenden Kriterien unterschiedlich eingeteilt. Nach Miller und Gay sind in

der Gruppe II solche Kollagene zusammengefaßt, die zwar ein Molekulargewicht

von mindestens 95.000 Dalton haben, jedoch aus mehreren deutlich voneinander

getrennten helikalen Bereichen bestehen: Kollagen-Typen IV, VI, VII und VIII.

Van der Rest und Garrone fassen mehr von der Funktion ausgehend die Typen IV

und VIII (möglicherweise auch Typ X) als lagenbildende Kollagene zusammen

(Typ IV→ Basalmembran, Typ VIII → Descemet-Membran der Cornea). Typ VI

hingegen bildet perlschnurartige Filamente und Typ VIII ist an der Bildung von

Verankerungsfasern im Bereich des Übergangs von der Basalmembran zum

subepithelialen Stroma beteiligt.

Die kurzkettigen Gruppe-III-Kollagene (Molekulargewicht < 95 000) (Miller und

Gay, 147) entsprechen funktionell etwa den „Fasern-assoziierten Kollagenen mit

unterbrochenen Tripelhelices“ („ FACITs“) nach Olsen: IX, XII und XIV (161,

176).

Dem Kollagen-Typ X kommt eine Sonderstellung zu: Es ist ein

knorpelspezifisches, relativ niedermolekulares Kollagen, das vorwiegend in der

Zone des hypertrophischen Knorpels im Bereich der Wachstumsfuge gebildet wird.

Dies legt eine Bedeutung bei der Umwandlung von Knorpel in Knochen nahe (25,

57, 58, 107, 119, 147, 163, 176).

Das von Endothelzellen gebildete Kollagen-Typ-XIII ist in seiner Struktur und

Funktion noch nicht ausreichend aufgeklärt (176). Insbesondere unter den relativ

niedermolekularen Kollagenen ist die Beschreibung weiterer Typen zu erwarten

(147).

Die verschiedenen Kollagentypen sind bezüglich der Charakterisierung des

Phänotyps von Chondrozyten deshalb von besonderem Interesse, weil bestimmte

Kollagentypen fast ausschließlich in hyalinem Knorpel vorkommen. Miller und

Matukas beschrieben 1969 als erste ein nur in Knorpel vorkommendes Kollagen,

das in der Folge als Kollagen-Typ II bezeichnet wurde (155). Anfangs war man der

Überzeugung, daß hyaliner Knorpel als Kollagen nur den Typ II enthalte, bzw.

umgekehrt, daß Kollagen-Typ II nur in hyalinem Knorpel zu finden sei (43, 56,

115, 139, 140, 160, 188, 189). Daher wird Kollagen-Typ II klassischerweise als

„Knorpelkollagen“ bezeichnet (140, 147). Später jedoch wurden weitere

knorpelspezifische Kollagene beschrieben (die sogenannten niedermolekularen

Knorpelkollagene Typen IX, X und XI). Außerdem zeigte sich, daß in der frühen

mesenchymalen Knorpelentwicklung von Chondrozyten auch Kollagen-Typ I

gebildet wird. Umgekehrt fand man auch z.B. im primitiven Achsenskelett oder im

Cornealepithel von Hühnerembryonen Kollagen-Typ II (136, 139, 147, 155). Im

18

ausgewachsenen Gewebe scheint es aber eine deutliche Zweiteilung zu geben. Es

gibt Kollagentypen, die hauptsächlich, wenn nicht ausschließlich im hyalinen

Gelenkknorpel (oder knorpelähnlichem Gewebe wie dem Nucleus pulposus der

Bandscheibe oder dem Corpus vitreum des Auges) vorkommen: Kollagen-

Typen II, IX, X und XI. Dabei lassen sich interessante Homologien feststellen: Mit

Ausnahme des Kollagen-Typs X hat jedes der „Knorpelkollagene“ eine

Entsprechung im Nicht-Knorpelgewebe. Funktionell und mengenmäßig

entsprechen die Kollagen-Typen I und III des Nicht-Knorpelgewebes dem

Kollagen-Typ II des Knorpels, das ebenfalls fasernbildende Kollagen-Typ XI des

Knorpels dem Kollagen-Typ V des Nicht-Knorpelgewebes.

Die Annahme, daß es auch für das fasernassoziierte Kollagen mit unterbrochener

Tripelhelix Typ IX des Knorpels eine Entsprechung im Nicht-Knorpelgewebe

geben müsse, führte Gordon, Gerecke und Olson 1987 zur Entdeckung des

Kollagens Typ XII, dem später ein homologes, aber nicht identisches Typ XIV

folgte (176). Es lassen sich daher nach Gruppen geordnet folgende sich in Funktion

und mengenmäßigem Gewebeanteil entsprechende Kollagene gegenüberstellen:

Knorpel Nicht-

Knorpelgewebe

Gruppe I

(quergestreifte Kollagene

mit einem Molekular-

gewicht von mindestens

95.000 Dalton)

Kollagen Typ II

Kollagen Typ XI

Kollagen Typen I u. III

Kollagen Typ V

Gruppe III

(fasernassoziierte

Kollagene mit unter-

brochenen Helices, MG

kleiner als 95.000 D)

Kollagen Typ IX Kollagen Typen

XII u. XIV

Tab. 1

Gegenüberstellung der Kollagenverteilung in Knorpel und Nicht-Knorpelgewebe

19

Für die Kollagentypen der Gruppe II (aus mehreren deutlich getrennten helikalen

Bereichen, Molekulargewicht von mindestens 95.000 D) mit ihren speziellen

Aufgaben in komplexeren Gewebeverbänden (Kollagentypen IV und VIII sowie VI

und VII [s.o.]) sind im hyalinen Knorpel keine Entsprechungen beschrieben

worden.

Es existiert also offensichtlich eine Zweiteilung in quasi für hyalinen Knorpel

spezifische auf der einen und normalerweise im Knorpel nicht vorkommende

Kollagentypen auf der anderen Seite. Dies legt einen Einsatz von Antikörpern gegen

diese Kollagentypen nahe, wenn es um die Charakterisierung des Phänotyps von

Chondrozyten im Verlauf der Kultur gehen soll, bei der eine Entdifferenzierung zu

fibroblastenartigen Zellen zu erwarten ist.

Einschränkend für die Praxis ist dabei zu bemerken, daß bisher nur Antikörper

gegen die Kollagentypen I-V frei im Handel erhältlich sind. Will man daher auf eine

laborchemisch sehr aufwendige eigene Antikörperproduktion verzichten, so wird

man aus obiger Gegenüberstellung nur die Kollagentypen I, II, III und V wählen.

Dies stellt insofern eine Erweiterung der klassischen Marker für Knorpel- und

Nicht-Knorpelgewebe dar, als bisher zu deren Unterscheidung praktisch nur

Antikörper gegen die Kollagentypen I und II verwandt wurden.

Ein weiterer neuer Ansatz in diesem Zusammenhang ist der Einsatz von

Antikörpern gegen ein erst vor relativ kurzer Zeit weitergehend untersuchtes

Glykoprotein bzw. seine Untereinheiten: das S-100-Protein.

20

1.2.4 S-100-Protein

Das S-100-Protein ist ein von B.W. Moore 1969 erstbeschriebenes saures Protein

mit einer Molmasse von 21-24.000 Dalton (68, 201). Funktionell gehört es zu einer

Familie aus Calcium-bindenden Proteinen wie Troponin C, Calmodulin und der

leichten Kette von Myosin (68). Ursprünglich hatte man das Molekül als spezifisch

für Gliazellen und davon abstammende Tumoren angesehen (67). Später entdeckten

es verschiedene Arbeitsgruppen in den unterschiedlichsten Geweben auch nicht-

ektodermalen Ursprungs (67, 68, 92, 93, 94, 102, 159, 201). In Chondrozyten

wurde das S-100-Protein erstmalig 1982 von der Arbeitsgruppe um Stefansson

beschrieben, als sie eigentlich das fetale Nervensystem auf dieses Molekül hin

untersuchen wollte (201). Das Protein existiert mindestens in drei unterschiedlichen

Formen, nämlich S-100-a0, S-100-a und S-100-b, die jeweils als Dimere aus

folgenden Untereinheiten bestehen: αα, αβ und ββ.

Karabela-Bouropoulou beobachtete 1988 einen interessanten Zusammenhang

zwischen der Zusammensetzung der Knorpelgrundsubstanz in Abhängigkeit von

ihrem Entwicklungsstadium (embryonal, jung, erwachsen, hyperplastisch sowie

auch neoplastisch) und der Immunreaktivität für S-100: solange nur wenig

Grundsubstanz bzw. hauptsächlich Hyaluronsäure gebildet wird, sind die

Chondrozyten negativ für das S-100-Protein. Mit zunehmender Differenzierung und

entsprechend vermehrter Ablagerung von Chondroitinsulfat und Kollagen-Typ II

zeigen die Zellen intrazytoplasmatisch eine stark positive Immunreaktivität für

S-100. Er spekuliert über einen zellulären Kontrollmechanismus, bei dem das

S-100-Protein an der Regulation der Glykosaminoglykan-Kollagen-

Wechselwirkungen beteiligt ist (92). Es wäre daher interessant zu prüfen, ob sich

das S-100-Protein bzw. seine α- und β-Untereinheiten als Marker für den

phänotypisch charakteristischen Chondrozyten eignen.

21

1.3 Zielsetzung

Das gebräuchlichste Zellkulturmodell zur Erforschung pathogenetischer

Zusammenhänge in der experimentellen Pathologie ist die Monolayerkultur. Die

Aussagekraft einer solchen Zellkultur ist insbesondere abhängig von der Konstanz

der Expression des charakteristischen Phänotyps der zu untersuchenden Zellen. Es

ist daher erforderlich, Verfahren zu entwickeln, die dieses Gütekriterium eines

Zellkulturmodells suffizient kontrollieren.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die phänotypische Expression von bovinen

Chondrozyten in der Monolayerkultur in ihrem zeitlichen Verlauf mittels

immunzytochemischer Marker zu charakterisieren.

Zur Anwendung kommen dabei Antikörper gegen Kollagen-Typ II als das für

hyalinen Knorpel charakteristische fasernbildende Kollagen sowie entsprechend als

charakteristisch für Nicht-Knorpelgewebe Antikörper gegen die Kollagentypen I,

III und V. Als neuer Ansatz kommen zusätzlich Antikörper gegen das

S-100-Protein und seine α-und β-Untereinheiten zum Einsatz.

22

2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

2.1.1 Bovine Chondrozyten in Monolayerkultur (P0-P6)

Aus je einem Metacarpophalangealgelenk von sechs adulten Rindern werden in

nachfolgend beschriebener Technik sechs getrennte Monolayerkulturen angelegt

und parallel bis zur sechsten Passage (P6) fortgeführt.

Um eine bzw. drei Wochen versetzt werden erneut Kulturen von jeweils vier

weiteren Individuen angesetzt. Dadurch ist es später möglich, auf ein und

demselben Objektträger getrennt kultivierte Chondrozytenpopulationen

verschiedener Passagen gleichzeitig histochemisch und immunzytochemisch

aufzuarbeiten.

Vorversuche ergaben eine positive Korrelation zwischen der Weite des Umfangs über dem

Gelenkspalt des Metacarpophalangealgelenks und der Ausbeute an Knorpel gemessen in der

Zellzahl bei der ersten Passage. Männliche Individuen weisen durchweg größere Umfangsweiten

mit entsprechend dickeren Gelenkknorpelschichten und höheren Zellausbeuten auf. Bezogen auf

die Weite des Umfangs über dem Gelenkspalt ist die Zellausbeute jedoch bei männlichen und

weiblichen Individuen nicht signifikant verschieden. Auch morphologisch und

proliferationskinetisch waren keine geschlechtsspezifischen Unterschiede festzustellen. Ebenfalls

ohne Einfluß auf die Zellausbeute sowie das Zellverhalten, insbesondere die Lebensfähigkeit in

Kultur, waren das Alter (im Bereich zwischen 1 und 7 Jahren) sowie die Art der Rinder. Für die

Versuchsreihen wurde jeweils ein Vorderfuß einer entsprechenden Anzahl von nacheinander

geschlachteten Rindern ausgewählt. Bei dem nach diesem Zufallsprinzip ausgewählten Individuen

handelte es sich um insgesamt 25 weibliche Rinder, davon 15 rot-weiß und 10 schwarz-weiß

gescheckt, im Alter zwischen 3 und 5 Jahren (vom Schlachtmeister anhand der Anzahl X der

bleibenden Zähne bestimmt: X/2 + 2 = Lebensalter).

Bei der Präparation der Metacarpophalangealgelenke wurde darauf geachtet, pathologisch

veränderte Gelenke als Quelle für die Knorpelentnahme auszuschließen. Erschien die

Gelenkflüssigkeit trüb oder die Gelenkoberfläche ulzerös verändert, so wurde das Gelenk

verworfen. Bei Vorversuchen waren die Knorpelzellen in solchen Fällen in Kultur wesentlich

schlechter angegangen.

Unter Aussparung von jeglichem Nicht-Knorpelgewebe werden unter aseptischen

Kautelen Knorpelscheiben aus dem Metacarpophalangealgelenk gewonnen.

23

Eine relativ hohe Infektionsrate bei fehlerhafter Gewinnung der Knorpelproben zur Etablierung

einer Knorpelzellkultur aus Rinderfüßen legt eine ausführlichere Beschreibung der Vorgehensweise

nahe.

Der möglichst frische, in der Höhe des oberen Sprunggelenks resezierte Rinderfuß wird zunächst

unter fließendem, handwarmen Wasser mit einer Bürste gründlich gesäubert. Mit einem Skalpell

wird nun die Haut auf der ventralen Seite von proximal nach distal durchtrennt. Dieser Schnitt wird

um den Huf herum T-förmig fortgesetzt. Dann wird die Haut in seitlicher Richtung mobilisiert,

nach dorsal umgeschlagen und schließlich hufwärts abgezogen. Dabei sollte die nun freigelegte

Faszienschicht nicht mit der behaarten Seite der Haut in Berührung kommen. Der gehäutete Fuß

wird aufrechtgestellt und mit 70%igem Alkohol desinfiziert. Von nun an wird nur noch unter

sterilen Kautelen gearbeitet, d.h. auf sterilen OP-Tüchern, mit sterilen Handschuhen, Skalpellen,

Pinzetten und Transportgefäßen sowie mit Mundschutz. Es wird als nächstes ein zirkulärer Schnitt

5 cm unterhalb des Metacarpophalangealgelenkspaltes gelegt, wobei die Faszie und die unmittelbar

daruntergelegenen Bänder bzw. Sehnen durchtrennt werden. Diese Gewebsschicht wird mobilisiert

und ohne Berührung der darunterliegenden Gelenkkapselmembran bis auf 5 cm oberhalb des

Gelenkspalts nach proximal umgeschlagen. Vor der nun erfolgenden Eröffnung der Gelenkkapsel

werden die bisher gebrauchten Handschuhe, Skalpelle und Pinzette gegen neue sterile

ausgewechselt. Die freigelegte Kapselmembran wird 0,5 cm distal der soeben entstandenen

Umschlagfalte semizirkulär inzidiert und nach distal über den Gelenkspalt geschlagen. Um die

Kapsel vollends zu eröffnen, wird auf beiden Kondylenseitenflächen in einem Abstand von 2 mm

parallel zur Gelenkoberfläche ein Schnitt gelegt, der der Krümmung der Gelenkflächen folgt. Dabei

werden die Kollateralbänder durchtrennt. Um schließlich das Gelenk aufzuklappen, wird als letzte

eine zentral im Gelenk verlaufende Sehne ohne Berührung der Gelenkflächen durchschnitten. Der

derart aufgeklappte Rinderfuß wird in einen Ständer mit Schraubzwingen fixiert und bis auf die

Gelenkflächen mit einem sterilen Tuch bedeckt. Sodann werden die Gelenkflächen mit sterilen

Kompressen von der viskösen Synovialflüssigkeit befreit, damit sich die Knorpelstückchen

anschließend besser von der Pinzette lösen. Denn nun wird der Knorpel wie aus Abb. 1 auf Seite 23

ersichtlich in kleinen Scheiben mit einem neuen sterilen Skalpell von der Gelenkoberfläche

abgetragen. Dabei wird peinlich genau darauf geachtet, den Schnitt nicht so tief zu legen, daß Teile

der an die subchondrale Schicht angrenzende kalzifizierten Knorpelschicht mitentfernt werden.

Einerseits spürt man an dem vermehrten Widerstand, daß der Schnitt zu tief liegt, andererseits weist

die entsprechende Knorpelscheibe eine im Gegensatz zur gewöhnlich glänzenden opaleszierenden

Glasknorpelschnittfläche in solchem Fall eine matte weißliche Stelle auf und wird daher verworfen.

Desweiteren wird peinlich genau vermieden, den Knorpel aus dem Bereich in der Nähe des

Übergangs in die Synovialmembranschicht zu gewinnen. Die Knorpelscheiben werden pro

Rinderfuß separat in ein steriles Zentrifugenröhrchen mit Transportpuffer gegeben und innerhalb

der nächsten 60 Minuten weiterverarbeitet.

24

Abb. 1

Gewinnung von hyalinem Knorpel

aus dem steril eröffneten Metacarpophalangealgelenk von Rindern

25

In einer Laminar-flow-Einrichtung erfolgen nun alle weiteren Arbeitsschritte unter

sterilen Kautelen. Die Knorpelscheiben werden quantitativ in eine Petrischale

überführt. Nach Absaugen des HEPES-Transportpuffers wird mehrmals mit

HEPES-Gebrauchspuffer gespült, um Verunreinigungen durch Synoviozyten und

andere Nicht-Knorpelzellen weitestgehend auszuschließen. Da die Knorpelscheiben

bei bovinem Knorpel lediglich eine Stärke von 0,5 bis maximal 1,2 mm

aufweisen, wird auf eine weitergehende mechanische Zerkleinerung verzichtet. Der

Gebrauchspuffer wird möglichst vollständig abgesaugt. Anschließend werden die

Knorpelstückchen mit 4 ml 0,2%iger Kollagenaselösung bei 37 °C inkubiert. Es

wird darauf geachtet, daß alle Knorpelscheiben vollständig mit Kollagenaselösung

bedeckt sind. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird die Kollagenase-

Knorpelzellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen überführt und mit 30 ml

Kulturmedium verdünnt. Nach Erstellung einer homogenen Suspension durch

wiederholtes Spülen durch eine englumige Pipette wird diese bei 1200 U.p.M. für

10 Minuten zentrifugiert. Nach möglichst vollständigem Dekantieren des

Überstandes wird das Sediment mit 35 ml Nährlösung resuspendiert und erneut in

gleicher Weise zentrifugiert. Nach dem nun folgenden Dekantieren wird der

Bodensatz mit 12 ml Kulturmedium resuspendiert. Das Kulturmedium wird jeweils

mit 1 µg Insulin und 50 µg Ascorbinsäure pro ml Medium angereichert. Aus der

homogenen Einzelzellsuspension werden 0,1 ml zur Zellzahlbestimmung mittels

Neubauerkammer abgezweigt. Die übrige Zellsuspension wird quantitativ in eine

T75-Gewebekulturflasche überführt. Die Inkubation erfolgt in einem Brutschrank

bei 37 °C und einer CO2-Sättigung von 5 %. Alle 48 Stunden wird das alte

Kulturmedium abgesaugt und durch 12 ml frisches Nährmedium ersetzt. Das

Zellwachstum sowie insbesondere der Konfluenzgrad werden jeweils im

Durchlichtmikroskop kontrolliert.

