Ökophysiologische Untersuchungen zur Bedeutung von Prolin...

Streßphysiologie bei antarktischen Diatomeen

Ökophysiologische Untersuchungen zur Bedeutung von Prolin bei der Anpassung an

hohe Salinitäten und tiefe Temperaturen.

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

dem Fachbereich 2 (Biologie / Chemie)

vorgelegt von

Ina Plettner

Lilienthal

Oktober 2002

II

1. Gutachter: Prof. Dr. G.O. Kirst (Universität Bremen)

2. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. D. Hanelt (Alfred-Wegener-Institut,

Bremerhaven)

Tag des öffentlichen Kolloquiums:

28.10.2002

14:00 Uhr

Raum A 2235 (NW 2)

III

Eidesstattliche Erklärung

gem. § 6 (5) Nr. 1 – 3 PromoO

Ich erkläre, daß ich

1. die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt habe,

2. keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt

habe und

3. die den benutzten Werke wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen als sol-

che kenntlich gemacht habe.

Lilienthal, 8.10.2002

Ina Plettner

IV

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Lebensraum „Antarktisches Meereis“ 1

1.2 Osmotische Akklimatisation 8

1.3 Fragestellung 18

2 Material und Methoden 23

2.1 Organismen 23

2.2 Kultivierung der Stammalgen 29

2.3 Niedermolekulare organische Osmolyte und freie Aminosäuren

der Stammkulturen 30

2.4 Akklimatisation an hohe Salinitäten und tiefe Temperaturen:

Langzeitversuch 32

2.5 Akklimatisation an hohe Salinitäten: Kurzzeitversuch 34 2.5.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii und

Ni. lecointei 34

2.5.2 Prolinstoffwechsel am Beispiel von Chaetoceros sp.

nach einem hyperosmotischen Schock 36

2.6 Analyse niedermolekularer organischer Osmolyte 37

2.6.1 Zucker und Polyole 37

2.6.2 Zuckeridentifikation 38

2.6.3 Quaternäre Ammoniumverbindungen und Ectoine 41

2.6.4 DMSP 43

2.6.5 Prolin 44

2.7 Analyse der intrazellulären freien Aminosäuren 46

2.7.1 Extraktionsverfahren 46

2.7.2 Analyse der freien Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung

mit Dabs-Cl 48

2.8 Proteingesamtgehalt 52

2.9 Analyse von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure 53

2.9.1 Erarbeitung einer HPLC-Methode für die Analyse von

∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure in Eisalgen 53

2.9.1.1 Spektralphotometrische P5C-Bestimmung 54

2.9.1.2 P5C-Bestimmung mit der HPLC 55

V

2.9.2 Extraktion von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure 56

2.10 Enzymatik zum Prolinstoffwechsel 57

2.10.1 Enzymextraktion 57

2.10.2 Proteinbestimmung 58

2.10.3 Enzymtests 59

2.10.4 Dialyse 63

2.10.5 Charakterisierung der P5C Reduktase 64

2.10.5.1 KM-Bestimmung 64

2.10.5.2 pH-Optimumskurve 64

2.10.5.3 Temperaturoptimumskurve 65

2.11 Bestimmung der Zellzahl 66

2.11.1 Neubauer-Zählkammer 66

2.11.2 Coulter Counter 67

2.12 Vitalitätsbestimmung 67

2.13 Pigmentbestimmung 68

2.14 Statistik 69

3 Ergebnisse und Diskussion der HPLC-Methodiken 70

3.1 Analyse der quaternären Ammoniumverbindungen und Ectoine 70

3.2 Analyse der Zucker / Polyole 72

3.3 Analyse der freien Aminosäuren 72

3.4 Analyse von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure 75

4 Ergebnisse 78


der Stammkulturen 78

4.1.1 Niedermolekulare organische Osmolyte 78

4.1.1.1 Actinocyclus actinochilus 79

4.1.1.2 Chaetoceros gracile 81

4.1.1.3 Chaetoceros sp. 82

4.1.1.4 Corethron pennatum 83

4.1.1.5 Amphiprora kufferathii 83

4.1.1.6 Fragilariopsis cylindrus 85

4.1.1.7 Navicula gelida 86

4.1.1.8 Nitzschia lecointei 87

4.1.1.9 Nitzschia medioconstricta 88

4.1.2 Zucker- / Polyolidentifikation 90

VI

4.1.3 freie Aminosäuren 92 4.1.3.1 Actinocyclus actinochilus 95

4.1.3.2 Chaetoceros gracile 96

4.1.3.3 Chaetoceros sp. 97

4.1.3.4 Corethron pennatum 98

4.1.3.5 Amphiprora kufferathii 99

4.1.3.6 Fragilariopsis cylindrus 100

4.1.3.7 Navicula gelida 101

4.1.3.8 Nitzschia lecointei 102

4.1.3.9 Nitzschia medioconstricta 103

4.2 Akklimatisation an hohe Salinitäten und tiefe Temperaturen 104

4.2.1 Salinität und Temperatur 104

4.2.2 Niedermolekulare organische Osmolyte 106

4.2.2.1 Prolin 107

4.2.2.2 DMSP, quaternäre Ammoniumverbindungen, Ectoine,

Zucker / Polyole 108

4.2.3 Pigmente 114

4.2.5 P5C Reduktase 115

4.2.6 Zusammenfassung 116

4.3 Akklimatisation an hohe Salinitäten: Kurzzeitversuch 117

4.3.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii und

Ni. lecointei 117




4.4.1 Enzymnachweis 124

4.4.2 Charakterisierung der P5C Reduktase 126

5 Diskussion 129


der Stammkulturen 129 Zusammenfassung 143

5.2 Langzeitversuch 147 Zusammenfassung 165

5.3 Kurzzeitversuch 166 5.3.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii und

Ni. lecointei 166

VII




5.4.1 Enzymnachweis 181

5.4.2 Zusammenfassung 190

6 Zusammenfassende Abschlußdiskussion 192

7 Literaturverzeichnis 198

8 Abkürzungsverzeichnis 225

9 Anhang 227

9.1 Kulturmedien 227

9.1.1 hw-Meersalz + Bioelemente 227

9.1.2 β f/2 Nährsalzzusätze 228

9.1.3 Medium K 229

9.2 Chemikalien 229

9.3 Literaturliste antarktischer Eisdiatomeen der AG Kirst 233

Danksagung 234

Einleitung

1

1 Einleitung

„Because all cells, at least those that are metabolically active, are approximately 85 –

95% water, it is a truism to state that any environmental factor that affects the activity,

structure, or physical state of water poses a threat to life.” (Zitat aus Somero, 1992;

Seite 3).

In diesem Sinne stellen die Polarregionen nicht nur einen aufgrund der niedrigen Tem-

peraturen extremen Lebensraum dar. Auch das Meereis mitsamt dem das Eis durch-

ziehenden Laugenkanalsystem, in dem zusätzlich hohe Salinitäten entstehen, erfor-

dern eine außergewöhnliche Anpassungsfähigkeit der dort lebenden Organismen. Die

große Faszination, die von den eisbedeckten Flächen und Eisbergen ausgeht, setzt

sich bis zu den Mikroorganismen fort, die in diesen so lebensfeindlich erscheinenden

Gebieten eine nicht unbedeutende Rolle für das Ökosystem einnehmen.

1.1 Lebensraum „Antarktisches Meereis“

Die Polarregionen sind großflächig von Meereis bedeckt. Im Südpolarmeer sind ca.

80% des Meereises einjährig. Die Eisdecke nimmt im antarktischen Sommer eine Flä-

che von 4*106 km2 ein, die sich im antarktischen Winter bis zu 20*106 km2 ausdehnt (Eicken, 1995; Zwally et al., 1983; vgl. Abb. 1.1). Für eine Vielzahl von Organismen ist

das Südpolarmeer ein extremer Lebensraum. Durch die Prozesse der Meereisbildung

und –schmelze wird insbesondere das Leben der Planktonorganismen stark beeinflußt

(siehe unten).

Abb. 1.1: Mittlere Eisausdehnung und -konzentration in der Antarktis im September 1985 (Früh-jahr: maximale Ausdehnung, a) und Februar 1986 (Herbst: minimale Ausdehnung, b). Die Eis-konzentration ist in verschiedenen Farben wiedergegeben (siehe Skala rechts). Die Darstellung basiert auf SMMR-Daten (Quelle: Eicken, 1995). SMMR: Scanning Multi-Channel Microwave Radiometer; Satellit

a b

Einleitung

2

Das Südpolarmeer ist ein sogenanntes „high-nutrient – low chlorophyll“-Gebiet (HNLC),

d.h. die Hauptnährsalze Silikat, Nitrat und Phosphat werden in der Regel nicht durch

Phytoplanktonblüten erschöpft. Diese Konstellation wird als „Antarktisches Paradoxon“

bezeichnet; ein Phänomen, das John Hart bereits 1934 erkannt hat. Die Quellen für

den Nährstoffreichtum des Südpolarmeeres sind die großflächigen Auftriebsgebiete

südlich der antarktischen Konvergenz. Phytoplanktonblüten sind im Südpolarmeer eher selten; im wesentlichen bedingt durch Fraßdruck (z.B. durch Euphausia superba, dem

antarktischen Krill), lichtlimitierende Bedingungen und Eisenmangel (Buma, 1992).

Phytoplanktonblüten entstehen vor allem an Eisbruchkanten bzw. Bereichen der Eis-

schmelze, da durch die oberflächennahe Salinitätserniedrigung eine geringere Durch-

mischungstiefe der Wassersäule verursacht wird. Die aus dem Eis freigesetzten Algen

sind dadurch länger dem Licht ausgesetzt und können eine Blüte bilden (Spindler &

Gradinger, 1995). Die Artenzusammensetzung des Planktons ist sehr variabel: an den

Eisbruchkanten dominieren oft Diatomeen, im freien Wasser eher Prymnesiophyceen.

Dinoflagellaten und Grünalgen haben eine geringere Bedeutung (Buma, 1992).

Das Meereis dient einer großen Anzahl von Organismen als Habitat. Diese Organis-

mengemeinschaft wird als „sea ice microbial community“ (SIMCO) bezeichnet (Sullivan

& Palmisano, 1981) und besteht aus Bakterien, Pilzen, Algen und Protozoen. Die Or-

ganismendichte im Eis ist wesentlich höher als im freien Wasser; als Beispiel: die Chlo-

rophyll (Chl.) a-Konzentrationen sind in Eisproben 25 bis 70mal höher als im offenen

Wasser und sogar 100 bis 390mal höher als in der Wassersäule unter dem Eis (EPOS I Expedition in das Weddell-Meer 1988) (Kirst et al., 1991). Die Artenzusammenset-

zung im Eis ähnelt eher einer benthischen als einer planktischen Gemeinschaft (Weissenberger, 1992; Horner et al., 1992; Squire, 1990) und besteht zu 42 bis 88%

aus Diatomeen, inklusive der Eisrandgebiete (Kang & Fryxell, 1992).

Die Lebensbedingungen im Eis sind variabel und verändern sich sowohl mit der Struk-

tur als auch mit dem Alter des Eises. Das antarktische Meereis ist zu etwa 80% einjäh-

rig und weist Unterschiede zu dem mehrjährigen arktischen Eis auf (Eicken, 1995;

Spindler, 1990). Die Unterschiede bestehen die im wesentlichen in der Eisdicke und

der Salinitätsverteilung: Das antarktische Meereis wird in der Regel nur maximal 2 m

dick und die Salinität in den Laugenkanälen (siehe unten) kann bis zu 205 PSU

(Weissenberger, 1992) (PSU = Practical Salinity Units; entspricht parts per thousand =

ppt oder Promille) erreichen. Eisschmelzprozesse finden vorwiegend an den Grenzflä-

chen zwischen Eis und Wasser statt (Gordon, 1981).

Einleitung

3

Der Lebensraum „Meereis“ wird von vielen abiotischen Faktoren beeinflußt, die im

Vergleich zu anderen rein marinen Habitaten Extremwerte erreichen können und daher

in ihrer Gesamtheit einen ungewöhnlichen und faszinierenden Lebensraum darstellen.

Raumangebot, Salinität, Temperatur und Licht sind die wichtigsten abiotischen Fakto-

ren. Sie kontrollieren durch ihre großen Gradienten das Wachstum des Phytoplanktons

im Südpolarmeer. Die Parameter bzw. deren Veränderungen hängen direkt oder indi-

rekt mit der Eisbedeckung und Eisbildung zusammen (El-Sayed & Fryxell, 1993).

Die Organismen, die im Eis leben, werden vermutlich während der Eisbildung aus dem

freien Wasser zwischen Eispartikeln eingeschlossen oder haften an ihnen und werden

auf diese Weise aus dem Wasser „geerntet“ („scavenging“ oder „harvesting“) (Spindler & Gradinger, 1995; Dieckmann & Kipfstuhl, 1995; Eicken, 1992; Garrison et al., 1983).

Eisalgen unterstützen diesen Vorgang quasi durch die Exsudation von Substanzen, die

ihnen eine gewisse Klebrigkeit verleihen, mittels derer sie an den Eiskristallen haften (Riebesell et al., 1991). Die Fähigkeit zur Synthese dieser Exopolymere wird vornehm-

lich pennaten Diatomeen zugeschrieben (Gleitz et al., 1998). Der tatsächliche Vorgang

ist allerdings noch immer unklar (Bartsch, 1989) und beruht wahrscheinlich auf einer

Kombination mehrerer Mechanismen. Der Einschluß ist ein – bezogen auf die Orga-

nismenzusammensetzung – hauptsächlich unspezifischer Vorgang (zusammengefaßt

von Brierley & Thomas, 2002).

Zu Beginn der Meereisbildung werden kleine Süßwasser-Eiskristalle mit durchschnitt-

lich 3 – 4 mm Durchmesser („frazil ice“) an oder nahe der Wasseroberfläche gebildet.

Eiskristalle bilden sich ebenso in stark unterkühltem Wasser in der Tiefe und steigen

an die Oberfläche. Anschließend verbinden sich die Kristalle zu einer seifenartigen

Flüssigkeit („grease ice“), das letztendlich zu einer festen Eisschicht zusammenfriert.

Nach der Bildung einer festen Eisdecke wächst das Eis in langen, säulenartigen Eis-

kristallen an der Unterseite weiter und bildet das charakteristische Säuleneis („conge-

lation ice“). Charakteristisch für das Säuleneis sind die langen und äußerst schmalen,

unverzweigten Laugenkanäle (Weissenberger, 1992; vgl. Abb. 1.3). An der Grenzflä-

che zwischen Eissäule und freiem Wasser ist die Eisstruktur aufgrund der höheren

Temperatur und der Wasserbewegung wieder – ähnlich dem Eis an der Oberfläche –

gröber strukturiert; die Eiskanäle verlaufen nicht mehr senkrecht, sondern ohne Orien-

tierung und haben einen wesentlich größeren Durchmesser (vgl. Abb. 1.3). Bereits die

unterschiedliche Struktur nur dieser beiden Eistypen suggeriert variable Lebensbedin-

gungen für die im Eis lebenden Organismen (Cota & Horne, 1989), die sich in der Ent-

wicklung bestimmter Organismengemeinschaften widerspiegeln (siehe unten und Abb.

1.14). Tatsächlich stellen der Eisbildungsprozeß und die daraus entstehenden Eistypen

Einleitung

4

ein noch wesentlich komplexeres Gebilde dar (vgl. auch Günther & Dieckmann, 1999).

Abb. 1.2 zeigt eine schematische Darstellung der derzeit aktuellen Vorstellung unter-

schiedlicher Eistypen des kontinentsnahen Fast-Eises.

Abb. 1.2: Schematische Darstellung einer Eissäule aus dem kontinentalnahen Meereis („fast ice“). Die Vergrößerung unten links zeigt einen Ausschnitt aus der Plättcheneisschicht (Quelle: Günther & Dieckmann, 1999; englische Ausdrücke sind, soweit möglich, übersetzt).

Meereis bildet sich durch das Ausfrieren des Süßwassers unter Ausschluß der im

Meerwasser enthaltenen Salze, die als Salzlauge („brine“) bezeichnet wird. Das Kri-

stallgitter des Eises besteht also hauptsächlich aus reinem Wasser und enthält nur ge-

ringste Ionenmengen. Während des fortschreitenden Eisbildungsprozesses wird die

Salzlauge weiter aufkonzentriert und in langen und schmalen Kanälen, die das gesam-

te Eis durchziehen, eingeschlossen. Diese Kanäle enden 10 bis 40 cm über der Grenz-

fläche zwischen Meereis und Meerwasser (Weeks & Ackley, 1982) und durchziehen

das Eis wie ein großes Netz mit Durchmessern von einigen Mikro– bis zu einigen Zen-timetern; im Mittel weisen sie einen Durchmesser von 200 µm auf (Eicken et al., 1995;

Weissenberger, 1992). Die Fläche der Laugenkanäle beträgt zwischen 0,4 und 4 m2*kg-1 Eis, mit abnehmender Tendenz bei sinkenden Temperaturen (Krembs et al.,

2000). Bei –2°C sind 6 bis 41% von Mikroorganismen besiedelt. Eine Temperaturre-

duktion von –2°C auf –6°C erhöht die Besiedlungsdichte stark, da die zur Verfügung

fast ice

Meereis Plättcheneis (nicht verfestigt) Wassersäule

Grenzschicht Plättcheneis / Meereis

Eisplättchen

Zwischenraumwasser

Schneedecke

Körnereis

Säuleneis

festes Plättcheneis

Einleitung

5

Abb. 1.3: Photographien von Breieis („grease ice“) aus einer Tiefe von etwa 2,5 m (links) und Säuleneis („congelation ice“) rechts aus eine Tiefe von 0,8 m (rechts). Maßstab: weiße Kenn-zeichnung oben rechts entspricht 1 cm. Photos mit freundlicher Genehmigung von A.C. Gress.

stehende Oberfläche reduziert wird (Krembs et al., 2000). Der Volumenanteil des Hohl-

raumnetzes kann einen Wert von bis zu 30% des gesamten Eisvolumens erreichen

(Spindler & Gradinger, 1995). Kunstharzausgüsse von antarktischem Meereis zeigen

die äußerst komplexe, dreidimensionale Struktur des Laugenkanalsystems

(Weissenberger, 1992). Strukturveränderungen sind immer mit Veränderungen der bil-

dungsbestimmenden physikalischen Faktoren (z.B. Temperatur) und der Ionenzusam-

mensetzung verbunden (Thomas & Dieckmann, 2002; Leppäranta & Manninen, 1988;

Frankenstein & Garner, 1967), während die Salinität der Salzlauge ausschließlich von

der Eistemperatur abhängig ist (Assur, 1958) (vgl. Abb. 1.4).

Eistemperaturen sind von Schneebedeckung und Lufttemperatur (Wind) abhängig

(Weissenberger, 1992) und liegen gewöhnlich zwischen –2°C und –6°C; Temperaturen

von weniger als -10°C sind eher selten (Weissenberger, 1992). Allerdings können die

Temperaturen an der Oberfläche von Packeis auch unter –20°C fallen, wenn im Winter

kein Schnee auf dem Eis liegt (Eicken, 1995).

Die Salinität der Lauge reicht von 27 PSU bis zu 205 PSU (Weissenberger, 1992). Ge-

wöhnlich werden im oberen Bereich der Eissäule die höchsten Salinitäten gemessen,

da die Temperatur aufgrund der Luft-Wasser-/Eisgrenze dort am niedrigsten ist (Abb.

1.14). An den Eisbruchkanten und in Schmelzwassertümpeln an der Eisoberfläche

kann das Meerwasser sogar bis auf eine Salinität von 4 PSU verdünnt werden.

Einleitung

6

Abb. 1.4: Schematische Darstellung der Beziehungen zwischen Salinität, Temperatur und Laugenkanalgröße: je tiefer die Temperatur, desto höher ist die Salinität und desto geringer ist das Volumen der Laugenkanäle (Einzelheiten im Text). I (A – E): Thermodynamisches Gleichgewicht während der Eisbildung. Je intensiver die blaue Farbe ist, desto höher ist die Salinität in den Eislaugenkanälen (vgl. Skala Teil II). II Gefrierpunktstemperatur mit entsprechender Salinität [‰] T = Temperatur [°C] (Quelle: nach Bartsch, 1989)

Licht ist - noch vor dem Einfluß der Temperatur (Fiala & Oriol, 1990) - der hauptsäch-lich determinierende Faktor für das Wachstum des Phytoplanktons (Tilzer et al., 1986).

Neben den Jahreszeiten bestimmen die Dicke der Schneeauflage, die Eisdicke und die

Dichte der im Eis eingeschlossenen Organismen Lichtqualität und –quantität (Spindler

& Gradinger, 1995; Bartsch, 1989). Die Eisalgengemeinschaften können extrem niedri-

gen Bestrahlungsstärken von 0,2 µmol Photonen*m-2*s-1 ausgesetzt sein. Eisdiato-

meen scheinen eher an niedrige Bestrahlungsstärken adaptiert zu sein (zusammenge-

faßt von Thomas & Dieckmann, 2002; Kirst & Wiencke, 1995), sind aber auch zur

I. II.

A.T> -1,8°C

B.T = -2,0°C

C.T = -3,5°C

T sinktweiter

D.

T steigt

E.

Eiskristalle

Gefrieren Schmelzen

Salinität [‰]

34

36

53

61

69

Gefrierpunkt [°C]

-1,8

-2,0

-3,0

-3,5

-4,0

Einleitung

7

Anpassung an hohe Lichtintensitäten in der Lage (Gleitz & Kirst, 1991), die an der Eis-

oberfläche über 1000 µmol Photonen*m-2*s-1 erreichen können (Abb. 1.14).

Nährsalze sind im Eis in der Regel trotz der hohen Besiedlungsdichte kein limitierender

Faktor; lediglich Silikat könnte für Diatomeen wachstumsbegrenzend werden. Die Aus-

nahmen bilden abgeschlossene Kavernen im Eis, die von Austauschprozessen ausge-

schlossen sind, und in denen ebenso sehr hohe Besiedlungsdichten durch die Bildung

einer Eisalgenblüte entstehen können wie in den oberen Eisschichten im Frühjahr

(Spindler & Gradinger, 1995; Gleitz & Kirst, 1991).

Aufgrund der großen Gradienten der abiotischen Faktoren in der Eissäule (zusammen-

gefaßt in Abb. 1.14) ist die vertikale Verteilung der Organismen im Eis sehr variabel (Horner et al., 1992) und abhängig vom saisonalen Verlauf der Eisbildung, des Eissäu-

lenwachstums und der Eisschmelze. Zusätzlich beeinflussen Nährsalzverfügbarkeit (Cota et al., 1987) und trophische Interaktionen deren Zusammensetzung. Wie bei der

vertikalen Verteilung der Organismen, so ergeben sich auch horizontale Variabilitäten

in der Besiedlung des Eises aus den genannten abiotischen Faktoren. Diese flecken-

hafte Besiedlung bezeichnet man als „patchiness“ (Spindler & Gradinger, 1995).

Wie bereits erwähnt, bilden sich spezielle Eisgemeinschaften, in denen bestimmte Ar-

ten trotz des Patchiness-Phänomens typischerweise wiederzufinden sind. I.A. werden die Definitionen nach Horner et al. (1992) verwendet, um die verschiedenen Gemein-

schaften bestimmten vertikalen Bereichen in der Eissäule zuzuordnen. Die vier wich-

tigsten, die Oberflächen-, die Zwischeneis-, die Bodeneis- und die Untereisgemein-

schaft, sind in Abb. 1.14 dargestellt. In der Zwischeneisgemeinschaft unterscheidet

man zusätzlich zwischen Bändergemeinschaften, die sich durch übereinandergescho-

bene Eisplatten bilden, und Laugenkanalgemeinschaften. Die Gemeinschaften entwik-

keln sich erst nach dem Einschluß ins Eis durch Wachstum. Im oberen Eisbereich do-minieren kleinzellige Chaetoceros-Arten mit einem Durchmesser von 20 bis 30 µm

inklusive ihrer Fortsätze und Arten der Gattung Fragilariopsis (Bartsch, 1989), während

großzellige Arten wie Actinocyclus actinochilus oder Odontella-Arten in den Boden-

und Untereisgemeinschaften zu finden sind. Leere und zerstörte Schalen von großzel-ligen Arten oder Organismen mit langen Fortsätzen, wie z.B. Corethron pennatum, sind

dort zu finden, wo die Eiskanäle den Durchmesser dieser Arten unterschreiten und die

Zellen durch mechanischen Druck zerstört werden. Nach Untersuchungen von Günther

& Dieckmann (2001) besteht eine eindeutige Korrelation zwischen der Eiskanalgröße

und der Größe der dort lebenden Arten. Obwohl bereits McGrath Grossi & Sullivan

(1985) vermutet haben, die vertikale Verteilung der Arten im Eis sei auch auf physiolo-

gischen Eigenschaften der Arten begründet, liegen bisher kaum experimentelle Daten

Einleitung

8

vor, die diese Vermutung untermauern könnten. Gerade Untersuchungen zur Tempe-

ratur- oder Salztoleranz, in die typische Vertreter der Eisgemeinschaften involviert wer-

den sollten, wären aufgrund der Gradienten innerhalb der Eissäule von besonderem In-

teresse.

1.2 Osmotische Akklimatisation

Bedeutung niedermolekularer organischer Osmolyte und compatible solutes

Veränderungen der Salinitäten beeinflussen die Organismen auf verschiedene Weise

(Kirst, 1996):

• durch osmotischen Streß mit direktem Einfluß auf das zelluläre Wasserpotential,

• durch Ionenstreß, der von passiv eingedrungenen bzw. ausgetretenen Ionen verur-

sacht wird und

• durch Veränderungen der intrazellulären Ionenverhältnisse.

Die unmittelbare Folge einer Salinitätsveränderung, basierend auf einem Anstieg bzw.

Abfall anorganischer Ionen (hauptsächlich Na+ und Cl-), sind passive Wasserströme; bei einem hyperosmotischen Schock aus der Zelle heraus und vice versa. Durch die

Salinitätsveränderung werden intrazelluläre Bedingungen – wie Ionenzusammenset-

zung, Intermediatkonzentrationen und pH-Wert - beeinflußt, die für optimales Wachs-

tum in engen Grenzen aufrechterhalten werden müssen (Bisson & Kirst, 1995). Ver-

änderte Ionenkonzentrationen stören viele Funktionen, besonders die enzymatische

Katalyse, die Bindung von (Co-) Substraten und Modulatoren an Enzyme, die Quintär-

struktur und Kompartimentierung der Proteine sowie deren Löslichkeit. Zusätzlich wer-

den viele membran- und membranassoziierte Funktionen, wie z.B. die Membranfluidi-

tät, negativ beeinflußt (zusammengefaßt von Somero, 1992). Im Rahmen der

osmotischen Akklimatisation, die sich zeitlich an die passiven Wasserflüsse anschließt,

werden die optimalen Bedingungen wiederhergestellt. Als osmotische Akklimatisation

bezeichnet man einen Prozeß, durch den über (monovalente) Ionen und niedermoleku-

lare organische Osmolyte das osmotische Gleichgewicht und - bei Zellen mit Zellwand

– der Turgor und das Ionengleichgewicht wiederhergestellt wird (Referenzen aus

Erdmann & Hagemann, 2001; Kirst, 1989). Dieses wird durch die Synthese osmotisch

aktiver Substanzen erreicht, die das osmotische Gleichgewicht in der Zelle wieder ein-

stellen, aber nicht in das Wachstum involviert sind.

Eine Wiederherstellung des osmotischen Potentials ausschließlich über Ionen erforder-

te hohe Konzentrationen, die einen negativen bzw. toxischen Effekt auf den Zellmeta-bolismus ausüben würden (Kirst, 1989; Yancey et al., 1982). Die Ausnahme bilden ha-

Einleitung

9

lophile Archaebakterien, die an hohe extrazelluläre Ionenkonzentrationen adaptiert sind

(DasSarma & Arora, 2001; Erdmann & Hagemann, 2001; Somero, 1992). Die Synthe-

se niedermolekularer organischer Osmolyte bei längerfristiger hyperosmotischer Bela-

stung bildet einen Ausweg. Man unterscheidet drei chemische Gruppen: a) Betaine

und verwandte Substanzen, b) Polyole und Zucker (z.B. Mannitol und Trehalose) und c) zwitterionische Aminosäuren, v.a. Prolin (McNeil et al., 1999). In Algen erfüllen oft

deren Hauptphotosyntheseprodukte diese Funktion; allerdings werden auch stickstoff-

haltige Substanzen wie Prolin, Homarin, Glycinbetain oder die Schwefelverbindung

Dimethylsulfoniumpropionat (DMSP) synthetisiert.

Obwohl die isoosmolalen Konzentrationen dieser Substanzen vergleichbare osmoti-

sche Potentiale aufweisen, müssen sowohl die „Synthesekosten“ (ATP und Redukti-

onsäquivalente) als auch die Mengen an Stickstoff bzw. Kohlenstoff berücksichtigt wer-

den, die für deren Aufbau notwendig sind. Konsequenterweise hat daher auch der

physiologische Status der Zellen einen großen Einfluß darauf, welche Osmolyte in wel-

chen Mengen überhaupt synthetisiert werden können (Stefels, 2000).

Niedermolekulare, organische Osmolyte haben neben ihrer osmotischen Aktivität wie-

tere positive Einflüsse auf den Zellmetabolismus: sie üben einen stabilisierenden Effekt

auf Makromoleküle (Enzyme) und Membranen aus und sind – auch in hohen Konzen-

trationen von über 2 molal - für den Metabolismus nicht toxisch. Aus diesem Grund

werden sie nach Brown & Simpson (1972) als „compatible solutes“ bezeichnet. Aller-

dings sind nicht alle organischen Osmolyte compatible solutes; eine Ausnahme bildet

z.B. Harnstoff. Weitere typische physikochemische Eigenschaften sind ihre hohe Was-

serlöslichkeit ohne Nettoladung bei physiologischem pH-Wert und die guten und effek-

tiven Regulationsmöglichkeiten (zusammengefaßt von DasSarma & Arora, 2001;

Erdmann & Hagemann, 2001; Kirst, 1995a), die in Eukaryoten möglicherweise – die

Erkenntnisse beruhen v. a. auf Prolin und Glycinbetain - auf Organell-Ebene ablaufen (Bishop et al., 1994). Vielen dieser Substanzen wird zusätzlich zu ihrer osmotischen eine kältestabilisierende

Funktion zugeschrieben und sie daher als „kryoprotektive Substanzen“ bezeichnet. Sie

schützen die Organismen u.a. vor intrazellulärer Eisbildung („Gefrierresistenz“) oder

vor den schädigenden Auswirkungen extrazellulären Eises („Gefriertoleranz“) (Definiti-

onen nach Hochachka & Somero, 1980).

In Eisdiatomeen sind bisher Prolin, die quaternäre Ammoniumverbindung Homarin, or-

ganische Säuren und DMSP als organische Osmolyte nachgewiesen worden; weiterhin

gibt es Hinweise auf das Vorkommen von Glycinbetain (Nothnagel, 1994; Wanzek,

1994; Bartsch, 1989). Die Iminosäure Prolin ist in den in dieser Hinsicht bisher unter-

Einleitung

10

suchten Arten Chaetoceros sp., Navicula sp., Amphiprora kufferathii und Nitzschia le-

cointei als Hauptosmolyt aufgetreten. Zum einen aufgrund der hohen Konzentrationen,

die die Diatomeen im Rahmen von Salzstreßversuchen akkumuliert haben, und zum

anderen aufgrund der vielfältigen Wirkungen, die diesem compatible solute zuge-

schrieben werden (siehe unten), sind Stoffwechsel und Regulation von Prolin von gros-

sem Interesse; vor allem vor dem als extrem zu betrachtenden Lebensraum Meereis.

Prolin

N+

COO-HH

Abb. 1.5: Strukturformel von Prolin (Quelle: Vairavamurthy et al., 1985)

Die Akkumulation von Prolin (Abb. 1.5) wurde erstmals in welkendem Roggen von Kemble & McPherson (1954), zitiert nach Jain et al., 2001) beobachtet und wird seit-

dem in seiner Funktion als „Antistreß-Substanz“ und Osmolyt erforscht.

Die Schutzfunktion als compatible solute umfaßt z.B. den Schutz der Membranintegri-

tät und die Aufrechterhaltung der Enzymaktivitäten in einer Umgebung mit niedriger Wasseraktivität, u.a. durch Abfangen freier Radikale (Jain et al., 2001; Bandurska,

2000; Fedina & Benderliev, 2000; Gibon et al., 2000; Hong et al., 2000). Als Puffersub-

stanz wird Prolin außerdem bei der Reduktion streßinduzierter zellulärer Azidifizierung diskutiert (Hare & Cress, 1997; zitiert nach Aziz et al., 1999). Prolin wird auch als

Schutz vor toxischen Kupferkonzentrationen akkumuliert (Chen et al., 2001; Ali et al.,

1998; Wu et al., 1995) und dient als Energielieferant für die Erholung nach Streßereig-

nissen (Kuznetsov & Shevyakova, 1999). Nach neuen Erkenntnissen soll Prolin auch die DNS-Transkription und –Replikation unterstützend beeinflussen (Rajendrakumar et

al., 1997). Zusätzlich ist es als kryoprotektive Substanz bei Makroalgen (Karsten,

1991), Mikroalgen (Kirst et al., 1991) und höheren Pflanzen in der Diskussion (Zusam-

menfassung siehe Abb. 1.6).

Einleitung

11

Abb. 1.6: Mögliche Schutzfunktionen erhöhter Prolinsynthese als Folge von Kälte und Salz-streß in Pflanzen. Die Funktionen als Osmolyt, compatible solute (comp. solute) und C- & N-Speicher sind für Eisdiatomeen belegt (Abb. nach Verma, 1999; modifiziert).

Prolin nimmt im Rahmen der compatible solutes eine Sonderstellung ein, da es als

Stoffwechselendprodukt nicht einem langsamen Turnover unterworfen ist, sondern

ebenso wie die anderen Aminosäuren in den aktiven Metabolismus involviert ist

(Erdmann & Hagemann, 2001). Ungewöhnlich im Prolinmetabolismus ist außerdem

das gemeinsame Intermediat Pyrrolin-5-Carboxylsäure (P5C) sowohl im Synthese- als

auch im Degradationsweg; zusätzlich bildet Glutaminsäure sowohl Ausgangssubstrat

als auch Endprodukt. Die Frage nach der Regulation ist folglich diffizil.

Prolin wird in höheren Pflanzen und Algen nach bisherigen Erkenntnissen direkt ent-

weder über Glutaminsäure oder Ornithin als Ausgangssubstrate synthetisiert (Chang & Lee, 1999; Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Hare et al., 1999). Gemeinsames Interme-

diat ist die ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure (P5C), die über die NAD(P)H-abhängige P5C

Reductase (P5CR, EC 1.5.1.2) zu Prolin reduziert wird (Abb. 1.7). Dieses Enzym be-findet sich im Cytosol oder in den Plastiden (Forlani et al., 1997). Während die Umset-

zung des P5C durch die P5CR zu Prolin allen bisher untersuchten Organismen

gemeinsam ist, gibt es Unterschiede in dessen Synthese. Bei Glutaminsäure als Aus-

gangssubstrat wird nach bisherigem Kenntnisstand Glutaminsäure entweder durch ei-nen Enzymkomplex, die P5C Synthase (EC 2.7.2.11 / 1.2.1.41, aus Forlani et al., 2000

und Hare et al., 1999; nach Hong et al., 2000 noch nicht vergeben), oder durch zwei

getrennt isolierbare Enzyme, die miteinander assoziiert sind (Chang & Lee, 1999) um-

gesetzt. Diese beiden Enzyme sind die γ-Glutamyl Kinase (EC 2.7.2.11) und die

Prolinakkumulation

Feedback-Regulation

Osmolyt

comp.solute

Radikal-fänger

C & NSpeicher

Cytosol .pH-Puffer

NAD(P) + /NAD(P)HBalance

Kälteschutz

Salinität&

Kälte

OxidativerStreß

OsmotischerStreß

ReduzierteDegradation

ErhöhteSynthese

Einleitung

12

Glutaminsäure-5-Semialdehyd Dehydrogenase (DH) (EC 1.4.1.3). Diese im Cytosol

(Nanjo et al., 1999) lokalisierte Reaktion mündet in der Bildung von Glutaminsäure-γ-

Semialdehyd, das spontan zu P5C zyklisiert (Abb. 1.7). Das Vorkommen beider Syn-

thesemöglichkeiten scheint nicht auf bestimmte Taxa beschränkt zu sein; z.B. wurden in Lycopersicon esculentum (Tomate) Genloci für beide Varianten gefunden (Review:

Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Garcia-Rios et al., 1997). Aufgrund der NAD(P)-H-

und ATP-Abhängigkeit ist die Synthese klar lichtabhängig, wie aufgrund verschiedener

Untersuchungen u.a. an Diatomeen gezeigt werden konnte (Nothnagel, 1994; Scho-

bert, 1977).

Abb. 1.7: Biosynthese von Prolin. Bis auf die spontane Zyklisierung von Glutaminsäure-γ-Semi-aldehyd zu ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure (P5C) sind alle Schritte durch Enzyme katalysiert:

P5C Synthase und / oder γ-Glutamyl Kinase und Glutaminsäure-5-Semialdehyd DH δ-Ornithin-Aminotransferase P5C Reductase

Neben dem beschriebenen und als „Glutaminsäureweg“ bezeichneten Syntheseweg

kann auch Ornithin als Ausgangssubstrat fungieren („Ornithinweg“ (Chang & Lee,

1999; Madan et al., 1995)). Er ist teilweise in den Mitochondrien lokalisiert. Ornithin

wird über die δ-Ornithin Aminotransferase (OAT; EC 2.6.1.13) zu Glutaminsäure-γ-Se-

mialdehyd desaminiert und folgt anschließend derselben Reaktionskette wie im Gluta-

minsäureweg (Abb. 1.7). Welcher dieser beiden Stoffwechselwege in Streßsituationen,

die eine erhöhte Prolinsynthese zur Folge haben, aktiviert wird, scheint einerseits vom

Organismus, andererseits aber auch von der Art des Stressors abhängig zu sein (Igarashi et al., 1997; Madan et al., 1995).

Glutamat Ornithin Arginin

Glutamat-γ-Semialdehyd

spontane Zyklisierung

∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

Prolin





Prolin





Prolin

Einleitung

13

Der Prolinabbau vollzieht sich in pflanzlichen Organismen offenbar einheitlich und wird

durch zwei enzymatische Schritte katalysiert, bei der – wie bei der Synthese - P5C als

freies Zwischenprodukt auftritt (Yoshiba et al., 1997) (wie in Abb. 1.7, nur in umgekehr-

ter Richtung ohne Beteiligung des Ornithins).

Für die Oxidation von Prolin sind bisher 2 Enzyme beschrieben worden, die Prolin DH

und die Prolin Oxidase. Die Nomenklatur für diese beiden Enzyme wird von den Auto-

ren nicht einheitlich gehandhabt (vgl. Tab. 5.5); in dieser Arbeit wird der Zuordnung nach Lutts et al. (1999) gefolgt. Die Prolin DH benötigt benötigt NAD(P)+ als Cofaktor,

während die Prolin Oxidase für die Reaktion zum P5C mit einem Elektronenakzeptor

(FAD+, Cytochrom c) arbeitet. Die Umsetzung von P5C zu Glutaminsäure katalysiert

die P5C DH (EC 1.5.1.12) mit NAD(P)+ als Cosubstrat.

Quaternäre Ammoniumverbindungen

Betaine sind Aminosäurederivate, in denen das Stickstoffatom vollständig methyliert

ist. Glycinbetain (Abb. 1.8) ist als osmotisch wirksame Substanz bzw. compatible solu-te in Algen und Blütenpflanzen weit verbreitet (zusammengefaßt von McNeil et al.,

1999; Hanson, 1992). Der Syntheseweg von Glycinbetain ist allerdings bisher nur in ei-nigen Blütenpflanzen nachgewiesen worden (Abb. 1.9; McNeil et al., 1999; Hanson,

1992) und streng lichtabhängig (Gage & Rathinaasabapathi, 1999).

Abb. 1.8: Strukturformeln der quaternären Ammoniumverbindungen Glycinbetain, Homarin und Trigonellin. (Quellen: Glycinbetain: Vairavamurthy et al., 1985; Homarin: http://home.ncifcrf.gov/mtddp/compounds/714351.html; Trigonellin: http://home.ncifcrf.gov/mtddp/compounds/714350.html; Zugriffe: 29.08.2002).

Neben der Funktion als Osmotikum gilt Glycinbetain auch als Methylgruppendonator,

Kohlenstoff- und Stickstoffquelle.

Glycinbetain Homarin Trigonellin

CH3 CH3

Einleitung

14

Der Syntheseweg von Homarin (Abb. 1.8) ist noch weitgehend unbekannt. Nishitani et

al. (1995) haben ein Enzym aus der Turbanschnecke (Batillus cornutus) isoliert, wel-

ches aus Picolinsäure und S-Adenosyl-Methionin S-Adenosyl-L-Homocystein syntheti-

siert.

Trigonellin (Abb. 1.8) wird aus Nikotinsäure synthetisiert, auf die eine Methylgruppe

von S-Adenosylmethionin übertragen wird. Die Reaktion wird von der Nikotinsäure N-

Methyltransferase katalysiert (http://www.hort.purdue.edu/rhodcv/hort640c/onium/on00

005.html; Zugriff 29.08.2002).

Abb. 1.9: Syntheseweg von Glycinbetain (Betain) in höheren Pflanzen. Das Produkt der CMO-Reaktion ist die Hydratform von Betainaldehyd, die in einem ständigen Gleichgewicht mit der Carbonylform steht. Abkürzungen: CMO = Cholin Monooxygenase (Fd = Ferredoxin-abhängig) BADH = Betain Aldehyd DH (NAD(P)H-abhängig) (Quelle: Hanson, 1992)

Dimethylsulfoniumpropionat

Die tertiäre Schwefelverbindung DMSP ist strukturell dem Glycinbetain sehr ähnlich

(Abb. 1.10) und hat ähnliche chemische und physiologische Eigenschaften (Erdmann & Hagemann, 2001; McNeil et al., 1999; Malin & Kirst, 1997; Kirst, 1996; Hanson et al.,

1994). Hauptproduzenten von DMSP sind marine Mikro- und Makroalgen (Dickson &

Kirst, 1986), denen DMSP als osmotisch wirksame Substanz dient. Untersuchungen von Gröne & Kirst (1991) bestätigen anhand von in-vitro-Aktivitätstest die Wirkung als

compatible solute. DMSP wird gewöhnlich zusätzlich zu anderen Osmolyten syntheti-

Betainaldehyd

Cholin Glycinbetain

Einleitung

15

siert (Malin & Kirst, 1997). Die Synthese von DMSP ist relativ „teuer“ für den Organis-

mus, da allein für die Assimilation von Schwefel (über Sulfat) der Energieaufwand

höher ist als für Stickstoff (über Nitrat). Möglicherweise induziert Stickstoffmangel einen

Proteinabbau und das daraus stammende Methionin kann für die DMSP-Synthese ge-

nutzt werden und dadurch stickstoffhaltige Osmolyte in ihrer Funktion ersetzen (Kirst,

1996).

Abb. 1.10: Strukturformel von Dimethylsulfoniumpropionat (DMSP); strukturell dem Glycin-betain sehr ähnlich (Abb. 1.8) und daher mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften (Quelle: Vairavamurthy et al., 1985).

Neben seiner Funktion als Osmolyt und compatible solute ist DMSP eine der Haupt-

quellen für das flüchtige Dimethylsulfid (DMS), dem aufgrund seiner klimarelevanten

Bedeutung viel Aufmerksamkeit gewidmet worden ist und wird (Ledyard & Dacey,

1994).

Der Schwefel für die Neusynthese von DMSP während des Wachstums stammt nach

Berechnungen von Matrai & Keller (1994) nicht aus internen proteinogenen Quellen.

Ob der Schwefel als Sulfat von außen aufgenommen und reduziert oder ob er aus an-

deren Quellen stammt, ist noch unklar. Der Syntheseweg von DMSP verläuft in Algen (in z.B. Tetraselmis subcordiformis; Macdonald et al., 1996; O. Wandschneider, pers.

Mitteilung) und höheren Pflanzen (Hanson et al., 1994) über Methionin als Ausgangs-

substanz, allerdings sind insgesamt drei Synthesewege identifiziert worden: zwei in hö-

heren Pflanzen und einer in Algen. Sie unterscheiden sich in der oxidativen Decarboxy-

lierung und der Reihenfolge der Methylierung (Abb. 1.11) (Erdmann & Hagemann,

2001).

Einleitung

16

Abb. 1.11: Biosyntheseweg für DMSP in Algen (Quelle: Stefels, 2000) Abkürzungen: met = Methionin

MTOB = 4-Methylthio-2-Oxobutyrat MTHB = Methylthio-2-Hydroxybutyrat DMSHB = Dimethylsulfonium-2-Hydroxybutyrat

DMSP = Dimethylsulfoniumpropionat = Methionin Aminotransferase

= 4-Methylthio-2-Oxobutyrat Reduktase = Methylthio-2-Hydroxybutyrat Methyltransferase

= Betainaldehyd DH

Neben seiner Funktion als Osmolyt und compatible solute dient DMSP in marinen Mak-roalgen (Karsten et al., 1990) und Mikroalgen (Stefels, 2000) als kryoprotektive Sub-

stanz.

Freie Aminosäuren

Aminosäuren sind Schlüsselfaktoren im Metabolismus und in der Entwicklung von Or-

ganismen. Mehr noch haben sie signalübertragende Funktion, kontrollieren ihren eige-

nen Metabolismus und die Expression einer Vielzahl von Genen. Als Metabolite sind

die freien Aminosäuren (FAS) insgesamt interessant, da durch sie Aussagen über den

metabolischen Zustand der Zellen getroffen werden können. Die Gesamtkonzentration

kann sich z.B. bei Salzstreßexposition erhöhen.

Die Zusammensetzung der FAS in Mikroalgen ist allerdings wenig aussagekräftig, da

sie starken Fluktuationen durch Zellalter, Zelldichte, Nährsalzangebot etc. ausgesetzt

ist (Nothnagel, 1994; Flynn, 1990a; Flynn, 1990b). Zudem sind die interspezifischen

S COO-

NH3+

S COO-

OH

S+

COO-

OH

S+

COO-

S COO-

O

met MTOB MTHB

DMSP DMSHB

S COO-

NH3+

S COO-

OH

S+

COO-

OH

S+

COO-

S COO-

O

met MTOB MTHB

DMSP DMSHB

Einleitung

17

Unterschiede zu groß, um Verwendung in der Praxis finden zu können (Flynn, 1990a).

Mit Hilfe des Konzentrationsverlaufes bestimmter Aminosäuren im Rahmen physiologi-

scher Experimente können dennoch Rückschlüsse auf den aktuellen Zellmetabolismus

gezogen werden (Atilio & Causin, 1996). Glutamin und Glutaminsäure sind die beiden

wichtigsten, da sie eine zentrale Rolle in der initialen Inkorporation des Ammoniums

und der Synthese der Aminosäuren, Nukleinsäuren etc. einnehmen (Flynn, 1990b).

Das Glutamin-zu-Glutaminsäure-Verhältnis wird als ein relativ sicherer Anzeiger für

den Stickstoffstatus einzelliger Algen beschrieben: bei einer ausreichenden Stickstoff-

versorgung ist der Wert größer als 0,4 bis 0,5, bei stickstoffverarmten Kulturen liegt er unter 0,1 (Martin-Jézéquel et al., 1992; Flynn & Hipkin, 1990; Dortch et al., 1985).

Aufgrund des Zusammenhangs mit dem Prolinmetabolismus liegt das Hauptaugen-

merk auf den Aminosäuren Glutaminsäure, Glutamin und Arginin. Letztere sind wegen

ihrer stickstoffspeichernden Funktion und ihrer Rolle als Vorläufer für die Ornithin- bzw.

Glutaminsäuresynthese interessant (vgl. Abb. 1.7; 1.12). Arginin wird im Harnstoffzyk-lus durch die Arginase (EC 3.5.3.1) zu Ornithin umgesetzt (Alabadí et al., 1996). Or-

nithin wird anschließend in ein Mitochondrium transportiert und kann dort zu Prolin

metabolisiert werden (vgl. Abb. 5.6). Glutamin und Glutaminsäure spielen die Schlüs-

selrolle in der Stickstoffassimilation. In marinen Diatomeen findet die Assimilation des

Ammoniums wie bei höheren Pflanzen zu über 90% über das GS-GOGAT-System statt

(Marsot et al., 1991; Al-Amoudi & Flynn, 1989; Abb. 1.12). Die auf diesem Weg synthe-

tisierte Glutaminsäure ist der Stickstoffdonator bei der Biosynthese aller essentiellen

zellulären Stickstoffkomponenten (Chen & Silflow, 1996) und damit der Aminosäuren.

Einleitung

18

Abb. 1.13: Stickstoffassimilierung über das GS-GOGAT-System. Die Reaktion läuft größtenteils im Chloroplasten ab und bildet den für die Aminosäurebiosynthese entscheidenden Schritt der Aminierung. Abkürzungen: GS: Glutamin-Synthetase; GOGAT: Glutamin:2-Oxoglutarat-Aminotransferase

1.3 Fragestellung

Die Fähigkeit, organische Osmolyte zu synthetisieren, wird als eine der wichtigsten Ei-

genschaften bei Eisalgen angesehen, um die Bedingungen in den hochsalinen und kal-

ten Eiskanälen des antarktischen Meereises zu tolerieren. Bezüglich dieser Thematik

liegen in der vorliegenden Arbeit zwei Schwerpunkte: Der erste beschäftigt sich mit

Prolin, das nach bisherigen Erkenntnissen als Hauptosmolyt in antarktischen Eisdiato-

meen gilt und bereits bei normaler Meerwassersalinität (34 PSU) in hohen Basiskon-zentrationen in Chaetoceros sp. und Navicula sp. synthetisiert wird, die die Summe

aller anderen FAS übersteigen (Nothnagel, 1994). Gleichzeitig ist über die Enzymatik

und Regulation dieses Osmolyten in den Eisdiatomeen wenig bekannt (vgl. Kap. 1.2).

Der zweite Schwerpunkt befaßt sich mit der Frage, ob ein Zusammenhang zwischen

der Fähigkeit, Prolin und/oder andere organische Osmolyte zu synthetisieren, und der

vertikalen Verteilung der einzelnen Arten in der Eissäule besteht (vgl. Abb. 1.13 und

1. Schritt: Glutamin-Synthese

C O O -

C H

C H 2

C H 2

C O - O

H 3 N

G l u t a m a t

G S + N H 4 +

+ A T P

C O O -

C H

C H 2

C H 2

C

O N H 2

H 3 N

Glutamin

+ A D P + P i

+ +

2. Schritt (irreversibel): Transfer der Amidogruppe des Glutamins auf 2-Oxoglutarat

COO-

C H

CH2

CH2

C

O NH2

H3N

Glutamin

+

COO-

C O

CH2

CH2

C

OO-

2-Oxoglutarat

GOGAT

2H+

2

COO-

C H

CH2

CH2

CO-O

H3N

Glutamat

+ +

Glutaminsäure

Glutaminsäure

Einleitung

19

Abb. 1.13: Abioti scheFakt or en

inner halbeiner antarkt ischen

Ei ssäul eund deren

Bedeutungfür di e Lebensbedingungen

der eingeschlossenen

Organi sm

en( im

Winter ): I n derM

it tedie schem

at is i er teD

ar stell ungder Eissäule

mitden Ei sgem

einschaft ennach

derDefi niti on von H

or ner et al.

( 1992) ; auf derli nkenSeite

di e demver tikal en

Ei ssäulenver lauf ent sprechendenG

r adient enderBestr ahlungsst ärke, Sal init ätund Tem

per atur

(nachM

cGr ath G

rossi & Sull ivan ( 1985) ) ; auf derrechtenS ei te

di e vierimLangzei tver such

ver wendeten

ant arkti schenD

iat omeen

ent sprechend

i hrer Ver tei lungin der Eissäule

bzw. im

P el agial. Größen

der Ar tensind

nichtmaßstabsgetr eu.

= Eisdi atomeen

= Chaet oceros

sp. = Ni tzschi a

lecointei= Am

phipror akuff erat hi i

IBestrahlungsstärke[µmol Photonen*m-2*s-1]

Salinität[PSU]

Temperatur[°C] -2

-3015 03 4

16 000

⇒variab le Lebens beding ungen:

groß eG

rad ientenvon Licht,

Sa linit ät, Te mperatu r, R

a um

⇒k onstant e

L ebensbe dingun gen:

niedrig eBestrah lungsstärken ,

no rmale

Meerw

ass erkonze ntration,W

as sertemp eraturvon -1,8 °C

Obe rflächen-

Unt ereis-

Z wischen-

eis-

Boden eis-

Schn ee

Band

E islaugen-kana l

S chmelz tüm

pel

Gem

eins chaft

= Coret hron pen natum

Abb. 1.13: Abioti scheFakt or en

inner halbeiner antarkt ischen

Ei ssäul eund deren

Bedeutungfür di e Lebensbedingungen

der eingeschlossenen

Organi sm

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it tedie schem

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( 1992) ; auf derli nkenSeite

di e demver tikal en

Ei ssäulenver lauf ent sprechendenG

r adient enderBestr ahlungsst ärke, Sal init ätund Tem

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(nachM

cGr ath G

rossi & Sull ivan ( 1985) ) ; auf derrechtenS ei te

di e vierimLangzei tver such

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i hrer Ver tei lungin der Eissäule

bzw. im

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der Ar tensind

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= Eisdi atomeen

= Chaet oceros

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IBestrahlungsstärke[µmol Photonen*m-2*s-1]

Salinität[PSU]

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niedrig eBestrah lungsstärken ,

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eis-

Boden eis-

Schn ee

Band

E islaugen-kana l

S chmelz tüm

pel

Gem

eins chaft

= Coret hron pen natum

Einleitung

20

Kap. 1.1). Mit Unterstützung der durchgeführten Experimente soll die Hypothese einer Zonierung, die neben der Zellgröße auch auf physiologischen Eigenschaften der Eisdi-

atomeen beruht, bestätigt werden; ähnlich wie es von Makroalgen an Felsküsten be-kannt ist. Folgende drei Versuchskomplexe wurden durchgeführt: 1. Neun antarktische Diatomeenarten, die typischerweise in unterschiedlichen Eisge-

meinschaften bzw. vorwiegend im freien Wasser gefunden werden (Einzelheiten in Kap. 2.1 und Abb. 2.6), werden unter hypo-, iso- und hyperosmotischen Bedingun-gen gehältert und die Zusammensetzung ihrer organischen Osmolyte und freien Aminosäuren ermittelt. Dieses Screening soll weitere Daten zur Untermauerung der Erkenntnis von Prolin als Hauptosmolyten in Eisdiatomeen liefern und das Verhält-nis der Iminosäure zu den FAS dargestellt werden (Abb.1.14).

Abb. 1.14: Versuchsverlauf für das Osmolyten- und FAS-Screening in 9 antarktischen Diato-meen. Einzelheiten siehe Text (Punkt 1). Abkürzung: FAS = freie Aminosäuren. 2. Die Diatomeenarten Chaetoceros sp., Amphiprora kufferathii und Nitzschia lecoi-

ntei wurden zur Überprüfung der Zonierungshypothese einem Langzeitversuch

ausgesetzt. Die Arten kommen in unterschiedlichen Eisbereichen vor (Einzelheiten in Abb. 1.13 und Kap. 2.1). Aufgrund von Untersuchungen der letzten Jahre gibt es

Hinweise darauf, daß sie sich entsprechend ihrer vertikalen Verteilung im Eis phy-siologisch voneinander unterscheiden (z.B. Schriek, 2000; Wanzek, 1994). Mit Co-

rethron pennatum wurde eine Art aus dem marinen Milieu des Südolarmeeres in

den Versuch einbezogen. Wie in Kap. 1.1 dargestellt, sind Algen der Oberflächen- und Zwischeneisgemeinschaften großen Schwankungen der Lebensbedingungen ausgesetzt: die Arten – wie Chaetoceros sp. und Nitzschia lecointei – müssen Fluk-

tuationen besonders der Temperatur und des Salzgehaltes ebenso tolerieren wie die der Bestrahlungsstärke. Im Gegensatz dazu leben die Arten der Bodeneis- und

Salinitäten: 17, 34 und 51 PSU

9 Arten

Osmolyte FAS

Salinitäten: 17, 34 und 51 PSU

9 Arten

Osmolyte FAS

Einleitung

21

Untereisgesellschaften (im Versuch durch Amphiprora kufferathii und Corethron

pennatum vertreten) in einer vergleichsweise stabilen Umwelt: die Salinität ist re-

lativ konstant und die Wassertemperatur beträgt ca. –2°C. Sie sind Schwachlicht-bedingungen ausgesetzt. Neben den Toleranzgrenzen für Temperatur und Salinität wurde untersucht, inwieweit sich die Zusammensetzung von niedermolekularen or-ganischen Osmolyten, insbesondere von Prolin, verändert und von deren Pool ein Rückschluß auf die physiologischen Eigenschaften gezogen werden kann.

Abb. 1.15: Versuchsverlauf für den Langzeitversuch mit vier ausgewählten antarktischen Dia-tomeen. Die Algen wurden langsam steigenden Salinitäten sowohl bei 0°C als auch bei gefrie-punktsnahen Temperaturen ausgesetzt und in bestimmten Abständen die organischen Osmoly-te analysiert. Einzelheiten siehe Text (Punkt 2). Abkürzungen: Max. = Maximum T = Temperatur Artnamen siehe Text (Seite 22)

3. Der zeitliche Ablauf der intrazellulären Prolinakkumulation und anderen, in die Syn-these involvierten Substanzen (FAS, P5C, Proteingesamtgehalt) nach einem hy-perosmotischen Schock bildet zusammen mit der Enzymatik des Prolinmetabolis-mus den letzten Abschnitt (Abb. 1.16). Die Fluktuationen der bestimmten Größen sollen zum Verständnis der Regulation der hyperosmotisch bedingten Prolinakku-mulation beitragen.

Langzeitexperiment:Hyperosmotische Bedingungen34 PSU langsam steigend; Max.: 196 PSU

0°C

9 Monate

T nahe Gefrierpunkt

Chaetoceros sp. Co. pennatumA. kufferathii Ni. lecointei

OsmolyteSalinitäts- / Temperaturgrenzen

Langzeitexperiment:Hyperosmotische Bedingungen34 PSU langsam steigend; Max.: 196 PSU

0°C

9 Monate

T nahe Gefrierpunkt

Chaetoceros sp. Co. pennatumA. kufferathii Ni. lecointei

OsmolyteSalinitäts- / Temperaturgrenzen

Einleitung

22

Abb. 1.16: Versuchsverlauf für die Kurzzeitexperimente im Rahmen des Prolinmetabolismus. Einzelheiten siehe Text (Punkt 3). Abkürzungen: P5C = ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure FAS = freie Aminosäuren Artnamen siehe Text (unten) Abschließend noch zwei Hinweise zur Benennung der Arten: Gattungsnamen der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Spezies, die denselben Anfangsbuchstaben auf-weisen, werden im Rahmen dieser Arbeit ggf. mit zwei Buchstaben abgekürzt, um Verwechslungen zu vermeiden. Beispielsweise wird Nitzschia mit Ni. und Navicula mit Na. angegeben.

Die für diese Arbeit durchgeführten Experimente beruhen auf Ergebnissen aus frühe-ren Arbeiten der AG Kirst, die z.T. mit denselben Isolaten durchgeführt worden sind. Da im Rahmen der Diskussion nicht ständig auf dieses Faktum hingewiesen werden kann, findet sich im Anhang (Tab. 9.4) eine Aufstellung der zitierten Arbeiten inklusive der behandelten Arten.

Kurzzeitexperiment:Salzschock 34 auf 68 PSU

Chaetoceros sp.A. kufferathiiNi. lecointei

Prolin

ProlinP5CFASEnzymaktivitäten

Charakterisierung

Kurzzeitexperiment:Salzschock 34 auf 68 PSU

Chaetoceros sp.A. kufferathiiNi. lecointei

Prolin

ProlinP5CFASEnzymaktivitäten

Charakterisierung

Material und Methoden

23

2 Material und Methoden

Zur besseren Übersicht ist in Abb. 2.1 ein Schema über die verwendeten Methoden und Meßgrößen inkl. der verwendeten Extraktion dargestellt.

Abb. 2.1: Übersicht über die verwendeten Methoden und Meßgrößen. Kasten: Methoden für die in fetten Buchstaben angegebenen Meßgrößen. Abkürzungen: L.-Mikroskop: Lichtmikroskop, EtOH: Ethanol, PCA: Perchlorsäure, TCA: Trichlor-essigsäure, GC: Gaschromatographie, HPLC: High Pressure Liquid Chromatography (Hochlei-stungsflüssigchromatographie), FAS: freie Aminosäuren, P5C: ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure, DMSP: Dimethylsulfoniumpropionat, Quacs: quaternäre Ammoniumverbindungen

2.1 Organismen

Nachfolgend ist eine Aufstellung über die 9 in den verschiedenen Experimenten unter-suchten antarktischen Diatomeen einschließlich ihrer Herkunft und ihrer bevorzugten Habitate aufgeführt. Im Anschluß findet sich in Abb. 2.6 in Anlehnung an Abb. 1.13 eine schematische Darstellung über die Verteilung der Arten in Eis- und Wassersäule. Im Bild werden nur die vier im Langzeitversuch (Kap. 2.4) verwendeten Arten darge-stellt. Ansichten der anderen Arten finden sich im Internet unter http://www.marbot.uni-bremen.de. Actinocyclus actinochilus (Ehrenberg) Simonsen

A. actinochilus ist eine zentrische Diatomee mit einem Durchmesser von 25 bis 100 µm. Die Volumenagaben für diese Art bewegen sich zwischen 34184 µm3 (Kang et al.,

Algen

PCA

Filtration

Alkalisierung Zellmühle

GC

DMSP Pigmente

Pelletierung

EtOH

ZuckerPolyoleQuacs

Ectoine

FAS

TCA

P5C

HPLC-Methoden

Extrakte

ZellzahlL.-MikroskopCoulter Counter

andere

Photometrie

Prolin Protein Enzyme

Photometrie


24

2001) und 91986 µm3 (Moro et al., 2000). Sie wurde aus Proben der Expedition ANT

XVI/3 1999, die uns von Frau D. Stübing (AG Hagen, Universität Bremen) zur Verfü-

gung gestellt worden waren, im Rahmen dieser Arbeit isoliert. Die Identifikation wurde anhand von elektronenmikroskopischen Verfahren bestätigt. Die Aufnahmen wurden von Frau D. ElMaghrabi im Alfred-Wegener-Institut (Bremerhaven) angefertigt. A. actinochilus lebt hauptsächlich im Pelagial. Dort werden größere Dichten vor allem unter dem Eis (Moro et al., 2000) und im Bereich von Eiskanten erreicht (Kang et al.,

2001). In der Eissäule selbst trifft man die Art in den untersten 10 cm im Bereich der Eis-Wasser-Grenze (Weissenberger, 1992) oder in Eisstrukturen mit größeren Laugen-kanälen, wie dem körnigen Eis (Watanabe et al., 1990), an.

Chaetoceros gracile Schütt

C. gracile ist eine kleinzellige Art von 20 bis 30 µm Durchmesser, die zu den Centrales

gehört und praktisch in allen Bereichen des Pelagials und der Eissäule angetroffen wird (Günther & Dieckmann, 2001; Moro et al., 2000; Clarke & Leakey, 1996; Bianchi et al., 1992). Sie wird auch in den Infiltrationsgesellschaften, die mit Meerwasser über-

spült werden und hohen Bestrahlungsstärken ausgesetzt sein können, gefunden (Gleitz & Kirst, 1991). Nach Bartsch (1989) fehlen Chaetoceros-Arten in den unteren

Eisschichten; andere Autoren berichten jedoch auch von einer Dominanz dieser Gat-tung in dem genannten Bereich (Gleitz & Kirst, 1991). C. gracile ist aufgrund ihres Le-

bensraumes starken Veränderungen in Lichteinfluß, Salinität, Temperatur und Raum-angebot unterworfen. Die Alge wurde aus Proben von der Expedition ANT XVI/3 (18.03.99 bis 10.05.99) von Herrn T. Mock (Alfred-Wegener-Institut, Bremerhaven) isoliert und der AG Kirst als axenische Kultur im Februar 2000 zur Verfügung gestellt. Chaetoceros sp.

Diese kleinzellige Chaetoceros (Abb. 2.2) konnte nicht bis zur Art bestimmt werden (Nothnagel, 1994). Kleinzellige Arten dieser Gattung weisen Ähnlichkeit mit C. neogra-

cile auf und werden deshalb oft auch als C. neogracile bezeichnet. Da diese nicht kor-

rekte Namengebung zu Fehlinterpretationen führen kann, empfiehlt sich nach Gleitz & Thomas (1993) eher die Bezeichnung Chaetoceros cf. neogracile. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Art als Chaetoceros sp. geführt. Chaetoceros sp. wurde 1986 im Rahmen de Winter Weddell Sea Projects (WWSP) aus

Packeisproben während der Antarktisexpedition ANT V2/3 mit FS Polarstern isoliert und ist seitdem in der AG Meeresbotanik in Kultur. Nothnagel (1994) hat die


25

Zellvolumina der Laborkulturen zwischen 58 µm3 (51 PSU) und 78 µm3 (17 PSU) bestimmt.

Abb. 2.2: Chaetoceros sp. lebend. Vergrößerung: 1000x

Wie bei C. gracile werden als Habitat für die kleinzelligen Chaetoceros-Arten das Pela-gial, die Plättcheneisschicht und die gesamte Eissäule genannt (Thomas et al., 1992;

Gleitz & Kirst, 1991; Bartsch, 1989). Sie gelten als typische Vertreter für mit Eis assozi-ierten Diatomeen (Pakhomov et al., 2001) und werden aufgrund ihrer geringen Größe in hohen Dichten in der Zwischeneisgemeinschaft vorgefunden (Watanabe et al., 1990), oft zusammen mit Arten der Gattung Fragilariopsis (Pakhomov et al., 2001).

Corethron pennatum (Grunow) Ostenfeld

Co. pennatum (Abb. 2.3) ist auch unter dem Namen Co. criophilum Castracane be-

kannt. Diese Art wurde aufgrund elektronenmikroskopischer Untersuchungen von Crawford et al. (1998) in C. pennatum umbenannt. Co. pennatum ist ein typischer Ver-treter der Diatomeen für das Pelagial (Pakhomov et al., 2001; Semeneh et al., 1998;

Clarke & Leakey, 1996; Fiala & Oriol, 1990) und bildet im Bereich der Südpolarfront punktuell dichte Blüten (Hense et al., 2000). Außerdem wird sie im freien Wasser unter dem Eis (Moro et al., 2000), in den untersten 10 cm der Eissäule (Weissenberger, 1992) und in der Nähe von Schmelzeiskanten vorgefunden (Kang et al., 2001; Bianchi et al., 1992). Co. pennatum wird den Centrales zugerechnet. Die Größe des sich in

Kultur befindlichen Isolats wird mit 21 bis 64 µm Breite und 100 bis 400 µm Länge an-gegeben; das entspricht Volumina von 11000 µm3 bis 640000 µm3 (Elvers, 1998). Aus Freilandproben wurden Volumina zwischen 20027 µm3 (Günther & Dieckmann, 2001) und 68427 µm3 (Moro et al., 2000) gemessen. Co. pennatum gilt vor allem wegen ihres hohen Silikatbedarfs als eine Nährsalzvorkommen anzeigende Art (Hense et al., 2000;

Elvers, 1998). Die genaue Herkunft des vorliegenden Isolats war nicht mehr nachzuvollziehen. Co.

pennatum ist seit mindestens 1995 in der AG Meeresbotanik in Kultur.


26

Abb. 2.3: Co. pennatum, lebend. Vergrößerung: 1000x

Amphiprora kufferathii Manguin

Viele Arten der Gattung Amphiprora Ehrenberg sind nach Patrick & Reimer (1975) der Gattung Entomoneis Ehrenberg zugeordnet worden. Nach dem heutigen Kenntnis-stand ist die Art Amphiprora kufferathii Manguin von diesem Transfer nicht betroffen

(Günther & Dieckmann, 2001). Aktuelle bisher nicht veröffentlichte molekularbiologi-sche Untersuchungen bestätigen die Zuweisung zur Gattung Amphiprora (C. Gobin, M.

Poulin, pers. Mitteilung). Bei der in früheren Arbeiten der AG Kirst (vgl. Tab. 9.4) ver-wendeten Bezeichnung Entomoneis kufferathii Manguin handelt es sich um dasselbe Isolat wie das in dieser Arbeit als Amphiprora kufferathii Manguin bezeichnete. Die pennate A. kufferathii (Abb. 2.4) wurde 1986 im Rahmen des Winter Weddell Sea

Projects (WWSP) aus Packeisproben während der Antarktisexpedition ANT V2/3 mit FS Polarstern isoliert und ist seit dieser Zeit in der AG Meeresbotanik in Kultur. Wan-zek (1994) hat das Volumen von A. kufferathii mit 6467 µm3 (-3,5°C; 68 PSU) und 7574

µm3 (4°C; 34 PSU) angegeben.

Abb. 2.4: A. kufferathii lebend. Vergrößerung: 1000x

A. kufferathii ist ein typischer Vertreter der Boden und Untereisgesellschaft (Pakhomov et al., 2001; Andreoli et al., 2000; Moro et al., 2000; Günther & Dieckmann, 1999; Hor-ner et al., 1992; Watanabe et al., 1990; Bartsch, 1989). Als dominante Art bildet sie un-

ter dem Eis lange Zellketten, die wie Vorhänge in das freie Wasser hängen können

(Bartsch, 1989). Neben den mattenbildenden Vorkommen unter dem Eis wird sie hauptsächlich in den unstrukturierten und großräumigen Plättcheneisbereichen im un-


27

teren Teil der Eissäule gefunden; innerhalb der Eissäule ist die Zahl der Zellen mäßig (McGrath Grossi & Sullivan, 1985). Im freien Wasser kommt sie in geringen Mengen nur nahe Eisbruchkanten und Schmelzeisrändern vor (Pakhomov et al., 2001; McGrath

Grossi & Sullivan, 1985). Im Hauptlebensraum Bodeneis im Bereich der Eis-Wasser-Grenze ist A. kufferathii vergleichsweise geringen Schwankungen der Salinität, Tempe-

ratur und Raumangebot ausgesetzt. Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger

Die pennate Art F. cylindrus ist neben den kleinzelligen Chaetoceros-Arten die charak-

teristische Eisalge, die in praktisch jedem Habitat des Eises abundant werden kann und die typischerweise, wie andere Vertreter ihrer Gattung, mit Eis assoziiert vorkommt (Trenerry et al., 2002; Pakhomov et al., 2001; Thomas et al., 2001). Auch im Pelagial kann sie hohe Dichten erreichen (Moro et al., 2000). F. cylindrus bzw. Arten dieser

Gattung werden i.d.R. nicht vereinzelt, sondern als eher dominant auftretende Arten

mit hohen Zelldichten gefunden. Das gilt für die Vorkommen in Schmelzwassertümpeln (Gleitz et al., 1996) ebenso wie für die des oberen Bereiches der Eissäule (Günther & Dieckmann, 1999) und der Bodeneisgesellschaft (Günther & Dieckmann, 2001). F. cy-

lindrus ist damit ebenso wie die Chaetoceros-Arten sehr variablen Lebensbedingungen

ausgesetzt. Die Alge wurde aus Proben von der Expedition ANT XVI/3 (18.03.99 bis 10.05.99) von Herrn T. Mock (Alfred-Wegener-Institut, Bremerhaven) isoliert und der AG Kirst im Herbst 2000 zur Verfügung gestellt. Navicula gelida var. antartica Grunow

Die Alge wurde aus Proben von der Expedition ANT XVI/3 (18.03.99 bis 10.05.99) von

Herrn T. Mock (Alfred-Wegener-Institut, Bremerhaven) isoliert und der AG Kirst als axenische Kultur im Februar 2000 zur Verfügung gestellt. Über bevorzugte Habitate dieser pennaten Art konnten keine Angaben gefunden wer-den. Es ist aufgrund der Zellgröße (sie liegt zwischen der von Chaetoceros sp. und Ni.

lecointei) und Vergleichsdaten mit anderen Arten der Gattung Navicula zu vermuten,

daß sie in der gesamten Eissäule zu finden ist, von der Infiltrationsgesellschaft (Gleitz & Kirst, 1991) bis zur Bodeneisgesellschaft (Watanabe et al., 1990). Da diese Art zur

Fortbewegung fähig ist, ist auch eine Migration innerhalb einer Eissäule möglich, wie sie bei Ni. lecointei beobachtet wird.


28

Nitzschia lecointei Van Heurck

Ni. lecointei (Abb. 2.5) kann im küstennahen Eis zu einer dominanten Art der Bodenge-sellschaft avancieren und dort Abundanzen von 25 bis 75% erreichen (Horner et al., 1992; Watanabe et al., 1990). Wachstum findet v.a. im Herbst und Frühjahr statt. Stel-

lenweise wird die Bildung dichter Matten erreicht. Im Frühjahr wandert die Art innerhalb der Eissäule in Richtung Lichtquelle nach oben und wird sowohl innerhalb der Eissäule als auch in der Infiltrationsgesellschaft in hoher Zahl gefunden (Gleitz & Kirst, 1991; Watanabe et al., 1990). Im Pelagial ist sie weniger zu finden, obwohl punktuelle Blüten in der Nähe von Schmelzeiskanten beobachtet worden sind (Semeneh et al., 1998; Clarke & Leakey, 1996). Auch diese Art ist, wie F. cylindrus und die beiden Chaetoce-

ros-Arten, stark unterschiedlichen abiotischen Faktoren ausgesetzt.

Abb. 2.5: Ni. lecointei lebend. Vergrößerung: 1000x

Diese pennate Art stammt aus Eisbohrkernen, die 1988 in der Weddell See während der Antarktisexpedition ANT VII/4 (EPOS leg 3) gezogen worden sind und ist seitdem in der AG Meeresbotanik in Kultur. Wanzek (1994) hat Zellvolumina zwischen 752 µm3 und 813 µm3 in den Laborkulturen (34 bis 68 PSU) bestimmt. Nitzschia medioconstricta Hustedt

Die Alge wurde aus Proben von der Expedition ANT XVI/3 (18.03.99 bis 10.05.99) von Herrn T. Mock (Alfred-Wegener-Institut, Bremerhaven) isoliert und der AG Kirst als axenische Kultur im Februar 2000 zur Verfügung gestellt. Die pennate Art Ni. medioconstricta wird in den untersten 10 cm der Eissäule gefunden

(Weissenberger, 1992); weitere Literaturhinweise zum Vorkommen dieser Art liegen nicht vor. Aufgrund der im Vergleich zu Ni. lecointei großen Art erscheint ein Vorkom-

men in Eisbereichen unwahrscheinlich, die durch Laugenkanäle mit sehr geringem Durchmesser gekennzeichnet sind, wie z.B. dem oberen Bereich des Säuleneises. Generell werden Arten der Gattung Nitzschia in jungem Eis häufig beobachtet (Trenerry et al., 2002).


29

Oberflächengem.

Zwischeneisgem.

Boden- / Untereiseisgem.

Pelagial

Schnee

Eislaugen-kanal

Schmelztümpel

Chaetoceros sp.C. gracileF. cylindrus

Chaetoceros sp.C. gracileF. cylindrusNa. gelidaNi. lecointei

A. actinochilusChaetoceros sp.C. gracileA. kufferathiiF. cylindrusNa. gelidaNi. lecointeiNi.medioconstricta

A. actinochilusCo. pennatum4

3

2

11

2

3

4

Abb. 2.6: Verteilung der neun untersuchten Arten nach ihren Hauptvorkommen innerhalb der Eissäule bzw. dem Pelagial in Anlehnung an Abb. 1.13. Dort sind auch die zugehörigen abiotischen Faktoren dargestellt, die hier der Übersicht wegen fehlen. Die Definitionen der Eis-gemeinschaften richten sich nach Angaben von Horner et al. (1992).

2.2 Kultivierung der Stammalgen

Medium

Seewasser der Nordsee (30 – 33 PSU), vorfiltriert (Partikelfilter) und sterilfiltriert (0,22 µm, Durapore CVGL-Filter, 24 cm lang, Millipore corporation, Bedford, MA, USA) Geräte

Sicherheitssterilbank Typ CA / REV 6, Haan

Conductometer LF 191, WTW, Weilheim pH-Meßgerät pH530, WTW, Weilheim Peristaltikpumpe Sartorius AG, Göttingen Sterilfilter: Vorfilter Sartopure PP2 5591302P9–NN (3 µm); Endfilter Sartobran P

5231307H8–VO–B (0,45 µm und 0,2 µm), Sartorius AG, Göttingen


30

Kühltruhe (modifiziert für die Algenanzucht), Comfort Plus, Siemens, München Leuchtstoffröhren L36W / 12-950 Lumilux de Luxe Daylight, Osram

Quantum Radiometer / Photometer Licor-185 B, mit Cos-Quantum-Sensor Li-190SB

und 4π Spherical Quantum Sensor Li-193SB, LI-COR Inc., USA

Als Medium für die Stammkulturen wurde vorfiltriertes Nordseewasser einer Salinität

von 30 bis 33 PSU verwendet und mit 2x f/2 β-Nährlösungen (Guillard, 1975; zitiert

nach Bidwell & Spotte, 1985; siehe Anhang, Tab. 9.2) sowie 2,4 mM Natriumhydrogen-carbonat als Kohlenstoffquelle angereichert. Das über Nacht bei 0°C gekühlte und equilibrierte Medium wurde auf pH 7,8 eingestellt, sterilfiltriert und bei 0°C gelagert.

Die Algen wurden bei einer Temperatur von 0°C (± 0,5°C) und einem Licht-Dunkel-

Rhythmus von 12 : 12 Stunden bei einer Bestrahlungsstärke von 12 (Cos-Sensor) bzw.

25 µmol Photonen*m-2*s-1 (4π-Sonde) in sterilen 250 mL-Erlenmeyerkolben kultiviert.

Die Kultivierung erfolgte im Batch-Verfahren: alle 4 Wochen wurden - je nach Art und Zelldichte - 1 bis 3 mL Stammkultur, bei den großzelligen Arten A. actinochilus und Co.

pennatum ca. 10 mL, unter sterilen Bedingungen in neues Medium überführt. Die Kul-

turen wurden einmal täglich geschüttelt. Im Lichtmikroskop waren keine Bakterien zu erkennen; aber die Kulturen waren nicht axenisch bzw. wurden nicht auf Bakterienfreiheit getestet (letzteres gilt für die Arten C.

gracile, Na. gelida var. antarctica und Ni. medioconstricta, die im Februar 2000 als axe-

nische Kulturen von T. Mock (AWI) übernommen worden sind). Auf im Lichtmikroskop erkennbare Bakterienkontaminationen wird an entsprechenden Stellen hingewiesen.

2.3 Niedermolekulare organische Osmolyte und freie Aminosäuren der Stammkulturen

Geräte

Impfbank Inter Med, MDH Ltd., Andover, England




31

Leuchtstoffröhren 0°C-Raum: pro Lampe je 1 Lumilux plus L36W/11-860 Tageslicht, Lumilux de Luxe L36W / 32-930 Warmton, Osram

Minifuge GL 4400 mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Omnifuge 2.0 RS mit Rotor BS 4402/A, Heraeus Sepatech, Osterode Die niedermolekularen organischen Osmolyte (Kap. 2.6) und freien Aminosäuren (FAS; Kap. 2.7) wurden in allen 9 Arten bestimmt.

Die Kultivierung erfolgte in 2x f/2 β- Medium (Kap. 2.2) bei den Salinitäten 17, 34 und

51 PSU, um hypo-, iso- und hyperosmotische Bedingungen zu simulieren (vgl. voran-gegangene Untersuchungen, z.B. Nothnagel, 1994). Die Salinitäten wurden mit entmin-eralisiertem Wasser (17 PSU) bzw. hw-Meersalz + Bio-Elemente (34 und 51 PSU; Zusammensetzung siehe Anhang, Tab. 9.1) eingestellt und mit einem Conductometer überprüft. Vor Beginn der Versuche wurden die Algen 14 Tage an die entsprechenden Salinitäten und Lichtbedingungen akklimatisiert; die Kultivierung erfolgte in sterilen 1 L-Fernbachkolben. Die Kulturen wurden einmal täglich geschüttelt. Die Kultivierungsbe-dingungen sind Tab. 2.1 zu entnehmen.

Tab. 2.1: Kultivierungsbedingungen während der Versuche zur Bestimmung der niedermolekularen Osmolyte und freien Aminosäuren in neun antarktischen Diatomeen.

Parameter Einstellung

Temperatur [°C] 0 ± 0,5

Licht-Dunkel-Rhythmus [h] 12 : 12

Bestrahlungsstärke [µmol Photonen*m-2*s-1] 40

Salinität [PSU] 17, 34, 51

Aus den Kulturen wurden in der Phase des spätlogarithmischen bis beginnend statio-nären Wachstums Extrakte für die verschiedenen Analysen hergestellt (Kap. 2.6 / 2.7). Die Probenentnahme erfolgte durch Zentrifugation (0°C; Zentrifugeneinstellungen Tab. 2.2). Der zellfreie Überstand wurde durch einen mit einer Wasserstrahlpumpe erzeug-ten Unterdruck mittels einer Pasteurpipette abgesaugt. Als Bezugsgröße diente die Zellzahl, welche mit der Neubauer-Zählkammer ermittelt worden ist (Kap. 2.11.1). In Abb. 2.1 ist eine Übersicht über verwendete Methoden und Meßgrößen dargestellt.


32

Tab. 2.2: Zentrifugalzeiten und –geschwindigkeiten, die zur Pelletierung der verschiedenen Eis-algenarten verwendet wurden. Die Zentrifugen wurden bei einer Temperatur von 0°C betrieben.

Art Zentrifugalzeit [min] Relative Zentrifugalkraft [*g]

A. actinochilus 20 45,3

C. gracile 10 3669

Chaetoceros sp. 10 3669

Co. pennatum 30 45,3

A. kufferathii 7 398

F. cylindrus 5 1639

Na. gelida var. antarctica 5 3669

Ni. lecointei 7 1639

Ni. medioconstricta 5 560

2.4 Akklimatisation an hohe Salinitäten und tiefe Temperaturen: Langzeitversuch

Geräte

Kühltruhe (modifiziert für die Algenanzucht), Comfort Plus, Siemens, München mit Leuchtstoffröhren Philips TLD 36W / 95 Leuchtstoffröhren 0°C-Raum: je 1 Lumilux plus L36W / 11-860 Tageslicht, Lumilux de Luxe L36W / 32-930 Warmton, Osram

Conductometer LF 191, WTW, Weilheim

pH-Meßgerät pH530, WTW, Weilheim Peristaltikpumpe Sartorius AG, Göttingen Sterilfilter: Vorfilter Sartopure PP2 5591302P9–NN (3 µm); Endfilter Sartobran P


Impfbank Inter Med, MDH Ltd., Andover, England Minifuge GL 4400 mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Omnifuge 2.0 RS mit Rotor BS 4402/A, Heraeus Sepatech, Osterode


33

In diesem Versuchsansatz wurden die vier Eisdiatomeen Chaetoceros sp., Co. penna-

tum, A. kufferathii und Ni. lecointei in einem Zeitraum von 9 Monaten langsam steigen-

den Salinitäten und sinkenden Temperaturen ausgesetzt (V S/T). Um die durch erhöh-te Salzkonzentrationen verursachten Reaktionen von denen durch tiefe Temperaturen bedingten unterscheiden zu können, wurde parallel zur Versuchsreihe V S/T eine mit steigenden Salinitäten und einer Kultivierungstemperatur von konstant 0°C durchge-führt (V S/0). Die Kultivierungsmedien für Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei wurden wie in Kap. 2.5 angegeben angesetzt; Co. pennatum wurde in Medium K (Keller et al.,

1987; modifiziert nach Elvers, 1998) kultiviert (siehe Anhang, Tab. 9.3). Die Kulturen wurden einmal täglich geschüttelt. Die Kultivierungsbedingungen sind in Tab. 2.3 dargestellt. Tab. 2.3: Kultivierungsbedingungen für die beiden Versuchsreihen V S/T und V S/0 des Lang-zeitversuches.

0°C-Raum Kühltruhe

Temperatur [°C] 0°C ± 0,5°C 0°C bis -17°C (± 0,5 °C)

Bestrahlungsstärke [µmol Photonen*m-2*s-1]

40 - 45 40 - 45

Lampen Lumilux plus L36W / 11-860 Tageslicht und Lumilux de Luxe L36W / 32-930 Warm-ton, Osram

Philips TLD 36W / 95

Licht-Dunkel-Rhythmus [h] 18 : 6 18 : 6

Die den Salinitäten zugeordneten Temperaturen im Versuchsansatz V S/T lagen knapp über dem Gefrierpunkt der jeweiligen Salinität (Tab. 2.4); festgesetzt nach den Anga-ben von Horner et al. (1992). Tab. 2.4: Die den Salinitäten zugeordneten Temperaturen der Versuchsreihe V S/T (modifiziert nach Horner et al., 1992). Weitere Angaben im Text.

Salinität [PSU]

34 51 68 85 102 119 132 151 160 175 183 196

Temperatur [°C]

0 -1,8 -3,6 -6,0 -7,5 -9,0 -11,0 -12,0 -13,0 -14,0 -14,5 -16,0

Sowohl Probenentnahmen als auch Mediumwechsel wurden bis zu einer Salinität von 85 PSU alle 14 Tage vorgenommen. Im weiteren Versuchsverlauf erfolgte er nur noch


34

monatlich, um den durch erhöhte Salzbelastung und tiefe Temperaturen verlangsam-ten Metabolismus der Eisalgen zu berücksichtigen und damit zu gewährleisten, daß die

Zeit zur Akklimatisation ausreichte. Proben wurden für die folgenden Analysen entnommen:

• Zucker, Polyole / Quacs, Ectoine (Kap. 2.6.1 / 2.6.3)

• DMSP (Kap. 2.6.4)

• Pigmente (Kap. 2.13)

• Prolin (Kap. 2.6.5)

• Zellzahl (Kap. 2.11.1) In Abb. 2.1 ist eine Übersicht über verwendete Methoden und Meßgrößen dargestellt.

2.5 Akklimatisation an hohe Salinitäten: Kurzzeitversuch

Geräte

Cellulose-Nitrat-Filter (Nr. 11307), Porengröße 0,2 µm, ∅ 25 mm, Sartorius, Göttingen

Leuchtstoffröhren 0°C-Raum: je 1 Lumilux plus L36W / 11-860 Tageslicht, Lumilux de Luxe L36W / 32-930 Warmton, Osram



Impfbank Inter Med, MDH Ltd., Andover, England Minifuge GL 4400 mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Omnifuge 2.0 RS mit Rotor BS 4402/A, Heraeus Sepatech, Osterode

2.5.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei

Vor Beginn der Versuche wurden die Algen bei 34 PSU mindestens 14 Tage an die Bedingungen im 0°C-Raum (Bestrahlungsstärke, Lichtrhythmus und Lampen) und die Versuchsmedien akklimatisiert. Die Kultivierungsmedien wurden komplett mit hw-Meersalz + Bioelemente angesetzt und die Salinität auf exakt 34 PSU bzw. 68 PSU für


35

den Salzschock eingestellt. Die Medien wurden mit f/2 β-Nährlösungen (Guillard, 1975;

zitiert nach Bidwell & Spotte, 1985) sowie 2,4 mM Natriumhydrogencarbonat als Kohlenstoffquelle angereichert und gepuffert: Für die Kulturmedien von Chaetoceros

sp. und Ni. lecointei wurden 3 mM HEPES und für die von A. kufferathii mit 5 mM

Glycylglycin verwendet. Die über Nacht auf 0°C gekühlten und equilibrierten Medien wurden auf pH 7,8 eingestellt und sterilfiltriert. Chaetoceros sp. und A. kufferathii wurden in 5L-Erlenmeyerkolben, Ni. lecointei in Kul-

turröhren mit einem Fassungsvolumen von je 600 mL kultiviert. Die Kulturröhren wur-den über einen autoklavierten Cellulose-Nitrat-Filter mit Luft begast. Durch die ständige Umwälzung wurde eine Verklumpung der Zellen verhindert und die Zellzählung verein-facht. Vorsuche ergaben keine Beeinflussung des intrazellulären Prolingehaltes durch die unterschiedlichen Hälterungsmethoden. Die weiteren Kultivierungsparameter sind in Tab. 2.5 angegeben.

Tab. 2.5: Kultivierungsparamter für den Salzschockversuch von 34 auf 68 PSU. Weitere Einzelheiten im Text.

Parameter Einstellung

Temperatur [°C] 0 ± 0,5

Licht-Dunkel-Rhythmus [h] Stunden 0 – 48: Dauerlicht ab 49. Stunde: 12 : 12

Bestrahlungsstärke [µmol Photonen*m-2*s-1] 40

Salinität [PSU] 1. Probenentnahme: 34 alle folgenden Proben: 68

10 Tage nach dem letzten Umsetzen wurden zunächst Proben aus den 34 PSU-Kulturen als Ausgangswert entnommen, nach dem in Tab. 2.2 angegebenen Schema abzentrifugiert und in 68 PSU-Medium resuspendiert (Zeitpunkt 0). Da die Prolin-synthese lichtabhängig ist, wurden die Algen während der ersten 48 Stunden unter Dauer--licht kultiviert (Vorversuche haben ergeben, daß die Akklimatisation nach ca. 48 Stunden beendet ist), in den folgenden 5 Tagen wieder in einem 12 : 12 Stunden Licht-Dunkel-Rhythmus. Anschließend wurden nach folgendem Zeitplan Proben entnommen:

• 1. Tag: alle 60 Minuten

• 2., 3. Tag: alle 120 min

• 4. bis 7. Tag: einmal täglich (morgens zu Beginn der Lichtphase) zusätzlich: 6. Tag: alle 4 Stunden während der Lichtphase (Tagesgang)


36

Pro Art wurden 2 Parallelkulturen untersucht, aus jeder Kultur wurden pro Entnahme-zeitpunkt 3 Proben entnommen. Die Analyse der Proben erfolgte wie in Kap. 2.6.5 be-

schrieben. Die Zellzahl wurde mit dem Coulter Counter bestimmt (Kap. 2.11.2). In Abb. 2.1 ist eine Übersicht über verwendete Methoden und Meßgrößen dargestellt.

2.5.2 Prolinstoffwechsel am Beispiel von Chaetoceros sp. nach einem hyperosmotischen Schock

Vorbereitung, Kultivierungsbedingungen und Ansatz des Versuches erfolgten wie in Kap. 2.5.1 beschrieben. Proben für die entsprechenden Analysen wurden vor der Auf-salzung auf 68 PSU (Nullprobe), 1,5, 19, 43 und 66 Stunden nach dem Salzschock sowie 7 bzw. 13 Tage nach dem Salzschock entnommen. Folgende Parameter wurden bestimmt: Prolin, FAS, Gesamtprotein, P5C, Enzymaktivitäten und Zellzahl. Einzelhei-ten sind in Tab. 2.6 dargestellt.

Tab. 2.6: Einzelheiten zu den im Kurzzeitversuch mit der antarktischen Eisdiatomee Chaetoce-ros sp. bestimmten Größen nach einem hyperosmotischen Schock von 34 auf 68 PSU. Zur wei-teren Durchführung des Versuchs sei auf den Text verwiesen. Abkürzungen: FAS = freie Aminosäuren P5C = ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

Parameter Probenvolumen [mL] Parallelen

Prolin 5 4

FAS 100 3

Gesamtprotein 10 4

P5C 1000 2

Enzymaktivität 1500 1

Zellzahl 2 4

Die Zellzahl wurde mit dem Coulter Counter (Kap. 2.11.2) ermittelt. In Abb. 2.1 ist eine Übersicht über verwendete Methoden und Meßgrößen dargestellt.


37

2.6 Analyse niedermolekularer organischer Osmolyte

2.6.1 Zucker und Polyole

Geräte

Minifuge GL, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode

Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Osterode Speed Vac Concentrator, Bachhofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen

Zentrifugenfilter: Vectraspin Micro Anopore Zentrifugalfilter (Porengröße 0,2 µm),

Whatman Ultrafree-MC Centrifugal Filter Devices (Porengröße 0,22 µm), Ami- con Bioseparations, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA

Membranfilter ME 24 Filter, Porengröße 0,2 µm, ∅ 50 mm, Schleicher & Schüll, Dassel

Nutsche mit Filtrationsaufsatz Ultraschallbad Sonore Super RK 106, Bandelin Electronic, Berlin Die niedermolekularen Zucker wurden nach Karsten et al. (1991) extrahiert und ana-

lysiert. 100 mL Kultur wurden abzentrifugiert (Tab. 2.1), das Pellet in 4 mL 70% Ethanol resus-pendiert und in verschraubbare 10 mL-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Inhaltsstoffe wurden in einem Wasserbad bei 80°C für 2 Stunden extrahiert. Nach dem Abzentrifu-gieren nicht löslicher Bestandteile (20 min; 5600 * g; Raumtemperatur (RT)) wurden 3,7 mL dieses Extraktes über Nacht in der Speed Vac bis zur Trockne eingeengt. Das Pellet wurde in 0,8 mL bidest. H2O aufgenommen, bei 5000 * g für 15 min durch Zentri-fugalfilter filtriert und bei –20°C gelagert. Die Quantifizierung erfolgte in einem isokratischen HPLC-System (Tab. 2.7) bei einer Flußrate von 0,5 mL / min und einer Säulentemperatur von 90°C; als Eluent diente täg-lich frisch filtriertes und im Ultraschallbad bei Wasserstrahlpumpenvakuum entgastes bidest. H2O. Das Injektionsvolumen betrug 20 µL.


38

Tab. 2.7: HPLC-System zur Auftrennung niedermolekularer Kohlenhydrate nach Karsten et al. (1991). Eluent: H2O (filtriert und entgast). Trennmechanismus: starker Kationenaustauscher auf Basis Polystyrol / Divinylbenzol in Calciumform. Trennung beruht auf sterischem Ausschluß, daneben Verteilung und Ligandenaustausch bei einigen Monosacchhariden.

Systemkomponente Typ Hersteller Analyseneinstellung

Pumpe Pumpe 515 Waters Corporation, Milford, MA, USA

0,5 mL / min

Probenaufgabeventil 7125 Rheodyne, Kotati, CA, USA

20 µL-Probenschleife

Säulenofen CHM Waters Corporation, Milford, MA, USA

90°C

Stahlfritte A-102X Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA, USA

Porengröße 0,5 µm

Vorsäulenkartusche Polyspher CHCA 20 x 3 mm, 10 µm Merck 1.51281.0001

Merck eurolab GmbH, Darmstadt

Hauptsäule Polyspher CHCA, 300 x 6,5mm, 10 µm, Merck 1.51280.0001

Merck eurolab GmbH, Darmstadt

Detektor 410 Differential Refraktometer (RI-Detektor)

Waters Corporation, Milford, MA, USA

35°C

Integrator C-R5A Chromatopac Shimadzu Corpora-tion, Kyoto, Japan

Die Identifizierung und Quantifizierung der Substanzen erfolgte über Kalibrierungsrei-hen (2,5 – 10 mM) authentischer Standards. Nach Karsten et al. (1991) gibt es keine

extraktionsbedingten Verluste.

2.6.2 Zuckeridentifikation

Die Analyse niedermolekularer Kohlenhydrate in Ni. lecointei und Ni. medioconstricta

zeigen die Akkumulation einer Substanz mit ansteigenden externen Salinitäten des Mediums. Die in den beiden Arten akkumulierten Substanzen konnten mit authenti-schen Standards nicht identifiziert werden. Die nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden zur Identifizierung der unter einem hyperosmotischen Streß akkumulierten Substanz herangezogen. Als Testsubstanzen wurden folgende Kohlenhydrate und Polyole verwendet: Xylose, Sorbose, Mannose, Galaktose, Glukose, Fruktose sowie Adonitol, Iditol und Erythritol.


39

Folgende Verfahren wurden angewendet: 1. Anthron-Test

2. Tests mit anderen HPLC-Säulen

3. Enzymtest mit β-Galactosidase DH

4. Dünnschichtchromatographie nach Kremer (1982; 1978) 5. Hydrolyse mit anschließender HPLC-Analyse

Ni. lecointei ist neben dem Osmolytenscreening (Kap. 2.3) auch in dem Langzeitver-

such (Abb. 1.16) untersucht worden, daher wurde der Identifikationsversuch vorrangig mit dieser Art vorgenommen. Anteilig wurden die beschriebenen Verfahren auch mit Extrakten von Ni. medioconstricta durchgeführt.

Anthrontest

Das Anthronreagenz besteht aus 70%iger Schwefelsäure plus 50 mg Anthron und 1 g Thioharnstoff auf 100 mL Reagenz. Mit dem Anthrontest können reduzierende Zucker photometrisch bestimmt werden (Roe, 1955). Zu 200 µL (verdünnten) Extraktes bzw. Standards wurden 1000 µL Anthronreagenz (gelb) pipettiert, gut vermischt und 15 min bei 100°C im Wasserbad gekocht. Die Reaktion wurde im Eisbad gestoppt und die

Absorbanz gegen einen Blindwert bei 578 nm gemessen. Tests mit anderen HPLC-Säulen

a) Fast Carbohydrate Analysis Column 100 x 7,8 mm mit Kartuschenvor-säule (Bio-Rad 125-0098 und 125-0119). Matrix: Sulfoniertes Divinyl-Benzen-Styren-Copolymer, Partikelgröße 9 µm. Eluent: H2O (filtriert und entgast). Ofentemperatur: 70°C. Fließgeschwindigkeit: 1 mL / min.

b) Nucleosil-100-NH2 25 x 4 mm mit Patronenkartusche (Knauer I6Y82) Matrix: Nucleosil-100 NH2, Partikelgröße 5 µm. Eluent: 75% Acetonitril HPLC grade (filtriert). Ofentemperatur: 35°C, Fließgeschwindigkeit 0,5 mL / min.

Die Analysen wurden mit der für die Zucker- / Polyolbestimmung verwendete HPLC-Anlage durchgeführt (siehe Tab. 2.7). Die Proben wurden wie in Kap. 2.6.1 beschrie-ben aufbereitet.

Enzymtest mit β-Galactosidase DH

Die β-Galactosidase DH oxidiert β-D-Galactose mit NAD(P)+ zu D-Galactonolacton:

D-Galactose + H2O + NAD(P)+ → D-Galactono-γ-Lacton + NAD(P)H + H+


40

Die Reaktion kann photometrisch über die Zunahme von NADPH + H+ bei 340 nm ver-folgt werden. Die Bestimmung erfolgte in einem Zeitraum von 5 min in Halbmikroküvet-

ten bei 30°C nach Vorgaben des Herstellers (Tab. 2.8). Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzyms gestartet. Als Substrat wurden 2,5 mM Standards der zu testen-den Zucker (s.o.) bzw. Ethanolextrakte von Ni. lecointei eingesetzt.

Tab. 2.8: Testansatz der β-Galactose DH zur Identifizierung eines Zuckers aus Etha- nolextrakten der Eisdiatomee Ni. lecointei. Meßtemperatur: 30°C bei 340 nm.

Substanz Einsatz [µL]

50 mM HEPES pH 8,5 840

75 mM DTT 40

175 mM NAD+ 20

2,5 mM Substrat bzw. Extrakt von Ni. lecointei 100

Enzym 10

Dünnschichtchromatographie nach Kremer (1982; 1978) Geräte

Chromatographiekammern DC-Alufolien-Kieselgelplatten 20 x 20 mm, Fluka 60778 Einmal-Mikropipetten, 10 µL, Brand 709109 Trockenschrank, Memmert Handelsübliche DC-Platten wurden zur Analysenvorbereitung chemisch modifiziert. Hierzu wurden die Platten mit 50 mM NaH2PO4 (in 50% MeOH) besprüht und zunächst 15 min bei Raumtemperatur und anschließend 60 min bei 110°C waagerecht getrok-knet. Etwa 1 cm über dem unteren Rand wurden mit Hilfe der Kapillaren 10 mM und 100 mM Standards bzw. die Extrakte von N. lecointei in je 1 cm breiten Streifen aufge-

tragen. Nach dem Trocknen der Proben wurden die Platten in die mit Laufmittel (täglich frisch, Tab. 2.9) gesättigte Kammer gestellt und für 4,5 – 4,75 Stunden chromato-graphiert. Zum Nachweis der Substanzen wurde die Laufmittelfront markiert, die Platte bei Raumtemperatur getrocknet, mit Anilinphtalat-Reagenz besprüht und für 15 min bei 100°C aktiviert. Zucker ergeben rötlichbraune Flecken auf weißem Grund.


41

Tab. 2.9: Laufmittel für die Dünnschichtchromato- graphie von Zuckern nach Kremer (1978) und Kremer (1982)

Substanz Einsatz [mL]

1-Propanol 60

Aceton p.A. 30

0,2 N Milchsäure 10

Hydrolyse mit anschließender HPLC-Analyse

Die Extrakte von N. lecointei und N. medioconstricta wurden zweifach hydrolysiert: a)

10 min bei 80°C in 1N HCl und b) 5 min bei 80°C in 0,3N HCl, dann bis zu 2 h in 1,5 N HCL. Von beiden Ansätzen wurden jeweils nach 5, 10 und danach alle 30 min nach Hydrolysebeginn Proben entnommen, mit NaHCO3 neutralisiert, filtriert und analysiert (Kap. 2.6.1).

2.6.3 Quaternäre Ammoniumverbindungen und Ectoine

Geräte

Minifuge GL, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode

Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Osterode Speed Vac Concentrator, Bachhofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen

Zentrifugenfilter: Vectraspin Micro Anopore Zentrifugalfilter (Porengröße 0,2 µm),

Whatman Ultrafree-MC Centrifugal Filter Devices (Porengröße 0,22 µm), Ami- con bioseparations, Millipore Corporation, Bedford, MA, USA

Filternutsche mit Filtrieraufsatz

Membranfilter RC 58, Porengröße 0,2 µm, ∅ 47 mm, Schleicher & Schüll, Dassel

pH-Meter GATionide electrode, GAT GmbH, Bremerhaven Ultraschallbad Sonore Super RK 106, Bandelin Electronic, Berlin Zur Bestimmung der quaternären Ammoniumverbindungen Homarin, Trigonellin und Glycinbetain sowie der beiden Ectoine wurden die Extrakte aus der Zucker- / Polyolbe-stimmung (Kap. 2.6.1) eingesetzt. Die Analyse erfolgte nach einer modifizierten Me-thode von Gorham (1984) und Colmer et al. (2000) mit der HPLC (Tab. 2.10). Für die


42

Analyse von Glycinbetain, Homarin, Trigonellin, Ectoin und Hydroxyectoin wurden 50 mM KH2PO4 + 2,5 % Methanol (pH 5,2) verwendet (durch Vorversuche ermittelt). Prolin

konnte zwar ebenfalls detektiert werden, wurde aber aufgrund seiner niedrigen Absor-banz mit dieser Methode nicht quantifiziert. Das Laufmittel wurde vor der Zugabe des filtrierten Methanols entgast und der pH-Wert erst nach der vorsichtigen Zugabe des Methanols auf pH 5,2 eingestellt. Als Analysenparameter wurde eine Flußrate von 0,5 mL/min und eine Säulentemperatur von konstant 35°C verwendet. Die Detektion erfolg-

te bei einer Wellenlänge von λ = 200 nm (AUFS (absorbance units full scale) von 1,0).

Das Injektionsvolumen betrug 20 µL. Tab. 2.10: HPLC-System zur Auftrennung niedermolekularer, stickstoffhaltiger Osmolyte nach einer modifizierten Methode von Gorham (1984) und Colmer et al. (2000). Trennmechanismus: Kationenaustausch mit SO3

-. AUFS = absorbance units full scale (Empfindlichkeit)


Pumpe Pumpe 515 Waters Corporation, Milford, MA, USA

0,5 mL / min

Probenaufgabeventil 7125 Rheodyne, Kotati, CA, USA


Säulenofen CHM Waters Corporation, Milford, MA, USA

35°C



Patronensäule Partisil SCX, 5 x 4 mm, B5Y235

Knauer GmbH, Berlin

Hauptsäule Partisil SCX, 250 x 4 mm, B6Y235

Knauer GmbH, Berlin

Detektor Waters 2487 Dual λ Absorbance Detector

Waters Corporation, Mil ford, MA, USA

35°C AUFS 1,0

Integrator C-R5A Chromatopac Shimadzu Corpora-tion, Kyoto, Japan

Der Homarinstandard wurde von meinem Kollegen Herrn Olaf Wandschneider nach ei-ner modifizierten Methode von Rhodes (pers. Mitteilung) synthetisiert und mir freundli-

cherweise zur Verfügung gestellt. Eine Kernresonanzspektrums- (NMR-) Analyse ergab eine Reinheit des Standards > 99 % (O. Wandschneider, pers. Mitteilung). Die in den Algenextrakten enthaltenen Substanzen wurden anhand der Retentionszei-ten von authentischen Standards identifiziert; Homarin und Trigonellin wurden zusätz-lich bei der Wellenlänge 270 nm überprüft.


43

2.6.4 DMSP

Geräte

GF/C-Filter, ∅ 47 mm, Whatman International Ltd., Maidstone, England

Probengefäß 24 mL mit Lochkappenschraubverschluß (9500-0906), Latek Labortech-nik-Geräte GmbH, Eppelheim Silikonsepten, PTFE-beschichtet (9501-2964), Latek Labortechnik-Geräte GmbH, Ep-pelheim

Spritzen, gasdicht (Volumen 100 – 500 µL), Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz bzw. Unimetrics (Volumen 100 – 250 µL), Shorewood, IL, USA Partikuläres DMSP wurde indirekt bestimmt (Steinke et al., 1998): Das DMSP spaltet

sich unter alkalischen Bedingungen zu Acrylsäure und Dimethylsulfid (DMS) im Ver-hältnis 1:1 (Challenger, 1959) auf (Abb. 2.7). Das freiwerdene Gas DMS reichert sich in der Gasphase der Probengefäße an und kann gaschromatographisch quantifiziert wer-den (vgl. Tab. 2.11). In den Probengefäßen besteht nach Kawabe et al. (1989) ein

DMS-Gleichgewicht zwischen der flüssigen und der gasförmigen Phase. Die in den GC injizierte DMS-Menge ist der Peakfläche direkt proportional.

Abb. 2.7: Zerfall des Dimethylsulfoniumpropionats (DMSP) unter alkalischen Bedingungen zu Dimethylsulfid (DMS) und Acrylsäure (Quelle: Steinke, 1997).

Für die Bestimmung des DMSP-Gehaltes wurden 10 - 40 mL Algensuspension auf GF/C-Filter mit einem moderaten Unterdruck von 100 mbar abfiltriert und die Filter so-fort in den gasdichten Probengefäßen eingeschlossen. Die Proben wurden unverzüg-lich nach der Entnahme bei -80°C eingefroren und bis zur Analyse gelagert.

Auf die noch gefrorenen Proben wurden jeweils 5 mL eiskalte 10N Natronlauge gege-ben, die Vials sofort wieder gasdicht verschlossen, um ein mögliches Entweichen von DMS zu minimieren, und anschließend gut geschüttelt. Es folgte eine Inkubation der Proben über Nacht im Dunkeln.

+ OH-

Dimethylsulfoniumpropionat

H3C

S

H3C

+ + H2O

Dimethylsulfid Acrylsäure

CCOO-

H

H2C

CH3

COO-

S+H3C


44

Tab. 2.11: GC-System zur Analyse von DMSP nach Steinke et al. (1998). Einzelheiten im Text.


Gaschromatograph Shimadzu 9A Shimadzu Seisakus-ho, Kyoto, Japan

Injektor dto. 240°C

Säule Teflonsäule Chromosorb 101 (80/100 mesh; Länge 3m; ID 3 mm

Macherey-Nagel, Düren

190°C

Wasserstoff Brenngas Messer Griesheim GmbH, Krefeld

0,75 kg / cm2

Stickstoff Trägergas Messer Griesheim GmbH, Krefeld

60 ml / min (ca. 4 kg / cm2)

Detektor flammenphotometrischer Detektor (FPD), schwefelspezifisch

Shimadzu Seisakus-ho, Kyoto, Japan

240°C

Integrator C-R3A dto.

Mit einer gasdichten Spritze wurden 50 - 500 µL aus dem Gasraum des Probengefäs-ses entnommen und in den GC injiziert. Für jede Probe wurde eine Dreifachbestim-mung durchgeführt. Die Retentionszeit betrug 0,9 min. Quantifiziert wurden die Ergebnisse mittels einer Kalibrierungskurve; die verwendeten Standards (5 – 75 µM DMS) wurden den Proben entsprechend vorbereitet. Das für die Kalibrierung benötigte DMSP wurde von meinem Kollegen Olaf Wandschneider nach Steinke et al. (1998) synthetisiert und mir für die Messungen freundlicherweise zur Ver-

fügung gestellt. Eine Überprüfung der Substanz mit NMR ergab eine Reinheit mehr als 99%.

2.6.5 Prolin

Geräte

Minifuge GL 4400, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Omnifuge 2.0 RS mit Rotor BS 4402/A, Heraeus Sepatech, Osterode

Spektralphotometer UV-160A, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan


45

Die Prolinkonzentration wurde spektralphotometrisch nach Bates et al. (1973), modifi-

ziert von Nothnagel (1994) bestimmt.

Nach Troll & Lindsley (1955) kondensieren in einem sauren Milieu (Phosphor- / Essig-säure-Gemisch) zwei Ninhydrinmoleküle und ein Prolinmolekül zu einem roten Farb-komplex (Abb. 2.8). In dieser Form kann Prolin im Photometer bei 520 nm quantifiziert werden.

Abb. 2.8: Das saure Kondensationsprodukt aus Ninhydrin und Prolin in der Enolform. In dieser Form kann Prolin im Photometer bei 520 nm quantifiziert werden. (Quelle: Troll & Lindsley, 1955) Abhängig von Zelldichte und Salinität wurden in verschraubbaren 10 mL-Zentrifugenröhrchen 2 – 20 mL Algenkultur abzentrifugiert (Zentrifugeneinstellungen Tab. 2.2) und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 400 µL H2O resuspendiert

und mit je 2 mL des Ninhydrin-Reagenzes1 und 75% Essigsäure versetzt. Die Proben wurden gut geschüttelt und 1 Stunde bei 100°C im Wasserbad gekocht. Nach dem Stoppen der Reaktion im Eisbad wurden 3 mL Toluol zum Extrakt gegeben und 15 s lang kräftig geschüttelt. Um eine gute Phasentrennung zu erreichen, wurden die Ex-trakte noch einmal 5 min bei 1631 * g zentrifugiert. Das farbtragende Toluol (rot) wurde von der wäßrigen Phase abgenommen und die Absorbanz bei 520 nm gegen Toluol gemessen. Bei nicht sofortiger Analyse wurden die Algenpellets in flüssigem Stickstoff schockge-froren und bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Durch die Lagerung ergaben sich keine Verluste (Daten nicht gezeigt). Die Nachweisgrenze für die Prolinbestimmung lag bei 10 nmol (Nothnagel, 1994). Die Kalibrierungen waren bis zu einer Prolinmenge von 500 nmol linear.

1 Ninhydrin-Reagenz: 1,25 g Ninhydrin in 50 mL 6 M Phosphorsäure- / Essigsäuregemisch (3 : 2 v/v) unter Erwärmung und Rühren lösen; 24 h bei 4°C haltbar.

OH

O

N

O

O


46

2.7 Analyse der intrazellulären freien Aminosäuren

2.7.1 Extraktionsverfahren

Geräte

Lyophilisator Lyovac GT 2, Leybold AG, Köln

Minifuge GL 4400, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Omnifuge 2.0 RS mit Rotor BS 4402/A, Heraeus Sepatech, Osterode pH-Meter GATionide electrode, GAT GmbH, Bremerhaven Polypropylen-Reagenzröhrchen (PPN; 10 mL), Greiner GmbH, Solingen Ultraschallbad Sonore Super RK 106, Bandelin Electronic, Berlin L-Glutamin reagiert unter Wärmeeinwirkung zu Pyro-Glutaminsäure (Willker et al.,

1995) und kann nicht mehr erfaßt werden. Aus diesem Grund wurden die FAS in einem kalten Aufschlußverfahren mit Perchlorsäure extrahiert (nach Bligny et al., 1989; modi-

fiziert nach Springer, 1996; siehe Tab. 2.12). Die lyophilisierten Proben wurden bei 4°C gelagert.


47

Tab. 2.12: Aufbereitung der Proben für die Aminosäurenanalyse mit der PCA-Extraktion (vgl. Bligny et al. 1989; modifiziert nach Springer, 1996); Zentrifugeneinstellungen für Algenpelletie-rung siehe Tab. 2.2. Abkürzung: PCA = Perchlorsäure

100 mL Algen abzentrifugieren ↓

Überstand absaugen ↓

Pellet im Zentrifugenglas belassen und in flüssigem Stickstoff einfrieren ↓

+ 1 mL kalter 8% PCA ↓

Pellet mit der PCA in die Reibschale geben ↓

Glas mit 1 mL kalter PCA ausspülen und auf das Pellet geben ↓

während des Auftauens 5 min lang mörsern (grünlicher Extrakt) ↓

Extrakt in ein Zentrifugenröhrchen geben ↓

Reibschale und Pistill mit 1 mL kalter PCA spülen; Extrakte vereinigen ↓

30 s zur völligen Zerstörung der Schalen unter Kühlung ins Ultraschallbad ↓

10 min bei 0°C und 4200 * g zentrifugieren ↓

Überstand in ein neues Zentrifugenröhrchen dekantieren, kalt stellen ↓

Pellet mit 2 mL PCA resuspendieren, Ultraschall; Zentrifugation wie oben; Überstände vereinigen

↓ Extrakt mit KOH auf pH 7,0 - 8,0 neutralisieren

↓ ausgefallenes KClO4 10 min bei 0°C und 4200 * g abzentrifugieren

↓ klaren Überstand in PPN-Röhrchen dekantieren

↓ Pellet mit 1 mL bidest. H2O waschen und abzentrifugieren; Überstände

vereinigen ↓

PPN-Röhrchen mit durchlöchertem Deckel verschließen ↓

Proben in flüssigem Stickstoff einfrieren ↓

sofort lyophilisieren


48

2.7.2 Analyse der freien Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung mit Dabs-Cl

Geräte


Nutsche mit Filtrationsaufsatz pH-Meter GATionide electrode, GAT GmbH, Bremerhaven

Autosamplervials mit Lochkappenschraubverschluß 1,5 mL, Merck 5480018 Septen, PTFE-beschichtet, Latek 9500-2960

Spritzenvorsatzfilter Spartan 13/0,2 RC, Porengröße 0,2 µm, ∅ 13 mm, Schleicher &

Schüll, Dassel Die intrazellulären FAS wurden mittels HPLC (Tab. 2.13) mit einer modifizierten Me-thode nach Drnevich & Vary (1993) analysiert, bei der die FAS vor der Analyse mit 4-N,N-Dimethylaminoazobenzen-4’-sulfonylchlorid (Dabs-Cl) derivatisiert werden. Die Modifikationen beruhen auf den Arbeiten von Nothnagel (1994) und Plettner (1997). Zusätzlich wurde die Methode erweitert. Mit Dabs-Cl können primäre und sekundäre Amine unter Wärmezufuhr und alkalischen

Bedingungen umgesetzt werden (Abb. 2.9): der Farbstoff und die Derivate weisen ein Absorbtionsmaximum bei 436 nm auf. Die Vorteile dieser Methode liegen in der relativ langen Stabilität der Derivate und dem Absorbtionsmaximum im sichtbaren Wellenlän-genbereich, da Lösemittel in diesem Bereich nicht absorbieren und eine relativ stabile Basislinie gewährleistet ist. Allerdings muß für eine Derivatisierung ein 4-facher Über-schuß an Dabs-Cl über die Aminosäuren vorhanden sein. Das Detektionslimit für diese Methode liegt bei 1 pmol (Lottspeich & Zorbas, 1998).


49

Tab. 2.13: HPLC-System zur Auftrennung von Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung mit Dabs-Cl. Einzelheiten zum Derivatisierungsverfahren und Analyse siehe Text.


Software / Hardware 32 Karat Software Version 3.0 / System Gold Hardware

Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA

siehe Text

Pumpen 116 Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

1,3 mL / min Gradientensystem

Autosampler 502 Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

Probenaufgabeventil 7010-080 Rheodyne, Cotati, CA, USA


Säulenofen BFO-04SV W.O. Electronics, Langenzersdorf, Österreich

extern gesteuert 20°C



Vorsäule KS 30/4 Nucleosil 100-5-C18, Macherey-Nagel 721323,


Hauptsäule EC 250 / 4.6 Nucleosil 100-5 C18, Macherey-Nagel 720014.46


Detektor 4-Kanal-Dioden-Array-Detektor (DAD), Modul 168

Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

436 ± 4 nm 2 Hz

Abb. 2.9: Reaktion von Dabsylchlorid mit primären und sekundären Aminen (rot). Die Reaktion findet unter alkalischen Bedingungen bei 70°C statt. Die Derivate absorbieren bei 436 nm. (Quelle: Lottspeich & Zorbas, 1998)

NCH3

CH3

N N SO2 Cl

NCH3

CH3

N N SO2 NHR

+ H2NR

+ HCl

pH 9,070°C10 min

NCH3

CH3

N N SO2 Cl

NCH3

CH3

N N SO2 NHR

+ H2NR

+ HCl

pH 9,070°C10 min


50

Geräteeinstellung: Flußrate: 1,3 mL / min

Detektor: Chromatogrammaufzeichnung bei 436 ± 4 nm (multichrom-wave-

length) Datensammelrate 2 Hz Aufzeichnung des Druck-, Gradienten- und Flußratenverlaufes

Säulentemperatur: 20°C Kalibrierung: Mehrpunkt-Kalibrierung mit linearer Integration der Peakarea Standardkonzentrationen: 0 - 300 nmol

Laufmittel: A: 10 mM Zitronensäure mit 4% DMF, pH 6,50 ± 0,05

B: 300 mL Laufmittel A + 700 mL Acetonitril mit 2,8% DMF Gradient: siehe Tab. 2.14

Tab. 2.14: Gradient für die Aminosäurentrennung und -quantifizierung; Aminosäuren derivatisiert mit Dabs-Cl, nach Drnevich & Vary (1993), modifiziert.

Änderungszeitpunkt [min]

Dauer [min]

Laufmittel A [%]

Laufmittel B [%]

Start 83 17

5,00 18,6 74 26

23,61 16 63 37

39,62 34,7 19 81

74,33 0,3 0 100

77,04 3 83 17

89,9 Ende

Folgende Aminosäuren konnten nachgewiesen werden: Alanin, Arginin, Asparagin, As-paraginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Glutamin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Ly-sin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin; zu-dem Cystin, Hydroxyprolin, Taurin. Zur Eichung wurden authentische Aminosäuren-Standard-Lösungen und Einzelsub-stanzen verwendet. Alle Standards wurden in 0,1 M HCl gelöst. Die Derivatisierung der Proben und Standards erfolgte nach Drnevich & Vary (1993), modifiziert (Tab. 2.15). Verluste von Glutamin durch die Derivatisierung bei 70°C konn-


51

ten nicht verzeichnet werden (Daten nicht gezeigt; Plettner, 1997). Die derivatisierten Proben sind etwa 4 Wochen bei 4°C bei gleichbleibender Qualität haltbar.

Tab. 2.15: Derivatisierung der L-Aminosäuren mit Dabs-Cl nach Drnevich & Vary (1993), modifiziert.

120 µL Probe / Standard in ein Eppendorf-Cup [2 mL] geben

↓

+ 1,23 µL 1 M KOH (pH > 9,0)

↓

schütteln

↓

+ 40 µL 0,1 M NaHCO3 (pH 8,3)

↓

schütteln

↓

+ 80 µL 4 mM Dabs-Cl (gelöst in Acetonitril)

↓

schütteln

↓ Derivatisierung im Wasserbad bei 70°C:

jeweils nach 1 min (feste Bestandteile gelöst; Lösung rot) und nach 4 min den Extrakt vorsichtig schütteln (Farbe der Lösung: orange)

↓

nach 12 min (Farbe der Lösung: gelb-orange) die Proben aus dem Wasserbad entnehmen und für 5 min bei RT abkühlen

↓

360 µL 50 mM Na2HPO4 (pH 7,0) und Ethanol (1 : 2, v/v)

↓

Filtration in Autosamplervials über 0,2 µm-Filter


52

Die intrazelluläre Konzentration der Iminosäure Prolin lag in allen Arten bei den Salini-

täten ≥ 34 PSU über dem mit der HPLC quantifizierbaren Bereich. Für die Bestimmung

der intrazellulären Prolinkonzentrationen wurde daher die spektralphotometrische Me-thode (Kap. 2.6.5) verwendet. Wie aus Vorarbeiten bekannt ist (Plettner, 1997), können die Ergebnisse beider Methoden miteinander verglichen werden, sofern für die spek-tralphotometrische Methode die Untergrenze von 30 nmol und für die HPLC-Methode eine Obergrenze von 14 nmol für die Auswertung eingehalten werden.

2.8 Proteingesamtgehalt

Geräte

Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Osterode

Halbmikroküvetten, Polystyren, Plastibrand

Spektralphotometer UV-160A, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan Der Proteingesamtgehalt wurde mit dem als Microassay2 bezeichneten Verfahren er-mittelt, der die Quantifizierung von 1 – 20 µg / mL Protein ermöglicht. Der verwendete Test basiert auf dem Prinzip des Bradford-Proteintests (Bradford, 1976). Der Farbstoff reagiert vorzugsweise mit basischen (v.a. Arginin) und aromatischen Aminosäurere-

sten zu einem blauen Komplex; die max. Absorbanz der sauren Coomassie-Brilliant-Blau G-250-Lösung driftet von 465 zu 595 nm. Vorteile dieses Testes sind seine schnelle und einfache Handhabbarkeit und seine geringe Störanfälligkeit, z.B. im Ver-gleich zu dem Bestimmungstest nach Lowry (Lowry et al., 1951).

Für die Bestimmung des Proteingesamtgehaltes wurden 10 mL Algensuspension ab-zentrifugiert (Tab. 2.2), der Überstand verworfen und das Pellet in flüssigem Stickstoff fixiert und bis zur Analyse bei –80°C gelagert. Die Zellen wurden mit 200 µL Re-suspensionspuffer versetzt und mit einem Handpotter nach erneutem Gefrieren in flüs-sigem Stickstoff aufgebrochen. Nach dem Zellaufschluß wurde der Extrakt 30 min auf Eis inkubiert, anschließend 1 min bei 13 000 * g und bei 4°C zentrifugiert. 50 µL Extrakt wurden für die Proteinbestimmung eingesetzt (Tab. 2.16). Nach einer Reaktionszeit von 10 min wurde die Absorbanz bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen.

2 Microassay mit dem Dye-Reagent Concentrate (BIO-RAD; siehe Anhang Kap. 9.2)


53

Tab. 2.16: Testansatz für die Bestimmung des Proteingesamtgehaltes. Das Test- prinzip basiert auf Bradford (1976). Weitere Einzelheiten im Text.


0,5 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 100

Bidest. H2O 650

Extrakt 50

Dye-Reagent Concentrate 200

Als Standard wurde Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Nach Berges et al. (1993)

ist die Farbreaktion dieses Proteins mit der von Diatomeenproteinen gut vergleichbar.

2.9 Analyse von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

2.9.1 Erarbeitung einer HPLC-Methode für die Analyse von ∆1-Pyrrolin-5-

Carboxylsäure in Eisalgen

Geräte

Biofuge fresco, Heraeus Instruments, Osterode Halbmikroküvetten, Glas pH-Meter GATionide electrode, GAT GmbH, Bremerhaven Thermomixer 5436, Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg Schwarzes Tuch


Autosamplervials mit Lochkappenschraubverschluß 1,5 mL, Merck 5480018


Nutsche mit Filtrationsaufsatz Septen, PTFE-beschichtet, Latek 9500-2960

Spritzenvorsatzfilter Spartan 13/0,2 RC, Porengröße 0,2 µm, ∅ 13 mm, Schleicher &

Schüll, Dassel Die meisten Autoren weisen P5C photometrisch nach einer Derivatisierung mit ortho-

Aminobenzaldehyd (o-AB) bei einer Wellenlänge von λ = 440 nm bzw. 444 nm nach.

Die i.d.R. leicht modifizierten Derivatisierungen gehen auf eine von Vogel & Davies


54

(1952) erarbeitete Grundversion im Rahmen eines Bioassays zurück, in dem o-AB als „trapping agent“ für den Nachweis des Prolin-Syntheseweges in Escherichia coli ver-

wendet worden ist. Die Farbreaktion (gelb) ist vermutlich auf die Bildung von Dihydro-

quinazolinium zurückzuführen und typisch für ∆1-Pyrrolin und ähnliche Komponenten

(Vogel & Davies, 1952).

2.9.1.1 Spektralphotometrische P5C-Bestimmung

Die Standards und Proben wurden nach einer modifizierten Methode von Mezl & Knox (1976) derivatisiert. Für die Stammlösung wurde P5C in 1 M HCl gelöst. Die Lösung wurde wöchentlich frisch angesetzt und bei 4°C gelagert. Die gebrauchsfertigen Stan-dards wurden alle 3 – 4 Stunden aus der Stammlösung hergestellt. Dazu wurden Ali-qots mit KOH auf pH 6,0 – 6,5 eingestellt (Endkonzentration des neutralisierten Standards: 5 mM). In ein Eppendorf-Cup wurden ad 800 µL P5C-Standard / Proben (neutralisiert) mit 200 µL 10% Trichloressigsäure (TCA) und 200 µL 0,5% o-AB (gelöst in Ethanol) pipettiert, gemixt und 30 min bei 35°C im Dunkeln inkubiert; innerhalb der 30 min wurden die Proben 2x leicht geschüttelt. Zur Pelletierung nicht löslicher Bestandteile wurden die

Standards / Proben 30 min bei RT und 13 000 * g zentrifugiert. Anschließend wurde die Absorbanz bei 444 nm in Halbmikroküvetten gegen einen Blindwert ohne P5C gemes-sen. Die stark sauren Standards konnten für die HPLC (Kap. 9.1.1.2) nicht verwendet wer-den. Vergleichsmessungen des oben beschriebenen Ansatzes ohne TCA-Zusatz, bzw. eines neutralisierten TCA-Ansatzes zeigten, daß TCA die Derivatisierung zwar beein-flußt, aber nicht notwendig für sie ist (Angaben gelten sowohl für die photometrische Bestimmung als auch für die HPLC-Bestimmung; Daten nicht gezeigt). Die Derivatisie-rung erfolgte daher leicht abgewandelt wie nachfolgend beschrieben: In ein Eppendorf-Cup wurden ad 1000 µL P5C-Standard bzw. Extrakt (neutralisiert) mit 200 µL 0,5% o-AB (gelöst in Ethanol) pipettiert, gemixt und 30 min bei 35°C im Dun-keln inkubiert; innerhalb der 30 min wurden die Standards / Extrakte 2x leicht geschüt-telt. Zur Pelletierung nicht löslicher Bestandteile wurden die Standards / Extrakte 20 min bei RT und 13 000 * g zentrifugiert. Anschließend wurde die Absorbanz bei 444 nm in Halbmikroküvetten gegen einen Blindwert ohne P5C gemessen.


55

2.9.1.2 P5C-Bestimmung mit der HPLC

Für die HPLC (Tab. 2.17) wurden die Standards und Proben wie in Kap. 2.9.1.1 ange-

geben derivatisiert. Einzelheiten zu dem verwendeten HPLC-System sind Tab. 2.17 zu entnehmen. Tab. 2.17: HPLC-System zur Auftrennung von P5C nach Vorsäulenderivatisierung mit o-AB. Einzelheiten zum Derivatisierungsverfahren und Analyse siehe Text. o-AB = ortho-Aminobenzaldehyd AUFS = absorbance units full scale (Empfindlichkeit)


Software / Hardware 32 Karat Software Version 3.0 / System Gold Hardware

Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA

siehe Text

Pumpen 116 Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

0,5 mL / min Gradientensystem

Autosampler 502 Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

Probenaufgabeventil 7010-080 Rheodyne, Cotati, CA, USA


Säulenofen BFO-04SV W.O. electronics, Langenzersdorf, Österreich

extern gesteuert 35°C



Vorsäule KS 30/4 Nucleosil 100-5-C18, Macherey-Nagel 721323,


Hauptsäule EC 250 / 4.6 Nucleosil 100-5 C18, Macherey-Nagel 720014.46


4-Kanal-Dioden-Array-Detektor (DAD),

Modul 168

Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA

225 ± 4 nm 298 ± 4 nm 444 ± 4 nm 3D-Spektren 1 Hz

Detektor

waters 2487 Dual λ Absorbance Detector (extern angeschlossen); Auswertung: Integrator siehe Tab. 2.10

Waters Corporation, Milford, MA, USA

35°C AUFS 0,1


56

Aufgrund der unpolaren Natur der Derivate wurde eine RP-Säule für die Trennung ge-wählt. Mit der isokratischen Methode (Tab. 2.18) wurde P5C nach 10 min eluiert (Daten

nicht gezeigt). Optimiert wurde die Analyse durch die Verwendung eines Gradienten-systems (Tab. 2.18), mit dessen Hilfe das derivatsierte P5C sauber von störenden Substanzen getrennt werden konnte. Tab. 2.18: Trennungsbedingungen für die P5C-Analyse nach Vorsäulenderivatisierung mit o-AB. Laufmittel A: H2O, Laufmittel B: Ethanol. Zu Einzelheiten und verwendeter HPLC-Anlage siehe Text und Tab. 2.17. o-AB = ortho-Aminobenzaldehyd.

isokratisch Gradient

Eluent 16 % Ethanol Start: 100 % Laufmittel A

5.bis 20. Min linearer Wechsel von Laufmittel A zu B (100 %)

23. Min: in 0,5 min auf 100 % Laufmittel A

Stop Methode nach 33,5 min

Flußrate [mL/min] 0,5 0,5

Probenvolumen [µL] 20 20

Säulentemperatur [°C] 35 35

Wellenlängen [nm] je ± 4 nm 444, 297, 249, 3D-Spektren 444, 298, 225, 3D-Spektren

Datensammelrate [Hz] 1 1

Laufzeit [min] 15 33,5

2.9.2 Extraktion von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

Geräte

siehe Kap. 2.9.1; zusätzlich: Minifuge GL 4400, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Nach mehreren Vorversuchen erwies sich eine Extraktion unter Verwendung von 10% TCA als am geeignetsten:


57

Es wurden 1 – 1,5 L dichter Algenkultur abzentrifugiert (Zentrifugalbedingungen siehe Tab. 2.2), das Pellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C gelagert.

Nach dem Antauen wurde das Pellet in einen Mörser überführt und nach erneuten Frie-ren in flüssigem Stickstoff mit Quarzsand und 1 mL 10% TCA bis zum Auftauen gemör-sert. Nach einer 10 min Extraktion auf Eis wurden die nicht löslichen Bestandteile 30 min bei 4°C und 4200 * g abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Vo-lumen bestimmt, der Extrakt mit KOH auf pH 6,0 bis pH 6,5 neutralisiert und das Volu-men erneut bestimmt. Anschließend wurden 1000 µL des Extraktes mit 200 µL 0,5% o-AB (in Ethanol gelöst) versetzt und wie in Kap. 2.9.1.1 derivatisiert und zentrifugiert. Vor der HPLC-Messung wurden die Proben über 0,2 µm–Filter in die Autosampler-Vials filtriert. Die Proben waren einige Tage bei Raumtemperatur haltbar. Bei einer Lagertemperatur von 4°C kam es zur Bildung von Präzipitaten.

2.10 Enzymatik zum Prolinstoffwechsel

Die in diesem Kapitel aufgeführten Angaben beziehen sich – wenn nicht anders ange-geben - auf Tests mit der Alge Chaetoceros sp., die sich nach Vorversuchen (u.a. mit A. kufferathii und Ni. lecointei) aufgrund der verhältnismäßig hohen P5CR-Aktivität als

geeigneter Modellorganismus ergeben hat.

2.10.1 Enzymextraktion

Extraktionspuffer

• 100 mM MES pH 6,5

• 10 mM MgCl2 x 6 H2O

• 0,5% Saccharose

• 1 mM DTT

• 2 mM Na2-EDTA

• 10% Glycerin

• 1 Spatelspitze Polyclar AT

• 1 Spatelspitze Amberlite XAD-4

• 1 Tablette Protease-Inhibitor / 50 mL

Puffer

• 1 mM Pepstatin (gelöst in Ethanol)

Resuspensionspuffer: wie Extraktionspuffer; ohne Polyclar AT, Amberlite XAD-4, Pepstatin


58

Geräte

J2-HS Zentrifuge, Festwinkelrotor JA-18, Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, USA Minifuge GL 4400 mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode Wenn nicht anders angegeben, wurden alle Arbeiten bei 4°C durchgeführt. Die Algen wurden pelletiert (Tab. 2.2), das Pellet in wenig Extraktionspuffer resuspendiert, in eine Reibschale überführt und nach Zugabe von etwas Quarzsand in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Zellen wurden 3 – 4 min gemörsert und der Extrakt bis zum völli-gen Auftauen inkubiert (ca. 15 min). Anschließend wurden Zellrückstände und Sand bei 4°C und 14500 * g für 30 min abzentrifugiert und die Überstände zur Ammonium-sulfatfällung eingesetzt.

Ammoniumsulfatfällung

Die für die Enzymnachweise und -charakterisierung bestimmten Extrakte wurden einer fraktionierten Fällung von 0 – 20%, 20 – 50% und 50 – 80% Ammoniumsulfat unterwor-fen. Hierzu wurde unter Rühren festes, gemörsertes Ammoniumsulfat portionsweise dem Extrakt zugeführt und die Suspension nach dessen vollständiger Auflösung 30

min inkubiert. Die Lösung wurde anschließend bei 4°C und 18500 * g für 30 min abzen-trifugiert. Die pelletierten Proteine wurden in Resuspensionspuffer resuspendiert und in 50 µL-Portionen bei –80°C gelagert. Im Gegensatz dazu wurde für die aus den Versuchen (Kap. 2.4 und 2.5) stammenden Extrakte eine Gesamtproteinfällung von 0 – 80% Ammoniumsulfat wie oben angege-ben gefällt und die resuspendierten Proteine in 250 µL- bis 500 µL-Portionen bei –80°C gelagert.

2.10.2 Proteinbestimmung

Geräte





59

Die Proteinbestimmung wurde im wesentlichen nach dem im Kap. 2.8 geschilderten Verfahren durchgeführt; es wurden 5 – 50 µL eines 1 : 20 verdünnten Enzymextraktes

eingesetzt.

2.10.3 Enzymtests

Geräte



Spektralphotometer UV-160A, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan Wasserbad Typ 1083, GFL mbH, Burgwedel P5C Synthase (EC 2.7.2.11 / 1.2.1.41)

Die P5CS katalysiert die Reaktion von L-Glutaminsäure zu Glutamat γ-Semialdehyd,

welches spontan zu P5C zyklisiert (vgl. Kap. 1.2):

glu + ATP + NAD(P)H + H+ → Glutamat γ-Semialdehyd + NAD(P)+ ADP + Pi

Glutamat γ-Semialdehyd ↔ P5C + H2O

Die Reaktion kann photometrisch über die Abnahme von NAD(P)H + H+ bei 340 nm verfolgt werden. Die Bestimmung erfolgte in Halbmikroküvetten bei 20°C nach Stines et al. (1999; Tab. 2.19).

Tab. 2.19: Testansatz für den P5CS-Nachweis nach Stines et al. (1999) bei einer Meßtemperatur von 20°C und einer Wellenlänge von λ = 340 nm über einen Zeitraum von 10 min.


500 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 150

100 mM MgCl2 x 6 H2O 187

100 mM L-Glutaminsäure 100

5 mM ATP 50

10 mM NADPH 6

ad 900 µL H2O 407

Enzymextrakt 100


60

Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzymextraktes gestartet und die Extinkti-onsabnahme über 10 min verfolgt.

Die Aktivität der P5CS wird in µkat/mg Protein angegeben. Katal ist die SI-Einheit für die Enzymaktivität; gebräuchlich ist wegen der kleineren Werte allerdings die Einheit U. Der Umrechnungsfaktor von Units zu katal beträgt 1 U = 16,67 nkat.

ε (NADPH) = 6,317 L * mmol-1 * cm-1

P5C Reduktase (EC 1.5.1.2)

Die P5C Reduktase (P5CR) katalysiert den letzten Syntheseschritt der Prolinbio-synthese vom P5C zu Prolin:

P5C + NAD(P)H + H+ → Prolin + NAD(P)+

Die Reaktion kann photometrisch über die Abnahme von NADPH + H+ bei 340 nm ver-folgt werden. Die Bestimmung erfolgte in Halbmikroküvetten bei 20°C nach Treichel (1986) (Tab. 2.20a, b). Die 5mM P5C-Lösung wurde aus einer in 1N HCl angesetzten 10 mM Stammlösung kurz vor Gebrauch auf pH 6,0 bis pH 6,5 mit KOH neutralisiert (vgl. Kap. 2.9.1.1).

Tab. 2.20a: Testansatz nach Treichel (1986) für die P5CR-Charakterisierung und den P5CR-Nachweis. Die Messungen erfolgten bei einer Temperatur von 20°C, einer Wellenlänge von λ = 340 nm über einen Zeitraum von 2,5 – 5 min. * abhängig von Proteingehalt und Aktivität der P5CR im Extrakt: Chaetoceros sp: 5 µL (20 – 50% Ammoniumsulfatfällung) A. kufferathii, Ni. lecointei: 5 – 50 µL (50 – 80% Ammoniumsulfatfällung)



75 mM DTT 40

15 mM NADH 15

5 mM P5C 30

ad 995 µL H2O 765 - 810

Enzymextrakt* 5 - 50


61

Tab. 2.20b: Testansatz nach Treichel (1986) für die Messungen der P5CR- Extrakte aus den Versuchen (0 – 80% Ammoniumsulfatfällung). Die Messungen erfolgten bei einer Temperatur von 20°C, einer Wellenlänge von λ = 340 nm über einen Zeitraum von 2,5 – 5 min. * abhängig von Proteingehalt und Aktivität der P5CR im Extrakt



75 mM DTT 40

15 mM NADH 10

5 mM P5C 15

ad 990 bzw. 900 µL H2O 825 bzw. 735

Enzymextrakt* 10 bzw. 100

Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzymextraktes gestartet und die Extinkti-onsabnahme über 2,5 – 5,0 min verfolgt.