Sobald die Zellen den Boden der Kulturflasche flächendeckend ausfüllen,

bezeichnet man die Kultur als konfluent. Sie ist damit reif zur Zellpassage. Das

Kulturmedium wird möglichst vollständig abgesaugt. Anschließend werden die am

Kulturflaschenboden adhärenten Zellen mit 4 ml 0,25%iger Trypsinlösung

inkubiert. Unter dem Durchlichtmikroskop wird der Ablösungsvorgang der Zellen

beobachtet. Sobald sich die Chondrozyten abgerundet haben und die ersten bei

leichtem Schwenken der Kulturflasche zu schwimmen beginnen (nach etwa

4-minütiger Inkubation) werden die noch adhärenten Zellen mechanisch durch

Schlagen der Kulturflasche gegen die Handinnenfläche abgelöst. Dies verkürzt die

erforderliche Inkubationszeit. Die enzymatische Aktivität des Trypsin wird

unmittelbar danach durch den Zusatz von 20 ml Nährmedium abgestoppt.

26

(Das Serum in dem Medium enthält physiologischerweise aktive

Proteinaseinhibitoren). Die Zellsuspension wird in ein Zentrifugenröhrchen

überführt und nach Erstellen einer Einzelzellsuspension bei 1000 U.p.M. für

10 Minuten zentrifugiert. Nach Dekantieren des Überstandes werden die Zellen mit

12 ml Nährsuspension resuspendiert. Aus der Einzelzellsuspension werden

0,1 ml entnommen, um nach Zusatz von 0,2 ml 1%iger Trypanblau-Lösung und

erneutem Durchmischen die Zellzahl mittels Neubauerkammer zu bestimmen sowie

die Lebensfähigkeit nach dem sog. „dye-exclusion-test“ („Farbstoff-Ausschluß-

Test“: lebende Zellen nehmen gewisse Farbstoffe wie Trypanblau nicht auf,

während sich bei toten und geschädigten Zellen sowohl das Zytoplasma als auch der

Kern anfärben, vgl. 7, 61, 62, 64, 186, 216 u.a.). Durch Hinzufügen einer

entsprechenden Menge von Nährmedium wird nun eine Einzelzellsuspension mit

einer definierten Zellkonzentration von 1,25 x 105 / ml erstellt.

In Vorversuchen wurde die optimale Aussaatdichte ermittelt. Getestet wurden Zellkonzentrationen

zwischen 1 x 104 und 2,5 x 105. Als Maß für die Proliferationskapazität der Chondrozyten wurde

jeweils der Proliferationsquotient Q ermittelt. Q entspricht dem Verhältnis der Zellzahl nach

einwöchiger Zellkultur zu derjenigen bei Zellaussaat. Bei höheren Konzentrationen, z.B. 2,5 x 105

Zellen/ml lag der Proliferationsquotient zwischen 1 und 2. Bei Konzentrationen kleiner als 5 x 104

war sogar eine Abnahme der absoluten Zellzahl zu beobachten: Q<1. Die optimale

Zellkonzentration für eine Primärkultur von 7tägiger Dauer lag bei 1,25 x 105 Chondrozyten pro

Milliliter Medium: Q=2,88, d.h. es kam innerhalb einer Woche Monolayerzellkultur nahezu zu

einer Verdreifachung der Zellzahl. Ursächlich für die geringere Teilungsrate bei höheren

Zellkonzentrationen dürfte die Tatsache sein, daß Chondrozyten in Monolayerkultur sich offenbar

beim Erreichen der Konfluenz deutlich weniger teilen; denn bei einer Konzentration von 2,5 x 105

erreichten die Zellen bereits nach 3 Tagen das Konfluenzstadium.

Von dieser Einzelzellsuspension wird ein definiertes Volumen nach Maßgabe der

jeweiligen Bodenfläche in eine neue Kulturflasche sowie zur späteren

zytochemischen Aufarbeitung in Objektträger-Zellkulturkammern überführt. Es

folgt die erneute Inkubation in oben beschriebenem Brutschrank.

27

2.1.2 Biologische Kontrolle:

Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur (P0-P2)

Bei der Präparation der Rinderfüße zur Knorpelentnahme werden Proben einer

Sehne als Beispiel für straffes Bindegewebe sowie Proben von lockerem

Bindegewebe unterhalb der inneren Faszienschicht entnommen. Die Gewebeproben

werden in Petrischalen für 48 Stunden in einem Gemisch aus gleichen Teilen einer

jeweils 0,2%igen Kollagenase-I- bzw. -II-Lösung inkubiert. Anschließend wird

nach Zusatz von 10 ml Kulturmedium das nicht enzymatisch aufgelöste

Restgewebe entfernt. Die zurückbleibende Zellsuspension wird in ein

Zentrifugenröhrchen überführt und mit Kulturmedium auf 35 ml aufgefüllt. Das

restliche Verfahren entspricht der Isolierung der Chondrozyten mit den

Unterschieden, daß die zweifache Zentrifugation nur bei 1000 U.p.M. für

10 Minuten erfolgt und als Nährmedium das Fibroblasten-Kulturmedium verwandt

wird. Derart aus straffen und lockerem Bindegewebe von drei unterschiedlichen

Individuen gewonnene Fibroblasten werden als biologische Kontrolle in der

Primärkultur P0 sowie in den beiden ersten Subkulturen P1 und P2 in gleicher Weise

wie die Chondrozyten histochemisch und immunzytochemisch aufgearbeitet.

2.1.3 In-situ-Kotrolle: Gewebeschnitte

Aus frisch gewonnenen Knorpelscheiben sowie aus Gewebeproben von einer

Sehne bzw. von lockerem Bindegewebe - wie in 2.1.2 beschrieben - werden

Gefrierschnitte erstellt und auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger gebracht.

Die Beschichtung erfolgt zum Schutz vor dem Abschwimmen der Schnitte bei der

nachfolgenden histochemischen und immunzytochemischen Aufarbeitung.

2.1.4 Prä-kulturelle Kontrolle: Ausstriche frisch isolierter Zellen

Wie unter 2.1.1 beschrieben wird eine Einzelzellsuspension aus frisch isolierten

Chondrozyten hergestellt. Als einzige Modifikation beträgt die Inkubationszeit in

Kollagenase einmal 24 Stunden wie im regulären Versuchsprotokoll und in einem

Zusatzversuch 42 Stunden. Die Zellsuspension wird bei 1200 U.p.M. für

10 Minuten zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Sediment auf mit

Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern ausgestrichen. Die nachfolgende

Aufarbeitung erfolgt wieder wie unter 2.2 beschrieben.

28

2.1.5 Zusatzversuche

1.) Perkonfluenz-Studie

Die Chondrozyten erreichen normalerweise nach einer Woche das Stadium der

Konfluenz und werden dann passagiert (vgl. 2.1.1). Davon abweichend wird eine

gesonderte Kultur von der 2. Passage an nicht mehr passagiert, sondern unter

regelmäßigem Medienwechsel für 3 Wochen weitergeführt. Die Einzelzell- und

Zellverbandsmorphologie werden regelmäßig unter dem Phasenkontrastmikroskop

kontrolliert.

2.) Trypsin-Studie

Bei einer Passage werden die Zellen normalerweise nach Maßgabe der

mikroskopischen Kontrolle durch ein etwa vierminütiges Einwirken von Trypsin

von ihrer Unterlage abgelöst (vgl. 2.1.1). Davon abweichend wird bei fünf

gesonderten Zellpopulationen in der ersten Passage die Inkubationszeit mit 1, 2, 3, 4

bzw. 6 Minuten vorgegeben. Die nach dieser Einwirkzeit abgelösten Zellen

werden in fünf getrennten Zellkulturkammern auf einem Objektträger ausgesät und

in der üblichen Weise histochemisch und immunzytochemisch aufgearbeitet.

3.) P0-Metachromasie-Studie

Frisch isolierte Chondrozyten werden in acht Objektträger-Zellkulturkammern

ausgesät. In der Primärkultur, d.h. in den ersten acht Tagen der Zellkultur noch vor

der regulären ersten Passage, werden vom zweiten Tag an täglich die Zellen eines

Objektträgers fixiert. So ergibt sich am Ende eine Folge von sieben Präparaten mit

einer jeweiligen Kulturdauer von ein bis sieben Tagen. Die Zellen des verbleibenden

achten Objektträgers werden nach der Fixierung vier Stunden in Hyaluronidase

präinkubiert. Die Färbung erfolgt jeweils nach Giemsa.

29

2.1.6 Histochemische Referenzfärbungen

Zur orientierenden Beurteilung des Wachstumsverhaltens, zur kontrastreicheren

Darstellung der Zellform und zur Prüfung des metachromatischen Färbeverhaltens

werden ergänzend folgende histochemischen Färbemethoden in z.T. modifizierter

Form durchgeführt:

a.) Giemsa

b.) Hämalaun-Eosin

c.) Azan

d.) Ladewig

Die Vorbehandlung und Fixierung erfolgte wie bei den immunzytochemischen

Präparaten.

Die für die Färbungen verwendeten Lösungen wurden von der Firma Merck,

Darmstadt, bezogen.

Färbeprotokolle

a.) Metachromatische Färbung nach Giemsa

1.) Spülen in Leitungswasser 3 x 5 Min.

2.) Färben mit Giemsa-Lösung 5 % in Aqua bidest. 15 Min.

(immer frisch ansetzen!)

3.) Entbläuen in Aqua bidest. mit Essigsäure (4 Tropfen auf 50 ml)

(unter mikroskopischer Kontrolle)

4.) Differenzierung in Alkohol 96 %

(ggfs. mehrmaliger Wechsel zwischen 3.) und 4.) zur Verbesserung der

Differenzierung; jedoch nicht zu häufig, da das Präparat dann verblaßt)

5.) Abstoppen mit Isopropanol 1

6.) Isopropanol 2 2 x 5 Min.

7.) Eintauchen in Xylol 2 x 1 Sek.

8.) Eindeckeln mit Vitro-Clud

30

b.) Hämalaun-Eosin (modifiziert)

1.) Spülen in Leitungswasser 5 Min.

2.) Färben mit Hämalaun 10 Min.

3.) Bläuen in Leitungswasser 15 Min.

4.) Gegenfärben mit Eosin 6 Min.

5.) Aufsteigende Alkoholreihe je 5 Sek.


c.) Azan-Färbung

1.) Spülen in Leitungswasser 5 Min.

2.) Färbung mit Azokarmin 10 Min.

(im Wärmeschrank bei 56 °C)

3.) Spülen in Leitungswasser 3 Sek.

4.) Eintauchen in Anilinalkohol 1 Sek.

5.) Eintauchen in Essig-sauren Alkohol 1 Sek.

6.) Beizen in Phosphorwolframsäure 1 Min.


8.) Anilinblauorange 8 Min.


10.) Aufsteigende Alkoholreihe (70 %, 96 %, 1. 100%) je 3 Sek.

2. 100 % 1 Min.

Xylol 5 Min.

11.) Eindeckeln mit Vitro- Clud

d.) Ladewig Bindegewebsfärbung (modifiziert)

1.) Vorfärbung mit Weigert A + B 8 Min.

2.) Spülen mit Aqua dest. 5 Sek.

3.) Phosphorwolframsäure 5 % 5 Min.


5.) Ladewig 90 Sek.

6.) Bläuen in Leitungswasser 10 Min.


8.) Aufsteigende Alkoholreihe je 3 Sek.


31

Verwendete Produkte:

- Kulturflaschen T25 bzw. T75 sowie Petrischalen: FALCON, Becton

Dickinson, Heidelberg, Deutschland

- Lab-Tek tissue culture chambers: NUNC, Wiesbaden-Bibrich, Deutschland

- HEPES Buffer ( 1molar, pH 7,3): GIBCO/BRL GmbH, Eggenstein,

Deutschlank 043-05630

- Dulbeco´s PBS: GIBCO (s.o.) 041-4190-M

- Insulin: SIGMA, I 1882

- L(+)-Ascorbinsäure, kristallin, reinst: MERCK, Darmstadt, Deutschland

- L-Glutamin ( 200 mM): GIBCO ( s.o.), 043-5030

- Foetales Kälberserum, steril: BOEHRINGER, Mannheim, Deutschland,

0210471

- Penicillin-Streptomycin-Lösung: GIBCO (s.o.) 043-5140H

(10.000 U/ml Penicillin, 10.000 µg/ml Streptomycin)

- Fungizone: GIBCO (s.o.) 043-5290 F

- Collagenase Type I bzw. II ( from clostridium histolyticum):

WORTHINGTON biochemical corporation

- Trypsin Type III, salt free: SIGMA (s.o.), T 8253

- Trypanblau-Lösung 0,5 % in NaCl-Lösung: BOEHRINGER (s.o.) 295833

- Poly-L-Lysin-Lösung: SIGMA (s.o.)

- EDTA-Pulver: SIGMA (s.o.)

32

Verwendete Lösungen

1.) HEPES-Puffer

a.) HEPES-Stammlösung (10fache Konzentration)

40 g NaCl + 1,5 g KCl +11,9 g HEPES + 10,0 g Glucose

bei Zimmertemperatur in etwa 450 ml Aqua bidest. auflösen

mit 4 N NaOH auf pH = 7,55 einstellen

mit Aqua bidest. auf 500 ml auffüllen, filtrieren

b.) HEPES-Fertiglösung (= Gebrauchslösung) (1fache Konzentration)

55,6 ml HEPES-Stammlösung + 500 ml steriles Aqua dest.

c.) HEPES-Transportpuffer

55,6 ml HEPES-Stammlösung + 500 ml steriles Aqua dest.

+ 4 ml Fungizone + 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung

2.) Chondrozyten-Kulturmedium

450 ml Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM)

+ 50 ml fetales Kälberserum (FKS)

+ 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung

3.) Fibroblasten-Kulturmedium

450 ml DMEM

+ 4 ml L-Glutamin

+ 50 ml FKS

+ 4 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung

33

4.) Kollagenase-Lösung 0,2 %

1.) 0,2 g Kollagenase I (bzw. II) abwiegen

2.) mit 90 ml HEPES-Gebrauchslösung (kalt) 5-10 Minuten rühren

3.) zentrifugieren (6000 U.p.M. für 30 Minuten)

4.) pH-Wert auf pH = 7,55 einstellen

5.) mit HEPES-Puffer auf 100 ml auffüllen

6.) steril filtrieren

7.) in Portionen abfüllen und bei -20 °C lagern

5.) Trypsin-EDTA-Fertiglösung

(Konzentrationen: Trypsin 0,25 %, EDTA 0,25 %)

1.) 0,5 g Trypsinpulver + 0,5 g EDTA-Pulver abwiegen

2.) EDTA mit 190 ml PBS auflösen (kurz in Ultraschallbad stellen!)

3.) pH auf 7,55 einstellen

4.) erst wenn die Lösung klar ist und der pH-Wert stabil bleibt,

Becherglas ins Ultraschallbad stellen und das Trypsinpulver einstreuen

5.) nach völliger Auflösung des Trypsin (etwa nach 15 Minuten)

pH-Wert auf pH = 7,55 einstellen

6.) Trypsin-EDTA-Lösung mit PBS auf 200 ml auffüllen

7.) steril filtrieren

8.) portionieren

34

2.2 Immunzytochemie

2.2.1 Indirekte-Peroxidase-Methode

Als immunzytochemisches Färbeverfahren kommt die Indirekte-Peroxidase-

Methode (modifiziert nach Nakane und Pierce; 1966 [154]) nach folgendem Rezept

zur Anwendung:

1.) 3 x spülen in PBS je 5 Min.

2.) Kontrolle K1 in PBS bis 13.) beiseite stellen

3.) Hemmung der endogenen Peroxidase durch

Inkubation in 1 % H2O2 in Methanol 20 Min.

4.) 3 x spülen in PBS je 5 Min.

5.) Kontrolle K2 in PBS bis 10.) beiseite stellen

6.) Inkubation mit Normalserum der Spezies des sek. Ak. 15 Min.

7.) 3 x spülen in PBS je 5 Min

8.) Inkubation mit dem primären Antikörper (bei 37 °C) 30 Min.

9.) unter fließendem PBS spülen, dann 3 x spülen in PBS je 5 Min.

10.) K2 wieder einfügen

11.) Inkubation mit dem sekundären Antikörper (bei 37 °C) 45 Min.

12.) unter fließendem PBS spülen, dann 3 x spülen in PBS je 5 Min.

13.) K1 wieder einfügen

14.) DAB-Entwicklung: - 40 mg DAB in 100 ml DAB-Gebrauchspuffer lösen

- lichtgeschützt rühren lassen 10 Min.

- filtrieren

- 30µ(!)l H2O2 zugeben

- kurz rühren lassen 15 Sek.

- sofort inkubieren 3 Min.

15.) in fließendem Leitungswasser wässern 15 Min.

16.) gegenfärben mit Hämalaun 2 Sek.

17.) gut in Leitungswasser spülen

18.) in Leitungswasser bläuen lassen 10-15 Min.

19.) Alkoholreihe aufsteigen

(Alk. 70 %, Alk. 96 %, 2 x Alk. 100 %, Xylol 100 %) je 5 Min.

20.) Eindeckeln mit Vitroclud

35

Als primäre Antikörper werden gegen die Kollagentypen I, II, III und V jeweils

Ziegen-Antikörper in einer Verdünnung von 1:50 in Tween-PBS verwendet. Als

primäre Antikörper gegen das S-100-Protein werden Kaninchen-Antikörper in einer

Verdünnung von 1:100 bzw. bei den Untereinheiten α und β von 1:50 eingesetzt.

Sekundäre Antikörper sind bei den Kollagenen Kaninchen-Antikörper gegen

Ziegen-Immunglobuline und bei S-100 bzw. seinen Untereinheiten Schweine-

Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline. Die Verdünnung beträgt bei den

sekundären Antikörpern jeweils 1:40.

Die Austestung der optimalen Antikörper-Konzentrationen erfolgte in einer Reihe

von Vorversuchen.

Die Fixierung mit Methanol/Ethanol (1:1) erwies sich gegenüber Formalin 4 % und

dem Kunststoff-Fixationsspray Merckofix überlegen (schonende Fixierung).

Zur Demaskierung der Kollagen-Fasern erfolgt bei der Hälfte der mit Kollagen-

Antikörpern zu färbenden Präparaten eine zusätzliche Präinkubation mit 0,2 %iger

Hyaluronidase-Lösung für 4 Stunden bei 37 ° C. Diese Form der Demaskierung

hatte sich in einer Reihe von Vorversuchen gegen eine Vorbehandlung mit Trypsin

sowie Hyaluronidase bei anderen Inkubationszeiten durchgesetzt.

Das chromogene Substrat Diaminobenzidin (DAB) ist äußerst kanzerogen und mit

entsprechender Vorsicht zu handhaben und zu entsorgen. Mit Gebrauchspuffer

angesetzt ist es maximal 30 Minuten verwendbar.

Hämalaun benötigt zum Bläuen die Mineralien des Leitungswassers. Darum kein

destilliertes Wasser verwenden!

36

Verwendete Produkte:

1.) Immunglobuline

- goat-anti-type-I-collagen, 1310-01, ATLANTA, Heidelberg, Deutschland

- goat-anti-type-II-collagen,1320-01, ATLANTA, (s.o.)

- goat-anti-type-III-collagen, 1330-01, ATLANTA, (s.o.)

- goat-anti-type-V-collagen, 1350-01, ATLANTA, (s.o.)

- rabbit-immunoglobulins-to-S-100-protein, DAKOPATS

- peroxidase-conjugated-rabbit-immunoglobulins-to-goat-immunoglobulins,

DAKOPATS

- peroxidase-conjugated-swine-immunoglobulins-to-rabbit-immunoglobulins,

DAKOPATS

Die Kaninchen-Antikörper gegen die α- bzw. β-Untereinheit des S-100-Proteins

wurden uns freundlicherweise von Dr. K. Kato, Department of Biochemistry,

Institute for Developmental Research, Aichi, Japan, zur Verfügung gestellt.