ε (NADH) = 6,317 L * mmol-1 * cm-1

Prolin Dehydrogenase (EC 1.5.1.2)

Prolin DH oxidiert Prolin zu P5C mit Hilfe von NAD(P)+:

Prolin + NAD(P)+ → P5C + NAD(P)H + H+

Die Reaktion kann photometrisch über die Extinktionszunahme durch Bildung von NAD(P)H + H+ bei 340 nm verfolgt werden. Die Bestimmung erfolgte in Halbmikrokü-vetten bei 20°C nach Krueger et al. (1986) (Tab. 2.21). Für 100 mL Glycinpuffer wur-

den 0,75 g Glycin, 0,58 g NaCl und 0,3 g festes NaOH in H2O gelöst und der pH-Wert auf pH 10,3 eingestellt.

Tab. 2.21: Testansatz für den Prolin DH-Nachweis nach Krueger et al. (1986) aus der fraktionierten Ammoniumsulfatfällung (Kap. 2.10.1). Die Messungen wurden bei einer Temperatur von 20°C und einer Wellenlänge von λ = 340 nm über einen Zeitraum von 10 min durchgeführt.


Glycinpuffer pH 10,3 750

200 mM L-Prolin 100

175 mM NAD+ 50

Enzymextrakt 100


62

Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzymextraktes gestartet und die Extinkti-onszunahme über 10 min verfolgt.

ε (NADH) = 6,317 L * mmol-1 * cm-1

P5C Dehydrogenase (EC 1.5.1.12)

P5C DH oxidiert P5C zu Glutaminsäure mit Hilfe von NAD(P)+:

P5C + NAD(P)+ → Glutaminsäure + NAD(P)H + H+

Die Reaktion kann photometrisch über die Extinktionszunahme durch Bildung von

NAD(P)H + H+ bei 340 nm verfolgt werden. Die Bestimmung erfolgte in Halbmikrokü-vetten bei 35°C nach Forlani et al. (1997) (Tab. 2.22).

Tab. 2.22: Testansatz für den P5C DH-Nachweis nach Forlani et al. (1997) aus der fraktionierten Ammoniumsulfatfällung (Kap. 2.10.1). Die Messungen wurden bei einer Temperatur von 35°C und einer Wellenlänge von λ = 340 nm über einen Zeitraum von 10 – 30 min durchgeführt. * abhängig von Proteingehalt und Aktivität der P5C DH im Extrakt


500 mM HEPES-KOH pH 7,5 100

100 mM MgCl2 x 6 H2O 100

15 mM NADH 10

5 mM P5C 166

ad 900 – 975 µL H2O 524 - 599

Enzymextrakt* 25 - 100

Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzymextraktes gestartet und die Extinkti-onszunahme über 10 bis 30 min verfolgt.

δ-Ornithin-Aminotransferase (EC 2.6.1.13)

OAT katalysiert die direkte Umsetzung von Ornithin zu Glutamat γ-Semialdehyd, das

spontan zu P5C zyklisiert (vgl. Kap. 1.2). Als Cofaktor dient Pyridoxalphosphat. Beglei-

tend zu der katalysierten Reaktion wird eine Aminogruppe auf α-Ketoglutarat transfe-

riert und führt zur Bildung von Glutaminsäure.

Ornithin + α-Ketoglutarat → P5C + Glutaminsäure


63

Gestartet wird die Reaktion mit der Zugabe von α-Ketoglutarat. Die Derivatisierung er-

folgte nach dem Stoppen der Reaktion mit 10% TCA (Tab. 2.23). Die Enzymaktivität wird indirekt über die Derivatisierung des Produktes P5C mit o-AB nach Vogel & Kopac (1960), verändert nach Yang & Kao (1999) bestimmt (Endproduktbestimmung).

Tab. 2.23: Indirekte Bestimmung der OAT-Aktivität nach Vogel & Kopac (1960), verän- dert nach Yang & Kao (1999). Das Endprodukt P5C wird mit o-AB derivatisiert und die Konzentration spektralphotometrisch bei 444 nm bzw. nach Neutralisation des Extraktes mittels HPLC ermittelt. Weitere Einzelheiten im Text.



60 mM Ornithin 96 (variabel)

10 mM Pyridoxalphosphat 80

ad 840 µL H2O 364 (variabel)

Enzymextrakt 100

20 mM α-Ketoglutarat neutralisiert 160

30 min bei 30°C im Wasserbad inkubieren (dunkel)

+ 200 µL 10% TCA, schütteln

+ 200 µL 0,5% o-AB, schütteln

30 min bei 35°C inkubieren (dunkel); dabei 2x vorsichtig schütteln

30 min bei 13 000 * g und RT zentrifugieren

Absorbanz im Photometer bei 444 nm gegen eine Referenz messen bzw. Probe für

die HPLC-Messung neutralisieren und filtrieren (vgl. Kap. 2.9.1.2)

Berechnung:

ε o-AB nach Mezl & Knox (1976) = 2590 L * mmol-1 * cm-1

2.10.4 Dialyse

Geräte

Slide-A-Lyzer 7K Dialysis Cassettes (7000 MWCO), 0,5 – 3 mL Probenvol., Produkt-

Nr. 66370, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA


64

Die Enzymextrakte aus dem Langzeitversuch (Kap. 2.4) mußten vor den Messungen dialysiert werden, da offensichtlich Reste der hohen Salzmengen aus dem Medium die

Aktivität der Enzyme hemmte. Die Extrakte wurden 2x 30 min gegen Resuspensi-onspuffer (Kap. 2.10.1) unter ständigem langsamen Rühren bei 4°C dialysiert und so-fort anschließend eingesetzt. Vorversuche ergaben eine Aktivitätsverminderung 30%.

2.10.5 Charakterisierung der P5C Reduktase

Geräte

Siehe Kap. 2.10.3

Für die Tests wurden jeweils 5 µL Enzymextrakt (20 – 50% Ammoniumsulfatfällung) von Chaetoceros sp. eingesetzt. Die Bestimmung wurde, wie in Kap. 2.10.3, Tab.

2.20a beschrieben, bei 20°C über einen Zeitraum von 2,5 – 5 min durchgeführt. Die Messungen erfolgten vierfach.

2.10.5.1 KM-Bestimmung

Die Substratsättigungskurven für die P5CR wurden, wie in Kap. 2.10.3, Tab. 2.20a beschrieben, bei 20°C aufgenommen. Die Messungen erfolgten vierfach. Für die Bestimmung von KM(NADH) wurden 7,5 µM bis 375 µM NADH eingesetzt; für KM(P5C) 2,5 µM bis 125 µM P5C. Die Ermittlung von Vmax- und KM erfolgte graphisch nach den gemessenen Initialgeschwindigkeiten aus den Substratsättigungskurven mit dem direkten linearen Plot nach Eisenthal & Cornish-Bowden (zitiert nach Lottspeich & Zorbas, 1998):

Vmax = V + (V/[S]) * KM

Zu Überprüfung der graphisch ermittelten Werte wurden KM und Vmax auch rechnerisch nach Hanes (1932) bestimmt.

2.10.5.2 pH-Optimumskurve

Zur Bestimmung des pH-Optimums wurde der Einfluß von verschiedenen pH-Werten im Bereich von pH 5,0 bis pH 10,3 auf die Aktivität der P5CR ermittelt. Die Abstufun-gen liefen in 0,5-pH-Einheiten. Es wurden verschiedene organische 50 mM Puffer verwendet, deren Pufferbereiche sich z.T. überlappten. Zusätzlich wurden 0,5 M


65

Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5 bis pH 8,5) und ein Glycinpuffer (pH 10,3; Tab. 2.24) eingesetzt. Für die Bestimmungen wurden entweder 910 µL der organischen Puffer

bzw. des Glycinpuffers oder 100 µL der 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (vgl. Tab. 2.24) in Halbmikroküvetten verwendet (Endvolumen 1000 µL). Die P5CR-Bestimmung erfolgte wie in Kap. 2.10.3 angegeben. Tab. 2.24: Für die Ermittlung des pH-Optimums der P5CR verwendete Puffer inkl. der von ih-nen abgedeckten pH-Bereiche.

Puffer pH-Bereich Konzentration [mM]

MES 5,0 – 7,5 50

HEPES 6,5 – 8,7 50

Glycylglycin 8,0 – 9,0 50

BISTRIS 8,5 – 9,5 50

CAPS 10,0 50

Glycinpuffer 10,3 0,75 g Glycin, 0,58 g NaCl, 0,3 g festes NaOH

Kaliumphosphat-Puffer 6,5 – 8,5 500

2.10.5.3 Temperatur-Optimumskurve

Die Enzymaktivitäten der P5CR wurden in 5°C-Schritten in einem Temperaturbereich von –4°C bis 55°C gemessen; Puffer, H2O und DTT wurden 10 min bei den ent-sprechenden Temperaturen vorinkubiert. Die ermittelten Meßdaten wurden nach der Arrhenius-Gleichung ausgewertet, die die quantitative Beziehung zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und der Temperatur beschreibt:

k = A * e-Ea/RT

A ist dabei eine für die untersuchte Reaktion charakteristische Konstante (Häufigkeits-faktor), Ea die Aktivierungsenergie [J * mol-1], R die ideale Gaskonstante [8,314 J*mol-1 * K-1] und T die absolute Temperatur [K]. Die Gleichung wurde 1889 von Svante Arrhe-nius hergeleitet und beschreibt die Temperaturabhängigkeit chemischer Reaktionen. Der Faktor „e-Ea/RT“ gibt den Teil der Moleküle an, deren Energie größer als die Akti-vierungsenergie Ea ist (Maxwell-Verteilungsgesetz). Nach Logarithmierung der oben genannten Gleichung ergibt sich:

lnk = lnA -Ea/RT


66

Nach der graphischen Auftragung von lnk gegen 1/T erhält man eine Gerade, aus de-ren Steigung (m = -Ea/R) sich Ea ergibt; der Ordinatenabschnitt gibt den Wert für lnA

an. Berechnen läßt sich Ea nach folgender Gleichung:

Ea = 2,303 * R * ((T1 * T2)/(T2 – T1)) * ln(k2/k1)

2.11 Bestimmung der Zellzahl

Zur Bestimmung der Zellzahl wurden bei jeder Probenentnahme aus jeder Kultur 2x 2 mL Zellkultur entnommen und mit 3 Tropfen Lugol’scher Lösung (20 g KJ, 200 mL H2O, 10 g J, 20 g Eisessig) fixiert. Die Zellen von Ni. lecointei aus dem Langzeitversuch (Kap. 2.4) waren z.T. stark ver-

klumpt, so daß eine Schalenpräparation notwendig wurde. Vorversuche haben erge-ben, daß die Unterschiede der Zellzahlen zwischen präparierten und nichtpräparierten

Proben vernachlässigbar gering waren. 2 mL Zellsuspension wurden mit 5 mL 65% Salpetersäure versetzt und 3x 5 min bei 100°C im Wasserbad erwärmt. Nach zweitägigem Absedimentieren wurden 5 mL Flüs-sigkeit vorsichtig abgenommen, die Proben mit 5 mL H2O gewässert und erneut 48 Stunden absedimentiert. Vor der Zählung wurden 5 mL Flüssigkeit vorsichtig abge-nommen, der verbleibende Rest gut durchmischt und die Zellzahl mit der Neubauer-Zählkammer ermittelt (Kap. 2.11.1).

2.11.1 Neubauer-Zählkammer

Geräte

Haemocytometer Neubauer improved, Brandt, Wertheim Bei jeder Zählung wurden aus jeder fixierten Probe 3x mind. 50 Zellen ausgezählt und die Zellzahl wie nachfolgend angegeben bestimmt:

Zellen / µL = (mm) eKammertief )(mm Fläche eausgezählt

Zellen gezählte2 ×

wobei: Kammertiefe = 0,1 mm


67

Aus den pro Probe ermittelten Zellzahlen wurden anschließend Mittelwert und Stan-dardabweichung bestimmt.

2.11.2 Coulter Counter

Geräte

Coulter Z-Serie (Z2), Coulter Electronics Inc., Miami, USA

Zu 10 mL isotonischer Lösung wurden 50 – 500 µL der fixierten Proben pipettiert und mit dem Coulter Counter bei den in Tab. 2.25 angegebenen Einstellungen gezählt. Tab. 2.25: Einstellungen des Coulter Counters für die mit Lugol`scher Lösung fixierten Eisdia-tomeen. Weitere Einzelheiten zur Messung im Text.

Spezies Größenbereich [µm]

Einzugsvolumen [mL]

Parallelmessungen pro Ansatz

Chaetoceros sp. 2,5 – 9,48 1 5

A. kufferathii 5 – 18,96 1 3

Ni. lecointei 3,5 – 11,95 1 3

Von jeder Probe wurden 2 Ansätze gemessen und nach den Messungen die ent-sprechenden Mittelwerte gebildet.

2.12 Vitalitätsbestimmung

Für die Lebend-Tod-Bestimmung wurde ein leicht modifizierter Vitalitätstest nach Crippen & Perrier (1974) mit Neutralrot für marines Plankton angewendet. Neutralrot ist ein basischer nicht toxischer Farbstoff, der in Diatomeen scheinbar das Cytoplasma, nicht jedoch die Chloroplasten lebender Zellen anfärbt. Eigentlich ist Neutralrot ein Vakuolenfarbstoff. Vermutlich färbt sich wegen der meist sehr kleinen Vakuolen in Dia-tomeen jedoch vermeintlich das Cytoplasma an. Gelegentlich kommt es bei der Anfärbung von Diatomeen zu einer Kontraktion der Zellmembran oder des Cytoplasmas, was nach Angaben der Autoren keinen Einfluß auf die Lebend-Tod-Bestimmung hat. Zu beachten ist, daß der Test innerhalb einer be-stimmten Zeitspanne durchgeführt werden muß, da Neutralrot später zum Zelltod führt.


68

Durchführung

1,5 mL einer 0,1%igen Neutralrot-Lösung (w/v) wurden zu 50 mL der zu testenden Al-genkultur pipettiert. Als optimal hat sich eine Anfärbungszeit von 3 Stunden erwiesen. Die Anfärbung fand in der Anzuchttruhe statt. Die Kultur wurde in dieser Zeit 2-3x leicht geschwenkt. Als Kontrolle wurden 50 mL derselben Algenkultur für 5 min in einem 60°C heißen Wasserbad erhitzt und der oben beschriebenen Färbung unterzogen.

2.13 Pigmentbestimmung

Geräte

GF/C-Filter, ∅ 47 mm, Whatman International Ltd., Maidstone, England

Glasperlen (∅ 2 und 4 mm)

Minifuge GL 4400, mit Schwenkbecherrotor 2150, Heraeus Christ, Osterode

Polypropylen-Reagenzröhrchen (PPN; 10 mL), Greiner GmbH, Solingen Vibrogen-Zellmühle Vi 4, Eden Bühler, Tübingen 10 mL Algenkultur wurden mit einem moderaten Unterdruck von 100 mbar abfiltriert und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80°C im Dunkeln gelagert. In die Reagenzröhr-chen wurden je 1 Löffel Glasperlen und 7 mL 90%iges Aceton gegeben und auf Eis ge-lagert. Nach der Zugabe der Filter wurden die Zellen unter Kühlung in 3 min in der Zellmühle aufgeschlossen und die Pigmente über Nacht bei +4°C im Dunkeln extra-hiert. Vor der Messung wurden die Trübungsreste für 5 min bei einer Temperatur von 0°C und 1631*g abzentrifugiert. Bis zur photometrischen Messung im Spektral-photometer UV-160A in Makroküvetten wurden die Proben dunkel und auf Eis gelagert. Als Blindwert diente ein wie die Proben aufbereiteter leerer GF/C-Filter. Die Konzentrationen von Chlorophyll (Chl.) a sowie die Chl. c1 und c2 wurden nach

Jeffrey & Humphrey (1975) berechnet. Die angegebenen Formeln gelten speziell für die Pigmente von Diatomeen:

Chl. a [µg/mL]: 11,47*E664 - 0,40*E630

Chl. c1 und c2 [µg/mL]: 24,36*E630 - 3,73*E664

Zuvor wurden die gemessenen Extinktionen durch einmaligen Abzug des Trübungs-wertes E750 korrigiert werden.


69

Der Gehalt an Gesamtcarotinoiden wurde nach Parsons et al. (1984) bestimmt. Zu be-

achten ist, daß die Konzentrationen nur abgeschätzt werden konnten, da Carotinoide

eine strukturell heterogene Klasse der Hydrogencarbonate sind, die verschiedene mo-lare Extinktionskoeffizienten aufweisen (Parsons et al., 1984):

Carotinoide [µg/mL]: 7,6*(E480 - 1,49*E510)

Zuvor mußten die gemessenen Extinktionen durch Abzug des Trübungswertes E750

korrigiert werden: E480 - 3*E750 und E510 - 2*E750

2.14 Statistik

Aufgrund der langsam wachsenden Organismen und der Menge der benötigten Bio-massen wurden nur deskriptive Statistikmethoden angewendet.

Ergebnisse und Diskussion der HPLC-Methodiken

70

3 Ergebnisse und Diskussion der HPLC-Methodiken

3.1 Analyse der quaternären Ammoniumverbindungen und Ectoine

Die quaternären Ammoniumverbindungen (Quacs), Prolin und Ectoine sind mit einer modifizierten Methode nach Gorham (1984) und Colmer et al. (2000) analysiert wor-

den. Unter Standardbedingungen lassen sich alle 6 Substanzen vollständig voneinan-der trennen (Abb. 3.1). Der Nachteil liegt in der geringen Absorbanz von Prolin und

Betain bei der verwendeten Meßwellenlänge von λ = 200 nm.

Abb. 3.1: Standardchromatogramm zur Trennung der Quacs, Prolin und Ectoine mit der Partisil SCX; Eluent: 100 mM KH2PO4, 2,5% MeOH, pH 5,2; 35°C, 0,5 mL/min; 200 nm. Retentionszei-ten: Hydroxyectoin 5,7 min, Prolin 6,7 min, Ectoin 7,8 min, Betain 9,0, Homarin 9,7 und Trigo-nellin 10,8 min. Weitere Einzelheiten im Text. Einige der niedermolekularen Osmolyte konnten mit mehreren Methoden identifiziert und quantifiziert werden. Wenn nicht anders angegeben, sind die Werte aus folgenden

Methoden verwendet worden: • Prolin: Spektralphotometrie (Kap. 2.6.5)

• Homarin: Quacsmethode (HPLC, Kap. 2.6.3)

und/oder Zucker- / Polyolmethode (HPLC, Kap. 2.6.1)

• Betain: Zucker- / Polyolmethode (HPLC,

Kap. 2.6.1)

Ein Vergleich der über die mit der spektralphotometrischen Methode und der Zucker- / Polyolmethode ermittelten Prolinkonzentrationen zeigten einen hohen Grad der Über-einstimmung (Daten nicht gezeigt). Betain und Homarin sollten ursprünglich nur mit der Quacsmethode quantifiziert werden, die als Methode seit 1984 (Gorham, 1984) allge-

3 nmol Hydroxyectoin

1,5 nmol Ectoin 37,5 nmol Betain

6 nmol Homarin3 nmol Trigonellin

37,5 nmol L-Prolin


71

mein und seit 1994 (Nothnagel, 1994) in der Arbeitsgruppe, allerdings unter Verwen-dung eines anderen HPLC-Systems, etabliert ist. Während der Messungen hat sich

herausgestellt, daß diese Methode v.a. für die pennaten Arten als ungeeignet anzuse-hen ist, weil in den Extrakten neben den gesuchten viele weitere Inhaltsstoffe enthalten sind. Diese eluieren auf der verwendeten Säule dicht hintereinander bzw. zusammen (siehe auch unten). Besonders die Bestimmung von Betain und Homarin ist dadurch stark eingeschränkt worden. Zusätzlich ergab sich während der Messungen ein Pro-blem der Coelution von Homarin und einer weiteren Substanz (z.B. in Ni. lecointei, sie-

he unten). Die Homarinkonzentrationen bzw. dessen Auftreten sind daher stichproben-

artig bei λ = 270 nm (Absorptionsmaximum von Homarin) geprüft worden; bei

Nichtübereinstimmung mit den bei 200 nm ermittelten Konzentrationen ist Homarin über die Zucker- / Polyolmethode quantifiziert worden (Retentionszeit: 25,6 min). Einige der Substanzen, welche die Analyse insbesondere von Betain und Homarin stö-ren, sind in mehreren Arten zu finden. Da sich das Verhältnis von Zellzahl zu Peakhö-he mit ansteigenden externen Salinitäten erhöht, könnte es sich um weitere osmotisch wirksame Stoffe handeln. Die Retentionszeiten betragen 8,0 min (Ni. lecointei), 9,2 min (Na. gelida, Ni. lecointei), 9,6 min (A. actinochilus, Co. pennatum, beide Nitzschia-

Arten) und 10,8 min (Na. gelida, Ni. lecointei). Bei den beiden zuletzt genannten Sub-

stanzen handelt es sich nicht um Homarin bzw. Trigonellin, da sie – im Gegensatz zu den entsprechenden Standards – keine Absorbanz bei 270 nm aufweisen. Nach den Elutionsprofilen von Colmer et al. (2000) könnte es sich bei der Substanz mit der Re-

tentionszeit von 9,6 min um Prolinbetain handeln. Bei allen Vorteilen der HPLC-Analytik, wie z.B. des Einsatzes relativ geringer Proben-volumina, zeigen die Ergebnisse ebenfalls deren Grenzen auf, da sie auf substanz-klassenspezifischen Nachweisen beruht. Unbekannte Substanzen müssen über ande-re analytische Methoden identifiziert werden. Für die Erfassung des gesamten Osmolytspektrums eines Organismus wäre die NMR-Spektroskopie eine Möglichkeit (vgl. Galinski 1995). Speziell bezüglich der Eisalgen beinhaltet diese Methode aller-dings den Nachteil, daß sie per se relativ unempfindlich ist. Zusätzlich akkumulieren

Eisdiatomeen im Gegensatz zu vielen Bakterien nach bisherigen Erkenntnissen die Osmolyte nur in Einzelfällen in molaren Konzentrationen (vgl. Kap. 5). Die für eine NMR-Spektroskopie erforderlichen Kulturvolumina müßten demnach sehr hoch sein (etwa 2 g Trockengewicht).


72

3.2 Analyse der Zucker / Polyole

Aufgrund der Problematik zur Identifikation unbekannter Zucker / Polyole in den Arten Na. gelida, Ni. lecointei und Ni. medioconstricta sei auf die Kap. 2.6.2 und 4.1.2 ver-

wiesen. Ergänzend wird darauf hingewiesen, daß neben den Zuckern und Polyolen auch die Quacs Betain und Homarin mit dieser Methode quantifiziert werden können. Die Sub-stanzen eluieren nach 35,6 min bzw. 25,0 min. Aufgrund der in Kap. 3.1 diskutierten Probleme mit der Quacsmethode sind Betain und Homarin mit der Zucker- / Polyol-methode analysiert worden.

3.3 Analyse der freien Aminosäuren

Alle in Tab. 3.1 aufgeführten Aminosäuren können mit Dabs-Cl derivatisiert und mit der verwendeten Methode in einem Lauf analysiert werden (Daten nicht gezeigt). Wie be-reits in Kap. 2.7.1 erwähnt, wurden neben einem käuflich erworbenen Standardge-misch mit 18 Aminosäuren zusätzlich weitere Aminosäuren, wie z.B. Glutamin und Asparagin, analysiert (Retentionszeiten siehe Tab. 3.1). L-Ornithin konnte in die Me-thode nicht integriert werden. Aus Vorversuchen hat sich ergeben, daß die Fehlerquote bei der Verwendung von ins-gesamt drei Standardgemischen am geringsten ist: a) käuflicher Standard (Abb. 3.2 als Beispiel), b) Glutamin und Asparagin sowie c) Hydroxyprolin, Taurin und Tryptophan. Cystein eluiert zusammen mit Prolin, wobei die Absorbanz von Prolin die von Cystein bei gleicher Konzentration weit übersteigt (Daten nicht gezeigt). Wegen der Coelution sind jedoch beide Aminosäuren nicht mit dieser Methode quantifiziert worden. Außer-

dem liegt die intrazelluläre Konzentration der Iminosäure Prolin in allen Arten bei den

Salinitäten ≥ 34 PSU über dem mit der HPLC quantifizierbaren Bereich und ist daher

über die spektralphotometrische Methode ermittelt worden. Die Prolinkonzentrationen in den Extrakten, deren Algen bei 17 PSU kultiviert worden sind, sind für die spektral-photometrische Prolinbestimmung ausreichend gewesen, so daß bei der Auswertung keine methodenspezifischen Unterschiede zu berücksichtigen sind.


73

Tab. 3.1: Retentionszeiten der Aminosäuren nach Vorsäulenderivatisierung mit Dabs-Cl nach einer modifizierten Methode von Drnevich & Vary (1993) und Nothnagel (1994). Einzelheiten zur Methode siehe Kap. 2.7.

Aminosäure Retentionszeit [min] Aminosäure Retentionszeit [min]

Alanin 48,7 Leucin 54,6

Arginin 49,2 Lysin 69,7

Asparagin 43,3 Methionin 53,3

Asparaginsäure 33,2 Phenylalanin 56,5

Cystein Coelution Prolin Prolin 50,6

Cystin 44,7 Serin 45,8

Glutamin 44,0 Taurin 50,0

Glutaminsäure 35,1 Threonin 46,6

Glycin 47,9 Tryptophan 55,4

Histidin 48,1 Tyrosin 75,6

Hydroxyprolin 42,8 Valin 51,2

Isoleucin 53,9

Nach einer von Vendrell & Avilés (1986) entwickelten Methode unter Verwendung an-

deren Säulenmaterials und eines anderen Puffer- und Gradientensystems ist neben der Derivatisierung und Analyse der genannten Aminosäuren zusätzlich die von meh-reren Aminosäurederivaten möglich; die Analysenzeit beträgt wie bei der in dieser Ar-beit verwendeten Methode etwa 80 min. Aufgrund der Trennung zahlreicher, chemisch ähnlicher Substanzen innerhalb einer Analysenmethode haben sowohl Pufferkonzen-tration und pH-Wert der Eluenten (Vendrell & Aviles, 1986; Chang et al., 1981; Noth-

nagel, pers. Mitteilung) als auch das verwendete Säulenmaterial und das Alter der Säule einen sehr großen Einfluß auf die Trennungsqualität und Retentionszeiten der Aminosäuren. Als Beispiel für in dieser Hinsicht besonders empfindlich reagierende Aminosäuren werden Asparaginsäure, Glutaminsäure und Arginin genannt (Vendrell & Aviles, 1986; Nothnagel, pers. Mitteilung).


74

Abb. 3.2: Chromatogramm eines käuflichen Aminosäurenstandardgemisches nach Vorsäulen-derivatisierung mit Dabs-Cl nach einer modifizierten Methode von Drnevich & Vary (1993) und Nothnagel (1994). Aus Darstellungsgründen ist ein Standard mit einer Konzentration außerhalb des Kalibrierungsbereiches ausgewählt worden. Einzelheiten zur Methode siehe Kap. 2.7. Die Retentionszeiten der weiteren, in die Methode integrierten Aminosäuren sind in Tab. 3.1 aufge-führt. In Klammern sind die Substanzen angegeben, die nicht im Standard enthalten waren, aber ebenfalls mit der verwendeten Methode quantifiziert worden sind.

Prolin / Cystein


75

3.4 Analyse von ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

Das bislang einzige in der Literatur beschriebene stabile Intermediat der Prolinbio-

synthese aus den L-Aminosäuren Glutaminsäure bzw. Ornithin ist DL-∆1-Pyrrolin-5-

Carboxylsäure (P5C). P5C entsteht durch spontane Zyklisierung aus der instabilen

Vorstufe Glutamat γ-Semialdehyd (Abb. 1.7). Beide Verbindungen stehen vermutlich

miteinander im Gleichgewicht; bei pH-Werten um pH 7,0 (physiologischer pH) liegt die

zyklisierte Form (P5C) vor (Vogel & Davies, 1952). P5C neigt zur Polymerisierung; ganz besonders unter neutralen Bedingungen in Konzentrationen ab etwa 50 mM und während der Maßnahmen zur Aufkonzentrierung (z.B. Lyophilisation) (Williams & Frank, 1975). Verfahren zur quantitativen Analyse von P5C sind aufgrund dieser Ei-genschaften Grenzen gesetzt. Neben der direkten Messung von P5C mit einem Amino-Acid-Analyzer nach Ansäuerung (Mezl & Knox, 1976) kann P5C indirekt durch Anfär-bung mit Ninhydrin (Strecker, 1960) gemessen werden. Gerade die letztgenannte Methode erschien wegen der sehr hohen intrazellulären Prolinkonzentrationen unge-eignet für die Analyse von P5C in Eisalgen.

Neben den (vernachlässigbaren) Reaktionen mit anderen ∆1-Pyrrolinen (z.B. Pyrrolin-

2-Carboxylsäure) / Zerfallsprodukten von P5C (Mezl & Knox, 1976) können auch Ami-nosäuren mit o-AB gefärbt werden. Vorversuche verschiedenen Aminosäurestandards ergaben einen Fehler von < 1 %; Prolin reagiert nicht mit o-AB. Aufgrund zu geringer intrazellulärer Konzentrationen konnte P5C in Eisalgen photome-trisch nicht nachgewiesen werden (Kap. 2.9.1.1); die für einen photometrischen Nach-

weis benötigten Mengen an Biomasse wären mit den vorhandenen Kultivierungsmög-lichkeiten nicht mehr händelbar gewesen. Die Erarbeitung einer HPLC-Methode für den P5C-Nachweis erschien daher sinnvoll (Kap. 2.9.1.2).


76

Abb. 3.3: Chromatogramm eines mit o-AB derivatisierten P5C-Standards (10 nmol), analysiert nach der Gradientenmethode (für Einzelheiten vgl. Tab. 2.18 in Kap. 2.9.1.2). P5C eluiert nach 16,5 min. Aufnahmewellenlänge λ = 444nm. Abkürzungen: o-AB = ortho-Aminobenzaldehyd P5C = ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure Das mit o-AB derivatisierte P5C läßt sich mit einer isokratischen Methode nachweisen (Meßbedingungen siehe Tab. 2.18; Daten nicht gezeigt). Der Vorteil dieser Methode liegt in der kurzen Laufzeit von 15 min, das Derivat eluiert bereits nach 9,5 min. Durch die Verwendung eines Gradientensystems (Tab. 2.18, Abb. 3.3) wurde zwar die Lauf-

zeit um etwa das Doppelte erhöht, dafür aber die Trennung des P5C von störenden Substanzen optimiert und die Nachweisgrenze verbessert. Das Derivat zeigt ein typisches Spektrum mit Absorptionsmaxima bei den Wellenlän-

gen λ = 225, λ = 298 und λ = 444 (je ± 4 nm; Abb. 3.4) und stimmt mit denen von

Strecker (1960) bestimmten überein. Durch die gegenüber 444 nm bei 298 nm höhere Absorbanz des Derivates kann die Nachweisgrenze weiter heraufgesetzt werden (vgl. Abb. 3.4a, b). Eine weitere Erhöhung der Nachweisgrenze konnte durch die Verwen-dung eines externen UV-Detektors mit Integrator erreicht werden, dessen Empfindlich-

keit die des Dioden-Array-Detektors (DAD) übersteigt. Die Wellenlänge λ = 225 nm

eignet sich wegen unruhiger Baseline, v.a. bei Messungen der Eisalgenextrakte, nicht als Analysenparameter.

P5C-Derivat


77

Abb. 3.4a: 3D-Spektrum eines mit o-AB derivatisierten P5C-Standards, analysiert mit der Gra-dientenmethode (für Einzelheiten vgl. Tab. 2.18 in Kap. 2.9.1.2). Deutlich erkennbar sind die drei Maxima bei den Wellenlängen λ = 225, 298 und 444 nm (siehe ). Abkürzungen: o-AB = ortho-Aminobenzaldehyd P5C = ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure Die Nachweisgrenze für P5C (HPLC-Gradientenmethode) liegt bei 4 nmol und damit um 12 nmol höher als bei der spektralphotometrischen Methode. Die Kalibrierung ver-läuft bis zu einer Konzentration von mindestens 1300 nmol P5C linear.

Abb. 3.4b: Konturdarstellung eines mit o-AB derivatisierten P5C-Standards, analysiert mit der Gradientenmethode (für Einzelheiten vgl. Tab. 2.18 in Kap. 2.9.1.2). Deutlich erkennbar sind die drei Maxima bei den Wellenlängen λ = 225, 298 und 444 nm (siehe ). Abkürzungen: o-AB = ortho-Aminobenzaldehyd P5C = ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

Maxima desP5C-Derivats

Maxima des P5C-Derivats

Ergebnisse

78

4 Ergebnisse


Für die Analyse der niedermolekularen organischen Osmolyte und FAS wurden die Al-gen vor Versuchsbeginn für 14 Tage an die verwendeten Salinitäten (17, 34 und 51 PSU) akklimatisiert (Kap. 2.3).

4.1.1 Niedermolekulare organische Osmolyte

Hauptosmolyt in allen 9 Arten ist die Iminosäure Prolin (genaue Daten siehe Kap. 4.1.1.1 – 4.1.1.9). Bei den zu den Centrales gehörenden Arten A. actinochilus, den beiden Chaetoceros-Arten und Co. pennatum ist Homarin als zweiter Osmolyt identifi-

ziert worden (Tab. 4.1, 4.2); in A. actinochilus und Co. pennatum allerdings nur in Kon-

zentrationen nahe der Nachweisgrenze. Tab. 4.1: Neben Prolin als Osmolyt genutzte Substanzen in 9 antarktischen Diatomeen. Kulti-vierung und Analyse: Kap. 2.3 und Kap. 2.6. Abkürzungen: B = Betain; Ho = Homarin; H.-Ectoin = Hydroxyectoin; Quacs = quaternäre Am-moniumverbindungen; ( ) = Konzentrationen im Bereich der Nachweisgrenze; x = vorhanden

Art Zucker / Polyole Quacs Ectoin H.-Ectoin DMSP Prolin weitere

A. actinochilus - (Ho) - - - x 1

C. gracile - Ho - - - x 1

Chaetoceros sp. - Ho - - - x 1

Co. pennatum - (Ho) - - - x 2

A. kufferathii - B, Ho - x - x 2

F. cylindrus B, Ho x x x x

Na. gelida x B, Ho - - x x 3

Ni. lecointei x B x x x x 3

Ni. medioconstricta x B x - x x 1

Die pennaten Arten zeigen ein weniger einheitliches Muster und ein breiteres Spektrum (vgl. Tab. 4.1, 4.2): der nach Prolin am höchsten konzentrierte Osmolyt ist Betain. A.

kufferathii, F. cylindrus und Na. gelida akkumulieren ebenfalls Homarin, die beiden

Ergebnisse

79

letztgenannten Arten auch DMSP als weitere Osmolyte. Wie die bisher genannten pennaten Arten akkumulieren sowohl Ni. lecointei als auch Ni. medioconstricta Prolin,

Betain und DMSP, allerdings kein Homarin. Zusätzlich weisen beide Arten einen nicht näher identifizierten Zucker bzw. Polyol in vergleichsweise hohen Mengen auf (siehe Kap. 4.1.2). In den Extrakten der pennaten Arten, mit Ausnahme von Na. gelida, wur-

den Ectoine nachgewiesen, deren Konzentrationen mit ansteigender externer Salinität zunahmen (vgl. Tab. 4.1, 4.2). Das Auftreten weiterer Peaks, deren Peakhöhen-zu-Zellzahl-Verhältnis mit ansteigender Salinität zunimmt, deutet auf die Synthese weite-rer, nicht identifizierter osmotisch wirksamer Substanzen hin (vgl. Tab. 4.1 „weitere“). Diese werden in der folgenden Detaildarstellung der organischen Osmolyte der einzel-nen Arten nicht mehr gesondert erwähnt.

Tab. 4.2: Übersicht über die als Osmolyt genutzte Substanzen in 9 antarkti-schen Eisdiatomeen, getrennt nach Pennales und Centrales. Absteigende Reihenfolge. Kultivierung und Analyse: Kap. 2.3 und Kap. 2.6. * = keine Quantifizierung möglich da unbekannter Zucker / Polyol

Centrales Pennales

Prolin Prolin, Betain

Homarin Homarin

(nicht in Ni. lecointei, Ni. medioconstricta)

DMSP

(nicht in A. kufferathii)

Zucker / Polyol*

(nicht in A. kufferathii, F. cylindrus)

Hydroxyectoin

(nicht in Ni. medioconstricta, Na. gelida)

Ectoin

(nicht in E. kufferathii, Na. gelida)

4.1.1.1. Actinocyclus actinochilus

In A. actinochilus konnte lediglich Prolin als Osmolyt identifiziert werden und wird im

Salinitätsbereich von 17 bis 34 PSU um das 10,6fache, im Bereich von 34 bis 51 PSU nur um das 1,7fache akkumuliert (Abb. 4.1 und Tab. 4.3). Betain wird von A. actinochi-

lus ebenfalls synthetisiert, aber nicht im Salinitätsbereich von 17 – 34 PSU akkumuliert

(Daten nicht gezeigt).

Ergebnisse

80

Tab. 4.3: Prolinkonzentrationen in A. actinochilus bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3.

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

17 133,10 ± 6,56

34 1412,63 ± 11,90

51 2363,22 ± 193,69

Abb. 4.1: Prolinkonzentrationen in A. actinochilus bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Ergebnisse

81

4.1.1.2 Chaetoceros gracile

C. gracile akkumuliert Prolin als Hauptosmolyten und Homarin als weiteren Osmolyten

(Abb. 4.2 und Tab. 4.4). Ähnlich A. actinochilus verzwanzigfacht sich die Prolinkonzen-

tration im Salinitätsbereich von 17 bis 51 PSU. Die intrazellulare Homarinkonzentration erreicht lediglich etwa jeweils 3,5% der Prolinkonzentrationen von 34 bzw. 51 PSU.

Tab. 4.4: Osmolytkonzentrationen in C. gracile bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

Homarin [fmol/Zelle]

17 1,92 ± 0,45 n.n.

34 20,84 ± 0,04 0,77 ± 0,18

51 40,39 ± 1,14 1,40 ± 0,05

Abb. 4.2: Osmolytkonzentrationen in C. gracile bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Homarin

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Ergebnisse

82

4.1.1.3 Chaetoceros sp.

Wie bei C. gracile wurden Prolin als Hauptosmolyt und Homarin als weiterer Osmolyt

mit ansteigender Salinität akkumuliert (Abb. 4.3 und Tab. 4.5). Die Prolinkonzentration steigt allerdings im Vergleich zu denen von C. gracile und A. actinochilus wesentlich

stärker (um den Faktor 58 zwischen 17 und 51 PSU) an. Der Homaringehalt ist gering und beträgt nur jeweils etwa 2% des Prolingehaltes.

Tab. 4.5: Osmolytkonzentrationen in Chaetoceros sp. bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]


17 0,69 ± 0,04 n.n.

34 11,12 ± 0,89 0,19 ± 0,01

51 39,86 ± 0,59 0,84 ± 0,05

Abb. 4.3: Osmolytkonzentrationen in Chaetoceros sp. bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbe-dingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Homarin

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Ergebnisse

83

4.1.1.4 Corethron pennatum

In Co. pennatum konnte nur Prolin als Osmolyt identifiziert werden (Abb. 4.4 und Tab.

4.3). Die Prolinkonzentration steigt um das 8,9fache von 1300,69 fmol / Zelle auf 11595,8 fmol / Zelle an. Homarin weist Konzentrationen an der Nachweisgrenze auf, so daß über eine mögliche Funktion als Osmolyt keine Aussage getroffen werden kann. Die hyposalinen Bedingungen bei 17 PSU sind für Co. pennatum letal.

Tab. 4.3: Osmolytkonzentrationen in Co. pennatum bei 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. k.D. = keine Daten wegen Zelltodes (17 PSU)

Salinität [PSU] Prolin [fmol/Zelle]

17 k.D.

34 1300,69 ± 100,00

51 11593,80 ± 164,57

Abb. 4.4: Osmolytkonzentrationen in Co. pennatum bei 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3. * letale Salinität

4.1.1.5 Amphiprora kufferathii

In A. kufferathii konnten vier Osmolyte identifiziert werden: Prolin als Hauptosmolyt so-

wie Homarin und Betain (Abb. 4.5 und Tab. 4.7). Die Betainkonzentrationen erreichen bei beiden Salinitäten etwa 9% der Prolinkonzentrationen. Beide Osmolyte werden im

0

2000

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6000

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17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

*

Ergebnisse

84

untersuchten Salinitätsbereich um den Faktor 3,5 (Prolin) bzw. 3,1 (Betain) angerei-chert. Homarin hat in A. kufferathii mit 54,14 fmol/Zelle bei 34 PSU (das sind 40% der

Prolinkonzentration) eine vergleichsweise hohe Konzentration und stellt damit den am zweithöchsten konzentrierten Osmolyten in A. kufferathii dar. Homarin wird im Gegen-

satz zu Betain und Prolin jedoch nur um den Faktor 1,5 bei 51 PSU angereichert und erreicht dementsprechend nur noch knapp 17% der Prolinkonzentration. Neben Prolin, Homarin und Betain konnte Hydroxyectoin bei 51 PSU nachgewiesen werden. Da die verwendete Kultur nicht axenisch war, könnte eine Bakterienkontami-nation das Vorkommen von Hydroxyectoin bedingen: Ectoine sind bisher nur in Bakte-rien nachgewiesen worden (E.A. Galinski, pers. Mitteilung). Die hyposalinen Bedingun-gen bei 17 PSU waren für A. kufferathii letal.

Tab. 4.7: Osmolytkonzentrationen in A. kufferathii bei 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingun-gen siehe Kap. 2.3. n = 3. k.D. = keine Daten wegen Zelltodes (17 PSU) n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

Betain [fmol/Zelle]


Hydroxyectoin [fmol/Zelle]

17 k.D. k.D. k.D. k.D.

34 135,31 ± 21,95 13,18 ± 2,08 54,14 ± 15,46 n.n.

51 477,61 ± 25,92 41,85 ± 1,43 80,92 ± 8,12 35,59 ± 3,72

Abb. 4.5: Osmolytkonzentrationen in A. kufferathii bei 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingun-gen siehe Kap. 2.3. n = 3. * letale Salinität Prolin Betain Homarin Hydroxyectoin

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100

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500

600

17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

*

Ergebnisse

85

4.1.1.6 Fragilariopsis cylindrus

In F. cylindrus konnten vier Osmolyte identifiziert werden: Prolin als Hauptosmolyt und

Homarin, Betain sowie DMSP als weitere Osmolyte (Abb. 4.6 und Tab. 4.8). Zusätzlich steigt die Gesamtkonzentration aller detektierter FAS mit ansteigenden externen Salini-täten an (siehe Kap. 4.1.3; Tab. 4.12a; Abb. 4.17). Prolin weist bei 34 PSU die höchste Konzentration mit 8,43 fmol/Zelle auf. Im Salinitätsbereich von 34 zu 51 PSU wird Pro-lin nur geringfügig akkumuliert; außerordentlich hoch ist dagegen die Akkumulation zwischen 17 und 34 PSU, die sich von 0,14 auf 8,43 um den Faktor 60 erhöht. Betain und DMSP weisen bei 34 PSU ähnliche Konzentrationen mit 1,90 bzw. 1,30 fmol/Zelle auf (22,5% bzw. 15,4% der Prolinkonzentration). Bei einer Erhöhung der Salinität von 34 auf 51 PSU verdoppelt sich die Betainkonzentration; die Konzentration von DMSP steigt dagegen nur geringfügig an. Homarin weist bei 34 und 51 PSU die geringsten Gehalte der Osmolyte auf. Die Konzentrationen von Hydroxyectoin steigen im Salinitätsbereich von 34 und 51 PSU von 0,43 auf 1,19 fmol/Zelle an; bei 17 PSU ist es nicht nachweisbar. Die Konzen-trationen bewegen sich im Bereich derer von Homarin. Ectoin konnte zwar nachgewiesen werden, wird jedoch nicht mit ansteigender Salinität akkumuliert (Daten nicht gezeigt). Tab. 4.8: Osmolytkonzentrationen in F. cylindrus bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3. n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

Betain [fmol/Zelle]

DMSP [fmol/Zelle]



17 0,14 ± 0,02 n.n. 0,418 ± 0,02 n.n. n.n.

34 8,43 ± 0,14 1,90 ± 0,44 1,30 ± 0,13 0,32 ± 0,02 0,43 ± 0,08

51 8,79 ± 0,27 4,07 ± 1,10 1,58 ± 0,09 1,14 ± 0,13 1,19 ± 0,09

Ergebnisse

86

Abb. 4.6: Osmolytkonzentrationen in F. cylindrus bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Betain DMSP Homarin Hydroxyectoin

4.1.1.7 Navicula gelida var. antarctica

Na. gelida akkumuliert verschiedene organische Osmolyte bei ansteigenden externen

Salinitäten, von denen vier identifiziert werden konnten: Prolin als Hauptosmolyt; wei-terhin Homarin, DMSP und Betain (Abb. 4.7 und Tab. 4.9). Während DMSP bei 17 und 34 PSU die höchsten Konzentrationen mit 14,59 fmol/Zelle bzw. 24,37 fmol/Zelle aufweist (vgl. Tab. 4.9), wird Prolin bei einer Erhöhung der exter-nen Salinität von 34 auf 51 PSU um den Faktor 6 bis auf 142,69 fmol/Zelle akkumuliert, während die anderen organischen Osmolyte Betain, DMSP und Homarin max. um den Faktor 4 (Homarin; bis auf 3,43 fmol/Zelle) höhere Konzentrationen aufweisen. Homa-rin weist bei allen Salinitäten die geringsten Konzentrationen auf. Eine Substanz eluiert auf der Mercksäule (Zucker- / Polyolmethode) bei einer Retenti-onszeit von 12,7 min; möglicherweise handelt es sich wie bei Ni. medioconstricta um Erythritol (siehe Kap. 4.1.2). Die Extrakte von Na. gelida sind jedoch, im Gegensatz zu

jenen, keinen weiteren Prüfungen zur Natur der Substanz unterzogen worden.

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1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

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mol

/Zel

le]

Ergebnisse

87

Tab. 4.9: Osmolytkonzentrationen in Na. gelida bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingun-gen siehe Kap. 2.3. n = 3. n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU] Prolin [fmol/Zelle]

Betain [fmol/Zelle]

DMSP [fmol/Zelle]


17 8,32 ± 2,13 3,03 ± 0,34 14,59 ± 0,81 0,14 ± 0,02

34 23,53 ± 5,69 13,36 ± 2,48 24,37 ± 2,12 0,88 ± 0,19

51 142,69 ± 0,00 25,43 ± 5,59 69,73 ± 2,00 3,89 ± 0,66

Abb. 4.7: Konzentrationen der identifizierten organischen Osmolyte von Na. gelida bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Betain DMSP Homarin

4.1.1.8 Nitzschia lecointei

In Ni. lecointei konnten vier Osmolyte identifiziert werden: Betain, weiterhin Prolin,

DMSP (Abb. 4.8 und Tab. 4.10) und ein nicht näher identifizierter Zucker (Kap. 4.1.2). Nach einem Vergleich der Peakhöhen dieser Substanz mit denen von bekannten Standards erscheinen Konzentrationen von durchschnittlich 0,5 mmol pro 100 mL Zell-kultur möglich. Ectoine konnten in den Stammkulturen nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu den anderen 7 bisher beschriebenen Arten kann für Ni. lecointei kein

Hauptosmolyt bestimmt werden, da sich die Konzentrationen bei externen Salinitäten von 34 und 51 PSU – mit einer Ausnahme von Prolin - in denselben Größenordnungen bewegen. Die Prolinkonzentration bei 34 PSU beträgt mit knapp 6 fmol/Zelle nur etwa

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20

40

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140

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17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Ergebnisse

88

40% der Betain- und DMSP-Konzentrationen. Auch bei 51 PSU ist die Konzentration von Prolin mit 19,69 fmol/Zelle niedriger als die von Betain und DMSP (24,01 bzw.

21,28 fmol/Zelle).

Tab. 4.10: Konzentrationen der identifizierten Osmolyte von Ni. lecointei bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3.

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

Betain [fmol/Zelle]

DMSP [fmol/Zelle]

17 1,97 ± 0,10 2,88 ± 1,33 4,58 ± 0,30

34 5,99 ± 0,17 13,79 ± 2,15 15,33 ± 1,06

51 19,69 ± 0,46 24,01 ± 0,63 21,28 ± 2,46

Abb. 4.8: Osmolytkonzentrationen in Ni. lecointei bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedin-gungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Betain DMSP

4.1.1.9 Nitzschia medioconstricta

In Ni. medioconstricta konnten fünf Osmolyte identifiziert werden: Prolin als Hauptos-

molyten; weiterhin Betain, DMSP (Abb. 4.9 und Tab. 4.11) und einen nicht näher identi-fizierten Zucker bzw. Polyol (Kap. 4.1.2), bei dem es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Erythritol handelt. Betain ist nur bei externen Salinitäten von 34 und 51 PSU nachweisbar und wird nur geringfügig akkumuliert (von 171,85 auf 187, 68 fmol/Zelle). Die Prolin- und DMSP-

0

5

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17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

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le]

Ergebnisse

89

Konzentrationen sind bei 17 PSU annähernd gleich (50,51 bzw. 55,15 fmol/Zelle) und steigen bei der Erhöhung der externen Salinität auf 34 PSU unterschiedlich stark an:

Der Prolingehalt verdoppelt sich, während die DMSP-Konzentration sich nahezu auf 258,76 fmol/Zelle verfünffacht. Bei der weiteren Erhöhung der externen Salinität von 34 auf 51 PSU kehrt sich das Akkumulationsverhältnis beider Substanzen um: Während die DMSP-Konzentration nur wenig bis auf 310,25 fmol/Zelle ansteigt, vervierfacht sich die Prolinkonzentration auf 494,09 fmol/Zelle und erreicht damit die höchste Konzen-tration unter den identifizierten Osmolyten. Hydroxyectoin konnte mit Konzentrationen zwischen 33,85 fmol/Zelle (17 PSU) und 48,95 fmol/Zelle (51 PSU) in den Extrakten von Ni. medioconstricta nachgewiesen

werden und weist damit die geringsten Mengen auf. Tab. 4.11: Konzentrationen der identifizierten Osmolyte von Ni. medioconstricta bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. n.n. = nicht nachweisbar

Salinität [PSU]

Prolin [fmol/Zelle]

Betain [fmol/Zelle]

DMSP [fmol/Zelle]


17 50,51 ± 17,97 n.n. 55,15 ± 0,76 33,85 ± 7,71

34 114,52 ± 2,19 171,85 ± 2,16 258,76 ± 5,04 40,12 ± 4,37

51 494,09 ± 3,13 187,68 ± 6,52 310,25 ± 11,77 48,95 ± 1,63

Abb. 4.9: Konzentrationen der identifizierten Osmolyte von Ni. medioconstricta bei 17, 34 und 51 PSU. Kultivierungsbedingungen siehe Kap. 2.3. n = 3. Prolin Betain DMSP Hydroxyectoin

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17 34 51

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/zel

le]

Ergebnisse

90

4.1.2 Zucker- / Polyolidentifikation

Wie bereits erwähnt, sind in den beiden Nitzschia-Arten und in Na. gelida Substanzen

mit der Zucker- / Polyolmethode gemessen worden, bei denen das Peakhöhen-zu-Zellzahl-Verhältnis mit ansteigenden externen Salinitäten zunimmt. Die Retentionszei-ten betragen 10,7 min (Ni. lecointei, siehe Abb. 4.10 als Beispiel) und 13,0 min (Ni.

medioconstricta und Na. gelida) und deuten auf Zucker bzw. Polyole hin. Zucker bzw.

Polyole sind in Eisdiatomeen bisher nicht nachgewiesen worden, daher wurden die an-hand der Retentionszeiten identifizierten Zucker / Polyole mit Hilfe von Standard-Proben-Gemischen und anderen Chromatographiebedingungen (z.B. durch Verände-rung der Flußrate) überprüft. Im Rahmen dieser Kontrollen hat sich herausgestellt, daß Ni. lecointei weder Xylose noch Glucose (die Retentionszeiten betragen 11,1 bzw. 9,6

min unter Standardbedingungen; beide Substanzen eluierten mit eindeutiger Trennung direkt vor bzw. nach dem unbekannten Zucker) akkumuliert. Ni. medioconstricta syn-

thetisiert offenbar Erythritol (Coelution von Erythritolstandard und Extrakt bei 13,0 min unter Standard- und veränderten Bedingungen) als Osmolyt.

Abb. 4.10: Ni. lecointei: Beispielchromatogramme aus der Zucker- / Polyolanalyse (Kap. 2.3): Proben des Langzeitversuches V S/0 (Kap. 2.4): a) 34 PSU, b) 102 PSU, Zellzahl / mL nahezu gleich. Der gesuchte Zucker hat eine Retentionszeit von 10,7 min und wird mit zunehmender Salinität in den Zellen akkumuliert. RT = Retentionszeit Die in den beiden Nitzschia-Arten auf der Zucker- / Polyolsäule eluierten Substanzen mit den RT 10,7 (Ni. lecointei) und RT 13,0 (Ni. medioconstricta) wurden mit zusätzli-

chen Methoden identifiziert (Ni. lecointei) bzw. die vorgenommene Identifikation für Erythritol (Ni. medioconstricta) bestätigt.

Zucker bei RT 10,7 min und

erhöhter externer Salinität

a

kein Zucker bei RT 10,7 min

b

Ergebnisse

91

Anthrontest

Die mit aufkonzentrierten Extrakten von Ni. lecointei und Ni. medioconstricta vorge-

nommenen Anthrontests sind positiv. Tests mit anderen HPLC-Säulen

Xylose und Sorbose können als Zucker / Polyol in Ni. lecointei ausgeschlossen wer-

den.

Enzymtest mit β-Galactosidase DH

Mit Hilfe des Enzymtests kann D-Galactose als Osmolyt in Ni. lecointei ausgeschlos-

sen werden. D-Mannose, D-Sorbose und D-Xylose werden von der β-Galactosidase

DH als Substrat nicht umgesetzt. Dünnschichtchromatographie

Mit Hilfe der Dünnschichtchromatograpie läßt sich weder die Substanz aus dem Extrakt von Ni. lecointei noch die von Ni. medioconstricta identifizieren. Ausgeschlossen wer-

den können D-Galactose, D-Mannose, D-Sorbose und D-Xylose (aufsteigende Reihen-folge. Die Extrakte von Ni. lecointei lassen sich als schwache, gelbliche Banden knapp

unterhalb der D-Galactose-Bande erkennen. Hydrolyse mit anschließender HPLC-Analyse

Die Konzentration der untersuchten Substanzen blieb unverändert. Die Substanzen konnten mit den verwendeten Verfahren nicht hydrolysiert werden.

Ergebnisse

92

4.1.3 freie Aminosäuren

Die Bezeichnung „FAS“ wird für die Summe der freien Aminosäuren (inkl. Der Amino-säurenderivate, die mit der verwendeten Methode derivatisiert werden können) ohne Prolin verwendet, da die Prolinkonzentrationen die der FAS weit übersteigen. Die FAS-Konzentration steigt nur in F. cylindrus mit zunehmender externer Salinität

von 1,62 fmol/Zelle bei 17 PSU auf 23,64 fmol/Zelle bei 51 PSU an (Abb. 4.17 / Tab. 4.12a). In den anderen 8 Arten sinkt die Konzentration dagegen ab; in Na. gelida und Ni. medioconstricta liegt das Maximum mit 211,53 fmol/Zelle bzw. 979,5 fmol/Zelle bei

34 PSU, in den anderen Arten liegt es bei der jeweils niedrigsten tolerierten externen Sali-nität (Tab. 4.12a). Tab. 4.12a: FAS-Konzentrationen (ohne Prolin) in den untersuchten 9 Arten bei 17, 34 und 51 PSU in fmol/Zelle. Kulturbedingungen und Meßbedingungen siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. Abkürzungen: k.D. keine Daten wegen Zelltodes FAS = freie Aminosäuren (ohne Prolin)

Art 17 PSU 34 PSU 51 PSU

A. actinochilus 8949,0 4495,0 4684,3

C. gracile 30,0 14,5 9,2

Chaetoceros sp. 43,9 18,0 9,1

Co. pennatum k.D. 12506,9 8250,4

A. kufferathii k.D. 981,8 562,7

F. cylindrus 1,6 13,5 23,6

Na. gelida 120,6 211,5 57,5

Ni. lecointei 55,1 42,7 33,8

Ni. medioconstricta 676,2 979,8 286,7

In allen Arten liegt der prozentuale Anteil der FAS-Konzentration an der Summe FAS plus Prolin bei 17 PSU bei über 90% (Tab. 4.12b). Bei 34 PSU variiert dieser Anteil und liegt zwischen 40% und 90%, wobei die beiden Chaetoceros-Arten insgesamt die ge-

ringsten FAS-Anteile an der Summe der FAS inkl. Prolin von allen Arten aufweisen (40,2% für C. gracile bzw. 61,9% für Chaetoceros sp.; Abb. 4.11a). F. cylindrus erreicht

einen Anteil von 62,4%; alle anderen Arten liegen bei über 70% (Tab. 4.12b). Bei einer externen Salinität von 51 PSU sinkt der FAS-Anteil in beiden Chaetoceros-

Arten auf knapp über 18%, während der aller anderen Arten mindestens bei knapp 30% liegt (Na. gelida; Abb. 4.11b). In F. cylindrus steigt der Anteil sogar von 62,4% auf

Ergebnisse

93

73,2% an (Tab. 4.12b), passend zu den insgesamt ansteigenden FAS-Konzentrationen bei ansteigenden externen Salinitäten (Abb. 4.16).

Abb. 4.11: FAS-Konzentrationen bei externen Salinitäten von 17, 34 und 51 PSU inkl. Prolin zur Darstellung des Unterschiedes zwischen den beiden Chaetoceros-Arten und den anderen sieben Spezies. Beispielhaft sind a) C. gracile und b) Na. gelida aufgeführt. Wie im Text näher erläutert, weist Na. gelida nach den Chaetoceros-Arten den niedrigsten prozentualen FAS-Anteil an FAS + Prolin auf. Einzelheiten zur FAS-Zusammensetzung der beiden Arten finden sich in den Kap. 4.1.3.2 (C. gracile) und Kap. 4.1.3.7 (Na. gelida). Separat sind nur die wichtig-sten FAS und Prolin aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivierungsbedingungen und Analyse-verfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4. Die Veränderungen der FAS-Zusammensetzung betreffen hauptsächlich in den Stoff-wechsel stark involvierte FAS wie z.B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Alanin und die stickstoffspeichernden FAS Glutamin und Asparagin (vgl. Abb. 4.12 – 4.20), nicht aber die aromatischen FAS. Auffällig im Vergleich der zu den Centrales zählenden Arten zu denen der Pennales ist der hohe Cystinanteil der Centrales. Nachfolgend ist die Zu-sammensetzung der FAS der einzelnen Arten aufgeführt. Besondere Berücksichtigung finden v.a. die FAS, die in mehreren Arten von Bedeutung sind.

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17 PSU 34 PSU 51 PSU

Salinität [PSU]

asp glu asn gln cystin ser arg ala Rest pro

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Salinität [PSU]

Konz

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asp glu asn gln cystin ser arg ala Rest pro

a b

Ergebnisse

94

Tab. 4.12b: Prozentuale Anteile der FAS-Konzentrationen an der Summe von FAS inkl. Prolin in den 9 untersuchten Arten bei 17, 34 und 51 PSU. Kultur- und Meßbe- dingungen siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. Abkürzungen: k.D. keine Daten wegen Zelltodes FAS = freie Aminosäuren (ohne Prolin)

Art Anteil der FAS an Σ FAS + Prolin [%] bei 17 PSU 34 PSU 51 PSU

A. actinochilus 98,5 77,8 76,8

C. gracile 94,0 40,2 18,2

Chaetoceros sp. 98,4 61,9 18,5

Co. pennatum k.D. 90,6 41,6

A. kufferathii k.D. 87,9 54,1

F. cylindrus 93,5 62,4 73,2

Na. gelida 93,6 90,0 28,6

Ni. lecointei 96,5 87,8 63,3

Ni. medioconstricta 93,0 89,5 36,7

Ergebnisse

95

4.1.3.1 Actinocyclus actinochilus

Die wichtigsten FAS in A. actinochilus sind Asparaginsäure und Glutaminsäure bei 17

PSU mit 2227,5 bzw. 3098,3 fmol/Zelle (Abb. 4.12). Beide Aminosäuren nehmen bei ansteigenden externen Salinitäten ab: Die Asparaginsäurekonzentration fällt über 232,2 fmol/Zelle bei 34 PSU bis auf 54,1 fmol/Zelle bei 51 PSU ab; die von Glutamin-säure erreicht bei 34 PSU mit 1199,2 fmol/Zelle nur noch knapp die Hälfte der bei 17 PSU gemessenen Konzentration und sinkt bei einer weiteren Salinitätserhöhung kaum weiter. Asparagin kann erst bei externen Salinitäten ab 34 PSU (482,3 fmol/Zelle) nachgewiesen werden. Neben den bereits erwähnten Aminosäuren weisen Glutamin, Cystin, Serin, Arginin und Alanin bei allen Salinitäten Konzentrationen über 100 fmol/Zelle auf, jedoch ohne Tendenz. In den Extrakten von A. actinochilus lassen sich Hydroxyprolin und Taurin

nicht nachweisen. Unter den als „Rest“ zusammengefaßten Aminosäuren weisen Gly-cin, Lysin und Tyrosin mit Konzentrationen von z.T. über 200 fmol/Zelle die höchsten Konzentrationen auf.

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Salinität [PSU]

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asp glu asn gln cystin ser arg ala Rest

Abb. 4.12: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Diatomee A. actinochilus bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die anteilig wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivierungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

96

4.1.3.2 Chaetoceros gracile

Die wichtigsten FAS von C. gracile mit Konzentrationen von mehr als 1 fmol/Zelle bei

mind. 2 Salinitäten sind Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Serin, Arginin, Alanin sowie Cystin (Abb. 4.13). Glutaminsäure hat den größten Anteil mit 10,5 fmol/Zelle, 4,3 fmol/Zelle und 2,6 fmol/Zelle bei den externen Salinitäten von 17, 34 und 51 PSU. Die Konzentrationen fast aller anderen genannten FAS nehmen ebenfalls mit zunehmenden externen Salinitäten ab. Ausnahmen bilden Glutamin, dessen Kon-zentration von 0,2 fmol/Zelle bei 17 PSU auf 1,5 fmol/Zelle bei 34 PSU ansteigt, und Cystin, das mit 1,5 fmol/Zelle bei 17 und 34 PSU eine gleichbleibende Konzentrationen aufweist. Die Reduktion der FAS-Gesamtkonzentration beruht vor allem auf Glutamin-säure, dessen Konzentration von 17 auf 51 PSU um etwa ein Drittel abnimmt. Nicht nachgewiesen werden konnten Hydroxyprolin, Taurin und Leucin.

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Salinität [PSU]

Kon

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Abb. 4.13: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee C. gracile bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

97

4.1.3.3 Chaetoceros sp.

Ähnlich C. gracile sind die wichtigsten FAS mit Konzentrationen von mehr als 1 fmol

pro Zelle bei mind. 2 Salinitäten sind Glutaminsäure, Asparagin, Cystin und Alanin. Bei 17 und 34 PSU hat Glutaminsäure den größten Anteil mit 17,6 fmol/Zelle und 7,4 fmol pro Zelle. Bei 34 und 51 PSU erreichen Chaetoceros sp. und C. gracile ähnlich hohe

FAS-Gesamtkonzentrationen von 14,5 und 18,0 fmol/Zelle bzw. 9,1 fmol/Zelle (vgl. Tab. 4.12a), bei 17 PSU weist Chaetoceros sp. jedoch mit 43,9 fmol/Zelle gegenüber 30 fmol/Zelle in C. gracile eine deutlich höhere Konzentration auf. Auffällig gegenüber den Veränderungen bei C. gracile ist zum einen die vergleichswei-

se starke Abnahme der Glutaminsäurekonzentration und zum anderen sowohl die ho-hen Alaninkonzentrationen zwischen 2,7 und 5,5 fmol/Zelle als auch die Zunahme die-ser Aminosäure bei 51 PSU (Abb. 4.14). Nicht nachgewiesen werden konnten Hydroxyprolin, Taurin und Leucin.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50


Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.14: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee Chaetoceros sp. bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kulti-vierungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

98

4.1.3.4 Corethron pennatum

Co. pennatum weist als wichtigste FAS Glutaminsäure, Asparagin, Cystin und Alanin

auf, deren Konzentrationen bei beiden Salinitäten – mit Ausnahme von Glutaminsäure mit 778,1 fmol/Zelle und Alanin mit 468,0 fmol/Zelle bei jeweils 51 PSU – über 1000 fmol/Zelle betragen (vgl. Abb. 4.15). Auffällig gegenüber den bisher beschriebenen Ar-ten sind die hohen Anteile von Cystin (2228,8 fmol/Zelle bzw. 2586,1 fmol/Zelle bei 34 und 51 PSU, das entspricht 18% bzw. 30%) und den restlichen Aminosäuren mit 34% bei 34 PSU und 26% bei 51 PSU. Die hohe Konzentration der unter „Rest“ zusammen-gefaßten Aminosäuren beruht hauptsächlich auf den beiden aromatischen Aminosäu-ren Tyrosin und Tryptophan sowie auf Lysin. Mit Ausnahme von Cystin (siehe oben), Glutamin und Methionin nehmen die Konzen-trationen aller anderen FAS mit zunehmender externer Salinität ab. Nicht nachgewie-sen werden konnten Hydroxyprolin und Taurin.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

34 PSU 51 PSU

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.15: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Diatomee Co. pennatum bei 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4. 17 PSU waren für diese Art letal.

Ergebnisse

99

4.1.3.5 Amphiprora kufferathii

Die Konzentrationen der separat aufgeführten FAS liegt zwischen 7 und 310 fmol/Zelle.

Glutaminsäure weist die höchsten Konzentrationen mit 309,4 fmol/Zelle bei 34 PSU und 198,7 fmol/Zelle bei 51 PSU auf (vgl. Abb. 4.16). Es folgen Asparagin mit 127,7 fmol/Zelle bzw. 29,6 fmol/Zelle und Alanin mit 83,0 fmol/Zelle und 88,5 fmol/Zelle. Ne-ben Alanin nimmt die Konzentration von Glutamin mit ansteigender externer Salinität zu; sie steigt von 41,3 fmol/Zelle auf 56,1 fmol/Zelle. Alle anderen FAS nehmen bei zu-nehmender Salinität ab. Unter den „restlichen“ FAS weist Glycin mit Konzentrationen von 78,3 fmol/Zelle (34 PSU) und 75,7 fmol/Zelle (51 PSU) verhältnismäßig hohe Konzentrationen auf. Hydroxyprolin konnte nicht nachgewiesen werden; Taurin dagegen weist geringe Kon-zentrationen bei beiden Salinitäten auf.

0

250

500

750

1000

34 PSU 51 PSU

Salinität [PSU]

Kon

z. [

fmol

/Zel

le]


Abb. 4.16: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee A. kufferathii bei 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4. 17 PSU waren für diese Art letal.

Ergebnisse

100

4.1.3.6 Fragilariopsis cylindrus

Im Gegensatz zu allen anderen untersuchten Arten steigt die Konzentration der Ge-

samt-FAS mit zunehmenden externen Salinitäten an (vgl. Tab. 4.12a). Bei einer Erhö-hung der Salinität von 17 auf 34 PSU beruht die Zunahme auf der Akkumulation aller gemessenen FAS (vgl. Abb. 4.17); besonders stark angestiegen ist die Glutaminsäure mit Werten von 0,2 fmol/Zelle auf 5,7 fmol/Zelle; entsprechend 13% bzw. 42% der FAS. Bei der weiteren Erhöhung der Salinität von 34 PSU auf 51 PSU steigt die Gluta-minsäurekonzentration um den Faktor 1,3 auf 7,5 fmol/Zelle und macht damit 32% der Gesamt-FAS aus. Der prozentuale Rückgang des Glutaminsäureanteils beruht auf den vergleichsweise stärkeren Zunahmen der anderen FAS, besonders auf der von Alanin. Dessen Konzentration steigt von 0,3 fmol/Zelle auf 4,6 fmol/Zelle an. Die Konzentrationen der nicht separat aufgeführten FAS (vgl. Abb. 4.17) liegen – bis auf Tyrosin und drei vereinzelten Werten – deutlich unter 1,0 fmol/Zelle.

0

5

10

15

20

25


Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.17: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee F. cylindrus bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

101

4.1.3.7 Navicula gelida var. antartica

Mit Ausnahme von Lysin, dessen Konzentrationen in Na. gelida bei 34 und 51 PSU

über 10,0 fmol/Zelle liegen, sind die Konzentrationen der als „Rest“ zusammengefas-sten FAS deutlich unter 2,0 fmol/Zelle eher unbedeutend. Nicht nachgewiesen werden konnten Hydroxyprolin und Tryptophan. Taurin ist bei allen Salinitäten in geringen Mengen von 0,3 fmol/Zelle vorhanden. Die Konzentrationen von Asparaginsäure sinken mit ansteigender externer Salinität von 12,6 fmol/Zelle (17 PSU) auf 2,7 fmol/Zelle (51 PSU). Die anderen, separat aufge-führten FAS – mit einer Ausnahme - weisen bei 34 PSU die höchsten und bei 51 PSU die niedrigsten Konzentrationen auf, wobei Glutaminsäure und Asparagin mit Konzen-trationen von über 40 fmol/Zelle bei 34 PSU die höchsten Werte erreichen. Glutamin wird als einzige FAS mit ansteigenden externen Salinitäten akkumuliert; die Konzentra-tion steigt von nicht nachweisbaren Mengen bei 17 PSU auf 11,8 fmol/Zelle an (Abb. 4.18).

0

50

100

150

200

250


Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.18: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee Na. gelida bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

102

4.1.3.8 Nitzschia lecointei

Auffallend gegenüber den anderen Arten ist der verhältnismäßig hohe Anteil der stick-

stoffreichen FAS Asparagin und Glutamin. Asparagin weist FAS-Anteile zwischen 13% und 25% (5,6 – 10,5 fmol/Zelle) während Glutamin etwas weniger mit 2% bis 18% (1,0 – 6,0 fmol/Zelle) aufweist (vgl. Abb. 4.19). Während bei 17 PSU Glutaminsäure mit 13,5 fmol/Zelle die am höchsten konzentrierte FAS darstellt, die bei den beiden höheren Salinitäten bis auf 2,3 fmol/Zelle abnimmt, so synthetisiert Ni. lecointei im Vergleich zu den bisher beschriebenen Arten große Men-

gen an Serin, die mit einer Konzentration von 12,6 fmol/Zelle bei 51 PSU die höchste Konzentration ausmacht. Wie Na. gelida steigen die Glutaminkonzentrationen von Ni. lecointei mit ansteigenden

Salinitäten an und erreichen bereits oben genannte Konzentrationen. Nicht nachgewiesen werden konnten Taurin und Tryptophan; dagegen sind Spuren von Hydroxyprolin bei allen Salinitäten aufgetreten.

0

10

20

30

40

50

60


Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.19: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee Ni. lecointei bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivie-rungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

103

4.1.3.9 Nitzschia medioconstricta

Vergleichbar mit Ni. lecointei, sind die stickstoffreichen FAS Asparagin und Glutamin in

einem verhältnismäßig hohen Anteil in Ni. medioconstricta nachgewiesen worden. Die prozentuale Verteilung bei den verschiedenen Salinitäten ist ähnlich; in Ni. mediocon-

stricta ist der Asparaginanteil mit 43% (291,2 fmol/Zelle) an den Gesamt-FAS aller-

dings sehr hoch (Abb. 4.20). Bei 34 und 51 PSU betragen sie 22% und 18%, das ent-spricht 212,5 fmol/Zelle und 51,9 fmol/Zelle. Die Glutaminkonzentration steigt nicht, wie bei Na. gelida und Ni. lecointei mit zunehmender externer Salinität an, sondern liegt bei

25,1 fmol/Zelle (17 PSU), 22,7 fmol/Zelle (34 PSU) und bei 35,7 fmol/Zelle (51 PSU); das kommt 4%, 2% und 12% gleich. Serin hat in Ni. medioconstricta keinen großen An-

teil an den Gesamt-FAS. Den Hauptanteil an den nicht gesondert aufgeführten FAS trägt Tyrosin mit Konzentra-tionen zwischen 65,8 fmol/Zelle und 178,0 fmol/Zelle ohne salinitätsbezogene Ten-denz. Es konnten alle detektierbaren FAS nachgewiesen werden; auch Hydroxyprolin und Taurin.

0

250

500

750

1000


Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]


Abb. 4.20: Zusammensetzung der FAS in der antarktischen Eisdiatomee Ni. medioconstricta bei 17, 34 und 51 PSU. Separat sind nur die wichtigsten FAS aufgeführt, die weniger wichtigen sind aus Darstellungsgründen zu einer Summe („Rest“, in grün dargestellt) zusammengefaßt. Kultivierungsbedingungen und Analyseverfahren siehe Kap. 2.3 und Kap. 2.7. n = 4.

Ergebnisse

104

4.2 Akklimatisation an hohe Salinitäten und tiefe Temperaturen: Langzeitversuch

Im Verlauf von insgesamt 9 Monaten wurden die vier antarktischen Diatomeen Chae-

toceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei steigenden Salinitäten aus-

gesetzt. Die Salinitäten wurden in Schritten von jeweils etwa 17 PSU erhöht. Zwischen den einzelnen Erhöhungen hatten die Organismen zwischen 34 und 85 PSU jeweils 14 Tage, bei den höheren Salinitäten ab 102 PSU 4 Wochen Zeit zur Akklimatisation. Der

Versuch wurde parallel bei einer Kultivierungstemperatur von 0°C (Versuchsreihe V S/0) und sinkenden Temperaturen (Versuchsreihe V S/T) durchgeführt. Unter sinken-den Temperaturen sind Temperaturen nahe des Gefrierpunktes der jeweiligen Salinität zu verstehen. Einzelheiten zur Durchführung finden sich in Kap. 2.4.

4.2.1 Salinität und Temperatur

Chaetoceros sp. und Ni. lecointei sind in einem Temperaturbereich von 6°C bis zu mind. –12°C lebensfähig; die untere Grenze von Chaetoceros sp. hat in dem Versuch

nicht ermittelt werden können (Abb. 4.21, Tab. 4.13). Der Toleranzbereich der beiden Arten Co. pennatum und A. kufferathii liegt mit unter –5°C bis 4°C (A. kufferathii) bzw. 6°C (Co. pennatum; Abb. 4.21, Tab. 4.13) deutlich darunter. Die Salinitätstoleranzen von Ni. lecointei und Chaetoceros sp. mit 151 bzw. mehr als 196 PSU sind größer als die von A. kufferathii mit 34 bis 115 und Co. pennatum mit 34

bis 68 PSU (Abb. 4.22, Tab. 4.13).

Tab. 4.13: Salinitätstoleranzbereiche in PSU, innerhalb derer die vier antarktischen Diatomeen-arten Chaetoceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei im Langzeitversuch über-lebt haben bzw. der Zelltod eingetreten ist (genaue Parameter zur Durchführung und Salinitäts-Temperaturbeziehung siehe Kap. 2.4). Zusätzlich sind die Temperaturgrenzen angegeben. Quellen für die Temperatur- und Salinitätsgrenzwerte, die nicht aus eigenen Daten stammen, sind den Abb. 4.20 und 4.21 zu entnehmen. † = Zelltod V S/T = Versuchsreihe bei der Salinität angepaßten Temperaturen

Art Salinität bei 0°C

[PSU] Salinität bei V S/T

[PSU] Temperatur-grenzen [°C]

Chaetoceros sp. <10 – 119 † 132 <10 – > 196 < -16 - 6

Co. pennatum 34 – 85 † 17 / 102 34 – 85 † 17 / 102 -6 - 6

A. kufferathii 34 - 115 † 17 / 119 34 - 85 † 17 / 115 -6 - 4

Ni. lecointei <17 – 151 † 160 <17 – 151 † 160 -12 - 6

Ergebnisse

105

Chaetoceros sp. toleriert bei angepaßten Temperaturen (V S/T) wesentlich höhere Sa-

linitäten als bei 0°C (mind. 196 PSU bei –17°C, während der Zelltod bei 0°C und einer Salinität von 132 PSU eintritt; Tab. 4.13). Bei A. kufferathii ist es umgekehrt: bei 0°C to-

leriert die Alge 115 PSU und überlebt dieselbe Salinität bei einer Temperatur von –7,5°C nicht (Tab. 4.13). Co. pennatum und Ni. lecointei weisen bezüglich der Tempe-

ratur keine unterschiedlichen Salinitätstoleranzbereiche auf (Tab. 4.13). Die Vitalität ist bei den niedrigen Salinitäten bis 85 PSU mit einer Vitalfärbung des Farbstoffes Neutralrot geprüft worden; ab einer Salinität von 102 PSU sind einige Zel-len in 34 PSU-Medium überführt und bei 0°C unter Standardbedingungen kultiviert wor-den. Wenn nach 4 Wochen kein Wachstum, keine Zellen oder Dauersporen bzw. -stadien im Lichtmikroskop mehr erkennbar gewesen sind, ist der Versuch mit der je-weiligen Kultur beendet worden.

Abb. 4.21: Temperaturtoleranzbereiche der vier antarktischen Diatomeen Chaetoceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei. Die Salinitäten waren den Temperaturen ent-sprechend erhöht (Versuchsbedingungen siehe Kap. 2.4). * nach Fiala & Oriol (1990) * nach Wanzek (1994) * nach Lehmal (1999) untere Grenze unbekannt † Zelltod

Temperaturtoleranzbereiche

-20

-15

-10

-5

0

5

10

Tem

pera

tur [

°C]

Chaetoceros sp. C. pennatumE. kufferathiiN. lecointei

† 8* † 8* † 6* † >6*

† -13 † -7,5 † -6,5

Ni. lecointei A. kufferathii Co. pennatum

Ergebnisse

106

Abb. 4.22: Salinitätsgrenzen, innerhalb derer die vier antarktischen Diatomeenarten Chaetoce-ros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei im Langzeitversuch (siehe Kap. 2.4) Vital-funktionen aufgewiesen haben (ohne Berücksichtigung der Temperatur; nähere Informationen unter Einbeziehung der Temperatur siehe Tab. 4.13). Die ermittelte Wachstumsgrenze von 10 PSU für Chaetoceros sp. beruht auf Daten von Nothnagel (1994). † Zelltod obere / untere Grenze unbekannt 34 PSU

4.2.2 Niedermolekulare organische Osmolyte

Nach den in Kap. 4.2.1 beschriebenen Auswirkungen erhöhter Salinität bei 0°C bzw. erhöhter Salinität in Kombination mit sinkenden Temperaturen auf die Akklimatisations-fähigkeit der vier untersuchten Arten sind die von diesen Bedingungen verursachten Veränderungen der intrazellulären organischen Osmolytkonzentrationen Thema dieses Abschnitts. Die bereits in den Stammkulturen identifizierten Osmolyte (Kap. 4.1.1) sind in den vier Arten auch bei weiter erhöhten externen Salinitäten bzw. erniedrigten Tem-peraturen akkumuliert worden. Das Akkumulationsmuster im Rahmen der beiden Ver-suchsreihen V S/0 und V S/T folgt i.d.R. folgendem Schema: Die Osmolyte werden bis zu einer artspezifisch unterschiedlichen externen Salinität akkumuliert; bei Verstärkung des Stresses verbleibt die Konzentration entweder auf einem hohen Niveau und nimmt erst kurz vor der letalen Salinitätserhöhung ab oder sie sinkt langsam ab, bis die Tole-ranzgrenze schließlich überschritten wird.

Salinitätstoleranzbereiche

0

50

100

150

200

Salin

ität [

PSU

]

Chaetoceros sp. C. pennatumE. kufferathiiN. lecointei

160 119 102

17 17Ni. lecointei A. kufferathii Co. pennatum

Ergebnisse

107

4.2.2.1 Prolin

Prolin ist – mit Ausnahme von Ni. lecointei – alleiniger Hauptosmolyt bei allen vier Ar-

ten. Bei der Kultivierungstemperatur 0°C (Abb. 4.23a–d, rote Balken) erreicht Chaeto-

ceros sp. bei 102 PSU die höchste Prolinkonzentration (106,58 fmol/Zelle); bei der

nächsthöheren Salinität (119 PSU), der letzten vor dem eingetretenen Zelltod, sinkt sie auf 68,76 fmol/Zelle ab. Co. pennatum weist zwischen 51 und 85 PSU schwankende

Konzentrationen zwischen 19926,99 fmol/Zelle (85 PSU) und 24199,57 fmol/Zelle (68 PSU) auf. Die intrazellulären Prolinkonzentrationen von A. kufferathii steigen von 47,14

fmol/Zelle (34 PSU) bis zu der höchsten tolerierten Salinität von 115 PSU auf 1413,27 fmol/Zelle an. Ähnlich wie bei Chaetoceros sp. steigen die Prolinkonzentrationen von Ni. lecointei bis auf einen Höchstwert an (23,87 fmol/Zelle bei 85 PSU) und nehmen bei

151 PSU, der höchsten tolerierten Salinität bei 0°C, auf 3,47 fmol/Zelle ab (diese Kon-zentration liegt unter der bei 34 PSU gemessenen von 6,30 fmol/Zelle). Die intrazellulären Prolinkonzentrationen bei der der Salinität angepaßten Kultivie-rungstemperaturen liegen – mit Ausnahme von Co. pennatum – über denen bei 0°C (Abb. 4.23a–d, blaue Balken). Die höchste Konzentration weist Co. pennatum mit

11878,35 fmol/Zelle bei 51 PSU auf. Bei weiter ansteigenden Salinitäten sinkt sie bis auf 8859,26 fmol/Zelle bei 85 PSU ab. A. kufferathii akkumuliert Prolin von 448,47 fmol/Zelle (51 PSU) bis auf 1413,27 fmol/Zelle (85 PSU). Chaetoceros sp. akkumuliert

bis zu einer Salinität von 151 PSU Prolin (von 42,56 fmol/Zelle bei 51 PSU bis zu

246,90 fmol/Zelle); bei weiterer Salinitätserhöhung sinken die Konzentrationen bis auf 89,90 fmol/Zelle bei 196 PSU ab. Die verhältnismäßig hohe Konzentration bei 102 PSU ist wahrscheinlich auf die erhöhte Salinität infolge des Gefrierens des Kultivierungsme-diums zurückzuführen, der sich Chaetoceros sp. mit erhöhten Prolinkonzentrationen angepaßt hat. In Ni. lecointei steigen die Konzentrationen bis 85 PSU auf 36,5

fmol/Zelle an und sinken anschließend auf Konzentrationen um 25 fmol/Zelle ab (102 – 132 PSU). Die sehr hohe Prolinkonzentration bei 151 PSU mit 56,86 fmol/Zelle ist u.U. auf Fehler bei der Zellzahlbestimmung zurückzuführen.

Ergebnisse

108

Abb. 4.23: Intrazelluläre Prolinkonzentrationen in fmol/Zelle der vier antarktischen Eisdiatomeen Chaetoceros sp. (a), Co. pennatum (b), A. kufferathii (c) und Ni. lecointei (d) während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Temperaturen (Durchführung siehe Kap. 2.4). n = 3. = Kultivierungstemperatur 0°C = Kultivierungstemperaturen nahe Gefrierpunkt = angefrorenes Medium = erhöhte Salinität (> 102 PSU) (Chaetoceros sp.; a) = möglicherweise Zellzahlfehler (Ni. lecointei; d)

4.2.2.2 DMSP, quaternäre Ammoniumverbindungen, Ectoine und Zucker / Polyole

Die in Kap. 3.1 aufgezeigten Unzulänglichkeiten der Quacsmethode sind auch bei der Osmolytanalyse dieses Versuchs von Bedeutung. Der in den Stammkulturen ermittelte „Osmolytcocktail“ der vier untersuchten Arten (Kap. 4.1.1) bestätigt sich. Einzige Ausnahme ist die Synthese einer nicht identifizierten Substanz, die von Chaetoceros sp. ausschließlich in der Versuchsreihe V S/T akkumu-

liert wird. Chaetoceros sp.

Chaetoceros sp. synthetisiert neben Prolin auch Homarin als Osmolyten (Abb. 4.24).

Der Konzentrationsverlauf, in Abhängigkeit von der Salinität und Temperatur, ist mit dem von Prolin vergleichbar (Abb. 4.23a): bei 0°C steigt die Homarinkonzentration von 0,58 fmol/Zelle bei 34 PSU auf 3,62 fmol/Zelle bei 102 PSU an; die weitere Erhöhung der Salinität auf 119 PSU führt zu keiner weiteren Akkumulation von Homarin. Die Ho-

0

20

40

60

34 51 68 85 102 119 132 151

Sa lin ität [PSU]

Prol

in [f

mol

/Zel

le]

*

0

400

800

1200

1600

34 51 68 85 115

Salin itä t [PSU]

Prol

in [f

mol

/Zel

le]

0

10000

20000

30000

34 51 68 85

Salin ität [PSU]

Prol

in [f

mol

/Zel

le]

0

100

200

300

34 51 68 85 102 119 132 151 160 175 183 196

Salin ität [PSU]

Prol

in [f

mol

/Zel

le]

a b

c d

Ergebnisse

109

marinkonzentration in Chaetoceros sp., die bei der Salinität angepaßten Temperaturen

gehältert worden sind, steigt zunächst auf 2,66 fmol/Zelle bei 102 PSU / -7,5°C an. Der

Rückgang auf 2,5 fmol/Zelle ist vermutlich auf den bereits in Kap. 4.2.2.1 angeführten Salinitätsfehler bei 102 PSU zurückzuführen (Einfrieren des Mediums), der zu einer vergleichsweise hohen Homarinkozentration bei 102 PSU geführt hat. Ab einer Salini-tät von 132 PSU bleibt die Homarinkonzentration auf einem Niveau zwischen 5,48 fmol/Zelle und 4,39 fmol/Zelle konstant. Die Homarinkonzentrationen erreichen etwa 2,5% der Prolinkonzentrationen und erreichen über den gesamten Salinitätsverlauf bei-der Versuchsreihen (V S/0 und V S/T) Anteile, die mit denen aus dem Osmoylten-screening der Stammkulturen (Kap. 4.1.1) vergleichbar sind. In Zellen der Versuchsreihe V S/T ist eine nicht identifizierte Substanz detektiert wor-den. Die Substanz eluiert nach 8,5 min (Quacsmethode, Kap. 2.6.3) und tritt bei einer Salinität von 68 PSU und einer Temperatur von -3,6°C erstmalig auf. Das Peakhöhen-zu-Zellzahl-Verhältnis steigt bis zu einer Salinität von 160 PSU und einer Temperatur von -13,0°C an und sinkt bei 175 PSU und -14,0°C wieder (Daten nicht gezeigt).

0

1

2

3

4

5

6

34 51 68 85 102 119 132 151 160 175 183

Salinität [PSU]

Hom

arin

[fm

ol/Z

elle

]

Abb. 4.24: Intrazelluläre Homarinkonzentration in fmol/Zelle in der antarktischen Eisdiatomee Chaetoceros sp. während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Tempe-raturen (Durchführung siehe Kap. 2.4). n = 3. Kultivierungstemperatur 0°C Kultivierungstemperaturen nahe Gefrierpunkt angefrorenes Medium = erhöhte Salinität (> 102 PSU)

Ergebnisse

110

Corethron pennatum

Neben Prolin konnte in Co. pennatum kein weiterer Osmolyt zweifelsfrei identifiziert

werden. Das Vorkommen von zwei weiteren Osmolyten ist möglich (vgl. Kap. 3.1; 4.1). Die Homarinkonzentrationen liegen im Bereich der Nachweisgrenze; in vielen Proben ist kein Nachweis möglich gewesen. Amphiprora kufferathii

A. kufferathii akkumuliert neben dem Hauptosmolyten Prolin auch Betain und Homarin

als weitere identifizierte, osmotisch wirksame Substanzen. In den Extrakten sind eben-falls Ectoin und Hydroxyectoin nachgewiesen worden, deren Konzentrationen mit an-steigender externer Salinität zunimmt.

0

50

100

150

200

250

34 51 68 85 115

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Abb. 4.25: Intrazelluläre Homarin- und Betainkonzentrationen in fmol/Zelle in der antarktischen Eisdiatomee A. kufferathii während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Temperaturen (Durchführung siehe Kap. 2.4). n = 3. Abkürzungen: decr. T = Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt des jeweiligen Mediums Betain (0°C) Betain (decr. T) Homarin (0°C) Homarin (decr. T) Die Homarinkonzentrationen der Versuchsreihe V S/T liegen unter denen der Ver-suchsreihe V S/0 (Abb. 4.25). In beiden Versuchsreihen steigen die Konzentrationen auf Maximalwerte von 138,11 fmol/Zelle (V S/0; 85 PSU) bzw. 44,59 fmol/Zelle (V S/T; 68 PSU) an. Bei den jeweils höchsten tolerierten Salinitäten sinken sie wieder bis zu 50% ab. Die Betainkonzentrationen liegen im Bereich der Homarinkonzentrationen und steigen mit zunehmender Salinität sowohl in V S/0 als auch in V S/T kontinuierlich an

Ergebnisse

111

(Abb. 4.25); die Verhältnisse zwischen den Betain- und Homarinkonzentrationen sind bei den niedrigen Salinitäten ähnlich denen des Osmolytenscreenings (Kap. 4.1.1). Die

Betainkonzentrationen der bei 0°C kultivierten Zellen liegen immer etwas höher als bei V S/T. In V S/0 übersteigen die Betainkonzentrationen mit 145,60 fmol/Zelle ab 85 PSU erstmals die von Homarin; in V S/T geschieht dies bereits bei 68 PSU mit 122,40 fmol/Zelle. Bei 115 PSU und 0°C erreicht die Betainkonzentration 16% der Prolin-konzentration; die von Homarin nur noch 5,3%. Bei 51 PSU liegen die Werte bei 8,8% bzw. 16,9% (vgl. Kap. 4.2.2.1). Ectoin und Hydroxyectoin sind aufgrund der hohen Konzentrationen im Vergleich zu den übrigen Osmolyten gesondert aufgeführt (Abb. 4.26). Lediglich die Ectoinkonzen-tration nimmt mit ansteigenden externen Salinitäten bei der Kultivierungstemperatur von 0°C von 1,36 fmol/Zelle bei 34 PSU bis auf 516,13 fmol/Zelle bei 115 PSU zu. Die Hydroxyectoinkonzentrationen und die Ectoinkonzentrationen der Versuchsreihe V S/T zeigen keine Tendenz. Auffällig sind die hohen Hydroxyectoinkonzentrationen von > 500 fmol/Zelle ab 68 PSU in der Versuchsreihe V S/0. Über die Möglichkeit des bak-teriellen Ursprungs der Ectoine sei auf Kap. 5.2 verwiesen.

Wie bereits bei dem Osmolytencheck der Stammkulturen (Kap. 2.4), ist das Vorkom-men von zwei weiteren Osmolyten möglich, die bei 0°C in deutlich größeren Mengen als bei der der Salinität angepaßten Temperaturen vorliegen.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

34 51 68 85 115

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Abb. 4.26: Intrazelluläre H.Ectoin- und Ectoinkonzentration in fmol/Zelle in der antarktischen Eisdiatomee A. kufferathii während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Temperaturen siehe Kap. 2.4). n = 3. Abkürzungen: decr. T = Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt des jeweiligen Mediums H.Ectoin = Hydroxyectoin H.Ectoin (0°C) H.Ectoin (decr. T) Ectoin (0°C) Ectoin (decr. T)

Ergebnisse

112

Nitzschia lecointei

Wie im Osmolytencheck der Stammkulturen (Kap. 2.4) ist im Langzeitversuch kein ein-deutiger Hauptosmolyt in Ni. lecointei zu bestimmen (vgl. Abb. 4.8). Prolin und Betain

werden bei 0°C in ähnlichen Konzentrationen synthetisiert (Abb. 4.27). Die Prolinkon-zentrationen steigen kontinuierlich bis auf 23,87 fmol/Zelle Prolin (85 PSU) bzw. 30,22 fmol/Zelle Betain (102 PSU) an und verbleiben bei den höheren Salinitäten auf diesem Niveau. Eine Ausnahme bildet die Betainkonzentration bei 151 PSU, die unter die Aus-gangskonzentration bei 34 PSU absinkt (vgl. Abb. 4.27). Im Gegensatz zu Prolin liegen – wie bei A. kufferathii - die Betainkonzentrationen der Zellen aus den Kulturen V S/T

unter denen bei 0°C erreichten (Ausnahme: 151 PSU; Abb. 4.27). Wie bereits erwähnt, könnten die hohen Konzentrationen in den Zellen bei 151 PSU / -12,0°C auf Fehler in der Zellzahlbestimmung zurückzuführen sein. In Ni. lecointei konnte kein Homarin

nachgewiesen werden. DMSP spielt als Osmolyt in der Versuchsreihe V S/0 bei Salinitäten ab 68 PSU im Ver-

gleich zu Prolin und Betain eine eher untergeordnete Rolle (Abb. 4.27). Bei 51 PSU übersteigen die Konzentrationen mit sowohl bei 0°C mit 18,47 fmol/Zelle als auch bei –1,8°C mit 14,84 fmol/Zelle jedoch die von Prolin und Betain. Das Ergebnis des Osmo-lytenchecks wird bestätigt (vgl. auch Abb. 4.8). In der Versuchsreihe V S/T jedoch übersteigen die DMSP-Konzentrationen die von Betain ab 119 PSU.

0

10

20

30

40

50

60

34 51 68 85 102 119 132 151

Salinität [PSU]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Abb. 4.27: Intrazelluläre Betain- und DMSP-Konzentrationen in der antarktischen Eisdiatomee Ni. lecointei während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Tempera-turen (Durchführung siehe Kap. 2.4). n = 3. Abkürzungen: decr. T = Temperaturen nahe dem Gefrierpunkt des jeweiligen Mediums. = möglicherweise Zellzahlfehler Betain (0°C) Betain (decr. T) DMSP (0°C) DMSP (decr. T)

Ergebnisse

113

Wie bei A. kufferathii konnten auch in Ni. lecointei Hydroxyectoin und Ectoin nachge-

wiesen werden; allerdings erst ab einer Salinität von 85 PSU. Die Konzentrationen sind

jedoch gering und liegen im Durchschnitt bei 1,0 fmol/Zelle (Ectoin) bzw. 3 fmol/Zelle (Hydroxyectoin). Die Werte von Hydroxyectoin sind jedoch überschätzt, da die Tren-nung von Hydroxyectoin und dem vor ihm liegenden Salzpeak unvollständig gewesen ist. Beide Substanzen sind in Zellen der V S/0 höher konzentriert als in V S/T (Daten nicht gezeigt). Der bereits während des Osmolytenchecks detektierte Zucker (Kap. 4.1.2) weist ein ähnliches Verteilungsmuster wie Prolin und Betain auf (dargestellt werden kann nur das Peakhöhen-zu-Zellzahl-Verhältnis; Abb. 4.28). Einzig bei 132 PSU in der Ver-suchsreihe V S/T übersteigt das Verhältnis jenes bei 0°C; bei allen anderen Werten ist es umgekehrt.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

34 51 68 85 102 119 132 151

Salinität [PSU]

hi /

Zelle

Abb. 4.28: Peakhöhen-zu-Zellzahl-Verhältnis (hi/Zelle) des nach 10,7 min auf der Mercksäule eluierten Zuckers (zur Identifikation siehe Kap. 4.1.2) in der antarktischen Eisdiatomee Ni. le-cointei während des Langzeitexperiments bei verschiedenen Salinitäten und Temperaturen (Durchführung siehe Kap. 2.4). n = 3. = Kultivierungstemperatur 0°C = Kultivierungstemperaturen nahe Gefrierpunkt = möglicherweise Zellzahlfehler Ni. lecointei synthetisiert offenbar zwei weitere Osmolyte, da die entsprechenden Peak-

höhe im Verhältnis zur Zellzahl mit zunehmender Salinität ansteigen (Daten nicht ge-zeigt).

Ergebnisse

114

4.2.3 Pigmente

In Co. pennatum und A. kufferathii verändern sich weder Konzentrationen noch die

Verhältnisse der Chlorophylle a und c sowie der Gesamtcarotinoide zueinander we-sentlich im Versuchsverlauf; die Konzentrationen der Pigmente nehmen mit ansteigen-der Salinität ab; die Temperatureffekte sind gering (Daten nicht gezeigt).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

34 51 68 85 102 119 132 151 160 175

Salinität [PSU]

Kon

z. [p

g/Ze

lle]

Abb. 4.29: Pigmentkonzentrationen von Chaetoceros sp. in der Versuchsreihe V S/T des Langzeitversuches. Zur Durchführung und Kultivierung siehe Kap. 2.4. n = 1. Chl. a Chl. c Carotinoide Vergleichbar mit Co. pennatum und A. kufferathii nehmen die Pigmentkonzentrationen in Chaetoceros sp. und Ni. lecointei bis zu einer externen Salinität von 119 PSU unab-

hängig vom Temperatureinfluß ab. Sowohl in Chaetoceros sp. als auch in Ni. lecointei

sind ab einer Salinität von 132 PSU (unabhängig von der Temperatur) keine Gesamt-carotinoide mehr nachzuweisen; unter denselben Bedingungen steigen die Chl. c-Konzentrationen an und erreichen die Größenordnung von Chl. a bzw. übersteigen diese (als Beispiel Chaetoceros sp., Abb. 4.29). Deutlicher werden die Reaktionen der

Organismen auf die erhöhte Salinität durch eine Verhältnisdarstellung (nachfolgend er-läutert am Beispiel von Chaetoceros sp.): Unabhängig von der Temperatur steigt das

Verhältnis von Chl. a zu Chl. c im Salinitätsbereich von 34 zu 119 PSU von 4,9 auf über 10 an (Abb. 4.30), da die Konzentration von Chl. c stärker abnimmt als die von Chl. a. Ab einer externen Salinität von 132 PSU liegt das Verhältnis gleichbleibend niedrig zwischen 0,63 – 1,0 und beruht vor allem auf der Zunahme der Chl. c-Konzen-trationen (vgl. Abb. 4.29). Das Verhältnis zwischen Chl. a und den Carotinoiden ver-

Ergebnisse

115

bleibt im Salinitätsbereich zwischen 34 und 119 PSU auf Werten zwischen 2,8 und 1,1 bei leicht abnehmender Tendenz aufgrund erhöhter Carotinoidkonzentrationen (Abb.

4.29, 4.30); bei den höheren Salinitäten sind keine Carotinoide mehr nachweisbar. Die dargestellten Werte können nur als Hinweis dienen, da keine Parallelproben analy-siert worden sind.

Abb. 4.30: Verhältnisse von Chl. a zu Chl. c (rote und blaue Linie) und von Chl. a zu den Ge-samtcarotinoiden (grüne und schwarze Linie) in der antarktischen Eisdiatomee Chaetoceros sp. Gesamtcarotinoide sind ab einer Salinität von 132 PSU nicht mehr nachweisbar. In der Versuchsreihe V S/0 (0°C) ist die Salinität 132 PSU für Chaetoceros sp. letal. Y-Achse: Verhält-nisse entsprechend der nachfolgend angegebenen Pigmente. Zur Durchführung und Kultivie-rung siehe Kap. 2.4. n = 1. Chl. a : c in V S/0 (Kultivierungstemperatur 0°C)

Chl. a : c in S S/T (gefrierpunktsnahe Temperaturen) Chl. a : Carotinoiden in V S/0 (Kultivierungstemperatur 0°C) Chl. a : Carotinoiden in V S/T (gefrierpunktsnahe Temperaturen)

4.2.5 P5C Reduktase

Die Aktivität der P5CR ist stichprobenartig in 0 – 80%-Ammoniumsulfatfraktionen von Chaetoceros sp. gemessen worden. Die Proben stammen aus der Versuchsreihe V

S/T 85 PSU und –6°C sowie 132 PSU und –11°C. Die Aktivitäten liegen im Bereich < 0,1 nkat/mg Protein und liegen unter denen bei 34 PSU bis 68 PSU ermittelten Werten (Kap. 4.3.2).

0

2

4

6

8

10

12

14

34 51 68 85 102 119 132 151 160 175

Salinität [PSU]

Verh

ältn

is

Ergebnisse

116

4.2.6 Zusammenfassung

Die vier Arten Chaetoceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei weisen

Unterschiede bezüglich ihrer Salinitäts- und Temperaturtoleranz auf. Den geringsten Toleranzbereich weist Co. pennatum auf, den größten bei der Salinität angepaßten Temperaturen Chaetoceros sp., bei 0°C Ni. lecointei. Die Iminosäure Prolin ist – mit Ausnahme von Ni. lecointei – in allen Arten der Haupt-osmolyt und weist – mit Ausnahme von Co. pennatum –höhere Konzentrationen bei

der Salinität angepaßten Temperaturen auf. Von den beiden zu den Centrales gehöri-gen Arten Chaetoceros sp. und Co. pennatum synthetisiert nur Chaetoceros sp. noch Homarin neben Prolin als weiteren Osmolyten auf. Die beiden pennaten Arten A.

kufferathii und Ni. lecointei dagegen synthetisieren mehrere osmotisch wirksame Substanzen: in A. kufferathii ist Homarin der Osmolyt mit der zweithöchsten Konzen-

tration; weiterhin wird Betain mit ansteigenden Salinitäten akkumuliert, jedoch übersteigen die Konzentrationen der Versuchsreihe V S/T nicht die der Versuchsreihe V S/0. In Ni. lecointei ist der Hauptosmolyt nicht eindeutig zu bestimmen: neben Prolin

wird Betain in Konzentrationen akkumuliert, die die von Prolin teilweise übersteigen. Im Gegensatz zu Prolin wird Betain jedoch nicht vermehrt bei tiefen Temperaturen syn-thetisiert. DMSP und ein nicht weiter identifizierter Zucker werden von Ni. lecointei als

Osmolyt akkumuliert; DMSP hat von der Konzentration her eine eher untergeordnete Bedeutung. Die intrazelluläre Zuckerkonzentration läßt sich nicht ermitteln. Es sind weitere Osmolyte in den Algen zu vermuten, die nicht identifiziert werden konnten: ein weiterer in Chaetoceros sp. und je 2 weitere in Co. pennatum, A. kuffera-

thii und Ni. lecointei. In den Extrakten der beiden pennaten Arten A. kufferathii und Ni. lecointei sind Ectoine

nachgewiesen worden; allerdings ohne daß ihnen eine sichere osmoprotektive Wir-kung zugesprochen werden könnte. Die Pigmentkonzentrationen verändern sich in den vier Arten bis auf eine Ausnahme nur unwesentlich. In Chaetoceros sp. und Ni. lecointei sind in der Versuchsreihe V S/T

ab einer externen Salinität von 132 PSU keine Carotinoide mehr nachweisbar; unter denselben Bedingungen steigt der Chl. c-Gehalt an und weist mit Chl. a vergleichbare Konzentrationen auf. Die P5CR-Aktivitäten in Chaetoceros sp. liegen bei großem Salz- und Temperaturstreß

deutlich unter denen bei 34 PSU bis 68 PSU.

Ergebnisse

117

4.3 Akklimatisation an hohe Salinitäten: Kurzzeitversuch

Vor dem hyperosmotischen Schock waren die Algen an eine Salinität von 34 PSU ak-klimatisiert und befanden sich in der beginnenden stationären Wachstumsphase. Vor dem hyperosmotischen Schock wurden aus der 34 PSU-Kultur Proben für den Zeit-punkt „0“ entnommen, die Algen pelletiert und in frischem Medium mit einer Salinität von 68 PSU resuspendiert. Weitere Informationen zur Durchführung des Versuches siehe Kap. 2.5.

4.3.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii, Ni. lecointei

Nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU benötigen die drei antarktischen Eisdiato-meen Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei zwischen 24 und 50 Stunden bei

Dauerlicht, um die intrazelluläre Konzentration ihres Hauptosmolyten Prolin an die er-höhten Salinitäten anzupassen. Innerhalb von etwa 20 Stunden nach der jeweiligen Beendigung der Prolinakkumulation beginnen die Zellen, sich zu teilen (Tab. 4.14, Abb. 4.31 – 4.33). Gemeinsam ist allen drei Arten, daß keine sogenannte Overshoot-Reaktion aufgetreten ist. Innerhalb der 7-tägigen Versuchsdauer sind an zwei Tagen während der Lichtphase (12 : 12 Stunden Licht-Dunkel-Rhythmus) intrazelluläre Prolin-konzentrationen gemessen worden: das erste Mal am 3. Tag nach dem Salzschock (ab der 60. h), das zweite Mal am 6. Tag nach dem Salzschock (ab der 132. h). Es ist kei-ne Tagesrhythmik festzustellen; allenfalls ein leichter Anstieg während der Lichtphase (vgl. Abb. 4.31 – 4.33, jeweils b). Die Zellgröße der drei Arten nimmt nach dem Salz-schock zu (Datenausgabe durch den Coulter Counter; Daten nicht gezeigt). Lediglich die Zellen von Ni. lecointei, deren Anzahl sich bis zum Ende des Versuches verdrei-

facht hat (Abb. 4.33a), werden ab dem letzten Tag wieder kleiner (die der anderen bei-den Arten nicht; Daten nicht gezeigt). Tab. 4.14: Zeitliche Abfolge der Prolinakkumulation und Beginn der ersten Zellteilungen in drei antarktischen Eisdiatomeen nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, anschließend in einem Licht : Dunkel-Rhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten siehe Kap. 2.5.

Art Ende Prolinakkumulation [h]

Beginn Zellteilungen [h]

1. Verdopplung [h]

Chaetoceros sp. ~ 40 60 – 80 ~140

A. kufferathii ~ 50 ~ 70 > 160

Ni. lecointei ~24 40 – 60 ~ 90

Ergebnisse

118

0,E+00

5,E+05

1,E+06

2,E+06

2,E+06

3,E+06

3,E+06

4,E+06

4,E+06

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Zeit nach Salzschock [h]

Zelle

n / m

L

Abb. 4.31a: Zellzahlen von Chaetoceros sp. einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Lichtrhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4.

Abb. 4.31b: Intrazelluläre Prolinkonzentrationen von Chaetoceros sp. nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Licht-rhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4. Licht aus Licht an

Chaetoceros sp.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

Chaetoceros sp.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

Ergebnisse

119

0,E+00

5,E+04

1,E+05

2,E+05

2,E+05

3,E+05

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Zellz

ahl /

mL

Abb. 4.32a: Zellzahlen von A. kufferathii nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Lichtrhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4.

Abb. 4.32b: Intrazelluläre Prolinkonzentrationen von A. kufferathii nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Licht-rhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4. Licht aus Licht an

E. kufferathii

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

E. kufferathii

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

Ergebnisse

120

Im Gegensatz zu Chaetoceros sp. und A. kufferathii ist Ni. lecointei in Kulturröhren mit

kontinuierlicher Begasung kultiviert worden (Kap. 2.5), um eine Zellverklumpung zu ver-

hindern. Aufgrund des geringen Fassungsvermögens der Kulturröhren im Verhältnis zu 5L-Erlenmeyerkolben sind insgesamt 3 Kulturröhren pro Parallele (symbolisiert durch die Farben blau, grün und rot in Abb. 4.33b) nacheinander verwendet worden. Die Pro-linkonzentrationen der 3 Sätze sind – wie an den Parallelmessungen während der Wechsel von einem Satz zum nächsten zu erkennen – nicht übergangslos. Darauf be-ruht die Schwierigkeit, exakte Aussagen über den genauen Akkumulationsverlauf bzw. über das Vorhandensein einer Overshoot-Reaktion zu treffen. In einem Vorversuch ist parallel zur Prolinkonzentration auch die DMSP-Konzentration in Ni. lecointei bestimmt worden. Die DMSP-Konzentration beginnt erst etwa 10 Stun-

den nach Beginn des Salzschockes zu steigen (Daten nicht gezeigt).

0,E+00

2,E+05

4,E+05

6,E+05

8,E+05

1,E+06

1,E+06

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Zelle

n / m

L

Abb. 4.33a: Zellzahlen von Ni. lecointei nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Lichtrhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4.

Ergebnisse

121

Abb. 4.33b: Intrazelluläre Prolinkonzentrationen von Ni. lecointei nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, dann mit einem Licht-rhythmus von 12 : 12 h. Weitere Einzelheiten in Kap. 2.5. n = 4. Licht aus Licht an Röhrensatz 1 Röhrensatz 2 Röhrensatz 3

4.3.2 Prolinstoffwechsel am Beispiel von Chaetoceros sp. nach einem hy-perosmotischen Schock

Neben der Prolinkonzentration ändert sich auch die P5C-Konzentration (P5C als einzi-ges relativ stabiles Intermediat der Prolinsynthese) bzw. die Aktivitäten der beteiligten Enzyme nach einem Salzschock. Aufgrund der hohen Aktivität der P5CR ist Chaetoce-

ros sp. als Modellorganismus für die Untersuchung dieser Veränderungen herangezo-

gen worden. Nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU ist die Prolinakkumulation in Chaetoceros sp. nach etwa 40 Stunden abgeschlossen (vgl. Kap. 4.3.1, Abb. 4.31b). Die Gesamt-

proteinmenge steigt vorübergehend von ca. 3 pg/Zelle auf etwa 4,5 pg/Zelle (Abb. 4.34a) an. Nach 6 Tagen geht die Konzentration wieder auf das Niveau des Aus-gangswertes zurück. Die Aktivität der P5CS, die L-Glutaminsäure zu dem Intermediat P5C umsetzt, steigt vorübergehend von 0,06 nkat/mg Protein bis auf die 2,5fache Aktivität mit ~0,15 nkat/mg Protein nach 42 bzw. 66 Stunden an (Abb. 4.34c). 6 Tage nach dem Salz-

N. lecointei

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

N. lecointei

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

N. lecointei

0

10

20

30

40

50

60

70

0 20 40 60 80 100 120 140 160


Prol

in [f

mol

/Zel

le]

erste Zellteilungen

Ergebnisse

122

schock sinkt die Aktivität mit 0,08 nkat/mg Protein auf einen Wert, der knapp über dem Ausgangsniveau liegt, ab.

Im Gegensatz zum Aktivitätsverlauf der P5CS bleibt innerhalb der ersten drei Tage nach dem Salzschock die Aktivität der P5CR, dem Enzym, welches das Intermediat P5C zu L-Prolin umsetzt, relativ konstant bei etwa 0,2 nkat/mg Protein. 6 Tage nach dem Schockereignis ist die Aktivität auf das fünffache angestiegen (Abb. 4.34d). Die Konzentration des Intermediats P5C steigt innerhalb der ersten 3 Tage nach dem Salzschock von 113,69 amol/Zelle auf die dreifache Konzentration (332,18 amol/Zelle) an; nach 6 Tagen sinkt sie auf 192,0 amol/Zelle (Abb. 4.34b) ab. Diese Konzentration liegt zwischen der Ausgangskonzentration bei 34 PSU und der nach 3 Tagen Salz-streß.

0

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

Zeit [h]

Prot

ein

[pg/

Zelle

]

050

100150

200250

300350

400

0 50 100 150 200

Ze i t [ h]

P5C

[am

ol/Z

elle

]

0,000,020,040,060,080,100,120,140,160,18

0 50 100 150 200

Zeit [h]

v [n

kat/m

g Pr

otei

n]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 50 100 150 200

Ze i t [ h ]

v [n

kat/m

g Pr

otei

n]

Abb. 4.34: Chaetoceros sp. nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, anschließend mit einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 : 12 Stun-den. Weitere Einzelheiten siehe Kap. 2.5.2. a) Proteingesamtgehalt in pg/Zelle, b) P5C-Konzentration in amol/Zelle, c) P5CS-Aktivität in nkat/mg Protein , d) P5CR-Aktivität in nkat/mg Protein Abkürzungen: P5C= Pyrrolin-5-Carboxylsäure P5CS = P5C Synthase P5CR = P5C Reduktase Die Konzentration der FAS (ohne Prolin) steigt in den ersten Sunden nach dem Salz-schock vorübergehend leicht von 17,3 fmol/Zelle auf 19,4 fmol/Zelle an und nimmt an-schließend bis 42 h nach dem Salzschock auf 8,0 fmol/Zelle ab (Abb. 4.35). Nach 6 Tagen wurden mangels Biomasse keine Proben mehr entnommen.

a b

c d

Ergebnisse

123

0

5

10

15

20

25

0,0 1,3 18,7 42,7 66,3

Zeit [h]

Kon

z. [f

mol

/Zel

le]

Abb. 4.35: Summe der freien Aminosäuren (FAS) ohne Prolin in Chaetoceros sp. in den ersten 3 Tagen nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, anschließend mit einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 : 12 Stunden. Weitere Ein-zelheiten siehe Kap. 2.5.2. Hauptanteil an den FAS mit Konzentrationen > 0,8 fmol/Zelle hatten Glutaminsäure und die als Stickstoffspeicher dienenden Aminosäuren Arginin, Glutamin und Aspara-gin; weiterhin wurden diese Konzentrationen von Methionin, Glycin, Serin, Alanin und Tryptophan erreicht. Alle anderen Aminosäuren weisen nur geringe Konzentrationen von max. 0,5 fmol/Zelle auf. Mit Ausnahme von Glutaminsäure, Glutamin, Tryptophan und Asparaginsäure folgen alle FAS dem oben beschrieben Muster; die Konzentrati-onen der beiden zuletzt genannten Aminosäuren bleiben konstant. Glutaminsäure und Glutamin werden zusammen mit Arginin und Asparagin aufgrund ihrer Funktion als Stickstoffspeicher bzw. Vorläufersubstanz für die Prolinsynthese (vgl. Kap. 1.2) geson-dert dargestellt: Während die Glutaminsäurekonzentration sich in den ersten 2 h des Salzschocks halbiert (von 3 auf 1,5 fmol/Zelle) und im weiteren Verlauf langsam weiter bis auf 0,7 fmol/Zelle (42 h; danach konstant) abnimmt (Abb. 4.36a), steigen die Argi-nin- und Asparaginkonzentrationen innerhalb der ersten 2 h um je 0,5 fmol/Zelle auf ih-ren Maximalwert (0,99 bzw. 4,6 fmol/Zelle) an und nehmen anschließend - z.T. deutlich unter das Ausgangsniveau - wieder ab (Abb. 4.36b, c). Die Glutaminkonzentration da-gegen erreicht ihren höchsten Wert erst 18,7 h nach dem Salzschock (0,8 fmol/Zelle;

Abb. 4.36d).

Ergebnisse

124

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 1,3 18,7 42,7 66,3

Zeit [h]

glu

[fmol

/Zel

le]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0,0 1,3 18,7 42,7 66,3

Ze i t [ h]

arg

[fmol

/Zel

le]

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0,0 1,3 18,7 42,7 66,3

Zeit [h]

asn

[fmol

/Zel

le]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 1,3 18,7 42,7 66,3

Ze i t [ h]gl

n [fm

ol/Z

elle

]

Abb. 4.36: Konzentrationen der vier Aminosäuren Glutaminsäure (a), Arginin (b), Asparagin (c) und Glutamin (d) in Chaetoceros sp. nach einem Salzschock von 34 auf 68 PSU. Die ersten 48 Stunden Kultivierung unter Dauerlicht, anschließend mit einem Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 : 12 Stunden. Weitere Einzelheiten siehe Kap. 2.5.2.


4.4.1 Enzymnachweis

Die P5CR als Schlüsselenzym des Prolinmetabolismus ist in den drei für die Enzym-versuche verwendeten Arten nachgewiesen worden: Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei. Die P5CR von Chaetoceros sp. benötigt NADH als Cosubstrat, wäh-

rend die P5CR der beiden anderen Arten NADPH nutzen (Tab. 4.15). In den dreifach fraktionierten Extrakten (0 – 20%, 20 – 50% und 50 – 80% Ammoniumsulfatfraktionen) ist die P5CR in unterschiedlichen Fraktionen nachgewiesen worden: die von Chaetoce-

ros sp. in der 20 – 50%-Fraktion, die der anderen beiden Arten in der 50 – 80%-Frak-

tion (Tab. 4.15). Weder mit dem jeweils nicht genutzten Cosubstrat noch in den ande-ren Fraktionen sind Schleich- oder Störreaktionen aufgetreten.

a b

c d

Ergebnisse

125

Tab. 4.15: Übersicht über Cosubstrat und Ammoniumsulfatfraktionen der P5CR in verschiedenen antarktischen Eisdiatomeen. Testbedingungen siehe Kap. 2.10.3, Tab. 2.20a. Kultivierungsbedingungen und Aufschluß- verfahren siehe Kap. 2.10.1.

Art (NH4)2SO4-Fraktion Cosubstrat

Chaetoceros sp. 20 – 50 NADH+H+

A. kufferathii 50 – 80 NADPH+H+

Ni. lecointei 50 - 80 NADPH+H+

Da die P5CR von Chaetoceros sp. die weitaus höchste Aktivität aufgewiesen hat, ist Chaetoceros sp. als Modellorganismus für weitere Versuche ausgewählt worden (vgl.

Kap. 2.5.2 und Kap. 4.3.2). Weiterhin sind in Chaetoceros sp. die P5CS und die Prolin DH (Test nach Krueger et

al., 1986), letztere mit geringen Aktivitäten, nachgewiesen worden (Einzelheiten siehe

Tab. 4.16). Das Testergebnis für die P5C DH ist nicht eindeutig; Schleichreaktionen im verwendeten Test sind nicht klar von eventuell vorhandenen (und sehr geringen) En-zymaktivitäten abzugrenzen. Enzymextrakte, die aus stickstofflimitierten Kulturen ge-wonnen worden sind, haben ebenfalls negative Ergebnisse ergeben. Die OAT weist nur geringste Aktivitäten sowohl in Extrakten von bei 34 PSU gehälterten Kulturen als

auch in unter Salzstreß stehenden Kulturen auf. Tab. 4.16: Nachweis von Enzymen des Prolinmetabolismus in Extrakten von Chaetoceros sp. Testbedingungen, Aufschluß etc. siehe Kap. 2.10. * ca. 50% Aktivität mit NADH+H+ k.D. = keine Daten

Enzym Aktivität? (NH4)2SO4-Fraktion Cofaktor(en)

P5CS ja 50 - 80 NADPH+H+*, ATP

Prolin DH ja 20 - 50 NAD+

P5C DH nicht gesichert 50 - 80 NAD(P)+

OAT minimal k.D. k.D.

Der für höhere Pflanzen nachgewiesene Syntheseweg für Prolin, ausgehend von L-Glutaminsäure über P5CS und P5CR, ist in Chaetoceros sp. aktiv.

Ergebnisse

126

4.4.2 Charakterisierung der P5C Reduktase

Für die Charakterisierung der P5CR sind Extrakte der 20 – 50% Ammoniumsulfatfrak-tion verwendet worden. Wenn nicht anders angegeben, sind die Tests bei einer Tem-peratur von 20°C und einem pH von 7,0 in Kaliumphosphatpuffer durchgeführt worden. Die Temperatur- und pH-Optima sind bei optimalen Substrat- und Cosubstratkonzen-trationen ermittelt worden (nach Bestimmung von KM und Vmax). Die Messungen erfolg-ten vierfach.

02468

101214161820

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50

P5C [mM]

v [n

kat/m

g Pr

otei

n]

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40

NADH [mM]

v [n

kat/m

g Pr

otei

n]

Abb. 4.37: Substrat- (=P5C-; a) und Cosubstrat- (=NADH-; b) Sättigungskurven für die P5C Reduktase (20 – 50% Ammoniumsulfatfällung) aus der antarktischen Eisdiatomee Chaetoceros sp. Die Konzentrationen des jeweils nicht geprüften (Co-) Substrates liegt im optimalen Aktivi-tätsbereich. Die gestrichelten Linien zeigen die polynomischen Trendlinien (Microsoft Excel 2000) mit Korrelationen von 0,99 (P5C) und 0,96 (NADH). Die Enzymaktivität ist in nkat/mg Protein angegeben. Meßbedingungen: bei einer Temperatur von 20°C, einem pH-Wert von 7,0 (50 mM Kaliumphosphatpuffer) und einer Wellenlänge von λ = 340 nm wurde die Aktivität über einen Zeitraum von 5 min gemessen. Weitere Einzelheiten zu den Testbedingungen siehe Kap. 2.10.5.1.

a

b

Ergebnisse

127

Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax und die Michaeliskonstante KM sind für sowohl das Substrat P5C als auch das Cosubstrat NADH bestimmt worden. Vmax (P5C)

liegt bei 27,47 nkat/mg Protein und Vmax (NADH) bei 19,53 nkat/mg Protein; die Micha-elis-Konstanten KM betragen KM (P5C) 170 µM und KM (NADH) 100 µM. Die graphisch nach Eisenthal & Cornish-Bowden (zitiert nach Lottspeich & Zorbas, 1998) bzw. rech-nerisch nach Hanes (1932) ermittelten Werte stimmen überein. Die Substratsätti-gungskurve für P5C (gemessen bis 400 µM) folgt der klassischen Michaelis-Menten-Ki-netik; Cosubstratkonzentrationen ab 375 µM hemmen die P5CR-Aktivität (Abb. 4.37). Die Aktivität der P5CR in Abhängigkeit von der Temperatur ist zwischen –4,0 und 60°C bestimmt worden. Das Temperaturoptimum liegt bei 40°C; bei 0°C werden noch 10,89% der maximalen Aktivität erreicht (Abb. 4.38a). Ab der Temperatur von 60°C ist die P5CR inaktiv. Die P5CR-Aktivität wird im Bereich von –4 bis 40°C (0,0037*K-1 bis 0,0032*K-1) nur von der Temperatur bestimmt und folgt der Arrhenius-Beziehung. Oberhalb von 40°C bestimmen denaturierende Einflüsse die Enzymaktivität (Abb. 4.38a, b). Die Aktivierungsenergie Ea für den Bereich –4°C bis 40°C beträgt 92,2 KJ*mol-1. Die P5CR hat nach Lagerung bei 0°C für 12 h noch 82% der bei 20°C ge-messenen Aktivität nach 0 min.

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

-5 5 15 25 35 45 55

Tempe r a t ur [ °C ]

v[nk

at/m

g Pr

otei

n]

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0,0025 0,0027 0,0029 0,0031 0,0033 0,0035 0,0037 0,0039

1/Temperatur [1/K]

ln v

[nka

t/mg

Prot

ein]

Abb. 4.38: Temperaturoptimum (a) und Arrhenius-Plot (b) der P5CR (20 – 50%) von Chaetoce-ros sp. in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0. Vorinkubationsdauer: 10 min. Ab 60°C keine Aktivität mehr feststellbar. Bei a Skalierung beachten. Testbedingungen siehe Kap. 2.10.5.3. n = 4. Das pH-Optimum, ermittelt für den Bereich zwischen pH 5,0 und pH 10,3 mit verschie-denen Puffern (50 mM; Abb. 4.39), liegt in Kaliumphosphatpuffer deutlich bei pH 7,0; in organischen Puffern weist die P5CR ein weiter gefaßtes Optimum bei pH 7,0 bis pH 8,0 auf. Insgesamt sind die P5CR-Aktivitäten in Kaliumphosphatpuffer etwas höher als die in organischen Puffern gemessenen (Abb. 4.39).

a b

Ergebnisse

128

0

3

6

9

12

15

18

21

5 6 7 8 9 10 11pH

v [n

kat/m

g Pr

otei

n]

Abb. 4.39: Einfluß des pH-Wertes auf die P5CR-Aktivität von Chaetoceros sp. Pufferkonzentra-tion: 50 mM; Temperatur: 20°C. Weitere Testbedingungen siehe Kap. 2.10.5.2. n = 4. Abkürzungen: Glycin: Zusammensetzung siehe Kap. 2.10.5.2, Tab. 2.24. K-P: Kaliumphosphatpuffer, Glygly: Glycylglycin K-P MES HEPES Glygly BISTRIS CAPS I Glycin

Diskussion

129

5 Diskussion


Prolin gilt als das am weitesten verbreitete organische Osmolyt und compatible solute. Nach Wanzek (1994), Nothnagel (1994) und Bartsch (1989) ist die Iminosäure Prolin der Hauptosmolyt in antarktischen Eisdiatomeen; eine Hypothese, die sich nach den vorliegenden Ergebnissen bestätigt hat. Eine Einschränkung betrifft die beiden Nitz-

schia-Arten Ni. lecointei und Ni. medioconstricta, da beide Arten neben Prolin bei 34

und 51 PSU vergleichbar hohe Betain- und DMSP-Konzentrationen aufweisen. Organische Osmolyte und compatible solutes zeichnen sich unter anderem durch ihre hohe Wasserlöslichkeit aus. Daher können diese Substanzen in hohen Konzentratio-nen zusätzlich zu den anderen Substanzen akkumuliert werden, die im Cytoplasma ge-löst sind. Die hohe Wasserlöslichkeit beruht auf den Polyhydroxygruppen, den quater-

nären Stickstoff- und tertiären Schwefelatomen. Derzeit wird über drei Mechanismen diskutiert, in welcher Weise die compatible solutes ihre Schutzwirkung entfalten. Diese können einzeln oder in Kombination miteinander auftreten (Kirst, 1996): 1. Die Bindung der compatible solutes an das betreffende Makromolekül könnte Was-

ser ersetzen und es „nachahmen“ (Yancey et al., 1982). Diese Wirkungsweise wird

vor allem für Polyole vorgeschlagen (Verma, 1999). 2. Prolin hat amphiphilen (detergenzähnlichen) Charakter, wodurch es die hydropho-

ben Bereiche eines Proteins maskiert, in hydrophile „verwandelt“ und auf diese Weise dessen Löslichkeit erhöht (Schobert & Tschesche, 1978).

3. Die dritte Möglichkeit wird als „Ausschlußmodell“ (= preferential exclusion) be-zeichnet (Yancey, 2001; Arakawa & Timasheff, 1985) und bezieht sich auf die hohe Löslichkeit der compatible solutes: Nach dieser Theorie werden die compatible so-lutes von dem direkten Kontakt mit dem Makromolekül ausgeschlossen und binden Wasser in ihrer eigenen Hydrathülle. In dieser Konstellation werden die nativen Strukturen der Makromoleküle begünstigt, da nur die kleinsten möglichen Flächen dem Wasser zugewandt sind („salting-out“). Ionische Osmolyte dagegen interagie-ren direkt mit der Proteinoberfläche und begünstigen dessen Entfaltung, was letzt-endlich zur Denaturierung führt („salting-in“). Das von Galinski (1995) entwickelte

Diskussion

130

„Eisinselmodell“ ist ein Erklärungsversuch des Ausschlußmodells auf molekularer Ebene.

Die Osmolyte und compatible solutes haben, wie aus der vorangegangenen Aufstel-lung ersichtlich ist, unterschiedliche biochemische Eigenschaften, die sich in der Effek-tivität ihrer Schutzwirkung niederschlagen (Bisson & Kirst, 1995). Einen weiteren Ein-fluß auf die Schutzwirkung haben aufgrund ihrer jeweiligen Konformation die Enzyme selbst, die die Interaktionen zwischen compatible solute und der Enzymoberfläche be-einflussen, und die Art des einwirkenden Stressors (Bisson & Kirst, 1995). Die höchsten Salzkonzentrationen werden von Algen toleriert, die Glycerol, Prolin oder Glycinbetain akkumulieren, die weniger anpassungsfähigen Spezies synthetisieren z.B. Disaccharide oder Polyole (zur Übersicht: Erdmann & Hagemann, 2001; Kirst, 1995a; Hochachka & Somero, 1980). Neben der Hauptfrage nach der Prolinkonzentration im Verhältnis zu den anderen frei-en Aminosäuren und den analysierten organischen Osmolyten (vgl. Kap. 1.3) ist ein weiterer Aspekt interessant: läßt die Zusammensetzung der organischen Osmolyte im

Hinblick auf die vertikale Verteilung der Arten in der Eissäule bzw. dem Pelagial einen Rückschluß auf unterschiedliche Anpassungsstrategien zu? Prolin und freie Aminosäuren

Prolin wird von höheren Pflanzen, Eubakterien, marinen Evertebraten, Protozoen und Algen synthetisiert und spielt eine wichtige Rolle in der osmotischen Akklimatisation. Da Prolin vor allem in höheren Pflanzen nur in verhältnismäßig geringen Konzentra-tionen gefunden wird, die für einen Ausgleich des osmotischen Potentials unzurei-chend erscheinen, gehen viele Autoren in erster Linie von einer Schutzfunktion aus (Ain-Lhout et al., 2001; Erdmann & Hagemann, 2001), während in Mikroorganismen

sowohl die schützende als auch die osmotische Wirkung je nach Lebensbedingung ge-wichtet ist. Nach bisherigen Erkenntnissen dient Prolin in den meisten Diatomeenarten als Osmo-lyt. In antarktischen Eisdiatomeen sind bisher neben Prolin als organische Osmolyte DMSP und Homarin identifiziert worden (siehe unten). Zusätzlich werden mit anstei-genden Salinitäten vereinzelt Aminosäuren akkumuliert, allerdings nur in verhältnis-mäßig geringen Konzentrationen. Nach Untersuchungen an dem Halophyten Distichlis spicata ist das akkumulierte Prolin überwiegend im Cytoplasma lokalisiert (Ketchum et al., 1991) und gilt aufgrund seiner

physikochemischen Eigenschaften als einer der effektivsten Osmolyte bzw. compatible

Diskussion

131

solutes: seine außerordentlich hohe Löslichkeit und sein amphiphiler Charakter sind die Grundlagen für die hohe Effektivität (vgl. Kap. 5.2).

Die Prolinkonzentrationen nehmen sowohl zwischen 17 und 34 PSU, als auch zwi-schen 34 und 51 PSU um unterschiedliche Faktoren zu. Zusätzlich gibt es Unterschie-de zwischen den verschiedenen Arten. A. actinochilus, beide Chaetoceros-Arten und F. cylindrus erhöhen die Prolinkonzentration zwischen 17 und 34 PSU mindestens um

den Faktor 10. Zwischen 34 und 51 PSU erhöht sich die Prolinkonzentration jedoch um einen deutlich geringereren Faktor, wie in den anderen fünf Arten auch. Im Gegensatz zu den vier oben genannten Arten weisen Na. gelida, Ni. lecointei und Ni. mediocon-

stricta zwischen 17 und 34 PSU nur eine geringere Erhöhung der Prolinkonzentration um das 2,3- bis 3fache auf (Anmerkung: für Co. pennatum und A. kufferathii waren 17

PSU letal). Diese drei Arten synthetisieren allerdings weitere organische Osmolyte, die bei normaler Umgebungssalinität in mit Prolin vergleichbaren Mengen akkumuliert wer-den (vgl. Abb. 4.7 bis Abb. 4.9; siehe auch unten). Die Prolinkonzentrationen in temperierten Diatomeen übersteigen bei bei der jeweiligen normalen Umgebungssalinität die der gesamten anderen Aminosäuren nicht oder nur leicht (Dickson & Kirst, 1987; Liu & Hellebust, 1976a; Liu & Hellebust, 1976b; Liu & Hellebust, 1976c). Im Gegensatz dazu ist in vorangegangenen Arbeiten in Eisdiato-meen eine hohe Prolinbasiskonzentration bereits bei 34 PSU (vgl. Springer, 1996;

Nothnagel, 1994) gegenüber temperierten Arten festgestellt worden. Die Prolinkonzen-trationen der Eisdiatomee Chaetoceros sp. beispielsweise beträgt 150 mol*m-3, wäh-

rend die Summe der FAS nur 100 mol*m-3 erreicht (Nothnagel, 1994); die von Springer (1996) für diese Art festgestellten Daten betragen 13 fmol/Zelle (Prolin) und 10,5 fmol pro Zelle (FAS). So eindeutig wie bei Nothnagel und Spinger sind die Ergebnisse die-ser Arbeit nicht: Bei 34 PSU liegt der Prolinanteil nur bei C. gracile über dem der FAS (vgl. Abb. 4.11 und Tab. 4.12b). Nur in den beiden Chaetoceros-Arten, F. cylindrus und – wenn auch nur geringfügig – in A. actinochilus ist die Glutaminsäurekonzentration

(Hauptaminosäure nach Prolin, siehe unten) niedriger als die Prolinkonzentration bei 34 PSU. Erst bei Erhöhung der externen Salinität auf 51 PSU übersteigen die Prolin-konzentrationen in fünf der neun Arten die der gesamten FAS deutlich. Ausnahmen bil-den Ni. lecointei, F. cylindrus, A. kufferathii und A. actinochilus. Die Prolinkonzentration

der genannten Arten liegt jedoch immer über denen der Glutaminsäure. Die Hypothese der hohen Prolinbasiskonzentrationen kann nach den vorliegenden Ergebnissen folg-lich nicht uneingeschränkt aufrecht erhalten werden. Die hohen Prolinkonzentrationen, die die genannten Autoren bei 34 PSU ermittelt haben, stehen möglicherweise im Zu-sammenhang mit dem Beprobungszeitpunkt, der bei Springer (1996) für 34 PSU in der

Diskussion

132

stationären Wachstumsphase gelegen hat (keine Angaben bei Nothnagel, 1994), und mit den verwendeten Methoden zur Bestimmung der FAS.

Aus Vorversuchen ist bekannt, daß die Prolinkonzentrationen – unabhängig von der Salinität - in der stationären Wachstumsphase um das mindestens 3- bis 4fache ge-genüber der logarithmischen Phase ansteigen kann (Altersakkumulation; vgl. Abb. 5.1 mit A. kufferathii als Beispiel). Die Anfangskonzentration – den ersten Tag ausgenom-men - in A. kufferathii beträgt ca. 140 fmol/Zelle bei 34 PSU; die Konzentrationen der

sich in der stationären Wachstumsphase befindlichen Zellen liegen bei 375 fmol/Zelle. Leider liegen keine Daten zu den FAS-Gehalten während der verschiedenen Wach-stumsphasen in Eisdiatomeen vor. Legt man jedoch die existenten FAS-Daten dieser Arbeit zugrunde, so überstiege die Prolinkonzentration (375 fmol/Zelle) aus Zellen der stationären Phase zwar die von Glutaminsäure (309 fmol/Zelle; vgl. Kap. 4.1.3.5), nicht jedoch die der Gesamt-FAS von 982 fmol/Zelle, Tab. 4.12a). Bei der „Altersakkumula-tion“ handelt es sich möglicherweise um eine Art Vorsorgereaktion, die einsetzt, sobald die Algen ihre Stoffwechselenergie aufgrund von Nährsalzlimitation nicht mehr über-wiegend in die Zellvermehrung investieren. Prolin wird auch als Stickstoffspeicher, Puf-fersubstanz und Kohlenstoffquelle akkumuliert (siehe Kap. 1.2, Abb. 1.6). Unterstütz-ung findet diese These durch Ergebnisse aus einem Dunkelinkubationsversuch mit Chaetoceros sp. und Navicula sp., während dem die Prolinkonzentrationen nur auf ein

salinitätsabhängiges Minimum sinken, trotz weiter andauernder Dunkelheit (Nothnagel,

1994). Der Autor vermutet, daß das Prolin als Energiespeicher genutzt worden ist und die Algen sich unter günstigen Bedingungen eine „Luxussynthese“ leisten. Bestätigend für diese Annahme sind Untersuchungen mit Ni. lecointei, die unter Stickstoffmangel-

bedingungen Prolin metabolisiert, dessen Konzentrationen aber ebenfalls eine salini-tätsabhängige Mindestkonzentration nicht unterschreiten (Plettner, 1997). Der Ansicht von Nothnagel (1994) nach trägt der vergleichsweise hohe Prolinüberschuß von Chae-

toceros sp. gegenüber dem von Navicula sp. (und, wie in Kap. 5.2 zu zeigen sein wird, auch gegenüber A. kufferathii und Ni. lecointei) zur Dominanz dieser Art in Wintereis-

gemeinschaften bei. Erreicht werden die hohen Konzentrationen unter Umständen durch spezielle Regulationsmechanismen (Kap. 5.4).