2.) Normalseren

- normal swine serum, X 901, DAKOPATTS

- normal rabbit serum, X 902, DAKOPATTS

3.) Verschiedenes

- Äthanol, Methanol, Xylol: Apotheke, Klinikum, RWTH Aachen

- Hyaluronidase from bovine testes, 5000 U/mg, 25116 SERVA

- H2O2 30 %: MERCK

- Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB): SIGMA

- Bovines Serumalbumin (BSA): AUREON

- Triton-x-100 und Tween 20 (Detergentien): MERCK

- Vitro Clud: LANGENBRINCK

37

Verwendete Lösungen

1.) PBS (phosphate buffered saline; Phosphatpuffer)

- 40 g NaCl + 5,7 g NaH2PO4 + 1,0 g KH2PO4 + 1,0 g KCl

- mit Aqua bidest. auf 4,5 l auffüllen

- bis zur völligen Auflösung rühren lassen

- pH mit 1 M HCl auf pH = 7,6 einstellen

- mit Aqua bidest. auf 5 l auffüllen

- filtrieren

2.) Tween-PBS-Lösung

- 2 g BSA in 200 ml PBS lösen

- 200 µl Triton-X-100 und 200 µl Tween 20 zusetzen

- rühren lassen

3.) DAB-Gebrauchslösung

(0.05 M Tris/HCl-Puffer, pH = 7,6)

- 25 ml Stammlösung I (24,2 g Tris + A. bidest auf 1l [0,2 M] )+ 19,6ml Stammlösung II (0,2 n HCl)

- mit A. dest. auf ca. 95 ml auffüllen

- pH = 7,6 mit 0,2 n HCl (= Stammlösung II) einstellen

- mit Aqua dest. auf 100 ml auffüllen

38

3 Ergebnisse



Die meisten der als Monolayer kultivierten Chondrozyten sind zwar nach acht

Stunden bereits am Boden der Kulturflasche adhärent, viele von ihnen behalten aber

ihre abgerundete Gestalt während der ersten beiden Tage in der Primärkultur noch

bei. Erst am dritten Tag zeigt sich bei einem Großteil der Knorpelzellen eine

ausgeprägte Abflachung und Ausbreitung der Zellen (Spreading). Die

Chondrozyten nehmen eine für sie charakteristische polygonale Form an. In der

Präkonfluenz - bevor sich die Zellen flächendeckend zu berühren beginnen - hat das

Spreading sein größtes Ausmaß erreicht. Bis zur ausgeprägten Konfluenz, bei der

die Kultur reif zur Passage ist, rücken die Zellen dichter zusammen, behalten dabei

aber ihre vieleckige bis leicht abgerundete Form bei, so daß sich insgesamt das

typische Bild eines Kopfsteinpflasters ergibt. Diese Zellverbandsmorphologie setzt

sich in den ersten Subkulturen unverändert fort. Erst in den späteren Passagen

deutet sich ein fischzugartiges Wachstumsverhalten an. Ausgeprägte fischzugartige

Formationen aus langgestreckten Zellen, die teilweise sogar in Wirbel übergehen,

zeigen sich dagegen nur in der Perkonfluenzstudie, d.h. wenn die Knorpelzellen

über die normale Konfluenz hinaus ohne Passage über Wochen kultiviert werden

(vgl. 2.1.5). Bei den regelmäßig bei Erreichen der Konfluenz passagierten Zellen

kann eine derart deutliche Änderung der Zellverbandsmorphologie nicht beobachtet

werden.

Die Einzelzellmorphologie zeigt bereits zu einem wesentlich früheren Stadium

Veränderungen. Beim Erreichen der Konfluenz erscheinen die Chondrozyten zwar

auch in den späteren Subkulturen im wesentlichen wieder in ihrer polygonalen

Form. Jedoch schon nach der ersten Passage dauert es nicht mehr wie bei der

Primärkultur zwei Tage, bis die Knorpelzellen sich am Boden der Kulturflasche

ausbreiten. Ein deutliches Spreading ist bei vielen Zellen schon nach wenigen

Stunden zu beobachten. Zudem zeigen sich schmale Zytoplasmafortsätze, deren

Ausmaß ein Vielfaches des Durchmessers des eigentlichen Zelleibes erreichen kann.

Die Knorpelzellen nehmen z.T. ein bizarres, unregelmäßig sternförmiges Aussehen

an, z.T. mit einer deutlich bipolaren Ausrichtung. Diese Formunterschiede zu den

Chondrozyten in der Primärkultur sind jedoch nur in der Präkonfluenz zu

beobachten, wenn die Zelldichte noch sehr gering ist. Beim Erreichen der

Konfluenz sind - wie oben beschrieben - kaum noch Unterschiede zur Primärkultur

festzustellen.

39


Im Gefrierschnitt von nativem hyalinen Knorpel fällt insbesondere im Bereich der

Chondrone eine intensive bläulich-violette metachromatische Anfärbung bei der

Färbung nach Giemsa auf (s. Abb.2 a). Bei den Färbungen, bei denen Hämalaun

verwendet wird, zeigt sich in den gleichen Arealen eine starke Basophilie. Nach

vierstündiger Präinkubation mit Hyaluronidase imponiert die Knorpelgrundsubstanz

nur noch blaß rosa. Die Chondrozyten sind teilweise aus ihren Höhlen

herausgelöst. Der um die isogenen Gruppen herum gelegene Knorpelhof ist als

solcher nicht mehr erkennbar (s. Abb. 2 b)

Abb. 2 a u. b

Gefrierschnitte von nativem hyalinem Knorpel, links vor rechts nach vierstündiger

Inkubation in Hyaluronidase. Die besonders kräftige metachromatische Anfärbung

im Bereich der Territorien verschwindet praktisch vollständig.

40

Dasselbe Färbeverhalten wie beim nativen unbehandelten Knorpel jedoch in

schwächerer Form, findet sich im Ausstrich frisch isolierter Knorpelzellen.

Insbesondere nach der längeren Inkubationszeit von 42 Stunden ist vermehrt ein

schmaler, schwach metachromatisch bzw. basophil gefärbter Saum zu sehen.

In den Präparaten der Primärkultur fällt schon bei der Betrachtung mit dem bloßen

Auge eine deutliche Blaufärbung auf, die in sämtlichen Subkulturen nicht

nachweisbar ist. Besonders eindrücklich stellt sich dieses Phänomen an den

Präparaten dar, bei denen Zellen einer Primärkultur gemeinsam mit denen einer

ersten und dritten Passage in einzelnen Kulturkammern aber auf demselben

Objektträger gehalten wurden. Etwa bei der immunzytochemischen Färbung mit

Immunglobulinen gegen Kollagen Typ I stellen sich bei einem solchen Präparat

makroskopisch zwei bräunlich gefärbte Rechtecke für die erste und dritte Subkultur

dar entsprechend ihrer positiven Immunreaktivität für Kollagen Typ I sowie ein

bläulich gefärbtes Rechteck für die Primärkultur. Mikroskopisch entspricht diese

Blaufärbung einer intensiven Basophilie der perizellulär abgelagerten Matrix. Sie ist

sowohl bei der Färbung mit Hämalaun-Eosin als auch bei der Gegenfärbung mit

Hämalaun bei den immunzytochemischen Färbungen zu beobachten.

Bei der Färbung nach Giemsa stellt sich ebenfalls ausschließlich in der Primär-,

nicht aber in den Subkulturen, eine deutliche bläulich-violette metachromatische

Verfärbung der Extrazellulärsubstanz dar, während das Zytoplasma der

Chondrozyten zart rosa gefärbt ist. Wie oben erwähnt konnte schon in dem

Zellausstrich frisch isolierter boviner Chondrozyten vereinzelt ein kleiner, schwach

bläulich-violetter Hof um die Zellen herum beobachtet werden. Ursprünglich mit

der Fragestellung, ob es sich hier um Reste der nativen Knorpelmatrix handelt oder

um von den isolierten Chondrozyten neu gebildete Zwischenzellsubstanz, wurde die

unter 2.1.5 beschriebene P0-Metachromasie-Studie als Zusatzversuch durchgeführt.

Schon mit dem bloßen Auge läßt sich an den sieben Präparaten eine von Tag zu Tag

zunehmende metachromatische Färbung feststellen. Mikroskopisch sieht man

zunächst ganz spärliche metachromatisch angefäbte extrazelluläre

Matrixablagerungen. Vom ersten bis zum letzten Tag der Primärkultur nimmt die

Menge der abgelagerten Extrazellulärsubstanz und die Intensität der

metachromatischen Färbung stark zu (s. Abb. 3 a-e, S. 41). Nach der ersten

Passage ist bis auf einen bläulich violetten Hauch in der ersten Subkultur keine

Metachromasie mehr nachweisbar. Werden die Präparate der Primärkultur vor der

Giemsafärbung vier Stunden in Hyaluronidase präinkubiert, so zeigt sich lediglich

eine zarte Rosafärbung. Es fehlt jegliche Metachromasie.

41

Abb. 3 a-e

P0-Metachromasie-Studie: in den nach Giemsa gefärbten Präparaten zeigen die

Chondrozyten eine von Tag zu Tag zunhemende Ablagerung einer stark

metachromatischen Extrazellulärsubstanz (von oben nach unten Tage 1, 2, 4, 5 u.6)

42



Gefrierschnitte von nativem hyalinen Knorpel stellen sich in der

immunzytochemischen Färbung mit Antikörpern gegen Kollagen-Typ I negativ dar

(s. Abb. 4 a). Sowohl vor wie nach einer vierstündigen Inkubation mit

Hyaluronidase zeigen die Chondrozyten (soweit nicht aus ihrer Matrix herausge-

löst), die Territorien als auch die Interterritorien keine positive Immunreaktivität.

Was jedoch auffällt, ist eine nach Hyaluronidase-Präinkubation noch deutlicher zu

Tage tretende positive Reaktion in einem schmalen bandförmigen Bereich

unmittelbar unter der natürlichen Knorpeloberfläche. Diese Braunfärbung findet

sich jedoch bei allen der hier ausgetesteten Antikörperfärbungen.

Für Kollagen-Typ II zeigen die Gewebeschnitte dagegen eine schwach positive

Reaktion, die sich durch Vorbehandlung mit Hyaluronidase deutlich verstärkt

(s. Abb. 4 b u. c). Allerdings sind die Strukturen nach der Inkubation mit dem

Enzym deutlich verwaschener. Das Zytoplasma der Chondrozyten (soweit sie nicht

herausgelöst sind) ist negativ. Eine eindeutige Zuordnung der positiven

Immunreaktivität zu entweder territorialer oder interterritorialer Matrix ist nicht

möglich.

Abb. 4 a-c

Nativer hyaliner Knorpel, Anfärbbarkeit mit den klassischen Kollagen-Antikörpern:

Negative Reaktivität für Kollagen-Typ I unabhängig von einer Hyaluronidase-

präinkubation (links, ohne Vorbehandlung), leichte Reaktion ohne Demaskierung

der Kollagen-Typ II-Fasern (Mitte) und deutliche Reaktion auf Anti-Kollagen-

Typ II nach vierstündiger Inkubation in Hyaluronidase (rechts).

43

Im Ausstrich frisch isolierter Chondrozyten ist wie im Gewebeschnitt keinerlei

Kollagen-Typ I nachweisbar. Alle Zellen sind negativ (s. Abb. 5 a).

Bei der Färbung mit Immunglobulinen gegen Kollagen-Typ II ist dagegen ein

interessantes Phänomen zu beobachten. Während nach einer 24stündigen

Inkubation mit Kollagenase zur Zellisolierung nur etwa 10- 30 % der Chondrozyten

eine deutlich positive Immunreaktion zeigen, sind es nach 42 Stunden über 50 %

der Zellen. Die Stärke der Reaktion kann dabei semiquantitativ mit ++ bis +++

angegeben werden (s. Abb. 5 b).

Abb. 5 a u. b

Im Ausstrich frisch isolierter Chondrozyten (prä-P0) sind sämtliche Chondrozyten

negativ für Kollagen-Typ I (links); für Kollagen-Typ II zeigen die Knorpelzellen

dagegen eine deutliche Reaktivität; dabei nimmt die Anzahl der positiv gefärbten

Zellen mit der Dauer der Inkubationszeit zu (rechts, nach 42stündiger Inkubation in

Kollagenase)

44

In der Primärkultur zeigt sich für die beiden ersten Kollagentypen ein

spiegelbildlich entgegengeseztes Muster. Für Kollagen-Typ I ist die Reaktion bei

fast allen Chondrozyten negativ. Jedoch werden vereinzelt Zellen gesehen, die zwei-

, z.T. sogar dreifach positiv gefärbt sind (s. Abb. 6 a). Die Immunglobuline gegen

Kollagen-Typ II reagieren dagegen mit den meisten Knorpelzellen. Nur wenige sind

negativ (s. Abb. 6 b).

Bereits in der ersten Subkultur dreht sich dieses Bild vollständig um. Die

überwiegende Zahl der Knorpelzellen ist zwei- bis dreifach positiv für Kollagen-

Typ I (s. Abb. 6 c) und negativ für Typ II (s. Abb. 6 d). Nur bei wenigen Zellen ist

noch das in der Primärkultur gezeigte Färbeverhalten sichtbar. In den späteren

Passagen sind praktisch keine Zellen mehr zu finden, die positiv für Kollagen-

Typ II oder negativ für Kollagen-Typ I sind (s. Abb. 6 e u. f).

Abb. 6 a-f

Immunreaktivität boviner Chondrozyten für Kollagen-Typ I bzw. II in

Monolayerkultur: links jeweils gefärbt mit Anti- Kollagen-Typ I, rechts mit Anti-

Kollagen-Typ II, oben die Primärkultur, in der Mitte die erste und unten die vierte

Subkultur: die Anfärbbarkeit für Kollagen-Typ I nimmt kontinuierlich zu, die für

Kollagen-Typ II nimmt spiegelbildlich ab.

45


In den Knorpelschnitten färben sich vor der Hyaluronidaseinkubation nur die

Chondrone mit Antikörpern gegen Kollagen-Typ III leicht positiv an, während die

Chondrozyten selbst und die Interterritorien negativ bleiben. Nach der

Enzymbehandlung werden die Chondrone noch deutlicher positiv. Auch der

interterritorielle Raum zeigt eine ganz leicht positive Immunreaktion für Kollagen-

Typ III.

Die Chondrone färben sich bei Kollagen-Typ V wesentlich deutlicher an, besonders

nach enzymatischer Vorbehandlung (+++). Die darin nicht eindeutig abgrenzbaren

Knorpelzellen sind leicht immunopositiv. Die Interterritorien nehmen erst nach der

Kollagenase-Präinkubation eine leicht bräunliche Tönung an. Wie in allen der hier

angewandten immunzytochemischen Färbungen zeigt sich auch für diese beiden

Antikörper ein schmaler positiver Saum unmittelbar unter der natürlichen

Knorpeloberfläche. Im Chondrozytenausstrich sind nur ganz vereinzelte Zellen

positiv für Kollagen-Typ III. Für Kollagen-Typ V ist die Immunreaktivität dagegen

fast durchgehend zumindest einfach positiv, für einige auch zweifach.

In der Primärkultur ist ein Teil der Zellen negativ bis ganz schwach positiv für

Kollagen-Typ III, der andere Teil zeigt dagegen eine deutlich positive Reaktion. Für

Kollagen-Typ V kann eine durchgehend z.T. mehr, z.T. weniger intensive positive

Immunrektivität beobachtet werden.

Von der ersten Subkultur an wird eine gleich starke etwa zweifach positive Reaktion

bei quasi allen Zellen für Kollagen-Typ III wie -Typ V gefunden (s. Abb. 7 a u. b).

Abb. 7 a u. b

Chondrozyten nach der ersten Passage (P1): für Kollagen-Typ III (links) und Typ V

(rechts) findet sich praktisch dasselbe Färbeverhalten.

46

3.2.3 S-100, S-100-α und S-100-β

In Kryostat-Schnitten des hyalinen Knorpels zeigt sich bei der Anfärbung mit

Antikörpern gegen S-100 eine deutliche intrazytoplasmatische, perinukleär

verdichtete braune Granulierung (+++), während das Stroma ohne

Hyaluronidasevorbehandlung negativ erscheint. (s. Abb. 8 a) Nach der

Präinkubation sind die Chondrone jedoch auch als dreifach positiv erkennbar,

während sich die interterritorielle Matrix bis auf den Bereich unmittlelbar unter der

Knorpeloberfläche nur leicht positiv anfärbt (s. Abb. 8 b).

Bei der Reaktion gegen die α-Untereinheit fällt dagegen eine dreifach positive

unmittelbar perizelluläre Braunfärbung auf, während die Zellen selbst negativ

erscheinen. Erst nach der Inkubation mit Hyaluronidase werden die Territorien

außerhalb der Kapsel positiv, während die Interterritorien ähnlich wie bei dem

Gesamtprotein nahezu negativ bleiben.

Bei der β-Untereinheit findet sich bereits bei dem unbehandelten Kryostatschnitt

sowohl eine deutliche intra- als auch eine etwas schwächere perizelluläre positive

Reaktion. Das Färbeverhalten nach Präinkubation mit Hyaluronidase entspricht dem

des S-100-Gesamtproteins.

Abb. 8 a u. b

Nativer hyaliner Knorpel, Färbung mit Anti-S-100-α: im Gegensatz zu der

β-Untereinheit und dem Gesamtprotein findet sich praktisch keine intrazelluläre

Immunreaktion, jedoch eine dreifach positive Braunfärbung perizellulär innerhalb

der Knorpelkapsel (links); erst nach der Hyaluronidasebehandlung werden die

Territorien kräftig positiv (rechts).

47

Von dem Zellausstrich bis zur sechsten Passage findet sich für die Knorpelzellen

quasi unverändert eine dreifach positive Immunreaktivität für das S-100-Protein

(vgl. Abb. 9 a-c)

Abb. 9 a-c

Knorpelzellen in Monolayerkultur, Färbung mit Anti-S-100, von oben nach unten:

Primärkultur, erste und vierte Subkultur: es zeigt sich durchgehend eine kräftig

braune Anfärbung.

48

Bei den Untereinheiten des S-100-Proteins sind hingegen Veränderungen im

Verlauf der Kultur zu beschreiben.

Die intra- bzw. perizellulär bevorzugte Verteilung der Untereinheiten setzt sich im

Zellausstrich fort. Dort wo Chondrozyten von einem schmalen Saum von

Extrazellulärmatrix umgeben sind, zeigt sich für S-100-α eine positive

Immunreaktivität in Form von dreifach positiven Granula. Gleichzeitig ist das

Zytoplasma nur ganz leicht bräunlich getönt. Bei S-100-β weisen die Knorpelzellen

hingegen eine dreifach positive intrazelluläre Färbung auf, die nach 42 Stunden in

Kollagenaselösung noch etwas deutlicher hervortritt.

In der Primärkultur zeigen die Chondrozyten eine wechselnd stark ausgeprägte

Immunreaktivität für S-100-α, die zwischen den Zellen von einfacher bis dreifacher

Positivität schwankt (s. Abb. 10 a, S. 49). Auch für S-100-β werden

Schwankungen in der Färbeintensität gesehen, doch ist die Immunreaktivität

insgesamt deutlich positiver (++ bis +++) (s. Abb. 10 b). Während sich die

phänotypische Expression in Bezug auf S-100-β in der ersten Subkultur nicht

ändert (vgl. Abb. 10 d), wird nach der ersten Passage deutlich weniger S-100-αnachweisbar (vgl. Abb. 10 c). Semiquantitativ könnte man die Intensistät der

Färbung nur noch mit + angeben. In den späteren Subkulturen nimmt die

Färbeintensität sukzessive weiter ab und wird ab der 5. Passage quasi negativ (vgl.

Abb. 10 e). Die Reaktion von Anti-S-100-β-Immunglobulinen mit den

Knorpelzellen wird hingegen nur unwesentlich schwächer und bleibt bis zur

sechsten Passage etwa zweifach positiv (vgl. Abb. 10f).