Diskussion

133

0

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

80.000

90.000Ze

llzah

l/m

L

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Prol

in[fm

ol/Z

elle

0 2 4 6 8 10 12

Tag Abb. 5.1: Wachstum und korrelierende intrazelluläre Prolinkonzentration der antarktischen Eis-diatomee A. kufferathii bei 34 PSU. Kultivierungsbedingungen, Prolin- und Zellzahlbestimmung wurden wie in den Kap. 2. 2, 2.6.5 und 2.11.1 durchgeführt. Aus Darstellungsgründen keine Angaben von Standardabweichungen. n = 3. Zellzahl / 10 mL Prolin [fmol/Zelle] Ein Vergleich der zellulären Konzentrationen bzw. der Faktoren, um die die Prolinkon-zentrationen zwischen den einzelnen Salinitätsstufen zunehmen, ist allerdings nur un-ter Berücksichtigung des nachfolgend beschriebenen Sachverhaltes zulässig. Für die Konzentrationsangabe der Inhaltsstoffe ist die Zellzahl als Bezugsgröße gewählt wor-den. Vergleiche von auf die Zelle bezogenen Konzentrationen können aus zwei Grün-den zu Fehleinschätzungen führen: der erste betrifft das osmotische bzw. absolute Zellvolumen, der zweite die absolute Zellgröße. Beide Faktoren können in unterschied-licher Weise von abiotischen Faktoren beeinflußt werden. Als osmotisches Zellvolumen wird das absolute Zellvolumen abzüglich des relativen Schalenanteils am Gesamtzell-

volumen bezeichnet (Nothnagel, 1994). Die Untersuchungen des genannten Autors an zwei Eisdiatomeen, die bei ähnlichen Bedingungen und denselben Salinitäten wie in Kap. 2.3 angebenen kultiviert worden sind, haben eine unterschiedliche Entwicklung des osmotischen Zellvolumens bei ansteigenden Salinitäten (17 bis 51 PSU) ergeben: während das Volumen von Navicula sp. bei ansteigenden Salinitäten von 260 auf 318 µm3 ansteigt, verringert sich das von Chaetoceros sp. von 72 auf 54 µm3. Zusätzlich

weist die Bestrahlungsstärke einen Einfluß auf. Aufgrund dessen kann bei Betrachtung des abiotischen Faktors Salinität und einer angenommenen fixen Zellgröße als Be-zugsgröße für die zu bestimmenden Inhaltsstoffe eine falsche Einschätzung erfolgen. Eine ähnliche Konsequenz ergibt sich aus der Verteilung der cytoplasmatischen und vakuolären Anteile der Zellen, denn die Kompartimentierung der Osmolyte ist ein wich-tiger Faktor bei der osmotischen Akklimatisation: während Na+ und Cl- im wesentlichen

Diskussion

134

in der/den Vakuolen lokalisiert sind, wird das osmotische Potential im Cytoplasma von K+ und den niedermolekularen organischen Osmolyten bestimmt (zusammengefaßt von McNeil et al., 1999). Verglichen mit Makroalgen und höheren Pflanzen, macht das

Cytoplasma in Mikroalgen einen relativ hohen Prozentsatz mit bis zu 80% aus. Der An-teil der organischen Osmolyte am osmotischen Potential ist daher verhältnismäßig hoch (Kirst, 1985). Vakuolenarme Arten, zu denen auch die beiden bereits genannten Eisdiatomeen mit 15% (Chaetoceros sp.) bzw. 26% (für Navicula sp.) zählen, müssen

für eine ausreichende Schutzwirkung eine größere Menge organischer Osmolyte bzw. compatible solutes akkumulieren als vakuolenreiche Arten. Trotz der angeführten Ar-gumente, die für die Verwendung des osmotischen Zellvolumens als Bezugsgröße sprechen, wurde aus technischen Gründen im Rahmen dieser Arbeit auf die Bestim-mung der genannten relevanten Größen verzichtet. Für eine ausführliche Diskussion dieses Sachverhaltes wird auf die Arbeit von Nothnagel (1994) verwiesen. Der zweite oben genannte Grund, der gegen die Zellzahl als Bezugsgröße genannt werden kann, beruht auf der Veränderung der Zellgröße im Rahmen des speziellen Teilungsmodus der Diatomeen. Diese Problematik wird in Kap. 5.3 diskutiert. Neben Prolin werden nur wenige andere FAS mit zunehmenden Salinitäten akkumu-liert, allerdings in weit weniger bedeutenden Mengen. Ausnahme bildet F. cylindrus,

deren FAS-Konzentration unter Beteiligung fast aller FAS ansteigt. Glutaminsäure und

Alanin übersteigen sogar deutlich die Konzentrationen von Glycinbetain und den ande-ren organischen Osmolyten. Da neutrale und saure Aminosäuren in passiver Form an der osmotischen Adaptation teilhaben (Paleg et al., 1985; Yancey et al., 1982), üben

sie einen zusätzlichen synergistischen Effekt aus. Ähnlich sind die Verhältnisse bei den zentrischen Arten und A. kufferathii, nicht jedoch bei Na. gelida, Ni. lecointei und Ni.

medioconstricta. Bei den drei letztgenannten Arten liegen die Konzentrationen der Glu-

taminsäure, welche die zweithöchsten Konzentrationen nach Prolin aufweist, deutlich unter denen der anderen organischen Osmolyte DMSP und Glycinbetain. Diese Be-funde bestätigen die Ergebnisse von Nothnagel (1994). In A. kufferathii, Na. gelida und Ni. lecointei wird Glutamin akkumuliert, im Gegensatz zu den Ergebnissen von Springer (1996) jedoch nicht in Chaetoceros sp. Glutamin hat

eine zentrale Funktion in der Stickstoffixierung und der Aminosäurensynthese (vgl. Kap. 1.2, Abb. 1.13). Gleichzeitig gilt sie neben Asparagin und Arginin als primärer Stickstoffspeicher. Wegen der genannten Gründe, der Funktion als Vorläufersubstanz für die Prolinsynthese und der hohen Metabolismusrate erscheint eine Funktion dieser Aminosäure als weiteres organisches Osmolyt per se zumindest fraglich, obwohl ihm

als Aminosäure auch eine osmotische Funktion bzw. eine Wirkung als compatible so-

Diskussion

135

lute zukommt (vgl. Paleg et al., 1985; Yancey et al., 1982). Bestätigend sind die Ergeb-

nisse von Nothnagel (1994) und van Bergeijk (pers. Mitteilung). Nach Ergebnissen

letztgenannter Autoren akkumuliert die benthische, in der Gezeitenzone vorkommende Diatomee Cylindrotheca closterium bei Salinitäten von 11 bis 55 PSU neben Prolin

auch Glutaminsäure. Als Grund geben die Autoren an, daß Glutaminsäure die Aus-gangssubstanz für die Prolinsynthese bei Salzstreß in Diatomeen sein könnte (vgl. Kap. 5.3). Der Grund für die Akkumulation läge in der Bereitstellung von genügend Substrat für die Prolinsynthese. Ähnlich argumentieren auch Lamosa et al. (1998), die beispielsweise Glutaminsäure in Mikroorganismen (Thermococcus spp.) eine vorüber-

gehende Rolle als organischem Osmolyt bei moderaten Streßbedingungen zuweisen, der später abgebaut und möglicherweise durch andere Substanzen ersetzt wird. Zur Klärung wären weitere Untersuchungen sinnvoll. Wie bereits erwähnt, ist Glutaminsäure, neben anderen FAS, die Hauptaminosäure nach Prolin bei allen Salinitäten: in dieser Hinsicht sind die Verhältnisse in den antark-tischen Diatomeen denen temperierter Arten ähnlich (de Roeck-Holtzhauer et al., 1993; Martin-Jézéquel et al., 1992; Marsot et al., 1991; vgl. Tab. 5.1). Die Glutaminsäurekon-

zentrationen werden in einigen Arten nur von Glutamin und/oder Asparagin übertroffen. Andere FAS, die in hohen Konzentrationen vorhanden sind, unterscheiden sich von Art zu Art. So sind die in Ni. medioconstricta festgestellten Tyrosinkonzentrationen zwar in

ihrer Höhe überraschend; Tyrosin wird aber z.B. auch in Chaetoceros gracilis, Thalas-

siosira pseudonana und Skeletonema costatum als eine der Hauptaminosäuren ge-nannt (de Roeck-Holtzhauer et al., 1993).

Die in Tab. 5.1 zusammengestellten Angaben sollen die grundsätzliche Variabilität der FAS-Zusammensetzung in den Diatomeen zeigen. Deutlich wird aber auch, daß – wie bereits mehrfach erwähnt – in den meisten Diatomeen die Aminosäuren in höchster Konzentration vorliegen, die in die Stickstoffassimilation und primäre Stickstoffspeiche-rung involviert sind, also Glutaminsäure, Arginin, Asparagin und Glutamin. Glycin, Se-rin und Threonin sind die in der Diatomeenzellwand hauptsächlich vertretenen Amino-säuren (Marsot et al., 1991), deren Einfluß auf die intrazelluläre FAS-Konzentration

allerdings gering zu sein scheint.

Diskussion

136

Tab. 5.1: Übersicht über Hauptaminosäuren, die in Diatomeen bestimmt worden sind. Fettge-druckt sind die Aminosäuren mit ansteigenden Konzentrationen bei zunehmender Salinität (für die anderen Arten liegen keine entsprechenden Daten vor). Mit der OPA-Methode ist keine Pro-linbestimmung möglich. Abkürzungen: OPA = ortho-Phtalaldehyd

Diatomeenart Haupt- aminosäuren

Methode Quelle

Chaetoceros calcitrans asp, glu, ile OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp.

Derrien et al. (1998)

Chaetoceros gracilis tyr, glu, lys OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp.

de Roeck-Holtzhauer et al. (1993)

Chaetoceros sp. pro, glu, ala, arg, asp, lys

Dabs-Cl, keine Bestimmung von asn,

gln

Nothnagel (1994)

Chaetoceros sp. pro, gln Aminosäurenanalyzer Springer (1996)

Navicula sp. pro, glu, ala, asp, gly

Dabs-Cl, keine Be-stimmung von asn, gln

Nothnagel (1994)

Nitzschia lecointei pro, glu, asp, gln, ala

Dabs-Cl Plettner (1997)

Phaeodactylum tricornutum

his, glu, gln, asp, asn

OPA Marsot et al. (1991); Flynn (1990)

Rhizosolenia delicatula glu, gln, ala, ile, lys OPA Martin-Jézéquel et al. (1992)

Skeletonema costatum tyr, glu OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp


Skeletonema costatum asp, glu, ile, orn OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp.


Thalassiosira pseudonana ser, tyr OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp.


Thalsassiosira sp. ser, tyr, gln OPA, keine Trennung von his-gln, thr-gly,

met, trp.


Cyclotella cryptica, C. meneghiniana, Phaeodac-tylum tricornutum

pro, glu-gln, thr-ser, ala, gly, asp

DC, keine Trennung von Glu-gln, thr-ser

Dickson & Kirst (1987)

Die Methodenwahl zur Bestimmung der FAS hat ebenfalls einen großen Einfluß auf

das Spektrum der FAS und damit auf die Einschätzung der Prolinkonzentration im Ver-gleich zu den anderen FAS: Während in der von Nothnagel gewählten Methode weder

Diskussion

137

Glutamin und Asparagin bestimmt werden konnten, ist in mit ortho-Phtalaldehyd (OPA)

derivatisierten Extrakten keine Prolinbestimmung möglich. Diese drei zählen allerdings

zu den im Spektrum aussagekräftigsten Aminosäuren. Wie in Kap. 3.3 erwähnt, haben Säulenmaterial und Pufferzusammensetzung ebenso wie das Extraktionsverfahren (vgl. Kap. 2.7.1) einen großen Einfluß auf die Analysen (siehe die Unterschiede der mit OPA derivatisierten Aminosäurenanalytik in Tab. 5.1). Taurin (NH3

+-CH2CH2SO3) ist eine nichtproteinogene Aminosäure, die in kleinen Men-gen bereits in mehreren Mikroalgen detektiert worden ist (Admiraal et al., 1986) und in A. kufferathii, Na. gelida und Ni. medioconstricta ebenfalls nachgewiesen werden konn-

te. Nach bisherigen Erkenntnissen spielt Taurin in Diatomeen eine eher untergeordnete Rolle. Einzige Ausnahme bildet die marine Art Nitzschia pungens f. multiseries, die Taurin anstatt von Prolin als Hauptosmolyten akkumuliert (Jackson et al., 1992). Die

physiologische Funktion von Taurin ist noch nicht vollständig geklärt; möglicherweise ist sie in verschiedenen Organismen von unterschiedlicher Art. Neben dem genannten Beispiel stammt der einzige Bericht über eine osmotische Rolle in Algen aus Untersu-chungen mit der Rotalge Porphyridium purpureum (Jackson et al., 1992). Größere Mengen Taurin (225 pmol/105 Zellen) synthetisiert auch Tetraselmis subcordiformis bei

normaler Meerwassersalinität (Flynn, 1990); Erkenntnisse über eine osmotische Funk-tion in dieser Art liegen nicht vor. Generell wird die Wirkung als compatible solute -

ebenso wie die der anderen neutralen und sauren Aminosäuren – unterstützt (Yancey et al., 1982), unter anderem, weil sie strukturelle Ähnlichkeiten zu den Ionen der Hof-

meister-Serie aufweisen, welche die native Struktur und Funktion der Makromoleküle unterstützen, z.B. ähnelt Taurin Ammoniumsulfat (Clark, 1985). In vielen Tieren, wie z.B. im Buntbarsch (Oreochromis mossambicus) wird Taurin als Osmolyt akkumuliert (Takeuchi et al., 2001).

Die Gesamtkonzentration der FAS fast aller untersuchten Arten sinkt bei 51 PSU auf das niedrigste Niveau, mit Ausnahme der von F. cylindrus, die die FAS als osmotisch

wirksame Komponente zu nutzen scheint. In früheren Arbeiten ist die Reduktion der Gesamt-FAS in in Ni. lecointei sowohl unter Kontrollbedingungen bei 51 PSU als auch

unter Stickstoffmangelsituationen festgestellt worden. Diese wurde mit einem zugun-sten der Prolinsynthese umgestellten Metabolismus in Zusammenhang gebracht (Plet-tner, 1997). Eine Reduktion der FAS-Grundgesamtheit wurde ebenfalls bei alternden Kulturen beobachtet, in denen sie möglicherweise durch Nitratmangel verursacht wird (Dortch et al., 1984). Dieses Phänomen ist in den Arbeiten von Nothnagel (1994) in den Starklichtkulturen und Springer (1996) für Chaetoceros sp. beobachtet worden. In

Diskussion

138

Gracilaria tenuistipitata steigt der Prolinanteil am Gesamt-FAS-Gehalt bei Hitzestreß

an, was, ebenso wie bei acht der in dieser Arbeit untersuchten Arten, eine Reduktion

der anderen FAS zugunsten von Prolin bedeutet (Chang & Lee, 1999). Quaternäre Ammoniumverbindungen, Zucker / Polyole und Ectoine

Allgemein gelten quaternäre Ammoniumverbindungen (Quacs) aufgrund ihrer Struktur als compatible solutes, allerdings konnte nicht für alle Substanzen eine entsprechende Funktion nachgewiesen werden. Für S-Methyl-L-Methionin und Trigonellin beispiels-weise wurde keine Schutzwirkung in höheren Pflanzen nachgewiesen (zur Übersicht Rhodes & Hanson, 1993). Wie eingangs bereits erwähnt, wurden neben Prolin die Quacs Homarin und Glycinbe-tain sowie die tertiäre Schwefelverbindung DMSP als weitere organische Osmolyte identifiziert. Wie in Kap. 3.1 erläutert, ist vom Vorhandensein weiterer osmotisch wirk-

samer Substanzen auszugehen. Angesichts der großen Spannbreite des Salzgehaltes im Habitat „Meereis“ und der – auf immer sensitiver und umfassender werdenen Nach-weismethoden begründet (vgl. Kap. 3) – als Neuentdeckungen anzusehenden Vielzahl von Osmolyten, die vor allem in Bakterien bestimmt werden (vgl. Silva et al. 1999;

Galinski; 1995), ist die offensichtliche Vielfalt an Osmolyten, in den pennaten Diatomeen wenig überraschend. Bis zur Mitte der 80er Jahre wurden nicht mehr als 2 bis 3 organische Osmolyte pro Mikroalge gefunden (Munns et al., 1983). In vielen

Fällen bestand jedoch eine Diskrepanz zwischen dem inneren und äußeren osmo-

tischen Potential (πi und πa). Das Vorkommen weiterer organischer Osmolyte (wie z.B.

Quacs) wurde daher nicht ausgeschlossen und später bestätigt (Dickson & Kirst, 1987). Wie in den eigenen Untersuchungen ist die Konzentration von Homarin auch in Chae-

toceros sp. und Navicula sp. verhältnismäßig gering und erreicht lediglich Werte um 2% (Chaetoceros sp.) bzw. 0,7% (Navicula sp.) der Prolinkonzentration bei 51 PSU

und 50 µmol Photonen*m-2*s-1 (Nothnagel, 1994). Nur in A. kufferathii sind die Konzen-

trationen mit 40% (34 PSU) bzw. 16,9% (51 PSU) der Prolinkonzentration vergleichs-weise hoch. Interessanterweise konnte in keiner der beiden Nitzschia-Arten Homarin

nachgewiesen werden. Die in den meisten Eisdiatomeen gefundenen verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen deuten eher auf eine Funktion als compatible solute hin, als daß sie hauptsächlich als osmotische Substanz ihre Wirkung ausüben. In der Prasino-phycee Tetraselmis subcordiformis dagegen liegen die Homarinkonzentrationen im Be-

Diskussion

139

reich der der anderen organischen Osmolyte Mannitol, DMSP und Glycinbetain (Dickson & Kirst, 1986). Nach Nishitani et al. (1995) ist Homarin an der osmotischen

Regulation beteiligt; einer Funktion, welche die geringen Mengen in den Eisalgen ebenfalls erklären könnte. Homarin wird während einer 42tägigen Dunkelinkubation von Navicula sp. im Gegensatz zu Prolin nicht verstärkt metabolisiert (Nothnagel,

1994), so daß der Autor diesem Omolyt eine Funktion als sekundärer Energiespeicher abspricht, wie sie für z.B. für DMSP von Karsten (1991) bei Makroalgen vorgeschlagen wird. Die Erkenntnisse über diese Substanz und ihrer Funtkion sind allerdings noch lückenhaft und bedürfen der weiteren Erforschung. Glycinbetain scheint hauptsächlich im Cytosol lokalisiert zu sein; allerdings werden in

den Chloroplasten der Blätter der Chenopodiaceae (Gänsefußgewächse) 20 bis 40% des zellulären Gesamtglycinbetaingehaltes gefunden (Hanson, 1992). Die Regulation der Synthese in Pflanzen und Algen ist noch nicht geklärt (Hanson, 1992). Möglicher-weise wird, ähnlich wie im Bakterium Rhizobium meliloti, bei hohen externen Osmolari-

täten die Demethylierung gehemmt, damit Glycinbetain als compatible solute akkumu-liert werden kann (Miller & Wood, 1996). McNeil et al. (1999) und Rhodes & Hanson

(1993) zitieren in ihren Reviews allerdings Autoren, die davon ausgehen, daß die Ak-kumulation von Glycinbetain auf einen nicht vorhandenen Katabolismus zurückzufüh-ren ist: Die Akkumulation beruht auf einer erhöhten Syntheserate bei durch Streß ver-

langsamten Wachstum. Die Wirkungsweise des Glycinbetain als compatible solute ist der von Prolin ähnlich, allerdings weniger effektiv. Außerdem ist Glycinbetain, im Ge-gensatz zu Prolin, in der Entgiftung von Hydroxyradikalen ineffektiv (Smirnoff & Cum-bes, 1989). Von den 9 untersuchten Arten wurde nur in den 5 pennaten Diatomen Glycinbetain de-tektiert und mit ansteigenden externen Salinitäten akkumuliert. Diese Substanz bildet zusammen mit DMSP das zweitwichtigste Osmolyt. Ausnahmen sind Ni. lecointei, bei

der die Glycinbetainkonzentrationen bei allen Salinitäten die von Prolin übersteigen, und A. kufferathii (siehe Homarin).

In Na. gelida und den beiden Nitzschia-Arten werden mit ansteigender Salinität Zucker bzw. Polyole akkumuliert. In Na. gelida und Ni. medioconstricta handelt es sich mit

größter Wahrscheinlichkeit um das Polyol Erythritol (vgl. Kap. 4.1.2); Sicherheit würde ein Kernresonanz- (NMR-) Spektrum geben. Der Zucker von Ni. lecointei konnte nicht

identifiziert werden. Ein Polyol kann jedoch ausgeschlossen werden. Für eine zweifels-freie Idendifikation mittels NMR müßte gesuchte Substanz in großer Menge in gereinig-ter Form (aus mindestens 2 g Trockenbiomasse) vorliegen. Über Zucker ist in Diato-

Diskussion

140

meen bisher wenig bekannt; der vorliegenden Literatur zufolge sind Zucker – wenn überhaupt – nur in geringsten Mengen detektiert worden. Ausnahme ist die marine Art Cylindrotheca fusiformis, die Mannose akkumuliert. Ein Grund für die Detektion des

Zuckers ist die Verwendung eines empfindlicheren Detektors im Vergleich zu dem von Nothnagel (1994) und Wanzek (1994) verwendeten Gerät. Die Zucker – wie im Lang-zeitversuch bei Ni. lecointei (vgl. Kap. 5.2) - werden offenbar auch erst bei Exposition

höherer Salinitäten in den Algen in größerer Menge synthetisiert und sind erst dann als Substanz mit osmotischer Funktion deutlich erkennbar. Ob und wenn ja, welche Rolle der unbekannte Zucker in Ni. lecointei bei der osmotischen Akklimatisation einnimmt,

ist nicht bekannt. Davon ausgehend, daß der Zucker entweder rasch synthetisiert oder aus Reservestoffen freigesetzt werde, könnte er – neben Prolin (vgl. Kap. 5.3) – ähn-lich wie Mannitol in Tetraselmis subcordiformis (O. Wandschneider, pers. Mitteilung;

Dickson & Kirst, 1986) in der ersten Akklimatisationsphase nach einer hyperosmoti-schen Belastung bedeutend sein. Ähnliches gilt für stickstofflimitierende Bedingungen unter hyperosmotischer Belastung, in denen Prolin in Ni. lecointei bis auf ein salinitäts-

abhängiges Minimum metabolisiert wird. Während die Prolinabnahme sofort nach Ver-suchsbeginn einsetzt, wird DMSP als potentieller Ersatzosmolyt erst zu einem relativ späten Zeitpunkt, nämlich 13 Tage nach Einsetzen der stickstofflimitierenden Bedin-gungen, vemehrt akkumuliert. Unter denselben Bedingungen durchgeführte Analysen der Anionen und Kationen zeigten keine Ionenakkumulation (Plettner, unveröffentlicht).

Ectoin und Hydroxyectoin gehören zu der Stoffklasse der Ectoine (Abb. 5.3). Es han-

delt sich um Aminosäurederivate, die als compatible solutes bisher nur in thermophilen Bakterien gefunden worden sind (Galinski, pers. Mitteilung). Die Frage, ob die in eini-gen pennaten Arten gefundenen Ectoine tatsächlich eukaryotischen oder eher bakteri-ellen Ursprungs sind, wird in Kap. 5.2 (Langzeitversuch) ausführlich diskutiert.

DMSP

Ausgehend von den generellen Eigenschaften der Osmolyte und in-vitro Enzymassays

scheint DMSP ein weniger effektives compatible solute zu sein als z.B. Glycinbetain, Prolin und Glycerol (Kirst, 1996). Wie andere organische Osmolyte auch ist DMSP wahrscheinlich im Cytoplasma lokalisiert (Macdonald et al., 1996). DMSP wird offenbar

nur von pennaten Diatomeen synthetisiert, nicht jedoch von den zentrischen Arten (vgl. auch Nothnagel; 1994).

Diskussion

141

Im Rahmen dieser Arbeit wurde in den vier pennaten Arten F. cylindrus, Na. gelida, Ni.

lecointei und Ni. medioconstricta DMSP nachgewiesen und mit ansteigenden Salinitä-

ten akkumuliert. In drei der vier Arten liegt die DMSP-Konzentration bei 34 PSU deut-lich höher als die von Prolin. Lediglich in F. cylindrus unterschreitet die DMSP-Konzen-

tration die von Prolin. Ähnlich den Gegebenheiten bei Glycinbetain dreht sich das Ver-hältnis bei 51 PSU zugunsten von Prolin – wieder mit Ausnahme von Ni. lecointei. In Navicula sp. erreicht die DMSP-Konzentration bei 51 PSU und 50 µmol Photonen pro

m-2*s-1 (Nothnagel, 1994) 11% der Prolinkonzentration und liegt auch bei 34 PSU deut-lich unter der Prolinkonzentration. Wie bereits bei der Homarinkonzentration, so bildet A. kufferathii auch bei der DMSP-Synthese-Fähigkeit, die nicht vorhanden ist, eine

Ausnahme (vgl. auch Wanzek; 1994). Wie bereits oben diskutiert, wird Prolin nach Beendigung der logarithmischen Wachs-tumsphase vermehrt akkumuliert („Altersakkumulation“ oder „Luxussynthese“). Be-obachtungen in den Eisalgenkulturen zufolge scheint dieses auch für DMSP zu gelten (vgl. auch Rott, 1993). Aus diesem Grund und wegen der langsamen Synthese nach einem Salzschock (vgl. Kap. 5.3) plädiert Kirst (1996) dafür, in DMSP vor allem ein zu-sätzliches compatible solute zu sehen, das, bei genügend metabolischen Reserven, als „Vorsichtsmaßnahme“ synthetisiert wird und bei plötzlichen Salinitässprüngen als Puffer wirken könnte. Bestätigt wird diese Annahme durch die vermehrte DMSP-Akku-mulation in der Diatomee Sceletonema costatum, die normalerweise relativ geringe

DMSP-Mengen produziert. In der stationären Wachstumsphase jedoch nimmt der An-teil von DMSP an partikulärem organischem Schwefel (POS) bzw. am Gesamtschwe-felgehalt deutlich zu (Matrai & Keller, 1994). Die Faktoren, welche die DMSP-Stoffwechselwege regulieren, sind noch weitgehend unbekannt (zusammengefaßt von Stefels, 2000). Die DMSP-Synthese wird durch Licht stimuliert, ist aber nicht notwendigerweise lichtabhängig (Stefels, 2000). Unter ande-rem aus diesem Grund wird der DMSP-Synthese auch eine Funktion als „Overflow-Mechanismus“ zugeschrieben, z.B. bei Stickstoffmangelbedingungen. Andreae (1986) kam als erster auf den möglichen Zusammenhang zwischen Stickstoff-mangelbedingungen und erhöhter DMSP-Produktion, als er feststellte, daß in sogenan-nten „low-productivity-areas“ höhere Dimethylsulfid-(DMS-) Werte gemessen wurden als aufgrund der Berechnungen zu erwarten waren. Weitere Untersuchungen bestätig-ten diese Vermutung: DMSP wird in vielen Mikroalgen bei Stickstoffmangel vermehrt synthetisiert (Macdonald et al., 1996; Turner et al., 1988; Plettner nicht veröffentlicht; O. Wandschneider, pers. Mitteilung). Stickstoffmangel induziert einen Proteinabbau und das daraus stammende Methionin könnte für die DMSP-Synthese genutzt werden

Diskussion

142

(Kirst, 1996). Eine Funktion als Energielieferant bei einer Dunkelinkubation der Eis-diatomee Navicula sp., wie Karsten (1991) es für Makroalgen postuliert hat, konnte

Nothnagel (1994) nicht nachweisen. Der abiotische Abbau von DMSP in Seewasser verläuft nur langsam. Gelöstes DMSP kann allerdings auch enzymatisch gespalten werden. Das dafür notwendige Enzym, die DMSP-Lyase, ist in marinen Bakterien (Kiene et al., 2000), in verschiedenen Mikroalgen (Steinke et al., 1998; de Souza & Yoch, 1995) und einigen Dinoflagellaten (A. Gress, pers. Mitteilung; Steinke et al., 2002) sowie Makroalgen, z.B. Ulva lactuca

(de Souza et al., 1996) identifiziert worden. Die Spaltung von DMSP zu DMS macht al-

lerdings nur etwa 50% der DMSP-Degradation aus, der Rest wird über Demethy-lierungsreaktionen von marinen Bakterien als reduzierte Schwefelverbindung recycelt und verbleibt im Nahrungsnetz (Review: Kiene et al., 2000). DMS, sein Vorläufer

DMSP und Dimethylsulfoxid (DMSO) bilden den größten Pool an organischen Schwe-felverbindungen in der marinen Umgebung. Die Produktion und Transformation dieser Verbindungen sind wichtige Faktoren im Schwefelkreislauf. DMS wird aus Organismen, vornehmlich Algen, durch Exsudation, Autolyse, Virenbefall und Zooplanktonfraß wäh-rend und nach Planktonblüten freigesetzt (Malin & Kirst, 1997). Nach Modellrech-nungen von Laroche et al. (1999) wird vor allem der durch Exsudation freigesetzte An-

teil an DMS z.Zt. noch unterschätzt.

Bakterieller Abbau, Photooxidation und See-Luft-Austausch sind die 3 größeren Sen-ken für DMS (Sakka et al., 1997). Die Freisetzung von marinem DMS in die Atmosphä-

re hat wahrscheinlich eine wichtige klimarelevante Funktion: es wird leicht zu Sulfat-Aerosolen oxidiert, die die Sonneneinstrahlung streuen und die Bildung von Wolken-kondensationskernen fördern (Scarratt et al., 2000; Malin & Kirst, 1997; Ledyard &

Dacey, 1994). Beide Prozesse führen zu vermehrter Albedo und üben daher einen kühlenden Einfluß auf das lokale Klima aus. Charlson et al. (1987) haben die Hypo-

these aufgestellt, daß die marine DMS-Produktion als ein klimaregulierender Mecha-nismus fungieren könnte, und zwar über eine Feedback-Regulationsschleife, die die Oberflächentemperatur der Ozeane, das Phytoplankton, DMS und Sulfat-Aerosole be-inhaltet. Die klimarelevante Bedeutung von DMS ist ein wichtiges Faktum in der von James Lovelock in den 70er Jahren mitbegründeten Gaia-Hypothese (siehe z.B. Lovelock, 1991), nach der die Erde als ein hochempfindlicher, sich selbst regulierender Organismus betrachtet wird. In der Antarktis gilt Phaeocystis antarctica als größter DMSP-Produzent, während die

Eisdiatomeen aufgrund ihres kleinen DMSP-zu-Chl.a-Verhältnisses zu den weniger be-

Diskussion

143

deutenden DMSP-Produzenten in der Antarktis zählen (Kirst et al., 1991). Jedoch sollte

ihr DMS-Output aufgrund der hohen Biomassen, die sie in der Eissäule erreichen, nicht unterschätzt werden (Burger, 2002; Trevena et al., 2000; DiTullio et al., 1998).

Zusammenfassung

Die pennaten Arten weisen mit Prolin, Homarin, Glycinbetain, DMSP und einem Zuk-ker/Polyol ein breites Spektrum an organischen Osmolyten auf. Die zu den Centrales gehörenen Arten synthetisieren neben Prolin nur Homarin als weiteren möglichen Os-molyten, wobei nur die beiden Chaetoceros-Arten, die in der Eissäule abundant sind,

diese Substanz mit ansteigenden Salinitäten akkumulieren. Im Gegensatz dazu finden sich in den beiden anderen Arten A. actinochilus und Co. pennatum, die hauptsächlich

im marinen Milieu zu finden sind, nur Spuren von Homarin (vgl. Abb. 2.6). Da man nach bisherigen Erkenntnissen davon ausgeht, daß eine „Osmolyt-Mixtur“ wir-kungsvoller ist als die Akkumulation eines einzelnen Osmolyten (Yancey, 2001), ist

nicht die Vielzahl der bestimmten organischen Osmolyte in den pennaten Arten ungewöhnlich, sondern eher das Vorkommen von nur einem bzw. zwei in den beiden Chaetoceros-Arten. Diese Arten sind – wie ebenfalls Ni. lecointei und F. cylindrus – in

den oberen Bereichen der Eissäule zu finden. Na. gelida, Ni. lecointei und Ni. medioconstricta weisen Besonderheiten in der Prolin-akkumulation und bezüglich der übrigen Osmolyte auf. In F. cylindrus erhöhen sich die

FAS-Gesamtkonzentrationen mit ansteigenden externen Salinitäten, wobei die Gluta-minsäurekonzentration selbst bei 51 PSU noch die der anderen Osmolyte deutlich übersteigt. A. kufferathii fehlt als pennater Art die Fähigkeit zur DMSP-Synthese, akku-

muliert aber im Verhältnis deutlich mehr Homarin als die anderen Arten. Die Aufstellung zeigt die Komplexität der antarktischen Diatomeen, sich an steigende externe Salinitäten anpassen und sich dadurch vor den schädigenden Einflüssen schützen zu können. Dennoch stellt die Entwicklung der „compatible-solute-Strategie“ (also die Synthese von als compatible solutes wirkenden Substanzen zur Stabilisierung von Proteinfunktionen bei den unterschiedlichsten Streßexpositionen) den evolutionär einfacheren Weg dar, eine Toleranz gegenüber hohen Osmolaritäten oder anderen Stressoren zu entwickeln (Somero, 1992), vergleicht man sie mit den Modifikationen, die an Proteinen von halophilen Archaebakterien zu finden sind (vgl. Kap. 5.2). Nach Yancey et al. (1982) beruht die Entstehung der compatible-solute-Strategie der Orga-

nismen auf einfachen biophysikalischen Gesetzmäßigkeiten, nach denen bestimmte Moleküle – die compatible solutes - mit den zellulären Makromolekülen unterstützend interagieren, und auf einem Phänomen, das sie als „genetischen Simplizismus“ be-

Diskussion

144

zeichnen. Damit ist gemeint, daß z.B. Dunaliella salina keine genetische Information für

sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Salzgehalten funktionierende Enzyme spei-

chern muß, da die vorhandenen Enzyme in Gegenwart der compatible solutes auch in einem weiten Salinitätsbereich ihre Aktivität aufrechterhalten können. Daneben gibt es allerdings Hinweise, daß, obwohl viele compatible solutes in zahlreichen, hinsichtlich ihrer phylogenetischen Abstammung völlig verschiedenen Organismen dieselben Sub-stanzen synthetisiert werden (konvergente Entwicklung), Parallelen im Osmolytmuster bestimmter Organismengruppen existent sind, wie z.B. die Akkumulation von Prolin als Hauptosmolyten in den meisten Diatomeen. Auf Gattungsebene, d.h. wenn die Arten einer Gattung – wie hier z.B. beide Nitzschia-Arten – dieselben Osmolyte synthetisie-ren, bezeichnen Blunden et al. (1992) das als taxonomische Signifikanz.

Die compatible-solute-Hypothese besagt, daß die Gesamtheit der in der Zelle akkumu-lierten Osmolyte die extrazelluläre Hypertonie ausbalanciert. Wird z.B. die Konzentrati-on des einen Osmolyten verändert, so muß dieser nach der Hypothese – bei anson-sten unveränderten Bedingungen – durch die Veränderung eines oder mehrerer anderer Osmolyte kompensiert werden (Burg, 1992). Als Beispiel könnte man die Ak-kumulation von DMSP in z.B. Ni. lecointei unter Stickstoffmangelbedingungen als Er-

satz für metabolisiertes Prolin (Plettner, unveröffentlicht) oder den Abbau von Inositol und Sorbitol in PAP-HAT 25-Zellen bei externer Betainzugabe mit nachfolgender Auf-nahme dieser Substanz in die Zellen anführen. Bei PAP-HAT 25-Zellen handelt es sich

um eine spezielle Nierenzellinie aus Kaninchen, die bei NaCl-Exposition bis 600 mM noch Wachstum aufweist (Burg, 1992). Die Fähigkeit zur Synthese mehrerer verschie-dener compatible solutes hätte den Vorteil für die Organismen, flexibel auf die Einwir-kung unterschiedlicher Stressoren reagieren zu können. Die eingangs gestellte Frage, ob sich auf der Ebene der synthetisierten organischen Osmolyte die vertikale Verteilung der Arten in der Eissäule erklären läßt, kann auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse des Osmolytenscreenings allein nicht beantwortet werden. Die unterschiedliche Effektivität in der Schutzwirkung der verschiedenen com-patible solutes bzw. deren unterschiedliche Eignung, verschiedene Zellkompartimente vor destruierenden Einflüssen zu bewahren, könnte einen Grund für die Unterschiede in den Osmolytcocktails der Organismen darstellen. Die Art des Stressors, dessen In-tensität (vgl. Kap. 5.2 und Kap. 5.3) und die jeweiligen Fähigkeiten der Organismen bedingen die Zusammensetzung dieses Cocktails (Erdmann & Hagemann, 2001). Die Daten über das Vorkommen antarktischer Eisdiatomeen in bestimmten Eisschich-ten bzw. der freien Wassersäule sind noch lückenhaft und von den Funden an be-stimmten Probenentnahmeorten abhängig („Patchiness“) (Brierley & Thomas, 2002).

Diskussion

145

Dennoch sind immer wieder dieselben Arten in denselben Eisalgengemeinschaften wiederzufinden und dominant (vgl. Kap. 1.2). Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse

läßt sich bezüglich der Habitate und des identifizierten „Osmolytcocktails“ folgende Hypothese aufstellen: Die zu den Centrales gehörigen Arten weisen nur wenige Osmo-lyte auf. Die Arten, die, wie Chaetoceros sp., in den Oberflächengesellschaften der Eis-

säule vorkommen, akkumulieren im Verhältnis zu den FAS höhere Prolinmengen als die pennaten Arten und A. actinochilus bzw. Co. pennatum und sind möglicherweise

aufgrund dessen an ihren Lebensraum angepaßt. Wie bereits erwähnt, ist die charakteristische Zusammensetzung der SIMCO eher benthischer als planktischer Natur (Horner et al., 1992; Squire, 1990). Viele pennate

Arten werden in ihren Habitaten, wie z.B. dem Wattenmeer, viel eher Streßsituationen ausgesetzt als die zentrischen Arten und sind aufgrund evolutionärer Anpassung möglicherweise generell streßtoleranter. Die pennaten Arten synthetisieren eine Viel-zahl organischer Osmolyte, die sie als „Cocktail“ nutzen, um sich an steigende Salini-täten bzw. sinkende Temperaturen akklimatisieren zu können. Auffällig sind die im Ver-hältnis hohen Konzentrationen von Glycinbetain und DMSP in den beiden Nitzschia-Arten. Es wird allgemein angenommen, daß die Arten der Gattung Nitzschia extrem

anpassungsfähig und tolerant gegenüber ungünstigen Lebensbedingungen ist (L. Medlin, pers. Mitteilung; DasSarma & Arora, 2001). Nach DasSarma & Arora (2001) zählen die beiden Gattungen Navicula und Amphora ebenfalls zu den äußerst

anpassungsfähigen Arten da sie oft unter hypersalinen Bedingungen vorkommen. Die Fähigkeit, neben Prolin weitere, effektive Osmolyte in ähnlich hohen Konzentrationen zu synthetisieren und sich damit – möglicherweise ergänzt durch Anpassungen des Enzymapparates, wie von Wanzek (1994) postuliert, – an extreme Situationen beson-ders gut anpassen zu können, kann mit dieser Beobachtung in Zusammenhang stehen. In den überwiegend im freien Wasser (unter dem Eis) vorkommenden Arten A. actino-

chilus und Co. pennatum (Centrales) ließ sich nur Prolin als Osmolyt identifizieren.

Aufgrund ihres Lebensraumes werden sie eher selten mit hohen Salinitäten konfron-tiert. Werden sie im Eis eingeschlossen, ist die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung durch physikalische Kräfte während der Eisbildung (Gleitz & Thomas, 1993; Bartsch, 1989) größer als die, sich längerfristig in einem Laugenkanal an einen hohen Salzge-halt anpassen zu müssen. Kurzfristig, d.h. für einige Stunden, werden größere Schock-ereignisse toleriert (wie z.B. Temperaturanstiege oder Salzschocks; Daten nicht ge-zeigt). Die Fähigkeit, spezielle Streßproteine zu synthetisieren, um sich Extremsituatio-nen bzw. Streßereignissen kurzfristig anpassen zu können, ist möglicherweise in die-sen Arten geringer ausgeprägt (vgl. Kap. 5.2). Die nachgewiesenen Spuren von

Diskussion

146

Homarin lassen sich möglicherweise mit einer These von Rhodes & Hanson (1993) er-klären, die sie für das Vorkommen von Glycinbetain aufgestellt haben: in einigen Gat-

tungen höherer Pflanzen werden nur Spuren von Glycinbetain gefinden, in anderen Gattungen dagegen hohe Konzentrationen. Die Autoren äußern die Vermutung, daß die Fähigkeit zur Synthese von Glycinbetain ein archaisches Angiospermencharakte-ristikum darstellt, das in einigen Gattungen stark, in den anderen dagegen nur schwach ausgeprägt ist. Vergleichende biochemische und immunologische Experimente bele-gen diese Vermutung. Die beiden anderen untersuchten Centrales, Chaetoceros sp. und C. gracile, akkumu-

lieren zusätzlich zu Prolin die Ammoniumverbindung Homarin. Beide Arten werden in den Oberflächengesellschaft in der Eissäule (Abb. 1.14) gefunden, wo sie – auch über einen längeren Zeitraum - hohen Salinitäten und tiefen Temperaturen ausgesetzt sind. In Chaetoceros sp. gibt es Hinweise auf die Fähigkeit, sich an tiefe Temperaturen anzupassen – im Gegensatz zu A. kufferathii -; z.B. in Enzymsystemen gegen antioxi-

dativen Streß (Schriek, 2000). Von einer genetischen Anpassung an die extremen Be-dingungen ist daher auszugehen (weitere Diskussion Kap. 5.2). Die pennaten Arten – mit Ausnahme von F. cylindrus, die in der gesamten Eissäule zu

den dominaten Spezies gehört - sind im Herbst und Winter eher in den unteren Berei-chen der Eissäule zu finden. Einige Arten (wie z.B. Ni. lecointei; vgl. Kap. 2.1) wandern

im Frühjahr, sobald Lichtintensität und Tageslichtdauer ansteigen, durch die Eiskanäle

in Richtung Oberfläche. In den oberen Eisbereichen herrschen tiefe Temperaturen und hohe Salinitäten vor. An diese Bedingungen können sich die angesprochenen Arten mit der Vielzahl ihrer osmotisch wirksamen Substanzen / compatible solutes anpassen. Wie für Chaetoceros sp. gibt es auch für Ni. lecointei Hinweise auf die Möglichkeit, sich

zusätzlich zur Akkumulation von compatible solutes an tiefe Temperaturen anpassen zu können (Wanzek, 1994; weitere Diskussion siehe Kap. 5.2). Bei dieser Diskussion darf nicht vergessen werden, daß auch weitere, nicht identifizier-te Osmolyte in den Eisalgen vorhanden sein könnten, die eventuell auch erst bei grös-seren Streßbedingungen synthetisiert werden (vgl. Kap. 5.2: Langzeitversuch). Ein Beispiel für eine osmotisch wirksame Substanz, über dessen Bedeutung und Funk-tion in marinen Systemen bisher wenig bekannt ist, ist die Schwefelverbindung Di-methylsulfoxid (DMSO). Es ist möglich, daß DMSO auch in Eisalgen synthetisiert wird, da es sehr gute kryoprotektive Eigenschaften aufweist (Lee & de Mora, 1999). Ein Vor-kommen von DMSO in verschiedenen Organismen würde z.B. die Bilanzen zum bisher unvollständigen Schwefelkreislauf vervollständigen (Malin & Kirst, 1997).

Diskussion

147

5.2 Langzeitversuch

Die Toleranzbereiche für sowohl die Temperatur als auch für die Salinität von Chaeto-

ceros sp. und Ni. lecointei sind wesentlich größer als die von Co. pennatum und A. kuf-

ferathii. Beide Bereiche stimmen mit den unterschiedlichen Vorkommen in der Eissäule überein: es ist für Co. pennatum mit seiner hauptsächlich marin determinierten Umwelt

unwahrscheinlich, sehr tiefe Temperaturen bzw. hohe Salinitäten anzutreffen. Ähn-liches gilt für A. kufferathii, die hauptsächlich in der Bodeneisgesellschaft mit relativ

stabilen Umweltbedingungen zu finden ist (vgl. Kap. 1.3; Abb. 1.14). In Laborexperi-menten konnten im Gegensatz zu Chaetoceros sp. und Ni. lecointei weder A. kuffera-

thii noch Co. pennatum für mehr als einige Stunden größere, sprungartige Veränderun-

gen der Temperatur oder Salinität tolerieren. Das Vorkommen der verschiedenen Arten innerhalb der Eissäule wird meist mit der Zellgröße in Verbindung gebracht (Gleitz & Thomas, 1993): je kleiner die Eislaugenka-

näle im Verlauf des Winters werden, desto kleinere Organismen werden dort nur über-leben und sich vermehren können. Das gilt insbesondere natürlich für schalentragende Organismen wie Diatomeen, die nicht in der Lage sind, ihre äußere Gestalt den sich ändernden Gegebenheiten anzupassen. Aufgrund der Struktur des Kanalsystems sind in den Kanälen lange, schmale Organismen im Vorteil (Krembs et al., 2000). Die Zerstörung von Schalen größerer Arten wie z.B. A. kufferathii, die im Winter vor allem

in oberen Bereichen der Eissäule gefunden worden sind (Grossmann & Gleitz, 1993; Bartsch, 1989), wird im wesentlichen auf die physikalischen Kräfte während der fort-schreitenden Verkleinerung der Eiskanäle während des Eiswachstums zurückgeführt, während lange und schlanke Formen sich durch das Eis bewegen und Bereiche mit günstigeren Lebensbedingungen aufsuchen können. Physiologische Gründe als Vertei-lungsparameter blieben bisher eher unberücksicht. Die Ergebnisse des Langzeitver-suches, in dem vier Arten aus unterschiedlichen Hauptlebensräumen in der Antarktis über einen Zeitraum von 9 Monaten langsam steigenden Salinitäten und sinkenden Temperaturen ausgesetzt worden sind, lassen die Hypothese zu, daß neben der Zell-größe auch physiologische Eigenschaften der Organismen für die vertikale Verteilung der Organismen in der Eissäule verantwortlich sind. Die vier Arten Chaetoceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei zeigen physiologische Eigenschaften, die

mit ihren Hauptlebensräumen – der Eissäule oder dem freien Wasser – konform ge-hen. Frühere Experimente mit den bipolaren Arten Thalassiosira antarctica, die eher als planktische Art einzustufen ist, und Nitzschia frigida, einer typischen Eisalge, zei-

gen deutliche Unterschiede im Wachstum bei ansteigenden Salinitäten, die die plank-tische Art im Nachteil sehen (Aletsee & Jahnke, 1992). Erst kürzlich stellten Gleitz et al.

Diskussion

148

(1998) aufgrund neuerer Erkenntnisse die Vermutung auf, daß spezielle physiologische Eigenschaften für die Dominanz von einigen kleinzelligen Arten im Packeis, wie z.B. F.

cylindrus, verantwortlich sind. Die Kopplung von Temperatur und Salzgehalt innerhalb des Eislakunensystems bedingt für Eisalgen doppelten Streß, da sie sich nicht nur gegen die große osmotische Belastung, sondern auch vor der mechanischen Zerstörung durch intrazelluläre Eisbil-dung schützen müssen (Spindler & Gradinger, 1995). Dabei stellt sich zunächst die Frage, ob sich im Rahmen der Langzeitanpassung die Osmolytmenge und –zusam-mensetzung (vgl. Kap. 5.1) verändern, woraus Rückschlüsse auf physiologische Me-chanismen gezogen werden könnten. Prolin als Hauptosmolyten kommt dabei beson-dere Aufmerksamkeit zu. Prolin gilt nicht nur als Osmolyt und compatible solute, sondern wird auch als Gefrier-schutzsubstanz diskutiert (Carpenter & Crowe, 1988; vgl. auch Kap. 1.2). Ähnlich den compytible solutes beeinflussen Gefrierschutzsubstanzen direkt und spezifisch kälte-sensitive Strukturen von Membranen, Proteinen und Enzymen (Schlee, 1986). Die drei tatsächlich im Eis bzw. an den Eisrändern vorkommenden Arten, wo die Temperaturen unter -2°C fallen können, akkumulieren in der Versuchsreihe V S/T (kombinierter Salz- und Temperaturstreß) mehr Prolin als bei 0°C mit ansteigenden externen Salinitäten.

Offensichtlich wird durch die tiefen Temperaturen eine gegenüber 0°C erhöhte Prolin-synthese induziert, die diese Arten zusätzlich vor den Auswirkungen tiefer Temperatu-ren (wie z.B. intrazellulärer Eisbildung) schützt. Tab. 5.2: Aufgelistet sind die Salinitäten (in PSU), bei denen die zelluläre Prolinkonzentration am höchsten ist. Mit Ausnahme von A. kufferathii, deren Prolinkonzentrationen bei der höchsten tolerierten Salinität maximal sind, verbleiben die Prolinkonzentrationen unter leichten Schwan-kungen auf dem Maximalniveau. Weitere Einzelheiten im Text. Kultivierungsbedingungen für den Langzeitversuch: Kap. 2.4. n = 3 Abkürzungen: V S/0 = Kultivierungstemperatur 0°C V S/T = Kultivierungstemperatur nahe Gefrierpunkt

Art

Max. Prolinkonzentration in V S/0 bei Salinität

[PSU]

Max. Prolinkonzentration in V S/T bei Salinität

[PSU]

Chaetoceros sp. 102 151

Co. pennatum 68 51

A. kufferathii 115 85

Ni. lecointei 85 85

Diskussion

149

Mit Ausnahme von A. kufferathii erhöhen sich die Prolinkonzentrationen nicht konstant

bis zur höchsten tolerierten Salinität, sondern erreichen eine Maximalkonzentration

(Tab. 5.2), die – unter leichten Schwankungen – während der nächsthöheren Salini-tätsstufen aufrechterhalten wird. In Co. pennatum und Ni. lecointei ist das Erreichen der Maximalkonzentrationen unabhängig von der Temperatur; Chaetoceros sp. akku-

muliert Prolin bei tiefen Temperaturen bis 151 PSU, bei 0°C jedoch nur bis 102 PSU. Die Akkumulationsmuster der übrigen Osmolyte sind mit dem des Hauptosmolyten vergleichbar. Bei dem Vergleich zwischen den bei 0°C gehälterten Kulturen (= reiner Salzstreß) mit den Kulturen der Versuchsreihe V S/T unter Einbeziehung aller unter-suchten Faktoren können folgende Aussagen getroffen werden: a) Co. pennatum reagiert am empfindlichsten auf Veränderungen sowohl der Salinität

als auch der Temperatur und ist nicht in der Lage, die Stoffwechselleistungen ent-sprechend anzupassen. Co. pennatum scheint gegenüber Temperaturveränderun-

gen sensibler zu sein als gegenüber Veränderungen der Salinität. b) Chaetoceros sp. und Ni. lecointei tolerieren beide hohe Salinitäten und tiefe Tem-

peraturen; Chaetoceros sp. (Zelltod bei 132 PSU / 0°C) reagiert sensibler auf rei-nen Salzstreß als Ni. lecointei, die Toleranz gegenüber kombiniertem Salz- und

Temperaturstreß ist dagegen größer. Interessanterweise sinkt die Prolinkonzentra-tion in beiden Arten bei der maximal tolerierten Salinität gegenüber den vorherigen

Werten stark ab. Dies könnten erste Anzeichen für instabil werdende Membranen sein, die einen ständigen Verlust intrazellulärer Substanzen bedeuten („leakage“) bzw. die Belastung durch ungehindert einströmende Ionen (vor allem Na+) erhöhen würden (Liu & van Staaden, 2000).

c) A. kufferathii akkumuliert im Gegensatz zu den anderen Arten bis zur maximal tole-

rierten Salinität bzw. Temperatur die analysierten Osmolyte (Ausnahme: Homarin bei 115 PSU / 0°C). Auch hier scheint der Zusammenbruch des Metabolismus und der Membranen plötzlich bei der nächsten stufenartigen Salinitätserhöhung bzw. Temperaturerniedrigung zu erfolgen. Eine moderatere Erhöhung der Salinität wür-de die Salinitätstoleranzgrenze wahrscheinlich etwas erhöhen; wie z.B. bei den Ex-perimenten von Bartsch (1989), in denen A. kufferathii eine Salinität von bis zu 150

PSU toleriert hat. Hier wurden die Salinitäten alle 2 Tage um etwa 5 PSU erhöht. Welche Rückschlüsse lassen sich nun aus den gemessenen Akkumulationsmustern auf den Metabolismus ziehen? Nach den Ergebnissen aus dem Osmolytenscreening verfolgen Chaetoceros und Ni. lecointei möglicherweise unterschiedliche Strategien: Chaetoceros sp. synthetisiert im Vergleich zu den FAS und organischen Osmolyten

Diskussion

150

hohe Prolinkonzentrationen, während Ni. lecointei mindestens vier – Glycinbetain,

DMSP, Prolin und einen Zucker – synthetisiert, diese allerdings in etwa gleichwertigen

Anteilen. Bartsch (1989) postuliert, daß Prolin in Eisdiatomeen nur bis zu einer Salinität von 90 PSU akkumuliert wird und bei weiterer Salinitätserhöhung konstant bleibt. Chaetoceros

sp. jedoch synthetisiert bis zu einer Salinität von 151 PSU ansteigende Prolinkonzen-trationen. Der Grund könnte in den verschiedenen Verlaufsformen der Experimente liegen: die genannte Autorin hat die Salinität der Kulturmedien alle zwei Tage durch Zugabe einer hochkonzentrierten Meersalzlösung um ca. 5 PSU erhöht, während in der vorliegenden Arbeit die Salinität zwar stufenweise erhöht worden ist, allerdings in größeren Zeiträumen von 2 – 4 Wochen, weil aus den Kurzzeitversuchen (Kap. 5.3) bekannt ist, daß ein Salzschock von 34 PSU eine Akklimatisationszeit von mind. 24 Stunden seitens der Eisalgen erfordert (vgl. auch Nothnagel, 1994). Zusätzlich muß berücksichtigt werden, daß Algen, die tiefen Temperaturen oder hohen Salinitäten aus-gesetzt werden, zunehmend physiologisch inaktiv sind (Übergang zur Dauersta-dienbildung, siehe unten). Die Zeit, die zur Akklimatisation notwendig ist, verfielfacht sich bei jeder weiteren Salinitätserhöhung und/oder Temperaturerniedrigung: in einer kleinzelligen Chaetoceros-Art, die in kombinierten Salinitäts- und Temperaturexperi-

menten hinsichtlich der Kohlenstoffassimilation untersucht worden ist, wurde bei z.B. 34 PSU eine schnellere Synthese von 14C-markierten Substanzen nachgewiesen als

bei –3°C und 55 PSU (Gleitz & Thomas, 1992). Eine weitere Bestätigung ergeben die P5CR-Aktivitäten, die gegenüber denen im Kurzzeitversuch ermittelten Anfangs-aktivitäten in-vitro von ca. 0,2 nkat/mg Protein unverändert sind. Nach der Akklimati-sation an die doppelte Meerwassersalinität von 68 PSU ist die P5CR-Aktivität in-vitro

gegenüber den Anfangswerten dagegen erhöht (vgl. Kap. 5.3). Wenn trotz einer wie-teren Salinitätserhöhung und der dadurch erforderlichen vermehrten Prolinsynthese die Aktivitäten wieder auf das Ausgangsniveau zurückgehen, zeugt das für einen reduzier-ten Stoffwechsel – dabei ist es zunächst von einer geringeren Bedeutung, ob diese Re-duktion auf dem Temperaturrückgang, wie aufgrund der Temperatur-Aktivitäts-Bezie-hung der P5CR-Aktivität zu vermuten ist, auf der hohen Salzbelastung oder auf einer Kombination beider Faktoren beruht. Für die Diskussion über mögliche in-vitro-Modifi-

kationen der Enzyme bzw. deren Regulation, die gegebenenfalls zu höheren Aktivitä-ten in-vivo führen könnten, sei auf die Kap. 5.3. und 5.4 verwiesen.

Reduzierte Stoffwechselaktivitäten aufgrund sinkender Temperaturen führen zu einer verminderten Energieversorgung, die zu einer Erhöhung der intrazellulären Ionenkon-zentration führen könnte. In den beiden Eisdiatomeen Chaetoceros sp. und Navicula

sp. ist der prozentuale Ionenanteil am osmotischen Potential unter Schwachlichtbedin-

Diskussion

151

gungen (5 µmol Photonen*m-2*s-1) höher als unter Starklichtbedingungen (50 µmol Photonen*m-2*s-1) (Nothnagel, 1994). Abnehmende Lichtintensitäten und die damit ein-

hergehende reduzierte Energieversorgung der Organismen führt zu der energiespa-renden Variante der osmotischen Akklimatisation (Kirst, 1995b). Weder in Chaetoceros sp. noch in Navicula sp. ändert sich die Vakuolengröße bei Exposition höherer Salinitä-

ten (Nothnagel, 1994). Aus diesem Grunde geht der Autor von einer Anreicherung der Ionen im Cytoplasma aus, wo deren inhibierende Wirkung durch die Akkumulation von compatible solutes kompensiert wird. Eine Änderung der Vakuolengröße im Rahmen eines Salzstresses wird als ein Indiz für die Funktion der Vakuole als Speicherkompar-timent angesehen (Kirst, 1989). Da die intrazelluläre Ionenkonzentration bereits bei ei-ner für Eisalgen geringen Erhöhung der Salinität von 34 auf 51 PSU ansteigt, ist von einer weiteren Erhöhung im Verlauf des Langzeitversuches auszugehen. Die Fähigkeit der vier Arten, erhöhte intrazelluläre Ionenkonzentrationen zu tolerieren, wird daher ei-ne wichtige Rolle im Zusammenhang mit der vertikalen Verteilung in der Eissäule spielen. Chaetoceros sp. und Navicula sp. (Nothnagel, 1994) zählen beide zu den K+-

Typen (Kirst & Bisson, 1979), d.h. sie nutzen bevorzugt K+ als ionische Komponente zur osmotischen Akklimatisation. Aufgrund fehlender Daten können A. kufferathii und Co. pennatum weder dieser noch der Na+-Gruppe zugeordnet werden. Die vergleichs-

weise niedrige Salinitätstoleranz beider Arten (85 bzw. 115 PSU als Maximum) wird als Anzeichen für eine Membrandestabilisierung und einen unregulierten Einstrom von Na+

in die Zellen angesehen. Wie bereits in Kap. 5.1 angedeutet, weist Prolin neben seiner hohen Löslichkeit (13 M in Wasser bei 20°C) gegenüber anderen organischen Osmolyten in seinen biophysika-lischen Eigenschaften einige Besonderheiten auf. Die folgenden Ausführungen sollen darstellen, aus welchem Grund a) gerade Prolin als hervorragendes compatible solute bzw. organisches Osmolyt gilt und b) welche Konsequenzen sich aufgrund der von den einzelnen Arten jeweils synthetisierten Konzentrationen auf die Adapationsstrategie er-geben.

Diskussion

152

Abb. 5.2: Kolloid-ähnliche Strukturen in einer Prolin-Wasser-Lösung. Die hydrophoben Berei-che der Prolinmoleküle („carbon“ und „nitrogen“) lagern sich zusammen; die hydrophilen („oxy-gen“ und „hydrogen“) sind nach außen gekehrt und assoziieren mit Wassermolekülen (Quelle: Schobert & Tschesche, 1978).

Steigende Prolinkonzentrationen zeigen eine ungewöhnlich hohe Gefrierpunkterniedri-gung (Schobert, 1977a), während sich die Aktivität von beispielsweise Glycin linear er-höht. Dieser als nichtideal bezeichnete Effekt von Prolin tritt bereits ab einer Konzen-tration von 0,04 M ein. Die für Prolin beschriebene Abweichung vom Idealverhalten ist

typisch für kolloidale Lösungen. Daher wird angenommen, daß Prolin Polymere formt, in denen die Pyrrolidinringe miteinander assoziieren und die hydrophilen Amino- und Carboxylgruppen nach außen gerichtet sind (Modell nach Schobert & Tschesche, 1978; vgl. Abb. 5.2). Die nach außen gerichteten Molekülreste bilden Wasserstoffbrük-kenbindungen mit den umgebenden Wassermolekülen. Durch die Polymerbildung der Prolinmoleküle erhöhen sich sowohl Dichte als auch Viskosität der Prolinlösung; der Effekt verstärkt sich mit zunehmenden Konzentrationen. Auf die gleiche Weise erhöht Prolin die Löslichkeit von Proteinen im Cytoplasma: die hydrophoben Bereiche des Proteins assoziieren mit den Pyrrolidinringen des Prolins, dessen polare Gruppen nach außen, also zur Oberfläche des Proteins gerichtet werden. Die hydrophoben Bereiche des Proteins werden sozusagen maskiert und in hydrophile verwandelt. Da die Löslich-keit des Proteins vom Verhältnis der hydrophilen zu den hydrophoben Resten abhän-gig ist, wird die Löslichkeit des Proteins durch die Prolinassoziation erhöht. Diese Cha-rakteristika der Prolin-Protein-Interaktionen werden anscheinend auch aufrecht erhalten, wenn das Wasserpotential des Zellsaftes sinkt und die Salzkonzentration sich erhöht. Diesem Modell setzen Carpenter & Crowe (1988) folgende Einschränkungen entgegen: Die Bindung von Prolin an ein Protein gilt nicht ubiquitär, sondern ist ab-

hängig von der Ladung des zu schützenden Objektes. Arakawa & Timasheff (1985)

Diskussion

153

haben gezeigt, daß Prolin von der Oberfläche des Lysozyms, eines Enzyms mit einem relativ großen Anteil polarer Seitenketten, ausgeschlossen ist. Dadurch wird das Aus-

schlußmodell auch für Prolin gültig (vgl. Kap. 5.1). Bei Proteinen mit einem großen

hydrophoben Anteil, wie z.B. dem β-Laktoglobulin, wird das Bindungsmodell nach

Schobert & Tschesche (1978) präferiert. Aber auch geladene Proteine werden durch hohe Prolinkonzentrationen (3 bis 4 M) geschützt. Die Ausführungen zeigen, daß eine möglichst hohe cytoplasmatische Prolinkonzentration für die Organismen in jedem Fall von Vorteil wäre. Um die Osmolytkonzentrationen verschiedener Arten bzw. Organismengruppen mit-einander vergleichen zu können, ist ein Bezug der ermittelten Konzentrationen auf das Zellvolumen notwendig. Von Ni. lecointei; A. kufferathii und Chaetoceros sp. sind die

Zellvolumina bei Exposition eines Salinitätsbereiches zwischen 17 und 68 PSU ermit-telt worden (Nothnagel, 1994; Wanzek, 1994). Obwohl nicht davon auszugehen ist, die der Zellvolumenbestimmung zugrunde liegenden Größen seien im Versuchsverlauf un-verändert geblieben (vgl. Kap. 5.1 und Kap. 5.3), beruht die weitere Diskussion auf die-ser Annahme, da keine entsprechenden eigenen Daten vorliegen. Als Grundlage wer-den die in Tab. 5.3 angegebenen Volumina verwendet.

Tab. 5.3: Absolute (in Klammern: osmotische) Zellvolumina der antarktischen Eisdiatomeen Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei. Die Zellen waren an 51 PSU, 0°C und 50 µmol Photonen*m-2*s-1 akklimatisiert.

Art Zellvolumen [µm3] Quelle

Chaetoceros sp. 58 (54) Nothnagel (1994)

A. kufferathii 7090,6 Wanzek (1994)

Ni. lecointei 996,5 Wanzek (1994)

Chaetoceros sp. bei bei 102 PSU Salinität eine Prolinkonzentration von 1,97 M (vgl. Tab. 5.4). Das ist eine annähernd 10mal höhere Prolinkonzentration als die von A. kuf-

ferathii bei derselben Salinität akkumulierte Menge, obwohl A. kufferathii als „Prolin-

alge“ bezeichnet wird (Bartsch, 1989). Selbst die Konzentration des zweiten Osmolyten Homarin ist in Chaetoceros sp. mit 0,7 M höher als die Prolinkonzentration von A. kuf-

ferathii. Die Bezeichnung „Prolinalge“ ist von der genannten Autorin wegen des star-

ken, prozentualen Anstiegs um den Faktor 10 zwischen 34 und 51 PSU und dem 50-fachen bis zu einer Salinität von 95 PSU gegenüber den Vergleichsarten Thalassiosira

antarctica und F. cylindrus gewählt worden. Die relativen Zunahmen geben jedoch

keine Auskunft über die tatsächlichen intrazellulären Konzentrationen, so daß die Be-

Diskussion

154

zeichnung „Prolinalge“ irreführend sein kann. Diese Auffassung wird durch die Arbeiten von Nothnagel (1994) und Wanzek (1994) gestützt. Die von Ni. lecointei akkumulierte Prolinmenge bei 102 PSU ist mit 0,03 M noch gerin-ger als die von A. kufferathii. Es stellt sich die Frage, ob diese geringe Konzentration wirksam ist. Die Brackwasserdiatomee Cyclotella cryptica akkumuliert bei einem Trans-

fer von 33% zu 80% Meerwasserkonzentration 20 mM Prolin (Liu & Hellebust, 1976b); einer Konzentration, die für einen Ausgleich des osmotischen Potentials als zu niedrig angesehen wird (Liu & Hellebust, 1976a). Die Konzentrationen der anderen Osmolyte liegen entsprechend den in Kap. 4.2 dargestellten Verhältnissen in A. kufferathii und Chaetoceros sp. weit unter denen von Prolin; nur die Glycinbetain- und DMSP-Konzentrationen von Ni. lecointei sind im unteren Salinitätsbereich denen von Prolin ähnlich (vgl. auch Tab. 5.4). Die höchste in Chaetoceros sp. gemessene Prolinkonzen-

tration erreicht 4,57 M bei einer Salinität von 151 PSU und einer Temperatur von –12°C. Mit denen in Chaetoceros sp. gefundenen Prolinkonzentrationen vergleichbare Mengen sind in verschiedenen Dunaliella-Arten (Glycerin) und in Halobakterien ge-

Tab. 5.4: Ausgewählte molare Osmolytkonzentrationen in den antarkischen Eisdiatomeen Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei im Langzeitversuch. Als Bezugsgröße dient das in Tab.5.3 angegebene Zellvolumen der Organismen. Einzelheiten zum Versuchsverlauf siehe Kap. 2.4. Abkürzungen: V S/0 = Kultivierungstemperatur konstant 0°C

V S/T = Kultivierungstemperaturen nahe Gefrierpunkt des Mediums

Art Prolin [M] bei 102 PSU / 0°C

Andere Osmolyte [M] bei 102 PSU / 0°C

Max. Prolinkonz. [M] in V S/0 bzw. V S/T

Chaetoceros sp. 1,97 0,70 (Homarin) 4,57 (151 PSU / -12°C)

A. kufferathii 0,20 0,03 (Betain) 0,01 (Homarin)

0,20 (115 PSU / 0°C)

Ni. lecointei 0,03 0,03 (Betain) 0,01 (DMSP)

0,04 (85 PSU / -6°C)

messen worden. Nach einem Salzschock wäre die energetisch favorisierte Maßnahme, das osmotische Gleichgewicht mit der Akkumulation von Ionen (hauptsächlich K+) wie-derherzustellen. Diese Art der Anpassung ist auf halophile Archaebakterien be-schränkt, die K+ bis zu einer Konzentration von 7 M akkumulieren können (Erdmann & Hagemann, 2001; Somero, 1992); Na+ wird ausgeschlossen (Yancey, 2001). Diese ho-hen Konzentrationen sind für die Halobakterien nicht toxisch, weil die in diesen Mikro-organismen enthaltenen Enzyme an die hohen intrazellulären Salzkonzentrationen adaptiert sind. Die bisher untersuchten Enzyme weisen einen im Vergleich zu den

Diskussion

155

mesophilen Bakterien hohen Anteil an sauren Aminosäureresten (Glutaminsäure und Asparaginsäure) auf (DasSarma & Arora, 2001). Die negativen Oberflächenladungen

verhindern die Denaturierung, Aggregation und Ausfällung in hochkonzentrierten Salz-konzentrationen und werden daher als wichtig für die Löslichkeit dieser halophilen Pro-teine angesehen (Günther & Dieckmann, 2001). Die gegenseitige Abstoßung der nega-tiv geladenen Carboxylgruppen führt zu einer Separation der Proteine. Sie bleiben in Lösung, solange einwertige Kationen (wie K+) diese Ladungskräfte neutralisieren (Somero, 1992; Hochachka & Somero, 1980). Aufgrund der geschilderten Toxizität akkumulieren alle anderen Organismen organi-sche Osmolyte. Dunaliella salina z.B. akkumuliert bei extrazellulären NaCl-

Konzentrationen von 5 M bis zu 7 M Glycerin im Cytoplasma; das Glycerin kann dabei bis zu 50% des Trockengewichtes einer Zelle ausmachen (Hernando et al., 2002). Der

Vorteil der Synthese – trotz des ca. 100mal höheren Energieaufwandes gegenüber ei-ner Ionenakkumulation (Oren, 1999) - liegt außerdem noch darin, daß die Organismen unabhängig von der extrazellulären Salzkonzentration ihre internen Komponenten bei-behalten können, also keine z.B. salzresistenten Enzyme zu entwickeln brauchten (Erdmann & Hagemann, 2001; Yancey et al., 1982; vgl. Kap. 5.1). Die im molaren Bereich liegenden Prolinkonzentrationen von Chaetoceros sp. bedeu-

ten eine bezüglich der osmotischen Dimension der Anpassung an die abiotischen Be-

dingungen in der Eissäule optimale Anpassung. Demgegenüber synthetisiert die in der Bodengesellschaft abundante A. kufferathii geringe Mengen dieses wichtigen Osmoly-ten. Selbst bei Addition aller idendifizierter Osmolyte erreicht A. kufferathii nicht die

Konzentrationen der kleinzelligen zentrischen Art (vgl. Tab. 5.4). Auf dieser Basis und vor dem Hintergrund der Temperatur- und Salinitätstoleranzgrenzen beider Arten kann von einer geringeren physiologischen Anpassungsfähigkeit von A. kufferathii ausge-gangen werden. Ni. lecointei, deren Konzentrationen von allen Arten am niedrigsten

sind, muß trotz der Vielzahl der synthetisierten organischen Osmolyte bzw. compatible solutes andere Eigenschaften aufweisen, die diese Art befähigen, bis 151 PSU sowohl in V S/T als auch in V S/0 zu überleben. Wie bereits angedeutet, werden die geringen Prolinkonzentrationen von Ni. lecointei nicht ausreichen, um das osmotische Potential auszugleichen. Selbst in Chaetoceros sp., bei der Prolin bei einer externen Salinität

von 51 PSU einen Anteil von 41% ausmacht (bei einer Prolinkonzentration von 500 mol*m-3), weist das interne gegenüber dem externen osmotischen Potential einen ne-gativen Wert auf (Nothnagel, 1994). Bei der Berechnung wurden Prolin, Homarin, or-ganische Säuren sowie ein- und zweiwertige An- und Kationen berücksichtigt.