49

Abb. 10 a-f

S-100-α und S-100-β im Vergleich, von oben nach unten: Primärkultur, erste und

vierte Subkultur. Bei der α-Untereinheit (links) entwickelt sich aus dem anfangs

gemischten Bild (+ bis +++) eine immer weiter abnehmende Immunreaktivität,

während das insgesamt kräftiger gefärbte bunte Bild bei der β-Untereinheit (rechts)

sich bis in die höheren Passagen in eine gleichmäßige zweifach positive

Immunreaktivität wandelt.

50


3.3.1 Histochemische Darstellung

1.) Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie

Die Fibroblasten des straffen wie die des lockeren Bindegewebes zeigen von

Anfang an ein im Vergleich zu den Chondrozyten andersartiges

Wachstumsverhalten. Sie haften schneller an der Unterlage und breiten sich danach

rasch aus. Sie nehmen dabei eine eher langgestreckte Form an und wachsen mehr in

Form von längsorientierten Ketten, die sich verzweigen können. Bei zunehmenden

Zellzahlen entwickelt sich so primär ein fischzugartiges Bild, das beim Erreichen

der Konfluenz auch wirbelartige Formen annehmen kann.

2.) Basophilie und Metachromasie

Weder in den Gewebeschnitten von straffem oder lockerem Bindegewebe noch bei

den isolierten und in Kultur gebrachten Fibroblasten zeigte sich zu irgendeinem

Zeitpunkt eine Metachromasie in der Färbung nach Giemsa oder eine wie für die

Chondrozyten beschriebene verstärkte Basophilie in einer Hämatoxylinfärbung.

51

3.3.2 Immunzytochemische Charakterisierung

1.) Kollagen-Typ I und I I

Eine Vorbehandlung der Bindegewebsproben mit Hyaluronidase verändert die

Immunreaktivität der Bindegewebsproben nicht. Die Fasern erscheinen lediglich

strukturierter, und viele der Zellen sind aus dem Gewebe herausgelöst. Für

Kollagen-Typ I zeigt sich in den Gewebeschnitten die stärkste Immunreaktivität

unter den Kollagen-Typen, obschon sie sehr diffus und absolut gesehen nicht sehr

ausgeprägt ist (+). Bei Kollagen-Typ II ergibt sich eine diffuse ganz leichte

Grundtönung, die sich in gleicher Form in der Kontrolle K2 wiederfindet. Die

Reaktion muß daher als unspezifisch angesehen werden.

Im Zellausstrich und in der Zellkultur sind die Unterschiede in den

Immunreaktivitäten deutlich ausgeprägter. Während die bovinen Fibroblasten

durchweg zweifach positiv für Kollagen-Typ I sind (s. Abb. 11), zeigen sie ebenso

durchgehend keinerlei Reaktion für Kollagen-Typ II.

Abb. 11

Bovine Fibroblasten in Monolayerkultur als biologische Kontrolle, erste Subkultur:

Es zeigt sich eine deutlich positive Immunreaktivität für Kollagen-Typ I

52

2.) Kollagen-Typ III und V

Sowohl im straffen wie im lockeren Bindegewebe läßt sich Kollagen-Typ III wie

auch Typ V nachweisen. Neben einer relativ homogenen Grundtönung, die in ihrer

Intensität jedoch stärker ist als die der Kontrolle K2 (vgl. o.), sind einzelne

septenartige Faserzüge verstärkt positiv dargestellt. Sowohl im Zellaussstrich als

auch in der Primär- und in den Subkulturen ergibt sich für beide Antikörper ein

buntes Bild. In unterschiedlichen Verteilungen ohne konstante Anteilsverhältnisse

finden sich Zellen, die negativ oder ganz schwach positiv sind, bis hin zu solchen

Fibroblasten, die eine zweifach positive Anfärbung zeigen.

3.) S-100, S-100-α und S-100-β

Die Immunreaktivität für S-100 und seine β-Untereinheit stellt sich für das straffe

Bindegewebe sehr ähnlich dar: mittelstark positive Septen (++) trennen Areale aus

sehr schwach bis schwach positiven Fasern. Dazwischen liegen die basophilen

Zellen von Flügelzellen. Im lockeren Bindegewebe finden sich dagegen

zigarrenförmige bis ovale basophile Kerne in mit Anti-S-100 und Anti-S-100-βleicht positiv gefärbten Nestern.

Für S-100 und seine β-Untereinheit findet sich im Zellausstrich vor der

Primärkultur ein buntes Bild von negativen bis zweifach positiven Zellen für S-100

und von negativen bis einfach positiven Zellen für S-100-β. In den nachfolgenden

Kulturen zeigt sich eine mäßig stark positive Immunreaktivität für S-100 und eine

schwach positive für seine β-Untereinheit.

53

Für S-100-α hingegen zeigt lockeres wie straffes Bindegewebe im Kryostatschnitt

keine positive Immunreaktivität.

In der Folge bleiben die Fibroblasten bis in die Subkulturen ohne Reaktion für

Antikörper gegen die α-Untereinheit des S-100-Proteins (s. Abb. 12).

Abb. 12

Primärkultur von bovinen Fibroblasten, Färbung mit Anti-S-100-α: Im Gegensatz

zu den Darstellungen mit Anti-S-100 und Anti-S-100-β findet sich keinerlei positive

Immunreaktion.

54

3.4 Synoptische Darstellung der Ergebnisse

Bei einer Einzeldarstellung der Ergebnisse kann eine differenzierte Beschreibung

der Antigenlokalisation erfolgen. Auch lassen sich Feinheiten in der Entwicklung

des Antigenexpressionsverhaltens veranschaulichen, etwa wenn ganz vereinzelt

Zellen in der Primärkultur schon den Phänotyp zeigen, der bei dem Großteil der

Zellen erst nach der ersten Passage zu sehen ist. Jedoch birgt diese Darstellung die

Gefahr, daß Tendenzen der Gesamtentwicklung nicht in hinreichender

Übersichtlichkeit deutlich werden. Um die Änderung des Antigenexpressions-

verhaltens von Chondrozyten im zeitlichen Verlauf der Monolayerkultur im

Überblick zu verdeutlichen, folgt eine synoptische Darstellung der Ergebnisse.

Die jeweiligen Intensitäten der Anfärbungen pro Antikörper und Passage sind

dreifach gemittelt:

1.) über die verschiedenen Zellen einer Population,

2.) über die verschiedenen Populationen unterschiedlicher Individuen, die auf

verschiedenen Objektträgern jedoch am gleichen Tag parallel mit identischen

Lösungen gefärbt wurden und

3.) über die verschiedenen Gruppen von Populationen aus zu unterschiedlichen

Zeitpunkten etablierten Kulturen (um eine bzw. drei Wochen versetzt), die

entsprechend eine bzw. drei Wochen später erst in der gleichlautenden Passage

gefärbt wurden.

In den späten Subkulturen P4-P6 werden praktisch keine Unterschiede in den

verschiedenen Immunreaktivitäten von Passage zu Passage beobachtet. Schon von

der zweiten Subkultur an sind die Unterschiede nur minimal. Daher werden der

Übersichtlichkeit halber die Passagen P2-P6 durch „ P6“ repräsentiert.

Die semiquantitative Auswertung erfolgt nach dem bekannten Schema ( - / + / ++ /

+++).

Mit einem Sternchen (*) sind die Reaktivitäten gekennzeichnet, die in einem

ausgesprochen großem Umfang in ihrer Intensität schwanken („buntes Bild“), ohne

daß im Grunde eine Intensität als die vorherrschende angegeben werden könnte

(siehe z.B. in der P0 bei Kollagen-Typ III und V).

55

Nativer

hyaliner

Knorpel

prä-P0 P0 P1 P6Sehne/

lockeres

BG

P0 P1 P2

Baso-

philie +++ + +++ - - - - - -

Meta-

chromasie +++ + +++ - - - - - -

Coll I - - - +++ +++ + ++ ++ ++

Coll II ++ ++ ++ - - - - - -

Coll III + + +* ++ ++ (+) +* +* +*

Coll V ++ ++ ++* ++ ++ + +* +* +*

S-100 +++ +++ +++ +++ +++ + + + +

S-100-α +++ +++ +++ + - - - - -

S-100-β ++ ++ ++ ++ ++ (+) (+) (+) (+)

Tab. 2

Darstellung der Ergebnisse im Überblick

56

4 Diskussion



Zellbiologisch zeigen die Chondrozyten schon nach der ersten Passage erste

Unterschiede zu den Zellen der Primärkultur. Die Ausbreitung am Boden der

Kulturflasche (Spreading) erfolgt bereits nach wenigen Stunden in ausgeprägter

Form, während sie in der Primärkultur erst nach zwei Tagen und dann eher zaghaft

beginnt. Genauso beschreibt Mallein-Gerin (136), daß differenzierte Chondrozyten

in der primären Monolayerkultur ihre runde Form nach ihrer Adhäsion noch 48

Stunden beibehalten (vgl. ebenso 137 und 140), während Fibrozyten schon nach

wenigen Stunden abgeflacht und langgestreckt gefunden werden. Durch das Fehlen

solcher rasch sich ausbreitender Zellen in seinen Kulturen schließt Mallein-Gerin

sogar eine Kontamination durch Fibrozyten aus (136). Ein verzögertes Spreading

wird somit als Charakteristikum des differenzierten Chondrozyten gewertet.

Folgerichtig könnte ein nach der ersten Passage stark beschleunigtes Spreading auf

eine Entdifferenzierung der Knorpelzellen hinweisen.

Zellmorpholgisch fällt bei den Chondrozyten nach dem Spreading zumindest noch

während der Präkonfluenz ein Verlust des rundlichen bis polygonalen Aussehens

und stattdessen eine bizarre sternförmige Gestalt auf. Dies trifft sowohl für die

Primärkultur zu wie für die Zellen nach der ersten Passage. Dabei kann mit der

Anzahl der Passagen eine zunehmend bipolare Orientierung beobachtet werden. In

der Literatur wird bei der Entdifferenzierung der Übergang von einem rundlich-

polygonalen, seßhaften, differenzierten Chondrozyt in einem epitheloidzelligen

Verband zu einem abgeflachten, in Abhängigkeit von der Zelldichte stern- bis

spindelförmigen, amöboid beweglichen, fibroblastenartig entdifferenzierten

Chondrozyten beschrieben, der eine bis zum Zehnfachen vergrößerte Zelloberfläche

aufweist (3, 58, 60, 66, 82, 140, 160, 188). Dieser Übergang wird in der

Monolayerkultur boviner Chondrozyten somit zumindest vorübergehend bereits in

der Primärkultur während der Präkonfluenz beobachtet. Chacko und Mitarbeiter

beschreiben die Chondrozyten in dieser Phase entsprechend bereits als

„entdifferenziert“ und gehen von einer Redifferenzierung aus, die eintritt, wenn die

Zellen in Kontakt zueinander kommen (34).

57

Tatsächlich nehmen die Chondrozyten bei Erreichen der Konfluenz ihre mehr

rundlich-polygonale Form wieder an. Diese „ Redifferenzierung“ beim Erreichen

der Konfluenz findet nach der ersten Passage nicht mehr in dem gleichen Ausmaß

statt. Die Zellen behalten auch in der Konfluenz eine mehr bipolare Ausrichtung bei

und erinnern so bereits mehr an Fibroblasten. Jedoch unterscheiden sich diese

„fibroblastenartig“ genannten Chondrozyten noch recht deutlich von echten

Fibroblasten. Bovine Fibroblasten aus straffem oder lockerem Bindegewebe, wie

wir sie als biologische Kontrolle separat kultiviert haben, sind weitaus stärker

langgestreckt und bilden typische fischzug- und teilweise wirbelartige Formationen

im Stadium der Konfluenz. Solche Bilder zeigen sich bei den Chondrozyten erst,

wenn sie über mehrere Wochen nicht passagiert wurden (Perkonfluenzstudie).

Andeutungsweise finden sie sich in der späten sechsten Subkultur.

Diese Beobachtung legt den Eindruck nahe, daß die Entdifferenzierung - zumindest

vom morphologischen Gesichtspunkt aus - stufenweise erfolgt:

1.) Zellbiologisch zeigen die Chondrozyten nur in der Primärkultur das von

Mallein-Gerin als charakteristisch für den differenzierten Phänotyp angesehene

Verhalten, nach der Zellaussaat zwar am Boden der Kulturflasche zu haften, sich

aber erst nach etwa 48 Stunden auszubreiten.

2.) Es kommt zu einer reversiblen einzelzellmophologischen Veränderung während

der Primärkultur im Sinne einer sternförmigen Abflachung, die Chacko als

Entdifferenzierung mit anschließender Redifferenzierung beim Erreichen der

Konfluenz interpretiert.

3.) Sowohl nach längerer Kultur im Stadium der Perkonfluenz wie auch nach mehr

als fünf Passagen ändert sich die Zellverbandsmorphologie im Sinne eines dann

mehr fischzugartig bis wirbelförmigen Wachstums von dann deutlich

langgestreckten Zellen.

Morphologisch erfolgt demnach eine zumindest zweistufige Entdifferenzierung von

fraglich auch unterschiedlicher Reversibilität: die einzelzell- und

zellverbandsmorphologische Entdifferenzierung erfolgen zu unterschiedlichen

Zeiten.

Wir werden anhand der histochemischen und immunzytochemischen Ergebnisse zu

prüfen haben, inwieweit sich diese morphologischen Entdifferenzierungsschritte in

entsprechenden funktionellen Veränderungen widerspiegeln.

58

Von großer klinischer Bedeutung ist weiterhin die Frage, inwieweit mit dem

zweiten Entdifferenzierungsschritt möglicherweise auch die Redifferenzierbarkeit

verlorengeht. Denn eine Möglichkeit zur Gewinnung großer Mengen differenzierter

Knorpelzellen, etwa zum Zwecke der Transplantation bei Gelenkknorpeldefekten,

ist die sequentielle Kultur in Monolayer- und Rührkultur. Dabei nutzt man bei der

Monolayerkultur die hohe Proliferationsrate und nimmt dafür die Entdifferenzierung

in Kauf. In der nachfolgenden Suspensionskultur redifferenzieren die Zellen zu

funktionsfähigen Chondrozyten (142, 160, 204).

Sollte daher nach dem zellverbandsmorphologischen zweiten Entdifferenzierungs-

schritt keine Redifferenzierbarkeit mehr gegeben sein, wäre es von entscheidender

Wichtigkeit, einen Marker für diesen zweiten Schritt zu finden, damit im klinischen

Gebrauch sofort erkennbar ist, wenn es zu einer solchen irreversiblen

Entdifferenzierung kommt.

59


Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der immunzytochemischen Charakterisierung

von Knorpelzellen. Insofern stellen die histochemischen Färbungen lediglich

Referenzmethoden dar. Da sie jedoch im wesentlichen auf dem Nachweis des

anderen der beiden Hauptbestandteile der Knorpelmatrix beruhen - der

Proteoglykane bzw. der Glykosaminoglykane nämlich -, sind sie eine wertvolle

Ergänzung. Ich möchte daher im Rahmen der Diskussion der Frage nachgehen,

inwiefern diesen klassischen Färbemethoden für das Erkennen der

Entdifferenzierung von Chondrozyten im Verlauf der Zellkultur heute noch

Bedeutung zugemessen werden sollte.

Lange bevor immunzytochemische Färbetechniken zur Verfügung standen, wurde

der charakteristische Phänotyp von Chondrozyten mit Hilfe histochemischer

Methoden nachgewiesen. Dabei spielen vor allem Färbungen mit

metachromatischen Farbstoffen eine große Rolle, so z.B. Toluidinblau (3, 34, 58,

64, 65, 71, 101, 137, 186, 206, 207, 216), Giemsa (104, 66), Methylenblau (51),

Thionin (81) und Safranin O (7, 65, 179). Auch Alzianblau (7, 12, 21, 81, 137,

179), wenn auch ohne metachromatisches Färbeverhalten, bindet vor allem an

Proteoglykane, die reich an Chondroitinsulfat sind und in Form großer Aggregate

vorliegen, beides Charakteristika der Proteoglykane des hyalinen Knorpels

(vgl. 1.2.2). Als Übersichtsfärbung ist die Hämalaun-Eosin-(HE-) Färbung wegen

ihrer kontrastreichen Darstellung wohl die am meisten verbreitete histologische

Färbung überhaupt (91). Bei der Knorpelfärbung wird nicht nur das Kernchromatin

(DNS mit „ S“ für Säure [!]) sondern auch die ebenfalls sauren polyanionischen

Glykosaminoglykane mit dem basischen Farbstoff Hämalaun (= Hämatoxylin +

Alaun) kräftig blau angefärbt. Man spricht daher auch von einer ausgeprägten

Basophilie insbesondere der perizellulären Matrix des hyalinen Knorpels (14, 81,

137). Speziell für die Elektronenmikroskopie sind Rutheniumrot (45, 65), Acridin-

Orange (23) und Cupromeronisch Blau (162) geeignet. Als elektronendichte

polykationische Farbstoffe stellen sie ebenfalls die polyanionischen

Glykosaminoglykane dar (162).

Zweifelsohne spielten die klassischen histochemischen Färbemethoden also schon

lange vor, aber auch noch während der immunzytochemischen Ära beim Nachweis

des charakteristischen Phänotyps von Knorpelzellen eine bedeutende Rolle. Jedoch

wurde die Ansicht geäußert, diese Methoden seien zu unspezifisch (139). Mit dem

Einsatz monospezifischer Antikörper in immunzytochemischen Färbetechniken

erhoffte man sich spezifischere Nachweismethoden.

60

Dies ist auch in großem Umfang gelungen. Besonders erwähnenswert sind hier

etwa die Untersuchungen mit zweifacher Immunfluoreszenzmarkierung von Klaus

von der Mark und Kollegen. Es gelang ihnen zu zeigen, welcher Kollagentyp Zelle

für Zelle im Zuge der Entdifferenzierung synthetisiert wird (noch Kollagen-Typ II,

schon Kollagen-Typ I oder auch beide simultan). Gleichzeitig konnten sie

feststellen, inwieweit dieser funktionelle Entdifferenzierungsschritt mit dem

morphologischen korreliert (140).

Haben durch solche spezifischeren Nachweismethoden die histochemischen

Färbemethoden ihre Bedeutung z.B. bei der Beurteilung des Differenzierungs-

grades von Chondrozyten verloren?

Nach der Definition des Phänotyps von Zellen hatten wir zwei mögliche Ansätze

seiner Charakterisierung unterschieden: den morphologischen und den funktionellen

Ansatz (vgl 1.2). Es ist zunächst festzuhalten, daß ebenso wie die

Immunzytochemie auch die klassische Histochemie ein Bindeglied zwischen

Morphe und Funktion darstellt. Und das in größerem Maße, als daß natürlich jede

Struktur letztlich aus einem molekularen Vorgang resultiert (91). Die zumindest

relative Spezifität der genannten histochemischen Färbungen beruht auf ihrer

Anfärbung ganz bestimmter Stoffwechselprodukte der Chondrozyten, nämlich der

polyanionischen Glykosaminoglykane, die als charakteristische Stoffwechsel-

produkte durchaus auch deren differenzierten Phänotyp beschreiben können.

Phosphorwolframsäure, die in der Ladewig-Färbung zur Anwendung kommt,

erfüllt dieses Kriterium z.B. nicht. Sie bindet zwar mit hoher Affinität an ein

Stoffwechselprodukt von Knorpelzellen, nämlich Kollagen-Typ II, jedoch gilt

diese hohe Affinität Kollagenfasern überhaupt (3) und somit beispielsweise auch

Kollagen--Typ-I-Fasern, die nicht spezifisch für Knorpelzellen sind, sondern auch

von Fibroblasten gebildet werden und bei den Knorpelzellen sogar als Zeichen der

Entdifferenzierung angesehen werden.