Diskussion

156

Wie in Kap. 5.1 bereits erwähnt, gibt es Hinweise darauf, daß Chaetoceros sp. im Gegensatz zu A. kufferathii über speziell kälteangepaßte Enzyme (Schriek, 2000)

verfügt. Im polaren Meereis ist die extrazelluläre H2O2-Konzentration mit 350 bis 500 nM ver-hältnismäßig hoch (Neftel et al., 1984). Besonders in Streßsituationen erhöht sich die intrazelluläre Konzentration von H2O2 und anderen Sauerstoffradikalen (Foyer et al.,

1994) und kann zur Denaturierung von Proteinen, DNA-Destruktion und Peroxidation von Lipiden führen. Gerade in den oberen Eissäulenbereichen, in denen neben hohen Salinitäten und tiefen Temperaturen zusätzlich hohe Bestrahlungsstärken Streßreak-tionen hervorrufen kann, ist eine effektive Entgiftung wichtig. Chaetoceros sp. weist

bezüglich der Superoxid Dismutase und der Peroxidase eine speziell kälteangepaßte Enzymausstattung auf (Schriek, 2000). Zudem ist der Umsatz an reduziertem Glutathi-on (GSH) in Chaetoceros sp. höher als in A. kufferathii. Neben der Entgiftungsfunktion

für H2O2 ist GSH in den Schutz vor Inaktivierung durch Kälte involviert, indem es die SH-Gruppen der Proteine stabilisiert (Anderson et al., 1990). Die ineffektivere GSH-Nutzung von A. kufferathii könnte ein Grund für den Zelltod bei –7,5°C sein, während Chaetoceros sp. diese Temperatur noch toleriert (Schriek, 2000). Einen weiteren Vor-teil hat Chaetoceros sp. aufgrund seiner hohen Prolinkonzentrationen gegenüber den

anderen Arten im Rahmen der antioxidativen Streßbewältigung, da das Molekül lang-lebige Produkte mit freien Radikalen bilden und sie auf diese Weise entgiften kann (Jain et al., 2001). Glycinbetain ist in dieser Hinsicht ineffektiv (Smirnoff & Cumbes,

1989). Neben der Anpassung von Ionenkonzentrationen und osmotischem Gleichgewicht können auch die Membranen als Grenzschicht zwischen dem externen Milieu und dem Zellinneren bzw. den Organellen bei Salz- und Temperaturstreß verändert werden (Thomas & Dieckmann, 2002). In Anpassung an hyper- bzw. hypoosmotischen Streß ändern sich die Phospholipidzusammensetzung sowie der Gehalt und Charakter der Sterole und ungesättigten Fettsäuren, damit die Membranintegrität und –fluidität erhal-ten bleibt. Ansteigende Salinitäten bewirken eine Erhöhung des anionischen Lipidan-teils gegenüber dem zwitterionischen Anteil, was sich auf das Phasenverhalten der Membranen auswirken kann (Crowe et al., 1990). Ähnliche Modifikationen sind auch

bei Temperaturstreß festgestellt worden. Untersuchungen zur Fettsäure- und Sterolzu-sammensetzung in Abhängigkeit von Licht, Salinität und Temperatur hat keine keine Mechanismen ergeben, die auf eine unterschiedliche Anpassungsfähigkeit drei Eisal-genarten Chaetoceros sp., Ni. lecointei und A. kufferathii in Bezug auf deren vertikale

Verteilung in der Eissäule schließen lassen (Lehmal, 1999; Grabowski, 1997).

Diskussion

157

Abnahmen der zellulären Prolinkonzentrationen, wie sie in Co. pennatum, Chaetoceros sp. und Ni. lecointei (V S/0) kurz vor dem Zelltod festgestellt worden sind, interpretieren

Liu & van Staaden (2000) als das erste Anzeichen für einen unausbalancierten Meta-bolismus, der als Folge von Membran- und Energieschäden anzusehen ist. Die hohen Prolinkonzentrationen bei 151 PSU (V S/T) in Ni. lecointei werden in erster

Linie auf Fehler bei der Bestimmung der Zellzahl zurückgeführt. Bandurska (2000) da-gegen interpretiert den kurz vor dem Zelltod sehr stark angestiegenen Prolinkonzentra-tionen in NaCl-gestreßter Gerste auf den Zusammenbruch des Proteinmetabolismus als Folge von Membranschäden. Eine derartige Argumentation gilt für Ni. lecointei

nicht, da die Konzentrationen der anderen Osmolyte Betain, DMSP und des Zuckers ebenfalls ansteigen. Für einen Fehler bei der Zellzahlbestimmung spricht die Tatsache, daß die Zellen durch den großen Streß zunehmend empfindlicher gegenüber mechani-schen Einwirkungen geworden sind; ein Problem, daß auch bei langer Dunkelinkubati-on von Navicula sp. aufgetreten ist (Nothnagel, 1994). A. kufferathii, die eine verhält-

nismäßig dünne und empfindliche Schale besitzt, hat sich in Vorversuchen als ungeeignet für die Schalenpräparation (Kap. 2.11) erwiesen. Beide Befunde bestätigen die Vermutung, daß es während der Schalenpräparation von Ni. lecointei bei 151 PSU

zu Verlusten gekommen ist. Kürzlich sind in Eisdiatomeen für Kälteschockproteine (cold-shock proteins, CSPs) co-

dierende Gene sind nachgewiesen worden (T. Mock, pers. Mitteilung). CSPs sind klei-ne Proteine, die als Reaktion auf einen plötzlichen Temperaturabfall synthetisiert wer-den und von anderen Streßproteinen völlig verschieden sind. Bakterielle CSPs binden an DNS, RNS und Proteine und stabilisieren sie; der genaue Schutzmechanismus ist allerdings noch unklar (Gounot & Russell, 1999). Zusätzlich induzieren sie die Synthe-se weiterer Proteine (Wouters et al., 2001). CSPs unterschiedlicher Effizienz könnten

bezüglich der Adaptationsfähigkeit der verschiedenen Eisdiatomeenarten ebenfalls ei-ne Rolle spielen, obwohl sie nur vorübergehend akkumuliert und nach Beendigung des Akklimatistionsprozesses wieder katabolisiert werden (Yancey, 2001). Neben den geschilderten Maßnahmen zur Verbesserung der Kältetoleranz, wie Mem-bran- und Enzymmodifikationen, müssen sich die Eisalgen, wenn sie im Eis einge-schlossen werden, gegen intrazelluläre Eisbildung bzw. vor den Folgen extrazellulärer Eisbildung schützen. Intrazelluläre Eisbildung verursacht irreversible Schäden an der zellulären Ultrastruktur und verursacht dadurch den Zellltod. Gefrierresistenz (Definition siehe Kap. 1.2) können Zellen durch die Erniedrigung des cytoplasmatischen Gefrier-punktes erreichen, indem sie die Konzentration der gelösten Substanzen erhöhen. Wie bei Salzstreß könnten Ionen diese Funktion ausüben, haben jedoch bekanntlich in ho-

Diskussion

158

hen Konzentrationen toxische Auswirkungen auf den Metabolismus (Kinraide, 1999; Wiggins, 1990). Die von den Zellen synthetisierten niedermolekularen Osmolyte wirken

in diesem Zusammenhang nicht nur als Osmotika und stabilisierende compatible solu-tes, sondern gleichzeitig als gefrierpunktsenkende Agentien: Wie die im Vergleich zu der Kultivierungstemperatur von 0°C erhöhten Prolinkonzentrationen in der Versuchs-reihe V S/T bei den drei Arten Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei zeigen

(siehe Abb. 4.23a-d), wirken niedrige Temperaturen als induzierende Parameter für ei-ne gegenüber 0°C erhöhte Prolinsynthese. Am Beispiel des „Frostschutzmittels“ Glyce-rin als organische Polyhydroxyverbindung postulieren Hochachka & Somero (1980) folgende Wirkungsweise: Die Erniedrigung des Gefrierpunktes wird durch die Wech-selwirkungen zwischen den OH-Gruppen des Glycerins mit den Wassermolekülen über Wasserstoffbrückenbindungen verursacht. Die Wechselwirkungen zwischen den ein-zelnen Wassermolekülen wird auf diese Weise geschwächt und die Ausbildung eines Eiskristallgitters verhindert (vgl. auch Wiggins, 1990). Prolin wird durch ähnliche Inter-aktionen mit den Wassermolekülen denselben Effekt erzielen. Am Beispiel des arktischen Laufkäfers Pterostichus brevicornis zeigen unterschiedlich

hohe Glyceringehalte einen engen Zusammenhang zum Gefrierpunkt: Sommerkäfer mit einem Glyceringehalt von 1% sterben bei einer Temperatur von –6°C, Winterkäfer dagegen erst bei einer Temperatur von –35°C. Diese Tiere weisen einen Glyceringe-halt von 22% auf. Ähnliche Ergebnisse erbrachten Versuche mit der im Gezeitenbe-

reich vorkommenden und damit potentieller extrazellulärer Eisbildung ausgesetzten Miesmuschel Mytilus edulis und der submers lebenden Venusmuschel Venus merce-

naria (Hochachka & Somero, 1980). Co. pennatum als vorwiegend im Pelagial lebende

Art synthetisiert bei sinkenden Temperaturen nicht vermehrt Prolin oder einen der an-deren untersuchten Osmolyten; ein Zeichen dafür, daß sie mäßig sinkende Temperatu-ren zwar vorübergehend toleriert, die dadurch hervorgerufenen Effekte aber nicht wie die anderen Arten kompensieren kann. Neben der intrazellulären bildet auch die extrazelluläre Eisbildung Gefahrenpotentiale für die Eisalgen. Da sie sich ihrer nicht – wie z.B. Fische – durch Migration entziehen können, haben sie Mechanismen entwickelt, sie zu tolerieren. Da durch die Eisbildung die Salzlake in den Kanälen zurückbleibt, besteht die Gefahr des Zelltodes durch phy-siologische Austrocknung. Es wird vermutet, daß sich die in den oberen Eisschichten vorkommenden Arten einen zusätzlichen Schutz vor den extrem salinen und kalten Bedingungen schaffen, indem sie Substanzen synthetisieren, die sie durch Exsudation freisetzen und mit deren Hilfe sie ihre unmittelbare Umgebung modifizieren. Die beiden bipolaren Diatomeen Thalassiosira antarctica und Nitzschia frigida haben Mucopoly-

Diskussion

159

saccharide freigesetzt, nachdem sie aufgrund hoher externer Salinitäten kein Wach-stum mehr zeigten (Aletsee & Jahnke, 1992). Die Autoren sprechen dieser Substanz

eine zusätzliche Schutzfunktion gegen Gefrieren zu. Die Sole in den oberen Eisberei-chen weist eine gelartige Konsistenz auf, die sich möglicherweise durch die Exsudate begründen läßt. Es wird vermutet, daß Eisdiatomeen zwei Arten von Substanzen ab-geben: zum einen die bereits erwähnten Polysaccharide, die vor allem von Organis-men aus dichten Populationen abgegeben werden. Dieser die Zellen umgebene Biofilm verändert die Mikroumgebung um die Zelle. Es wird spekuliert, daß die Substanzen un-ter anderem vor Eiskristallschäden schützen und als Puffer gegen pH-Veränderungen wirken (Thomas & Dieckmann, 2002). Bei der zweiten Substanzgruppe, die exsudiert wird, handelt es sich möglicherweise um Glykoproteine (Thomas & Dieckmann, 2002; Raymond, 2000). Die genaue Funktion dieser auch als makromolekularen, eisaktiven Substanzen bezeichneten Stoffgruppe ist noch nicht bekannt. Die Substanzen binden bevorzugt an Eiskristalle, scheinen mit vielen Eisdiatomeen assoziiert zu sein und ha-ben ihre größte Aktivität im unteren Bereich der Eissäule. Nach Raymond (2000) könn-ten sie am Prozeß des Eiswachstums beteiligt sein und die Struktur der Laugenkanäle aufrechterhalten. Der genaue Mechanismus ist allerdings derzeit noch unbekannt. Eine weitere Möglichkeit der Modifikation der Eiskanäle ist die Abgabe von Fettsäuren oder Lipide seitens der Eisalgen. Im Salinitätsbereich zwischen 80 und 125 PSU steigt der intrazelluläre Gehalt von mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAS) und der Gesamt-

lipide (vgl. pers. Mitteilung von S. Günther an H. Lehmal (Lehmal, 1999); Seite 84). Es ist jedoch nicht belegt, ob Anteile dieser Substanzen auch von der Alge exsudiert wer-den. Im Salinitätsbereich zwischen 85 und 119 PSU (Versuchsreihe V S/T) wies das Pellet der pelletierten Chaetoceros-Kulturen beim Umsetzen eine gelartige Konsistenz

auf, vergleichbar mit einer sehr zähen, glycerinhaltigen Lösung. Daher wird von einer Abgabe an das Medium ausgegangen. Unter denselben Bedingungen kam es 3 bis 4 Tage nach dem Umsetzen nur in diesen Kulturen zu einem Gefrieren des Mediums; weder in der Nitzschia-Kultur, die in demselben Medium mit identischem Puffer kulti-

viert worden ist, noch in zellfreiem Kontrollmedium kam es zu einer Eisbildung. Wie von Brierley & Thomas (2002) postuliert, kann daraus auf eine Modifikation der Le-bensbedingungen in den Eiskanälen geschlossen werden. Als eiskernbildend („ice nucleating agents = INAs) werden Substanzen bezeichnet, die eine sogenannte hete-rogene Kristallisation auslösen. Die Gefriertemperatur in einer INA-haltigen Lösungen liegt durch Einflußnahme dieser Substanzen höher als die einer vergleichbaren INA-freien Lösung (Zachariassen, 1992). Chaetoceros sp. könnte mit Hilfe derartiger Sub-

stanzen die Ausbildung eines Eiskristallgitters in einer geeigneten Formation begünsti-gen. In Insekten sind Lipoproteine als INAs identifiziert worden, die einen Lipidanteil

Diskussion

160

von 51 Gewichtsprozent aufweisen (Duman et al., 1992). Die gelartige Konsistenz des

Algenpellets ließe sich durch einen derartigen Mechanismus erklären.

Nicht alle kryoprotektiven Substanzen haben eine gleich effektive Wirkung – ähnlich wie bei den compatible solutes: Viele physiologische Experimente zeigen, daß z.B. Po-lyole bei moderatem Salzstreß akkumuliert und bei sich verstärkenden Streßsituati-onen durch das effektivere Prolin ersetzt werden (Kap. 5.3). Nach Versuchen von Carpenter & Crowe (1988) weist Prolin im Vergleich zu Glycinbetain auch die besseren kryoprotektiven Eigenschaften auf. In Abhängigkeit von der ständig steigenden osmoti-schen bzw. temperaturbedingten Belastung wird Prolin von A. kufferathii und Ni. lecoin-

tei, ganz besonders von der letztgenannten, ab einer Salinität von 68 PSU gegenüber

den anderen Osmolyten verstärkt akkumuliert; allerdings nur in V S/T. Bei der Kultivie-rungstemperatur von 0°C bleiben die Verhältnisse etwa gleich. In Abhängigkeit von der Temperatur binden sich die compatible solutes an die Proteine („salting-in“) oder sind von der Proteinoberfläche ausgeschlossen (Arakawa et al.,

1990; zitiert nach Somero, 1992). DMSO und einige andere kryoprotektive Substanzen üben ihre Schutzwirkung nur bei niedrigen Temperaturen und in relativ geringen Kon-zentrationen aus, wie sie z.B. in Tetraselmis subcordiformis (Dickson & Kirst, 1986) mit

Werten um 250 mM vorkommen. Aufgrund von Experimenten und der strukturellen Ähnlichkeit von DMSP und DMSO sind beide Substanzen vermutlich in ihrer Wir-kungsweise ähnlich (Somero, 1992). Nach dem Autor beruht der unter bestimmten Be-

dingungen eintretende destabilisierende Effekt auf hydrophoben Interaktionen zwi-schen z.B. DMSO und unpolaren Seitenketten der Proteine: Je höher die Temperatur ist, desto stärker sind die hydrophoben Interaktionen, die schließlich zur Auffaltung des nativen Proteins führen können. Einen vergleichbaren Effekt könnten hohe Konzentra-tionen hervorrufen. Inwieweit diese Effekte auf die experimentellen in-vitro-Bedin-

gungen zurückzuführen sind, die mit den physiologischen Bedingungen nichts gemein haben, oder ob es sich um Erkenntnisse handelt, die auch in-vivo auftreten könnten, ist

nicht bekannt. Andere compatible solutes, wie Glycerin und zwitterionische Amino-säuren, weisen diese Eigenschaften nicht auf. Aufgrund der im Vergleich zu Tetrase-

lmis subcordiformis, einem Organismus mit hohem DMSP-Gehalt (Gröne & Kirst, 1991;

Dickson & Kirst, 1986), geringen Konzentrationen (vgl. Tab. 5.4) ist eine destabili-sierende Wirkung des DMSP in Ni. lecointei nicht zu erwarten.

DMSP kommt von den vier im Langzeitversuch verwendeten Arten nur in Ni. lecointei

vor. DMSP ist aufgrund seines klimarelevanten Spaltungsproduktes DMS (vgl. Kap. 5.1), zusätzlich zu seiner osmotischen Bedeutung für die synthetisierenden Organis-men, von Interesse.

Diskussion

161

DMSP hat in Ni. lecointei offenbar eine kryoprotektive Funktion, da die Konzentrationen

ab 119 PSU in der Versuchsreihe V S/T die DMSP-Konzentrationen bei 0°C überstei-

gen. DMSP ist als kryoprotektive Substanz auch in verschiedenen antarktischen Mak-roalgen (Karsten et al., 1990) und Mikroalgen (zusammengefaßt von Stefels 2000)

nachgewiesen worden. Zu berücksichtigen sind methodenbedingte, mögliche Unter-schätzungen der DMSP-Konzentrationen, besonders bei den hohen Salinitäten: Wäh-rend der Filtration können Zellen durch einen zu hohen Unterdruck zerstört werden; die Zellen, besonders die in der Versuchsreihe V S/0, scheinen dem lichtmikroskopischem Eindruck nach mit steigenden Salinitäten zunehmend empfindlicher gegenüber me-chanischem Streß zu werden (vgl. Argumentation zum Zellzahlfehler bei 151 PSU). Die tatsächlichen DMSP-Konzentrationen sind daher möglicherweise höher als angege-ben. Unter denselben Bedingungen (bei 119 PSU in V S/T) sinkt erstmals die Betainkonzen-tration unter die von DMSP. Wenn Organismen, wie in diesem Versuch Ni. lecintei,

sowohl DMSP als auch Glycinbetain synthetisieren, beeinflußt die Verfügbarkeit von Schwefel- und Stickstoffverbindungen, welche der beiden Verbindungen aufgebaut wird (Rhodes & Hanson, 1993). Neben der Nährsalzversorgung, die im Versuch keinen limitierenden Faktor darstellen sollte, können andere Gründe für die Umshiftung ver-antwortlich sein. Nach Hare et al. (1998) ist der DMSP- mit dem Glycinbetain-

Metabolismus eng verflochten, vermutlich über den Methyl-Zyklus. Dieser Zyklus könn-

te als eine Art Überlaufventil für Energie genutzt werden, wenn – wie im Versuch – trotz gleichbleibend hoher Lichtintensitäten aufgrund sinkender Temperaturen eine Stoffwechselreduktion eintritt. Die DMSP-Synthese ist für die Organismen vergleichs-weise teuer; die überschüssige Energie könnte auf diese Weise für die Synthese eines dem Glycinbetain in seiner Wirkungsweise ähnlichen compatible solute genutzt wer-den, anstatt Zellschäden zu verursachen. Möglicherweise besteht auch ein Zusam-menhang mit der sich unter denselben Bedingungen verändernden Pigmentzusam-mensetzung. Eisdiatomeen sind auch bei einer Temperatur von –15°C (T. Mock, pers. Mitteilung; die dieser Temperatur entsprechende Salinität beträgt in dem zu dieser Ar-beit durchgeführten Versuch 183 PSU) und trotz eines Wachstumsstops aufgrund nied-riger Temperaturen bzw. hoher Salinitäten (Aletsee & Jahnke, 1992) noch photo-synthetisch aktiv. Ab 132 PSU konnten mit der verwendeten spektralphotometrischen Methode keine Carotinoide mehr in Ni. lecointei nachgewiesen werden. Bei derselben

Salinität steigen die Chl.a- und Chl.c-Konzentrationen wieder an, die bei 119 PSU ein Minimum erreicht hatten. Ähnlich verhält es sich mit dem Chlorophyllgehalt in den Blättern von Brassica napus (Raps), der zunächst sinkt, wenn die Pflanze einem osmo-

tischen Streß ausgesetzt wird. Bei weiter sinkendem Wasserpotential steigt er aller-

Diskussion

162

dings wieder an: Die Autoren erklären dies mit einer nicht-spezifischen Inaktivierung von Enzymen wie der Chlorophyllase (Gibon et al., 2000). Die Pigmentkonzentrationen

von Chaetoceros sp. entwickeln sich wie die von Ni. lecointei. Chaetoceros sp. kann

überschüssige Energie über die sogenannte streßinduzierte Prolinsynthese verbrau-chen. Die Prolinsynthese über den Glutamatweg gilt auch als Schutzmechanismus vor Schäden durch Photoinhibition, da Reduktionsäquivalente verbraucht werden (Hare et

al., 1998). Nach Meinung der Autoren könnte der gesamte Zyklus der Prolinsynthese

und –degradation zur Aufrechterhaltung des zellulären Redoxpotentials in Streßsitua-tionen dienen. Ein weiteres Indiz für die These, daß physiologische Eigenschaften die Verteilung der Arten in der Eissäule widerspiegelt, sind Ergebnisse aus einem Studienprojekt mit Herrn L. Friedrichs. Die Sole in den oberflächennahen Eiskanälen kann einen pH-Wert um pH 9,8 erreichen (Gleitz et al., 1995). Im Projektversuch wurden Wachstumkurven von A. kufferathii und Chaetoceros sp. inklusive der intrazellulären Prolinkonzentratio-

nen bei 34 PSU und unterschiedlichen extrazellulären pH-Werten zwischen pH 6,5 und 10,5 aufgenommen. Ähnlich den Temperatur- und Salinitätsgrenzen besteht auch in der Toleranz externen pH-Werten gegenüber ein Unterschied zwischen den Arten: Chaetoceros sp. toleriert und vermehrt sich bei allen pH-Werten, während A. kufferathii

ab einem extrazellulären pH-Wert von 9,0 das Wachstum einstellt. Beide Arten synthe-

tisieren vermehrt Prolin bei höheren pH-Werten offenbar als Puffersubstanz gegenüber den hohen Ionenkonzentrationen. Gleitz et al. (1996) und Gleitz & Thomas (1993) füh-ren den Erfolg von Chaetoceros cf. neogracile auf die Fähigkeit dieser kleinzelligen Art

zurück, HCO3- auch bei hohen pH-Werten effektiv assimilieren zu können. Einige Nord-

see-Diatomeen, mit denen ähnliche Wachstumsexperimente wie im Projektversuch durchgeführt worden sind, zeigen eine wesentlich geringere pH-Toleranzbreite (S. Kühn, pers. Mitteilung); und auch Taraldsvik & Myklestad (2000) vermuten, daß sich die Toleranzbereiche von marinen und küstennahen Arten unterscheiden: In der Diato-mee Skeletonema costatum steigt der Glutaminsäuregehalt bei pH 9,4 stark gegenüber

den Konzentrationen um pH 8,0 an. Die Autoren führen den Anstieg auf Beeinträchti-gungen der Enzymfunktionen und/oder Veränderungen der Membrankonformation zu-rück, davon ausgehend, daß der interne dem externen pH-Wert entspricht. Ob Algen-zellen in der Lage sind, den inneren pH-Wert gegenüber dem äußeren in irgendeiner Form zu regulieren, ist noch unklar. Diatomeen haben zwei Möglichkeiten, ungünstige Bedingungen zu überdauern: durch die Bildung von Dauersporen oder Dauerstadien. Induziert werden diese sogenannten

Diskussion

163

Ruhestadien durch ungünstige Bedingungen (z.B. Nährsalzmangel, Lichtmangel oder -streß, Fraßdruck), wobei insbesondere Stickstofflimitation als wichtiger auslösender

Faktor gilt (Oku & Kamatani, 1999; Kuwata & Takahashi, 1999; Hargraves & French, 1983). Dauersporen zeichnen sich durch eine stark verdickte Silikatschale aus, wes-halb Diatomeen sie nur bei ausreichenden Silikatvorkommen bilden können (Oku & Kamatani, 1999). Dauerstadien sind äußerlich kaum von vegetativen Zellen zu unter-scheiden und entwickeln sich meist unter silikatlimitierenden Bedingungen. Sie weisen oft geschrumpfte, fragmentierte Chloroplasten, einen geringen Chlorophyll a-Gehalt und die Akkumulation von Fettsäuren auf (Zhukova & Aizdaicher, 2001; Kuwata et al.,

1993). In der Regel überleben die Dauersporen wesentlich länger als Dauerstadien (als Beispiel siehe Zusammenstellung in Hargraves & French (1983). Unter Stickstoffman-gelbedingungen (Plettner, 1997) und während einer wochenlangen Dunkelinkubation (Nothnagel, 1994) ist bereits die Bildung von Dauerstadien bei Ni. lecointei bzw. Chaetoceros sp. und Navicla sp. vermutet worden. Es ist davon auszugehen, daß auch

die im Lanzeitversuch untersuchten Arten Dauerstadien ausgebildet haben; zumal in den Kulturen von Co. pennatum und Chaetoceros sp. während der Kultivierung bei den

höchsten der tolerierten Salinitäten zusätzlich zu der schwachen Pigmentierung ge-schrumpfte Chloroplasten aufgefallen sind. Da Dauerstadien physiologisch nahezu in-aktiv sind, tritt dieser Zustand wahrscheinlich erst bei Salinitäten auf, bei denen die Prolinkonzentration im Vergleich zu der davor liegenden Salinitätsstufe nicht weiter er-

höht worden ist. Während des Versuches konnte in keiner der vier Arten die Bildung von Dauersporen beobachtet werden; es ist allerdings nicht auszuschließen, daß sie während der licht-mikroskopischen Kontrollen übersehen bzw. nicht erfaßt worden sind. Ungewöhnlich wäre das nicht, da bei den Kontrollen lediglich nur ein kleiner Teil der gesamten Kultur unter dem Lichtmikroskop betrachtet wird. Dauersporen von Diatomeen sind im Eis bisher allerdings nur vereinzelt gefunden worden (Peters & Thomas, 1996; Bartsch, 1989). In einigen Arten sind während des Osmolytenchecks (vgl. Kap. 5.1) anhand der Retentionszeiten Hydroxyectoin und Ectoin als Osmolyte identifiziert worden. Ectoine (Abb. 5.4) sind zyklisierte Aminosäurederivate und bilden eine eigene chemische Stoffklasse.

Diskussion

164

Abb. 5.4: Ectoin (links) und Hydroxyectoin (rechts) (http://www.uni-bonn.de/mibi/galins_d.html; Zugriff 19.04.02) Ectoin wurde als erstes in dem extrem halophilen Bakterium Ectothiorhodospira halo-

chloris, isoliert aus dem Wadi Natrum (Ägypten), identifiziert. E. halochloris akkumuliert Ectoin zusammen mit Glycinbetain und Trehalose als compatible solute (Hernando et

al., 2002). Die Gene für die Synthese von Ectoin und Hydroxyectoin wurden in-

zwischen auch aus vielen anderen Bakterien isoliert. Die Synthese von Ectoin startet mit Aspartatsemialdehyd und wird über drei enzymkatalysierte Reaktionen zum Pro-dukt Ectoin umgesetzt (Galinski, 1995). Der Biosyntheseweg für Hydroxyectoin ist noch nicht aufgeklärt und verläuft wahrscheinlich analog (Galinski, 1995). Die im Osmolytenscreening festgestellten Vorkommen konnten im Langzeitversuch für A. kufferathii und Ni. lecointei bestätigt werden. Die Konzentrationen in Ni. lecointei

sind mit durchschnittlich 1 fmol/Zelle verschwindend gering; die Ectoine könnten auf-grund der geringen bakteriellen Kontamination der Kulturen allein auf diese zurück-zuführen sein. In A. kufferathii sind die Ectoinmengen jedoch vergleichsweise hoch und

übersteigen die von Betain und Homarin. Die Ectoine sind mit der Quacsmethode

(Kap. 2.6.3) identifiziert und quantifiziert worden. Wie in Kap. 3.1 erläutert, ist diese Methode für die Detektion der Quacs und Ectoine nur mit Einschränkungen zu verwen-den. Die Konzentrationen der Ectoine sind daher aufgrund von störenden Substanzen stark überschätzt. Die hohen Ectoinkonzentrationen in A. kufferathii treten ab 68 PSU

auf, vor allem in der Versuchsreihe V S/0. Bei 85 PSU und 115 PSU (0°C) sind ver-stärkt Bakterienkontaminationen im Lichtmikroskop festgestellt worden, so daß die Vor-kommen auf sie zurückgeführt werden können. Es sind allerdings auch in axenischen Kulturen von A. kufferathii geringe Mengen an Ectoin bzw. Hydroxyectoin nachgewie-

sen worden, so daß bei dem derzeitigen Kenntnisstand eine Synthese seitens der Eis-algen zwar nicht völlig auszuschließen, aber eher als unwahrscheinlich anzusehen ist. Eine Überprüfung der Ergebnisse mit anderen Methoden, wie z.B. eine Derivatisierung nach alkalischer Hydrolyse mit 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Chlorid (FMOC) nach Kunte et al. (1993) oder ein C-13 NMR-Spektrum, sind aus Zeitgründen nicht weiter

verfolgt worden.

Diskussion

165

Zusammenfassung

Die vier antarktischen Diatomeen Chaetoceros sp., Co. pennatum, A. kufferathii und Ni. lecointei zeigen physiologische Eigenschaften, die mit ihrer vertikalen Verteilung in

der Eissäule konform gehen. Chaetoceros sp. und Ni. lecointei weisen die größten Toleranzbereiche bezüglich der Temperatur, Salinität und pH-Wert (nur Chaetoceros sp.) auf, während A. kufferathii,

die vorwiegend im Boden- und Untereis zu finden ist, und die hauptsächlich planktisch lebende Co. pennatum wesentlich weniger anpassungsfähig sind.

Die aus dem Osmolytenscreening bekannte Zusammensetzung organischer Osmolyte hat qualitativ keine Veränderung erfahren. Die einzige Ausnahme bildet Chaetoceros

sp., die in der Versuchsreihe V S/T, also bei sinkenden Temperaturen, eine weitere, nicht identifizierte Substanz synthetisiert. Da diese Substanz nur in Zellen der Ver-suchsreihe V S/T mit der Quacsmethode (vgl. Kap. 2.6.3 und Kap. 3.1) detektiert wer-den konnte, ist von einer durch tiefe Temperaturen induzierten Substanz mit einer

möglichen kryoprotektiven Wirkung auszugehen. Mit steigender Streßbelastung erhöht sich in allen Arten die Bedeutung von Prolin als compatible solute. Mit Ausnahme von Co. pennatum akkumulieren die Diatomeen Prolin auch als kryoprotektive Substanz

vermehrt bei der Kultivierung in V S/T im Vergleich zur konstanten Kultivierungs-temperatur von 0°C. Die bereits in Kap. 5.1 geäußerte Vermutung, Chaetoceros sp. und Ni. lecointei nutzten

verschiedene Strategien, um sich an die hohen Salinitäten und tiefen Temperaturen anzupassen, hat sich bestätigt: Chaetoceros sp. akkumuliert Prolin bis zu einer Kon-

zentration von 4,5 M (151 PSU) und scheint diese aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften sehr effektive Substanz in allen Streßsituationen zu nutzen. Zudem schafft sie sich offenbar im Eis, möglicherweise durch die Exsudation bestimmter Sub-stanzen, ein eigenes Mikroklima. Ni. lecointei dagegen synthetisiert maximal 40 mM

Prolin; die Konzentrationen der anderen Osmolyte liegen noch darunter. Da die akku-mulierten Mengen nicht ausreichen, um das osmotische Potential auszugeglichen, han-delt es sich hier entweder um eine besonders salztolerante Art, wie bereits vermu-tet und wie die Überlebensfähigkeit bei 151 PSU in sowohl V S/0 als auch V S/T be-legt, oder/und sie synthetisiert weitere, noch nicht bekannte organische Osmolyte.

Diskussion

166

5.3 Kurzzeitversuch

5.3.1 Prolinkonzentrationen in Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. le-cointei

Die Zeit, die Eisdiatomeen benötigen, um nach einem Salzschock die intrazelluläre Prolinkonzentration an die erhöhte Salinität anzupassen, scheint von mehreren Fakto-ren abhängig zu sein. Da sie offensichtlich keine, an die tiefen Temperaturen der Ant-arktis angepaßten Enzyme besitzen (Kap. 5.4), dauert die Anpassung bei ihnen, im

Gegensatz zu temperierten einzelligen Algen (Dickson & Kirst, 1986; Liu & Hellebust, 1976a) Stunden bis Tage statt Minuten bis Stunden. Die temperierte Diatomeenart Phaeodactylum tricornutum benötigt entgegen der zuvor gemachten Angaben mit ca.

60 Stunden mehr Zeit als die Eisalgen für die Akklimatisation, um die Prolinkonzentra-tion nach einem Salzschock von 770 auf 1300 bzw. 2000 mosmol/kg anzupassen (Schobert, 1977b). Diese lange Zeit ist ungewöhnlich für eine temperierte Art. Leider hat die Autorin keine Angaben über Wachstumsbeginn der Kulturen gemacht, was, wie später noch zu erläutern sein wird, ein wichtiges Kriterium sein könnte, denn die Ver-laufskurven für die Prolinakkumulation von P. tricornutum sind denen der Eisalgen ähn-

lich. Da auch die Bezugsgröße (mg Prolin*mL-1 gepackte Zellen) eine andere als die hier verwendete ist, entfällt eine Diskussion über mögliche Gründe für die lange Akkli-matisationsphase gegenüber den Eisalgen. Es liegen keine weiteren Vergleichsdaten für Diatomeen vor, denn die Daten von Cyclotella cryptica sind aufgrund eines völlig

anderen Versuchsansatzes nur bedingt vergleichbar; zudem erstreckt sich der Bepro-bungszeitpunkt nur über die ersten vier Stunden nach dem Salzschock (Liu & Helle-bust, 1976a; Liu & Hellebust, 1976b). In-vitro Aktivitätstests der P5CR aus Chaetoceros sp. zeigten eine nur von der Tempe-

ratur abhängige Reaktionsgeschwindigkeit zwischen –4°C und 35°C (Abb. 4.38). Auch wenn die P5CR in den meisten Organismen nicht das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Prolinsynthese darstellt (zusammengefaßt von Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Hare et al., 1999), ist doch davon auszugehen, daß die Prolinsynthese aufgrund

der niedrigen Temperaturen gegenüber temperierten Arten verlangsamt abläuft. Dieser scheinbare Nachteil ist für die Algen im Eis eher irrelevant, da sich die Bedingungen im Eis i.d.R. langsam verändern und die Salinität entsprechend langsam ansteigt, als daß sie – wie im Experiment - einem plötzlichem hyperosmotischem Schock ausgesetzt werden.

Diskussion

167

Ein Faktor, der auf die Akklimatisationszeit Einfluß nimmt, ist die Schockgröße. Nach einem Salzschock von 34 auf 51 PSU benötigt Chaetoceros sp. 8 Stunden, um die in-

trazelluläre Prolinkonzentration an die erhöhte Salinität anzupassen (ähnliche Ver-suchsbedingungen wie in dieser Arbeit; Nothnagel, 1994); bei einem Salzschock von 34 auf 68 PSU sind es ca. 40 h (Tab. 4.14). Ähnlich ist es bei der Grünalge Stichococ-

cus bacillaris (Ahmad & Hellebust, 1993) und der Coccolithophoride Hymenomonas

carterae, deren DMSP-Konzentrationen je später ihre Endkonzentration erreichen de-sto größer der hypersaline Schock war (Vairavamurthy et al., 1985). Wie in Kap. 5.4 und bei der Diskussion über die Reaktionen von Chaetoceros sp. unter Einbeziehung

weiterer Faktoren näher erörtert werden wird, ist die verlängerte Reaktionszeit offenbar auf die notwendige Mehrakkumulation zurückzuführen. Inwieweit ein durch die einge-drungenen Ionen verstärkt gehemmter Syntheseapparat an der langsameren Anpas-sung beteiligt ist, kann ohne weitere Versuche nicht beantwortet werden. Des weiteren werden andere Stoffwechselvorgänge, wie z.B. die Aminosäuren- und Proteinsynthese, von hyperosmotischen Schockerereignissen beeinflußt. Beide Prozesse werden umso stärker und länger inhibiert, je größer das Schockereignis gewesen ist. Bei Ni. lecointei konnte im Gegensatz zu den anderen beiden Arten eine Erniedrigung

der Prolinkonzentration nach etwa 40 h beobachtet werden. Zum gleichen Zeitpunkt begannen die Zellen, sich wieder zu teilen. In dem von Nothnagel (1994) durchgeführ-ten Versuch sank die Prolinkonzentration nach 48 h gegenüber der nach 24 h von ca

250 auf 225 mol*m-3 ab; auch dieses wurde mit starkem Zellwachstum begründet. Nie-renzellen akklimatisieren sich an hohe Osmolalitäten durch die Synthese von compati-ble solutes und Hitzeschockproteinen (Hsps = heat shock proteins). Während der Ak-klimatisationsphase verzögert sich der Zellzyklus in der G2/M-Phase (Dmitrieva et al.,

2001). Die Autoren vermuten, daß diese Verzögerung, die auf einen NaCl-Streß und auch auf andere Streßereignisse folgt, die notwendige Zeit für adaptive Prozesse und/oder Reparaturmaßnahmen zur Verfügung stellt, damit gefährliche Mutationen nicht in die Tochterzellen übertragen werden. Der Beginn der Zellteilungen kann folg-lich als Maß für eine vollständige Akklimatisation angesehen werden. Eine Wachstums-verringerung ist wahrscheinlich auf eine Erhöhung der intrazellulären Ionenkonzen-tration und die Regulation bzw. Synthese von Prolin und anderen organischen Osmoly-ten zurückzuführen (Munns et al., 1983). Die Tatsache, daß in Ni. lecointei sowohl die

Prolinakkumulation am schnellsten abgeschlossen als auch das Wachstum als erstes wieder eingesetzt hat, ist ein Indiz für die hohe Salztoleranz dieser Art verglichen mit den beiden anderen (vgl. auch Kap. 5.1 und Kap. 5.2). Aus welchem Grund in Chaeto-

ceros sp. und A. kufferathii keine Abnahmen der Prolinkonzentration aufgetreten sind,

kann nur vermutet werden. Beide Arten haben Prolinendkonzentrationen erreicht, die in

Diskussion

168

der Größenordnung derer liegen, die im Langzeitversuch für 68 PSU und 0°C ermittelt worden sind. Die Kulturen befanden sich zum Erntezeitpunkt in der spätlogarithmi-

schen bis stationären Wachstumsphase, in der Prolin noch nicht verstärkt als Reserve-substanz akkumuliert wird (vgl. Kap. 5.1). Im Gegensatz dazu hat Ni. lecointei im Ver-

gleich zum Langzeitversuch etwa doppelt so viel Prolin als Reaktion auf den hyperos-motischen Schock akkumuliert, die bei dem wieder einsetzenden Wachstum als zusätzliche C- bzw. N-Quelle genutzt werden kann. In höheren Pflanzen wird oft nach Streßereignissen eine Prolindegradation beobachtet, wobei die Iminosäure als C-, N- und Energiequelle genutzt werden kann (Hare et al., 1998). Inwieweit die Abnahme mit den Konzentrationen der anderen Osmolyte, die in Ni. lecointei in ähnlichen Konzentra-

tionen wie Prolin synthetisiert werden, korreliert ist, kann nur abgeschätzt werden (sie-he unten), da Untersuchungen zu dieser Fragestellung nicht durchgeführt worden sind. Möglicherweise kommt dem Zucker, der in Ni. lecointei gefunden worden ist, als

physiologisch „billiges“ Osmolyt eine Bedeutung zu. Er könnte zeitgleich mit Prolin akkumuliert werden, ähnlich wie es in der marinen Mikroalge Stichococcus bacillaris

mit Prolin und Sorbitol geschieht (Ahmad & Hellebust, 1988). Die Röhrenkultivierung von Ni. lecointei, durch die die Zellen ständig durchmischt wer-

den, verhindert die Bildung einer Diffusionsbarriere direkt an den Zellen, die eine gleichmäßige Versorgung mit Nährsalzen verhindert hätte. In verschiedenen Vorversu-

chen zur Kultivierung dieser Art in Erlenmeyerkolben, im Rolltanks oder in Kulturröhren mit ständiger Begasung ergab sich langfristig kein Unterschied in Wachstumsverhalten oder Prolinkonzentration (Daten nicht gezeigt). Eine kurzfristige Unterversorgung mit Nährsalzen bei den beiden anderen Arten, die in Erlenmeyerkolben gehältert worden sind, ist allerdings auch eher unwahrscheinlich, da die Kulturen einmal pro Stunde ge-schüttelt worden sind und sie sich innerhalb dieser Zeit nicht auf dem Boden abgesetzt haben. Wenn trotzdem eine Nährsalzunterversorgung in den Zellen bestanden hätte, wäre der Prolinanstieg in den Zellen nicht linear verlaufen, sondern während der 2 Pro-benentnahmepausen (2 – 10 h und 26 – 33 h nach dem Salzschock) abgeflacht (als Beispiel Abb. 4.32b A. kufferathii).

Die Zellgröße und damit das Zellvolumen sind Faktoren, die bezüglich der osmotischen Akklimatisation eine wichtige Rolle spielen. In kleineren Zellen hat eine auf die Zellzahl bezogene Konzentration „x“ einen größeren Anteil am osmotischen Potential als in größeren Zellen. Ähnliches gilt für den cytoplasmatischen Anteil am Gesamtzellvolu-men: je größer der Vakuolenanteil ist, desto mehr konzentrieren sich die Osmolyte im Cytosol. Um die Ergebnisse der Osmolytkonzentrationen mit denen anderer Spezies vergleichen zu können, wären volumenbezogene Konzentrationsangaben sinnvoll; für

Diskussion

169

die Berechnung osmotischer Gesamtbilanzen sogar notwendig (vgl. Kap. 5.1). Gerade die Diatomeen zeigen aufgrund ihres speziellen Teilungsmodus ein sehr differenziertes

Größenspektrum. Zellbezogenen Konzentrationsangaben können daher zu Fehlein-schätzungen führen. Die Zellvolumina aller drei Arten verringern sich bei langfristigen Expositionen bei 51 bzw. 68 PSU und führen zu einer Erhöhung des Oberflächen-Volu-menverhältnisses (Nothnagel, 1994; Wanzek, 1994); über kurzfristige Veränderungen bei hyperosmotischen Schockereignissen liegen keine gesicherten Daten vor. Die Zell-zahlen für diesen Versuch wurden mit dem Coulter Counter bestimmt, der gleichzeitig ein Größenspektrum aller gezählten Partikel ermittelt. Im Versuchsverlauf verschob sich das Spektrum aller drei Arten in Richtung Zellvergrößerung (möglicherweise auf Veränderungen in der Struktur der Gürtelbänder zurückzuführen), nur bei Ni. lecointei

wurden am Ende des Versuchs die Ausgangswerte wieder erreicht. Der Rückgang der Prolinkonzentration in Ni. lecointei könnte z.T. auf die beschriebenen Größenverän-

derungen zurückzuführen sein; wie groß sie sein könnten, müßte durch speziell aus-gelegte Versuche ermittelt werden. Der Anstieg der Prolinkonzentration verläuft in allen drei Arten linear und ohne lag-Phase, so daß davon auszugehen ist, daß keine neuen Enzyme zusätzlich synthetisiert werden. Möglicherweise werden bereits vorhandene Enzyme aktiviert, wie es für Cya-nobakterien und andere Algen bereits vermutet worden ist (Ahmad & Hellebust, 1993;

Dickson & Kirst, 1986). Bei der Synthese von mehreren compatible solutes als Reakti-on auf einen hyperosmotischen Schock verläuft die Akklimatisation offenbar differen-zierter: nach Salzschockereignissen verschiedener Stärke akkumuliert die Prasinophy-cee Tetraselmis subcordiformis von den gemessenen vier organischen Osmolyten

DMSP, Homarin, Glycinbetain und Mannitol nur letzteres ohne lag-Phase; vermutlich werden bereits vorhandene Enzyme des Mannitolsyntheseweges aktiviert. Die Synthe-se der drei anderen Verbindungen als Folge des Streßereignisses begann erst 3 Stun-den nach Beginn der hyperosmotischen Belastung. Dickson & Kirst (1986) vermuten, daß für die Akkumulation der drei Osmolyte Homarin, Glycinbetain und DMSP Enzyme de-novo synthetisiert werden müssen. Anschließend wird als weitere Akklimatisations-

phase eine Art „Feinabstimmung“ mit den genannten Substanzen vorgenommen. Eine ähnliche, „gestaffelte“ Akklimatisation ist auch in den Eisdiatomeen wahrscheinlich: nach Ergebnissen aus Praktikumsversuchen beginnt die Akkumulation von DMSP in Ni. lecointei nach einem hyperosmotischen Schock von 34 auf 68 PSU und 0°C erst

rund 10 Stunden nach Beginn des hyperosmotischen Schocks. Andere Untersuchun-gen an verschiedenen Tetraselmis-Arten (O. Wandschneider, pers. Mitteilung) deuten

auf eine allgemein gültiges Schema hin. Aus diesem Grund wird DMSP oft nicht als

Diskussion

170

Osmolyt bezeichnet, der für die strikte Aufrechterhaltung bzw. Wiederherstellung des osmotischen Gleichgewichtes genutzt wird, sondern eher als zusätzliches compatible

solute (Stefels, 2000; vgl auch Kap. 5.1 und 5.2). Parallel zur Prolinakkumulation nach dem Salzschock wurden während des Versuchs-verlaufs 2 Tagesgänge gemessen. Im Gegensatz zu Arabidopsis thaliana, die eine kla-

re diurnale Oszillation im Licht-Dunkel-Rhythmus zeigt, und zwar nicht nur im Prolinge-halt, sondern auch in den den Prolin DH und P5CS zugehörigen mRNA-Mustern (Hayashi et al., 2000), ist bei den drei untersuchten Arten keine klare Tendenz zu er-

kennen. Tagesgänge bei 34 PSU, bei denen eine engmaschigere Beprobung vorge-nommen worden ist, bestätigen das vorliegende Ergebnis. Wie als Beispiel in Abb. 5.4 dargestellt ist, lassen sich die Veränderungen im Tagesverlauf eher auf eine Zunahme während des Zellzyklus als auf eine Tagesrhythmik zurückführen.

0

2

4

6

8

10

12

xPr

olin

[fmol

/Zel

le]

0,0·107

0,5·107

1,0·107

1,5·107

2,0·107

2,5·107

3,0·107

3,5·107

Zellz

ahl/1

0mL

8 10 13 15 18 20 23

Uhrzeit

Abb. 5.4: Tagesverlauf der intrazellulären Prolinkonzentration in Chaetoceros sp. und der ermit-telten Zellzahlen. Die Zellen befanden sich in der spätlogarithmischen Wachstumsphase. Salini-tät: 34 PSU, 0°C und Licht-Dunkel-Rhythmus von 12 : 12 Stunden (8 – 20 Uhr Licht; 40 µmol Photonen*m-2*s-1). Die Standardabweichungen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt (n = 3); bis auf die Prolinwerte um 8 Uhr und um 22 Uhr (<1,0) bewegen sie sich in der Größenordnung von ± 0,5. Zellzahl / 10 mL Prolin [fmol/Zelle]

Diskussion

171

5.3.2 Prolinstoffwechsel am Beispiel von Chaetoceros sp. nach einem hyperosmotischen Schock

Es sind zwei Stoffwechselwege beschrieben, über die Prolin gebildet werden kann: der erste hat L-Glutaminsäure als Ausgangssubstanz, der zweite L-Ornithin (vgl. Kap. 1.2). Prolinakkumulation kann aus verschiedenen Stoffwechselvorgängen resultieren: a) Hemmung der Prolinoxidation (-degradation), b) Erhöhung der Biosynthese über Glu-taminsäure oder Ornithin, c) Verminderung der Proteinsynthese bzw. der Nutzung von Prolin als Substrat für andere metabolische Funktionen, d) Hydrolyse von Proteinen (Charest & Phan, 1990) und e) den Verlust der Feedback-Kontrolle der Prolinsynthese durch steigende Prolinkonzentrationen (Paleg et al., 1985). Ein Großteil der zum Pro-

linmetabolismus veröffentlichten Arbeiten bezieht sich auf höhere Pflanzen, Bakterien und Tiere; über den Prolinstoffwechsel und dessen Regulation in Algen gibt es relativ wenig Informationen. In höheren Pflanzen ist es erst in den letzten etwa 7 Jahren auf-

grund molekulargenetischer Methoden gelungen, genauere Untersuchungen zur Enzymatik des Prolinstoffwechsels zu erlangen (Kuznetsov & Shevyakova, 1999; siehe auch Darstellung Abb. 5.5). Die Schwierigkeit in den Untersuchungen ergibt sich aus den relativ geringen Aktivitäten und den oft mit Membranen assoziierten Enzymen. In welchem Ausmaß sich bei der Diversität des Prolinmetabolismus grundlegende Regu-lationsmechanismen in marinen Algen im allgemeinen und Eisdiatomeen im besonde-ren von denen in höheren Pflanzen unterscheiden, ist schwer abzuschätzen. Im folgenden soll die Akklimatisation von Chaetoceros sp. an eine erhöhte Salinität von

68 PSU in zwei Phasen betrachtet werden: Die erste Phase betrifft die Tage direkt nach dem Salzschock auf enzymatischer Ebene unter Mitberücksichtigung der FAS, also die Zeitspanne der Akklimatisation. Die zweite Phase beschreibt die Verhältnisse der untersuchten Faktoren 6 Tage danach zu einem Zeitpunkt, an dem sich die Algen an die erhöhte Salinität vollständig angepaßt haben (Kap. 5.3.1). In den ersten drei Tagen nach dem hyperosmotischen Schock ist in Chaetoceros sp.

wie bei den höheren Pflanzen der Glutaminsäureweg verstärkt aktiv: die Aktivität der P5CS steigt ohne lag-Phase bereits innerhalb der ersten 2 h nach dem hyperosmoti-schen Schock an; gleichzeitig erhöht sich die intrazelluläre P5C-Konzentration. Diese

Erhöhung ist auf eine in den ersten Tagen unverändert bleibende P5CR-Aktivität zu-rückzuführen.

Diskussion

172

Abb. 5.5: Prolinstoffwechsel in Pflanzen, wie er auch in Eisdiatomeen möglich wäre. Dargestellt sind neben den am Prolinstoffwechsel direkt beteiligten Ausgangssubtraten (grün), Produkten (rot) und Intermediaten (P5C und P2C) weitere Substanzen, die als Lieferanten für die Prolin-synthese und Regulation im Zusammenhang stehen und deren Bedeutung im Text näher erläu-tert wird. Auf die Darstellung der spontanen Zyklisierung zwischen P5C und GSA wird der Übersicht wegen verzichtet; ebenso wie die Enzyme (blau) ohne Cosubtrate angegeben sind; Details dazu werden unten angegeben. Der Harnstoffzyklus ist ebenfalls nur unvollständig dar-gestellt. Die Abbildung wurde nach Vorgaben von Sanchez et al. (2001); Roosens et al. (1999); Forlani et al. (1997) und Dashek & Erickson (1981) erstellt. Abkürzungen und (Co-) Substrate der Enzyme: Mitochondrium, umgebener Bereich: Cytosol und Chloroplasten GS: Glutamin Synthetase (ATP, NH4) GOGAT: Glutamin:2-Oxoglutarat-Aminotransferase (NAD(P)H oder Ferredoxinred.) P5CS: P5C Synthase (Hybridenzym) bzw. γ-Glutamyl Kinase / Glutamat-5-Semialdehyd DH

(ATP, NADPH) P5CR: P5C Reductase (NAD(P)H, P5C: Pyrrolin-5-Carboxylsäure) δ-OAT: δ-Ornithin-Aminotransferase (2-Oxoglutarat, Pyridoxalphosphat) α-OAT: α-Ornithin-Aminotransferase;

nach Bishop et al. (Bishop et al., 1994): L-Aminosäuren Oxidase P2CR: P2C Reductase (NAD(P)H, P2C: Pyrolin-2-Carboxylsäure) Pro Ox.: Prolin oxidierende Enzyme: Prolin DH (NAD(P)+); Prolin Oxidase (FAD+) P5C DH: NAD(P)+ GSA: Glutamat-γ-Semialdehyd Die Synthese, Akkumulation und Degradation von Prolin sind hochgradig regulierte und komplexe Prozesse, die über das einfache Schema der reziproken Regulation von P5CS und der Prolin oxidierenden Enzyme hinausgehen. Tatsächlich sind viele weitere Faktoren an der Regulation und Expression der Enzyme beteiligt. Sobald die erhöhten Salinitäten von den Zellen erkannt werden, wird eine Signalkette aktiviert, an der Ca2+ beteiligt ist (Erdmann & Hagemann, 2001; Lee & Liu, 1999; Bressan et al., 1998). De-

tails über die Art der Signaltransduktion und die Partizipation des Stresses an sich sind

Ornithin

P5C

Prolin P2C

Glutamat

Ornithin

Arginin

Citrullin

Arginino-succinat

Aspartat

Prolin

Glutamat

Asparagin

P5C

Glutamin

Citrullin

Arginase

δ-OAT

α-OAT

P5CR

P2CR

P5CR

P5CS

P5C

Pro Ox.

P5C DH

GSGOGAT

Ornithin

P5C

Prolin P2C

Glutamat

Ornithin

Arginin

Citrullin

Arginino-succinat

Aspartat

Prolin

Glutamat

Asparagin

P5C

Glutamin

Citrullin

Arginase

δ-OAT

α-OAT

P5CR

P2CR

P5CR

P5CS

P5C

Pro Ox.

P5C DH

GSGOGAT

Diskussion

173

noch unbekannt. Der Akklimatisationsprozeß wird über spezifische Genexpression ge-steuert. Welche Gene exprimiert werden, ist abhängig von der Art des Stressors

und/oder vom Entwicklungsstatus, letzteres gilt besonders für mehrzellige Organismen. Unter Salzstreß werden spezielle „Osmogenes“ aktiviert, die eine Vielzahl von Protei-nen codieren. Zu diesen Proteinen zählen z.B. Chaperone, Proteasen und deren Inhibi-toren sowie Enzyme für die Synthese von compatible solutes (Kuznetsov & Shevyako-va, 1999; Verma, 1999; Le Rudulier et al., 1984). Eine Zusammenfassung der bekann-

ten Regulationsmechanismen auf molekularer Ebene geben Kuznetsov & Shevyakova (1999) und Hare et al. (1999). In Abb. 5.6 ist in stark vereinfachter Form dargestellt,

wie man sich die regulatorische Genexpression am Beispiel der P5CS und der Prolin oxidierenden Enzyme vorstellt. Die Synthese von P5C über die P5CS ist die geschwindigkeitsbestimmende Reaktion in der Prolinsynthese (Hong et al., 2000; Verma, 1999). Da die P5CS-Aktivität in Chae-

toceros sp. ohne lag-Phase ansteigt, ist von einer Aktivierung bereits vorhandener Pro-

teine auszugehen (Erdmann & Hagemann, 2001). Die erhöhte Aktivität könnte auf ge-speicherte mRNA zurückzuführen sein (Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Hare et al.,

1999), deren Translation zu einer schnellen Enzymsynthese ohne lag-Phase führt. Zu-sätzlich kann nicht ausgeschlossen werden, daß inaktive Formen der P5CS in Chaeto-

ceros sp. vorhanden sind, die durch spezielle Aktivatoren, entweder Proteine oder se-

cond messenger, die bei Salzstreß freigesetzt werden, in die aktive Konformation überführt werden. In Vigna aconitifolia und Arabidopsis ist in Streßsituationen die

Hemmung der P5CS durch Prolin herabgesetzt und dadurch die Feedback-Regulation verändert (Hong et al., 2000). Die Autoren vermuten, daß dabei die Konformation der

vorhandenen P5CS-Enzyme geändert wird, beispielsweise über die Änderung einer Seitenkette. Augenblickliche Regulation kann auch über Modulation erfolgen (Hochachka & Somero, 1980). Die Aktivität der regulatorischen Proteine wird durch Modulatoren beeinflußt, welche die Aktivität am aktiven Zentrum des Enzyms, bei der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, beeinflussen. Denn die Geschwindigkeit der Enzymreaktion wird im wesentlichen durch die freie Aktivierungsenergie bestimmt (sie-he Kap. 5.4). Eine Erniedrigung der Aktivierungsenergie im Rahmen einer Kälte- oder Salzanpassung würde die Effizienz der Enzymreaktion erhöhen. In Triticum aestivum

(Weizen) beispielsweise sinken im Rahmen einer Kälteakklimatisation von 15°C auf 5°C die Aktivierungsenergien der Ornithin Transaminase von durchschnittlich 41,1 KJ*mol-1 auf 37,7 KJ*mol-1 ab (Charest & Phan, 1990), was zu einer vermehrten Prolin-synthese führt. Enzymmodulatoren haben wenig chemische Gemeinsamkeiten mit den Substrat-, Produkt- oder Cosubstratmolekülen. Bindungszentren für die Modulatoren

Diskussion

174

Abb. 5.6: Stark vereinfachtes, schematisches Modell für die Regulation der Prolinbiosynthese und –degradation unter Normal- Streßbedingungen. A) Normalbedingungen. B) Aktivierte P5CS-Synthese bei gleichzeitig gehemmter Expression des für die Prolin Oxidase codierenden Gens. P5CS: P5C Synthase, POX: Prolin Oxidase, En: Enhancer, S: Silencer, AAA: Poly-A-Ende, TATA: Bereich, der in die Transkriptionkontrolle involviert ist, PK: Protein Kinase, P: Phosphatase cytoplasmatisches Regulatorprotein: unter Normalbedingungen (a) inaktiv, unter Streßbe-dingungen (b) mit einer großen Affinität zum En-Bereich des P5CS-Gens und zum S-Bereich des POX-Gens . Ribosom. Die Stärke der Pfeile symbolisiert die Aktivität. Hemmung. Der Ornithinweg wird in diesem Modell nicht berücksichtigt (Quellen: Kuznet-sov & Shevyakova, 1999; Hare et al., 1999).

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS gene

POX gene

P5CS

POX

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS genePOX gene

P5CS

POX

P

PK

Osmotischer Streß

Kälte, Salz

Kälte

a

b

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS gene

POX gene

P5CS

POX

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS gene

POX gene

P5CS

POX

En S EnTATA

En S EnTATA

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAAmRNA AAA mRNA AAAmRNA AAA

Nucleus

P5CS gene

POX gene

P5CS

POX

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS genePOX gene

P5CS

POX

P

PK

Osmotischer Streß

Kälte, Salz

Kälte

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAA

Nucleus

P5CS genePOX gene

P5CS

POX

P

PK

Osmotischer Streß

Kälte, Salz

Kälte

En S EnTATA

En S EnTATA

En S EnTATA

En S EnTATA

mRNA AAA mRNA AAAmRNA AAA

Nucleus

P5CS genePOX gene

P5CS

POX

P

PK

Osmotischer Streß

Kälte, Salz

Kälte

a

b

Diskussion

175

sind die allosterischen Zentren, die mit dem aktiven Zentrum für die eigentliche kataly-tische Reaktion nichts zu tun haben.

Die meisten untersuchten Organismen beginnen erst nach einer lag-Phase mit der Pro-linakkumulation, d.h. die erhöhten P5CS-Aktivitäten beruhen auf Neusynthese (z.B. in Oryza sativa; Igarashi et al., 1997) oder im marinen Copepoden Tigriopus californicus (Burton, 1991). Interessanterweise akkumulieren die euryhalinen Mikroalgen Chlorella

autotrophica und Stichococcus bacillaris Prolin ebenfalls ohne lag-Phase (Ahmad &

Hellebust, 1988). Auch diese Autoren gehen von einer veränderten Regulation des Prolinmetabolismus aus. Möglicherweise ist die Regulation in marinen Mikroalgen ge-nerell von der Regulation der höheren Pflanzen abweichend. Die P5CS-Aktivität in Chaetoceros sp. hat sich 42 h nach dem Salzschock nochmals

erhöht und könnte ihren Ursprung in einer Neusynthese von P5CS haben. Eine Neu-synthese zu einem früheren Zeitpunkt erscheint unwahrscheinlich: Bei 20 bis 30°C wird für die de-novo-Synthese von Enzymen, ausgehend von der Transkription, ein Zeit-

rahmen von mindestens 30 bis 90 Minuten veranschlagt. Geht man von einer reinen Translation vorhandener mRNA aus, so könnte bei 0°C die Zeitspanne bis zur ersten Probenentnahme nach dem Salzschock (1,5 h) bei Chaetoceros sp. für eine teilweise

Neusynthese aufgrund der verlangsamten Stoffwechselraten nicht ausreichend sein. Auch in Oryza sativa entstanden klare mRNA-Signale (Northern Blot) erst innerhalb

von 10 Stunden nach Beginn einer Salzexposition, die sich bis zur 24. Stunde verstärk-ten (Igarashi et al., 1997). In den bereits erwähnten marinen Mikroalgen C. autotrophi-

ca und S. bacillaris wurde die Proteinsynthese die ersten 30 Minuten nach einem Salz-

schock eingestellt und erreichte erst nach der vollständigen Akklimatisation wieder volle Aktivität (Ahmad & Hellebust, 1988). Eine ähnliche Reaktion könnte auch in Chaetoceros sp. zu der verspäteten Steigerung der P5CS-Aktivität nach 42 Stunden

geführt haben. Eine weitere Erklärung für die höhere Aktivität wäre die Expression eines zweiten Enzymes, das die Reaktion von Glutaminsäure zu P5C katalysiert. In Ly-

copersicon esculentum (Tomate) werden über zwei Genloci verschiedene Enzyme mit derselben Funkion codiert (Fujita et al., 1998; Garcia-Rios et al., 1997): ein Locus co-

diert für die beiden Enzyme γ-Glutamyl Kinase und Glutamat-5-Semialdehyd DH, die

u.a. in Bakterien als Komplex die einzige bisher bekannte Form zur Synthese von P5C via Glutaminsäure bilden (Hayzer & Leisinger, 1983). Beide Enzyme liegen als Kom-

plex vor, unter anderem um das instabile Zwischenprodukt γ-Glutamyl-Phosphat zu

schützen (zusammengefaßt von Treichel, 1986). Der zweite Locus codiert für die P5CS, evolutionär wahrscheinlich ein Hybrid aus den beiden zuvor genannten Enzy-men (Fujita et al., 1998). Inzwischen sind ebenfalls in Arabidopsis thaliana beide Loci

Diskussion

176

identifiziert worden (siehe Review von Kuznetsov & Shevyakova, 1999), so daß beide Formen in Eukaryoten verbreitet sein könnten. Es gibt Hinweise auf deren Aktivierung durch unterschiedliche Stressoren (Hong et al., 2000; Hare et al., 1999).

Neben dem Glutaminsäureweg kann P5C (und damit Prolin) auch via Ornithin über die OAT synthetisiert werden. In der Rotalge Gracilaria tenuistipitata beispielsweise wird

bei Hitzestreß der Ornithinweg für die vermehrte Synthese von Prolin aktiviert (Chang & Lee, 1999; Lee, 1998a) und gleichzeitig der Glutaminsäureweg gehemmt. Die Fakto-ren, die zu einer Aktivierung des Ornithinweges führen, sind in anderen Organismen al-lerdings nicht derartig eindeutig wie in G. tenuistipitata; vor allem das Stickstoffangebot

scheint eine entscheidene Rolle zu spielen. Kuznetsov & Shevyakova (1999) postulie-ren in ihrem Review, daß der Ornithinweg bei Streßexposition und gleichzeitigem NH4-Überschuß aktiviert wird. Andere Ergebnisse wiederum, wie z.B. Untersuchungen an Phaseolus vulgaris (Grüne Gartenbohne), zeigen, daß der Ornithinweg auch unter

Normalbedingungen höhere Aktivitäten aufweist als der Glutaminsäureweg, sofern die Stickstoffversorgung ausreichend ist (Sanchez et al., 2001). Da in dem durchgeführten

Versuch Stickstoff keinen limitierenden Faktor dargestellt hat (siehe unten: Glutamin-zu-Glutaminsäure-Verhältnis), könnte eine Prolinsynthese auch über die OAT möglich sein. Eventuell wird deren Aktivität auch nur vorübergehend erhöht, wie es in G. tenui-

stipitata beobachtet worden ist (Lee, 1998b); allerdings bleibt die Aktivität der P5CS

von G. tenuistipitata konstant, während die von Chaetoceros sp. weiter steigt. Mögli-

cherweise shiftet die Prolinsynthese vom Ornithinweg wieder zurück zum Glutaminsäu-reweg, da die Verfügbarkeit von FAS sinkt (siehe unten). In Chaetoceros sp. konnte

keine OAT-Aktivität nachgewiesen werden (vgl. Kap. 5.4). Eine Prolinsynthese über Ornithin sollte dennoch vorhanden sein, da die Prolinsynthesebilanz, bezogen auf die Enzymaktivitäten pro Stunde, im Verlauf der Akklimatisation ansonsten unstimmig wä-re: In den ersten Stunden nach dem Salzschock werden 1,95 fmol*Zelle-1*h-1 Prolin synthetisiert. Die P5CS weist jedoch nur eine Aktivität von 0,97 fmol*Zelle-1*h-1 Prolin auf. Die P5CR zeigt mit 1,81 fmol*Zelle-1*h-1 Prolin eine ausreichende Syntheselei-stung. Logische Konsequenz wäre das Vorhandensein einer weiteren P5C-Quelle, die nur via Ornithin ausgefüllt werden kann. Ein Indiz dafür sind die Konzentrationen ande-rer FAS: Arginin, das über den Harnstoffzyklus einen Vorläufer für Ornithin darstellt, weist eine Zunahme von 0,5 fmol*Zelle-1*h-1 auf und würde die Bilanz verbessern, so-fern eine 100%ige Umsetzung zu Prolin vorausgesetzt wird. Während sich die Konzentration des einzigen nachweisbaren Zwischenproduktes der Prolinsynthese, des P5C, innerhalb der ersten vier Tage nach dem hyperosmotischen

Diskussion

177

Schock nahezu vervierfacht, bleibt die Aktivität der P5CR konstant. Für eine optimale Prolinakkumulation wäre eine parallel zur P5CS-Aktivität ansteigende P5CR-Aktivität

zu erwarten gewesen, auch wenn die P5CR nicht als geschwindigkeitsbestimmendes Enzym in der Prolinsynthese angesehen wird (Verma, 1999). Erhöhte P5C-Gehalte gelten in mehreren Pflanzen als Induktor für die Expression von osmotisch regulierten Genen (Hua et al., 2001; Hong et al., 2000; Iyer & Caplan, 1998). Die Expression der

P5CR wird zwar im Anschluß an den Beginn des Salzstresses ebenso erhöht wie die der P5CS, die Translation aber zunächst noch gehemmt, um den P5C-Level erhöht zu halten. Dieses Phänomen der leicht verspäteten P5CR-Aktivierung ist z.B. in Arabi-

dopsis beobachtet worden (Hua et al., 2001). Die nach 6 Tagen erhöhte P5CR-Aktivität bei gleichzeitiger Abnahme der P5C-Konzentration in Chaetoceros sp. scheint diesem

Zusammenhang zu entsprechen. Erkenntnisse über intrazelluläre P5C-Konzentrationen respektive deren Verlauf nach Streßereignissen sind rar. Hua et al. (2001) haben in Arabidopsis einen fünffachen An-

stieg der P5C-Konzentrationen gemessen; die Ergebnisse waren allerdings aufgrund methodischer Schwierigkeiten nicht reproduzierbar. Das Problem liegt in der Schwierig-keit, P5C a) in stabiler Form zu isolieren (vgl. Kap. 2.9 und Kap. 3.4) und b) in nach-weisbaren Mengen extrahieren zu können, da die Konzentrationen als Intermediat mit schnellem Turnover sehr gering sind (Hua et al., 2001; Treichel, 1986). P5C neigt bei

neutralen pH-Werten und Konzentrationen von mehr als 50 mM zur Polymerisation, so

daß Maßnahmen zur Aufkonzentrierung, wie z.B. mittels Lyophilisation, ungeeignet sind (zusammengefaßt von Williams & Frank, 1975). Beide Probleme sind durch die HPLC-Methode gelöst worden, da durch den sauren und kalten Aufschluß mit TCA das P5C weder von Enzymen umgesetzt noch durch Polymerisierung Verluste entstanden sind. Die in dieser Arbeit dargestellten Messungen beinhalten zwar pro Probenent-nahme lediglich 2 Parallelen, die Konzentrationen stimmen jedoch mit denen der Vor-versuche überein. Zusätzlich weist A. kufferathii ein vergleichbares Akkumulations-muster nach einem hyperosmotischen Schock wie Chaetoceros sp. auf; mit der Zell-

größe entsprechenden höheren Konzentrationen (Daten nicht gezeigt). Die Interpreta-tion der vorliegenden Ergebnisse ist schlüssig, dennoch sollte berücksichtigt werden, daß noch keine Daten über P5C-Konzentrationen während der verschiedenen Wach-stumsphasen vorliegen, die die gewonnenen Erkenntnisse relativieren könnten. Zu-sätzlich kommt erschwerend hinzu, daß P5C nicht nur das Zwischenprodukt bei der Synthese via Glutaminsäure ist, sondern ebenfalls als Produkt der OAT und der Prolin oxidierenden Enzyme Prolin DH und Prolin Oxidase auftritt. Neben den angespro-chenen Regulationsmöglichkeiten können in-vivo Modifikationen an den Enzymen vor-

genommen werden, die z.B. zu einer veränderten Substrataffinität vor allem bei der

Diskussion

178

Langzeitakklimatisation führen. Diese Modifikationsmöglichkeiten werden in Kap. 5.4 diskutiert.

Die Aktivitäten der P5CS steigt in zwei Stufen an (siehe oben), die P5C-Konzentrationen linear. Neben den bereits angesprochenen Faktoren könnte eine vor-übergehende Aktivierung der Prolindegradation ein Grund sein. Generell werden zwar bei Streßexposition die den ersten Schritt katalysierenden katabolen Enzyme ge-hemmt, um die Akkumulation von Prolin zu ermöglichen (Girija et al., 2002; Sanchez et

al., 2001; Hayashi et al., 2000; Ramanjulu & Sudhakar, 2000; Lee & Liu, 1999). Dies gilt vermutlich auch für die Diatomee Phaeodactylum tricornutum (Schobert, 1980).