Die Basophilie bei Anfärbung mit Hämalaun und die verschiedenen

metachromatischen Färbungen sind wie oben bereits angedeutet nur relativ

spezifisch. Viele Substanzen können eine basophile und sogar eine

metachromatische Anfärbung zeigen. Voraussetzung ist lediglich das Vorkommen

einer großen Anzahl dicht benachbarter saurer Gruppen. So färben sich

beispielsweise auch Mastzellgranula je nach Farbstoff basophil oder

metachromatisch an. Denn das in den Granula enthaltene Heparin ist ein stark

saures, vielfach sulfatiertes Glykosaminoglykan.

61

Die Spezifität dieser Färbemethoden ist also sicher nicht als ausreichend zu

bezeichnen.Doch diese ist auch nicht erforderlich. Entscheidend für den Nachweis

der Entdifferenzierung von Knorpelzellen in der Zellkultur ist vielmehr die

jahrzehntelang bewiesene hohe Sensitivität dieser histochemischen

Nachweismethoden für Knorpel-Glykosaminoglykane. Als Kriterium für die

Entdifferenzierung war zwar unter 1.1.2 von vielen Autoren auch eine qualitative

Veränderung der gebildeten Proteoglykane angeführt worden, jedoch steht, wie

auch unsere Versuchsergebnisse zeigen, der quantitative Aspekt deutlich im

Vordergrund: Wenn bis einschließlich zur Primärkultur bei nativem Knorpel wie bei

daraus isolierten Chondrozyten eine basophile bzw. metachromatische Matrix

darzustellen ist, die von der ersten Subkultur an praktisch nicht mehr nachgewiesen

werden kann, dann ist das ein äußerst aussagekräftiges Kriterium für einen

stattgefundenen Entdifferenzierungsschritt. Offenbar haben die Chondrozyten die

für ihren differenzierten Phänotyp charakteristische Synthese knorpelspezifischer

Glykosaminoglykane eingestellt oder zumindest stark reduziert. Da sich diese

Umstellung des Biosyntheseprogramms in den hier angewandten klassischen

histochemischen Färbemethoden sehr klar und eindrücklich darstellt, sehen wir sie

zur Darstellung des Phänotyps von Chondrozyten nicht nur als Referenzfärbung zu

immunzytochemischen Färbungen als ungedingt empfehlenswert an.

Die Frage soll aber noch einmal explizit aufgenommen werden: Werden bei diesen

Färbemethoden tatsächlich knorpelspezifische Stoffwechselprodukte nach-

gewiesen?

Beim Vergleich mit der Literatur wird zunächst einmal deutlich, daß dieses

metachromatische Färbeverhalten als das Charakteristikum der Matrix des hyalinen

Knorpels schlechthin angesehen wurde. Honor B. Fell etwa beschreibt in ihrer

bedeutenden Pionierarbeit über die Histogenese von Knorpel und Knochen 1925

die metachromatische Färbung mit Methylenblau (Zellen: hell smaragd-grün,

Matrix: tief blau-violett) als die beste Methode, um die charakteristische Matrix bei

der Chondrogenese schon im frühesten Stadium festzustellen (51).

Die Tatsache, daß man rein empirisch die Metachromasie als charakteristisches

Kriterium für den differenzierten Phänotyp angesehen hat, mag allein noch nicht

überzeugen. Gibt es Hinweise dafür, daß die Produktion und Ablagerung

knorpelspezifischer Proteoglykane das funktionelle Korrelat der Metachromasie und

ausgeprägten Basophilie ist?

62

Dieser funktionelle Aspekt kam in der Geschichte der Knorpelforschung tatsächlich

in der nächsten Nachweismethode des differenzierten Chondrozytenphänotyp zum

Tragen. Denn nun wurde der charakteristische Phänotyp des hyalinen Knorpels mit

dem Nachweis des Einbaus von 35S-Sulfat in das Chondroitinsulfat mittels

Autoradiographie nachgewiesen. Regelmäßig bildete jedoch auch hier die

Metachromasie bei histochemischen Färbungen die Referenzmethode (z.B. 81, 137,

206).

Mit Rutheniumrot gelang es auf elektronenmikroskopischer Ebene die

Proteoglykane sichtbar zu machen, die für die Metachromasie verantwortlich sind

(vgl. 65). Als elektronendichter polykationischer Farbstoff bindet er genau an

dieselben polyanionischen Glykosaminoglykane, die die ebenfalls basischen

Farbstoffe wie Toluidinblau oder das Azur in der Färbung nach Giemsa so

verändern, daß sie in einem anderen Farbton erscheinen.

Als man schließlich in der Lage war, die Proteoglykane zu extrahieren und

biochemisch zu charakterisieren, fanden die metachromatischen Färbungen

wiederum als Referenzmethode Verwendung (z.B. 78, 205).

Immunzytochemisch gelang es umgekehrt, mit polyklonalen Antikörpern gegen das

nun biochemisch charakterisierte Kernprotein die Proteoglykane in situ

nachzuweisen und zwar sowohl in der Extrazellulärmatrix wie auch in den

intrazytoplasmatischen Organellen der Chondrozyten (164).

Mit monoklonalen Antikörpern gegen die Chondroitinsulfatketten und einer

Markierung mittels Goldpartikeln konnten im kryotechnisch vorbehandelten

Gewebe schließlich immunelektronenmikroskopisch die Proteoglykane mit den

vorbeschriebenen Rutheniumrot-gefärbten Granula korreliert werden.

Insgesamt besteht also kein Zweifel darüber, daß mit den metachromatischen

histochemischen Färbungen eben dieselben Proteoglykane dargestellt werden, die

sich autoradiographisch, elektronenmikroskopisch und immunzytochemisch

nachweisen lassen und biochemisch charakterisiert wurden.

Diese Proteoglykane werden in der Literatur als charakteristisch für den

differenzierten Phänotyp der Chondrozyten angesehen. Insbesondere werden dabei

folgende Kriterien angeführt (vgl. auch 1.1.2):

1.) besonders große Mengen an sulfatierten Glykosaminoglykanen (hohe

proteingebundene negative Ladungsdichte), die zu einer metachromatischen

Anfärbung bzw. zu einer ausgeprägten Basophilie bei entsprechenden

histochemischen Färbemethoden führen (3, 66, 81, 82, 101, 137, 139, 186, 197,

216)

63

2.) relativ hochmolekulare Proteoglykane, die sich wiederum zu besonders großen

Aggregaten zusammenlagern, sogenannte Knorpel-( = cartilage) spezifische

Proteoglykane (CS-PG) (11, 12, 46, 59, 79, 129, 131, 133, 136, 139, 207,

208)

3.) eine typische Glykosaminoglykanzusammensetzung (viel sulfatiertes

Chondroitinsulfat, wenig Hyaluronsäure, nur geringe Anteile an Dermatan- und

Keratansulafat) (46, 101, 129, 139, 188, 189, 208).

Wie aber verhalten sich unsere konkreten Untersuchungsergebnisse im Vergleich zu

den Befunden anderer Arbeitsgruppen?

Für unser Chondrozyten-Monolayer-Kulturmodell bilden Kryostatschnitte von

nativem hyalinem Knorpel die In-situ-Kontrolle. Im Bereich der Chondrone zeigt

sich dort eine intensive bläulich-violette Anfärbung bei der Färbung nach Giemsa

und eine deutliche Basophilie bei den Färbungen mit Hämalaun. Die Tatsache, daß

in unseren Gewebeschnitten von nativem Glasknorpel somit die vorbeschriebenen

knorpelspezifischen Proteoglykane nachweisbar sind, entspricht genau den

Erwartungen, die sich aus der Literatur ergeben, und kann als positive In-situ-

Kontrolle gewertet werden.

Nun findet sich das gleiche Färbeverhalten zudem mit gleicher Intensität auch in

unserer Primärkultur P0, d.h. in der Monolayerkultur von bovinen Chondrozyten

nach der Befreiung aus der sie umgebenden Extrzellulärmatrix bis zur 1. Passage

nach einer Woche. Hier ergeben sich nun einige Unterschiede im Vergleich zu

früheren Beobachtungen.

Manning und Bonner (137) waren 1967 die ersten, die Monolayerkulturen aus

humanen adulten Gelenkknorpelzellen erstellten. Sie beschreiben jedoch, daß die

Chondrozyten in der Monolayerkultur kein metachromatisches Material um die

Zellen herum ablagerten. Lediglich wenn die Zellen als „Organkultur“ in Form

eines durch Zentrifugieren frisch isolierter Zellen gewonnenen dreidimensionalen

Zellhaufens gezüchtet wurden, zeigte sich nach Färbung mit Toluidinblau eine

ausgeprägte charakteristische Metachromasie. In unserer Monolayerkultur läßt sich

dagegen in der Primärkultur eindeutig die Synthese und Ablagerung einer für den

differenzierten Chondrozyten charakteristischen metachromatischen

Extrazellulärmatrix nachweisen. Besonders eindrücklich weist dies unsere

P0-Metachromasie-Studie nach. Wie unter 3.1.2 beschrieben, läßt sich mit dem

bloßen Auge an den sieben Präparaten eine von Tag zu Tag zunehmende

metachromatische Färbung feststellen.

64

Mikroskopisch sieht man zunächst ganz spärlich metachromatisch angefärbte

extrazelluläre Matrixablagerungen. Vom ersten bis zum letzten Tag der

Primärkultur nimmt die Menge der abgelagerten Extrazellulärsubstanz und die

Intensität der metachromatischen Färbung stark zu. (Vgl. Abb. 3 a-e, S.41) Es läßt

sich also feststellen, daß hier von den isolierten und dann als Monolayer kultivierten

Chondrozyten eindeutig neu gebildete Proteoglykane abgelagert werden. Dies

verneinen Manning und Bonner für ihre primäre Monolayerkultur. Eine mögliche

Erklärung dieser scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse könnte in folgendem

liegen: Manning und Bonner hielten die Zellen über 90 Tage in Kultur, bevor es zu

einer Infektion durch Bakterien oder Pilze kam. Eine Passage wird in ihrer

Versuchsbeschreibung nicht erwähnt, so daß von einer Primärkultur über drei

Monate hinweg ausgegangen werden kann. Übereinstimmend zeigen die Ergebnisse

unserer Perkonfluenzstudie eine deutliche fibroblastenartige Entdifferenzierung bei

einer Kultivierung der Zellen ohne Passagierung sogar bereits nach weniger als drei

Wochen. Denkbar wäre daher, daß die Autoren die erste Färbung mit Toluidinblau

erst durchführten, als es bereits zu der Entdifferenzierung gekommen war. Insofern

schließen sich die beschriebenen Ergebnisse nicht notwendig aus.

In der Primärkultur wird somit eindeutig metachromatische Matrix neu synthetisiert

und abgelagert. Interessant ist nun zu diskutieren, wie der schmale, schwach

metachromatische bzw. basophile Saum im Ausstrich von bovinen Chondrozyten

unmittelbar nach der Zellisolierung (prä-P0) zu bewerten ist. Manning und Bonner

beschreiben in mit Toluidinblau gefärbten Zellausstrichen frisch isolierter humaner

Knorpelzellen bei einigen Zellen einen ebensolchen Hof von leicht

metachromatischem Material und halten es für „wahrscheinlich nicht entfernte

Matrix“ (137). Es stellt sich die Frage, ob es sich tatsächlich um Matrixreste oder

etwa um von den frisch isolierten Chondrozyten neu synthetisierte Matrix handelt.

Diese Fragestellung ist deshalb von besonderem Interesse, weil es hier letztlich um

die Frage geht, wann die Knorpelzellen mit ihren spezifischen

Stoffwechselleistungen in der Zellkultur beginnen.

Man muß sich vergegenwärtigen, daß eine enzymatische Zellisolierung mittels

Kollagenase etwa einen Tag dauert (Manning und Bonner: 18 Stunden, bei uns: 24

Stunden regulär). Das Einsetzen einer verstärkten Stoffwechselaktivität - anfangs

als Wiedereinsetzen des Chondrozytenstoffwechsels überhaupt angesehen - wäre

daher bei bereits früh in diesem Prozeß freigewordenen Chondrozyten durchaus

denkbar.

65

In einem Zusatzversuch verlängerten wir die Dauer der Kollagenaseinkubation

von 24 auf 42 Stunden. Sollte es sich tatsächlich um Matrixreste handeln, so

sollten diese Reste bei fast doppelter Enzymeinwirkzeit deutlich reduziert werden,

insofern die Reste neben Proteoglykanen auch Kollagen enthielten. Es zeigt sich

hingegen eine genau entgegengesetzte Entwicklung. Das Ausmaß der

Metachromasie nimmt nicht nicht etwa ab. Vielmehr nimmt die Intensität der

bläulich-violetten Färbung zu. Vor allem aber wächst die Anzahl der Zellen mit

einem metachromatischen Saum deutlich an. Entsprechend ist es offenbar eine

Funktion der Zeit, wieviele Zellen nach der Isolierung aus der sie umgebenden

Matrix mit der Synthese knorpelspezifischer Stoffwechselprodukte beginnen. Was

hier bei einer Verlängerung der Inkubationszeit in Kollagenase in dem

anschließenden präkulturellen Zellausstrich plausibel erscheint, wurde für die

Primärkultur anhand der oben beschriebenen P0-Metachromasie-Studie geprüft. Die

Folge der sieben Präparate mit einer Dauer der Primärkultur von ein bis sieben

Tagen zeigt eine von Tag zu Tag zunehmende Metachromasie von einem schmalen

leicht metachromatischen Saum am 1. Tag bis hin zu einer intensiven blau-violetten

Färbung einer die Zellen großflächig umgebenden Interzellularsubstanz am 7. Tag.

Dieser Zusatzversuch macht sehr anschaulich deutlich, in welchem Maß der

Glykosaminoglykanstoffwechsel durch die Isolierung der Knorpelzellen angeregt

wird. Schon mit bloßem Auge kann man an der zunehmenden Blau-Violett-Färbung

der Präparate die enorm zunehmende Stoffwechselaktivität der Chondrozyten

ermessen. Die beschriebene Entwicklung nach der Zellisolierung gemeinsam mit der

Beobachtung bei verlängerter Kollagenaseinkubationszeit legt die Vermutung nahe,

daß die vermehrte Stoffwechselaktivität schon während der Zeit der

Enzymeinwirkung durch die Befreiung aus der Matrix induziert wurde und dann

sukzessive immer mehr Zellen erfaßt. Es ist daher unwahrscheinlich, daß es sich bei

dem Matrixsaum im Zellausstrich prä-P0 - wie von Manning und Bonner

angenommen - um Matrixreste handelt. Ein eindeutiger Beweis der Neusynthese

von Glykosaminoglykanen bereits vor 18 Stunden nach Beginn der

Kollagenaseinkubation wäre z.B. autoradiographisch durch eine Knorpelzell-

isolierung in einer mit 35S-Sulfat angereicherten Kollagenaselösung zu erbringen.

Zeigt der perizelluläre Saum eine Radionuklidanreicherung an, so hat die

Glykosaminoglykansynthese offenbar in vitro stattgefunden. Darüber hinaus wäre

mit dieser weiteren Methode nochmals gezeigt, daß die Chondrozyten in der

Primärkultur auch als Monolayer den differenzierten Phänotyp exprimieren.

66

Im Rahmen der Diskussion der Einzelzell- und Zellverbandsmorphologie wurde

schon erwähnt, daß Chacko, Abbott und S.u.H. Holtzer (34) während der

Primärkultur im Stadium der Präkonfluenz zunächst eine Entdifferenzierung

beschreiben, sowie dann beim Erreichen des Konfluenzstadiums eine

Redifferenzierung. Interessanterweise beobachtet Chacko diese Redifferenzierung

nur, wenn die fibroblastenartig erscheinenden Chondrozyten innerhalb von 7- 10

Tagen die Konfluenz erreichen. Nur dann nehmen sie wieder ihre runde Form an

und lagern eine metachromatische Extrazellulärmatrix ab. Wurden die

morphologisch entdifferenzierten Chondrozyten allerdings länger als 14 Tage in der

Primärkultur gehalten, bevor sie dann Kontakt mit anderen Zellen derselben

Population bekamen, dann nahmen sie weder ihre rundliche Form wieder an, noch

synthetisierten sie Chondroitinsulfat. Die Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Chacko

stimmen insofern mit den unseren überein, als wir beide am Ende der ersten Woche

der Primärkultur im Stadium der Konfluenz eine Population differenzierter

Chondrozyten mit einer neusynthetisierten phänotypisch charakteristischen

metachromatischen Extrazellulärmatrix beschreiben.

Die Ergebnisse der P0-Metachromasie-Studie wiedersprechen hingegen der

Vorstellung von einer zwischenzeitlichen Entdifferenzierung und Redifferenzierung

während der Primärkultur. Auch bevor die Zellen einander berühren, beginnen sie

von Tag zu Tag kontinuierlich zunehmende Mengen klassischer metachromatischer

Extrazellulärmatrix abzulagern. Funktionell kann also keineswegs von einer

Entdifferenzierung während der Primärkultur gesprochen werden. Chacko

beschrieb abgeflachte sternförmige Chondrozyten als morphologisch

entdifferenziert. Aus unseren Beobachtungen erscheint es sinnvoll, den

morphologisch entdifferenzierten Chondrozyten genauer zu definieren. Nicht die

Abflachung an sich scheint das entscheidende Kriterium für die Entdifferenzierung

zu sein, denn zumindest funktionell sind diese Chondrozyten ja ganz offensichtlich

nicht entdifferenziert. Ein klarer morphologischer Hinweis auf die

Entdifferenzierung ergibt sich hingegen aus einer deutlich bipolaren Ausrichtung,

wie wir sie sowohl in höheren Passagen, in denen die Zellen auch funktionell

entdifferenziert erscheinen, als auch bei den als biologische Kontrolle kultivierten

Fibroblasten beobachten. Wir schlagen daher abweichend von der Literatur als

entscheidendendes morphologisches Kriterium für die Entdifferenzierung nicht die

Abflachung, die relative Zytoplasmavermehrung oder ein sternförmiges Aussehen

vor, sondern die bipolare spindelförmige Ausrichtung, d.h. vereinfacht, daß die

Zellen deutlich länger als breit sind. In unseren Versuchen wurde eine deutliche

Bipolarität auch während des präkonfluenten Spreadings nicht vor der ersten

Passage beobachtet.

67

Betrachtet man die Bipolarität als das entscheidende Kriterium für die

morphologische Entdifferenzierung, dann korreliert auch weitgehend der Zeitpunkt

der morphologischen mit dem der funktionellen Entdifferenzierung. Dies ist jedoch

nicht zwingend notwendig (vgl. 136, 140). Auch hat die grundsätzliche Abflachung

mit allen zellbiologischen Konsequenzen zweifelsohne eine wesentlich größere

Relevanz als eine langgestreckte Form, wenn es um Überlegungen eines

ursächlichen Zusammenhangs zwischen der Zellform und der Entdifferenzierung

geht. Diese führten ja auch zu den verschiedenen und durchaus erfolgreichen

Formen der Suspensionskultur (13, 15, 45, 206). Sicherlich wird hier aber auch zu

differenzieren sein zwischen Ursache der bzw. Voraussetzung für die

Entdifferenzierung und dem Zustand der bereits erfolgten Entdifferenzierung.

Jedenfalls aber bleibt von der ersten Passage an in der Präkonfluenz die auffällige

Korrelation zwischen der morphologischen Bipolarität und dem funktionellen

Sistieren der Ablagerung einer metachromatischen Matrix festzuhalten. Interessant

wäre es in diesem Zusammenhang zu wissen, ob die Zellen, die in Chackos

Versuch erst nach 14 Tagen die Konfluenz erreichten und dann kein

Chondroitinsulfat mehr bildeten, ebenfalls und insbesondere von welchem Zeitpunkt

an eine bipolare Ausrichtung zeigten. Die Frage ist also: wann kam es hier zur

Entdifferenzierung?