Vorübergehend kann die Aktivität dieser Enzyme allerdings auch erhöht und Prolin als schnell verfügbarer Energielieferant genutzt werden. Bei anhaltenden Streßbedingun-gen werden die Aktivitäten entsprechend der erforderlichen Prolinakkumulation ange-paßt, indem regulatorische Proteine aktiviert werden und auf verschiedenen Zellebe-nen Modifikationen des Katabolismus initiieren (Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Hare et al., 1999). Gerade in den Chaetoceros-Arten mit ihren hohen Prolinbasiskonzentrati-

onen könnte die Iminosäure eine derartige Funktion erfüllen. Da keine Aktivitäten der katabolen Enzyme gemessen worden sind (vgl. Kap. 4.4 und Kap. 5.4) und die Prolin-akkumulation ohne lag-Phase und linear verläuft, ist diese Annahme jedoch rein speku-lativ.

6 Tage nach dem Schockereignis stellt sich ein etwas verändertes Bild dar: die Aktivität der P5CS ist auf das Ausgangsniveau zurückgegangen, die der P5CR gestiegen und die intrazelluläre P5C-Konzentration liegt zwischen Ausgangs- und Kurzzeitstreßni-veau. Die erhöhte P5CR-Aktivität könnte für den Rückgang der P5C-Konzentration ge-genüber den ersten Tagen nach dem hyperosmotischen Schock verantwortlich sein. Die P5C-Konzentration ist als gegenüber dem Ausgangswert bei 34 PSU möglicher-weise weiterhin leicht erhöht, weil die ständige Syntheseleistung bei 68 PSU höher sein wird als bei 34 PSU, um das Prolinniveau halten zu können. In diesem Fall würde die P5C-Konzentration als Induktor für die Prolinsynthese wirken, wie oben bereits er-wähnt. Die nach erst nach 6 Tagen erhöhte Aktivität der P5CR entspricht der Theorie, daß die P5CR bei Streß (Hua et al., 2001; Ramanjulu & Sudhakar, 2000) aktiviert wird,

die Translation aber direkt nach dem Streßereignis vorübergehend gehemmt ist (siehe oben). Die mit der Aktivität bei 34 PSU vergleichbare P5CS-Aktivität zusammen mit erhöhten P5C-Konzentrationen bei gleichzeitig gestiegener P5CR-Aktivität lassen auch den Schluß zu, daß die Prolinsynthese nach 6 Tagen anteilig über Ornithin abläuft. Weiter-

Diskussion

179

hin können die veränderten Aktivitäten mit den oben bereits erwähnten und im folgen-den Kap. 5.4 zu diskutierenden in-vivo-Modifikationen der Enzyme im Zusammenhang

mit einer gegenüber 34 PSU verstärkten Hemmung der Prolinoxidation stehen. Salzstreß führt zu vorübergehenden, aber auch zu anhaltenden Veränderungen des Proteinmusters. In Chaetoceros sp. steigen die Proteinkonzentrationen vorübergehend

an. Neben der diskutierten möglichen Neusynthese von in den Prolinmetabolismus in-volvierten Enzymen ist eine Synthese von Streßproteinen möglich. Streßproteine sind in der Regel nur vorübergehend in den Zellen zu finden, um kurz nach Eintritt eines Streßereignisses den Metabolismus bei dessen Bewältigung zu unterstützen. Die Syn-these von Streßproteinen ist eines der bemerkenswertesten Umshiftungen im Metabo-lismus. Untersuchungen an Cyanobakterien zeigen die Beteiligung einer Vielzahl von Genen an der Streßantwort; in Anabaena torulosa sind z.B. etwa 100 Gene gefunden

worden (zusammengefaßt von Erdmann & Hagemann, 2001). Die Gesamtkonzentration der FAS (ohne Prolin) in Chaetoceros sp. steigt nur in den

ersten Stunden nach dem hyperosmotischen Schock vorübergehend leicht an. 42 h nach dem Schock erreichen die Konzentrationen nur noch 50% im Vergleich zu 34 PSU. Ausgehend von den Prolinkonzentrationen, ist die Akklimatisation an 68 PSU zu diesem Zeitpunkt beendet (siehe oben). Die Tendenz von Chaetoceros sp. bestätigt

sich, nach Akklimatisation an höhere Salinitäten die FAS-Konzentrationen (ohne Prolin) zugunsten der von Prolin abzusenken (vgl. Kap. 5.1). Die Erhöhung der FAS-Konzentrationen 2 h nach dem hyperosmotischen Schock aufgrund von Proteolyse ist eher unwahrscheinlich, da der Proteingesamtgehalt nicht sinkt. Die Erhöhung könnte als Folge eines durch den Salzschock aktivierten Metabolismus auftreten, der wegen der intrazellulären Umorganisationen (siehe oben) einen Mehrbedarf an FAS hat. Gleichzeitig erfüllen die FAS eine osmotische Funktion (Clark, 1985). Die Glutaminsäurekonzentration als direkter Vorläufer der Prolinsynthese über den Glutaminsäureweg bzw. als Schlüsselsubstanz in der Stickstoffassimilation sinkt im Gegensatz zu der von Arginin sofort nach dem hyperosmotischen Schock ab (Ornithin als direkter Vorläufer für Prolin via dem Ornithinweg konnte nicht gemessen werden). Eine erhöhte Argininsynthese könnte mit einer Aktivierung des Ornithinweges einher-gehen, wie Untersuchungen mit Oryza sativa bei Kupferstreß ergeben haben: Die Ar-

gininkonzentrationen steigen zusammen mit P5CR- und OAT-Aktivitäten an, während die Glutaminsäurekonzentration sinkt (Chen et al., 2001; Chen & Kao, 1993). Die nach-

folgende Abnahme der Argininkonzentration bei gleichzeitig gleichbleibender bis leicht erhöhter Glutaminkonzentration spricht für das vermutete Umshiften vom Ornithin- zum

Diskussion

180

Glutaminsäureweg, das aufgrund der veränderten P5CS-Aktivitäten wahrscheinlich ist (siehe oben). In Cyclotella cryptica verläuft die Prolinsynthese nach einem Salzschock

ebenfalls sowohl über Glutaminsäure als auch über Ornithin: neben vor allem Prolin, dem Endprodukt, und den beiden genannten Aminosäuren werden auch Glutamin, Ar-ginin und Asparaginsäure mit 14C markiert, das als 14CO2 vor Versuchsbeginn zugege-ben worden ist (Dashek & Erickson, 1981; Liu & Hellebust, 1976b). Asparaginsäure ist aufgrund seiner Vorläuferfunktion für Asparagin und Arginin in die Prolinsynthese in-volviert. In Chaetoceros sp. ist die Asparaginsäurekonzentration mit durchschnittlich

0,5 fmol/Zelle in den ersten Tagen nach dem hyperosmotischen Schock deutlich höher als in den an 51 PSU bereits adaptierten Zellen des Osmolytenscreenings (Kap. 5.1), was ebenfalls ein Argument für eine Einbeziehung des Ornithinweges in die salzstreß-induzierte Prolinsynthese ist. In einem Parallelversuch wurden C. cryptica entweder 14C-markiertes Arginin, Glutaminsäure oder Ornithin mit Beginn eines Salzschocks an-geboten; die Prolinsynthese erfolgte am schnellsten mit Ornithin als Substrat (Liu & Hellebust, 1976a; Liu & Hellebust, 1976c). Eine Stickstoffmangelsituation während des Versuches erscheint unwahrscheinlich, da die als primäre Stickstoffspeicher geltenden Aminosäuren Glutamin, Asparagin und Ar-ginin im Vergleich zu denen der anderen FAS immer realtiv hoch konzentriert waren (0,3 – 1,0 fmol/Zelle). Unter Stickstoffmangelbedingungen sanken in Ni. lecointei so-

wohl bei 34 PSU als auch bei 51 PSU die Konzentrationen von Glutamin und Aspara-gin unter die Nachweisgrenze (Plettner, 1997). Das Glutamin-zu-Glutaminsäure-Verhältnis weist im Zeitverlauf Werte deutlich über 0,1 auf. Nach der Definition von Flynn (Flynn, 1990a; vgl. Kap. 1.2) ist im Versuchsverlauf eine ausreichende Stickstoff-versorgung gewährleistet; weitere Untersuchungen an Cyanobakterien und Mikroalgen bestätigen die positive Korrelation von Stickstoffstatus und dem genannten Verhältnis (vgl. Kap. 1.2 und Lohrenz & Taylor, 1987). Zusätzlich zu den genannten Faktoren wird auch dem GS-GOGAT-System (siehe Kap. 1.2; Abb. 1.13) eine regulatorische Funktion in der Prolinsynthese zugesprochen, das Glutamin bzw. Glutaminsäure direkt unter Streßbedingungen für die Prolinsynthese be-reitstellt (Brugière et al., 1999). In Mikroalgen und Oryza sativa verändern sich nach ei-

nem Salzschock kurzfristig die Aktivitäten der GS und der GDH (aminierende Reaktion, vgl. Abb. 1.13) (Lutts et al., 1999; Ahmad & Hellebust, 1988). Die Autoren begründen

diese Veränderung mit dem hohen Stickstoffbedarf aufgrund der Prolinsynthese und vermuten, daß die GDH an der Bereitstellung von Glutaminsäure für die Prolinsynthese beteiligt ist. Abnehmende Glutaminsäurekonzentrationen bei gleichzeitg steigenden Glutaminkonzentrationen gelten als Indikator für vermehrte Ammoniumassimilation

Diskussion

181

über das GS-GOGAT-System zur Bereitstellung von Stickstoff für die Prolinsynthese (Syrett, 1981; zitiert nach Al-Amoudi & Flynn, 1989). In Tetraselmis marina ist die Ab-

nahme von Glutaminsäure als Zeichen einer aktivierten Aminosäurensynthese interpre-tiert worden, da Glutaminsäure die Vorläufersubstanz für Glutamin, Prolin und Arginin ist (Al-Amoudi & Flynn, 1989).


5.4.1 Enzymnachweis

P5C Synthase

Wie bereits in Kap. 5.3 diskutiert, wird Prolin entweder über den Glutaminsäure- und/oder den Ornithinweg synthetisiert. Der Glutaminsäureweg wurde zunächst in Bak-terien entdeckt und später für andere Organismen bestätigt. Die ersten Reaktionen füh-ren zur Synthese von P5C. In Hefe, Bakterien und der Rhodophyceae Gracilaria tenui-

stipitata wird dieser Schritt nach bisherigen Erkenntnissen ausschließlich durch die

beiden Enzyme γ-Glutamyl Kinase und Glutamat-5-Semialdehyd Dehydrogenase kata-

lysiert. In höheren Pflanzen gibt es Hinweise auf zwei Varianten mit P5C als Produkt: die bifunktionelle P5CS, die die Aktivitäten der beiden einzelnen Enzyme als Hybrid in sich vereint, und/oder die beiden bereits genannten einzelnen Enzyme (vgl. Abb. 1.7).

In höheren Pflanzen werden die beiden letztgenannten Enzyme durch ein Gen mit pro-karyotischer Struktur codiert (Garcia-Rios et al., 1997). In-vitro Enzymassays sind so-wohl für die prokaryotische (Smith et al., 1984) als auch für die eukaryotische Variante

schwierig durchzuführen, weil beide Enzyme nur als Komplex stabil sind. Über spektralphotometrische in-vitro-Tests allein läßt sich nicht herausfinden, welche

der beiden Varianten im Organismus aktiv ist, denn die für den prokaryotischen Kom-plex verwendeten Methoden lassen sich auch für das Hybridenzym verwenden und vice versa (Rout & Shaw, 1998; Garcia-Rios et al., 1997). Gelelektrophoretische Me-

thoden wären ein geeignetes Mittel zur Unterscheidung beider Varianten, da sich die P5CS im Gegensatz zu den beiden trennbaren Enzymen auf einem SDS-PAGE-Gel als Einzelbande zeigt (Fujita et al., 1998). Die Isolation der für die P5CS bzw. deren

prokaryotische Variante codierenden Gene wären allerdings ein sichererer und mögli-cherweise auch einfacherer Beweis. Denn wie in Kap. 5.3 erläutert, werden beide Vari-anten anscheinend unterschiedlich reguliert und entsprechend bei verschiedenen Streßexpositionen exprimiert. Gerade in sehr kleinen und relativ langsam wachsenden

Diskussion

182

Organismen wie den Eisalgen und speziell der in diesen Versuchen betrachteten Chaetoceros sp., in denen sehr viel Biomasse notwendig ist, um die Enzyme des Pro-

linstoffwechsels allgemein und der membrangebundenen im besonderen in ausrei-chender Menge zu extrahieren (siehe auch Katabolismus), ist die Anwendung moleku-

larbiologischer Methoden eine sinnvolle Ergänzung zu biochemischen und physiolo-gischen Untersuchungen. P5C Reductase

Die P5CR benötigt entweder NADH oder NADPH als Cosubstrat. In den meisten Or-ganismen wird eine der beiden Substanzen bevorzugt verwendet (Basch et al., 1996; Rayapati et al., 1989; Laliberté & Hellebust, 1989); in vielen Arbeiten wurden allerdings

keine Angaben über eventuell vorhandene Aktivitäten mit dem jeweils nicht aufgeführ-ten Cosubstrat gemacht. Die drei auf P5CR getesteten Eisdiatomeen zeigten charakteristische Unterschiede: die P5CR von Chaetoceros sp. katalysiert die Reaktion von P5C zu Prolin ausschließ-

lich mit NADH und befindet sich in der 20 – 50%-Ammoniumsulfatfraktion; die P5CR der beiden anderen Arten dagegen zeigt nur Aktivitäten mit NADPH (50 – 80%-Ammoniumsulfatfraktion). Diese Verteilung war reproduzierbar und die Aufschluß- und Fällungsbedingungen bei allen drei Arten identisch. Die Lokalisation der P5CR wird in verschiedenen Kompartimenten diskutiert; nach bisherigen Erkenntnissen ist das En-zym jedoch hauptsächlich im Cytosol zu finden (Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Chil-son et al., 1997; Treichel, 1986), obwohl auch Isoenzyme in Mitochondrien oder Chlo-roplasten beschrieben worden sind (Forlani et al., 1997; Basch et al., 1996) . Lediglich in Blättern von Pisum sativum ist die P5CR ausschließlich in den Chloroplasten lokali-siert (Rayapati et al., 1989). Isoenzyme katalysieren dieselben Reaktionen, können je-

doch im Einzelnen besondere katalytische Eigenschaften aufweisen (Hochachka & Somero, 1980). Die FPLC-Elutionsprofile der P5CR von zwei Chlorella-Arten, C. autotrophica als eury-haline Art und C. saccharophila als weniger salztolerante Art, sind aufgrund der unter-

schiedlichen Ladung der jeweiligen P5CR deutlich verschieden voneinander: die von C. autotrophica ist neutral oder leicht positiv, die von C. saccharophila negativ geladen (Laliberté & Hellebust, 1989). Die Aktivität der P5CR von C. autotrophica und ihr Eluti-

onsprofil ist dabei abhängig von der Pufferzusammensetzung: ohne die Zugaben von Glycinbetain und Sorbitol ist auch dieses Enzym negativ geladen bei gleichzeitiger Ak-tivitätsabnahme in-vitro. Die Autoren vermuten, daß die Quartärstruktur der P5CR sen-sibel auf das umgebene Medium reagiert und auf diese Weise die Aktivität in-vivo regu-

Diskussion

183

liert wird. Die P5CR beider Arten weisen im Gegensatz zu höheren Pflanzen eine hohe Cosubtratspezifität für NADH auf. Die Aktivitäten mit NADPH erreichen max. 10% von

der mit NADH. In höheren Pflanzen ist eine derartige Spezifität nicht beschrieben, ob-wohl jeweils eine Präferenz für entweder NADH oder NADPH besteht (zusammenge-faßt in Laliberté & Hellebust (1989). Da auch in den drei Eisdiatomeen Chaetoceros sp., A. kufferathii und Ni. lecointei eine hohe Spezifität für jeweils eines der beiden Co-

substrate auftritt, handelt es sich möglicherweise um eine spezielle Eigenschaft von Mikroalgen bezüglich der Prolinsynthese und –regulation. Als Gegenbeispiel kann al-lerdings die Diatomee Cyclotella cryptica angeführt werden, deren P5CR keines der

beiden Cosubstrate bevorzugt (Liu & Hellebust, 1976c). Die ausführliche Zusammen-fassung der Ergebisse soll zeigen, daß in Mikroalgen weitere bzw. von den aus höhe-ren Pflanzen bisher bekannten verschiedene Regulationsmechanismen existieren könnten, die sich u.a. in den Eigenschaften der P5CR widerspiegeln. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang zwischen Mikroalgen, die verhältnismäßig mehr Prolin als höhere Pflanzen akkumulieren, wenn sie einem osmotischen Streß ausgesetzt sind (vgl. Kap. 5.1), und den Eigenschaften der P5CR. Die ermittelten KM-Werte für von Chaetoceros sp. stimmen mit denen für Chlorella au-

totrophica überein (KM (P5C) 170 µM und KM (NADH) 100 µM) (Laliberté & Hellebust, 1989). Der KM (P5C) von Gracilaria tenuistipitata ist dagegen mit 90 µM niedrigerer; die

maximale Reaktionsgeschwindigkeit liegt mit 412 nkat*mg-1 Protein knapp 6x über der von Chaetoceros sp. (Lee, 1998a). Die KM-Werte von Nicotiana tabacum für P5C lie-

gen ebenfalls im Bereich von 150 bis 180 µM; der für das bevorzugt genutzte Cosub-strat NADPH allerdings wesentlich niedriger bei 30 µM (zum Vergeich: KM (NADH) 510 µM; LaRosa et al., 1991).

Die Aussagekraft der Michaelis-Konstanten aus verschiedenen Organismen ist aller-dings eher gering, da die Anpassung der Organismen an höhere Salinitäten bzw. Streß allgemein einen Einfluß auf die Sustrataffinitäten ausüben kann. In Gracilaria tenuistipi-

tata z.B. steigt die Substrataffinität für P5C, gemessen an der Erniedrigung des KM-Wertes von 90 µM auf 40 µM (Lee, 1998a); ähnliches gilt für den Halophyten Mesem-

bryanthemum nodiflorum (Treichel, 1986). Im Gegensatz zu höheren Pflanzen wird die Anpassung an höhere Salinitäten in den beiden Chlorella-Arten jedoch in keiner Ver-

änderung der Substrat- oder Cosubstrataffinität reflektiert (Laliberté & Hellebust, 1989). Entsprechende Versuche mit Chaetoceros sp. sind nicht mehr durchgeführt worden. Die Aktivitäten der P5CR werden in den Chlorella-Arten, in Cyclotella cryptica und in Chaetoceros sp. durch Prolin in-vitro gehemmt (Daten nicht gezeigt), auch das ist ein Unterschied zu den Ergebnissen mit höheren Pflanzen (Shiono et al., 1986). Die phy-

Diskussion

184

siologischen Substratkonzentrationen liegen i.d.R. im niedrigen Substratbereich einer Sättigungskurve. Bei niedrigen KM kommt der Substratkonzentration daher eine hohe

regulatorische Funktion zu (Hochachka & Somero, 1980). Die KM-Werte einer Reakti-onsfolge, also im vorliegenden Beispiel bei der Prolinsynthese von Glutaminsäure bzw. Ornithin via P5C zu Prolin, liegen im Normalfall in der gleichen Größenordnung. Damit soll ein ungestörter Reaktionsablauf gesichert und die Regulation des Stoffwechelwe-ges erleichert werden. Ähnlich wie bei der Temperaturkompensation (vgl. Kap. 5.3) kann eine Regulation der Enzymaktivität bzw. –funktionalität auch durch die Akkumulation von compatible solu-tes erfolgen: Somero (1992) faßt in seinem Artikel die Ergebnisse mehrerer Arbeiten zusammen: Generell üben die compatible solutes Glycerin und Prolin auch in höheren Konzentrationen keinen oder nur einen verhältnismäßig geringen Einfluß auf die maxi-male Reaktionsgeschwindigkeit oder KM aus. Im Gegensatz dazu wirken sowohl erwartungsgemäß NaCl und KCl als auch die basischen Aminosäuren Arginin und Lysin, die nicht als compatible solutes gelten, über sinkende Reaktionsgeschwin-digkeiten oder steigende KM hemmend – auch auf die Enzymreaktionen der halotole-ranten Grünalge Dunaliella viridis.

Zusammengefaßt könnten diese Unterschiede zwischen höheren Pflanzen und den Mikroalgen auf eine etwas andere Regulation der Prolinsynthese hinweisen, die auch die P5CR einbezieht. In höheren Pflanzen wird die P5CR-Aktivität selbst zwar auch im

Zuge der Streßakklimatisation erhöht, hat allerdings keine geschwindigkeitsbestim-mende Funktion (Kuznetsov & Shevyakova, 1999; Hare et al., 1999).

Das breite pH-Optimum der P5CR von Chatoceros sp. von pH 7,0 - 8,0 wurde auch in A. kufferathii und Ni. lecointei gemessen und scheint für die cytosolische P5CR spezi-fisch zu sein und ist beispielsweise auch in Arten der Gattung Chlorella bestimmt wor-

den (Laliberté & Hellebust, 1989; Dashek & Erickson, 1981). Die aus Chloroplasten isolierte P5CR weist dagegen ein bimodales pH-Optimum mit Spitzen bei pH 6,5 und pH 8,4 auf (Rayapati et al., 1989).

Das Temperaturoptimum der P5CR liegt bei 40°C. Das Enzym ist folglich nicht an die tiefen Temperaturen der Antarktis angepaßt. Die entsprechend niedrigen Aktivitäten bei 0°C erklären die langsame Akklimatisationsgeschwindigkeit bezüglich der intrazel-lulären Prolinkonzentration nach einem hyperosmotischen Schock (Kap. 5.3). Da die Eisdiatomeen in der Regel jedoch nicht schlagartig hyerosmotischen Bedingungen ausgesetzt werden und bei langsamen Ausfrieren des Eises genügend Zeit zur Akkli-matisation haben, ist die geringe Aktivität bei niedrigen Temperaturen nicht unbedingt

Diskussion

185

ein Nachteil. Wie in Kap. 5.3 erwähnt, wird die Geschwindigkeit einer Enzymreaktion im wesentlichen durch ihre freie Aktivierungsenergie (EA) bestimmt. Die Aktivierungs-

energie von 92,2 KJ*mol-1 liegt knapp über den für enzymatische Reaktionen typischen Aktivierungsenergien von 40 bis 80 KJ*mol-1 (Hochachka & Somero, 1980). Literatur-hinweise zum Vergleich der Temperatureigenschaften der P5CR aus Chaetoceros sp. mit der anderer Organismen liegen nicht vor. Nach Vorversuchen mit Extrakten aus A.

kufferathii und Ni. lecointei liegt das Temperaturoptimum deren P5CR möglicherweise zwischen 20 und 25°C und damit deutlich unter dem von Chaetoceros sp., ein weiterer

Hinweis auf eine biochemisch unterschiedliche P5CR. Aufgrund der niedrigen Aktivi-täten konnte keine weitere Charakterisierung vorgenommen werden. Die P5CR von A.

kufferathii und Ni. lecointei sind in unterschiedlichen Ammoniumsulfatfraktionen gefun-

den worden, so daß sie andere biochemische/biophysikalische Eigenschaften aufwei-sen als die von Chaetoceros sp. Weitere Untersuchungen in dieser Hinsicht sind nicht

unternommen worden, da das erste Ziel war, einen Modellorganismus für die Beschrei-bung des Prolinsyntheseweges in einer der drei untersuchten Eisdiatomeen zu finden. Tertiär-, Quartär- und Quintärstrukturen werden von nichtkovalenten Wechselwirkun-gen beeinflußt. Der hydrophobe Anteil der Proteine beträgt wahrscheinlich über 50% (Hochachka & Somero, 1980). Bei 25°C sind diese Bindungen stabiler als die polaren (van-der-Waals-Kräfte, Ionen-, Wasserstoffbrückenbindungen); bei einer Temperatur

von 0°C kehrt sich die Stabilität der Wechselwirkungen um (Gounot & Russell, 1999). Ein Wechsel der Umgebungstemperatur wirkt sich bei den einzelligen Mikroorganis-men unmittelbar auf die biochemischen Reaktionen der Zelle aus und beeinflußt da-durch unter Umständen die Tertiär- und Quartärstrukturen der Enzyme. Die Folge kön-nen eine Funktionseinschränkung oder auch eine entsprechende Anpassung an die aktuelle Temperatursituation sein, um den Effekt der sinkenden Temperaturen auf die chemischen Reaktionsgeschwindigkeiten einzuschränken. Homologe Enzyme aus Kontroll- und kälteangepaßten Bakterienkulturen unterschieden sich z.B. in der Prote-instruktur. Bei den Enzymen aus den nichtangepaßten Bakterien geht die Quartärstruk-tur bei niedrigen Temperaturen verloren, während sie bei den kälteangepaßten erhal-ten bleibt. Nach Übersichtsartikeln von Fields (2001) und Aghajari & Haser (1999) genügt für die Anpassung eine geringe Veränderung der Enzymstabilitäts- und –flexibilitätsparameter. Dazu könnten z.B. leichte Seitenkettenmutagenesen ausreichen. Möglicherweise sind einige psychrophile Organismen auch auf die Bindung von com-patible solutes an Proteine angewiesen, die die hydrophoben Bereiche stabilisieren und auf diese Weise vor Kältedenaturierung schützen. Dieser Aspekt der Protein-Solute-Interaktion ist bisher wenig erforscht. Geht man nach der Definition von Gounot

Diskussion

186

& Russell (1999) aus, zählt die P5CR von Chaetoceros sp. zu den kälteangepaßten

Enzymen, da die Aktivität bei 0°C noch 10,9% der optimalen Aktivität bei 40°C auf-weist. Ihr Bezugsenzym ist die Amylase eines psychrotoleranten Vibrio-Bakteriums, de-

ren Aktivitätsoptimum bei 35°C liegt und ebenfalls noch 10% Aktivität bei einer Temperatur von 0°C aufweist. Viele ektotherme Organismen können Temperaturschwankungen ausgleichen, indem sie durch positive Temperaturmodulation Veränderungen der Reaktionsgeschwindig-keiten sofort kompensieren. Am wichtigsten für die Anpassungsart ist ein Anstieg des Substratbindevermögens eines Enzyms bei einer Temperaturerniedrigung. Für einen Nachweis dieses Effektes müßte die Substrataffinität des betrachteten Enzyms bei verschiedenen Temperaturen überprüft werden und die jeweiligen Reaktionsgeschwin-digkeiten bei physiologischen Substratkonzentrationen miteinander verglichen werden. Bei einer positiven Temperaturmodulation wären die Reaktionsgeschwindigkeiten in diesem Fall temperaturunabhängig. Aus Unkenntnis der physiologischen P5C-Konzentrationen zum Zeitpunkt der Experimente mit der Chaetoceros-P5CR sind ent-

sprechende Messungen nicht mehr durchgeführt worden. Die zweite Möglichkeit der Temperaturanpassung wäre die Synthese von Isoenzymen, wie es beispielsweise für die Regenbogenforelle (Oncorhynchus myciss, nach der Zusammenfassung von

Hochachka & Somero, 1980) nachgewiesen worden ist. Die kälteadaptierten Enzyme werden im Winter, die wärmeadaptierten dagegen im Sommer exprimiert.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob bei der P5CR von Chaetoceros sp. eine Temperaturmodulation vorliegt oder ob –

bei tiefen Temperaturen wie im Langzeitversuch – kälteangepaßte Isoformen vorliegen oder nicht. Das Enzym weist zwar ein Reaktionsoptimum bei 40°C auf, hat aber bei 0°C noch eine Restaktivität von 10%. Diese Restaktivität ist nach Gounot & Russell (1999) ein Zeichen für eine kälteangepaßte Enzymform. Vergleichende Untersuchun-gen mit temperierten und/oder tropischen Arten dieser Gattung liegen nicht vor. Es gibt Hinweise auf die Synthese von kältestabilen Enzymen in Chaetoceros sp., die in die oxidative Streßantwort involviert sind (Schriek, 2000); Enzyme, die A. kufferathii in die-

ser Form nicht aufweist. Insofern wäre es nicht überraschend, wenn eine derartige An-passung auch im Prolinmetabolismus existent wäre; vor allem vor dem Hintergrund der Zonierung der beiden Arten in der Eissäule (vgl. Kap. 5.2), der extrem hohen Prolinkonzentrationen im Vergleich zu A. kufferathii und Ni. lecointei und der Tatsache,

daß die P5CR der Arten unterschiedliche Cosubstrate nutzen, in verschiedenen Ammoniumsulfatfraktionen vorkommen und daher unterschiedliche physikochemische Eigenschaften aufweisen (siehe oben).

Diskussion

187

Inwieweit sich die Unterschiede der P5CR von Chaetoceros sp. und denen von A. kuf-

ferathii und Ni. lecointei auf physiologischer Ebene auswirken, kann aufgrund der vor-

liegenden Ergebnisse und Literaturhinweise nicht bewertet werden. Vor dem Hinter-grund der hohen molaren Prolinkonzentrationen von Chaetoeros sp. und der hohen in-

vitro-Aktivitäten im Vergleich zu denen der anderen beiden Arten erscheint eine „lei-

stungsfähige“ P5CR als wahrscheinlich. Bezogen auf die in Tab. 5.3 angegebenen Zellvolumina, ist die Syntheseleistung von Chaetoceros sp. in den ersten 12 Stunden

nach dem hyperosmotischen Schock von 34 auf 68 PSU um das 8fache höher als die der anderen Arten. Weitere Untersuchungen unter Einbeziehung z.B. gelelektrophore-tischer Methoden und verschiedener Aufschlußverfahren zur Isolierung von Chloropla-sten und Mitochondrien sind notwendig, um Aufschluß über biochemische Unterschie-de und Lokalisationen zu erlangen.

δ-Ornithin-Aminotransferase

In Chaetoceros sp. weist die OAT nur geringste Aktivitäten bei 34 PSU auf. Messungen

mit Extrakten aus einem hyperosmotischen Streß ausgesetzten Zellen (12 – 24 h) er-

gaben keine Aktivitätssteigerungen (Daten nicht gezeigt). Die OAT ist in den Mitochon-drien lokalisiert (Kuznetsov & Shevyakova, 1999). Wie bereits bei der Diskussion der katabolen Enzyme erwähnt, ist die OAT aufgrund fehlender Detergenzienverwendung möglicherweise ebenfalls nicht bzw. nur sehr unvollkommen extrahiert worden. Die Diatomee Cyclotella cryptica synthetisiert Prolin über Glutaminsäure und Glutamin,

aber auch über Arginin und Ornithin. In der Alge konnten erhöhte P5CR- und Arginase-Aktivitäten ermittelt werden, jedoch keine Glutamat Kinase– oder OAT-Aktivitäten (Dashek & Erickson, 1981; Liu & Hellebust, 1976c). Die Untersuchungen wurden mit 14CO2 durchgeführt und lassen das Vorhandensein des Ornithinweges in der Kieselal-ge vermuten (vgl. Kap. 5.3.2). Nach Charest & Phan (1990) setzt eine Ornithin Transaminase (ebenfalls EC 2.6.1.13)

aus Triticum aestivum (Weizen) mit NADH Ornithin und α-Ketoglutarat zu P5C und

Glutaminsäure um. Entsprechende Tests mit Extrakten aus Chaetoceros sp. verliefen

negativ. Eine weitere Möglichkeit der P5C-Synthese in den Mitochondrien ist die Um-setzung von Ornithin aus dem Harnstoffzyklus über Pyrrolin-2-Carboxylsäure (P2C) zu Prolin (zusammengefaßt von Sanchez et al., 2001; Forlani et al., 1997; Abb. 5.5). In

der Literatur wird dieser Weg im Rahmen der Streßtoleranz und Streßaktivierung sel-ten genannt, daher ist es schwierig, seine Rolle abzuschätzen. Adams (1970) faßt die Ergebnisse mehrerer Untersuchungen zusammen, nach denen die Prolinsynthese über P2C in Mutanten, die kein P5C synthetisieren können, gesichert wird.

Diskussion

188

Katabolismus

Die Prolinoxidation wird von drei verschiedenen Enzymen katalysiert; nur in Enterobak-terien wird die Reaktion von einem Enzymkomplex, der Prolin DH/1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure DH, umgesetzt (Meile & Leisinger, 1982). Der Prolinabbau vollzieht sich in pflanzlichen Organismen offenbar einheitlich und wird durch zwei Enzyme katalysiert, bei der – wie bei der Synthese - P5C als freies Zwi-schenprodukt auftritt (Yoshiba et al., 1997) (wie in Abb. 1.7, nur in umgekehrter Rich-

tung ohne Beteiligung des Ornithins). Für die Oxidation von Prolin sind bisher 2 Enzyme beschrieben worden, die Prolin DH und die Prolin Oxidase. Die Nomenklatur für diese beiden Enzyme wird von den Auto-ren nicht einheitlich gehandhabt (vgl. Tab. 5.5); in dieser Arbeit wird der Zuordnung nach Lutts et al. (1999) gefolgt. Die Prolin DH ist ein im Cytosol gelöstes Enzym und benötigt NAD(P)+ als Cofaktor. In-vitro kann man diese Reaktion nur bei hohen pH-

Werten (pH 10) verfolgen. Es handelt sich um die Gegenreaktion der P5CR. Die Prolin

Oxidase befindet sich an der inneren Mitochondrienmembran (zusammengefaßt von Kuznetsov & Shevyakova, 1999) und benötigt einen Elektronenakzeptor (FAD+, Cy-tochrom c). Die Umsetzung von P5C zu Glutaminsäure katalysiert die P5C DH (EC 1.5.1.12) mit NAD(P)+ als Cosubstrat. Die P5C DH ist wie die Prolin Oxidase in den Mitochondrien lokalisiert (Hare & Cress, 1997). Tab. 5.5: Beispiele für die unterschiedliche Nomenklatur der Prolin oxidierenden Enzyme. Abkürzungen: n.g. = nicht genannt e--Akzeptor = Elektronenakzeptor DH = Dehydrogenase * = in-vitro

Bezeichnung EC-Nummer Lokalisation e-- akzeptor Quelle

Prolin DH 1.5.99.8 Mitochondrien n.g. Forlani et al. (2000)

Prolin DH 1.5.99.8 Membrangebun-den (Bakterium)

FAD+ Meile & Leisinger (1982)

Prolin DH 1.5.1.2 Cytosol NAD(P)+ Lutts et al. (1999)

Prolin DH 1.4.3 Mitochondrien n.g. Forlani et al. (1997)

Prolin DH n.g. Cytosol NAD(P)+ Veeranjaneyulu & Ranjita Kumari (1989)

Prolin Oxidase 1.5.99.8 Mitochondrien FAD+ Lutts et al. (1999)

Prolin Oxidase n.g. Mitochondrien O2 Veeranjaneyulu & Ranjita Kumari (1989)

Prolin Oxidase 1.4.3.1 n.g. Cytochrom c* Lee & Liu (1999)

Diskussion

189

Von den drei möglichen katabolen Enzymen konnte in Chaetoceros sp. nur die Prolin

DH sicher nachgewiesen werden. Aufgrund der sehr geringen Aktivitäten handelt es

sich wahrscheinlich eher um die Gegenreaktion der P5CR, da die Aktivitäten nur bei unphysiologisch hohen pH-Werten um pH 10 abläuft. Nach Rena & Splittstoesser (1975; zitiert nach Veeranjaneyulu & Ranjita Kumari, 1989) läuft die Reaktion über eine für die Oxidationsreaktion aktivierte Seitenkette der P5CR. Allgemein wird die Meinung vertreten, daß die Oxidation von Prolin hauptsächlich über die Prolin Oxidase verläuft (Laliberté & Hellebust, 1989). Die Prolin Oxidase ist in der Mitochondrienmembran lokalisiert (Nakashima et al., 1998; Kiyosue et al., 1996), die P5C DH dagegen eher in der Mitochondrienmatrix (Forlani et al., 1997). In Chaetoceros sp. konnte keine Aktivität der Prolin Oxidase ge-

messen werden. Der Grund liegt wahrscheinlich in der Nichtverwendung von Deter-genzien während der Extraktionsprozedur, mit denen das Enzym aus der Membran hätte herausgelöst werden können. Ähnliches könnte auch für das Fehlen der P5C DH-Aktivität verantwortlich sein. Neben der erfolglosen Extraktion der Enzyme wären nied-rige Aktivitäten per se eine Erklärung. Dafür spricht die hohe Basiskonzentration von

Prolin, die – entsprechend den Regulationsmechanismen in Abb. 5.6 bei einem Salz-streß – die Prolin oxidierenden Enzyme hemmen. In Extrakten von Chaetoceros sp.

nach einer viertägigen Stickstoffmangelexposition bei 51 PSU (nach 4 Tagen Stick-stoffmagel ist die Abnahme der intrazellulären Prolinkonzentration noch nicht abge-

schlossen; Daten nicht gezeigt), ließen sich ebenfalls weder Prolin Oxidase- noch P5C DH-Aktivitäten nachweisen; ein Nachweis für die zuerst genannte Hypothese. In höheren Pflanzen wird – wie bereits mehrfach erwähnt – die Aktivität der Prolin oxi-dierenden Enzyme deutlich erhöht, sobald die Prolinkonzentration ansteigt. Bei Salz- bzw. Wasserstreß werden die Aktivitäten der Prolin DH und der Prolin Oxidase ge-hemmt (Girija et al., 2002; Ramanjulu & Sudhakar, 2000; Lee & Liu, 1999). Wie bereits

bei der Diskussion der P5CR angesprochen, erfolgt die Regulation auch über eine Senkung der Substrataffinitäten (Lee, 1998b). Neben Salz- oder Hitze ist Calcium of-fenbar in die Regulation des Prolinabbaus involviert, wie Untersuchungen an Ulva fas-

ciata ergeben haben (Lee & Liu, 1999).

Ebenso wie die von P5CR ist auch die Regulation von P5C DH in höheren Pflanzen komplexer als die der jeweils ersten Enzyme der Synthese oder Oxidation (P5CS bzw. Prolin Oxidase), deren Aktivitäten direkt durch die einwirkenden Stressoren bzw. die entsprechend hohen Substratkonzentrationen reguliert werden. Die P5CR und die P5C DH haben in P5C ein Substrat, das neben Glutaminsäure auch über Ornithin und Argi-nin aus dem Harnstoffzyklus gebildet werden kann. Zusätzlich zu den als Aktivatoren zählenden Stressoren gilt für beide Enzyme eine erhöhte P5C-Konzentration als indu-

Diskussion

190

zierend (Forlani et al., 2000; Forlani et al., 1997), während Prolin und Arginin (für die P5C DH; Forlani et al., 2000) bzw. Prolin (für die P5CR als hemmendes Produkt) allein

keinen Einfluß auf die Aktivität oder Genexpression zu haben scheinen.

5.4.2 Zusammenfassung

Die Prolinsynthese in Chaetoceros sp. erfolgt unter Normalbedingungen mit Glutamin-

säure als Ausgangssubstrat über P5C. Das die Synthese regulierende Enzym, die P5CS, ist über die Aktivität bestimmt worden. Ob es sich um das Hybridenzym oder um

den Komplex aus γ-Glutamyl Kinase und Glutamat-5-Semialdehyd DH handelt, kann

anhand des durchgeführten Testes nicht bestimmt werden. Da der Komplex unter streßfreien Bedingungen bisher nur in Prokaryoten und der Rotalge Gracilaria tenuisti-

pitata isoliert werden konnte, während in höheren Pflanzen das Hybridenzym P5CS

exprimiert wird, ist vom Vorhandensein des letzteren auszugehen. Der letzte Schritt der Synthese wird von der P5CR vollzogen. In Chaetoceros sp. befindet sich das Enzym

mit 20 – 50% Ammoniumsulfatfällung in einer anderen Fraktion und reagiert aus-schließlich mit NADH als Cosubstrat, im Unterschied zu den aus Ni. lecointei und A.

kufferathii extrahierten Enzymen (50 – 80% Ammoniumsulfat; NADPH). Die alleinige

Funktion der P5CR mit entweder nur dem phosphorylierten oder dem nichtphosphory-lierten Cosubstrat ist bisher mit zwei Chlorella-Arten nur aus marinen Mikroalgen be-

kannt und stellt möglicherweise ein Charakteristikum dar. Ebenfalls im Gegensatz zu höheren Pflanzen wird die P5CR in-vitro durch Prolin gehemmt; könnte in-vivo folglich

auch eine regulatorische Funktion innehaben. Die aus unterschiedlichen Fraktionen stammenden P5CR-Aktivitäten zusammen mit der Verwendung unterschiedlicher Co-substrate deuten auf biochemische Varianten der P5CR hin, die sich ansatzweise in den kinetischen Eigenschaften wie z.B. Temperaturabhängigkeit niederschlagen. Ob es sich bei Chaetoceros sp. um eine gegenüber Ni. lecointei und A. kufferathii beson-

ders salz- oder kälteangepaßte Form der P5CR handelt, kann ohne weitere Untersu-chungen nur vermutet werden. Aufgrund der in-vitro gemessenen hohen Aktivitäten ist

von einer besonders leistungsfähigen P5CR auszugehen, was die im Vergleich zu den anderen Arten hohen molaren Prolinkonzentrationen erklären würde und eine ausge-zeichnete Anpassung an die Lebensbedingungen in oberen Bereich der Eissäule dar-stellt.

Über die den Katabolismus von Prolin betreffenden Enzyme können wenig Aussagen getroffen werden, da – wahrscheinlich aufgrund methodischer Schwierigkeiten - nur leichte Aktivitäten der Prolin DH gemessen werden konnten, die eher als Gegenreakti-on der P5CR zu werten sind als daß es eine Funktion in der Prolinoxidation übernäh-

Diskussion

191

me. Daneben muß ein Aspekt berücksichtigt werden, der in höheren Pflanzen und i.d.R. auch in temperierten marinen Organismen nicht zum Tragen kommt: in Chaetoceros sp. wird bei 34 PSU eine vergleichsweise hohe Prolinbasiskonzentration

aufrechterhalten. Da bei ansteigenden Prolinkonzentrationen normalerweise die Oxida-tion – mit Ausnahme von Streßsituationen – aktiviert wird, ist zu vermuten, daß die Re-gulation in Chaetoceros sp. anders aufgebaut ist und dieser Aktivierung entgegenwirkt.

Vermutlich sind beide Gründe für den erfolglosen Nachweis verantwortlich. Unter Kurzzeitsalzstreß steigt die Aktivität der P5CS als unmittelbare Folge des Streß-ereignisses an. Die Erhöhung erfolgt in zwei Stufen, die auf mehreren Reaktionen ba-sieren können: a) Modifikationen der Quartärstruktur des Enzyms, die eine Erhöhung der Substrataffinität zur Folge haben, b) Neusynthese von P5CS, die den P5CS-Anteil am Gesamtproteinpool der Zellen erhöhen und c) Neusynthese des Komplexes, wie für u.a. für die Tomate beschrieben. Die Aktivität der P5CR erhöht sich erst bei Langzeitakklimatisation an den Salzstreß, wahrscheinlich wird die Transkription und/oder Translation vorübergehend durch ande-re Regulationsmechanismen gehemmt, um die P5C-Konzentration, die im Versuch vor-übergehend ansteigt, als Induktionssubstanz vorübergehend erhöht zu halten. P5C soll u.a. die Synthese von Salzstreßproteinen induzieren und für die Aktivierung des Ornithinweges verantwortlich sein. In Chaetoceros sp. konnten nur geringste OAT-Aktivitäten ermittelt werden, was wie

bei den katabolen Enzymen auf methodischen Schwierigkeiten beruhen könnte. Aus-reichende Stickstoffversorgung (gemessen an den Asparagin- und Glutaminkonzentrationen) war gewährleistet. Für eine wenigstens vorübergehende Aktivität der OAT spricht zum einen die Aktivitätserhöhung in 2 Stufen der P5CS bei gleichbleibender Prolinakkumulationsrate und der vorübergehende Anstieg der Argininkonzentration als Vorläufer für Ornithin.

Zusammenfassende Abschlußdiskussion

192

6 Zusammenfassende Abschlußdiskussion

Neun antarktische Diatomeen wurden hinsichtlich ihrer Zusammensetzung organischer Osmolyte (mit Ausnahme der organischen Säuren) und der freien Aminosäuren bei 17, 34 und 51 PSU untersucht. Die verschiedenen Salinitäten sollten hypo-, iso- und hy-perosmotischen Bedingungen simulieren. Erste Zielsetzung war es, die Iminosäure Prolin als Hauptosmolyten in antarktischen Diatomeen zu bestätigen. Die zweite Ziel-setzung sollte Belege für oder wider die von Nothnagel (1994) aufgestellte Vermutung erbringen, hohe Prolinbasiskonzentrationen bereits bei 34 PSU, also unter Bedingun-gen, die als normale Umgebungssalinität anzusehen sind, seien charakteristisch für Eisdiatomeen. Mit vier ausgewählten Arten, die in verschiedenen vertikalen Bereichen

der Eissäule bzw. im Pelagial vorkommen, wurde ein Langzeitexperiment über eine Dauer von neun Monaten durchgeführt, in dem sie langsam steigenden Salinitäten und sinkenden Temperaturen ausgesetzt worden sind. Neben der Feststellung, inwieweit physiologische Eigenschaften (Temperatur- und Salinitätstoleranz) der vier Arten mit ihrem Vorkommen in der Eissäule in Verbindung zu bringen sind, wurde geprüft, wel-che Rolle Prolin in der Anpassung an die untersuchten abiotischen Faktoren zukommt. Im letzten Teil wurden erste Versuche zur Enzymatik des Prolinmetabolismus in Eisdia-tomeen vorgenommen, um Hinweise auf besondere Regulationsmechanismen oder Enzymformen erhalten zu können, die sich von den Erkenntnissen in höheren Pflanzen und Bakterien unterscheiden. Prolin ist als Hauptosmolyt in antarktischen Diatomeen bestätigt worden; die hohen Basiskonzentrationen jedoch nur bedingt. Hohe Prolinbasiskonzentrationen sind nach Nothnagel (1994) vorhanden, wenn die Prolinkonzentration bei 34 PSU, also normaler Umgebungssalinität, über der FAS-Gesamtkonzentration bzw. über der von Glutamin-säure, der nach Prolin in der Regel am höchsten konzentrierten Aminosäure, liegen. Nach dieser Definition sind in den antarktischen Diatomeen hohe Prolinbasiskonzentra-tionen nicht generell vorhanden. Nur in beiden Chaetoceros-Arten und in F. cylindrus

weisen die Prolinkonzentrationen entsprechend hohe Werte auf. In den anderen Arten dagegen liegen Prolinkonzentrationen unterhalb des genannten Bereiches, auch unter der Berücksichtigung des in der stationären Wachstumsphase gegenüber der loga-rithmischen Phase verstärkt akkumulierten Prolins (Altersakkumulation). Besteht ein Zusammenhang zwischen den hohen Prolinkonzentrationen und Enzymen des Prolinmetabolismus? Die vorliegenden Ergebnisse aus den Enzymversuchen ge-


193

ben erste Hinweise darauf. Von den drei oben genannten Arten wurde Chaetoceros sp.

bezüglich der Prolinenzymatik untersucht. Über die P5CR liegen die meisten Daten vor. Die P5CR von Chaetoceros sp. scheint – im Gegensatz zu den meisten bisher un-

tersuchten Organismen – an der Regulation der Prolinsynthese beteiligt zu sein, da sie durch Prolin gehemmt wird. Die P5CR von Chaetoceros sp. weist gegenüber denen von A. kufferathii und Ni. lecointei deutliche Unterschiede auf: sie sind – trotz identi-

scher Extraktionsbedingungen – in unterschiedlichen Ammoniumsulfatfraktionen wie-derzufinden und arbeiten ausschließlich mit unterschiedlichen Cosubstraten (Chaeto-

ceros sp. mit NADH, die beiden anderen mit NADPH). Beides deutet auf eine voneinander verschiedene biochemische Struktur hin. Außerdem liegen die in-vitro-Aktivitäten der Chaetoceros-P5CR deutlich höher bzw. das Enzym in höheren Mengen

als in den beiden anderen Arten vor, da trotz gleichen Proteineinsatzes mehr NADH pro Zeiteinheit als NADPH umgesetzt worden ist. Bestätigung finden die in-vitro-Messungen von der auf das Volumen bezogenen Prolinakkumulation in-vivo innerhalb

der ersten 12 Stunden nach einem hyperosmotischen Schock von 34 auf 68 PSU. Die von Chaetoceros sp. akkumulierte Menge liegt ca. 8mal höher als die der anderen bei-

den Arten. Zum ersten Mal ist durch ein Experiment der direkte Beweis erbracht worden, daß die vertikale Verteilung der Arten innerhalb der Eissäule nicht allein auf die Zellgröße zu-

rückzuführen ist, sondern sich auch in physiologischen Eigenschaften widerspiegelt (vgl. Abb. 6.1). Chaetoceros sp., Ni. lecointei, A. kufferathii und Co. pennatum weisen

entsprechend ihrer vertikalen Verteilung innerhalb der Eissäule unterschiedliche Salini-täts- und Temperaturtoleranzbereiche auf: die beiden großzelligen Arten A. kufferathii und Co. pennatum sind vergleichsweise stenök, da sie nur geringere Veränderungen

von Salinität und Temperatur tolerieren können. Der durch hauptsächlich marine Pa-rameter determinierte Lebensraum von Co. pennatum erfordert bezüglich der unter-

suchten abiotischen Faktoren Salinität und Temperatur noch weniger Anpassungsfä-higkeit als der von A. kufferathii. In den Boden- und Untereisgemeinschaften wird A.

kufferathii der Salzlauge ausgesetzt, die im Verlauf der Wochen nach der Eisbildung

aus der Eissäule aussinken kann und sowohl Temperaturen und als auch Salinität un-ter dem Eis entsprechend beeinflußt. Chaetoceros sp. und Ni. lecointei sind – zumin-

dest zeitweise – in der gesamten Eissäule zu finden und können die dort herrschenden variablen Lebensbedingungen (vgl. Abb. 1.13) mit ihren breiten Lebensgrenzen von Temperatur und Salinität (Abb. 4.21 und Abb. 4.22) tolerieren. Beide Arten akkumulie-ren ihren Hauptosmolyten Prolin bis zu Salinitäten von 85 (Ni. lecointei) bzw. 151 PSU


194

nur 1 Osm

olyt: Prolin

geringe Kälte-und Salinitätstoleranz

Abb. 6.1:Schematische D

arstellung der Zonierungder im

Langzeit untersuchten vier Eisdiatomeen C

haetoceros sp., Ni. lecointei, A. kufferathi und C

o. pennatum.

Neben der Zellgröße beruht die Zonierung

auch auf physiologischen Eigenschaften der Organism

en (Text rechts). Über die m

it einem roten Stern gekennzeichneten

Organism

en liegen Literaturdaten vor, die die der Zonierung entsprechenden physiologischen Eigenschaften bestätigen (siehe Text). Zu der im Screening der w

eiteren fünfArten festgestellten O

smolytverteilung: siehe Ausführungen im

Text. Symbolbezeichnung siehe Abb. 1.13.

Z o n i e r u n g i m E i sLebensbedingungen

variabel

konstant

Prolinakkumulation sehr hoch (~ 4,5 M

)hohe Prolinbasiskonzentration

bei 34 PSU⇒

leistungsfähige P5CR

⇒besondere R

egulation wahrscheinlich

nur 2 Osm

olyte: Prolin, Hom

arin

Modifikation der E

isstruktur durch Substanz-exsudation

möglich

Synthese einer kälteinduzierten Substanzw

ahrscheinlich (Kap. 3)

hohe pH-Toleranz (bis pH

10,5)

geringe Osm

olytkonzentration (~ 40 mM

)

viele compatible solutes: P

rolin, DM

SP,

Glycinbetain, unbekannter Zucker, kein H

omarin

Hauptosm

olyt bei hohen Salinitäten: Prolin⇒

weniger leistungsfähige P5C

R

⇒besonders salzresistent?

geringe Osm

olykonzentration (~ 80 mM

)

einige compatible solutes: Prolin, G

lycinbetain,H

omarin, kein

DM

SP

Hauptosm

olyt Prolin⇒

weniger leistungsfähige P

5CR

nur 1 Osm

olyt: Prolin






o. pennatum.





Organism






variabel

konstant



bei 34 PSU⇒


⇒besondere R


nur 2 Osm

olyte: Prolin, Hom

arin

Modifikation der E


möglich




10,5)

geringe Osm


)


rolin, DM

SP,


omarin

Hauptosm



R


geringe Osm


)


lycinbetain,H

omarin, kein

DM

SP

Hauptosm

olyt Prolin⇒


5CR

nur 1 Osm

olyt: Prolin






o. pennatum.





Organism






variabel

konstant



bei 34 PSU⇒


⇒besondere R


nur 2 Osm

olyte: Prolin, Hom

arin

Modifikation der E


möglich




10,5)

geringe Osm


)


rolin, DM

SP,


omarin

Hauptosm



R


geringe Osm


)


lycinbetain,H

omarin, kein

DM

SP

Hauptosm

olyt Prolin⇒


5CR


195

(Chaetoceros sp.). Tiefe Temperaturen induzieren bei den im Eis lebenden Arten Chaetoceros sp., Ni. lecointei und A. kufferathii im Vergleich zu einer Kultivierungs-

temperatur von 0°C eine vermehrte Prolinakkumulation, was als eine kryoprotektive Schutzmaßnahme anzusehen ist. Co. pennatum weist diese Fähigkeit nicht auf.

Je höher die externen Salinitäten ansteigen, desto mehr tritt Prolin als Hauptosmolyt in den Diatomeen in den Vordergrund, da es gegenüber den anderen Osmolyten (wie z.B. Glycinbetain) vermehrt akkumuliert wird. Gewöhnlich wird dies mit der besseren Schutzwirkung des Prolins gegenüber DMSP bzw. Glycinbetain begründet. Aufgrund der stark unterschiedlichen Prolinkonzentrationen von Chaetoceros sp. (mit maximal 4,5 M) und Ni. lecointei (maximal 40 mM) ist von verschiedenen Anpassungs-

strategien auszugehen, die die Arten dazu befähigt, in den oberen Eisbereichen zu überleben (siehe Zusammenfassung in Abb. 6.1). Chaetoceros sp. akkumuliert Prolin in Konzentrationen, die den Glycerinkonzentrationen der halophilen Mikroalge Dunaliel-

la salina ähnlich sind. Aufgrund dieses Faktums und der Berechnungen von Nothnagel gleicht Chaetoceros sp. mit Prolin einen großen Teil des osmotischen Potentials aus. Gleichzeitig kann Chaetoceros sp. neben der osmotischen Wirkung die anderen vielfäl-

tigen Funktionen dieser Iminosäure nutzen (beispielsweise als kryoprotektive und Speichersubstanz oder Antioxidans; vgl. Abb. 1.6), ohne Energie für die Synthese an-derer compatible solutes aufzubringen. Nach Nothnagel reagiert Chaetoceros sp. auf

erhöhte Salinitäten über eine Verringerung des Wachstums und des Zellvolumens mit

einer Reduktion des Stoffwechsels. Außerdem hält diese kleinzellige Art die Photosyn-theserate unter niedrigen Temperaturen konstant, reduziert die Atmung und ist durch eine effiziente C-Assimilation charakterisiert (Thomas et al., 1992). Zusätzlich gibt es Hinweise darauf, daß Chaetoceros sp. die Struktur der Eiskanäle beeinflussen und sich

ein individuelles Mikroklima schaffen kann; wahrscheinlich durch die Exsudation von Substanzen. Der „Erfolg“ dieser Art sowohl in der freien Wassersäule als auch im Eis könnte auf die Summe bzw. Kombination der verschiedenen Anpassungsstrategien zu-rückzuführen sein. Ni. lecointei dagegen synthetisiert mehrere organische Osmolyte, von denen in dieser

Arbeit DMSP, Glycinbetain und Prolin identifiziert worden sind. Zusätzlich wird ein Zuk-ker akkumuliert. Die Osmolytkonzentrationen sind mit maximal 80 mM allerdings sehr gering, so daß die Anpassung an die hohen Salinitäten und tiefen Temperaturen in der Eissäule auf anderen Eigenschaften als den hier untersuchten beruhen muß. Generell gilt die Gattung Nitzschia als salztolerant, ohne daß bisher spezifische Hinweise auf

physiologische Gründe vorhanden sind. Generell erfolgen Akklimatisationsprozesse via der Expression verschiedener Gene, die abhängig sind von Art des Stressors, dem Ta-xon des Organismus, und dem Entwicklungsstand des Organismus. Unter Trocken-


196

und Salzsstreß werden z.B. „Wassermangelgene“ (osmogenes) aktiviert. Diese codie-ren verschiedene Proteine (molekulare Chaperone, Proteasen, Protease Inhibitoren).

Zusätzlich werden andere Proteine exprimiert, beispielsweise für Komponenten des ak-tiven Ionentransportsystems, für die Synthese organischer Osmolyte und Genregulati-onsproteine (Kuznetsov & Shevyakova, 1999). Für die Wirkungsweise von Prolin und anderen Osmolyten ändert sich die Ansicht, und immer mehr rückt die Meinung in den Vordergrund, daß die Schutzwirkung mehr Gewicht hat als die osmotische Funktion (Hare et al., 1999). Das gilt insbesondere für Prolin: Viele Autoren sprechen Prolin trotz

einer Akkumulation als Reaktion auf osmotischen oder Wasserstreß eine Funktion als wirkungsvollem Osmolyten ab, da die Konzentrationen zu gering ausfallen. Beispiels-weise erhöhen die Zellen einer Süßkartoffelkultur (Ipomoea batatas) zwar die Prolin-

konzentration um das 5fache bei einem durch 0,6 M Sorbitol induzierten osmotischen Streß, die Endkonzentration macht dennoch nur 1,5% der Gesamt-FAS aus. Diese Menge ist zu gering für eine ausreichende Wirkung als osmotische Substanz (Wang et

al., 1999). Ähnliche Verhältnisse finden sich auch in der Rotalge Gracilaria

tenuistipitata (Lee et al., 1999). Diese stellvertretend für viele andere Ergebnisse aus

Experimenten ausgewählten Beispiele zeigen, daß Prolin zwar akkumuliert wird, aber nicht als alleiniges Osmotikum wirken kann. Hier ist die Diskussion um eine andere Funktion, wie in Kap. 1.2 dargestellt, durchaus berechtigt. Hare et al. (1998) präferieren

eine Funktion der Prolinsynthese zur Aufrechterhaltung des zellulären Redox-Status nach einem Streßereignis. Auch in Ni. lecointei überwiegt aufgrund der geringen Kon-

zentrationen die Wirkung der niedermolekularen Substanzen als compatible solute. Die direkte Wirkungsweise der verschiedenen Osmolyte bzw. compatible solutes auf unter-schiedliche Strukturen und Kompartimente der Zellen ist äußerst vielfältig und steht im Zusammenhang mit anderen Schutzmechanismen, wie das Beispiel mit Antioxidantien in Mitochondrien der Wurzeln von Zea mays (Hamilton & Heckathorn, 2001) zeigen.

Die Synthese eines Cocktails vieler Wirkstoffe mit unterschiedlichen Funktionen hat den Vorteil der synergistischen Wirkung (Paleg et al., 1985) einerseits, andererseits er-

möglicht sie den Organismen, während der Langzeitadaptation mit der Synthese spezi-fischer Substanzen auf die jeweiligen Stressoren zu reagieren. Die vermehrte DMSP-Synthese ab 119 PSU kann als Indiz dafür gewertet werden, da DMSP neben einer osmotischen und kryoprotektiven auch eine antioxidative (Sunda et al., 2002) und eine

– im Vergleich zur Prolinsynthese – vermehrt energieverbrauchende Funktion bei Licht-streß aufweist. Prolin wird von Ni. lecointei zunächst als unspezifische Streßantwort

synthetisiert und anschließend, in einer späteren Phase der Akklimatisation, teilweise durch DMSP und wahrscheinlich auch Glycinbetain ersetzt.


197

Weder die Anzahl der organischen Osmolyte noch deren molare Konzentration läßt auf die Fähigkeit der Organismen schließen, sich an verändernde abiotische Faktoren

mehr oder weniger gut anpassen zu können. Nach den vorliegenden Ergebnissen syn-thetisieren die pennaten Arten mehr organische Osmolyte als die zentrischen Arten, was vermutlich evolutionär bedingt ist. Die pennaten Arten weisen dabei sehr unter-schiedliche Wege auf, sich an – für Eisalgen moderate – Salinitätserhöhungen von 51 PSU anzupassen: F. cylindrus akkumuliert neben DMSP, Homarin und Glycinbetain die FAS, wohingegen A. kufferathii als einzige der untersuchten pennaten Arten kein

DMSP, dafür neben Prolin und Glycinbetain Homarin in vergleichsweise hohen Antei-len synthetisiert. Die beiden Nitzschia-Arten und Na. gelida können zusätzlich Erythritol bzw. einen noch unbekannten Zucker bilden; in beiden Nitzschia-Arten konnte jedoch

kein Homarin identifiziert werden. Der Prolinstoffwechsel in den Eisdiatomeen, untersucht am Beispiel Chaetoceros sp.,

weist bezüglich der Synthesewege keine Besonderheiten gegenüber höheren Pflanzen oder Bakterien auf und verläuft bei hyperosmotischem Streß sowohl über den Gluta-minsäure- als auch über den Ornithinweg. Wie bereits oben diskutiert, ist die Regula-tion allerdings von denen der höheren Pflanzen verschieden. Inwieweit die Unterschie-de auf Eisdiatomeen generell zutreffen oder nur ein Charakteristikum von Chaetoceros

sp. darstellen, kann wegen der geringen Datenmenge nicht beurteilt werden. Aufgrund der großen Prolinmengen, die Chaetoceros sp. synthetisiert, und der erwähnten bio-

chemischen Unterschiede ist eher von letzterem auszugehen. Weiterführende bioche-mische und molekularbiologische Untersuchungen, die den katabolen Weg ebenso ein-beziehen wie die in die Regulation bzw. Induktion involvierten Streßgene, sollten Aufschluß über die offenen Fragen geben können. Mit der entwickelten HPLC-Methode zur Detektion des Intermediats P5C ist die Möglichkeit vorhanden, mehr Kenntnis über physiologische P5C-Konzentrationen zu erlangen und dessen Rolle als regulatorische Substanz im Prolinstoffwechsel einzuschätzen.

Literaturverzeichnis

198

7 Literaturverzeichnis

Adams E. 1970. Metabolism of Proline and of Hydroxyproline. International Reviews of

Connective Tissue Research 5: 1-91.

Admiraal W, Peletier H, Laane RWPM. 1986. Nitrogen metabolism of marine plank-

tonic diatoms; excretion, assimilation and cellular pools of free amino acids in seven species with different cell size. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 98: 241-263.

Aghajari N, Haser R. 1999. Psychrophilic enzymes: insights into cold adaptation and

catalysis from the first high resolution crystal structures. In: Margesin R, Schinner F, eds. Cold-Adapted Organisms. Ecology, Physiology, Enzymology and Molecular Biol-

ogy. Berlin, Heidelberg, New York, Barcelona, Hong Kong, London, Milan, Paris, Sin-

gapure, Tokyo: Springer-Verlag, 277-296.

Ahmad I, Hellebust JA. 1988. The Relationship between Inorganic Nitrogen Metabo-

lism and Proline Accumulation in Osmoregulatory Responses of Two Euryhaline Mi-croalgae. Plant Physiology 88: 348-354.

Ahmad I, Hellebust JA. 1993. Protein biosynthesis in salt-shocked cells of Stichococ-

cus Bacillaris (Chlorophyceae). Journal of Phycology 29: 294-300.

Ain-Lhout F, Zunzunegui M, Barradas MCD, Tirado R, Clavijo A, Novo FG. 2001. Comparison of proline accumulation in two mediterranean shrubs subjected to natural and experimental water deficit. Plant and Soil 230: 175-183.

Alabadí D, Agüero MS , Pérez-Amador MA, Carbonell J. 1996. Arginase, Arginine Decarboxylase, Ornithine Decarboxylase, and Polyamines in Tomato Ovaries. Plant

Physiology 112: 1237-1244.

Al-Amoudi OA, Flynn KJ. 1989. Effect of Nitrate-N Incorporation on the Composition of the Intracellular Amino Acid Pool of N-deprived Tetraselmis marina. British phy-

cological Journal 24: 53-61.

Aletsee L, Jahnke J. 1992. Growth and productivity of the psychrophilic marine dia-toms Thalassiosira antarctica Comber and Nitzschia frigida Grunow in batch cultures at

temperatures below the freezing point of sea water. Polar Biology 11: 643-647.


199

Ali G, Srivastava PS, Iqbal M. 1998. Morphognetic response and proline content in Bacopa monniera cultures grown under copper stress. Plant Science 138: 191-195.

Anderson JV, Hess JL, Chevone BI. 1990. Purification, Characterization, and Immu-

nological Properties for two Isoforms of Glutathione Reductase from Eastern White Pi-ne Needles. Plant Physiology 94: 1402-1409.

Andreae MO. 1986. The ocean as a source of atmospheric sulfur compounds. In: Buat-Ménard P, ed. The Role of Air-Sea Exchange in Geochemical Cycling. Dordrecht,

boston, Lancaster, Tokyo: D. Reidel Publishing Company, 331-362.

Andreoli C, Moro I, LaRocca N, DallaValle L, Masiero L, Rascio N, DallaVecchia F. 2000. Ecological, physiological, and biomolecular surveys on microalgae from Ross Sea (Antarctica). Italian Journal of Zoology 67: 147-156.

Arakawa T, Carpenter JF, Kita YA, Crowe JH. 1990. The basis for toxicity of certain cryoprotectants: a hypothesis. Cryobiology 27: 401-415.

Arakawa T, Timasheff SN. 1985. The stabilization of proteins by osmolytes. Biophysi-

cal Journal 47: 411-414.

Assur A. 1958. Composition of sea ice and its tensile strength. Natural Research

Council Publications 598: 106-138.

Atilio B, Causin HF. 1996. The Central Role of Amino Acids on Nitrogen Utilization and Plant Growth. Journal of Plant Physiology 149: 358-362.

Aziz A, Martin-Tanguy J, Larher F. 1999. Salt stress-induced proline accumulation

and changes in tyramine and polyamine levels are linked to ionic adjustment in tomato leaf discs. Plant Science 145: 83-91.

Bandurska H. 2000. Does proline accumulated in leaves of water deficit stressed bar-

ley plants confine cell membrane injury? I. Free proline accumulation and membrane injury index in drought and osmotically stressed plants. Acta Physiologiae Plantarum 22: 409-415.

Bartsch A. 1989. Die Eisalgenflora des Wedellmeeres (Antarktis): Artenzusammen-setzung und Biomasse sowie Ökophysiologie ausgewählter Arten. Berichte zur Polar-

forschung 63.


200

Basch JJ, Wickham D, Farrell Jr HM. 1996. Pyrroline-5-Carboxylate Reductase in Lactating Bovine Mammary Glands. Journal of Dairy Science 79: 1361-1368.

Bates LS, Waldren RP, Teare ID. 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil 39: 205-207.

Berges JA, Fisher AE, Harrison PJ. 1993. A comparison of Lowry, Bradford and

Smith protein assays using different protein standards and protein isolated from the marine diatom Thalassiosira pseudonana. Marine Biology 115: 187-193.

Bianchi F, Boldrin A, Cioce F, Dieckmann G, Kuosa H, Larsson A-M, Nöthig E-M, Sehlstedt P-I, Socal G, Syvertsen EE. 1992. Phytoplankton distribution in relation to

sea ice, hydrography and nutrients in the northwestern Weddell Sea in early spring 1988 during EPOS. Polar Biology 12: 225-235.

Bidwell JP, Spotte S. 1985. Artificial Seawaters. Formulas and Methods. Boston:

Jones and Bartlett Publishers, Inc.

Bishop SH, Greenwalt DE, Kapper MA, Paynter KT, Ellis LL. 1994. Metabolic Regu-

lation of Proline, Glycine, and Alanine Accumulation as Intracellular Osmolytes in Rib-bed Mussel Gill Tissue. The Journal of Experimental Zoology 268: 151-161.

Bisson MA, Kirst GO. 1995. Osmotic Acclimation and Turgor Pressure Regulation in Algae. Naturwissenschaften 82: 461-471.

Bligny R, Roby C, Douce R. 1989. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance stud-ies in higher plant cells. In: Pfeffer PE, Gerasimowicz WV, eds. Nuclear magnetic reso-

nance in agriculture. Boca Raton: CRC Press Inc., 72-87.

Blunden G, Smith BE, Irons MW, Yang M-H, Roch OG, Patel AV. 1992. Betaines and Tertiary Sulphonium Compounds from 62 Species of Marine Algae. Biochemical

Systematics and Ecology 20: 373-388.

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemis-

try 72: 248-254.

Bressan RA, Hasegawa PM, Pardo JM. 1998. Plants use calcium to resolve salt stress. trends in plant science 3: 411-412.


201

Brierley AS, Thomas DN. 2002. The ecology of Southern Ocean pack ice. In: South-ward AJ, Tyler PA, Young CM, Fuiman LA, eds. Advances in Marine Biology. London:

Academic Press Ltd., 171-214.

Brown AD, Simpson JR. 1972. Water Realtions of Sugar-tolerant Yeasts: the Role of Intracellular Polyols. Journal of General Microbiology 72: 589-591.