Neben dem oben behandelten Zeitpunkt des Einsetzens der charakteristischen

Stoffwechselleistungen der Chondrozyten, die ja den differenzieten Phänotyp

widerspiegeln, interessiert vor allem, wann die Knorpelzellen diese wieder

einstellen, denn damit fällt funktionell die Entdifferenzierung zusammen. Bereits

nach der ersten Passage findet sich in den verschiedenen Präparaten noch maximal

ein Hauch von Metachromasie bzw. Basophilie. Mit dem Erreichen der ersten

Subkultur (P1) haben die Knorpelzellen im wesentlichen also schon ihren

differenzierten Phänotyp verloren - zumindest was die Proteoglykane bzw.

Glykosaminoglykane anbelangt. Wie verhält es sich aber diesbezüglich bei den

Kollagenen?

68



Antikörper gegen Kollagen-Typ I und II können als die beiden klassischen

immunzytochemischen Marker für die De- und Redifferenzierung von

Chondrozyten angesehen werden. Als klassisches Charakteristikum für den Verlust

des differenzierten Phänotyps von Chondrozyten wird das Einstellen der Synthese

von Kollagen-Typ II und der Beginn der Produktion von Kollagen-Typ I

beschrieben (6, 11, 12, 19, 43, 58, 60, 66, 101, 115, 133, 136, 139, 140, 160,

186, 188, 189, 197, 207, 216). Bei unserer Anwendung dieser klassischen Marker

bestätigt sich, was die histochemischen Färbungen schon orientierend zeigen: im

Übergang von der Primärkultur P0 zur ersten Subkultur P1 stellen die Knorpelzellen

ihre für sie charakteristische Biosynthese von Kollagen-Typ II ein und beginnen

die Produktion eines Kollagen-Typs der normalerweise charakteristisch für Nicht-

Knorpelgewebe ist: Kollagen-Typ I. Die für Kollagen-Typ II bis zur Primärkultur

beobachtete zweifach positive Immunreaktivität wird nach der ersten Passage

negativ und behält dieses Färbeverhalten bis zum Abbruch der Versuchsreihe nach

der sechsten Passage bei. Für Kollagen-Typ I verhält es sich genau umgekehrt: Bis

zur Primärkultur P0 einschließlich ist die Antikörperfärbung negativ und wird von

der ersten Subkultur P1 an (sogar dreifach) positiv.

Von der Mark (140) beobachtete 1977 an embryonalen Hühnerchondrozyten eine

recht abrupte Umstellung der Synthese von Kollagen Typ II auf Typ I und

bezeichnete dies als „switch“, d.h. also als „Umschalten“ bzw. „An- und

Ausschalten“ wie bei einem Lichtschalter. Er beschrieb, daß die Zahl der

Kollagen-Typ I produzierenden Zellen kontinuierlich zunahm und die derjenigen

mit Kollagen-Typ II-Produktion in gleichem Maße weniger wurde. Dabei zeigte er

sehr eindrücklich anhand einer Doppelfärbetechnik mit Fluoreszein und Rhodamin,

daß nur 1 % der Chondrozyten gleichzeitig die beiden unterschiedlichen

Kollagentypen produzierten, d.h. fast alle Chondrozyten synthetisierten entweder

den einen oder den anderen Kollagentyp. Einen langsamen Übergang in der

Synthese der verschiedenen Kollagene gibt es also offenbar für die Einzelzelle

nicht. Exakt dasselbe Umschalten beobachten wir in unserem Monolayer-

Zellkulturmodell von bovinen Chondrozyten im Übergang von der Primär- zur

ersten Subkultur.

69

Nun stellt sich die Frage: Was ist die Ursache für dieses Umschalten der

Kollagensynthese bzw. - grundsätzlicher formuliert - für die Entdifferenzierung der

Chondrozyten in unserem Zellkulturmodell genau zum Zeitpunkt der ersten

Passage.

Wie unter 1.1.2 erwähnt gibt es eine Vielzahl von Erklärungsversuchen für das

Phänomen der Entdifferenzierung. Ein Zusammenhang mit der Passagierung der

Zellen wurde in der Literatur bislang nicht beschrieben. Die vorliegenden

Ergebnisse bieten die Möglichkeit, den Einfluß der beiden verwendeten

Enzymlösungen (Trypsin und Kollagenase) auf den differenzierten Phänotyp von

Chondrozyten zu beurteilen.

Bei einer Passage werden bekanntlich die konfluenten Zellen mittels Trypsin von

ihrer Unterlage abgelöst, zentrifugiert und verteilt auf mehrere Kulturflaschen neu

ausgesät. Nun läge es nahe anzunehmen, daß dieser erste Vorgang des

Passagierens, d.h. insbesondere der erstmalige Kontakt mit dem vergleichsweise

aggressiven Enzym Trypsin (vgl. 81), die Ursache für die Änderung des

phänotypischen Expressionsverhaltens sei. Tatsächlich beschreibt Benya 1990, daß

durch Trypsin Strukturen der Zelloberfläche geschädigt oder zerstört werden, z.B.

Rezeptoren, die auch an der Genexpression regulatorisch beteiligt sein könnten

(142).

In der Tat konnten wir in einem orientierenden Zusatzversuch (Trypsin-Studie)

zeigen, daß unterschiedliche Einwirkzeiten von Trypsin zwischen 0 und 6 Minuten

ein deutlich unterschiedliches Ausmaß des Umschaltens in der Kollagensynthese

bewirkt: die Dauer der Trypsininkubation korrelierte direkt mit dem Anteil von

Kollagen-Typ-I-positiven Zellen. Der angeführte Versuch hat jedoch nur grob

orientierenden Charakter und entbehrt sowohl einer ausreichenden Fallzahl als auch

einer angemessenen Quantifizierung. Dennoch soll diese orientierende Beobachtung

dazu anregen, diesen Einfluß genauer zu untersuchen. Gegebenenfalls könnte sich

dabei die Empfehlung ergeben, in der Monolayerkultur grundsätzlich auf das zum

Passagieren allgemein übliche Trypsin zu verzichten und zum Preis einer mehrfach

längeren Einwirkzeit auf Kollagenase zu wechseln.

Ist es indes berechtigt, das Trypsin alleine für den Verlust des charakteristischen

Phänotyps verantwortlich zu machen? Zum einen stammen die Präparate mit der

Bezeichnung „P1“ vom Ende (!) der ersten Subkultur. Die Knorpelzellpopulation

ist zu diesem Zeitpunkt also bereits 14 Tage alt. Nach der ersten Passage ist also

wiederum eine Woche Zellkultur vergangen. Zum anderen zeigen bereits die

Präparate der Primärkultur eindeutig, daß die Trypsinexposition die alleinige

Ursache nicht sein kann.

70

Denn bereits in der Primärkultur P0 tauchen die ersten Zellen auf, die eindeutig

negativ für Kollagen-Typ II und dreifach positiv für Kollagen-Typ I sind. (vgl.

Abb. 6a, S. 44). Bereits in der Primärkultur, also vor dem ersten Kontakt mit

Trypsin, schalten die ersten Chondrozyten ihre Kollagensynthese um. Sollte daher

die primäre Inkubation in Kollagenase die Ursache für die Entdifferenzierung sein?

Bei der genauen Betrachtung der Untersuchungsergebnisse fallen zwei

Beobachtungen auf, die gegen diese Annahme sprechen.

1.) Die Inkubation in Kollagenase dient der Isolierung der Chondrozyten aus der sie

umgebenden Extrazellulärmatrix. In der Zeit nach der Isolierung, sprich im

Normalfall in der Primärkultur, zeigen aber alle Chondrozyten zumindest eine

leicht, meist aber eine ausgeprägt positive Immunreaktivität für Kollagen-Typ II.

Diese Beobachtung spricht gegen eine unmittelbar knorpelzellschädigende Wirkung

von Kollagenase.

2.) Ähnlich wie bei der Metachromasie und Basophilie beschrieben (vgl. 4.1.2)

sind nach einer 24-stündigen Inkubation in Kollagenase 10 -30 % der Zellen im

Zellausstrich vor der Primärkultur (prä-P0) Kollagen-Typ II positiv. Wird die

Dauer der Inkubation aber auf 42 Stunden erhöht, so finden sich bis über 50 % der

Knorpelzellen zweifach positiv für Kollagen-Typ II (vgl. Abb. 5 b, S. 43) Die

Anzahl der Zellen, die den charakteristischen differenzierten Phänotyp der

Chondrozyten exprimieren, nimmt somit mit zunehmender Dauer der Inkubation in

Kollagenase sogar noch deutlich zu. Ein knorpelzellschädigender Einfluß der

Kollagenase erscheint daher unwahrscheinlich.

Zusammenfassend wäre also ein die Entdifferenzierung vorantreibender Einfluß des

Trypsins weiter zu prüfen, während der Kollagenase in diesem Zusammenhang

zumindest keine unmittelbare Bedeutung zuzukommen scheint.

Als weitere Beobachtung bestätigt sich auch hier die Arbeitshypothese aus 4.1.2,

daß die Anzahl der den charakteristischen Phänotyp exprimierenden Chondrozyten

eine Funktion der Zeit nach ihrer Isolierung aus der sie umgebenden Knorpelmatrix

ist. Für diese Annahme spricht auch eine zweite Beobachtung: Nach der Inkubation

mit Hyaluronidase erscheint die Grundsubstanz des nativen hyalinen Knorpels

deutlich positiv für Kollagen-Typ II. Das Zytoplasma der Chondrozyten im

Gewebeschnitt ist dagegen unverändert negativ (vgl. Abb. 4 b, S. 42). Früher

herrschte die Vorstellung, daß Knorpelzellen in reifem Gelenkknorpel inaktive,

stoffwechselarme Zellen seien. Inzwischen hat es jedoch bereits Einzug in die

Lehrbücher genommen, daß das Gegenteil der Fall ist.

71

Es wird beschrieben, daß die Knorpelzellen des hyalinen Gelenkknorpels einen sehr

regen Stoffwechsel haben. Elektronenmikroskopisch spiegelt sich diese hohe

Stoffwechselaktivität in einem Reichtum an Mitochondrien und an rauhem

endoplasmatischen Retikulum sowie einem großen Golgi-Apparat wieder (3, 30,

91). Diese hohe Stoffwechselaktivität ist für den ständigen Umsatz der

Extrazellulärmatrix auch im reifen Gelenkknorpel erforderlich (175). Eine Störung

dieses Gleichgewichts zwischen kontinuierlichem Auf- und Abbau der

Matrixbestandteile ist ein entscheidender pathogenetischer Gesichtspunkt in

Überlegungen zur Entstehung von degenerativen Gelenkerkrankungen (24, 75, 98,

121, 166, 193, 185 u.a.). „Ruhende“ Zellen im Sinne von stoffwechselinaktiven

Knorpelzellen scheinen die Chondrozyten des Gelenkknorpels demzufolge im

Normalfall nicht zu sein. Dennoch kann man sie offenbar in einem Zustand

antreffen, in dem sie gerade kein Kollagen-Typ II produzieren. Denn

intrazytoplasmatisch, wo die Kollagensynthese ablaufen müßte, ist kein

Kollagen-Typ II darstellbar, wie es ja hingegen in der Primärkultur der Fall ist.

Entweder die Kollagen-Typ II-Produktion verläuft also diskontinuierlich, oder aber

die entsprechende Synthese verläuft kontinuierlich, aber auf so niedrigem Niveau,

daß sie unserer immunzytochemischen Darstellung entgeht. So beziffert R. Putz die

Halbwertszeit der zellulären und extrazellulären Anteile des Knorpels mit 800-1000

Tagen (14). In jedem Fall aber scheint die Befreiung der Chondrozyten aus der sie

umgebenden Extrazellulärmatrix ein Stimulus zu sein, der sie innerhalb von

Stunden bis Tagen in überaus stoffwechselaktive Zellen verwandelt. Diese

Beoachtung hatten wir bereits bei der P0-Metachromasie-Studie gemacht (vgl.

4.1.2). Da diese Zunahme der für den hyalinen Knorpel charakteristischen

Stoffwechselaktivität nach der Isolierung der Zellen aber selbst in Kollagenase-

lösung zunimmt, kann - wie oben bereits festgestellt - die Inkubation in eben dieser

Lösung schwerlich Ursache für den Verlust der Expression des knorpelspezifischen

Phänotyps sein.

72


In der Primärkultur boviner Chondrozyten zeigt sich für Kollagen-Typ III und

Typ V ein buntes Bild. Von Zelle zu Zelle finden sich sehr unterschiedlich intensive

Anfärbungen. Für Kollagen-Typ III liegt die Färbeintensität zwischen nahezu

negativ bis stark positiv (+++), für Kollagen-Typ V zwischen ein- bis dreifach

positiv (In diesem Fall bewirkt die Mittelung der Intensitäten der Immunreaktivität

über der Gesamtheit der Zellen pro Population wie bereits erwähnt einen deutlichen

Verlust an Aussagekraft in der synoptischen Darstellung unter 3.4, daher das

Sternchen [* ]). Im Zellausstrich prä-P0 hingegen zeigen sich nur ganz vereinzelt

Zellen, die positiv für Kollagen-Typ III sind, während fast alle Chondrozyten eine

ein- bis zweifach positive Reaktion für Typ V aufweisen. Nach der ersten Passage

ist das Bild für beide Antikörper dagegen recht homogen: mit nur unwesentlichen

Intensitätsunterschieden zeigen sich nahezu alle Zellen zweifach positiv, wobei

Kollagen-Typ V tendenziell etwas intensiver gefärbt ist (vgl. Abb. 7, S. 45).

Bei Kenntnis der Literatur läßt dieses Ergebnis zuerst an eine Fehlbestimmung

denken. Man würde erwarten, daß die Färbungen für Kollagen-Typ III und V als

„Nicht-Knorpel-Kollagene“ genauso wie für Kollagen-Typ I bis zur Primärkultur

negativ sind und hätte ab der ersten Subkultur mit einer positiven Immunreaktivität

gerechnet. Wodurch jedoch eine Fehlbestimmung etwa durch Verwechslung von

Antikörpern quasi ausgeschlossen ist, möchte ich in einer kurzen Fehlerdiskussion

ausführen.

Jede der Antikörperfärbungen ist parallel am gleichen Tag wie auch in der Folge an verschiedenen Tagen

durchgeführt worden. Parallel am gleichen Tag, das bedeutet mit anderen Schnitten bzw. Zellpopulationen

von unterschiedlichen Individuen auf anderen Objektträgern, jedoch mit identischen Färbelösungen. In

der Folge an verschiedenen Tagen, d.h. mit entsprechend neu angesetzten Lösungen. Eine Verwechslung

der Schnitte, eine Fehlbeschriftung der Objektträger oder eine Inkubation mit einem falschen Antikörper

sind daher unwahrscheinlich. Bei erneuter Versuchsdurchführung mit neuen Schnitten bzw.

Zellpopulationen von anderen Individuen unter peinlich genauer Beachtung und Kontrolle der

Beschriftung der Objektträger und der entsprechenden Antikörperinkubation erhielten wir die gleichen

Ergebnisse. Eine unspezifische Anfärbung durch eine endogene Gewebeperoxidase oder eine

unspezifische Bindung der Kaninchen-Zweitantikörper ist ausgeschlossen. Die Hemmung der endogenen

Peroxidase durch 1%iges H2O2 in Methanol sowie die Abdeckung unspezifischer Bindungsstellen durch

normales Kaninchenserum erfolgte protokollgemäß. Zudem waren die entsprechenden Kontrollen K1 und

K2, die simultan in der gleichen Küvette in DAB entwickelt wurden, zweifelsfrei negativ.

73

Eine zusätzliche Kontrolle war dadurch gegeben, daß die verwendeten 4- bzw. 8-Kammer-Lab-Teks die

gleichzeitige Anfärbung von 4 bis 8 getrennten Populationen auf einem Objektträger erlauben. Dabei

wurden sowohl Populationen von verschiedenen Passagen (z.B.P0/ P1/ P3) als auch unterschiedliche

Zellarten (Chondrozyten/ Fibroblasten) streng getrennt also ohne Kontaminationsmöglichkeit auf

einem Objektträger kultiviert und dann aufgearbeitet. Jegliche Unregelmäßigkeit der Färbeergebnisse

innerhalb des Kulturverlaufs einer Zellpopulation oder innerhalb der gleichen Subkultur bei

verschiedenen Populationen hätte somit beim Vergleich auffallen müssen.

Da wir pro Antikörper nur mit einer Charge gearbeitet haben, wäre theoretisch (!) ein Verpackungs- oder

Beschriftungsfehler durch die Hersteller denkbar, da alle Versuche in diesem Falle durchweg mit dem

falschen Antikörper durchgeführt worden wären. Dann aber hätte der fälschlich z.B.als „ Goat-Anti-

Type-V-Collagen“ bezeichnete Antikörper keiner der damals käuflichen fünf Ziegenantikörper (gegen die

Kollagen-Typen I, II, III, IV und V) sein können. Denn Antikörper gegen Typ IV färben nur das Kollagen

von Basalmembranen und zeigten sich in Vorversuchen wie erwartet negativ für Chondrozyten und

Fibroblasten. Die übrigen Antikörper haben wir alle durchgehend verwendet, konnten jedoch kein

identisches Verteilungsmuster der Immunreaktivitäten für zwei nominell unterschiedlich Antikörper

feststellen. Insgesamt ist eine wirkliche Verwechslung der Antikörper also praktisch nicht möglich.

Leider werden auch weiterhin außer dem inzwischen zusätzlich verfügbaren Anti-Kollagen-Typ VI keine

weiteren Antikörper gegen die übrigen der 14 bekannten Kollagene angeboten. Insbesondere ein Anti-

Kollagen-Typ XI hätte Aufschluß über das jetzt leider nur spekulativ klärbare Färbeverhalten geben

können.

Wie in der Einleitung bereits dargestellt, besitzen die „Knorpel-Kollagene“ der

Gruppen I und III jeweils homologe Gegenstücke unter den „Nicht-Knorpel-

Kollagenen“. Das dem Kollagen-Typ V entsprechende Knorpel-Gegenstück ist das

Kollagen-Typ XI. Die Kollagene Typ V und XI sind sich gemäß der Literatur in

Struktur und Funktion sehr ähnlich. Denkbar wäre hier daher die Möglichkeit einer

ausgeprägten Kreuzreaktivität. In diesem Falle läge es nahe anzunehmen, daß beim

Übergang von der relativ homogenen Anfärbung in dem prä-kulturellen Ausstrich

prä-P0 über das „bunte Bild“ in der Primärkultur P0 zur homogenen Anfärbung in

der ersten Subkultur P1 möglicherweise ein Umschalten vom als Knorpel-Kollagen

bekannten Typ XI auf das bisher als Nicht-Knorpel-Kollagen angesehene Typ V

erfolgt. Ein vergleichbares Verhalten finden wir ja bei den analogen Kollagenen

Typ II und I, bei denen es zu einem Umschalten von der Primär- zur ersten

Subkultur kommt. Eine sichere Klärung dieser Frage wäre erst durch die

Anwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Kollagen-Typ XI zu erreichen.

Bedauerlicherweise sind diese jedoch bisher nicht käuflich zu erwerben. Auf

Anfrage war von der Herstellerfirma zu erfahren, daß bei der Prüfung der Spezifität

der Anti-Kollagen-Typ-V-Antikörper leider auch keine Prüfung auf Kreuzreaktivität

mit Kollagen-Typ XI erfolgte.

74

Somit sind unsere Ergebnisse bezüglich des Nachweises von Kollagen-Typ V in

hyalinem Knorpel und Chondrozyten unter dem Vorbehalt zu betrachten, daß eine

Kreuzreaktivität mit Kollagen-Typ XI denkbar wäre.

Für Kollagen-Typ III gibt es kein spezielles auf seine Kreuzreaktivität

möglicherweise ungeprüftes Analogon, wie es der Kollagen-Typ V in dem Typ XI

hat. Desweiteren würde es überraschen, nur bei einem der vier verwendeten Anti-

Kollagen-Antikörper eine derart ausgeprägte unspezifische Färbung zu finden. Wo

eine Zellpopulation für Kollagen-Typ I oder II negativ ist, zeigt sich dort kein

Anhalt für eine unspezifische Grundtönung. Wie in der Fehlerdiskussion bereits für

Anti-Kollagen-Typ V ebenso auch für Anti-Kollagen-Typ III gültig besprochen,

wurde eine unspezifische Färbung zudem durch die beiden Kontrollen K1 und K2

ausgeschlossen. Jedoch nicht nur die Zellen des Zellausstrichs prä-P0 und der

Primärkultur P0 zeigen eine positive Reaktion für Kollagen-Typ III, auch die

Chondrone der Gefrierschnitte von hyalinem Knorpel zeigen eine schwache, aber

deutlich positive Immunreaktivität. Es ist daher anzunehmen, daß hier tatsächlich

ein bestimmtes Antigen mit dem verwendeteten „Kollagen-Typ III“-

Immunglobulinen nachgewiesen wird. Da diese Antikörper aber durch Injektion von

gereinigetem Kollagen-Typ III aus humanen und bovinen Plazentarvilli

gewonnen wurden und auf ihre Spezifität vom Hersteller an Kollagen-Typ III

geprüft wurden, liegt es selbst bei Kenntnis der Literatur nahe, daß das

nachgewiesene Antigen nichts anderes als tatsächlich Kollagen-Typ III ist.

Weshalb würde man ausgehend von der Literatur für hyalinen Knorpel und daraus

isolierten Chondrozyten keinen Nachweis von Kollagen-Typ III oder V erwarten?

Miller und Gay stellen 1987 unter den faserbildenden Kollagenen die

Typen I, III und V als Kollagene von Nicht-Knorpelgewebe den

„Knorpelkollagen-Typen“ II und K (heute als Typ XI bezeichnet) gegenüber (147,

vgl. Tab. 1). Auch van der Rest und Garrone, 1991, sehen „eine dichotome

Sicht von zwei Systemen“ sich abzeichnen, „eines um Kollagen-Typ I verbunden

mit Typ III und V und das andere um Kollagen-Typ II verbunden mit Typ XI“

(176). Heißt das nun definitiv, daß man davon ausgeht, daß die Kollagen-

Typen III und V nicht in hyalinem Knorpel vorkommen? Beide Arbeitsgruppen

legen zwar diese Zweiteilung der Kollagene in solche von Knorpel- auf der einen

und von Nicht-Knorpelgewebe auf der anderen Seite nahe. Sie schließen aber ein

Vorkommen von Kollagen-Typ III und V im hyalinen Knorpel nicht kategorisch

aus. Explizit erfolgt ein solcher Ausschluß nur in der anderen Richtung: für das

Vorkommen von Knorpelkollagenen in Nicht-Knorpelgewebe.

75

Auch da formulieren Miller und Gay noch vorsichtig: „ (...) 4 der 11 (1987

bekannten [Anmerkung des Autors]) Kollagene sind hauptsächlich, wenn nicht

ausschließlich, im hyalinen Knorpel oder knorpelartigen Geweben abgelagert (...)“

(147). Burgeson, 1988, drückt es entschiedener aus, aber ebenfalls mit dem Blick

in obige Richtung: „Die Typen II und XI sind auf Knorpelgewebe beschränkt.“(28)

Schon die Erstbeschreiber des Kollagen-Typ II Miller und Matukas hatten 1969

dieses Kollagen als „in Knorpel, nicht aber in Knochen und Haut vorhanden“

beschrieben (148). Der hyaline Knorpel wurde zwar um „knorpelartige Gewebe“

wie den Nucleus pulposus der Bandscheibe und das Corpus vitreum des Auges

ergänzt. In dieser Form ist die auf Knorpel beschränkte Verteilung des Kollagen-

Typ II jedoch wiederholt bestätigt worden (58, 141, 161).

Später kamen dann zwei weitere knorpelspezifische Kollagene hinzu. Der Kollagen-

Typ XI war anfangs als 1α2α3α-Kollagen oder Kollagen-Typ K bekannt

(Burgeson und Hollister, 1979 in 147). Kollagen-Typ IX war Anfang der achtziger

Jahre von verschiedenen Arbeitsgruppen um Schimokomaki, Ayad und Reese

zunächst in Form Pepsin-unlöslicher Fragmente in einer verwirrenden Vielzahl von

Bezeichnungen beschrieben worden. Erst die Arbeitsgruppen um Ninomiya, M.

von der Rest, Mayne und Olsen konnten 1984/85 gemeinsam zeigen, daß es sich

um Fragmente eines einzigen neuen Kollagentyps handelte. Sie nannten ihn

Kollagen-Typ IX (147). Alle drei Kollagentypen (II, IX und XI) werden also

übereinstimmend als knorpelspezifisch angesehen. Das bedeutet, daß diese

sogenannten Knorpelkollagene nicht in Nicht-Knorpelgewebe vorkommen.

Allerdings heißt das nicht automatisch, daß die Autoren umgekehrt davon ausgehen,

daß Nicht-Knorpelkollagene nicht zusätzlich zu den Knorpelkollagenen auch in

hyalinem Knorpel vorkommen könnten. Diesbezüglich fand sich keine definitive

Aussage in der Literatur. Auf der anderen Seite hat bisher noch niemand das

Vorkommen der Kollagen-Typen III und V in hyalinem Knorpel berichtet. Unter

dem obengenannten Vorbehalt, daß eine Kreuzreaktivität mit Kollagen-Typ XI

noch auszuschließen ist, beschreibe ich daher hiermit als einer der ersten das

Vorhandensein und die Synthese der normalerweise in Nicht-Knorpelgewebe

gefundenen Kollagen-Typen III und V in hyalinem Gelenkknorpel und daraus

isolierten Chondrozyten.

Bei der Reaktion mit Kollagen-Typ III wie Typ V fällt in der Primärkultur auf, daß

die Intensität der Immunopositivität enorm schwankt („buntes Bild“). Manche

Zellen reagieren nur sehr schwach, andere dagegen sehr ausgeprägt mit den

Antikörpern. Dies legt das Vorliegen von verschiedenen Subpopulationen nahe, die

in verschiedenem Maße die genannten Kollagentypen synthetisieren.

76

Auch in dem Zellausstrich prä-P0 beobachten wir zwar für Kollagen-Typ III, daß

nur manche Chondrozyen mit den Antikörpern reagieren und ein Großteil keine

Reaktion zeigt. Dieses Phänomen hatten wir jedoch auf die unterschiedliche Latenz

bis zur aktiven Expression des charakteristischen Phänotyps nach der Befreiung aus

der Extrazellulärmatrix zurückgeführt. Dabei beträgt diese Latenzzeit bei den

anderen histochemisch oder immunhistochemisch nachgewiesenen

Biosyntheseprodukten maximal wenige Tage. Zumindest für die

Glykosaminoglykane und die beiden anderen Kollagentypen I und II ergab sich

zum Zeitpunkt der Färbung der Primärkultur P0, d.h. nach sieben Tagen

Monolayerkultur, ein homogenes Bild. Daher wäre es bei dem bunten Bild selbst

noch in der Primärkultur durchaus denkbar, daß in der P0 verschiedene

Subpopulationen von Knorpelzellen vorliegen, die zwar alle Kollagen-Typ II, aber

in unterschiedlichem Ausmaß auch Typ III und V synthetisieren.

Dabei müssen mindestens die drei folgenden unterschiedliche Möglichkeiten

erwogen werden.

1.) Es handelt sich um echte Chondrozytensubpopulationen, die sich jedoch nur

durch den Zeitpunkt des Einsetzens der vermehrten Stoffwechselaktivität oder durch

eine verfrühte Entdifferenzierung unterscheiden.

Das bunte Bild ergibt sich aus Knorpelzellen, die nach der Befreiung aus der

Extrazellulärmatrix erst verspätet beginnen, den charakteristischen Phänotyp zu

exprimieren (d.h. zum Teil länger als eine Woche dazu benötigen) und/oder einer

verfrühten Entdifferenzierung unterliegen. In letzterem Fall sähe man das Kollagen-

Typ III also nicht als in hyalinem Knorpel regulär vorkommendes Protein sondern

bereits als Entdifferenzierungsprodukt an.

Eine verspätete Aktivierung des Stoffwechsels für diesen speziellen Kollagentyp ist

zwar aufgrund der etwa gleich langen Latenzzeit für die anderen

Stoffwechselprodukte (s.o.) unwahrscheinlich, aber nicht unmöglich. Ebenso kann

man eine im Vergleich zur Expression der Kollagen-Typen II und I sowie der

Glykosaminoglykane verfrühte Entdifferenzierung nicht ausschließen, wenn sie

auch nicht wahrscheinlich ist. In diesem Fall wäre Kollagen-Typ III als ein

besonders empfindlicher Marker für die Entdifferenzierung anzusehen, da die

Chondrozyten unter entsprechenden Kulturbedingungen offenbar zuerst mit einer

für sie untypischen Kollagen-Typ III-Synthese beginnen. In diesem Falle müßte

man jedoch die zwar nur leichte, aber doch deutlich positive Immunreaktivität der

Chondrone in den Gefrierschnitten von hyalinem Knorpel als unspezifische

Reaktion ansehen (was de facto durch die negativen Kontrollen K1 und K2

ausgeschlossen ist). Eine derart ausgeprägte unspezifische Kreuzreaktivität würde

einen Antikörper indes als besonders empfindlichen Marker disqualifizieren.

77

2.) Es handelt sich zwar um eine echte Mischpopulation, jedoch nicht aus

verschiedenen Chondrozytenpopulationen, sondern aus Knorpelzellen und Nicht-

Knorpelzellen. D.h. es liegt eine Kontamination mit Synoviozyten, Osteoblasten

oder Fibroblasten aus dem Perichondrium vor, die quasi fälschlich in dem Ausstrich

prä-P0 und in der Primärkultur P0 von Chondrozyten eine partielle

Immunopositivität für Kollagen-Typ III vortäuschen.

Das Problem der Überwucherung durch Fibroblasten bildete früher bei der

Erstellung von Knorpelzellkulturen aus embryonalem Hühnerknorpel ein

Hauptproblem (124). Dabei wurde der Knorpel meist aus dem Brustbein oder aus

Extremitätenknospen von Hühnerembryonen entnommen. Die Überwucherungs-

theorie stellte sogar einen Erklärungsversuch für die Entdifferenzierung von

Knorpelzellen in Kultur dar (27, 160, 198). Extrinsische Perichondriumzellen

unterdrückten die phänotypische Expression von embryonalen Hühner-

chondrozyten in Kultur (198). Der Gelenk(!)knorpel von Säugetieren ist jedoch

nicht nur avaskulär und damit frei von jedem fibrovaskulären Begleitgewebe (124,

191), sondern ist auch von keinem Perichondrium überzogen (14, 16). Hyaliner

Gelenkknorpel ist neben der Linse des Auges das einzige Gewebe des menschlichen

Körpers, das nur aus einer einzigen Zellart aufgebaut ist (64, 124). Der

Gelenkknorpel ist also optimal geeignet, um echte Reinkulturen einer einzigen

Zellart zu gewinnen. Wie ausführlich unter 2.1.1 beschrieben, wurde äußerste

Sorgfalt darauf gelegt, bei der Probenentnahme jegliche Kontamination mit

subchondralen Knochen oder angrenzender Synovialmembran zu verhindern.

Etwaige an der Knorpeloberfläche haftende Synoviozyten wurden mit der

Synovialflüssigkeit mittels steriler Kompressen entfernt und schließlich durch das

wiederholte Spülen mit Pufferlösung sicher beseitigt. Was darüber hinaus eine

Verunreinigung durch Fibroblasten vollends unwahrscheinlich macht, sind zwei

Tatsachen:

a.) In gleicher Weise wie es Manning und Bonner (137) für ihre Primärkultur von

humanen Chondrozyten beschreiben, finden sich auch bei uns in den ersten 48

Stunden keine Zellen, die ein ausgeprägtes Spreading zeigen, was für Fibroblasten

bekanntlich nach wenigen Stunden charakteristisch ist. Zudem hätten dann gerade

die in dem Zellausstrich prä-P0 bereits immunopositiven Zellen ein ausgeprägtes

Spreading zeigen müssen. Eine solche Korrelation ist indes nicht zu beobachten.

b.) Die beschriebenen Zellen sind nur für Kollagen-Typ III und - falls die Zellen

identisch sein sollten - eventuell noch für Kollagen-Typ V positiv. Kollagen-Typ I

aber konnte in dem präkulturellen Zellausstrich prä-P0 überhaupt nicht und in der

Primärkultur P0 nur ganz vereinzelt nachgewiesen werden.

78

Unsere biologischen Kontrollen aber zeigen: von einem Fibroblasten wäre zu

erwarten, daß er sich mit Anti-Kollagen-Typ I deutlich positiv anfärbt. Denn zu

jedem Zeitpunkt der Kultur von bovinen Fibroblasten, sowohl von straffen wie von

lockerem Bindegewebe, war die positive Immunreaktivität für Kolagen-Typ I am

stärksten.

Eine Verunreinigung durch Nicht-Knorpelzellen erscheint also sehr

unwahrscheinlich.

3.) Es handelt sich um echte Chondrozytensubpopulationen, die auch in situ

Kollagen-Typ III synthetisieren und für die leichte Immunopositivität des hyalinen

Knorpels für Kollagen-Typ III in der In-situ-Kontrolle verantwortlich sind.

Tatsächlich werden in Abhängigkeit von den verschiedenen Zonen des

Gelenkknorpels (dünne oberflächliche oder tangentiale Schicht, mittlere oder

Übergangsschicht, tiefe Radiärschicht und schließlich kalzifizierte Schicht [7, 41])auch unterschiedliche Subpopulationen von Knorpelzellen mit voneinander

abweichenden charakteristischen Biosyntheseprofilen beschrieben. Aydelotte und

Mitarbeiter (9) isolierten 1990 Chondrozyten aus verschiedenen Tiefen des

Gelenkknorpels. Sie beschreiben, wie die Zellen unter gleichen Kulturbedingungen

in Agarose-Kultur ihre für die jeweilige Schicht charakteristischen metabolischen

Unterschiede beibehalten. Sie beziehen sich dabei insbesondere auf den Anteil an

Keratansulfat von der Gesamtheit der Glykosaminoglykane. Solch eine

unterschiedlich ausgeprägte Synthese für verschiedene Chondrozyten-

subpopulationen wäre auch für die Kollagen-Typen III und V denkbar.

Einschränkend muß dabei jedoch angemerkt werden, daß sich in unseren

Gewebeschnitten keine differenzielle Verteilung der Immunopositivität für

Kollagen-Typ III oder V in Abhängigkeit von dem Abstand zu der natürlichen

Knorpeloberfläche zeigt.

Betrachtet man die Immunreaktivitäten für Kollagen-Typ III und V über den

gesamten Kulturverlauf, dann fällt in jedem Fall beim Übergang von der

Primärkultur P0 zur ersten Subkultur P1 eine deutliche Änderung im

Antigenexpressionsverhalten der Chondrozyten auf. Bei beiden wandelt sich ein

buntes Bild unterschiedlicher Intensitäten in eine gleichmäßige etwa zweifach

positive Anfärbung. (Durch die Mittelung der Intensitäten in der synoptischen

Darstellung unter 3.4 entstünde übrigens ohne das Sternchen (*) der Eindruck, als

fände für Kollagen-Typ V überhaupt kein Wandel statt.). Für Kollagen-Typ III ist

dieser Wandel mit einer Zunahme der mittleren Färbeintensität verbunden, d.h. es

wird insgesamt mehr Antigen synthetisiert.

79

Für Kollagen-Typ V bleibt die mittlere Färbeintensität erhalten. Manche Zellen

synthetisieren also mehr Antigen, andere jedoch weniger. Ab der ersten Subkultur

produzieren somit alle Zellen eine etwa gleich große Menge von Antigenen, die sich

durch Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V darstellen lassen. Es fällt auf, daß

dieser Wandel im Antigenexpressionsverhalten genau zu demselben Zeitpunkt im

Verlauf der Kultur stattfindet wie auch bei den Kollagen-Typen I und II sowie bei

der Metachromasie bzw. Basophilie der Glykosaminoglykane.

Zusammenfassend läßt sich sagen: Wenn auch nicht so eindeutig wie bei den

Kollagen-Typen I und II, so findet doch ebenso bei den Kollagentypen III und V

ein Umschalten im Biosyntheseprogramm beim Übergang von der Primär- zu der

ersten Subkultur statt. Bei den bisher als Marker gebräuchlichen Kollagen-Typen I

und II erfolgt ein vollständiges An- bzw. Abschalten: Synthese ja oder nein. Beim

Übergang zur ersten Passage wird Kollagen-Typ II „abgeschaltet“ und die Typ I-

Produktion „angeschaltet“. Bei den Kollagen-Typen III und V erfolgt ein

Umschalten von einer in verschiedenen Chondrozytenpopulationen offenbar

unterschiedlichen Syntheseaktivität in eine für alle Zellen gleich starke

Antigenproduktion. In diesem Sinne sind die Chondrozytenpopulationen offenbar

„gleichgeschaltet“ worden. Zudem ist die Synthese von Kollagen-Typ III von einer

mittleren Produktionsstufe „1“ auf „2“ „hochgeschaltet“ worden, um das Bild von

Klaus von der Mark zu modifizieren. Inwieweit bei der Immunreaktivität für

„Kollagen-Typ V“ evt. auch ein Umschalten von initial tatsächlichem Kollagen-Typ

XI auf tatsächliches Kollagen-Typ V erfolgt, läßt sich wie gesagt mit den z.Z.

erwerblichen Antikörpern letztlich nicht eindeutig klären.

80

4.2.3 S-100, S-100-α ,S-100-β

Für das S-100-Protein findet sich im gesamten Verlauf der Kultur keine Änderung

in der Antigenexpression. Vom Gewebeschnitt über den präkulturellen

Zellausstrich prä-P0 und die Primärkultur P0 bis hin zur 6. Passage sind die

Chondrozyten durchweg dreifach positiv gefärbt (vgl. Abb. 9 a-c, S. 47). Beim

Übergang von der Primär- zur ersten Subkultur hatten wir in den histochemischen

Färbungen ein deutliches Nachlassen in der knorpelspezifischen

Glykosaminoglykansynthese beschrieben. Da das S-100-Protein nach der ersten

Passage keine solche Änderung in der Immunreaktivität zeigt, muß die These von

Karabela-Bouropoulou (92) in Frage gestellt werden. Er hatte 1988 darüber

spekuliert, ob S-100 möglicherweise an einem zellulären Kontrollmechanismus

beteiligt sei, der die Glykosaminoglykan-Kollagen-Wechselwirkungen reguliert. In

diesem Fall wäre zumindest ein Rückgang der Immunopositivität für S-100 zu

erwarten gewesen. Dies ist aber insbesondere nach der 1. Passage nicht der Fall. Da

das Antigenexpressionsverhalten sich bei der Entdifferenzierung zwar für die

spezifischen Hauptsyntheseprodukte der Chondrozyten (Kollagen-Typ II und

knorpelspezifische Proteoglykane) ändert, nicht aber für das S-100-Protein, scheint

dieses saure Protein nicht charakteristisch für den differenzierten

Chondrozytenphänotyp zu sein.

Die Arbeitsgruppe um die Japaner Haimoto und Kato (67) beschreibt hingegen eine

differenzielle Verteilung der Untereinheiten des S-100-Proteins für

Chondrozyten (+) und Fibroblasten (-). Tatsächlich zeigt sich auch bei uns für eine

dieser beiden Untereinheiten ein charakteristischer Wandel im Antigenexpressions-

verhalten beim Übergang von der Primär- zur ersten Subkultur. Die β-Untereinheit

ist über die erste Passage hinaus unverändert zwei- bis dreifach positiv in ihrer

Immunreaktivität. S-100-α dagegen wird von der ersten Subkultur an deutlich

weniger nachweisbar und nimmt bei den folgenden Passagen kontinuierlich ab, bis

schließlich keine Reaktion mehr zu beobachten ist. Auch die In-situ-Kontrolle legt

nahe, daß die Expression der α-Untereinheit charakteristisch für den differenzierten

Phänotyp des Chondrozyten ist. Nach der Demaskierung der Epitope mittels

Hyaluronidase wird eine zwei- bis dreifach positive territoriale Anfärbung für

S-100-α sichtbar. Diese Verteilung entspricht derjenigen der Metachromasie bzw.

der Basophilie in den histochemischen Färbungen und somit den durch Giemsa

bzw. Hämalaun nachgewiesenen knorpelspezifischen Proteoglykanen.