Brugière N, Dubois F, Limami AM, lelandais M, Roux Y, Sangwan RS, Hirel B. 1999. Glutamine Synthetase in the Phloem Plays a Major Role in Controlling Proline Production. The Plant Cell 11: 1995-2011.

Buma AGJ. 1992. Factors controlling phytoplankton growth and species composition

in the Antarctic Ocean. Dissertation, Rijksuniversiteit Groningen.

Burg MB. 1992. Molecular Basis for Accumulation of Compatible Osmolytes in Mam-malin Cells. In: Somero GN, Osmond CB, Bolis CL, eds. Water and Life. Comparative

Analysis of Water Relationships at the Organismic, Cellular, and Molecular Levels. Ber-

lin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer Verlag, 33-51.

Burger U. 2002. Struktur- und Funktionanalysen am osmotisch regulierten Transpor-

ter BetP aus Corynebacterium glutamicum. Dissertation, Universität zu Köln.

Burton RS. 1991. Regulation of Proline Synthesis During Osmotic Stress in the Cope-pod Tigriopus californicus. The Journal of Experimental Zoology 259: 166-173.

Carpenter JF, Crowe JH. 1988. The Mechanism of cryoprotection of proteins by

Solutes. Cryobiology 25: 244-255.

Challenger F. 1959. Aspects of the organic chemistry of sulphur. London: Butterworths

Scientific Publications.

Chang J-Y, Knecht R, Braun DG. 1981. Amino acid analysis at the picomol level. Ap-plication to the C-terminal sequence analysis of polypeptides. Biochemical Journal 199: 547-555.

Chang Y-C, Lee T-M. 1999. High temperature-induced free proline accumulation in gracilaria tenuistipitata (Rhodophyta). Bot.Bull.Acad.Sin. 40: 289-294.

Charest C, Phan CT. 1990. Cold acclimation of wheat (Triticum aestivum): Properties of enzymes involved in proline metabolism. Physiologia Plantarum 80: 159-168.


202

Charlson RJ, Lovelock.J.E. , Andreae MO, Warren SE. 1987. Oceanic phytoplank-ton, atmospheric sulphur, cloud albedo and climate. Nature 326: 655-661.

Chen CT, Chen L-M, Kao CH. 2001. Regulation of proline accumulation in detached rice leaves exposed to excess copper. Plant Science 160: 283-290.

Chen CT, Kao CH. 1993. Osmotic stress and water stress have opposite effects on putrescine and proline production in excised rice leaves. Plant Growth Regulation 13: 197-202.

Chen Q, Silflow CD. 1996. Isolation and Characterization of Glutamine Synthetase Genes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology 112: 987-996.

Chilson OP, Kelly-Chilson AE, Diani J. 1997. Pyrroline-5-carboxylate reductases in

soybean nodules: the enzymes in host cytosol and bacteroids are antigenically distinct. Plant Science 122: 43-50.

Clark ME. 1985. The Osmotic Role of Amino Acids: Discovery and Function. In: Gilles R, Gilles-Baillien M, eds. Transport Processes, Iono- and Osmoregulation (Current

Comparative Approach). Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo : Springer Verlag, 412-

423.

Clarke A, Leakey JG. 1996. The seasonal cycle of phytoplankton, macronutrients, and the microbial community in a nearshore Antarctic marine ecosystem. Journal of Lim-

nology and Oceanography 41: 1281-1294.

Colmer TD, Corradini F, Cawthray GR, Otte ML. 2000. Analysis of Dimethylsulpho-

niopropionate (DMSP), Betaines and other Organic Solutes in Plant Tissue Extracts using HPLC. Phytochemical Analysis 11: 163-168.

Cota GF, Prinsenberg S, Bennett EB, Loder JW, Lewis MR, Anning JL, Watson NHF. 1987. Nutrient fluxes during extended blooms of Arctic ice algae. Journal of Geo-

physical Research 92: 1951-1962.

Cota GR, Horne EPW. 1989. Physical control of Arctic ice algal production. Marine

Ecology - Progress Series 52: 111-121.

Crawford RM, Hinz F, Honeywill C. 1998. Three species of the diatom genus Core-

thron Castracane: structure, distribution and taxonomy. Diatom Research 13: 1-28.


203

Crippen RW, Perrier JL. 1974. The use of Neutral Red and Evans Blue for live-dead-determinations of marine plankton. Stain Technology 49: 97-104.

Crowe JH, Carpenter JF, Crowe LM, Anchordoguy TJ. 1990. Are freezing and de-

hydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing so-lutes with biomolecules. Cryobiology 27: 219-231.

Dashek WV, Erickson SS. 1981. Isolation, Assay, Biosynthesis, Metabolism, Uptake and Translocation, and Function of Proline in Plant Cells ans Tissues. The Botanical

Review 47: 349-385.

DasSarma S, Arora P. 2001. Halophiles. Encyclopedia of Life Sciences / Nature Pub-

lishing Group / www.els.net Manhattan Press: 1-9.

de Roeck-Holtzhauer Y, Claire C, Bresdin F, Amicel L, Derrien A. 1993. Vitamin,

Free Amino Acid and Fatty Acid Compositions of Some Marine Planktonic Microalgae Used in Aquaculture. Botanica Marina 36: 321-325.

de Souza MP, Chen YP, Yoch DC. 1996. Dimethylsulfoniopropionate lyase from the marine macroalga Ulva curvata: purification and characterization of the enzyme. Planta 199: 433-438.

de Souza MP, Yoch DC. 1995. Comparative Physiology of Dimethyl Sulfide Produc-tion by Dimethylsulfonioprpionate Lyase in Pseudomonas doudoroffii and Alcaligenes sp. Strain M3A. Applied and Envionmental Microbiology 61: 3986-3991.

Derrien A, Coiffard LJM, Coiffard C, de Roeck-Holtzhauer Y. 1998. Free amino acid

analysis of five microalgae. Journal of Applied Phycology 10: 131-134.

Dickson DMJ, Kirst GO. 1986. The role of β-dimethylsulphoniopropionate, glycine be-

taine and homarine in the osmoacclimation of Platymonas subcordiformis. Planta 167: 536-543.

Dickson DMJ, Kirst GO. 1987. Osmotic adjustment in marine eukaryotic algae: the

role of inorganic ions, quarternary ammonium, tertiary sulphonium and carbohydrate solutes. I. Diatoms and Rhodophyte. The New Phytologist 106: 645-655.

Dieckmann GS, Kipfstuhl S. 1995. Unterwassereis und grüne Eisberge. In: Hempel I, Hempel G, eds. Biologie der Polarmeere. Jena, Stuttgart, New York: Gustav Fischer

Verlag, 86-94.


204

DiTullio GR, Garrison DL, Mathot S. 1998. Dimethylsulfoniopropionate in sea ice al-gae from the Ross Sea polynya. Antarctic Sea Ice Biological Processes, Interactions,

and Variability.Antarctic Research Series 73: 139-146.

Dmitrieva NI, Michea LF, Rocha GM, Burg MB. 2001. Cell cycle delay and apoptosis in response to osmotic stress 2. Comparative Biochemistry and Physiology A -

Molecular and Integrative Physiology 130: 411-420.

Dortch Q, Clayton JR, Jr., Thoresen SS, Cleveland JS, Bressler SL, Ahmed SI. 1985. Nitrogen storage and use of biochemical indices to assess nitrogen deficiency and growth rate in natural plankton populations. Journal of Marine Research 43: 437-

464.

Dortch Q, Clayton JR, Thoresen SS, Ahmed SI. 1984. Species differences in accu-mulation of nitrogen pools in phytoplankton. Marine Biology 81: 237-250.

Drnevich D, Vary TC. 1993. Analysis of physiological amino acids using dabsyl deri-vatization and reversed-phase liquid chromatography. Journal of Chromatography 613: 137-144.

Duman JG, Wu DW, Yeung KL, Wolf EE. 1992. Hemolymph Proteins Involved in the

Cold Tolerance of Terrestrial Arthropods: Antifreeze and Ice Nucleator Proteins. In: Somero GN, Osmond CB, Bolis CL, eds. Water and Life. Comparative Analysis of Wa-

ter relationships at the Organismic, Cellular, and Molecular Levels. Berlin, Heidelberg,

New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag,

282-300.

Eicken H, Lensu M, Leppäranta M, Tucker WB, Gow AJ, Salmela O. 1995. Thick-

ness, structure, and properties of level summer multi year ice in the Eurasian sector of the Arctic Ocean. Journal of Geophysical Research 100: 22,697-22,710.

Eicken H. 1992. The role of sea ice in structuring Antarctic ecosystems. Polar Biology 12: 3-13.

Eicken H. 1995. Wie polar wird ein Polarmeer durch das Meereis? In: Hempel I, Hem-pel G, eds. Biologie der Polarmeere. Jena, Stuttgart, New York: Gustav Fischer Verlag,

58-76.

El-Sayed SZ, Fryxell GA. 1993. Phytoplankton. Antarctic Microbiology 1: 65-122.


205

Elvers D. (unveröffentlicht): Untersuchungen zum Sinkverhalten der Diatomee Core-

thron criophilum: Einfluß von Licht, Nährstoffangebot, Energiestatus, Morphologie und

Lebenszyklus. Diplomarbeit, Universität Bremen 1998.

Erdmann N, Hagemann M. 2001. Salt Acclimation of Algae and Cyanobacteria: A comparison. In: Rai LC, Gaur JP, eds. Algal Adaptation to Environmental Stresses.

Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 323-361.

Fedina IS, Benderliev KM. 2000. Response of Scenedesmus incrassatus to salt stress as affected by methyl jasmonate. Biologia Plantarum 43: 625-627.

Fiala M, Oriol L. 1990. Light-Temperature Interactions on the Growth of Antarctic Dia-toms. Polar Biology 10: 629-636.

Fields PA. 2001. Review: Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility. Comparative Biochemistry and Physiology A – Molecular and Integrative

Physiology 129: 417-431.

Flynn KJ, Hipkin CR. 1990. Changes in intracellular amino acids and gluta-mine:glutamat during N-deprivation and feeding in Candida nitratophila. The New Phy-

tologist 114: 435-440.

Flynn KJ. 1990a. Composition of intracellular and extracellular pools of amino acids, and amino acid utilization of microalgae of different sizes. Journal of Experimental Ma-

rine Biology and Ecology 139: 151-166.

Flynn KJ. 1990b. The determination of nitrogen status in microalgae. Marine Ecology

Progress Series 61: 297-307.

Forlani G, Mangiagalli A, Pinter C, Nielsen E. 2000. Expression of delta-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase and proline / ariginine homeostatsis in Solanum tubero-

sum. Physiologia Plantarum 110: 22-27.

Forlani G, Scainelli D, Nielsen E. 1997. Delta1-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydro-genase from Cultured Cells of Potato. Purification and Properties. Plant Physiology 113: 1413-1418.

Foyer CH, Descourvieres P, Kunert KJ. 1994. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants. Plant Cell and Environment 17: 507-523.


206

Frankenstein G, Garner R. 1967. Equations for determining the brine volume of sea ice from -0.5°C to -22°C. Journal of Glaciology 6: 943-944.

Fujita T, Maggio A, Garcia-Rios M, Bressan RA, Csonka LN. 1998. Comparative

Analysis of the Regulation of Expression and Structures of Two Evolutionary Divergent Genes for delta1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase from Tomato. Plant Physiology 118: 661-674.

Gage DA, Rathinaasabapathi B . 1999. Role of Glycine Betaine and Dimethylsulfo-

niopropionate in Water-Stress Tolerance. In: Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, eds. Molecular Responses to Cold, Drought, Heat and Salt Stress in Higher Plants.

Austin, Texas, USA: R.G. Landes Company, 125-152.

Galinski EA. 1995. Halophile und halotolerante Eubakterien. In: Hausmann K, Kremer BP, eds. Extremophile. Mikroorganismen in ausgefallenen Lebensräumen. Weinheim,

New York, Basel, Cambridge, Tokyo: VCH, 89-112.

Garcia-Rios M, Fujita T, LaRosa PC, Locy RD, Clithero JM, Bressan RA, Csonka LN. 1997. Cloning of a polycistronic cDNA from tomato encoding gamma-glutamyl kinase and gamm-glutamyl phosphate reductase. Proceedings of the National Acad-

emy of Sciences USA 94: 8249-8254.

Garrison DL, Ackley SF, Buck KR. 1983. A physical mechanism for establishing algal populations in frazil ice. Nature 306: 363-365.

Gibon Y, Sulpice R, Larher F. 2000. Proline accumulation in canola leaf discs sub-

jected to osmotic stress is related to the loss of chlorophylls and to the decrease of mitochondrial activity. Physiologia Plantarum 110: 469-476.

Girija C, Smith BN, Swamy PM. 2002. Interactive effects of sodium chloride and cal-

cium chloride on the accumulation of proline and glycinebetaine in peanut (Arachis hy-pogaea L.). Environmental and Experimental Botany 47: 1-10.

Gleitz M, Bartsch A, Dieckmann GS, Eicken H. 1998. Composition and succession

of sea ice diatom assemblages in the eastern and southern Weddell Sea, Antarctica. Antarctic Sea Ice Biological Processes, Interactions, and Variability. Antarctic Research

Series 73: 107-120.


207

Gleitz M, Kirst GO. 1991. Photosynthesis-irradiance relationships and carbon metabo-

lism of different ice algal assemblages collected from Weddell Sea pack ice during aus-tral spring (EPOS 1). Polar Biology 11: 385-392.

Gleitz M, Kukert H, Riebesell U, Dieckmann GS. 1996. Carbon acquisition and growth of Antarctic sea ice diatoms in enclosed bottle incubations. Marine Ecology


Gleitz M, Rutgers v.d.Loeff M, Thomas DN, Dieckmann GS, Millero FJ. 1995. Comparison of summer and winter inorganic carbon, oxygen and nutrient concentra-tions in Antarctic sea ice brine. Marine Chemistry 51: 81-91.

Gleitz M, Thomas DN. 1992. Physiological responses of a small Antarctic diatom (Chaetocerossp.) to simulated environmental constraints associated with sea-ice for-mation. Marine Ecology - Progress Series 88: 271-278.

Gleitz M, Thomas DN. 1993. Variation in phytoplankton standing stock, chemical

composition and physiology during sea-ice formation in the southeastern Weddell Sea, Antarctica. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 173: 211-230.

Gordon AL. 1981. Seasonality of the Southern Ocean sea ice. Journal of Geophysical

Research 86: 4193-4197.

Gorham J. 1984. Separation of Plant Betaines and their Sulphur Analogues by Cation-Exchange High-Performance Liquid Chromatography. Journal of Chromatography 287: 345-351.

Gounot AM, Russell NJ. 1999. Physiology of cold-adapted microorganisms. In: Mar-gesin R, Schinner F, eds. Cold-Adapted Organisms. Ecology, Physiology, Enzymology

and Molecular Biology. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 33-55.

Grabowski V. (unveröffentlicht): Temperatur-, licht- und wachstumsbedingte Verän-

derungen im Fettsäuregehalt und in der Fettsäurezusammensetzung der antarktischen Eisdiatomeen Chaetoceros sp., Entomoneis kufferathii und Nitzschia lecointei. Diplom-

arbeit, Universität Bremen 1997.

Gröne T, Kirst GO. 1991. Aspects of dimethylsulphoniopropionate effects on enzymes isolated from the marine phytoplankter Tetraselmis subcordiformis (Stein). Journal of

Plant Physiology 138: 85-91.


208

Grossmann S, Gleitz M. 1993. Microbial responses to experimental sea-ice formation: implications for the establishment of Antarctic sea-ice communities. Journal of Experi-

mental Marine Biology and Ecology 173: 273-289.

Guillard RRL. 1975. Culture of Phytoplankton for Feeding Marine Invertebrates. In: Smith WL, Chanley MH, eds. Culture of Marine Invertebrate Animals. New York: Ple-

num Press, 29-60.

Günther S, Dieckmann GS. 1999. Seasonal development of algal biomass in snow-coverered fast ice and the underlying platelet layer in the Weddell Sea, Antarctica. Ant-

arctic Science 11: 305-315.

Günther S, Dieckmann GS. 2001. Vertical zonation and community transition of sea-ice diatoms in fast ice and platelet layer, Weddell Sea, Antarctica. Annals of Glaciology 33: 287-296.

Hamilton EW, Heckathorn SA. 2001. Mitochondrial adaptations to NaCl. Complex I is

protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is pro-tected by proline and betaine 4. Plant Physiology 126: 1266-1274.

Hanes CS. 1932. Studies on plant amylases. I. The effect of starch concentration upon the velocity of hydrolysis by the amylase of germinated barley. Biochemical Journal 26: 1406-1421.

Hanson AD, Rivoal J, Paquet L, Gage DA. 1994. Biosynthesis of 3-Dimethylsulfoniopropionate in Wollastonia biflora (L.) DC. Evidence That S-

Methylmethionine is an Intermediate. Plant Physiology 105: 103-110.

Hanson AD. 1992. Compatible Solute Synthesis and Compartimentation in Higher Plants. In: Somero GN, Osmond CB, Bolis CL, eds. Water and Life. Berlin, Heidelberg,

New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag, 52-60.

Hare PD, Cress WA, van Staden J. 1998. Dissecting the roles of osmolyte accumula-tion during stress. Plant Cell and Environment 21: 535-553.

Hare PD, Cress WA, van Staden. 1999. Proline synthesis and degradation: a model system for elucidating stress-related signal transduction. Journal of Experimental Bot-

any 50: 413-434.


209

Hare PD, Cress WA. 1997. Metabolic implications of stress-induced proline accumula-tion in plants. Plant Growth Regulation 21: 79-102.

Hargraves PE, French FW. 1983. Diatom resting spores: significance and strategies. In: Fryxell GA, ed. Survival strategies of the algae. Cambridge, London, New York,

New Rochelle, Melbourne, Sydney: Cambrige University Press, 49-68.

Hayashi F, Ichino T, Osanai M, Wada K. 2000. Oscillation and Regulation of Proline Content by P5CS and ProDH Gene Expressions in the Light/Dark Cycles in Arabidop-

sis thaliana L. Plant Cell Physiology 41: 1096-1101.

Hayzer DJ, Leisinger T. 1983. Proline Biosynthesis in Escherichia coli: Kinetic and mechanistic properties of glutamate semialdehyde dehydrogenase. Biochemical and

Biophysical research Communications 742: 391-398.

Hense I, Bathmann UV, Timmermann R. 2000. Plankton dynamics in frontal systems of the Southern Ocean. Journal of Marine Systems 27: 235-252.

Hernando M, Carreto JI, Carignan MO, Ferreyra GA, Gross C. 2002. Effects of solar

radiation on growth and mycosporine-like amino acids content in Thalassiosira sp, an Antarctic diatom. Polar Biology 25: 12-20.

Hochachka PW, Somero GN. 1980. Strategien biochemischer Anpassung. Stuttgart,

New York: Georg Thieme Verlag.

Hong Z, Lakkineni K, Zhang Z, Verma DPS. 2000. Removal of Feedback Inhibition of

delta1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase Results in Increased Proline Accumulation and Protection of Plants from Osmotic Stress. Plant Physiology 122: 1129-1136.

Horner R, Ackley SF, Dieckmann GS, Gulliksen B, Hoshiai T, Legendre L, Melnikov IA, Reeburgh WS, Spindler M, Sullivan CW. 1992. Ecology of sea ice biota: 1. Habitat, terminology, and methodology. Polar Biology 12: 417-427.

Hua XJ, vandeCotte B, VanMontagu M, Verbruggen N. 2001. The 5 ' untranslated

region of the At-P5R gene is involved in both transcriptional and post-transcriptional regulation. Plant Journal 26: 157-169.

Igarashi Y, Yoshiba Y, Sanada Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Wada K, Shinozaki K. 1997. Characterization of the gene for delta-pyrroline-5-carboxylate synthetase and


210

correlation between the expression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L. Plant Molecular Biology 33: 857-865.

Iyer S, Caplan A. 1998. Products of Proline Catabolism Can Induce Osmotically Regu-lated Genes in Rice. Plant Physiology 116: 203-211.

Jackson AE, Ayer SW, Laycock MV. 1992. The effect of salinity on growth and amino acid composition in the marine diatom Nitzschia pungens. Canadian Journal of Botany 70: 2198-2201.

Jain M, Mathur G, Koul S, Sarin NB. 2001. Ameliorative effects of proline on salt stress-induced lipid peroxidation in cell lines of groundnut (Arachis hypogaea L.). Plant

Cell Reports 20: 463-468.

Jeffrey SW, Humphrey GF. 1975. New Spectrophotometric Equations for Determining Chlorophylls a, b, c1 and c2 in Higher Plants, Algae and Natural Phytoplankton. Bio-

chemie und Physiologie der Pflanzen 167: 191-194.

Kang S-H, Fryxell GA. 1992. Fragilariopsis cylindrus (Grunow) Krieger: The most

abundant diatom in water column assemblages of Antarctic marginal ice-edge zones. Polar Biology 12: 609-627.

Kang SH, Kang JS, Lee S, Chung KH, Kim D, Park MG. 2001. Antarctic

phytoplankton assemblages in the marginal ice zone of the northwestern Weddell Sea. Journal of Plankton.Research 23: 333-352.

Karsten U, Thomas DN, Weykam G, Daniel C, Kirst GO. 1991. A simple and rapid

method for extraction and separation of low molecular weight carbohydrates from macroalgae using high-performance liquid chromatography. Plant Physiology and Bio-

chemistry 29: 373-378.

Karsten U, Wiencke C, Kirst GO. 1990. The effect of light intensity and daylenght on

the beta-dimethylsulphoniopropionate (DMSP) content of marine green macroalgae from Antarctica. Plant, Cell and Environment 13: 989-993.

Karsten U. 1991. Ökophysiologische Untersuchungen zur Salinitätstoleraz

antarktischer Grünalgen unter besonderer Berücksichtigung des beta-Dimethylsulfoniumpropionat- (DMSP)-Stoffwechsels. Berichte zur Polarforschung 79.


211

Kawabe T, Nagaoka T, Nagahama G, Morita H, Ohbayashi A. 1989. Generation of Dimethyl Sulfide from Dimethyl-beta-propiothetin in an Extract of Green Alga Mono-

stroma nitidum and Its Retenion by Cyclodextrin. Agricultural and Biological Chemistry 53: 2587-2591.

Keller MD, Selvin RC, Claus W, Guillard RRL. 1987. Media for the culture of Ultra-plankton. Journal of Phycology 23: 633-638.

Kemble AR, MacPherson HT. 1954. Liberation of amino acids in perennial rye grass during wilting. Biochemical Journal 58: 46-59.

Ketchum REB, Warren RS, Klima LJ, Lopez-Gutiérrez F, Nabors MW. 1991. The

Mechanism and Regulation of Proline Accumulation in Suspension Cell Cultures of the Halophytic Grass Distichlis spicata L. Journal of Plant Physiology 137: 368-374.

Kiene RP, Linn LJ, Bruton JA. 2000. New and important roles for DMSP in marine microbial communities. Journal of Sea Research 43: 209-224.

Kinraide TB. 1999. Interactions among Ca2+, Na + and K+ in salinity toxicity: quantita-tive resolution of multiple toxic and ameliorative effects. Journal of Experimental Botany 50: 1495-1505.

Kirst GO, Bisson MA. 1979. Regulation of Turgor Pressure in Marine Algae: Ions and Low-molecular-weight Organic Compounds. Australien Journal of Plant Physiology 6: 539-556.

Kirst GO, Thiel C, Wolff H, Nothnagel J, Wanzek M, Ulmke R. 1991. Dimethyl-

sulfonoipropionate (DMSP) in ice-algae and its possible biological role. Marine

Chemistry 35: 381-388.

Kirst GO, Wiencke C. 1995. Ecophysiology of Polar Algae. Journal of Phycology 31: 181-199.

Kirst GO. 1985. Osmotische Adaptation bei Algen. Naturwissenschaften 72: 125-132.

Kirst GO. 1989. Salinity tolerance of eukaryotic marine algae. Annual Review of Plant

Physiology and Plant Molecular Biology 40: 21-53.

Kirst GO. 1995a. Halophile Mikroalgen. In: Hausmann K, Kremer BP, eds. Extremophi-

le. Mikroorganismen in ausgefallenen Lebensräumen. Weinheim, New York, Basel,

Cambridge, Tokyo: VCH, 159-176.


212

Kirst GO. 1995b. Influence of Salinity on Algal Ecosystems. In: Wiessner W, Schnepf E, Starr RC, eds. Algae, Environment and Human Affairs. Bristol: Biopress Ltd., 123-

142.

Kirst GO. 1996. Osmotic Adjustment in Phytoplankton and Macroalgae. the Use of

Dimethylsulfoniopropionate (DMSP). In: Kiene RP, Visscher PT, Keller MD, Kirst GO, eds. Biological and Enviromental Chemistry of DMSP and Related Sulfonium Com-

pounds. New York: Plenum Press, 121-129.

Kiyosue T, Yoshiba Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1996. A Nuclear

Gene Encoding Mitochondrial Proline Dehydrogenase, an Enzyme Involved in Proline Metabolism, Is Upregulated by Proline but Downregulated by Dehydration in Arabidop-sis. The Plant Cell 8: 1323-1335.

Krembs C, Gradinger R, Spindler M. 2000. Implications of brine channel geometry and surface area for the interaction of sympagic organisms in Arctic sea ice. Journal of

Experimental Marine Biology and Ecology 243: 55-80.

Kremer BP. 1978. Improved method for the thin-layer chromatographic identification of alditols. Journal of Chromatography 166: 335-337.

Kremer BP. 1982. Trennung und Nachweis pflanzlicher Polyole. Biologie in unserer

Zeit 12: 91-94.

Krueger R, Jäger H-J, Hintz M, Pahlich E. 1986. Purification to Homogeneity of Pyr-roline-5-Carboxylate Reductase of Barley. Plant Physiology 80: 142-144.

Kunte HJ, Galinski EA, Trüper HG. 1993. A modified FMOC method for the detection of Amino acid type osmolytes and tetrahydropyrimidines (ectoines). Journal of Microbi-

ological Methods 17: 129-136.

Kuwata A, Hama T, Takahashi M. 1993. Ecophysiological characterization of two life forms, resting spores and resting cells, of a marine planktonic diatom, Chaetoceros

pseudocurvisetus, formed under nutrient depletion. Marine Ecology Progress Series 102: 245-255.

Kuwata A, Takahashi M. 1999. Survival and recovery of resting spores and resting cells of the marine planktonic diatom Chaetoceros pseudocurvisetus under fluctuating nitrate conditions. Marine Biology 134: 471-478.


213

Kuznetsov VIV, Shevyakova NI . 1999. Proline under Stress: BIOLOGICAL Role, Me-tabolism, and Regulation. Russian Journal of Plant Physiology 46: 274-287.

Laliberté G, Hellebust JA. 1989. Pyrroline-5-Carboxylate Reductase in Chlorella

autotrophica and Chlorella saccharophila in Relation to Osmoregulation. Plant Physiol-

ogy 91: 917-923.

Lamosa P, Martins LO, da Costa MS, Santos H. 1998. Effects of Temperature, Salin-ity, and Medium composition on Compatible Solute Accumulation by Thermococcus

ssp. Applied and Envionmental Microbiology 64: 3591-3598.

Laroche D, Vézina AF, Levasseur M, Gosselin M, Stefels J, Keller MD, Matrai PA, Kwint RLJ. 1999. DMSP synthesis and exudation in phytoplankton: a modeling ap-proach. Marine Ecology Progress Series 180: 37-49.

LaRosa PC, Rhodes D, Rhodes JC, Bressan RA, Csonka LN. 1991. Elevated

Accumulation of Proline in NaCl-Adapted Tobacco Cells Is Not Due to Altered delta1-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase. Plant Physiology 96: 245-250.

Le Rudulier D, Strom AR, Dandekar AM, Smith LT, Valentine RC. 1984. Molecular Biology of Osmoregulation. Science 224: 1064-1068.

Ledyard KM, Dacey JWH. 1994. Dimethylsulfide production from dimethylsulfonio-propionate by a marine bacterium. Marine Ecology Progress Series 110: 95-103.

Lee PA, de Mora SJ. 1999. Intracellular dimethylsulfoxide (DMSO) in unicellular ma-rine algae: speculations on its origin and possible biological role. Journal of Phycology

35: 8-18.

Lee T-M, Chang Y-C, Lin Y-H. 1999. Differences in physiological responses between winter and summer Gracilaria tenuistipitata (Gigartinales, Rhodophyta) to varying tem-perature. Bot.Bull.Acad.Sin. 49: 93-100.

Lee T-M, Liu C-H. 1999. Correlation of decreased calcium contents with proline accu-mulation in the marine green macroalga Ulva fasciata exposed to elevated NaCl con-tents in seawater. Journal of Experimental Botany 50: 1855-1862.

Lee T-M. 1998a. Changes in activities and properties of biosynthetic enzymes in rela-tion to high-tempertature-induced proline accumulation in Gracilaria tenuistipitata (Gigartinales, Rhodophyta). Phycologia 37: 433-438.


214

Lee T-M. 1998b. The role of proline dehydrogenase and delta1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase in the regulation of proline homeostasis in Gracilaria tenuistipitata (Gi-

gartinales, Rhodophyta) exposed to high temperature. Phycologia 37: 439-442.

Lehmal H. 1999. Adaptation to low temperatures: lipids in ice diatoms. Reports on Po-

lar Research 317.

Leppäranta M, Manninen T. 1988. The brine and gas content of sea ice with attention to low salinities and high temperatures. Finnish Institute of Marine Research, Internal

Report 1-14.

Liu MS, Hellebust JA. 1976a. Effects of salinity and osmolarity of the medium on amino acid metabolism in Cyclotella cryptica. Canadian Journal of Botany 54: 938-948.

Liu MS, Hellebust JA. 1976b. Effects of salinity changes on growth and metabolism of the marine centric diatom Cyclotella cryptica. Canadian Journal of Botany 54: 930-937.

Liu MS, Hellebust JA. 1976c. Regulation of proline metabolism in the marine centric diatom Cyclotella cryptica. Canadian Journal of Botany 54: 949-959.

Liu T, van Staaden J. 2000. Selection and characterization of sodium chloride-tolerant callus of Glycine max. (L.) Merr cv. Acme. Plant Growth Regulation 31: 195-207.

Lohrenz SE, Taylor CD. 1987. Inorganic 14C as a probe of growth rate-dependent

variations in intracellular free amino acid and protein composition of NH4+-limited conti-

nous cultures of Nannochloris atomis Butcher*. Journal of Experimental Marine Biology

and Ecology 106: 31-55.

Lottspeich F, Zorbas H. 1998. Bioanalytik. Heidelberg, Berlin: Spektrum Akademi-

scher Verlag GmbH.

Lovelock J. 1991. Das Gaia-Prinzip. Die Biographie unseres Planeten. Frankfurt am

Main, Leipzig: Insel Verlag.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry 193: 265-275.

Lutts S, Majerus V, Kinet JM. 1999. NaCl effects on proline metabolism in rice (Oryza

sativa) seedlings. Physiologia Plantarum 105: 450-458.


215

Macdonald CJ, Little R, Moore GR, Malin G. 1996. NMR spectroscopy as a probe for

DMSP and glycine betaine in phytoplankton cells. In: Kiene RP, Visscher PT, Keller MD, Kirst GO, eds. Biological and Environmental Chemistry of DMSP and Related Sul-

fonium Compounds. New York, London: Plenum Press, 45-54.

Madan S, Nainawatee HS, Jain RK, Chowdhury JB. 1995. Proline and Proline Me-tabolism Enzymes in in-vitro Selected NaCl-tolerant Brassica juncea L. under Salt Stress. Annals of Botany 76: 51-57.

Malin G, Kirst GO. 1997. Algal production of dimethyl sulfide and its atmospheric role. Journal of Phycology 33: 889-896.

Marsot P, Cembella AD, Colombo JC. 1991. Intracellular and Extracellular Amino Acid Pools of the Marine diatom Phaeodactylum tricornutum (Bacillariophyceae) grown on Unenriched Seawater in High-Cell-Density Dialysis Culture. Journal of Phycology 27: 478-491.

Martin-Jézéquel V, Sournia A, Birrien J-L. 1992. A daily study of the diatom spring

bloom at Roscoff (France) in 1985. III. Free amino acids composition studied by HPLC analysis. Journal of Plankton Research 14: 409-421.

Matrai PA, Keller MD. 1994. Total organic sulfur and dimethylsulfoniopropionate in marine phytoplankton: intracellular variations. Marine Biology 119: 61-68.

McGrath Grossi S, Sullivan CW. 1985. Sea Ice Microbial Communities. V. The ver-tical Zonation of Diatoms in an Antarctic Fast Ice Communitiy. Journal of Phycology 21: 401-409.

McNeil SD, Nuccio ML, Hanson AD. 1999. Betaines and Related Osmoprotectants. Targets for Metabolic Engineering of Stress Resistance. Plant Physiology 120: 945-

949.

Meile L, Leisinger T. 1982. Purification and Properties of the Bifunctional Proline De-hydrogenase / 1-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase from Pseudomonas aerugi-

nosa. European Journal of Biochemistry 129: 67-75.

Mezl VA, Knox WE. 1976. Properties and Analysis of a Stable Derivative of Pyrroline-5-Carboxylic Acid for Use in Metabolic Studies. Analytical Biochemistry 74: 430-440.


216

Miller KJ, Wood JM. 1996. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annual Review

of Microbiology 50: 101-136.

Moro I, Paccagnella R, Barbante C, Andreoli C. 2000. Microalgal communities of the

sea ice, ice-covered and ice- free waters of Wood Bay (Ross Sea, Antarctica) during the austral summer 1993-94. Marine Ecology – Pubblicazioni Della Stazione Zoologica

di Napoli I 21: 233-245.

Munns R, Greenway H, Kirst GO. 1983. Halotolerant Eukaryotes. In: Lange OL, No-bel PS, Osmond CB, Ziegler H, eds. Encyclopedia of Plant Physiology, N.S., Vol. 12C:

Physiology Plant Ecology III. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 59-135.

Nakashima K, Satoh R, Kiyosue T, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1998. A

Gene Encoding Proline Dehydrogenase Is Not Only Induced by Proline and Hyperos-molarity, but Is Also Develpmentally Regulated in the Reproductive Organs of Arabi-dopsis. Plant Physiology 118: 1233-1241.

Nanjo T, Kobayashi M, Yoshiba Y, Sanada Y, Wada K, Tsukaya H, Kakubari Y, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1999. Biological functions of proline in morphogenesis and osmotolerance revealed in antisense transgenic Arabidopsis

thaliana. The Plant Journal 18: 185-193.

Neftel A, Jacob P, Klockow D. 1984. Measurements of hydrogen peroxide in polar ice samples. Nature 311: 43-45.

Nishitani H, Kikuchi S, Okumura K, Taguchi H. 1995. Finding of a Homarine-

Synthesizing Enzyme in Turban Shell and Some Properties of the Enzyme. Archives

of Biochemistry and Biophysics 322: 327-332.

Nothnagel J. 1994. Der Einfluss von Salinität und Lichtintensität auf die Osmolytkon-

zentrationen, die Zellvolumina und die Wachstumsraten der antarktischen Eisdiato-

meen Chaetoceros sp. und Navicula sp. unter besonderer Berücksichtigung der

Iminosäure Prolin. Dissertation, Universität Bremen.

Oku O, Kamatani A. 1999. Resting spore formation and biochemical composition of the marine planktonic diatom Chaetoceros pseudocurvisetus in culture: ecological sig-

nificance of decreased nucleotide content and activation of the xanthophyll cycle by resting spore formation. Marine Biology 135: 425-436.


217

Oren A. 1999. Bioenergetic aspects of halophilism. Microbiological and Molecular Bio-

logical Review 63: 334.

Pakhomov EA, Ratkova TN, Froneman PW, Wassmann P. 2001. Phytoplankton dy-

namics at the ice-edge zone of the Lazarev Sea (Southern Ocean) during the austral summer 1994/1995 drogue study. Polar Biology 24: 422-431.

Paleg G, Stewart GR, Starr R. 1985. The effect of compatible solutes on proteins. Plant and Soil 89: 83-94.

Parsons TR, Maita Y, Lalli CM. 1984. A Manual of Chemical and Boilogical Methods for Seawater Analysis. In:A Manual of Chemical and Biological Methods for Seawater

Analysis. Pergamon Press.

Patrick R, Reimer CW. 1975. The Diatoms of the United States II, Part 1. Academy of

National Sciences Philadelphia Monogr. 13: 213.

Peters E, Thomas DN. 1996. Prolonged darkness and diatom mortality I: Marine Ant-arctic species. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 207: 25-41.

Plettner I. (unveröffentlicht): Der Einfluß von Stickstoffmangel auf die Eisdiatomee

Nitzschia lecointei VAN HEURCK bei verschiedenen Salinitäten: freie Aminosäuren

und Dimethylsulfoniumpropionat. Diplomarbeit, Universität Bremen 1997.

Rajendrakumar CSV, Suryanarayana T, Reddy AR. 1997. DNA helix destabilization by proline and betaine: possible role in the salinity tolerance process. FEBS Letters 410: 201-205.

Ramanjulu S, Sudhakar C. 2000. Proline metabolism during dehydration in two mul-berry genotypes with contrasting druoght tolerance. Journal of Plant Physiology 157: 81-85.

Rayapati PJ, Stewart CR, Hack E. 1989. Pyrroline-5-Carboxylate Reductase Is in Pea (Pisum sativum L.) Leaf Chloroplasts. Plant Physiology 91: 581-586.

Raymond JA. 2000. Distribution and partial characterization of ice-active molecules associated with sea-ice diatoms. Polar Biology 23: 721-729.

Rena AB, Splittstoesser WE. 1975. Proline dehydrogenase and pyrroline-5-carboxylate reductase from pumpkin cotyledons. Phytochemistry 14: 657-661.


218

Rhodes D, Hanson AD. 1993. Quaternary ammonium and tertiary sulfonium com-pounds in higher plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biol-

ogy 44: 357-384.

Riebesell U, Schloss I, Smetacek V. 1991. Aggregation of algae released from melt-ing sea-ice: Imlications for seeding and sedimmentation. Polar Biology 11: 239-248.

Roe JH. 1955. The determination of sugar in blood and spinal fluid with anthrone re-agent. Journal of Biological Chemistry 212: 335-343.

Roosens NH, Willem R, Li Y, Verbruggen I, Biesemans M, Jacobs M. 1999. Proline Metabolism in theWild-Type and in a Salt-Tolerant Mutant of Nicotiana plumbaginifolia Studied by 13C-Nuclear Magnetic Resonance Imaging. Plant Physiology 121: 1281-

1290.

Rott B. (unveröffentlicht): Untersuchungen zur Schwachlichtadaptation der antarkti-schen Eisalge Nitzschia lecointei (Van Heurck) mit Berücksichtigung des DMSP-

Gehaltes. Diplomarbeit, Universität Bremen 1993.

Rout NP, Shaw BP. 1998. Salinity tolerance in aquatic macrophytes: probable role of proline, the enzymes involved in its synthesis and C4 type of metabolism. Plant Science 136: 121-130.

Sakka A, Gosselin M, Levasseur M, Michaud S, Monfort P, Demers S. 1997. Ef-

fects of reduced ultraviolet radiation on aqueous concentrations of dimethylsulfonium-propionate and dimethylsulfide during a microcosm study in the Lower St. Lawrence Estuary. Marine Ecology Progress Series 149: 227-238.

Sanchez E, LopezLefebre LR , Garcia PC, Rivero RM, Ruiz JM, Romero L. 2001. Proline metabolism in response to highest nitrogen dosages in green bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Strike). Journal of Plant Physiology 158: 593-598.

Scarratt MG, Levasseur M, Schultes S, Michaud S, Cantin G, Vézina AF, Gosselin M, de Mora SJ. 2000. Production and consumption of dimethylsulfide (DMS) in North Atlantic waters. Marine Ecology - Progress Series 204: 13-26.

Schlee D. 1986. Ökologische Biochemie. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Sprin-

ger Verlag.


219

Schobert B, Tschesche H. 1978. Unusual solution properties of proline and its inter-action with proteins. Biochimica et Biophysica Acta 541: 270-277.

Schobert B. 1977a. The Anomalous Colligative Properties of Proline. Die Naturwis-

senschaften 64: 386.

Schobert B. 1977b. The Influence of Water Stress on the Metabolism of Diatoms: II. Proline Accumulation Under Different Conditions of Stress and Light. Zeitschrift für

Pflanzenphysiologie 85: 451-461.

Schobert B. 1980. Proline catabolism, relaxation of osmotic strain and membrane permeability in the diatom Phaeodactylum tricornutum. Physiologia Plantarum 50: 37-

42.

Schriek R. 2000. Effects of Light and Temperature on the Enzymatic Antioxidative Defense Systems in the Antarctic Ice Diatom Entomoneis kufferathii Manguin. Reports

on Polar Research 349.

Semeneh M, Dehairs F, Elskens M, Baumann MEM, Kopczynska EE, Lancelot C, Goeyens L. 1998. Nitrogen uptake regime and phytoplankton community structure in the Atlantic and Indian sectors of the Southern Ocean. Journal of Marine Systems 17: 159-177.

Shiono T, Kador PF, Kinoshita JJ. 1986. Purification and characterization of rat lens pyrroline-5-carboxylate reductase. Biochimica et Biophysica Acta 881: 72-78.

Silva Z, Borges N, Martins LO, da Costa RWMS, Santos H. 1999. Combined effect

of the growth temperature and salinity of the medium on the accumulation of compati-ble solutes by Rhodothermus marinus and Rhodothermus obamensis. Extremophiles 3: 163-172.

Smirnoff N, Cumbes QJ. 1989. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes. Phytochemistry 28: 1057-1060.

Smith CJ, Deutch AH, Rushlows KE. 1984. Purification and Characteristics of a gamma-Glutamyl Kinase Involved in Escherichia coli Proline Biosynthesis. Journal of

Bacteriology 157: 545-551.

Somero GN. 1992. Adapting to Water Stress: Convergence on Common Solutions. In: Somero GN, Osmond CB, Bolis CL, eds. Water and Life. Comparative Analysis of Wa-


220

ter Relationships at the Organismic, Cellular, and Molecular Levels. Berlin, Heidelberg,

New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag,

3-18.

Spindler M, Gradinger R. 1995. Meereis-Protisten. In: Hausmann K, Kremer BP, eds. Exremophile. Mikroorganismen in ausgefallenen Lebensräumen . Weinheim, New

York, Basel, Cambridge, Tokyo: VCH, 27-45.

Spindler M. 1990. A comparison of Arctic and Antarctic sea ice and the effects of dif-ferent properties on sea ice biota. In: Bleil U, Thiede J, eds. Geological history of the

Polar Oceans: Arctic Versus Antarctic. Kluwers Academis Publishers, 173-186.

Springer K. (unveröffentlicht): Der Einfluss von Salinität auf die antarktische Eisdiato-mee Chaetoceros sp.: Gehalt an organischen Säuren und Aminosäuren, insbesondere

Glutamin. Diplomarbeit, Universität Bremen 1996.

Squire VA. 1990. Sea ice: its formation, distribution and properties. In: Medlin LK, Priddle J, eds. Polar marine diatoms. Cambridge: British Antarctic Survey, 3-8.

Stefels J. 2000. Physiological aspects of the production and conversion of DMSP in marine algae and higher plants. Journal of Sea Research 43: 183-197.

Steinke M, Malin G, Archer SD, Burkill PH, Liss PS. 2002. DMS production in a coc-clithophorid bloom: evidence for the importance of dinoflagellate DMSP lyases. Aquatic

Microbial Ecology 26: 259-570.

Steinke M, Wolfe GV, Kirst GO. 1998. Partial characterisation of dimethylsulfonio-

propionate (DMSP) lyase isoenzymes in 6 strains of Emiliania huxleyi. Marine Ecology


Steinke M. 1997. Untersuchungen zum DMSP-Haushalt mariner Algen. Produktion

von DMS durch DMSP-spaltende-Lyasen in marinen Algen. Dissertation, Universität

Bremen; Cuvilier Verlag Göttingen.

Stines AP, Nayöor DJ, Hoj PB, van Heeswick R. 1999. Proline Accumulation in De-

veloping Grapevine Fruit Occurs Independently of Changes in the Levels of delta1-Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase mRNA or Protein. Plant Physiology 120: 923-931.

Strecker HJ. 1960. The Interconversion of Glutamic Acid and Proline. Journal of Bio-

logical Chemistry 235: 2045-2049.


221

Sullivan CW, Palmisano AC. 1981. Sea ice microbial communities in McMurdo Sound. Antarctic Journal of US 16: 126-127.

Sunda W, Kleber DJ, Kiene RP, Huntsmann S. 2002. An antioxidant function for DMSP and DMS in marine algae. Nature 418: 317-320.

Syrett PJ. 1981. Nitrogen metabolism of microalgae. Canadian Bulletin of Fish aquatic

Science 210: 182-210.

Takeuchi K, Toyohara H, Kinoshita M, Sakaguchi M. 2001. Ubiquitous increase in taurine transporter mRNA in tissues of tilapia (Oreochromis mossambicus) during high-salinity adaptation. Fish Physiology and Biochemistry 23: 173-182.

Taraldsvik M, Myklestad SM. 2000. The effect of pH on growth rate, biochemical composition and extracellular carbohydrate production of the marine diatom Skele-

tonema costatum. European Journal of Phycology 35: 189-194.

Thomas D, Dieckmann GS. 2002. Biogeochemistry of Antarctic sea ice. Oceanogra-

phy and Marine Biology: an Annual Review 40: 143-169.

Thomas DN, Baumann MEM, Gleitz M. 1992. Efficiency of carbon assimilation and photoacclimation in a small unicellular Chaetoceros species from the Weddell Sea (Antarctia): influence of temperature and irradiance. Journal of Experimental Marine

Biology and Ecology 157: 195-209.

Thomas DN, Dieckmann GS. 2002. Ocean science - Antarctic Sea ice - a habitat for extremophites. Science 295: 641-644.

Thomas DN, Kennedy H, Kattner G, Gerdes D, Gough C, Dieckmann GS. 2001. Biogeochemistry of platelet ice: its influence on particle flux under fast ice in the Wed-dell Sea, Antarctica. Polar Biology 24: 486-496.

Tilzer MM, Elbrächter M , Gieskes WWC, Beese B. 1986. Light-temperature interac-tions in the control of photosynthesis in Antarctic phytoplankton. Polar Biology 5: 105-

111.

Treichel S. 1986. The influence of NaCl on delta1-pyrroline-5-carboxylate reductase in proline-accumulating cell suspension cultures of Mesembryanthemum nodiflorum and other halophytes. Physiol.Plant. 67: 173-181.


222

Trenerry LJ, McMinn A, Ryan KG. 2002. In situ oxygen microelectrode measure-ments of bottom-ice algal production in McMurdo Sound, Antarctica. Polar Biology 25: 72-80.

Trevena AJ, Jones GB, Wright SW, van den Enden RL. 2000. Profiles of DMSP, al-gal pigments, nutrients and salinity in pack ice from eastern Antarctica. Journal of Sea

Research 43: 265-273.

Troll W, Lindsley J. 1955. A photometric method for the determination of proline. Journal of Biology and Chemistry 215: 655-660.

Turner SM, Malin G, Liss PS, Harbour DS, Holligan PM. 1988. The seasonal varia-

tion of dimethyl sulfide and dimethylsulfoniopropionate concentrations in nearshore wa-ters. Limnology and Oceanography 33: 364-375.

Vairavamurthy A, Andreae MO, Iverson RL. 1985. Biosynthesis of dimethylsulfide and dimethylpropiothetin by Hymenomonas carterae in relation to sulfur source and sa-linity variations. Limnology and Oceanography 30: 59-70.

Veeranjaneyulu K, Ranjita Kumari BD. 1989. Proline Metabolism During Water Stress in Mulberry. Journal of Experimental Botany 40: 581-583.

Vendrell J, Aviles FX. 1986. Complete Amino Acid Analysis of Proteins by Dabsyl De-rivatization and Reversed-Phase Liquid Chromatography. Journal of Chromatography 358: 401-413.

Verma DPS. 1999. Osmotic Stress Tolerance in Plants: Role of Proline and Sulfur Me-

tabolisms. In: Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, eds. Molecular Responses to

Cold, Drought, Heat and Salt Stress in Higher Plants. R.G. Landes Company, 153-168.

Vogel HJ, Davies BH. 1952. Glutamic gamma-Semialdehyde and delta1-Pyrroline-5-carboxylic Acid, Intermediates in the Biosynthesis of Proline. The Journal of American

Chemical Society 74: 109-112.

Vogel RH, Kopac MJ. 1960. Some properties of ornithine delta-transferase from Neu-

rospora. Biochimica et Biophysica Acta 37: 539-540.

Wang H-L, Lee P-D, Liu L-F, Su J-C. 1999. Effect of sorbitol induced osmotic stress

on the changes of carbohydrate and free amino acid pools in sweet potato cell suspen-sion cultures. Bot.Bull.Acad.Sin. 40: 219-225.


223

Wanzek M. 1994. Der Einfluss unterschiedlicher Temperaturen auf Wachstum, Photo-

synthese, Respiration und ausgewählte Inhaltsstoffe der antarktischen Diatomeen En-

tomoneis kufferathii Manguin und Nitzschia lecointei Van Heurck., Dissertation

Universität Bremen.

Watanabe K, Satoh H, Hoshiai T. 1990. Seasonal Variation in Ice Algal Assemblages in the Fast Ice Near Syowa Station in 1983/84. In: Kerry KR, Hempel G, eds. Antarctic

Ecosystems. Ecological Change and Conservation. Berlin, Heidelberg, New York, Lon-

don, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona: Springer-Verlag, 136-142.

Weeks WF, Ackley SF. 1982. The growth, structure, and properties of sea ice. USA

Cold Regions Research and Engineering Laboratory, CRREL Monograph 82-1, Hano-

ver, New Hampshire.

Weissenberger J. 1992. Die Lebensbedingungen in den Solekanälchen des antarkti-schen Meereises. Berichte zur Polarforschung 111.

Wiggins PM. 1990. Role of Water in Some Biological Processes. Microbiological Re-

views 54: 432-449.

Williams I, Frank L. 1975. Improved Chemical Synthesis and Enzymatic Essay of delta1-Pyrroline-5-Carboxylic Acid. Analytical Biochemistry 64: 85-97.

Willker W, Engelmann J, Brand A, Sonnewald U, Leibfritz D. 1995. Identification of pyro-glutamate and glucosyl-aminoacids in cell culture media. Journal of Magnetic

Resonance Analysis 1: 20-24.

Wouters JA, Frenkiel H, deVos WM, Kuipers OP, Abee T. 2001. Cold shock proteins

of Lactococcus lactis MG1363 are involved in cryoprotection and in the production of cold- induced proteins. Applied and Environmental Microbiology 67: 5171-5178.

Wu JT, Chang SC, Chen KS. 1995. Enhancement of intracellular proline level in cells of Anacystis nidulans (Cyanobacteria) exposed to deleterious concentrations of copper. Journal of Phycology 31: 376-379.

Yancey PH, Clark ME, Hand SC, Bowlus RD, Somero GN. 1982. Living with Water Stress: Evolution of Osmolyte Systems. Science 217: 1214-1222.

Yancey PH. 2001. Water Stress, Osmolytes and Proteins. American Zoology 41: 699-

709.


224

Yang C-W, Kao CH. 1999. Importance of ornithine-delta-aminotransferase to proline accumulation caused by water stress in detached rice leaves. Plant Growth Regulation

27: 189-192.

Yoshiba Y, Kiyosue T, Nakashima K, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 1997. Regulation of Levels of Proline as an Osmolyte in Plants under Water Stress. Plant Cell

Physiology 38: 1095-1102.

Zachariassen KE. 1992. Ice Nucleating Agents in Cold-Hardy Insects. In: Somero GN, Osmond CB, Bolis CL, eds. Water and Life. Comparative Analysis of Water relation-

ships at the Organismic, Cellular, and Molecular Levels. Berlin, Heidelberg, New York,

London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest: Springer-Verlag, 261-281.

Zhukova NV, Aizdaicher NA. 2001. Lipid and fatty acid composition during vegetative

and resting stages of the marine diatom Chaetoceros salsugineus 1. Botanica.Marina 44: 287-293.

Zwally HJ, Comiso JC, Parkinson CL, Campbell WJ, Carsey FD, Gloersen P. 1983. Antarctic Sea Ice, 1973 - 1976: satellite pssive-microwave observations. Washington:

NASA SP-459, National Aeronautic Space Administration.

Abkuerzungsverzeichnis

225

8 Abkürzungsverzeichnis

AT(D)P Adenosintri-(di-)phosphat AUFS absorbance units full scale

(Empfindlichkeit) bidest. bidestilliert BSA bovine serum albumin

(Rinderserumalbumin) Chl. a Chlorophyll a Cl- Chloridanion Dabs-Cl 4-Dimethylaminoazobenzol-

4'-sulfonylchlorid DH Dehydrogenase DMS Dimethylsulfid DMSP Dimethylsulfoniumpropionat DNS Desoxyribonukleinsäure DTT Dithiothreitol Ea Aktivierungsenergie FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid FAS freie Aminosäuren Glu Glutaminsäure H2O Wasser (bidest.) HNLC High Nutrient Low Chloro-

phyll (hohe Nährsalz- / niedrige Chl.-Konzentration

HPLC High Pressure Liquid Chloro- matography (Hochdruckflüssigchroma-tographie)

KM Michaelis-Menten- Konstante

Konz. Konzentration Na+ Natriumkation

NAD(P)H Nikotinamid-Adenin- Dinukleotid-(Phosphat)

NMR nuclear magnetic resonance (Kernresonanz)

o-AB ortho-Aminobenzaldehyd OAT δ-Ornithin Aminotransferase

OPA ortho-Phtalaldehyd

Pi Orthophosphat

P5C ∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure

P5CR P5C Reduktase P5CS P5C Synthase PCA perchloric acid

(Perchlorsäure) pers. persönliche (Mitteilung) PSU Practical Salinity Unit Quacs Quaternäre Ammoniumver-

Bindungen RNS Ribonukleinsäure RT Retentionszeit SIMCO Sea Ice Microbial

Community

TCA trichloric acetic acid (Trichloressigsäure)

V S/0 Langzeitexperiment, Kultivierung bei 0°C

V S/T Langzeitversuch, Kultivierung bei gefrierpunktsnahen Salinitäten

Vmax maximale Enzymreaktions-geschwindigkeit

Abkürzungsverzeichnis

226

Abkürzungen der Spezies A. actinochilus: Actinocyclus actinochilus

C. gracile: Chaetoceros gracile

Co. pennatum: Corethron pennatum

A. kufferathii: Amphiprora kufferathii

F. cylindrus: Fragilariopsis cylindrus

Na. gelida: Navicula gelida var. antartica

Ni. lecointei: Nitzschia lecointei

Ni. medioconstricta: Nitzschia medioconstricta

Anhang

227

9 Anhang

9.1 Kulturmedien

9.1.1 hw-Meersalz + Bioelemente

Tab. 9.1: Inhaltsstoffe des hw-Meersalz + Bio- Elemente (Wiegandt GmbH, Krefeld); angegebene Mengen pro Liter angesetztes Meerwasser (Herstel- lerangaben) bei einer Dichte von 1,023

Substanz Konzentration [g/L]

Bicarbonate 0,15

Borsäure 0,03

Bromide 0,07

Calcium 0,42

Chloride 19,35

Fluor 0,001

Jod 0,0004

Kalium 0,39

Magnesium 1,30

Natrium 10,75

Nitrate nicht enthalten

Phosphor nicht enthalten

Strontium 0,01

Sulfate 2,70

Bio-Elemente D-Biotin, Glycin, Leucin, meso-Inosit, Nicotinsäure-amid, Thiamindichlorid, Tryptophan, Tyrosin, Vita-mine A, B12, C, E

Anhang

228

9.1.2 β f/2 Nährsalzzusätze

Tab. 9.2: Zusammensetzung der β- f/2-Nährlösungen (Guillard, 1975; zitiert nach Bidwell & Spotte 1985)

Nr. Komponente Endkonzentration [mg/L]

Konzentration [µM]

1 Hauptnährsalze

NaNO3 75 883

NaH2PO4*H2O 5 36,3

Na2SiO

3*9H

2O 15 - 303 (1,5 - 3 mg Si) 54 - 107

2 Spurenmetalle

FeC6H 5O7*5H 2O 3 (0,5 mg Fe) 8,9 (Fe); 8,9 (Citrat)

C6H8O7*H2O 16,8 80,1 (Citrat)

CuSO4*5H2O 0,01 (2,5 µg Cu) ∼0,04 (Cu)

ZnSO4*7 H2O 0,022 (5 µg Zn) ∼0,08 (Zn)

CoCl2*6 H2O 0,01 (2,5 µg Co) ∼0,05 (Co)

MnCl2*4 H2O 0,18 (0,05 mg Mn) ∼0,9 (Mn)

Na2MoO4*2 H2O 0,006 (2,5 µg Mo) ∼0,03 (Mo)

3 Vitamine

Thiamin*HCl 0,1

Biotin 0,5 µg

B12 (Cyanocobala min)

0,5 µg

3 Das Medium der für die Arbeit gehälterten Algen wurde mit 30 mg/L angesetzt; entsprechend gelten die hohen Konzentrationen, die bei den anorganischen Zusätzen angegeben sind.

Anhang

229

9.1.3 Medium K

Tab. 9.3: Zusammensetzung von Medium K (Keller et al., 1987) und Medium K modifiziert nach Elvers (1998)

Nr. Komponente Endkonzentration [mol/L] Medium K

Endkonzentration [mol/L] Medium K modifiziert

1 NaNO3 8,83*10-4 Dto. Medium K

2 Na2 – glycero – PO4 1*10-5 2*10-5

3 Na2SiO3 * 9H2O 5,4*10-5 1,8*10-4

4 Vitamine Dto. Medium K

Thiamin-HCl 3*10-7 Dto. Medium K

Biotin 2,1*10-9 Dto. Medium K

Vitamin B12 3,7*10-10 Dto. Medium K

5 Spurenelemente Dto. Medium K

Fe-EDTA 1,17*10-5 Dto. Medium K

Mn(Cl2) * 4H2O 9*10-7 Dto. Medium K

Zn(SO4) * 7H2O 8*10-8 Dto. Medium K

Co(SO4) * 7H2O 5*10-8 Dto. Medium K

Na2MoO4 * 2H2O 3*10-8 Dto. Medium K

CuSO4 * 5H2O 1-10-8 Dto. Medium K

(Na2)-EDTA * 2H2O 1*10-4 Dto. Medium K

6 TRIS 1*10-3 Dto. Medium K

7 NH4Cl 5*10-5 Dto. Medium K

8 H2SeO3 1*10-8 Dto. Medium K

9.2 Chemikalien

Aceton p.A., Fluka 00570 Acetonitril HPLC grade, Riedel-de Haën 34998 Adenosintriphosphat di-Natriumsalz, Roche 127529

Amberlite XAD-4, Sigma XAD-4

Anhang

230

ortho-Aminobenzaldehyd, Sigma A-9628

Aminosäurestandard (L-), Sigma AA-S-18 Ammoniumchlorid, Riedel-de Haën 31107 Ammoniumsulfat, Riedel-de Haën 31119 Anilinphtalat-Sprühlösung, Merck 1.01269.0100 Anthron, Serva 13680 Asparagin (L-), Aldrich A9,300-3

Betain, Sigma B-2629 oder Betain ⋅ HCl, Serva 14990

Biotin, Serva 15060 CAPS, Sigma C-2632 CHES (2-(Cyclohexylamino)-Ethansulfonsäure), Merck 115229 Citronensäure Monohydrat, Merck 244 Citronensäure wasserfrei, Fluka 27487 Cobaltchlorid Hexahydrat, Riedel-de Haën 31277 Cobalt(II)-sulfat Heptahydrat, Merck 102556 Cyanocobalamin (Vitamin B12), Merck 24592 Cystin, Sigma C-8755

4-Dimethylaminoazobenzol-4'-sulfonylchlorid (Dabs-Cl), Fluka 39068 N,N-Dimethylformamid, Riedel-de Haën 15440 Dimethylsulfoniumpropionat, Synthese Herr O. Wandschneider, Universität Bremen DTT (Dithiothreitol), Biomol 04010 Dye-Reagent Concentrate, Bio-Rad 500-0006 Ectoin (L-), BIOMOL 53238 EDTA-Dinatriumsalz Dihydrat, Merck 108418 EDTA-NH4-Fe(III)-Salz, Serva 11288 Eisen(III)-citrat, Merck 3862 Eisessig, Fluka 45725 Erythritol, Sigma E-7500 Essigsäure p.A., Fluka 45731 Ethanol, Roth 9065.3 Fructose (D-), Sigma F-3510 Galactose (D-), Sigma G-0750

β-Galactosidase Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens (E.C. 1.1.1.48), Roche 104 973 Glucose (D-), Sigma G-7528 Glutamin (L-), Sigma G-3126

Anhang

231

Glutaminsäure (L-), Sigma G-1251 Glycerin, Riedel-de Haën 33224

Glycin, Riedel-de Haën 33226 Glycylglycin, Biomol 05008 HEPES, Biomol 05288 HEPES-K, Fluka 54464 Histidin (L-), Sigma H-8125 Homarin, Synthese Herr O. Wandschneider, Universität Bremen hw-Meersalz + Bio-Elemente, Wiegandt GmbH, Krefeld Hydroxyectoin (L-), BIOMOL 53239 Hydroxy-Prolin, Sigma H-6002 Isoton® II, Beckman Coulter Euro Diagnostics GmbH, Krefeld Jod, Merck 4761 Kaliumdihydrogenphosphat, Merck 1.04873.1000 Kaliumdihydrogenphosphat, Riedel-de Haën 30407 di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat, Merck 1.05099.1000

Kaliumhydroxid, Riedel-de Haën 30603 Kaliumiodid, Acros 20647-1000

α-Ketoglutarat, Sigma K-1875

Kupfersulfat Pentahydrat Merck 102790 Magnesiumchlorid Hexahydrat, Acros 197530010 Mangan(II)-chlorid Tetrahydrat, Riedel-de Haën 31422 Mannose (D-), Sigma M-4625 MES (2-Morpholinoethansulfonsäure Monohydrat), Biomol 06010 Methanol HPLC grade, Fluka 65548 Methanol p.A., Fluka 65543 Milchsäure (DL-), 90%, Fluka 69785 Na2-EDTA (Titriplex), Merck 8418.0250

β-NAD+, Biomol 16110

β-NADH1-Na2-Salz, Serva 30314

β-NADP+1-Na-Salz, Biomol 16146

β-NADPH1-Na4-Salz, Biomol 16156

Natriumchlorid, Fluka 71381 Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat, Merck 6346 di-Natriumglycerophosphat, Merck 1041649025

Natriumhydrogencarbonat, Riedel-de Haën 31437

Anhang

232

di-Natriumhydrogenphosphat, Merck 6586

Natriumhydroxid, Fluka 71692

Natriummolybdat Dihydrat, Merck 6521 Natriumnitrat, Riedel-de Haën 31440 Natronwasserglas, Riedel-de Haën 13726 Neutralrot, Janssen Chimica 22.981.89 Ninhydrin, Merck 1.06762.0100 Ornithin (L-), Sigma O-2375 Pepstatin A, Boehringer Mannheim 253286 Perchlorsäure 70% suprapure, Merck 517.0250 Phosphorsäure 85%, Janssen Chimika 20.114.35 Polyclar AT pract., Serva 33162 Prolin (L-), Sigma P-0380 1-Propanol für die Chromatographie, Merck 1024 Protease-Inhibitor Complete™, Roche 1697498 Protein Assay (Dye Reagent Concentrate, Nr 500-0006), Bio-Rad Laboratories GmbH, München Pyridoxalphosphat, Janssen Chimica 26496/1

DL-∆1-Pyrrolin-5-Carboxylsäure, Sigma P-3545

Quarzsand, Merck 7536 Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V, Sigma A-6793 Saccharose, Serva 35580 Salpetersäure 65%, Merck 1.00456.1000 Salzsäure 37% rauchend, trace select, Fluka 84415 Schwefelsäure 95 – 97% p.A., Merck 100731 Selenige Säure, Aldrich 21,117-6 Sorbose (D-), Sigma S-4887 Taurin, Fluka 86329 Thiamin ⋅ HCl, Serva 36020

Thioharnstoff, Riedel-de Haën 33717 Toluol, Fluka 89681 Trichloressigsäure, Merck 1.00807.0250 Trigonellin Hydrochlorid, Fluka 91890 TRIS, Biomol 08003 Tryptophan (L-), Sigma T-0254 Xylose (D-), Sigma X-1500 Zinksulfat Heptahydrat, Merck 8883

Anhang

233

9.3 Literaturliste antarktische Eisdiatomeen AG Kirst

Tab. 9.4: Übersicht über die in dieser Arbeit zitierten Arbeiten, in denen dieselben Isolate ant-arktischer Diatomeen verwendet worden sind. Eine ausführliche Liste der bis dato in der AG Kirst mit antarktischen Eisdiatomeen durchgeführten Arbeiten findet sich in Lehmal (1999).

Autor Spezies In dieser Arbeit untersucht?

Elvers (1998) Corethron pennatum Ja

Grabowski (1997) Chaetoceros sp.

Amphiprora kufferathii

Nitzschia lecointei

Ja

Ja

Ja

Lehmal (1999) Chaetoceros sp.


Nitzschia lecointei

Ja

Ja

Ja

Plettner (1997) Nitzschia lecointei Ja

Rott (1993) Nitzschia lecointei Ja

Schriek (2000) Chaetoceros sp.


Ja

Ja

Springer (1996) Chaetoceros sp. Ja

Nothnagel (1994) Chaetoceros sp.

Navicula sp.

Ja

Nein

Wanzek (1994) Amphiprora kufferathii

Nitzschia lecointei

Ja

Ja

Danksagung

234

Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Prof. G.O. Kirst für die (Wieder-) Aufnahme in die Arbeitsgruppe und die Überlassung des Themas, das zu bearbeiten er mir jede erdenkliche Freiheit gelassen hat. Er hat mir durch seine Bereitschaft, mir zuzuhören, des öfteren die Ruhe zurückgegeben, die ich angesichts unfertiger oder ausgefallener Kühlräume bzw. einer mal wieder nicht funktionierenden HPLC verloren hatte. Herrn Priv.-Doz. Dr. D. Hanelt und natürlich auch Herrn Prof. G.O. Kirst danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit zu begutachten; insbesondere angesichts der kurzen Zeit, in der sie diese Aufgabe erfüllt haben. Den weiteren Mitgliedern des Prüfungsausschusses, Frau Prof. F. Koenig, Herrn Prof.

C. Wiencke, Frau Janina Stückroth und Herrn Mark Hünken danke ich ebenfalls für ihr Mitwirken. Frau Roswitha Ulmke danke ich ganz besonders für ihre tatkräftige Unterstützung im Labor durch alle möglichen kleinen und großen Gefälligkeiten; ganz besonders für ihre Mithilfe bei den HPLC-Messungen an der „kleinen“ waters und bei den Prolinbestim-mungen. Ohne sie hätte ich die Messungen in dem vorgenommenen Umfang nicht durchführen können. Frau Dr. Nicole Warlich hat den Bau und die Einrichtung der Kulturräume „auf den Weg“ gebracht und mir dadurch in meinem ersten Jahr in uneigennütziger Weise den Rücken freigehalten. Ebenso sei ihr wie auch Herrn Dr. Oliver Nixdorf und Frau Julia Foerster für das Korrekturlesen und ihre äußerst hilfreichen Anmerkungen gedankt, die mir halfen, meine Satzkonstruktionen zu entwirren und verständlicher zu machen. Herrn Mark Hünken danke ich für die Bereitschaft, die Computer der AG funktionsfähig zu halten, die unmöglichsten Fragen zu beantworten und auch den HPLC-Computer in seine Betreuung einzubeziehen und mir dadurch einige Laufereien zu ersparen (dem

“Netz” sei Dank!). Dank ihm haben wir wieder eine aktuelle Homepage. Außerdem hat er die „Eisalgenfraktion“ in der AG wieder verstärkt, so daß wir Pflege und Kenntnisse dieser kälteliebenden Organismen teilen konnten. Seine Hilfe bei dem als „Nachtakti-on“ durchgeführten Ausdruck verdankt die Arbeit ihr vollständiges Erscheinungsbild. Allen weiteren Mitgliedern der AG Meeresbotanik, auch wenn sie nicht namentlich ge-nannt sind, möchte ich herzlich meinen Dank aussprechen. Vor allem in den letzten

Danksagung

235

Wochen meiner Promotionsarbeit habe ich so viel Hilfsbereitschaft erfahren, wie ich es nicht für möglich gehalten hätte. Herzlichen Dank dafür! Zu allen fällt mir die eine oder

andere erinnerungswürdige Gegebenheit ein, an die ich mich in Zukunft gerne erinnern werde. Der FNK danke ich für die gewährte Unterstützung in den letzten Monaten. Meinen Freunden, ganz besonders Frau Sonja Wiese, und der Familie, sei für ihre mo-ralische Unterstützung und ihr Verständnis gedankt, das sie mir, meinen gelegentlichen Launen („Es klappt mal wieder überhaupt nichts!“) und meiner Zeitknappheit in den vergangenen Jahren entgegen gebracht haben. Meinen Eltern gilt mehr als nur mein Dank. Ihnen ist diese Arbeit in Liebe und Dank-barkeit gewidmet. Sie haben mir durch ihre Unterstützung das Erreichen dieses Zieles möglich gemacht; ganz besonders in der letzten Phase des Zusammenschreibens.

Ökophysiologische Untersuchungen zur Bedeutung von Prolin...

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