81

Das wiederum läßt die von Karabela-Bouropoulou diskutierte These in einem neuen

Licht erscheinen. Es wäre denkbar, daß S-100-a0 an dem von ihm genannten

zellulären Kontollmechanismus bei der Regulation zwischen Glykosaminoglykanen

und Kollagen beteiligt ist. Als S-100-a0 wird die Form des dimeren S-100-Proteins

bezeichnet, die nur aus zwei α-Untereinheiten besteht (αα). Die beiden anderen

Formen, S-100-a (αβ) und S-100-b (ββ) bestehen jeweils aus mindestens einer

β-Untereinheit (Isobe et al. in 67, 68, 93, 94). Die Antikörpergewinnung gegen

S-100 erfolgt jedoch zumeist und so auch bei uns durch Immunisierung gegen

S-100-Protein aus Rinderhirn. Dieses besteht aber fast ausschließlich aus S-100-a

und S-100-b. Daher wird mit derart gewonnenen Antikörpern quasi kein S-100-a0

nachgewiesen (68). Die von uns verwendeten Immunglobuline gegen S-100-αweisen im Gegensatz zu denen gegen S-100 gerade diese S-100-a0-Form nach,

eben weil sie aus zwei α-Untereinheiten besteht. Es wäre also denkbar, daß unsere

Antikörper gegen S-100-α speziell die S-100-a0-Form des S-100-Proteins

nachweist. Unabhängig davon, ob das mutmaßliche S-100-a0 tatsächlich

regulatorische Aufgaben wahrnimmt, scheint es jedenfalls vorwiegend extrazellulär

zu liegen und zwar vorwiegend im Bereich der Chondrone, wo auch die

knorpelspezifischen Proteoglykane abgelagert sind.

Beim S-100-β fällt eine im Gegensatz zur α-Untereinheit vor allem auch

intrazelluläre Verteilung auf. Wissend, daß unsere S-100-Antikörper vornehmlich

durch Immunisierung mit S-100-a und -b (αβ bzw.ββ) gewonnen werden,

überrascht es nicht, daß die Verteilung der Immunreaktivität für S-100 und seine

β-Untereinheit einander entsprechen. Beide zeigen neben einer positiven Anfärbung

der Territorien intrazellulär eine perinukleär verdichtete braune Granulierung. Wie

bereits erwähnt, ändert sich im Gegensatz zu der von S-100-α bei diesen beiden

diese Immunreaktivität nicht im Zuge der Entdifferenzierung zu fibroblastenartigen

Zellen. Auch hier zeigt sich, daß die resultierenden Zellen zwar den Fibroblasten

ähnlicher werden, aber durchaus nicht mit ihnen identisch sind. Haimoto und

Mitarbeiter beschreiben die Fibrozyten im Gegensatz zu den für S-100-α- und

-β-positiven Chondrozyten in beiden Fällen als negativ (67). Das entspricht

annähernd unseren Ergebnissen der bovinen Fibroblasten als biologische Kontrolle,

die sich für S-100-α als negativ (vgl. Abb.12, S. 53) und für S-100-β lediglich als

ganz schwach positiv (+) zeigen. Auf die biologische Kontrolle zu den

Chondrozyten möchte ich im kommenden Abschnitt gesondert eingehen.

82


Das Wachstumsverhalten der Fibroblasten ist im Vergleich zu dem der

Chondrozyten derart andersartig, daß Manning und Bonner das Fehlen eines

solchen Verhaltens als Ausschlußkriterium für die Kontamination durch

Fibroblasten anführen (137). Schon unter 4.1.1 wurde angedeutet, daß

Fibroblasten zur Abgrenzung gegen differenzierte Chondrozyten insbesondere drei

Charakteristika zeigen:

1.) rasches Spreading nach Adhäsion der Zellen innerhalb weniger Stunden

2.) lang-gestreckte spindelförmige Einzelzellmorphologie mit amöboider

Beweglichkeit und

3.) kettenförmiges Wachstum in der Präkonfluenz und eine fischzugartige bis

wirbelförmige Zellverbandsmorphologie in der Konfluenz.

Fibroblasten zeigen weder eine Metachromasie in der Färbung nach Giemsa noch

eine ausgeprägte Basophilie in den Färbungen mit Hämalaun.

Für die histochemischen wie für die immunzytochemischen Färbemethoden fällt

auf, daß keine Änderung des Antigenexpressionsverhaltens während der gesamten

Zellkultur vom Zellausstrich frisch isolierter Zellen bis hin zur 2. Subkultur zu

beobachten ist. Die In-situ-Kontrollen für Kollagen Typen I und III zeigen eine

relativ schwache, aber positive Immunreaktivität. Die Fibroblasten zeigen als Nicht-

Knorpelzellen wie auch in der Literatur beschrieben keine Immunreaktivität für

Kollagen-Typ II (vgl. 28, 58, 141, 147, 161). Alle Fibroblasten bieten eine

positive Reaktion für Kollagen-Typ I (vgl. Abb. 11, S. 51), während sich für

Kollagen-Typen III und V jeweils ein buntes Bild unterschiedlicher

Färbeintensitäten zeigt. Wie für die differenzierten Knorpelzellen wären hier

Mischpopulationen oder auch verschiedene Funktionszustände zu diskutieren.

In gleicher Weise zeigt sich auch für S-100 und seine β-Untereinheit ein buntes Bild

unterschiedlich starker Färbungen jedoch nur in dem Zellausstrich prä-P0. Man

könnte hier eine Analogie zu den Arealen schwach positiver Fasern und den stärker

positiven Septen im Gewebeschnitt des Bindegewebes sehen. Es wäre denbar, daß

die Zellen stärkerer Immunreaktivität am Aufbau der positiver gefärbten Strukturen

in situ beteiligt sind.

83

Ab der Primärkultur zeigen die Fibroblasten hingegen eine homogene Anfärbung.

Interessant ist hier jedoch, daß die Fibroblasten in Monolayerkultur im Vergleich zu

den differenzierten wie auch den entdifferenzierten Chondrozyten durchweg eine

deutlich schwächere Anfärbung mit Antikörpern gegen das S-100-Protein und seine

beiden Untereinheiten zeigen. S-100-β zeigt eine nur ganz schwache

Immunreaktivität, während bei S-100-α überhaupt keine positive Immunreaktion

mehr zu finden ist. Dies entspricht -wie oben bereits erwähnt- annähernd dem, was

Haimoto und Mitarbeiter gefunden haben. Auch das S-100-Protein zeigt bei den

Fibroblasten eine im Vergleich zu den durchweg dreifach positiven Chondrozyten

eine gerade mal einfache Positivität. Hier wird deutlich, daß sich der Phänotyp von

bovinen Fibroblasten unterschiedlichen Ursprungs deutlich nicht nur von

differenzierten, sondern auch entdifferenzierten Chondrozyten unterscheidet.

Inwiefern dieser Befund die drei S-100-Antikörper damit allerdings als neu zu

empfehlende Marker zur Charakterisierung des Phänotyps von Chondrozyten im

Verlauf der Kultur qualifiziert, soll bei der Diskussion der synoptischen Darstellung

der Ergebnisse besprochen werden.

84

4.4 Synoptische Auswertung

Betrachtet man die soeben im einzelnen diskutierten Ergebnisse in der synoptischen

Darstellung, so fällt als erstes das Umschalten des Biosyntheseprofils beim

Übergang von der Primärkultur zur ersten Subkultur auf. Am eindrücklichsten ist

dies bei der histochemischen Darstellung der knorpelspezifischen Proteoglykane

und bei den immunzytochemischen Färbungen von Kollagen-Typ I und II sowie

von S-100-α zu sehen: die ausgeprägte Basophilie bzw. Metachromasie ist nach der

ersten Passage völlig verschwunden, Kollagen-Typ II wird - wie in der Literatur

oftmals beschrieben - durch Kollagen-Typ I ersetzt, und S-100-α erscheint in der

ersten Subkultur in seiner Immunreaktivität stark abgeschwächt, um dann nach den

folgenden Passagen nicht mehr nachweisbar zu sein.

Der Vergleich mit der biologischen Kontrolle läßt in dieser Darstellung deutlich

hervortreten, in welche Richtung die Entdifferenzierung der Chondrozyten erfolgt:

für die eben erwähnten Antigene, die bereits nach der ersten Passage ein

vollständiges Umschalten ihrer Synthese zeigen, setzt sich das

Antigenexpressionsverhalten quasi nahtlos bei den Fibroblasten bzw. deren

Ursprunggeweben fort. Diese äußerst klaren Verhältnisse bestätigen daher die

Kollagen-Typen II und I als bereits bekannte Marker für den differenzierten bzw.

entdifferenzierten Phänotyp und stellen als ganz neuen Marker die α-Untereinheit

des S-100-Proteins heraus. Da das Umschalten jedoch nicht ebenso schlagartig

erfolgt wie bei den beiden Kollagen-Typen, bietet das Anti-S-100-α ihnen

gegenüber jedoch aller Wahrscheinlichkeit nach für die Praxis keinen Vorteil.

Weder das S-100-Protein noch seine β-Untereinheit zeigen ein Umschalten in ihrer

Synthese in der gesamten Monolayerkultur. Es zeigt sich ein in der gemittelten

Intensität identisches Färbeverhalten vom nativen Knorpel bis hin zur 6. Subkultur

(+++ bzw. ++). Somit eignen sich Antikörper gegen diese beiden Proteine nicht als

Marker für den differenzierten Phänotyp von Chondrozyten in Abgrenzung zu

entdifferenzierten Chondrozyten. Sehr wohl aber verdeutlichen sie, daß die

Chondrozyten sich - wenn auch phänotypisch in Richtung von - keineswegs aber zu

wirklichen Fibroblasten entdifferenzieren. Denn in beiden Fällen zeigen die

fibroblastenartig entdifferenzierten Chondrozyten eine bei weitem ausgeprägtere

Immunreaktivität als die Fibroblasten.

85

In dieser Arbeit sind Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V versuchsweise zur

Charakterisierung des Phänotyps von Chondrozyten im Verlauf der

Monolayerkultur verwendet worden. Auf den ersten Blick scheint die synoptische

Darstellung eine nur eingeschränkte Aussagekraft dieser Antikörper nahezulegen,

wenn es um die Abgrenzung gegen entdifferenzierte Zellen geht. Die Unterschiede

in den Immunreaktivitäten sowohl zwischen differenzierten und entdifferenzierten

Chondrozyten als auch zwischen Chondrozyten und Fibroblasten sind gering oder

fehlen. Scheinbar erschwerend kommt hinzu, daß sowohl bei den differenzierten

Chondrozyten wie auch bei den Fibroblasten große Intensitätsunterschiede auftreten

(sog. buntes Bild, gekennzeichnet durch das Sternchen [* ]). Bei beiden sind

Subpopulationen zu diskutieren (s.o.). Gerade dieses Umschalten von

Chondrozytenpopulationen mit sehr ausgeprägten Intensitätsunterschieden zu

solchen mit ausgesprochen einheitlicher Anfärbung kann jedoch als Kriterium für

eine Änderung der phänotypischen Differenzierung gewertet werden. Das Auftreten

des sog. bunten Bildes bei den Fibroblasten im Gegensatz zu den entdifferenzierten

Chondrozyten verdeutlicht aufs neue, daß entdifferenzierte Chondrozyten streng

von Fibroblasten zu unterscheiden sind. Soll jedoch aufgrund des

immunzytochemischen Färbeverhaltens eines einzelnen Chondrozyten auf seinen

Differenzierungsgrad geschlossen werden, dann sind die Antikörper gegen die

Kollagentypen III und V ungeeignet.

86

5 Zusammenfassung

Die Validität und Reliabilität eines Zellkulturmodells von hyalinem Knorpel hängen

entscheidend davon ab, ob es gelingt, die Entdifferenzierung der Knorpelzellen

durch geeignete Marker zu kontrollieren. In der vorliegenden Arbeit wird der

Phänotyp von bovinen Chondrozyten im Verlauf der Monolayerkultur

immunzytochemisch charakterisiert. Dabei kommen neben den bereits als Marker

etablierten Antikörpern gegen Kollagen-Typ I und II auch Immunglobuline gegen

die Kollagen-Typen III und V zur Anwendung, sowie als neuer Ansatz in diesem

Zusammenhang Antikörper gegen das Glykoprotein S-100 sowie seine α- und

β-Untereinheiten. Als Referenzfärbungen dienen klassische histochemische

Färbemethoden.

Differenzierte Chondrozyten zeigen charakteristischerweise erst etwa 48 Stunden

nach der Adhäsion ein ausgeprägtes Spreading. Bereits nach der ersten Passage

erfolgt dieses Spreading ebenso wie bei den als biologische Kontrolle dienenden

Fibroblasten innerhalb weniger Stunden. Dieses Verhalten wird als zellbiologisches

Entdifferenzierungsmerkmal gedeutet.

Die sternförmige Abflachung während der Präkonfluenz in der Primärkultur wird

nicht wie in der Literatur als Entdifferenzierung mit anschließender

Redifferenzierung in der Konfluenz interpretiert. Vielmehr wird als entscheidendes

einzelzellmorphologisches Kriterium für die Entdifferenzierung die spindelförmige

bipolare Ausrichtung der Chondrozyten angesehen, wie sie nach der ersten Passage

zunehmend beobachtet wird. Zellverbandsmorphologisch zeigt sich ein weiterer

Entdifferenzierungsschritt in Richtung eines fibroblastenartigen

Wachstumsverhaltens erst nach fünf bis sechs Passagen bzw. nach drei Wochen

konfluenter Kultur ohne Passage. Die Zellen wachsen dann mehr fischzugartig bis

wirbelförmig.

Die klassische histochemische Färbung nach Giemsa wird aufgrund der sehr

sensitiven metachromatischen Anfärbung der knorpelspezifischen Proteoglykane

trotz seiner im Vergleich zu immunzytochemischen Färbemethoden geringeren

Spezifität als in der Routine sehr geeignete Nachweismethode für den Verlust bzw.

das Wiedererlangen des differenzierten Phänotyps empfohlen.

Sowohl immunzytochemisch als auch histochemisch wird nachgewiesen, daß bereits

während der Inkubation in Kollagenase wie auch in der Primärkultur in

Abhängigkeit von der Zeit seit der Isolierung aus der Extrazellulärmatrix

zunehmend mehr Zellen zu einer verstärkten Synthese knorpelspezifischer

Stoffwechselprodukte (CS-PG, Kollagen-Typ II) angeregt werden.

87

Einzelne Zellen, die bereits Kollagen-Typ I synthetisieren, weisen darauf hin, daß

die Entdifferenzierung ansatzweise auch schon vor der ersten Passage beginnt.

Doch die bei weitem überwiegende Zellzahl zeigt während der Primärkultur eine

klare chondrozytenspezifische funktionelle Differenzierung: ausgeprägte Basophilie

und Metachromasie, Immunopositivität für Kollagen-Typ II und Immuno-

negativität für Kollagen-Typ I. Die α-Untereinheit des Glykoproteins S-100 zeigt

eine gleichartige Anfärbbarkeit und insbesondere nach der ersten Passage dasselbe,

wenn auch nicht ebenso schlagartige Umschalten wie die etablierten Marker des

differenzierten Phänotyps. Insofern kann Anti-S-100-α bedingt als neuer Marker

für den charakteristischen Phänotyp des differenzierten Chondrozyten angesehen

werden. Da S-100-α in Kryostatschnitten von hyalinem Knorpel ebenso wie die

Proteoglykane vor allem im Bereich der Chondrone abgelagert wird, wäre ein

funktioneller Zusammenhang zwischen S-100-α und den knorpelspezifischen

Proteoglykanen denkbar. S-100 selbst sowie seine β-Untereinheit zeigen bis zur

sechsten Passage und somit weit über den Zeitpunkt der Entdifferenzierung hinaus

ein gleichartig positives Färbeverhalten. Sie können daher nicht als spezifisch für

den differenzierten Chondrozyten angesehen werden. Allerdings kann mit Hilfe der

Antikörper gegen diese Proteine der fibroblastenartig entdifferenzierte Chondrozyt

von dem als biologische Kontrolle dienenden wirklichen Fibroblasten deutlich

unterschieden werden. Eine ähnliche, aber weniger klare Unterscheidung ist anhand

der neu verwendeten Antikörper gegen Kollagen-Typ III und V möglich. Bei den

differenzierten Chondrozyten wie bei den Fibroblasten zeigt sich ein „buntes Bild“

sehr unterschiedlicher Intensitäten. Hier können jeweils unterschiedliche

Subpopulationen von Zellen diskutiert werden. Lediglich die entdifferenzierten

Chondrozyten zeigen interessanterweise eine einheitliche Anfärbung. Die

Möglichkeit einer Kreuzreaktivität der verwendeten Antikörper gegen

Kollagen-Typ V mit Kollagen-Typ XI konnte bislang noch nicht sicher

ausgeschlossen werden. Jedoch zeichnet sich die Möglichkeit ab, daß in hyalinem

Knorpel nicht nur sogenannte „Knorpelkollagene“ enthalten sind, sondern auch

„Nicht-Knorpelkollagene“. In dieser Arbeit wird möglicherweise erstmalig die

Synthese und Ablagerung von Kollagen-Typ III durch differenzierte Chondrozyten

beschrieben.

88

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7 Danksagung

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Universitätsprofessor C.J. Kirkpatrick, M.D.

Ph.D., D.Sc.. Er war so freundlich, mir das Thema der vorliegenden Dissertation zu

überlassen und mich mit vielerlei Anregungen wie auch in der praktischen Durchführung

meiner Arbeit zu unterstützen. Sowohl als Wissenschaftler wie auch als Mensch habe ich

ihn als Vorbild schätzen gelernt.

Für die intensive Betreuung in der praktischen Durchführung und der Auswertung der

Arbeit möchte Frau Dr. Helma Motherby meinen herzlichen Dank sagen. Ihr verdanke ich

viele wichtige Anregungen.

Frau Elfriede Bilo bin ich sehr dankbar, daß sie mich mit viel Geduld an ihrem

Erfahrungsreichtum in den histochemischen Färbetechniken hat teilhaben lassen.

Frau Petra Mertens danke ich, daß sie mich in die immunzytochemischen Techniken

eingeführt hat und mir immer hilfreich zur Seite stand.

8 Lebenslauf

Gerhard Dyckhoff

Lessingstr. 34

69469 Weinheim

1965 Am 26. März in Aachen geboren

als Sohn der Eheleute Oberstudienrat Heinrich Dyckhoff

und Regina Dyckhoff, geb. Scholz

1971 Einschulung in die Grundschule Oberforstbach

1975 Eintritt in das Inda-Gymnasium, Kornelimünster

1984 Abschluß mit dem Abitur

1985 Im Wintersemester Beginn des Studiums der Humanmedizin

an der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

1992 Am 25. Januar Eheschließung mit Birgit Dyckhoff, geb. Vierfuß

1992 Am 3. November Abschluß des Studiums mit dem 3. Staatsexamen

1993/94 Arzt im Praktikum in der Praxis für Kinderheilkunde

von Herrn Dr. M. Blatzheim, Stolberg

1994 Seit Juli Assistent an der Univ.-Hals-Nasen-Ohren-Klinik Heidelberg

Monolayerkulturen von bovinen Chondrozyten ...

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